JPS6158587A - α−Ｌ−フコシダ−ゼおよびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な酵素であるα−Ｌ−フコシダーゼ（以下
本発明酵素と略すこともある）ならびにその製造方法曇
こ関する。

近年、細胞膜表面（こ存在している複合糖質の生理的役
割の重要性が認識され、複合糖質の糖鎖の構造解析１帖
合様式の決定に基質特異性の異なる各種のグリコシダー
ゼが広く利用されている。このうちフコース残基の分解
酵素としては主に構造研究に３６ける重要性からα−Ｌ
−フコシダーゼについてよく研究がｔテなわれている。

ａ−Ｌ−フコシダーゼはｆ４１１　＋’１４　、　　カ
ビ、植物、軟体動物、哺乳類等広く存在している。しか
しながら、微生物勘よび植物由来の酵素は厳密な基質特
異性を有している反ｔＬ　ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ
−フコシドのような人工の基質に作用しないために酵系
活性を簡便に測定できない欠点を有している。一方動物
由来の酵素の場合上述の欠点は見られないが、材料の入
手等に問題があり、多量の酵素を簡便。

安価に調製することは困難である。本発明者らは糖鎖構
造の解析などの研究に容易に利用しうるａ−Ｌ−フコシ
ダーゼを提供すべく鋭意研究を重ねた結果、自然界より
新たに分離されたα−Ｌ−フコシダーゼ生産菌の培養物
より単一の酵素蛋白質としてａ−Ｌ−フコシダーゼを得
ることに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、ｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−７コ
シドの如き人目基質や胃ムチン、ルイス式血液型物質、
ヒト赤血球などの天然基質番二作用してフコース残基を
加水分解するα−Ｌ−フコシダーゼを提供するものであ
る。さらをこ、本発明はフザリウム属に属し、前記のａ
　−Ｌ−フコシダーゼ生産能を有する鑓生物を培養し、
培ｔｌ物よりα−Ｌ−フコシダーゼを採取することを特
徴とするα−Ｌ−フコシダーゼの製造方法をも提供する
ものである。

本発明酵素は、従来微生物由来の酵素では基質とならな
かったｐ−ニトロフェニル−ａ−Ｌ−フコシドに作用す
る一方、胃ムチンやルイス式血液型物質、ヒト赤血球な
どに含まれるフコース残基にも作用するなど広い基質特
異性を有しており、複合糖質糖鎖をはじめとする各種の
糖含有化合物中のフコース含量の分析に利用できる利点
がある。

また、本発明酵素は菌体外に分泌される誘導酵素である
ため、容易にかつ多量の酵素蛋白を得ることができ、し
かも極めて簡単をこ単一の酵素蛋白標品として精製する
ことができるため糖鎖構造研究用の分析試薬として大は
、かつ安価な供給が可能である。

以下、本発明を更に詳細に説明する。後に示す実施例の
方法で装造したα−Ｌ−フコシダーゼの酵素学的および
理化学的性質は下記のとおりである。

（１）作　用 本発明酵素は、α−帖粘合ているフコース残基のａ−粘
合を特異的に加水分解する。

（２）基質特異性 種々のｐ−ニトロフェニル−グリコシドに対して本発明
酵素を作用させた結果を第１表に示した。

第１表 以上のとおり本発明酵素はｐ−ニトロフェニＩレーα−
Ｌ−フコシド以外のｐ−ニトロフェニル−グリコシドに
対し°〔は実質的には全く活性を示さない。

一方、本発明酵素はｐ−ニトロフェニル−ａ−Ｌ−フコ
シド以外に胃ムチン、ルイス式血液型物質、ヒト赤証球
などに含まれるフコース残基を加水分解する。このこと
は、本発明酵素がαｌ→２粘合、およびαｌ→４結合の
再結合４−ｆｉ式のフコース残基を加水分解することを
示しており、従って本発明酵素は従来の微生物由来のα
−Ｌ−フコシダーゼとは異なった全く新しいタイプのα
−Ｌ−フコシダーゼである。

なお、本発明酵素のｐ−ニトロフェニル−ａ　−Ｌ−フ
コシドに対するＫｍ値は８．７Ｘ１０Ｍである。

（８）　　力価の測定法 酵素活性の測定はｐ−ニトロフェニル−ａ−Ｌ−フコシ
ドを基質とし、ｐＨ４，５のクエン酸緩衝液中、８７“
Ｃで２０分間反応を行ない、ホウ酸緩衝液（ｐｆ−Ｉ９
．８）を加えて反応を停止させた後、遊離のｐ−二トロ
フェノールの量を４ＱＱｙｂｍの吸光度をａｌｌｌ定す
ること（こ上り行なった。酵素活性の単位は１分間（こ
１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離する酵素量を
１ユニツトとした。

ブタ胃ムナンを基質とした場合は、ｐＨ４，５のクエン
酸緩衝液中３７℃で８時間反応を行ない、は、ｌｉ４．
ｆｉのクエン酸緩衝液中８７℃で３時間反応を行ない、
抗Ｌｅ唾清とＬｅ　血球との凝集反応の抑制効果の減少
（こより酵素活性を確認した。

ヒト赤゛血球を基質とした場合は、０型赤血球の２％生
理食塩水溶ｉｌｌ　ｋ二本発明酵素を８７℃で３時間作
用さき、ユ〜レックス・レクチンとの凝集能の減少から
酵素の作用を雁認した。

（４）　至１ＶＩＰ　Ｈおよび安定ｐＨ範囲至適ｐＨは
第１図に示すとおりｐｆ″Ｉ４．．５〜５．５であり、
安定ｐｉ（は４℃、４８時間の処理条件の場合第２図に
承すとおりＩＪＨ４，５〜８．５であった。

なお第１因および第２図（こおいて使用した緩衝液をク
エン酸−１（ＣＪ　ｉ　、−ｏ、酸ｌ１Ｉ１２１．クエ
ン酸シ４．リンｒｄｉカリウム１ム、トリス−Ｈｃｆ　
ｌ−１−口で示した。

一〇− （５）　　温度會こよる失活の条件 ｐＨ７において２０℃〜６０℃の各温度において１０分
間保持した後、残存する酵素活性を測定活性を示した。

（６）　　精製方法 本発明酵素の精製は、塩析法、各種クロマトグラフ法等
を適宜に組合わせて行なうことができる。

精製の具体例は実施例に示すとおりである。

（７）　　分子量 本発明酵素の分子量はセファデックスＧ　−２００を用
いるグル濾過法をこより１２０，０００±５，０００と
測定された。

（８）　　ポリアクリルアミド電気泳動精製された本発
明酵素は、ポリアクリルアミド電気泳動において琳−の
バンドを示した。

次（二本発明酵素を微生匍の培養によって製造する方法
を具体的に示す。

本発明酵素の製造に使用される微生物はフザリウム（Ｆ
ｕｓａｒｉｕｍ　）属に属し、かつα−Ｌ−フコシダー
ゼを生産する能力を有するものであれば如何なるもので
もよい。このような微生物の具体例としては、本発明者
らにより芭蕉腐朽株下の土壌より分離されたフザリウム
・オキシスポラム５Ａ２５２株が挙げられる。この菌株
の菌学的性質を以下に記載する。

（１）　　各培地における生育状態 ■　麦芽汁寒天培地 その生育は不良。菌糸は薄く白色。菌糸裏面は赤紫色を
呈する。大分生子は組型が主であるが一部酵母型も見ら
れる。小分生子は偽萌子状ｔこ連鎖している。

■　オートミル軍人培地 生育は不良。菌糸はまばらで疎。菌糸裏面は白色で拡散
性色素は認めリセない。大分生子は細長い組型であり、
−カル分生子は酵母状胞子形であたかも偽菌糸のように
連鎖しているものが多く存在する。

■　グルコース寒天培地 グルコース１％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．５
％ｇ　！ＡＮ化ナトリウム０．５％、寒天２％を成分と
する培地では生育は非常に良く、白色で密な菌叢を形成
−ｒる。菌糸の裏面は白色で拡散性色素は認められない
。

（２）　　生理的′性質 生育ｐＦＴ範囲は４．０〜９．０であり、７．０〜８．
５が最適である。生育温度範囲は１５〜８７℃であり２
５〜８０℃が最適である。

以」−の諸性質よりこの菌株をフザリウム・オキシスポ
ラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｊ（ｙｓｐｏｒｕｍ　）と
同定し、微生物工業技術研究所に微工研菌寄第７７６２
号で寄託されている。

削記使用微生物の培養（こ用いる培地組成は通常の微生
物の培養Ｑこ用いられるようなものであればどのような
ものでもよい。炭素源としては、例えばグルコース、フ
コース、アラビノース、シュークロース、　”ＩＩＪ浴
性）殿粉、糖蜜、デキストリンなどの糖質、窒素源とし
ては、ペプトン、肉エキス。

酵母エキス、カザミノ酸、コーンステイープリカー、各
種アンモニウム塩、各種硝酸塩、尿素等が挙げられる。

７１１（機塩としては各種のナトリウム塩２カリウム塩
、カルシウム鹿、マンガン塩、マダイ、シウム塩、リン
酸塩、硝ｒ１β塩等の塩類が用いられ場合なこよっては
ビタミン類などを閑の生育を促進する目的で添υ１１し
Ｃｊ）よい。また、活性汚泥をアルカリおよび酸で〃１
１水分解して得られる汚泥抽出物を培地として利用する
こともでさる。本発明では炭素源としてフコースが適し
ており、また、活性汚泥のアルカリおよび酸抽出物の如
きフコース含４ず物も効果がある。培養は培地を通常の
方法で滅菌し、本発明の菌株を接種し、２０〜８０℃。

ＰＨ７，０で２〜８１１間振とうまたは通気攪拌により
好気的を１行なう。

本発明酵素は以Ｆのようにして採収することができる。

すなわち培養終Ｔ′後、濾過または遠心分離により菌体
を除いた培養１−、ｒｆｔ液に硫安等の無機塩を添　　
　□１１ＩＩして生じる塩析物上り分離する方法、前記
培養上澄液を限外が過（二より濃縮する方法がある。本
発明酵素はこれら塩析物あるいは濃縮物から常法（こよ
り４’＃製される。

ト発明酵素はまた炭素源としてフコースを含まない培准
で培俸１．た後、得られた菌体を集菌、洗１浄後フコー
スを含ｆ「培地に移すことによってよ６効果的（こｆ（
することがでさる。このようにして得られたα−Ｌ−フ
コシダーゼも」１記と同様に精製されろ。

以下、実施例にＬり本発明を更（こ詳細に説明するが、
以Ｆの実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではな
い。

実施例１ 活°１゛Ｌ汚泥（水分含駄約８５％）に等量の０．６Ｎ
−ＮａＯＨを加え、１２０℃、３０分間加熱抽出した後
、遠心分１’ｉ！ＩＪにより得られた上清を流水で透析
後凍結乾燥した。このものを０．８Ｎ−１（ｃｌで１２
０℃′。

８０分間加熱処理した後ＮａＯＨで中和したもメ１５ｍ
１を試験管に分注し、１２０°Ｃ，１５分間加圧滅１肖
した培地にフザリウム・オキシスポラムＳＡ　２５２（
微工研菌寄第７１１２号）の菌株を接種し、２８℃。

２日間振とう培養した。遠心により得た培養が液Ｇこ硫
安を７５％飽和まで加え生成した沈澱を０．旧Ｍ　＋）
ン酸緩箭液（ｐｉ（７，ｏ　）に溶解し１同緩衝液で一
夜透析した。この透析内液を同、ｌＩｌ衝液で予め平１
斬化したＤＷＡト：−セファデックスＡ−５００カラム
（１，６Ｘ　５　（Ｉｃ、ｖｌ）に通【７、吸着した酵
ヘヲ０６８ＭのＮａＣｌを含ｆｒ同緩衝液を用いＣ溶出
した。

活性画分を集め硫安を８０％飽Ａ１１（こなるように加
えた。生成した沈澱を帆００１Ｍリン酸＄１　ｔ＃ｎｆ
ｔ　（ｐＨ７，０）に溶ｌイし、同縁１ｄｆｉ７反で一
夜透析した。この透析内液を同縁１釘ｔ１シｃ）Ｖ−１
４ｊ化したハイドロ午ジルアパタイトカラム（２，３Ｘ
　ｌ　３Ｃｍ）に通し、吸着した酵素をリン酸綬衝液（
ｐＨ７，ｏ　）　ｔ’５ｏｏｌ〜ＯＪ］５　Ｍのリニア
グラジェント法で溶出した。溶出された活性両分を集め
硫安を８０％飽和をこなるように添加し、生成した沈殿
を０．０１ＭＩＪン酸緩衝ｍ（ｐＨ７，０）に溶解した
。この溶液を予め同緩衝液で平衡化したセファデックス
Ｇ　−１５０カラム（１，２Ｘ１０５ｃｍ、ｌを用い°
〔ゲル鋸屑を行なった。活性両分を東め°Ｃ硫安を８（
）じ茗飽和Ｇこなるように加え、生成した沈澱を０．０
５Ｍ’Ｊン酸緩衝液（ｐＨ’７．０　）に溶解し、同緩
衝液にて一夜透析した。この透析内液を予め同緩衝液で
平衡化したコンカナバリンＡ−セファロース４Ｂカラム
（０，５Ｘ　１０ｃｍ）４こ通し、吸着した酵素をα−
メチル−マンノシドθ〜０．５Ｍのリニアグラジェント
法で溶出した。活性画分を集めて濃縮し、α−Ｌ−フコ
シダーゼの積装標品８００μｇ　　（比活性２．５８　
Ｕ／ｍｇ蛋白、収率１９．９％）を得た。

実施例２ フコース０．２％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．
５％、塩化ナトリウム０．５％を含む培地１００ｍ／を
容１ｔ５００１Ｌ／の振とうフラスコに分注し１２０℃
。

１５分間加圧滅菌した後、同じ組成の培地で前培養した
フザリウム・オキシスポラムＳ　Ａ　２５２の菌株を５
ｍ７？　　接種し２８℃、２日間振とう培養した。

培養終了後が過により菌体を除き培養が液を得た。

このものから実施例１と同様にしてα−Ｌ−フコシダー
ゼの積装標品ｇ、１ｍｇ（比活性９．８６　ＵＡｎｇ蛋
白、収率２８，６％）を得た。

実施例３ グルコース２％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．５
％、塩化ナトリウム０．５％を含む培地１００ｍｔ’を
容置５００ｍ／の振とうフラスコをこ分注し１２０’Ｃ
。

１５分間加圧滅菌した後、同じ組成の培地で前培養した
フザリウム・オキシスポラムＳ　Ａ　２５２の菌株を５
ｍｌ接柚Ｌ１２８℃、２日間振とう培養した。培養終了
後が過により菌体を集菌し、生理食塩水でよく洗浄した
イ麦、培養液と等容の０．２％フコースを含０’　５（
ｌ　ｍＭ　トリス−Ｉ４ｃｅ＃Ａ南ｉ（’Ｌ　（ｐ　ｉ
ｆ　８．５　）瘉こ懸濁し、２８℃、２４時間振とうし
た。伽とっ終了後、濾過をこより菌体を除いたｌＪｉ液
を限外ｌ＋ｉ過膜（アミコンｆＬ製ＰＭ−ＩＱメツプラ
ン）を用いＡＥ−セファデックスＡ−’５（１のカラム
（２，２Ｘ１０ＣＩＤＪＧこ通し、吸着した酵素を０．
３　ＭのＮａＣｌを含む同緩衝液でｍ出した。活性画分
を東めＣ限外か過により濃縮し１α−Ｌ〜フコシダーゼ
の４ｎｎ製品１．１ｍｇ（比活性７２．５１Ｊ／／ｉｃ
ｇ蛋白、収率５５．８％）を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明酵素の作用ｐＨ範囲を示す。第２図は本
発明酵素の安定ｐＨ範囲を示す。 第１図、第２図においてビはクエン酸−［／−は酢酸、
−はクエン酸、Ｌ−はリン酸カリウム、口（はトリス−
Ｉ（Ｃ１の各緩衝液を示す。 第３図は本発明酵素の安定温度範囲を示す。 出願人　製鉄化学工業株式会ｉｔ 代表者　佐々木　　浩 ｆ’ＨｐＨ 彊ＬＡ’ｃ）

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）α−結合をしたフコース残基を有する人工基質な
   らびに天然基質に作用してフコース残基のα−結合を特
   異的に加水分解するα−Ｌ−フコシダーゼ。
2. （２）人工基質がｐ−ニトロフェニル−α−Ｌ−フコシ
   ドである特許請求の範囲（１）記載のα−Ｌフコシダー
   ゼ。
3. （３）天然基質がブタ胃ムチンである特許請求の範囲（
   １）記載のα−Ｌ−フコシダーゼ。
4. （４）天然基質がルイス式血液型物質である特許請求の
   範囲（１）記載のα−Ｌ−フコシダーゼ。
5. （５）天然基質がヒト赤血球である特許請求の範囲（１
   ）記載のα−Ｌ−フコシダーゼ。
6. （６）至適ｐＨがｐＨ４．５〜５．５である特許請求の
   範囲（１）記載のα−Ｌ−フコシダーゼ。
7. （７）４℃、４８時間の保持条件において安定ｐＨ範囲
   が４．５〜８．５である特許請求の範囲（１）記載のα
   −Ｌ−フコシダーゼ。
8. （８）ｐＨ７で１０分間処理した時６０℃以上で失活す
   る特許請求の範囲（１）記載のα−Ｌ−フコシダーゼ。
9. （９）ゲルろ過法により測定した分子量が１２０，００
   ０±５，０００である特許請求の範囲（１）記載のα−
   Ｌ−フコシダーゼ。
10. （１０）フザリウム属に属し、α−Ｌ−フコシダーゼを
    生産する能力を有する微生物を培養し、培養物よりα−
    Ｌ−フコシダーゼを採取することを特徴とするα−Ｌ−
    フコシダーゼの製造方法。
11. （１１）フザリウム属に属し、α−Ｌ−フコシダーゼを
    生産する能力を有する微生物を栄養培地で培養して菌体
    を増殖せしめ次いで当該菌体をフコースを含有する培地
    に移し、培地中にα−Ｌ−フコシダーゼを蓄積させるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲（１０）記載のα−Ｌ−
    フコシダーゼの製造方法。