JPS6335600A - Ｔ細胞活性化因子 - Google Patents
Ｔ細胞活性化因子Info
- Publication number
- JPS6335600A JPS6335600A JP61181014A JP18101486A JPS6335600A JP S6335600 A JPS6335600 A JP S6335600A JP 61181014 A JP61181014 A JP 61181014A JP 18101486 A JP18101486 A JP 18101486A JP S6335600 A JPS6335600 A JP S6335600A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- amino acid
- cell
- factor
- amino
- lys
- Prior art date
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- Pending
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
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- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
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- Public Health (AREA)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、新規なＴ細胞活性化因子に関する。
本発明のＴ細胞活性化因子は免疫担当細胞の機能を活性
化するので、癌その他の戻患に対する治療に用いること
ができる。
化するので、癌その他の戻患に対する治療に用いること
ができる。
従来技術
Ｔ′ａ胞活性化因子は、従来インク゛−ロイキン１（Ｉ
Ｌ−１） ＩＪｌｉｚｅｌ、 Ｓ、Ｂ、 ｅｔ ａ
ｌ、、ジャーナ）Ｌｔ−オブ・イムノロシイ （Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、 １２０． １４９７〜１５０３
． １９７８） 、 インターロイキン２ （ＩＬ−
２）（Ｇｉｌｌｉｓ、 Ｓ、ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｉ＋ｎ
ｍｕｎｏｌ、 、 １２０． ２０２７〜２０３２．１
９７８）などが知られている。
Ｌ−１） ＩＪｌｉｚｅｌ、 Ｓ、Ｂ、 ｅｔ ａ
ｌ、、ジャーナ）Ｌｔ−オブ・イムノロシイ （Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、 １２０． １４９７〜１５０３
． １９７８） 、 インターロイキン２ （ＩＬ−
２）（Ｇｉｌｌｉｓ、 Ｓ、ｅｔ ａｌ、、Ｊ、Ｉ＋ｎ
ｍｕｎｏｌ、 、 １２０． ２０２７〜２０３２．１
９７８）などが知られている。
ヒトのＩＬ−２の場合、呑口らによって、ヒトＩＬ−２
産生細胞ジャーカット細胞由来の相補的ＤＮＡを用いて
、組換えＤＮＡ技術によりＩＬＬ２が産生され、レセプ
ター解析まで進んでいる（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、 Ｔ、
ｅｔ ａｌ、、 ネイチャー （ｌｌａｔｕｒｅ）
。
産生細胞ジャーカット細胞由来の相補的ＤＮＡを用いて
、組換えＤＮＡ技術によりＩＬＬ２が産生され、レセプ
ター解析まで進んでいる（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、 Ｔ、
ｅｔ ａｌ、、 ネイチャー （ｌｌａｔｕｒｅ）
。
３０２、 ３０５，１９８３． Ｌｅｏｎａｒｄ、
Ｗ、Ｊ、ｅｔ ａユ、、Ｎａｔｕｒｅ。
Ｗ、Ｊ、ｅｔ ａユ、、Ｎａｔｕｒｅ。
３１１、６２６−６３５．１９８４ ］。
一方、ＩＬ−１の場合も、最近相補的ＤＮＡが解析され
〔＾ｕｒｏｎ、Ｄ、Ｅ、ｅｔ ａｌ、、プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ
、）、 ８１゜７９０７〜７９１１．１９８４ ；Ｍ
ａｒｃｈ、 Ｃ０Ｊ、、Ｎａｔｕｒｅ、 ３１５゜６４
１〜６４７．１９８５） 、Ｉ Ｌ−１α（等電点５．
０）およびＩＬ−１β（等電点７．０）の全アミノ酸構
造が明らかとなっている。ＩＬ−１を生産する細胞とし
てはマクロファージ、上皮系細胞、好中球、Ｂリンパ球
などと広範である（Ｂｒｕｎｔ、 Ｊ、Ｖ、 、バイオ
／チクノロシイ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３
．５９５〜５９７゜１９８５ ）。
〔＾ｕｒｏｎ、Ｄ、Ｅ、ｅｔ ａｌ、、プロシーディ
ング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミイ・オブ・サイ
エンス （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 Ｓｃｉ
、）、 ８１゜７９０７〜７９１１．１９８４ ；Ｍ
ａｒｃｈ、 Ｃ０Ｊ、、Ｎａｔｕｒｅ、 ３１５゜６４
１〜６４７．１９８５） 、Ｉ Ｌ−１α（等電点５．
０）およびＩＬ−１β（等電点７．０）の全アミノ酸構
造が明らかとなっている。ＩＬ−１を生産する細胞とし
てはマクロファージ、上皮系細胞、好中球、Ｂリンパ球
などと広範である（Ｂｒｕｎｔ、 Ｊ、Ｖ、 、バイオ
／チクノロシイ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、３
．５９５〜５９７゜１９８５ ）。
発明の解決課題および構成
本発明者は、ＩＬ−１産生細胞の培養上清より新規なＴ
細胞活性化因子を得るべく研究を重ねた。
細胞活性化因子を得るべく研究を重ねた。
その結果、従来報告されているものとは異なるＴ細胞活
性化因子を単離精製することに成功した。
性化因子を単離精製することに成功した。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明は、新規なＴ細胞活性化因子を提供する。
本発明のＴ細胞活性化因子は下記の理化学的性質を有す
る。
る。
ａ）分子量：約１７．５００ （ＳＤＳ−ＰＡ（、Ｅ法
）約２０．０００（ゲルｐ過） ｂ）等電点：９．５±０．３（クロマトフオーカシング
法） 約９゜２（等電点電気泳動） Ｃ）アミノ酸組成比：６Ｎ塩酸で１１０℃。
）約２０．０００（ゲルｐ過） ｂ）等電点：９．５±０．３（クロマトフオーカシング
法） 約９゜２（等電点電気泳動） Ｃ）アミノ酸組成比：６Ｎ塩酸で１１０℃。
２０時間減圧下に加水分解後、アミノ酸アナライザーに
より分析したアミノ酸組成比（モル比）はアラニン（Ａ
ｌａ）を１．００として以下の通りである。
より分析したアミノ酸組成比（モル比）はアラニン（Ａ
ｌａ）を１．００として以下の通りである。
アラニン（Ａｌａ） １．００アルギニ
ン（Ａｒｇ） ０．６０アスパラギン酸／ア
スパラギン（Ａｓｐ／Ａｓｎ） ０．３ ８
システイン（Ｃｙｓ） 測定せずグルタミン
酸／グルタミン （Ｇｌｕ／Ｇｌｎ）
０．７ ５グリンン（Ｇｌｙ） ０．５９
ヒスチジン（Ｈｉｓ） ０．２１イアｏイシ
ン（ｒ ｌ ｅ）’ ０．４２ロイシン（Ｌｅ
ｕ） ０．４６リジン（Ｌｙｓ）
１．５３メチオニン（Ｍｅｔ）
０．２４フェニルアラニン（Ｐｈｅ） ０．１６プ
ロリ７（Ｐｒｏ） ０．４６セリ：ｚ
（Ｓｅｒ） ０．９７トリブトフアン（Ｔ
ｒｐ） 測定せずトレオニン（Ｔｈｒ＞
０．５６チロシン（Ｔｙｒ） ０．
２９バリン（Ｖａｌ） ０．６３ｄ）アミ
ノ酸配列 アミノ末端側より、４２個のアミノ酸が以下の配列を有
している。
ン（Ａｒｇ） ０．６０アスパラギン酸／ア
スパラギン（Ａｓｐ／Ａｓｎ） ０．３ ８
システイン（Ｃｙｓ） 測定せずグルタミン
酸／グルタミン （Ｇｌｕ／Ｇｌｎ）
０．７ ５グリンン（Ｇｌｙ） ０．５９
ヒスチジン（Ｈｉｓ） ０．２１イアｏイシ
ン（ｒ ｌ ｅ）’ ０．４２ロイシン（Ｌｅ
ｕ） ０．４６リジン（Ｌｙｓ）
１．５３メチオニン（Ｍｅｔ）
０．２４フェニルアラニン（Ｐｈｅ） ０．１６プ
ロリ７（Ｐｒｏ） ０．４６セリ：ｚ
（Ｓｅｒ） ０．９７トリブトフアン（Ｔ
ｒｐ） 測定せずトレオニン（Ｔｈｒ＞
０．５６チロシン（Ｔｙｒ） ０．
２９バリン（Ｖａｌ） ０．６３ｄ）アミ
ノ酸配列 アミノ末端側より、４２個のアミノ酸が以下の配列を有
している。
Ｈ，Ｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｌｙｓ−３
ｅｒ−＾１ａ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｇ ｌ ｙ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ Ｉ
ａ−Ｖａ ｌ −Ｔ ｈ ｒ−Ｌｙｓ−Ａ Ｉ ａ−Ｇ
Ｉｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ ｌｙ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−９ｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ一本発明物質は、ヒト細胞を培地に
培養し、培養物中に本発明物質を１積させ、該培養物か
ら採取することによって得られる。
ｅｒ−＾１ａ−Ｐｒｏ−＾１ａ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙ
ｓ−Ｇ ｌ ｙ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａ Ｉ
ａ−Ｖａ ｌ −Ｔ ｈ ｒ−Ｌｙｓ−Ａ Ｉ ａ−Ｇ
Ｉｎ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇ ｌｙ−Ｌｙｓ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−＾ｒｇ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｌ
ｙｓ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−９ｅｒ−Ｖａｌ−Ｔｙ
ｒ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ一本発明物質は、ヒト細胞を培地に
培養し、培養物中に本発明物質を１積させ、該培養物か
ら採取することによって得られる。
本発明物質生産のために用いられるヒト細胞としては、
該物質を生産する細胞であればいかなる細胞株も用いる
ことができる。好適な例としては、ヒトＢリンパ腫細胞
ＳＳＹ株、バーキットリンパ腫ナマノＣバ株などがあげ
られる。
該物質を生産する細胞であればいかなる細胞株も用いる
ことができる。好適な例としては、ヒトＢリンパ腫細胞
ＳＳＹ株、バーキットリンパ腫ナマノＣバ株などがあげ
られる。
培地としては、ハムＦＩＯ培地、ハムＦ１２培地（以上
フローラボ社製）、ダルベ１コウＭＥＭ培地、ＭＥＭ培
地、ＲＰＭＩ−１６４０培地（以上日永製薬社製）など
の無蛋白培地が用いられる。
フローラボ社製）、ダルベ１コウＭＥＭ培地、ＭＥＭ培
地、ＲＰＭＩ−１６４０培地（以上日永製薬社製）など
の無蛋白培地が用いられる。
培地には、必要により、仔牛脂児血清１〜１０％（１ν
／Ｖ）。
／Ｖ）。
グルタミン０．５〜５ｍＭ／ｍｌ、抗生物質〔ベニシリ
ア （２５Ｕ／ｍｌ） 、ストレプトマイシン（２５ｘ
／ｎ＋Ｉ）など〕１重曹（０，０１％）などを適ｌ加え
てもよい。
ア （２５Ｕ／ｍｌ） 、ストレプトマイシン（２５ｘ
／ｎ＋Ｉ）など〕１重曹（０，０１％）などを適ｌ加え
てもよい。
培地には、種々の培養ビン、ンヤーレ、ローラボトル、
スピンナーフラスコ、ジャーファーメンタ−などを用い
ることができる。培養は、通常種細胞密度５Ｘ１０’
〜２Ｘ１０’細胞／ｍｌとし、３０〜４０℃、２〜４日
間行うと、各細胞密度に応じ、本発明物質が主に培養液
中に生成する。たとえば、Ｉ Ｘ １０’細胞／ｍｌの
種細胞密度、３７ｔ、２日間の培養では、培養液中に４
４単位／ｍｌの活性物質が生成する。
スピンナーフラスコ、ジャーファーメンタ−などを用い
ることができる。培養は、通常種細胞密度５Ｘ１０’
〜２Ｘ１０’細胞／ｍｌとし、３０〜４０℃、２〜４日
間行うと、各細胞密度に応じ、本発明物質が主に培養液
中に生成する。たとえば、Ｉ Ｘ １０’細胞／ｍｌの
種細胞密度、３７ｔ、２日間の培養では、培養液中に４
４単位／ｍｌの活性物質が生成する。
培養物からの本発明物質の採取は、塩析、クロマトグラ
フィー、電気泳劾法、抽出法、遠心分燐法、ｆｉ析法な
どを単独または適宜組み合わせることにより行う。具体
的には次のとおり行う。得られた培養液上清を、冷却遠
心分離し、限外濾過用ホロファイバーで冷却下濃縮する
。濃縮液をリン酸緩衝液に対して透析する。
フィー、電気泳劾法、抽出法、遠心分燐法、ｆｉ析法な
どを単独または適宜組み合わせることにより行う。具体
的には次のとおり行う。得られた培養液上清を、冷却遠
心分離し、限外濾過用ホロファイバーで冷却下濃縮する
。濃縮液をリン酸緩衝液に対して透析する。
透析液をＱＡＥタイプまたはＤＥＡＥタイプの陰イオン
交換樹脂、たとえばＤＥＡＥ−トヨバール（東洋曹達社
製）カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜１．０Ｍの
ＮａＣｊ！匂配で溶出する。活性画分を集め限外ｐ過膜
により濃縮し、高速液体クロマトグラフィータイプの陰
イオン交換樹脂たトエハファルマシアＦＰＬＣモノＱ（
ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）カラムクロ
マトグラフィーにかける。０〜１．０ＭのＮａＣｊ！匂
配で溶出し、活性画分を回収する。活性画分を限外濾過
でｓ！１後、逆相高速液体クロマトグラフィーにかける
。０．１％トリフルオロ酢酸から７０％アセトニトリル
を含む０．１％トリフルオロ酢酸までの匂配溶出を行う
。アセトニ） ＩＪル約４５％で溶出される両分に活性
画分が溶出される。
交換樹脂、たとえばＤＥＡＥ−トヨバール（東洋曹達社
製）カラムクロマトグラフィーにかけ、０〜１．０Ｍの
ＮａＣｊ！匂配で溶出する。活性画分を集め限外ｐ過膜
により濃縮し、高速液体クロマトグラフィータイプの陰
イオン交換樹脂たトエハファルマシアＦＰＬＣモノＱ（
ファルマシア・ファイン・ケミカルズ社製）カラムクロ
マトグラフィーにかける。０〜１．０ＭのＮａＣｊ！匂
配で溶出し、活性画分を回収する。活性画分を限外濾過
でｓ！１後、逆相高速液体クロマトグラフィーにかける
。０．１％トリフルオロ酢酸から７０％アセトニトリル
を含む０．１％トリフルオロ酢酸までの匂配溶出を行う
。アセトニ） ＩＪル約４５％で溶出される両分に活性
画分が溶出される。
活性画分を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分析することにより活性画分が単一蛋白質であることを
確認する。
分析することにより活性画分が単一蛋白質であることを
確認する。
本発明物質の分析は以下の方法で行われている。
（１） 分子量
Ａ、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法（以下５ＤＳ−ＰＡＧＥという）による分子
量測定 レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）らの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、
Ｕ、に、。
電気泳動法（以下５ＤＳ−ＰＡＧＥという）による分子
量測定 レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）らの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、
Ｕ、に、。
ｅｔ ａｌ、、ネイチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）、
２２７． ６８０゜１９７０Ｅに従い濃度１５％のポリ
アクリルアミドゲルを使用する５ＤＳ−ＰＡＧＥにより
測定する。
２２７． ６８０゜１９７０Ｅに従い濃度１５％のポリ
アクリルアミドゲルを使用する５ＤＳ−ＰＡＧＥにより
測定する。
Ｂ、セファデックスＧ−１００を用いたゲルｐ適法によ
る分子量測定 セファデックスＧ−１００（ファルマンア社製）をカラ
ム（１８Ｘ ２４０ ＩＩ＋ｓ、 ガラスカラム）に
充填し、ｌＱｍＭリン酸緩衝液−ＮａＣｊ！ （ＰＢＳ
）１０．３１ｉ４ ＮａＣｊ！ （ｐＨ７，２）の緩
衝液を用い、本発明物質を添加し、ゲル濾過を行う。分
子量は溶出位置より標準分子量キット（ファルマシア社
製）から求めた標準曲線を用いて算出する。
る分子量測定 セファデックスＧ−１００（ファルマンア社製）をカラ
ム（１８Ｘ ２４０ ＩＩ＋ｓ、 ガラスカラム）に
充填し、ｌＱｍＭリン酸緩衝液−ＮａＣｊ！ （ＰＢＳ
）１０．３１ｉ４ ＮａＣｊ！ （ｐＨ７，２）の緩
衝液を用い、本発明物質を添加し、ゲル濾過を行う。分
子量は溶出位置より標準分子量キット（ファルマシア社
製）から求めた標準曲線を用いて算出する。
（２）等電点
Ａ、クロマトフオーカシング法
０、０２５ Ｍ ）リエチルアミンー塩酸援衡液（ｐ）
（１１，０）で平衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム（０
，５Ｘ ２０ｃｍ、）７／ｌ／？シア社製）を用い、溶
出はＱ、 Ｑ Ｑ ７５ｍｍｏｌ／ ｐ Ｈ単位／ｍｌ
ファルマライト（ｐＨ８〜１０．５）−塩酸（ｐＨ８，
０）を用いるクロマトフオーカシング法（Ｓｉｅｇｅｌ
、 Ｌ、 Ｍ、 、 バイオキミカ エトバイオフィ
ジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔＢｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ Ａｃｔａ） １１２． ３４６．１９６
６ ］により等電点測定を行う。等電点は、溶出位置に
おけるｐＨの実測値よりもとめる。
（１１，０）で平衡化したＦＰＬＣ用モノＰカラム（０
，５Ｘ ２０ｃｍ、）７／ｌ／？シア社製）を用い、溶
出はＱ、 Ｑ Ｑ ７５ｍｍｏｌ／ ｐ Ｈ単位／ｍｌ
ファルマライト（ｐＨ８〜１０．５）−塩酸（ｐＨ８，
０）を用いるクロマトフオーカシング法（Ｓｉｅｇｅｌ
、 Ｌ、 Ｍ、 、 バイオキミカ エトバイオフィ
ジカ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔＢｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ Ａｃｔａ） １１２． ３４６．１９６
６ ］により等電点測定を行う。等電点は、溶出位置に
おけるｐＨの実測値よりもとめる。
Ｂ１等電点電気泳動
等電点装置（ファルマシア社製、スウェーデン）とアン
ホライン（＾ｍｐｈｏｌｉｎｅ） ポリアクリルアミ
ドブレート（ｐＨ３，５〜ｌ １．０ ）（ＬＫＢ社マ
ニュアルに従い作成）を使用し、Ｌ１等電点測定マーカ
ーキット（ファルマシア社製、スウェーデン）を使用し
て、等電点を測定する。等電点は銀染色法（第１化学薬
品）により染色後、等電点マーカーを基準に算出する。
ホライン（＾ｍｐｈｏｌｉｎｅ） ポリアクリルアミ
ドブレート（ｐＨ３，５〜ｌ １．０ ）（ＬＫＢ社マ
ニュアルに従い作成）を使用し、Ｌ１等電点測定マーカ
ーキット（ファルマシア社製、スウェーデン）を使用し
て、等電点を測定する。等電点は銀染色法（第１化学薬
品）により染色後、等電点マーカーを基準に算出する。
（３） アミノ酸組成比
６Ｎ塩酸で１１０℃、２０時間加水分解（減圧下）後、
アミノ酸アナライザー〔ピコタグ（Ｐ ＩＣＯ・ＴＡＣ
，） 、 ウｔ−ターズ社製、アメリカ〕によりアミノ
酸組成を分析する。
アミノ酸アナライザー〔ピコタグ（Ｐ ＩＣＯ・ＴＡＣ
，） 、 ウｔ−ターズ社製、アメリカ〕によりアミノ
酸組成を分析する。
（４）アミノ酸配列
Ｎ末端アミノ酸配列は自動アミノ酸配列測定機“ガス−
フェーズ−プロティン拳ンークエンサー・モデル４７０
Ａ″（アプライド・バイオシステムズ社製）とスペクト
ラ・フィツクス（Ｓｐｅｃｔｒａ ｐｈｙｓｉｃｓ）社
製高速液体り０７トグラフイーの組み合せによって測定
する。
フェーズ−プロティン拳ンークエンサー・モデル４７０
Ａ″（アプライド・バイオシステムズ社製）とスペクト
ラ・フィツクス（Ｓｐｅｃｔｒａ ｐｈｙｓｉｃｓ）社
製高速液体り０７トグラフイーの組み合せによって測定
する。
（５）活性測定法
等厚らの方法（臨床検査 訃、 （３）、 ３２８．１
９８４＞に準じて、活性の評価をする。すなわち、４〜
６週令のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの胸腺細胞をｌＯ％仔牛脂
児血清（Ｆｅ２）（ギプコ社製）およびコンカナバリ：
／Ａ （ＣｏｎＡ）０．５〜１．０４ｇ／ｍｌを加えた
ＲＰＭＩ−１６４０培地（田水製薬社製）に１〜２ Ｘ
ｌ Ｏ’細胞／ｍｌの濃度で懸濁させる。この胸腺細
胞懸濁液０．１〜ｌおよび適当濃度に希釈した本発明試
料各Ｑ、ｌｎ＋ｌを９６穴マイクロプレートの各ウェル
に入れ、これを５％炭酸ガス含有空気中、３７℃で４８
時間培養する。０．２５μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウ
ェルにパルスラベルして、３日目に細胞を回収する。３
Ｈ−チミジンの導入は続く液体シンチレーション計数に
より測定する。活性は最大胴線細胞３Ｈ−チミジン導入
の５０９６を発生させる能力を１単位とし、これに試料
の希釈倍率を乗する方法で表す。なお、比活性は、ブラ
ッドフォードの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｎ、Ｍ、、ｅ
ｔ ａｌ、、アナリティ力ルバイオケミストリ（＾ｎ
ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）。
９８４＞に準じて、活性の評価をする。すなわち、４〜
６週令のＣ３Ｈ／Ｈｅマウスの胸腺細胞をｌＯ％仔牛脂
児血清（Ｆｅ２）（ギプコ社製）およびコンカナバリ：
／Ａ （ＣｏｎＡ）０．５〜１．０４ｇ／ｍｌを加えた
ＲＰＭＩ−１６４０培地（田水製薬社製）に１〜２ Ｘ
ｌ Ｏ’細胞／ｍｌの濃度で懸濁させる。この胸腺細
胞懸濁液０．１〜ｌおよび適当濃度に希釈した本発明試
料各Ｑ、ｌｎ＋ｌを９６穴マイクロプレートの各ウェル
に入れ、これを５％炭酸ガス含有空気中、３７℃で４８
時間培養する。０．２５μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウ
ェルにパルスラベルして、３日目に細胞を回収する。３
Ｈ−チミジンの導入は続く液体シンチレーション計数に
より測定する。活性は最大胴線細胞３Ｈ−チミジン導入
の５０９６を発生させる能力を１単位とし、これに試料
の希釈倍率を乗する方法で表す。なお、比活性は、ブラ
ッドフォードの方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ｎ、Ｍ、、ｅ
ｔ ａｌ、、アナリティ力ルバイオケミストリ（＾ｎ
ａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、）。
７２、２４８． １９７６）または、５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルの銀染色からの蛋白質定量値を基に、前
述の方法で算出した単位数をこの定量値で割った値で表
す。
リルアミドゲルの銀染色からの蛋白質定量値を基に、前
述の方法で算出した単位数をこの定量値で割った値で表
す。
本発明のＴ細胞活性化因子を先の活性測定法に従って活
性測定を行った結果、第１図に示されるように本発明因
子がＴ細胞活性化作用をもっていることが明らかである
。第１図の実験においては、Ｃ３Ｈ／Ｈａマウス胸腺細
胞１０７細胞／ｍｌを、０．５鴻／ｍｌのコンカナバリ
ンＡ（ＣｏｎＡ）存在下、４８時間培養後、続く２４時
間の〔３Ｈ〕−チミジンの取り込みにより活性測定を行
った。
性測定を行った結果、第１図に示されるように本発明因
子がＴ細胞活性化作用をもっていることが明らかである
。第１図の実験においては、Ｃ３Ｈ／Ｈａマウス胸腺細
胞１０７細胞／ｍｌを、０．５鴻／ｍｌのコンカナバリ
ンＡ（ＣｏｎＡ）存在下、４８時間培養後、続く２４時
間の〔３Ｈ〕−チミジンの取り込みにより活性測定を行
った。
ヒト白血病細胞株Ｈ３Ｂ、２細胞［Ｋａｓａｈａｒａ。
Ｔ、ｅｔ ａｌ、、 ジャーナル・オブ・イムノロ
ジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、 １３４．１６８２
（１９８６）） ’１０’細胞／ｍｌを５Ｌｃｇ／ｍ
ｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）存在下、本発明因
子１０ｎｇ／ｍｌとともに２４時間培養し、培養上清中
のＩＬ−２活性を測定した。ＩＬ−２活性はＩＬ−２依
存性キラ−Ｔ細胞株を用いて、ＰＨ）−チミジンの取り
込み量として測定した。結果を第１表に示す。
ジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、 １３４．１６８２
（１９８６）） ’１０’細胞／ｍｌを５Ｌｃｇ／ｍ
ｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）存在下、本発明因
子１０ｎｇ／ｍｌとともに２４時間培養し、培養上清中
のＩＬ−２活性を測定した。ＩＬ−２活性はＩＬ−２依
存性キラ−Ｔ細胞株を用いて、ＰＨ）−チミジンの取り
込み量として測定した。結果を第１表に示す。
第 １ 表
Ｔ細胞活性化因子 ＩＬ−２生成（ｃｐｍ）−２，
８９８± ８００ ＋ １５．１００ ±１．０７３本発明物
質のＮ末端より４２番目までのアミノ酸配列は、ヒトヒ
ストン８２Ｂと同一のＮ末端アミノ酸まで構造を有する
。しかし、以下の点で本発明因子はヒトヒストン８２Ｂ
と異なる。
８９８± ８００ ＋ １５．１００ ±１．０７３本発明物
質のＮ末端より４２番目までのアミノ酸配列は、ヒトヒ
ストン８２Ｂと同一のＮ末端アミノ酸まで構造を有する
。しかし、以下の点で本発明因子はヒトヒストン８２Ｂ
と異なる。
すなわち、該物質は分子量がヒト膵臓から分画したヒス
ト７Ｈ２Ｂ （Ｏｈｅ、Ｙ、 ｅｔ ａｌ、、Ｊ。
ト７Ｈ２Ｂ （Ｏｈｅ、Ｙ、 ｅｔ ａｌ、、Ｊ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 ８５．６１５．１９７９）より約
１１００はど大きく、等電点がヒストン８２ＢよりｐＩ
値として約１．５低い。次に、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーでは物質の構造、性質により、保持時間に差異
が認められることから、該物質とヒストン８２Ｂの保持
時間の比較をした。その結果、第３図に示したとおり、
保持時間に１０分以上の差が認められる。また、活性の
比較を行ったところ、ヒストン８２ＢにもＴ細胞活性能
が認められたが、それは本発明因子の１／１０程度と低
く、本発明因子はヒストン８２Ｂと差異が認められた。
１１００はど大きく、等電点がヒストン８２ＢよりｐＩ
値として約１．５低い。次に、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーでは物質の構造、性質により、保持時間に差異
が認められることから、該物質とヒストン８２Ｂの保持
時間の比較をした。その結果、第３図に示したとおり、
保持時間に１０分以上の差が認められる。また、活性の
比較を行ったところ、ヒストン８２ＢにもＴ細胞活性能
が認められたが、それは本発明因子の１／１０程度と低
く、本発明因子はヒストン８２Ｂと差異が認められた。
さらに該因子は培地上清中に見出される分泌蛋白である
がヒストン８２Ｂは核内に存在する構造蛋白である点で
大きく異なるものである。従って本発明因子は、Ｔ細胞
活性化能を有し、ヒストン８２Ｂ様構造を分子内に含む
、分子予約１７．５００の新規な生理活性蛋白質である
ことがわかる。
がヒストン８２Ｂは核内に存在する構造蛋白である点で
大きく異なるものである。従って本発明因子は、Ｔ細胞
活性化能を有し、ヒストン８２Ｂ様構造を分子内に含む
、分子予約１７．５００の新規な生理活性蛋白質である
ことがわかる。
実施例１゜
（１）細胞培養
ヒトリンパ腫細胞系５ＳＹ−１株（英国Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ 八ｎｉｍａｌ
Ｃｅ１ｌ Ｃｕ１ｔｕｒｅに１９８５年８月１３
日イ寸でＮＣＡＣＣ８５０６１９０１として寄託しであ
る。）５Ｘ１０’細胞／ｍｌを５％仔牛脂児血清を加え
たＲＰＭ Ｉ培地（日永製薬社製） ８０ Ｑｍｌを含
むスピナーフラスコ（染出製作所社製）に接種し、培養
を３７℃で４８時間行った。細胞濃度が２ Ｘ １０’
細胞／ｍｌに到達したとき、培地を１％仔牛脂児血清を
加えたＲＰＭＩ−１６４０培地８０ Ｑｍｌに交換し、
さらにシリカ（マリンクロットケミカルワークス社製）
を培地に対して、１００■／ｍｌ加えて、３７℃で４３
時間培１した。かくして、Ｔ細胞活性化因子が４４．４
単位／ｍｌ培地に蓄積した。
ｌ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ ｏｆ 八ｎｉｍａｌ
Ｃｅ１ｌ Ｃｕ１ｔｕｒｅに１９８５年８月１３
日イ寸でＮＣＡＣＣ８５０６１９０１として寄託しであ
る。）５Ｘ１０’細胞／ｍｌを５％仔牛脂児血清を加え
たＲＰＭ Ｉ培地（日永製薬社製） ８０ Ｑｍｌを含
むスピナーフラスコ（染出製作所社製）に接種し、培養
を３７℃で４８時間行った。細胞濃度が２ Ｘ １０’
細胞／ｍｌに到達したとき、培地を１％仔牛脂児血清を
加えたＲＰＭＩ−１６４０培地８０ Ｑｍｌに交換し、
さらにシリカ（マリンクロットケミカルワークス社製）
を培地に対して、１００■／ｍｌ加えて、３７℃で４３
時間培１した。かくして、Ｔ細胞活性化因子が４４．４
単位／ｍｌ培地に蓄積した。
同操作をくり返し、該因子を有する培養上清２７！を得
た。
た。
（２）Ｔ細胞活性化因子の分離精製
１）精製工程ｌ
上記培養上清２７．ｆ！を冷却遠心分離機（４℃）で８
．０００回転／分、２０〜３０分間遠心分離した。上澄
液を４℃で限外濾過用ホロファイバー（分画分子１３，
０００．アミコン社製）を用いて約１５倍濃縮した。濃
縮サンプルをさらに同ホロファイバーを用いて、ポリエ
チレングリコール６．０００を０．０１％含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，５）に対し、ＮａＣβ濃度１
濃度１稈 ２）精製工程２ 工程１で得られた濃縮液的２βを０．０１％ポリエチレ
ングリコール６、 ０ ０ ０を含む１０ｍＭＩＪン酸
暖衡液（ ｐ Ｈ ７． ５ ）で平衡化したＤＥＡＥ
− ）ヨバール６ ５ ０ Ｍ （２．８ｃｍＸ ４
０ｃｍ）（東洋曹達社製）カラムを用いるＤＥＡＥ−ト
ヨバールクロマトグラフィーで処理した。
．０００回転／分、２０〜３０分間遠心分離した。上澄
液を４℃で限外濾過用ホロファイバー（分画分子１３，
０００．アミコン社製）を用いて約１５倍濃縮した。濃
縮サンプルをさらに同ホロファイバーを用いて、ポリエ
チレングリコール６．０００を０．０１％含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐ Ｈ７，５）に対し、ＮａＣβ濃度１
濃度１稈 ２）精製工程２ 工程１で得られた濃縮液的２βを０．０１％ポリエチレ
ングリコール６、 ０ ０ ０を含む１０ｍＭＩＪン酸
暖衡液（ ｐ Ｈ ７． ５ ）で平衡化したＤＥＡＥ
− ）ヨバール６ ５ ０ Ｍ （２．８ｃｍＸ ４
０ｃｍ）（東洋曹達社製）カラムを用いるＤＥＡＥ−ト
ヨバールクロマトグラフィーで処理した。
サンプル充填後、カラム平衡暖衝液で洗浄し、次に０〜
１．０Ｍの塩化ナトリウム匂配で溶出した。前記活性測
定法より活性画分を同定した。主な活性は約０．６〜０
．８ＭのＮａＣβで溶出した（約１８０ｍ１）。この方
法により生理活性画分の回収率は約２３％であり、精製
度は約２．５００倍であった。
１．０Ｍの塩化ナトリウム匂配で溶出した。前記活性測
定法より活性画分を同定した。主な活性は約０．６〜０
．８ＭのＮａＣβで溶出した（約１８０ｍ１）。この方
法により生理活性画分の回収率は約２３％であり、精製
度は約２．５００倍であった。
３）精製工程３
工程２で得られた活性画分１８０＋ｎｌを集めて、限外
濾過膜ＹＭ５（アミコン社製）により、約１００倍濃縮
したく約２１１１１）。この濃縮液を１０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐ Ｈ７，５）により、ＮａＣβ濃度を約３
ＱｍＭまで希釈の後、ファルマシアＦＰＬＣモノＱカラ
ム（５ｅＸ５０ｍｍ）（ファルマシア・ファイン・ケミ
カルズ社製）に吸着させた。カラムを１０ｍＭ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄し、次に０〜ＩＭの塩化
す）ＩＪウム匂配で溶出した。活性画分は、約０．３〜
０．５ＭＮａＣβで溶出した（約１５ｍ１）。この工程
の活性回収率は約６０％であり、精製度は約１．３倍上
昇する。
濾過膜ＹＭ５（アミコン社製）により、約１００倍濃縮
したく約２１１１１）。この濃縮液を１０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐ Ｈ７，５）により、ＮａＣβ濃度を約３
ＱｍＭまで希釈の後、ファルマシアＦＰＬＣモノＱカラ
ム（５ｅＸ５０ｍｍ）（ファルマシア・ファイン・ケミ
カルズ社製）に吸着させた。カラムを１０ｍＭ）リス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５）で洗浄し、次に０〜ＩＭの塩化
す）ＩＪウム匂配で溶出した。活性画分は、約０．３〜
０．５ＭＮａＣβで溶出した（約１５ｍ１）。この工程
の活性回収率は約６０％であり、精製度は約１．３倍上
昇する。
４）精製工程４
工程３で得られた活性画分１５ｍ１を集めて、限外−過
膜ＹＭ５（アミコン社製）により、約１０倍濃縮した。
膜ＹＭ５（アミコン社製）により、約１０倍濃縮した。
ａ槽液を逆相高速液体クロマトグラフィーカラムＭＭＣ
−パックＡＭ−３１２０ＤＳ （１５ｃｍｘ６ｍ、栗田
工業社製）ニカケタ。ＴＲＩＲＯＴＡＲＳＲ高速液体ク
ロマトグラフィー（日本分光社製）を使用し、２１０ｎ
ｍの吸光度で溶出液をモニターした。溶出は３０℃で０
．１％トリフルオロ酢酸から７０％アセトニトリルを含
む０．１％トリフルオロ酢酸までの匂配により１．Ｏ１
′ｎｌＺ分の流速で行った。該因子はアセトニトリル濃
度的４２％で溶出された。活性画分を１５％５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分析することにより、
該両分は分子量的１７．５００の単一蛋白質を含むこと
を確認した。この工程の活性回収率は約３１％であり、
精製度は約２５倍であった。
−パックＡＭ−３１２０ＤＳ （１５ｃｍｘ６ｍ、栗田
工業社製）ニカケタ。ＴＲＩＲＯＴＡＲＳＲ高速液体ク
ロマトグラフィー（日本分光社製）を使用し、２１０ｎ
ｍの吸光度で溶出液をモニターした。溶出は３０℃で０
．１％トリフルオロ酢酸から７０％アセトニトリルを含
む０．１％トリフルオロ酢酸までの匂配により１．Ｏ１
′ｎｌＺ分の流速で行った。該因子はアセトニトリル濃
度的４２％で溶出された。活性画分を１５％５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動で分析することにより、
該両分は分子量的１７．５００の単一蛋白質を含むこと
を確認した。この工程の活性回収率は約３１％であり、
精製度は約２５倍であった。
なお全工程を通じての活性回収率は約４％であり、精製
度は約８．５Ｘ１０’倍であった。
度は約８．５Ｘ１０’倍であった。
また該因子の生物活性は、約Ｉ Ｘ １０’単位／＋ｇ
蛋白であった。
蛋白であった。
なお精製結果のまとめを第２表に示した。
第２表 Ｔ細胞活性化因子のｍ製
発明の効果
本発明によれば、免疫担当細胞の機能を活性化し、癌そ
の他の疾患に対する治療に用いることができる新規なＴ
細胞活性化因子が提供される。
の他の疾患に対する治療に用いることができる新規なＴ
細胞活性化因子が提供される。
第１図は、本発明因子のＴ細胞活性化作用によるＣ３Ｈ
／Ｈｅマウス胸腺細胞への〔３Ｈ〕−チミジンの取り込
み活性を示す。
／Ｈｅマウス胸腺細胞への〔３Ｈ〕−チミジンの取り込
み活性を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）下記の理化学的性質を有する新規Ｔ細胞活性化因子
。 ａ）分子量：約１７，５００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法） ｂ）等電点：９．５±０．３（クロマトフォーカシング
法） ｃ）アミノ酸組成比：６Ｎ塩酸で１１０℃、 ２０時間減圧下に加水分解後、アミノ酸アナライザーに
より分析したアミノ酸組成比（モル比）はアラニン（Ａ
ｌａ）を１．００として以下の通りである。 アラニン（Ａｌａ） １．００ アルギニン（Ａｒｇ） ０．６０ アスパラギン酸／アスパラギン（Ａｓｐ／Ａｓｎ） ０
．３８ システイン（Ｃｙｓ） 測定せず グルタミン酸／グルタミン（Ｇｌｕ／Ｇｌｎ） ０．７
５ グリシン（Ｇｌｙ） ０．５９ ヒスチジン（Ｈｉｓ） ０．２１ イソロイシン（Ｉｌｅ） ０．４２ ロイシン（Ｌｅｕ） ０．４６ リジン（Ｌｙｓ） １．５３ メチオニン（Ｍｅｔ） ０．２４ フェニルアラニン（Ｐｈｅ） ０．１６ プロリン（Ｐｒｏ） ０．４６ セリン（Ｓｅｒ） ０．９７ トリプトファン（Ｔｒｐ） 測定せず トレオニン（Ｔｈｒ） ０．５６ チロシン（Ｔｙｒ） ０．２９ バリン（Ｖａｌ） ０．６３ ｄ）アミノ酸配列 アミノ末端側より、４２個のアミノ酸が以下の配列を有
している。 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61181014A JPS6335600A (ja) | 1986-07-31 | 1986-07-31 | Ｔ細胞活性化因子 |
| EP87306829A EP0256735A3 (en) | 1986-07-31 | 1987-07-31 | T cell-activating factor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61181014A JPS6335600A (ja) | 1986-07-31 | 1986-07-31 | Ｔ細胞活性化因子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6335600A true JPS6335600A (ja) | 1988-02-16 |
Family
ID=16093239
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61181014A Pending JPS6335600A (ja) | 1986-07-31 | 1986-07-31 | Ｔ細胞活性化因子 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0256735A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6335600A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4130786A1 (de) * | 1991-09-16 | 1993-03-18 | Symbiotec Gmbh | Peptide zur herstellung von mitteln zur diagnose und therapie von systemischen lupus |
-
1986
- 1986-07-31 JP JP61181014A patent/JPS6335600A/ja active Pending
-
1987
- 1987-07-31 EP EP87306829A patent/EP0256735A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0256735A3 (en) | 1988-05-04 |
| EP0256735A2 (en) | 1988-02-24 |
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