JPS63501920A

JPS63501920A - ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼ−ション検知用圧電性デバイス

Info

Publication number: JPS63501920A
Application number: JP61505176A
Authority: JP
Inventors: ファウセット、ニュートン・シィ; エバンス、ジェフリー・エイ
Original assignee: ザ・ユニバ−シティ−・オブ・サザン・ミシシッピ
Priority date: 1985-09-26
Filing date: 1986-09-15
Publication date: 1988-08-04
Also published as: EP0239613B1; EP0239613A1; DE3673516D1; AU6404286A; WO1987002066A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーション検知用圧電性デバイス本発明は、一般にポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションを検知するためのシステムに関する。より詳しくは、本発明は圧電性結晶を使用した、ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションを検知するためのシステムに関する。本発明は、特に医療診断、細菌学、ウィルス学、病理学ならびに生化学および分子生物学研究用の用途を有する。例えば、本発明のシステムは、ＤＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションのようなポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションの検知に有用である。

ＤＮＡおよびＲＮＡは、１つの核酸残基の３′位と隣接する核酸残基の５′位との間のリン酸ジエステル結合により特徴付けられた核酸の鎖である。核酸は、次のような１種またはそれ以上の塩基を含むニゲアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）、およびチミン（ＴＸＤＮＡに存在）またはウラシル（ＵＸＲＮＡに存在）。

二重鎖ＤＮＡでは、Ｄ　Ｎ　Ａ鎖のベアリングは相補的である、即ち、一方の鎖のグアニンは、他方の鎖のシトシンと常にベアリングしており（Ｇ−Ｃ）、一方の鎖のアデニンは他方の鎖のチミンと常にベアリングしている（Ａ−Ｔ）ことが知られている。ウラシルがチミンと代わっている（Ａ−Ｕ）以外は、同じことが二重鎖ＲＮ　Ａについて当てはまる。

ポリヌクレオチドの単一の鎖のベアリングは、核酸の相補的塩基間に形成される水素結合により起こる。十分に加熱した場合、ベアリングしたポリヌクレオチドが融解し、即ち、水素結合が切れて二重鎖が個々の鎖に分かれる（変性する）。

ポリヌクレオチド鎖は、相補的塩基間の水素結合を再生することにより、一旦単一鎖に分けられた二重螺旋を再生する傾向がある。

ポリヌクレオチドの相補的鎖と再アニールするＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の能力は、ハイブリダイゼーションによる塩基配列相同性を決定する能力をもたらす。例えば既知の塩基配列を宵するＤＮＡ鎖と異なる供給源からのポリヌクレオチド鎖との間のハイブリダイゼーションの程度は、種の類縁関係の尺度として役立てることができ、とりわけバクテリアおよびウィルスの同定の目的に有用である。

ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションを検知する幾つかの方法が開発されてきた。ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションを検知するそのような方法の１つは、放射線標識を使用している。

他の既知の方法は、再生速度、電子顕微鏡測定および蛍光顕微鏡に関連する蛍光色素で標識を付けたポリヌクレオチドの使用を利用している。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに特有のＩｇＧも使用されている。更に、他の方法は、ビオチン、アミノビオチン、リボ酸およびピリミジンまたはプリン環に共有結合している他の決定因子を含むヌクレオチド誘導体を使用する。

ＤＮＡまたはＲＮＡ類縁関係を検知するために使用される方法は、生化学的に非定型な菌株の同定、あまり研究されていない生物の群の分類、提案されている分類学上の変更の調整または無効化、新規に説明されている生物と現存する分類群との間の関係の決定のような種々の目的および混合培養物の同定のために研究実験室で使用されている。残念ながら、臨床研究におけるこれらの方法の適用は、大部分の目的には実用的でない。例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーション検知に放射線標識を使用する臨床研究において、この方法は、簡便性および迅速性に欠け、高価であり、また潜在的な安全性の問題が宵るので、これらの方法は実用的でないことが判っている。

一般に、本発明はポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションを検知する新規要素および方法を含んで成る。ポリヌクレオチドを圧電性結晶の表面に固定化して、次に、結晶の共振周波数を測定する。

圧電性結晶の共振周波数を測定す４種々の方法を使用できる。次に、適当なハイブリダイゼーション条件下で、調製した結晶を、ポリヌクレオチドの別の供給源にさらす前と後の圧電性結晶の共振周波数の差を測定することによりポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションを検知できる。

物質の圧電性検知圧電気は、誘電性結晶に機械的圧力を加えることにより生じる電気または電気極性である。圧電気の概念は良く知られている。例えば、圧電性結晶は、通信分野において、エレクトロニック・ネットワークの選択フィルター、また周波数制御に温度を正確に測定するセンサーとして使用されている。

ある種の結晶は、圧電効果を示す、即ち、結晶の圧縮が結晶を横切る電圧を発生させる。このような種類の結晶の例には、石英、酒石酸エチレンジアミン、チタン酸バリウム、閃亜鉛鉱などが包含される。結晶の周波数は、その有効物質に依存する。結晶の共振周波数は、振動回路の出力に取り付けｒこ周波数計により得ることができる。例えば結晶表面に物質を添加することにより結晶の有効物質が変化すると、結晶の共振周波数は変化し、それは周波数計により測定できる。結晶の周波数は、結晶に加えられる物質の量に比例して低下する。

圧電性結晶は、通常ＡＴまたはＢＴカット石英プレート（ＡＴおよびＢＴは、結晶構造に対するプレートの向きを言う。）から製造される。ＡＴおよびＢＴカット結晶は主表面に平行な軸の回りで剪断モード（ｓｈｅａｒ　ｍｏｄｅ）において振動し、使用温度において小さいまたは零温度係数を有する。ＡＴカットは、温度係数および物質感度においてＢＴカットより優れている。典型的な９ＭＨｚ結晶は、厚さ約０．１５ｒｒの１０〜１６ｉｚのディスク、正方形または矩形である。９Ｍｌ−１ｚ−ＡＴカット石英結晶は、本発明を実施するのに非常に効果があることが判明した。

結晶の共振周波数を検知するための手段は、種々の方法で提供することができる。一般に、結晶は電極材料間に挟まれ、そのリード線は、振動回路に接続されている。振動回路の出力側に取り付けられた周波数計またはそれに類するものは、結晶の共振周波数を測定するために使用される。

電極材料は、結晶と物理的に接触している必要はない。しかじな　′がら、本発明に使用する圧電性結晶を調製する有効な方法は、対向する結晶表面に電極材料を付着させることである。例えば、典型的な石英結晶では、電極材料は対向する結晶表面の中央部分に付着させることができる。更に、電極材料の帯を結晶表面に付着させて、結晶表面の中央部分に付着させた電極材料から振動回路に接続するためのリード線を取り付けることができる結晶の端へのバスを形成できる。

本発明の実施には、いずれかの適当な電極材料を使用することができる。そのような材料には、金、銀、アルミニウム、ニッケル、クロム、チタンおよびタンタルなどが包含されるが、これらに限定されるものではない。

簡単な振動回路、周波数計数器および真空加熱炉のような器械の使用ならびに超小形電子回路部品の使用は、安価でありまた効果的であるので、経済的に有利である。更に、特に圧電性結晶からの信号は、コンピューターに伝達するために容易にデジタルメーターに表示されるか、またはデジタル信号に変換できる周波数におけるものであるので、本発明は限られた使用訓練を必要とするだけである。

ポリヌクレオチドの圧電性結晶への結合ポリヌクレオチドがハイブリダイゼーションを起こすことは良く知られている。例えば、変性ＤＮＡおよびその相補体は、適当な条件下でハイブリダイゼーションを起こし、再会合して二重鎖ＤＮＡになる。ＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションは、相補体と一緒にインキュベートされた場合にのみ起こる。部分的なハイブリダイゼーションは、関連する種の単一鎖の間で起こり得る。ハイブリダイゼーションの程度は、種の類縁関係の程度に対応する。例えば、約６０％のハイブリダイゼーションは、種間の関係が近いことを示す。

ポリヌクレオチドは圧電性結晶表面に直接に、または結晶表面に旧恩て付着させた材料を介して間接的に化学的に結合できる。この説明の目的に対して、結晶表面は、結晶表面自体または結晶の表面に付着させた１つまたはそれ以上の材料を含む。そのような他の材料は、電極材料またはポリマーのもしくは他の結合材料の薄層、例えば中間分子結合であってよい。例えば、合成ポリヌクレオチドを結晶表面に化学的に結合することができ、その次に、天然のポリヌクレオチドを酵素ライゲーションにより付着させることができる。

より特に、ポリヌクレオチドは、基質、例えばポリマー基質に順に化学的に結合している官能基に化学的に共有結合している異なるポリヌクレオチドに、酵素反応（ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ）によりライゲートすることができる。

特に効果的なポリマー基質は、加水分解に対して安定な、反応性側基により置換された疎水性主鎖により特徴付（Ｊられるようなポリマーである。例えば、そのようなポリマーには、エチレンまたはプロピレンとＮ−（６−ｘ−ヘキシル）− アクリルアミドのコポリマー、スヂＩノンとｐ−Ｘ−メヂルスチレンのコポリマー、アルキル化シロキサンと６−Ｘ−ヘキシルおよびアルキル置換シロキサンのコポリマーならびに類似のポリマーが包含され、ここで、Ｘは、ポリヌクレオチドまたは誘導ポリヌクレオチドと結合できるアミノ、スルフヒドリル、ヨード、ブロモ、クロロ、カルボキシル、ヒドロキシ、クロロカルボニル、ジメチルンリル基および類似の基のような反応基であるか、これらに限定されるものではない。本発明に有用な他のポリマーには、ポリ（ブチルメタクリレート）およびポリウレタンなどが包含されるが、これらに限定されるものではない。

ポリヌクレオチドを固定化する最も鋭敏な部分の１つは、結晶表面の中央部分である。

本発明の１つの態様において、ポリマー溶液（通常５〜１５μｇ）を結晶表面にピペット秤取して、真空下で溶媒を蒸発させる。使用するポリマー溶液およびこれまでの経験に応じて、この段階で結晶を洗浄してよい。洗浄は１種またはそれ以上の溶媒と溶液との組み合わせで行ってよい。典型的な洗浄は、＋００収の蒸留水により行なう。上述のように、電極材料を有して成る結晶表面のその部分にポリヌクレオチドを付着させるのが望ましい。この場合において、ポリマーは、結晶表面のその部分に実質的に適用することができる。

乾燥結晶の共振周波数は、この段階で適宜測定できる。測定を行う場合、連続した洗浄−乾燥サイクル間における共振周波数の変化が±５０Ｈｚ以下になるまで、洗浄、真空下での乾燥および測定を繰り返す必要がある。この段階において安定した周波数（±５０Ｈｚ）を達成するのに必要な洗浄の量は、これまでの経験により示されている。実際、これまでの経験では、この時点においては、洗浄− 乾燥サイクルは必要ではないことが示されている。洗浄サイクルが必要であるかどうかは、使用するポリマーおよび付着方法に大きく依存するであろう。結晶の反対側は、適宜同じ方法で処理してよい。

固定すべきポリヌクレオチドを含む緩衝溶液（通常ホスフェート緩衝液、ｐＨ＝６〜８）を結晶表面にピペット秤取する。この溶液は、ポリヌクレオチドもしくはポリマーまたはその双方と反応して、ポリヌクレオチドとポリマーまたは他の表面材料との間に化学結合を形成する追加の結合剤を含んでよい。ある場合では、ポリヌクレオチドもしくはポリマーまたはこれらの双方と反応できるこれらの試薬は、ポリヌクレオチドを追加する前に結晶表面に適用して、乾燥させてよい。別法では、電磁線を使用して、ポリマーもしくはポリヌクレオチドまたはその双方に前辺て存在する官能基を活性化させ、ポリヌクレオチドと基質との間の化学結合を形成させてよい。

ＤＮＡまたはＲＮＡとの反応後、共振周波数が±５０Ｈｚ以内で安定になるまで、結晶の蒸留水による洗浄および真空下での乾燥を繰り返す。洗浄温度は高くてよいが、加水分解または望ましい結合の破壊を起こすほどであってはならない。

結晶表面に所望のポリヌクレオチドを被覆した後に、結晶の周波数を測定することができる。これは、最初に結晶を洗浄してすべての溶解性および非付着性材料を除き、次に少し加熱して結晶を真空下で乾燥させることにより行う。その後、結晶の共振周波数を測定して記録する。

使用する圧電性結晶、核酸および他のポリマーは比較的安定かつ安価である。調製される圧電性結晶は、−回使用が実施可能なように安価に製造できると考えられる。従って、本発明の明白な利点の１つは、ポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーシぢンの検知に使用する種々のキットを提供できることである。例えば、そのようなキットには、独立した要素、試験結晶、対照結晶、ポリマー、ポリヌクレオチド、結合剤、電子装置またはこれらのいずれかの組み合わせを包含してよい。更に、このキットは、例えばポリマーもしくは他の基質または結合材料のみにより、あるいは付着されたポリヌクレオチドにより所望の程度にまで調製された結晶を包含することができる。

ハイブリダイゼーションの圧電性検知ポリヌクレオチドを含む緩衝水溶液を、上述のように一般的に調製した結晶の表面に付着させる。溶液中のポリヌクレオチドは、単一または二重鎖のいずれであってもよい。溶液および結晶は、二重鎖ポリヌクレオチドが融解して単一鎖になるに十分な温度にまで加熱する。次に、対照ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに最適な所定の値まで温度を下げる。このインキュベーション期間は、含まれるポリヌクレオチドに基づく所定の時間継続させる。この期間は、ポリヌクレオチドの複雑さに応じて数分から数時間まで変わり得る。

１つの態様において、ハイブリダイゼーションは、結晶表面においてポリヌクレオチドの緩衝溶液をインキュベートすることにより行う。典型的には、溶液は、試験するポリヌクレオチドを約１ｍ９／ｘＱで含むが、実質的により低い含量であってよい。典型的なインキュベーション温度は、形成される二重螺旋の融解温度より約３０℃低い。インキュベーション時間は、二重螺旋化されるポリヌクレオチドの複雑性および分子量に応じて数分から数時間まで変化する。有用な温度範囲は、ポリヌクレオチドの融解点以上の加熱およ゛び熱い溶液の結晶への適用が関係する。この場合、温度をインキュベーション温度にまで下げて、その温度で必要な時間保持する。別法では、融解したＤＮＡまたはＲＮＡの溶液を急激に冷却して、即ち、急冷して、相捕的ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の自然な会合を遅らせることが次に、急冷溶液を結晶に適用して、二重螺旋形成に最適な温度でインキュベートする。多くの場合、会合温度を下げる溶媒系を使用することが可能である。例えば、５０％ホルムアミドを使用すると、ホルムアミドを使用しないなら加温が必要である場合であってもより低い温度で有効にインキュベートできる。

典型的には１〜５０μ夕のポリヌクレオチド溶液を結晶の片側または両側に適用する。溶液は、インキュベーションの間、それほど蒸発しないで結晶上で保持される必要がある。これは、例えば結晶の中央部分にシリコーンゴム反応チャンバー（ドーム）を設けることにより行うことができる。反応チャンバーは、中央部分を除去して第２完全隔膜で覆ったシリコーン・ガスクロマトグラフ隔膜から作ることができる。別法では、圧電性結晶を収容するように特別に製造された反応チャンバーを使用することができる。

インキュベーション期間に続いて、結晶を洗浄して溶解性および非付着性材料を除いて真空下で乾燥させる。適用した溶液が対照ポリヌクレオチドの相補体であるポリヌクレオチドを含有するなら、結晶表面上のポリヌクレオチドの量は増加している。一般に、対照ポリヌクレオチドは、試験ポリヌクレオチドによるインキュベーションより前に結晶表面に固定化する。しかしながら、この順を逆にする、即ち、結晶表面に試験ポリヌクレオチドを固定化して、その次に対照ポリヌク１ノオヂドにより結晶をインキュベートすることも可能である。

このシステムは、ハイブリダイゼーションの定量的および定性的検知の双方を提供することができる。ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより生じる物質の増加量は、一般に周波数計により測定される。ハイブリダイゼーションの程度は、インキュベーション工程の前後の共振周波数の差から評価される。例えば、９　Ｍ　ＨＺ結晶基準で、約０．８Ｈｚのシフトは質ｆｆｉ　ｌ　ｎｙ（ナノグラム）の変化に対応する。検地感度は、結晶の基本周波数の関数である。結晶のより高い基本周波数は感度の増加に対応し、一方、より低い基本周波数は逆の結果となる。

更に、このシステＪ１は、特に迅速かつ正確であり、更に経済的に得られる結果が必要である臨床研究において、既知の方法より多くの利点を提供すると考えられる。本発明は、圧電性物質検知の基本的な容易性故、より迅速な結果を提供し、混合バクテリアまたはウィルス培養物に適用できるが、ハイブリダイゼーションを使用しないバクテリアおよびウィルスを同定する方法では純粋培養物（非混合）を得る必要かある。更に、本発明は、かっての病原体同定法に優る利点を提供する。かっての方法は、突然変異した種を正確に同定することができない表現型の観測に基づいており、このような種は、ハイブリダイゼーション法により検知することができる。更に、蛍光測定法に使用されるような突然変異誘発性色素および放射線測定法に使用されるような３２Ｐまたは同様な危険な同位体を避けることができる。

他の診断用途も、本発明の範囲であると考えられる。例えば、本発明は、核酸含有病因物質の存在を診断し、抗生物質に対する抵抗の存在を測定するためにバクテリアを試験し、遺伝的不規則性を検知し、腫よう細胞を診断する病理学的原因物質を含む核酸の存在を診断するために、ならびにポリヌクレオチド・ハイブリダイゼーションを使用する他の同様な方法に有用であると考えられる。

以下の実施例は、本発明をより完全に説明するために記載しており、いずれにせよ本発明の範囲を限定するように解釈されるものではない。これらの実施例は、ポリヌクレオチドの結晶への固定化、その後のハイブリダイゼーションおよびその圧電性共振によるハイブリダイゼーションの検知を説明している。従って、この方法は、列挙したＤＮＡまたはＲＮＡだけに限定されるものではない。

実施例以下の実施例に使用されている手順は、上述の一般的な手順を説明するものである。手順は、２つの別々の結晶について平行して行い、その一方を対照とした。

ハイブリダイゼーション時に得られる周波数シフトは対照に対して相対的に表現している。

それほどハイブリダイゼーションが起こらないように対照の条件を調節した以外は、試験試料と同じ方法で対照を処理した。

結果は、次のように表現している： ΔＨｚ＝（Ｈｚ・輔′・）対照−（Ｈｚ・−Ｈ′・）試験試料式中：Ｈｚｔ−調製結晶の共振周波数、およびＨ２３−インキュベーション期間後の結晶の共振周波数。

一般にΔＨｚがマイナス数百ヘルツからマイナス数千ヘルツの値を有する場合に、ハイブリダイゼーションが示される。ΔＨｚの再現性は、ポリヌクレオチドの固定化ならびにその後のハイブリダイゼーション条件および反応の再現性のような種々の要因に依存する。

圧電性共振によるＲ　Ｎ　Ａハイブリダイゼーションの検知ポリイノシン酸（ポリＩ）とポリシチジル酸（ポリＣ）との間でハイブリダイゼーションが起こり、二重鎖合成ポリマー（ポリＩ：Ｃ）が生成することがよく知られている。しかしながら、ポリウリジル酸（ポリＵ）とポリイノシン酸（ポリＩ）との間ではハイブリダイゼーションが起こらない。以下の実施例１〜３は、結晶表面上で起こり得る以下のようにして、ポリ（ブチルメタクリレート）基質に付着させたポリイノシン酸とポリジデシル酸をハイブリダイゼーションさせた：ポリ（ブチルメタクリレート）（酢酸エチル中、０．１％）ｌＯμＱを結晶の両側に適用して乾燥させた。トリアシトトリニトロベンゼン結合剤（クロロホルム中、０．１％）１０μＱを結晶の両側に適用した。

緩衝液Ａ（０，１４Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，８）中のポリ■、Ｉｍｙ／ｍＱの５μＱをポリマー被覆結晶の両側に適用し、３００ｎｍで３０分間両側を放射線照射した。緩衝液Ａ中のポリＣ，ｌＨ／ｒｔｒ（ｌの５μａをハイブリダイゼーションのために適用した。ハイブリダイゼーションは、ガラスドーム下で４６℃で２５分間行った。

対照結晶は、ポリイノシン酸を使用せずに同じ手順で行った。

第１結果：　ΔＨｚ＝−６１３（対照に対して）第２結果：　ΔＨｚ＝−６８６（対照に対して）実施例２以下のようにして、ポリウレタン基質に付着させたポリイノシン酸とポリシチジル酸をハイブリダイゼーションさせた：ポリウレタン（ジメチルホルムアミド中、０．２％）５μＱを結晶の両側に適用して乾燥させた。２，６−ビス（４−アジドベンジリデン）−シクロヘキサノン結合剤（アセトン中、０．１％）５μρ を結晶の両側に適用した。緩衝液Ｂ（０，１０Ｍナトリウム、０．０１Ｍホスフェート、りＨ７，８）中のポリ！、５ｖｉ／ｍＱの５μＱをポリマー被覆結晶の両側に適用し、３３０ｎｍで３０分間両側を放射線照射した。緩衝液Ｂ中のポリＣ，２，ＯＸ１０−３Ｍ（０，６５靜／２ｇ）の５μＱをハイブリダイゼーションのために結晶の両側に適用した。結晶は、ポリＣと共に６５℃で３０分間加熱し、ハイブリダイゼーションは、シリコーンゴムドームを使用して室温で２時間行った。

結果：　ΔＨｚ＝−１２３７（対照に対して）実施例３以下のようにして、シクロヘキセン反応性部位マスクを有するポリウレタン基質に付着させたポリイノシン酸とポリシチジル酸をハイブリダイゼーションさせた：ポリウレタン（ジメチルホルムアミド中、０．２％）１０μＱを結晶の両側に適用して乾燥させた。次に、２，６−ビス（４−アジドベンジリデン）−シクロヘキサノン結合剤（アセトン中、０．２％）１０μＱを結晶の両側に適用した。緩衝液Ｂ（０，１０Ｍナトリウム、０．１Ｍホスフェート、ｐＨ７，８）中のポリエ、２．Ｏｘ　１０−３Ｍ（０，７０Ｒ９／ｘＱ）の５μｇをポリマー被覆結晶の両側に適用し、３６６ｎｍで０．５時間放射線照射した。シクロヘキセンｌＯ μｇを結晶の両側に適用し、３６６ｒ＋ｍで１０分間両側を放射線照射した。緩衝液Ｂ中のポ’）　Ｃ，２、Ｏｘ　１０−’Ｍ（０，６５ｉ９／ｘＱ）ノ５　ｔｔＱをハイブリダイゼーションのために結晶の両側に適用した。結晶は、ポリＣと共に６０℃で３０分間加熱し、次に、ハイブリダイゼーションのために室温で２時間インキュベートした。

ポリシチジル酸の代わりに２．Ｏｘ　１０−３Ｍポリウリジル酸（０，６５１１９／πｆ２）５μＱを使用した以外は、対照結晶に対して同じ手順を行った。

結果：　八Ｈｚ＝−２２７Ｈｚ（対照に対して）対照（Ｈ２Ｓ　Ｈｚｔ）は＋１８Ｈｚであり、結晶に固定化されたポリイノシン酸と溶液中に存在するポリウリジル酸との間で明白なハイブリダイゼーションが起こっていないことを示している。このことは、ポリＵに対してではなく、ポリＣに対するハイブリダイゼーションに対するポリイノシン酸の既知の特異性と一致している。

以下のようにして、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓ　ａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ；以下、ネズミチフス菌と称す。）ＤＮＡを、ポリ（ブチルメタクリレート）基質に付着させたネズミチフス菌Ｄ　Ｎ　Ａにハイブリダイゼーションさせた：ポリ（ブチルメタクリレート）（酢酸エチル中、０．１％）ニジメトキシフェニルアセトフェノン（アセトン中、０．１％）が１００：１（体積／体積）の溶液１０μＱを結晶に適用した。緩衝液Ａ（０，１４Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ６，８）中の（沸騰させた後に４℃で急冷して変性した）ネズミチフス菌Ｄ　Ｎ　Ａ　％　１１９７　ＲＱのｌＯμｇを結晶の片側に適用して、３６５ｎｍで２時間放射線照射した。結晶は、蒸留水で濯いで乾燥させた。以下の結果ｌの場合において、変性ネズミチフス菌ＤＮＡｌ０μｇを追加して、上述のように放射線照射した。ハイブリダイゼーションは、（１００℃で加熱して、その後６５℃に冷却した）融解ネズミチフス菌ＤＮＡ、ｌｘ９／ｒｘ（ｌのｌＯμＱで行った。

インキュベージジンはシリコーンゴム・ドームを使用して６５℃で２時間行った。

対照結晶に関しては、ハイブリダイゼーション工程の間に融解ネズミチフス菌ＤＮＡの代わりに融解カーフ・サイマス（ｃａｌｆ　ｔｈｙｍｕｓ）ＤＮＡ、０．４ｘ９／ｘ（ｌの２０μＱでインキュベートした以外は同じ手順を行った。

第１結果：　ΔＨｚ＝−７７９（対照に対して）第２結果：　ΔＨｚ＝−１０１３（対照に対して）実施例５以下のようにして、ポリ（ブチルメタクリレート）基質に付着させたネズミチフス菌ＤＮＡにネズミチフス菌ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせた。

ポリ（ブチルメタクリレート）（酢酸エチル中、０．１％）ニジメトキシフェニルアセトフェノン（アセトン中、０．１％）が１００：１（体積／体積）の溶液ｌＯμｇを結晶に適用した。次に、結晶を上記組成のポリ（ブチルメタクリレート）ニジメトキシフェニルアセトフェノン溶液に浸漬した。緩衝液Ａ（０，１４Ｍリン酸ナトリウム、ＰＨ６，８）中の（沸騰させた後に４℃で急冷して変性させた）ネズミチフス菌ＤＮＡ、１巧／ｘ（ｌの１０μρを結晶の片側に適用して、３６５ｎｍで２時間放射線照射した。ハイブリダイゼーションは、（１００℃ で加熱して、その後６５℃に冷却した）融解ネズミチフス菌ＤＮＡ、１ｍ９／＋＋（ｌのｌＯμｇにより行ない、シリコーンゴム・ドームを使用して６５℃で２時間インキュベートした。

対照結晶に対して、変性ネズミチフス菌ＤＮＡの代わりに、変性カーフ・サイマスＤＮＡ（１衝液Ａ中、０　、４１１ｇ／πＱを２５μのを固定化に使用した以外は、同じ手順を行った。

結果：　ΔＩ−（ｚ−−８３３（対照に対して）実施例６以下のようにして、ネズミチフス菌Ｄ　Ｎ　Ａを、ポリ（ブチルメタクリレート）に付着させた単一鎖Ｍ１３ウィルスＤＮＡに挿入されたエンドヌクレアーゼ被制限ネズミチフス菌ＤＮＡにハイブリダイゼーションさせた。

ポリ（ブチルメタクリレート）（酢酸エチル中、０．１％）ニジメトキシフェニルアセトフェノン（アセトン中、０．１％）がｔｏｏ：１（体積／体積）の溶液５μｇを結晶に適用した。緩衝液Ｂ（０，１０Ｍナトリウム、０．１０Ｍホスフェート、ｐＨ７−８）中のサルモネラＤＮ、Ａ挿入単一鎖Ｍ１３＋ｎｐ８、Ｉη ／ｊ１ｇのｌＯμＱをポリマー゛被゛覆結晶に適用して、３６５ｎｍで２時間放射線照射した。１　ｚｇｌｘＱ・のブレンダー剪断（４分間）融解ネズミチフス菌Ｄ　Ｎ　Ａを適用して、ハイブリダイゼーションをシリコーンゴム・ドームを使用して６５°Ｃで２時間行つ　ノニ。

対照ｌ：ネズミチフス菌ＤＮＡの代わりに、ｌπ９／酎のブレンダー剪断融解カーフ・サイマスＤＮＡ１０７１Ｑをハイブリダイゼーション工程に使用した以外は、同じ手順を結晶に行った。

対照２：サルモネラＤＮＡ挿入Ｍ１３ｍｐ８ＤＮＡの代わりに緩衝液Ｂを使用して、ネズミチフス菌ＤＮＡの代わりに、ｌｘｇ／ｘＱのブレンダー剪断融解カーフ・サイマスＤ　Ｎ　Ａ　１０μｅをハイブリダイゼーション工程に使用した以外は、同じ手順を結晶に行った。

結果＝　ΔＨｚ＝−５５７（対照ｌに対して）ΔＨｚ＝−８７５（対照２に対して）国際調査報告、、Ｊ、１゜ッ、２１ゆ、。Ｐ口ｌυＳ　’１６１０’＋３６”ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　’ｔＦＥＥ　ＩＮＴＥＲ−’１ＡＴＩｃＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥ？ＣＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　Ａ？ＭＪＣＡＴＩＣＮ　Ｎｏ、　ＰＣτ／ＵＳ　８６１０ユ８６１　（ＳＡ　１４６９６）丁ｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａ′＋ｅｎｔ　０５ｆｉｃｅ　ｉｓ　ｉｎ　ｎｏ　ｖａｙ　１ｉａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅｓｅｐａｒｔｉｃｕｌａｒｓ　ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　ｍｅｒｅｌｙ　ｇｉｖｅｎ　Ｅｏｒ　”ｓｈｅ　ｐｕｒｐｏｓａ　ｏＥｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ。

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）圧電性結晶、および（ｂ）該結晶の表面上に固定化されたポリヌクレオチドを有して成るポリヌクレオチド・ハイプリダイゼーションの検知に使用する要素。
２．該結晶の共振周波数を測定する手段を更に有して成る請求の範囲第１項記載の要素。
３．該結晶の共振周波数を測定する該手段が、該結晶の対向表面の少なくとも一部分に付著されている電極材料を含む請求の範囲第２項記載の要素。
４．該ポリヌクレオチドの実質的部分が、該電極材料を有して成る該結晶表面の一部分に固定化されている請求の範囲第３項記載の要素。
５．該ポリヌクレオチドが固定化されている該結晶表面が、該結晶とポリヌクレオチド層との間にあるポリマ−基質を更に有して成る請求の範囲第１項または第４項記載の要素。
６．該ポリヌクレオチドと該ポリヌクレオチドを固定化すべき該表面との間に結合剤を組み込むことにより、該結晶表面に該ポリヌクレオチドを固定化する請求の範囲第１項または第４項記載の要素。
７．ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼを異なるポリヌクレオチドに使用して該ポリヌクレオチドを酵素でリゲートすることにより該結晶表面にポリヌクレオチドを固定化して、該結晶表面に順に化学的に結合される官能基に該異なるポリヌクレオチドを化学的に共有結合する請求の範囲第１項または第４項記載の要素。
８．該ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡである請求の範囲第１項記載の要素。
９．該電極材料が、金、銀、アルミニウム、ニッケル、クロム、チタン、タンタルから選択される請求の範囲第３項記載の要素。
１０．該ポリマ−基質が、加水分解に対して安定であり、反応性側基で置換された疎水性主鎖により特徴付けられるポリマーの種類から選択される請求の範囲第５項記載の要素。
１１．該ポリマーが、スチレンとｐ−ｘ−メチルスチレン、エチレンまたはプロピレンとＮ−（６−ｘ−ヘキシル）−アクリルアミド、アルキル化シロキサンと６−ｘ−ヘキシルおよびアルキル置換シロキサンのコポリマ−（ｘは、ポリヌクレオチドまたは誘導ポリヌクレオチドと結合できる反応基である。）から選択される請求の範囲第１０項記載の要素。
１２．該ポリマ−基質が、合成ポリヌクレオチドを含んで成る請求の範囲第５項記載の要素。
１３．該ポリマ−基質が、ポリ（ブチルメタクリレート）、ポリウレタンから選択されたポリマーを含んで成る請求の範囲第５項記載の要素。
１４．該結合剤が、アジド基の存在により特徴付けられる有機化合物である請求の範囲第６項記載の要素。
１５．該結合剤が、２，６−ビス（４−アジドベンジリデン）−シクロヘキサノン、トリアジドトリニトロベンゼンから選択される請求の範囲第１４項記載の要素。
１６．圧電性結晶、付着されたある種のポリヌクレオチドを有する該結晶の表面を有して成り、該結晶は該結晶の共振周波数を測定するための手段と電気的に協同する、該ある種のポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチドとの間の類縁関係を検知するデバイス。
１７．（ａ）圧電性結晶、（ｂ）該結晶の表面に付着されたポリヌクレオチド、および（ｃ）該結晶の共振周波数を測定する手段を有して成るポリヌクレオチド・ハイプリダイゼーションを検知するデバイス。
１８．該ポリヌクレオチドの実質的部分が付着されている該表面が、該結晶の少なくとも一部分に付着されている電極材料を有して成る請求の範囲第１７項記載のデバイス。
１９．該ポリヌクレオチドの実質的部分が付着されている該表面が、該結晶の少なくとも一部分に被覆されているポリマーを有して成る請求の範囲第１７項記載のデバイス。
２０．該結晶が石英結晶である請求の範囲第１７項記載のデバイス。
２１．該電極材料が、金、銀、クロム、ニッケル、アルミニウム、チタン、タンタルから選択される請求の範囲第１８項記載のデバイス。
２２．該ポリヌクレオチドが結合剤により該表面に付着されている請求の範囲第１７項記載のデバイス。
２３．該ポリマーが、加水分解に対して安定であり、反応性側基で置換された疎水性主鎖により特徴付けられるポリマーの種類から選択される請求の範囲第１９項記載のデバイス。
２４．該ポリマーが、スチレンとｐ−ｘ−メチルスチレン、エチレンまたはプロピレンとＮ−（６−ｘ−ヘキシル）−アクリルアミド、アルキル化シロキサンと６−ｘ−ヘキシルおよびアルキル置換シロキサンのコポリマー（ここで、ｘはポリヌクレオチドまたは誘導ポリヌクレオチドと結合できる反応基である。）から選択される請求の範囲第２３項記載のデバイス。
２５．該ポリマーがポリ（ブチルメタクリレート）、ポリウレタンから成る群から選択される請求の範囲第１９項記載のデバイス。
２６．該ポリマーが、合成ポリヌクレオチドである請求の範囲第１９項記載のデバイス。
２７．該結合剤が、アジド基の存在により特徴付けられる有機化合物から成る群から選択される請求の範囲第２２項記載のデバイス。
２８．第１ポリヌクレオチドと第２ポリヌクレオチドとの間のポリヌクレオチド・ハイプリダイゼーションを検知する方法であって、（ａ）第１ポリヌクレオチドが圧電性結晶の表面に付着されている該結晶の第１共振周波数を検知する工程、（ｂ）該第１ポリヌクレオチドと該第２ポリヌクレオチドとの間でハイブリダイゼーシヨンが起こるに十分か時間および適当な条件下で、該付着第１ポリヌクレオチドを第２ポリヌクレオチドの別の供給源にさらす工程、（ｃ）該ハイプリダイゼーション工程の後に該結晶の第２共振周波数を検知する工程、ならびに（ｄ）該第１共振周波数と該第２共振周波数を比較する工程を含んで成る方法。