JPS6362197B2

JPS6362197B2 -

Info

Publication number: JPS6362197B2
Application number: JP1022385A
Authority: JP
Priority date: 1985-01-22
Filing date: 1985-01-22
Publication date: 1988-12-01
Also published as: JPS61170388A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はセルラーゼ類の回収方法に関し、さら
に詳しくは、セルラーゼやヘミセルラーゼなどの
セルラーゼ類を用いたセルロース性物質の分解糖
化終了液から、残存する前記セルラーゼ類を極め
て簡単な処理によつて効率よく回収する方法に関
するものである。

従来の技術近年、エネルギー問題、環境汚染、未利用資源
の有効利用などの観点から、セルロース性物質の
糖化の研究が盛んに行われており、なかでも装置
や操作が簡単であつて、しかも温和な条件で行う
ことができ、その上生成した糖がそれ以上分解す
ることのない酵素糖化法が有効な方法として注目
されている。

この酵素糖化法においては、一般に、酵素とし
て用いるセルラーゼやヘミセルラーゼなどのセル
ラーゼ類を生産する費用が全経費の約半分を占め
るといわれており、そのためこの高価な酵素を回
収再利用することが極めて重要な問題となつてい
る。

したがつて、従来、糖化終了液からセルラーゼ
類を回収する方法として、限外ろ過による方法や
有機溶媒などを用いて沈殿させて回収する方法な
どが提案されている。しかしながら、前者の方法
においては、加圧下で行われるため、装置や操作
に多大の費用を要し、また後者の方法においては
溶媒の費用や回収などに問題があり、さらに両方
法とも処理中に酵素が失活する率が高いなどの欠
点がある。

発明が解決しようとする問題点本発明の目的は、このような従来のセルラーゼ
類の回収方法における欠点を克服し、セルラーゼ
類を用いたセルロース性物質の分解糖化終了液か
ら、残存するセルラーゼ類を極めて簡単な処理に
より、効率よく低コストで回収する方法を提供す
るものである。

問題点を解決するための手段本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、自然界に
豊富に存在するキチンから導かれたキトサン及び
部分脱アセチルキチンは酸性水溶液に容易に溶解
するが、中性又はアルカリ性水溶液には溶解しな
いこと、及びタンパク質に対して優れた親和力を
有することに着目し、これらをセルラーゼ類の吸
着剤として用いることにより、前記目的を達成し
うることを見出し、この知見に基づいて本発明を
完成するに至つた。

すなわち、本発明は、セルラーゼ類を用いたセ
ルロース性物質の分解糖化終了液から該セルラー
ゼ類を回収するに当り、分解糖化終了液を酸性に
調整し、これにキトサン又は部分脱アセチルキチ
ンを加えて溶解し、次いでこの混合物をアルカリ
性に調整して該セルラーゼ類を吸着したキトサン
又は部分脱アセチルキチンを析出させ、これを未
反応固形物とともに分離することを特徴とするセ
ルラーゼ類の回収方法、及び前記分解糖化終了液
からあらかじめ未反応固形物を分離したのち、こ
の液を酸性に調整し、キトサン又は部分脱アセチ
ルキチンを加えて溶解し、次いでこの混合物をア
ルカリ性に調整して該セルラーゼ類を吸着したキ
トサン又は部分脱アセチルキチンを析出させ、こ
れを分離することを特徴とするセルラーゼ類の回
収方法を提供するものである。

本発明方法において用いるセルロース性物質と
しては、例えば針葉樹や広葉樹、南洋材や北洋材
などから得られる木屑、のこぎり屑、樹皮、廃木
材などすべての木質が挙げられ、さらに農業廃棄
物として廃棄するために経費を必要とする稲ワラ
やサトウキビ、トウモロコシなどの廃棄物、ある
いは新聞紙、段ボールのような紙類などが挙げら
れる。

また、本発明方法において用いる酵素のセルラ
ーゼ類としては、例えばアスペルギルス属の菌体
や、トリコデルマ属の菌体などから生産されるセ
ルラーゼ又はセルラーゼとヘミセルラーゼを含む
酵素などが挙げられる。また、本発明において
は、これらの酵素はそれぞれ起源の異なるものを
単独で用いてもよいし、あるいは２種以上を同時
に用いてもよい。さらに酵素源として、これらの
酵素を含む菌体抽出液や菌培養液を用いることも
できる。

本発明方法の特徴は、セルラーゼ類の吸着剤と
してキトサン又は部分脱アセチルキチンを用いる
ことである。キトサンはえび、かになどの甲殻類
の外皮の構成成分であるキチンを、例えば濃度40
〜50重量％のアルカリ水溶液とともに60℃以上の
温度で加熱するという処理を繰り返すことによつ
て脱アセチル化した物質であり、Ｄ―グルコサミ
ンを基本単位とするβ―１，４結合より成る多糖
類の１種である。また、部分脱アセチルキチン
は、前記キチンを部分的に脱アセチル化したもの
であり、キトサンを製造する中間過程で得られ
る。このようなキトサン及び部分脱アセチルキチ
ンは、タンパク質に対して優れた親和力を有して
おり、特にセルラーゼ類の吸着剤として有効であ
る。また、これらは酸性水溶液に溶解するが、中
性又はアルカリ性水溶液には溶解しない性質を有
している。本発明方法は、キトサンや部分脱アセ
チルキチンが有するこのような性質を利用して、
セルラーゼ類を回収する方法である。

本発明方法においては、セルラーゼ類を用いた
セルロース性物質の分解糖化終了液から、残存す
るセルラーゼ類を回収するために、まず、該分解
糖化終了液を未反応固形物を含んだ状態で酸性に
調整し、これにキトサン又は部分脱アセチルキチ
ンを加えて溶解するか、又は前記分解糖化終了液
をろ過や遠心分離などの手段によつて溶液と未反
応固形物とに分離したのち、該溶液を酸性に調整
し、これにキトサン又は部分脱アセチルキチンを
加えて溶解する。この際、前記の分解糖化終了液
又はろ過液のPHは、キトサンや部分脱アセチルキ
チンを溶解し、かつこれらの変質や酵素の失活が
生じない程度に酸を加えて、通常2.3〜6.8の範囲
に調整されるが、一般に、セルラーゼ類によるセ
ルロース性物質の分解糖化は、酵素の安定性のた
めに酸性で行われているので、特に酸を加える必
要がない。PH調整を行う場合、使用する酸につい
ては特に制限はないが、酢酸や塩酸が好ましい。
また、セルロース性物質の分解糖化に、キトサン
や部分脱アセチルキチンが溶解しにくいPH緩衝液
を使用している場合は、添加するキトサンや部分
脱アセチルキチンの量に対して約1/10程度の酢酸
又は塩酸を加えることが望ましい。一方、キトサ
ン又は部分脱アセチルキチンの使用量は、セルラ
ーゼ類の残存量に対して２倍以上にするのが有利
である。

次に、このようにしてキトサン又は部分脱アセ
チルキチンを溶解した分解糖化終了液、あるいは
ろ過液をPH7.0〜10程度のアルカリ性に調整して、
セルラーゼ類を吸着したキトサン又は部分脱アセ
チルキチンを析出させる。このPH調整に使用する
アルカリについては、特に制限はないが、好まし
いのは水酸化ナトリウムや水酸化カリウムであ
る。次いで、析出したキトサン又は部分脱アセチ
ルキチンをろ過や遠心分離などの手段によつて分
離する。この際、分解糖化終了液をそのまま用い
たものでは、セルラーゼ類を吸着したキトサン又
は部分脱アセチルキチンは未反応固形物とともに
分離される。また、処理温度については、全工程
にわたつて、通常１〜60℃の温度範囲で操作され
る。

このようなセルラーゼ類の回収方法により、分
解糖化終了液又はろ過液中に残存するセルラーゼ
類の90〜95％が回収される。また、本発明方法に
おいては、該分解糖化終了液を溶液と未反応固形
物とに分離したのち、必要に応じ、該固形物中に
残存するセルラーゼ類を常法にしたがつて溶出し
て得られた希薄溶液を前記分離溶液に加え、この
混合溶液から前記のようにしてセルラーゼ類を回
収することもできる。

このようにして分離された、セルラーゼ類を吸
着しているキトサン又は部分脱アセチルキチン、
あるいはこれと未反応固形物との混合物を、新し
い基質を含むPH2.3〜6.8の水溶液又は緩衝溶液中
に添加し、さらに必要ならば新しいセルラーゼ類
を加えて分解糖化反応を行う。この分解糖化終了
液中に残存するセルラーゼ類は、キトサン又は部
分脱アセチルキチンを新しく加えずに、他は前記
と同様な操作によつて回収することができる。こ
のように、本発明方法においては、キトサン又は
部分脱アセチルキチンは繰り返し使用が可能であ
る。

発明の効果本発明方法によると、セルラーゼ類の吸着剤と
してキトサン又は部分脱アセチルキチンを用いる
ことにより、セルラーゼ類を用いたセルロース性
物質の分解糖化終了液から、該セルラーゼ類を極
めて簡単な処理で、効率よく低コストで回収する
ことができ、この方法を適用することにより、セ
ルロース性物質の糖化コストを大幅に節減するこ
とができる。

実施例次に実施例により本発明をさらに詳細に説明す
る。

実施例１ PH4.5の酢酸緩衝溶液100mlに粉砕したアカマツ
木粉４ｇを加え、さらに市販のトリコデルマ・ビ
リデ起源のセルラーゼ（セルラーゼオノヅカＲ―
10）300mgを加え40℃で24時間振りまぜたのち、
木粉の48％が分解した反応終了液を遠心分離し、
未反応固形物と溶液とに分離する。この溶液を分
析すると60％のセルラーゼが残存していた。

次に、分離した溶液にキトサン400mgを溶解し
たのち、室温において1Nの水酸化ナトリウム水
溶液でPHを9.0にする。もはや沈殿が生じなくな
つたのち、沈殿をろ別し得られた沈殿をPH4.5の
酢酸緩衝溶液60mlに加えて溶解した。セルラーゼ
を定量すると165mgであり溶解して残存していた
セルラーゼの92％を回収した。この液に2.4ｇの
アカマツ木粉を加えて40℃で24時間振りまぜたと
ころ、41％の分解率を得た。

この分解糖化終了液をそのまま室温で再びPH
9.5に調節し、沈殿の生成が終つた時点で、未反
応残渣とともに沈殿をろ別し、再びPH4.5の酢酸
緩衝溶液60mlに投入、さらに新しいアカマツ木粉
2.4ｇを加えて40℃で24時間反応させ、分解率38
％を得た。

実施例２さとうきびのしぼりカス（バガス）をアルカリ
処理により脱リグニンし、20メツシユ程度に粉砕
した粉末２ｇをPH4.0のクエン酸緩衝溶液50mlに
加え、さらにアスペルギルス・ニゲル起源のセル
ラーゼ（セルロシンAP）200mgを加えて48℃で24
時間振りまぜた結果、50％の分解率を得た。溶液
には円二色性測定により分析すると70％のセルロ
シンAPが残存していた。次に380mgの部分脱アセ
チルキチンと0.1mlの氷酢酸をこの溶液に加えて
溶解したのち、水酸化カリウム溶液でPH8.0に調
節し、生じた沈殿をろ別した。このろ液のセルラ
ーゼ含量を再び定量分析すると痕跡程度であり、
ほとんどのセルラーゼが部分脱アセチルキチンと
ともに除かれていた。

実施例３ 500ml容のフラスコに炭素源として適量のセル
ロース粉末を加えた水溶性栄養培地100mlを入れ
て滅菌したのち、トリコデルマ・ビリデQM414
を接種し、30℃の温度で好気条件下で６日間培養
した。培養液のPHは常に5.4に調節した。

別の100ml容のフラスコに粉砕したブナ木粉３
ｇを入れこれに前記培養液50ml（酵素含量120mg）
を加え45℃で24時間分解を行い40％の分解率を得
た。反応液には当初加えたセルラーゼの58％が残
存していた。次に、遠心分離により固形物と溶液
に分離し、この固形物1.8ｇを水100mlとPH4.6の
酢酸緩衝溶液40mlで処理し、固形物に残存するセ
ルラーゼ40mgを溶出した。前記遠心分離の上澄み
液に、未反応固形物よりセルラーゼを溶出した液
計140mlを加え、これにキトサン300mgを溶解した
のち、水酸化ナトリウム水溶液でPH9.0に調節す
る。もはや沈殿が生じなくなつた時点で沈殿をろ
別し、この沈殿を再びPH4.0の酢酸緩衝溶液40ml
に投入し、溶解したのち、さらにラワン材の粉末
1.2ｇを加え45℃で24時間分解を行い、分解率42
％を得た。

実施例４ 100ml容の三角フラスコにセルロシンAP75mgと
セルラーゼオノヅカＲ―10 75mgを入れ、PH4.5の
リン酸緩衝溶液50mlを加え、さらに新聞紙を乾燥
して粉砕した試料２ｇを加えて、45℃で24時間振
りまぜたところ、52％の分解率を得た。この液に
部分脱アセチルキチン350mgと1NHCl0.1mlを加
えて溶解したのち、1N NaOHでPHを9.0に調節
し、次いで生じた沈殿と未反応固形物をろ別し、
これらをPH4.8の酢酸緩衝溶液に加え、さらに２
ｇの前記新聞紙を加えて再び45℃で24時間振りま
ぜた結果、49％の分解率が得られた。

Claims

【特許請求の範囲】１セルラーゼ類を用いたセルロース性物質の分
解糖化終了液から該セルラーゼ類を回収するに当
り、分解糖化終了液を酸性に調整し、これにキト
サン又は部分脱アセチルキチンを加えて溶解し、
次いでこの混合物をアルカリ性に調整して該セル
ラーゼ類を吸着したキトサン又は部分脱アセチル
キチンを析出させ、これを未反応固形物とともに
分離することを特徴とするセルラーゼ類の回収方
法。２セルラーゼ類を用いたセルロース性物質の分
解糖化終了液から該セルラーゼ類を回収するに当
り、分解糖化終了液からあらかじめ未反応固形物
を分離したのち、この液を酸性に調整し、これに
キトサン又は部分脱アセチルキチンを加えて溶解
し、次いでこの混合物をアルカリ性に調整して該
セルラーゼ類を吸着したキトサン又は部分脱アセ
チルキチンを析出させたのち、これを分離するこ
とを特徴とするセルラーゼ類の回収方法。