JPS6332149B2 - - Google Patents
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- JPS6332149B2 JPS6332149B2 JP20987081A JP20987081A JPS6332149B2 JP S6332149 B2 JPS6332149 B2 JP S6332149B2 JP 20987081 A JP20987081 A JP 20987081A JP 20987081 A JP20987081 A JP 20987081A JP S6332149 B2 JPS6332149 B2 JP S6332149B2
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
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- G03C1/00—Photosensitive materials
- G03C1/005—Silver halide emulsions; Preparation thereof; Physical treatment thereof; Incorporation of additives therein
- G03C1/04—Silver halide emulsions; Preparation thereof; Physical treatment thereof; Incorporation of additives therein with macromolecular additives; with layer-forming substances
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Description
本発明は抗原とか抗体の感作あるいは酵素の固
定などに広く利用しうる新規な人工担体の生産方
法の改良に関する。抗原、抗体反応を利用する臨
床検査等の分野において、抗原または抗体をある
適当な大きさの粒子を担体としてそれに吸着もし
くは結合させ、それぞれに対応する抗体または抗
原の存在によつてこの感作された担体の凝集を起
させる方法は間接受身凝集反応と呼ばれている。
そして、この間接受身凝集反応は被検液中の抗体
や抗原を高感度に検出できるので、いろいろの疾
患の血清学的診断や血液学的診断に広く用いられ
ている。 この反応に用いられる担体としては、ポリスチ
レンラテツクス、カオリン、炭未などの非生物学
的粒子と、動物赤血球、細菌菌体のような生物学
的粒子とがある。一般に非生物学的粒子の担体
は、化学的に安定で、それ自身抗原活性を有しな
いなどの利点はあるが、抗原あるいは抗体が密に
吸着されにくいという欠点がある。たとえば、保
存のために凍結乾燥すると抗原や抗体が担体から
遊離してしまうのである。そのために、やむなく
液体中で冷暗所に保存するという手段がとられて
いるが、その結果長期間保存することができな
い。また、非生物学的担体のうち、炭末とカオリ
ンは一定の大きさの粒子を選出することが困難で
あり、ポリスチレンラテツクスは反応の媒質とし
て望ましい中性域では非特異凝集である自然凝集
をおこす危険がある。 一方、生物学的担体である動物赤血球や細菌菌
体はそれぞれの大きさが一定であるという利点は
あるものの、生物の種類によつて粒子の大きさは
定まつており、目的に応じた任意の大きさの粒子
を得ることはできない。たとえば、動物赤血球は
大きさの一定した最も入手しやすい担体であるが
血球表面に固有の抗原を有しており、抗体との間
で非特異凝集反応である交差反応を起こして目的
とする凝集反応に誤まりを与える可能性がある。
さらに、赤血球の生物学的、化学的および物理的
特性値が動物の個体間でばらついてしまつて常に
一定品質の血球を入手することが難しいという欠
点がある。 本発明者らはこれらの欠点のないすぐれた担体
を開発すべく種々検討の結果、ゼラチン、水溶性
多糖類、およびポリメタリン酸ナトリウムを含
み、水とアルコール等の混合物を溶媒とする溶液
を撹拌下でPH調整することによつて粒子を析出さ
せ、この粒子をアルデヒド系架橋剤で処理して不
溶化すれば、従来の欠点を尽く解消したすぐれた
担体が得られることを見出し、この内容を既に特
許出願した（特開昭57−153658号）。そして、そ
の後アルコール等の親水性有機溶媒を用いなくと
も人工担体が好収率で得られることを見出してこ
の内容も特許出願した（特開昭57−160465号）。
しかしながら、いずれの方法においても生成した
粒子の凝集を防止するためにPH調整後に界面活性
剤を添加していた。本発明は、溶媒が水のみで親
水性有機溶媒を用いない方法において、界面活性
剤をPH調整前に予め添加しておけば担体の収量が
増加することに基いてなされたものである。 すなわち本発明は、ゼラチン、水溶性多糖類、
およびポリメタリン酸ナトリウムを含み、温度が
ゼラチンのゲル化温度以上である水溶液を、撹拌
しつつ酸を加えてPH2.5〜6.0に調整し、その後ア
ルデヒド系架橋剤を作用せしめて不溶化する人工
担体の生産方法において、前記のPH調整を行なう
まえに陰イオン系または非イオン系の界面活性剤
を前記水溶液に含有させておくことを特徴とする
人工担体の生産方法に関するものである。 本発明に使用するゼラチンは通常は市販品をそ
のまま用いればよい。市販品のなかでは酸性ゼラ
チンが好ましい。 水溶性多糖類は増粘剤または糊料として使用し
うるものであり、多糖類の誘導体および塩も含ま
れる。例としては、アラビアゴム、カルボキシメ
チルセルロース、アルギン酸ナトリウム、寒天、
カラゲーナンなどを挙げることができるが、特に
アラビアゴムが好適である。 ポリメタリン酸ナトリウムは化学式（NaPO3）
oで表わされる物質であり、たとえば四メタリン
酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムの如
きものである。 そのほかのものとしては、担体を着色する場合
には、着色剤を粒子形成前に溶液に加えておくの
がよい。着色を必要とする例としては、本発明品
を間接受身凝集反応の担体として用いる場合を挙
げることができる。すなわち、本発明品は通常は
無色不透明であるところから、これを着色するこ
とによつて凝集像の判定を容易にすることができ
る。着色剤としては、たとえば食用赤色３号、ロ
ーダミン、ローズベンガル、ポンソー3R、ボル
ドーＳ、フクシン、エオシン、およびニユートラ
ルレツドなどの赤色色素、あるいはクリスタルバ
イレツト、トルイジンブルーおよびメチレンブル
ーなどの青色色素等を用いうる。しかしながら、
リアクテイブ・レツド、ダイレクト・ブルーなど
の反応性染料で着色すれば色落ちしないことか
ら、反応性染料が特に好適である。着色剤以外に
も目的に応じ種々の物質を添加してもよいことは
いうまでもない。 PH調整前の溶液におけるこれら各物質の濃度と
しては、ゼラチン0.01〜２％程度、好ましくは
0.05〜1.0％程度、そして水溶性多糖類0.01〜２％
程度、好ましくは0.05〜1.0％程度である。ポリ
メタリン酸ナトリウムはゼラチン乾燥重量の0.5
〜20％程度を含有させるようにするのがよい。各
物質はこれらの濃度範囲において、所望の粒子の
粒径および物性に応じて適宜定めればよい。着色
剤を添加する場合には、通常は0.005〜0.5％程度
であるが、反応性染料を用いればゼラチン乾燥重
量の１〜５％程度で足りる。 本発明においては、このような溶液にPH調整前
にさらに陰イオン系または非イオン系の界面活性
剤を含有させるところに特徴がある。 陰イオン系界面活性剤の例としては、アルキル
スルホコハク酸、アルキルスルホマレイン酸、ア
ルキル硫酸エステル、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル硫酸エステルなど、そして非イオン系
界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレン脂
肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエー
テル、ポリオキシエチレンアルキルフエニルエー
テル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステルな
どを挙げることができる。界面活性剤は粒子の凝
集を防止する目的で添加するのであるが、陽イオ
ン系の界面活性剤では粒子の凝集を防止すること
ができないので本発明の対象外である。PH調整前
の溶液における濃度としては、陰イオン系界面活
性剤の場合は0.001〜0.01％程度、非イオン系界
面活性剤の場合は0.01〜0.1％程度で凝集防止効
果が得られる。溶液を冷却すればもつと低い濃度
で凝集を防止することができる。 このような溶液を調製する過程は問うところで
はなく、例えば各々を温水に溶解してから混合し
てもよく、各々を一緒に溶解してもよい。しかし
ならが、水溶性多糖類には不溶成分も少量含まれ
ていることが多いところから、別途に溶解して添
加するのがよい。一方、ゼラチンは等電点以下の
PHでは水溶性多糖類と反応して白濁を生ずるので
酸性ゼラチンを用いる場合にはアルカリを加えて
溶液のPHを少なくともその付近にまで高めておく
のがよい。しかしながら、この白濁は生じた後で
もアルカリを添加することによつて消すことがで
きる。いずれにせよ、溶液は酸の添加を開始する
まえには白濁のない状態にしておけなければなら
ない。 溶液の温度はゼラチンのゲル化温度以上でなけ
ればならない。この温度はゼラチンの濃度等によ
つて異なるが通例25〜30℃程度である。良好な粒
子形成の観点から特に35〜50℃程度がよい。 次に、この溶液を撹拌しながら酸を加えてPH
2.5〜6.0に調整する。この工程は粒子を生成させ
るところである。均一な粒子を形成させるため
に、35〜50℃に加温を続け、適度に撹拌しながら
酸を滴下していくのがよい。PH2.5〜6.0の範囲に
おける至適のPHは原料溶液の組成および目的とす
る粒径によつて異なるので予め実験を行なつて定
めるのがよい。たとえば得られた粒子を抗原感作
用担体に用いる場合には２〜10μ程度の粒径にす
るのがよく、その場合至適のPHは4.0〜5.5の範囲
にある。このPH調整に使用する酸は特に限定され
るものではなく無機酸でも有機酸でもよいが、な
るべくおだやかなものがよく、たとえば酢酸など
が好適である。 本工程で生成した粒子は系の温度をゼラチンの
ゲル化温度以下に下げても消失しないので母液と
の平衡関係はない。また、粒子はほとんどの場合
負に帯電しており、その表面には溶液中の陽イオ
ンが配向していていわゆる電気二重層を形成して
いる。そして、このことが粒子の安定な分散を促
しているのである。 酸の添加後は生成した粒子の凝集を防止するた
めに速かに粒子分散液を冷却するのがよい。そし
て、液温がゲル化温度以下に、好ましくは10℃以
下になつたところでアルデヒド系架橋剤を添加し
て粒子を不溶化する。この架橋剤の添加量はゼラ
チン乾燥重量の0.1〜200％程度であり、添加後は
一夜程度放置して架橋反応を充分に行なわせる。
架橋剤の例としては、グルタルアルデヒド、ホル
ムアルデヒド、グリオキザール、クロトンアルデ
ヒド、アクロレイン、アセトアルデヒドなどを挙
げることができるが、特にグルタルアルデヒドが
好適である。 アルデヒド系架橋剤で処理後は粒子を遠心分離
等で回収して、必要により洗浄する。洗浄は粒子
分散のために用いた界面活性剤と同じものを同濃
度で含む水で２〜３回行なえばよい。 このようにして得られた担体を種々の用途に供
すればよいが、架橋が不充分な場合には塩類溶液
中で膨潤することがある。そこでこのような用途
に用いる場合にはアルデヒド系架橋剤で処理して
膨潤を防止するのがよい。例えば、抗原を感作す
る場合にはリン酸緩衝液中で行なうので、赤血球
を固定化する条件でホルマリン処理する。この処
理によつて膨潤を防止するとともにホルマリンの
殺菌効果によつて長期間の保存に耐える担体が得
られる。 本発明の担体は抗原、抗体、酵素などを巾広く
固定することができる。たとえば、抗原とか抗体
を感作する場合には動物赤血球を担体として行な
う常法に準じて行えばよい。 本発明の担体は間接受身凝集反応の担体として
従来最もすぐれているとされていた動物赤血球と
同等の性能を有し、さらに化学的、物理的に均質
かつ安定であり、抗原活性がなく任意の粒径のも
のを容易かつ安価に大量生産できるなど動物赤血
球にない幾多の利点を有するものである。そして
本発明は、アルコール等を溶媒に含む先願発明に
対してはこのような有機溶剤を使用しないことに
よつて製造設備を大巾に簡略化しかつ操作を容易
にしており、アルコール等を溶媒に用いない先願
発明に対しては界面活性剤の添加時期を変えるこ
とによつて収率を向上させている。 以下、実施例及び担体の使用例を示す。なお、
本明細書において特に記載がなければ％は重量％
を表わしている。 実施例 １ 等電点がPH９であるゼラチン4gを40℃の温水
に溶解して100mlとし、10％の水酸化ナトリウム
溶液でPH９に調整した。アラビアゴム4g水に溶
解して100mlとし、不溶物を別した後40℃に加
温した。 このようにして得られたゼラチン溶液50mlとア
ラビアゴム溶液50mlを混合し、この混合液を40℃
の蒸溜水300mlに加えた。これに10％のヘキサメ
タリン酸ナトリウム溶液1.6ml、１容量％ポリオ
キシエチレンフエニルエーテル（エマルゲンＡ−
60、花王石鹸(株)登録商標）溶液８ml、および１％
ダイレクトブルー溶液６mlを加えた。 次いで、この溶液を40℃に保ち、撹拌しながら
10容量％酢酸溶液を滴下してPH4.8に調整し、粒
子を生成させた。 粒子分散液を氷冷して５℃にしてからグルター
ルアルデヒド1.3gを加え、よく撹拌後この温度で
一夜静置した。それからこの粒子分散液を
2000rpmで10分間遠心分離して粒子をペレツトと
して回収した。この粒子を0.02容量％のエマルゲ
ンＡ−60溶液に懸濁して遠心分離する洗浄操作を
３回繰返してから粒子濃度が５％になるように４
容量％ホルマリン溶液に分散し、５℃で１週間静
置した。 本例で得られた担体粒子は6.2gであり、その75
％は３〜6μの範囲にあつた。 実施例 ２ １容量％のエマルゲンＡ−60溶液８mlのかわり
に１％アルキルスルホマレイン酸（デモールEp、
花王石鹸(株)登録商標）溶液２mlを用い、そして１
％ダイレクトブルー溶液６mlのかわりに１％リア
クテイブレツド６mlを用いたほかは実施例１と同
様にして担体粒子を調製した。但し、酢酸を滴下
して調整したPHは4.6であつた。こうして得られ
た担体粒子は11gであり、その75％は３〜6μの範
囲にあつた。 実施例 ３ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、まずアラビアゴム4gのかわりにカ
ルボキシメチルセルロース1gを、そして１容量
％のエマルゲンＡ−60溶液８mlのかわりに１％デ
モールEp溶液0.5mlを用いた。それから、添加量
についても、ゼラチン、10％ヘキサメタリン酸ナ
トリウム溶液、１％ダイレクトブルー溶液、およ
びグルタルアルデヒドをいずれも４分の１にし
た。また、PHも4.8から4.6にした。このようにし
て得られた担体粒子は4.8gであり、その95％が
0.8〜1.5μの範囲にあつた。 実施例 ４ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、ゼラチン溶液を50mlから40mlにし、
アラビアゴム溶液を50mlから60mlに変えた。それ
から、10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液を
1.6mlか1.2mlに、１容量％エマルゲンＡ−60溶液
８mlを１％デモールEp溶液２mlに、１％ダイレ
クトブルー６mlを4.8mlに、そしてグルタルアル
デヒドを1.3gか1.0gにそれぞれ変えた。また、酢
酸の滴下終了PHを4.2とした。 このようにして得られた担体粒子は9.6gであ
り、その90％１〜2μの範囲にあつた。 実施例 ５ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、ゼラチン溶液を50mlから60mlにし、
アラビアゴム溶液を50mlから40mlに変えた。それ
から、10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液を
1.6mlから２mlに、１容量％エマルゲンＡ−60溶
液を１％デモールEp溶液２mlに、１％ダイレク
トブルー６mlを7.2mlに、そしてグルタルアルデ
ヒドを1.3gから1.8gにそれぞれ変えた。また、酢
酸の滴下終了PHを4.6とした。 このようにして得られた担体粒子は10.4gであ
り、その75％が３〜6μの範囲であつた。 使用例 １ 実施例１で得られた担体粒子を濃度が５％にな
るようにPH7.2のリン酸塩緩衝生理食塩水（以下
PBSと略記する。）に分散し、その20mlを5ppm
のタンニン酸を含むPH7.2のPBS20mlと混合した。 混合液を37℃で15分間加温後遠心分離して、生
理食塩水で充分洗浄してから５％になるようにPH
6.4のPBSに分散し全量を20mlとした。一方、PH
6.4のPBS中に浮遊させた梅毒病原体トレポネー
マ・パリーダムを超音波処理して破壊し、抗原液
とした。 タンニン酸処理粒子分散液20mlと抗原液20mlと
を混合して37℃で40分間加温した。こうして得ら
れた抗原感作粒子をPH6.4のPBSで充分に洗浄し、
粒子濃度が５％になるように19mlの分散用メデイ
ウムに分散して凍結乾燥した。 この凍結乾燥品に蒸溜水を加えて凍結乾燥前と
同容量になるように復元し、梅毒陽性血清につい
てマイクロタイタープレート法で力価を測定した
結果を下表に示す。なお、ヒツジ赤血球を担体と
した市販のTPHAキツト（富士臓器製薬(株)製）
を用いて同様に測定した結果も併せて示す。
定などに広く利用しうる新規な人工担体の生産方
法の改良に関する。抗原、抗体反応を利用する臨
床検査等の分野において、抗原または抗体をある
適当な大きさの粒子を担体としてそれに吸着もし
くは結合させ、それぞれに対応する抗体または抗
原の存在によつてこの感作された担体の凝集を起
させる方法は間接受身凝集反応と呼ばれている。
そして、この間接受身凝集反応は被検液中の抗体
や抗原を高感度に検出できるので、いろいろの疾
患の血清学的診断や血液学的診断に広く用いられ
ている。 この反応に用いられる担体としては、ポリスチ
レンラテツクス、カオリン、炭未などの非生物学
的粒子と、動物赤血球、細菌菌体のような生物学
的粒子とがある。一般に非生物学的粒子の担体
は、化学的に安定で、それ自身抗原活性を有しな
いなどの利点はあるが、抗原あるいは抗体が密に
吸着されにくいという欠点がある。たとえば、保
存のために凍結乾燥すると抗原や抗体が担体から
遊離してしまうのである。そのために、やむなく
液体中で冷暗所に保存するという手段がとられて
いるが、その結果長期間保存することができな
い。また、非生物学的担体のうち、炭末とカオリ
ンは一定の大きさの粒子を選出することが困難で
あり、ポリスチレンラテツクスは反応の媒質とし
て望ましい中性域では非特異凝集である自然凝集
をおこす危険がある。 一方、生物学的担体である動物赤血球や細菌菌
体はそれぞれの大きさが一定であるという利点は
あるものの、生物の種類によつて粒子の大きさは
定まつており、目的に応じた任意の大きさの粒子
を得ることはできない。たとえば、動物赤血球は
大きさの一定した最も入手しやすい担体であるが
血球表面に固有の抗原を有しており、抗体との間
で非特異凝集反応である交差反応を起こして目的
とする凝集反応に誤まりを与える可能性がある。
さらに、赤血球の生物学的、化学的および物理的
特性値が動物の個体間でばらついてしまつて常に
一定品質の血球を入手することが難しいという欠
点がある。 本発明者らはこれらの欠点のないすぐれた担体
を開発すべく種々検討の結果、ゼラチン、水溶性
多糖類、およびポリメタリン酸ナトリウムを含
み、水とアルコール等の混合物を溶媒とする溶液
を撹拌下でPH調整することによつて粒子を析出さ
せ、この粒子をアルデヒド系架橋剤で処理して不
溶化すれば、従来の欠点を尽く解消したすぐれた
担体が得られることを見出し、この内容を既に特
許出願した（特開昭57−153658号）。そして、そ
の後アルコール等の親水性有機溶媒を用いなくと
も人工担体が好収率で得られることを見出してこ
の内容も特許出願した（特開昭57−160465号）。
しかしながら、いずれの方法においても生成した
粒子の凝集を防止するためにPH調整後に界面活性
剤を添加していた。本発明は、溶媒が水のみで親
水性有機溶媒を用いない方法において、界面活性
剤をPH調整前に予め添加しておけば担体の収量が
増加することに基いてなされたものである。 すなわち本発明は、ゼラチン、水溶性多糖類、
およびポリメタリン酸ナトリウムを含み、温度が
ゼラチンのゲル化温度以上である水溶液を、撹拌
しつつ酸を加えてPH2.5〜6.0に調整し、その後ア
ルデヒド系架橋剤を作用せしめて不溶化する人工
担体の生産方法において、前記のPH調整を行なう
まえに陰イオン系または非イオン系の界面活性剤
を前記水溶液に含有させておくことを特徴とする
人工担体の生産方法に関するものである。 本発明に使用するゼラチンは通常は市販品をそ
のまま用いればよい。市販品のなかでは酸性ゼラ
チンが好ましい。 水溶性多糖類は増粘剤または糊料として使用し
うるものであり、多糖類の誘導体および塩も含ま
れる。例としては、アラビアゴム、カルボキシメ
チルセルロース、アルギン酸ナトリウム、寒天、
カラゲーナンなどを挙げることができるが、特に
アラビアゴムが好適である。 ポリメタリン酸ナトリウムは化学式（NaPO3）
oで表わされる物質であり、たとえば四メタリン
酸ナトリウム、ヘキサメタリン酸ナトリウムの如
きものである。 そのほかのものとしては、担体を着色する場合
には、着色剤を粒子形成前に溶液に加えておくの
がよい。着色を必要とする例としては、本発明品
を間接受身凝集反応の担体として用いる場合を挙
げることができる。すなわち、本発明品は通常は
無色不透明であるところから、これを着色するこ
とによつて凝集像の判定を容易にすることができ
る。着色剤としては、たとえば食用赤色３号、ロ
ーダミン、ローズベンガル、ポンソー3R、ボル
ドーＳ、フクシン、エオシン、およびニユートラ
ルレツドなどの赤色色素、あるいはクリスタルバ
イレツト、トルイジンブルーおよびメチレンブル
ーなどの青色色素等を用いうる。しかしながら、
リアクテイブ・レツド、ダイレクト・ブルーなど
の反応性染料で着色すれば色落ちしないことか
ら、反応性染料が特に好適である。着色剤以外に
も目的に応じ種々の物質を添加してもよいことは
いうまでもない。 PH調整前の溶液におけるこれら各物質の濃度と
しては、ゼラチン0.01〜２％程度、好ましくは
0.05〜1.0％程度、そして水溶性多糖類0.01〜２％
程度、好ましくは0.05〜1.0％程度である。ポリ
メタリン酸ナトリウムはゼラチン乾燥重量の0.5
〜20％程度を含有させるようにするのがよい。各
物質はこれらの濃度範囲において、所望の粒子の
粒径および物性に応じて適宜定めればよい。着色
剤を添加する場合には、通常は0.005〜0.5％程度
であるが、反応性染料を用いればゼラチン乾燥重
量の１〜５％程度で足りる。 本発明においては、このような溶液にPH調整前
にさらに陰イオン系または非イオン系の界面活性
剤を含有させるところに特徴がある。 陰イオン系界面活性剤の例としては、アルキル
スルホコハク酸、アルキルスルホマレイン酸、ア
ルキル硫酸エステル、ポリオキシエチレンアルキ
ルエーテル硫酸エステルなど、そして非イオン系
界面活性剤の例としては、ポリオキシエチレン脂
肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエー
テル、ポリオキシエチレンアルキルフエニルエー
テル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステルな
どを挙げることができる。界面活性剤は粒子の凝
集を防止する目的で添加するのであるが、陽イオ
ン系の界面活性剤では粒子の凝集を防止すること
ができないので本発明の対象外である。PH調整前
の溶液における濃度としては、陰イオン系界面活
性剤の場合は0.001〜0.01％程度、非イオン系界
面活性剤の場合は0.01〜0.1％程度で凝集防止効
果が得られる。溶液を冷却すればもつと低い濃度
で凝集を防止することができる。 このような溶液を調製する過程は問うところで
はなく、例えば各々を温水に溶解してから混合し
てもよく、各々を一緒に溶解してもよい。しかし
ならが、水溶性多糖類には不溶成分も少量含まれ
ていることが多いところから、別途に溶解して添
加するのがよい。一方、ゼラチンは等電点以下の
PHでは水溶性多糖類と反応して白濁を生ずるので
酸性ゼラチンを用いる場合にはアルカリを加えて
溶液のPHを少なくともその付近にまで高めておく
のがよい。しかしながら、この白濁は生じた後で
もアルカリを添加することによつて消すことがで
きる。いずれにせよ、溶液は酸の添加を開始する
まえには白濁のない状態にしておけなければなら
ない。 溶液の温度はゼラチンのゲル化温度以上でなけ
ればならない。この温度はゼラチンの濃度等によ
つて異なるが通例25〜30℃程度である。良好な粒
子形成の観点から特に35〜50℃程度がよい。 次に、この溶液を撹拌しながら酸を加えてPH
2.5〜6.0に調整する。この工程は粒子を生成させ
るところである。均一な粒子を形成させるため
に、35〜50℃に加温を続け、適度に撹拌しながら
酸を滴下していくのがよい。PH2.5〜6.0の範囲に
おける至適のPHは原料溶液の組成および目的とす
る粒径によつて異なるので予め実験を行なつて定
めるのがよい。たとえば得られた粒子を抗原感作
用担体に用いる場合には２〜10μ程度の粒径にす
るのがよく、その場合至適のPHは4.0〜5.5の範囲
にある。このPH調整に使用する酸は特に限定され
るものではなく無機酸でも有機酸でもよいが、な
るべくおだやかなものがよく、たとえば酢酸など
が好適である。 本工程で生成した粒子は系の温度をゼラチンの
ゲル化温度以下に下げても消失しないので母液と
の平衡関係はない。また、粒子はほとんどの場合
負に帯電しており、その表面には溶液中の陽イオ
ンが配向していていわゆる電気二重層を形成して
いる。そして、このことが粒子の安定な分散を促
しているのである。 酸の添加後は生成した粒子の凝集を防止するた
めに速かに粒子分散液を冷却するのがよい。そし
て、液温がゲル化温度以下に、好ましくは10℃以
下になつたところでアルデヒド系架橋剤を添加し
て粒子を不溶化する。この架橋剤の添加量はゼラ
チン乾燥重量の0.1〜200％程度であり、添加後は
一夜程度放置して架橋反応を充分に行なわせる。
架橋剤の例としては、グルタルアルデヒド、ホル
ムアルデヒド、グリオキザール、クロトンアルデ
ヒド、アクロレイン、アセトアルデヒドなどを挙
げることができるが、特にグルタルアルデヒドが
好適である。 アルデヒド系架橋剤で処理後は粒子を遠心分離
等で回収して、必要により洗浄する。洗浄は粒子
分散のために用いた界面活性剤と同じものを同濃
度で含む水で２〜３回行なえばよい。 このようにして得られた担体を種々の用途に供
すればよいが、架橋が不充分な場合には塩類溶液
中で膨潤することがある。そこでこのような用途
に用いる場合にはアルデヒド系架橋剤で処理して
膨潤を防止するのがよい。例えば、抗原を感作す
る場合にはリン酸緩衝液中で行なうので、赤血球
を固定化する条件でホルマリン処理する。この処
理によつて膨潤を防止するとともにホルマリンの
殺菌効果によつて長期間の保存に耐える担体が得
られる。 本発明の担体は抗原、抗体、酵素などを巾広く
固定することができる。たとえば、抗原とか抗体
を感作する場合には動物赤血球を担体として行な
う常法に準じて行えばよい。 本発明の担体は間接受身凝集反応の担体として
従来最もすぐれているとされていた動物赤血球と
同等の性能を有し、さらに化学的、物理的に均質
かつ安定であり、抗原活性がなく任意の粒径のも
のを容易かつ安価に大量生産できるなど動物赤血
球にない幾多の利点を有するものである。そして
本発明は、アルコール等を溶媒に含む先願発明に
対してはこのような有機溶剤を使用しないことに
よつて製造設備を大巾に簡略化しかつ操作を容易
にしており、アルコール等を溶媒に用いない先願
発明に対しては界面活性剤の添加時期を変えるこ
とによつて収率を向上させている。 以下、実施例及び担体の使用例を示す。なお、
本明細書において特に記載がなければ％は重量％
を表わしている。 実施例 １ 等電点がPH９であるゼラチン4gを40℃の温水
に溶解して100mlとし、10％の水酸化ナトリウム
溶液でPH９に調整した。アラビアゴム4g水に溶
解して100mlとし、不溶物を別した後40℃に加
温した。 このようにして得られたゼラチン溶液50mlとア
ラビアゴム溶液50mlを混合し、この混合液を40℃
の蒸溜水300mlに加えた。これに10％のヘキサメ
タリン酸ナトリウム溶液1.6ml、１容量％ポリオ
キシエチレンフエニルエーテル（エマルゲンＡ−
60、花王石鹸(株)登録商標）溶液８ml、および１％
ダイレクトブルー溶液６mlを加えた。 次いで、この溶液を40℃に保ち、撹拌しながら
10容量％酢酸溶液を滴下してPH4.8に調整し、粒
子を生成させた。 粒子分散液を氷冷して５℃にしてからグルター
ルアルデヒド1.3gを加え、よく撹拌後この温度で
一夜静置した。それからこの粒子分散液を
2000rpmで10分間遠心分離して粒子をペレツトと
して回収した。この粒子を0.02容量％のエマルゲ
ンＡ−60溶液に懸濁して遠心分離する洗浄操作を
３回繰返してから粒子濃度が５％になるように４
容量％ホルマリン溶液に分散し、５℃で１週間静
置した。 本例で得られた担体粒子は6.2gであり、その75
％は３〜6μの範囲にあつた。 実施例 ２ １容量％のエマルゲンＡ−60溶液８mlのかわり
に１％アルキルスルホマレイン酸（デモールEp、
花王石鹸(株)登録商標）溶液２mlを用い、そして１
％ダイレクトブルー溶液６mlのかわりに１％リア
クテイブレツド６mlを用いたほかは実施例１と同
様にして担体粒子を調製した。但し、酢酸を滴下
して調整したPHは4.6であつた。こうして得られ
た担体粒子は11gであり、その75％は３〜6μの範
囲にあつた。 実施例 ３ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、まずアラビアゴム4gのかわりにカ
ルボキシメチルセルロース1gを、そして１容量
％のエマルゲンＡ−60溶液８mlのかわりに１％デ
モールEp溶液0.5mlを用いた。それから、添加量
についても、ゼラチン、10％ヘキサメタリン酸ナ
トリウム溶液、１％ダイレクトブルー溶液、およ
びグルタルアルデヒドをいずれも４分の１にし
た。また、PHも4.8から4.6にした。このようにし
て得られた担体粒子は4.8gであり、その95％が
0.8〜1.5μの範囲にあつた。 実施例 ４ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、ゼラチン溶液を50mlから40mlにし、
アラビアゴム溶液を50mlから60mlに変えた。それ
から、10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液を
1.6mlか1.2mlに、１容量％エマルゲンＡ−60溶液
８mlを１％デモールEp溶液２mlに、１％ダイレ
クトブルー６mlを4.8mlに、そしてグルタルアル
デヒドを1.3gか1.0gにそれぞれ変えた。また、酢
酸の滴下終了PHを4.2とした。 このようにして得られた担体粒子は9.6gであ
り、その90％１〜2μの範囲にあつた。 実施例 ５ 下記の点を除いて実施例１と同様にして担体粒
子を調製した。 すなわち、ゼラチン溶液を50mlから60mlにし、
アラビアゴム溶液を50mlから40mlに変えた。それ
から、10％ヘキサメタリン酸ナトリウム溶液を
1.6mlから２mlに、１容量％エマルゲンＡ−60溶
液を１％デモールEp溶液２mlに、１％ダイレク
トブルー６mlを7.2mlに、そしてグルタルアルデ
ヒドを1.3gから1.8gにそれぞれ変えた。また、酢
酸の滴下終了PHを4.6とした。 このようにして得られた担体粒子は10.4gであ
り、その75％が３〜6μの範囲であつた。 使用例 １ 実施例１で得られた担体粒子を濃度が５％にな
るようにPH7.2のリン酸塩緩衝生理食塩水（以下
PBSと略記する。）に分散し、その20mlを5ppm
のタンニン酸を含むPH7.2のPBS20mlと混合した。 混合液を37℃で15分間加温後遠心分離して、生
理食塩水で充分洗浄してから５％になるようにPH
6.4のPBSに分散し全量を20mlとした。一方、PH
6.4のPBS中に浮遊させた梅毒病原体トレポネー
マ・パリーダムを超音波処理して破壊し、抗原液
とした。 タンニン酸処理粒子分散液20mlと抗原液20mlと
を混合して37℃で40分間加温した。こうして得ら
れた抗原感作粒子をPH6.4のPBSで充分に洗浄し、
粒子濃度が５％になるように19mlの分散用メデイ
ウムに分散して凍結乾燥した。 この凍結乾燥品に蒸溜水を加えて凍結乾燥前と
同容量になるように復元し、梅毒陽性血清につい
てマイクロタイタープレート法で力価を測定した
結果を下表に示す。なお、ヒツジ赤血球を担体と
した市販のTPHAキツト（富士臓器製薬(株)製）
を用いて同様に測定した結果も併せて示す。
【表】
使用例 ２
実施例１で得られた担体粒子を使用例１と同様
にタンニン酸処理した。そして、このタンニン酸
処理粒子を粒子濃度が１％になるようにPH7.2の
PBS5mlに分散した。 高純度に精製したストレプトキナーゼを32V／
mlになるようにPH7.2のPBS5mlに溶解し、この溶
液を粒子分散液と混合した。 混合液を37℃で30分間加温し、粒子を遠心分離
して生理食塩水で充分に洗浄した。この粒子を濃
度が５％になるように分散用メデイウムに分散
し、凍結乾燥して４℃で保存した。 このようにして得られたストレプトキナーゼ固
定化粒子の力価をマイクロプレート法によつて求
めたところ下表に示すような結果が得られる。
にタンニン酸処理した。そして、このタンニン酸
処理粒子を粒子濃度が１％になるようにPH7.2の
PBS5mlに分散した。 高純度に精製したストレプトキナーゼを32V／
mlになるようにPH7.2のPBS5mlに溶解し、この溶
液を粒子分散液と混合した。 混合液を37℃で30分間加温し、粒子を遠心分離
して生理食塩水で充分に洗浄した。この粒子を濃
度が５％になるように分散用メデイウムに分散
し、凍結乾燥して４℃で保存した。 このようにして得られたストレプトキナーゼ固
定化粒子の力価をマイクロプレート法によつて求
めたところ下表に示すような結果が得られる。
Claims (1)
- １ ゼラチン、水溶性多糖類、およびポリメタリ
ン酸ナトリウムを含み、温度がゼラチンのゲル化
温度以上である水溶液を、撹拌しつつ酸を加えて
PH2.5〜6.0に調整し、その後アルデヒド系架橋剤
を作用せしめて不溶化する人工担体の生産方法に
おいて、前記のPH調整を行なうまえに陰イオン系
または非イオン系の界面活性剤を前記水溶液に含
有させておくことを特徴とする人工担体の生産方
法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20987081A JPS58113756A (ja) | 1981-12-28 | 1981-12-28 | 人工担体の生産方法 |
| EP19820301235 EP0062968B2 (en) | 1981-03-18 | 1982-03-11 | Support material for use in serological testing and process for the production thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20987081A JPS58113756A (ja) | 1981-12-28 | 1981-12-28 | 人工担体の生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58113756A JPS58113756A (ja) | 1983-07-06 |
| JPS6332149B2 true JPS6332149B2 (ja) | 1988-06-28 |
Family
ID=16579994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20987081A Granted JPS58113756A (ja) | 1981-03-18 | 1981-12-28 | 人工担体の生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58113756A (ja) |
-
1981
- 1981-12-28 JP JP20987081A patent/JPS58113756A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS58113756A (ja) | 1983-07-06 |
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