JPS6399100A - 遊離プロタミンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「産業上の利用分野」 本発明は魚介類等の精巣から抽出調製されたプロタミン
酸性塩から遊離プロタミンを製造する方法に関する。

プロタミンは医薬品、食品保存料、生化学試薬等の利用
があるが、その製法上酸性塩として製造する方法が容易
であり製品としては酸性塩がほとんどであった。本発明
は今まで製法上問題が多く、製品化されていなかった遊
離プロタミンの簡易的な製造方法を提供せんとするもの
である「従来技術」 プロタミンは分子［４０００〜６０００の塩基性蛋白質
であり、魚介類精子核中でＤＮＡと結合したヌクレオプ
ロタミンとして存在し、遺伝情報調節に重要な（動きを
しているといわれている。このような、魚介類等の精子
核から抽出調製されたプロタミンは、塩基性蛋白質であ
るという性質から、遊離状態では不安定であり各種陰イ
オンと結合しやすいため、その分離精製において硫酸塩
、塩酸塩、硝酸塩等の酸性塩とするのが一般的である。

しかし、医薬品、食品添加物、生化学試薬等の分野では
プロタミンをより純粋な形にした遊離プロタミンとして
供給されることが望まれていた。

：ａｌｌｉ＆プロタミンの調製は、実験的にはプロタミ
ン硫酸塩から強塩基性の陰イオン交換樹脂により硫酸イ
オンを除去することにより可能である。しかし、種々の
問題点から工業的には生産されていない０本発明者はこ
の遊離プロタミンを効率的に工業生産する方法の開発を
進めた。

「発明が解決しようとする問題点」 遊離プロタミンの工業的調製法として発明者は第一にプ
ロタミン酸性塩のプロタミンに結合している陰イオンを
強塩基性イオン交換樹脂により除去する方法と、第２に
同様な塩基性蛋白質であるリゾチームで実施されている
アルカリ剤を添加して等電点にＰＨを調整し、遊離リゾ
チームを沈澱させる方法をプロタミンに応用するといっ
た２つの方法について考えて実験した。その結果、前者
のイオン交換樹脂法の欠点は、溶液反応であるため、プ
ロタミンの濃度は粘性を持たない程度の稀薄な濃度でな
らなければならないこと、そのため液量が多くなりイオ
ン交換反応後にａ１ｉｉ工程が必要となりその製造にお
いて工数と時間を費やし、しかも、ｅｍのランニングコ
ストがかかることなどがあげられる。さらにはイオン交
換にかかわる設備が高価であることもあげられる。

また、リゾチームで実施されている等電点沈澱法による
遊離型の製法では、プロタミンに関しては陰イオンが解
離せず遊離プロタミンは得られないことが、本発明者等
の研究の結果、明らかになった。

すなわち、本発明者等は、プロタミン酸性塩溶液にアル
カリ剤を加えてプロタミンの等電点（ＰＩ＝１２．５）
において有機溶媒を加えて沈澱させたところ遊離プロタ
ミンを得ることはできなかった。しかし、プロタミンの
塩基性はその約７割を占める塩基性アミノ酸のアルギニ
ンに由来し、陰イオンはアルギニン側鎖のグアニジル基
と結合しているが、等電点においても容易に解離しない
理由は、その結合が単なるイオン的な結合ではなく、蛋
白質としての立体構造的な安定性によるものと考えられ
る。

本発明は、この問題点について、過剰のアルカリ剤を添
加してプロタミンと陰イオンとの結合を解離させた後沈
澱させることによって解決し、遊離プロタミンを工業的
に効率良く製造する方法を提供するものである。

「問題点を解決するための手段」 本発明者等は問題点を解決するための手段としてプロタ
ミン酸性塩溶液に対してアルカリ剤の添加量をふやして
等電点以上にする、すなわちプロタミン酸性塩の陰イオ
ンの当量に対して５倍以上の当量のアルカリ剤を添加し
た後、プロタミンを沈澱させることによって遊離プロタ
ミンを得ることができ、本発明に到達した。

本発明において用いられるプロタミン酸性塩は、サケ、
マス、スケソウタラ等の精子核より硫酸・塩酸等の希鉱
酸、ＮａＣ１等の高濃度塩類及びＳＤＳ　（ドデシル硫
酸ナトリウム）等の界面活性剤で抽出し精製されたもの
で、プロタミン硫酸塩、塩酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の
酸性塩であればいずれの形でも用いることができる。

また、添加するアルカリ剤はＮａＯＨ，ＫＯＨ，Ｂａ　
（ＯＨ）２、ＮＨ４ＯＨ等の水酸化物であれば本発明に
使用可能であり、その添加量はプロタミン酸性塩の陰イ
オンの当量に対して５倍以上の当量であればよい。

次に遊離プロタミンを沈澱させる方法としてはエチルア
ルコール、メチルアルコール、アセトン等のプロタミン
を沈εさせることのできる水に可溶の有機溶媒をプロタ
ミン溶液に対して２倍以上加えるか、又はさらにアルカ
リ剤を加え、その濃度を１０％以上にして塩析作用をす
ることにより′Ｍ遊離プロタミン沈澱させることができ
る。

沈澱させた後は一般的方法で製品とすることができる。

たとえば、沈澱を遠心分離により回収し、凍結乾燥、粉
砕することにより製品となる。

また、製品として高純度が要求される場合、限外濾過、
イオン交換等で沈澱にわずかに混入する塩類を除去する
ことによって、高純度のＭ＃プロタミンを製造すること
が可能である。

「作　用」 ′Ｍ遊離プロタミン製法としては叙上のように強塩基性
陰イオン交換樹脂によりプロタミン酸性塩の陰イオンを
樹脂に吸着させ除去する方法とプロタミンの等重点にお
いて遊離プロタミンを沈澱させる方法が考えられる。実
験の結果等電点において沈りさせるという考え方は、同
じく塩基性蛋白質であるリゾチームの製造に用いられて
おりその製法を応用したのであるが、この方法ではプロ
タミンと陰イオンが解離せず、′ＭｌｌＩＩプロタミン
を得ることはできなかった。ところが、アルカリ剤をプ
ロタミン酸性塩の陰イオンの当量に対して５倍当量以上
加えると、アルカリ剤の陽イオンが過剰に存在するため
、陰イオンの解離度が大きくなり遊離プロタミンを得る
ことができた。この方法を用いた遊離プロタミンの実際
の製造ではアルカリ剤添加後有機溶媒でプロタミンを不
溶化して沈澱させるか、又は、さらにアルカリ剤を加え
その濃度を１０％以上にし、塩析作用により沈澱させた
後に遠心性ｍ機により沈澱を回収して凍結乾燥、粉砕し
て製品とすることが望ましい。

この方法はプロタミンを沈澱物として回収できるため、
イオン交換樹脂による方法と比較して濃縮工程がないた
め、濃縮装置を導入する必要がなく、濃縮に要する時間
、濃１ｉｉ装置のランニングコスト等を削減できるとい
うメリットがある。

さらにはイオン交換に関する設備を投資する必要がない
こともあげられる。

このように、遊離プロタミンの沈毅法として有機溶媒を
添加してプロタミンを析出、沈澱させる方法と、アルカ
リ剤の濃度が１０％以上になるように添加して塩析作用
によって沈澱させる方法との２つがある。塩析による沈
澱法は蛋白質の沈澱法としては一般的であり、塩析剤と
しては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の中性の
塩類を用いるのが普通であるが、これを遊離プロタミン
の塩析剤として使用した場合、前述のようにプロタミン
の立体的不安定性から陰イオンと再び結合し、塩析され
たものはプロタミン酸性塩となることが本発明者等によ
って確認されている（実施例３参照）従って、本発明の
アルカリ剤による塩析作用によってプロタミン酸性塩の
陰イオンを解離させることと、遊離プロタミンを沈澱さ
せることが同時に可能であるため、より望ましい方法で
ある。

「実施例」 第１実施例、第２実施例は沈澱に有機溶媒を用いたもの
であり、第３実施例は塩析作用により沈澱させたもので
ある。

実施例１ プロタミン硫酸塩の１％溶液１０１００Ｏに対してＮ　
ａＯＨを第２表に示す割合で加えた後、アセトンを６０
００ｍ１加えてプロタミンを沈澱させた。３０００ｒｐ
ｍ、１０分間の遠心分離でプロタミンを回収し凍結乾燥
して硫酸イオンを測定した。第１表に示すごと＜ＮａＯ
Ｈをプロタミンと結合している硫酸イオンの当量の５倍
以上加えることにより陰イオンの混入が１％以下の遊離
プロタミンが得られることがわかった。

実施例２ プロタミン塩酸塩の１０％溶液１００ｍ１に対してＮ　
ａＯＨを第１表に示す割合で加えた後、エチルアルコー
ルを１００ｍ１（エチルアルコール濃度は５０％となる
）を加え沈澱させ、３０００ｒｐｍｌＯ分間の遠心分離
によってプロタミンを回収し、凍結乾燥して塩素イオン
を測定した。第２表に示すごと＜　Ｎ　ａＯＨをプロタ
ミンと結合している塩素イオンの当量の５倍以上加える
ことにより陰イオンの混入が１％以下の遊離プロタミン
が得られることがわかった。

実施例３ プロタミン塩酸塩の１０％溶液５００ｍ１に塩素イオン
の当量の５倍当量のＮ　ａＯＨを加えた後、ＮａＯＨ，
ＮＨ４Ｃｌを第３表に示す濃度になるように加え、３０
０Ｏｒｐｍ、１０分間の遠心分離によってプロタミンを
回収し、凍結乾燥して塩素イオンを測定した。第３表に
示すごとく、ＮＨ４Ｃｌを用いて塩析した場合は遊離プ
ロタミンを得ることはできないが、Ｎ　ａ　ＯＨ濃度が
１０％以上で塩析すると塩素イオンの混入が１％以下の
遊離プロタミンが得られた。尚、ＮａＯＨ濃度１０％は
この場合プロタミン塩酸塩の塩素イオンの当量の９倍に
相当する。

「効　果」 本発明は叙上のようにプロタミン酸性塩にプロタミンと
結合している陰イオンの当量の５倍以上のアルカリ剤を
添加することにより解離状態にしたのち有機溶媒を加え
て沈澱させるか、又はアルカリ剤による塩析で遊離プロ
タミンを沈澱物として製造する方法である。

従って１本発明は従来技術であるイオン交換樹脂法の問
題点である製造工程中の液量が多く濃縮工程のための工
数と時間を費やすことと、ｅ１ｉ！装置、イオン交換装
置の設備投資が必要であるという点を解消できた。すな
わち本発明により従来技術に比べて工程上、設備上の簡
略化が可能となった。また、本発明は従来技術である等
電点沈澱法ではプロタミンと結合している陰イオンを解
離させることができないという問題点を解決し、簡単に
プロタミンを遊離させることができたもので非常に有益
である。

叙上のように本発明は従来製法上の問題から実現しなか
った遊離プロタミンを効率的に工業生産し、医薬品、食
品添加物、生化学試薬等の分野に供給できるようにした
という点で極めて有益である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）プロタミン酸性塩溶液にプロタミンと結合してい
   る陰イオン当量の５倍以上のアルカリ剤を添加して解離
   状態にしたのち、有機溶媒を用いるか、或いはアルカリ
   剤による塩析で遊離プロタミンを沈澱させるようにした
   ことを特徴とする遊離プロタミンの製造法。
2. （２）上記アルカリ剤による塩析の場合、アルカリ剤の
   濃度を１０％以上にすることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項記載の遊離プロタミンの製造法。