JPS6345234A - ２−アリ−ルプロピオン酸の製造方法 - Google Patents
２−アリ−ルプロピオン酸の製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、化学式
に示される立体特異的形状の薬学的に活性な化合物、及
びアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩又はピバロイル
エステルのようなその薬学的に許容できる塩及びエステ
ルで、Ｒ，が、任意に置換したヘテロ環システム中に任
意に含まれうる、フェニル基やナフチル基のような任意
に置換してもよいアリール基、もしくは、任意に置換さ
れうる、炭素原子と、窒素、硫黄及び酸素から選ばれた
１以上の原子とを含むヘテロ環システムを示すような化
合物の製造方法に関するものである。
びアルカリ金属又はアルカリ土類金属塩又はピバロイル
エステルのようなその薬学的に許容できる塩及びエステ
ルで、Ｒ，が、任意に置換したヘテロ環システム中に任
意に含まれうる、フェニル基やナフチル基のような任意
に置換してもよいアリール基、もしくは、任意に置換さ
れうる、炭素原子と、窒素、硫黄及び酸素から選ばれた
１以上の原子とを含むヘテロ環システムを示すような化
合物の製造方法に関するものである。
数多（の生物学的に活性な化合物が、立体異性体の混合
物の形で存在することが知られている。
物の形で存在することが知られている。
現在に至るまで、これらの混合物はしばしば、農業的又
は薬学的目的で利用されている。通常、望ましい生物学
的活性残基は、一方の立体異性体に存在するので、その
結果、２ケの立体異性体の混合物の場合、その混合物の
能力は半分に減ってしまう、しかし、立体異性体を混合
物のまま使用する大きな理由は、立体異性体の分離のた
めのコストが、それによる活性の増加による潜在的利点
を越えてしまうことにある。しかし現代の薬学者は徐々
に、いくつかの立体異性体中の１つは望ましい治療的効
果をもたないだけでなく、他の望ましくない、毒性も含
む生理学的効果をもつがもしれないというような、混合
物の投与に対する他の意味にも気付きはじめてきている
。
は薬学的目的で利用されている。通常、望ましい生物学
的活性残基は、一方の立体異性体に存在するので、その
結果、２ケの立体異性体の混合物の場合、その混合物の
能力は半分に減ってしまう、しかし、立体異性体を混合
物のまま使用する大きな理由は、立体異性体の分離のた
めのコストが、それによる活性の増加による潜在的利点
を越えてしまうことにある。しかし現代の薬学者は徐々
に、いくつかの立体異性体中の１つは望ましい治療的効
果をもたないだけでなく、他の望ましくない、毒性も含
む生理学的効果をもつがもしれないというような、混合
物の投与に対する他の意味にも気付きはじめてきている
。
特に、Ｓ、アダムス（Ｓ、 Ａｄａｍｓ ）等によりジ
ャーナル・オブ・ファーム・アンド・ファーマキューテ
４ツタ（Ｊ、 Ｐｈａｒ＋ｗ、 Ｐｈａｒｍａｃ、 ）
２８巻２５６頁（Ｉ９７６年）及び、Ａ 、Ｊ 、ハ
ツト（Ａ、Ｊ、 Ｂｕｔｔ）及びＪ、コールドウェル（
Ｊ、 Ｃａｌｄｗｅｌｌ ）による、クリニカル・ファ
ーマコキネティクス（ＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｍＣ１１
ｎｉｃａｌＰｈａ ） ９巻３７１頁（Ｉ９８４年）の
報告で知られているように、その対掌体の１５０倍にも
及びＳ−エナンチオマー（光学活性立体異性体）のイブ
プロフェン（Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ ） 残４と同様なナ
プロキセン（ＩＩａｐｒｏｘｅｎ ）の試験管内におけ
る抗炎症活性が発見された。
ャーナル・オブ・ファーム・アンド・ファーマキューテ
４ツタ（Ｊ、 Ｐｈａｒ＋ｗ、 Ｐｈａｒｍａｃ、 ）
２８巻２５６頁（Ｉ９７６年）及び、Ａ 、Ｊ 、ハ
ツト（Ａ、Ｊ、 Ｂｕｔｔ）及びＪ、コールドウェル（
Ｊ、 Ｃａｌｄｗｅｌｌ ）による、クリニカル・ファ
ーマコキネティクス（ＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｍＣ１１
ｎｉｃａｌＰｈａ ） ９巻３７１頁（Ｉ９８４年）の
報告で知られているように、その対掌体の１５０倍にも
及びＳ−エナンチオマー（光学活性立体異性体）のイブ
プロフェン（Ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ ） 残４と同様なナ
プロキセン（ＩＩａｐｒｏｘｅｎ ）の試験管内におけ
る抗炎症活性が発見された。
Ｓ、イリウチジマ（Ｓ、 Ｉｒｉｕｃｈｉｊｉｍａ ）
と、Ａ。
と、Ａ。
ケイユ（Ａ、 Ｋｅｉｙｕ ） （アグリヵルチャナレ
・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ
、旧。ｌ。
・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ
、旧。ｌ。
Ｃｈｅｗ、 ） ４５巻、１３８９頁（Ｉ９８１年））
は、ある選ばれた微生物は、低い転換率ではあるが、ナ
プロキセン及びケトプロフェンのメチルエステルを加水
分解することができることを示した。アスペルギルス・
ソジャエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ５ｏｊａｅ ）は
選択的に、Ｒ型ナプロキセンのメチルエステルを加水分
解し、９５重量パーセントのＲ−配置をもつナプロキセ
ンを生産し、一方、ミクロバクテリウム°スメグマティ
ス（Ｍｙｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇ −ｎ＋
ａｔｉｓ）は選択的にＳ型ケトプロフェン（ｋｅ ｔｏ
ｐｒｏｆ ｅｎ）のメチルエステルを加水分解し、６９
重量パーセントではあるがＳ−配置をもっケトプロフェ
ンを与える。
は、ある選ばれた微生物は、低い転換率ではあるが、ナ
プロキセン及びケトプロフェンのメチルエステルを加水
分解することができることを示した。アスペルギルス・
ソジャエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ５ｏｊａｅ ）は
選択的に、Ｒ型ナプロキセンのメチルエステルを加水分
解し、９５重量パーセントのＲ−配置をもつナプロキセ
ンを生産し、一方、ミクロバクテリウム°スメグマティ
ス（Ｍｙｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇ −ｎ＋
ａｔｉｓ）は選択的にＳ型ケトプロフェン（ｋｅ ｔｏ
ｐｒｏｆ ｅｎ）のメチルエステルを加水分解し、６９
重量パーセントではあるがＳ−配置をもっケトプロフェ
ンを与える。
ドイツ特許出願ＤＥ ３３４５６６０号中には、ナプロ
キセン・エステルのラセミ体からのＳ−ナプロキセンの
生産が述べられている。しかし、この特許出願中では、
Ｓ型ナプロキセンが、ナプロキセンエステルのラセミ体
から直接形成されるのではなく、Ｒ型のナプロキセンエ
ステルを酵素的に加水分解し、生じたＲ−ナプロキセン
を、Ｓ型ナプロキセンのエステルと分離した後、反応混
合物中に残存するＳ型ナプロキセンエステルのけん化又
は酵素的加水分解によって形成するものである。
キセン・エステルのラセミ体からのＳ−ナプロキセンの
生産が述べられている。しかし、この特許出願中では、
Ｓ型ナプロキセンが、ナプロキセンエステルのラセミ体
から直接形成されるのではなく、Ｒ型のナプロキセンエ
ステルを酵素的に加水分解し、生じたＲ−ナプロキセン
を、Ｓ型ナプロキセンのエステルと分離した後、反応混
合物中に残存するＳ型ナプロキセンエステルのけん化又
は酵素的加水分解によって形成するものである。
最近の刊行されたものには（り・ミン（Ｑｕ −Ｍｉｎ
ｇ）等テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎＬｅｔｔｅｒｓ ） 、２７巻、１６号、１７〜６
３頁（Ｉ９８６年））、Ｓ型のナプロキセンエステルを
、立体選択的に転換しうる、キャンディダ・シリンドラ
セア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ ）が
らの１つの酵素の調製法が述べられている。著者らは、
この調製物中に存在する、キャンディダ・リパーゼが、
ナプロキセンの加水分解を任っているこを示している。
ｇ）等テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎＬｅｔｔｅｒｓ ） 、２７巻、１６号、１７〜６
３頁（Ｉ９８６年））、Ｓ型のナプロキセンエステルを
、立体選択的に転換しうる、キャンディダ・シリンドラ
セア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ ）が
らの１つの酵素の調製法が述べられている。著者らは、
この調製物中に存在する、キャンディダ・リパーゼが、
ナプロキセンの加水分解を任っているこを示している。
しかし、彼等が精製したリパーゼ調製物の比活性は非常
に低い（ある条件下で、リパ−ゼ・ミリグラム当り、毎
分３Ｘ１０−”モル）。
に低い（ある条件下で、リパ−ゼ・ミリグラム当り、毎
分３Ｘ１０−”モル）。
それ故、Ｓ型立体異性体の直接的調製に対し、経済的に
魅力のある収率を得ることができる工業的規模のプロセ
スに対する大きな需要が存在し、本発明の目的は、その
ようなプロセスを与えることである。広範囲な研究と実
験の結果、化学式（）： の化合物で、Ｒ１は先に定義したもので、Ｒ，は、エス
テル残基及び好ましくは任意に置換したアルキル基であ
る化合物に、少なくとも８０重量パーセント以上のＳ配
置を有する化合物（Ｉ）へと、化合物（ＩＩ）を立体選
択的に加水分解しうる、微生物もしくは、微生物由来の
物質を作用させることを含む、化合物（Ｉ）のＳ型立体
異性体を特に精製するための、改良した選択的合成法が
まさに全発見されたのである。
魅力のある収率を得ることができる工業的規模のプロセ
スに対する大きな需要が存在し、本発明の目的は、その
ようなプロセスを与えることである。広範囲な研究と実
験の結果、化学式（）： の化合物で、Ｒ１は先に定義したもので、Ｒ，は、エス
テル残基及び好ましくは任意に置換したアルキル基であ
る化合物に、少なくとも８０重量パーセント以上のＳ配
置を有する化合物（Ｉ）へと、化合物（ＩＩ）を立体選
択的に加水分解しうる、微生物もしくは、微生物由来の
物質を作用させることを含む、化合物（Ｉ）のＳ型立体
異性体を特に精製するための、改良した選択的合成法が
まさに全発見されたのである。
さらに、本発明は、化学式（Ｉ）の立体特異的Ｓ配置の
薬学的に活性な化合物もしくは、好ましくはそのアルカ
リ金属塩又はアルカリ土類金属塩である、薬学的に許容
できるその塩又はエステル（但し、ＲＩが任意に置換さ
れうるヘテロ環システム中に任意に含まれうるフェニル
基や、ナフチル基のような任意に置換されうるアリール
基、もしくは、任意に置換されうるシステムで、炭素原
子の他に、窒素、硫黄及び酸素から選ばれる１以上の原
子を含むペテロ環システムを表わし、Ｒ２が任意に置換
されるアルキル基である）を優先的に生産するための、
化学式（ＩＩ）の化合物（ＩＩ）に、化合物（ＩＩ）を
立体選択的に加水分解して、化合物（Ｉ）に転換する能
力を有する微生物を作用させることを含む方法に関する
ものである。
薬学的に活性な化合物もしくは、好ましくはそのアルカ
リ金属塩又はアルカリ土類金属塩である、薬学的に許容
できるその塩又はエステル（但し、ＲＩが任意に置換さ
れうるヘテロ環システム中に任意に含まれうるフェニル
基や、ナフチル基のような任意に置換されうるアリール
基、もしくは、任意に置換されうるシステムで、炭素原
子の他に、窒素、硫黄及び酸素から選ばれる１以上の原
子を含むペテロ環システムを表わし、Ｒ２が任意に置換
されるアルキル基である）を優先的に生産するための、
化学式（ＩＩ）の化合物（ＩＩ）に、化合物（ＩＩ）を
立体選択的に加水分解して、化合物（Ｉ）に転換する能
力を有する微生物を作用させることを含む方法に関する
ものである。
好ましくは、Ｒ２は、１〜８ケの炭素原子をもつ線状ア
ルキル基で、さらに好ましくはＲ２はメチルもしくはエ
チル基である。
ルキル基で、さらに好ましくはＲ２はメチルもしくはエ
チル基である。
化合物（Ｉ）には、ナプロキセン、イブプロフェン、ス
プロフエン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、ベノ
キサプロフェン、カープロフェン、シクロプロフェン、
パープロフェン、リシプロフェナム、フェノプロフェン
、クリダナック、ターチプロフェン、ヘキサプロフェン
、インドプロフェン、メキソプロフェン、プラノプロフ
ェン、Ｒ８０３、ブロチジン酸、チアプロフェン酸又は
プロフエジルがあげられる。
プロフエン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、ベノ
キサプロフェン、カープロフェン、シクロプロフェン、
パープロフェン、リシプロフェナム、フェノプロフェン
、クリダナック、ターチプロフェン、ヘキサプロフェン
、インドプロフェン、メキソプロフェン、プラノプロフ
ェン、Ｒ８０３、ブロチジン酸、チアプロフェン酸又は
プロフエジルがあげられる。
さらに好ましくは本発明に沿ってナプロキセンが優先的
にＳ配置で精製される。
にＳ配置で精製される。
好ましい具体例によると、この方法は、化合物（Ｉ）が
少なくとも９０重量パーセントＳ配置で形成されるよう
な適当な微生物又はそれに由来する物質を選択すること
により実行される。
少なくとも９０重量パーセントＳ配置で形成されるよう
な適当な微生物又はそれに由来する物質を選択すること
により実行される。
本発明のもう１つの目的は、前述のキャンディダ・シリ
ントラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ
）のリパーゼの少なくとも１０倍以上、望ましくは１
００倍以上の活性のある酵素を提供することにある。
ントラセア（Ｃａｎｄｉｄａ ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ
）のリパーゼの少なくとも１０倍以上、望ましくは１
００倍以上の活性のある酵素を提供することにある。
本発明の別の目的は、後に、化合物（Ｉ）を分離し、他
の部分を加水分解する、本発明に従った工程を含む、少
なくとも８０重量パーセント以上のＲ配置を有する化合
物（Ｉ）の精製に対する工程を提供することにある。
の部分を加水分解する、本発明に従った工程を含む、少
なくとも８０重量パーセント以上のＲ配置を有する化合
物（Ｉ）の精製に対する工程を提供することにある。
“適当な微生物”という言葉は、例えば、バチルス属、
シュードモナス属、アースロバクター属、ムコール属、
ストレプトマイセス属に属する微生物を意味している。
シュードモナス属、アースロバクター属、ムコール属、
ストレプトマイセス属に属する微生物を意味している。
また、新しい遺伝的物質の導入を通して、化合物（ＩＩ
）を化合物（Ｉ）に立体選択的に転換する能力を得た微
生物も“適当な微生物”という言葉の具体例となる。
）を化合物（Ｉ）に立体選択的に転換する能力を得た微
生物も“適当な微生物”という言葉の具体例となる。
これは、立体選択的加水分解を任う物質、あるスクリー
ニングした微生物からのエステラーゼ酵素をコードする
クローン化した遺伝子を他の微生物特に大腸菌に形質転
換することにより行うことができる。他の微生物は、サ
ツカロミセス、クルイベロミセス、アスペルギラス、ニ
ジエリシア、シュードモナス及びストレプロミセス属に
属するものである。クローン化した遺伝子は、エステル
、好ましくは、β−ナフチル・アセテート又はナプロセ
ンエステルを加水分解することのできる酵素をコードす
る能力により選択することができる。
ニングした微生物からのエステラーゼ酵素をコードする
クローン化した遺伝子を他の微生物特に大腸菌に形質転
換することにより行うことができる。他の微生物は、サ
ツカロミセス、クルイベロミセス、アスペルギラス、ニ
ジエリシア、シュードモナス及びストレプロミセス属に
属するものである。クローン化した遺伝子は、エステル
、好ましくは、β−ナフチル・アセテート又はナプロセ
ンエステルを加水分解することのできる酵素をコードす
る能力により選択することができる。
一方、それらは、すでに選択されている、エステラーゼ
の遺伝子とクロス・ハイブリダイゼーションさせること
により選択することができる。後者の仮定は、関連する
微生物は、対応する酵素のＤＮＡ配列中に相同性を示す
という観察（イハラ（Ｉｈａｒａ ）等、ジャーナル・
オプ・バイオケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、
） ９８Ｓ、９５頁（Ｉ９８５年））及び、プラス
ミドｐＮＡＰＴ−７（実施例１１参照）は、他のバチル
ス種から誘導した染色体ＤＮＡとクロス・ハイブリダイ
ゼーションをするという我々の観察に基づいている。加
えて、この発明は化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）へ転換
するプロセスにおいて、微生物及びその微生物から誘導
した物質の活性を増加する目的で、微生物中に、そのエ
ステラーゼをコードする遺伝子コピーを数多く、もしく
は修正した形で導入する方法を公開している。この微生
物は、例えば枯草菌である。
の遺伝子とクロス・ハイブリダイゼーションさせること
により選択することができる。後者の仮定は、関連する
微生物は、対応する酵素のＤＮＡ配列中に相同性を示す
という観察（イハラ（Ｉｈａｒａ ）等、ジャーナル・
オプ・バイオケミストリー（Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、
） ９８Ｓ、９５頁（Ｉ９８５年））及び、プラス
ミドｐＮＡＰＴ−７（実施例１１参照）は、他のバチル
ス種から誘導した染色体ＤＮＡとクロス・ハイブリダイ
ゼーションをするという我々の観察に基づいている。加
えて、この発明は化合物（ＩＩ）を化合物（Ｉ）へ転換
するプロセスにおいて、微生物及びその微生物から誘導
した物質の活性を増加する目的で、微生物中に、そのエ
ステラーゼをコードする遺伝子コピーを数多く、もしく
は修正した形で導入する方法を公開している。この微生
物は、例えば枯草菌である。
その微生物を、例えば、高分子ゲル中にうまく固定化す
ることができる。これは生菌又は死菌の状態でも、また
、もし、高い比活性が必要な場合には、ある程度精製し
たエステラーゼ酵素を用いて行うことができる。
ることができる。これは生菌又は死菌の状態でも、また
、もし、高い比活性が必要な場合には、ある程度精製し
たエステラーゼ酵素を用いて行うことができる。
それ故、“微生物又は、それから誘導された物質”とい
う言葉は、死んでから、もしくは生きている微生物、又
はそれに由来する、任意の濃度と精製度の抽出物を意味
している。
う言葉は、死んでから、もしくは生きている微生物、又
はそれに由来する、任意の濃度と精製度の抽出物を意味
している。
特に、ナプロキセンのエチル及びメチルエステル〔エチ
ル２−（６−メドキシー２−ナフチル）プロピオネート
及びメチル２−（６−メドキシー２−ナフチル）プロピ
オネート〕をＳ−ナプロキセン（２−（６−メドキシー
２−ナフチル）プロピオン酸〕に加水分解する、そして
、イブプロフェンのエチル及びメチルエステル〔エチル
２−（４−イソブチル−１−フェニル）プロピオネート
及びメチル２−（４−イソブチル−１−フェニル）プロ
ピオネート〕をＳ−イブプロフェン〔２−（４−イソブ
チル−１−フェニル）プロピオン酸〕に加水分解する微
生物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）
、バチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ１ｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒａ＋ｉｓ） （この種の試料は、ＡＴ
ＣＣ受理番号１１９４５号に保管されている）、シュー
ドモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅ −５ｃｅｎｃｅ ）シュードモナス・プ
チダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ ） （こ
の種の試料はＩＦＯ受理番号１２９９６号で保管されて
いる）、シュードモナス・リボフラビナ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ ）（この種の試
料はＩＦＯ受理番号１３５８４号で保管されている）、
シュードモナス・オバリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏ
ｖａｌ ｉｓ） （この種の試料は１ＡＭ受理番号１０
４９号で保管されている）、シュードモナス・アエルギ
ノザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
）（この種の試料はＩＦＯ受理番号１３１３０号で保管
されている）、ムコール・アングリマクロスポラス（Ｍ
ｕｃｏｒａｎｇｕｌｉｗ＋ａｃｒｏｓｐｏｒｕｓ ）（
この種の試料は１ＡＭ受理番号６１４９号で保管されて
いる）、アースロバクター・バラフィネウム（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉ−ｎａｕｓ） （こ
の種の試料はＡＴＣＣ受理番号２１２１８号で保管され
ている）、１ｓＩＩＩ−２５株（Ｓｔｒａｉｎ １ｓｌ
ＩＩ−２５）（この種の試料はＣＢＳ受理番号６６６．
８６号で保管されている） 、ＬＫ３−４株（５ｔｒａ
ｉｎＬＫ３−４）（この種の試料はＣＢＳ受理番号６６
７．８６号で保管されている）、ＳｐＡ株（５ｔｒａｉ
ｎ Ｓｐ ４）（この種の試料はＣＢＳ受理番号６６８
．８６号で保管されている）、Ｔｈａｉｍ１８ １株（
５ｔｒａｉｎＴｈａｉＩ［Ｉ １８ １）（この種の試
料はＣＢＳ受理番号６６９、８６号で保管されている）
、ＴｈａｉＶＩ １２株（５ｔｒａｉｎ Ｔｈａｉ
Ｖｌ １２）（この種の試料はＣＢＳ受理番号６７０．
８６号で保管されている）、の培養物を含んでいる。好
ましくは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ
）種の培養物は、バチルス種Ｔｈａｉ １−８（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ５ｐｅｃｉｅｓ Ｔｈａｔ １ ８）（
この種の試料は、ＣＢＳに受理番号６７９．８５号で保
管されている）、バチルス種１ ｎ Ｎ−８（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｐｅｃｉｅｓＩｎｌＶ−８）（この種の試
料は、ＣＢＳに受理番号６８０、８５号で保管されてい
る）、バチルス種Ｎａｐ １０−Ｍ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｐｅｃｉｅｓ Ｎａｐｌ Ｏ−Ｍ ）（この種の試
料はＣＢＳに受理番号８０５．８５号で保管されている
）、バチルス種Ｓｐｌ［ｌ−４（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ
ｅｃｉｅｓ Ｓｐ ｍ −４）（この種の試料は、ＣＢ
Ｓに受理番号８０６．８５号で保管されている）、枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） １−８
５ （ユキ（Ｙｕｋｉ ）等、日本遺伝学雑誌（Ｊｐｎ
、 Ｊ、 Ｇｅｎｅｔ、）４２巻、２５１頁（Ｉ９６７
年））、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ ） １−８５／ ｐＮＡＰ Ｔ −７（この種の試
料はＣＢＳに受理番号６７３．８６号で保管されている
）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）１
Ａ−４０／ ｐＮＡＰＴ−８（この種の試料は、ＣＢＳ
に受理番号６７４．８６号で保管されている）及び枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） Ｉ
Ａ −４０／ＰＮＡＰＴ−７（この種の試料は、ＣＢＳ
に受理番号６７５．８６号で保管されている）の培養物
を含んでいる。シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓ
ｅｕｄｏ＋ｗｏｎａｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ）の
培養物は、シュードモナス種Ｋｏｒ Ｉ −６（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ５ｐｅｃｉｅｓＫｏｒ１６）（この
種の試料はＣＢＳに受理番号８０７．８５号で保管され
ている）及び、ＩＦＯに受理番号３０８１号で保管され
ているシュードモナス争フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｓ＋ｏｎａｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の培養物を含
んでいる。ＩＦＯとは日本の大阪にある発酵研究所を示
し、１ＡＭは、日本の東京大学の応用微生物学研究所の
ことである。本発明の工程の好ましい具体例によると、
化合物（ＩＩ）を、少なくとも８０重量パーセントＳ−
配置をもつ化合物に転換できる微生物は、約半日から１
０日間培養しなければならない、その後、その細胞を、
液体栄養培地に懸濁し、化合物（ＩＩ）をその細胞の作
用を受けさせる。一方では、その細胞を例えば、細胞破
壊培地に懸濁させることで殺ろし、さらに化合物（■）
を、その細胞由来の物質の作用を受けさせる。
ル２−（６−メドキシー２−ナフチル）プロピオネート
及びメチル２−（６−メドキシー２−ナフチル）プロピ
オネート〕をＳ−ナプロキセン（２−（６−メドキシー
２−ナフチル）プロピオン酸〕に加水分解する、そして
、イブプロフェンのエチル及びメチルエステル〔エチル
２−（４−イソブチル−１−フェニル）プロピオネート
及びメチル２−（４−イソブチル−１−フェニル）プロ
ピオネート〕をＳ−イブプロフェン〔２−（４−イソブ
チル−１−フェニル）プロピオン酸〕に加水分解する微
生物は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）
、バチルス・リチェニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ１ｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒａ＋ｉｓ） （この種の試料は、ＡＴ
ＣＣ受理番号１１９４５号に保管されている）、シュー
ドモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅ −５ｃｅｎｃｅ ）シュードモナス・プ
チダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ ） （こ
の種の試料はＩＦＯ受理番号１２９９６号で保管されて
いる）、シュードモナス・リボフラビナ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎａ ）（この種の試
料はＩＦＯ受理番号１３５８４号で保管されている）、
シュードモナス・オバリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｏ
ｖａｌ ｉｓ） （この種の試料は１ＡＭ受理番号１０
４９号で保管されている）、シュードモナス・アエルギ
ノザ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ
）（この種の試料はＩＦＯ受理番号１３１３０号で保管
されている）、ムコール・アングリマクロスポラス（Ｍ
ｕｃｏｒａｎｇｕｌｉｗ＋ａｃｒｏｓｐｏｒｕｓ ）（
この種の試料は１ＡＭ受理番号６１４９号で保管されて
いる）、アースロバクター・バラフィネウム（Ａｒｔｈ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉ−ｎａｕｓ） （こ
の種の試料はＡＴＣＣ受理番号２１２１８号で保管され
ている）、１ｓＩＩＩ−２５株（Ｓｔｒａｉｎ １ｓｌ
ＩＩ−２５）（この種の試料はＣＢＳ受理番号６６６．
８６号で保管されている） 、ＬＫ３−４株（５ｔｒａ
ｉｎＬＫ３−４）（この種の試料はＣＢＳ受理番号６６
７．８６号で保管されている）、ＳｐＡ株（５ｔｒａｉ
ｎ Ｓｐ ４）（この種の試料はＣＢＳ受理番号６６８
．８６号で保管されている）、Ｔｈａｉｍ１８ １株（
５ｔｒａｉｎＴｈａｉＩ［Ｉ １８ １）（この種の試
料はＣＢＳ受理番号６６９、８６号で保管されている）
、ＴｈａｉＶＩ １２株（５ｔｒａｉｎ Ｔｈａｉ
Ｖｌ １２）（この種の試料はＣＢＳ受理番号６７０．
８６号で保管されている）、の培養物を含んでいる。好
ましくは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ
）種の培養物は、バチルス種Ｔｈａｉ １−８（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ５ｐｅｃｉｅｓ Ｔｈａｔ １ ８）（
この種の試料は、ＣＢＳに受理番号６７９．８５号で保
管されている）、バチルス種１ ｎ Ｎ−８（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ５ｐｅｃｉｅｓＩｎｌＶ−８）（この種の試
料は、ＣＢＳに受理番号６８０、８５号で保管されてい
る）、バチルス種Ｎａｐ １０−Ｍ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｐｅｃｉｅｓ Ｎａｐｌ Ｏ−Ｍ ）（この種の試
料はＣＢＳに受理番号８０５．８５号で保管されている
）、バチルス種Ｓｐｌ［ｌ−４（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ
ｅｃｉｅｓ Ｓｐ ｍ −４）（この種の試料は、ＣＢ
Ｓに受理番号８０６．８５号で保管されている）、枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） １−８
５ （ユキ（Ｙｕｋｉ ）等、日本遺伝学雑誌（Ｊｐｎ
、 Ｊ、 Ｇｅｎｅｔ、）４２巻、２５１頁（Ｉ９６７
年））、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉ
ｓ ） １−８５／ ｐＮＡＰ Ｔ −７（この種の試
料はＣＢＳに受理番号６７３．８６号で保管されている
）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）１
Ａ−４０／ ｐＮＡＰＴ−８（この種の試料は、ＣＢＳ
に受理番号６７４．８６号で保管されている）及び枯草
菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） Ｉ
Ａ −４０／ＰＮＡＰＴ−７（この種の試料は、ＣＢＳ
に受理番号６７５．８６号で保管されている）の培養物
を含んでいる。シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓ
ｅｕｄｏ＋ｗｏｎａｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ ）の
培養物は、シュードモナス種Ｋｏｒ Ｉ −６（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ５ｐｅｃｉｅｓＫｏｒ１６）（この
種の試料はＣＢＳに受理番号８０７．８５号で保管され
ている）及び、ＩＦＯに受理番号３０８１号で保管され
ているシュードモナス争フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｓ＋ｏｎａｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）の培養物を含
んでいる。ＩＦＯとは日本の大阪にある発酵研究所を示
し、１ＡＭは、日本の東京大学の応用微生物学研究所の
ことである。本発明の工程の好ましい具体例によると、
化合物（ＩＩ）を、少なくとも８０重量パーセントＳ−
配置をもつ化合物に転換できる微生物は、約半日から１
０日間培養しなければならない、その後、その細胞を、
液体栄養培地に懸濁し、化合物（ＩＩ）をその細胞の作
用を受けさせる。一方では、その細胞を例えば、細胞破
壊培地に懸濁させることで殺ろし、さらに化合物（■）
を、その細胞由来の物質の作用を受けさせる。
上述のような約半日から１０日間の培養の後、その細胞
を、その培地から単離した後、その細胞を液体栄養培地
もしくは、細胞破壊培地に懸濁する。
を、その培地から単離した後、その細胞を液体栄養培地
もしくは、細胞破壊培地に懸濁する。
化合物（ＩＩ）の選択的加水分解に用いる微生物の生育
のために、同化可能な炭素源（例えば、グルコース、ラ
クテート、スクロース他）、窒素源（例えば、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム他）に
、有機栄養源（例えば、酵母抽出物、モルト抽出物、ペ
プトン、肉エキス他）、無機栄養源（例えば、リン酸、
マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄及び他の金属痕跡量
）のための試薬を補った通常の培地が用いられる。
のために、同化可能な炭素源（例えば、グルコース、ラ
クテート、スクロース他）、窒素源（例えば、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム他）に
、有機栄養源（例えば、酵母抽出物、モルト抽出物、ペ
プトン、肉エキス他）、無機栄養源（例えば、リン酸、
マグネシウム、カリウム、亜鉛、鉄及び他の金属痕跡量
）のための試薬を補った通常の培地が用いられる。
より好ましい培地として、いくつかの成分を任意に補っ
たジャツブ培地（Ｊａｐ ｍｅｄｉｕ■）が用いられた
。次の組成で示されるジャツブ培地を用いた；大豆粉（
３０ｇ／ｌり 、硝酸ナトリウム（７，５ｇ／ｊり 、
硫酸鉄・７水（０，２８ｇ／／）、クエン酸ナトリウム
（６ｇ／ｌ）及びフラクトース（Ｉ２，５ｇ／ｌ） ｐ
Ｈ７，２に調整、使用前に、培地を１２０℃、２０分で
滅菌する。
たジャツブ培地（Ｊａｐ ｍｅｄｉｕ■）が用いられた
。次の組成で示されるジャツブ培地を用いた；大豆粉（
３０ｇ／ｌり 、硝酸ナトリウム（７，５ｇ／ｊり 、
硫酸鉄・７水（０，２８ｇ／／）、クエン酸ナトリウム
（６ｇ／ｌ）及びフラクトース（Ｉ２，５ｇ／ｌ） ｐ
Ｈ７，２に調整、使用前に、培地を１２０℃、２０分で
滅菌する。
もう１つの好ましい培地としては、任意にいくつかの成
分を補ったＴＳＢ−培地２Ｘがある。６０ｇ／Ｉ！のト
リブチカーゼ・ソイ・プロス（オクソイド（Ｏｘｏｉｄ
” ））を含む培地を使用した。使用前にその培地を
１２０℃で２０分間滅菌した。もう１つの好ましい培地
は、い（つかの成分を補った２ＸＴＹ培地である。トリ
プトン（デイフコ（Ｄｉｆｃｏ” ）） ３０ ｇ ／
ｌ 、イースト・イクストラクト（デイフコ（Ｄｉｆ
ｃｏ” ）） ２０ ｇ ／ １、塩化ナトリウム３
ｇ ／ ｌ 、リン酸アンモニウム１ ｇ／ｌ、 及び
硫酸アンモニウムＩｇ／ｊ２を含むｐＨ６，８の培地を
用いた。使用前に、１１０℃で３０分間滅菌した。また
、さらに好ましい培地として、いくつかの成分を任意に
補ったスキム・ミルク培地を用いた０次の組成のスキム
・ミルク培地を用いた；スキムミルク粉から作った１０
％スキムミルクを使用前に１１０℃で３０分間滅菌した
。
分を補ったＴＳＢ−培地２Ｘがある。６０ｇ／Ｉ！のト
リブチカーゼ・ソイ・プロス（オクソイド（Ｏｘｏｉｄ
” ））を含む培地を使用した。使用前にその培地を
１２０℃で２０分間滅菌した。もう１つの好ましい培地
は、い（つかの成分を補った２ＸＴＹ培地である。トリ
プトン（デイフコ（Ｄｉｆｃｏ” ）） ３０ ｇ ／
ｌ 、イースト・イクストラクト（デイフコ（Ｄｉｆ
ｃｏ” ）） ２０ ｇ ／ １、塩化ナトリウム３
ｇ ／ ｌ 、リン酸アンモニウム１ ｇ／ｌ、 及び
硫酸アンモニウムＩｇ／ｊ２を含むｐＨ６，８の培地を
用いた。使用前に、１１０℃で３０分間滅菌した。また
、さらに好ましい培地として、いくつかの成分を任意に
補ったスキム・ミルク培地を用いた０次の組成のスキム
・ミルク培地を用いた；スキムミルク粉から作った１０
％スキムミルクを使用前に１１０℃で３０分間滅菌した
。
例えば、スキムミルク栄養添加としては、０．５％ラク
テート又はＰＳ■塩、もしくはその双方の組合せで行っ
た０次の組成のｐｓｍ塩培地を用いた；リン酸二水素カ
リウム（２，１ｇ／ｌ） 、Ｉ７７酸ｌ水素アンモニウ
ム（Ｉ，０ｇ／ｇ、硫酸アンモニウム（０，９ｇ／ｊり
、塩化カリウム（０，２ｇ／Ｉり、クエン酸ナトリウム
（０，２９ｇ／ｌ）、硫酸カルシウム、・２水（０，０
０５ｇ／ｊ？） 、硫酸マグネシウム・７水（０，２ｇ
＃り、硫酸鉄アンモニウム・６８ｚＯ（２，５ｍｇ／
ｌ ） 、硫酸亜鉛・７水（０，５＋ａｇ／ ｌ ）
、塩化マンガン・４Ｈ２０（０，３ＩＩＩｇ／ｌ）、硫
酸銅・５ＨｚＯ（０，１５Ｉ１ｇ／ ｊり 、塩化コバ
ルト・６ＨｚＯ（０，１５ｎ＋ｇ／ ｌ ） 、オルト
−ホウ酸（０，０５ｍｇ／ ｌ ） 、モリブデン酸ナ
トリウム・２水（０，Ｏ５５ｍｇ／ ｌ ） 、ヨウ化
カリウム（０，１輪ｇ／ｌ）、ｐ）１６．８に調整。ｐ
ｓｍ塩培地は使用前に１２０℃２０分間滅菌した。
テート又はＰＳ■塩、もしくはその双方の組合せで行っ
た０次の組成のｐｓｍ塩培地を用いた；リン酸二水素カ
リウム（２，１ｇ／ｌ） 、Ｉ７７酸ｌ水素アンモニウ
ム（Ｉ，０ｇ／ｇ、硫酸アンモニウム（０，９ｇ／ｊり
、塩化カリウム（０，２ｇ／Ｉり、クエン酸ナトリウム
（０，２９ｇ／ｌ）、硫酸カルシウム、・２水（０，０
０５ｇ／ｊ？） 、硫酸マグネシウム・７水（０，２ｇ
＃り、硫酸鉄アンモニウム・６８ｚＯ（２，５ｍｇ／
ｌ ） 、硫酸亜鉛・７水（０，５＋ａｇ／ ｌ ）
、塩化マンガン・４Ｈ２０（０，３ＩＩＩｇ／ｌ）、硫
酸銅・５ＨｚＯ（０，１５Ｉ１ｇ／ ｊり 、塩化コバ
ルト・６ＨｚＯ（０，１５ｎ＋ｇ／ ｌ ） 、オルト
−ホウ酸（０，０５ｍｇ／ ｌ ） 、モリブデン酸ナ
トリウム・２水（０，Ｏ５５ｍｇ／ ｌ ） 、ヨウ化
カリウム（０，１輪ｇ／ｌ）、ｐ）１６．８に調整。ｐ
ｓｍ塩培地は使用前に１２０℃２０分間滅菌した。
微生物の生長の間、０から４５℃の間の温度と、３．５
から９の間のｐｌ（が維持された。微生物の生育には、
２０から３７℃の間の温度と、５から９の間のｐＨが望
ましい。
から９の間のｐｌ（が維持された。微生物の生育には、
２０から３７℃の間の温度と、５から９の間のｐＨが望
ましい。
微生物の生育に必要な好気的条件は、もし、酸素の供給
が、その微生物の代謝必要量にみあうなら、既存のいか
なる操作によっても提供することができる。このことは
、空気の形でうまく酸素を供給し、同時に任意に反応液
体を振盪又は攪拌することにより、最も簡単に行うこと
ができる。化合物（Ｉｔ）の化合物（Ｉ）への転換の間
、微生物は上記の通常の培地中で生長期にあるか、又は
、酵素の分解を防ぐべく、システム（培地又はバフファ
ー）中に維持されなければならない。
が、その微生物の代謝必要量にみあうなら、既存のいか
なる操作によっても提供することができる。このことは
、空気の形でうまく酸素を供給し、同時に任意に反応液
体を振盪又は攪拌することにより、最も簡単に行うこと
ができる。化合物（Ｉｔ）の化合物（Ｉ）への転換の間
、微生物は上記の通常の培地中で生長期にあるか、又は
、酵素の分解を防ぐべく、システム（培地又はバフファ
ー）中に維持されなければならない。
化合物（ＩＩ）の化合物（Ｉ）への転換の間、必要なと
きは、同化可能な炭素源（例えば、グルコース、ラクテ
ート、スクロース他）、窒素源（例えば硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム等）、有機栄
養源（例えば、酵母抽出物、モルト抽出物、ペプトン、
肉エキス等）、及び無機栄養源（例えば、リン酸、マグ
ネシウム、カリウム、亜鉛、鉄、他のｍ！金金属を含有
するような通常の培地が用いられる。
きは、同化可能な炭素源（例えば、グルコース、ラクテ
ート、スクロース他）、窒素源（例えば硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム等）、有機栄
養源（例えば、酵母抽出物、モルト抽出物、ペプトン、
肉エキス等）、及び無機栄養源（例えば、リン酸、マグ
ネシウム、カリウム、亜鉛、鉄、他のｍ！金金属を含有
するような通常の培地が用いられる。
好ましくは、化合物（ＩＩ）の化合物（Ｉ）への転換の
間、いくつかの成分を補ったジャンプ培地（前述）を使
用した。またさらに好しくは、いくつかの成分を補った
スキムミルク培地（前述）を用いた。
間、いくつかの成分を補ったジャンプ培地（前述）を使
用した。またさらに好しくは、いくつかの成分を補った
スキムミルク培地（前述）を用いた。
その微生物は、同化可能な炭素源又は、窒素源を除去す
ることにより、非生長期に維持することができる。この
段階の間、温度はＯから４５℃に、ｐＨは３．５から９
の間に維持される。
ることにより、非生長期に維持することができる。この
段階の間、温度はＯから４５℃に、ｐＨは３．５から９
の間に維持される。
好ましくは、その微生物を２０から３７℃の間の温度、
５から８の間のｐＨに維持する。この段階で必要とされ
る好気的条件は、もし酸素の供給が、その微生物の代謝
に必要な量にみあうのに十分ならば、既存のいかなる操
作でも供給することができる。このことは、空気の形で
うまく酸素を供給し、同時に任意にその反応液を振盪又
は攪拌することにより、最も簡単に行うことができる。
５から８の間のｐＨに維持する。この段階で必要とされ
る好気的条件は、もし酸素の供給が、その微生物の代謝
に必要な量にみあうのに十分ならば、既存のいかなる操
作でも供給することができる。このことは、空気の形で
うまく酸素を供給し、同時に任意にその反応液を振盪又
は攪拌することにより、最も簡単に行うことができる。
前述したように、微生物もしくは、それから誘導した物
質によって作られた化合物（Ｉ）は、そのような生産物
に対して知られている従来の操作に従って、回収及び精
製される。
質によって作られた化合物（Ｉ）は、そのような生産物
に対して知られている従来の操作に従って、回収及び精
製される。
その微生物は寒天スラント、５０％グリセリン保存、も
しくは、凍結乾燥により保存することができる。もし必
要なら、これらの微生物の前培養を、例えば、その微生
物を、ロータリーシェーカーにより、３０℃で２４時間
ブイヨン又はＢＨＩ中でインキュベートするといった、
確立した操作により行なわれる。ブイロン培地は次の組
成で用いることがてきる；ラブ・レムコＬ２９ （肉エ
キス、オクソイド（Ｏｘｏｉｄ ” ）（９ｇ ／ ｌ
） 、ハク）ペプトン（Ｉ０ｇ／ｌ）、塩化ナトリウ
ム（５ｇ／ｉり、ｐＨ７，６に調整。使用前に、培地を
１２０℃で２０分間滅菌する。
しくは、凍結乾燥により保存することができる。もし必
要なら、これらの微生物の前培養を、例えば、その微生
物を、ロータリーシェーカーにより、３０℃で２４時間
ブイヨン又はＢＨＩ中でインキュベートするといった、
確立した操作により行なわれる。ブイロン培地は次の組
成で用いることがてきる；ラブ・レムコＬ２９ （肉エ
キス、オクソイド（Ｏｘｏｉｄ ” ）（９ｇ ／ ｌ
） 、ハク）ペプトン（Ｉ０ｇ／ｌ）、塩化ナトリウ
ム（５ｇ／ｉり、ｐＨ７，６に調整。使用前に、培地を
１２０℃で２０分間滅菌する。
ＢＨＩ（プレイン・ハート・インフュージョン）培地は
０．０３７ｇ／ｌのＢＨＩ（オクソイド（Ｏｘｏｉｄ”
））を含み、ｐＨ７，０に調整したものを使用した。
０．０３７ｇ／ｌのＢＨＩ（オクソイド（Ｏｘｏｉｄ”
））を含み、ｐＨ７，０に調整したものを使用した。
使用前にこの培地を１２０℃、２０分間滅菌した。
ナプロキセンのメチルエステルの加水分解を任う、バチ
ルスＴｈａｉ Ｉ −８の酵素が特性づけられた。
ルスＴｈａｉ Ｉ −８の酵素が特性づけられた。
そのエステラーゼ活性はその微生物中に存在するリパー
ゼ活性とは無関係であることがわかった。
ゼ活性とは無関係であることがわかった。
事実、ナプロキセンの不適正な異性体が低レベル加水分
解を起こすのは、主にバチルス株の混入したリパーゼ活
性によるものと思われる。Ｔｈａｉ Ｉ −８の精製し
たナプロキセン・エステラーゼは、バチルスの全細胞破
壊物よりも有意に高い立体異性選択性をもっている。
解を起こすのは、主にバチルス株の混入したリパーゼ活
性によるものと思われる。Ｔｈａｉ Ｉ −８の精製し
たナプロキセン・エステラーゼは、バチルスの全細胞破
壊物よりも有意に高い立体異性選択性をもっている。
Ｔｈａｉ １−８エステラーゼを含むプラスミドをもつ
、大腸菌／ｐＮＡＰＴ−７及びバチルス／ｐＮＡＰ？
−７は、有意なＳ−ナプロキセン・エステラーゼヲ生産
する。驚くべきことに、５ＤＳ−ＰＡＧＥＸＩ（ＰＬＣ
−５ＥＣ及びアイソエレクトリックフォーカシングによ
り確証されたように、エステラーゼ活性をもつタンパク
質はその微生物の細胞破壊物中に最も高い濃度で存在す
るタンパク質である。
、大腸菌／ｐＮＡＰＴ−７及びバチルス／ｐＮＡＰ？
−７は、有意なＳ−ナプロキセン・エステラーゼヲ生産
する。驚くべきことに、５ＤＳ−ＰＡＧＥＸＩ（ＰＬＣ
−５ＥＣ及びアイソエレクトリックフォーカシングによ
り確証されたように、エステラーゼ活性をもつタンパク
質はその微生物の細胞破壊物中に最も高い濃度で存在す
るタンパク質である。
遺伝子クローニングは、ある酵素の発現レベルを改良す
ることが知られているが、エステラーゼの場合のような
促進は驚くべきことである。酵素の遺伝子をクローニン
グするときには、不適正な折りたたみ、タンパク質の変
性及び細胞内の沈殿というような問題にしばしば出くわ
す（ハリス、Ｔ、Ｊ、Ｒ，遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ
、 Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、又、１９８３年、アカ
デミツク・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ））
、予期できなかったことに、エステラーゼ遺伝子のクロ
ーニングに際しては、これらの問題のどれもが生じなか
った。
ることが知られているが、エステラーゼの場合のような
促進は驚くべきことである。酵素の遺伝子をクローニン
グするときには、不適正な折りたたみ、タンパク質の変
性及び細胞内の沈殿というような問題にしばしば出くわ
す（ハリス、Ｔ、Ｊ、Ｒ，遺伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ
、 Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、又、１９８３年、アカ
デミツク・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ））
、予期できなかったことに、エステラーゼ遺伝子のクロ
ーニングに際しては、これらの問題のどれもが生じなか
った。
Ｓ型特異性は以下のように定義した；
Ｓ（生成）
本発明は、さらに実施例について述べていくが、これは
本発明の範囲をこれら実施例に制限するものではない。
本発明の範囲をこれら実施例に制限するものではない。
実施例１
バチルスＴｈａｉ Ｉ −８、バチルスＩｎｒＶ−８、
パルスＮａｐｌＯＭ、バチルスＳｐＩ［［−４、バチル
ス・リチェニホルミス（ＡＴＣＣＩ １９４５）及びシ
ェードモナスＫｏｒｌ−６を用いたＲ３−ナプロゼンエ
チルエステルのＳ−ナプロキセンへの転換バチルスＴｈ
ａｉ Ｉ −８、バチルスＩｎ１Ｖ−８、パルスＮａｐ
ｌＯＭ、バチルスＳｐＩＩＩ−ａ、バチルス・リチェニ
ホルミス（ＡＴＣＣＩ １９４５）及びシュードモナス
Ｋｏｒｌ−６を５００１１１１パフフルフラスコ中の２
５ｙａｌの１０％スキムミルクで各々インキュベートし
、ロータリーシェーカー上で３０℃、４８時間インキュ
ベートした。この増殖後、１００ｍｇのナプロキセンエ
チルエステルを５００ｎ＋７！の大豆油にとかし、１１
０℃、１時間の滅菌の後、各培養液に加えた。微生物に
応じて、２〜５回分の培養物を使用した。この培養物を
、ロータリーシェカー上、３０℃でさらに２４時間イン
キュベートした。その後、その培養物をオルトリン酸で
ｐＨ２〜３に酸性化し、少量の硫酸アンモニウムを添加
し、２５■ｌ培地当り、２０ｍｌのクロロホルム又は酢
酸エチルを添加して抽出した。その抽出物はＴＬＣで分
析した。ＴＬＣ分析は、シリカゲルプレート（螢光指示
薬Ｆ ２％４を含むシリカゲル６０）をクロロホルム＋
１％酢酸で展開し、ナプロキセンとナプロキセンエチル
エステルの分離を行った。Ｒｆ値は、ナプロキセンのエ
チルエステルが０．７でナプロゼンが０．２であった。
パルスＮａｐｌＯＭ、バチルスＳｐＩ［［−４、バチル
ス・リチェニホルミス（ＡＴＣＣＩ １９４５）及びシ
ェードモナスＫｏｒｌ−６を用いたＲ３−ナプロゼンエ
チルエステルのＳ−ナプロキセンへの転換バチルスＴｈ
ａｉ Ｉ −８、バチルスＩｎ１Ｖ−８、パルスＮａｐ
ｌＯＭ、バチルスＳｐＩＩＩ−ａ、バチルス・リチェニ
ホルミス（ＡＴＣＣＩ １９４５）及びシュードモナス
Ｋｏｒｌ−６を５００１１１１パフフルフラスコ中の２
５ｙａｌの１０％スキムミルクで各々インキュベートし
、ロータリーシェーカー上で３０℃、４８時間インキュ
ベートした。この増殖後、１００ｍｇのナプロキセンエ
チルエステルを５００ｎ＋７！の大豆油にとかし、１１
０℃、１時間の滅菌の後、各培養液に加えた。微生物に
応じて、２〜５回分の培養物を使用した。この培養物を
、ロータリーシェカー上、３０℃でさらに２４時間イン
キュベートした。その後、その培養物をオルトリン酸で
ｐＨ２〜３に酸性化し、少量の硫酸アンモニウムを添加
し、２５■ｌ培地当り、２０ｍｌのクロロホルム又は酢
酸エチルを添加して抽出した。その抽出物はＴＬＣで分
析した。ＴＬＣ分析は、シリカゲルプレート（螢光指示
薬Ｆ ２％４を含むシリカゲル６０）をクロロホルム＋
１％酢酸で展開し、ナプロキセンとナプロキセンエチル
エステルの分離を行った。Ｒｆ値は、ナプロキセンのエ
チルエステルが０．７でナプロゼンが０．２であった。
有機層はその後エバポレートし、ナプロキセンはシリカ
ゲルカラムをエーテルで溶出する方法で、残香油から精
製した。得られた結果をＴａｂｌｅ Ｉに示す。
ゲルカラムをエーテルで溶出する方法で、残香油から精
製した。得られた結果をＴａｂｌｅ Ｉに示す。
旋光性が、室温で、１又は１０ｃｍ光路長セル（体積０
．５〜５Ｉｌｌ）を用い、パーキン−エルマー１４１ポ
ーラリメータ−（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １４１ｐ
ｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ）を用いて測定された。旋光度は
５８９ｎｍで記録した（ナトリウムＤ−線）、旋光性は
生成物を５１１１！メタノールに溶解（最高５０ａ＋ｇ
）して測定した。市販のＳ−ナプロキセン（セシファー
マ（Ｓｅｃｉｆａｒ＋ｗａ））は＋６０″の１αｌ、ｒ
ｔ値をもっている。
．５〜５Ｉｌｌ）を用い、パーキン−エルマー１４１ポ
ーラリメータ−（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ １４１ｐ
ｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ）を用いて測定された。旋光度は
５８９ｎｍで記録した（ナトリウムＤ−線）、旋光性は
生成物を５１１１！メタノールに溶解（最高５０ａ＋ｇ
）して測定した。市販のＳ−ナプロキセン（セシファー
マ（Ｓｅｃｉｆａｒ＋ｗａ））は＋６０″の１αｌ、ｒ
ｔ値をもっている。
実施例２
微生物による加水分解により生じたＲ及びＳ型ナプロキ
センの立体異性体の分布 実施例１に述べたように、すべてのテストは、１００ｒ
ｔｒ１バツフル・フラスコ中２５ｍｌ！の培地をつかっ
て行った。すべての培地は、ＢＨＩ培地中２４時間前培
養した培養物をイノキュレートされた。
センの立体異性体の分布 実施例１に述べたように、すべてのテストは、１００ｒ
ｔｒ１バツフル・フラスコ中２５ｍｌ！の培地をつかっ
て行った。すべての培地は、ＢＨＩ培地中２４時間前培
養した培養物をイノキュレートされた。
検定は、およそ２０ｍｇのナプロキセンエチルエステル
のラセミ体を大豆油に溶かしたものを使って、１から２
４時間かけて行った。抽出物はＩＩＰＬｃで分析した。
のラセミ体を大豆油に溶かしたものを使って、１から２
４時間かけて行った。抽出物はＩＩＰＬｃで分析した。
そのエステルと酸はシリカカラム（ＣＰ −５ｐｅｒ−
Ｓｉ、クロムバク（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ））で分析した
。移動相：イソオクタン／エチルアセテート／ギ酸（８
７５ｒａｌ／ １２５＋＋ｊ！／３．５＋＋＋１） 。
Ｓｉ、クロムバク（Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ））で分析した
。移動相：イソオクタン／エチルアセテート／ギ酸（８
７５ｒａｌ／ １２５＋＋ｊ！／３．５＋＋＋１） 。
流速： １．７ｍｌ／ｍｉｎ ％溶出時間は、ナプｏ−
ｔ−センエチルエステルが３．８分、ナプロキセンカ９
．０分であった。
ｔ−センエチルエステルが３．８分、ナプロキセンカ９
．０分であった。
その立体異性的純度を測定するためにナプロキセンを誘
４体化した。ナフタレンメチルアミドに誘導したナプロ
キセン試料は、キラルＤＮＢＰＧカラムで、イソオクタ
ン／クロロホルム／メタノール（９００ｒａｌ／１０ｒ
ａｌ／３０ｖａｌ）のを容出液で分離した。流速は２ｊ
！／ｗｉｎｓ誘導体化したＳ−ナプロキセン及びＲ−ナ
プロキセンの溶出時間は、それぞれ２８．１分及び３０
．７分であった。
４体化した。ナフタレンメチルアミドに誘導したナプロ
キセン試料は、キラルＤＮＢＰＧカラムで、イソオクタ
ン／クロロホルム／メタノール（９００ｒａｌ／１０ｒ
ａｌ／３０ｖａｌ）のを容出液で分離した。流速は２ｊ
！／ｗｉｎｓ誘導体化したＳ−ナプロキセン及びＲ−ナ
プロキセンの溶出時間は、それぞれ２８．１分及び３０
．７分であった。
誘導操作二抽出物２ｃａｌを窒素気流中で乾燥させた。
その乾燥試料を２００μｉのベンゼンと１０μｌのチオ
ニルクロライドと６０℃で１０分間反応させた。反応混
合物を窒素気流中で乾燥させた。乾燥したジクロロメタ
ン中に溶かした５％ナフタレンメチルアミン２００μ！
を加え、反応を室温で１時間行った０反応混合物を再び
窒素で乾燥し、それから２ｔｓｌのイソオクタン／クロ
ロホルム（２：１、ｖ ／ ｖ及び２＋＋＋ｌＩＮ塩酸
）で抽出した。有機層を１（ＰＬＣで分析した。結果を
表２に示す。
ニルクロライドと６０℃で１０分間反応させた。反応混
合物を窒素気流中で乾燥させた。乾燥したジクロロメタ
ン中に溶かした５％ナフタレンメチルアミン２００μ！
を加え、反応を室温で１時間行った０反応混合物を再び
窒素で乾燥し、それから２ｔｓｌのイソオクタン／クロ
ロホルム（２：１、ｖ ／ ｖ及び２＋＋＋ｌＩＮ塩酸
）で抽出した。有機層を１（ＰＬＣで分析した。結果を
表２に示す。
実施例３
種々の微生物を用いたＲ３−ナプロキセンのメチルエス
テルのＳ−ナプロキセンへの転換実施例１及び２で述べ
たように、すべてのテストは１００ｔｓｌのバフフルフ
ラスコ中、２５ｍｌ１の培地をつかって行った。しかし
、ラセミ体のナプロキセン・エチルエステルの代りに、
ラセミ体のナプロキセンメチルエステルを培養液に添加
した。
テルのＳ−ナプロキセンへの転換実施例１及び２で述べ
たように、すべてのテストは１００ｔｓｌのバフフルフ
ラスコ中、２５ｍｌ１の培地をつかって行った。しかし
、ラセミ体のナプロキセン・エチルエステルの代りに、
ラセミ体のナプロキセンメチルエステルを培養液に添加
した。
その培地は、ＢＨＩ培地中で２４時間前培養した培養液
がイノキュレートされた。結果をＴａｂｌｅ ３に示す
。
がイノキュレートされた。結果をＴａｂｌｅ ３に示す
。
実施例４
バチルスＴｈａｉ Ｉ −８、バチルスＩｎＩＶ−８及
びバチルス・リチュニホルミス（ＡＴＣＣＩ １９４５
）を用いた、Ｓ−ナプロキセン・エチルエステルのＳ−
ナプロキセンへの転換。
びバチルス・リチュニホルミス（ＡＴＣＣＩ １９４５
）を用いた、Ｓ−ナプロキセン・エチルエステルのＳ−
ナプロキセンへの転換。
実施例１で述べたようにすべてのテストは１００ｍ１バ
ツフルフラスコ中２５１１Ｉｌの培地をつかって行った
。すべての培地は、ＢＴ（Ｉ培地で２４時間前培養した
培養液がイノキュレートされた。加水分解したＳ−ナプ
ロキセンエチルエステルの量はＴａｂｌｅ ４に示した
。
ツフルフラスコ中２５１１Ｉｌの培地をつかって行った
。すべての培地は、ＢＴ（Ｉ培地で２４時間前培養した
培養液がイノキュレートされた。加水分解したＳ−ナプ
ロキセンエチルエステルの量はＴａｂｌｅ ４に示した
。
Ｔａｂｌｅ ４
栄養添加スキムミルク培地（ＰＳＩ［Ｉ及びラクテート
添加）中２４時間加水分解をうけたＳ−ナプロキセンエ
チルエステルの量 ＊エステルのおよそ３０ｍｇを２５ｒｓｌ培養液に加え
た。
添加）中２４時間加水分解をうけたＳ−ナプロキセンエ
チルエステルの量 ＊エステルのおよそ３０ｍｇを２５ｒｓｌ培養液に加え
た。
実施例５
ファーメンタ中で生育したバチルスＴｈａｉ Ｉ −８
によるラセミ体ナプロキセンエチルエステルのＳ−ナプ
ロキセンへの転換。
によるラセミ体ナプロキセンエチルエステルのＳ−ナプ
ロキセンへの転換。
バチルスＴｈａｔ Ｉ −８をＢＨＩ墳地中地９２４時
間前培養、その後、５０ＩＩ１１の培養物を、１０％ス
キムミルク培地又は、ＰＳ■塩及び５ｇ／ｌのラクテー
トを補った１０％スキムミルクを含む１１エフヒウエイ
ラー・ファーメンタ− （Ｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ Ｆｅｒａ＋ｅｎｔｅｒ）にイ
ノキュレートした。
間前培養、その後、５０ＩＩ１１の培養物を、１０％ス
キムミルク培地又は、ＰＳ■塩及び５ｇ／ｌのラクテー
トを補った１０％スキムミルクを含む１１エフヒウエイ
ラー・ファーメンタ− （Ｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ Ｆｅｒａ＋ｅｎｔｅｒ）にイ
ノキュレートした。
次の培養条件が使われた：
容 積 ＝５１培地
温度＝３０℃
攪拌速度：５００ｒｐＩ１１
空気流量：５０１／ｈ
消泡剤：プルロニフクＬ８１の自動添加でコントロール
ｐＨ：制御せず（ｐＨ値は６〜９の間に保たれた）
微生物は７０時間生育させ、その間、いくつかの試料が
取り出され、ナプロキセンのエチルエステルに対する活
性の検定をした。その検定は、２５ａ＋／の試料に、大
豆油に溶かした２０ｍｇのラセミ体ナプロキセンエチル
エステルを添加し、パフフルフラスコ中３０℃、１時間
インキュベートすることにより行った。このインキュベ
ーション後、その試料を抽出、誘導体化そして、ＨＰＬ
Ｃで分析した。
取り出され、ナプロキセンのエチルエステルに対する活
性の検定をした。その検定は、２５ａ＋／の試料に、大
豆油に溶かした２０ｍｇのラセミ体ナプロキセンエチル
エステルを添加し、パフフルフラスコ中３０℃、１時間
インキュベートすることにより行った。このインキュベ
ーション後、その試料を抽出、誘導体化そして、ＨＰＬ
Ｃで分析した。
２４時間後、微生物の乾燥重量と、容量活性は一定に保
たれた。培養液のｐＨ値は、培養の間、スキムミルクが
用いられたときは６．０から７．８に、栄養添加したス
キムミルクを用いたときは６．０から８．４に増加した
。
たれた。培養液のｐＨ値は、培養の間、スキムミルクが
用いられたときは６．０から７．８に、栄養添加したス
キムミルクを用いたときは６．０から８．４に増加した
。
その結果をＴａｂｌｅ ５に示す。
Ｔａｂｌｅ ５
スキムミルク及び栄養添加スキムミルクを用いたときの
、バチルスＴｈａｉ Ｉ −８の培養結果実施例６ ファーメンタ−で生育させたバチルスＩｎｒＶ−８によ
る、ラセミ体ナプロキセン・エチルエステルのＳ−ナプ
ロキセンへの転換 実施例５で述べたのと同じ操作を、バチルスＩｎＩＶ−
８について行った。７０時間のインキュベーションの間
、いくつかの試料を取り、その時間内に、容量活性同様
乾燥重量が実質的に一定になるまで、先に述べた検定を
行った。その間、ｐＨ値値は、スキムミルクの場合６．
４から７．９に、栄養添加スキムミルクの場合、６．２
から８．４に変化した。
、バチルスＴｈａｉ Ｉ −８の培養結果実施例６ ファーメンタ−で生育させたバチルスＩｎｒＶ−８によ
る、ラセミ体ナプロキセン・エチルエステルのＳ−ナプ
ロキセンへの転換 実施例５で述べたのと同じ操作を、バチルスＩｎＩＶ−
８について行った。７０時間のインキュベーションの間
、いくつかの試料を取り、その時間内に、容量活性同様
乾燥重量が実質的に一定になるまで、先に述べた検定を
行った。その間、ｐＨ値値は、スキムミルクの場合６．
４から７．９に、栄養添加スキムミルクの場合、６．２
から８．４に変化した。
結果をＴａｂｌｅ ６にまとめた。
Ｔａｂｌｅ ６
スキムミルク及び栄養添加スキムミルクを用いた、バチ
ルスＩｎｒＶ−８の培養結果 実施例７ 種々の微生物を用いた、Ｒ，Ｓ−イブプロフエンのエチ
ルエステルのＳ−イブプロフェンへの転換 実施例１及び２で述べたように、すべてのテストは、１
００〜５００ｔａｌのハ′ツフルフラスコ中、２５〜１
００ＩＩ１１の培地で行った。その培地は栄養混合培地
（例えばＢＨＩ）で２４時間前培養した培養液をイノキ
ュレートし、４８時間培養した。
ルスＩｎｒＶ−８の培養結果 実施例７ 種々の微生物を用いた、Ｒ，Ｓ−イブプロフエンのエチ
ルエステルのＳ−イブプロフェンへの転換 実施例１及び２で述べたように、すべてのテストは、１
００〜５００ｔａｌのハ′ツフルフラスコ中、２５〜１
００ＩＩ１１の培地で行った。その培地は栄養混合培地
（例えばＢＨＩ）で２４時間前培養した培養液をイノキ
ュレートし、４８時間培養した。
その後、麻地体積に応じて、２０〜８０μｌのラセミ体
イブプロフェンのエチルエステルをその培養液に添加し
、２４時間インキュベートした。
イブプロフェンのエチルエステルをその培養液に添加し
、２４時間インキュベートした。
その培養液を、）１．Ｐｏ、でｐＨ２，５に酸性化し、
少量の硫酸アンモニウムを添加後、ＣＨ２ＣＩ Ｎで抽
出した。抽出物中に存在するイブプロフェンをナフタレ
ン−メチルアミド誘導体に誘導し、その立体異性的純度
を測定した。
少量の硫酸アンモニウムを添加後、ＣＨ２ＣＩ Ｎで抽
出した。抽出物中に存在するイブプロフェンをナフタレ
ン−メチルアミド誘導体に誘導し、その立体異性的純度
を測定した。
３ｔｓｌの抽出物に、２−プロモー１−メチルピリジン
・ヨーダイトのジメチルホルムアミトン（５０ｍｇ／ｒ
ｓｌ）２ ０ ０μｌと、１−ナフタレン−メチルアミ
ンのＣＨｔＣ Ｎ ！溶液（Ｉ ０ ０ｍｇ／ｓ＋４り
２００μｌを加え、２２℃で５分間反応させた。
・ヨーダイトのジメチルホルムアミトン（５０ｍｇ／ｒ
ｓｌ）２ ０ ０μｌと、１−ナフタレン−メチルアミ
ンのＣＨｔＣ Ｎ ！溶液（Ｉ ０ ０ｍｇ／ｓ＋４り
２００μｌを加え、２２℃で５分間反応させた。
この反応溶液を窒素気流中６０℃で乾燥させた。
残渣を３ｍｊ２のイソオクタン／ＣＨｚｌ！ｚ （２
： １、ｖ ／ ｖ ）にとかし、２ｎａｌのＩ Ｎ
Ｈ２ＳＯ４を添加後抽出した。
： １、ｖ ／ ｖ ）にとかし、２ｎａｌのＩ Ｎ
Ｈ２ＳＯ４を添加後抽出した。
有機層をキラルＤＮＢＰＧカラムでイソオクチル／イソ
プロピルアルコール／メタノール（９２／２／ｌｖ／ｖ
）を用いて、また不純物が分析を妨害するときには、イ
ソオクタン／イソプロピルアルコール／メタノール（９
８／１／１、ｖ ／ ｖ ）を用いてＨＰＬＣ分析した
。
プロピルアルコール／メタノール（９２／２／ｌｖ／ｖ
）を用いて、また不純物が分析を妨害するときには、イ
ソオクタン／イソプロピルアルコール／メタノール（９
８／１／１、ｖ ／ ｖ ）を用いてＨＰＬＣ分析した
。
結果をＴａｂｌｅ ７に示す。
表示されている値は、２回の実験の平均値である。＊で
示されている微生物を用いた値は単一の実験の結果であ
る。この場合には、５０μ！のテトラデカンにｌＯμｌ
のイブプロフェンを培養液に添加した。
示されている微生物を用いた値は単一の実験の結果であ
る。この場合には、５０μ！のテトラデカンにｌＯμｌ
のイブプロフェンを培養液に添加した。
実施例８
種々の微生物を用いた、Ｓ−イブプロフェンメチルエス
テルのＳ−イブプロフェンへの転換すべてにテストは、
実施例７と同様に行った。
テルのＳ−イブプロフェンへの転換すべてにテストは、
実施例７と同様に行った。
ラセミ体のイブプロフェンエチルエステルの代りに、ラ
セミ体のイブプロフェンメチルエステルを培養液に加え
た。結果をＴａｂｌｅ ８に示した。
セミ体のイブプロフェンメチルエステルを培養液に加え
た。結果をＴａｂｌｅ ８に示した。
表示されている値は、２回の実験の平均値である。＊で
示した微生物を用いたときは、単一の実験から得られた
値である。この場合には、５０μｌのテトラデカンに？
容かした１０μｌのイフ゛フ゛ロフエンを培養液に添加
した。
示した微生物を用いたときは、単一の実験から得られた
値である。この場合には、５０μｌのテトラデカンに？
容かした１０μｌのイフ゛フ゛ロフエンを培養液に添加
した。
実施例９
枯草菌ＴｈａｉＩ−８（ＣＢＳ ６７９．８５）中に
存在するナプロキセンメチルエステラーゼの特性化 バチルスＴｈａｉ １−８を１０％のスキムミルクを含
むエスヒワイラー・ファーメンタ−（Ｅｓｃｈ−ｗｅｉ
ｌｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）で生育させた（実施例５
参照）２８時間の増殖後、細胞を遠心で集菌した。その
細胞をＱ、 ｌ Ｍ ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）に溶
解し、リゾチーム（０，５■／ｍｌリゾチーム、４■／
ｍ ｌ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ）で室温１８時間処理し、つ
いでＤＮａｓｅ （０，０１ｍｇ／ｍＩＤＮａ５ｅ
％ ３．５ｑ／ｍｌＭｇＣ７’ｚ）で同温度で１時間処
理した。
存在するナプロキセンメチルエステラーゼの特性化 バチルスＴｈａｉ １−８を１０％のスキムミルクを含
むエスヒワイラー・ファーメンタ−（Ｅｓｃｈ−ｗｅｉ
ｌｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）で生育させた（実施例５
参照）２８時間の増殖後、細胞を遠心で集菌した。その
細胞をＱ、 ｌ Ｍ ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）に溶
解し、リゾチーム（０，５■／ｍｌリゾチーム、４■／
ｍ ｌ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ ）で室温１８時間処理し、つ
いでＤＮａｓｅ （０，０１ｍｇ／ｍＩＤＮａ５ｅ
％ ３．５ｑ／ｍｌＭｇＣ７’ｚ）で同温度で１時間処
理した。
遠心後、上清のタンパク画分を７０％硫酸アンモニウム
胞和により沈殿させた。遠心後、そのペレットを０．０
１ Ｍ ＭＯＰＳ （３−（Ｎ−モルホリノ）プロパ
ンスルホン し、保存剤として０．０２％アジ化ナトリウムを含む同
バッファーで１８時間透析した。
胞和により沈殿させた。遠心後、そのペレットを０．０
１ Ｍ ＭＯＰＳ （３−（Ｎ−モルホリノ）プロパ
ンスルホン し、保存剤として０．０２％アジ化ナトリウムを含む同
バッファーで１８時間透析した。
最終溶液を精製用ＨＰＬＣ−ＳＥＣ （サイスーエクス
クルージョン・クロマトグラフィー）カラム（ＴＳＫ２
０００ＳＷ，６００Ｘ２１．５ｍ−）で、０、１Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ ５． ５ ）を５ｍ６／ｗｉｎの流
速で溶出することにより分析した。１０分後カラ、２ｍ
ｌづつのフラクションを集め、リパーゼ及びＳ−ナプロ
キセンメチルエステラーゼ活性の検定を行った。
クルージョン・クロマトグラフィー）カラム（ＴＳＫ２
０００ＳＷ，６００Ｘ２１．５ｍ−）で、０、１Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ ５． ５ ）を５ｍ６／ｗｉｎの流
速で溶出することにより分析した。１０分後カラ、２ｍ
ｌづつのフラクションを集め、リパーゼ及びＳ−ナプロ
キセンメチルエステラーゼ活性の検定を行った。
リパーゼ活性は、基質として、ＰＨ８．０の０，ＩＭＭ
Ｏ Ｐ Ｓ中で２０■／ ｍ ｌのＳ−ナプロキセン
メチルエステルを用いて検定した。１８時間のインキュ
ベーションの後、生成したＳ−ナプロキセンの量を実施
例２で述べたようにＨ Ｐ Ｌ Ｃにより測定した。
Ｏ Ｐ Ｓ中で２０■／ ｍ ｌのＳ−ナプロキセン
メチルエステルを用いて検定した。１８時間のインキュ
ベーションの後、生成したＳ−ナプロキセンの量を実施
例２で述べたようにＨ Ｐ Ｌ Ｃにより測定した。
図１は、バチルスＴｈａｉ Ｉ − ８細胞破壊物のＨ
ＰＬＣ−ＳＥＣ？８出パターンを示している。Ｓ−ナプ
ロキセン・メチル・エステラーゼ（フラクション３７）
は、この微生物中に存在するリパーゼ活性（フラクショ
ン３１）と明らかに分離している。
ＰＬＣ−ＳＥＣ？８出パターンを示している。Ｓ−ナプ
ロキセン・メチル・エステラーゼ（フラクション３７）
は、この微生物中に存在するリパーゼ活性（フラクショ
ン３１）と明らかに分離している。
Ｔａｂｌｅ ９では、細胞破壊物、ＨＰＬＣ−ＳＥＣの
フラクション３１及びフラクション３８の立体異性選択
性の比較がしである。Ｒ及びＳ−ナプロキセンメチルエ
ステルのエステラーゼ活性は前述の方法でテストした。
フラクション３１及びフラクション３８の立体異性選択
性の比較がしである。Ｒ及びＳ−ナプロキセンメチルエ
ステルのエステラーゼ活性は前述の方法でテストした。
Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性を含むタンパク画分
の見かけの分子量は、標準物質として、２７０００まで
の既知の分子量のタンパク質混合物を用いて見積もった
。
の見かけの分子量は、標準物質として、２７０００まで
の既知の分子量のタンパク質混合物を用いて見積もった
。
検定条件下での、Ｓ−ナプロキセンメチルエステルの加
水分解反応のｐＨ依存性が図２に示しである。用いたバ
ッファーは０． １ ＭリンＭ ＣｐＨｉＵ域５、５〜
７．５）、０．１Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ領域７．５〜９
．０）、０．１Ｍグリシン（ｐＨ領域９．０〜１ ０．
０ ）である。
水分解反応のｐＨ依存性が図２に示しである。用いたバ
ッファーは０． １ ＭリンＭ ＣｐＨｉＵ域５、５〜
７．５）、０．１Ｍ）リス−塩酸（ｐＨ領域７．５〜９
．０）、０．１Ｍグリシン（ｐＨ領域９．０〜１ ０．
０ ）である。
エステラーゼ反応の温度依存性は図３に示しである。４
５℃以上の温度では、エステラーゼ反応はほとんどみら
れなかった。３７℃での加水分解は大ざっばにいって２
５℃での反応の２倍である。
５℃以上の温度では、エステラーゼ反応はほとんどみら
れなかった。３７℃での加水分解は大ざっばにいって２
５℃での反応の２倍である。
実施例１０
Ｒ−Ｓナプロキセンエステルの立体選択的転換を任う遺
伝子の分子クローニング 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） Ｔ
ｈａｉ Ｉ −８（ＣＢＳ６７９．８５）の染色体ＤＮ
Ａフラグメントを含むプラスミド、ｐＮＡＰＴ−２を以
下のように調製した。
伝子の分子クローニング 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ） Ｔ
ｈａｉ Ｉ −８（ＣＢＳ６７９．８５）の染色体ＤＮ
Ａフラグメントを含むプラスミド、ｐＮＡＰＴ−２を以
下のように調製した。
Ｔ、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等が１９８２年コ
ールド・スプリングハーバ−、ラボラトリ−から出版し
た分子クローニングのハンドブックに述べられているよ
うに、一般的なりローニング技術を用いた。全てのＤ
Ｎ Ａ修飾酵素は市販されているもので、製造業者の指
示に従って用いた。ＤＮＡの分離及び精製のための物質
及び器具は、業者の指示に従って用いた。
ールド・スプリングハーバ−、ラボラトリ−から出版し
た分子クローニングのハンドブックに述べられているよ
うに、一般的なりローニング技術を用いた。全てのＤ
Ｎ Ａ修飾酵素は市販されているもので、製造業者の指
示に従って用いた。ＤＮＡの分離及び精製のための物質
及び器具は、業者の指示に従って用いた。
ポジティブ・セレクション・ベクターｐＵＮ１２１にル
ソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）等、１９８３年、核酸研究（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） １
１巻、８０１９頁）を用いた。このプラスミドは、アン
ピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン両性遺伝子及び
Ｃ１−リプレッサー遺伝子を持っている。
ソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）等、１９８３年、核酸研究（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ） １
１巻、８０１９頁）を用いた。このプラスミドは、アン
ピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン両性遺伝子及び
Ｃ１−リプレッサー遺伝子を持っている。
このテトラサイクリン遺伝子の転写は、Ｃ１−リプレッ
サー遺伝子の遺伝子産物によって阻害される。０１−リ
プレッサー遺伝子のＢｃｌ １部位への外来ＤＮＡの
挿入は、テトラサイクリン遺伝子の活性化をうながす。
サー遺伝子の遺伝子産物によって阻害される。０１−リ
プレッサー遺伝子のＢｃｌ １部位への外来ＤＮＡの
挿入は、テトラサイクリン遺伝子の活性化をうながす。
これは、７ンピシリン／テトラサイクリン寒天プレート
上での組換えのポジティブ・セレクションを可能にする
。
上での組換えのポジティブ・セレクションを可能にする
。
５ａｎ３Ａで部分分解した枯草菌Ｔｈａｉ １−８ Ｄ
ＮＡを、Ｂｃｌ １で消化したｐＵＮ １２１ ＤＮ
Ａと混合した。ポリヌクレオチドリガーゼの使用による
再環状化の後、そのＤＮＡ混合物を、前述の（Ｔ。
ＮＡを、Ｂｃｌ １で消化したｐＵＮ １２１ ＤＮ
Ａと混合した。ポリヌクレオチドリガーゼの使用による
再環状化の後、そのＤＮＡ混合物を、前述の（Ｔ。
マニ７チス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、１９８２年）Ｃａ
（Ｊ２のトランスフォーメション操作によって大腸菌Ｄ
ＨＩ （ＡＴＣＣ３３８４９）に導入した。
（Ｊ２のトランスフォーメション操作によって大腸菌Ｄ
ＨＩ （ＡＴＣＣ３３８４９）に導入した。
アンピシリン及びテトラサイクリンに耐性な１０００個
の大腸菌コロニーを得た。すべてのトランスフォーマン
トを保存し、Ｊ、Ｐ、ジャーゲン（Ｇｅｒｇｅｎ）等の
方法に従って、レビリカプレートを作った。複製コロニ
ーは、以前に述べられた手順に基づく、軟寒天重層技術
によって、エステラーゼ活性の検出が行なわれた（Ｔ、
Ｂ、ハイガード（Ｈｉｇｅｒｄ）とＪ、スピジゼン（Ｓ
ｐｉｚｉｚｅｎ）、１９７３年、ジャーナル、オブ、バ
クテリオロジ−（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）
１１４巻、１１８４真）基本的には、０．５％の低融点
アガロース、０．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，５）
、０．５■／ｌのベーターナフチル・アセテート及び０
．５■／ ｍ ｌのファースト・ブルーをトランスフォ
ーマ−の上に散布する。数分後、エステラーゼ又はリパ
ーゼ活性をもつコロニーは紫色を呈す。そのコロニーを
２×ＴＹ培地（Ｉ６ｇ／ｊ！バクトドリプトン、１０ｇ
／ｌイースト・エクストラクト、５ｇ／ｌ塩化ナトリウ
ム）中で１晩増殖させ、つづいてＳ−ナプロキシエステ
ルをＳ−ナプロキセンに転換する（実施例１の方法）能
力を検定する。１つの大腸菌トランスフォーマントは、
Ｓ−ナプロキセンエステルを転換することができた。ｐ
ＮＡＰＴ−２と呼ばれる、このトランスフォーマントか
ら単離したプラスミドを図４に示した。その大きさは９
．４ｋｂである。
の大腸菌コロニーを得た。すべてのトランスフォーマン
トを保存し、Ｊ、Ｐ、ジャーゲン（Ｇｅｒｇｅｎ）等の
方法に従って、レビリカプレートを作った。複製コロニ
ーは、以前に述べられた手順に基づく、軟寒天重層技術
によって、エステラーゼ活性の検出が行なわれた（Ｔ、
Ｂ、ハイガード（Ｈｉｇｅｒｄ）とＪ、スピジゼン（Ｓ
ｐｉｚｉｚｅｎ）、１９７３年、ジャーナル、オブ、バ
クテリオロジ−（Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 ）
１１４巻、１１８４真）基本的には、０．５％の低融点
アガロース、０．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７，５）
、０．５■／ｌのベーターナフチル・アセテート及び０
．５■／ ｍ ｌのファースト・ブルーをトランスフォ
ーマ−の上に散布する。数分後、エステラーゼ又はリパ
ーゼ活性をもつコロニーは紫色を呈す。そのコロニーを
２×ＴＹ培地（Ｉ６ｇ／ｊ！バクトドリプトン、１０ｇ
／ｌイースト・エクストラクト、５ｇ／ｌ塩化ナトリウ
ム）中で１晩増殖させ、つづいてＳ−ナプロキシエステ
ルをＳ−ナプロキセンに転換する（実施例１の方法）能
力を検定する。１つの大腸菌トランスフォーマントは、
Ｓ−ナプロキセンエステルを転換することができた。ｐ
ＮＡＰＴ−２と呼ばれる、このトランスフォーマントか
ら単離したプラスミドを図４に示した。その大きさは９
．４ｋｂである。
２ＸＴＹ培地で１晩増殖した大腸菌／ｐＮＡＰＴ−２及
び大腸菌／ｐＮＡＰＴ−７の活性をＴａｂｌｅ １０に
示した。プラスミドｐＵＮ１２１のみをもつ大腸菌は、
Ｓ又はＲ−ナプロキセンエステルを加水分解することが
できない。これは、Ｓ−ナプロキセンの加水分解に必要
な全ての情報は、５ｋｂの枯草菌Ｔｈａｔ １−８ Ｄ
ＮＡ挿入物中に存在することを示している。
び大腸菌／ｐＮＡＰＴ−７の活性をＴａｂｌｅ １０に
示した。プラスミドｐＵＮ１２１のみをもつ大腸菌は、
Ｓ又はＲ−ナプロキセンエステルを加水分解することが
できない。これは、Ｓ−ナプロキセンの加水分解に必要
な全ての情報は、５ｋｂの枯草菌Ｔｈａｔ １−８ Ｄ
ＮＡ挿入物中に存在することを示している。
ｐＮＡＰＴ−２を持つ大腸菌ＤＨＩの試料はＣＢＳ受理
番号６７１．８６号に保管されている。
番号６７１．８６号に保管されている。
Ｔａｂｌｅ １０
実施例１１
枯草菌中に多数の遺伝子コピーを導入することによるエ
ステラーゼ活性の改良 エステラーゼをコードするプラスミドｐＮＡＰＴ −２
は、５ｋｂの枯草菌Ｔｈａｉ Ｉ −８（ＣＢ Ｓ
６７９．８５）のＤＮＡ挿入物を持っている。これは、
約３０ｋｂのタンパク賞をコードする遺伝子に対して予
期されるに十分率さい大きさであるので、その挿入物は
、エステラーゼ活性を失うことなしに短かくなっている
ということが考えられる。この可能性を試すために、ｐ
ＮＡＰＴ−２のＨｉｎｄ ｍ制限酵素断片をｐ Ｐ Ｎ
ｅｏｌｏｒｉに連結した。これは以下のように行った＊
ｐ Ｐ Ｎｅｏｌｏｒｉは、ｐＵＢｌｌｏ（Ｔ、 Ｃ
，グリクザン（Ｇｒｙｃｚａｎ ）等、１９７８年、ジ
ャーナル・オブ・バタテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、）１３４巻、３１８頁）の２．５ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ−３ｎａＢ１制限断片に、ｐＵＣ１９（Ｃ，ヤニッ
シューペロン（Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ −Ｐｅｒｒｏｎ）
等、ジーン（Ｊｅｎｅ）、３３巻、１０３頁、１９８５
年）の２．７ ｋｂ ＥｃｏＲＩ−３ｍａｌ制限断片を
連結することにより構築した。
ステラーゼ活性の改良 エステラーゼをコードするプラスミドｐＮＡＰＴ −２
は、５ｋｂの枯草菌Ｔｈａｉ Ｉ −８（ＣＢ Ｓ
６７９．８５）のＤＮＡ挿入物を持っている。これは、
約３０ｋｂのタンパク賞をコードする遺伝子に対して予
期されるに十分率さい大きさであるので、その挿入物は
、エステラーゼ活性を失うことなしに短かくなっている
ということが考えられる。この可能性を試すために、ｐ
ＮＡＰＴ−２のＨｉｎｄ ｍ制限酵素断片をｐ Ｐ Ｎ
ｅｏｌｏｒｉに連結した。これは以下のように行った＊
ｐ Ｐ Ｎｅｏｌｏｒｉは、ｐＵＢｌｌｏ（Ｔ、 Ｃ
，グリクザン（Ｇｒｙｃｚａｎ ）等、１９７８年、ジ
ャーナル・オブ・バタテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ、）１３４巻、３１８頁）の２．５ｋｂのＥｃｏ
ＲＩ−３ｎａＢ１制限断片に、ｐＵＣ１９（Ｃ，ヤニッ
シューペロン（Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ −Ｐｅｒｒｏｎ）
等、ジーン（Ｊｅｎｅ）、３３巻、１０３頁、１９８５
年）の２．７ ｋｂ ＥｃｏＲＩ−３ｍａｌ制限断片を
連結することにより構築した。
生じたシャトル・プラスミドｐ Ｐ Ｎｅｏｌｏｒｉ
（５，２ｋｂ ）はｐＵｃ１９オリジンとｐＵＢ１１０
オリジンの存在のために、大腸菌中及びバチルス種牛で
複製する能力をもっている。さらにｐ Ｐ Ｎｅｏｌｏ
ｒｉは、アンピシリン耐性遺伝子と、ネオマイシン耐性
遺伝子を持っている（Ｃ，ヤニフシューペロン（Ｃ，Ｙ
ａｎｉｓｃｈ −Ｐｅｒｒｏｎ ）等、１９８５年、門
、マツムラ（Ｍａｔｓｕ＋＊ｕｒａ ）等、ジャーナル
・オプ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
） １６０巻、４１３頁、１９８４年）。
（５，２ｋｂ ）はｐＵｃ１９オリジンとｐＵＢ１１０
オリジンの存在のために、大腸菌中及びバチルス種牛で
複製する能力をもっている。さらにｐ Ｐ Ｎｅｏｌｏ
ｒｉは、アンピシリン耐性遺伝子と、ネオマイシン耐性
遺伝子を持っている（Ｃ，ヤニフシューペロン（Ｃ，Ｙ
ａｎｉｓｃｈ −Ｐｅｒｒｏｎ ）等、１９８５年、門
、マツムラ（Ｍａｔｓｕ＋＊ｕｒａ ）等、ジャーナル
・オプ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、
） １６０巻、４１３頁、１９８４年）。
サブクローニングのために、ＨｉｎｄＩ［［で消化した
ｐＮＡＰＴ−２を旧ｎｄｌＩ［で消化したｐ Ｐ Ｎｅ
ｏｌｏｒｉと混合し、連結した。その混合物を先に述べ
たように（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ ）等、１９
８２年）大腸菌ＪＭＩ Ｏ１ｈｓｄｓにトランスフオー
ムした。
ｐＮＡＰＴ−２を旧ｎｄｌＩ［で消化したｐ Ｐ Ｎｅ
ｏｌｏｒｉと混合し、連結した。その混合物を先に述べ
たように（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ ）等、１９
８２年）大腸菌ＪＭＩ Ｏ１ｈｓｄｓにトランスフオー
ムした。
大ｌＬｉｆｆ１ Ｊ Ｍ ｌ ０１ ｈｓｄｓは、ファ
ーバゲン・コレクション（Ｐｈａｂａｇｅｎ ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ ）から入手した（オランダ、ウトレクト
（Ｕｔｒｅｃｈｔ ）受理番号ＰＣ２４９３）。ベータ
・ナフチル・アセテートを加水分解することのできるコ
ロニーを実施例１０で述べたように選択した。２ケの陽
性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、いくつか
の制限酵素認識部位を決定することにより詳細に特徴づ
けた。これらのプラスミド、ｐＮＡＰＴ−７及びｐＮＡ
ＰＴ−８の遺伝子地図を図５と図６に示した。Ｓ−ナプ
ロキセンメチルエステルに対する、大腸菌／ ｐ Ｎ
Ａ Ｐ Ｔ −７及び大腸菌／ＰＮＡＰＴ−８の活性を
測定した（ Ｔａｂｌｅ １１） 。
ーバゲン・コレクション（Ｐｈａｂａｇｅｎ ｃｏｌｌ
ｅｃｔｉｏｎ ）から入手した（オランダ、ウトレクト
（Ｕｔｒｅｃｈｔ ）受理番号ＰＣ２４９３）。ベータ
・ナフチル・アセテートを加水分解することのできるコ
ロニーを実施例１０で述べたように選択した。２ケの陽
性コロニーから、プラスミドＤＮＡを単離し、いくつか
の制限酵素認識部位を決定することにより詳細に特徴づ
けた。これらのプラスミド、ｐＮＡＰＴ−７及びｐＮＡ
ＰＴ−８の遺伝子地図を図５と図６に示した。Ｓ−ナプ
ロキセンメチルエステルに対する、大腸菌／ ｐ Ｎ
Ａ Ｐ Ｔ −７及び大腸菌／ＰＮＡＰＴ−８の活性を
測定した（ Ｔａｂｌｅ １１） 。
両方のプラスミドは、挿入物として、方向は逆であるが
、２．２ｋｂのｐＮＡＰＴ−２の旧ｎｄｍ −Ｈｌｎｄ
ｌ［Ｉフラグメントを有していることがわかろう。
、２．２ｋｂのｐＮＡＰＴ−２の旧ｎｄｍ −Ｈｌｎｄ
ｌ［Ｉフラグメントを有していることがわかろう。
また、エステラーゼの遺伝子は、それらのＴｈａｉ ｌ
−８ＤＮＡの２．０ｋｂＳｆｆ域に存在しなければなら
ないであろう、大腸菌ＪＭ １０１ ｈｓｄｓからの抽
出後、そのプラスミドｐＮＡＰＴ−７及びｐＮＡＰＴ
−８を、枯草菌１−８５及び枯草菌１Ａ−４０のプロト
プラストにトランスフオームした（Ｃ，チャング（Ｃｈ
ａｎｇ ）とＳ、Ｎ、コーエン（Ｃｏｈｅｎ ） 、モ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティクス（Ｊ
、 Ｇｅｎｅ、 Ｇｅｎｅｔ、 ） 、１６８巻、１１
１頁、１９７９年）、枯草菌１−８５ （ユキ（Ｙｕｋ
ｉ ）、Ｓ、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・ジエネ
ティクス（Ｊｐｎ、 Ｊ、 Ｇｅｎｅｔ、 ） ４２巻
、２５１頁、１９６７年）と、枯草菌１Ａ４０ （バチ
ルス・ストック・センターＢ、Ｇ、Ｓ、Ｃ，Ｉ Ａ ４
０ ）はすでに述べられてきている。
−８ＤＮＡの２．０ｋｂＳｆｆ域に存在しなければなら
ないであろう、大腸菌ＪＭ １０１ ｈｓｄｓからの抽
出後、そのプラスミドｐＮＡＰＴ−７及びｐＮＡＰＴ
−８を、枯草菌１−８５及び枯草菌１Ａ−４０のプロト
プラストにトランスフオームした（Ｃ，チャング（Ｃｈ
ａｎｇ ）とＳ、Ｎ、コーエン（Ｃｏｈｅｎ ） 、モ
レキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティクス（Ｊ
、 Ｇｅｎｅ、 Ｇｅｎｅｔ、 ） 、１６８巻、１１
１頁、１９７９年）、枯草菌１−８５ （ユキ（Ｙｕｋ
ｉ ）、Ｓ、ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・ジエネ
ティクス（Ｊｐｎ、 Ｊ、 Ｇｅｎｅｔ、 ） ４２巻
、２５１頁、１９６７年）と、枯草菌１Ａ４０ （バチ
ルス・ストック・センターＢ、Ｇ、Ｓ、Ｃ，Ｉ Ａ ４
０ ）はすでに述べられてきている。
ネオマイシン耐性コロニーを、先に述べた方法に従って
（実施例１２参照）２ＸＴＹ培地で増殖後、Ｓ−ナプロ
キセンメチルエステルを加水分解する能力をテストした
。 Ｔａｂｌｅ １１にその活性を示した。多数の遺伝
子コピーの導入によって、約３００倍の改良が成遂げら
れた。それ故、この微生物及びこれらが誘導された物質
の、Ｓ−ナプロキセンエステルを加水分解するための工
程に用いるための適性が大巾に改良されたことになる。
（実施例１２参照）２ＸＴＹ培地で増殖後、Ｓ−ナプロ
キセンメチルエステルを加水分解する能力をテストした
。 Ｔａｂｌｅ １１にその活性を示した。多数の遺伝
子コピーの導入によって、約３００倍の改良が成遂げら
れた。それ故、この微生物及びこれらが誘導された物質
の、Ｓ−ナプロキセンエステルを加水分解するための工
程に用いるための適性が大巾に改良されたことになる。
遺伝子クローニングがある酵素の発現レベルを改善する
ことは知られてはいるが、エステラーゼの場合の、この
促進度には、驚くべきものがある。
ことは知られてはいるが、エステラーゼの場合の、この
促進度には、驚くべきものがある。
酵素に対する遺伝子のクローニングの際には、不適正な
折りたたみ、タンパク質の変性及び細胞内沈殿といった
問題に、非常にしばしば出くわす。
折りたたみ、タンパク質の変性及び細胞内沈殿といった
問題に、非常にしばしば出くわす。
（ハリス（Ｈａｒｒｉｓ ）、Ｔ、Ｊ、Ｒ，１９８３年
、遺伝子工学４アカデミツクプレス）予想に反して、エ
ステラーゼ遺伝子のクローニングの場合、これらの問題
は１つも生じなかったようである。
、遺伝子工学４アカデミツクプレス）予想に反して、エ
ステラーゼ遺伝子のクローニングの場合、これらの問題
は１つも生じなかったようである。
実施例１２
大腸菌ＪＭＩ Ｏ１ｈｓｄｓ ／ｐＮＡＰＴ−７のナプ
ロキセンメチルエステラーゼの特性化 実施例１１の大腸菌Ｊ Ｍ １０１ ｈｓｄｓ ／ ｐ
ＮＡＰＴ−７の１リツトル培養培地を用いた。その培地
を遠心し、ペレットをｐＨ８，０の０．１ Ｍ ）リス
ー塩酸バフファに懸濁、１％ｖ／ｖオクタツールの存在
下、１■／Ｉｌｌリゾチーム、４■／ｍ１ＥＤＴＡと、
３０℃で１時間、インキュベートした。そのＤＮＡを１
５ ｍＭ Ｍｇ”の存在下０．０２■／ＩＩｌのＤＮａ
ｓｅで加水分解した（３０分、２２℃）、。
ロキセンメチルエステラーゼの特性化 実施例１１の大腸菌Ｊ Ｍ １０１ ｈｓｄｓ ／ ｐ
ＮＡＰＴ−７の１リツトル培養培地を用いた。その培地
を遠心し、ペレットをｐＨ８，０の０．１ Ｍ ）リス
ー塩酸バフファに懸濁、１％ｖ／ｖオクタツールの存在
下、１■／Ｉｌｌリゾチーム、４■／ｍ１ＥＤＴＡと、
３０℃で１時間、インキュベートした。そのＤＮＡを１
５ ｍＭ Ｍｇ”の存在下０．０２■／ＩＩｌのＤＮａ
ｓｅで加水分解した（３０分、２２℃）、。
遠心後、上清のタンパク質両分を６０％硫酸アンモニウ
ム飽和で沈殿させた。遠心後、そのペレットをｐＨ７，
５（７）１０ ｍＭ ＭＯＰＳに溶解し、超遠心により
１０倍に濃縮した（アミコン（Ａｍ１ｃｏｎ ）ＹＭＩ
Ｏ）。１ミリリツトル中２０■のＳ−ナプロキセンメチ
ルエステル、２％トウィーン、１■／■Ｉｌ ＢＳＡ（
仔牛血清アルブミン）の存在下、２５０℃、ｐＨ７，５
の０．ＩＭＭＯＰＳ中で検定した大腸菌ｐＮＡＰＴ−７
のＳ−ナプロキセンエステルに関する比活性はタンパク
質１ミリグラム当り、１．６ユニットであることがわか
った。明細書をとおして、ｌユニット（ｕ）とは、特定
条件下で、分当りｌＸｌ０−’モルのＳ−ナプロキセン
メチルエステルを加水分解する酵素量である。トウィー
ンは、強い疎水性エステルとＢＳＡの溶解度を変え、特
異的吸着による酵素の不活性化を紡ぐ目的で加えた。タ
ンパク質濃度は、ＢＳＡを標準物質としたブラッドフォ
ード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ）の方法に従がい決定した。
ム飽和で沈殿させた。遠心後、そのペレットをｐＨ７，
５（７）１０ ｍＭ ＭＯＰＳに溶解し、超遠心により
１０倍に濃縮した（アミコン（Ａｍ１ｃｏｎ ）ＹＭＩ
Ｏ）。１ミリリツトル中２０■のＳ−ナプロキセンメチ
ルエステル、２％トウィーン、１■／■Ｉｌ ＢＳＡ（
仔牛血清アルブミン）の存在下、２５０℃、ｐＨ７，５
の０．ＩＭＭＯＰＳ中で検定した大腸菌ｐＮＡＰＴ−７
のＳ−ナプロキセンエステルに関する比活性はタンパク
質１ミリグラム当り、１．６ユニットであることがわか
った。明細書をとおして、ｌユニット（ｕ）とは、特定
条件下で、分当りｌＸｌ０−’モルのＳ−ナプロキセン
メチルエステルを加水分解する酵素量である。トウィー
ンは、強い疎水性エステルとＢＳＡの溶解度を変え、特
異的吸着による酵素の不活性化を紡ぐ目的で加えた。タ
ンパク質濃度は、ＢＳＡを標準物質としたブラッドフォ
ード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ）の方法に従がい決定した。
大腸菌ｐＮＡＰＴ保持体は超遠心後、実施例９で述べた
、ＨＰＬＣ−３ＥＣシステムで分析した。
、ＨＰＬＣ−３ＥＣシステムで分析した。
１５分後から、カラムからのフラクションを２−１づつ
集め、Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性をテストした
（実施例９参照）。
集め、Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性をテストした
（実施例９参照）。
図７は、ＨＰＬＣ−３ＥＣフラクシヨンのＯＤ２８０ｎ
ｍ吸光度とエステラーゼ活性を示しである。Ｓ−ナプロ
キセンエステラーゼ活性は、吸光度溶出プロフィールの
ピークのところに存在する。まった（同様に分析した、
枯草菌Ｔｈａｉ Ｉ −８エステラーゼの溶出時間も同
じであった（結果は示していない）。
ｍ吸光度とエステラーゼ活性を示しである。Ｓ−ナプロ
キセンエステラーゼ活性は、吸光度溶出プロフィールの
ピークのところに存在する。まった（同様に分析した、
枯草菌Ｔｈａｉ Ｉ −８エステラーゼの溶出時間も同
じであった（結果は示していない）。
図８は、大腸菌ｐＮＡＰＴ−７保持体と、ＨＰＬＣ−Ｓ
ＥＣのフラクション２６の、リームリ（Ｌａｅｍｓ＋ｌ
ｉ ）の方法による１２．６％５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果
を示しである。
ＥＣのフラクション２６の、リームリ（Ｌａｅｍｓ＋ｌ
ｉ ）の方法による１２．６％５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果
を示しである。
レーン４は大腸菌ＪＭＩ ０１ ｈｓｄｓ ／ｐＵＮ１
２１を含んでいる。ＰＡＧＥ （ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動）によって、大腸［ｐＮＡＰＴ−７保持体中
のもっとも顕著なタンパク質バンドは大腸菌にはみられ
ないが、ＨＰＬＣ−３ＥＣのフラクション２６に検出さ
れる唯一のタンパク質バンドである。
２１を含んでいる。ＰＡＧＥ （ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動）によって、大腸［ｐＮＡＰＴ−７保持体中
のもっとも顕著なタンパク質バンドは大腸菌にはみられ
ないが、ＨＰＬＣ−３ＥＣのフラクション２６に検出さ
れる唯一のタンパク質バンドである。
図９は、大腸菌ｐＮＡＰＴ−７の等電点ゲル電気泳動（
ＬＫＢアムホリン（Ａｎｐｈｏｌｉｎｅ Ｐ Ａ Ｇ
−プレート、ｐＨ３，５〜９．５）の結果を示した。Ａ
では、タンパク賞をサーバ・プルＲ（５ｅｒｖａ Ｂｌ
ｕｅＲ）で染色した。Ｂでは、同試料のエステラーゼ活
性を、実施例１０に述べたβ−ナフチルアセテート／Ｆ
Ｂ （ファースト・ブルーＲＲ塩）により視覚化した。
ＬＫＢアムホリン（Ａｎｐｈｏｌｉｎｅ Ｐ Ａ Ｇ
−プレート、ｐＨ３，５〜９．５）の結果を示した。Ａ
では、タンパク賞をサーバ・プルＲ（５ｅｒｖａ Ｂｌ
ｕｅＲ）で染色した。Ｂでは、同試料のエステラーゼ活
性を、実施例１０に述べたβ−ナフチルアセテート／Ｆ
Ｂ （ファースト・ブルーＲＲ塩）により視覚化した。
Ａ中の最も顕著なタンパク賞バンドが、最も高いエステ
ラーゼ活性を任うことが示された。
ラーゼ活性を任うことが示された。
実施例１３
大腸菌ＪＭＩ ０１ ｈｓｄｓ ／ｐＮＡＰＴ−７によ
るイブプロフェンのエチルエステルのイブプロフェンへ
の転換 硫安沈殿と超遠心の後、大腸菌ｐＮＡＰＴ細胞破壊物は
、Ｒ−及びＳ−イブプロフェン・エチルエステルの加水
分解に関するテストを行った。
るイブプロフェンのエチルエステルのイブプロフェンへ
の転換 硫安沈殿と超遠心の後、大腸菌ｐＮＡＰＴ細胞破壊物は
、Ｒ−及びＳ−イブプロフェン・エチルエステルの加水
分解に関するテストを行った。
酵素活性は、０．３■／ｌＩｌのＲ又はＳ−イブプロフ
ェンエチルエステル、２％トウィーン及ヒ１■／＋１ｌ
ＢＳＡの存在下ｐＨ７，５の０． Ｉ Ｍ ＭＯＰＳバ
ッファ中２５℃で検定した。２時間後、アセトニトリル
を添加することにより反応を停止した。
ェンエチルエステル、２％トウィーン及ヒ１■／＋１ｌ
ＢＳＡの存在下ｐＨ７，５の０． Ｉ Ｍ ＭＯＰＳバ
ッファ中２５℃で検定した。２時間後、アセトニトリル
を添加することにより反応を停止した。
反応混合物は、ＨＰＬＣ逆相カラム（クロムパンクボリ
ゴシル６０ Ｄ −１０ＣＮ（ｃｈｒｏｍｐａｃｋｐｏ
ｌｙｇｏｓｉｌ ） 、２５０ Ｘ ４．６ ｗａｓ
）、を使い、１．５１１１／＋ｍｉｎの流速で、３４％
アセトニトリル、０、０５ Ｍリン酸（ｐＨ３，０）を
流すことにより分析した。Ｒ，Ｓ−イブプロフェン及び
Ｒ，Ｓ−イブプロフェンエチルエステルの？８出時間は
５．９８分及び１１．０８分であった。結果をＴａｂｌ
ｅ １２にまとめた。
ゴシル６０ Ｄ −１０ＣＮ（ｃｈｒｏｍｐａｃｋｐｏ
ｌｙｇｏｓｉｌ ） 、２５０ Ｘ ４．６ ｗａｓ
）、を使い、１．５１１１／＋ｍｉｎの流速で、３４％
アセトニトリル、０、０５ Ｍリン酸（ｐＨ３，０）を
流すことにより分析した。Ｒ，Ｓ−イブプロフェン及び
Ｒ，Ｓ−イブプロフェンエチルエステルの？８出時間は
５．９８分及び１１．０８分であった。結果をＴａｂｌ
ｅ １２にまとめた。
Ｓ−イブプロフェンのエチルエステルの加水分解は同条
件下でテストしたＳ−ナプロキセンメチルエステルの加
水分解活性の６０％であった。
件下でテストしたＳ−ナプロキセンメチルエステルの加
水分解活性の６０％であった。
実施例１４
バチルス１−８５／ｐＮＡＰＴ−７のＳ−ナプロキセン
エステラーゼの特性化 バチルス１−８５／ｐＮＡＰＴ−７を２ＸＴＹ培地で５
リツトルエスヒバイラ・ファーメンタ−を用いて増殖さ
せた。細胞ペーストを遠心で単離した。そのペレットを
ｐＨ８，０の０．１ Ｍ ）リス−塩酸に溶解し、実施
例９に述べた方法で分解した。
エステラーゼの特性化 バチルス１−８５／ｐＮＡＰＴ−７を２ＸＴＹ培地で５
リツトルエスヒバイラ・ファーメンタ−を用いて増殖さ
せた。細胞ペーストを遠心で単離した。そのペレットを
ｐＨ８，０の０．１ Ｍ ）リス−塩酸に溶解し、実施
例９に述べた方法で分解した。
遠心後、上清を６０％飽和硫酸アンモニウムにし、再び
遠心した。ペレットをｐＨ７，５０，０２ＭＭ０ＰＳに
）容かし、アミコンＹ Ｍ １０ （ＡｍｉｃｏｎＹＭ
ＩＯ）フィルターで濾過した。この細胞分解物を分析用
ＨＰＬＣ−３ＥＣカラム（ＴＳＫ２０００ Ｓ讐、２Ｘ
（３００Ｘ７．５ ＋ｕ＋））を用い、ｐＨ５，６の
０．０１Ｍ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンス
ルホン酸、Ｑ、 Ｉ Ｍ ＮａＣｌで溶出した。流速は
Ｉ ｎ＋ｌ／ｗｉｎ 、 １０分後から１ ｍｌづつ
フラクションを集め、実施例１２の方法に従がいＳ−ナ
プロキセンメチルエステラーゼ；活性をテストした。
遠心した。ペレットをｐＨ７，５０，０２ＭＭ０ＰＳに
）容かし、アミコンＹ Ｍ １０ （ＡｍｉｃｏｎＹＭ
ＩＯ）フィルターで濾過した。この細胞分解物を分析用
ＨＰＬＣ−３ＥＣカラム（ＴＳＫ２０００ Ｓ讐、２Ｘ
（３００Ｘ７．５ ＋ｕ＋））を用い、ｐＨ５，６の
０．０１Ｍ ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンス
ルホン酸、Ｑ、 Ｉ Ｍ ＮａＣｌで溶出した。流速は
Ｉ ｎ＋ｌ／ｗｉｎ 、 １０分後から１ ｍｌづつ
フラクションを集め、実施例１２の方法に従がいＳ−ナ
プロキセンメチルエステラーゼ；活性をテストした。
図１Ｏは、そのフラクションのＯＤ ２８（ｌｎ＠の
プロフィールとエステラーゼ活性を示しである。
プロフィールとエステラーゼ活性を示しである。
Ｓ−ナプロキセンエステラーゼの溶出時間は、見かけの
分子１２７０００に相当する。Ｎ々のタンパクＭ試料の
比活性をＴａｂｌｅ １３にまとめた。エステラーゼ活
性は実施例１２に述べた方法で検定した。
分子１２７０００に相当する。Ｎ々のタンパクＭ試料の
比活性をＴａｂｌｅ １３にまとめた。エステラーゼ活
性は実施例１２に述べた方法で検定した。
バチルスｐＮＡＰＴ ７保持体の立体異性選択性をＴ
ａｂｌｅ １４に示した。その活性は、実施例１２に従
って検定した。
ａｂｌｅ １４に示した。その活性は、実施例１２に従
って検定した。
図８に、リームリ（Ｌａｅｍａｌｉ ）の方法に従った
、バチルスｐＮＡＰＴ−７と、各々、リパーゼ活性と、
Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性を示すＨＰＬＣ−３
ＥＣのフラクションＳ及び７の１２．６％５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を示す。バチルス保持゛体におけるタンパク
質の主なバンドは、フラクション５中には存在せず（リ
パーゼ活性）、フラクション７中に存在する唯一のバン
ドである。レーン８のタンパク質バンドは、見かけの分
子量３１０００に相当する。
、バチルスｐＮＡＰＴ−７と、各々、リパーゼ活性と、
Ｓ−ナプロキセンエステラーゼ活性を示すＨＰＬＣ−３
ＥＣのフラクションＳ及び７の１２．６％５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を示す。バチルス保持゛体におけるタンパク
質の主なバンドは、フラクション５中には存在せず（リ
パーゼ活性）、フラクション７中に存在する唯一のバン
ドである。レーン８のタンパク質バンドは、見かけの分
子量３１０００に相当する。
図９には、バチルスｐ Ｎ Ａ Ｐ Ｔ ７とフラク
ション７の等電点ゲル電気泳動の結果が示されている。
ション７の等電点ゲル電気泳動の結果が示されている。
（技術的な詳細は実施例１２参照）。バチルスｐＮＡＰ
Ｔ−７保持体では、等電点（ＴＥＰ）４．５をもつリパ
ーゼ活性がナフチルアセテートの基質に関するもっとも
卓越した活性である。
Ｔ−７保持体では、等電点（ＴＥＰ）４．５をもつリパ
ーゼ活性がナフチルアセテートの基質に関するもっとも
卓越した活性である。
ＨＰＬＣ−３ＥＣのフラクション７においては、タンパ
ク質の主バンドはＩ Ｅ Ｐ ５．４を有しており、パ
ートＢ中に示したナフチルアセテート加水分解活性と共
存する。β−ナフチル・ファースト・ブルー検定法は、
エステラーゼよりも、リパーゼに対し、より感受性が高
いことに注意しなければならない。
ク質の主バンドはＩ Ｅ Ｐ ５．４を有しており、パ
ートＢ中に示したナフチルアセテート加水分解活性と共
存する。β−ナフチル・ファースト・ブルー検定法は、
エステラーゼよりも、リパーゼに対し、より感受性が高
いことに注意しなければならない。
ＨＰＬＣ−３ＥＣのＯＤ２８０ｎｍ ピーク （フラク
ション７）は、ナプロキセンエステラーゼ活性を含み、
５ＤＳ−ＰＡＧＥで１つの主タンパク質バンドからなる
ようである。等電点ゲル電気泳動は、フラクション７の
主タンパク質バンドがエステラーゼ活性をもつことを示
した。これは、大腸菌及びバチルスの両方に存在する枯
草菌Ｔｈａｉ １−８のエステラーゼ活性のクローニン
グがエステラーゼ産生を増加していることを意味する。
ション７）は、ナプロキセンエステラーゼ活性を含み、
５ＤＳ−ＰＡＧＥで１つの主タンパク質バンドからなる
ようである。等電点ゲル電気泳動は、フラクション７の
主タンパク質バンドがエステラーゼ活性をもつことを示
した。これは、大腸菌及びバチルスの両方に存在する枯
草菌Ｔｈａｉ １−８のエステラーゼ活性のクローニン
グがエステラーゼ産生を増加していることを意味する。
事実、大腸菌ｐＮＡＰＴ−７及びバチルスｐＮＡＰＴ−
７中のナプロキセンエステラーゼは、両方の微生物の細
胞分解物中、もっとも高い濃度をもつタンパク質である
。
７中のナプロキセンエステラーゼは、両方の微生物の細
胞分解物中、もっとも高い濃度をもつタンパク質である
。
図１はバチルスＴｈａｉＩ ８細胞分解物のＩＩ Ｐ
Ｌ Ｃ−３ＥＣの結果を示す図である。 図２は実施例９の検定条件下におけるＳ−ナプロキセン
メチルエステルの加水分解のｐＨ依存性を示す図である
。 図３はエステラーゼ反応における温度の影響を示す図で
ある。 図４はｐＮＡＰＴ−２の制限地図であって、制限酵素認
識部位の数は９．４ｋｂの大きさをもつプラスミドｐＮ
ＡＰＴ−２において決定され、Ｓ ａｎ ３ ａで部分
消化したＴｈａｉ Ｉ −８ＤＮＡとｐＵＮ１２１との
連結部位はＢｃｌ １／５ａｎ３ａと表わされる。 図５及び図６は、各々、ｐＮＡＰＴ−７とｐＮＡＰＴ−
８の制限地図を示す。 ｐＮＡＰＴ−２の２．２ｋｂの旧ｎｄＩ［Ｉフラグメン
トをｐ Ｐ Ｎｅｏｌｏｒｉにクローン化した。生じた
プラスミドｐＮＡＰＴ−７とｐＮＡＰＴ−８を、いくつ
かの制限酵素をつかって詳細に解析した。双方のプラス
ミドとも７．３ｋｂの大きさをもっている。 ｐＮＡＰＴ−８は２．２ｋｂのｌｌ１ｎｄＩ［Ｉフラグ
メントをｐＮＡＰＴ−７と逆方向の向きにもっているこ
とがわかる。 図７はＨＰＬＣ−３ＥＣフラクシヨンのＯＤ−２８０ｎ
ｍ吸光度とエステラーゼ活性とを示す図である。 図８は大腸菌ｐＮＡＰＴ−７保持体と、１（ＰＬＣ−３
ＥＣのフラクション２６の、リムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ
）の方法による１２．６％ＳＤＳ −ＰＡＧＥの図で
ある。 図９は大腸菌ｐＮＡＰＴ−７保持体の等電点ゲル電気泳
動（ＬＫＢアンホリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ＰＡＧプ
レート、ｐＨ３，５〜９．５）の結果を示す図である。 図１０はＨＰＬＣ−３ＥＣフラクシヨンのＯＤ２８０ｎ
ｍプロフィールと、エステラーゼ活性を示す図である。 相 対 傭 蛯５−ナブコキせン（マイクロ七ル／ｍＩりニ：＝：
ｐＵＮ １２１ ＤＮＡ ＝ ：丁にλＬ Ｉ−８ＤＮＡ 挿入物祖 ｉｔ 値 し・・ノ ニ １ 二 Ａ− 弓 （□！ 咋 卆 １− レーン１，５及び９：分子量マーた し一ン２ 二人腸菌ｐＮＡＰ−’／保符体レー
ン４ ｂ”ン６ ：ｐＮＡＰＴ−７ｔＬつｌｊ菌１
−８５ＦＩＧ、８ Ａ−Ｂ し−Ｌ〆 ： ２ ３ ｔ ″し
一ン２ ： ＨＰＬＣグルロＭのレーン３の訳書ハ活性
フラクションＦＩＧ、 ９ 相 対 儂
Ｌ Ｃ−３ＥＣの結果を示す図である。 図２は実施例９の検定条件下におけるＳ−ナプロキセン
メチルエステルの加水分解のｐＨ依存性を示す図である
。 図３はエステラーゼ反応における温度の影響を示す図で
ある。 図４はｐＮＡＰＴ−２の制限地図であって、制限酵素認
識部位の数は９．４ｋｂの大きさをもつプラスミドｐＮ
ＡＰＴ−２において決定され、Ｓ ａｎ ３ ａで部分
消化したＴｈａｉ Ｉ −８ＤＮＡとｐＵＮ１２１との
連結部位はＢｃｌ １／５ａｎ３ａと表わされる。 図５及び図６は、各々、ｐＮＡＰＴ−７とｐＮＡＰＴ−
８の制限地図を示す。 ｐＮＡＰＴ−２の２．２ｋｂの旧ｎｄＩ［Ｉフラグメン
トをｐ Ｐ Ｎｅｏｌｏｒｉにクローン化した。生じた
プラスミドｐＮＡＰＴ−７とｐＮＡＰＴ−８を、いくつ
かの制限酵素をつかって詳細に解析した。双方のプラス
ミドとも７．３ｋｂの大きさをもっている。 ｐＮＡＰＴ−８は２．２ｋｂのｌｌ１ｎｄＩ［Ｉフラグ
メントをｐＮＡＰＴ−７と逆方向の向きにもっているこ
とがわかる。 図７はＨＰＬＣ−３ＥＣフラクシヨンのＯＤ−２８０ｎ
ｍ吸光度とエステラーゼ活性とを示す図である。 図８は大腸菌ｐＮＡＰＴ−７保持体と、１（ＰＬＣ−３
ＥＣのフラクション２６の、リムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ
）の方法による１２．６％ＳＤＳ −ＰＡＧＥの図で
ある。 図９は大腸菌ｐＮＡＰＴ−７保持体の等電点ゲル電気泳
動（ＬＫＢアンホリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ＰＡＧプ
レート、ｐＨ３，５〜９．５）の結果を示す図である。 図１０はＨＰＬＣ−３ＥＣフラクシヨンのＯＤ２８０ｎ
ｍプロフィールと、エステラーゼ活性を示す図である。 相 対 傭 蛯５−ナブコキせン（マイクロ七ル／ｍＩりニ：＝：
ｐＵＮ １２１ ＤＮＡ ＝ ：丁にλＬ Ｉ−８ＤＮＡ 挿入物祖 ｉｔ 値 し・・ノ ニ １ 二 Ａ− 弓 （□！ 咋 卆 １− レーン１，５及び９：分子量マーた し一ン２ 二人腸菌ｐＮＡＰ−’／保符体レー
ン４ ｂ”ン６ ：ｐＮＡＰＴ−７ｔＬつｌｊ菌１
−８５ＦＩＧ、８ Ａ−Ｂ し−Ｌ〆 ： ２ ３ ｔ ″し
一ン２ ： ＨＰＬＣグルロＭのレーン３の訳書ハ活性
フラクションＦＩＧ、 ９ 相 対 儂
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （ただし、Ｒ＿１は、任意に置換し得るヘテロ環システ
ムに任意に含まれうるフェニル又はナフチル基のような
任意に置換しうるアリール基、又は炭素原子と、窒素、
硫黄及び酸素から選ばれた１以上の原子とを含むヘテロ
環システムであり、前記環システムが任意に置換しても
よい。）で示される立体特異的形態の薬学的に活性な化
合物、もしくは薬学的に許容し得るその塩、もしくはそ
のエステルの製造方法であって、該製造方法が、 式（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （ただし、Ｒ＿２はエステル残基、好ましくは任意に置
換されうるアルキル基である。） で示される化合物を、微生物又はその由来物質であって
、前記化合物（II）を立体選択的に加水分解して少なく
とも８０重量％のＳ−配置を有する前記化合物（ I ）
に変える能力を有するものの作用に付し、必要により前
記化合物（ I ）を薬学的に許容し得る塩又はエステル
に変えることを含む製造方法。 ２、Ｒ＿２が１から８ヶの炭素原子からなる線状アルキ
ル基である特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、Ｒ＿２がエチル基である特許請求の範囲第１項又は
第２項記載の方法。 ４、Ｒ＿２がメチル基である特許請求の範囲第１項又は
第２項記載の方法。 ５、前記化合物（ I ）がナプロキセン、イブプロフェ
ン、シクロプロフェン、スプロフェン、カープロフェン
、ケトプロフェン、ベノキサプロフェン、フェノプロフ
ェン、パープロフェン、リシプロフェナム、フラービプ
ロフェン、ワルプロフェン、クリダナック、ターチプロ
フェン、ヘキサプロフェン、インドプロフェン、メキソ
プロフェン、プラノプロフェン、Ｒ８０３、プロチジン
酸、チアプロフェン酸又はプロフェジルである特許請求
の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ６、前記化合物（ I ）がナプロキセンである特許請求
の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ７、前記化合物（ I ）がイブプロフェンである特許請
求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ８、前記微生物が、前記化合物（II）を少なくとも９０
重量％のＳ−配置の前記化合物（ I ）に転換できる特
許請求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ９、少なくとも８０％のＲ−配置の前記化合物（Ｉ）の
製造方法であって、特許請求の範囲第１項〜第８項のい
ずれかに記載の方法を含有し、その後前記化合物（Ｉ）
を分離し、残存部分を加水分解する方法。 １０、前記微生物を生菌又は死菌の状態で固定化する特
許請求の範囲第１項〜第９項のいずれかに記載の方法。 １１、前記化合物（II）を前記化合物（ I ）に変換で
きる物質を微生物から遊離し、そのようなものとして使
用する特許請求の範囲第１項〜第１０項のいずれかに記
載の方法。 １２、前記微生物がバチルス属、シュードモナス属、ア
ースロバクター属、ムコール属又はストレプマイセス属
に属する細菌である特許請求の範囲第１項〜第１１項の
いずれかに記載の方法。 １３、前記微生物が、枯草菌又はバチルス・リチェニホ
ルミスである特許請求の範囲第１項〜第１１項のいずれ
かに記載の方法。 １４、前記微生物がムコール・アングリマクロスポラス
である特許請求の範囲第１項〜第１１項のいずれかに記
載の方法。 １５、前記微生物がシュードモナス・フルオレセンス、
シュードモナス・アエルギノーサ、シュードモナス・プ
チーダ、シュードモナス・オバリス又はシュードモナス
・リボフラビナである特許請求の範囲第１項〜第１１項
に記載の方法。 １６、前記微生物がストレプトマイセス・フラボビレン
スである特許請求の範囲第１項〜第１１項のいずれかに
記載の方法。 １７、前記微生物が、ｉｓIII−２５株（ＣＢＳ６６６
．８６）、ＬＫ３−１株（ＣＢＳ６６７．８６）、Ｓｐ
４株（ＣＢＳ６６８．８６）、ＴｈａｉIII１８−１株
（ＣＢＳ６６９．８６）又はＴｈａｉVI１２株（ＣＢＳ
６７０．８６）である特許請求の範囲第１項〜第１１項
のいずれかに記載の方法。 １８、前記微生物がアースロバクター・パラフィネウス
である特許請求の範囲第１項〜第１１項のいずれかに記
載の方法。 １９、前記微生物がエステラーゼをコードするＤＮＡフ
ラグメントで形質転換した微生物である特許請求の範囲
第１項〜第１１項のいずれかに記載の方法。 ２０、前記ＤＮＡフラグメントがいずれかのバチルス種
由来のものである特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１、前記ＤＮＡフラグメントが枯草菌由来のものであ
る特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、前記ＤＮＡフラグメントがプラスミド中に挿入さ
れている特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２３、前記プラスミドがｐＮＡＰＴ−７又はｐＮＡＰＴ
−８である特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４、前記微生物が大腸菌であり、好ましくは、大腸菌
ＪＭ１０１ｈｓｄｓ又は大腸菌ＤＨ１である特許請求の
範囲第１９項又は第２０項に記載の方法。 ２５、前記微生物が、枯草菌であり、好ましくは枯草菌
１−８５又は枯草菌１Ａ４０である特許請求の範囲第１
９項又は第２０項に記載の方法。 ２６、特許請求の範囲の第１項〜第２５項のいずれか記
載の方法により生産される化合物（ I ）又は化合物（
I ）のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩。 ２７、少なくとも８０重量％がＳ−配置を有する特許請
求の範囲第２６項記載の化合物。 ２８、少なくとも９０重量％が、Ｓ−配置を有する特許
請求の範囲第２７項記載の化合物。 ２９、特許請求の範囲第２６項〜第２８項のいずれか記
載の化合物を少なくとも１種含む薬学的生産物。 ３０、バチルス種Ｔｈａｉ I −８（ＣＢＳ６７９．８
５）。 ３１、バチルス種ＩｎIV−８（ＣＢＳ６８０．８５）。 ３２、バチルス種Ｎａｐ１０−Ｍ（ＣＢＳ８０５．８５
）。 ３３、バチルス種ＳｐIII−４（ＣＢＳ８０６．８５）
。 ３４、シュードモナス種Ｋｏｒ I −６（ＣＢＳ８０７
．８５）。 ３５、大腸菌ＤＨＩ／ｐＮＡＰＴ−２（ＣＢＳ６７１．
８６）。 ３６、大腸菌ＪＭ１０１ｈｓｄｓｐＮＡＰＴ−７（ＣＢ
Ｓ７１２．８６）。 ３７、枯草菌１−８５／ｐＮＡＰＴ−７（ＣＢＳ６７３
．８６）。 ３８、枯草菌１Ａ−４０／ｐＮＡＰＴ−７（ＣＢＳ６７
５．８６）。 ３９、枯草菌１Ａ−４０／ｐＮＡＰＴ−８（ＣＢＳ６７
４．８６）。 ４０、大腸菌ＪＭ ｈｓｄｓ／ｐＮＡＰＴ−８（ＣＢＳ
６７２．８６）。 ４１、ＬＫ３−４株（ＣＢＳ６６７．８６）。 ４２、Ｓｐ４株（ＣＢＳ６６８．８６）。 ４３、ＴｈａｉIII１８−１株（ＣＢＳ６６９．８６）
。 ４４、ＴｈａｉVI１２株（ＣＢＳ６７０．８６）。 ４５、ｉｓIII−２５株（ＣＢＳ６６６．８６）。 ４６、少なくとも９５重量％がＳ−配置を有する化合物
（ I ）を化合物（II）に立体選択的に加水分解するこ
とのできる酵素。 ４７、式（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） （ただし、Ｒ＿１が、任意に置換してもよいヘテロ環シ
ステム中に任意に含まれうるフェニル基又はナフチル基
のような任意に置換し得るアリール基、又は、任意に置
換した、炭素原子と、窒素、硫黄及び酸素から選ばれた
１以上の原子とを含むヘテロ環システムであり、前記環
システムは任意に置換されていてもよく、前記Ｒ＿２は
エステル残基、好ましくは任意に置換してもよいアルキ
ル基である。）で示される化合物（II）を、 式（ I ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で示され、かつ少なくとも８０重量％のＳ−配置を有す
る化合物（ I ）に立体選択的に加水分解することので
きる、微生物由来の特許請求の範囲第４６項に記載の酵
素。 ４８、前記化合物（ I ）がナプロキセン又はイブプロ
フェンである特許請求の範囲第４７項記載の酵素。 ４９、特許請求の範囲第３０項〜第４５項のいずれかに
記載の微生物から得られた、特許請求の範囲第４７項に
記載の酵素。 ５０、少なくとも０．１ユニットの比活性を有する特許
請求の範囲第４６項記載の酵素。 ５１、少なくとも１ユニットの比活性を有する特許請求
の範囲第５０項記載の酵素。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB868600245A GB8600245D0 (en) | 1986-01-07 | 1986-01-07 | Preparation of 2-arylpropionic acids |
| FR8600245 | 1986-01-08 |
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