JPH10501414A

JPH10501414A - ａｒｅＡ遺伝子が修飾された真菌及びアスペルギルスオリザエからのａｒｅＡ遺伝子

Info

Publication number: JPH10501414A
Application number: JP8501508A
Authority: JP
Inventors: クリステンセン，トウエ; ジェイ．ハイネス，マイケル
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1994-06-17
Filing date: 1995-06-19
Publication date: 1998-02-10
Also published as: US6025185A; ATE256191T1; DE69532283D1; EP0770139A1; FI965031A7; AU2733895A; WO1995035385A1; CN1253574C; DE69532283T2; CN1150824A; FI965031A0; DK0770139T3; EP0770139B1; FI965031L

Abstract

(57)【要約】本発明はプロテアーゼを生産しない真菌に関する。本発明の真菌は、通常は生産されるプロテアーゼにより、タンパク質分解を受けやすいタンパク質の生産のための宿主として有用であり、従って、本発明は本発明の真菌を用いることによる着目のタンパク質を高収量で生産する方法を含む。本発明は前記真菌を製造する方法及びこれらの方法に用いられるDNA構築体も含む。

Description

【発明の詳細な説明】 areA遺伝子が修飾された真菌及びアスペルギルスオリザエからのareA遺伝子発明の分野本発明は、プロテアーゼを生産しない真菌に関する。本発明の真菌は、通常生産されるプロテアーゼにより、タンパク質分解を受けやすいタンパク質の生産のための宿主として有用であり、本発明は結果として、本発明の真菌を用いることにより、目的のタンパク質を高収量で生産する方法を包含する。本発明は前記真菌を生産する方法及びこれらの方法で用いられるDNA構築体も含む。発明の背景真菌、及び特に糸状菌は、著るしく高レベルのタンパク質を分泌する能力のために、商業的に広く用いられる。アスペルギルス属に属する糸状菌は、特に内因性のタンパク質、そして最近は、また、異種タンパク質生産のための商業的な使用について長い歴史がある。タンパク質の生産に用いられるほとんどの微生物が有する一つの不利益は、タンパク質分解のために目的のタンパク質生成物を分解にさせ得るプロテアーゼの本来の生産である。これを避ける多くの方法が予想されてきた。他の解決策の中でも、種々のプロテアーゼをコードする遺伝子を欠失または崩壊させることが提案された。あいにく、真菌は非常に多数のプロテアーゼを生産し、このような解決策を多かれ少なかれ、非現実的なものにする。したがって、プロテアーゼの生産がないか、非常に低レベルである糸状菌株についての必要性が存続している。長年、Ａ．ニドラン(A．nidulans)における窒素代謝生成物の抑制を仲介する調節遺伝子は、細胞外プロテアーゼの生産に影響を与えることが知られていた（ Arst及びCove「molec．gen．Genet.」126 、第111〜141頁（1973年））。Ａ．ニドランからのareA遺伝子はクローン化され（Caddick他「EMBO Journal 」５、第1087〜1090頁、（1986年））、この遺伝子によりコードされた活性化因子タンパク質中の異なった領域の機能を評価するために、それに多くの修飾がなされた（Staukovitch他「Mol．Microbiol．」７、第81〜87頁（1993年））。さらに、Ａ．フミガツス（A．fumigatus）における相当する機能をコードする遺伝子が最近明らかにクローン化された（Hansel他「真菌遺伝学についての第２回ヨーロッパ会議」1994年４月28日〜５月１日、要約書、Ｅ11）。該文献から、遺伝子型argB areAlのＡ．ニドラン株をｔ−PAの生産のための宿主として用いる単一の用途も既知である（Upshall他「Biotechnology」５、第 1301〜1304頁（1987年））。この例では、argB遺伝子型のみがそのアルギニン原栄養性によって選択マーカーとして用いられるが、areA遺伝子型は単なる偶然である。本発明は、プロテアーゼを欠く糸状菌の必要性の軽減を一つの目的とする。発明の概要本発明は組換えDNA技術によるareA遺伝子が、結果として、機能的AreA活性化因子を供給するようには発現できないように修飾された、真菌に関する。本発明は更にareA遺伝子の欠失により得られた上記真菌を生産する方法に関する。これは、ｉ）着目の真菌からのareA遺伝子をクローン化し、 ii）内部の部分が置換されたか、欠失されたか、または余分のDNAが挿入された、areA遺伝子を含むDNA構築体を生産し、 iii）該構築体で前記真菌を形質転換させ、そして、 iv）areA^-である形質転換体を選択することを含む方法により得ることができる。上述のareA遺伝子のクローン化から得られた情報はよく知られたアンチセンス技術に関連して、areA遺伝子から転写されたmRNAに相補的なRNA分子の合成を起こす発現プラスミドを構築し、それを用いて着目の真菌を形質転換することにも用い得る。本発明はさらに上述の方法中に用いることを意図するDNA構築体に関する。さらに本発明は、所望のタンパク質または遺伝子産物、特に分泌タンパク質を生産する方法に関し、それにより、着目のタンパク質または遺伝子産物をコードするDNA配列を少くとも含むDNA構築体を用いて修飾または所望により形質転換された真菌を適当な条件で適切な増殖培地中で培養し、所望の遺伝子産物を回収し、精製する。本発明を研究の対象とした時、驚くべきことに、本発明の真菌は上記分泌タンパク質をはるかに改良された収量で生産するということを発見した。驚くべきことに、Ａ．オリザエ（A．Orizae）areA^-株の良好な増殖を可能とする唯一の窒素源はグルタミンであることも発見した。最後に本発明は上記方法により生産されたタンパク質産物に関する。図面の簡単な説明本発明を例及び図面を参照して明細書の次の部分でさらに詳細に記載するが、図面中、第１図はHowB101の構築に包含される段階を示し、第２図は、pSK5及びpSK9の構築に包含される段階を示し、第3a及び3b図は、pToC266の構築に包含される段階を示し、第４図はpMT1606の構築に包含される段階を示し、第５図は、pToC56の構築に包含される段階を示す。定義本明細書では次の定義が用いられる。表現areAΔはareA遺伝子を欠失している株を意味する。表現areA^-は機能的なAreA活性化因子を生産しない株を意味する。用語「機能の喪失」もしばしばこれについて用いられる。表現「アンチセンス技術」は、米国特許第5,190,931号で開示されているような方法を示す。発明の詳細な説明上記のように、本発明の、最初の面は組換え技術によるareA遺伝子が、機能的なAreA活性化因子を供給するようには発現できないように修飾された真菌に関する。この目的は特にareA遺伝子の欠失または崩壊により得ることができる。 areA遺伝子のクローン化を例に記載する。他の真菌からのAreA同族体は、既知の遺伝子の１つとの交差ハイブリダイズまたはareA変異体、たとえば本出願中に記載されているＡ．ニドランareA−18またはＡ．オリザエareA欠失株、の相補性のいずれかによりクローン化できるだろう。遺伝子を欠失または崩壊させる方法は、特に国際特許出願公開第90/00192号明細書（ジェネンコル）に記載されている。遺伝子中のDNAを置換する方法も普通に知られており、遺伝子の１つまたはそれよりも多い連続的な部分を置換することにより達成し得るが、機能的でないAr eA活性化因子変異体をコードするDNA配列を生じる部位指向変異誘発によっても得ることができる。上記目的を得ることができる他の方法はアンチセンス技術を用いることによる。アンチセンス技術及びその使用法は前述の米国特許第5,190,931号明細書（ニューヨーク大学）中に詳細に記載されている。前記不活性化を得る他の方法はareA遺伝子の内部に余分のDNAを挿入することにより、正常に機能しない活性化因子タンパク質の発現を生じさせる方法である。この方法に関連して、クローン化により供給された情報を、areA遺伝子中に組み入れることができるDNA構築体を作るのに用いることができ、それを他の遺伝子、たとえばpyrG遺伝子と置換することにすら用いることができる。 areA活性化因子の存在を回避する他の方法は、areA遺伝子自体の発現を調節する発現シグナルの調節で妨げることによる。本発明によると、真菌は好ましくは、アスペルギルス、トリコデルマ、フミコーラ（Humicola）、カンジダ、アクレモニウム、フザリウム及びペニシリウムからなる群から選択された属に属する。これらの属のなかでも、Ａ．オリザエ、Ａ．ニガー、Ａ．アワモリ、Ａ．ホエニシス(phoenicis)、Ａ．ジャポニクス、Ａ．フォエチダス（foeti dus）、Ａ．ニドラン、Ｔ．リーセイ（reesei）、Ｔ．ハルチアヌム（harzianum ）、Ｈ．インスレンス（insulens）、Ｈ．ラヌギノサ（lanuginosa）、Ｆ．グラミネアルム（graminearumu）、Ｆ．ソラニ（solani）、Ｐ．クリソゲヌム(chrys ogenum)等を含む群から選択された種が好ましい。前記のように、本発明は本発明の第１の面の真菌を生産する方法を包含することも意味し、該方法において、前記不活性化はareA遺伝子の欠失により得られたものであり、該方法はｉ）着目の真菌からのareA遺伝子の同族体をクローン化し、 ii）内部の部分が置換もしくは欠失されるか、または余分なDNAが挿入されたa reA遺伝子を含む、DNA構築体を調製し、 iii）該構築体で前記真菌を形質転換し、 iv）areA^-である形質転換体を選択することを含む。真菌を生産する方法も包含し、該方法においては不活性化はアンチセンス技術を用いて得られた。上記方法はｉ）areA遺伝子から転写されたmRNAに相補的なRNAの合成を生じさせる発現プラスミドの構築、 ii）前記発現プラスミド及び異なるプラスミドまたは同じプラスミドにくっついている適当な標識を用いる宿主真菌の形質転換、 iii）前記標識を用いる形質転換体の選択、及び iv）たとえば種々の窒素源での増殖の分析による、AreA産物の合成における低下を示す株の形質転換体からのスクリーニングを含む。本発明の更なる面は、上述の方法で用いるためのDNA構築体を含むことを意味する。前者の方法に関する限り、前記DNA構築体は、内部の部が置換もしくは欠失されているか、余分のDNAが挿入されているareA遺伝子を含んでよい。 DNA構築体は、着目のタンパク質産物をコードするDNA配列、たとえば後述するものも含んでよい。後者のアンチセンス方法に関する限り、DNA構築体は機能的なプロモーターに結合する、areA遺伝子の逆方向のDNA配列を含んでもよく、それにより、mRNAは少くとも部分的にはareA遺伝子から生産されるmRNAに相補的である。本発明の更なる面は所望の遺伝子産物、好ましくは分泌された遺伝子産物の生産のための方法に関し、それにより、本発明の真菌は適当な条件で適切な増殖培地中で培養され、所望の遺伝子産物が回収され、精製される。非相同の遺伝子により発現された遺伝子産物の場合には、所望の遺伝子産物をコードするDNA配列は前記真菌を生産するために用いられるDNA構築体の一部であってもよい。しかしながら、通常、所望の産物を生産可能な真菌を作るために本発明の真菌の別の形質転換を実施する。真菌を形質転換する方法は当業界で良く知られている。たとえば欧州特許出願公開（A2）0184438号明細書（Gist-Brocades N．V．）及び欧州特許出願第87103 806号（Novo Nordisk A/S）参照。生来の産物については、これはもちろん必要でないが、生産を増加するために、目的のタンパク質をコードする遺伝子の多数のコピーを供給して宿主に取り込ませることは好都合であるかもしれない。所望の遺伝子産物は一般的にはペプチドまたはタンパク質、好ましくは酵素である。酵素の中でも、好ましくはプロテアーゼ、たとえばトリプシン及びキモシン、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、キシラナーゼ、ラッカーゼ、ペクチナーゼ等を含む群から選択される。所望の遺伝子産物の他の型は一般的に治療上活性なペプチドまたはタンパク質である。治療上活性なペプチドまたはタンパク質の中でもタンパク質は好ましくはインスリン、成長ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチン、インターフェロン、PDGF ，VII因子、VIII因子、ウロキナーゼ、ｔ−PA，CSF、ラクトフェリン、TPO等を含む群から選択される。本発明を、下記の例中でさらに詳細に説明する。しかしながら、これらは添付の請求の範囲で限定された本発明の範囲をどのような方法であっても限定するものと解すべきではない。例物質及び方法株Ａ．オリザエ、IFO4177 ：発酵研究所（大阪）から購入日本国大阪市淀川区２丁目十三本町17 −25 ToC913：この株の構築は例に記載されている。遺伝子 areA：この遺伝子は窒素代謝を調整する調節タンパク質をコードする。 pyrG：この遺伝子は、ウリジンの生合成に包含される酵素である、オロチジン−Ｓ′−ホスフェート脱炭酸酵素をコードする。 bar ：この遺伝子は、元来ストレプトマイセスハイグロスコピクス（Hygroscopicus）から単離されホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼをコードする。この酵素はホスフィノスリシン〔＝グルフォシネート(glufosinate)〕を修飾し、それにより、細菌、真菌及び植物に毒であるこの化合物を不活性化する。プラスミド pUC118：ヴィエラ及びメシング「J．Meth．Enzymol．」153第３〜11頁（1987年） pSO2：このプラスミドの構築は例に記載されている。 pJers4：pUC118中のpSO2の2.0Kbのサブクローン。pJers4 は機能的なＡ．オリザエpyrG遺伝子を含有する。 pSO5：pSO2からのこのプラスミドの構築は例に記載されている。 pToC56：このプラスミドの構築は欧州特許出願第87103806号に記載されている。 pToC266：このプラスミドの構築は例に記載されている。 pMT1606 ：pBP1T（B．Straubinger他「Fungal Genetics Newsle tter」39：第82〜83頁（1992年））及びp775（欧州特許出願第87103806号）からのこのプラスミドの構築は例に記載されている。 p777：このプラスミドの構築は欧州特許出願第87103806号に記載されている。 pHW470：このプラスミドの構築は例に記載されている。例１アスペルギルスオリザエareAΔ株の構築 areAΔ株を次の工程により構築した。Ａ．オリザエpyrG遺伝子をクローン化し、Ａ．オリザエpyrG変異体株を単離した。Ａ．オリザエからのareA遺伝子をクローン化した。areA遺伝子からのDNAフラグメントの上流と下流の間にpyrG遺伝子を担持したプラスミドでpy rG変異株を形質転換した。areAのコード領域にはこのプラスミドには存在しなかった。形質転換体をウリジンの不在、塩素酸塩存在下で増殖する能力により選択した。この二重選択は機能的なpyrG遺伝子とareAマイナスについて選択する。py rG遺伝子によって染色体のareA遺伝子が置換されているものを同定するために、この選択手順により得られた株をサザン分析により最終的にスクリーニングした。Ａ．オリザエpyrG遺伝子のクローン化Ａ．オリザエpyrG遺伝子をＡ．ニガーpyrG遺伝子を用いる交差ハイブリダイズによりクローン化した（W．Van Hartingsveldt他「Mol．Gen．Genet」206：第71 〜75頁（1987年））。部分的SauIIIＡ消化Ａ．オリザエIFO4177 DNAのラムダライブラリーを低ストリンジェンシーで、Ａ．ニガーpyrG遺伝子からの１Kb DNA フラグメントを用いて探査した。陽性クローンからの3.8Kb HindIIIフラグメントをpUC118中にサブクローン化した。生じたプラスミド、pSO₂は、Ａ．ニガーpy rG^-変異体の補完によってpyrG遺伝子を含有していることが明らかになった。Ａ．オリザエpyrGマイナス株の構築約１KbのpyrGフランキング配列を両末端に含有する、pyrG欠失プラスミドであるpSO5をプラスミドpSO2から構築した。Ａ．オリザエIFO4177をこの構築物を用いて形質転換し、形質転換体を、pyrG変異体の表現型特性である５−フッ化オロト酸耐性により選択した。１つの形質転換体であるHowB101 pyrG座での予期された欠失を有していることがサザン分析により明らかになった。pyrG変異体HowB10 1は増殖のためにウリジンを必要とするので、ウリジンなしで増殖する能力についての選択により、HowB101をwt pyrG遺伝子を用いて形質転換することができる。 HowB101の構築における工程を図１に図解する。areA 遺伝子のクローン化Ａ．ニドランareA遺伝子への交差ハイブリダイズによりＡ．オリザエareA遺伝子をクローン化した（B．Kudla他「EMBO J．」９：第1355〜1364頁（1990年）。Ａ．オリザエのゲノムライブラリーをSauIIIＡを用いる染色体DNAの部分的消化及び得られたDNAフラグメントのλGEM-IIベクター（Promegaから入手）へのクローン化により調製した。Ａ．ニドランareA遺伝子を用いる該ライブラリーの交差ハイブリダイズをホルムアミド中で37℃で行った。ハイブリダイズλクローンを単離し、これらのフラグメントからpBluescriptSK＋ベクター（Stratageneから入手）へ、サブクローン化し、図２に図解したプラスミドpSK5及びpSK9を生じた。もし、それが本当にＡ．オリザエareA同族体であるなら、クローン化された遺伝子はＡ．ニドランareA変異体を補完可能である。該クローンの5643bpを配列化し、Ａ．オリザエareA遺伝子とＡ．ニドランareA遺伝子との比較から、それらが高度に相同性であることが分かった。Ａ．オリザエareA遺伝子の配列を配列番号１に示す。areA 欠失プラスミドの構築Ａ．オリザエ染色体からのareA遺伝子を欠失させるために、プラスミドpToC26 6を構築した。pToC266はareA遺伝子の上流に由来する2.1KbのDNAフラグメント（ pSK5から単離された）及びareA遺伝子からの下流に由来する1.4KbのDNAフラグメント（pSK9から単離された）を含有する。２つのフラグメントはゲノム中で約3. 2Kb分離され、コード領域は遺伝子のこの部分に位置する。pJers4からのＡ．オリザエpyrG遺伝子をareA上流及び下流DNAフラグメントの間に挿入した。pToC266 の構築を図3a及び3bに図解する。pToC266は唯一のEcoRＩ部位を有し、pToC266を形質転換に用いる前にこの制限酵素を用いる切断により線状化した。Ａ．オリザエareAΔ株の選択Ａ．オリザエHowB101をpToC266を用いて形質転換した。形質転換体を、５％の塩素酸塩、0.5mMの硫酸アンモニウム及び１％のグルコースを含有する最少プレート（Cove「Biochem．Diophy．Acta」113：第51〜56頁（1966年））上で選択した。このように形質転換体をウリジンを添加せずに増殖可能であることによって pyrG遺伝子を得たこと及び耐塩素酸塩耐性の両方について、二重の選択を受けさせた。塩素酸塩耐性はＡ．ニドランareA変異体の表現型の一つである（H．N．Ar st及びD．J．Cove「MGG」126：第111〜141頁（1973年））。弱く増殖する形質転換体を同じ型のプレート上で二回再単離した。ToC913，ToC919及びToC920と名づけられた３つの別個の形質転換体に異なった窒素源上で増殖テストを受けさせた。それらはグルタミン上でよく増殖したが、アンモニアを含め、他の試験窒素源上では弱く増殖した。サザン分析により、３つの株はareA構造遺伝子を失い、それがpyrG遺伝子により置換されたことが分かった。 areAΔ株を窒素源としてグルタミンを含有する最少プレート上で線状化された pToC266の形質転換体の選択によっても得ることができる。このような一つの実験で25形質転換体の１つがareAΔ株であった。例２pMT1606 の構築Ａ．オリザエTAKA−アミラーゼプロモーターの後に挿入され、続いてＡ．ニガーgla遺伝子からの転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルを含有するフラグメントを挿入されたストレプトマイセスヒグロスコピウスからのbar 遺伝子を含有するプラスミド（C．J．トムプソン他「EMBO J．」６：第2519〜2523（1987））を構築した。プラスミド、pMT1606をＡ．オリザエのグルフォシネート耐性形質転換体の選択に用い得る。プラスミドpBP1T（B.Straubinger他「Fungal Genetics Newslett er」39：第82〜83頁（1992年））からのbar遺伝子を単離し、欧州出願番号87103 806号に記載されている真菌の発現プラスミドp775中にクローン化することによって、pMT1606を構築した。図４はpMT1606の構築を図解する。例３ToC913 （Ａ．オリザエIFO4177 areAΔ）中のキモシンの生産Ａ．オリザエareAΔ株ToC913を、哺乳類の酵素キモシンについての真菌の発現プラスミドである、プラスミドpToC56（図５）を用いて、pMT1606を用いる共形質転換により形質転換した。プラスミドpToC56の構築は欧州特許出願第87103806 号に記載されている。形質転換体を10mMのアンモニウム及び１mg／mlのグルフォシネートを含有する無機培地上の増殖により選択し、キモシンを生産する能力により、pToC56の存在についてスクリーニングした。三つの形質転換体をマルトデキストリン及びグルタミンを含有する最少培地で、振とうフラスコ中で、30℃で４日間増殖させた。 IFO4177（欧州特許出願第87103806号に記載されているようにして得られた）中のpToC56の二つの形質転換体並びに形質転換されていないIFO4177及びToC913 をToC913形質転換体と共に増殖させた。発酵ブイヨンの標本を毎日とり、SDS−Page及びウェスタンブロットを適用した。ブロット膜をキモシン特異的ウサギ抗体と共にインキュベートし、次いでペルオキシダーゼに結合したヤギウサギ抗体と共にインキュベートした。膜の着色から、IFO4177の形質転換体からの上清は少量のキモシンまたはその分解産物を発酵の第１日目及び第２日目に含有するが、発酵のその後ではそれらを含有しないことが分かった。 ToC913の形質転換体は少くとも10倍よりも多くの全サイズのキモシンを含有した。上清中のキモシンの量は最初の２〜３日に増加し、次いで一定となった。 IFO4177，ToC913，ToC913中でのpToC56の形質転換体及びIFO4177中での形質転換体の発酵の第３または４日からの上清を等電点電気泳動ゲルに適用し、電気泳動を実施した。pH勾配は3.5〜9.5であった。電気泳動後、ゲルを２mMのZn²⁺を含有するpH=7.0の緩衝液で洗浄し、0.5％のカゼインを含有する寒天を上塗りした。ゲルを45℃でプロテアーゼ活性が見えるようになるまでインキュベートした。 IFO4177からの標本では、プロテアーゼ活性を有する三つのバンドを見ることができ、１つはアルカリ性pIで２つは酸性pIであった。 IFO4177のpToC56からの標本において、かすかなキモシンからの反応が見られ、それは未形質転換IFO4177中に見い出された酸性のバンドの１つと部分的に重なっていたが、最も酸性のpIを有するプロテアーゼはかろうじて見えたが、アルカリ性pIを有するプロテアーゼは、ほぼ中性のpHを有する１またはそれよりも多いバンドと共にはっきりと見えた。 ToC913からの標本では、プロテアーゼ活性は検出されなかったが、ToC913のpT oC56からの標本は強いキモシンのシグナルを示した。この形質転換体からの標本中に、他のプロテアーゼは検出されなかった。例４ToC913 中のヒトトリプシンの生産（Ａ．オリザエIFO4177 areAΔ ）ヒト膵臓トリプシノーゲンＩ（TRYI）をコードするcDNAを標準手順及びM．Emi 他の「遺伝子（Gene）」41：第305〜310頁（デンマーク特許出願693195号参照）に公表された配列を用いて単離した。BamHＩ部位（GGATCC）を開始コドン（ATG( Met)）の上流直後に、短い配列ACCを間に、導入した。 BamHＩ部位を、欧州特許出願第87103806号に記載された真菌発現プラスミド中のTaka−アミラーゼプロモーター中のBamHＩリンカーにcDNAを融合させるのに用いた。cDNAの３’末端を停止コドンの41bp下流、p777中のNrul部位に融合させた。こらはTRYI cDNAをＡ．オリザエTaka−アミラーゼプロモーター及びＡ．ニガーグルコアミラーゼ転写ターミネーターの間に挿入する。生じたプラスミドをpHW470と呼んだ（デンマーク特許出願６９３１９５号参照）。 pHW470をプラスミドpMT1606と共にToC913中に共形質転換した。BASTA耐性形質転換体を分生子柄を通して二回、再単離した。８形質転換体を、YRM〔グルコースを２％のマルトースで置換したYPD（Sherman F.他「Methods in Yeast Geneti cs」Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY（1981年）〕中で30℃で４日間増殖させた。上清をSDS−PAGE、次いでウェスタンブロット及びブタのトリプシンに対して生じたウサギ抗体とのインキュベーションにより、ヒトトリプシンの含有量について分析した。次いで、ブロット膜をペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートし、３−アミノ−９−エチル−カルバゾールと反応させた。３つの形質転換体からの上清は予想されたサイズの着色バンドを含有した。３つの陽性の上清中のトリプシンの濃度は２〜５ mg／Ｉであった。トリプシンの存在を更に上清の標本とＬ−ベンゾイル−アルギノイル−パラニトロアニリド(Ｌ−BAPNA)とのインキュベーションにより実証した。３つの免疫陽性株からの標本は基質を分裂させ、黄色に顕色した。ToC913及び IFO4177からの標本はこの基質に対して何らの活性も示さなかった。このアッセイにおけるヒトトリプシンの特異的活性は未知であるので、これらのデータから上清中のトリプシンの濃度を計算することは不可能である。野生型株IFO4177中のpHW470形質転換体も同様に作った。20より多くのＬ−BAP NA陽性形質転換体が見られたが、これらの形質転換体からの上清中に何らの免疫活性バンドも検出できなかった。このアッセイの検出限界は約0.5mg／ｌであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハイネス，マイケルジェイ. オーストラリア国，ビクトリア 3052，パークビル，ユニバーシティオブメルボルン，デパートメントオブジェネティクス（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．真菌であって、該組換えDNA技術によるareA遺伝子が、機能的なareA活性化因子を供給するようには発現され得ない方法によって修飾された真菌。２．前記不活性化がareA遺伝子のすべてまたは一部の欠失によって得られたものである、請求項１記載の真菌。３．前記不活性化がareA遺伝子自身の発現を調節する発現シグナルの調節を妨げることによって得られたものである、請求項１記載の真菌。４．前記不活性化がアンチセンス技術を用いて得られたものである、請求項１記載の真菌。５．前記不活性化がareA遺伝子中に内部的に余分なDNAを挿入することにより得られたものである、請求項１記載の真菌。６．該真菌が糸状菌、好ましくは、アスペルギルス、トリコデルマ、フミコーラ、カンジダ、アクレモニウム、フサリウム及びペニシリウムを含む群から選択された属に属するものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の真菌。７．真菌が、Ａ．オリザエ、Ａ．ニガー、Ａ．アワモリ、Ａ．ホエニシス、Ａ．ジャポニクス、Ａ．フォエチダス、Ａ．ニドラン、Ｔ．リーセイ、Ｔ．ハルチアヌム、Ｈ．インスレンス、Ｈ．ラヌギノサ、Ｆ．グラミネアルム、Ｆ．ソラニ、Ｐ．クリソゲヌム等を含む群から選択される種に属するものである、請求項６に記載の真菌。８．請求項１に記載の真菌の生産する法であって、前記不活性化がAreA遺伝子の欠失により得られたものであって、該方法はｉ）着目の真菌からのareA遺伝子をクローン化し、 ii）内部の部分が置換もしくは欠失されるか、または余分なDNAが挿入されたa reA遺伝子を含む、DNA構築体を生産し、 iii）該構築体を有する真菌を形質転換し、 iv）areA^-である形質転換体を選択すること含む、生産方法。９．請求項１に記載の真菌の生産方法であって、前記不活性化がアンチセンス技術により得られたものであって、ｉ）areA遺伝子から転写されたmRNAに相補的なRNAの合成を生じさせる発現プラスチドの構築、 ii）前記発現プラスミド及び異なるプラスミドまたは同じプラスミドのいずれかにくっついている適当な標識での宿主真菌の形質転換、 iii）前記標識を用いる形質転換体の選択、及び iv）AreA産物の合成における低下を示す株についての選択された形質転換体のスクリーニングを含む、生産方法。 10．所望の遺伝子産物の生産方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の真菌を適当な条件で適切な増殖培地で培養し、所望の遺伝子産物を回収し、精製することによる方法。 11．所望の遺伝子産物の生産方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載の真菌であって、所望の遺伝子産物をコードするDNA配列を真菌のゲノムに、機能的な仕方で組込まれるように形質転換された真菌を適当な条件で適切な増殖培地で培養し、所望の遺伝子産物を回収し、精製することによる方法。 12．所望のポリペプチドを生産する方法であって、真菌を適当な増殖培地で培養し、前記ポリペプチドを前記培養から回収する方法を含んでなり、前記真菌は前記真菌中に前記ポリペプチドまたはその前駆体の発現を引き起こし得る組換え DNA構築体を担持し、前記真菌はさらに前記真菌の野生型よりも少量の機能的なA reAを生産することにより特徴づけられる、前記方法。 13．請求項12に記載の方法であって、前記真菌のゲノムに組込まれたとき、機能的なAreAの生産の減少を引き起こし得るDNA構築物で、前記真菌の親を形質転換することを含む方法により、前記真菌は野生型よりも少量のAreAを生産するように修飾されている、前記方法。 14．請求項12に記載の方法であって、前記真菌により前記ポリペプチドが細胞外培地に分泌される方法。 15．請求項12に記載の方法であって、前記真菌が同様の真菌よりも多量の前記ポリペプチドを生産し、前記同様の真菌は、野生型の前記真菌により生産される AreAと同様な量のAreAを生産し、前記同様な真菌は前記真菌と他のすべての点で同一である、方法。 16．前記遺伝子産物が分泌されたタンパク質である、請求項10または11〜15記載の方法。 17．請求項10〜16のいずれか１項に記載の方法であって、所望の遺伝子産物が、産業用ペプチドまたはタンパク質、好ましくは酵素である、方法。 18．請求項17に記載の方法であって、前記酵素は、プロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、キモシンを含む群から選択される、方法。 19．請求項10〜116のいずれか１項に記載の方法であって、所望の遺伝子産物が、治療上活性なペプチドまたはタンパク質である、方法。 20．請求項19に記載の方法であって、前記治療上活性なペプチドまたはタンパク質が、インスリン、成長ホルモン、グルカゴン、ソマトスタチン、インターフェロン、PDGF，VII因子、VIII因子、ウロキナーゼ、tPA，EPOまたはTPOを含む群から選択される、方法。 21．10〜20の方法のいずれか１つの方法により生産された遺伝子産物。 22．Ａ．オリザエからのareA遺伝子（配列番号１）またはその機能的な対立遺伝子をコードする、DNA配列。 23．Ａ．オリザエからのAreA活性化因子（配列番号２）。