JPS6344897A - ペプチド類の生産法 - Google Patents
ペプチド類の生産法Info
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- JPS6344897A JPS6344897A JP62091446A JP9144687A JPS6344897A JP S6344897 A JPS6344897 A JP S6344897A JP 62091446 A JP62091446 A JP 62091446A JP 9144687 A JP9144687 A JP 9144687A JP S6344897 A JPS6344897 A JP S6344897A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
１１上立皿貝差里
本発明は、遺伝子工学的に有用な物質を生産する技術に
関するものである。
関するものである。
え未及亘
動物細胞を形・質転換して培養し、有用な物質を生産す
る試みは種々報告されている。主な報告をその生産量の
概算と共に示すと次の如くである。
る試みは種々報告されている。主な報告をその生産量の
概算と共に示すと次の如くである。
１ＢＰｖ（牛パピローマウィルスーマウスＣ１２７系：
ヒトＩＦＮ−ｙ遺伝子（ＣＤＮＡ） 、 ＳＶ４０初期
プロモーター３Ｘ １０’ｕ／＋ｌ （Ｒ，Ｆｕｋ
ｕｎａｇａ、 ｅｔ ａｌ。
ヒトＩＦＮ−ｙ遺伝子（ＣＤＮＡ） 、 ＳＶ４０初期
プロモーター３Ｘ １０’ｕ／＋ｌ （Ｒ，Ｆｕｋ
ｕｎａｇａ、 ｅｔ ａｌ。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ ８
１５０８Ｂ（１９８４））Ｈ） −５Ｖ４０− ＣＶ−
１系： ヒトＩＦＮ−β遺イ云子（ｃＤＮＡ）、ＳＶ４
０初期プロモーター ２ｘ １０’ｕ／ｍｌ （Ｄ、Ｇ
ｈｅｙｓｅｎｅｔ ａｔ、 Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ！ ３０５ （１９８２））ｉｉｉ）
５Ｖ４０−１：Ｏ５系：ヒトインシュリン遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）、ＳＶ４０初期プロモーター （０，Ｌａｕｄ
ｅｔ ａｌ。
１５０８Ｂ（１９８４））Ｈ） −５Ｖ４０− ＣＶ−
１系： ヒトＩＦＮ−β遺イ云子（ｃＤＮＡ）、ＳＶ４
０初期プロモーター ２ｘ １０’ｕ／ｍｌ （Ｄ、Ｇ
ｈｅｙｓｅｎｅｔ ａｔ、 Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ ！ ３０５ （１９８２））ｉｉｉ）
５Ｖ４０−１：Ｏ５系：ヒトインシュリン遺伝子（ｃ
ＤＮＡ）、ＳＶ４０初期プロモーター （０，Ｌａｕｄ
ｅｔ ａｌ。
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 ６０４３（１９８３））ｉ
ｖ） Ｅｃｏ−ｇｐｔ−Ｃ１Ｏ系： ヒトＩＦＮ−７遺
伝子（ｃＤＮＡ）ＳＶ４０初期プロモーター
Ｉ Ｘ １０’ｕ／ｍｌ（角谷徹他 生化学’１６
．９１５ （１９８４））、 、 。
ｖ） Ｅｃｏ−ｇｐｔ−Ｃ１Ｏ系： ヒトＩＦＮ−７遺
伝子（ｃＤＮＡ）ＳＶ４０初期プロモーター
Ｉ Ｘ １０’ｕ／ｍｌ（角谷徹他 生化学’１６
．９１５ （１９８４））、 、 。
ｖ） ｄｈｆｒ−ＣｔｌＯ系： ヒトＩＦＮ−７遺伝
子（ｃＤＮＡ）、ＳＶ４０初期プワモーター
１． ｘ １０５ｕ／’ｍ ｌ、（Ｓ、５ｃａｈｉｌ
ｌ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ ８０゜４６５４（１９８３））
パ これらの方法は夫々特徴があるが目的物質の生産性等に
ついて未だ充分ではなく種々の方法の開発が期待される
。
子（ｃＤＮＡ）、ＳＶ４０初期プワモーター
１． ｘ １０５ｕ／’ｍ ｌ、（Ｓ、５ｃａｈｉｌ
ｌ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ ８０゜４６５４（１９８３））
パ これらの方法は夫々特徴があるが目的物質の生産性等に
ついて未だ充分ではなく種々の方法の開発が期待される
。
また、ミエローマは抗体産生細胞としてモノクローナル
抗体の生産に利用されているが、他のペプチド類の生産
については知られていない。
抗体の生産に利用されているが、他のペプチド類の生産
については知られていない。
発明の構成
本発明は、形質転換動物細胞を昂いて有用なペプチド類
を生産する方法に関し、更に詳しくは、゛ 拒エローマ
細胞を病質転換し、これを増殖させてよび３°下、流の
両側にＳＶ４０初期プロモーター配列を有する組換プラ
スミドをベクターに用いて哨乳類細胞を形質転換しこれ
を１ＩＩｌ舛さ・せて目的のペプチド類を生産させる方
法に関し、更に本発明は、５゜上流および３゛下流の両
側にＳＶ４０初期プロモーター配列を有矛る組換プラス
ミドをベクターに用いるとして用い外来遺伝子産物を大
量に生産する方法に関するものであり、ミエローマ細胞
のｉｎ ＋ｊｖ。
を生産する方法に関し、更に詳しくは、゛ 拒エローマ
細胞を病質転換し、これを増殖させてよび３°下、流の
両側にＳＶ４０初期プロモーター配列を有する組換プラ
スミドをベクターに用いて哨乳類細胞を形質転換しこれ
を１ＩＩｌ舛さ・せて目的のペプチド類を生産させる方
法に関し、更に本発明は、５゜上流および３゛下流の両
側にＳＶ４０初期プロモーター配列を有矛る組換プラス
ミドをベクターに用いるとして用い外来遺伝子産物を大
量に生産する方法に関するものであり、ミエローマ細胞
のｉｎ ＋ｊｖ。
およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの早い増殖能、高い蛋白合成
能（ＩｇＧ）および高！度、培養ができる利点と、ＳＶ
４０のプロモーター（エンハンサ−）の強力な発現力を
組合せ、ペブチＶ類−大量生産をめざすことを特の両側
にＳＶ４０初期プロモーター配列を有する組換プラスミ
、ドおよびその組換プラスミドで形ｉ転牟、されたミエ
ローマ細胞に関する。
能（ＩｇＧ）および高！度、培養ができる利点と、ＳＶ
４０のプロモーター（エンハンサ−）の強力な発現力を
組合せ、ペブチＶ類−大量生産をめざすことを特の両側
にＳＶ４０初期プロモーター配列を有する組換プラスミ
、ドおよびその組換プラスミドで形ｉ転牟、されたミエ
ローマ細胞に関する。
、 導入されたプラスミドは、ミエローマの染色体ｑＮ
八に組込まれて安定に保存される。遺伝子産物であるペ
ブチ、ド類は恒久的に形質転換細胞より生産される（細
胞は半永久的に生存可能である）。
八に組込まれて安定に保存される。遺伝子産物であるペ
ブチ、ド類は恒久的に形質転換細胞より生産される（細
胞は半永久的に生存可能である）。
ミエローマは非生産型または非分泌型（ＩｇＧに関して
）を用いれば、ＩｇＧが混在しないので目的のペプチド
類の精製に便利である。更に、ミエローマ細胞はマウス
等の動物の腹腔内で増殖させ得るので、大量の遺伝子産
物（ペプチド類）の取得も期待される。
）を用いれば、ＩｇＧが混在しないので目的のペプチド
類の精製に便利である。更に、ミエローマ細胞はマウス
等の動物の腹腔内で増殖させ得るので、大量の遺伝子産
物（ペプチド類）の取得も期待される。
本発明のもう一つの特徴は、目的物（ＩＦＮ等）のペプ
チド類をコードした外来遺伝子の５゛上流および３゛下
流の両端にＳＶ４０のプロモーターを配置したベクター
を用いることにより、遺伝子産物の生産量が約１０倍に
も上昇する点である。
チド類をコードした外来遺伝子の５゛上流および３゛下
流の両端にＳＶ４０のプロモーターを配置したベクター
を用いることにより、遺伝子産物の生産量が約１０倍に
も上昇する点である。
宿主に用いる細胞としては、各種のミエローマ細胞およ
びミエローマ由来のバイプリドーマを挙げることができ
、例えば、マウス、ラットおよびヒトのミエローマ細胞
がある。なかでも、ｔｇＧ非生産型、非分泌型の細胞が
目的物の精製には好適である。マウスミエローマ細胞と
しては例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−０１ （非分泌
型）ＨＧＰＲＴ−１ＸＩｉ３−Ａｇ８−６．５．３（非
生産型） ＨＧＰＲＴ二ＳＰ−２１０−Ａｇ１４ （非
生産型） ＨＧＰＲＴ−等があり、実験材料として供給
されている（文献１および２参照）。
びミエローマ由来のバイプリドーマを挙げることができ
、例えば、マウス、ラットおよびヒトのミエローマ細胞
がある。なかでも、ｔｇＧ非生産型、非分泌型の細胞が
目的物の精製には好適である。マウスミエローマ細胞と
しては例えば、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−０１ （非分泌
型）ＨＧＰＲＴ−１ＸＩｉ３−Ａｇ８−６．５．３（非
生産型） ＨＧＰＲＴ二ＳＰ−２１０−Ａｇ１４ （非
生産型） ＨＧＰＲＴ−等があり、実験材料として供給
されている（文献１および２参照）。
ベクターとしては、動物細胞で発現させる強力なプロモ
ーター（例えばＳＶ４０のプロモーター、 ＢＰＶのプ
ロモーター、メタロチオネインのプロモーター、ｄｈｆ
ｒのプロモーター、各種末端反復領域ＬＴＲ等）と選択
マーカーを有するものが適当である。
ーター（例えばＳＶ４０のプロモーター、 ＢＰＶのプ
ロモーター、メタロチオネインのプロモーター、ｄｈｆ
ｒのプロモーター、各種末端反復領域ＬＴＲ等）と選択
マーカーを有するものが適当である。
この選択マーカーとしては、例えば、Ｅｃｏ−、ｇｐｔ
、 ｔｋ、ｄｈｆｒを挙げることが出来るが、その他の
よく知られたものを用いることもできる。
、 ｔｋ、ｄｈｆｒを挙げることが出来るが、その他の
よく知られたものを用いることもできる。
ＳＶ４０のプロモーターの塩基配列は、文献−３に開示
されており、目的物の遺伝子と組合せたベクターは、実
施例等を参考にして通常の技術により容易に構築できる
。ベクターの構築等←必要なりＮＡ断片の切断、合成、
検索、単離等は一般的な方法で行なうことができる。文
献４および５参照。
されており、目的物の遺伝子と組合せたベクターは、実
施例等を参考にして通常の技術により容易に構築できる
。ベクターの構築等←必要なりＮＡ断片の切断、合成、
検索、単離等は一般的な方法で行なうことができる。文
献４および５参照。
動物細胞を形質転換して目的の遺伝子を導入するには、
プロトプラスト融合法やリン酸カルシウム法等の一般的
方法を応用できる。文献６〜８参照。
プロトプラスト融合法やリン酸カルシウム法等の一般的
方法を応用できる。文献６〜８参照。
細胞の増殖は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行なうか、またはＵ
」」でマウスやラット等の腹腔内で行なうことができ、
目的に応じて適宜選択し、効率よく目的物を生産すれば
よい。文献２参照。
」」でマウスやラット等の腹腔内で行なうことができ、
目的に応じて適宜選択し、効率よく目的物を生産すれば
よい。文献２参照。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養に用いる培地としては、ミエ
ローマの培養に通常用いられるものでよいが、例えば、
ＲＰＭＩ−１６４０培地にｐｃｓを１鴎加えたもの、Ｒ
ＤＦ培地（ＲＰＭＩ−１８４０’：ＤＭＥＭ：Ｆ１２−
８：１：１）に牛胎児血清（Ｆｉｌｓ）または合成血清
を１０９６加えたもの、あるいはＲ１）Ｆ培地ＣＲＴ’
ＭＩ−１６４０：ＤＭＥＭ：Ｆ１２−３：１：１）にＩ
ＴＦ、Ｓ （インスリン、トランスフェリン、エタノー
ルアミンおよびセレン）およびアルブミンを加えた無血
清培地等があり、種々のものが報告および市販されてい
る。文献９参照。
ローマの培養に通常用いられるものでよいが、例えば、
ＲＰＭＩ−１６４０培地にｐｃｓを１鴎加えたもの、Ｒ
ＤＦ培地（ＲＰＭＩ−１８４０’：ＤＭＥＭ：Ｆ１２−
８：１：１）に牛胎児血清（Ｆｉｌｓ）または合成血清
を１０９６加えたもの、あるいはＲ１）Ｆ培地ＣＲＴ’
ＭＩ−１６４０：ＤＭＥＭ：Ｆ１２−３：１：１）にＩ
ＴＦ、Ｓ （インスリン、トランスフェリン、エタノー
ルアミンおよびセレン）およびアルブミンを加えた無血
清培地等があり、種々のものが報告および市販されてい
る。文献９参照。
培養には、デイツシュやスピナーフラスコを使用できる
が、ホローファイバーを用いた高密度培養法も効率的で
有利である。さらに、マイクロカプセル法、エアーリフ
ト培養法、メンプランバーライジョン培養法等がある。
が、ホローファイバーを用いた高密度培養法も効率的で
有利である。さらに、マイクロカプセル法、エアーリフ
ト培養法、メンプランバーライジョン培養法等がある。
文献１２〜１５参照。
細胞の培養は、５＊二酸化炭素の存在下で行なう等、一
般的な方法、例えば文献１および１０の記載に準じて行
なえばよい。
般的な方法、例えば文献１および１０の記載に準じて行
なえばよい。
ｉｎ ｖｉｖｏでの増殖も、通常使用されている動物と
方法で行なえばよいが、例えば、ミエローマ細胞の移植
が可能なりａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ、、 Ｂａ１ｂ／ｃ
の如き系統のマウスを挙げることが出来る。
方法で行なえばよいが、例えば、ミエローマ細胞の移植
が可能なりａｌｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ、、 Ｂａ１ｂ／ｃ
の如き系統のマウスを挙げることが出来る。
生産するペプチド類としては特に制限はなく、この分野
の通常の知識に基いて選ぶことができ、例えば、インタ
ーフェロン類、腫瘍壊死因子、インターロイキンのよう
なリンホカイン類、インスリン、成長ホルモンのような
ホルモン類、肝炎ワクチン、インフルエンザワクチンの
ような多くの抗原蛋白類、組織プラスミノーゲン活性因
子やソマトメジン等をあげることができる。
の通常の知識に基いて選ぶことができ、例えば、インタ
ーフェロン類、腫瘍壊死因子、インターロイキンのよう
なリンホカイン類、インスリン、成長ホルモンのような
ホルモン類、肝炎ワクチン、インフルエンザワクチンの
ような多くの抗原蛋白類、組織プラスミノーゲン活性因
子やソマトメジン等をあげることができる。
生産されたペプチド類は、イオン交換クロマトグラフィ
、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過等の通常の
方法で分離、精製することができる。
、アフィニティクロマトグラフィ、ゲル濾過等の通常の
方法で分離、精製することができる。
次にガンマ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ、）をペプ
チドの例として用いた実施例を挙げて説明するが限定の
意味はない。
チドの例として用いた実施例を挙げて説明するが限定の
意味はない。
火五■
ｌ：ベクターの構築（第１図）
プラスミド１Σニ匹Ｉ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ−ｉｃａｌｓ；このプラスミドのＫｐｎ
ＩサイトからＢａｍ１（Ｉサイトまでの断片の地図を第
３図に示す）をＳＶ４０初期プロモーター直後のＢｇｌ
ＩＩサイトで切断し、クレノーフラグメントでプラン
トエンド化し、ＳｍａＩリンカ−（宝酒造）を挿入して
プラスミド１】ｋｌｏ−Ｓｍａｌを製し、これを大腸菌
Ｈ，Ｂ １０１で増殖させた。
Ｂｉｏｃｈｅｍ−ｉｃａｌｓ；このプラスミドのＫｐｎ
ＩサイトからＢａｍ１（Ｉサイトまでの断片の地図を第
３図に示す）をＳＶ４０初期プロモーター直後のＢｇｌ
ＩＩサイトで切断し、クレノーフラグメントでプラン
トエンド化し、ＳｍａＩリンカ−（宝酒造）を挿入して
プラスミド１】ｋｌｏ−Ｓｍａｌを製し、これを大腸菌
Ｈ，Ｂ １０１で増殖させた。
一方ヒトγ−ＩＦＮ遺伝子を含むプラスミド１基」（Ｅ
、ｃｏｊｉ ＭＫ−５、ＦＥＲＭ Ｐ−８７３６後にＦ
ＥＲＭ ［１Ｐ−１３２９として微生物工業技術研究所
に保管委託）をＢａｎ ＩＩＩとＢａｍＨＩで処理して
、γ−ＩＦＮ遺伝子（ｇｅｎｏｍｉｃ）を切出し、クレ
ノーフラグメントでプラントエンド化し、これを１ΣＩ
＝１０−ＳｍａｌのＳｍａＩサイトに挿入してｐＫＳＶ
−１０−γを得た。
、ｃｏｊｉ ＭＫ−５、ＦＥＲＭ Ｐ−８７３６後にＦ
ＥＲＭ ［１Ｐ−１３２９として微生物工業技術研究所
に保管委託）をＢａｎ ＩＩＩとＢａｍＨＩで処理して
、γ−ＩＦＮ遺伝子（ｇｅｎｏｍｉｃ）を切出し、クレ
ノーフラグメントでプラントエンド化し、これを１ΣＩ
＝１０−ＳｍａｌのＳｍａＩサイトに挿入してｐＫＳＶ
−１０−γを得た。
ｂ、ＫＳＶ−１０−ｙへ（７）選択マーカーＥｃｏ−ｇ
ｌｌｊ遺伝子の臣λニ プラスミドｐＳＶ−２−ｇｐｔ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＡＴ
’ＣＧ Ｎｏ、３７１４５）をＰｖｕｌＴとＥｃｏＲＩ
で処理してＥｃｏ−ｇｐｔ断片を切出し、これをプラス
ミドｐＵｃ １３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をＳｍａｌとＥｃｏＲＩ とで
処理して得た断片とライゲートしてプラスミド餞ｃ１３
ＴｓＶ７ｇＴｌｔを得た。このプラスミドより Ｅｃｏ
−ｇｐｔ遺伝子（ＳＶ４０プロモーター＋ Ｅｃｏ−
ｇｐｔ ＋ＳＶ４’Ｏターミネータ）をＢａｍＨＩで切
出しくこの断片の地図を第４図に示す）、ｐＫＳＶ−１
０−γ（γ−ＩＦＮ遺伝子の３°側にあるＳＶ４０のタ
ーミネータ−末端にＢａｍ旧サイトがある）のＢａｍ）
ＩＩサイトに挿入してｐＫＳＶ−１０−γ−ｇｐｔを得
た。
ｌｌｊ遺伝子の臣λニ プラスミドｐＳＶ−２−ｇｐｔ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓまたはＡＴ
’ＣＧ Ｎｏ、３７１４５）をＰｖｕｌＴとＥｃｏＲＩ
で処理してＥｃｏ−ｇｐｔ断片を切出し、これをプラス
ミドｐＵｃ １３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｐ−Ｌ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をＳｍａｌとＥｃｏＲＩ とで
処理して得た断片とライゲートしてプラスミド餞ｃ１３
ＴｓＶ７ｇＴｌｔを得た。このプラスミドより Ｅｃｏ
−ｇｐｔ遺伝子（ＳＶ４０プロモーター＋ Ｅｃｏ−
ｇｐｔ ＋ＳＶ４’Ｏターミネータ）をＢａｍＨＩで切
出しくこの断片の地図を第４図に示す）、ｐＫＳＶ−１
０−γ（γ−ＩＦＮ遺伝子の３°側にあるＳＶ４０のタ
ーミネータ−末端にＢａｍ旧サイトがある）のＢａｍ）
ＩＩサイトに挿入してｐＫＳＶ−１０−γ−ｇｐｔを得
た。
このＥｃｏ−ｇｐｔ遺伝子はＳＶ４０初期プロモーター
を５°上流にもっているので、出来上がったプラスミド
ではγ−ＩＦＮ遺伝子が二つのＳＶ４０プロモーターで
はさまれている状態である。このプラスミドを形質転換
に用いた。
を５°上流にもっているので、出来上がったプラスミド
ではγ−ＩＦＮ遺伝子が二つのＳＶ４０プロモーターで
はさまれている状態である。このプラスミドを形質転換
に用いた。
ｌ−暉咀［■コ２ソλｌ択ヱニＪ二」ｋｉ（社しΔ導込
プラスミドｐＦＧ−５（文献１１）よりＢａｍＨＩで切
出したｔｋ遺伝子（ｔｋのプロモーター＋ ｔｋ＋ ｔ
ｋのターミネータ−）をｐＫＳＶ−１０−ｙのＢａ＋＋
＋ＨＩサイトに挿入してプラスミド ｋＳＶ−１０−−
ｔｋを得た。このもののＳＶ４０初期プロモーターはγ
−ＩＦＮ遺伝子の５°側に一つあるだけである。このプ
ラスミドを形質転換に用いた。
プラスミドｐＦＧ−５（文献１１）よりＢａｍＨＩで切
出したｔｋ遺伝子（ｔｋのプロモーター＋ ｔｋ＋ ｔ
ｋのターミネータ−）をｐＫＳＶ−１０−ｙのＢａ＋＋
＋ＨＩサイトに挿入してプラスミド ｋＳＶ−１０−−
ｔｋを得た。このもののＳＶ４０初期プロモーターはγ
−ＩＦＮ遺伝子の５°側に一つあるだけである。このプ
ラスミドを形質転換に用いた。
グルコース（最終濃度１豹、アンピシリン（最終濃度５
０μｓ／ｍｌ）を含有するしブロス（ＬＢ）に、ベクタ
ー（ＫＳｖ−１０−γ−ｇｐ ｔ）を含有する大腸菌を
加えたもの５０ｍ１を６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ）
が０．５になるまで３７℃で培養した。以後の処理は４
℃で行なった。培養液を３０００ｒｐｍで１５分遠心し
沈漬を２０％蔗糖含有０．０５Ｍ トリス緩衝液（ｐ）
１８）で洗浄し、同じ緩衝液１．２５ｍ１を加えて攪拌
した。これに、リゾチーム（Ｓｉｇ＋ｎａ）、０．２５
ｍ１（０，２５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）に５ｍｇ／ｍ
ｌに溶解）を加えて５分間放置し、さらに０．２５Ｍ
ＥＤＴＡ ０．５ｍｌを加えて５分間放置した。
０μｓ／ｍｌ）を含有するしブロス（ＬＢ）に、ベクタ
ー（ＫＳｖ−１０−γ−ｇｐ ｔ）を含有する大腸菌を
加えたもの５０ｍ１を６００ｎｍにおける濁度（ＯＤ）
が０．５になるまで３７℃で培養した。以後の処理は４
℃で行なった。培養液を３０００ｒｐｍで１５分遠心し
沈漬を２０％蔗糖含有０．０５Ｍ トリス緩衝液（ｐ）
１８）で洗浄し、同じ緩衝液１．２５ｍ１を加えて攪拌
した。これに、リゾチーム（Ｓｉｇ＋ｎａ）、０．２５
ｍ１（０，２５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）に５ｍｇ／ｍ
ｌに溶解）を加えて５分間放置し、さらに０．２５Ｍ
ＥＤＴＡ ０．５ｍｌを加えて５分間放置した。
これに０．０５Ｍ トリス緩衝液（ｐ）１Ｂ） ０．５
ｍｌを加えて温度を３７℃にして１５分間放置した。こ
の液に蔗糖（最終濃度１０駒、塩化マグネシウム（最終
濃度１０＋＋＋Ｍ）を加えたＤＭＥ培養液１０ｍ１を加
えて室温に１０分間放置した。
ｍｌを加えて温度を３７℃にして１５分間放置した。こ
の液に蔗糖（最終濃度１０駒、塩化マグネシウム（最終
濃度１０＋＋＋Ｍ）を加えたＤＭＥ培養液１０ｍ１を加
えて室温に１０分間放置した。
１）で得たプロトプラスト懸濁液に、ミエローマ細胞（
Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３ （）ＩＧＰＲＴ−） （
Ｆｌｏｗ−大日本製薬）ＩＸＩＯ’個を加え１５００ｒ
ｐｍで５分間遠心した。
Ｘ６３−Ａｇ８−６．５．３ （）ＩＧＰＲＴ−） （
Ｆｌｏｗ−大日本製薬）ＩＸＩＯ’個を加え１５００ｒ
ｐｍで５分間遠心した。
上滑を捨て沈漬をほぐしてこれにポリエチレングリコー
ル液（Ｓｉｇ＋ｎａ ＰＥＧ４０００９ｇに燐酸緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ）を加えて２０ｍ１にしたもの）０．
５ｍｌをゆっくり加えて均一に懸濁した。１分間放置後
、これに３７℃のＤＭＥ培養液を３０秒毎に１ｍｌずつ
計８回加えた。これを遠心して、沈漬を次の組成のＲＰ
ＭＩ−Ｘ）ＩＴ培養液に懸濁させて９６穴プレート ３
枚にまき、４８時間培養した。
ル液（Ｓｉｇ＋ｎａ ＰＥＧ４０００９ｇに燐酸緩衝生
理食塩水（ＰＢＳ）を加えて２０ｍ１にしたもの）０．
５ｍｌをゆっくり加えて均一に懸濁した。１分間放置後
、これに３７℃のＤＭＥ培養液を３０秒毎に１ｍｌずつ
計８回加えた。これを遠心して、沈漬を次の組成のＲＰ
ＭＩ−Ｘ）ＩＴ培養液に懸濁させて９６穴プレート ３
枚にまき、４８時間培養した。
ＲＰＭＩ−ＸＨＴ培養 組成
ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ １ ｆ！、用）にカ
ナマイシン３Ｂｍｇ。
ナマイシン３Ｂｍｇ。
ストレプトマイシン１２０ｍｇ 、キサンチン２５０ｍ
ｇ 。
ｇ 。
ヒボキサンチン１３．８＋ｎｇ、チミジン３．８７ｍｇ
、 ２−メルカプトエタノール３．５μｇおよび炭酸水
素ナトリウム２ｇを加え、全量をＩｋとし、これにＦｅ
２ （牛胎児血清） １００ｍ１を加えた 次いでミコフェノール酸を６ｍｇ／ｌになるように加え
た前記の培養液（ＰＲＭＩ−ＸＨＭＴと呼ぶ）で培養し
て形質転換細胞を選別し、３日おきに培養液を半分取換
えて２週間培養し選別を完了した。
、 ２−メルカプトエタノール３．５μｇおよび炭酸水
素ナトリウム２ｇを加え、全量をＩｋとし、これにＦｅ
２ （牛胎児血清） １００ｍ１を加えた 次いでミコフェノール酸を６ｍｇ／ｌになるように加え
た前記の培養液（ＰＲＭＩ−ＸＨＭＴと呼ぶ）で培養し
て形質転換細胞を選別し、３日おきに培養液を半分取換
えて２週間培養し選別を完了した。
ｆｔオ、Ｌ （ｔｋ ）細胞ニツイテはＫＳＶ−１０−
−ｇ ｔおよびｐＫＳＶ−１０−γ−ｔｋをリン酸カル
シウム法によって導入し、それぞれＲＰＭＩ−Ｘ）ＩＭ
ＴおよびＲＰＭＩ−ＨＡＴ培地を用いて同様に選別した
。
−ｇ ｔおよびｐＫＳＶ−１０−γ−ｔｋをリン酸カル
シウム法によって導入し、それぞれＲＰＭＩ−Ｘ）ＩＭ
ＴおよびＲＰＭＩ−ＨＡＴ培地を用いて同様に選別した
。
Ｉ■、−ＩＦＮの発
ＩＩで得た培養細胞（ＫＳＶ−１０−−ｇ ｔで形質転
換したミエローマ細胞Ｘ６３−Ａｇ８−８．５．３ （
ＨＧＰＲＴ−））を、次の組成の培養液に５ｘ １０’
／ｍｌに調整し、その２０１１１１を１００ｍｍ径デイ
ツシュに入れてインキュベーター中３７℃で４日間培養
した。細胞を集めて細胞密度８ｘ １０’／ｍｌ、培養
液量１００ｍ１をスピナーフラスコに入れて３７℃の恒
温室中で攪拌数５Ｏｒｐｍで培養した。
換したミエローマ細胞Ｘ６３−Ａｇ８−８．５．３ （
ＨＧＰＲＴ−））を、次の組成の培養液に５ｘ １０’
／ｍｌに調整し、その２０１１１１を１００ｍｍ径デイ
ツシュに入れてインキュベーター中３７℃で４日間培養
した。細胞を集めて細胞密度８ｘ １０’／ｍｌ、培養
液量１００ｍ１をスピナーフラスコに入れて３７℃の恒
温室中で攪拌数５Ｏｒｐｍで培養した。
培養液組成
ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ Ｉ Ａ用）８容、Ｄ
ＭＥ （Ｓｉｇｍａ） １容Ｆ−１２（Ｓｉｇｍａ）
１容の割合の液中に、 ＨＥＰＥＳ （Ｓｉｇ＋＋＋ａ
）２５ｍＭ、グルコース４ｇ、炭酸水素ナトリウム２ｇ
、２−メルカプトエタノール３，５μｇ１カナマイシン
３６ｍｇ、ストレプトマイシン１５０ｍｇ、キサンチン
２５０ｍｇ、ヒボキサンチン１３．６ｍｇ、チミジン３
．８７ｍｇが含まれるように全量を１℃とし、これにミ
コ 〜フェノール酸をＢｍｇ／ｌになるように加え
、Ｎｌｌ血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ） １００ｍ１を加えた。
ＭＥ （Ｓｉｇｍａ） １容Ｆ−１２（Ｓｉｇｍａ）
１容の割合の液中に、 ＨＥＰＥＳ （Ｓｉｇ＋＋＋ａ
）２５ｍＭ、グルコース４ｇ、炭酸水素ナトリウム２ｇ
、２−メルカプトエタノール３，５μｇ１カナマイシン
３６ｍｇ、ストレプトマイシン１５０ｍｇ、キサンチン
２５０ｍｇ、ヒボキサンチン１３．６ｍｇ、チミジン３
．８７ｍｇが含まれるように全量を１℃とし、これにミ
コ 〜フェノール酸をＢｍｇ／ｌになるように加え
、Ｎｌｌ血清（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ） １００ｍ１を加えた。
培養開始５日後より毎日培養液の半量を回収して新鮮な
培地と取り替えた。スピナーフラスコ培養液中の細胞密
度を１．Ｏｘ １０’ 〜１．５ｘ １０６／ｍｌニ保
ちつつ培養を続けた。毎日回収した培養液の上清をアッ
セイに用いた。
培地と取り替えた。スピナーフラスコ培養液中の細胞密
度を１．Ｏｘ １０’ 〜１．５ｘ １０６／ｍｌニ保
ちつつ培養を続けた。毎日回収した培養液の上清をアッ
セイに用いた。
ＩＩで得た形質転換し細胞については、６０ｍｍのデイ
ツシュで常法通り培養し上清をアッセイした。
ツシュで常法通り培養し上清をアッセイした。
また、７週令のヌードマウスＢａ１ｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ
に、ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン；和光純薬） ０．５＋ｎｌを腹腔内に接種
し、１週間後細胞Ｘ６３−八ｇ８−６．５．３ （ＨＧ
ＰＲＴ ）Ｉ ＸＩＯ’個を腹腔的接種し飼育した６２
０日後に腹水を採取してアッセイに用いた。
に、ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン；和光純薬） ０．５＋ｎｌを腹腔内に接種
し、１週間後細胞Ｘ６３−八ｇ８−６．５．３ （ＨＧ
ＰＲＴ ）Ｉ ＸＩＯ’個を腹腔的接種し飼育した６２
０日後に腹水を採取してアッセイに用いた。
■、γ−ＩＦＮのアッセイ
フィリップらの報告（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ ７８３８９〜３９４ （１９８１）に準じ
て、ヒト羊膜由来ＰＬ細胞と５Ｖ（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖ
ｉｒｕｓ）を用い、９６穴タイタートレイで、Ｎ１）Ｉ
のα−ＩＦＮ標準品と、ジェネンテク社のＹ−ＩＦＮと
の５０＊ＣＥＰ阻止法（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆ
ｆｅｃｔｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）により測
定した。
ｏｌｏｇｙ ７８３８９〜３９４ （１９８１）に準じ
て、ヒト羊膜由来ＰＬ細胞と５Ｖ（Ｓｉｎｄｂｉｓ ｖ
ｉｒｕｓ）を用い、９６穴タイタートレイで、Ｎ１）Ｉ
のα−ＩＦＮ標準品と、ジェネンテク社のＹ−ＩＦＮと
の５０＊ＣＥＰ阻止法（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆ
ｆｅｃｔｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）により測
定した。
え豆葛力盟
実施例で得られたアッセイの結果を次に示す。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ 培養
Ｂａ１ｂ／ｃ ｎｕ／ｎｕ腹腔内
ス腹腔−カルチャーでの培養は２０日間Ｉ！続したが、
開始５日後より毎日半量回収した培養液の生産量は殆ど
変わらなかった。この４Ｘ １０’ ｕ／ｍｌの発現は
５０ｍ１培養液７１００ｍ１スピナーフラスコ７日に相
当し極めて優れた生産量である。スピナーカルチャーに
潅流培養装置を装着すれば高密度培養が可能であり、１
〜５ ｘ １０’ｕ／ｍ１以上の高生産を長期間維持で
きるものと推定される。
開始５日後より毎日半量回収した培養液の生産量は殆ど
変わらなかった。この４Ｘ １０’ ｕ／ｍｌの発現は
５０ｍ１培養液７１００ｍ１スピナーフラスコ７日に相
当し極めて優れた生産量である。スピナーカルチャーに
潅流培養装置を装着すれば高密度培養が可能であり、１
〜５ ｘ １０’ｕ／ｍ１以上の高生産を長期間維持で
きるものと推定される。
また、ミエローマ細胞はホローファイバー培養法を始め
とする種々の高密度培養法が適用可能であり、これらの
培養手法を利用すれば更に高発現（例えば５ ｘ １０
’ ｕ／ｍｌ）が期待でき、しかも目的のペプチド類の
分ｌＩＫ精製を簡略化できる。
とする種々の高密度培養法が適用可能であり、これらの
培養手法を利用すれば更に高発現（例えば５ ｘ １０
’ ｕ／ｍｌ）が期待でき、しかも目的のペプチド類の
分ｌＩＫ精製を簡略化できる。
ｆｔｂ、吐級江計工」旦とＬ （ｔｋ−）細胞の、およ
びＫＳＶ−ＩＱ−Ｔ−ｔｋとＬ （ｔｋ ）細胞の組合
せにおいて、γ−ＩＦＮ遺伝子の代りにα−ＩＦＮ遺伝
子を用いて発現を試みたところ、それぞれＩ Ｘ １０
’ｕ／ｍｌと２ｘ １０３ｕ／ｎ＋１のタイターが得ら
れた。
びＫＳＶ−ＩＱ−Ｔ−ｔｋとＬ （ｔｋ ）細胞の組合
せにおいて、γ−ＩＦＮ遺伝子の代りにα−ＩＦＮ遺伝
子を用いて発現を試みたところ、それぞれＩ Ｘ １０
’ｕ／ｍｌと２ｘ １０３ｕ／ｎ＋１のタイターが得ら
れた。
また、ＫＳＶ−１０−１’ ＝ｇｐｔとＸ６３−Ａｇ８
−６．５．３細胞の組合せで、無血清培地（Ｆｅ２の代
りにインスリン、トランスフェリン、セレン、エタノー
ルアミンおよび牛血清アルブミンを加える）を使用した
スピナーカルチャー培養ではｌｘ １０’ｕ／ｍｌのタ
イターが得られた。
−６．５．３細胞の組合せで、無血清培地（Ｆｅ２の代
りにインスリン、トランスフェリン、セレン、エタノー
ルアミンおよび牛血清アルブミンを加える）を使用した
スピナーカルチャー培養ではｌｘ １０’ｕ／ｍｌのタ
イターが得られた。
以上の如く本発明は極めて優れたペプチド類の生産法で
ある。
ある。
文献１ 宗村編 細胞培養マニュアル 講談社文献２
岩崎等 単クローン抗体 講談社（１９８２）文献３
５ｃｉｅｎｃｅ ２００４９５〜４９８ （１９７８）
文献４ Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、、３１５３
１（ｔｔ？’９）文献５ Ｔ、Ｍａｎｉｔａｔｔｓ
ｅｔ ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ）Ｉａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ（１９８２）文献Ｂ Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂ
ｉｏ１４（８）７４３〜７５２（１９８１）文献７
Ｐｒｏｃ、Ａｃａｄ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８０
８２５〜８２９文献８ 小河原 わかりやすい遺伝子組
換え１４４〜ｌＩ＋５ ＜１９８５）法用書店 文献９ 別冊２７ 蛋白買核酸酵素４５３〜４５５文
献ｌＯ福井等編 細胞培養技術 講談社（１’９８５）
文献１１ Ｐｒｏｃ、＾ｃａｄ、Ｎａｔ１．ｓｃｉ、
ＵｓＡ ７６３７５７（１９７９）文献１２ Ｓｃ、
１ｅｎｃｅ、１７８６５ （１９７２）文献１３ 米
国特許４，４０９，３３１文献１４ Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｓｏｃ、、Ｔｒａｎｓ、、１３’ＩＯ，（１９８５）
文献１５ 村上浩紀編 細胞制御工学 学窓社
岩崎等 単クローン抗体 講談社（１９８２）文献３
５ｃｉｅｎｃｅ ２００４９５〜４９８ （１９７８）
文献４ Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、、３１５３
１（ｔｔ？’９）文献５ Ｔ、Ｍａｎｉｔａｔｔｓ
ｅｔ ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ）Ｉａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ（１９８２）文献Ｂ Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂ
ｉｏ１４（８）７４３〜７５２（１９８１）文献７
Ｐｒｏｃ、Ａｃａｄ、Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８０
８２５〜８２９文献８ 小河原 わかりやすい遺伝子組
換え１４４〜ｌＩ＋５ ＜１９８５）法用書店 文献９ 別冊２７ 蛋白買核酸酵素４５３〜４５５文
献ｌＯ福井等編 細胞培養技術 講談社（１’９８５）
文献１１ Ｐｒｏｃ、＾ｃａｄ、Ｎａｔ１．ｓｃｉ、
ＵｓＡ ７６３７５７（１９７９）文献１２ Ｓｃ、
１ｅｎｃｅ、１７８６５ （１９７２）文献１３ 米
国特許４，４０９，３３１文献１４ Ｂｉｏｃｈｅｍ
、Ｓｏｃ、、Ｔｒａｎｓ、、１３’ＩＯ，（１９８５）
文献１５ 村上浩紀編 細胞制御工学 学窓社
第１図および第２図はベクター構築工程図であり第３図
および第４図はＤＮＡ断片の地図であり、第５図乃至第
１２図は用いたプラスミドの概略地図である。 ｐＳＫＶ−１０ ＳＶ４０ 初期プロモーター
ポリアゾニレ−ジョンサ
イト第３図 第４図 第５図 第６図 プロモーター 第７図 第８図 第９図 第１０図 第１２図
および第４図はＤＮＡ断片の地図であり、第５図乃至第
１２図は用いたプラスミドの概略地図である。 ｐＳＫＶ−１０ ＳＶ４０ 初期プロモーター
ポリアゾニレ−ジョンサ
イト第３図 第４図 第５図 第６図 プロモーター 第７図 第８図 第９図 第１０図 第１２図
Claims (3)
- （１）哺乳類細胞を形質転換し、これを増殖させてペプ
チド類を生産させる方法において、該細胞としてミエロ
ーマ細胞を用いることを特徴とする方法 - （２）哺乳類細胞を形質転換し、これを増殖させてペプ
チド類を生産させる方法において、該形質転換を、該ペ
プチド類をコードする遺伝子の５’上流および３’下流
の両側にＳＶ４０初期プロモーター配列を有するベクタ
ーを用いて行なうことを特徴とする方法 - （３）哺乳類細胞を形質転換し、これを増殖させてペプ
チド類を生産させる方法において、該ペプチド類をコー
ドする遺伝子の５’上流および３’下流の両側にＳＶ４
０初期プロモーター配列を有するベクターを用いかつ哺
乳類細胞としてミエローマ細胞を用いて該形質転換を行
なうことを特徴とする方法
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8552786 | 1986-04-14 | ||
| JP61-85527 | 1986-04-14 |
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|---|---|
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| JP2573215B2 JP2573215B2 (ja) | 1997-01-22 |
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|---|---|---|---|
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| AU (1) | AU600481B2 (ja) |
| CA (1) | CA1297434C (ja) |
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| DK (1) | DK189987A (ja) |
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| IL (1) | IL82207A (ja) |
| NO (1) | NO175872C (ja) |
| PH (1) | PH26343A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| GB8809129D0 (en) * | 1988-04-18 | 1988-05-18 | Celltech Ltd | Recombinant dna methods vectors and host cells |
| US5879936A (en) * | 1988-04-18 | 1999-03-09 | Aluguisse Holding A.G. | Recombinant DNA methods, vectors and host cells |
| US5573937A (en) * | 1989-12-07 | 1996-11-12 | Snow Brand Milk Products Co., Ltd. | Serum free culture medium |
| US5891693A (en) * | 1990-01-25 | 1999-04-06 | Alusuisse Holdings A.G. | Recombinant DNA methods vectors and host cells |
| GB9022545D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
| GB9022543D0 (en) * | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Antibody production |
| EP0798379A3 (en) * | 1996-03-29 | 1999-10-06 | Tosoh Corporation | Human glutamic acid decarbocylase-expressing myeloma cell line |
| UY26317A1 (es) * | 2000-08-30 | 2000-10-31 | Alfonso Cayota Carlos Pritsch | Sistema de produccion de trombopoyetina humana por celulas de mamiferos en cultivo |
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| US4740461A (en) * | 1983-12-27 | 1988-04-26 | Genetics Institute, Inc. | Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells |
| US4663281A (en) * | 1984-03-22 | 1987-05-05 | Mass Institute Of Technology | Enhanced production of proteinaceous materials in eucaryotic cells |
| JPS6147500A (ja) * | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
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-
1994
- 1994-09-28 CN CN94116755A patent/CN1107513A/zh active Pending
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