JPS6329224B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は生物活性物質の特異的な相互作用を利
用した測定試薬、とくに血清学的診断に有用な測
定試薬に関するものである。従来、血清学的検査
法として用いられている間接赤血球凝集反応なら
びに間接赤血球凝集阻止反応は鋭敏であり、且つ
比較的簡易な方法であるので広範に使用されてい
る。しかし、担体として用いる動物由来の赤血球
は粒子サイズが均一である点で担体として優れて
いるが、それ自身抗原性を有するので、ヒト血清
などとの間に非特易的な反応を生じ易く、場合に
よつては非特異抗原を吸収する必要がある。又、
保存時不安定であつて変性を起したり、自己凝集
を起すなどの欠陥がある。一方、担体として種々
の合成高分子微粒子が開発されて用いられている
が、凍結に耐えないなど保存安定性や自己凝集性
や特異性ならびに凝集像の明確さの点で必ずしも
充分満足できない。 本発明者らはこれらの欠点を除くために抗原性
がなく、安定な担体について研究を重ね、無機化
合物ならびにこれと相互作用を有する鞣剤の化合
物例えばタンニン鞣剤に着目して種々検討を重ね
た結果、各種の無機化合物（とくに無機水酸化
物）の微粒子を、収歛性を有するタンニンなどの
鞣剤で処理した後、生物活性物質で感作すること
によつて自己凝集性がなく、明確な凝集像の得ら
れる優れた血清学的診断用の測定試薬が得られる
ことを見出し本発明を完成した。 さらに従来の担体による試薬においては自己凝
集が起るなどによつて凍結あるいは凍結乾燥によ
る保存が不可能であつたが、本発明による方法に
よつて凍結あるいは凍結乾燥が可能となり、凍結
によつて日常測定作業上、試薬保存を安全にする
と共に、凍結乾燥によつて試薬の保存や運搬上、
著しく安全で便利な粉末状測定試薬を得ることが
できた。 即ち、本発明は微粒子担体として、一般の凝集
反応用には0.1μｍ〜10μｍの粒子ナイズをもつ各
種無機水酸化合物の微粒子をタンニンなどの鞣剤
による処理を行つて使用用することを特徴とする
が、感作する生物活性物質の種類や凝集反応を行
わせる免疫測定法の方法によつて選択するのが望
ましい。又、大粒子を必要とするような測定法の
場合には10μｍ以上数100μｍの粒子も用いること
ができる。各種無機化合物のうち無機水酸化物が
好適であり、カルシウム、亜鉛、アルミニウム、
カドミウム、クロム、コバルト、ストロンチウ
ム、鉄、銅、ニツケル、バリウム、ビスマス、マ
グネシウム、カドミウムなどの水酸化物または塩
ならびにそれらの錯塩、およびアパタイトなどの
天然鉱物物質などで、水性溶媒に不溶性か難溶性
あるいは各種鞣剤との相互作用によつて不溶化さ
れるものが用いられる。（以下、無機水酸化物と
称す。） さらに本発明者らは所期の目的を効果的に達成
するために検討を重ねた結果、上記の担体を収歛
性が強く、石灰、鉛などの各種金属塩を相互作用
することが知られている各種タンニン剤、合成鞣
剤などの活性化剤で処理することによつて、抗原
抗体反応の特異性を向上させることが可能とな
り、同時に抗原や抗体などの生物活性物質の感作
を効果的に調整することができた。即ち、上記の
各種無機水酸化物の微粒子担体を各種鞣剤の水性
溶液で処理した後、生物活性物質で感作すること
により、鋭敏で、特異性の高い測定試薬が得ら
れ、優れた凝集反応の成績を得た。 本発明て用いる活性化剤は植物性鞣剤ちそて知
られている縮合型タンニンに属するもの（ワツト
ル、ケプラチヨーなど）ならびに加水分解型タン
ニンに属するもの（ミラボラン、チエスナツトな
ど）が含まれ、合成鞣剤としてはフエノール系、
ナフタレン系、ナフタレン−フエノール系、ナフ
トール系、ナフトール−フエノール系、スルホン
酸系、芳香族スルホン酸系、カルボン酸系、重合
カルボン酸系、各種錯塩、ホルマリン系、リグニ
ンフエノール、リグニンナフトールおよび、フエ
ノールとクロム塩、芳香族スルホン酸および芳香
族オキシ化合物とホルマリの集合体の如き、上記
の各種混合体、各種錯塩、複合物、縮合体などが
用いられ、アクリリツクレジンなどのレジン鞣剤
（カルバミン酸誘導体、ビニル化合物、フエノー
ル類、脂肪族化合物、アルデヒドおよびキノン類
などの重合物又は縮合による樹脂化物）や水溶性
カルボジイミド、トリレンジイソシアネート、ジ
フルオロジニトロベンゼン、マレインイミド、イ
ミドエステル、メチロールメラミン、ベンチジン
やアルデヒド化合物が含まれる。 尚、本発明においては生物活性物質として間接
凝集反応、間接凝集阻止反応の試験に供される各
種の抗原、抗体、その他の活性物質などのいずれ
も用いることができる。例えばヒト・γ−グロブ
リン、ヒト血清アルブミン、ヒトフイブリノーゲ
ン、ヒト縅毛性ゴナドトロピン、エストリオール
−16−グルクロナイド、HPL、妊娠性蛋白S_p1、
TP抗原、脂質抗原、核蛋白、サイログロブリン、
HB抗原、インスリン、グルカゴン、ヒアルロニ
ダーゼ、や各種毒素、ヒト以外の各種動物の血清
蛋白質などや抗Ｃ反応性蛋白抗体、抗ストレピト
リジンＯ抗体、抗エストリオール抗体、抗リポプ
ロテイン抗体、抗ヒトアルブミン抗体、その他各
種血清蛋白質に対する抗体、各種活性物質に対す
る抗体、各種微生物やヴイルスに対する抗体など
である。 平均粒子サイズ0.1μｍ〜10μｍに調製した無機
水酸化物の微粒子担体を緩衝液−例えば食塩を含
む燐酸緩衝液、PH7.2（以下PBSと称す）−懸濁し、
遠心分離により洗滌する。次いで、適当量、例え
ば50倍容の上記活性化剤の0.02％〜１％を含む緩
衝液中に入れて、室温下で１時間処理する。その
後遠心分離して得た沈澱を緩衝液で充分洗滌す
る。次にあらかじめ検討して決めた適当濃度の生
物活性物質（例えば前記の抗原物質あるいは抗
体）を含む適量の例えば10倍容の緩衝液中で37℃
下、１時間処理した後、一夜４℃下で静置する
等、一定時間生物活性物質を感作する。その後遠
心分離して沈澱物を緩衝液に再懸濁して数回洗滌
した後、0.02％〜１％程度の濃度になるように緩
衝液に懸濁しして測定試薬を製造する。 尚、上記の各種処理条件は活性化剤、微粒子担
体、または生物活性物質の種類および使用濃度に
応じて実験的に決定される。 凝集反応による測定は被検血清を非働化した
後、稀釈せずにそのまま本試薬と直接反応させ
た。 上記で得られた試薬は概して低温下（４℃付
近）では長期間、目的の抗原抗体反応による被凝
集力は低下せず、非特異凝集を生ぜず長期間適確
な測定が可能であるが、適当な安定化剤を添加す
ればより安全である。 さらに上記の測定試薬を適当な保護媒質の存在
下で凍結あるいは凍結乾燥を行うことができる。
即ち上記測定試薬を血清、血清アルブミン、ゼラ
チンなどの蛋白質、非イオン性界面活性剤、グル
タミン酸ソーダ、乳糖、アスパラギン酸、アスパ
ラギン、葡萄糖およびポリビニルピロリドンの如
き水溶性合成高分子物質の存在下で凍結あるいは
凍結乾燥することが凝集反応性を損うことなく可
能である。凍結乾燥を行つて得た粉末状測定試薬
を用いた実施例を次の第１表で示した。 尚、凝集の強さの判定結果は次の如く示した。 ＋＋…肉眼的に強い凝集状態 ＋…肉眼的に明瞭な凝集状態 ±…肉眼的に不明瞭な凝集状態 −…肉眼的に全く凝集を認めない状態

【表】 又、本発明の診断試薬は間接凝集反応（所謂逆
受身凝集反応も含む）あるいは間接凝集阻止反応
に用いられているスライドグラス板法、マイクロ
プレート法、試験管沈降法など各種の方式の測定
法に供することが可能で、担体材料、活性化法な
らびに感作法を選択して適当条件を設定すること
により、それぞれの免疫反応に適合した測定試薬
を凍結あるいは凍結乾燥することのできる安定し
た形で製造することが出来る。 本発明の測定試薬と市販の合成高分子ラテツク
ス試薬を用いて被検血清32例についてスライドグ
ラス板凝集法でリウマチ因子を測定し比較した結
果を第２表に示した。 その結果は両試薬が概ねよく一致した成績を得
た。さらに、リウマチ因子陰性血清検体の例数を
増して凝集反応を試みたが偽陽性（false
positive）は認められなかつた。又、市販の合成
高分子ラテツクス試薬に比較して本試薬は蔭蔽力
が高く凝集像がより鮮明でワーラー、ローズ法に
よつて求めた凝集価を反映して、凝集価によく対
応した凝集状態を示し、明確に判定できた。

【表】 実施例 １ 磨砕乳化処理によつて調製したハイドロキシア
パタイトの微粒子担体（粒子サイズ0.8μ）の４％
のPBS懸濁液をタンニン鞣剤チエスナツトの0.1
％PBS溶液20倍量で20℃下１時間振盪し活性化
処理を行つた後、遠心分離した、沈澱にPBSを
加えて洗滌し、再び遠心分離、洗滌することを３
回行つた。次いで得られた沈澱をヒトγ−グロブ
リンの1750μｇ／mlの濃度のPBS溶液２倍量中に
懸濁して37℃１時間振盪した後、一夜４℃下に静
置してヒトγ−グロブリンで感作する。遠心分離
して過剰のヒトγ−グロブリンを除き、沈澱物を
PBSで２回洗滌した後、濃度４％になるように
PBSに懸濁することによつて測定試薬を製造し
た。本試薬はスライドグラス上で同量の稀釈して
いない被検血清と直接混和して凝集の有無を判定
する、判定結果は実験例に示したと同様で、合成
高分子ラテツクス試薬よりも蔭蔽力が強く、より
鮮明な凝集像が得られ、明確に判定することが可
能となり適切な結果が得られた。また４℃下で12
ケ月間保存後も同様の成績が得られた。 実施例 ２ 実施例１によつて製造した測定試薬と磨砕乳化
処理によつて調製したハイドロキシアパタイトの
微粒子担体（粒子サイズ0.8μ）の４％PBS懸濁液
を遠心分離して得た沈澱に活性化処理を行わずに
ヒトγ−グロブリンで感作して製造した試薬を比
較するために、被検血清40例について実施例１と
同様にスライドグラス板凝集法でリウマチ因子を
測定した結果を第３表に示した。両試薬を比較す
るとタンニン鞣剤による活性化処理を行つた試薬
は蔭蔽力が強く凝集像が鮮明であつて凝集価に対
応した凝集状態を示し、明確に判定できるのに対
して、活性化を行わない試薬（実施例２）では自
己凝集の傾向があり低凝集化の被検血清で判定が
難しく偽陽性（false positive）の判定を与える
例が認められた。さらにリウマチ因子陰性検体の
例数を増して凝凝集反応を試みたが、活性化した
試薬では偽陽性は認められないが、活性化処理を
しない試薬では偽陽性が認められた。尚、その他
の無機物の微粒子に活性化処理を行わずに製造し
て測定した場合にも同様な結果であつた。

【表】 実施例 ３ 磨砕乳化処理によつて調製したカルシウム水酸
化物の微粒子担体（粒子サイズ0.8μ）を燐酸を用
いてPH7.2に調節し、４％PBS懸濁液を調製する。
以下実施例１の方法に従つてヒトγ−グロブリン
で感作したリウマチ因子測定試薬を製造した。こ
の試薬を用いて被検血清と直接凝集反応を行つた
ところ、良好適切な結果を得た。 実施例 ４ 磨砕乳化処理によつて調製したアルミニウム水
酸化物の微粒子担体（粒子サイズ0.8μ）を４％に
なるようにPBSに懸濁し、この懸濁液にタンニ
ン酸の0.1％PBS溶液20倍量を加え、20℃下１時
間振盪し活性化処理を行つた。遠心分離によつて
得た沈澱とPBSで洗滌し、再度遠心分離し洗滌
することを３回行つた。次いでこの沈澱をヒトγ
−グロブリンの1750μｇ／ml濃度のPBS溶液２倍
量中に懸濁して37℃、１時間振盪してヒトγ−グ
ロブリンを感作する。遠心分離して余剰のγ−グ
ロブリンを除いた後沈澱物をPBSで２回洗滌し
た後、４％になるようにPBSに再懸濁すること
によつてリウマチ因子測定試薬を製造した。本試
薬はスライドガラス上で同量の稀釈してない被検
血清と直接混和して凝凝集の有無を判定する。本
試薬は明確で適切な判定結果を与えた。 実施例 ５ 磨砕乳化処理によつて調製したクロム水酸化物
の微粒子担体（粒子サイズ0.8μ）を用いて実施例
４と同様な工程でヒトγ−グロブリンで感作し
て、リウマチ因子測定試薬を製造した。本試薬を
用いて被検血清と直接凝集反応を行つた結果、、
明確且つ適切な成績が得られた。 実施例 ６ 乳化処理を施して調製したバリウム水酸化物の
微粒子担体（粒子サイズ0.6μ）を燐酸を用いてPH
7.2に調整して4.5％PBS懸濁液を調製する。以下
実施例１の方法に従つてヒトγ−グロブリンで感
作してリウマチ因子測定試薬を製造した。本試薬
による被検血清との凝集反応成績は適切であつ
た。 実施例 ７ 実施例１の方法によつて製造した測定試薬を遠
心分離して得た沈澱を牛血清アルブミンのPBS
溶液あるいは乳糖のPBS溶液に懸濁し、−80℃の
冷媒中で凍結せしめ、−80℃のトラツプをもつ凍
結乾燥装置で真空度10^-5mmHgの条件で凍結乾燥
を行つて、乾燥状態の測定試薬を製造した。保存
後蒸留水で複元しても自己凝集は認められず被検
血清との凝集反応を行つた結果、実施例１に示し
た結果と差異は認められなかつた。 実施例 ８ 実施例１の方法に準じて製造れた測定試薬を遠
心分離して得た沈澱を牛血清アルブミンのPBS
溶液あるいは乳糖のPBS溶液に懸濁液し、−80℃
の冷媒中で凍結せしめ、−20℃下で凍結保存した。
保存後融解した後も自己凝集は認められず、被検
血清との凝集反応を行つた結果、凍結しない測定
試薬での判定成績と同様に適切明確な結果が得ら
れた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 0.1〜10μｍの粒子径を有する無機水酸化化合
   物微粒子に鞣剤処理を施した微粒子を生物活性物
   質で感作してなる血清学的測定試薬。 ２ 前記無機水酸化物が水性媒体に不溶性または
   難溶性であり、カルシウム、亜鉛、アルミニウ
   ム、カドミウム、クロム、コバルト、ストロンチ
   ウム、鉄、銅、ニツケル、バリウム、ビスマス、
   マグネシウム、カドミウムの水酸化物、並びにそ
   の錯塩、または水酸基を有する天然鉱物物質から
   選択され、前記鞣剤が植物性鞣剤、合成鞣剤、ま
   たはレジン鞣剤から選択されることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の血清学的測定試薬。 ３ 前記鞣剤がタンニン鞣剤であることを特徴と
   する特許請求の範囲第２項記載の血清学的測定試
   薬。 ４ 生物活性物質が抗原であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の血清学的測定試薬。 ５ 生物活性物質が抗体であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の血清学的測定試薬。 ６ 剤形が微粒子懸濁液であることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の血清学的測定試薬。 ７ 剤形が凍結乾燥された粉末であることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の血清学的測定
   試薬。