JPS6337631B2

JPS6337631B2 -

Info

Publication number: JPS6337631B2
Application number: JP11312484A
Authority: JP
Inventors: Yasuto Hirakawa; Kifuku Takagi
Original assignee: Nippon Mining Co
Priority date: 1984-06-04
Filing date: 1984-06-04
Publication date: 1988-07-26
Also published as: JPS60259193A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、オレフインを酸化して相応するエポ
キシドに転化し得る能力を有する菌を用いてオレ
フインを酸化させる方法に係り、特には、特定の
方法で培養した菌を用いてオレフインを酸化し、
エポキシド類を製造する方法に関する。従来の技術コリネバクテリウム属，ブレビバクテリウム属
又はノカルデイア属等に属する菌を用いてオレフ
インを酸化し、相応するエポキシドを直接生産さ
せる方法は既に提案されている（特公昭56−40号
公報、特開昭57−2692号公報）。ところで、上記方法においては、特殊な天然有
機物培地例えばNB培地〔ニユートリエントブロ
スNo.２（オキソイド社製）〕等を用い、通常の回分
式培養により、増殖させて得た菌を用いてオレフ
インを酸化させていた。発明が解決しようとする問題点しかしながら従来の培養増殖方法では、得られ
た菌のエポキシド生産活性は全般に低く、バツチ
毎の生産活性のバラツキも大きく、しかも高価な
培地を必要とする等、エポキシドを商業的に生産
する上で問題があつた。本発明は、かかる問題を解決したもので、高収
率で、安定して、しかも安価に、オレフインを酸
化して直接に相応するエポキシドを製造する方法
を提供することを目的としたものである。問題点を解決するための手段本発明は、コリネバクテリウム属、ブレビバク
テリウム属及びノカルデイア属に属する微生物群
から選定されるオレフインを酸化して相応するエ
ポキシドに転化し得る能力を有する菌を用いてオ
レフインを酸化させ、エポキシド類を製造する方
法において、前記菌を静止期の状態に保持しつつ
半回分培養を行つて得た菌を用いることからなる
微生物によるエポキシド類の製造方法である。作用本発明で使用するコリネバクテリウム属、ブレ
ビバクテリウム属及びノカルデイア属に属する微
生物群から選定されるオレフインを酸化して相応
するエポキシドに転化し得る能力を有する菌（以
下「エポキシド生産菌」という）は、コリネバク
テリウム・アルカナムATCC21194（工業技術院微
生物工業技術研究所寄託番号FERM−Ｐ−
4598）、コリネバクテリウム・ハイドロカーボク
ラスタスATCC15108（同、FERM―Ｐ―4599）、
ブレビバクテリウム・ブタニカムATCC21196
（同、FERM―Ｐ―4600）、ブレビバクテリウ
ム・ケトグルタミカムATCC15587（同、FERM
―Ｐ―4601）、ノカルデイア・コラリーナＢ―276
（同、FERM―Ｐ―4094）、ノカルデイア・ブタ
ニカATCC21197（同、FERM―Ｐ―4602）、並び
にノカルデイア・パラフイニカATCC21198（同、
FERM―Ｐ―4603）を例示し得る。これらの菌のうち、ノカルデイア・コラリーナ
Ｂ―276の菌学的性状は、特公昭56−40号公報に、
コリネバクテリウム・アルカナムATCC21194、
ブレビバクテリウム・ブタニカムATCC21196、
ノカルデイア・ブタニカATCC21197及びノカル
デイア・パラフイニカATCC21198の菌学的性状
は、特公昭47−48673号公報に、コリネバクテリ
ウム・ハイドロカーボクラスタスATCC15108の
菌学的性状は、特公昭46−41588号公報に、また、
ブレビバクテリウム・ケトグルタミカム
ATCC15587の菌学的性状は、米国特許第3591456
公報にそれぞれ詳記されている。上掲したようなエポキシド生産菌を通常の培
地、例えばグルコース10〜60ｇ／、硫安１〜６
ｇ／、K₂HPO₄1〜２ｇ／、MgSO₄・
7H₂O0.5〜２ｇ／、KCl0.1〜１ｇ／、
FeSO₄・7H₂O0.01〜0.1ｇ／、カラリン102（三
洋化成工業(株)製）１〜５ml／からなる培地で、
PH6.8〜7.2に制御しながら、30℃の温度で通気、
撹拌しながら回分式培養を行うと、当該菌体は誘
導期、対数増殖期及び転移期を経て静止期に達す
る。本発明では、上記静止期に達して菌体に新たに
増殖原料、例えばグルコース、シユクロース、廃
糖蜜、酢酸等の炭素源及び硫安、尿素等の窒素源
を加え、好気的条件下に引き続いて半回分培養を
行うものである。尚、半回分培養とは公知のとお
り、回分式培養において培養期間中増殖原料を連
続的或いは間欠的に添加して培養を行う方式をい
うものである。この半回分培養の期間中、静止期
の状態を保つ必要がある。すなわち、菌の増殖を
出来るだけ押え、自己消化と増殖とがバランスを
保つようにするものであり、決して対数増殖期の
ような増殖速度となるようなことは避けなければ
ならないが、多少の増殖は支障ない。この半回分培養における増殖原料の添加は、添
加増殖原料の種類、菌体の種類、培地等の培養条
件により異なるため一概に決めることはできない
が、炭素源として、菌体１ｇ当たり炭素量として
５〜10mg／Hr、窒素源として、菌体１ｇ当たり
窒素量として0.5〜１mg／Hr程度の範囲で適宜選
定して添加すれば十分である。この増殖原料の添加は、又、培養槽からの排ガ
ス中の炭酸ガス濃度を測定し、この炭酸ガス濃度
により調節することもできる。すなわち、培養槽
排ガス中の炭酸ガス量は、回分式培養においては
対数増殖期で最大となり、転移期から静止期にか
けて激減し、以後漸次減少していく。そこで、こ
の発生炭酸ガスの量が所定値以下となつたら、増
殖原料を添加し半回分培養に切り換え、以後炭酸
ガスの発生量が一定の値になるように基質の添加
量を調節する。この場合、炭酸ガスの発生量の適
正調節範囲は、添加増殖原料、菌体の種類、培養
条件によりそれぞれ異なるため一概に決定するこ
とはできないが、一般的には５〜６ｇ／の菌体
濃度で0.5Nl／ｌ・minの通気速度であれば、排
ガス中の炭酸ガス濃度は0.05〜0.2ｍmol／Nlの範
囲とすることができる。この半回分培養は、菌体のエポキシド生産活性
を十分に高めるためには、少なくとも10時間は行
うことが好ましく、40時間を越えてさらに培養を
続けても、これ以上さらに活性が向上することは
期待できないので、10〜40時間で行うことが好ま
しい。以上のようにして培養増殖されたエポキシド生
産活性の高い菌体は、既知のオレフインを酸化し
てエポキシドを製造する方法に供される。例え
ば、上述の条件で培養増殖された菌体をその濃度
が２〜30ｇ／となるように調製して反応槽に収
容する。これに原料オレフイン及び空気、酸素、
酸素富化ガスのように酸素含有ガスを供給して酸
化させる。このとき、原料オレフインがプロピレ
ンやブテンのようにガス状で供給できる場合は、
酸素含有ガスと共に連続的に導入することが好ま
しい。一方、原料オレフインが液状物の場合は、
あらかじめ全量を反応槽に収容しておくか、又は
連続的或いは間歇的にポンプ等により供給するこ
とが好ましい。尚、原料オレフインは、前述のプ
ロピレンやブテンのようにα―，β―，γ―位に
二重結合を有する直鎖状又は分岐鎖状のオレフイ
ン或いはスチレン等、芳香環を有するオレフイン
等、エポキシド生産菌が酸化し得るオレフインで
あれば、いずれでも本発明の効果を奏する。上記
酸化反応はPH５〜９の領域で20〜50℃の温度下に
１〜６日間行われる。又、この反応は常圧下で行
い得るが、加圧下で行うことにより、エポキシド
の生産性を向上させることもできる。一方、酸化
反応中に前述した菌体の培養増殖に用いた炭素
源、窒素源、更には、その他の無機塩成分を適宜
添加することにより菌体のエポキシド生産活性を
維持し、或いはさらに高めた状態でエポキシドを
生産することができる。この酸化反応は回分方式
でも連続方式でも行い得る。酸化反応により生成
したエポキシドは、吸収或いは相分離、抽出、蒸
留等の公知の手段を適用して分離採取できる。実施例実施例１〔種菌の調製〕ノカルデイア・コラリーナＢ―276（工業技術院
微生物工業技術研究所寄託番号FERM―Ｐ―
4094）の３白金耳をNBG培地（ラブレンコパウ
ダー（オキソイド社製）10ｇ、中性バクテリオロ
ジカルペプトン10ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グル
コース10ｇに水道水を加えて１とし、オートク
レーブ中で120℃、15分加熱殺菌した液体培地）
50mlを入れた500mlの坂口フラスコに接種し、30
℃の温度で24時間振盪培養（148回／分）した。〔菌体の増殖及び菌懸濁液の調製〕上記で調製した種菌の培地（リン酸水素二カリ
ウム1.74ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩1.5ｇ、
塩化カリウム0.5ｇ、硫酸第一鉄・７水塩50mg、
イーストエキストラクト（デイフコ社製）５ｇ、
硫酸アンモニウム１ｇ、グルコース10ｇに水道水
を加えて１とし、殺菌した液体培地）１に対
し50ml接種し、空気の通気量0.5／min、30℃
の温度で、PH6.8〜7.2に制御しながら撹拌下に増
殖させた。培養期間中は培養槽から排出されるガ
ス中の炭酸ガス濃度を測定した。培養開始から25
時間後にCO₂の生成速度が50ｍmol／―dayま
で下がつたので増殖原料溶液（50ｇ／のグルコ
ース及び５ｇ／硫安を含有する溶液）の添加を
開始し、CO₂の生成速度が50〜90ｍmol／―
dayとなるように増殖原料溶液の添加量をコント
ロールして半回分培養を行つた。この培養におけ
る菌の増殖、排ガス中のCO₂濃度についての経過
を第１図に示した。上記半回分培養の培養液を所定時間に20mlサン
プリングし、15000Gで10分間遠心分離機により
固液分離し、上澄液を除去した。次いで、0.1モ
ル濃度のリン酸緩衝液（PH7.5）で洗浄し、培地
（0.1モル濃度のリン酸緩衝液（PH7.5）１に対
し、リン酸水素二カリウム1.75ｇ、硫酸マグネシ
ウム・７水塩３ｇ、硫酸第一鉄・７水塩50mgを溶
解した溶液）で１回洗浄し、乾燥菌体濃度として
3.8mg／mlとなるように前記培地に再懸濁して菌
懸濁液を調製した。〔エポキシド生産活性の評価〕上記のように調製した菌懸濁液10mlとグルコー
ス溶液（50重量／容量％）0.6ml、消泡剤（デイ
スホームCC―222（日本油脂製））0.1mlを内径18
mmφのチユーブ型の反応器に入れ、５容量％のプ
ロピレン―空気混合ガスを60ml／minの速度で吹
き込み、出口ガス中のプロピレンオキサイドの量
をガスクロマトグラフイーで測定しエポキシドの
生産活性を調べた。この結果を第１表に示す。比較例１実施例１において菌体の増殖過程で、CO₂の生
成速度が50ｍmol／―day以下となつても増殖
原料溶液を添加せず、そのまま回分式培養を続け
たこと以外は全く実施例１と同様の操作を行つ
た。菌体の増殖過程における菌の増殖、排ガス中の
CO₂濃度の経過について第２図に示すとともに、
エポキシドの生産活性を第１表に示した。

【表】を示すことになる。
この結果から明らかなように静止期の状態を保
持しつつ半回分培養を行うことにより著るしくオ
キサイド生産活性を高めることができる。実施例２及び比較例２ブレビバクテリウム・ブタニカムATCC21196
（工業技術院微生物工業技術研究所寄託番号
FERM―Ｐ―4598）、ブレビバクテリウム・ケト
グルタミカムATCC15587（同、FERM―Ｐ―
4601）、コリネバクテリウム・アルカナム
ATCC21194（同、FERM―Ｐ―4598）、コリネバ
クテリウム・ハイドロカーボクラスタス
ATCC15108（同、FERM―Ｐ―4599）を実施例
１及び比較例１と同様の方法で64時間（菌体増殖
過程の開始時から）培養し、乾燥菌体濃度として
３〜４ｇ／となるような菌懸濁液を調製した。 500ml容の坂口フラスコに上記菌懸濁液20mlと
オレフインとして１―オクテンを0.1ml、有機溶
剤として１―ヘキサデカン２mlを収容して密栓し
たのち30℃の温度で24時間、150回／分で往復振
盪しつつ反応させた。反応終了後50mlのエーテル
で抽出し、該抽出物をガスクロマトグラフイーに
より分析し生成エポキシオクタンの量を得た。実施例１の方法で得た菌体を用いたものを実施
例２、比較例１の方法で得たものを比較例２とし
て、上記結果を第２表に示した。

【表】発明の効果以上のような本発明は、エポキシド生産菌のエ
ポキシド生産活性を向上させることができ、高収
率で安定し、しかも安価で、工業的に有利にエポ
キシドを生産できる効果を有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の半回分培養を行つた場合の菌
体増殖及び炭酸ガス生成速度の経過を示すもの
で、第２図は半回分培養を行わない場合の経過を
示す。

Claims

【特許請求の範囲】

１コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属及びノカルデイア属に属する微生物群から選定
されるオレフインを酸化して相応するエポキシド
に転化し得る能力を有する菌を用いてオレフイン
を酸化させ、エポキシド類を製造する方法におい
て、前記菌を静止期の状態に保持しつつ半回分培
養を行つて得た菌を用いることを特徴とする微生
物によるエポキシド類の製造方法。