JPS63267300A

JPS63267300A - 安定な過酸化物基質配合物

Info

Publication number: JPS63267300A
Application number: JP3198188A
Authority: JP
Inventors: ルス　エム．ジョンズ
Original assignee: Synbiotics LLC
Current assignee: Synbiotics LLC
Priority date: 1987-02-17
Filing date: 1988-02-16
Publication date: 1988-11-04
Also published as: EP0279614A3; EP0279614A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は酵素基質に関し、そして特に／４’−オキシダ
ーゼ酵素基質に関する。

（従来の技術）パーオキシダーゼが基質の配合物は通常二容器系を用い
る。第一容器は緩衝化された過酸化水素を収容する。第
二容器はテトラメチルベンジジンを収容する。単一容器
中に基質系が配合される場合、通常遭遇される２つの問
題点が存在する。第一にテトラメチルベンジジンが不溶
性であることである。第二は、・クーオキシダーゼ酵素
の非存在下で溶液を着色せしめる反応が起こり、これが
その後の酵素の測定を妨害することである。ノや一オキ
シダーゼの九めの貯蔵安定性の単−漆器基質が望まれる
。

（発明の概要）１？−オキシダーゼ酵素のための、貯蔵安定性の単一容
器酵素基質溶液が提供される。この基質溶液は溶解した
テトラメチルベンジジン（７部）及び過酸化物源を含ん
で成り、そしてパーオキシダーゼの非存在下では着色し
た溶液を生成しない。この基質溶液は酢酸塩／クエン酸
（塩）緩衝液。

ＴＭＢ、安定な過酸化水素源及びメタノールを単一の容
器に含んで成る。

（具体的な説明）パーオキシダーゼ酵素のための、貯蔵安定性の単一容器
酵素基質溶液が提供される。この貯蔵安定性基質溶液は
溶解し次テトラメチルベンジジン及び過酸化水素源を含
んで成る。さらに具体的には、基質溶液は、酢酸塩／ク
エン酸（塩）緩衝液、溶解したテトラメチルベンジジン
（ＴＭＢ　）、安定な過酸化物源、及びメタノールを単
一容器に含んで成る。通常の貯蔵のもとでは溶液は着色
しない。

酢酸塩／りエン酸（塩）水性緩衝液は酢酸塩とクエン酸
（塩）の比率的３５：１〜約４０＝１、及び約０．０１
〜約１．ＯＮの酢酸塩濃度を有し、約５．２〜６．０の
声を示す。通常、基質溶液中の酢酸塩の濃度は約０．０
１〜約０．２Ｎであり、クエン酸（塩）濃度は約０．０
００２〜約０．０４Ｎであり。

そして−は約５．４〜約５．８である。ナトリウムが通
常の反対イオンである。緩衝剤によシ基質溶液に寄与さ
れる合計モル濃度は約０６０１〜０．２４、さらに通常
は０．０５〜０．１５であり、好ましくは約０．１Ｍで
ある。

約５．２より低い一値はＴＭＢの不安定化、及び溶液の
青変を導く。６．０より有意に高い−は・卆−オキシダ
ーゼ活性を低下せしめ、そしてそれ故にシグナルが弱く
なる。緩衝剤の濃度は臨界的ではないが、緩衝剤成分に
ついて与えられた限界からの差異は性能を害する傾向が
ある。

３．３’、５，５’−ナト５メチルベンジジン（′ｒＭ
Ｂ）は通常、約０．０４ｍＭ以上であって飽和以下の濃
度で基質溶液中に存在する。通常、ＴＭＢは約０．２〜
約０．８ｍＭの濃度、さらに普通には約０．４ｍＭの濃
度で存在する。

メタノールは一般に、基質溶液の約１０〜約５０係１通
常３０〜５０％、最も普通には約４０％　（Ｖ／Ｖ　）
で存在する。より高い濃度は、酵素活性に影響を与える
ことによりシグナルを低下せしめる。

より低い濃度は、望ましいレベルのＴＭＢを溶液状に維
持しない。メタノールが補助的有機溶剤として好ましい
が、他の低分子量水溶剤オキシ有機溶剤を使用すること
もできる。

ノや一オキシダーゼ基質として役立つのに十分な濃度の
安定な過酸化物源も基質溶液中に存在する。

安定な過酸化物源は例えば退散化水素付加複合体。

例えば尿素過激化水素である。尿素過酸化水素は通常、
約０．００１Ｍ〜０．１Ｍ１通常約０．００２〜０．０
０５Ｍの濃度で存在する。

補助的添加物も存在することができる。基質配合物中に
細菌増殖阻害剤を含めることもできる。

有用な細菌増殖阻害剤は安息香酸ナトリウムである。補
助的添加物は一般に０．５重量％未満で存在することが
できる。

この発明の貯蔵安定性水性基質溶液は、単一容器基質配
合物において従来遭遇された問題点を解決する。ＴＭＢ
は溶解したままであり、そしてその活性を保持し、そし
て溶液は通常の貯蔵条件下で長期間にわたり着色しない
。

この発明の基質溶液は種々の用途において・々−オキシ
ダーゼ酵素のために、特に西洋ワサビパーオキシダーゼ
のために使用される。酵素が安定であり、生理的媒体中
に存在せず、そして検出が容易であるために、種々の診
断測定における標識として西洋ワサビパーオキシダーゼ
が広く使用される。この様々測定の例としてＥＬＩＳＡ
（米国特許随３．７９１，９３２）、Ｔａｎｄｅｍ　（
米国特許随４．３７６．１１０　）等が挙げられる。こ
れらの測定を行うためのキットを提供することができ、
このキットは本発明の基質溶液、西洋ワサピノセーオキ
シダーゼと結合したりセプター、通常は抗体又はリガン
ド、の接合体、及びその測定のために有用な他の試薬を
含むであろう。（リガンド及びリセプターの定義につい
ては米国特許Ｎ１３．８１７，８３７を参照のこと）。

次に、例によシこの発明をさらに具体的に説明するが、
これによりこの発明の範囲を限定するものではない。

実験西洋ワサビ／４’−オキシダーゼのための単一容器基質
として次の配合物を調製した。

組成ｌｌ中、酢駿ナトリウム・三水和物１３．５９（０，１ｍｏｔ）
クエン酸・−水和物０．０５５９　　　　Ｃ０，００２
６ｍｏｔ）尿素過酸化水素　　０．２７　ｇ　　　（０
，００３ｍｏｔ）３．３’、５．５’−テトラメチルベ
ンジジン１００〜　（０，４ｍＭ）メタノール　　　４
００ゴ　　（４０％）安息香駿ナトリウム　Ｉ９　　　
（０，１％）水　　　　　　　　　　　　　　　　残余
量最終ｐＨ５，６〜５．７上記の配合物は３７℃にて１週間にわたシ安定であり、
これは検出可能な色が存在しないこと、及び西洋ワサビ
パーオキシダーゼ（ＨＲＰ）の測定ニおいて有用である
ことにより証明される。具体的には、ＴＭＢを１：１０
稀釈で０Ｄ２８５において測定し念。θ８目にＴＭＢの
測定値は０．９５であった。

３７℃にて７日間の後ＴＭＨの測定値は０．８８であり
、６係のロスであった。この配合物をまた低温（２〜８
℃）にて６ケ月間保持した。１：１０稀釈物はＯ８目に
０．９５の０Ｄ２８５を有していた。６ケ月後０Ｄ２８
５は０．９３であり、ロスは２％であつ九。

通常の反応混合物中でのＨＲＰ基質として使用した場合
、ＴＢＭＶｃ′：）Ａて文献に記載されているように、
この配合物は無色から青に、緑色を介して黄−橙色に変
化した。

この配合物を、二容器測定法と平行して、ＦｅＬＶの測
定において使用した。測定法は次の通りであった。要約
すれば、ミクロタイタープレートを２〜８℃において、
１００１１１の抗−ＦｅＬＶ抗体と共に一夜インキユペ
ートして該抗体をウェルに固定化した。溶液を除去し、
そしてウェルを空力乾燥して、使用するまで２〜８℃に
貯蔵した。１滴（約４０μｌ）のサンプル、及び標準的
方法により西洋ワサビパーオキシダーゼ酵素に接合した
抗−ＦｅＬＶ抗体の溶液１滴を各ウェルに加えた。５〜
１０分間のインキュベーションの後、蒸留水又は脱イオ
ン水により各ウェルを５回洗浄することにより、ウェル
に結合したサングルと酵素接合体との複合体を残したま
ま未結合の成分をすすぎ落とした。

２滴の単一容器基質か、又は２５％ジメチルホルムアミ
ドを含有する酢酸塩／クエン酸塩緩衝液（０，０９７Ｍ
酢酸塩及び０．０１３Ｍクエン酸、−４，９−５，１）
中０．２ダ／ｌの３．３’、５．５’−テトラメチルベ
ンジジンの溶液１滴と０．０５Ｍリン酸カリウム／クエ
ン酸塩緩衝液（ｐｉ４４．９〜５．１）中５．８　ｍＭ
尿素過酸化水素溶液１滴か、のいずれかを各ウェルに滴
加した。５〜１０分間のインキュベーションの後、各ウ
ェルの光学濃度を６３０　ｎｍにおいて読み取りた。

標単的二容器測定法に比べて単−容器配１合物ではＴＭ
Ｂ濃度が低くそして溶剤の濃度が高いため。

単一容器配合物によシ薄い色が生じ九が、次の表に示す
ように同じ結果が得られ九。

以下Ａτ白０Ｄ６５ｏでの読みブランク　　　　　　・・・・・・・・・　　　　０．
００２陽極対照　　　　　０．２５４　　　０．１４９
陰極対照　　　　　０．００１　　　０．００１標　　
準　　　　　　　０．１８１　　　　０．０８５３３　
　　　　　　０．０００　　　０．００２３４　　　　
　　　０．００３　　　０．００１４５　　　　　　　
０．７１１　　　０．２８２５０　　　　　　　０．０
０１　　　０．００１５１　　　　　　　　ｏ、ｏｏｏ
　　　　ｏ、ｏｏ。

５５　　　　　　　０．００１　　　０．００１５５　
　　　　　　０．００Ｂ　　　　０．００６５７　　　
　　　　０．００２　　　０．００３５　Ｂ　　　　　
　　　Ｏ，００６０，００５７Ｑ　　　　　　　　Ｏ，
００１０，００２７１０，００４０，００３７３０，００５０，００４表に示されるように、二容器基買及び単一容器基質のい
ずれを用いても、各サンプルはＦｅＬＶの存在について
、同一の結果を与えた。

二容器基質の成分の１滴は単一容器基質の２滴より大容
量であったが、別の実験によれば、容量の増加は結果に
変化を与えなかりた。

以上、本発明を具体的に説明したが、本発明の範囲内で
多くの変更を行うことができよう。

Claims

【特許請求の範囲】１、パーオキシダーゼ酵素のために有用な、ｐＨ範囲等
５．２〜６．０の貯蔵安定性水性基質溶液であって、（ａ）酢酸塩とクエン酸（塩）の比率が約３５：１〜約
４０：１であり、そして前記溶液中の酢酸塩濃度が約０
．０１〜約１．０Ｎである水性酢酸塩／クエン酸（塩）
緩衝液；（ｂ）約０．０４ｍＭ以上の濃度のテトラメチルベンジ
ジン；（ｃ）パーオキシダーゼにより触媒される反応の結果と
してテトラメチルベンジジンと共に色の変化を生じさせ
るのに十分な濃度の安定な過酸化水素源；及び（ｄ）約１０％〜約５０％（Ｖ／Ｖ）の量のメタノール
：を単一容器中に含んで成る基質溶液。２、前記酢酸塩濃度が０．０１〜０．２Ｎであり、クエ
ン酸（塩）濃度が０．０００２〜０．０４Ｎであり、そ
して前記ｐＨが５．４〜５．８の範囲にある、請求項１
に記載の基質溶液。３、合計緩衝剤モル濃度が約０．１Ｍである、請求項２
に記載の基質溶液。４、前記酢酸塩濃度が約０．１Ｎであり、クエン酸（塩
）濃度が約０．００２Ｎであり、そして前記ｐＨが約５
．６である請求項３に記載の基質溶液。５、前記テトラメチルベンジジン濃度が約０．２〜約０
．８ｍＭである、請求項１に記載の基質溶液。６、前記テトラメチルベンジジン濃度が約０．４ｍＭで
ある、請求項５に記載の基質溶液。７、メタノールが約３０％〜約５０％（Ｖ／Ｖ）存在す
る、請求項１に記載の基質溶液。８、メタノールが約４０％（Ｖ／Ｖ）で存在する、請求
項７に記載の基質溶液。９、前記安定な過酸化水素源が尿素過酸化水素である、
請求項１に記載の基質溶液。１０、尿素過酸化水素が約０．００２〜０．００５Ｍの
濃度で存在する、請求項９に記載の基質溶液。１１、有効量の細菌増殖阻害剤をさらに含んで成る、請
求項１に記載の基質溶液。１２、前記細菌増殖阻害剤が安息香酸ナトリウムである
、請求項１１に記載の基質溶液。１３、媒体中のパーオキシダーゼの濃度の測定方法であ
って、（１）西洋ワサビパーオキシダーゼを含む媒体を、ｐＨ
約５．２〜６．０のパーオキシダーゼ用水性基質溶液と
混合し、ここで該基質溶液は（ａ）酢酸塩とクエン（酸）塩の比率が約３５：１〜約
４０：１であり、そして前記溶液中の酢酸塩濃度が約０
．０１〜約１．０Ｎである水性酢酸塩／クエン酸（塩）
緩衝液；（ｂ）約０．０４ｍＭ以上の濃度テトラメチルベンジジ
ン；（ｃ）パーオキシダーゼにより触媒される反応の結果と
してテトラメチルベンジジンと共に色の変化を生じさせ
るのに十分な濃度の安定な過酸化水素源；及び（ｄ）約１０％〜約５０％（Ｖ／Ｖ）の量のメタノール
；を単一容器中に含んで成り；そして、（２）テトラメチルベンジジンの反応の結果としての色
の変化を検出する；ことを含んで成る方法。１４、臨床測定を行うためのキットであって、リガンド
又はリセプターと西洋ワサビパーオキシダーゼとの接合
体；及びｐＨ約５．２〜６．０のパーオキシダーゼ用水
性基質溶液を含んで成り、該基質溶液が、（ａ）酢酸塩とクエン酸（塩）の比率が約３５：１〜約
４０：１であり、そして前記溶液中の酢酸塩濃度が約０
．０１〜約１．０Ｎである水性酢酸塩／クエン酸（塩）
緩衝液；（ｂ）約０．０４ｍＭ以上の濃度のテトラメチルベンジ
ジン；（ｃ）パーオキシダーゼにより触媒される反応の結果と
してテトラメチルベンジジンと共に色の変化を生じさせ
るのに十分な濃度の安定な過酸化水素源；及び（ｄ）約１０％〜約５０％（Ｖ／Ｖ）の量のメタノール
；を単一容器中に含んで成る、ことを特徴とするキット。