JPS6354399A - 脂質単分子膜を用いた抗体タンパクの固定化方法 - Google Patents
脂質単分子膜を用いた抗体タンパクの固定化方法Info
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- JPS6354399A JPS6354399A JP19722086A JP19722086A JPS6354399A JP S6354399 A JPS6354399 A JP S6354399A JP 19722086 A JP19722086 A JP 19722086A JP 19722086 A JP19722086 A JP 19722086A JP S6354399 A JPS6354399 A JP S6354399A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〈産業上の利用分野〉
本発明は抗体タンパクを固定化する方法に関する。更に
詳しくは、水溶性抗体タンパクを、その・ 抗原−抗体
反応活性を完全に保持しながら固体基板−りに該タンパ
クを高密度に固定化する方法に関ｌる。
詳しくは、水溶性抗体タンパクを、その・ 抗原−抗体
反応活性を完全に保持しながら固体基板−りに該タンパ
クを高密度に固定化する方法に関ｌる。
く背景及び従来技術〉
抗体タンパクの抗原−抗体反応を利用した診断技術に於
て、抗体タンパクを固体基板上に固定化する方法がこれ
まで数多く提案されてきた。これらの内、あるものは、
抗体タンパクのアミノ基又はカルボキシル基と反応又は
吸着結合できる官能基を右する固体表面に固定化するも
のであるが、この場合、固定化のための反応条件の設定
によっては、抗体タンパクの変性や、非特異的反応によ
る活性部位の失活が起りやすいという問題点があった。
て、抗体タンパクを固体基板上に固定化する方法がこれ
まで数多く提案されてきた。これらの内、あるものは、
抗体タンパクのアミノ基又はカルボキシル基と反応又は
吸着結合できる官能基を右する固体表面に固定化するも
のであるが、この場合、固定化のための反応条件の設定
によっては、抗体タンパクの変性や、非特異的反応によ
る活性部位の失活が起りやすいという問題点があった。
また、親水性ゲルの中に抗体タンパクを抱き込ませて、
固体基板上に固定化する方法も可能性のある方法である
が、この場合、抗原タンパクがゲル中の抗体タンパクに
接近て“き難くなり、抗原−抗体反応を利用した診断材
料としての感度低下を招き易い。こうした方法に対して
近年、水面上に脂質膜を展開し、これに水中から水溶性
酵素（例、カタラーゼ、フェリチン、ヘミグロビン。
固体基板上に固定化する方法も可能性のある方法である
が、この場合、抗原タンパクがゲル中の抗体タンパクに
接近て“き難くなり、抗原−抗体反応を利用した診断材
料としての感度低下を招き易い。こうした方法に対して
近年、水面上に脂質膜を展開し、これに水中から水溶性
酵素（例、カタラーゼ、フェリチン、ヘミグロビン。
グルコースオキシダーゼ、ｅｔｃ、）や抗体タンパク［
免疫グ［１プリンＧ （ＨＵＧ）、 ＩｇＥ、 ｅｔｃ
］を吸着固電化づ−る試みか報告されている（バイオキ
ミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（８ｉｏｃｈｅｍ
、 Ｂｉｏ−ｐｔ）ｙｓ、 Ａｅｔａ、） ２２５ｆｆ
、 ３８２ （１９７１）やジャーナル・オブ・セルラ
〜 ・バイオケミス］〜リー （Ｊ、 Ｃｅ１ｌ。
免疫グ［１プリンＧ （ＨＵＧ）、 ＩｇＥ、 ｅｔｃ
］を吸着固電化づ−る試みか報告されている（バイオキ
ミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（８ｉｏｃｈｅｍ
、 Ｂｉｏ−ｐｔ）ｙｓ、 Ａｅｔａ、） ２２５ｆｆ
、 ３８２ （１９７１）やジャーナル・オブ・セルラ
〜 ・バイオケミス］〜リー （Ｊ、 Ｃｅ１ｌ。
Ｂｉｏｃｔ＋ｅｍ、） ２９．２３９ （１９８５）等
参照］。
参照］。
これらは確か（こタンパクを、その活性を保持したまま
固定化する優れた方法であるが、この方法に於て従来用
いられてきた脂質膜は、ステアリン酸、アラキン酸及び
ジパルミトイルホスファデジルコリン（Ｄ Ｐ Ｐ Ｃ
＞等の如く、水に対して可溶ｔ４． （少くとも、１μ
ｇ／ＩＪ２水の溶解度）のもの、又は水中で二分子膜ベ
シクルを形成しやすいもの（ＤＰＰＣ等）であった。従
って、水面上で該膜に吸着された抗体タンパクは、時間
が経つにつれ、脂質膜と共に再び水中に再溶解したり、
−旦固体Ｍ板上に累積した後でも抗原水溶液に浸漬した
際、脱ｗｉｔノやすいという問題点を有していた。
固定化する優れた方法であるが、この方法に於て従来用
いられてきた脂質膜は、ステアリン酸、アラキン酸及び
ジパルミトイルホスファデジルコリン（Ｄ Ｐ Ｐ Ｃ
＞等の如く、水に対して可溶ｔ４． （少くとも、１μ
ｇ／ＩＪ２水の溶解度）のもの、又は水中で二分子膜ベ
シクルを形成しやすいもの（ＤＰＰＣ等）であった。従
って、水面上で該膜に吸着された抗体タンパクは、時間
が経つにつれ、脂質膜と共に再び水中に再溶解したり、
−旦固体Ｍ板上に累積した後でも抗原水溶液に浸漬した
際、脱ｗｉｔノやすいという問題点を有していた。
〈発明の目的〉
本発明者らは、かかる従来技術の欠点を克服し、高い抗
原−抗体反応活性の保持率と、高密度な抗体タンパクの
固定化を可能に１べく鋭意検８４のＩＩ！ｉ果、本発明
に到達したしのである。
原−抗体反応活性の保持率と、高密度な抗体タンパクの
固定化を可能に１べく鋭意検８４のＩＩ！ｉ果、本発明
に到達したしのである。
〈発明の開示〉
すなわら本発明は、水相面１、に展開された炭素原子数
２４〜３２の長鎖脂肪酸、その多価金属塩及び／又はそ
のエステルの単分子膜に当該水相中に溶解した水溶性抗
体タンパクを接触させることにより当該水相界面で抗体
タンパク−単分子膜複合体を形成させ、それを固体基板
上に積層することを特徴と覆る脂質中分子膜を用いた抗
体タンパクの固定化方法である。
２４〜３２の長鎖脂肪酸、その多価金属塩及び／又はそ
のエステルの単分子膜に当該水相中に溶解した水溶性抗
体タンパクを接触させることにより当該水相界面で抗体
タンパク−単分子膜複合体を形成させ、それを固体基板
上に積層することを特徴と覆る脂質中分子膜を用いた抗
体タンパクの固定化方法である。
本発明でいう抗体タンパクとは、抗原−抗体反応を起ｌ
ノうる水溶性タンパクの総称であり、その分子中に抗原
認識部位（Ｆａｂと略）と疎水性末端部位（ＦＣと１１
８）を心している。
ノうる水溶性タンパクの総称であり、その分子中に抗原
認識部位（Ｆａｂと略）と疎水性末端部位（ＦＣと１１
８）を心している。
かかる抗体タンパクの具体例としては、免疫グロブリン
Ｇ（ＩｇＧと略称） 、 ■ｇＥ 、 ＩｇＨ及びこれ
らの抗体、絨毛性性腺刺激ホル−［ン（）−Ｉ ＣＧ
＞抗体、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体等があげられる
。
Ｇ（ＩｇＧと略称） 、 ■ｇＥ 、 ＩｇＨ及びこれ
らの抗体、絨毛性性腺刺激ホル−［ン（）−Ｉ ＣＧ
＞抗体、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体等があげられる
。
これらの抗体タンパクの固定化にあたっては、Ｆａｂ部
分を変性しないようにすることが肝要であるが、萌述の
如〈従来の化学反応による固定化の場合Ｆａｂ部分も反
応に関与して抗体タンパクの活性低下を招いていた。本
発明においては抗体タンパクは、後述の脂質単分子膜中
にＦＣ部位で疎水的に相Ｕ作用しながら高密度にくみ込
まれるか、イイン的相互作用により免疫活性を高く保持
したまま単分子膜に吸着固定される。
分を変性しないようにすることが肝要であるが、萌述の
如〈従来の化学反応による固定化の場合Ｆａｂ部分も反
応に関与して抗体タンパクの活性低下を招いていた。本
発明においては抗体タンパクは、後述の脂質単分子膜中
にＦＣ部位で疎水的に相Ｕ作用しながら高密度にくみ込
まれるか、イイン的相互作用により免疫活性を高く保持
したまま単分子膜に吸着固定される。
上記の抗体タンパクを固定化するための脂質単分子膜と
しては、水面上で固体上の凝縮単分子膜を形成し、水に
実質的に溶解しないものが好ましい。そのようなものの
具体例としては、炭素原子数２４〜３２の長鎖脂肪酸、
その多価金属塩及び／又はその上スプルが用いられる。
しては、水面上で固体上の凝縮単分子膜を形成し、水に
実質的に溶解しないものが好ましい。そのようなものの
具体例としては、炭素原子数２４〜３２の長鎖脂肪酸、
その多価金属塩及び／又はその上スプルが用いられる。
このような性質を有する化合物としては、リグノセリン
酸（Ｃ２３Ｈ４７ＣＯＯＨ）、セロチン酸（Ｃ２５Ｈ５
１ＣＯＯＨ）。
酸（Ｃ２３Ｈ４７ＣＯＯＨ）、セロチン酸（Ｃ２５Ｈ５
１ＣＯＯＨ）。
モンタン酸（Ｃ２□ｌ−！５５Ｇｏｏｆ−１＞、メリシ
ン酸（Ｃ２９）−１５９ＣＯＯＩ−１＞ 、ラクセロン
酸（Ｃ３１Ｈ６３ＣＯＯＨ） 及びＣ口 ト１２ｎ＋Ｉ
Ｃ００Ｍ （ｎ ＝２３〜３１、Ｍ−アルカリ
土類金属、カドミウム、アルミニウム等の多価金属イオ
ン）で表わされる長鎖脂肪酸の多価金属塩及びそれら脂
肪酸のメタノール又はエタノールとのエステルである。
ン酸（Ｃ２９）−１５９ＣＯＯＩ−１＞ 、ラクセロン
酸（Ｃ３１Ｈ６３ＣＯＯＨ） 及びＣ口 ト１２ｎ＋Ｉ
Ｃ００Ｍ （ｎ ＝２３〜３１、Ｍ−アルカリ
土類金属、カドミウム、アルミニウム等の多価金属イオ
ン）で表わされる長鎖脂肪酸の多価金属塩及びそれら脂
肪酸のメタノール又はエタノールとのエステルである。
これらは例えばカルボン酸又はそのエステルの状態で
ベンじンやクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、０．
５〜１．５ミリモル／１の溶液となしたのら、これを蒸
溜水又は多価金属塩（例えば、塩化バリウム、塩化カド
ミウム、塩化アルミニウム）を含む、ｐｔ１６．５〜７
．５の水溶液表面上に展開することにより、単分子膜と
なしうる。次いで、該単分子膜を、その表面ルノＪか１
〜３０ｍＮ （ミリＮ）／ｍになるように圧縮したのら
、そのままの圧縮条ｆ↑で膜面下の水相に前記の抗体タ
ンパクを注入する。所定時間（通常、３０分〜１時間）
、該抗体タンパクと水面上の単分子膜とを接触させてお
くことにより、タンパクと該単分子膜との複合化が完了
する。この時点で抗体タンパクと単分子膜との複合体膜
を、表面圧力３０〜５０ミリＮ／ｍにて再び圧縮したの
ら、固体基板上にラングミュア・ブロジエツ１〜法又は
水平付着法（詳１１１１は新実験化学講Ｐト第１８巻第
４３９頁参照）により一苦又は複数層積層することがで
きる。
ベンじンやクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、０．
５〜１．５ミリモル／１の溶液となしたのら、これを蒸
溜水又は多価金属塩（例えば、塩化バリウム、塩化カド
ミウム、塩化アルミニウム）を含む、ｐｔ１６．５〜７
．５の水溶液表面上に展開することにより、単分子膜と
なしうる。次いで、該単分子膜を、その表面ルノＪか１
〜３０ｍＮ （ミリＮ）／ｍになるように圧縮したのら
、そのままの圧縮条ｆ↑で膜面下の水相に前記の抗体タ
ンパクを注入する。所定時間（通常、３０分〜１時間）
、該抗体タンパクと水面上の単分子膜とを接触させてお
くことにより、タンパクと該単分子膜との複合化が完了
する。この時点で抗体タンパクと単分子膜との複合体膜
を、表面圧力３０〜５０ミリＮ／ｍにて再び圧縮したの
ら、固体基板上にラングミュア・ブロジエツ１〜法又は
水平付着法（詳１１１１は新実験化学講Ｐト第１８巻第
４３９頁参照）により一苦又は複数層積層することがで
きる。
その際の抗体タンパクの固体基板上への固定化量は、積
層時の水面展開膜の基板への転移比及びＬＪ Ｖ−−吸
収スペクトル強度より算出される。
層時の水面展開膜の基板への転移比及びＬＪ Ｖ−−吸
収スペクトル強度より算出される。
かくして（■られた基板上の複合体は、抗体タンパクの
抗卯−抗体反応活性を酵素免疫診断法（ＥＩＡ）により
求めた結束、１ぐれた活性を示づものであった。
抗卯−抗体反応活性を酵素免疫診断法（ＥＩＡ）により
求めた結束、１ぐれた活性を示づものであった。
以下、実施例により本発明を更に詳しく説明する。
実施例１
リグノセリンＷ （Ｃ２３Ｈ４７ＣＯｉ４１ ） ８
ｍ（Ｊを２５ｍ１の蒸ｄ１り［Ｊ口車ルムに溶解し蒸溜
水を張った。π−△測定用水槽上に上記溶液１００μｌ
を徐々に滴下した。滴下終了後、水面展間膜を５分間静
置した後人面圧２０ｍＮ／ｍになるまで仕切板を移動し
た。
ｍ（Ｊを２５ｍ１の蒸ｄ１り［Ｊ口車ルムに溶解し蒸溜
水を張った。π−△測定用水槽上に上記溶液１００μｌ
を徐々に滴下した。滴下終了後、水面展間膜を５分間静
置した後人面圧２０ｍＮ／ｍになるまで仕切板を移動し
た。
ヒｔ−ＩｇＧ水溶液を水槽中濃度０．０３ｍＭ ｒｎｌ
になるように水中から注入した後１時間静置した。この
水面ＦＩ＝ （Ｍ膜を、３０ｍＮ／ｍの表面ＬＦ下で圧
縮しながら、疎水化処理（シランカップリング処理）を
施した石英板上に垂直浸漬用−１，げ法（以下、ｌ−Ｂ
法と称覆−）により２層累積しノた処、平均累積比は０
．７であった。紫外吸収スペクトルから求めた石英板上
に累積したヒｈ Ｉ（ＩＧの被覆率は１．６ Ｘｌ０−
［１ｍｏｌ ／尻であった。この累積膜にベルオキシタ
ーゼ標識抗ヒ１〜ＩｇＧ抗体（２０μｍ／ｄ）液を作用
させた後、オルトフェニレンジアミン、過酸化水素混合
溶液中に浸漬して累積膜中の抗原活性を調べた処、活性
を保持していることがわかった。
になるように水中から注入した後１時間静置した。この
水面ＦＩ＝ （Ｍ膜を、３０ｍＮ／ｍの表面ＬＦ下で圧
縮しながら、疎水化処理（シランカップリング処理）を
施した石英板上に垂直浸漬用−１，げ法（以下、ｌ−Ｂ
法と称覆−）により２層累積しノた処、平均累積比は０
．７であった。紫外吸収スペクトルから求めた石英板上
に累積したヒｈ Ｉ（ＩＧの被覆率は１．６ Ｘｌ０−
［１ｍｏｌ ／尻であった。この累積膜にベルオキシタ
ーゼ標識抗ヒ１〜ＩｇＧ抗体（２０μｍ／ｄ）液を作用
させた後、オルトフェニレンジアミン、過酸化水素混合
溶液中に浸漬して累積膜中の抗原活性を調べた処、活性
を保持していることがわかった。
実施例２
実施例１に於て、リグノセリン酸を用いる代りに、ラク
セロンｖ、、（Ｃ３１１−１６３ＣＯＯ［−１）ヲ用イ
テ水面展間膜を形成し水中よりヒＩ−ＩｇＧを吸右させ
たのら、石英ガラス基板上に累積した処、平均累積比は
０．８２であった。また、実施例１と同様にしてこのも
のの抗原活性を調べた処、水中に溶解しているＩ（ＩＧ
と同じ程度の高い活性を保持していた。
セロンｖ、、（Ｃ３１１−１６３ＣＯＯ［−１）ヲ用イ
テ水面展間膜を形成し水中よりヒＩ−ＩｇＧを吸右させ
たのら、石英ガラス基板上に累積した処、平均累積比は
０．８２であった。また、実施例１と同様にしてこのも
のの抗原活性を調べた処、水中に溶解しているＩ（ＩＧ
と同じ程度の高い活性を保持していた。
比較例１
ステアリン酸溶液を用いて実施例１と同様にして水面上
に単分子膜を展開し、その後、水中にヒ１−１９Ｇを注
入した。５分間静置後、表面圧３０ミリＮ／ｍを保つよ
う仕切り板を移動させた処、水面展間膜の面積は減少し
続け、ステアリン酸のＩＣ１Ｇ水溶液中への部分溶解か
見られた。この水面展開膜を、石英ガラス板上にＬＢ法
によつ−Ｃ２層累積した処、ぞの累積比は０．４１と低
く、累積中に膜の部分的剥離が観察された。この膜の抗
原活性を実施例１と同様にして評価した処、水溶液状態
でのｒｇＧ活性の １７３〜１／４に低下していた。
に単分子膜を展開し、その後、水中にヒ１−１９Ｇを注
入した。５分間静置後、表面圧３０ミリＮ／ｍを保つよ
う仕切り板を移動させた処、水面展間膜の面積は減少し
続け、ステアリン酸のＩＣ１Ｇ水溶液中への部分溶解か
見られた。この水面展開膜を、石英ガラス板上にＬＢ法
によつ−Ｃ２層累積した処、ぞの累積比は０．４１と低
く、累積中に膜の部分的剥離が観察された。この膜の抗
原活性を実施例１と同様にして評価した処、水溶液状態
でのｒｇＧ活性の １７３〜１／４に低下していた。
Claims (1)
- 水相面上に展開された炭素原子数２４〜３２の長鎖脂肪
酸、その多価金属塩及び／又はそのエステルの単分子膜
に当該水相中に溶解した水溶性抗体タンパクを接触させ
ることにより当該水相界面で抗体タンパク−単分子膜複
合体を形成させ、それを固体基板上に積層することを特
徴とする脂質単分子膜を用いた抗体タンパクの固定化方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19722086A JPS6354399A (ja) | 1986-08-25 | 1986-08-25 | 脂質単分子膜を用いた抗体タンパクの固定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19722086A JPS6354399A (ja) | 1986-08-25 | 1986-08-25 | 脂質単分子膜を用いた抗体タンパクの固定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6354399A true JPS6354399A (ja) | 1988-03-08 |
| JPH047759B2 JPH047759B2 (ja) | 1992-02-12 |
Family
ID=16370833
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19722086A Granted JPS6354399A (ja) | 1986-08-25 | 1986-08-25 | 脂質単分子膜を用いた抗体タンパクの固定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6354399A (ja) |
-
1986
- 1986-08-25 JP JP19722086A patent/JPS6354399A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH047759B2 (ja) | 1992-02-12 |
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