JPS645021B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵素的に得たＬ―メチオニンオリゴマ
ーを酸性媒体中で加水分解するＬ―メチオニンの
製造法にする。 更に詳細には、本発明はＬ―メチオニン残基を
含み、そして５〜10残基、平均８残基の鎖長を有
するオリゴマーより実質的に成る酵素的に得たＬ
―メチオニンオリゴマーを中間生成物としてその
使用に関する。 大豆たん白、葉のたん白および微生物たん白の
ような含硫アミノ酸に本来乏しい或る種の食品成
分は、特に食事療法もしくは幼児の適用に対して
は、メチオニンで強化することができ、もしくは
強化しなければならない。 年間100000tの規模で化学合成により生産され
るDL―メチオニンはヒトの消費用食品に確実に
使用できるようにはなつていないので、特に家畜
および家禽に消費される。 ヒトに関する限りＬ―メチオニンのみが現在で
は使用が考慮されている。Ｌ―メチオニンは年間
50〜100tの規模で２個の光学的対称体の酵素分割
によりDL―メチオニンから製造される。このた
めにＬ―メチオニンはDL―メチオニンより約10
倍高価である。 メチオニンのオリゴマー、特に２量体は化学的
に合成されている： ―Ｎ―カルボベンゾキシメチオニンのようなＮ―
保護メチオニンをシクロヘキシルカルボジイミ
ドのようなカツプリング剤の存在でメチオニン
エチルエステルと反応させ保護基を開裂される
ことにより、 ―遊離アミノ酸の存在で、無加熱およびPH値10の
水性媒体中でＮ―カルボキシアンヒドリドもし
くはLeuchのアンヒドリドから（Hirschmann
法）。 これらの方法は高価であり、不安定生成物もし
くは純度が保証されなければならないカツプリン
グ反応剤を使用する。 更に、高分子量のポリ―Ｌ―メチオニンはＮ―
カルボキシアンヒドリドから無水媒体中で重合に
より得られた。しかし、この方法は取扱いの困難
なLeuchのアンヒドリドの使用も含む。 従つて、これらの方法は高価格および食品衛生
上純度保証を要するために食品添加物の製造には
決して使用されなかつた。 従つて消化条件でＬ―メチオニンを遊離するＬ
―メチオニンの安全な代替物かもしくはかなり適
度の価格で入手しうるＬ―メチオニンが有するで
あろう利益を評価することは容易である。 本発明は正確にこれらの２目的に適合するＬ―
メチオニン残基を有し、５〜10残基、平均８残基
の鎖長オリゴマーより実質的に成り、そして60〜
90重量％に達するＬ―メチオニン含量を有るＬ―
アミノ酸オリゴマーを供する。１態様では、オリ
ゴマーはＬ―メチオニン残基より成るホモ―オリ
ゴマーである。このようなオリゴマーは水および
水性バツフアーに不溶で、ジメチルスルホキシド
（DMSO）に可溶である。その全窒素含量は9.5〜
10.5％となり、その比族光度〔α〕²⁵ _Dは−12〜14゜
（DMSO）にある。 「水に不溶」なる表現は試験管内でオリゴ―Ｌ
―メチオニンは水に有意に溶解しないことを意味
すると理解される。このことは水性媒体および生
物学的液体中の生体内にその溶解度を決して事前
判定するものではない（むしろその反対）。 一変形では、オリゴマーはヘテロ―オリゴマー
である。すなわちメチオニン残基の他に、他のア
ミノ酸残基を含む。このようなオリゴマーはグル
タミン酸もしくはアスパラギン酸のような極性ア
ミノ酸残基がそこに導入されることを条件とし
て、たとえば水性媒体に溶解する。 別法では、たとえばトリプトフアン、フエニル
アラニンもしくはチロシンのような芳香族アミノ
酸残基の導入により、酵素加水分解を促進する、
パンクレアチンプロテアーゼに対する付加的開裂
部位を創ることによつてＬ―メチオニンのホモ―
オリゴマーよりパンクレアチン酵素に関して一層
消化性であることができる。 更に、オリゴマーはたとえば胃の中で遭遇する
ような酸性PH條件下でＬ―メチオニンを遊離す
る。従つて、オリゴーＬ―メチオニンを通して本
発明の開示で以下に記載するようにDL―メチオ
ニンからＬ―メチオニンを得ることができること
は認められるであろう。本方法は全体として、酵
素の介在を含むが、上記酵素による分割方法より
Ｌ―メチオニンの製造に一層良く適する。 本発明は又Ｌ―アミノ酸オリゴマーの製造方法
をも供し、その方法はメチオニンエステルおよび
任意には１種もしくはそれ以上の他のアミノ酸エ
ステルを、５〜７のPH値を有し、チオール―プロ
テアーゼが活性を有する温度で水性媒体中でチオ
ール―プロテアーゼと反応させ、その後反応媒体
から形成したＬ―アミノ酸オリゴマーを単離する
ことより成る。 出発メチオニンはＬ―メチオニンかもしくは
DL―メチオニンであることができることは指摘
される。後者の場合に、反応媒体は未反応Ｌ―メ
チオニンをエステル形で含む。 メチオニンエステル、好ましくはメチルもしく
はエチルエステルの製造は簡単な複雑でない準備
工程である。含まれる操作はメチオニンを相当す
るアルコールと塩化チオニル（SOCl₂）の存在で
反応させることによりきわめて容易に行なうこと
ができる。 ヘテロ―オリゴマーの場合には、所要量のアミ
ノ酸を上記のように製造したエステル、好ましく
はメチルもしくはエチルエステル形で、メチオニ
ンエステルおよびチオール―プロテアーゼより成
る反応混合物に添加するだけで十分である。たと
えばDLもしくはＬ―トリプトフアン、DL―チロ
シン、α，γ―ジエチルグルタメートエステルを
使用することができる。DL―アミノ酸が出発に
使用される場合にはＬ―残基の上記のようにメチ
オニンに対し得られるであろう。 使用されるチオール―プロテアーゼは好ましく
はパパイン、フアイシン、もしくはブロメリン
で、これらは安価で豊富な酵素である。それらの
場合に、反応は30〜50℃の範囲の温度で好ましく
は37℃のオーダーの温度で行なわれる。 使用される水性反応媒体は全く簡単には水であ
ることができる。その場合、PH値は上記限定内に
好ましくは一定であることを確保するために監視
されるべきである。酵素反応進行につれて、たと
えば2N苛性ソーダのようなアルカリ剤が添加さ
れるであろう。別の可能性は水性媒体としてバツ
フアー溶液、たとえばカルボン酸ソーダ塩、クエ
ン酸ソーダ、コハク酸ソーダ、酢酸ソーダなどの
バツフアー溶液を使用することである。 水性媒体のPH値は酵素反応に対する決定因子で
あり、きびしく５〜７のPHに保持すべきである。
有利にはこのPH値は反応が水中で行なわれる場合
6.5近辺に、反応がバツフアー中で行なわれる場
合5.5近辺に選択される。 オリゴマーの形成される酵素反応が完了する
と、初めの透明反応溶液は乳サスペンジヨンに変
化した。次に有利には酵素は、たとえば90℃に簡
単に加熱することにより失格される。その後所要
オリゴマーを形成する固相は液相から分離され
る。不純物および２枚反応生成物の他に、反応媒
体は、出発アミノ酸がDL形である場合、未反応
Ｄ―アミノ酸をエステル形（メチルもしくはエチ
ルエステル）で溶液中に含む。 オリゴマーの純度を改善するために、固相は水
で自由に洗條される。相の分離は遠心分離により
容易に行なうことができる。 精製は固相を水に再サスペンドした後、透析も
しくは限外濾過により行なうこともできる。透析
濾過すなわち保留物の稀釈を伴う限外濾過を適用
することが好ましい。その場合、稀釈はレベルを
一定に保持しつつ連続的に、もしくはバツチにお
いてさえ稀釈することなく限外濾過し、次いで次
の限外濾過工程前に初めのレベルに再調整するこ
とにより行なうことができる。 この処理は上記の特性を有し、特性記述方法が
実施例で示されるＬ―アミノ酸オリゴマーを与え
る。酸性媒体中のペプシンの存在では、本発明に
よるオリゴマーは加水分解され、多くにはジ―Ｌ
―メチオニンおよび―Ｌ―メチオニンを随伴する
Ｌ―メチオニンを与える。ホモ―オリゴマーの場
合には、オリゴーＬ―メチオニンはメチオニンが
不足する食品添加物の強化でＬ―メチオニン固有
の機能を果すことができることは指摘される。 高酸性条件下では、オリゴーＬ―メチオニンは
無視しうる程度のラセミ化を含むＬ―メチオニン
に開裂される。酸性媒体中で加水分解によるDL
―メチオニンからオリゴーＬ―メチオニンの製造
は、ラセミ化合物からＬ―メチオニンを製造する
すばらしい方法を表わす。 本発明方法の第１態様では、メチオニンエステ
ルの塩酸塩は水に好ましくは１〜2Mの濃度で溶
解される。PHは反応中2N NaOHを添加すること
により6.5に一定に保持される。使用メチオニン
がDL―メチオニンである場合、その濃度は勿論
出発メチオニンがＬ―メチオニンである場合より
２倍高い。 主としてパパイン、ブロメリンもしくはフイシ
ンの酵素は２重量％の量で、好ましくは１％ずつ
２回の添加で添加される。反応が完了すると、す
なわち約６時間後に、乳サスペンジヨンが形成さ
れ簡単に90℃に加熱して含まれる酵素が失活され
る。２相（固相および液相）は分離され、その後
固相―オリゴーＬ―メチオニンを表わす―は透析
濾過により洗條される。 第２態様では、反応は5.5近辺のPH値で、クエ
ン酸ソーダ、コハク酸ソーダもしくは酢酸ソーダ
のバツフアー中で行なわれる。 上記と同じ実験方法はヘテロ―オリゴマーの場
合、当該アミノ酸エステルの各種塩酸塩を第１工
程で選択された割合で水に溶解することにより適
用することができる。 次例は本発明を例示し、オリゴーＬ―メチオニ
ンを特徴ずけるために使用された方法を記載す
る。これらの例において引用の割合および％は重
量値を表わす。 例１ （参考） Ｌ―メチオニンエチルエステルの塩酸塩をＬ―
メチオニンのエタノール溶液にSOCl₂を作用させ
て通例方法で製造する。 こうして形成させた塩酸塩は次に１mlにつき
300mgの量（1.4M）で水に溶解する。溶液は反応
中2N NaOHを添加して6.5にPH値を保持するた
めにPHスタツトに入れる。 Ｌ―システイン中の0.1Mパパイン水溶液は次
に酵素の１重量％の量で添加する。１時間後、別
の１％の酵素を上記と同じ方法で添加する。 37℃で、6.5に厳密に一定に保持したPHで、６
時間の反応時間後、初め透明の反応媒体は乳サス
ペンジヨンに変化した。次にこのサスペンジヨン
は簡単に90℃に加熱し、酵素を失活させ、次いで
固相を分離して自由に水で洗條する。 粗製オリゴーＬ―メチオニンを表わすこうして
分離した固相は20倍の水に再サスペンドし、次に
Amicon UM10膜を備えた限外濾過セルに2.5気
圧の窒素圧および４℃の温度で導入する
（Amiconは商標である）。限外濾過はその容積が
初めの容積の1/20に減少するまで継続し、その後
初めの容積は水を加えて回復させ、そして方法は
反復する。約100容の濾液を回収した時に限外濾
過は停止し、保留物は凍結乾燥により乾燥する。
この保留物は精製オリゴーＬ―メチオニンを表わ
す。 オリゴーＬ―メチオニンの特性記述 KBr中の１％濃度の固形状態の赤外（I.R.）
スペクトルは次の特性バンドを示す： 3230cm^-1（Ｓ）：α，β構造のＮ―Ｈストレツチ
特性 1710cm^-1（Ｗ）：Ｃ＝Ｏ：末端カルボキシ基 1620cm^-1（Ｓ）：Ｃ＝Ｏストレツチ：アミドバン
ド 1520cm^-1（Ｓ）：Ｎ＝Ｈ歪：アミドバンド 700cm^-1（ｍ）：プレーンの外側の振動：アミド
バンド ジメチルスルホキシド（DMSO―db）中の
精製オリゴーＬ―メチオニンのプロトンの80M
Hzにおける核磁気共鳴（N.M.R.）スペクトル
は次の特性信号を示す： 8.2ppm：多重線(2)：末端アミノ基H₂N― 4.4ppm：多重線（約10×２）：メチレンプロトン
―Ｏ―CH ₂ −CH₃ 2.4ppm：多重線 1.8ppm：シヨルダーαβおよびγプロトン 2.0ppm：単線（約10×２）：チオエーテルプロト
ン―Ｓ―CH ₃ 1.2ppm：３重線(3)：メチルプロトン ―Ｏ―CH₂―CH ₃ ジメチルスルホキシド（DMSO）中の微細
Sephadex G25レジン上の溶離プロフイルはオ
リゴーＬ―メチオニンは比較的均質で、主なピ
ークは―溶離容積および作用条件によれば―オ
クタマーに相当することを示す（Sephadexは
商標である）。 他の特性データーは以下に示す： ―水および水性バツフアーに不溶、 ―ジメチルスルホキシド（DMSO）に可溶、 ―9.5〜10.5％の全窒素含量、比旋光度〔α〕²⁵ _D
＝−12〜−14゜（DMSO）、 ―円形２色性θ＝1922゜、230および195nmにお
ける２個のネガテイブバンド ―加水分解によりエステル基の開裂後６〜10メ
チオニン残基を含むオリゴマーに対する理論
（計算）元素分析と比較した元素分析：％Ｏ
＝45.22、％Ｈ＝7.62、％Ｎ＝10.58、平均数
８の残基に相当する、―メチオニン含量78〜
90％。 例２ （参考） 例１記載の方法をＬ―メチオニンの代りにDL
―メチオニンを２倍の濃度で使用し反復する。 透析濾過後、物理性およびIRおよびNMR―ス
ペクトルが示すように例１と同じオリゴーＬ―メ
チオニンを得る。 例３ （参考） Ｌ―メチオニンを使用するが、酵素としてパパ
インの代りにフイシンで例１記載の方法を反復す
る。 得たオリゴーＬ―メチオニンは例１のものと同
じである。 例４ （参考） メチオニンメチルエステルはメチオニンのメタ
ノール溶液にSOCl₂を作用させて製造し、塩酸塩
の形で単離する。 例１のエチルエステルの代りにこのメチルエス
テルを相当する割合で使用し、例１記載の方法を
反復する。 例１のものと同じオリゴＬ―メチオニンをこう
して得る。 例５ （参考） 反応媒体として水性バツフアーを5.5のPHを有
するクエン酸ソーダ1M溶液の形で使用すること
により、例１記載の方法を修正する。この場合、
PHは反応中一定に保持するのでNaOHは添加す
る必要がない。その他については方法は例１記載
のとおりである。 例１記載のものと同じオリゴーＬ―メチオニン
をこうして得る。 例６ （参考） DL―メチオニンで出発する例２記載の方法を、
前例によるPH5.5の0.1M酢酸ソーダバツフアーを
使用し反復する。もう１度DL―メチオニンの濃
度はＬ―メチオニンの濃度の２倍である。 前例記載のものと同じオリゴーＬ―メチオニン
をこうして得る。 実施例 １ 前例記載のオリゴーＬ―メチオニンを２重量％
の量の豚のペプシンにより酵素分解する。このた
めにオリゴーＬ―メチオニンは２重量％の量で、
PH２および37℃の温度に24時間懸濁させる。この
時間が過ぎると、85％のオリゴーＬ―メチオニン
は可溶性生成物に変換する。これらの可溶性生成
物は実質的に遊離Ｌ―メチオニン（Ｌ―メチオニ
ンエチルエステルの痕跡量を随伴する）およびジ
―Ｌ―メチオニンおよびトリ―Ｌ―メチオニンよ
り成る。 実施例 ２ 例１〜６記載のオリゴーＬ―メチオニン１ｇを
約20時間105〜110℃で、約500mlの6N塩酸中で窒
素下に酸加水分解する。次に酸は減圧蒸留して除
き、加水分解物は水中に採取する。クロマトグラ
フ的に（薄層）および電気泳動的に純粋Ｌ―メチ
オニンは約１〜2.5％のＤ―メチオニンと共にそ
こで識別される。存在する少量のＤ―メチオニン
はオリゴマー中の残留Ｄ―メチオニンの存在かも
しくは化学的加水分解により生ずるラセミ化に基
因することができる。単離および再結晶アミノ酸
は＋22〜＋23゜（6NHCl）の比旋光度〔α〕²⁵ _Dを有
する。市販品の分析品質を比較することによりＬ
―メチオニンは＋23.7゜±0.5゜の旋光度〔α〕²⁵ _Dを有
する。 例７ （参考） 約１ミリモル／mlのDL―メチオニンエチルエ
ステルの塩酸塩および0.25ミルモル／mlのα，γ
―ジエチルグルタメートを水に溶解する。生成溶
液は40℃でPH―スタツトに入れる。PHは
2NNaOHを添加して6.5に保持する。次にパパイ
ンを１mg／mlの量で添加する。一定PHで６時間の
反応時間後、酵素を失活させ、遠心分離により分
離した白色沈でんは例１記載のように限外濾過し
て処理する。次に生成物は0.2NNaOH溶液に分
散し環境温度で２時間撹拌後、透明溶液を得る。
溶液のPHは6N塩酸を添加して10まで下げる。そ
の後溶液はSephadex Ｇ―10カラムで処理し、過
剰の塩を除き、ペプチツドを溶離する。得た中性
溶液は真空濃縮し、凍結乾燥する。このアミノ酸
の分析は生成物が約65％のメチオニンに対し34〜
35％のグルタミン酸より成ることを示す。 ヘテロ―オリゴマーの20℃における水への溶解
度は１mg／mlのオリゴーＬ―メチオニンに対し
200mg／mlである。 オリゴマーの異る溶解度は反応混合物のグルタ
ミン酸およびメチオニンの割合を変えることによ
り得ることができる。たとえばグルタミン酸がオ
リゴマーの8.5％を表わす場合、オリゴマーは５
〜10mg／mlの溶解度を有する。 例８〜９ （参考） １ミルモル／mlのDL―メチオニンエチルエス
テルの塩酸塩および0.25ミルモル／mlのDL―ト
リプトフアンエチルエステルの塩酸塩を例１記載
の酵素処理にかけ、アミノ酸分析によれば11±
3.5％のトリプトフアンを含む（例８）白色水不
溶性粉末を得る。 DL―トリプトフアンの代りに0.25ミルモル／
mlのＬ―チロシンエチルエステルの塩酸塩を使用
する上記と同じ処理は、14±２％のＬ―チロシン
を含むヘテロ―オリゴマーを得る（例９）。 反応媒体にトリプトフアンもしくはチロシンを
添加することは次に示すように、パンクレアチン
プロテアーゼによるオリゴマーの酵素分解を促進
する： オリゴマーの５％水分散液はPH８のPH―スタツ
トおよび40℃の温度で５mg／mlのパンクレアチン
により分解させる。異る時間に試料はニンヒドリ
ンと反応させ、可溶性フラクシヨンのα―位置に
おける窒素含量を決定する。結果は次表に示す： 【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ DL―メチオニンのエステルとPH５〜７の水
   性媒体中チオールプロテアーゼとをこの酵素の活
   性温度で反応させついで得られたＬ―メチオニン
   のオリゴマーを酸性媒体中にて加水分解すること
   を特徴とする、Ｌ―メチオニンの製造法。