JPS6332147B2 - - Google Patents
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- JPS6332147B2 JPS6332147B2 JP20986881A JP20986881A JPS6332147B2 JP S6332147 B2 JPS6332147 B2 JP S6332147B2 JP 20986881 A JP20986881 A JP 20986881A JP 20986881 A JP20986881 A JP 20986881A JP S6332147 B2 JPS6332147 B2 JP S6332147B2
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/548—Carbohydrates, e.g. dextran
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- G03C—PHOTOSENSITIVE MATERIALS FOR PHOTOGRAPHIC PURPOSES; PHOTOGRAPHIC PROCESSES, e.g. CINE, X-RAY, COLOUR, STEREO-PHOTOGRAPHIC PROCESSES; AUXILIARY PROCESSES IN PHOTOGRAPHY
- G03C1/00—Photosensitive materials
- G03C1/005—Silver halide emulsions; Preparation thereof; Physical treatment thereof; Incorporation of additives therein
- G03C1/04—Silver halide emulsions; Preparation thereof; Physical treatment thereof; Incorporation of additives therein with macromolecular additives; with layer-forming substances
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Description
本発明は抗原とか抗体の感作あるいは酵素の固
定などに広く利用しうる新規な人工担体の製造方
法の改良に関する。抗原、抗体反応を利用する臨
床検査等の分野において、抗原または抗体をある
適当な大きさの粒子を担体としてそれに吸着もし
くは結合させ、それぞれに対応する抗体または抗
原の存在によつてこの感作された担体の凝集を起
させる方法は間接受身凝集反応と呼ばれている。
そして、この間接受身凝集反応は被検液中の抗体
や抗原の高感度に検出できるので、いろいろの疾
患の血清学的診断や血液学的診断に広く用いられ
ている。 この反応に用いられる担体としては、ポリスチ
レンラテツクス、カオリン、炭末などの非生物学
的粒子と、動物赤血球、細菌菌体のような生物学
的粒子とがある。一般に非生物学的粒子の担体
は、化学的に安定で、それ自身抗原活性を有しな
いなどの利点はあるが、抗原あるいは抗体が密に
吸着されにくいという欠点がある。たとえば、保
存のために凍結乾燥すると抗原や抗体が担体から
遊離してしまうのである。そのために、やむなく
液体中で冷暗所に保存するという手段がとられて
いるが、その結果長期間保存することができな
い。また、非生物学的担体のうち、炭末とカオリ
ンは一定の大きさの粒子を選出することが困難で
あり、ポリスチレンラテツクスは反応の媒質とし
て望ましい中性域では非特異凝集である自然凝集
をおこす危険がある。 一方、生物学的担体である動物赤血球や細菌菌
体はそれぞれの大きさが一定であるという利点は
あるものの、生物の種類によつて粒子の大きさは
定まつており、目的に応じた任意の大きさの粒子
を得ることはできない。たとえば、動物赤血球は
大きさの一定した最も入手しやすい担体である
が、血球表面に固有の抗原を有しており、抗体と
の間で非特異凝集反応である交差反応を起こして
目的とする凝集反応に誤まりを与える可能性があ
る。さらに、赤血球の生物学的、化学的および物
理的特性値が動物の個体間でばらついてしまつて
常に一定品質の血球を入手することが難しいとい
う欠点がある。 本発明者らはこれらの欠点のないすぐれた担体
を開発すべく種々検討の結果、ゼラチン、水溶性
多糖類、およびポリメタリン酸ナトリウムを含
み、水とアルコール等の混合物を溶媒とする溶液
を撹拌下でPH調整することによつて粒子を析出さ
せ、この粒子をアルデヒド系架橋剤で処理して不
溶化すれば、従来の欠点を尽く解消したすぐれた
担体が得られることを見出し、この内容を既に特
許出願した（特開昭57―153658号）。この方法に
おいては生成した粒子の凝集を防止するためにPH
調整後に界面活性剤を添加していたが、本発明者
らはその後さらに研究を進めた結果、界面活性剤
をPH調整前に添加すれば担体の収量が大巾に増加
することを見出し、これに基いて本発明を完成す
るに到つた。すなわち本発明は、ゼラチン、水溶
性多糖類、ポリメタリン酸ナトリウム、親水性有
機溶媒、および水を含み、温度がゼラチンのゲル
化温度以上である溶液を、撹拌しつつ酸を加えて
PH2.5〜6.0に調整し、その後アルデヒド系架橋剤
を作用せしめて不溶化する人工担体の製造方法に
おいて、前記のPH調整を行なうまえに陰イオン系
または非イオン系の界面活性剤を前記溶液に含有
させておくことを特徴とする人工担体の製造方法
に関するものである。 本発明に使用するゼラチンは通常の市販品をそ
のまま用いればよい。市販品のなかでは酸性ゼラ
チンが好ましい。 水溶性多糖類は増粘剤または糊料として使用し
うるものであり、多糖類の誘導体および塩も含ま
れる。例としては、アラビアゴム、カルボキシメ
チルセルロース、アルギン酸ナトリウム、寒天、
カラゲーナンなどを挙げることができるが、特に
アラビアゴムが好適である。 ポリメタリン酸ナトリウムは化学的（NaPO3）
oで表わされる物質であり、たとえば四メタリン
酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムの如
きものである。 親水性有機溶媒としては、低級アルコール、た
とえばメチルアルコール、エチルアルコール、プ
ロピルアルコール等、およびアセトンなどを用い
ることができる。 そのほかのものとしては、担体を着色する場合
には、着色剤を粒子形成前に溶液に加えておくの
がよい。着色を必要とする例としては、本発明品
を間接受身凝集反応の担体として用いる場合を挙
げることができる。すなわち、本発明品は通常は
無色不透明であるところから、これを着色するこ
とによつて凝集像の判定を容易にすることができ
る。着色剤としては、たとえば食用赤色３号、ロ
ーダミン、ローズベンガル、ポンソー3R、ボル
ドーＳ、フクシン、エオシン、およびニユートラ
ルレツドなどの赤色色素、あるいはクリスタルバ
イオレツト、トルイジンブルーおよびメチレンブ
ルーなどの青色色素等を用いうる。しかしなが
ら、リアクテイブ・レツド、ダイレクト・ブルー
などの反応性染料で着色すれば色落ちしないこと
から、反応性染料が特に好適である。着色剤以外
にも目的に応じ種々の物質を添加してもよいこと
はいうまでもない。 PH調整前の溶液におけるこれら各物質の濃度と
しては、ゼラチン0.01〜２％程度、好ましくは
0.05〜1.0％程度、水溶性多糖類0.01〜２％程度、
好ましくは0.05〜1.0％程度、そして親水性有機
溶媒は４〜25容量％程度である、ポリメタリン酸
ナトリウムはゼラチン乾燥重量の0.5〜20％程度
を含有させるようにするのがよい。各物質はこれ
らの濃度範囲において、所望の粒子の粒径および
物性に応じて適宜定めればよい。着色剤を添加す
る場合には、通常は0.005〜0.5％程度であるが、
反応性染料を用いればゼラチン乾燥重量の１〜５
％程度で足りる。 本発明においては、このような溶液にPH調整前
にさらに陰イオン系または非イオン系の界面活性
剤を含有させるところに特徴がある。 陰イオン系界面活性剤の例としては、アルキル
スルホコハク酸、アルキルスルホマレイン酸、ア
ルキル硫酸エステル、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル硫酸エステルなど、そして非イオン系
界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレン脂
肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエー
テル、ポリオキシエチレンアルキルフエニルエー
テル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステルな
どを挙げることができる。界面活性剤は粒子の凝
集を防止する目的で添加するのであるが、陽イオ
ン系の界面活性剤では粒子の凝集を防止すること
ができないので本発明の対象外である。PH調整前
の溶液における濃度としては、陰イオン系界面活
性剤の場合は0.001〜0.01％程度、非イオン系界
面活性剤の場合は0.01〜0.1％程度で凝集防止効
果が得られる。溶液を冷却すればもつと低い濃度
で凝集を防止することができる。 このような溶液を調製する過程は問うところで
はなく、例えば各々を温水に溶解してから混合し
てもよく、各々を一緒に溶解してもよい。しかし
ながら、各物質の溶解を容易にするために親水性
有機溶媒はあとから加えるのがよく、また水溶性
多糖類には不溶成分も少量含まれていることが多
いところから、別途に溶解して添加するのがよ
い。一方、ゼラチンは等電点以下のPHでは水溶性
多糖類と反応して白濁を生ずるので酸性ゼラチン
を用いる場合にはアルカリを加えて溶液のPHを少
なくともその付近にまで高めておくのがよい。し
かしながら、この白濁は生じた後でもアルカリを
添加することによつて消すことができる。いずれ
にせよ、溶液は酸の添加を開始するまえには白濁
のない状態にしておかなければならない。 溶液の温度はゼラチンのゲル化温度以上でなけ
ればならない。この温度はゼラチンの濃度等によ
つて異なるが通例25〜30℃程度である。良好な粒
子形成の観点から特に35〜50℃程度がよい。 次に、この溶液を撹拌しながら酸を加えてPH
2.5〜6.0に調整する。この工程は粒子を生成させ
るところである。均一な粒子を形成させるため
に、35〜50℃に加温を続け、適度に撹拌しながら
酸を滴下していくのがよい。PH2.5〜6.0の範囲に
おける至適のPHは原料溶液の組成および目的とす
る粒径によつて異なるので予め実験を行なつて定
めるのがよい。たとえば得られた粒子を抗原感作
用担体に用いる場合には２〜10μ程度の粒径にす
るのがよく、その場合至適のPHは4.0〜5.5の範囲
にある。このPH調整に使用する酸は特に限定され
るものではなく無機酸でも有機酸でもよいが、な
るべくおだやかなものがよく、たとえば酢酸など
が好適である。 本工程で生成した粒子は系の温度をゼラチンの
ゲル化温度以下に下げても消失しないので母液と
の平衡関係はない。また、粒子はほとんどの場合
負に帯電しており、その表面には溶液中の陽イオ
ンが配向していていわゆる電気二重層を形成して
いる。そして、このことが粒子の安定な分散を促
しているのである。 酸の添加後は生成した粒子の凝集を防止するた
めに速かに粒子分散液を冷却するのがよい。そし
て、液温がゲル化温度以下になつたところでアル
デヒド系架橋剤を添加して粒子を不溶化する。こ
の架橋剤の添加量はゼラチン乾燥重量の0.1〜200
％程度であり、添加後は一夜程度放置して架橋反
応を充分に行なわせる。架橋剤の例としては、グ
ルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、グリオキ
ザール、クロトンアルデヒド、アクロレイン、ア
セトアルデヒドなどを挙げることができるが、特
にグルタルアルデヒドが好適である。 アルデヒド系架橋剤で処理後は粒子を遠心分離
等で回収して、必要により洗浄する。洗浄は粒子
分散のために用いた界面活性剤と同じものを同濃
度で含む水で２〜３回行なえばよい。 このようにして得られた担体を種々の用途に供
すればよいが、架橋が不充分な場合には塩類溶液
中で膨潤することがある。そこでこのような用途
に用いる場合にはアルデヒド系架橋剤で処理して
膨潤を防止するのがよい。例えば、抗原を感作す
る場合にはリン酸緩衝液中で行なうので、赤血球
を固定化する条件でホルマリン処理する。この処
理によつて膨潤を防止するとともにホルマリンの
殺菌効果によつて長期間の保存に耐える担体が得
られる。 本発明の担体は抗原、抗体、酵素などを巾広く
固定することができる。たとえば、抗原とか抗体
を感作する場合には動物赤血球を担体として行な
う常法に準じて行えばよい。 本発明の担体は間接受身凝集反応の担体として
従来最もすぐれているとされていた動物赤血球と
同等な性能を有し、さらに化学的、物理的に均質
かつ安定であり、抗原活性がなく任意の粒径のも
のを容易かつ安価に大量生産できるなど動物赤血
球にない幾多の利点を有するものである。そし
て、本発明は先願発明に比し、界面活性剤の添加
時期を変えることによつて担体の収率を大巾に高
めている。 以下、実施例及び担体の使用例を示す。なお、
本明細書において、％は特に記載がなければ重量
％を表わしている。 実施例 １ 等電点がPH９であるゼラチン４ｇを40℃の温水
に100mlになるように溶解し、10％の水酸化ナト
リウム溶液を用いてPH９に調整した。アラビアゴ
ム４ｇを100mlになるように水に溶解し、不溶物
を別した後40℃に加温した。 このようにして得られたゼラチン溶液50mlとア
ラビアゴム溶液50mlを混合し、この混合液をあら
かじめ40℃に加温した30容量％のメチルアルコー
ル溶液300mlに注ぎ入れ、よく撹拌した。これに
10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液1.6ml、１
％アルキルスルホマレイン酸（商品各デモール
Ep、花王石鹸(株)製品）、溶液２ml、および１％ダ
イレクトブルー溶液６mlを加えてよく撹拌した。 次いで、40℃に保ちながら10容量％の酢酸溶液
を滴下してPH4.8に調整し、粒子を生成させた。 このPH調整によつて得られた粒子分散液を氷冷
して５℃にしてからグルタールアルデヒド1.3ｇ
を加え、よく撹拌後この温度で一夜静置した。そ
れからこの粒子分散液を2000rpmで10分間遠心分
離して粒子をペレツトとして回収した。この粒子
を0.005％デモールEp溶液に懸濁して遠心分離す
る洗浄操作を３回繰返してから、４容量％ホルマ
リン溶液に分散し、５℃で１週間放置した。 本例で得られた担体粒子は7.7ｇであり、その
75％が３〜6μの範囲にあつた。 実施例 ２ 30容量％のメチルアルコール溶液のかわりに30
容量％のエチルアルコール溶液を、そして１％デ
モールEp溶液２mlのかわりに１容量％ポリオキ
シエチレンフエニルエーテル（エマルゲンＡ―
60、花王石鹸(株)登録商標）溶液８mlを用いたほか
は実施例１と同様にして担体粒子を調製した。但
し、酢酸を滴下して調製したPHは4.9であつた。
こうして得られた担体粒子は7.8ｇであり、その
70％が７〜11μの範囲にあつた。 実施例 ３ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、まずアラビアゴム４ｇのかわりにカ
ルボキシメチルセルロース１ｇを、そして30容量
％のメチルアルコール溶液のかわりに30容量％エ
チルアルコール溶液を用いた。それから、添加量
についても、ゼラチン10％ヘキサメタリン酸ナト
リウム溶液、１％デモールEp溶液、１％ダイレ
クトブルー溶液、およびグルタルアルデヒドをい
ずれも４分の１にした。また、PHも4.8から4.6に
した。 このようにして得られた担体粒子は3.8ｇであ
り、その90％が１〜2μの範囲にあつた。 実施例 ４ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、ゼラチン溶液を50mlから40mlにし、
アラビアゴム溶液を50mlから60mlに変えた。それ
から、10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液を
1.6mlから1.2mlに、１％ダイレクトブルー溶液を
６mlから4.8mlに、そしてグルタルアルデヒドを
1.3ｇから1.0ｇにそれぞれ変えた。また、酢酸滴
下終了PHを4.6とした。 本例で得られた担体粒子は6.4ｇであり、その
90％が１〜2μの範囲にあつた。 実施例 ５ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、ゼラチン溶液を50mlから60mlにしア
ラビアゴム溶液を50mlから40mlに変えた。それか
ら、10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液を1.6
mlから２mlに、１％ダイレクトブルー６mlから
7.2mlに、そしてグルタルアルデヒドを1.3ｇから
1.8ｇにそれぞれ変えた。また、酢酸滴下終了PH
を4.8とした。 本例で得られた担体粒子の収量は8.6ｇであり
得られた粒子の75％が３〜6μの範囲にあつた。 使用例 １ 実施例１で得られた担体粒子を、下表に示す濃
度のタンニン酸を含むPH7.2のリン酸塩緩衝生理
食塩水（以下、PBSと略記する。）中に粒子濃度
が2.5％になるように分散し、37℃で15分間加温
した。粒子を遠心分離して生理食塩水で充分洗浄
した。 梅毒病原体トレポネーマ・パリーダム（以下、
TPと略記する。）菌体をPH6.4のPBS中に浮遊さ
せ超音波で菌体を破壊してTP抗原液とした。 前記のタンニン酸処理粒子をPBSに５％の濃
度に分散し、この分散液を下表に示す倍数で希釈
したTP抗原液と等容づつ混合した。混合液を37
℃で40分間加温して、粒子にTP抗原を感作した。 TP抗原感作粒子を遠心分離してPH6.4のPBSで
充分洗浄し、分散用メデイウムに濃度が５％にな
るように分散した。 このようにして得られたTP抗原感作粒子分散
液を用い、マイクロプレート法で梅毒陽性血清と
反応させたところ下表に示す如き結果が得られ
た。なお、対照としてヒツジ赤血球を担体に用い
た場合の結果もあわせて下表に示す。
定などに広く利用しうる新規な人工担体の製造方
法の改良に関する。抗原、抗体反応を利用する臨
床検査等の分野において、抗原または抗体をある
適当な大きさの粒子を担体としてそれに吸着もし
くは結合させ、それぞれに対応する抗体または抗
原の存在によつてこの感作された担体の凝集を起
させる方法は間接受身凝集反応と呼ばれている。
そして、この間接受身凝集反応は被検液中の抗体
や抗原の高感度に検出できるので、いろいろの疾
患の血清学的診断や血液学的診断に広く用いられ
ている。 この反応に用いられる担体としては、ポリスチ
レンラテツクス、カオリン、炭末などの非生物学
的粒子と、動物赤血球、細菌菌体のような生物学
的粒子とがある。一般に非生物学的粒子の担体
は、化学的に安定で、それ自身抗原活性を有しな
いなどの利点はあるが、抗原あるいは抗体が密に
吸着されにくいという欠点がある。たとえば、保
存のために凍結乾燥すると抗原や抗体が担体から
遊離してしまうのである。そのために、やむなく
液体中で冷暗所に保存するという手段がとられて
いるが、その結果長期間保存することができな
い。また、非生物学的担体のうち、炭末とカオリ
ンは一定の大きさの粒子を選出することが困難で
あり、ポリスチレンラテツクスは反応の媒質とし
て望ましい中性域では非特異凝集である自然凝集
をおこす危険がある。 一方、生物学的担体である動物赤血球や細菌菌
体はそれぞれの大きさが一定であるという利点は
あるものの、生物の種類によつて粒子の大きさは
定まつており、目的に応じた任意の大きさの粒子
を得ることはできない。たとえば、動物赤血球は
大きさの一定した最も入手しやすい担体である
が、血球表面に固有の抗原を有しており、抗体と
の間で非特異凝集反応である交差反応を起こして
目的とする凝集反応に誤まりを与える可能性があ
る。さらに、赤血球の生物学的、化学的および物
理的特性値が動物の個体間でばらついてしまつて
常に一定品質の血球を入手することが難しいとい
う欠点がある。 本発明者らはこれらの欠点のないすぐれた担体
を開発すべく種々検討の結果、ゼラチン、水溶性
多糖類、およびポリメタリン酸ナトリウムを含
み、水とアルコール等の混合物を溶媒とする溶液
を撹拌下でPH調整することによつて粒子を析出さ
せ、この粒子をアルデヒド系架橋剤で処理して不
溶化すれば、従来の欠点を尽く解消したすぐれた
担体が得られることを見出し、この内容を既に特
許出願した（特開昭57―153658号）。この方法に
おいては生成した粒子の凝集を防止するためにPH
調整後に界面活性剤を添加していたが、本発明者
らはその後さらに研究を進めた結果、界面活性剤
をPH調整前に添加すれば担体の収量が大巾に増加
することを見出し、これに基いて本発明を完成す
るに到つた。すなわち本発明は、ゼラチン、水溶
性多糖類、ポリメタリン酸ナトリウム、親水性有
機溶媒、および水を含み、温度がゼラチンのゲル
化温度以上である溶液を、撹拌しつつ酸を加えて
PH2.5〜6.0に調整し、その後アルデヒド系架橋剤
を作用せしめて不溶化する人工担体の製造方法に
おいて、前記のPH調整を行なうまえに陰イオン系
または非イオン系の界面活性剤を前記溶液に含有
させておくことを特徴とする人工担体の製造方法
に関するものである。 本発明に使用するゼラチンは通常の市販品をそ
のまま用いればよい。市販品のなかでは酸性ゼラ
チンが好ましい。 水溶性多糖類は増粘剤または糊料として使用し
うるものであり、多糖類の誘導体および塩も含ま
れる。例としては、アラビアゴム、カルボキシメ
チルセルロース、アルギン酸ナトリウム、寒天、
カラゲーナンなどを挙げることができるが、特に
アラビアゴムが好適である。 ポリメタリン酸ナトリウムは化学的（NaPO3）
oで表わされる物質であり、たとえば四メタリン
酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムの如
きものである。 親水性有機溶媒としては、低級アルコール、た
とえばメチルアルコール、エチルアルコール、プ
ロピルアルコール等、およびアセトンなどを用い
ることができる。 そのほかのものとしては、担体を着色する場合
には、着色剤を粒子形成前に溶液に加えておくの
がよい。着色を必要とする例としては、本発明品
を間接受身凝集反応の担体として用いる場合を挙
げることができる。すなわち、本発明品は通常は
無色不透明であるところから、これを着色するこ
とによつて凝集像の判定を容易にすることができ
る。着色剤としては、たとえば食用赤色３号、ロ
ーダミン、ローズベンガル、ポンソー3R、ボル
ドーＳ、フクシン、エオシン、およびニユートラ
ルレツドなどの赤色色素、あるいはクリスタルバ
イオレツト、トルイジンブルーおよびメチレンブ
ルーなどの青色色素等を用いうる。しかしなが
ら、リアクテイブ・レツド、ダイレクト・ブルー
などの反応性染料で着色すれば色落ちしないこと
から、反応性染料が特に好適である。着色剤以外
にも目的に応じ種々の物質を添加してもよいこと
はいうまでもない。 PH調整前の溶液におけるこれら各物質の濃度と
しては、ゼラチン0.01〜２％程度、好ましくは
0.05〜1.0％程度、水溶性多糖類0.01〜２％程度、
好ましくは0.05〜1.0％程度、そして親水性有機
溶媒は４〜25容量％程度である、ポリメタリン酸
ナトリウムはゼラチン乾燥重量の0.5〜20％程度
を含有させるようにするのがよい。各物質はこれ
らの濃度範囲において、所望の粒子の粒径および
物性に応じて適宜定めればよい。着色剤を添加す
る場合には、通常は0.005〜0.5％程度であるが、
反応性染料を用いればゼラチン乾燥重量の１〜５
％程度で足りる。 本発明においては、このような溶液にPH調整前
にさらに陰イオン系または非イオン系の界面活性
剤を含有させるところに特徴がある。 陰イオン系界面活性剤の例としては、アルキル
スルホコハク酸、アルキルスルホマレイン酸、ア
ルキル硫酸エステル、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル硫酸エステルなど、そして非イオン系
界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレン脂
肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエー
テル、ポリオキシエチレンアルキルフエニルエー
テル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステルな
どを挙げることができる。界面活性剤は粒子の凝
集を防止する目的で添加するのであるが、陽イオ
ン系の界面活性剤では粒子の凝集を防止すること
ができないので本発明の対象外である。PH調整前
の溶液における濃度としては、陰イオン系界面活
性剤の場合は0.001〜0.01％程度、非イオン系界
面活性剤の場合は0.01〜0.1％程度で凝集防止効
果が得られる。溶液を冷却すればもつと低い濃度
で凝集を防止することができる。 このような溶液を調製する過程は問うところで
はなく、例えば各々を温水に溶解してから混合し
てもよく、各々を一緒に溶解してもよい。しかし
ながら、各物質の溶解を容易にするために親水性
有機溶媒はあとから加えるのがよく、また水溶性
多糖類には不溶成分も少量含まれていることが多
いところから、別途に溶解して添加するのがよ
い。一方、ゼラチンは等電点以下のPHでは水溶性
多糖類と反応して白濁を生ずるので酸性ゼラチン
を用いる場合にはアルカリを加えて溶液のPHを少
なくともその付近にまで高めておくのがよい。し
かしながら、この白濁は生じた後でもアルカリを
添加することによつて消すことができる。いずれ
にせよ、溶液は酸の添加を開始するまえには白濁
のない状態にしておかなければならない。 溶液の温度はゼラチンのゲル化温度以上でなけ
ればならない。この温度はゼラチンの濃度等によ
つて異なるが通例25〜30℃程度である。良好な粒
子形成の観点から特に35〜50℃程度がよい。 次に、この溶液を撹拌しながら酸を加えてPH
2.5〜6.0に調整する。この工程は粒子を生成させ
るところである。均一な粒子を形成させるため
に、35〜50℃に加温を続け、適度に撹拌しながら
酸を滴下していくのがよい。PH2.5〜6.0の範囲に
おける至適のPHは原料溶液の組成および目的とす
る粒径によつて異なるので予め実験を行なつて定
めるのがよい。たとえば得られた粒子を抗原感作
用担体に用いる場合には２〜10μ程度の粒径にす
るのがよく、その場合至適のPHは4.0〜5.5の範囲
にある。このPH調整に使用する酸は特に限定され
るものではなく無機酸でも有機酸でもよいが、な
るべくおだやかなものがよく、たとえば酢酸など
が好適である。 本工程で生成した粒子は系の温度をゼラチンの
ゲル化温度以下に下げても消失しないので母液と
の平衡関係はない。また、粒子はほとんどの場合
負に帯電しており、その表面には溶液中の陽イオ
ンが配向していていわゆる電気二重層を形成して
いる。そして、このことが粒子の安定な分散を促
しているのである。 酸の添加後は生成した粒子の凝集を防止するた
めに速かに粒子分散液を冷却するのがよい。そし
て、液温がゲル化温度以下になつたところでアル
デヒド系架橋剤を添加して粒子を不溶化する。こ
の架橋剤の添加量はゼラチン乾燥重量の0.1〜200
％程度であり、添加後は一夜程度放置して架橋反
応を充分に行なわせる。架橋剤の例としては、グ
ルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、グリオキ
ザール、クロトンアルデヒド、アクロレイン、ア
セトアルデヒドなどを挙げることができるが、特
にグルタルアルデヒドが好適である。 アルデヒド系架橋剤で処理後は粒子を遠心分離
等で回収して、必要により洗浄する。洗浄は粒子
分散のために用いた界面活性剤と同じものを同濃
度で含む水で２〜３回行なえばよい。 このようにして得られた担体を種々の用途に供
すればよいが、架橋が不充分な場合には塩類溶液
中で膨潤することがある。そこでこのような用途
に用いる場合にはアルデヒド系架橋剤で処理して
膨潤を防止するのがよい。例えば、抗原を感作す
る場合にはリン酸緩衝液中で行なうので、赤血球
を固定化する条件でホルマリン処理する。この処
理によつて膨潤を防止するとともにホルマリンの
殺菌効果によつて長期間の保存に耐える担体が得
られる。 本発明の担体は抗原、抗体、酵素などを巾広く
固定することができる。たとえば、抗原とか抗体
を感作する場合には動物赤血球を担体として行な
う常法に準じて行えばよい。 本発明の担体は間接受身凝集反応の担体として
従来最もすぐれているとされていた動物赤血球と
同等な性能を有し、さらに化学的、物理的に均質
かつ安定であり、抗原活性がなく任意の粒径のも
のを容易かつ安価に大量生産できるなど動物赤血
球にない幾多の利点を有するものである。そし
て、本発明は先願発明に比し、界面活性剤の添加
時期を変えることによつて担体の収率を大巾に高
めている。 以下、実施例及び担体の使用例を示す。なお、
本明細書において、％は特に記載がなければ重量
％を表わしている。 実施例 １ 等電点がPH９であるゼラチン４ｇを40℃の温水
に100mlになるように溶解し、10％の水酸化ナト
リウム溶液を用いてPH９に調整した。アラビアゴ
ム４ｇを100mlになるように水に溶解し、不溶物
を別した後40℃に加温した。 このようにして得られたゼラチン溶液50mlとア
ラビアゴム溶液50mlを混合し、この混合液をあら
かじめ40℃に加温した30容量％のメチルアルコー
ル溶液300mlに注ぎ入れ、よく撹拌した。これに
10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液1.6ml、１
％アルキルスルホマレイン酸（商品各デモール
Ep、花王石鹸(株)製品）、溶液２ml、および１％ダ
イレクトブルー溶液６mlを加えてよく撹拌した。 次いで、40℃に保ちながら10容量％の酢酸溶液
を滴下してPH4.8に調整し、粒子を生成させた。 このPH調整によつて得られた粒子分散液を氷冷
して５℃にしてからグルタールアルデヒド1.3ｇ
を加え、よく撹拌後この温度で一夜静置した。そ
れからこの粒子分散液を2000rpmで10分間遠心分
離して粒子をペレツトとして回収した。この粒子
を0.005％デモールEp溶液に懸濁して遠心分離す
る洗浄操作を３回繰返してから、４容量％ホルマ
リン溶液に分散し、５℃で１週間放置した。 本例で得られた担体粒子は7.7ｇであり、その
75％が３〜6μの範囲にあつた。 実施例 ２ 30容量％のメチルアルコール溶液のかわりに30
容量％のエチルアルコール溶液を、そして１％デ
モールEp溶液２mlのかわりに１容量％ポリオキ
シエチレンフエニルエーテル（エマルゲンＡ―
60、花王石鹸(株)登録商標）溶液８mlを用いたほか
は実施例１と同様にして担体粒子を調製した。但
し、酢酸を滴下して調製したPHは4.9であつた。
こうして得られた担体粒子は7.8ｇであり、その
70％が７〜11μの範囲にあつた。 実施例 ３ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、まずアラビアゴム４ｇのかわりにカ
ルボキシメチルセルロース１ｇを、そして30容量
％のメチルアルコール溶液のかわりに30容量％エ
チルアルコール溶液を用いた。それから、添加量
についても、ゼラチン10％ヘキサメタリン酸ナト
リウム溶液、１％デモールEp溶液、１％ダイレ
クトブルー溶液、およびグルタルアルデヒドをい
ずれも４分の１にした。また、PHも4.8から4.6に
した。 このようにして得られた担体粒子は3.8ｇであ
り、その90％が１〜2μの範囲にあつた。 実施例 ４ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、ゼラチン溶液を50mlから40mlにし、
アラビアゴム溶液を50mlから60mlに変えた。それ
から、10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液を
1.6mlから1.2mlに、１％ダイレクトブルー溶液を
６mlから4.8mlに、そしてグルタルアルデヒドを
1.3ｇから1.0ｇにそれぞれ変えた。また、酢酸滴
下終了PHを4.6とした。 本例で得られた担体粒子は6.4ｇであり、その
90％が１〜2μの範囲にあつた。 実施例 ５ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、ゼラチン溶液を50mlから60mlにしア
ラビアゴム溶液を50mlから40mlに変えた。それか
ら、10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液を1.6
mlから２mlに、１％ダイレクトブルー６mlから
7.2mlに、そしてグルタルアルデヒドを1.3ｇから
1.8ｇにそれぞれ変えた。また、酢酸滴下終了PH
を4.8とした。 本例で得られた担体粒子の収量は8.6ｇであり
得られた粒子の75％が３〜6μの範囲にあつた。 使用例 １ 実施例１で得られた担体粒子を、下表に示す濃
度のタンニン酸を含むPH7.2のリン酸塩緩衝生理
食塩水（以下、PBSと略記する。）中に粒子濃度
が2.5％になるように分散し、37℃で15分間加温
した。粒子を遠心分離して生理食塩水で充分洗浄
した。 梅毒病原体トレポネーマ・パリーダム（以下、
TPと略記する。）菌体をPH6.4のPBS中に浮遊さ
せ超音波で菌体を破壊してTP抗原液とした。 前記のタンニン酸処理粒子をPBSに５％の濃
度に分散し、この分散液を下表に示す倍数で希釈
したTP抗原液と等容づつ混合した。混合液を37
℃で40分間加温して、粒子にTP抗原を感作した。 TP抗原感作粒子を遠心分離してPH6.4のPBSで
充分洗浄し、分散用メデイウムに濃度が５％にな
るように分散した。 このようにして得られたTP抗原感作粒子分散
液を用い、マイクロプレート法で梅毒陽性血清と
反応させたところ下表に示す如き結果が得られ
た。なお、対照としてヒツジ赤血球を担体に用い
た場合の結果もあわせて下表に示す。
【表】
使用例 ２
実施例１で得られた担体粒子をタンニン酸
10ppmを含むPH7.2のPBS中に粒子濃度が2.5％に
なるように分散し、37℃で15分間加温した。粒子
を遠心分離して生理食塩水で充分洗浄し、１％に
なるようにPH7.2のPBS中に分散した。一方、高
純度に精製したストレプトキナーゼをPH7.2の
PBSに128U／mlになるように溶解した。 タンニン酸処理粒子分散液４mlとストレプトキ
ナーゼ溶液４mlとを混合し、37℃で30分間加温し
た。その後、粒子を遠心分離してPH7.2のPBSで
洗浄し、粒子濃度１％になるようにPH7.5のゼラ
チン緩衝液に分散した。なお、ゼラチン緩衝液は
ゼラチン５ｇ、塩化ナトリウム10ｇ、およびリン
酸カリウム13.6ｇを１に溶解したものである。 この粒子分散液のストレプトキナーゼ活性は約
60Uであつたので、溶液中の酵素の約12％が粒子
に固定されたことになる。 酵素活性の測定方法は次のように行なつた。す
なわち、酵素溶液または粒子分散液0.25mlにヒト
プラズマ0.1mlおよびトロンビン溶液0.05mlを加
えて37℃で30分間加温した。トロンビン溶液は
500単位のトロンビンをホウ酸緩衝液で80倍に希
釈したものである。酵素活性は、線凝固を阻止す
るストレプトキナーゼの最大希釈倍数で示した。
10ppmを含むPH7.2のPBS中に粒子濃度が2.5％に
なるように分散し、37℃で15分間加温した。粒子
を遠心分離して生理食塩水で充分洗浄し、１％に
なるようにPH7.2のPBS中に分散した。一方、高
純度に精製したストレプトキナーゼをPH7.2の
PBSに128U／mlになるように溶解した。 タンニン酸処理粒子分散液４mlとストレプトキ
ナーゼ溶液４mlとを混合し、37℃で30分間加温し
た。その後、粒子を遠心分離してPH7.2のPBSで
洗浄し、粒子濃度１％になるようにPH7.5のゼラ
チン緩衝液に分散した。なお、ゼラチン緩衝液は
ゼラチン５ｇ、塩化ナトリウム10ｇ、およびリン
酸カリウム13.6ｇを１に溶解したものである。 この粒子分散液のストレプトキナーゼ活性は約
60Uであつたので、溶液中の酵素の約12％が粒子
に固定されたことになる。 酵素活性の測定方法は次のように行なつた。す
なわち、酵素溶液または粒子分散液0.25mlにヒト
プラズマ0.1mlおよびトロンビン溶液0.05mlを加
えて37℃で30分間加温した。トロンビン溶液は
500単位のトロンビンをホウ酸緩衝液で80倍に希
釈したものである。酵素活性は、線凝固を阻止す
るストレプトキナーゼの最大希釈倍数で示した。
Claims (1)
- １ ゼラチン、水溶性多糖類、ポリメタリン酸ナ
トリウム、親水性有機溶媒、および水を含み、温
度がゼラチンのゲル化温度以上である溶液を、撹
拌しつつ酸を加えてPH2.5〜6.0に調整し、その後
アルデヒド系架橋剤を作用せしめて不溶化する人
工担体の製造方法において、前記のPH調整を行な
うまえに陰イオンまたは非イオン系の界面活性剤
を前記溶液に含有させておくことを特徴とする人
工担体の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20986881A JPS58113754A (ja) | 1981-12-28 | 1981-12-28 | 人工担体の製造方法 |
| EP19820301235 EP0062968B2 (en) | 1981-03-18 | 1982-03-11 | Support material for use in serological testing and process for the production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20986881A JPS58113754A (ja) | 1981-12-28 | 1981-12-28 | 人工担体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58113754A JPS58113754A (ja) | 1983-07-06 |
| JPS6332147B2 true JPS6332147B2 (ja) | 1988-06-28 |
Family
ID=16579958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20986881A Granted JPS58113754A (ja) | 1981-03-18 | 1981-12-28 | 人工担体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58113754A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010169435A (ja) * | 2009-01-20 | 2010-08-05 | Beckman Coulter Inc | 抗血小板抗体の存在を検査する方法 |
-
1981
- 1981-12-28 JP JP20986881A patent/JPS58113754A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58113754A (ja) | 1983-07-06 |
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|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
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