JPS6336778A - 耐熱性グルコアミラ−ゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なグルコアミラーゼとその製造法に係わ
り、特にぶどう糖製造におけるでん粉の糖化反応に好適
な耐熱性／耐酸性グルコアミラーゼとその製造法に関す
る。

〔従来技術〕

耐熱性酵素は、常温用酵素に比べ、加熱やｐＨの変化に
も安定性が高く、酵素利用工業には極めて有用である。

現在、工業的に用いられているグルコアミラーゼはリゾ
プス（Ｒｈ　１ｚｏｐｕｓ）属およびアスペルギルス（
Ａｓｐｅｒｇｉｌ　１ｕｓ）属から産生されており、い
ずれも常温性酵素であり、５０℃を越えると急速な酵素
活性の失活が起る（酵素利用ハンドブックｐ６２．他人
書館、昭和５７年）。耐熱性に優れたグルコアミラーゼ
については、Ｖ、Ｂａｓａｖｅｓｗａｒａ等（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｊ、、１９３．３７９．１９８１年）やカドコ
シン等（特開昭６０−５４６８０号）の例があるが、い
ずれも熱安定性を発揮するためにはｐ１）６程度の中性
条件が必要である。ところで、でん粉を原料とするぶど
う糖の製造は、１０〜４０％濃度のでん粉スラリーをα
−アミラーゼにより液化する液化工程及びこの液化でん
粉溶液をグルコアミラーゼにより糖化する糖化工程の２
工程により行われている。液化工程においては、原料で
ん粉中に含まれる不純物の有機酸のためにｐＨは５以下
、しばしば４以下を呈する。このため、先に本発明者ら
はｐＨ４においてもすぐれた耐熱性を有する新規なα−
アミラーゼを開発しく特願昭５９−２３６９１７号）、
でん粉スラリーを酸性状態のままで液化することを可能
にした。しかしながら、液化工程にひきつづいて行われ
る糖化反応に使用するグルコアミラーゼには、ｐＨ４〜
５の酸性条件下で作用可能な耐熱性酵素はまだ未開発で
ある。先に述べたカドコシン等の耐熱性グルコアミラー
ゼの作用好適ｐＨは６付近であり、このため、液化でん
粉溶液にアルカリを加えて中和しなければならない。そ
の結果、ぶどう糖や異性化糖等の最終製品を得る場合に
は、反応後に中和剤を除去することが必要となり、イオ
ン交換樹脂を用いる脱塩工程への負荷を著しく増大させ
ている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明の目的は、上記従来技術の問題点を解決し、でん
粉を原料としてぶとう等を製造するにあたりｐＨ５以下
、６０〜７５℃の条件下で使用可能なグルコアミラーゼ
、すなわち偏性嫌気性菌を起源とし、耐熱性に優れるの
みならず、耐酸性をも有する新規なグルコアミラーゼと
その製造法を提供することにある。

〔問題点を解決するための技術手段〕

本発明者らは、耐熱性にすぐれ、かつ耐酸性を有する新
規なグルコアミラーゼを得ることを目的に、酵素及び酵
素産生用微生物の探索を行った。

その結果、６０℃で培養した高温メタン醗酵液より分離
したクロスツリジウム属に属する偏性嫌気性細菌である
クロスツリジウム・エスピーＧ−０００５（ｃｌｏｓｔ
ｒｉｄｉｕｍ　ｓｐ　Ｇ−０００５）（微工研菌寄第８
７３７号）が、酵素の特性が従来のグルコアミラーゼと
全く異なる新規な耐熱性グルコアミラーゼを産生ずるこ
とを見い出し、本発明に至った。本発明のグルコアミラ
ーゼを産生ずるクロスツリジウム属細菌は、工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託している（受託番号：微工
研菌寄第８７３７号（１４ＲＭ　Ｐ−８７３７））。ま
ず、本田の菌学的性質の詳細を説明する。

なお、以下の記載において％は特に指示しない限り重量
％である。

Ａ、形態的性質 （１）栄養細胞の形態 下記のデキストリン・ペプトン培地の寒天平板上、嫌気
性雰囲気中、６０℃で２日間培養した場合、栄養細胞は
０．３〜０．５　Ｘ　２〜４μｍの大きさの直状の桿菌
である。上記の栄養細胞は単独あるいは連鎖して存在す
る。液体培養においても同様となる。また、細胞の多形
性はみられない。

デキストリン−ペプトン培地の組成 デキストリン　　　　　　　　　　１．５％ペプトン　
　　　　　　　　　　０．５％酵母エキス　　　　　　
　　　　０．５％Ｋｌｌ□ＰＯ４０，７％ Ｎａ１ｌ！Ｐ０．　　　　　　　　　　　０．２％Ｍｇ
５Ｏ，・７Ｈ，００，００１％ 寒天　　　　　　２．０％ チオグリコール酸ナトリウム　　０．１％水道水 ｐＨ６，０ （２）運動性の有無 運動性は認められない （３）胞子の有無 でん粉−ペプトン培地の寒天平板培養において胞子の形
成が認められる。胞子は栄養細胞内端部に形成され、直
径０．５μｍ程度の球状をなしている。

（４）ダラム染色性 陰性 Ｂ、各培地における生産状態 （１）コロニーの形態 でん粉−ペプトン培地の寒天平板培養でのコロニーは、
中心部がやや隆起した扁平な円形となり、周縁部は不規
則である。色素は産生せず、乳白色半透明である。

（２）肉汁寒天平板培養 生育は認められない 肉汁寒天培地組成 肉エキス　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０％食塩　　　　　０．２％ チオグリコール酸ナトリウム　０．１％寒天　　　　　
２．０％ 蒸留水 ｐＨ６，０ （３）肉汁寒天斜面培養 生育は認められない （４）肉汁寒天穿刺培養 穿刺線にそってわずかに増殖していることが観察される
。色素の産生は認められない。

（５）肉汁液体培養 生育は認められない 肉汁培地の組成 肉エキス　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　ｌ・０％食塩　　　　　０．２％ チオグリコール酸ナトリウム　０．０１％蒸留水 ｐＨ６，０ （６）肉汁・ゼラチン培養 生育は認められない。ゼラチンの液化も認められない。

肉汁ゼラチン培地の組成 肉エキス　　　　　　　　　　１．０％ペプトン　　　
　　　　　　　１．０％食塩　　　　　０．２％ ゼラチン　　　　　　　　　１５．０％チオグリコール
酸ナトリウム　０．１％蒸留水 ｐＨ６，０ （７）リドマスミルク培養 酸を生成して赤変し、固（凝固する。ガスの発生が認め
られる。

Ｃ０生理的性質 （１）生育の温度範囲 ４９〜６４℃で生育する。４６℃、６９℃では生育は認
められない。５７〜６１℃付近で良好に生育する。

（２）生育のｐＨ範囲 ｐＨ４．８〜７．５で生育する。ｐＨ６，０付近で良好
に生育する。

（３）酸素に対する態度 偏性嫌気性 （４）Ｏ−Ｆテスト　（Ｈｕｇｈ　Ｌａ１ｆｓｏｎ法）
陰性。空気雰囲気中及び流動パラフィン重層による嫌気
性条件下共にガス生成を伴って生育し、酸の生成により
黄色となる。空気雰囲気中での培養においては、気相境
界部より約１ｃｓ下より、底部にかけて生育した。

培地組成 ペプトン　　　　　　　　　　０．２％ぶとう糖　　　
　　　　　　　　１．０％食塩　　　　　０．５％ に２ＨＰ０．　　　　　　　　　　　　０．０３％ブロ
ムクレゾールパープル　　０．００２％寒天　　　　　
０．３％ 蒸留水 ｐＨ６，０ （５）硝酸塩の還元 陰性 （６）ＶＰテスト 陰性 （７）ＭＲテスト 陽性。赤変化する。

（８）インドール生成 ペプトン水に生育しないため測定できない。

（９）硫化水素の生成 陰性（Ｋｌｉｇｒｅｒの培地使用において）（１０）で
ん粉の加水分解 陽性 （１））クエン酸の利用 陽性（Ｓｉｍｏｎｓ培地使用において）（１２）アンモ
ニウム塩の利用 ペプトン水に生育せず、測定できない。

（１３）色素の菌体外生成 陰性 （１４）ウレアーゼ 陰性 （１５）オキシダーゼ 陰性 （１６）カタラーゼ 陰性 （１７）　ｔｔＪＭの資化性 糖の資化性及びダーラム管を用いたガス発生有無の観察
結果を第１表に示す。表中、資化性及びガスの生成が認
められた場合には＋、認められない場合には−の記号で
示した。

（本頁以下余白） 第　　　１　　　表 糖質化性試験用液体培地組成 炭素源（糖）１．０％ ペプトン　　　　　　　　　　１．０％ＮａＣ１０，２
％ チオグリコール酸ナトリウム　０．１％蒸留水 ｐＨ６，０ （１８）無機塩培地への生育 生育は認められない。

これらの結果よりバージ−の細菌分類マニュアル（Ｂｅ
ｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎ
ａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ　８ｔｈ　Ｅ
ｄｉｔｉｏｎ）に基づき、クロスツリジウムに属する細
菌と同定した。

次に、本発明なる耐熱性グリコアミラーゼの酵素的特性
について記す。

なお、グルコアミラーゼ活性の測定は次のように行った
。

グルコアミラーゼ活性測定の基質には可溶性でん粉（和
光純薬製、生化学用）を用いた。まず、５％可溶性でん
粉溶液０．５艷、ｐＨ４．５の０．１　Ｍ酢酸−酢酸ナ
トリウム緩衝液０．５ｄ、純水１ｍｌ。

酵素溶液０．５−を混合し、６０℃で３０分間酵素反応
を行わせた。次いで、反応液中のぶどう糖■をグルコー
ス分析器（米国、イエロー・スプリングス・インスツル
メント・カンパニー（Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ）社製、グルコ
ースオキシダーゼ法により測定する。）を用いて測定し
た。

グルコアミラーゼ活性の１単位は、上記測定条件下で１
分間に１μｍｏｌのぶとう糖を生成する能力と定義した
。

（１）調製方法 実施例において詳細に説明するので、ここでは筒車な説
明にとどめる。

本発明になるクロスツリジウム属細菌Ｇ−０００５菌を
、デキストリン・ペプトン及び酵母エキスを含有する液
体培地に接種し、嫌気条件下、６０℃にて１〜３日間培
養する。培養液を遠心分離等により菌体及びそれ以外の
不溶物質を除去したいわゆる培養濾液を得る。次いで、
培養濾液を、モレキュラーシーブ膜濾過、塩析イオン交
換クロマト、ゲル濾過クロマト等、公知の方法を適宜利
用して本発明のグルコアミラーゼを濃縮するとともに、
それ以外の不純物を除く。

なお、液体培養における液体培地の炭素源としては、上
記デキストリンに限るものではなく、可溶性でん粉、馬
鈴薯でん粉、コーンスターチ、甘薯でん粉、廃糖みつ等
を用いてもよい。また、その他の栄養成分も上記に限定
するものではなく、コーンステイープリカー、各種アミ
ノ酸、ビタミン、各種塩等を単独もしくは混合して用い
てもよい。

（２）作用及び基質特異性 本酵素は、馬鈴薯、とうもろこし、甘薯等のでん粉、お
よびこれらを加水分解して得た可溶性でん粉、デキスト
リン、マルトース等をぶとう糖に加水分解するグルコア
ミラーゼである。マルトース基質の場合、ぶどう糖生成
速度は可溶性でん粉基質の約２である。

（３）至適ｐＨ 本酵素の６０℃における作用ｐＨ曲線を第１図に示す。

本酵素の６０℃における最適ｐＨ域は４〜５にあり、か
つ、好適ｐＨは（最適ｐＨでの活性の８０％を有するｐ
Ｈ域とする）３．８〜５．７にある。

なお、反応の際のｐＨ緩衝液としては、塩化カリウム−
塩酸（ｐＨ２，０）、グリシン−塩酸（ｐ　Ｈ２，５〜
３．５）、β：β−ジメチルグルタル酸−トリス（ヒド
ロキシメチルアミノ）メタン−２−アミノ−２−メチル
−１：３−プロパンジオール（以下ｒＧＴＡＪと略称）
（ｐＨ３，５〜９）の０．０５Ｍ緩衝液を用いた。

（４）ｐＨ安定性 本発明のグルコアミラーゼをｐＨ２，３，４゜４．５，
５．６，７．９の各ｐＨ下（０，０５Ｍ塩化カリウム−
塩酸、　０．０５Ｍグリシン−塩酸及び０．０５ＭＧ　
Ｔ　Ａ’　１）衝液を使用）で７０℃、３０分間インキ
ュベートした。そののち、反応液を希釈し、ｐＨ４．５
に調整したのち、可溶性でん粉を基質として残存活性を
測定した。その結果を第２図に示した。本発明のグルコ
アミラーゼはｐＨ４．５〜５．０の範囲で完全に活性が
保持されていた。したがって、本グルコアミラーゼは酸
性領域ですぐれた安定性を有する酵素であることがわか
った。

（５）至適温度 本発明のグルコアミラーゼの活性をｐＨ４．５の条件下
、４０．５０．６０．６５．７０．７５℃の温度にて測
定したところ、第３図に示す結果を得た。本結果より、
至適温度は７０℃付近にある。好適温度（最適温度での
活性の８０％を有する温度域とする）は５３〜７３°Ｃ
である。

（６）グルコアミラーゼ活性に及ぼす金属塩の影響 本発明のグルコアミラーゼの活性に及ぼす金属塩の影響
を第２表に示す。グルコアミラーゼ活性の測定において
各種の金属塩を５ｍＭ８こなるように添加した。そして
、金属塩無添加に対する活性を％で表示した。なお、ア
ンモニウム塩及びＥＤＴＡ添加の場合についても第２表
に付記した。マグネシウムイオン、カルシウムイオン、
カリウムイオンがグルコアミラーゼ活性作用を有するこ
とが認められる。ニッケルイオン、鉄イオンには阻害作
用が認められる。

（来夏以下余白） 第　　　２　　　表 活性測定条件 ｐＨ５，０（０，１Ｍクエン酸−第２クエン酸ナトリウ
ム緩衝液）活性測定温度：６０”Ｃ（７）熱安定性 本発明のグルコアミラーゼを基質無添加下、ｐＨ４．５
にて、６０〜８０℃の加熱処理を行い、一定時間毎（２
０，４０秒、　　１．　２．　４．１０．２０．４０分
、１゜２．４．６，８．１６時間、１．２．４．７．１
０゜１５、２０日）に処理液の一部を採取し、液中のグ
ルコアミラーゼ活性を５Ｑ’Ｃ，ｐＨ４．５にて測定し
た。

これをもとに各温度における活性半減期を求め、その結
果を第４図に示した。７０℃及び７５℃における基質無
添加下での活性半減期はそれぞれ、６時間、１分間であ
る。本グルコアミラーゼはこれまで公知のグルコアミラ
ーゼに較べ高度の耐熱性を有している。一方、ｐ　Ｈ４
．０、４．３、４．５、５，０。

６．０の各ｐＨにおける基質無添加下、７０’Ｃでの活
性半減期を求め、第３表に示した。この結果から、本グ
ルコアミラーゼは、クロスツリジウム・サーモアミロリ
ディクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｍ
ｙｌｏｌｙ−ｔｉｃｕｍ）　、サーモマイセス・ラヌギ
ノスス（Ｔｈｅｒｍｏ−ｍｙｃｅｓ　１ａｎｕｇｉｎｏ
ｓｕｓＬ及びタラコミセス０デユポンテイ（Ｔａｌａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｄｕｐｏｎｔｉ）により産生されるグル
コアミラーゼよりも、特に、ｐＨ４〜５の酸性領域にお
いてすぐれた耐熱性をもっことを示す。

（本頁以下余白） （８）耐熱性に及ぼす金属塩の影響 本発明のグルコアミラーゼの耐熱性に及ぼす金属塩の影
響を第４表に示す。グルコアミラーゼの水溶液（０，０
５Ｍ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液に溶解、ｐＨ４．５）
に各種の金属塩を５ｍＭ濃度になるように添加し、７０
℃、１時間の加熱処理を行ったのち、ｐＨ４．５，６０
℃でグルコアミラーゼ活性を測定した。そして、加熱処
理前に対する加熱処理後の活性、すなわち残存活性を％
で表示した。

第４表から、ニッケルイオン、マンガンイオン、マグネ
シウムイオンに保護効果のあることが認められる。コバ
ルトイオン、カルシウムイオンについては保護効果は認
められない。亜鉛イオンは耐熱性を著しく低下させる。

（本頁以下余白） 第　　　４　　　表 （９）分子量 本発明のグルコアミラーゼの分子量はゲル濾過クロマト
法（スエーデン、ファルマシア製セファデックスＧ−１
００を使用）による溶出パターンから３．８Ｘ１０’と
測定される。

〔作　用〕　　　　′ 以上述べたことから明らかなように、本発明の新しい耐
熱性グルコアミラーゼは、特にｐＨ４〜５の酸性領域で
の耐熱性において、従来の嫌気性細菌の産生ずる耐熱性
酵素と著しく異なる。

ところで、ぶどう糖や異性化糖を製造するには、まず、
原料のでん粉をα−アミラーゼで液化し、そのあとグル
コアミラーゼで糖化している。液化の際、原料のでん粉
を２０〜４０％の高濃度に仕込むため、液のｐＨは酸性
を呈する。このため、従来の耐熱性α−アミラーゼ及び
耐熱性グルコアミラーゼを用いる場合には、作用ｐＨ域
が中性域にあるため、アルカリで中和しなければならな
い。

これに対し、先に本発明者らが見い出した耐熱性・耐酸
性の新規なα−アミラーゼ（特願昭５９−２３６９１７
号）及び、本発明の新規なグルコアミラーゼを用いるこ
とにより、液化での中和を行うことなく酸性の状態での
まま液化及び糖化を行うことが可能となり、ひいては反
応後の脱塩工程への負荷を大幅に軽減できる。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を示し、さらに詳しく説明する。

実施例１ デキストリン１．５％、ポリペプトン０．５％、酵母エ
キス０．５％、リン酸第１カリウム０．７％、リン酸第
２ナトリウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０
．００１％、チオグリコール酸ナトリウム０．１％及び
水道水を含む液体培地（ｐ　Ｈ６，０）　３２ｋｇを内
容積５１の培養槽１０基に３．１５　ｋｇづつ分注し、
１２０℃で１５分間殺菌した。それぞれの培養槽に上記
培地を用いて嫌気的に培養したクロスツリジウム属細菌
Ｇ−０００５の菌体懸濁液０．３５ｋｇを添加した。

次いで、ガス出口に水封トラップを付し、培養槽内気相
部をアルゴンガス（酸素濃度ｉ　ｐｐｍ以下）で十分置
換後、嫌気条件下で培養した。培養液のｐＨは６．０に
、培養液の温度は６０℃にそれぞれ自動調整した。２１
時間培養後、培養液を合せ、６０００ｒｐｍで遠心分離
し、菌体を除去した。回収した上澄液についてガラス濾
紙（東洋科学産業型、　ＧＡ−１００及びＧＣ−５０）
メンブレンフィルタ　（東洋科学産業型、ポアサイズ１
μｍ及び０．４５μｍ）を用いて加圧濾過し、菌体及び
その他の固形物を除去して培養濾液を得た。この培養濾
液よりＩＯ−を採取し、純水にて２４時間透析したのち
、グルコアミラーゼ活性を測定したところ、培養濾液１
ｇあたり０．０５単位のグルコアミラーゼが存在してい
た。

次に上記培養濾液２９ｋｓｒを中空繊維型モレキュラー
シーブ膜（分画分子ｆｆ１ｌｏ、０００．米国アミコン
製（Ａｍｉｃｏｎ　Ｃｏ、）ＨＩＰＩＯ−２０）で加圧
濾過し、２　ｋｇに濃縮した。上記濃縮液について硫安
を用いた塩析を行い、飽和度（硫安飽和濃度に対す割合
、％で表わす）２０％にて析出せず、飽和度５５％にて
析出した固形物を１４．ＯＯＯｒｐｍで遠心分離し回収
した。次いで飽和度５５％の硫安溶液で固形物を洗浄し
回収した。次いで、固形物を０．０５Ｍ　）リス−塩酸
緩衝液（ｐＨ７，５）に溶解し２４０ｇとした。次いで
上記緩衝液１０βを用いて、２４時間の透析を２回繰返
し実施した。そののち、透析した液中の固形物を、ガラ
ス濾紙（東洋濾紙製、　ＧＣ〜５０）を用いた濾過で除
去した。清澄化した透析液は３１０ｇであった。

次に、上記透析液をジエチルアミノエチル化架橋アガロ
ースゲル（ファルマシア製、　ＤＥＡＲセファロースＣ
Ｌ−６８）を用いたイオン交換クロマト　（カラムサイ
ズφ４４　Ｘ　５００ｍｍ）により精製した。０．０５
Ｍトリス−塩酸緩衝液で平衡化したゲルカラムに上記透
析液をチャージし、洗滌した。次いで緩衝液中の塩化ナ
トリウム濃度を直線勾配で上昇しつつ展開した。グルコ
アミラーゼの溶出パターンを第５図に示す。塩化ナトリ
ウム濃度０．２５Ｍの溶出位置にグルコアミラーゼ活性
を有するピークが認められた。グルコアミラーゼフラク
ションとして３６０ｇを回収し、次いでモレキュラーシ
ーブ膜（分画分子量１０，０００．米国アミコン製、　
ＰＭ−１０）を用い、純水１０ｋｇを加えて加圧濾過し
、脱塩、濃縮を行い粗精製グルコアミラーゼ液１６０ｇ
を得た。本溶液中のグルコアミラーゼ活性は３．３単位
／ｇであった。

次に上記粗精製グルコアミラーゼにつきゲル濾過により
精製した。まず、上記ゲルコミラーゼ液１００ｇを４０
Ｔｏｒｒの減圧下で凍結乾燥し、これを０゜０５Ｍクエ
ン酸・第２クエン酸緩衝液（ｐＨ４．５）　　４ｄに溶
解し、固形物を４００Ｏｒｐｍの遠心分離で除去した。

次に、上記緩衝液で平衡化した架橋デキストランゲル（
ファルマシア製、セファデックスＧ−１００）を充填し
たクロマトカラム（φ１５　Ｘ　９００ｍｍ）に上記グ
ルコアミラーゼ液１−をチャージし同じ緩衝液で展開し
た。その結果を第６図に示した。溶出液ｆｆ１６５ｍＺ
の位置にグルコアミラーゼ活性のピークが認められた。

上記ゲル濾過を残りの粗精製グルコアミラーゼについて
も実施し、精製グルコアミラーゼフラクション４０ｇを
得た。本フラクションのグルコアミラーゼ活性は１２単
位／ｇであった。

以上の精製操作により、培養濾液基準の比活性は１７１
倍に向上した。また、培養濾液基準の活性回収率は２３
％である。培養濾液を基準とした各工程の標品の比活性
、収量、活性回収率を第５表に示した。

（本頁以下余白） 実施例２ 実施例１において、培養液から遠心分離により菌体を含
む固形物４００ｇを回収した。次いで、生理食塩水６０
０ｇを加えてスラリー化し、菌体スラリー１０００　ｇ
を得た。次いで菌体スラリーより４０ｇを分取し、フレ
ンチプレス（大岳製作所製）用加圧セルにセントした。

次いで油圧プレスにより、１６００ｋｇ／ｃｎｌの圧力
をかけたのち、細口より５−７分の速度で大気中に噴出
させて菌体を破砕した。

残りの菌体スラリーについても上記操作を行って菌体破
砕スラリー１０００　ｇを得た。

次いで、菌体スラリーより１６．００Ｏｒｐｍの遠心分
離により固形物を除去しさらにガラス濾紙（東洋濾紙層
、　ＧＡ−１００，ＧＣ−５０）及びメンブレンフィル
タ（東洋濾紙製、ポアサイズ１，０．４５μｍ）を用い
て加圧濾過し、菌体破砕上澄液８００ｄを得た。

次いで、菌体破砕上澄液に７０℃、５分間の熱処理を行
い、熱変性を起しやすいたん白質を変性させた。５℃以
下まで冷却したのち、８０００ｒｐｍの遠心分離により
固形物を除去した。得られた熱処理上澄液は７６０ｄで
あった。

次に、実施例１記載の手法により、硫安沈澱、透析、イ
オン交換クロマト、ゲル濾過の各精製を実施した。菌体
破砕上澄液を基準とした各工程の標品の比活性、収量、
活性回収率を表６に示した。

（不貞以下余白） 実施例３ コーンスターチ２．３％、ポリペプトン０．２％。

酵母エキス０．２％、硫酸アンモニウム０．２％、リン
酸１カリウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０
゜００２％、システィン０．１％及び水道水を含む液体
培地（ｐＨ６，４）　２０ｋｇを内容積５０βの培養槽
に仕込み、槽内及び培養槽外壁に設けたジャケット部に
蒸気を吹込み、１２０℃、２０分間の殺菌を実施した。

次いで、培養槽内を６０℃まで冷却したのち、無菌水を
加えて培地量を３２ｋｉｒとした。次に、実施例１に示
した培地及び手法により調製したクロスツリジウム属細
菌Ｇ−０００５菌懸濁液３．５　ｋｇを添加した。次い
で、ガス出口に水封トラップを付し、培養槽内気相部を
窒素ガスで置換したのち、嫌気条件下、６０℃、ＰＨ６
，５で培養した。４０時間培養したのち、直ちに連続型
遠心分離機により固形物を除去し培養上澄液３３．５ｋ
ｇを得た。本培養上澄液には０．０９単位７ｇのグルコ
アミラーゼ活性が存在していた。次いで、上記培養上澄
液の２１をロークリエバポレータ用フラスコにとり、６
０℃の水浴に浸漬下でロータリエバポレータを用いて減
圧蒸留を行った。なお、蒸留開始時の発泡を抑えるため
、ｎ−オクチルアルコールｌ−を添加したのち減圧を開
始した。フラスコ内の培養上澄液の減少量に応じてフラ
スコ内に外部より新たな培養上澄液を供給して減圧蒸留
をｍ続した。なお、フラスコ内での発泡が著しくなった
場合には随時ｎ−オクチルアルコールを添加した。減圧
蒸留によって、濃縮液２．３ｐを得た。

次いで、上記濃縮液について７０℃、５分間の熱処理を
加え、直ちに５０℃以下まで冷却した。次いで、７００
０ｒｐｍの遠心分離によって、熱処理で析出した固形物
を除去し、熱処理上澄液２．１）を得た。

次に熱処理上澄液について硫安を用いた塩析を行い、飽
和度２０％−５５％の両分を回収した。次いでこれを飽
和度５５％の硫安溶液で洗浄したのち固形物を蒸留水に
溶解し、粗グルコアミラーゼ溶液５２０ｇを得た。

次に、粗グルコアミラーゼ？容？夜にコーンスターチ２
００ｇを添加し、十分攪拌混合したのち、遠心分離によ
りコーンスターチを分離して上澄液を回収した。さらに
コーンスターチを蒸留水２００ｇで洗浄して洗浄液を回
収し、上記上澄液とあわせて４９０ｇのでん粉吸着処理
液を得た。次いで、ガラス濾紙（東洋濾紙製、　ＧＡ−
１００，ＧＣ−５０）を用いて加圧濾過し、粗グルコア
ミラーゼ溶液４８０ｇを得た。本溶液のグルコアミラー
ゼ活性は５．３単位／ｇであり、培養上澄液基準で、比
活性は５９倍に向上し、活性回収率は８４％であった。

〔発明の効果〕

本発明の新規な耐熱性／耐酸性グルコアミラーゼは、特
にｐＨ４〜５の酸性領域下にてすぐれた耐熱性を有する
ため、でん粉を原料としてぶどう糖を製造する際、でん
粉溶液を中和することなく酸性状態での糖化が可能とな
る。これに比べ、従来公知の耐熱性グルコアミラーゼを
用いる場合には、でん粉溶液を中性化するためにアルカ
リを添加しなければならない。したがって、本発明のグ
ルコアミラーゼを用いることにより、でん粉溶液の中和
工程が不要となり、かつ反応後の脱塩工程への負荷を大
幅に軽減できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のグルコアミラーゼの活性に及ぼすｐＨ
の影響を示す特性図、第２図は本グルコアミラーゼの熱
安定性に及ぼすｐＨの影響を示す特性図、第３図は本グ
ルコアミラーゼの活性に及ぼす温度の影響を示す特性図
、第４図は本グルコアミラーゼの耐熱性を示す特性図、
第５図は本グルコアミラーゼのジエチルアミノエチル架
橋アガロースゲルを用いたイオン交換液体クロマトグラ
フにおけるグルコアミラーゼ活性溶出パターン図、第６
図は本グルコアミラーゼの架橋デキストランゲルを用い
たゲル濾過におけるグルコアミラーゼ活性溶出パターン
図である。 特許出願人　株式会社日立製作所 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 ｐＨ 第２図 Ｈ 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の理化学的性質を示す耐熱性グルコアミラーゼ
   。 （１）作用至適ｐＨ：４〜５ （２）作用至適温度：７０℃ （３）安定ｐＨ：４．５〜５．０ （４）ｐＨ４．５かつ温度７０℃における酵素活性半減
   期が６時間以上 （５）ｐＨ４．０かつ温度７０℃における酵素活性半減
   期が５．５時間 （６）分子量：３．８×１０＾４ ２、クロスツリジウム属に属する下記理化学的性質のグ
   ルコアミラーゼ生産菌を培養し、菌体及び培地中に該グ
   ルコアミラーゼを蓄積せしめ、菌体及び又は培地中から
   該グルコアミラーゼを回収することを特徴とする耐熱性
   グルコアミラーゼの製造法。 （１）作用至適ｐＨ：４〜５ （２）作用至適温度：７０℃ （３）安定ｐＨ：４．５〜５．０ （４）ｐＨ４．５かつ温度７０℃における酵素活性半減
   期が６時間以上 （５）ｐＨ４．０かつ温度７０℃における酵素活性半減
   期が５．５時間 （６）分子量：３．８×１０＾４ ３、クロスツリジウム属に属するグルコアミラーゼ生産
   菌がクロスツリジウム・エスピーＧ−０００５であるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の耐熱性グル
   コアミラーゼの製造法。