JPS60227694A - ヒト成熟白血球インタフエロンのアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は絹換えＤＮＡ技術の分野、すなわちポリペプチ
ドの製造に対して組換えＩ’）ＮＡ核技術用いられるｈ
法に関り−る。

にり１細には、本発明は成熟ヒ］〜白血球インタフ「［
１ンのアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法に関
し、本発明の方法は、部分アミノ酸配列Ｃｙｓ−＾１ｉ
　−Ｔｒｐ　−Ｇｌｕ　−Ｖａｌ　−Ｖａｔ　−Ａｒｇ
　−八ｌａ　−Ｇｌｕ　−１１ｅ　−Ｎｅｔ　−八ｒｇ
　−Ｓｅｐを有することを％Ｓ＋　ｍどし、そして先行
配列を伴なわない場合は、１６５−１６６個のアミノ酸
を有し、あるいはメブオニンが前記インタフエロンの第
１番目のアミノ酸のＮ末端に結合している場合は、１６
６−１６７個のアミノ酸を有することを特徴とする明細
書の浄書（内容に変更なし） ポリペプチドを製造するにあたり、このポリペプチドを
発現し、複製しつる微生物発現ビヒクルで形質転換した
微生物の培養物を発育ざｌｊ１ポリペプチドを発現さｌ
！、ぞしてポリペプチドを採取りることを特徴どりる方
法である。。

本発明の背頻についてまず記載づ−る。ヒＩ・白血球イ
ンタフエ［１ン（１，ｅｌＦ）は、最初、アイＩＪ″ツ
クス（ｌ５ａａｃｓ）おＪ：びリンデンマン（ｌ　ｉ　
ｎｄｃｎｍａｎｎ　）にＪ、す、きわめて相な沈殿物と
して、発見されそして調製された（ブロク、アール、ソ
シ、　（Ｐｒｏｃ。

Ｒ，Ｓｏｃ、＞　８１　／ｌ　７．２５Ｂ−２６７（１
９５７）　：米国特許口＋、ｓ、Ｐ、）３，６９９．２
２２）。ぞれを精製し特徴づ【ノる努力は長く続【−ノ
られ、正常または白血病の提供省から得た白血球に由来
りる比較的均一な白血球インフッ１０ンの調製にみノう
びいた（ドイツ特許公報Ｎｏ、２．９／１７．１３４　
）。

これらのインタフエロンは、それらの標的細胞にウィル
ス抵抗１！１の状態を付与Ｊる能力を有することの知ら
れている一群の蛋白質である。ざらに、インクフエロン
は、細胞の増殖を１１止しそして免５− −５−１　− 明細書の浄書（内容に変更なし〕 感染および悪性腫瘍の治療に白血球インタフ■ロンを臨
床的に用いることが促進されｌこ。

白面球インタフエロンは、本質的に均一な状態に精製さ
れルビンシニ１タイン（ｌ１ｌＩｈｉｎＲｊ（！ｉｎ）
　ａｑ。

ブロク、す１〜ル、アカド、→」−イ、米田（ｐｒｏｃ
。

Ｎａ口８八ｃａｄ、ｓｃｉ、１１．ｓ　八、）　７　６
　、　６　４　０−　６４　６（１９７９）ニアｏｏｎ
等、向上、７６．５６０１−５６０５　（１９７９）　
）約１７．５００から約２１．０００の範囲の分子量を
イＪ？Ｉるど報告された。これらの調製物の比活を目Ｅ
Ｌ、ぎわめて高く、２×１０　から１×１０９単位／　
ｍＵ　ｒｌｊ白質であるが、細胞培養法よりの収量はお
ぞろしく低い１．シかし、蛋白質の配列をぎめる技術の
進歩で、部分的アミノ酸配列が決定された〔ゾーン（Ｚ
ｏｏｎ）ＱＱ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０７．
５２７　（１９８０）；レビイ（１−ｅｖｙ）　Ｑ’ｒ
、ブロク、すＩ〜ル、アカド。

４ノ　イ　、　米１）（Ｐｒｏｃ、Ｈａｔ　ｌ　、八ｃ
ａｄ、ｓｃｉ、Ｉｌ、Ｓ、＾、）７７゜５１０２−５１
０４　（１９８０））。種々の白血球インタフエロンの
グリ］シル化は、現在完全には明らかでないが、秤類間
におＩ−Ｊるグリコジル化明にｎ１書の浄書（内容に変
更なし） の差のみでは、観察されている分子量の分布を説明しえ
ない。（の代わりに、白血球インクフエロンは、種類に
従いアミノ酸組成おＪ：び配列において名しく差があり
、アミノ酸の相同性は、場合ににす８０％より低い。

提供者の白血球Ｊ：りの分１ｌ１１１で部分的′／、ｉ
特徴イ・目）および限定されＩこ臨床的研究のための１
−分（ｉ　ｌａ　（７）、均一な白面球インタフエロン
を与えた（）れども、それだけでは、大規模な臨床試験
および広範イ【予防的および（または）治療的使用に必
要であるインタフエロンを１１？供するにはまったく不
十分である。まさに、ヒ！・白血球由来のインタフ■ロ
ンを抗腫瘍および抗ウィルスに用いる現在の臨床試験で
は、粗（１％より低い）調整物を用いており、実際的で
ない価格においてすら十分な砧を生産するに至らず、広
範な領域での研究を遅らｌて来た。

しかし、組換えＤＮＡ技術の出現にともなって、有用な
ポリペプチドのきわめて多様な種類を、微生物により調
節生産することが可能になった。すでに、この技術によ
り修飾をう（）で、ソマトスタチン、と１−インシュリ
ンのＡおＪ、びＢ鎖おにびヒト生長ホルモンのようなポ
リペプチド鎖を生産づることが可能どなった細菌が存在
するに至ってい　７− −６−１　＝ 明細書の浄ｗＩ（内容に変更なし） る。

イタクラ（Ｉｔａｋｕｒａ　）等、す゛イエンス（Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ　）１９８　、１０５６−１０６３　（１９
７７）　；ゲデル（ＧＯ（！（Ｉｄｏｌ　）等、ネーブ
ヤー（Ｎａｔｕｒｅ）　２８１　。

５５４４〜５４８（１９７９））。より最近になって、
絹換えＩ）　ＮΔ技術が、プロインシュリンおよσブモ
シンアルファー１の生産を可能とし、さらに、へｌυ人
かの著ｔ１は、ヒト白面球インタフ■ロンを］−ドする
ＤＮＡの採取おにび、その結果得られる、白血球インタ
フエロン活牲を有する蛋白？ｆの生成について報告して
いるナガタ（Ｎａｇａｔａ）等、ネーヂャ−（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　２８４．３１６−３２０　（１９８０）；ナン
テイ（Ｎａｎｔｅ　ｉ　）等、ジエイン（ａｅｎｅ）よ
追、１−１０　（１９８０）：タニグヂ（Ｔａｎｉｇｕ
ｃｂｉ　）等、ネーヂャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８５　、
５４７−５　Ａ　９　（１９８０）　）。

組換えｌ’）ＮＡ技術の工作室は、細菌および他の微生
物に存在し、しばしば、細胞中に多数のコピーとして存
在する、２重鎖ＤＮＡの非染色体性のループである、プ
ラスミドである。プラスミド−８＝ 明細占の浄書（内容に変更なし） ＤＮＡ中に］−ドされる情報には、娘細胞中に１ラスミ
ドを再生産りるに必要な情報〈′つまり、゛１ノブリ］
ン″）および、そして、ふつうは、１種または１種より
多くの選択特性、たとえば、細菌の場合では、抗生物質
に対ηる抵抗性の情報がある。この情報により、対象と
り−るプラスミドを含有り−る宿主細胞のクローンを認
識し、選択用の１８地中に優先的に発育さすことが可能
となる。プラスミドが６用なのは、プラスミドｒ）ＮＡ
上の異なる部位をそれぞれに認識する、ある種類または
別の種類の制限エンドヌクレアーＵまたは″制限酸素゛
′ににす、プラスミドが特異的に切断されつるというこ
とである。そのあとで、切断部位の両端か、切断部位に
接【ノて再構築した末端をむすびあわり−ことにより、
異質の遺伝子または遺伝子断片をプラスミド中に挿入し
つる。Ｉ）　Ｎ　Ａの組換えは、細胞の外部で実施しつ
るが、生成する“組換え″プラスミドは、形質転換と称
される方法により細胞内に導入され、その転換細胞を発
育さすことにより、異質の遺伝子を含有する組換えプラ
スミドを人聞に生産しうる。さらに、その異質遺伝子が
、プラスミド内のコードされるＤＮＡ情報の転写および
翻訳を支配する部分に関して正しく挿入されるならば、
生成する発現ビヒクルは、挿入された遺伝子の］−ドす
るポリペプチド配列を実際の生成つまり発現と称される
プロ廿スに実際に使用されつる。

発現は、ＲＮ△ポリメラーゼにＪ、り認識されそれが結
合する、プロ［−ターどじで知られる領域において開始
される。ある場合には、たとえば、本発明の実施におい
て右利とされる］・リプトフアンまたは”　ｔｒｐ、　
”プロモーターのＪ：うな場合には、プロモーター領域
には、゛オペレーター″領域が重なり、結合された、プ
ロモーター−オペレーターとなっている。オペレーター
は、特定のブ１］モーターにおける転写開始の瀕度を調
節する役割をする、いわゆるリプレッサー蛋白質により
認識されるＩ）ＮΔ配列である。ＲＮΔボリメラ−１？
は、ＤＮＡに沿って移動し、］−ド配列に含Ｊ：れφ情
報を、その５′末端から３′末端へと、メツセンジャー
ＲＮＡに転写し、ついｅそれは、ＯＮへのコードするア
ミノ酸配列を右Ｊ−るポリペプチドへ　１０− ど翻訳される。それぞれのアミノ酸は、ヌクレオブドト
リプレツ１−または“コドン″によりコードされる。こ
れらは、本発明の目的に関連して゛構造遺伝子″と称さ
れる部分、つまり、発現される生成物のアミノ酸配列を
コードづる部分に存在する。プロモーターに結合したあ
と、ＲＮＡボリメラーＵは、まず、リボゾーム結合部位
をコードするヌクレオチドを転写し、ついで、翻訳開始
または゛′聞始シグナル″（ふつうはＡ　ｌ’　Ｇで、
得られるメツレンジｌ７ＲＮＡではＡ　ＬＪ　Ｇどなる
）を、ついで、ＷＪ７ａｍ伝子自体転子自体るヌクレオ
チド］トンを転写する。構造遺伝子の端においていわゆ
る停止コドンが転写される。そのあとは、ポリメラーゼ
が、メツセンジャーＲＮＡの付加配列を形成することが
あつ−Ｃも、停止シグナルが存在するので、リボゾーム
により翻訳されないままとなる。

リボゾームは、ふつう、ｌｌｌＲＮＡが形成されつつあ
る細菌においてはメツレンジｒ−ＲＮ、Ａ上にある特定
の接合部位に結合する。そして、翻訳の開始シグナルに
始まり、前記した停止したシグナル　１１− で終了する、コードされたポリペプチドを生ずる。

リボゾーム結合部（ｆｌをコードする配列が、Ａ　ＬＪ
　Ｇ開始コドンに関して適切に位置し、そして、残りの
］トンのＪ−べてが、インフェース（ｉｎ　ｐｌ＋ａｓ
ｅ）に開始コドンに従うならば、所望の生成物が生産さ
れる。得らねた生成物は、宿主細胞を１ｌＩＩｉ解さｕ
１適当な精製法により他の細菌蛋白質Ｊ：り生成物を採
取することに」、りうることができる。

我々は、絹換えＤＮＡ技術（つまり、インタフエロン遺
伝子を微生物発現ビヒクルに挿入し、微生物遺伝子調節
要素の制御下にそれらを発現さけること）の利用が、大
量の白面球インタフ■ロンを提供するｂつどｂ有効な方
法と考えた。イれは、ヒ１〜由来の月別に特徴的なグリ
丁１シル化の特性を欠如する（）れども、広範囲に及び
ウィルスおにび新生物による病気の治療に用いられるで
あろう。

本発明の第１の白面法遺伝子を採取する方法は次の各段
階からなる。

（１）　均一・な状態に精製されたヒ１へ白血球インタ
フエロンの部分アミノ酸配列を用いて、部分アミ　１２
− ノ酸配列をコードしつる、可能なヌクレオチドの組合わ
Ｕのすべてを表わす、集合体としてのコドンを含む、合
成りＮＡプローブのセットを構成する。

［２１ＭｌされたメツヒンジＶ−ＲＮΔから相補１）Ｎ
Ａ（ｃＤＮＡ）を金石する細菌」ロニーバンクを調製す
る。放射ラベルされた別の誘導ｍ１ｌＮ八を、このバン
クからのプラスミドｃＤＮΔとバイブリドとする。バイ
ブリドとしたｍＲＮＡを溶出し、卵母細胞分析でインタ
フエロンへの翻訳について試験する。このようにして、
インタフ］二［１ン活性を誘導することが示されたコロ
ニーよりのプラスミドＤＮＡを、上記（１）のように製
造したブ［１−ブに対するバイブリド形成について試験
する。

（３）　上記（２）の］−稈と平行して、プラスミド中
の誘導されたｍＲＮ　Ａに由来するＣＤ　Ｎ　Ａ　を用
いて、別の形質転換］［に−バンクを用意する。（１）
のプローブをバイブリド化プローブとして用いるための
放射ラベル１本鎖ｃＤＮΔの合成を誘起す　１３− るのに用いた。合成プ［１−ブは鋳型どしての誘導ｍＲ
ＮＡどバイブリドを形成し、逆転写により拡大されて、
誘導された、ｌｌＩ用ラベうｃＤＮＡを形成する。この
Ｊ：うにして１９られｌご放射ラベルＣＤ　Ｎ　Ａに対
してバイブリド化されたニ目−に一バンクよりのクロー
ンについてさらに調べ（、完全長のインタフエ［１ン］
−ド遺伝子の存在を確かめる。（１）また（２）で４！
ノられる部分長の１１１定される遺伝子断片も、それら
自体、完全長遺伝子のブ１−１−ノ゛に用いつる。

（４）　上記に得られた完全長遺伝子は、成熟ポリペプ
チドの微生物にｊ；る発現を妨げるかも知れないリーダ
（Ｉｅａｄｅｒ）配列があれば、それを除ぎ、そして、
微生物プロモーターの開始ジグノールおＪ：びリボゾー
ム結合部位に関して、発現ビヒクル中に適当に位置する
ことを可能どするように、合成りＮＡを用いて、４ｔｆ
ｔ上げられた。発現さねたインタフエロンは精製して、
その特性を確認し、活性を測定する。

（５）　上記の方法で調製したインタフニ［ロン遺伝　
１４− 了断片−でれ自体は、他の部分的に相同な白血球インタ
フエロン種の、バイブリド化によるプローブに用いられ
る。

上記に概要を示した組換えＤＮＡ技術を応用することに
より、相当する先行配列またはその一部分を木質的にと
もなわない、成熟ポリペプチドどしての１１１Ｙの相同
的な白血球インタフエロン（グリ］シル化されていない
）を、高収量、高純度で、微生物的に生産することが可
能どイ１つた。、これらのインフェースは、動物おにび
ヒトのウィルスおＪ、び悪性腫瘍疾患に用いるに適当な
レベルまで、直接発１ｑさせ、採取し、そして精製する
ことができる。このように発現された、１群のインタノ
■ロンはイン　ビトロ試験で有効であることが示され、
そして、微生物的に生産された最初の白血球インフェー
スとして、イン　どボの試験でも、始めて、有効なこと
が示されたのである。

水用ｍ山中で用いられる“成熟白面球インタフ工しＩン
″の用語は、グリコシル基を欠如づ゛る、微生物的（た
とえば、細菌的に）生産されるインタ　１５− フ■ロンを意味り゛る。本発明の成熟白面球インタフエ
日ンは天然生成物の第１のアミノ酸二１トンのすぐ前に
ある翻訳開始シグナル（ＡＴＧ＞より直ちに発現される
。従って、この゛成熟″ポリペプチドはその配列中に第
１のアミノ酸としてメブオニン（八ＴＧがコードする）
を金石するが、木質的にその特性は影響されない。使方
、微イ１物宿主は翻訳生成物を加工して、最初のメヂＡ
ニンを除きうる。成熟白血球インタフ■［−１ンは、通
常のリーダー以外の接合蛋白質と一緒に発現されうるが
、この接合物は、細胞外または細胞内の環境において特
異的に除去しつる（英国特許公報 Ｎｏ、　２００７６７６八をみよ）。最後に、成熟イン
クフエロンは、接合物を細胞壁まＣ輸送する、微生物“
′シグナル″ペプチドとの接合物とし−（１１−産され
うる。Ｉｌｌｌｌ上壁いてジグノールは処理してはづさ
れ、成熟ポリペプチドが分泌される。

成熟白血球インタフ丁ロンの゛′発現°゛とは、ヒ］へ
白血球インタフＪロンゲノムのＩＩＩＲＮΔ翻訳に直接
に結果する、グリコジル基または先行配列を含　１６　
− 有しないインタフエロン分子の細菌または他の微生物に
ｊこる生産を意味する。

特定の白面球インタフエロン蛋白質は、ここでは、決定
されたＤＮＡ遺伝子（表２および表４）おにび演紳的に
定められるアミノ酸配列（表３および表５）により定義
される。これらの特定のインタフ］ニロン、実際ここに
含まれるすべての群の白面球インタフＪロンタンパク質
に対して、天然の対立１ｌｆｌ伝子変異（ａｌｌｅｌｉ
ｃ　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　）が存在し、個体間にもおこ
りつる。これらの変異は、配列全体にお（）るアミノ酸
の相異または、配列中のアミノ酸の欠落、間ぎ代え、挿
入、反転または追加として表われる。本明細書で対象と
する各インタフ■ロン、標示された１、ｅｌＦＡから１
．ｅｌＦ　Ｊについて、そのような、対立遺伝子変異は
、標示の範囲内または、その定義内に含まれ、従って、
本発明の範囲内に含まれるとする。

つぎに、表および図について説明する。

　１７− 表　１ タンパク質　Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉ　１ｅ−Ｍｅｔ−Ａｒ
ｇ：） −Ｃ−−−−−−−−−Ｔ−（丁−１０）トリフ０シン
ペフ０ヂド　（丁−１３）−−−ｔｌｉ　ｓ−Ｇ　１　
ｕ−Ｍｅ　Ｌ−Ｉ　１ｅ−Ｇ　１ｎ−−−−Ｇ−−−Ｃ
−−−−−−−（丁−１３０）特開昭ＧＯ−２２７６９
４（７） 特開口ＲＢＯ−２２７６９４（８） ＜＋ｆｌＬ）ＱｌｊＩＪ、Ｉじｒ　＜　−Ｌ）Ｉｄ　Ｊ
ｘ−（５工　鎖−一へ２７一 Ｓ−（７Ｃ７Ｃ７σ工σασ　Ｃｆ　■−，，２□、。

ＣＬ　ＣＬ　（Ｌ　Ｃｗ　Ｑ−ｅＬ　ｌ：Ｌ　Ｑ−ＣＬ
　１　σＣ７００１Ｃｒ　Ｃ７（７Ｃ）ＣＩＣ）ＯＯＣ
ＩＣＩＣ）　Ｃ）　＜＞＜＜＜＜＜ｄ＝＝エエエ：Ｉ：
　＝＝’：Ｘ　ＬＬＪ　ＬＩＪ−ＬＬＪ　ＬＪＪ　ＬＬ
Ｊ　ｕＪ　ｕＪαααααα　α　匡１　」−ｕ−一Σ
−一〇Ｃ）　００　Ｃ）　Ｃ１０Ｃ）ｌ　Ｏ０ＣＩ　Ｃ
Ｉ　Ｃ１０ＣＩ　ＣｌゾゾゾΣｙ×　ン　ｚ　ｚ　ｚ　
ｚ　’ｚ　ｚ　ｚ　ｚ門−シーシーーー　−−１」−シ
ー一一一ΣｕｃＪＬ）Ｌｌ）−ＣＪ　ＬＪ　Ｕｌ　０σ
σσ０００（７−乙ｅＬα乙ユ　乙　−シー一一一一一
ゾααααα　二　洲とφＵ洲ψ二と αｃｔ■いα■　α　二―――い〜−１ΣΣΣΣΣΣ　
Σ　Σ　ンＬＬ、Ｉシンｘ×ゾ×ヘー　０σ０・Ｃ７σ
α　σ　Ｃア　ロＯＬＬ＋００−〇−くく■く→＜＜」
−シー一一一− ｕ　ｕ−シー一　Σ　−シー一一一一一一一一一一一　
−−１ω−ト←Ｌ／’ｌ　Ｃ１＋φ←−Σ−−Σ−一　
Σ　ＬＪ　ｕＪ　Ｃ７ＬＬＩ−α−一［Ｆ］＋　ｕＪ　
ｕＪ　Ｃａｒ　ｕ−ムＪ　−−ＬＬＩ　Ｃ１０ゾゾンｙ
ンＸンｙ　ｇ φレワ０＝　αｃＩ！：Ｃｔαα Ｃピ　ＩＣピ　ＣピαＣピαＣピ シー一一一一一一−Ｉ Ｌ／ＩＣｒ：α匡αα匡α １、Ｉ　ψ−ＬＬＩ！シーーーーゾ σσαασ００σ　０ ０　−シー一−１−− Ｚ：　ｌ　’２：　Ｃ２：　Ｚ：２：　”−ｚｚ＋　−
＋　＋　＋−ゾくト Ｃｌ　Ｌ／’ｌ　Ｌ／’ｌ　＋ハＬ／′＋（いいｌ　い
α　−Ｊ　ＬＬ　−シー−Ｌｗ −Ｌ−シー―――− ＬＬＩ　いＶｌ−いいいいφ　Ａ い−ｃｔααα＝ααα　Ｃ１ ΣΣΣΣΣΣΣΣ　Σ ｕ＝　−−＝　−−−−＝　−１ ＬＡＪ　ｗ　ＬＬＩ　ＬＩＪ　ＬＬＩ　ＬＬＪ　ＬＩＪ
　ＬＩＪ　ｗ　ｌ＜（（＜（（＜（（ −ααズαＩＩαα＝　Ｃ１ 、Ｊ　＞　＞　：＞　＞　＞　＞　＞　＞　＞　１〉〉
ン＞（Ｃ＞＞＞　＞ →くくヒ＜＜＋−ニーユニ］ユズゴ 〉−シー一一　−σσσＣ７Ｃｌ　Ｃｒ　Ｃｒ　Ｃｒい
Ｖｌい　φ　φ　ｖ＞　：ｌ：　：Ｃ’Ｘ：、　＝工＝
工＝！ゾゾ×　ゾ　ン　！　−シー一１−−−ＣＪ　）
　＞　ＬＪ　洲　ｕ　：＞　＞　＞　＞　−＞　）ン１
／ｌいいの　い　い　Ｌ／’ｌ　Ｑ、いψψ―ψψいシ
ー一一一一一一一一一一一−− ＞）＞＞　＞　＞　＞　→（（（（＜（（−〉−ン一〉
ＬＬＪ０σｅＬ　Ｃ７（７Ｃｙσ〉〉ΣΣ　Σ　Σ　σ
０００σσσσ −Σ−一　−Σ　匡１し−−１１１ −−−−　−−−Ｉ　ＣｙＯσａｙ　ｘ　（７ｃｒ　ｃ
ｒく＞いく　い　い　ｚ！ｚ２ｚｚｚｚ ｗｗｕ−ｗ　ｔ、ｗ　ｗ　＋、＋　ロロΦ口■口ＣΦ）
−）−ψニ　Ｉ／Ｉ　α　＋　Ｃ１００−ＣＩ　００−
シー一　−−ＬＬＩＬｌ＋１ＬＩ＋匡−−１（（＜（（
（（Ｌｌ、ＩｕＪｕＪＬａＪ）ＬａＪＬ＋ＪＬＪψ−Σ
ΣΣΣ　Σ　Σ　ΣＩＬＬＩＬ１．ＩＬＩ−Ｉ−σ−−
−くωＣＪ□−匡■工　くω（Ｊ　ＯＬｕ―Φ工３スス
ズズユズズ　コＩ Ｊ　＜＜ｅＣ＜い＜＜＜　ｃｃｌ ＬＪ　（Ｊ　ＣＪ　ＣＪ　Ｌ）　＜ｗ　ｗ　ｗ　ｗ　１
く　ロ、Ｖ日λｅｌ＋ｏ＋ユ」工０゜ ＸＡｌ　いいいいいいのφ　ｌＩ Ｉ／＋１＞）−＞＞８１−＞二洲　洲Ｉｇン×ｙンｙ’
ｗ！：’ｌ　”１ ン’ｗ：ｃｆ：ンンｙ×７ １−　ＬＩＪ　ＬＬＪ　１．ａ、Ｉ−ンーーーーントー
←＋１−←Σ −１−シー一一一」」」Ｉ Ｊ　Ｍ−）＞弓−２）−ン二；）＋１ ｚ　−シー一一一一一　− 一１トｌ−ｌ−ｌ−１−ヒトヒ　ト −−−−−−−−−１ ０αααααααα　α１ ０１　００Ｆ　０　Ｃ（（７００（７ ＞シと＞　＞　＞　＞　＞　＞　１ ＬＩＪＩ　ＭシフＭＭソゾン　！ ＝　ＯＬ：　Ｃｅ　Ｃｔ　！１とＣピｙＣピ　Ｃピー　
〜−〉〉ン＞＞＞＞＞　） ＞　（（（＜＜（１−（ シー一一一一一一−１ −−、−−−ｔ＋＋ｔ＋ｗ　−−Ｉ Ｉ／ＩＩ／Ｉいいいいいい　い１　− ００００口Ｏロロ　ロ　ヘ αｌ　ΣΣΣΣαΣΣΣ　Σ ＬＬ、１ＬＩＪ−−−−−− ｃｙｌ　＋＋　０−ＣＬＱ、（Ｌ（Ｌ（ＬＩＬＣＬ　Ｑ
−Ｏ←−１，Ｌ、ＩΦ−一一一 −〉〉〉〉〉〉〉〉〉 ＬＬＩ　ロロロαＣΦＣ口 ＬＬＩ　１　＞　＞　＞　ＬＩＪ　＞　＞　）　＞ｅｔ
　ｃｏ　ｕ　ＣＩ　ＬＪＪ　Ｗ　（Ｄ　：ＳＩ　５１０ Ａ　ＭＡＬＴＦＡＬＬＶＡＬＬＶＬＳＣＨＭＡＬＰＦＳ
ＬＭＭＡＬＶＶＬＳＣ Ｉ　Ｍ　Ａ　Ｌ　Ｓ　Ｆ　Ｓ　Ｌ　Ｌ　Ｍ　Ａ　Ｖ　Ｌ
　Ｖ　Ｌ’　Ｓ　ＹＪ　ＭＡＲ，５ＦＳＬＬｌ＝ＩＶＶ
ＬＶ’ＬＳＹＣＭＡＬＳＦＳＬＬＭＡＶＬＶＬＳＹ ０３０ ＣＩ　Ｓ　Ｖ　Ｌ　ＨＥ　Ｍ　工Ｑ’　Ｑ　Ｔ　Ｆ、　
Ｎ　Ｌ　Ｆ　５１００　１１Ｃ ２０１１０ ０５０ ７，０、８Ｃ１９０ ＴＥＤＳＳＡＡＷＩ：ＱＳＬＬＥＫ、ＦＳＴＥＩＹＱ２
０ １３０　”　１４０ Ａ　ＹＬＫＥＫＫＹＳＰＣＡＷＥＶＶＲＨＹ”ＬＭＥＫ
ＫＹＳＰＣＡ冒Ｅ、ＶＶＲＥＩ ＥＩ ２４ １５０　’　１６０ ４ＲＳＦ’５ＦＳＴＮＬＫＫＧｔＲＲＫＤｊＩＲ５ＬＳ
、ＦＳＩＩ’ＬＱＫＲＬＲＲＫＤ表１は、Ｔ−１，１り
よびＴ−１３ど称される、ヒト白血球Ｊ：り分１１！＋
されイして均一に精製された、すべての種類のインフェ
ースに共通の２つのアミノ酸配列を承り。これらのベブ
ブドを”二１−ドする可能なｎ＋ＲＮΔ配列のすべてｉ
１５よび対応づるＤＮΔ配列を示り一、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ
および１」の文字は、それぞれ、アデニン、ブミン、グ
ｊ′−ン、シ１−シンおよびウラシルの塩基を含有（る
ヌクレオチドを示づ。文字Ｎは、ヌクレオチドＡ、Ｇ。

Ｃおよび（Ｊのいずれかを示７１’　ポリヌクレオブト
は、５′　（左側）ｈ曹う３′　（右１１１０　）の方
向に読むように記載されて丸いる。そして、２小鎖（“
ｄ、ｓ、”　）　Ｄ　Ｎ　Ａを承Ｊ時には、下側Ｊ：た
は非］−ド鎖については、順序は逆どなる。第１図は、
可能性のある１０Ｉ［プラスミドと３２ｐ−ラベル合成
デＡキシＡリゴヌクレＡブトとのバイブリド化を示すオ
ー１−ラジオグラムである。

第２表は、それぞれ、１１　Ａ　Ｉ＋から゛′１−ド′
までの記号を（＝Ｊされている、白血球インタフ１［１
ンの発現のために候補として分離された８個の遺伝予断
　２５− 明細書の浄書（内容に変更なし） 片のヌクレオブト配列（］−ド鎖）を示す。それぞれの
１０１「について、△ＴＧの翻訳開始コドンおよび終１
１−１〜リブレツ１−が下線で示されている。停止］ト
ンまたは終止］トンに続いて３′の未翻訳領域が示され
ている。含まれているＬｅＩＦ＾の全遺伝１艮には、表
２の第３列△ラインに示されるように、伯の」トンには
存在するひとつの］トンが欠如している。５′非翻訳域
がリーダー配列に先行している。分Ｈしたままの断片［
には、リーダーの完全４１先行配列は存在しない。しか
し、仮定される成熟ｔｅｎ　Ｅに対りる全遺伝子を含有
する。

分離されたままの断片Ｇは、］−ド配列が完全で４１い
。

表３′ｃは、ヌクレオチド配列ｊ：り示される８個の１
ｅＩＩ蛋白質蛋白質比較している。ＩＩＩＰＡＣ−１−
亀ＩＢ＝ｒミツシ」ン　Ａン　バイオケミカル　ノーメ
ンカルブ＼ｐ　−（Ｃｏｎ＋ｎ＋１ｓｓｉｏｎ　ｏｎ　
ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｎｔｃｎｃｌａｔｕｒｃ）
の提案による１文字省略が用いられでいる。つまり、ア
ラニンは八で、システィンは０で、アスパラギン酸はＤ
で、グルタミン酸は　２６− 明細書の浄書（内容に変更なし） Ｆで、フェニルアラニンはＦで、グリシン４Ｊ　Ｇ　′
ｃ。

ヒスチジンはｌｌｒ。

２６−１− イソ１−１イシンは■で、リジンはＫで、ロイシンは１
−Ｃ１メチＡニンはＭで、アスパラギンはＮで、ブ［ｌ
リンは［）で、グルタミンはＱで、アルギニンはＲで、
ヒリンはＳ１スレオニンはＴで、バリンはＶで、トリプ
トファンはＷで、ヂロシンはＹで表ねづ。数はアミノ酸
の位置を示す。Ｓはシグナルペプチドを示り゛。１６５
個のアミノ酸配列である１、ｃｌ［Ａ配列中の４４位の
ダツシコは、このＬｃｌＦ八配列へ伯の１−ｅｌＦの１
６６個のアミノ酸配列と一列にそろえるために入れであ
る。ＬｅｌＦ　Ｅの配列は、その］−ド領域の余分のヌ
クレオチド（表２の位ｉｅ’１１８７　）を無視して定
められている。星ｒＦ’ｌ　Ｃ１、インフェースにある
終１１ニコドンを示す。Ｊべてのｌ　ｅ　Ｉ　Ｆに」（
通の７ミノＭ（プソイド遺伝子１、ｅＨ［を除く）もま
た示されている。アンダーラインした残基は、ヒ１へ線
組芽インクフエロンにも存在するアミノ酸である。

第２図は、１．ａｌＦり「］−ン化ｃｌ）　Ｎ　Ａの８
個の型（八から１−１まで）の制限エンドヌクレアーゼ
地図を示す。バイブリドプラスミドは、ｄＣ：ｄＧテー
リ　２７− 明細書の浄書（内容に変更なし） ンク法（Ｊ　チル（Ｇｏｃｄｄｅｌ　、口ｖ）舌、ネー
ブ１／−（Ｎａｔｕｒｅ）２８７，４１１−４１６　（
１９８０））により構築された。

それで、ｃＤＮＡ挿入物は、ｐｓｔ　Ｔを用いて切断し
つる。各ｃＤＮ△挿入物の末端のラインは、側面に接す
るホモ重合ｄＣ：ｄＧテールを示す。Ｐｖｔ＋　ｌ［。

ＥｃｏＲ■およびＢｊｌｌ　ｌの制限部位も示しである
。淵い領域は成熟１ｅ汀のニー１−ド配列を示Ｊ゛。斜
線の部分はシグノールペプヂド」−ド配列である。白い
部分は３′および５′非コード配５１１である。

第３図は、成熟１．ｅｌ「への直接的微生物合成を」−
ドする遺伝子の構築を示１゜制限部位おＪ、び残部が示
されている（“’Ｐｓｔｉ”等）。”ｂ、ｐ、”は塩基
対を示す。

第４図および第５図は、１ｃｌｒＢ成熟白面球インタフ
エロンを発現１゛るに用いられる２つの頂仏子断片の制
限地図を示Ｊ−０示した二］トン配列は、示した２つの
場合について制限酵素Ｓａｕ　３　ａで消化づ゛ること
で生成Ｊる］−ド鎖末端である。

表１および表５は、タイプＩおよび、ｊを含めた、２８
− −２８−１　− 第５表において、Ｗ印は対応するＯＮΔ配列における終
止コドンをポし、ハイフ］−ンは配列にＡ−３Ｌする欠
落またはギ曳７ツゾを示Ｊ−６ つぎに、本発明を実施するための有利な具体例を示す。

八　使用微生物 記載した実施においては、２種の微生物、つより、米国
特許（１１，ｓ、Ｐ、＞４．１９０．／１９５記載のイ
ー、］す（Ｆ、ｃｏｌｉ）　Ｘ　１７７６およびイー。

−］す（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ−１２２９／１株（］−ン
ドＡ、　ｔｈｉ−、ｈｓｒ−、ｈｓｎ＋”　、英国性Ｙ
［公報ＮＯ２０５５３８２に記載）を用いている。イれ
ぞれ、ザ　アメリカン　タイプ　カルヂＶ−］レクショ
ン（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、ＡＴＣＣＮ
０．３１５３７および３１／１４６が付されている。絹
換えＩ）ＮＡの実験のすべては、ナショナル　インスヂ
ヂー］−−ト　Ａブ　ヘルス（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ
５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　１ｌｅａｌｔｈ）　（Ｄ該当−
リール万２９− 明細書の浄書（内容に変更なし） イドラインに従って実施された。

本発明のもつとも右利な具体例は、上記定義の菌株イー
、］す（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ｘ　１７７６おにびイー。

］す（Ｆ、ｃｏｌｉ）　Ｋ−１２菌株 −２９−１− 明細書の浄占（内容に変更なし） ２９４のみならず、他の既知のイー、］す（Ｅ、Ｃ０１
ｉ）株（以下Ｆ、ＣＯＩ＋で示す）たとえば［、ｃｏｌ
ｉ　Ｂを含めたｒ、ｃｏ＋＋および他の微生物株に関連
して記載してゆくが、これらの多くは、１Ｆ　アメリカ
ン　タイプ　カルヂＡ７−］レクション（ｔｈｅ　Ａｔ
ｎｅｒｉｃａｎ　ｌ’ｙｐｃ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）のような、知られている
微生物寄託施設に寄託されており入手可能である。ドイ
ツ特許２６４４４３２もみられたい。これらの他の微生
物には、 バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）たとえばバチルス　１ノ
ブブリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉＳ）おに
び他の腸内細菌たとえばサルモネラ　チフイムリウ１＼
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｎ＋ｕｒｉｕｍ）
およびレラチア　マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎｓ　）があり、異質遺伝子配列を発現
しつる、複製しうるプラスミドを使用する。酵母たとえ
ばサッカロスマイｔ′！スセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｃｒｅｖｉｓｉａｅ）　ｔ３また、
酵母プロモーターの制御下に、インタフエロンをコード
する遺伝子を発現させることにＪ、る−　３〇　− 明細書の浄書（内容に変更なし） インタフエロン蛋白質の′！ＩＪ造に１１いて右利であ
りうる。

Ｂ、ｌｅｆＵｍＲＮ　Ａの原料および精製１、ｅｌＦ　
ｍＲＮ　Ａは、ヒト白血球より採取しうる。

ふつうは、ドイツ特許Ｎｏ、　２９４．７１３４に記載
のように、センダイ（５ｅｎｄａ　ｉ　）ウィルスまた
はニューカッスル（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ　）病ウィルス
でインタフエロンを生産するように誘導した −　ろＯ−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） 慢性骨ずい性白血病患壱の白血球ｊ：り帽たものを使用
する。特に有利な、本明細内の４１事に用いられる原料
は、急性骨ずい性白血病の１患者に由来するＫＧ−１と
称するレルラインである。このけルラインは、コフラー
（ＫｏｃＨＩｅｒ、１１．ｌ’、　）おにびゴルデ（Ｇ
ｏｌｄｅ、　Ｄ、　Ｌ　、）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ　）２００．１１５３　（１９７８）に記載されてい
るように、（ローズウＡル　パーク　メモリアルインス
チチ−１−１−１１ＰＨＩ　（Ｒｏｓｅｗａｌ　ｌ　Ｐ
ａｒｋ　ＭｅｍｏｒｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ　）　）
　１６４０プラス１０％熱不活化ＦＣ８（生胎児面清）
　、２５　ｍＨＩｌ［ＰＥＳ緩衝液（Ｎ−２−ヒドロキ
シエチル−ピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸）
おにび５０　ＩＩ　９　／　ｍＱのゲンタマイシン含有
培地に容易に発育し、１週間に２度、継代培養（１から
３スプリット）シうる。

上記の発育培地に１０％０％ジメチルスルホ４−リイド
えて、細胞ＧＪ凍結さＩ！うる。ＫＧ−１は、１Ｆアメ
リカン　タイプ　カルヂャー　］レクション（ｔｈｅ　
Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣＮ［１ＣＲＩ−８０３１）
に寄託されている。

　３１− 明細書の浄書（内容に変更なし） に６−１細胞は、ルピンスティン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉ
ｎ）等記載の方法ブロク、ナトル、アカド、１ノ”イ、
米１）（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、へｃａｄ、ｓｃｉ、１
１．ｓ、八、）■。

６４０−６／４４　（１９７９））により、センダイ（
５ｅｎｄａ　ｉ　）または二ｕ、−カッスル（Ｎｅｗｃ
ａｓｔｌｅ　）−３１１− 明細書の浄書（内容に変更なし） 病ウィルスを用い、白血球インタフ−１−［］ン＋ｎＲ
ＮＡを生産するように誘導された。細胞は、誘脣後５時
間に採取しＲＮＡを、グアニジンヂオシアネー１ヘーグ
アニジンＩｎ酸塩法（ヂ＼アーウィン（Ｃｔ＋ｉｒｇｗ
ｉｎ）等、バイオケミストリイ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ）　ｊ　８．５２９／Ｉ　−５２９９（１９７９）
）により調製した。誘導し／７い細胞からのＲＮＡも同
様に調製しｌこ１．Ａリゴ’ｊ’　Ａ’　Ａシチミジン
（ｄ■）−１Ｋル［１−ズクｎ　：／ｌヘグラノイーａ
３　Ｊ：びスクロースグラジエンｔ−ｍ遠心を用いて、
ポリ（△）ｍＲＮへの１２Ｓ分画を１ｑた。ｌｊ法は、
グＩＪ　−：／　（Ｇｒｅｅｎ　）等（アーク、バイＡ
クミ、パイオフィス（＾ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ
ｏｐｈＶＳ、　）　１７λ。

７’１−８９　（１９７６））おにびＡり］１７（０ｋ
ｕｙｕ＋ｔ＋ａ　）等（アーヂ、パイＡケミ、バイＡフ
イス、（八ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｃｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ
、　）　１８　Ｂ−、９８−１０４（１９７８））の方
法を用いｌこ。この＋１１ＲＮΔは、アフリカッメガ−
■−ル卵ｔ］細胞分析（カバリ−ＩＪ　（Ｃａｖａｌｉ
ｅｒｉ　）等、ブロク、す１〜ル。

アカド、リイ、米（Ｆｌ　＜　１’ｒｏｃ、Ｈａｔｌ、
八ｃａｄ、ｓｃ、ｉ。

　３２− 明細書の浄書（内容に変更なし） １１、ｓ、八、）　７４．　３２８７−３２９１　（１
９７７））で８０００−１０　、０００単位／マイクロ
グラ１＼のインタフエロンタイターを示す。

−３２−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） Ｃ，ＬｃｌＦ　ＣＤ　ＮΔ配列を含有Ｊる：１［に−バ
ンクの調製 ５μ９のｍｌ（Ｎ八を用い、標準方法ライケンス（Ｗｉ
ｃｋｃｎｓ　）等、ジ土イ、バイＡル、り一ミ、（，１
゜Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２　！：）　３　、２４８３
−２４９５（１９７８）おＪ、びゴデル（Ｇｏｃｄｄｅ
　ｌ　）等、ネーチャー（ＮａｔｕｒＯ）　２８１．５
４４−４５１８（１９７９））により、２単鎖ｃＤＮ△
を調製した。ｃＤ　Ｎ　Ａは６％ポリアクリルアミドゲ
ル」二での電気泳動により、大きさに従って分画し、５
００から１５００ｂ、ｒｌの大きさの材ＩＩ　２３０１
１０を、電気溶出により１ｑた。このｃＤＮ△の１００
ｎｑ分を、デオキシシチジン（ｄＣ）残基でラーーリン
グしくチャンク（Ｃｈａｎｇ　）等、ネーブＡ／−（Ｎ
ａｔｕｒｅ）２７５．６１７−６２４　（１９７８）、
Ｐｓｔ■部位においてデオキシグアノシン（ｄＧ）残基
でテーリング（ｔａｉｌｉｎｇ　）　ＬＪた４７０ｒｌ
ＯのプラスミドｐＢＲ３２２とアニーリングしくポリバ
ー（ｌｌｏｌｉｖａｒ　）等、ジエイン（Ｇｅｎｅ）　
２．９５−１１３（１９７７））、これを用いてＥ、ｃ
ｏｌｉｘ　１７７６３３− 明細書の浄書（内容に変更なし） を形質転換した。ＣＤＮＡｎ１）について約１３０個の
テ１〜ラリ“イクリン抵抗性で、アンピシリン感受性の
形質転換株を得た。

−３３−１− 第２の同様の実験では、ｃＤ　Ｎ　Ａ　ｎｏについて、
約１０００個のテ１ヘラ１ナイクリン抵抗Ｆ１で、アン
ピシリン感受性のＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２株２９４の転
換株を得た。この場合、６００から１３００ｂ、ｐ、の
範囲の、クイズにＪ：り分画したＣＤＮＡｊＡ別を、電
気溶出により採取し、ｄＣでチーリングリ−るのに用い
た。

Ｄ１合成Ａリゴヌクレオブドの調製おＪ：びその使用 ヒ１へ白血球インタフエロンのいくつかの１〜リブシン
分解断片のアミノ酸配列についての知見は、Ｌｅｆｔ”
　ｍＲＮ　Ａの種々の領域に対して相補的な合成デオキ
シオリゴヌクレＡヂドのデザインを可能とした。２つの
１ヘリプシンペプチドＴ１およびＴ１３を選んだ。その
埋山は、それらのアミノ酸配列は、すべての可能な］−
ド配列（表１）を説明（るのに、１２個および４個のウ
ンデカマーを合成するだけですむからである３、それぞ
れの配列について、４組のデＡ４−シオリゴヌクレＡヂ
ドブローブを合成した。つまり各々三つ（Ｔ−ＩＡ。

　３４− 明細書の浄書（内容に変更なし） Ｂ、Ｃ，Ｄ＞または一つ（１−−１３Δ、Ｂ、０゜１）
）のＡリゴメクレオヂドを含有Ｊ−る。示した相補的チ
オｌニジオ９ゴヌクレオチド１１塩基鎖艮は、ホスホ１
〜りエステル法で化学的に合成した（フレア（Ｃｒｅａ
）等、プ「１り、　ナト）Ｌｔ、　ｌカド、　４ｊイ。

米ｌｉ、１（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、
Ｉ１．ｓ、Ａ、　）　７５　、５７６５−Ｅ５７６９　
（１９７８）　）。■−１３シリーズでは、４個の個々
のプローブを調製した。表１に示すにうに、３個のプロ
ーブの４プールとして、１２個の−［−１プ「ｌ−ブを
調製した。

ｒ−１３シリーズの４個のそれぞれのプローブａ３よび
各３個のプライマーの４プールとして調製し／−二１２
個のＴ−１プローブを、バイブリド化プ［１−ブに用い
るための成用ラベル１重鎖ＣＤ　Ｎ　Ａの合成を誘導す
るために用いた。鋳型ｍＲＮ　Ａは、レンダイ誘導にＧ
−１細胞（８０００１１ｉ位ＩＦ活性／μｇ）からの１
２ＳＲＮΔまたは非誘導白血球（〈１０単位／μグ）に
出来する全ポリ（Ａ）ｍＲＮ八である。３２ｐ−ラベル
ｃＤＮＡを、既知の反応条ｆｌ（ノイズ（Ｎｏｙｅｓ　
）等、ブロク、ナト　３５− 明細書の浄阜（内容に変更なし） ル、アカド、Ｖイ、米国（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　Ｉ　、
　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ　。

１１、ｓ、、Ａ、＞７万、１７７０−１７７／Ｉ　（１
９７９））−６５−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） を用いて、これらのプライマーより調製した。

２０℃旧・リス（１’ｒｉｓ）　（以７４ｒｉｓで示す
）　−１１ＣＩ（ｐＨ８，３）　、２０ｍＨＫＣｌ、　
８１１１８　８（ＩｃＩ２．３０ｍＨβ−メルカプｌ−
エタノール中で６０μｍ容量の反応を、Ｉ３こなった。

この反応は、各プライマーの１７１９（つＪ：す、Ｔ−
１シリースについては、全部で１２μり、■−１３シリ
ースについては全部で／ｌｆ１ｇ）、２／１ｇの゛誘導
″された１２Ｓ分画ｍＲＮΔ（または、非誘導ポリ（Ａ
）ｍＲＮＡ３０００　Ｃｉ／ｍ　ｍｏｌｅ）および６０
単位逆転写酵素（ベセスダ　リ１ノーブ　ラボラｉ−リ
イス（ＢＯｌｌｌｃｓｄａ　１（ｅｓｃａｒｃｈ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　）である。

生成物は、１０ｍＱセファデックス（５ｅｐｈａｄｅｘ
■）■ （以下５ｃｐｈａｄｃｘ　’Ｃ示−！ＪＵＧ−５０カラ
ムーにのゲル濾過により、結合されむかったラベルより
分け、７０℃で３０分間０．３ＮＮａ叶で処理し、ＲＮ
Ａを分解し、１１Ｃ１で中和した。バイブリド化は、カ
ファＩ−ス（にａｆａｔｏｓ　）等、ヌクレイツク　ア
シド　３６− 明細書の浄書（内容に変更なし） リザーブ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）　７
　、　１５１１１−１５５２　（１９７９）記載に準じ
て実施した。

［クローンＩｌｌ’ｊ二」１３０の同□定−３６−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） ５００個のＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２株２９４形質転換
株（０項参照）のそれぞれより、プラスミドＤＮＡの１
１１　ｇを調製するのに、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍ）舌、ヌクレイツク　アシド　リサーブ（Ｎｕｃｌ
ｃｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　）　７　、１５１３−
１５２３（１９７９）の迅速プラスミド分離操作を用い
た。各Ｉ）ＮΔ試利を変成させ、カファ１ヘス（にａｆ
ａｌ：ｏｓ　）等の１−間引用の方法に従い、３反復ぐ
二［・ロレルローズフィルター上につけた。

５００個のプラスミド試料を含有するニトロレル［ｌ−
スフイルターの３組は、 ａ）　７ライマーの１−−１のセラ１へでプライムされ
Ｉ、：　誘　）＃Ｃ１）Ｎ　Δ　。

＋１）１−１３でプライムされた誘導ＣＤＮＡおよび Ｃ）プライマーの両方のレットを用いて調製された１誘
１ｃＤＮＡとハイブリダイズした。非誘導ブ［１−ブの
全体に対Ｊるよりも誘導されたＣＤＮΔブ［］−ブの一
方または両方に対してより強くバイブリド化するならば
、クローンは陽性と　３７− 明細書の浄書（内容に変更なし） 考えた。５００個より３０個の゛陽性″り「１−ン−ろ
７−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） １’１１．１−１’１１３０　”）を選択し、さらに分
析した。

［、クローンｐ１．３１−　ｐＬ３９の同定、ＬｅｌＦ
遺伝子断ハを含有するプラスミド〈Ｎα１０４）の分離
プ「１−ブどして３２ｐ−ラベル誘導＋１１ＲＮ　Ａリ
ーレンホーグ（１，１ｌｌｅｎｈａｕｏ）等、バイオケ
ミストリイ（Ｂｉｏｃｌｌｅｍｉｓｔｒｙ、　）１５，
１８５８−１８６５　（１９７６））を用いて、グラン
スティン（６ｒｕｎｓｔｃｉｎ　）およびボグネス（＋
１０（ｌｎｅｓｓ　）の」ロニーハイブリド化法（ブロ
ク、ナトル、アカド、す゛イ、米国（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ
口、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　１１．　ｓ、　Ａ、　
）−７２，３９６１−３９６５（１９７５）”）により
ｒ、ｃｏｌｉｘ　１７７６の形質転換株をスクリーニン
グした。非誘導細胞９Ｊミリの非ラベルｌ１ｌＲＮＡを
３２ｐ−ラベル調製物中に存在する非誘導＋ｌｌＲＮ　
Ａと競合ざＪために、ブ［１−ブに対して２００対１に
混合した。ラベルされた ｎ１ＲＮＡのバイブリド化は、誘導された配列を含ＯＪ
るコロニーに選択的に起るはづである。３つの群の形質
転換株が得られた。

（１）　コロニーの２から３％が３２０−＋１１ＲＮＡ
に非−３８− ＋２１１０％は、バイブリド化の程回が、上記（１）群
Ｊ、り著しく低かった。

−３８−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） （３）　残りは、検出しうる程度のバイブリド化のシグ
ナルを示ざイ【かった、。

陽Ｉ１１の］［に一（第（１）および第（２）群）につ
いては、インタフエロンｎ１ＲＮＡがプラスミドＤＮＡ
に特異的にバイブリド化Ｊ−ることによる分析で、イン
クフエ［］ンに特異的な配列の存在について調べた。ま
ず、デー・ラリイクリン（２０ｕ　ｇ／　ｒｄ　）、ジ
アミノピメリンＭ（１００μ５／ｍＱ）、チミジン（２
０μ”：Ｉ　／　ｍＱ　）　８３　Ｊ：びｄ−ビＡ′チ
ン（ｌｔｔｑ／　ｍＱ　＞を加えたＮ９１８地の１００
ｍ１２に、６０個の強陽１１１］ロニー（第１群）のそ
れぞれを個別的に発育さＩ！た。Ｍ９培地は、１リツ１
〜ルについて、Ｈａ　ＩＩＰＯ４（６ｇ）、にｌｌ２Ｐ
Ｏ４（３！１　）　、ＮａＣ１（（）　、　５　’Ｉ　
）　ａ３　に　（Ｉ　Ｎ１１４　Ｃ１（１ｇ）　ヲ含’
Ｆｉ　Ｌ、オートクレーブしたあと、無菌Ｉ　Ｎ　Ｎｏ
ｎｏ４の１＃１１！おＪ：び無菌０．０１　ＨＣａＣｌ
２の１０ｍＱを添加づ′る。

１０個のｊ８養物はプールし、フレベル（ｃｌｅｗｅｌ
ｌ）等、バイＡ゛ケミストリイ（Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｓ
ｔｒｙ）　９　。

／４２Ｂ−４４０（１９７０）記載のように、６個のプ
ールにリブラスミドＤＮＡを分離した。各　３９− 明細書の浄書（内容に変更なし） プラスミドＤＮＡブールの −３’？−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） １０　ｕ　（Ｊは、ｌ１ｉｎｄｌｌｌで切断し、変性し
、Ｄ　Ｂ　Ｍ（ジアゾベンジルオキイメチル）紙に共イ
ｊ結合さ「た。誘導１１１Ｉ胞よりの精製のｎ＋ＲＮＡ
のＩ　Ｉｔ　ｒｌをそれぞれの濾紙にバイブリドさＵだ
。バイブリドしないｍＲＮ　Ａは洗って除去した。特異
的にバイブリドされたｍＲＮ　Ａは溶出し、アフリカッ
メガエルの卵母細胞中で翻訳させた。この分析で、６個
のプールはＪ−べて陰性であった。弱陽（Ｑの］口二一
（第２群）の５９個より、各ｉＱ］Ｉ］ニーの５プール
と９　ｍｌ　ｒ’ｌニーの１プールを調製し、それらの
プールよりプラスミドを調製し、上記のように調べた。

試験した６個のプールのうち、１個（ＫＩＯ）は、試験
の度に、バックグラウンドレベルを著しく超えるレベル
で、インタフエ［１ンｍＲＮ　Ａにバイブリドした。特
異的インタフ１−ロンＣＤ　Ｎ　Ａクローンを同定する
ために、プールに１０の９コロニーよりプラスミドＤＮ
Ａを調製し、個別的に調べた。９個のプラスミドのうち
の２個（Ｎｏ、１０１およびＮ０１０４　）がインタ７
１［１ンｍＲＮ　Ａと、バックグラウンドレベルを十分
に超　４０− 明細書の浄書（内容に変更なし） えて結合した。プラスミドＮｏ、　１０　／ｌより、２
６０１１．１１．を含有Ｊる、独特のＢｇｌ　ＩＴ制限
断片を分離した。これを、ティラー（ｌａｙｌｏｒ）　
’８、バイオケミ。

バイオフィス。アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ、Ａｃｔａ）／１４２．３２／ｌ−３３０（１９７Ｇ
）の方法により３２ｐでラベルし、その場でのコ「に−
スクリ一ング法（グララスデイン等（Ｇｒｕｎｓｔｅｉ
ｎ　ａｎｄｌｌｏｇｎｃｓｓ）、プ「１り、す１〜ル、
サイ、米国（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ｓｃｉ、１１．Ｓ、八　）７２．　３９６１
−３９６５（１９７５））により［、ｃｏｌｉ　２９４
転換株の４００　（ＩＩ、Ｉを、個別的にスクリーニン
グするためのブ［−１−ゾに用いた。このプローブと種
々の程麿にバイブリド化Ｊる、９個のＴ１口二一（ｐｌ
３１−ｒｌ１３９）を同定した。

ざらに、ラベルされＩこ２６０　ｂ、ＬＩｌｉ片を用い
て、ｆｉ−ｌｌ様にして、／ｌ　ＯＯ０個のＦ、ｃｏｌ
ｉ２９４転換株を個別的にスクリーニングした。このプ
ローブと秤杆の程亀にバイブリド覆る５０個のコ１］ニ
ーを同定した。ひとつは、１．ｅｌＦＧ断片を、ひとつ
は、１、ｃｌＦ　Ｉｆ断片を、ひとつはＬｃｌＦ　ＩＩ
Ｉ　と称する断片　４１− 明細書の浄書（内容に変更なし） （みかけ上、１ｅｌＦ　ＩＩの対立遺伝子である）を含
有した。生ずるバイブリドプラスミドは、“’ｐ１．ｃ
ｌＦ１１″等と称した。

−４１〜１− 明細書の浄書（内容に変更なし） Ｇ、最初の完全長１　ｅ　Ｉ　Ｆ　遺伝子の分離および
配列の床定 全体で３９個の可能性のあるＬｅｌトｃＤ　Ｎ　Ａクロ
ーンＪ、リプラスミドＤＮＡを調製した。そして、カフ
ァ１〜ス（にａｆａｔｏｓ　）等（上記引用）のバイブ
リド化操作により、同じ２６０ｂ、１１．ＤＮＡプロー
ブを用い再スクリーニングした。このプローブと３個の
プラスミド（ｒｌ１７１．　Ｉ）Ｌ３１　、　ｐｌ−３
４）は非常に強いバイブリド化シグナルを与え、４個（
ｒ＋１．１３　、　ｐｌ３０．　ｐｌ−３２、Ｉ）Ｌ３
６　）は中程度にバイブリド化し、３個（ｐｌ６　、　
ｐｌ、８　、　ｐｌ−１４＞は、弱くバイブリド化した
。

３９個の可能ヤ１のあるＬｅｌＦ　ｃＤ　Ｎ　Ａ組換え
プラスミドは、また、３２ｐ−ラベル合成ウンデカマー
（１−１プライマープールのそれぞれまたはＴ−１３プ
ライマーのそれぞれ）をじかにバイブリド１１ものブ１
−１−ブに用いて検索した。検出しつるバイブリド化の
シグナルを与えるのに完全な塩基間の対が必要であるよ
うに、バイブリド化の条件を選んだ（ワララス（Ｗａｌ
ｌａｃｅ　）等、ヌクレイツク　４２　− 明細書の浄書（内容に変更なし） ４２−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） 旦、３５４３−３５５７　（１９７９’））。つにす、
３９個のり［コーン３１：リブラスミドＤ　Ｎ　Ａを、
標準上澄液法（ｃｌｅａｒｅｄ　＋ｙｓａｔｅ　ｐｒＯ
ｃｅｄｌｌｒｏ；フレベル（Ｃｌｃｗｅｌｌ）等、上記
）で調製し、バイオラド　ア刀′１］−ス（Ｂｉｏｒａ
ｄ＾ｇａｒｏｓｃ）　八−５０カラムクロマ１〜グラフ
イーで精製した。各調製物の試料（３μうｌ）は、Ｅｃ
ｏＲｌ：で処理して開環し、アルカリで変（ＩＩさ１↓
、２枚の別々の二ｌ−ＩＴ＋レルロースフィルターにス
ポラ１〜した。１スポツトについて１．５１．１　Ｓｌ
どりる。上記引用のカフ７１〜ス（Ｋａｆａｔｏｓ　）
等の文献をみＪ：。合成チオ：１−シオリゴヌクレオチ
ドプライマーおよびプライマープールのそれぞれは、（
γ３２Ｐ）へ−「］）でつぎのようにリン酸化した。ｒ
）Ｏｐｍｏｌｃ　（Ｄ−Ａリゴヌクレオチドオヨヒ１０
０１１ｍｏｌｅの（７３２Ｐ）Ａｌ−Ｐ（二］−−イン
グランド　ニコークレア−（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮ
ｕｃｌｅａｒ）、２　Ｆ５００Ｃｉ／ｍ　ｍｏｌｅ）を
、５０ｍＨのＴｒｉｓ−ＩＩｃＩ、　１０ｍＪｌのＮ０
ＣＩ２おにび１５ｍＨのβ−メルカプ１へ１−タノール
の混合物の３０１１１中で合併した。２中位の１４ボリ
ヌクレＡチドキナーゼを添　４３− 加し、３７℃で３０分後３２ｐ−ラベルプライマーは、
１０ｍＬｌ？ファデックス（５ｃｐｈａｄｅｘ■）Ｇ−
５０カラムードでのり ＝４６−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） ロマトグラフイーで精製した。１０６ｃｐｍのプラライ
？−Ｔ−１３ＧまたＧＪ：３　Ｘ　１６６Ｃｐｌｎ　（
１）−、ｆ　ライマープールＴ−ＩＣを用いてバイブリ
ド化した。

バイブリド化は、ワララス（Ｗａｌｌａｃｅ　）等の上
記引用の方法に従って、６　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ（Ｉ　Ｘ　
Ｓ　Ｓ　（’、　＝０、１５ＨＮａＣｌ、０．０１５８
　＜え／ＶＭ〕−１ヘリウム、ａｌ１７．２　）　、１
０ＸＤｅｎｌ＋ａｒｄｔｓ　（０，２％牛血清アルブミ
ン、０．２％ポリビニルビ１］リドン、０．２％ｒｉｃ
ｏｌ　ｌ　）溶液中で、１５℃で１４１．１．間バイブ
リド化した。フィルターは６　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１１０℃
で５分間宛３度洗った。乾燥し、Ｘ−線フイルムにざら
した。結果は、第１図に、３２ｐ−プライン−プールＴ
−１３Ｃおｊ：びプライマー−Ｔ−ＩＣの場合について
示しである。

クローン１０４からのプラスミドＩ）Ｎ△は、プライマ
ープールＴ−１Ｇおよびプライマー■−１３Ｇと顕著に
バイブリド化した。しかし、他のウンデカマーとは、検
出しうる稈のバイブリド化は示さなかった。第１図に示
すように、３９個の可能性のあるＬｅＩＦプラスミドの
うちのいくらか４４− 明細書の浄書（内容に変更なし） （ｔ＋１２．／１．１３．１７．２０，３０．３１゜３
４）はこれらのプローブの両方とバイブリド化した。し
かし、制限分析から、これらのプラスミドのうｌ）のひ
とつだ（）、ｐ１３１が２６０ｂ、ｐ、内部ｎｏｔ　Ｉ
ｔ断片をも含有した。ｐ１３１をＰｓｔ　Ｉで消化しだ
結果、ＣＤＮＡ挿入物の大ぎさは約１０００１）、１）
、であった。

ｔ＋１．３１のＰｓｌ、　Ｉ挿入物全体の配列を、マキ
サムギルバート（Ｈａｘａｎ＋−Ｇｉ　１ｂｃｒｔ　）
化学法（メソード　Ｔンリ゛イ干ル、（Ｍｅｔｈｏｄｓ
　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　６５　。

／ｌ　９９．−５６０　（１９８０）　）およびジデオ
キシ鎖末端化方法（スミス、メソード　工ンザイモル（
ＳｍｉｔｌｌＨｅｔ、ｌ＋ｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　
）　５５　、５５　Ｑ　−５８０（１９８０））で決定
した。その際、５ａｕ３ａ断片を８１３ベクター中にサ
ブクローン化しておいた。、ｌ’）ＮＡ配列は表２の“
Ａ″に示しである。入手１ノうる蛋白質配列についての
情報、既知の１．ｅ　Ｉ　Ｆ分子量の範囲、３個の可能
な読み枠における停止１１−リプレツ１〜の相対的な存
在より適当な翻訳読み枠が示吟された。それから、プレ
ーまたは　４５− 明細書の洋書（内容に変更なし） シグナルペプチドを含めて１０１Ｆアミノ酸全配ケ１が
示された。第１のＡ　Ｔ　Ｇ　ＩＡ訳聞開始」トンは、
配列−４５−１− の５′末端より６０番目のヌクレオチドに存在し、１８
８　ｍｌトンあどに、ＴＧΔ終１ト１へリプレットが存
在する。３′末端には３７１２個の非ｒＡ訳ヌクレＡヂ
ドが（ｂす、ついでポリ（Ａ）配列がつづく。

仮定されるシグナルペプチド（おイらく、白血球よりの
成熟１．　ｅ　Ｉ　Ｆの分泌にあづかるのであろう）は
２３アミノ酸艮である。成熟ＬｅＩＦを構成する１６５
アミノ酸の分子間の削算飴は、 １９．３９０である。我々は、このｐｌ、３１により］
−ドされた＋−ｅｒｒを’　１．ｅｌＦ　Ａ”と称した
。表３の配列データ（“’Ａ”）より、ＬｅＩＦ　Ｂの
トリプシンペプチドＴ１およびＴ１３は、ＬｅｌＦＡの
１４５−１　’１９．１３Ｊ：び５７−６１にそれぞれ
相当することが分る。これらの２つの領域に見出される
実際のＤ　Ｎ　Ａ　］−ド配列は、プライマープール王
ｔ−Ｃｄ５　Ｊ：びプライマーＴ１３−Ｃに表されるも
のである（表４をみよ）。

１１、成熟白面球インタフ■ロンＡ（ＩｅｌＦＡ）の直
接発■」 　４６− 明細書の浄書（内容に変更なし） ＬｅＩＦ八を成熟インタフ■ロンボリペブブドどじで直
接に発現さ１！るための操作は、合成（Ｎ−末端）およ
び相補的ＤＮＡの組合１！を包含Ｊる点でヒト生長ホル
モンにＩｌ＋いられた方法（ゴデル（Ｇｏｃｄｄｅｌ　
）等、ネーヂャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２８１　。

５４４−５４８　（１９７９）の−変形である。

第３図に示１Ｊ：うに、５ａｕ３ａ制限エンドヌクレア
ーぜ部位は、便宜なことに、ＬｃＴＦＡの］トン１およ
び３とのあいだに存在する。ΔＴＧ翻訳聞始開始ンを含
有し、アミノ１１（システィン）に対する］トンを修復
し、［ｃｏＲＩ粘り末端を新しく作製することを包含す
る、２つの合成デＡ゛キシＡリゴヌクレオブードをデ畳
アインしｌこ。これらのＡリボマーは、ｐ１３１の３　
／１　ｂ、ｐ、ｓａｕ　３　ａ−八ｖａ　Ｈ断片に連結
した。生ずる４５ｂ、ｐ、生成物は２つの追加のＤＮＡ
断片に連結させ、８６５ｂ、１１．合成−天然雑種遺伝
子とした。これは、ｌ　ｅｌｌ＾を］−ドし、ＥｃｏＲ
Ｉおにびｐｓｔ　Ｔ制限部位によりはさまれている。こ
の遺伝子は、ＦｃｏＲＩおよびＰｓｔ　■部位のあいだ
において、ｐＢＲ３２２に挿入し、プラスミド　４７− 明細書の浄書（内容に変更なし） ｐｌＯＩＦ　八１としｌこ。

２、　１−！Ｊ’７１−／アン調節要素（［ｇ、ｃｏｌ
ｉ　ｔｒＦｌプロモーター、オペレーターおよびｔｒｐ
リーダーリボシーｌ＼結合部位を含有するが翻訳開始の
ためのΔＴ　Ｇ配列を欠如Ｊる）の構築 プラスミドρＧ旧は、欠失Δ１Ｆ１４１３を含有する［
、ｃｏｌｉｌ〜リブトファンオペロンを担う（ミオ量ｆ
す（旧ｏｚｚａｒｉ）等、ジ■イ、バクテリオ［ｌシイ
（，１，ＢａｃｔｃｒｉｏｌｏｏＶ）　１３３　、１　
／Ｉ　５７−１４６６（１９７８））。それゆえに、ｔ
ｒｐリーダーの員初の６個のアミノ酸そしてｔｒｐ　Ｅ
ポリペプチドのａ３　Ｊ：そ最後の１／３　（以降、あ
わせて１１丁’　と称する）ならびにｔｒｐ　（）ポリ
ペプチドの全体を含有する融合蛋白質を発現する。これ
はすべてｔｒｐプロモーター−−オペレーターシステム
の調節下にある。このプラスミド２０μ９を制限酵素Ｐ
ＶＬＩ　］’［でＨ１ｊ化した。これは、プラスミドを
５個の部位において切断する。この遺伝子断片はついで
ＥｃｏＲＩリンカ−（ｐＣ八へ’　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ
　ＣＡ　Ｔ　Ｇの自己相補性のオリゴヌクレオチドより
成立つ）ど結合させ、４８− 明細書の浄書（内容に変更なし） あとから、［ｃｏＲＩ部位含有プラスミド中にクロー−
４８−１− ン化するためのＥｃｏＲｉ切断部位とする。ｐＧ旧より
得られるＤＮＡ断片の２０μりを、２００　ｐｍｏｌｅ
の５′−リン酸化合成ＡリゴヌクレＡヂドｐｃへＴ　Ｇ
　Ａ　Ａ　１’　１’　ＣＡ　ｌ’　Ｇの存在で、２０
μｍ王、ｒ）ＮＡリガーピ緩衝液（２０１１１８Ｔｒｉ
Ｓ　ｐｌ＋　７．６．０．５ｍＨＡＴＰ、　１０ｍＨＨ
ｏＣ１２，５ｍＨシ（；４スＬｚ−ｉ’ｔ−−ル）中で
１０単位Ｔ４ｒ）ＮΔリガーゼで４℃＼夜処理した。溶
液はついで７０℃で１０分間加熱し、連結を停止させた
。リンカ−はＥｃｏＲＩ消化で切断し、ＥｃｏＲＴ末端
を有する断片を５パーレントポリアクリルアミドゲル電
気泳動（以降ＰＡＧＥと称する）を用いて分け、大ぎい
方の３個の断片を、■チジウムブロマイドでまず染色し
、紫外線で断片の位置を定め、ゲルより対象となる部分
を切り取る方法で分離した。各ゲル断片（３００μＩ　
Ｏ，ＩＸＴＢＥ）を透析バッグに入れ、そして、０．１
Ｘ丁ＢＦ緩衝液（Ｔ８Ｆ緩衝液は１０．８９のＩｒ１ｓ
塩基、５　、５　ｑ　ノホウＭ、０．０９ｇのＮ’ａ　
２　Ｆ　Ｄ　Ｔ　Ａを１リツｌ−ルの１−１２０中に含
有）中で１００Ｖ１時間電気泳動し−４９− 明細書の浄書（内容に変更なし） た。透析バッグより水溶液を採取し、フェノール抽出、
り１」ロ小ルム抽出、０．２Ｍ塩化ナトリウムｍ度どし
、エタノール沈殿接水中にＤＮＡを採取した。ＩｃｏＲ
Ｉ粘着末端を有するｔｒｐプロモーター−−オペレータ
ー含有遺伝子は、つぎに記載する操作で同定した。つま
り、デ１〜ラザイクリン感受性ノラスミドに断ハを挿入
し、これは、プロモーター−オペレーターの挿入で、テ
トラサイクリン抵抗１１とした。

プラスミドｐＢＲ１１１（ロドリゲズ（Ｒｏｄｒｉｇｕ
ｅｚ　）等、ヌクレイツク　アシド　リサーチ（Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ＾ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）６．３２６７〜３２８
７　（１９７９））は、アンピシリン抵抗性を発現しそ
して、テトラ１ノ−イタリン抵抗性遺伝子を含有する。

しかし、それに組合わされたプロモーターが存在しない
ので、その抵抗性を発現しない。このプラスミドは従っ
てテトラサイクリン抵抗＋４７−ある。このＥｃｏＲＩ
部位にプＩ］モーター−オペレーターシステムを導入す
ることにより、プラスミドをテトラサイクリン抵抗性と
なしつる。

５０− 明細書の浄書（内容に変ｙなし） ｐＢＲｌｌＩをＥＣＯＲｉで消化し、酵素はフェノール
抽（ ５０−１− ｌて水中につる。別々の反応混合物中に存在する生成り
ＮＡ分子は、上記に得られた３個のＤＮＡ断片のそれぞ
れど合（＋１　Ｌ　、そして、前記のにうに、Ｔ４ＤＮ
Δリガーゼで連結させた。反応混合物中に存在り−るＤ
　Ｎ△を用いて、椋準方法（バーシー］フィールド（１
ｌｅｒｓｈｆ　ｉ　ｅ　ｌ　ｄ　）等、ブロク。

ノー１−ル、アカド、リイ、米国（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、　ＡｃａｄＳｃｉ、１１．ｓ、八、）　７　１．　
３４５５−３４５９（１９７ＩＩ　）　）にＪ：すＤＮ
Ａどり込み能のあるＦ。

ｃｏｌｉに一１２株２９４を形質転換し、この細菌を、
２０　ｆｌ　！７　／　ｍＱのアンピシリンおにび５　
ＩＩ　９　／　ｍ（ｌのデトラリイクリンを含有するＬ
　１１　（１ｕｒｉａ−Ｒθ口ａＶ１！　）プレー１−
に接種した。いくつかのテ１ヘラリイクリン抵抗１１］
［に一を選び、プラスミド１’）　Ｎ　Ａを分Ｈしそし
て、望む断ｊ）の存在を制限酵素分析でＩＩ１「かめた
。生ずるプラスミドをＤＢＲＩＩ　ｔｒｐど称１Ｊる。

肝炎ＢのウィルスゲノムのＥｃＯｌＩＩおよびＢａｍ１
ｌｌ演化４１成物を常法により採取し、プラスミドｌｌ
Ｇ１１−−　区１　− 明細書の浄書（内容に変更なし） ６のＦＣＯＲＩおよびＢａｍｌｌＴ部位にり［１−ン化
しくゴデル（Ｇｏｃｄｄｅｌ　）等、ネーチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）２８１．５４４ ラスミドρＩＩｓ　３２をＸｂａ　Ｉで切断し、フェノ
ール抽出し、り１−１［Ｉホルム抽出し、エタノール沈
殿ざＵた。１沈殿は、０　、　１　ｍｌ　ｄＴＴＰ　８
３よびＱ、１ｍｔ４＋ｌ　ＣＴ　Ｐを含有する３　０　
ｔｔ　ｌポリメラーゼ緩衝液（５０ｍｔ＋リン酸カリウ
ｌｚ　ｐＨ７、，４，７ｎｔＨＨ（ＩｃＩ２゜（ベーリ
ン万−−マンハイム（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒ−Ｈａｎ
ｎｈｅｉｍ）　）で、０℃で３０分、ついで３７℃で２
時間処Ｐ１！シた。この処理でＸｂａ　Ｉ切断部位の５
′突出末端に相補的な４個のヌクレオチドのう４５の２
個がみたされる。

５’　ＣＴＡＧＡ−５’　ＣＴＡＧＡ−３’　Ｔ−ＴＣ
Ｔ− ２つのヌクレオブトｄＣおよびｄＴが組込まれて２つの
突出する５′ヌクレオヂドを有する末端を与える。プラ
スミドｐｕＳ　３２　（フェノールおよびクロロホルム
抽出後エタノール沈殿させて水に取る）のこの直鎖残基
を、ＥｃｏＲＩで切断した。大５２− −ｂ’ｌ−１− 一　５２−１− ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａ　Ｉ断片より分【ノ、電気溶出によ
り分離した。ｐｌ−１３３２（０，２μｑ）よりのこの
［’）ＮＡ断片は、上記に類似の条件で、ｐＢ旧１ｔ、
ｒｐに由来するトリプトノアンオベロン（約０．０１μ
ｇ）のＥｃｏＲＩ−Ｔａｑ　Ｉ断片に連結した。

上記のＤｔｌＳ　３２の断片をＥｃｏＲＩ　−Ｔａｑ　
Ｉ断１）ニ連結するこの方法において、完全なワトソン
ークリック塩基対ではない（）れども、Ｔａｑ”ｆの突
出する末端をＸｂａ　Ｉの残存する突出末端に連結する
。

この連結反応混合物の１部はｒ、ｃｏｌｉ２９４細胞の
変換に用い、熱処理し、７ンピシリン含右Ｌ　Ｂプレー
ト中に塗布した。２４個のコロニーを選択し、３　ｄ　
Ｌ　Ｂ　（Ｉｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ　）中で発育ざ
１１、プラスミドを分離した。これらの］コロニのうち
の６個が、［：、ｃｏｌｉによるＤＮＡ修復および複製
により再生されたＸ、ｂａ　Ｉ部位を有することが分っ
た。

　５３　− 明細書の浄書（内容に変更なし） −Ｔ　Ｃ−１−Ａ　Ｇ　Ａ　””　−Ｔ　ＣＴ　Ａ　Ｇ
△−−八Ｇ　Ｃ−「０丁−−Ａ　Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＴ　−
これらのプラスミドは、ＥｃｏＩＩ　Ｉおよび１ｌｐａ
　１の両方で切断されて、期待される制限断片を与える
こと６分つＩＣ６ｐＴｒｐ１４と称するひとつのプラス
ミドを、つぎに論議づるように異質のポリペプチドを発
現さづのに用いた。

プラスミドｒｌｌｌＧＩ＋１０７　（ゴデル（Ｇｏｅｄ
ｄｅｌ）等、ネーブＸ７−　（Ｎａｔｕｒｃ）　′Ｌ８
１．　５４４１．１９７９）は、合成Ｉ）Ｎ△断）１よ
り生成された２３個のアミノ酸］トンおＪ、びヒト生民
ホルモンメツセンジャー　ＲＮ△の逆転写で生成される
相補的ＤＮΔＪ：す１ｇられる１　６３１ｔ！＋］のア
ミノ酸］トンＪ：り成立つヒ１〜イ１艮ホル１ンに対Ｊ
る遺伝子を含ｌυでいる。この遺伝子は、１＝１・１良
ホルモンの″先行″配列の］トンを欠如りるＧ−Ｊれど
も、ＡＴＣｗＩ訳開始コドンを含有する。この遺伝子は
、１０　ｕ　ｐＨＧＨ１０７Ｊ：す、［＜：ｏＲＪ処理
、それに続く、上記のような［。

ｃｏｌｉｌ）ＮΔボリメラ〜ゼ■クレノー（に＋ｅｎｏ
ｗ）（以下ＫｌｅｎＯＷで示′？Ｉ）断片およびｄＴＴ
、ＰおよびｄＡＴＰ　５４− 明細書の浄書（内容に変更なし） 処理を経て分離しＩＪ、、フェノールおよびり［１［１
ホルム抽 一５／１．−１− 出のあとエタノール沈殿させたプラスミドをＢａｍｔｌ
　Ｉ　″ｃ処理した。

ヒト生長ホルモン（１−Ｉ　Ｇ　Ｈ）　ｌ伝子含有断片
は、Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ、つづいて電気溶出により分離した
。生ずるＤＮＡ断片は、テトラサイクリンプロモーター
　−−Ａ”ベレーターシステムを欠如するが、テトラ勺
イクリン抵抗性槙造遺伝子の最初の３５０個のヌクレＡ
−チドをも含有するので、引きつづき発現プラスミド中
にクローン化したときに、その挿入物を含有するプラス
ミドは、テトラサイクリン抵抗性の回復により見定め得
る。断片のＥｃｏＲＩ末端（、ｌ、旧０ｎＯＷポリメラ
ー１ｉＴ法でみたされであるので、この断片は、ひとつ
の平滑末端（ｂｉｕｎｔｅｒｒｄ　）おにびひとつの粘
着末端を有する。それで、４あとから発現プラスミドに
挿入されても正しい配向が確実になる。

発現プラスミドｐ？ｒｐｌ　４を、ついで、上記調製の
１−ＩＧＩ−１遺伝子含有餅片を受け入れるように調製
した。すなわち、ｐｌｒｐＬ４をｘｂａ　Ｉ消化し、生
、する粘着性末端を、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ％ｄ　Ｇ　１
’　ＰおよびｄＣＩＰを　５５　− 用いるにｌ　ｅｎｏｗポリメラーゼ■法でみたした。フ
ェノールおよびクロロボルム抽出おＪ：びエタノール沈
殿のあと、生ずるＤＮＡはＢａｍ　ｌ−Ｉ　Ｉで処理し
、生ずる大型プラスミド断片をＰＡＧＥおよび電気溶出
で分離した。ｐＴｒｐｌ　４山来の断片は１個の切断末
端および１個の粘着末端を有し、前記した１−Ｉ　Ｇ　
＋−１遺伝子含有断片と正しい配向で再結合号”ること
を可能とした。

ＨＧＨＩ伝子断片とｐＴｒｐｌ　ＡΔＸｂａ　−Ｂａ１
ｌ−ｌ　１断片とは、上記と類似の条件で、合４１ｆ　
Ｌ相！１に連結した。みたされたＸｂａ　■おＪ：びＥ
ｃｏＲ■末端は、平滑末端による連結で、Ｘｂａ　Ｉ部
位おＪ：びＦｃｏＲＪ部位の両方を再構成した。

みたされたＸｂａ　Ｉ　みたされたＦｃｏＲＴ　ＩＩＧ
ＩＩ３１伝子聞始Ｘｂａ　Ｉ　ＥｃｏＲＩ この構築はまたテ］−ラサイクリン抵抗性遺伝子をも創
出する。プラスミドｐＨＧ１１１０７は、ｌ−Ｉ　Ｇ　
＋−１遺伝子より上流に存在するプロモーター（ｌａｃ
プロ　５６− モータ〜）よりテ１ヘラサイクリン抵抗性を発現するの
で、ｐＨＧｔ１２０７と称するこの構築は、トップトノ
アンプロモーターーオペレーターの調節下でのテｉ〜ラ
リイクリン抵抗性遺伝子の発現を可能とする。ついで、
連結混合物でＥ、ｃｏｌｉ２９４を転換し、５μ９　／
　ｍＱのテトラサイクリンを含有するＬ　Ｂプレートに
で」ロニーを選択した。

プラスミドｐＨＧｌｌ　２０７はＥＣＯＲｉ消化し、ｔ
ｒｐプロモーター−オペレーターおよびｔｒｐリーダー
リボゾーム結合部位を含有するが翻訳開始のためのＡ　
ｒ　Ｇ配列を欠如Ｊる３００ｂ、Ｐ、断片を、１”ＡＧ
Ｅそれにつづく電気溶出で採取した。この１）　Ｎ　Ａ
断片はｐｌ、ｅｌＦ　ＡのＥｃｏＲＩ部位にクローン化
した。上記の変型ｔｒｐレギユロン（ｒｅｇｕｌｏｎ　
）（発現レベルを高めるように調節するためにアテ二］
■−タ配列を欠失させたＩｇ、　（ｏｌｉ　ｔｒｐオペ
ロン）を含有する発現プラスミドは、プロモーター−オ
ペレーターシステムを抑制するに十分量のトリブトノア
ン添加培地にあらかじめ定めたレベルまで弁台さＵうる
。ついで、トリプトファンを除　５７− 去しシステムの抑制を除（）ば、目的とする生成物が発
現されつる。

より具体的に示すと、第３図を参照にして、２５０　Ｉ
Ｉ　ｇのプラスミドｐ１３１をＰｓｔ　Ｉで消化し、１
ｏｏｏｂ、ｐ、の挿入物を６％ポリアクリルアミドゲル
上のゲル電気泳動で分離した。約４０７１９の挿入物を
ゲルより電気溶出し、３つに分けて、つぎのようにさら
に消化した。ａ）この断片の１６μグ試料を、３７℃で
４５分間Ｂ！１１　ｍの４０１１ｊ位で部分的に消化し
、反応混合物は６％ポリアクリルアミドゲル上で精製し
た。望む６７０ｂ、ｐ、の断片的２μ９を採取した。ｂ
）　１０００　ｂ、ｐ、Ｐｓｔ　Ｉ挿入物の別の試ｒ１
（８μｇ）をＡｖａ　ＩＴおよびＢ（］ｆｌ［で消化し
た。ゲル電気泳動のあとに、上記の１５０ｂ、ｐ、の断
片１μ９を得た。Ｃ）１０００ｂ、Ｉ）。

片の１６μりを５ａｕ３ａおよびＡｖａ　ｆｌで処理し
た。

１０％ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動したアト、
約０．２５μｇ（１０ｕ＋ｏｌｅ　）の３４．ｂ、Ｉ）
。

断片を得た。２つの示したデ第４シオリゴメクレオチド
、５’　−ｄＡＡＴ１ｃ＾ＴＧＴＧＴ　（断片１）およ
び　５８− 明細書の浄書（内容に変更なし） ５′−ｄＧ八へＣ八へＡＣＡＴＧ　（断片２）はホスホ
トリエステル法で合成した。断片２はつぎのにうにリン
酸化した。、２００／ｌｌ（約４０μｍｏｌｅ　）の（
γ３２Ｐ）Ａ　Ｔ　ｒ）　（アメルシャム（八ｍｃｒｓ
ｈａｍ）　、　５０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｃ　）を乾燥し
、６０ｍＨのＴｒｉｓ−１１ｃＩ（ｐＨ８）　、１０　
ｌ１ｌｔｌのＨ（ｌｃ１２．１５ｍＨβ−メルカプトエ
タ／　−）ｔｔ　にり成立つ、１００　ｐｍｏｌｅのＤ
ＮＡ断片おにび２単位の１４ポリヌクレオチドキナ−１
！含有溶液３０μＩに再懸濁した。３７℃で１５分１す
、１ｆｌｌの１０ｍＨのＡＴＰを添加し、反応はさらに
１５分進行させた。混合物はついで７０℃で１５分加熱
し、１００　ｐｍｏｌｅの５’　−０ｆ−１断片１おＪ
：び１Ｑｐｍ０１８の３４　ｂ、ｒｌ、５ａｌｌ　３　
ａ　ＡＶａ　Ｉｆ断片ど合併し／ｊ。２０ｍＨＴｒｉｓ
ｌｌＣＩ　（ＤＩＩ７　、５　）、１０ｍ１４　ＨｏＣ
Ｉ２．１０ｍ１ｔジヂＡスレイトール、（１、５ｍ）ｌ
　Ａ　Ｔ　Ｐおよび１０単位Ｔ４ＤＮＡリガーＶの５０
μｍ中で５時間４℃で連結させた。混合物は６％ポリア
クリルアミドゲル上で電気泳動し、４５ｂ、ｐ、生成物
を電気溶出で採取した。４５ｂ、ｐ、生成物の３０　ｎ
ｏ　（１ｐＩＩｌｏｌｅ　）を、１５〇５９− 明細書の浄書（内容に変更なし） ｂ、ｐ、Ａｖａ　ＴＩ　− −５９−１−− Ｂｇｌ　ｌ断片の０．５μｇ（５μｍｏｌｅ　）　オ、
ｋ（Ｆ６７０ｂ、ｔｌ、ＢＱＩ　ＩＴ−Ｐｓｔ　ｌ断片
の１μｇ（２ｐＨｏｌｅ　）と合［Ｉ　Ｌ、　ｔ＝。２
０１１ｉ位のＴ　４　ＤＮ　Ａ　ＩＪガ−１を用いて２
０℃１６時間連結処理した。６５℃で１０分間加熱して
リガーじを不活化した。混合物は［ｃｏＲＩおｊ：びＩ
’Ｓｔ　Ｉで消化して遺伝子の重合体を除去した。混合
物は６％Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅで精製した。約２０μｇ（０，
０４ｐｍｏｌｅ　）の８６５ｂ、Ｄ生成物を分離した。

これの半分（１０ｎｏ）を、ｐＢｆ１３２２　（０，３
μｇ）のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ　丁部位のあいだに挿
入した。Ｅ、　ｃｏｌｉ　２９４を形質転換すると７０
個のテトラサイクリン抵抗性、７ンビシリン感受性の転
換株を与えた。これらのうちの１８個からプラスミドＤ
ＮＡを分離し、ＩＥｃｏＲＩおよびＰｓｔ　Ｉで消化し
た。１８個のプラスミドのうち、１６個が８６５　ｈ、
＋３、長のＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ　ｌ断片を有した。これ
らのうちのひとつｐＬｅｌＦ　ＡＩの１μりを［ＣＯＲ
■テ消化し、Ｆ、　ｃｏｌｉ　ｔｒｐプロモーターおよ
びｔｒｐリーダーリボゾーム結合部位を有する、上記製
造のような３００　ｔ）、ｒｌ、ＥｃｏＲＩ断片　６０
− 明細書の浄書（内容に変更なし） （０，１１１ｇ）に連結させた。ｔｒｐプ［１モーター
を含イｊ’Ｊる転換物は、グランスデインー小グネス（
Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎｉｌｏｇｎｃｓｓ　）　−１０ニー
スクリーニング法と組合わＵて、３２Ｐｔｒｐプローブ
を用いて同定した。ｔｒｐ断片中の非対称的に位置して
いるＸｌ）ａ　Ｉ部位は、ｔｒｐプロモーターが、１ｅ
ｌＦ　Ａ遺伝子の方向に配向している、組換え生成物の
同定を可能どした。

１、　１ｅｌＦＡのインビトロおよびインビボ活性Ｉ［
分析の１．ｌ：めの抽出物をつぎのように調製した。１
８ｉ＆物の１　ｍＱを５μｇ／＃１１！のテトラサイク
リンを含イ１１゛る【−ブロス中で発育ざＶ１Ａ５５０
値を約１．０とし、ついで、５１１’Ｊ／ｍｆｌのテト
ラサイクリンを含イｊするＭ９培地２５＃ｌｌ！中に希
釈した。

Δ５５０が１．０に達した時に１０Ｉｎ！！、の試料を
遠心採取し、細胞塊を、１５％スクロース、５０ｍＨＴ
ｒ　ｉ　５−１−１ｃＩ　（ＤＩ＋８．０＞、５０ｍ１
４Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａの１　ｍＱ中に懸濁さけた。１■のリ
ゾチームを添加し、０℃５分のあと、細胞は超音波処理
で破壊した。試料は１０分間（１５，０ＯＯｒＤＩＩｌ
　）−６１＝ 明細書の浄書（内容に変更なし） で遠心し、上清中のインタフＪロン活ｆ１を、細胞−６
１−１〜 変性効果（ＣＰＦ）の阻止分析にＪ：す、標準１．ｅＨ
と比較して測定した。細胞（＋）たりのＩＦ分子数を測
定するためには、４Ｘ”［１８単位／　ｍｙ　（Ｄ　Ｌ
ｅｌＦ比活性を用いた。− 表６に示すように、ｔｒｐｆ１１モーターを望む配向に
挿入したクローンｐＬｅｌｒ＾ｔｒｐ２５は高い活性（
２，５ｘ１０８単位／１）を示した。表７に示すように
、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　−’Ｉ　２株２９４／　ｐＬｅｌ
Ｆ＾ｔｒｐ２５の生成づるＩ［は、ヒｉ〜１．ｅＨ標品
と同様に挙動したｎｒｌｌ＋２−Ｃの処理に対し安定で
、つυギ抗ヒｌ−白血球抗体により中和される。このイ
ンタフエ［コンの児かりの分子ｍ（，１約２０．０００
である。クローンｐｌａｎへｔｒｌ１２５はアメリカン
タイプカルチＶ〜コレクション（△−１−ＣＣ）に寄託
されている。

インタフ１ｔ］ンのインビボでの効果には、マク日ノ２
−ジおよびノーヂュラルキラー（Ｎ　Ｋ　）細胞が必要
である。そし−Ｃインビボでの作用は、これらの細胞の
刺激を含むようにみえる。それで、Ｅ。

ｃｏｌｉ　２９４　／　ＤＬｅｌＦ八２５に上２５産さ
れるイン　６２− タフエロンは、細胞培養の分析では抗ウィルス活性を右
するが、感染動物では無効である可能性がある。さらに
、細菌より生産された、非グリ］シレート化ＬｅｌＦへ
のインビボ・抗ウィルス作用は、ｔｌ−”／’；’：ｚ
’−−］−ト（ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ）　”白血球に由
来するグリコシレート化ＬｅｌＦとは異なることがあり
うる。それで細菌により合成されたＬｅｌＦ＾（２％純
度）の生物活性を、スクイレルモンキー（リスザル）へ
の致死量の脳心筋炎ウィルス（ＦＭＣ）感染において、
バフイー］　−１−ＬｅＴＦ（８％純度）と比較してみ
たく表８）。

表６　Ｅ、ｃｏｌｉ抽出物のインタフ１ｔン活性　６３
− 明細書の浄書（内容に変更なし） 表７　［、ｃｏｌｉ２９　／Ｉ　／ｒ１１．ｅｊＦ　Ａ
　２５抽出物ど標準１、ｅＩ［＊どの活１’ｌ比較 木表６に記載（７）［、ＣＯ１＋２９４　／ｒｌｌｅｌ
Ｆ　Ａ　ｔｒｔｌ　２５の抽出物ｍＱあたり２５０．０
００単位を、最小必須培地で５００倍希釈し、５００単
位／ｄの比活性どした。白血球インタフ１ｔン標準〔ワ
ドレイイラスブブ−’１−−１−　（Ｗａｄｌｅｙ　Ｉ
ｎ５ｔ目ｕｔｅ）　）をあらかじめＮ　Ｉ　＋−１白血
球インタフエロン標準に対して、タイターをめて、やは
り５００　Ｕ　／　ｔｒｄｌの最終濃度に希釈した。１
ｍＱＦｒｋをｌＮｌｌＣｌで０１１２とし、４℃で５２
時ｕ１１インキコーベートし、Ｎ　ａ　Ｏｌ−１を添加
中和し、ＩＦ活性を標準ＣＰＦＩＩｆｌ止分析で測定し
た。

５００単Ｉｆ／　／　ｔｎＱ試ｎ（未処理）の２５μｍ
分を　６４　− 明、細書や浄書（内容に変更なし） ’２５　ｕ　ｌのつ４Ｊギ抗− ６４−１− ヒト白面法インタフ１０ンど３７℃で６０分インキコベ
ー１へし、１２．ＯＯＯｘｇで５分遠心し、上清を分析
しｌこ。

表８　スクイレルｔンキー（リスデル）のＩＥ　Ｍ　Ｃ
ウィルス感染に対する種々のＬｅＩ［調整物の抗ウイル
ス効果 リールはすべてＨｔ　（平均体重７１３ｇ＞で、感染前
には、ＥＭＣウィルス抗体は有しない。ザルに　６５− 明細書の浄書（内容に変更なし） は、１００Ｘｔ［５ｏＥＭＣウィルス（マウスで測定）
を筋肉内感染さけた。λ１照感染督ナルは、感染１股１
３４．１５８．１６４１１Ｓ間に死亡した。

１０６甲位インタフ刊］ン処理は、感染前４時間、感染
１１ｔ　２．２３．２９．４８．７２．１６８および２
４０時間目に静脈内投与した。細菌性白血球インク７　
Ｔロンは、ｒ、ｃｏｌｉ２９　／ｌ　／１１１ｃｌＦ　
Ａ　２５の融解物よりのカラムクロマト分画で、比活性
７．４Ｘ１０６単Ｂ／、　／　ｍ９蛋白質であった。対
照細菌蛋白質は、ｒ、ｃｏｌｉ２９４　／ｐＢＲ３２２
融解物よりの相当Ｊるカラム分画で、２倍の全蛋白質量
どした。白血球インタフエ【］ン標準は、クロマトグラ
フィーで、３２Ｘ１０６単位／ｍ’Ｊ蛋白質の比活性に
精製しＩＣ１正常のし１へ゛バッフイーヨー１〜゛′細
胞よりのセンダイ（Ｓｃｎｄａｉ）−フィルス誘導イン
タフ］−１］ンであつｌこ。

対照のり′ルは、序々に進行する昏睡、バランスの消失
、後肢の弛緩、まひそして死亡前８時間順にり開始づる
涙の流出を示し１＝　、インタフ■ロン処理すルは、こ
れらの異常はまったく示さず、常−６６一 時活動的で、ウィルス血症による症状を示さなかった。

４日までウィルス血症を示さなかった対照中の１頭のサ
ルは、もっとも遅れて死んだ（感染ン投与すルは、感染
後１４および２１Ｅ１の検査でＥＭＣウィルスに対する
抗体を生成しなかった。

れうることを示す。即由は、爽雑り−る蛋白賀は、細菌
とバツノイー」−ト調製物ではまったく異なるからであ
る。さらに、これらの結果は、１．ｅＨＡのインビボ抗
つィスル活竹にグリ」シル化が不要であることを示す。

Ｊ、　その他の白面球インタフエロンに対するＣＤＮＡ
の分離 完全に特徴づけられたｌｅＨＡ　ｃＤ　Ｎ　Ａ含有プラ
スミドよりのＤＮＡを、、Ｐｓｔ　■で切断し、電気泳
動により分離し、３２ｐでラベルした。生ずる放射ラベ
ルＤＮＡをプローブに用い、上記の−６７− 明細書の浄書（内容に変更なし） グランスティン（Ｇｒｕｎｓｔｅ　ｉ　ｎ　）および小
グネス（＋１０（］ｎ４！３３　）のインジトウーコロ
ニースクリーニング法により、上記Ｃ項におけると同様
に得られた、追加の［、ｃｏｌｉ２９４の転換株をスク
リーニングし／ｊ、Ｉｌｉ々の程度にプローブにバイブ
リド化した］１に一を単離した。これらの］口ニーから
のプラスミドＩ’）　Ｎ　ＡおＪ：び上記Ｇ項に示した
１０個のバイブリド化］ロニーからのプラスミドＤ　’
Ｎ　Ａを、Ｐｓｔ、　１切断にＪ：り分離し、３つの方
法で特徴づ【」た。第１に、これらのＰＳｔ断片を、酵
素Ｂ（１１１、ＰＶＩＩ　ＩＴおよσ［ｃｏｌｌ　Ｔを
用いる制限エンドヌクレアー口演化パターンで特徴づ【
Ｊｌｚ二〇この分析は、第２図に示した、少なくとも８
種の異なる型（１−ｃｌＦ　八、　Ｉ−ｅＴＦ　８．　
１．ｃｌＦ　Ｃ１１−ｅｌＵ　Ｄ、ＬｅｌＦ　Ｆ、１ｃ
ｌＦ　Ｆ、１．ＯＴＦ　Ｇおよび１．ａｌｌ’　Ｉｆ）
の分類を可能とした。これ【、１、これまでに知られて
いるＬｅｒＦ　Ａの先行配列おＪ：び］−ド配列に関す
る、種々の制限切断点のおおよその位置を示している。

これらのうらのひどツ１．ｅｌＦ’Ｄは、ナガタ（Ｎａ
ｏａｔａ　）等がネーヂャー（Ｎａｔｕｒｅ）　２８４
．３１６−３２０６８− 明細書の浄書（内容に変更なし） （１９８０）に報告したのと同じと信「られる。

６８−１− リー△含有ＫＧ−１細ｋ　ＲＮΔＪ、す、１．ｅｌＦｍ
ＲＮ△を選択的に除去する能力について、クリーブラン
ド（Ｃ１ｃｖｅｌａｎｄ　）等が１＝ル（Ｃｅｌｌ）λ
且、９５−１（：）５　（１９８０）に記載しＩこハイ
ブリッド化選択分析により調べ／Ｃ０１，ｅＨ＾、Ｂ、
Ｃおよび［（まこの分析で陽ヤ１であった。第３に、こ
れらのｐｓｔ断片を発現プラスミドに挿入し、１：。

ｃｏｌｉ　２９４をそのプラスミドで形質転換し、断片
を発現さけた。プレインタフ工ロンど信「られる発現生
成物は、ＬｅｌＦ　Ｆ断片がかろうじて陽ｖ１以外は、
イタフエロン活性に対するＣＰＥ分析でリベて陽性であ
った。上記に加えて、上記の１０１［型のすべてについ
て配１１１を定めた。

Ｋ、　第２の成熟白面法インクフエ［１ン（ＬＯＩＩ−
８＞の直接発現 成熟１ｅｆｔ　Ｂに対Ｊる遺伝子を含有Ｊ−る分１１Ｉ
Ｉ断片の配列は、型ＡおＪ、びＢの最初の１４個のヌク
レオチドが同じであることを示す。それで、ｔｒｐ　−
プロモーター−オペレーター、リボゾーム結合部９− 位１１３Ｊ：びＬ　ｅ　Ｉ　Ｆ八（−Ｂ）遺伝子の開始
を有する断片をｐＬｃＴｒ八２５へり分離し、発現プラ
スミドにおいてＢ配列の残りの部分と結合させた。ｐＬ
　４（第２図に示した１、ｅＴＦ　Ｂ　Ｐｓｔ末端遺伝
子を含有図にそれぞれ示す。

第４ｘ図の配列によりＰｓｔ　Ｉ断）ｔに対しておおＪ
：そ９５０ｂ、ｐ、のＳａｕ　３　ａ−Ｐｓｔ　Ｉ断片
をうるには、１個または１個より多くの介在するＳａｕ
　３　ａ制限部位が存在するので、いくつかの段階が必
要である。つまり、つぎのようになる。

１、　つぎの断片を分離した。

ａ）　Ｓａｕ　３　ａからＦｃｏＲＩまでの１１０ｂ　
ｂ、ｐ、：ｌ＋）　［ｃｏＲＪからＸｂａまでの１３２
ｂ、ｌ）。

ｃ）　ＸｂａからＰｓｔまでの＞７００ｂ、ｐ。

２　断片（１ａ）おＪ：び（１ｂ）を連結させＸｂａお
よび＋３（ＩＩＩＩで切断して、Ｓａｕ　３　ａおよび
Ｘｂａ末端を経由する自己重合を防いだ（関連するＳａ
ｕ　３　ａ部位はＢ（１１ＩＩ部位内に＝　７０− あり；ｌ１ｏｌｌ切断はＳａｕ　３　ａ粘着↑１１末端
を残した）。２４２ｂ、ｐ、断片を分１１１１１　Ｌ、
た。

（２）および（１Ｃ）の生成物を連結さゼ、ふたたび自
己重合を防ぐために、Ｐｓｔ　ＩＩおよびＢｇｔ　ＩＴ
で切断した。５ａｌｔ　３　ａからＰｓｉ　Ｉまでの（
第４λ図）約９５０ｂ、ｐ、断片を分離した。この断ハ
は、ＬｅｌＦ八に共通していない、１．ｅｒＦ　Ｂ遺伝
子の部分を含有した。

ＬｅｌＦ　Ａのｔｒｐプロモーター−オペレーター、リ
ボゾーム結合部位、ＡＴＧ開始シグナルおよびシスティ
ン］トンを含有する 約３００ｂ、ｐ、断片（ＩＩｉｎｄＩＩ［から５ａｌｌ
　３　ａまで）を、ｐＬｅｊＦ２５より分離した。

Ｐｓｔ　Ｊから）〜１ｉｎｄｌｆｆまでの約３６００１
１．１１、断片をＩ］ＢＲ３２２にり分離した。レプリ
」ンおＪ：びテトラサイクリン１氏抗１１が］−ドされ
ているが、アンピシリン抵抗性は含有しない。

段階３．４および５で得られた断ハをトリプル連結し、
生ずるプラスミドで１．ｃｏｌｉ　７１− 明細書の浄書（内容に変更なし） Ｋ−１２株２９４を転換した。

転換株はミニスクリーニング（バーンボイム（Ｂ　ｉ　
ｒｎｌ）ｏ　ｉｍ　）等、ヌクレイツク　アシド　リナ
ーヂ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　八ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、）　７
　、　１　５　１　３　−１５２３　（１９７９）　）
に処し、プラスミド試料はｒｃａｌｌＴで消化した。消
化物は３個の断片を与え！、二が、イれらの特徴は、１
）ＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ　ｔｒｐプトＩＴニーター
断片；２）Ｉｌｌ−４の内部ＥｃｏＲ■−ＥｃｏＲ■断
片；および３）　ｏｆ　４の蛋白質翻訳開始ジグ丈ルー
４ｃｏＲ’、ｌ断片。

ＣＰ　［分析で、上記のように調製したクローンより細
菌抽出物は、代表的には、Ａ３５ｏ−１で約１０　Ｘ　
１０６中位／１のインタフエロン活性を与えた。このＪ
：うに調製されたひとつの代表的なり１１−ンしり、　
Ｉ’、ｃｏｌｉ２９４／　ｐｌｅｌｌ　Ｂ　ｔｒｐ　７
である。このり［１−ンはＡＴＣＣに寄託されている。

１、　さらに別の成熟白面球インタフエロン（’Ｌｅ　
Ｉ　Ｆ＋−：　、　Ｄ　、　ｒ　、　ＩＩ　、　Ｉおに
び、」）の直接発現他のＬ（３１Ｆタイプを含有ツる追
加の完全長遺伝子断片は、ｔｅｌＦ八におＩｊると同様
に、ティラーし発　７２− ７２−１− 除去し、先行配列除去で失なわれたＮ−末端アミノ酸〜
」トンを合成りＮＡ断片の連結でおき代えるという、便
利な方法がとれるかどうかを決めうるよう、成熟インタ
フエロンタイプの第１のアミノ酸」トンに十分に近く制
限部位が存在するかどうかは、従来法による完全な配列
決定から分るであろう。それがうまくいかなければ、つ
ぎの操作を用いうる。要するに、成熟ポリペプチドの第
１のアミノ酸に対する」トンの開始する点より正確に前
のところで先行配列含有断ハを切断する。つまり １、　その点をとりまく領域内において２巾鎖ＤＮＡを
１巾鎖ＤＮＡに変える： ２、　段階（１）で生成した１重鎖の領域に目的とする
切断部位と結合するメクレオチドと反対側にプライマー
の５′末端が位置するようにしで、１重鎖ＤＮＡの相補
的なプライマーをバイブリド化する。

　７３− ３　プライン−より３′の方向にある、段階１で除かれ
た第２の鎖の部分を、アデニン、チミン、グアニンおよ
びシトシン含有デＡ′ヤシヌクレオブトトリホスフェー
トの存在でのＯＮ’Ａポリメラーゼを用いる反応で恢復
させる。

４、　切断しようどする点をこえて突出している、残存
する１重鎖ＤＮＡを消化づる。

翻訳開始シグナルＡ−ＴＧを、コード鎖の３′末端に有
する短鎖長合成りＮＡを、ついで、得られた成熟インタ
フエロンのために仕立上げられた遺伝子に、たとえば平
滑末端連結で連結し、そしてこの遺伝子を発現プラスミ
ドに挿入し、プロモーターおよびそれに組合わされたり
ボゾーｌ＼結合部位による調節下におく。

上記のに項で用いたのと同様にして、ｌｅｌ［Ｃおよび
ｔｅｌＦ　Ｄを］−ドする遺伝予断）１を、直接的細菌
による発現のために適当に配列し１こ。これらの追加の
白血球インタフエロンの発現のための戦略として、それ
ぞれの場合について、ｐｌ、ｅｌＦ　Ａ２’５７４− まりの１０■「への１１゛ｐプ【コモ−ター−オペレー
ター、リボゾーム結合部位、Ａ　Ｔ　Ｇ開始ジグプルお
よびシスｊインー］トンを含有する、約３００ｂ、ｌ）
、の断ｊ’、　（ｌＩｉｎｄｌ［ｌからＳａｕ　３　ａ
まで）を用いる。これに対して、すべてに共通である最
初のシスティンより向うの、それぞれのアミノ酸配列を
コードするその他のインクツコニロン遺伝子よりの遺伝
子断片を結合する。１りられたそれぞれのプラスミドを
用いてｒ、ｃｏｌ　ｉ　Ｋ−１２株２９４を転換した。

それぞれの遺伝子を形成するための結合は次のようであ
る。

しり。！］ ｐｌｅａｔＣＪ：り次の断片を分離する：（ａ）　Ｓａ
ｕ　３　ａからＳａｕ　９６までの３５ｂ、Ｉ）。

（Ｉ＋）　Ｓａｕ　９６からｐｓｔ　Ｉまでの＞９００
ｂ、Ｉ）（Ｃ１上記Ｋ（４）項におけるように、ｐｌ、
ｅＩＦ　Ａ−２５より約３００ｂ、ｐの断片（ｌｌｉｎ
ｄｌｌ　−５ａｕ３　ａ）を分離する。

（ｄ）上記Ｋ（５）項の約３６００ｂ、ｐ、の断片を分
離する。

　７５− １摩 （１）　（ａ）おＪ、び（Ｃ）を連結１−る。Ｂｇｌ　
ＴＩ　、　１ｌｉｎｄ■で切断し、約３３５ｂ、１１．
の生成物を分離する。

（２）　（１）　＋（１１）　（（（１）と！〜リアル
連結し、生ずるプラスミドでＥ、ｃｏｌｉを転換する。

このように調製された代表的４【クローンはＦ、ｃｏｌ
ｉ　Ｋ−１２株２９４　／　ｒｌｌ、ｅＴＦ　ＣｔｒＤ
　３５である。このり【］−ンはＡＴＣＣに寄託されて
いる。

ＬｅＩＦ　Ｄ ｐＬｅＩＦ　Ｄよりつぎのように分ｌ１ｌｌｌ？ｌる：
ａ）　Ｓａｕ　３　ａから八Ｖａ　Ｔ［までの３５ｂ、
ｐ。

ｂ）八ｖａｌｌＪ：すＢ（１１■までの１５０ｂ、ｐ。

ｃ）　Ｂｇｌ　ＩＩよりＰｓｔ　Ｉまで約７００ｂ、１
１゜ｐＬｅｌＦ　Ａ２５　Ｊ：す、つぎの断片を分＊ｔ
７１−る：ｄ）　１Ｉｉｎｄｌｌ［Ｊ：すＳａｕ　３　
ａまで３００ｂ、ｒ＋。

ｐＢＲ３２２よりつぎの断片を分離する：ｅ）　ｌ１ｉ
ｎｄＩＩＩＪ：すｐｓｔ　Ｉまで約３６００　ｂ、ｐ。

（１）　（ａ）　＋（１＋）を連結し、ＢＱＩ　ＩＩで
切断し、−７６＝ １８５ｂ、ｐ、生成物（１）を精製する。

（２）　（１）　＋−（ｄ）を沙結し、１ｌｉｒ＋ｒｌ
ｌｉ、Ｂｏｌ　ＩＩで切断し、そして、約５００ｂ、ｐ
、生成物（２）を精製する。

（３）　（２）　−）　（Ｃ）→（ｅ）を連結し、生ず
るプラスミドでｒ、ｃｏｌｉを転換する。

このようにして調製された代表的クローンは、Ｆ、ｃｏ
ｉｌ　Ｋ−１２株２９４　／　ｔｌｌ、ｅｌＦ　Ｄ　ｔ
ｒｐｌｌである。このクローンはＡＴＣＣに寄託されて
いる。

口状Ｌ」 １ｅＴＦ　Ｆを含有する断片は、１ｅｉＦＢおよびＬｅ
ＩＦ　Ｆの１から１３までのアミノ酸が完全に相同であ
ることを利用する再構成で直接的に発現するよう什立十
げることができる。上記の１１８　Ｇ　８．２０７より
、Ｐｓｔ　ＴおＪ：びＸｂａ　：［消化を経由し、つい
で約ｊＯ５０ｂ、　ｒｌ、の断片を分離することにより
、適当な配列末端をＱ’　７するｔｒｐプロモーター含
有断片（ａ）をうる。第２の断片（ｂ）は、プラスミド
ｒｌＨＫＹ１０のＰｓｔ　Ｉおよび１ｕｌｌ　ＩＩ消化
より生ず　７７− る断片の大きい方としてつる。断片（ａ）はアンピシリ
ン抵抗性を」１−ドする遺伝子の約半分を含有し：断片
（ｂ）は、その遺伝子の残りを含有し、また、組合わさ
れたプロモーター以外のテ１〜ラサイクリン遺伝子のす
べてを含有する。断）−７（ａ）および（ｂ）は丁４リ
ガーぜにより結合し、生成物を、Ｘｂ’ａ　ＩおよびＢ
（］ｌ　ｍで処理して、二聞化がおこらぬようにし、ｔ
ｃｐプロモーター−Ａ−ベレーターおよびテトラ勺イク
リンおよびアンピシリン抵抗ｖ１の遺伝ｆを含有１−る
断片（Ｃ）どする。

約５８０ｂ、ｐの断片（ｄ）はｐＬｅＩＦ　ＦのＡＶｔ
’ｌ　ＴＩおよびＢｇｌ　［の消化で得られる。これは
、１．ｅＴＦ　ｒの１４から１６６までのアミノ酸に対
する」トンを含有する。

断片（ｅ）　（４９ｂ、ｐ、）は、ｐＬｅｌＦ　ＢのＸ
ｂａ　ＴおよびＡｖａ　Ｉｆ消化で得られる。断片（ｅ
）は１．ｅＴＦ　Ｆのアミノ酸１から１３を］−卜する
。

断片（Ｃ）　、（ｄ）および（ｅ）は、Ｔ４リガー１の
存在で、トリプル連結する。それぞれ断１１の接着末端
は、複合プラスミドが正しく環状となり、テ　７８　− 明細書の浄書（内容に変更なし） トラ１ノイクリン抵抗性遺伝子が成熟１．ｅｌＦ　Ｆの
遺伝子とあわせて、ｔｒｐプロモーター−Ａペレーター
の調節下に入るようになっており、それで、望むプラス
ミドで転換した細菌は、テトラサイクリン含有プレート
十で選択しつる。このように調製された代表的クローン
は、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２株２９４／　ｒｌｌｅＨ
Ｆ　ｔｒＤｌである。このクローンはＡＴＣＣに寄託さ
れている。

１、ｅＨＩＩ 完全１ｅｌＦ　ＩＩ頂遺伝を、成熟白血球インタフエロ
ンどして発現さすために、つぎのＪ：うに配列しうる。

１、プラスミドｐ１．ｅＴＦ　Ｉｆを１ｌａｅ　ＩＴお
よびＲｓａ　Ｉ消化に処して、ジグプルペプチドアミノ
酸１０から３′非二１−ド領域までに及ぶ８１６ｂ、ｐ
、断片を分１１１１１−ｉＪる。

２　この断片を変性し、ＤＮＡポリメラーゼ■のにｌｃ
ｎｏｗ断片（クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）等、ブロク、す
１−ＪＬｔ　、　７’カド、サイ、米国（Ｐｒｏｃ、　
ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｉｌ、Ｓ、八、）６５−１１６８（１９７０）
）により、　７９− 明細書の浄書（内容に変更なし） 合成デオキシリボＡリゴヌクレオチドブライマ−７９−
１− ５’−ｄＡＴＧ　ＴＧｒ　ＡＡＴ　ＣＴＧ丁Ｃ「を用い
て修複合成に処する。

３　得られた生成物をＳａｕ　３　ａで切断し、１から
１５０のアミノ酸を現わす４・５２ｂ、ｐ、断片を分離
する。

４Ｓａｕ　３　ａおよびｐｓｔ　ＩでｐＬｅｌＦ　ＩＩ
を８１１化し、得られた５００ｂ、ｐ、断片を分離し、
１５０番目のアミノ酸からコード配列のＲ後までを］−
ドする遺伝ｆをうる。

５、　段階（３）および（４）で分離した断ハを連結し
て、断片 １　１６６ ｍａｔ　ｃｙｓ　ａｓｐ停止 ＡＩＧ　ＴＧＴ・・・−←−−シー・−・ＧＡＴ　、Ｔ
Ｇ八−・・・−Ｐｓｔ、ｌ５ａｕ　３　ａ をうる。これは１．、ｅｌｒ　Ｉｆの１６６個のアミノ
酸を−１−ドする。　・ ６、ＤＬｅｌＦ　八１ｒｐ　２５をＸｂａｉｒ消化し、
１）ＮＡポリメラ−１ｆｆｉＩを用いて平滑末端とし、
生成物をｐｓｔ、　Ｉで消化する。得られた大型断ハを
分　８０− 明細書の浄書（内容に変更なし） 離し、段階（５）の生成物と連結させて発現プラスミド
どじつる。これは、ｒ、ｃｏｌｉ　Ｋ　−１２株２９４
または他の宿主細菌の転換に用いて、成熟１、ｅｌＦ　
’Ｉｆを発現しうる。

しｅｌＦ　Ｉ ローン（１，ａｗｎ）等により構成されたヒトゲノムの
フェースλ　Ｃｈａｒｏｎ　’　４　Ａ組換えライブラ
リー（セル（Ｃｅｌ＋）　、上５’、１１５７　（１９
７８））を、−１−２引用のローン（Ｌａｗｎ）等の方
法およびマニアデス（ＨａｎｉａｔｉＳ）等、セル（Ｃ
ｅ１１）１上。

６８７（１９７Ｂ）の方法にＪ：す、白血球インタフエ
ロンに関してスクリーニングした。ｃＤ　Ｎ　Ａクロー
ン１．ｃｌＦ　八に由来する放射性１．ｅＴ［プローブ
を用いて、約５００．０００個のブラー□りをスクリー
ニングした。６個のＬ　ｅ　Ｉ　Ｆゲノムクローンを選
び出しＩこ。再スクリー“ニングおよびプラーク精製に
つづいて、これらのり１］−ンのうちのひとつλｌＩ１
．ｃｌＦ　２を選びさらに分析した。　□−に記の方法
を用いて、他のプローブも、ヒトゲノｌ＼からその他の
１０１１り［１−ンを分離するのに有　８１− 明細書の浄書（内容に変更なし） 利に用いつる。ついで、これらは、本発明による８１−
１− ぞの他の白面法インタフ１０ン蛋白質を製造するのに用
いつる。

１　り［］−］ンλ旧−ｅＩＦ２の２０００　ｂ、ｐ、
ＥｃｏＲＴ断片を、Ｅｃｏ８１部位においてｐＢＲ３２
５中へ、サブクｌ］−ン化した。、得られたプラスミド
１．ｅＩＦ　Ｉを［ｃｏＲＩで切断し、２０００ｂ、ｐ
断片を分離した。

この２０００　ｂ、ｐ、ＥｃｏＲＩ断ハにデ第４シオリ
ゴヌクレオチドｄＡＡＴ丁ＣＴＧＣＡＧ　（ＥｃｏＲＩ
　−Ｐｓｔ、Ｊ］ンバーター）を連結した。得られた生
成物をｐｓｔ　■で切断し、ｐｓｔ　Ｉ未満を有する２
０００ｂ、１１断ハとした。これを５ａｕ９６で切断ｌ
ノＩこ。ひとつのＰｓｔ　Ｉおよびひどつの５ａｕ９６
末端を有する１１００ｂ、ｐ断１１を分離した。

２、　プラスミドｐ１．ｃｌＦ　Ｃｔｒｐ　３５をｐｓ
ｔ　ＩおよびＸｂａ　Ｔで消化した。大型断片を分離し
た。

３、　ｐｌ、ｅｌ［Ｃｔｒｐ　３５　Ｊ：りの小型Ｘｂ
ａＬ−Ｐｓｔ　Ｊ断片をＸｂａ　Ｉおよび５ａｌｔ　９
６で消化した。

４０　ｂ、ｐ、Ｘｂａ　■−Ｓａｕ　９５断片を分離シ
タ。

４、　段階（１）　、　（２）および（３）より分−１
した断片を連結して、ｌ）１．ｅＩＦＩ　ｔｒｌｌ　１
発現プラスミドと−８２＝ した。このクローンはＡＴＣＣに寄託されている。

ｅｌＦ　Ｊ １、　プラスミドｐＬｅＴＦ　Ｊは、１．ｅＨＪｉｌ伝
子配子配列有するヒトゲノムＤＮＡの３．８１０ベース
旧ｎｄＩ［ｌ断片を含有乳［る。このプラスミドから７
６０　ｂ、Ｄ、Ｄｄｅ　Ｉ　−Ｒｓａ　ｌ断片を分離し
た。

２、　プラスミドｐ１．ｅｌＦ　Ｂ　ｔｒｐ　７を１ｌ
ｉｎｄｌｌｌおよびＯｄｅ　Ｉで切断し、３４０　ｂ、
ｐ、ｌｌ１ｎｄＩ［［−Ｄｄｅ　ｌ断片を分離した。

３　プラスミドｐＢＲ３２２をｐｓｔ　Ｔで切断し、１
’）ＮＡボリメラーｔ’Ｉとインギュベー１〜し、平滑
末端とし、（Ｋ　ｌｅｎｏｗ断片）、ツいで１ｌｉｎｄ
ｌＴＩで消化した。大型（約３６００ｂ、ｒ＋、、）断
片を分離した。

４　段階（１）　、　（２）および（３）で分離した断
片を連結して、発現プラスミドｐｌｅＨＪ　ｔｒｐ　１
とした。このクローンはＡＴＣＣに寄託されている。

Ｌ亙ｌ 細菌抽出物中の白面法インタフＴロン含有量は、つぎの
ようにして、増加させつる。

１、　ポリエチレンーイミン沈殿。ここで、イン　８３
− 明細書の浄書（内容に変ｙなし） タフＴ［［Ｔｌンを含めた細胞蛋白質の大部分は上清に
留まる。

２、　硫酸アンモニウム分画。ここで、インタフエロン
は、５５％飽和硫酸アンモニウムの溶液中から析出する
。

３、　硫酸アンモニ「クムペレットを０．０６Ｍリン酸
カリウム、１０　ｍＨＴｒｉｓ　−１１ｃＩ　、ｐＨ７
，２に懸濁さｔ！、　２５ｍＨＴｒｉｓ−ＩＩＣＩ　、
ｐＨ７，９に対して透析する。インタフ■ロン活性は溶
液中に残る。

４．１−記の上清をｐＨ８，５に調整してＤ［△ＦＥ−
１？ルロース力ラムでクロマトグラフィーを行う（２５
ｍＨＴｒｉｓ　−１１ｃＩ、ｐＨ８，５中Ｏから０．２
Ｍ　ＮａＣｌの直線勾配で溶出）。

５、　ブバクロムーブルーーアガロース（Ｃｉｂａｃｌ
ｌｒｏｍｅ　１３１ｔｉｅ−Ａ　ｇａｒｏｓｅ）または
ヒドロキシルアパタイト（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｐａｔｉ
ｔｅ　）に吸着させ、１．５８ＫＣＩまたは０．２Ｍリ
ン酸塩で溶出する（必要にＪ：り実施）。

６、　セフ／’デツクス（５ＯｐｈａｄｅＸ■）Ｇ−７
５力　８４− −８４−１−− 明細書の浄書（内容に変更なし） −［ルｌ］−ズー１−陽イオン交換クロマ１〜グラフィ
ーを行う。酢酸アンモニウム勾配（０，２Ｍ酢酸アン干
ニウムまで）で展開する。

Ｌ記の方法で〉９５％純酊の生成物を得る。

この物質はまた、］ノイズ排斥クロマトグラフィー、逆
相（Ｉｔｌ”−８）高圧液体クロマトグラフィー、Ｉ１
：たは固定化抗インタフ■ロン抗体−にのアフイニｊイ
ク［］７１゛・グラフィーで精製しうる。

刈払どじて、上記の段階４よりの物質をミルスティン（
Ｈｉ　１ｓｔｅｉｎ）　、サイエンティフィック　）７
メリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ）
　２４３．６６（１９８０）記載のように調整した七ツ
ク１］リール抗悼カラノ＼に加え、０．２Ｍｌ’ＩＩ酸
、０．１％１−リ１ヘン（１’ｒ　：　ｔｏｎ　）　ａ
−３よび０．１５ＨＮａＣＩで溶出しつる。

別様の右利な貝体例どして、上記操作で製造した白血球
インタフエロンをつぎの段階で精製しつる。

１、　発現された白面球インタフ■ロンを含有する凍結
細胞塊を、手作業または適当な粉砕装置で８５− −　８５−１　− （ｗ／Ｖ）スクロース、０．２ＨＮａＣＩ　、５　ｍＭ
ＥＤＴＡ、０．１ｍＨＰＭＳＦおよび１〇−１００ｍＨ
ＨＣｌＣＩ２含有緩衝液への４容吊中に懸濁させる。懸
濁液は豹４℃に保つ。

懸濁液は、約６０００ｐｓｉでホモジナイ１ｆ−を通し
、ついで、１０００ｐｓｉ以下で２度目を通す。

両方の通過よりのホモジナイザーからの流出液は、水浴
中で冷却する。

２、　ホモジネートにボリエブレンーイミンをゆっくり
と添加して、約０．３５％濃度とし、約３０分放置する
。固望物は遠心または濾過で除去する。この段階は、温
度を調節するかまたは、上清（濾液）を１０℃より低く
保つように十分にすみやかに実施する。上清（濾液）を
限外濾過で濃縮して、もとの容量の約１／１０とする。

粒状物またはにこりを認めたら、ミクロポアメンブレン
のような適当なフィルターで除去しうる。

３、　澄明化溶液は、５−８ｃｍ／時間（たとえば、直
径２．６ｃｍのカラムで、２５−４０　ｍｌ／ｕＸ！間
）でモノクロナル抗体カラムに直接流す。ついでこ　８
６− １１Ｃ１、ａｌｌ　７．５７４％、　５　（ＮａＣ１（
０，５Ｍ＞　ａよび１へり１ヘン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ
−１００（０，２％）または同等の表面活性剤含有）で
洗う。洗ったあと、このノコラムに０　、１５　）ＩＮ
ａ（’、ｌおよび１−リドン（ｌｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−
１００（０，１％）または同等の表面活性剤を含有する
約１０カラム容笛の溶液を通′？ｉｏこのカラムを１〜
す１−ン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００（０，１％）
または同等の表面活性剤を含有りる（’）、２ＭＭｔ酸
で溶出する。モノクロナル抗体カラムよりの蛋白質ピー
ク（ＬＪ　Ｖ吸収またはその伯の方法で測定）を集め、
Ｉ　Ｎ　Ｎａ０１１またはｊ、　ＯＭ　Ｔｒｉｓｍ　Ｍ
でｐＨを約４゜５に調整する。

４　プールされたインタフエ日ンピークを、適当な緩’
＆ｊＭたとえば酢酸アンモニウムｐｌ＋４、５　（５０
１１１８）　ｒ平衡させたボワットマン（Ｗｌｌａｔｍ
ａｎ　＞、、、　ＣＭ　５２　ｔルロースまたは同等の
陽イオン交換体に加える。加えたあど、カラムを平衡の
ための緩衝液で洗い、流出液のｊＪ　Ｖ吸収がたいらど
なるに至らＩ！、カラムからはほとんど蛋白　８７− １１７１細書の浄書（内容に変更なし）質が溶出しない
状態とする。

８７−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） カラムをついで、２５ｎＨ１４酢酸アンモニウム１０．
１２ＭＪ蕩化す１−リウムまたはインクフエロンの回収
を最高とする組合わせで溶出し、満足な外観および溶解
性を右する凍結乾燥ケーキとする。

下記（）にこの右利な具体例におりるモノクロナル抗体
は、スト−へリン（Ｓｔａｅｌｌｅｌｉｎ　）等がブロ
ク、すトル、アカド、リーイ、米国（Ｐ、ｒｏｃ、　Ｈ
ａｔ　ｌ　。

八ｃａｄ、Ｓｃｉ、１１．ｓ、八、＞　７８．　１８　
４８７５．２（，１９Ｂ　１．　）に記載した。方法で
調製しつる。モノクロナル抗体は、下記するように、精
製し、アフイ、ゲル（Ａｆｆｉ！３０１　）〜１０に共
遍結合させる。

腹水液Ｊ：りの七ツク［１ナル抗体の調製おにび精製１
ｔｌｔ　Ｂａ　ｌ　ｈ、／　ｃマウス５頭のそれぞれに
、対数増殖期の中間でとったハイブリドーマ（ｈｙｂｒ
ｉｄｏｍａ　）細胞の１．５−　Ｉ　Ｑｘ　１０　個を
接種した。マウスの生成する腹水液から得た約５×１０
　個の生育しうる細胞を、１０または１０頭より多くの
マウスのそれぞれに腹腔内接種した。この腹水液を各マ
ウスＪ：り反復（２から４回）採取した。ひとつのｎＴ
のマウスからつぎの群のマウスに、３回まで、−８８〜 −８８−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） かえ毎に、採取腹水液をプールした。

低速遠心（５００−１０００’ｘｇ）で１５分間処理し
、腹水液より細胞および残渣を除いた。ついで１Ｂ、Ｏ
ＯＯｒｌ）ｍで９０分遠心した。上清を凍結させマイナ
ス２０℃に貯蔵した。融解させてから、３５．００Ｏｒ
ｐｍで９０分間遠心シ、サラにフィブリンおにび粒状物
を除いた。各移しかえどどの腹水液のバッグについて、
固体相抗体結合試験（スト−へリン（Ｓｔａｅｈｅｌｉ
ｎ　）等、上記引用文献）により特異抗体活ｆ１を試験
し、満足ならばプールした。

プールされた溶液中の蛋白質瀧邸は、１　ｍｇの蛋白質
が１．０ｃｔｎの厚さのキ］ベツ１へで２８０　ｒｌｌ
ｌｌで１．２の吸光１＋ｆｉを示すという近似法で測定
した。

高Ｉ！ｉｉ１度の抗体を有り−る腹水液は３０−３５　
ｍｇ蛋白質／　１１１１８を含有Ｊる３、これは、／ｌ
−７１１ｒｆｌ特異抗体／ｍＱに相当する。この液体を
Ｐ１３８（０，０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７，３，
０，１５Ｍ　ＮａＣ１）で希釈し、１０から１２ｍ９／
ｒｒｔｌの蛋白質濃度としＩこ　。

８９− 明細書の浄書（内容に変更なし） 希釈溶液の各１００ｄに、室温で飽和した硫酸−８９−
１− 明°細書の浄書（内容に変更なし） アンモニウム溶液９０ｄを、０℃ではげしくかくはんし
ながら添加した。懸濁液を４０から６０分間水中に保っ
た。ついで、４℃で、１０．０００ｒｐｍで１５分遠心
した。−に清を（プいしゃしで除き、十分に液を切った
。蛋白質塊を０．０２Ｍ　ＴｒｉｓｌｌｃＩ　（Ｆｉｌ
ｌ　７．９）１０．０４Ｍ　１４８ｃｌ（緩衝液１）に
溶解した。蛋白質溶液を、１００容量の緩衝液■に対し
て、室温で１６から１８時間透析した。その間、少なく
とも１度緩衝液を交換した。

透析溶液を１５．０００ｒｐｍ　テＩ　０分間遠心し、
不溶物を除いた。股木中の全蛋白質の最初の量の約３０
から３５％が、２８０　ｎｍの吸光値より概算して採取
された。

次いで、１１ｄについて３０−４０ｍｇの蛋白質を含有
する溶液をバッファー（Ｂｕｆｆｅｒ　）　■で平衡さ
せたＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ−ｔル日−スカラムに加えた。添加
Ｊる蛋白質１グラムについて少なくとも１００ｍ１のカ
ラム床容量とした。Ｏ，’　０２Ｍ　Ｔｒｉｓ　ＩＩＣ
Ｉｐｌ！７．９中ＮａＣ１をＯ，’０４Ｍから０．５Ｍ
ＨａＣｌ濃度に直線状にＮａＣ１１１度を変化させて、
カラ９０− ９０−１− 明細書の浄書（内容に変更なし） 出しｌこ。０．０６から０．　１Ｍ　ＮａＣ１１７）ピ
ーク分画をプールし、等容量の硫酸アンモニウム飽和溶
１１１１、（室温）を加え沈殿遠心し、濃縮した。蛋白
質１３Ｍを０．２Ｍ　Ｈａｌｌ＋二０３（１）Ｉ＋約８
．０）１０、３Ｍ　ＮａＣＩ（Ｉｌｉｉ液■）に溶解し
、室温で、ｆｉｌし緩ｖＩＪ液（３庶交換）に対しで透
析した。透析した溶液を２０．０ＯＯＸ９で１５分遠心
し、不溶物を除いた。蛋白質潤度を緩衝液■で２０から
２５　ｍ９　／　ｍＱとした。

免疫吸着剤の調製 アノイゲル（八〇１ｏｃｌ　＞　−１０（バイオ　ラド
ラボラトリイス、リッチモンド、カリ小ルニア（Ｂｉｏ
　Ｒａｄ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＸＲｉｃｈｍｏｎ
ｄ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）をグラスフィルター−Ｌ
で水冷イソプロパツールで３度洗い、ついで水冷蒸留水
で３度洗った。ゲルスラリ＝（冷水巾約５０％）をプラ
スデックチューブに移し、短時間遠心して沈降させた。

上清をアスピレータ−で除き、パックされたゲルを等容
量の精製抗体溶液ど混合し、４℃で５時間、長軸が円状
に廻転Ｊるように回転した。反応後、ゲル　９１− 明細書の浄書（内容に変更なし） を遠心し、緩衝液ＩＩＩ　（０、Ｉ　Ｍ　Ｎａ１ｌＣ０
３１０、１５Ｍ　ＮａＣ１）　ｒ２ −９１−１一 度洗い、非結合抗体を除いた。洗液を合併し蛋白質を測
定すると、９０％以上の抗体がゲルに結合していた。

未反応の部分をふさぐために、ゲルを等容量の０．１Ｍ
１−タノールアミン・ＩＩｃＩ　（ｐｌ（８）と混合し
、長袖を円こ状に回転させて室温で６０分処理ｌノだ。

ゲルスラリーよりＰ　１３　Ｓで洗浄して反応剤を除き
、４℃で０．０２％（Ｗ／Ｖ）のアジ化ナトリウムの存
在でＰＢＳに貯蔵した。

Ｎ、非経口投与 １ｅｌＦは、抗肺瘍または抗ウイルス治療を要する患者
【こ非経１」投与しつる。また、免疫抑制状態を示す患
者にも投与しうる。投与量および投与割合は、ヒト由来
の物質について現在臨床的に行なわれているのと同様に
する。たとえば、約（１−１０）×１０６単位／日で１
％より大の純度の場合には、たとえば５×１０７単位／
日に及びつる。

非経［］投与用の形態とした本質的に均一な細菌性１ｃ
ｌＦの適当な投与形態では、たとえば、２×１０８単位
／ｌ１１ｇの比活性（７）　ＬｅｌＦ３１１１９を２５
ｍｅの−９２− 勧学的フイルターを通し、濾過溶液ケ無菌的に１００本
のびｌυに分【プて、非経１］投与に適やなｊ；うに、
１本が６×１０　単位純インタフエロンを含有するよう
にする。これらのびんは、使用前は冷所（−２０℃）に
保つのが望ましい。

本発明の化合物は、医薬として有用な組成物を調製する
ための既知の方法に従って製剤化できる。

その際、このポリペプチドは、医薬として許容されうる
担体ビヒクルと混合する。適当なビヒクルおよびそれら
の製剤化については、マーチン（Ｅ。

Ｗ、Ｈａｒｔｉｎ）にＪこるレミントンズ　ファーマレ
ウチカル　量ノーイエラス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　
ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）に記
載されているとａ３っである。これを、本明［の参考文
献として引用する。これらの組成物では、インタフエ［
］ン蛋白質の有効量と適当な量のビヒクルとをあわＶて
、宿主に対して効果的な投与とするに適当な、医薬とし
て許容されうる組成物とＪ−る。ひとつの有利な投与形
態は非経口投与である。

９３−

【図面の簡単な説明】

第１図は可能性のある＋−ｅｕプラスミドと３２ｐラベ
ル合成デオキシオリゴヌクレオチドとのバイブリド化を
示ずオー］〜ラジオグラムである。 第２図は、１．ｅｌＦクローン化ＣＤＮＡの８個の型（
Ａから１−１まで）の制限エンドヌクレアーゼ地図を示
す。 第３図は、成熟１ｅｌＦへの直接的微生物合成をコード
する遺伝子の構築を示す。 第４図および第５図はＬｅＩＦ　Ｂ成熟白血球インター
７１０ンを発現するために用いられる２つの遺伝子断片
の制限地図を示す。 代理人　浅　利　皓 　９４− 図面の浄書（内容に変更なし） ３２Ｐ−Ｔ−１ｃプローブ ３２Ｐ−Ｔ−１３Ｃプローブ Ｎ１図 暑謬 特開昭ＧＯ−２２７６９４（４０） 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号優先権主
張　［相］１９８岬９月８日［相］米国（Ｕ　Ｓ）［株
］１８４９０９■１９８師１１月１０日［相］米国（Ｕ
Ｓ）■２０５５７８［相］１９８１年４月２１日［相］
米国（ＵＳ）［有］２５６２０４＠発　明　者　シドニ
イ　ペスト力　アメリカ合衆国ニル、プルツクサイ ＠出　願　人　ゲネンテツク、インコ　アメリカ合衆国
カーボレーテッド　コ　ポイント　サ ＡＩＱ− １−シャーシー州ノース　カルドウエ ト　テラス　８２ リフオルニア州ザウス　サンフランシス／　ブルノ　ブ
ールバード　４６０ 手続補正書（方式） 昭和２θ年夕月２Ｒ日 特許庁長官殿 ■、事件の表示 昭和途７年特許願第コタ３９．Ｂ−刊 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所 ４、代理人 ５、補正命令の日付 図　面（第１１３Ｅ１３ ８、補正の内容　別紙のとおり 図面の浄書　（内容に変更なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　ヒト成熟白血球インタフエ［１ンの７アミノ酸
   配列を含むポリペプチドであって、部分アミノ酸配列Ｃ
   ｙｓ　−Ａｌａ　−Ｔｒｐ　−Ｇｉｌｌ　−Ｖａｌ　−
   Ｖａｌ　−Ａｒｇ　−八ｌａ　−Ｇｌｕ−−Ｉｌｅ　−
   Ｎｅｔ　−八ｒｊ］　−３Ｑｒ　を有することを特徴と
   し、そして先行配列を伴なわない場合は、１６５−１６
   ６個のアミノ酸をイラし、あるいはメチオニンが前記イ
   ンタフエロンの第１番目のアミノ酸のＮ末端に結合して
   いる場合は、１６６−１６７個のアミノ酸を右するポリ
   ペプチドを製造するに当り、このポリペプチドを発現し
   、複製しうる微生物発現ビヒクルで形質転換した微生物
   の培養物を発育させ、ポリペプチドを発現させそしてポ
   リペプチドを採取することを特徴とするポリペプチドの
   製造方法。 （２）　ポリペプチドが、先行配列を伴なわない場合は
   、１１４位にアミノ酸へｓｐ　、　ＧＩＬＩまたはＶａ
   ｌを有し、あるいはメチオニンがインタフエロンの第１
   番目のアミノ酸のＮ末端に結合しでいる場合は１１５位
   にアミノ酸Ａｓｐ’　、　Ｇｌ’ｕまたはｖａｔをｈす
   ることを特徴とする洪モ参参特許請求の範囲第１項のポ
   リペプチドの製造方法。　′（３）　ポリペプチドがヒ
   ト白血球インタフエロンＡ’（ｌ’、ｃＴＦ　八）であ
   る特許請求の範囲第１項のポリペプチドの製造方法。 （４）　ポリペプチドがヒ１−白血球インタフエロンＢ
   　（ｆｅｌ「Ｂ）である特許請求の範囲第１項のポリペ
   プチドの製造方法。 （５）　ポリペプチドがヒ１〜白血球インタフエロン０
   （１０１［Ｃ）である特許請求の範囲第１項のポリペプ
   チドの製造方法。 （６）　ポリペプチドがヒ］−白面録イン゛タフエロン
   Ｄ　（ｆｅｎ　Ｄ）である特許請求の範囲第１項のポリ
   ペプチドの製造方法。 （７）　ポリペプチドがヒト白面用（インタフエロンＦ
   （１０Ｉ［「）である特許請求の範囲第１項のボリペプ
   チドの製造方法。 （８）　ポリペプチドがヒ１〜白血球インタフＩ　ＩＴ
   ＩンＩ」（１，ｅＴＦ　Ｈ）である特許請求の範囲第１
   項のポリペプチドの製造方法。 （９）　ポリペプチドがヒＩ〜白面球インタフＴロンＩ
   　（ＬｅＩＦ　Ｉ）である特許請求の範囲第１項のポリ
   ペプチドの製造方法。 （１０）　ポリペプチドがヒト白血球インタフエロンＪ
   　（１，ｅｌｒＪ）である特許請求の範囲第１　ｒｎの
   ポリペプチドの製造方法。 （１１）　ポリペプチドが特許請求の範囲第３項〜第１
   ０項のいずれか一つのポリペプチドの対スＩ遺伝子変異
   によるポリペプチドである特許請求の範囲第１項のポリ
   ペプチドの製造方法。 （１２）　ポリペプチドが１ｅＴＦ　への対立遺伝子変
   異によるポリペプチドである特許請求の範囲第１項のポ
   リペプチドの製造方法。 （１３）　ポリペプチドがＩｅＴＦ　Ａと１個だりアミ
   ノ酸が異る特許請求の範囲第１項のポリペプチドの製造
   方法。 （１４）　ポリペプチドがＬｅＩＦ八と２３１立のアミ
   ノ酸が責る特許請求の範囲第１項のポリペプチドの製造
   方法。 （１５）　ポリペプチドが２３位にＡｒｇを含有する魚
   で１ｅｌＦ　Ａと異る特許請求の範囲第１項のポリペプ
   チドの製造方法。