JPS645875B2 - - Google Patents
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- JPS645875B2 JPS645875B2 JP54127754A JP12775479A JPS645875B2 JP S645875 B2 JPS645875 B2 JP S645875B2 JP 54127754 A JP54127754 A JP 54127754A JP 12775479 A JP12775479 A JP 12775479A JP S645875 B2 JPS645875 B2 JP S645875B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
- C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
- C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
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- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
-
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
- C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01108—Lactase (3.2.1.108)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
- C12Y305/02006—Beta-lactamase (3.5.2.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
- A23C2220/00—Biochemical treatment
- A23C2220/10—Enzymatic treatment
- A23C2220/104—Enzymatic treatment with immobilised enzymes
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- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
本発明は水に不溶でかつ酵素的に活性な固定化
ラクターゼおよびその製造法に関し、より詳しく
はマクロ多孔型フエノールホルムアルデヒド系酸
性かつ塩基性の両性イオン交換樹脂にアスペルギ
ルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）起源のラ
クターゼを固定化して得られる、乳糖分解能力が
高く、安定で水に不溶は固定化ラクターゼおよび
その製造法に関する。 本発明の目的は基質の乳糖への連続的接触反応
を可能にし、反応溶液を固定化ラクターゼから分
離すると反応が停止するという簡単で効率的な使
用を可能にする固定化ラクターゼおよびその製造
法を提供することにある。 酵素を固定化すると、本来均一水溶液反応の触
媒である酵素を反復および連続使用することが可
能になる。かくして工業的使用における固定化酵
素の有用性のために近年数多くの酵素固定化技術
が開発されている。（例えば、ザボロスキー著；
“インモウビライズド エンザイムス”シー・ア
ール・シー・プレス〔C.R.Zaborsky、
Immobilized Enzymes、C.R.C.Press〕1973年あ
るいは千畑一郎編、固定化酵素、講談社1975年）
これまでに公知の固定化酵素の製造方法は次の４
種に大別されよう。(1)吸着法 (2)共有結合法 (3)
包括法 および (4)架橋法 である。各方法には
それぞれ長所と短所があり一概にどの方法が優れ
ているとは云えない。しかも多種多様の酵素の全
てに適した固体化担体および固定化酵素製造法は
殆んどない。実際には、酵素の種類あるいは固定
化酵素の使用条件等に合わせて、目的に合致した
優れた固定化酵素を与える担体および製造法が
個々に選ばれるべきである。その上国際生化学連
合（IBU）酵素委員会報告（1964年）に準拠する
酵素番号において同一番号に分類される酵素であ
つても酵素の起源が異なれば、分子量のみならず
酵素的性質も非常に異なる酵素がある事が注意を
要する。この様な場合、非常に優れた固定化酵素
を与える酵素−担体−固定化法の組み合せは同一
番号の酵素であつてもその起源によつて異つてく
るのは当然である。 さて、ラクターゼ（β−ガラクトシダーゼ）
（酵素番号３、２、１、23）は乳糖（ラクトース）
をグルコースとガラクトースに加水分解する酵素
であり、動植物更には多くの細菌、かびおよび酵
母によつて生産される事が知られている。ラクタ
ーゼは乳糖をグルコースとガラクトースに加水分
解するという作用のみが同一で、他の酵素的性質
が異る多種類の酵素が存在する一つの典型的な例
である。たとえば、微生物起源のラクターゼだけ
に限つても大腸菌、Echerichia coli（E.coliと略
記）起源のラクターゼは菌体内酵素で分子量52万
ないし54万、至適PHがPH7.3で酵素の触媒化学的
特性を表わすミカエリス定数KmはONPG（オル
トーニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド）および乳糖に対して各々9.5×10-4Mおよび
7.5×10-3Mである。一方Saccharmyces fragilis
またはSaccharomyces lactis等の酵母起源のラ
クターゼも菌体内酵素であるが分子量は20万であ
り、E.coli起源の酵素の1/2以下で、至適PHはPH
6.5ないしPH7.0、ONPGおよび乳糖に対するKm
もE.coli起源のラクターゼの値とはかなり違つて
いる。更にかびの一種Aspergillus niger起源の
ラクターゼは菌体外酵素であり、至適PHはPH3.5
と低く、分子量も10万ないし11万程度と信じられ
ている。また類似のかびAspergillus oryzae起源
のラクターゼは至適PHがPH4.5ないしPH5.0である
以外にもいくつかの点でAspergillus niger起源
の酵素と異つている。（以上はC.D.Boyer編
「The Enzymes」第３版 ７巻 617頁より663頁
まで、およびその中に引用されている各文献より
引用。）この様に起源の異るラクターゼはとても
同一の構造および性質を持つた化合物（蛋白質）
とは考えられない。ただ乳糖をグルコースとガラ
クトースにあるいはアリールまたはアルキル−β
−Ｄ−ガラクトシドをアルコールとガラクトース
に加水分解するという点にのみ同一性を有する酵
素であることがわかる。従つて一種のラクターゼ
に適した担体および固定化法でもつてあらゆる起
源のラクターゼに適していることが云えない事が
理解できる。たとえばU.S.Patent3767531号には
フエノール性水酸基とメチロール基以外アミノ
基、置換アミノ基あるいはカルボキシメチル基等
の官能基を持たないフエノールホルムアルドヒド
樹脂を担体としてグルタルアルデヒドで
Aspergillus niger起源のラクターゼを固定化す
る方法が開示されている。しかしこの担体および
固定化法があらゆる起源のラクターゼに適してい
るのではない事が後で見る通りである。 さてラクターゼの工業的利用法の一つは乳糖不
耐症者のための牛乳中の乳糖の加水分解であり、
もう一つはホエー（乳清）中の乳糖の加水分解で
ある。従つて主としてこの２つへの応用を目的と
し、しかも実際に工業的利用に適したと考えられ
る微生物起源のラクターゼおよびその製造技術の
開発に多大の努力が払われている。（たとえば、
H.H.WeetallとS.Suzuki編“Immobilized
Enzyme Technology”、Plenum Press、New
York（1975年）あるいはA.C.OlsonとC.L.Cooney
編、“Immobilized Enzymes in Food and
Microbial Processes”Prenum Press、New
York（1974年）等参照）とりわけホエーは膜技術
の発達により高分子量の蛋白質部分と乳糖を主成
分とする低分子量を容易に分離出来る様になつて
来ている。かくして固定化ラクターゼによる乳糖
の加水分解とその加水分解物の食品工業への利用
に関しては今や機が熟していると考えられ、多数
の研究例があるにもかかわらず現在のところ殆ん
ど実用化されていない。その理由は牛乳と酸性ホ
エーの両方に有効なラクターゼが少い事やガラク
トースによる生成物阻害の問題等いくつか挙げら
れるが主なものは次の２つである。 (1) 乳糖に対して高活性で安定かつ適度な価格で
生産されうるラクターゼが少なかつた。 (2) 乳糖に対して高活性で安定な固定化ラクター
ゼが開発されていない。 ラクターゼの工業的利用という観点から、より
重要と考えられる固定化ラクターゼの製造に関し
ては前述の様に全ての起源のラクターゼ一般に対
して最適の固定化法というのは殆んど期待でき
ず、優れた固定化ラクターゼの開発のためには、
(ア)起源の違いによる酵素の種類 (イ)担体 (ウ)固定
化法の３つの最適組み合せを十分考える必要があ
る。換言すれば実用上最も優れていると思われる
ラクターゼを選び、そのラクターゼに最適の優れ
た担体に、工業的使用方法も考慮して、固定化法
を定める事である。この事は当然ラクターゼのみ
ならずあらゆる種類の固定化酵素に当てはまる。
こうした観点から本発明者らは新規の優れた固定
化担体を開発して来た。（たとえば特願昭53−
26913号） こうした担体のうちで特願昭53−26913号に開
示されている担体の一つである比表面積が１m2／
ｇ以上でかつ細孔直径が100Åないし2000Åのマ
クロポアーの容量の合計が0.1c.c.／ｇ以上であり、
アミノ基または／および置換アミノ基に基づく陰
イオン交換容量を1meq／ｇ以上有し、かつカル
ボキシメチル基に基づく陽イオン交換容量を
0.5meq／ｇ以上有するマクロ多孔型フエノール
ホルムアルデヒド系両性イオン交換樹脂を担体と
し、Aspergillus oryzae起源のラクターゼをグル
タルアルデヒドで処理し、共有結合的に固定化さ
せて得られた固定化ラクターゼは活性が高く、高
い塩濃度の基質溶液を用いた場合にも酵素の脱離
がなく、安定であることを見い出し本発明を完成
した。本発明による固定化ラクターゼは酵母起源
のラクターゼやAspergillus niger起源のラクタ
ーゼの固定化酵素よりも広いPH範囲で有効であ
り、かつ低温10℃以下においても十分なる活性を
有するなど工業的利用の観点から優れた性質を有
している。 本発明におけるマクロ多孔型フエノールホルム
アルデヒド系両性イオン交換樹脂は上記の特性を
有していればいかなる方法で製造されたものでも
良い。本発明の具体的説明に際して使用した担体
は市販のフエノールホルムアルデヒド縮合物を樹
脂母核とするマクロ多孔型陰イオン交換樹脂にカ
ルボキシメチル基を付与し両性イオン交換樹脂と
したものであり、その製造法は特願昭53−26913
号に開示されている。しかし他の公知の方法によ
つて製造したものでも良い。形状はグラニユー状
またはビーズ状であつてその大きさはおよそ12メ
ツシユ（1410μ）から60メツシユ（250μ）程度の
ものが好ましい。あまり大きいと空隙体積
（Void volume）が大きくなり体積当りの活性は
小さくなる。一方あまり細かい破片では圧損が大
きくなり過ぎたり、あるいは固定化酵素と反応液
の分離がむつかしくなつたりして好ましくない。 本発明におけるラクターゼはAspergillus
oryzaeの一株菌より分泌酵素として得られるも
ので以下に述べる様な性質を持つている。 (ア) 至適PHと活性のPH依存性； 基質が乳糖の場合もONPGの場合も共に至
適PHはPH4.5ないしPH5.0である。13.3（ｗ／ｖ）
％の乳糖溶液に対する相対活性のPH依存性が図
１に示されている。30℃においてPH4.5の活性
に対するPH6.5の活性の比率は0.65±0.05程度で
ある。 (イ) ミカエリス定数Km； PH4.5、30℃において乳糖を基質とした場合、
Km0.10±0.05mole／。 (ウ) ガラクトースによる阻害定数Ki； PH4.5、30℃において乳糖を基質とした場合、
Ki＝0.007±0.004mole／。 以上によつてラクトースの特性はほぼ定義さ
れるが更にいくつかの性質を以下に示す。 (エ) PH安定性； 40℃で１時間各PHの緩衝液に浸漬した場合PH
4.0からPH7.5の間では非常に安定で活性の低下
は全くない。 (オ) 温度安定性； PH4.5及びPH6.5共に50℃以下の温度では30分
間浸漬による失活は全くない。以下に55℃以上
の温度にPH4.5とPH6.5で30分間浸漬したときの
残存活性を示す。
ラクターゼおよびその製造法に関し、より詳しく
はマクロ多孔型フエノールホルムアルデヒド系酸
性かつ塩基性の両性イオン交換樹脂にアスペルギ
ルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）起源のラ
クターゼを固定化して得られる、乳糖分解能力が
高く、安定で水に不溶は固定化ラクターゼおよび
その製造法に関する。 本発明の目的は基質の乳糖への連続的接触反応
を可能にし、反応溶液を固定化ラクターゼから分
離すると反応が停止するという簡単で効率的な使
用を可能にする固定化ラクターゼおよびその製造
法を提供することにある。 酵素を固定化すると、本来均一水溶液反応の触
媒である酵素を反復および連続使用することが可
能になる。かくして工業的使用における固定化酵
素の有用性のために近年数多くの酵素固定化技術
が開発されている。（例えば、ザボロスキー著；
“インモウビライズド エンザイムス”シー・ア
ール・シー・プレス〔C.R.Zaborsky、
Immobilized Enzymes、C.R.C.Press〕1973年あ
るいは千畑一郎編、固定化酵素、講談社1975年）
これまでに公知の固定化酵素の製造方法は次の４
種に大別されよう。(1)吸着法 (2)共有結合法 (3)
包括法 および (4)架橋法 である。各方法には
それぞれ長所と短所があり一概にどの方法が優れ
ているとは云えない。しかも多種多様の酵素の全
てに適した固体化担体および固定化酵素製造法は
殆んどない。実際には、酵素の種類あるいは固定
化酵素の使用条件等に合わせて、目的に合致した
優れた固定化酵素を与える担体および製造法が
個々に選ばれるべきである。その上国際生化学連
合（IBU）酵素委員会報告（1964年）に準拠する
酵素番号において同一番号に分類される酵素であ
つても酵素の起源が異なれば、分子量のみならず
酵素的性質も非常に異なる酵素がある事が注意を
要する。この様な場合、非常に優れた固定化酵素
を与える酵素−担体−固定化法の組み合せは同一
番号の酵素であつてもその起源によつて異つてく
るのは当然である。 さて、ラクターゼ（β−ガラクトシダーゼ）
（酵素番号３、２、１、23）は乳糖（ラクトース）
をグルコースとガラクトースに加水分解する酵素
であり、動植物更には多くの細菌、かびおよび酵
母によつて生産される事が知られている。ラクタ
ーゼは乳糖をグルコースとガラクトースに加水分
解するという作用のみが同一で、他の酵素的性質
が異る多種類の酵素が存在する一つの典型的な例
である。たとえば、微生物起源のラクターゼだけ
に限つても大腸菌、Echerichia coli（E.coliと略
記）起源のラクターゼは菌体内酵素で分子量52万
ないし54万、至適PHがPH7.3で酵素の触媒化学的
特性を表わすミカエリス定数KmはONPG（オル
トーニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド）および乳糖に対して各々9.5×10-4Mおよび
7.5×10-3Mである。一方Saccharmyces fragilis
またはSaccharomyces lactis等の酵母起源のラ
クターゼも菌体内酵素であるが分子量は20万であ
り、E.coli起源の酵素の1/2以下で、至適PHはPH
6.5ないしPH7.0、ONPGおよび乳糖に対するKm
もE.coli起源のラクターゼの値とはかなり違つて
いる。更にかびの一種Aspergillus niger起源の
ラクターゼは菌体外酵素であり、至適PHはPH3.5
と低く、分子量も10万ないし11万程度と信じられ
ている。また類似のかびAspergillus oryzae起源
のラクターゼは至適PHがPH4.5ないしPH5.0である
以外にもいくつかの点でAspergillus niger起源
の酵素と異つている。（以上はC.D.Boyer編
「The Enzymes」第３版 ７巻 617頁より663頁
まで、およびその中に引用されている各文献より
引用。）この様に起源の異るラクターゼはとても
同一の構造および性質を持つた化合物（蛋白質）
とは考えられない。ただ乳糖をグルコースとガラ
クトースにあるいはアリールまたはアルキル−β
−Ｄ−ガラクトシドをアルコールとガラクトース
に加水分解するという点にのみ同一性を有する酵
素であることがわかる。従つて一種のラクターゼ
に適した担体および固定化法でもつてあらゆる起
源のラクターゼに適していることが云えない事が
理解できる。たとえばU.S.Patent3767531号には
フエノール性水酸基とメチロール基以外アミノ
基、置換アミノ基あるいはカルボキシメチル基等
の官能基を持たないフエノールホルムアルドヒド
樹脂を担体としてグルタルアルデヒドで
Aspergillus niger起源のラクターゼを固定化す
る方法が開示されている。しかしこの担体および
固定化法があらゆる起源のラクターゼに適してい
るのではない事が後で見る通りである。 さてラクターゼの工業的利用法の一つは乳糖不
耐症者のための牛乳中の乳糖の加水分解であり、
もう一つはホエー（乳清）中の乳糖の加水分解で
ある。従つて主としてこの２つへの応用を目的と
し、しかも実際に工業的利用に適したと考えられ
る微生物起源のラクターゼおよびその製造技術の
開発に多大の努力が払われている。（たとえば、
H.H.WeetallとS.Suzuki編“Immobilized
Enzyme Technology”、Plenum Press、New
York（1975年）あるいはA.C.OlsonとC.L.Cooney
編、“Immobilized Enzymes in Food and
Microbial Processes”Prenum Press、New
York（1974年）等参照）とりわけホエーは膜技術
の発達により高分子量の蛋白質部分と乳糖を主成
分とする低分子量を容易に分離出来る様になつて
来ている。かくして固定化ラクターゼによる乳糖
の加水分解とその加水分解物の食品工業への利用
に関しては今や機が熟していると考えられ、多数
の研究例があるにもかかわらず現在のところ殆ん
ど実用化されていない。その理由は牛乳と酸性ホ
エーの両方に有効なラクターゼが少い事やガラク
トースによる生成物阻害の問題等いくつか挙げら
れるが主なものは次の２つである。 (1) 乳糖に対して高活性で安定かつ適度な価格で
生産されうるラクターゼが少なかつた。 (2) 乳糖に対して高活性で安定な固定化ラクター
ゼが開発されていない。 ラクターゼの工業的利用という観点から、より
重要と考えられる固定化ラクターゼの製造に関し
ては前述の様に全ての起源のラクターゼ一般に対
して最適の固定化法というのは殆んど期待でき
ず、優れた固定化ラクターゼの開発のためには、
(ア)起源の違いによる酵素の種類 (イ)担体 (ウ)固定
化法の３つの最適組み合せを十分考える必要があ
る。換言すれば実用上最も優れていると思われる
ラクターゼを選び、そのラクターゼに最適の優れ
た担体に、工業的使用方法も考慮して、固定化法
を定める事である。この事は当然ラクターゼのみ
ならずあらゆる種類の固定化酵素に当てはまる。
こうした観点から本発明者らは新規の優れた固定
化担体を開発して来た。（たとえば特願昭53−
26913号） こうした担体のうちで特願昭53−26913号に開
示されている担体の一つである比表面積が１m2／
ｇ以上でかつ細孔直径が100Åないし2000Åのマ
クロポアーの容量の合計が0.1c.c.／ｇ以上であり、
アミノ基または／および置換アミノ基に基づく陰
イオン交換容量を1meq／ｇ以上有し、かつカル
ボキシメチル基に基づく陽イオン交換容量を
0.5meq／ｇ以上有するマクロ多孔型フエノール
ホルムアルデヒド系両性イオン交換樹脂を担体と
し、Aspergillus oryzae起源のラクターゼをグル
タルアルデヒドで処理し、共有結合的に固定化さ
せて得られた固定化ラクターゼは活性が高く、高
い塩濃度の基質溶液を用いた場合にも酵素の脱離
がなく、安定であることを見い出し本発明を完成
した。本発明による固定化ラクターゼは酵母起源
のラクターゼやAspergillus niger起源のラクタ
ーゼの固定化酵素よりも広いPH範囲で有効であ
り、かつ低温10℃以下においても十分なる活性を
有するなど工業的利用の観点から優れた性質を有
している。 本発明におけるマクロ多孔型フエノールホルム
アルデヒド系両性イオン交換樹脂は上記の特性を
有していればいかなる方法で製造されたものでも
良い。本発明の具体的説明に際して使用した担体
は市販のフエノールホルムアルデヒド縮合物を樹
脂母核とするマクロ多孔型陰イオン交換樹脂にカ
ルボキシメチル基を付与し両性イオン交換樹脂と
したものであり、その製造法は特願昭53−26913
号に開示されている。しかし他の公知の方法によ
つて製造したものでも良い。形状はグラニユー状
またはビーズ状であつてその大きさはおよそ12メ
ツシユ（1410μ）から60メツシユ（250μ）程度の
ものが好ましい。あまり大きいと空隙体積
（Void volume）が大きくなり体積当りの活性は
小さくなる。一方あまり細かい破片では圧損が大
きくなり過ぎたり、あるいは固定化酵素と反応液
の分離がむつかしくなつたりして好ましくない。 本発明におけるラクターゼはAspergillus
oryzaeの一株菌より分泌酵素として得られるも
ので以下に述べる様な性質を持つている。 (ア) 至適PHと活性のPH依存性； 基質が乳糖の場合もONPGの場合も共に至
適PHはPH4.5ないしPH5.0である。13.3（ｗ／ｖ）
％の乳糖溶液に対する相対活性のPH依存性が図
１に示されている。30℃においてPH4.5の活性
に対するPH6.5の活性の比率は0.65±0.05程度で
ある。 (イ) ミカエリス定数Km； PH4.5、30℃において乳糖を基質とした場合、
Km0.10±0.05mole／。 (ウ) ガラクトースによる阻害定数Ki； PH4.5、30℃において乳糖を基質とした場合、
Ki＝0.007±0.004mole／。 以上によつてラクトースの特性はほぼ定義さ
れるが更にいくつかの性質を以下に示す。 (エ) PH安定性； 40℃で１時間各PHの緩衝液に浸漬した場合PH
4.0からPH7.5の間では非常に安定で活性の低下
は全くない。 (オ) 温度安定性； PH4.5及びPH6.5共に50℃以下の温度では30分
間浸漬による失活は全くない。以下に55℃以上
の温度にPH4.5とPH6.5で30分間浸漬したときの
残存活性を示す。
【表】
PH4.5とPH6.5による差違はない。
(カ) 活性化エネルギーEa；
PH4.5で13.3（ｗ／ｖ）％濃度の乳糖溶液を基
質にした場合のアレニウスプロツトは曲率を持
つが30℃ないし40℃におけるEa＝９±3kcal／
mole。 もちろん以上の数値は酵素反応の測定において
通常認められる実験誤差を含んでいる。以上の性
質に合致するラクターゼであれば製造法には何ら
制限はない。この様なラクターゼは通常粉末状態
あるいは場合によつては溶液状態で保管される。
活性に関しては、固定化ラクターゼの工業的利用
を目的とする本発明の趣旨からもあまり低活性の
酵素を用いることは意味がない。従つて未固定の
粉末酵素１mg当り15ILU以上の活性を持つものを
使用するのが好ましい。更に好ましくは40ILU／
mg以上である。 (注) 本出願において１単位即ち1ILUのラクター
ゼはPH4.5、30℃において13.3（ｗ／ｖ）％濃度
の乳糖溶液を基質とし、１分間に1μmoleのグ
ルコースを生成する酵素量として定義される。
生成したグルコース量はグルコースオキシダー
ゼーパーオキシダーゼー色素系を用いて定義さ
れる。なお、活性（単位）測定において反応温
度あるいは反応のPHが上記と異なる場合がある
のでその都合測定PHと温度を記載することにす
る。 本発明の固定化ラクターゼの製造に関しては製
造された固定化ラクターゼが本発明の範囲内にあ
れば、いかなる方法を採用しても良い。実際には
次の２種の製造法が現実的であると思われる。 第１の方法は、PH4.0からPH6.5の範囲内の緩衝
液に溶解したラクターゼ溶液に担体を浸漬し、こ
のPH範囲で、ラクターゼを担体に吸着させる。つ
いで、ラクターゼを吸着している担体をグルタル
アルデヒドと接触させ、すなわち、PH3.5ないし
PH7.0のPH範囲内に調整したグルタルアルデヒド
水溶液に酵素を吸着した担体を浸漬し、撹拌をし
ながら反応させ固定化酵素を製造する。未反応の
グルタルアルデヒドを洗い流し、固定化酵素を得
る。グルタルアルデヒドは酵素と担体の間を架橋
し共有結合的に酵素を固定化すると信じられる。
事実、高塩濃度の基質を用いても酵素の脱離が起
らないのは後で見る通りである。 第２の方法は第１の方法とほぼ逆の順序で固定
化する方法である。 すなわち、PH3.5ないしPH7.0のPH範囲内に調整
したグルタルアルデヒド水溶液に担体を浸漬し、
担体にグルタルアルデヒドを反応させる。次い
で、グルタルアルデヒドと反応した該担体を、PH
3.5からPH7.0のPH範囲内の緩衝液に溶解したラク
ターゼの水溶液に浸漬し、該ラクターゼを、担体
に結合しているグルタルアルデヒドと反応させて
固定化酵素を製造する。グルタルアルデヒドと共
有結合的に反応せず、吸着のみで担体に固定化さ
れている酵素が存在する可能性があるが、その様
な場合には高塩濃度の緩衝液で洗浄すればよい。
第１、第２のいずれの方法で製造された固定化ラ
クターゼもその酵素的性質は実験誤差内でほぼ同
一である。 第１の方法ではラクターゼを吸着させた後、未
吸着のラクターゼを洗い流し、担体に吸着されて
いない遊離の酵素間で架橋が起らない様にした方
が良い。ラクターゼを吸着している担体のグルタ
ルアルデヒドによる処理はPH2.0からPH8.0程度の
PH範囲内で可能である。しかしあまりに低いPHで
はラクターゼの失活が起り、また塩基性PH領域で
はグルタルアルデヒドの反応が不活発になる。結
局実用的なPH領域は上記の様にPH3.5からPH7.0の
範囲内という事になる。とりわけPH4.0からPH6.5
のPH範囲内で処理を行うと先に吸着したラクター
ゼがグルタルアルデヒド処理中に溶出することが
なく特に好ましい。 第２の方法では、担体をグルタルアルデヒドと
反応させる場合も当然PH2.0程度からPH8.0程度位
で十分に反応させることが出来る。しかし、あま
り低いPHでは反応後グルタルアルデヒド化した担
体のマクロポアー内部のPHを後の操作に好ましい
PHにまで変換するのが煩雑になる。結局PH3.5か
らPH7.0のPH範囲内の反応を行なわせるのが実際
的である。次のラクターゼとの反応過程において
は、第１の方法の場合と同様の理由でPH3.5から
PH7.0の範囲内が実際的であり、PH4.0からPH6.5の
範囲内がより好ましい。 反応温度に関しては水溶液が氷結温度より高
く、50℃以下であれば良い。吸着およびグルタル
アルデヒドとの反応とも５℃ないし45℃が好まし
い。第１の方法の場合は吸着の温度をグルタルア
ルデヒドによる処理温度よりやゝ高くし例えば吸
着温度30℃、グルタルアルデヒドによる処理温度
が20℃程度で行なえば良い。使用するグルタルア
ルデヒド濃度は0.1％ないし、５％程度が適当で
あり、第１の方法の方が第２の方法よりうすいグ
ルタルアルデヒド濃度で固定化出来る。あまりに
低濃度のグルタルアルデヒドの場合は酵素の脱離
が起り本発明の固定化ラクターゼが得にくい。逆
にあまりに高濃度では固定化ラクターゼの活性が
低下するのでバランスを考えて濃度を選ぶ必要が
ある。吸着、グルタルアルデヒド処理あるいは担
体とグルタルアルデヒドさらにグルタルアルデヒ
ドと酵素の反応に必要な時間は固定化反応時の温
度によつて異るがいずれの場合も通常１時間ない
し20時間程度である。実際に度々用いる15℃ない
し40℃程度の吸着あるいはグルタルアルデヒドと
の反応温度では各々１時間ないし６時間程度で十
分である。固定化される粉末ラクターゼの量は１
ｇの乾燥担体当り最大250mgないし300mg程度であ
り、通常第１の方法の方が第２の方法より多量の
ラクターゼを固定化できる。固定化反応に際して
は50ないし250rpm程度の適当な速度で撹拌を行
ないながら固定化反応を進めるのが効率的であ
る。なお第１、第２の方法とも固定化反応後、高
塩濃度の緩衝液および水によつて固定化ラクター
ゼを十分に洗浄し、不充分な結合の為に脱離しや
すいラクターゼは全て除去することが重要であ
る。すなわちこの様な操作によつても脱離しない
強固に結合した酵素こそが本発明における固定化
ラクターゼなのである。 次に本発明における固定化ラクターゼの酵素的
性質を示す。 (1) 至適PHと活性のPH依存性 至適PHは乳糖基質の場合PH4.0ないしPH5.0
で、固定化による至適PHの移動は殆んどみられ
ない。しかし更に低PHでは活性が上昇する傾向
がある。13.3（ｗ／ｖ）％濃度の乳糖溶液を基
質とした場合の相対活性のPH依存性を図２に示
す。PH4.5の活性に対するPH6.5の活性は0.55±
0.1である。 (2) ミカエリス定数Km； PH4.5、30℃において乳糖を基質とした場合、
Km0.15±0.1mole／ (3) ガラクトースによる阻害定数Ki； PH4.5、30℃において乳糖を基質とした場合、
Ki＝0.15±0.1mole／ (4) PH安定性； 40℃で１時間各PHの緩衝液に浸漬した場合、
PH2.0からPH7.0の間では安定で活性の低下は全
くない。 (5) 温度安定性； PH4.5において３時間各温度で浸漬した場合、
50℃以下では安定で活性の低下は全くない。55
℃以上では活性の低下がおこる。 以上の酵素的性質に合致するのが本発明におけ
る固定化ラクターゼであるが、上記以外の実用面
における特徴として次の点が挙げられる。 (1) 単位重量当りの活性 乾燥固定化ラクターゼ（以後IMLと略記）
１ｇ当りの活性に制限はないが本発明の目的に
照してあまり低活性のものは意味がない。結
局、PH4.5、30℃において200ILU／ｇ−IML程
度以上のものが実用上意味がある。最大固定化
量は粉末状ラクターゼで250mg／ｇ−担体ない
し300mg／ｇ−担体であることを先に記したが
表１に見る様に本固定化ラクターゼの活性は粉
末状ラクターゼの固定化量が50mg／ｇ−担体以
上200mg／ｇ−担体程度まで固定化量に無関係
にほぼ一定で本固定化ラクターゼの活性は一義
的には固定化前の粉末状ないし溶液状ラクター
ゼの活性によつて決まると云える。
質にした場合のアレニウスプロツトは曲率を持
つが30℃ないし40℃におけるEa＝９±3kcal／
mole。 もちろん以上の数値は酵素反応の測定において
通常認められる実験誤差を含んでいる。以上の性
質に合致するラクターゼであれば製造法には何ら
制限はない。この様なラクターゼは通常粉末状態
あるいは場合によつては溶液状態で保管される。
活性に関しては、固定化ラクターゼの工業的利用
を目的とする本発明の趣旨からもあまり低活性の
酵素を用いることは意味がない。従つて未固定の
粉末酵素１mg当り15ILU以上の活性を持つものを
使用するのが好ましい。更に好ましくは40ILU／
mg以上である。 (注) 本出願において１単位即ち1ILUのラクター
ゼはPH4.5、30℃において13.3（ｗ／ｖ）％濃度
の乳糖溶液を基質とし、１分間に1μmoleのグ
ルコースを生成する酵素量として定義される。
生成したグルコース量はグルコースオキシダー
ゼーパーオキシダーゼー色素系を用いて定義さ
れる。なお、活性（単位）測定において反応温
度あるいは反応のPHが上記と異なる場合がある
のでその都合測定PHと温度を記載することにす
る。 本発明の固定化ラクターゼの製造に関しては製
造された固定化ラクターゼが本発明の範囲内にあ
れば、いかなる方法を採用しても良い。実際には
次の２種の製造法が現実的であると思われる。 第１の方法は、PH4.0からPH6.5の範囲内の緩衝
液に溶解したラクターゼ溶液に担体を浸漬し、こ
のPH範囲で、ラクターゼを担体に吸着させる。つ
いで、ラクターゼを吸着している担体をグルタル
アルデヒドと接触させ、すなわち、PH3.5ないし
PH7.0のPH範囲内に調整したグルタルアルデヒド
水溶液に酵素を吸着した担体を浸漬し、撹拌をし
ながら反応させ固定化酵素を製造する。未反応の
グルタルアルデヒドを洗い流し、固定化酵素を得
る。グルタルアルデヒドは酵素と担体の間を架橋
し共有結合的に酵素を固定化すると信じられる。
事実、高塩濃度の基質を用いても酵素の脱離が起
らないのは後で見る通りである。 第２の方法は第１の方法とほぼ逆の順序で固定
化する方法である。 すなわち、PH3.5ないしPH7.0のPH範囲内に調整
したグルタルアルデヒド水溶液に担体を浸漬し、
担体にグルタルアルデヒドを反応させる。次い
で、グルタルアルデヒドと反応した該担体を、PH
3.5からPH7.0のPH範囲内の緩衝液に溶解したラク
ターゼの水溶液に浸漬し、該ラクターゼを、担体
に結合しているグルタルアルデヒドと反応させて
固定化酵素を製造する。グルタルアルデヒドと共
有結合的に反応せず、吸着のみで担体に固定化さ
れている酵素が存在する可能性があるが、その様
な場合には高塩濃度の緩衝液で洗浄すればよい。
第１、第２のいずれの方法で製造された固定化ラ
クターゼもその酵素的性質は実験誤差内でほぼ同
一である。 第１の方法ではラクターゼを吸着させた後、未
吸着のラクターゼを洗い流し、担体に吸着されて
いない遊離の酵素間で架橋が起らない様にした方
が良い。ラクターゼを吸着している担体のグルタ
ルアルデヒドによる処理はPH2.0からPH8.0程度の
PH範囲内で可能である。しかしあまりに低いPHで
はラクターゼの失活が起り、また塩基性PH領域で
はグルタルアルデヒドの反応が不活発になる。結
局実用的なPH領域は上記の様にPH3.5からPH7.0の
範囲内という事になる。とりわけPH4.0からPH6.5
のPH範囲内で処理を行うと先に吸着したラクター
ゼがグルタルアルデヒド処理中に溶出することが
なく特に好ましい。 第２の方法では、担体をグルタルアルデヒドと
反応させる場合も当然PH2.0程度からPH8.0程度位
で十分に反応させることが出来る。しかし、あま
り低いPHでは反応後グルタルアルデヒド化した担
体のマクロポアー内部のPHを後の操作に好ましい
PHにまで変換するのが煩雑になる。結局PH3.5か
らPH7.0のPH範囲内の反応を行なわせるのが実際
的である。次のラクターゼとの反応過程において
は、第１の方法の場合と同様の理由でPH3.5から
PH7.0の範囲内が実際的であり、PH4.0からPH6.5の
範囲内がより好ましい。 反応温度に関しては水溶液が氷結温度より高
く、50℃以下であれば良い。吸着およびグルタル
アルデヒドとの反応とも５℃ないし45℃が好まし
い。第１の方法の場合は吸着の温度をグルタルア
ルデヒドによる処理温度よりやゝ高くし例えば吸
着温度30℃、グルタルアルデヒドによる処理温度
が20℃程度で行なえば良い。使用するグルタルア
ルデヒド濃度は0.1％ないし、５％程度が適当で
あり、第１の方法の方が第２の方法よりうすいグ
ルタルアルデヒド濃度で固定化出来る。あまりに
低濃度のグルタルアルデヒドの場合は酵素の脱離
が起り本発明の固定化ラクターゼが得にくい。逆
にあまりに高濃度では固定化ラクターゼの活性が
低下するのでバランスを考えて濃度を選ぶ必要が
ある。吸着、グルタルアルデヒド処理あるいは担
体とグルタルアルデヒドさらにグルタルアルデヒ
ドと酵素の反応に必要な時間は固定化反応時の温
度によつて異るがいずれの場合も通常１時間ない
し20時間程度である。実際に度々用いる15℃ない
し40℃程度の吸着あるいはグルタルアルデヒドと
の反応温度では各々１時間ないし６時間程度で十
分である。固定化される粉末ラクターゼの量は１
ｇの乾燥担体当り最大250mgないし300mg程度であ
り、通常第１の方法の方が第２の方法より多量の
ラクターゼを固定化できる。固定化反応に際して
は50ないし250rpm程度の適当な速度で撹拌を行
ないながら固定化反応を進めるのが効率的であ
る。なお第１、第２の方法とも固定化反応後、高
塩濃度の緩衝液および水によつて固定化ラクター
ゼを十分に洗浄し、不充分な結合の為に脱離しや
すいラクターゼは全て除去することが重要であ
る。すなわちこの様な操作によつても脱離しない
強固に結合した酵素こそが本発明における固定化
ラクターゼなのである。 次に本発明における固定化ラクターゼの酵素的
性質を示す。 (1) 至適PHと活性のPH依存性 至適PHは乳糖基質の場合PH4.0ないしPH5.0
で、固定化による至適PHの移動は殆んどみられ
ない。しかし更に低PHでは活性が上昇する傾向
がある。13.3（ｗ／ｖ）％濃度の乳糖溶液を基
質とした場合の相対活性のPH依存性を図２に示
す。PH4.5の活性に対するPH6.5の活性は0.55±
0.1である。 (2) ミカエリス定数Km； PH4.5、30℃において乳糖を基質とした場合、
Km0.15±0.1mole／ (3) ガラクトースによる阻害定数Ki； PH4.5、30℃において乳糖を基質とした場合、
Ki＝0.15±0.1mole／ (4) PH安定性； 40℃で１時間各PHの緩衝液に浸漬した場合、
PH2.0からPH7.0の間では安定で活性の低下は全
くない。 (5) 温度安定性； PH4.5において３時間各温度で浸漬した場合、
50℃以下では安定で活性の低下は全くない。55
℃以上では活性の低下がおこる。 以上の酵素的性質に合致するのが本発明におけ
る固定化ラクターゼであるが、上記以外の実用面
における特徴として次の点が挙げられる。 (1) 単位重量当りの活性 乾燥固定化ラクターゼ（以後IMLと略記）
１ｇ当りの活性に制限はないが本発明の目的に
照してあまり低活性のものは意味がない。結
局、PH4.5、30℃において200ILU／ｇ−IML程
度以上のものが実用上意味がある。最大固定化
量は粉末状ラクターゼで250mg／ｇ−担体ない
し300mg／ｇ−担体であることを先に記したが
表１に見る様に本固定化ラクターゼの活性は粉
末状ラクターゼの固定化量が50mg／ｇ−担体以
上200mg／ｇ−担体程度まで固定化量に無関係
にほぼ一定で本固定化ラクターゼの活性は一義
的には固定化前の粉末状ないし溶液状ラクター
ゼの活性によつて決まると云える。
【表】
(2) 安定性の良さと高生産性
本発明における固定化ラクターゼの特記すべ
き特徴は、保存時あるいは乳糖の連続分解反応
時の安定性の良さとそれに基く乳糖分解の生産
性の高さである。基質がホエー液や牛乳の様に
塩濃度が高く、種々の化合物が混合しているも
のであつてもやはり酵素の脱離がなく安定で高
い生産性を示す。具体的に例を示すと次の通り
である。 (i) 耐薬性 PH4.5、30℃において760ILU／ｇ−IMLの
固定化ラクターゼを沃素系殺菌洗浄剤、ダイ
ヤザン （旭硝子KK販売）の500倍希釈溶
液（食品衛生加工領域における使用に適して
いるとされている濃度）を浸漬し、４℃で１
ケ月保持した後活性を先と同一条件で測定し
たところ765ILU／ｇ−IMLで活性の低下は
全く見られず強い耐薬性を有していることが
わかる。 (ii) 連続反応における安定性 ホエーパウダー（ニユージーランド産）を
７（ｗ／ｖ）％になる様にPH4.5の緩衝液に溶
解し、不溶分を5000Gで遠心分離除去した、
やゝ不透明のホエー液を基質とし、PH4.5、
30℃における活性が685ILU／ｇ−IMLの本
発明の固定化ラクターゼを10ml充填したカラ
ムに４℃において空間速度SV＝2.3hr-1で
135日間連続的にホエー中の乳糖の加水分解
を行なつた。乳糖分解率は135日間90±３％
保ち、活性の低下は全く見られず、本発明に
おける固定化ラクターゼが連続反応において
も非常に安定であり、生産性も非常に高くな
ることがわかる。 本発明の固定化ラクターゼが工業的利用という
点で優れている事がわかるが、次に実施例を挙げ
て本発明を更に具体的に説明するがその趣旨を越
えない限り以下の実施例によつて限定されるもの
ではない。本発明における固定化ラクターゼの活
性測定条件等を先に記しておく。 固定化ラクターゼの活性測定法 PHを4.5で0.05M濃度の酢酸塩緩衝液に固定
化ラクターゼ0.1ないし0.3ml程度を懸濁し、別
に用意した同一緩衝液の乳糖溶液を乳糖濃度が
13.3（ｗ／ｖ）％になる様に加え、30℃で15分
間往復振盪（100rpm、振巾3.5cm）したのち固
定化ラクターゼを別し、液中のグルコース
含量をグルコースオキシダーゼ−パーオキシダ
ーゼ−色素系を用いて定量する。１分間に
1μmoleのグルコースを生成する酵素量をもつ
て１単位（1ILU）とする。なお活性測定時の
PHおよび温度をその都度必ず記載する事にす
る。 固定化ラクターゼおよび担体の乾燥重量測定 適当量の固定化ラクターゼまたは担体を２mm
程度以下の厚さに広げ恒量に達するまで50℃で
８時間以上減圧（５mmHg以下）乾燥する。そ
の後固定化ラクターゼまたは担体を1.5時間以
上室温（18〜25℃）のデシケーター中に放置し
た後重量を測定し、この時の重量を乾燥重量と
する。本出願中に記載されている固定化ラクタ
ーゼおよび担体の重量は全て本法で測定した乾
燥重量である。 実施例 １ 固定化ラクターゼの製造とその組成 アスペルギルス・オリーゼ起源の乾燥粉末ラク
ターゼ（新日本化学工業製、PH4.5、30℃におけ
る活性が47ILU／mgで、同様にPH4.5、30℃にお
けるKm＝0.11mole／）15.0ｇを0.05M濃度の
酢酸塩緩衝液（PH5.5）750mlに溶解した。この溶
液に粒子径が250μないし1410μで比表面積が約32
m2／ｇ、孔径100Åから2000Åまでのマクロポア
ーの細孔容量の合計が約0.53c.c.／ｇで、アミノ基
および置換アミノ基に基づく陰イオン交換容量が
6.08meq／ｇ、かつカルボキシメチル基に基づく
陽イオン交換容量が2.65meq／ｇであるマクロ多
孔型フエノールホルムアルデヒド系両性イオン交
換樹脂（市販のデユオライト Ａ−７樹脂（ダイ
ヤモンドシヤムロツク社製）にカルボキシメチル
化反応を行つたもの）を100ｇ浸漬し、温度20−
22℃に保ちながら６時間、約120RPMで回転しな
がら吸着固定化を行つた。吸着後、0.2M濃度の
酢酸塩緩衝液（PH5.5）およびイオン交換水で洗
液中に酵素蛋白質が全く見い出されなくなるまで
十分洗浄した。このとき吸着された酵素量は洗液
中の蛋白質量から132.4mg／ｇ−担体と算出され
た。かくして得られたラクターゼ吸着固定化担体
を１％濃度のグルタルアルデヒド溶液（PH4.5に
調整）750mlに浸漬し、約５℃に保ちながら６時
間、120RPM程度に撹拌しつつグルタルアルデヒ
ド処理を行つた。次いで0.2M濃度の酢酸塩緩衝
液およびイオン交換水で十分に洗浄した結果、グ
ルタルアルデヒド処理後に固定化されている酵素
量は131.5mg／ｇ−担体と算出された。得られた
固定化ラクターゼの活性はPH4.5、30℃において
635ILU／ｇ−IMLである。本固定化ラクターゼ
９mlづつを２本の外套管付きカラムに充填し、カ
ラム温度を40℃に保ちながら１本のカラムには
0.3M濃度の酢酸塩緩衝液（PH4.5）をもう１本の
カラムには0.3M濃度のリン酸塩緩衝液（PH6.65）
を共に空間速度SV＝5.0hr-1で48時間流下させ
た。この２種の緩衝液は７％ホエー溶液あるいは
牛乳とほぼ同じ電気伝導度を持つている。緩衝液
を流し始めた最初の数時間内に、固定化酵素量の
0.5％程度が流失する事が流出液の紫外吸収スペ
クトルより算定される。しかしその後は全く流出
がなく、48時間流下実験後の本固定化ラクターゼ
の活性はPH4.5、30℃において各々645ILU／ｇ−
IMLおよび640ILU／ｇ−IMLであり、活性の低
下は全くないと結論出来る。即ち濃厚な塩溶液に
よつても酵素脱離が起らず安定な固定化酵素であ
ることがわかる。 スキムミルク中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ30mlをカラムに充填した
後、４℃の冷室内に設置し、12（ｗ／ｖ）％のス
キムミルク溶液（ネルソン・ソモギー法で測定し
た糖量５（ｗ／ｖ）％）をSV＝0.8hr-1で連続的
に180日間流下させた。本スキムミルク液のPHは
調整せずにPH6.65である。流下開始後１週間の平
均乳糖分解率は72％で180日目の分解率は71％で
あつた。従つて活性の低下は全くと云つて良い程
ない事がわかる。この間１週間に２回づつ２％ヨ
ウ素と11％の非イオン界面活性剤を主成分とする
市販殺菌洗浄剤、ダイヤザン （発売；旭硝子
KK）の原液を100倍に希釈した液および滅菌水
で固定化ラクターゼを洗浄した。従つて殺菌剤に
よる活性の低下も起らないことがわかる。 ホエー中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ10mlをカラムに充填した後
４℃の冷室内に設置し、粉末ホエー（ニユージー
ランド産）を７（ｗ／ｖ）％になる様にPH4.4の緩
衝液に溶解し、不溶分を5000Gで遠心分離器にか
け除去した（除去された不溶分は投入固形分の約
10％）ホエー液を基質とし、SV＝2.25hr-1で200
日間連続的に流下させ分解反応を行つた。流下開
始直後４日間の平均乳糖分解率は88％で200日後
の乳糖分解率は90％であり活性の低下はやはり全
くない事がわかる。なお本実験の場合、２週間に
１回の割合で、同じく殺菌洗浄剤、ダイヤザン
の原液を500倍希釈した液および滅菌水で固定化
ラクターゼを洗浄し、ホエー液が固定化ラクター
ゼカラムを通過後腐敗が起りやすくなるのをふせ
いだ。 実施例 ２ 固定化ラクターゼの製造と組成 実施例１の固定化ラクターゼの製造に用いたの
と同じ担体を乾燥状態で18.2ｇ秤量し、イオン交
換水に浸漬し湿潤状態にした後３％濃度のグルタ
ルアルデヒド溶液（PH4.5に調整）150mlに浸漬
し、液温を18±１℃に保ち、ゆるやかに撹拌しな
がら２時間反応を行つた。反応後、担体をイオン
交換水および酢酸塩緩衝液で十分洗浄した後、実
施例１の固定化ラクターゼの製造に用いたのと同
じ乾燥粉末ラクターゼ3.0ｇを溶解した0.05M濃
度の酢酸塩緩衝液（PH5.0）150mlに浸漬した。液
温を25℃に保ちながらゆるやかに撹拌し、４時間
固定化反応を行つた。固定化後0.3M濃度の酢酸
塩緩衝液（PH5.0）更にイオン交換水で十分に洗
浄し、吸着のみで固定化されているラクターゼを
脱離させた。こうして固定化された酵素量は洗液
中の蛋白質量より149.4mg／ｇ−担体と算出され、
PH4.5、30℃における活性は685ILU／ｇ−IMLで
あつた。 実施例１の場合と同様にPH4.5およびPH6.65の
0.3M濃度の緩衝液を48時間流した後の活性はそ
れぞれ700ILU／ｇ−IMLおよび690ILU／ｇ−
IMLで酵素脱離による活性の低下は全くなく安
定な固定化ラクターゼが製造されたことがわか
る。 固定化ラクターゼの安定性（耐薬性） 日本薬局方塩化ベンザルコニウムの10w／ｖ％
からなる殺菌消毒剤オスバン 液（販売；武田薬
品工業KK）の100倍および500倍希釈液に本固定
化ラクターゼの一部を浸漬し４℃で１ケ月放置し
た後PH4.5、30℃で活性を測定したところ
680ILU／ｇ−IMLと685ILU／ｇ−IMLであり活
性の低下は見られなかつた。 ローフアツトミルク中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ20mlをカラムに充填した後
４℃の冷室内で、ローフアツト乳（明治乳業製、
ネルソン・ソモギー法で測定した乳糖含率5.25
％）をSV＝0.75hr-1で100日間連続的に流下させ
た。乳糖分解率は初めから72％±３％を保つてお
り活性の低下は見られなかつた。この場合にも１
週間に２回づつヨウ素系殺菌剤と滅菌水による固
定化ラクターゼの殺菌洗浄を行つた。 Km、Kiの測定 本固定化ラクターゼのKm値ついでKi値の決定
をPH4.5、30℃で行なつたところKm値はラインウ
エーバー・バークプロツトより0.16mole／と
算出され、0.2mole濃度のガラクトースを添加し
て測定したKi値は0.11mole／であつた。 実施例 ３ 固定化ラクターゼの製造と組成 アルペルギルス・オリーゼ起源の乾燥粉末ラク
ターゼ（新日本化学工業製、PH4.5、30℃におけ
る活性が73ILU／mgでKm値0.11mole／）1.15
ｇを0.05M濃度の酢酸塩緩衝液（PH5.5）75mlに
溶解した。この溶液に粒子径が約250μないし約
1000μで比表面積が約68m2／ｇ、孔径100Åから
2000Åまでのマクロポアーの細孔容量の合計が
0.56c.c.／ｇ、陰イオン交換容量が3.62meq／ｇか
つカルボキシメチル基に基ずく陽イオン交換容量
が1.85meq／ｇであるマクロ多孔型フエノールホ
ルムアルデヒド系両性イオン交換樹脂（市販のデ
ユオライトＡ−４ （ダイヤモンドシヤムロツク
社製）にカルボキシメチル化反応を行ない変性し
たもの）を10ｇ浸漬し、液温を35±２℃に保ちな
がら３時間、約120RPMで回転撹拌を続けラクタ
ーゼを担体に吸着させた。吸着後0.2M濃度の酢
酸塩緩衝液（PH5.5）およびイオン交換水で十分
洗浄した。固定化された酵素量は96mg／ｇ−担体
と算出され、得られた吸着固定化ラクターゼの実
測活性はPH4.5、30℃で1080ILU／ｇ−IMLであ
つた。次に本吸着固定化ラクターゼを2.5％濃度
のグルタルアルデヒド溶液（PH4.3に調整）75ml
に浸漬し、液温を10℃ないし15℃に保ちながら４
時間120RPMで撹拌しながらグルタルアルデヒド
処理を行なつた。このグルタルアルデヒド処理後
固定化されている酵素量は92mg／ｇ−担体である
ことが、固定化ラクターゼの洗浄液から算出され
た。この固定化ラクターゼの活性はPH4.5、30℃
で815ILU／ｇ−IMLであつた。 乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ10mlづつを２本の外套管付
きカラムに充填し、１本のカラムはPH6.3、40℃
SV＝5.0hr-1なる条件で、もう１本のカラムに
はPH4.5、40℃、SV＝8.5hr-1なる条件で、
100ppmのｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル
を含有する0.05M濃度のリン酸塩緩衝液に溶解し
た７（ｗ／ｖ）％の乳糖液を連続的に流下させ、
乳糖の連続分解を行なつた。PH6.3、SV＝5.0hr-1
なる条件で操作しているカラムの方は100日間98
±２％の分解率を保ち活性の低下は全く認められ
なかつた。ただ固定化ラクターゼ充填部の微生物
汚染がはげしく週１回づつ、実施例２で用いた殺
菌消毒剤オスバン の300倍希釈液と滅菌水でカ
ラム中の固定化ラクターゼを洗浄する必要があつ
た。洗浄直前には見かけ上分解率が低下するが洗
浄後は再び元の値98±２％にもどる。一方PH4.5、
SV＝8.5hr-1なる条件で操作しているカラムの方
の分解率は98ないし100％を200日の測定期間中ず
つと保つており活性の低下は全く認められなかつ
た。なおこの後者の操作条件では２〜３週間に１
回滅菌洗浄を行なえば十分であつた。 実施例 ４ 固定化ラクターゼの製造とその組成 実施例３の固定化ラクターゼの製造に用いたの
と同じ乾燥粉末ラクターゼ28ｇをPH5.2の0.05M
濃度の酢酸塩緩衝液1825mlに溶解した。この溶液
に実施例１の固定化ラクターゼの製造に際して使
用したのとほぼ同一の粒子径、比表面積および細
孔容量を持ちかつ陰イオン交換容量が6.26meq／
ｇかつカルボキシメチル基による陽イオン交換容
量が2.86meq／ｇであるマクロ多孔型フエノール
ホルムアルデヒド系両性イオン交換樹脂240ｇ
（乾燥状態時の重量）を浸漬し、液温を30℃に保
ちながら４時間約150RPMで回転撹拌を続けなが
ら吸着を行なつた。吸着後0.2M濃度のPH4.5の酢
酸塩緩衝液およびイオン交換水で十分洗浄し洗液
中の蛋白質量より吸着された酵素量は112mg／ｇ
−担体と算出された。次いでこのラクターゼ吸着
担体を0.75％濃度のグルタルアルデヒド溶液（PH
4.5の0.05M酢酸塩緩衝溶液にグルタルアルデヒ
ドを溶解したもの）1800mlに浸漬し、液温を19な
いし20℃に保ちながら３時間、120RPMで回転撹
拌しながらグルタルアルデヒド処理を行なつた。
３時間後0.2M濃度の酢酸塩緩衝液およびイオン
交換水で十分洗浄した後グルタルアルデヒド処理
後固定化されているラクターゼ量は111mg／ｇと
算出され、PH4.5、30℃における本固定化酵素の
活性は850ILU／ｇ−IMLであつた。 活性のPH依存性 本固定化ラクターゼの各PHにおける活性を30℃
で13.3（ｗ／ｖ）％濃度の乳糖溶液を基質として
測定した。結果を相対活性のPH依存性として示し
たものは実験誤差内で図２の曲線と一致した。 Km、Kiの測定 本固定化ラクターゼのKm値およびKi値の決定
実験をPH4.5、30℃で２回行なつた。Km値の２回
の平均は0.2mole／でKi値の平均は0.15mole／
であつた。 保存安定性 本固定化ラクターゼの１部を減圧下でゆるやか
に乾燥させ、含水率50％の状態（固定化ラクター
ゼの重量と固定化ラクターゼに含まれる水分量が
等しい状態、本固定化ラクターゼの場合、見掛け
上はかわいている様に見える。）で２つにわけ空
気中で密栓し一方を４℃で、もう一方を室温（15
℃から28℃）で２ケ月間放置した後活性を測定し
たところ各830ILU／ｇ−IML、および870ILU／
ｇ−IMLであり活性の低下は全くないと認めら
れる。また本固定化ラクターゼをPH2.6およびPH
3.0に調整した溶液中に浸漬し、１ケ月間４℃で
放置したのち活性をPH4.5、30℃で測定したとこ
ろ共に845ILU／ｇ−IMLで、実験誤差以上の活
性の低下は全く認められなかつた。 スキムミルク中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ11.3mlをカラムに充填し、
乳糖濃度を5.0（ｗ／ｖ）％に調製したスキムミル
ク溶液を４℃の冷室内でSV＝1.0hr-1で流下させ
た。100日間の連続反応中分解率は72±２％を保
持しており活性の低下は全く見られなかつた。な
おこの実験においても固定化ラクターゼカラムを
１週間に２回の割合いで100倍に希釈したヨウ素
系殺菌剤溶液で洗浄している。 実施例 ５ 固定化ラクターゼの製造とその組成 アスペルギルス・オリーゼ起源の乾燥粉末ラク
ターゼ（PH4.5、30℃において80ILU／mg）30ｇ
をPH5.5酢酸塩緩衝溶液1750mlに溶解した。この
溶液に実施例４の固定化ラクターゼの製造時に使
用したのと同一の樹脂230ｇを浸漬し、液温を30
℃に保ちながら４時間、約120RPMで回転撹拌を
続けながら吸着を行なつた。吸着されたラクター
ゼの量は洗浄液中の蛋白質量より121.4mg／ｇ−
担体と算出された。次いでこのラクターゼ吸着固
定化した担体を0.5％濃度のグルタルアルデヒド
溶液（0.05M濃度の酢酸塩緩衝液でPH4.5に調整）
1750mlに浸漬し、液温を20℃に保ちながら５時
間、120RPMで回転撹拌を続けグルタルアルデヒ
ド処理を行なつた。グルタルアルデヒド処理後の
ラクターゼの固定化量は洗浄液より121.1mg／ｇ
−担体と計算され、PH4.5、30℃における本固定
化酵素の活性は1000ILU／ｇ−IMLであつた。 スキムミルク中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ20mlをカラムに充填し、乳
糖濃度を5.0（ｗ／ｖ）％に調製したスキムミルク
溶液を４℃の冷室内でSV＝1.2hr-1で連続的に流
下させた。連続反応を135日続けたところ乳糖の
分解率は70％ないし75％の間を上下し結局135日
間で活性の低下は全く見られなかつた。この間、
１週間に２回の割合いで固定化ラクターゼの殺菌
洗浄を行なつた。 ホエー中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ９mlずつを２本の外套管付
きカラムに充填し、150ppmのｐ−ヒドロキシ安
息香酸ｎ−プロピルを含有する７（ｗ／ｖ）％濃
度のホエー粉末（ニユージーランド産）溶液を
5000Gで遠心分離器にかけ不溶分を除去した上澄
液（PH4.5に調整）を基質とし一本のカラムは４
℃の冷室におきSV＝3.5hr-1で基質を流下させ、
もう一本のカラムは40℃に保ちSV＝16hr-1で基
質を注入した。後者の場合、基質液および反応後
の流出液とも約２℃に冷却して腐敗をできるだけ
ふさぐ様にした。両者とも135日間の連続反応を
行なつたが前者のカラムでは乳糖分解率88±２％
をその期間中保持し、一方後者のカラムでは乳粉
分解率97ないし100％をその期間中保持して活性
の低下は全く見られなかつた。前者のカラム操作
では２週間に１回の割合いでカラム中の固定化ラ
クターゼを殺菌すれば微生物による汚染は起らな
かつたが、後者のカラム操作では１週間に１度の
割合いで固定化ラクターゼの殺菌洗浄を行なつて
も微生物の汚染をさけることが出来ず、分解率は
見かけ上低下した。ただし殺菌洗浄の都度分解率
は回復した。 比較参考例 １ 酵母起源のラクターゼの固定化その固定化酵素
活性 酵母サツカロマイセス（キユーベルマイセ
ス）・ラクチス起源の乾燥粉末ラクターゼを実施
例１で使用した担体にPH6.65において吸着させ
た。次いで1.0％濃度のグルタルアルデヒド溶液
（PH6.65に調整）で処理した。固定化された酵素
粉末量は96mg／ｇ−担体で酵素固定化率は64％で
あつた。 しかしながら実用的に大きな問題は、PH6.65、
30℃で13.3（Ｗ／Ｖ）％の乳糖液を基質として測
定したときの活性が1.4ILU／ｇ−IMLに過ぎず、
実際的には活性を持たないのに等しいことであ
る。またこの固定化ラクターゼをPH5.5の酢酸緩
衝液で洗浄したところ活性は全くなくなつてしま
つた。つまりサツカロマイセス・ラクチス起源の
ラクターゼを本発明における固定化担体に本発明
の固定化法に従つて固定化することによつて得ら
れた固定化ラクターゼは実用的には全く意味のな
いものであることがわかる。 比較参考例 ２ アミノ基およびカルボキシメチル基を持たない
担体への固定化 実施例１における粉末状ラクターゼを使用し、
酵素固定化用担体を市販のフエノールホルマリン
系樹脂デユオライト ES−762（ダイヤモンドシ
ヤムロツク社製、フエノール性水酸基とメチロー
ル基以外イオン交換基を持たない。）に変えると
共に使用担体量を酵素投入量等の数量を全て1/10
スケールに変更した以外他の条件は実施例１と同
様にして固定化を行つた。酵素固定量は53mg／ｇ
−担体でPH4.5・30℃における活性は285ILU／ｇ
−IMLで実施例１の半分にも満たない。 実施例１における固定化ラクターゼの一部と本
比較参考例における固定化ラクターゼの一部を殺
菌洗浄剤ダイヤザン の100倍希釈剤液に室温
（15ないし22℃）で浸漬した。後者の固定化ラク
ターゼは24時間後に活性は90％に低下し、５日後
には82％に低下したが、前者の場合は同一浸漬期
間に活性の低下は全くなかつた。 比較参考例 ３ アスペルギルス・ニガー起源のラクターゼの固
定化 アスペルギルス・ニガー起源の工業用グレード
のラクターゼを本発明における担体に吸着させ、
次いで2.0％濃度のグルタルアルデヒド溶液（PH
4.5）で処理した。 この固定化ラクターゼの牛乳のPHであるPH6.65
の活性は30℃で1ILU／ｇ−IML以下であり、牛
乳の乳糖を分解するには実用上全く意味がないこ
とがわかる。
き特徴は、保存時あるいは乳糖の連続分解反応
時の安定性の良さとそれに基く乳糖分解の生産
性の高さである。基質がホエー液や牛乳の様に
塩濃度が高く、種々の化合物が混合しているも
のであつてもやはり酵素の脱離がなく安定で高
い生産性を示す。具体的に例を示すと次の通り
である。 (i) 耐薬性 PH4.5、30℃において760ILU／ｇ−IMLの
固定化ラクターゼを沃素系殺菌洗浄剤、ダイ
ヤザン （旭硝子KK販売）の500倍希釈溶
液（食品衛生加工領域における使用に適して
いるとされている濃度）を浸漬し、４℃で１
ケ月保持した後活性を先と同一条件で測定し
たところ765ILU／ｇ−IMLで活性の低下は
全く見られず強い耐薬性を有していることが
わかる。 (ii) 連続反応における安定性 ホエーパウダー（ニユージーランド産）を
７（ｗ／ｖ）％になる様にPH4.5の緩衝液に溶
解し、不溶分を5000Gで遠心分離除去した、
やゝ不透明のホエー液を基質とし、PH4.5、
30℃における活性が685ILU／ｇ−IMLの本
発明の固定化ラクターゼを10ml充填したカラ
ムに４℃において空間速度SV＝2.3hr-1で
135日間連続的にホエー中の乳糖の加水分解
を行なつた。乳糖分解率は135日間90±３％
保ち、活性の低下は全く見られず、本発明に
おける固定化ラクターゼが連続反応において
も非常に安定であり、生産性も非常に高くな
ることがわかる。 本発明の固定化ラクターゼが工業的利用という
点で優れている事がわかるが、次に実施例を挙げ
て本発明を更に具体的に説明するがその趣旨を越
えない限り以下の実施例によつて限定されるもの
ではない。本発明における固定化ラクターゼの活
性測定条件等を先に記しておく。 固定化ラクターゼの活性測定法 PHを4.5で0.05M濃度の酢酸塩緩衝液に固定
化ラクターゼ0.1ないし0.3ml程度を懸濁し、別
に用意した同一緩衝液の乳糖溶液を乳糖濃度が
13.3（ｗ／ｖ）％になる様に加え、30℃で15分
間往復振盪（100rpm、振巾3.5cm）したのち固
定化ラクターゼを別し、液中のグルコース
含量をグルコースオキシダーゼ−パーオキシダ
ーゼ−色素系を用いて定量する。１分間に
1μmoleのグルコースを生成する酵素量をもつ
て１単位（1ILU）とする。なお活性測定時の
PHおよび温度をその都度必ず記載する事にす
る。 固定化ラクターゼおよび担体の乾燥重量測定 適当量の固定化ラクターゼまたは担体を２mm
程度以下の厚さに広げ恒量に達するまで50℃で
８時間以上減圧（５mmHg以下）乾燥する。そ
の後固定化ラクターゼまたは担体を1.5時間以
上室温（18〜25℃）のデシケーター中に放置し
た後重量を測定し、この時の重量を乾燥重量と
する。本出願中に記載されている固定化ラクタ
ーゼおよび担体の重量は全て本法で測定した乾
燥重量である。 実施例 １ 固定化ラクターゼの製造とその組成 アスペルギルス・オリーゼ起源の乾燥粉末ラク
ターゼ（新日本化学工業製、PH4.5、30℃におけ
る活性が47ILU／mgで、同様にPH4.5、30℃にお
けるKm＝0.11mole／）15.0ｇを0.05M濃度の
酢酸塩緩衝液（PH5.5）750mlに溶解した。この溶
液に粒子径が250μないし1410μで比表面積が約32
m2／ｇ、孔径100Åから2000Åまでのマクロポア
ーの細孔容量の合計が約0.53c.c.／ｇで、アミノ基
および置換アミノ基に基づく陰イオン交換容量が
6.08meq／ｇ、かつカルボキシメチル基に基づく
陽イオン交換容量が2.65meq／ｇであるマクロ多
孔型フエノールホルムアルデヒド系両性イオン交
換樹脂（市販のデユオライト Ａ−７樹脂（ダイ
ヤモンドシヤムロツク社製）にカルボキシメチル
化反応を行つたもの）を100ｇ浸漬し、温度20−
22℃に保ちながら６時間、約120RPMで回転しな
がら吸着固定化を行つた。吸着後、0.2M濃度の
酢酸塩緩衝液（PH5.5）およびイオン交換水で洗
液中に酵素蛋白質が全く見い出されなくなるまで
十分洗浄した。このとき吸着された酵素量は洗液
中の蛋白質量から132.4mg／ｇ−担体と算出され
た。かくして得られたラクターゼ吸着固定化担体
を１％濃度のグルタルアルデヒド溶液（PH4.5に
調整）750mlに浸漬し、約５℃に保ちながら６時
間、120RPM程度に撹拌しつつグルタルアルデヒ
ド処理を行つた。次いで0.2M濃度の酢酸塩緩衝
液およびイオン交換水で十分に洗浄した結果、グ
ルタルアルデヒド処理後に固定化されている酵素
量は131.5mg／ｇ−担体と算出された。得られた
固定化ラクターゼの活性はPH4.5、30℃において
635ILU／ｇ−IMLである。本固定化ラクターゼ
９mlづつを２本の外套管付きカラムに充填し、カ
ラム温度を40℃に保ちながら１本のカラムには
0.3M濃度の酢酸塩緩衝液（PH4.5）をもう１本の
カラムには0.3M濃度のリン酸塩緩衝液（PH6.65）
を共に空間速度SV＝5.0hr-1で48時間流下させ
た。この２種の緩衝液は７％ホエー溶液あるいは
牛乳とほぼ同じ電気伝導度を持つている。緩衝液
を流し始めた最初の数時間内に、固定化酵素量の
0.5％程度が流失する事が流出液の紫外吸収スペ
クトルより算定される。しかしその後は全く流出
がなく、48時間流下実験後の本固定化ラクターゼ
の活性はPH4.5、30℃において各々645ILU／ｇ−
IMLおよび640ILU／ｇ−IMLであり、活性の低
下は全くないと結論出来る。即ち濃厚な塩溶液に
よつても酵素脱離が起らず安定な固定化酵素であ
ることがわかる。 スキムミルク中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ30mlをカラムに充填した
後、４℃の冷室内に設置し、12（ｗ／ｖ）％のス
キムミルク溶液（ネルソン・ソモギー法で測定し
た糖量５（ｗ／ｖ）％）をSV＝0.8hr-1で連続的
に180日間流下させた。本スキムミルク液のPHは
調整せずにPH6.65である。流下開始後１週間の平
均乳糖分解率は72％で180日目の分解率は71％で
あつた。従つて活性の低下は全くと云つて良い程
ない事がわかる。この間１週間に２回づつ２％ヨ
ウ素と11％の非イオン界面活性剤を主成分とする
市販殺菌洗浄剤、ダイヤザン （発売；旭硝子
KK）の原液を100倍に希釈した液および滅菌水
で固定化ラクターゼを洗浄した。従つて殺菌剤に
よる活性の低下も起らないことがわかる。 ホエー中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ10mlをカラムに充填した後
４℃の冷室内に設置し、粉末ホエー（ニユージー
ランド産）を７（ｗ／ｖ）％になる様にPH4.4の緩
衝液に溶解し、不溶分を5000Gで遠心分離器にか
け除去した（除去された不溶分は投入固形分の約
10％）ホエー液を基質とし、SV＝2.25hr-1で200
日間連続的に流下させ分解反応を行つた。流下開
始直後４日間の平均乳糖分解率は88％で200日後
の乳糖分解率は90％であり活性の低下はやはり全
くない事がわかる。なお本実験の場合、２週間に
１回の割合で、同じく殺菌洗浄剤、ダイヤザン
の原液を500倍希釈した液および滅菌水で固定化
ラクターゼを洗浄し、ホエー液が固定化ラクター
ゼカラムを通過後腐敗が起りやすくなるのをふせ
いだ。 実施例 ２ 固定化ラクターゼの製造と組成 実施例１の固定化ラクターゼの製造に用いたの
と同じ担体を乾燥状態で18.2ｇ秤量し、イオン交
換水に浸漬し湿潤状態にした後３％濃度のグルタ
ルアルデヒド溶液（PH4.5に調整）150mlに浸漬
し、液温を18±１℃に保ち、ゆるやかに撹拌しな
がら２時間反応を行つた。反応後、担体をイオン
交換水および酢酸塩緩衝液で十分洗浄した後、実
施例１の固定化ラクターゼの製造に用いたのと同
じ乾燥粉末ラクターゼ3.0ｇを溶解した0.05M濃
度の酢酸塩緩衝液（PH5.0）150mlに浸漬した。液
温を25℃に保ちながらゆるやかに撹拌し、４時間
固定化反応を行つた。固定化後0.3M濃度の酢酸
塩緩衝液（PH5.0）更にイオン交換水で十分に洗
浄し、吸着のみで固定化されているラクターゼを
脱離させた。こうして固定化された酵素量は洗液
中の蛋白質量より149.4mg／ｇ−担体と算出され、
PH4.5、30℃における活性は685ILU／ｇ−IMLで
あつた。 実施例１の場合と同様にPH4.5およびPH6.65の
0.3M濃度の緩衝液を48時間流した後の活性はそ
れぞれ700ILU／ｇ−IMLおよび690ILU／ｇ−
IMLで酵素脱離による活性の低下は全くなく安
定な固定化ラクターゼが製造されたことがわか
る。 固定化ラクターゼの安定性（耐薬性） 日本薬局方塩化ベンザルコニウムの10w／ｖ％
からなる殺菌消毒剤オスバン 液（販売；武田薬
品工業KK）の100倍および500倍希釈液に本固定
化ラクターゼの一部を浸漬し４℃で１ケ月放置し
た後PH4.5、30℃で活性を測定したところ
680ILU／ｇ−IMLと685ILU／ｇ−IMLであり活
性の低下は見られなかつた。 ローフアツトミルク中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ20mlをカラムに充填した後
４℃の冷室内で、ローフアツト乳（明治乳業製、
ネルソン・ソモギー法で測定した乳糖含率5.25
％）をSV＝0.75hr-1で100日間連続的に流下させ
た。乳糖分解率は初めから72％±３％を保つてお
り活性の低下は見られなかつた。この場合にも１
週間に２回づつヨウ素系殺菌剤と滅菌水による固
定化ラクターゼの殺菌洗浄を行つた。 Km、Kiの測定 本固定化ラクターゼのKm値ついでKi値の決定
をPH4.5、30℃で行なつたところKm値はラインウ
エーバー・バークプロツトより0.16mole／と
算出され、0.2mole濃度のガラクトースを添加し
て測定したKi値は0.11mole／であつた。 実施例 ３ 固定化ラクターゼの製造と組成 アルペルギルス・オリーゼ起源の乾燥粉末ラク
ターゼ（新日本化学工業製、PH4.5、30℃におけ
る活性が73ILU／mgでKm値0.11mole／）1.15
ｇを0.05M濃度の酢酸塩緩衝液（PH5.5）75mlに
溶解した。この溶液に粒子径が約250μないし約
1000μで比表面積が約68m2／ｇ、孔径100Åから
2000Åまでのマクロポアーの細孔容量の合計が
0.56c.c.／ｇ、陰イオン交換容量が3.62meq／ｇか
つカルボキシメチル基に基ずく陽イオン交換容量
が1.85meq／ｇであるマクロ多孔型フエノールホ
ルムアルデヒド系両性イオン交換樹脂（市販のデ
ユオライトＡ−４ （ダイヤモンドシヤムロツク
社製）にカルボキシメチル化反応を行ない変性し
たもの）を10ｇ浸漬し、液温を35±２℃に保ちな
がら３時間、約120RPMで回転撹拌を続けラクタ
ーゼを担体に吸着させた。吸着後0.2M濃度の酢
酸塩緩衝液（PH5.5）およびイオン交換水で十分
洗浄した。固定化された酵素量は96mg／ｇ−担体
と算出され、得られた吸着固定化ラクターゼの実
測活性はPH4.5、30℃で1080ILU／ｇ−IMLであ
つた。次に本吸着固定化ラクターゼを2.5％濃度
のグルタルアルデヒド溶液（PH4.3に調整）75ml
に浸漬し、液温を10℃ないし15℃に保ちながら４
時間120RPMで撹拌しながらグルタルアルデヒド
処理を行なつた。このグルタルアルデヒド処理後
固定化されている酵素量は92mg／ｇ−担体である
ことが、固定化ラクターゼの洗浄液から算出され
た。この固定化ラクターゼの活性はPH4.5、30℃
で815ILU／ｇ−IMLであつた。 乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ10mlづつを２本の外套管付
きカラムに充填し、１本のカラムはPH6.3、40℃
SV＝5.0hr-1なる条件で、もう１本のカラムに
はPH4.5、40℃、SV＝8.5hr-1なる条件で、
100ppmのｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル
を含有する0.05M濃度のリン酸塩緩衝液に溶解し
た７（ｗ／ｖ）％の乳糖液を連続的に流下させ、
乳糖の連続分解を行なつた。PH6.3、SV＝5.0hr-1
なる条件で操作しているカラムの方は100日間98
±２％の分解率を保ち活性の低下は全く認められ
なかつた。ただ固定化ラクターゼ充填部の微生物
汚染がはげしく週１回づつ、実施例２で用いた殺
菌消毒剤オスバン の300倍希釈液と滅菌水でカ
ラム中の固定化ラクターゼを洗浄する必要があつ
た。洗浄直前には見かけ上分解率が低下するが洗
浄後は再び元の値98±２％にもどる。一方PH4.5、
SV＝8.5hr-1なる条件で操作しているカラムの方
の分解率は98ないし100％を200日の測定期間中ず
つと保つており活性の低下は全く認められなかつ
た。なおこの後者の操作条件では２〜３週間に１
回滅菌洗浄を行なえば十分であつた。 実施例 ４ 固定化ラクターゼの製造とその組成 実施例３の固定化ラクターゼの製造に用いたの
と同じ乾燥粉末ラクターゼ28ｇをPH5.2の0.05M
濃度の酢酸塩緩衝液1825mlに溶解した。この溶液
に実施例１の固定化ラクターゼの製造に際して使
用したのとほぼ同一の粒子径、比表面積および細
孔容量を持ちかつ陰イオン交換容量が6.26meq／
ｇかつカルボキシメチル基による陽イオン交換容
量が2.86meq／ｇであるマクロ多孔型フエノール
ホルムアルデヒド系両性イオン交換樹脂240ｇ
（乾燥状態時の重量）を浸漬し、液温を30℃に保
ちながら４時間約150RPMで回転撹拌を続けなが
ら吸着を行なつた。吸着後0.2M濃度のPH4.5の酢
酸塩緩衝液およびイオン交換水で十分洗浄し洗液
中の蛋白質量より吸着された酵素量は112mg／ｇ
−担体と算出された。次いでこのラクターゼ吸着
担体を0.75％濃度のグルタルアルデヒド溶液（PH
4.5の0.05M酢酸塩緩衝溶液にグルタルアルデヒ
ドを溶解したもの）1800mlに浸漬し、液温を19な
いし20℃に保ちながら３時間、120RPMで回転撹
拌しながらグルタルアルデヒド処理を行なつた。
３時間後0.2M濃度の酢酸塩緩衝液およびイオン
交換水で十分洗浄した後グルタルアルデヒド処理
後固定化されているラクターゼ量は111mg／ｇと
算出され、PH4.5、30℃における本固定化酵素の
活性は850ILU／ｇ−IMLであつた。 活性のPH依存性 本固定化ラクターゼの各PHにおける活性を30℃
で13.3（ｗ／ｖ）％濃度の乳糖溶液を基質として
測定した。結果を相対活性のPH依存性として示し
たものは実験誤差内で図２の曲線と一致した。 Km、Kiの測定 本固定化ラクターゼのKm値およびKi値の決定
実験をPH4.5、30℃で２回行なつた。Km値の２回
の平均は0.2mole／でKi値の平均は0.15mole／
であつた。 保存安定性 本固定化ラクターゼの１部を減圧下でゆるやか
に乾燥させ、含水率50％の状態（固定化ラクター
ゼの重量と固定化ラクターゼに含まれる水分量が
等しい状態、本固定化ラクターゼの場合、見掛け
上はかわいている様に見える。）で２つにわけ空
気中で密栓し一方を４℃で、もう一方を室温（15
℃から28℃）で２ケ月間放置した後活性を測定し
たところ各830ILU／ｇ−IML、および870ILU／
ｇ−IMLであり活性の低下は全くないと認めら
れる。また本固定化ラクターゼをPH2.6およびPH
3.0に調整した溶液中に浸漬し、１ケ月間４℃で
放置したのち活性をPH4.5、30℃で測定したとこ
ろ共に845ILU／ｇ−IMLで、実験誤差以上の活
性の低下は全く認められなかつた。 スキムミルク中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ11.3mlをカラムに充填し、
乳糖濃度を5.0（ｗ／ｖ）％に調製したスキムミル
ク溶液を４℃の冷室内でSV＝1.0hr-1で流下させ
た。100日間の連続反応中分解率は72±２％を保
持しており活性の低下は全く見られなかつた。な
おこの実験においても固定化ラクターゼカラムを
１週間に２回の割合いで100倍に希釈したヨウ素
系殺菌剤溶液で洗浄している。 実施例 ５ 固定化ラクターゼの製造とその組成 アスペルギルス・オリーゼ起源の乾燥粉末ラク
ターゼ（PH4.5、30℃において80ILU／mg）30ｇ
をPH5.5酢酸塩緩衝溶液1750mlに溶解した。この
溶液に実施例４の固定化ラクターゼの製造時に使
用したのと同一の樹脂230ｇを浸漬し、液温を30
℃に保ちながら４時間、約120RPMで回転撹拌を
続けながら吸着を行なつた。吸着されたラクター
ゼの量は洗浄液中の蛋白質量より121.4mg／ｇ−
担体と算出された。次いでこのラクターゼ吸着固
定化した担体を0.5％濃度のグルタルアルデヒド
溶液（0.05M濃度の酢酸塩緩衝液でPH4.5に調整）
1750mlに浸漬し、液温を20℃に保ちながら５時
間、120RPMで回転撹拌を続けグルタルアルデヒ
ド処理を行なつた。グルタルアルデヒド処理後の
ラクターゼの固定化量は洗浄液より121.1mg／ｇ
−担体と計算され、PH4.5、30℃における本固定
化酵素の活性は1000ILU／ｇ−IMLであつた。 スキムミルク中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ20mlをカラムに充填し、乳
糖濃度を5.0（ｗ／ｖ）％に調製したスキムミルク
溶液を４℃の冷室内でSV＝1.2hr-1で連続的に流
下させた。連続反応を135日続けたところ乳糖の
分解率は70％ないし75％の間を上下し結局135日
間で活性の低下は全く見られなかつた。この間、
１週間に２回の割合いで固定化ラクターゼの殺菌
洗浄を行なつた。 ホエー中の乳糖の連続分解 本固定化ラクターゼ９mlずつを２本の外套管付
きカラムに充填し、150ppmのｐ−ヒドロキシ安
息香酸ｎ−プロピルを含有する７（ｗ／ｖ）％濃
度のホエー粉末（ニユージーランド産）溶液を
5000Gで遠心分離器にかけ不溶分を除去した上澄
液（PH4.5に調整）を基質とし一本のカラムは４
℃の冷室におきSV＝3.5hr-1で基質を流下させ、
もう一本のカラムは40℃に保ちSV＝16hr-1で基
質を注入した。後者の場合、基質液および反応後
の流出液とも約２℃に冷却して腐敗をできるだけ
ふさぐ様にした。両者とも135日間の連続反応を
行なつたが前者のカラムでは乳糖分解率88±２％
をその期間中保持し、一方後者のカラムでは乳粉
分解率97ないし100％をその期間中保持して活性
の低下は全く見られなかつた。前者のカラム操作
では２週間に１回の割合いでカラム中の固定化ラ
クターゼを殺菌すれば微生物による汚染は起らな
かつたが、後者のカラム操作では１週間に１度の
割合いで固定化ラクターゼの殺菌洗浄を行なつて
も微生物の汚染をさけることが出来ず、分解率は
見かけ上低下した。ただし殺菌洗浄の都度分解率
は回復した。 比較参考例 １ 酵母起源のラクターゼの固定化その固定化酵素
活性 酵母サツカロマイセス（キユーベルマイセ
ス）・ラクチス起源の乾燥粉末ラクターゼを実施
例１で使用した担体にPH6.65において吸着させ
た。次いで1.0％濃度のグルタルアルデヒド溶液
（PH6.65に調整）で処理した。固定化された酵素
粉末量は96mg／ｇ−担体で酵素固定化率は64％で
あつた。 しかしながら実用的に大きな問題は、PH6.65、
30℃で13.3（Ｗ／Ｖ）％の乳糖液を基質として測
定したときの活性が1.4ILU／ｇ−IMLに過ぎず、
実際的には活性を持たないのに等しいことであ
る。またこの固定化ラクターゼをPH5.5の酢酸緩
衝液で洗浄したところ活性は全くなくなつてしま
つた。つまりサツカロマイセス・ラクチス起源の
ラクターゼを本発明における固定化担体に本発明
の固定化法に従つて固定化することによつて得ら
れた固定化ラクターゼは実用的には全く意味のな
いものであることがわかる。 比較参考例 ２ アミノ基およびカルボキシメチル基を持たない
担体への固定化 実施例１における粉末状ラクターゼを使用し、
酵素固定化用担体を市販のフエノールホルマリン
系樹脂デユオライト ES−762（ダイヤモンドシ
ヤムロツク社製、フエノール性水酸基とメチロー
ル基以外イオン交換基を持たない。）に変えると
共に使用担体量を酵素投入量等の数量を全て1/10
スケールに変更した以外他の条件は実施例１と同
様にして固定化を行つた。酵素固定量は53mg／ｇ
−担体でPH4.5・30℃における活性は285ILU／ｇ
−IMLで実施例１の半分にも満たない。 実施例１における固定化ラクターゼの一部と本
比較参考例における固定化ラクターゼの一部を殺
菌洗浄剤ダイヤザン の100倍希釈剤液に室温
（15ないし22℃）で浸漬した。後者の固定化ラク
ターゼは24時間後に活性は90％に低下し、５日後
には82％に低下したが、前者の場合は同一浸漬期
間に活性の低下は全くなかつた。 比較参考例 ３ アスペルギルス・ニガー起源のラクターゼの固
定化 アスペルギルス・ニガー起源の工業用グレード
のラクターゼを本発明における担体に吸着させ、
次いで2.0％濃度のグルタルアルデヒド溶液（PH
4.5）で処理した。 この固定化ラクターゼの牛乳のPHであるPH6.65
の活性は30℃で1ILU／ｇ−IML以下であり、牛
乳の乳糖を分解するには実用上全く意味がないこ
とがわかる。
図１は本発明の固定化ラクターゼの構成要素の
一つであるアスペルギルス・オリーゼ起源のラク
ターゼの相対活性のPH依存性を示すグラフであ
る。実験温度30℃、基質は乳糖13.3（ｗ／ｖ）％
である。図２は本発明の固定化ラクターゼの相対
活性のPH依存性を示すグラフである。実験温度30
℃、基質は乳糖13.3（ｗ／ｖ）％である。
一つであるアスペルギルス・オリーゼ起源のラク
ターゼの相対活性のPH依存性を示すグラフであ
る。実験温度30℃、基質は乳糖13.3（ｗ／ｖ）％
である。図２は本発明の固定化ラクターゼの相対
活性のPH依存性を示すグラフである。実験温度30
℃、基質は乳糖13.3（ｗ／ｖ）％である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 比表面積が１m2／ｇ以上、孔径100Åないし
2000Åのマクロポアーの細孔容量の合計が0.1
c.c.／ｇ以上、アミノ基あるいは置換アミノ基に基
づく陰イオン交換容量が1meq／ｇ以上かつカル
ボキシメチル基に基づく陽イオン交換容量が
0.5meq／ｇ以上であるマクロ多孔型フエノー
ル・ホルムアルデヒド系両性イオン交換樹脂を担
体としアスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus
oryzae）起源のラクターゼをグルタルアルデヒ
ド処理によつて該担体に共有結合的に固定化させ
た固定化ラクターゼ。 ２ ラクターゼが以下のごとき性質を有すること
を特徴とする特許請求の範囲１に記載の固定化ラ
クターゼ。 (ア) 作用至適PH4.5からPH5.0（乳糖基質に対して） (イ) ミカエリス定数Km；0.1±0.05mole／（PH
4.5、30℃で乳糖基質に対して） ３ 比表面積が１m2／ｇ以上、孔径100Åないし
2000Åのマクロポアーの細孔容量の合計が0.1
c.c.／ｇ以上、アミノ基あるいは置換アミノ基に基
づく陰イオン交換容量が1meq／ｇ以上、かつカ
ルボキシメチル基に基づく陽イオン交換容量が
0.5meq／ｇ以上である多孔型フエノールホルム
アルデヒド系両性イオン交換樹脂を担体とし、ア
スペルギルス・オリーゼ（Aspergillus oryzae）
起源のラクターゼを（あ）PH4.0からPH6.5のPH領
域の水溶液中で該担体に吸着せしめ、次いで
（い）PH3.5からPH7.0のPH領域のグルタルアルデ
ヒド水溶液で処理することにより固定化すること
を特徴とする固定化ラクターゼの製造法。 ４ 比表面積が１m2／ｇ以上、孔径100Åないし
2000Åのマクロポアーの細孔容量の合計が0.1
c.c.／ｇ以上、アミノ基あるいは置換アミノ基に基
づく陰イオン交換容量が1meq／ｇ以上、かつカ
ルボキシメチル基に基づく陽イオン交換容量が
0.5meq／ｇ以上であるマクロ多孔型フエノール
ホルムアルデヒド系両性イオン交換樹脂を担体と
し、アスペルギルス・オリーゼ（Aspergillus
oryzae）起源のラクターゼを該担体に固定化す
るに際して（あ）PH3.5からPH7.0のPH領域のグル
タルアルデヒド水溶液で担体を処理し、（い）次
いでPH4.0からPH6.5のPH領域の水溶液中で該ラク
ターゼを、担体に結合しているグルタルアルデヒ
ドと反応させて固定化することを特徴とする固定
化ラクターゼの製造法。
Priority Applications (8)
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|---|---|---|---|
| JP12775479A JPS5651984A (en) | 1979-10-02 | 1979-10-02 | Fixed lactase and its preparation |
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