JPS63254992A - モノクロ−ナル抗体 - Google Patents
モノクロ−ナル抗体Info
- Publication number
- JPS63254992A JPS63254992A JP62087803A JP8780387A JPS63254992A JP S63254992 A JPS63254992 A JP S63254992A JP 62087803 A JP62087803 A JP 62087803A JP 8780387 A JP8780387 A JP 8780387A JP S63254992 A JPS63254992 A JP S63254992A
- Authority
- JP
- Japan
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- cancer
- cea
- monoclonal antibody
- cell
- carcinoembryonic antigen
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は癌胎児性抗原（以下、ＣＥＡと呼称）に対する
モノクローナル抗体に関する。詳細には、抗原決定基の
異なる複数種の抗ＣＥＡモノクローナル抗体に関する。
モノクローナル抗体に関する。詳細には、抗原決定基の
異なる複数種の抗ＣＥＡモノクローナル抗体に関する。
ＣＥＡは分子量約１８万の糖蛋白質であり、消化器癌患
者の血清中に存在することがら、癌マーカーとして広く
臨床診断に利用されている。
者の血清中に存在することがら、癌マーカーとして広く
臨床診断に利用されている。
ところで、ＣＥＡ以外の物質でありながら、抗ＣＥＡ抗
体と交叉反応を示す物ｆｆ （ＣＥＡ関連抗原）が正常
組織中に見出されている。すなわち、ＣＥＡ関連抗原は
ＣＥＡと部分的にその構造が一敗するか類似する物質と
考えられている。
体と交叉反応を示す物ｆｆ （ＣＥＡ関連抗原）が正常
組織中に見出されている。すなわち、ＣＥＡ関連抗原は
ＣＥＡと部分的にその構造が一敗するか類似する物質と
考えられている。
ＣＥＡ関連抗原としては、非特異的交叉抗原（正常人の
肺や肺臓に存在）、正常糞便抗原（正常成人糞便に存在
）、胆系糖蛋白質（胆汁に存在）などが知られている。
肺や肺臓に存在）、正常糞便抗原（正常成人糞便に存在
）、胆系糖蛋白質（胆汁に存在）などが知られている。
一つの抗原決定部位のみを認識するモノクローナル抗体
技術が確立されたことにより、ＣＥＡまたはＣＥＡ関連
抗原と抗ＣＥＡモノクローナル抗体との関係についても
研究されつつある（特開昭５９−５１２０号、特開昭６
０−５００４２７号、特開昭６０−１８７６５号の各明
細書参照）。
技術が確立されたことにより、ＣＥＡまたはＣＥＡ関連
抗原と抗ＣＥＡモノクローナル抗体との関係についても
研究されつつある（特開昭５９−５１２０号、特開昭６
０−５００４２７号、特開昭６０−１８７６５号の各明
細書参照）。
従って、抗ＣＥＡモノクローナル抗体と言えども、認識
する抗原決定部位が異なる可能性があり、必ずしも同一
抗体とは言えず、その利用価値も変わるものと予想され
る。
する抗原決定部位が異なる可能性があり、必ずしも同一
抗体とは言えず、その利用価値も変わるものと予想され
る。
上記の実情に迄みて、本発明らは抗ＣＥＡモノクローナ
ル抗体について鋭意研究を行って来た結果、ＣＥＡまた
は正常組織に由来するＣＥＡ関連抗原との反応性の違い
から、抗原決定部位の異なるモノクローナル抗体を見出
し、しかも、その一部は特異的な反応性を有するが故に
臨床上極めて有望なことを見出して、本発明を完成する
に至った。
ル抗体について鋭意研究を行って来た結果、ＣＥＡまた
は正常組織に由来するＣＥＡ関連抗原との反応性の違い
から、抗原決定部位の異なるモノクローナル抗体を見出
し、しかも、その一部は特異的な反応性を有するが故に
臨床上極めて有望なことを見出して、本発明を完成する
に至った。
即ち、本発明は免疫原として癌胎児性抗原または癌胎児
性抗原産生癌細胞を用いて得られうるものであり、かつ
、癌胎児性抗原および大腸癌に対して反応性を有すると
ともに他の特性を有するモノクローナル抗体を提供する
ものである。
性抗原産生癌細胞を用いて得られうるものであり、かつ
、癌胎児性抗原および大腸癌に対して反応性を有すると
ともに他の特性を有するモノクローナル抗体を提供する
ものである。
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合によ
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッ
ドをクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を有す
る特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるクロー
ンを選択することによって製造される。その操作は、免
疫原として下記のものを使用すること以外は、従来既知
の方法に準ずればよい。
って製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細胞
との間に、融合ハイブリッドを形成させ、該ハイブリッ
ドをクローン化し、上記癌細胞（即ち、上記特性を有す
る特定抗原）に対し特異性を示す抗体を産生ずるクロー
ンを選択することによって製造される。その操作は、免
疫原として下記のものを使用すること以外は、従来既知
の方法に準ずればよい。
免疫原としてはＣＥＡ、ＣＥＡ産生癌細胞またはその抽
出液を用いる。
出液を用いる。
ＣＥＡとしてはたとえば、癌患者腹水由来のものなどが
用いられる。
用いられる。
ＣＥＡ産生癌細胞としては、食道癌（ＴＥ−２）、肺癌
（ＰＣ−３）、肺癌（ＰＣ−９）、胃癌（ＭＫＮ−２８
）、胃癌（ＭＫＮ−４５）、胃癌（ＫＡＴＯ−ＩＩＩ）
、肝臓癌（ＨＥＫ）などの株化癌細胞が用いられる。
（ＰＣ−３）、肺癌（ＰＣ−９）、胃癌（ＭＫＮ−２８
）、胃癌（ＭＫＮ−４５）、胃癌（ＫＡＴＯ−ＩＩＩ）
、肝臓癌（ＨＥＫ）などの株化癌細胞が用いられる。
抽出液の場合は、上記株化癌細胞を超音波処理等で破壊
し、遠心分離（例、１０，０００〜２０．０００ Ｇ、
１０〜６０分）を行って細胞抽出液を得、この上清を分
子１１０万〜２００万の物質の分離が可能なゲル濾過担
体く例、セファデックス、セファクリル、セファロース
、バイオゲル等）を使用して分子篩し、高分子画分（分
子量約７０万〜１５０万）を回収したものを用いる。免
疫は、免疫原をそのまま、または、適当な抗ＣＥＡ抗体
と反応（イムノブロック法）させたものを用いる。
し、遠心分離（例、１０，０００〜２０．０００ Ｇ、
１０〜６０分）を行って細胞抽出液を得、この上清を分
子１１０万〜２００万の物質の分離が可能なゲル濾過担
体く例、セファデックス、セファクリル、セファロース
、バイオゲル等）を使用して分子篩し、高分子画分（分
子量約７０万〜１５０万）を回収したものを用いる。免
疫は、免疫原をそのまま、または、適当な抗ＣＥＡ抗体
と反応（イムノブロック法）させたものを用いる。
イムノブロック法は、たとえばＣＥＡと適当な抗ＣＥＡ
モノクローナル抗体とを約ｌ：１〜１０の割合で混和す
る方法である。
モノクローナル抗体とを約ｌ：１〜１０の割合で混和す
る方法である。
得られた免疫原はたとえば、完全フロインドアジュバン
ト（Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎ
ｔ）と混和後、動物の免疫用として使用する。動物とし
ては、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ウサギなどが例示
される。免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に、
ＣＥＡの場合は、約１〜１００μｇ／回、癌細胞の場合
は約１０’〜Ｌ Ｏ” ｃｅｌｌ相当分／回を注射する
ことにより行われ、初回免疫より約１〜２週間毎に１〜
４度免疫を行い、更に約１〜４週間後に最終免疫を行う
、最終免疫より約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細
胞を分取する。
ト（Ｆｒｅｕｎｄ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎ
ｔ）と混和後、動物の免疫用として使用する。動物とし
ては、マウス、ラット、ウマ、ヤギ、ウサギなどが例示
される。免疫は動物の皮下、筋肉内あるいは腹腔内に、
ＣＥＡの場合は、約１〜１００μｇ／回、癌細胞の場合
は約１０’〜Ｌ Ｏ” ｃｅｌｌ相当分／回を注射する
ことにより行われ、初回免疫より約１〜２週間毎に１〜
４度免疫を行い、更に約１〜４週間後に最終免疫を行う
、最終免疫より約３〜５日後、免疫動物から抗体産生細
胞を分取する。
抗体産生細胞としては、肺細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リ
ンパ球が挙げられる。
ンパ球が挙げられる。
骨髄腫細胞としては、たとえばマウス、ラット、ヒト等
由来のものが使用される。たとえば、マウスミエローマ
Ｐ３Ｕ１、Ｘ ６３− Ａ ｇ ８−６．５．３等が挙
げられる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは同種動物由来
のものであることが好ましい。
由来のものが使用される。たとえば、マウスミエローマ
Ｐ３Ｕ１、Ｘ ６３− Ａ ｇ ８−６．５．３等が挙
げられる。抗体産生細胞と骨髄腫細胞とは同種動物由来
のものであることが好ましい。
細胞融合は、たとえば、ジー、ガルファー（Ｇ。
Ｇａ１ｆｒｅ） （ネーチ＃、 −（Ｎａｔｕｒｅ）
２６６、５５０ （１９７７））に記載の方法又はこれ
に準する方法によって行われる。この際、３０〜５０％
ポリエチレングリコール（平均分子量１ 、０００〜４
、０００）を用いて３０〜４０℃の温度下、約ｌ〜３
分間程度反応させることによって行われる。
２６６、５５０ （１９７７））に記載の方法又はこれ
に準する方法によって行われる。この際、３０〜５０％
ポリエチレングリコール（平均分子量１ 、０００〜４
、０００）を用いて３０〜４０℃の温度下、約ｌ〜３
分間程度反応させることによって行われる。
細胞融合によって得られた細胞は目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングに付され
る。即ち、当該細胞を、たとえばマイクロプレート中で
培養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を
、たとえば酵素抗体法等によって測定し、適切な抗体を
産生しているウェルを得る。このようなウェルから、更
にたとえば限界希釈法によってクローニングを行ってク
ローンを得る。このクローンは、たとえばあらかじめプ
リスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移植
し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含
む腹水を採取し、検定する。
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングに付され
る。即ち、当該細胞を、たとえばマイクロプレート中で
培養し、増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を
、たとえば酵素抗体法等によって測定し、適切な抗体を
産生しているウェルを得る。このようなウェルから、更
にたとえば限界希釈法によってクローニングを行ってク
ローンを得る。このクローンは、たとえばあらかじめプ
リスタンを投与したＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内へ移植
し、１０〜１４日後にモノクローナル抗体を高濃度に含
む腹水を採取し、検定する。
または、ウシ血清アルブミン（０，１〜１％）含有無皿
清培地（ＲＩＴＣ５５−９培地など）中で増殖させ、培
養上清を集めることもできる。選ばれたクローンの産生
ずるモノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精
製法として従来既知の硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタ
ノール分画法、陰イオン変換体を応用することで、容易
に達成される。
清培地（ＲＩＴＣ５５−９培地など）中で増殖させ、培
養上清を集めることもできる。選ばれたクローンの産生
ずるモノクローナル抗体の回収は、免疫グロブリンの精
製法として従来既知の硫安分画法、ＰＥＧ分画法、エタ
ノール分画法、陰イオン変換体を応用することで、容易
に達成される。
（ｉ）分類
得られたモノクローナル抗体をＣＥＡまたはＣＥＡ関連
抗原との反応性により分類する。
抗原との反応性により分類する。
ＣＥＡの場合は、ＣＥＡそのもの、またはＣＥＡ産生癌
細胞（たとえば大腸癌）等を用いる。
細胞（たとえば大腸癌）等を用いる。
ＣＥＡ関連抗原としては、腸粘膜、顆粒球、胆管などの
正常組織またはその抽出液等を用いる。
正常組織またはその抽出液等を用いる。
このうち、腸粘膜としては大腸または小腸の粘膜上皮、
顆粒球としては末梢血白血球、肺臓）Ｊｌ織などを用い
ることが好ましい。
顆粒球としては末梢血白血球、肺臓）Ｊｌ織などを用い
ることが好ましい。
反応方法は公知の免疫反応の手段、たとえば酵素抗体法
等を用いることができる。
等を用いることができる。
（ｉ ｉ）性質゛
本発明のモノクローナル抗体は以下の性質を有する４つ
の群に分類できるが、ＣＢＡおよび大腸癌に対して反応
する点においてすべて共通する。
の群に分類できるが、ＣＢＡおよび大腸癌に対して反応
する点においてすべて共通する。
（ａｌｃＥＡ、大腸癌、顆粒球および胆管に対して反応
するモノクローナル抗体。
するモノクローナル抗体。
ｔｂｌｃＥＡ、大腸癌および顆粒球に対して反応するが
、胆管に対して反応しないモノクローナル抗体。
、胆管に対して反応しないモノクローナル抗体。
（Ｃ）ＣＥＡ、大腸癌および胆管に対して反応するが、
顆粒球に対して反応しないモノクローナル抗体。
顆粒球に対して反応しないモノクローナル抗体。
ｆｄｌｃＥＡおよび大腸癌に対して反応するが、顆粒球
および胆管に対して反応しないモノクローナル抗体。
および胆管に対して反応しないモノクローナル抗体。
さらに詳細には以下の性質を存する４つの群に分類でき
る。
る。
（ａｌｃＢＡ、大腸癌、腸粘膜、顆粒球および胆管に対
して反応するモノクローナル抗体。
して反応するモノクローナル抗体。
ｆｂｌ ＣＥＡ、大腸癌、腸粘膜および顆粒球に対し
て反応するが、胆管に対して反応しないモノクローナル
抗体。
て反応するが、胆管に対して反応しないモノクローナル
抗体。
（ＣＩＣＥＡ、大腸癌および胆管に対して反応するが、
腸粘膜および顆粒球に対して反応しないモノクローナル
抗体。
腸粘膜および顆粒球に対して反応しないモノクローナル
抗体。
（ｄｌｃＥＡ、大腸癌および腸粘膜に対して反応するが
、顆粒球および胆管に対して反応しないモノクローナル
抗体。
、顆粒球および胆管に対して反応しないモノクローナル
抗体。
本発明によって得られたモノクローナル抗体は、ＣＥＡ
を認識するため、腫瘍のイメージングあるいは制癌剤と
コンジュゲートさせ、ターゲティングセラピイ（ｔａｒ
ｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ）等への臨床応用あるい
は癌の早期発見、予後の追跡調査に有用な診断薬として
の応用が期待される。
を認識するため、腫瘍のイメージングあるいは制癌剤と
コンジュゲートさせ、ターゲティングセラピイ（ｔａｒ
ｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅｒａｐｙ）等への臨床応用あるい
は癌の早期発見、予後の追跡調査に有用な診断薬として
の応用が期待される。
特に、相互に抗原決定部位が異なることから、腫瘍の種
類に応じて、本発明抗体を使い分けたり、二種以上の本
発明抗体を用いて診断用試薬としての感度を向上させる
ことができる。
類に応じて、本発明抗体を使い分けたり、二種以上の本
発明抗体を用いて診断用試薬としての感度を向上させる
ことができる。
また、本発明のモノクローナル抗体のうち、顆粒球およ
び胆管等の正常組織由来の抗原に反応しないものはＣＥ
Ａに特異的であり、癌特異的な抗体と推定される。従っ
て、このような抗体は臨床上極めて有用と考えられる。
び胆管等の正常組織由来の抗原に反応しないものはＣＥ
Ａに特異的であり、癌特異的な抗体と推定される。従っ
て、このような抗体は臨床上極めて有用と考えられる。
実施例１
＋１１ 免疫原の調製：
低分化型腺癌系胃癌細胞株ＭＫＮ−４５を等張リン酸緩
衝液（ｐＨ７，２）に！！！濁し、約１．５Ｘ１０’細
胞数／回をＢＡＬＢ／ＣマウスＣａ性、４週令以上）へ
腹腔内投与により２週間毎に３度免疫し、更に３週間後
に最終免疫を行った。
衝液（ｐＨ７，２）に！！！濁し、約１．５Ｘ１０’細
胞数／回をＢＡＬＢ／ＣマウスＣａ性、４週令以上）へ
腹腔内投与により２週間毎に３度免疫し、更に３週間後
に最終免疫を行った。
ｉ＆終゛免疫より４日後にマウス［臓を摘出した。
（２）細胞融合およびクローニング：
上記のマウス牌細胞と、マウスミエローマＸ６３− Ａ
ｇ ８−６．５．３とを１：１（細胞数６．２Ｘ１０
’）の割合で混合し、１２．３％ジメチルスルホキシド
加４２．６％ポリエチレングリコール（平均分子量１０
００）中で１分間反応させることにより細胞融合を行っ
た。
ｇ ８−６．５．３とを１：１（細胞数６．２Ｘ１０
’）の割合で混合し、１２．３％ジメチルスルホキシド
加４２．６％ポリエチレングリコール（平均分子量１０
００）中で１分間反応させることにより細胞融合を行っ
た。
処理された細胞を７Ｘ１０’個７０．１ ｍｌ／ｗｅｌ
ｌとなるように９６ウエルマイクロプレートに植え込み
、ＨＡＴ培地（表１）で９〜１４日間培養後、ＨＴ培地
（表１）に移行し、更にフラスコ（２５ｃＪ）に培養で
きるようになってからＤ−ＭＥＭ培地（表１）で培養し
た。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵素
抗体法によりヨ１１定し、適切なウェルから限界希釈法
により、求めるハイブリドーマのクローニングを行った
。
ｌとなるように９６ウエルマイクロプレートに植え込み
、ＨＡＴ培地（表１）で９〜１４日間培養後、ＨＴ培地
（表１）に移行し、更にフラスコ（２５ｃＪ）に培養で
きるようになってからＤ−ＭＥＭ培地（表１）で培養し
た。増殖の見られたウェルの培養上清中の抗体価を酵素
抗体法によりヨ１１定し、適切なウェルから限界希釈法
により、求めるハイブリドーマのクローニングを行った
。
即ち、マイクロタイタープレートにウェル当たり２５．
０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次にＤ −
Ｍ Ｂ Ｍ培地（表１）で、１０．５．２．５．１個１
０．１＠７となるようにハイブリドーマを希釈し、これ
をマイクロタイタープレートに０．１ ｍＪずつ植え込
み培養した。４日後にＤ−ＭＥＭ培地を０、１ ｍ７加
え、以後４〜７日に１度、培地の半■交換を行った。培
養開始後１０〜２０日で肉眼で認められるコロニーが形
成され、クローン株を得た。
０００個のマウス腹腔浸出細胞を植え込み、次にＤ −
Ｍ Ｂ Ｍ培地（表１）で、１０．５．２．５．１個１
０．１＠７となるようにハイブリドーマを希釈し、これ
をマイクロタイタープレートに０．１ ｍＪずつ植え込
み培養した。４日後にＤ−ＭＥＭ培地を０、１ ｍ７加
え、以後４〜７日に１度、培地の半■交換を行った。培
養開始後１０〜２０日で肉眼で認められるコロニーが形
成され、クローン株を得た。
（３） スクリーニング法
得られたハイブリドーマについて目的とするモノクロー
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングを次のよ
うに行った。
ナル抗体を産生ずるクローンのスクリーニングを次のよ
うに行った。
（イ）方法の説明
以下のようにして酵素抗体法を行った。
抗原（各種株化癌細胞または部分精製癌関連抗原または
正常細胞）をコートしたマイクロプレートに検体を加え
、３７℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標
識抗マウス免疫グロブリン（Ｉ ｇＧ＋ Ｉ ｇＡ＋
ｒ ｇＭ）ウサギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反
応させた。未反応の標識抗体を洗浄除去後、０−フェニ
レンジアミン液を加え、室温にて３００分間反応せた後
、２Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光
度を測定した。この方法で各種細胞との反応性を調べた
。
正常細胞）をコートしたマイクロプレートに検体を加え
、３７℃で１時間反応させ、洗浄後ペルオキシダーゼ標
識抗マウス免疫グロブリン（Ｉ ｇＧ＋ Ｉ ｇＡ＋
ｒ ｇＭ）ウサギ抗体を加え、さらに３７℃で１時間反
応させた。未反応の標識抗体を洗浄除去後、０−フェニ
レンジアミン液を加え、室温にて３００分間反応せた後
、２Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光
度を測定した。この方法で各種細胞との反応性を調べた
。
癌胎児性抗原（ＣＥＡ）との交叉反応性は、ＣＥＡ感作
感作血球−ＰＨＡ法で行った。
感作血球−ＰＨＡ法で行った。
（ロ）スクリーニングの流れ
１次スクリーニング：ターゲットセル（ＭＫＮ−４５）
および正常由来細胞（ＣＯＤｏ ３ Ｋ）を用いた酵
素抗体法で、ＭＫＮ−４５に対して陽性でＣ０Ｄａｓ
ＳＫに対して陰性なウェルを選抜。
および正常由来細胞（ＣＯＤｏ ３ Ｋ）を用いた酵
素抗体法で、ＭＫＮ−４５に対して陽性でＣ０Ｄａｓ
ＳＫに対して陰性なウェルを選抜。
２次スクリーニング：選抜された細胞株を２〜３回クロ
ーニングし、その培養上清を多くの癌由来の株化細胞と
の反応性を検討する。
ーニングし、その培養上清を多くの癌由来の株化細胞と
の反応性を検討する。
（４）モノクローナル抗体の回収、精製上記のスクリー
ニングによって得られたクローン株を、予め０．５ｍｌ
／匹ブリスタンを投与した４週令以後のＢＡＬＢ／Ｃマ
ウス（雄）の腹腔内へ２、Ｏ〜３．ＯＸ ｌ Ｏ’ ｃ
ｅｌｌ／匹移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗
体を高濃度に含む腹水を採取した。
ニングによって得られたクローン株を、予め０．５ｍｌ
／匹ブリスタンを投与した４週令以後のＢＡＬＢ／Ｃマ
ウス（雄）の腹腔内へ２、Ｏ〜３．ＯＸ ｌ Ｏ’ ｃ
ｅｌｌ／匹移植し、１０〜１４日後にモノクローナル抗
体を高濃度に含む腹水を採取した。
この腹水に０．９％ＮａＣ１？ｆＬを加え５〜１０倍希
釈した後、硫酸アンモニウムを４０％濃度となるように
加え、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなるべく少
量の０．９ ′ＡＮ ａ ＣＩｌ液で溶解させた後、０
．９％ＮａＣ１液を外液として透析した。
釈した後、硫酸アンモニウムを４０％濃度となるように
加え、沈澱画分を分取した。この沈澱画分をなるべく少
量の０．９ ′ＡＮ ａ ＣＩｌ液で溶解させた後、０
．９％ＮａＣ１液を外液として透析した。
透析終了後、高速液体クロマトグラフィー（ＴＳＫ−Ｇ
ｅｌｌ Ｇ−３０００Ｓ１４）を行い、グロブリン画分
を得、精製モノクローナル抗体とした。
ｅｌｌ Ｇ−３０００Ｓ１４）を行い、グロブリン画分
を得、精製モノクローナル抗体とした。
こうして前記骨［（ａｌに属するモノクローナル抗体（
ＢＤ６）を得た。
ＢＤ６）を得た。
実施例２
分化型腺癌性肺癌細胞株ＰＣ−９を用いて、免疫スケジ
ュールを１週間毎に４回、更に２週間後に最終免疫とす
る以外は全て実施例１に準じて操作し、前記分［（Ｃ１
に属するモノクローナル抗体（ＡＨ３）を得た。
ュールを１週間毎に４回、更に２週間後に最終免疫とす
る以外は全て実施例１に準じて操作し、前記分［（Ｃ１
に属するモノクローナル抗体（ＡＨ３）を得た。
実施例３
免疫原として肝臓癌由来細胞株ＨＥＫを用いる以外は全
て実施例１に準じて操作し、前記分類ｆｂｌに属するモ
ノクローナル抗体（ＪＡ４）を得た。
て実施例１に準じて操作し、前記分類ｆｂｌに属するモ
ノクローナル抗体（ＪＡ４）を得た。
実施例４
ｆｉｌ免疫原の調製
癌患者腹水由来ＣＥＡ３０ｐｇを、実施例１で得られた
精製モノクローナル抗体（ＢＤ６）１２ＯＮと混和・処
理してＣＥＡの一部の抗原決定基をブロックした。
精製モノクローナル抗体（ＢＤ６）１２ＯＮと混和・処
理してＣＥＡの一部の抗原決定基をブロックした。
このＣＥＡ３０／Ａｌｒ１０．１ｍｌを等量の完全ソロ
インドアジュバントと混和後、Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウ
ス（ａ性・４週令）に〔１０日毎に３回〕皮下注射して
免疫し、更に１０日後、アジュバントなしで腹腔内投与
して最終免疫した。
インドアジュバントと混和後、Ｂ Ａ Ｌ Ｂ／Ｃマウ
ス（ａ性・４週令）に〔１０日毎に３回〕皮下注射して
免疫し、更に１０日後、アジュバントなしで腹腔内投与
して最終免疫した。
最終免疫より３日後にマウスｐＩ臓を摘出した。
（２）細胞融合
上記の肺細胞と、マウスミエローマＰ３Ｕ１とを約２
： １ （３，３ｘｌＯ’個：１．６Ｘ１０’個）の割
合で混合し、４５％ポリエチレングリコール（平均分子
［４０００）用いて２分間反応させて細胞融合を行った
。これを遠心後、上清を捨て、５分間放置後、ＨＡＴ培
養液に細胞を浮遊させ、９６穴の平底のマイクロプレー
トに０．１ｍ７ｆつ播いた後、７．５％ＣＯ□インキュ
ベーター中で培養した。
： １ （３，３ｘｌＯ’個：１．６Ｘ１０’個）の割
合で混合し、４５％ポリエチレングリコール（平均分子
［４０００）用いて２分間反応させて細胞融合を行った
。これを遠心後、上清を捨て、５分間放置後、ＨＡＴ培
養液に細胞を浮遊させ、９６穴の平底のマイクロプレー
トに０．１ｍ７ｆつ播いた後、７．５％ＣＯ□インキュ
ベーター中で培養した。
（３） スクリーニング法
９６大のマイクロプレートで培養し、増殖してきたハイ
ブリドーマの中で抗ＣＥＡ抗体を産生じているーａｌｌ
を表面にＣＥＡを結合させたヒツジ赤血球を用いるＰ
ＨＡ法によりスクリーニングした。
ブリドーマの中で抗ＣＥＡ抗体を産生じているーａｌｌ
を表面にＣＥＡを結合させたヒツジ赤血球を用いるＰ
ＨＡ法によりスクリーニングした。
更に、これらの中から、抗ＣＥＡモノクローナル抗体Ｂ
Ｄ６を介してＣＥＡを結合させたヒツジ赤血球を用いる
ＰＨＡ法により、ＢＤ６が認識している抗原以外の抗原
決定基を認識する抗体を産生じているーａｌｌをスクリ
ーニングした。
Ｄ６を介してＣＥＡを結合させたヒツジ赤血球を用いる
ＰＨＡ法により、ＢＤ６が認識している抗原以外の抗原
決定基を認識する抗体を産生じているーａｌｌをスクリ
ーニングした。
得られたーａｌｌから、実施例１に準じて操作し、４種
のモノクローナル抗体Ａ１０ （前記分類＋ｄ＋に属す
る）、Ｂ９（前記分類（ｂｌに属する）、Ｄ６−１ （
前記分類ｆｂｌに属する）、Ｄ６−２（前記分類＋ｄ＋
に属する）を得た。
のモノクローナル抗体Ａ１０ （前記分類＋ｄ＋に属す
る）、Ｂ９（前記分類（ｂｌに属する）、Ｄ６−１ （
前記分類ｆｂｌに属する）、Ｄ６−２（前記分類＋ｄ＋
に属する）を得た。
実験例１
モノクローナル抗体の特性
かくしてスクリーニングされたクローンの産生ずるモノ
クローナル抗体の性状は、表２及び表３のとおりである
。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー法で検定した
。
クローナル抗体の性状は、表２及び表３のとおりである
。免疫グロブリンのクラスはオフタロニー法で検定した
。
なお、本発明で用いた酵素抗体法は、ケネット（Ｋｅｎ
ｎｅｔｔ）らの方法〔モノクローナル アンチボディー
（ブレニウム プレス）ニューヨーク ロンドン、 ３
７６、 （１９８０））に準じて細胞をそのまま利用す
るエンザイム リンクド イムノソルベント アッセイ
（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉａ＋ｍｕｎｏｓｏ
ｒｂｅｎｔ＾５ｓａｙ） （エリザ（ＥＬＩＳＡ） ）
法である。
ｎｅｔｔ）らの方法〔モノクローナル アンチボディー
（ブレニウム プレス）ニューヨーク ロンドン、 ３
７６、 （１９８０））に準じて細胞をそのまま利用す
るエンザイム リンクド イムノソルベント アッセイ
（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉａ＋ｍｕｎｏｓｏ
ｒｂｅｎｔ＾５ｓａｙ） （エリザ（ＥＬＩＳＡ） ）
法である。
実験例２
実施例１〜４で得られたモノクローナル抗体とＣＥＡま
たはＣＥＡ関連抗原との反応性を副べ、その結果を表４
に示した。
たはＣＥＡ関連抗原との反応性を副べ、その結果を表４
に示した。
なお、ＣＥＡは患者腹水を精製して得られたものを使用
した。
した。
（対象組織）
組織および末梢血：４％パラホルムアルデヒドで固定し
た凍結包埋ヒト肺臓、肝臓および未固定凍結包埋したヒ
ト大腸癌、大腸粘膜、小腸粘膜を凍結切片作製後、アセ
トン固定したものを実験に用いた。また、末梢血は塗抹
種木作製後、アセトン固定した後に実験に用いた。
た凍結包埋ヒト肺臓、肝臓および未固定凍結包埋したヒ
ト大腸癌、大腸粘膜、小腸粘膜を凍結切片作製後、アセ
トン固定したものを実験に用いた。また、末梢血は塗抹
種木作製後、アセトン固定した後に実験に用いた。
免疫組織−細胞化学的染色：固定した組織の凍結切片あ
るいは血液塗抹標本を室温で１時間風乾した後に冷等張
リン酸緩衝液で洗浄した。
るいは血液塗抹標本を室温で１時間風乾した後に冷等張
リン酸緩衝液で洗浄した。
０．３％過酸化水素加メタノール中で、室温下、３０分
間インキュベートすることにより内因性ペルオキシダー
ゼをブロックした後に等張リン酸緩衝液で洗浄した。３
％ヤギ血清中に室温下、３０分間インキュベートし、そ
の後１次抗体（モノクローナル抗体）と室温下、２時間
反応させた。なお、−次抗体である抗ＣＥＡモノクロー
ナル抗体は２μｇ／ｍｌとなるように２％ウシ血血清ア
ルブミン環張リン酸緩衝液で希釈した。等張リン酸緩衝
液で洗浄した後、３％ヒト血清＋３％ヤギ血清中で３０
分間、室温下でインキュベートシタ。その後、２次抗体
と室温下、１時間反応させた。なお、２次抗体はタボ社
のヒツジ抗マウスｌ ｇＧ＋ＩｇＭペルオキシダーゼを
２％ウシ血清アルブミン、３％ヤギ血清、３％ヒト血血
清環張リン酸緩衝液で２０倍に希釈したものを用いた。
間インキュベートすることにより内因性ペルオキシダー
ゼをブロックした後に等張リン酸緩衝液で洗浄した。３
％ヤギ血清中に室温下、３０分間インキュベートし、そ
の後１次抗体（モノクローナル抗体）と室温下、２時間
反応させた。なお、−次抗体である抗ＣＥＡモノクロー
ナル抗体は２μｇ／ｍｌとなるように２％ウシ血血清ア
ルブミン環張リン酸緩衝液で希釈した。等張リン酸緩衝
液で洗浄した後、３％ヒト血清＋３％ヤギ血清中で３０
分間、室温下でインキュベートシタ。その後、２次抗体
と室温下、１時間反応させた。なお、２次抗体はタボ社
のヒツジ抗マウスｌ ｇＧ＋ＩｇＭペルオキシダーゼを
２％ウシ血清アルブミン、３％ヤギ血清、３％ヒト血血
清環張リン酸緩衝液で２０倍に希釈したものを用いた。
等張リン酸緩衝液で洗浄後、０．０５％過酸化水素、０
．０２％ジアミノベンチジン（シグマ社）含有トリス−
塩酸緩衝液、ｐｌ＋７．６中で４分間ペルオキシダーゼ
反応を行った。等張リン酸緩衝液で洗浄後、組織切片は
メチルグリーンで、また血液塗抹標本はへマドキシリン
で核染色を行った後、脱水、透徹、封入を行い検鏡に供
した。
．０２％ジアミノベンチジン（シグマ社）含有トリス−
塩酸緩衝液、ｐｌ＋７．６中で４分間ペルオキシダーゼ
反応を行った。等張リン酸緩衝液で洗浄後、組織切片は
メチルグリーンで、また血液塗抹標本はへマドキシリン
で核染色を行った後、脱水、透徹、封入を行い検鏡に供
した。
（以下余白）
表 １
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 次の特性を有するモノクローナル抗体から選ばれる癌胎
児性抗原モノクローナル抗体： （１）免疫原として癌胎児性抗原または癌胎児性抗原産
生癌細胞を用いて得られうるものであり、かつ癌胎児性
抗原、大腸癌、顆粒球および胆管に対して反応性を有す
るモノクローナル抗体。 （２）免疫原として癌胎児性抗原または癌胎児性抗原産
生癌細胞を用いて得られうるものであり、かつ癌胎児性
抗原、大腸癌および顆粒球に対して反応性を有するが、
胆管に対して反応性を有しないモノクローナル抗体。 （３）免疫原として癌胎児性抗原または癌胎児性抗原産
生癌細胞を用いて得られうるものであり、かつ癌胎児性
抗原、大腸癌および胆管に対して反応性を有するが、顆
粒球に対して反応性を有しないモノクローナル抗体。 （４）免疫原として癌胎児性抗原または癌胎児性抗原産
生癌細胞を用いて得られうるものであり、かつ癌胎児性
抗原および大腸癌に対して反応性を示すが、顆粒球およ
び胆管に対して反応性を有しないモノクローナル抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62087803A JPS63254992A (ja) | 1987-04-09 | 1987-04-09 | モノクロ−ナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62087803A JPS63254992A (ja) | 1987-04-09 | 1987-04-09 | モノクロ−ナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63254992A true JPS63254992A (ja) | 1988-10-21 |
Family
ID=13925138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62087803A Pending JPS63254992A (ja) | 1987-04-09 | 1987-04-09 | モノクロ−ナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63254992A (ja) |
-
1987
- 1987-04-09 JP JP62087803A patent/JPS63254992A/ja active Pending
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