JPS647966B2

JPS647966B2 -

Info

Publication number: JPS647966B2
Application number: JP55156053A
Authority: JP
Inventors: Dee Barudeshuiiraa Jon; Shii Ganburu Ronarudo; Aaru Mooku Maashia; Shen Tsunnyun; Emu Honpihomu Mitoree
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1979-11-08
Filing date: 1980-11-07
Publication date: 1989-02-10
Also published as: JPS5675439A; DK154264C; IE802286L; GR71720B; DK154264B; NZ195377A; PT72040A; AU533213B2; DE3068062D1; ES496666A0; ATE7656T1; EP0028917A2; IE50369B1; EP0028917A3; AU6420380A; DK472980A; ES8203222A1; US4310505A; EP0028917B1; PT72040B

Description

【発明の詳細な説明】脂質小胞はすでに得られており、放射性標識さ
れたリポソームの使用が報告されている。I.R.マ
クダーガル（McDougall）、J.K.ダニツク
（Dunnick）、M.G.マクナミー（McNamee）およ
びJ.P.クリス（Kriss）（1974）Proc.Natl.Acad.
Sc.USA.71 3487−3491；K.J.ハング（Hwang）
とM.R.マウク（Mauk）（1977）Proc.Natl.
Acad.Sci.USA74、4991−4995；G.H.ヒンケル
（Hinkle）、G.S.ボルン（Born）、W.V.ケスラー
（Kessler）とS.M.シヨー（Shaw）（1978）、J.
Phar、Sci、67、795−798。これらの小胞は、単に超音波処理の方法を用い
たリポソームの中に取り込まれる放射性イオンの
量が限られているために、比較的低い水準の放射
性イオンしか含まれなかつた。小胞の内部の水量
が少ないため、放射性イオンを含む総懸濁量の数
パーセントしか小胞内に包み込まれず、残りは実
際の目的のためには失なわれてしまう。選択的イオノフオア（イオンに親和性がある、
あるいはイオンを引き付ける化合物を意味する総
称的な用語）〔6S−6α（2Sγ、3Sγ）、8βRγ、9β、
11α〕−５−（メチルアミノ）−２−〔〔３、９、11
−トリメチル−８−〔１−メチル−２−オキソ−
２−（1H−ピロル−２−イル）エチル〕１、７−
ジオキサスポロ〔５、５〕アンデシ−２−イル〕
メチル〕−４−ベンゾキサゾール−カルボキシル
酸、以下イオノフオアA23187と呼ぶ、は２価陽
イオンと結合し、それを天然および人工の脂質膜
を通過させることに用いられてきた、ヒヨーノ
（Hyono）、A.、ヘンデリツク（Hendriks Th.）
デーマン（Daeman）F.J.M.、とボンデイング
（Bonting）S.L.（1975）Biochim.Biophys.Acta.、
389 34−46；サルカジ（Sarkadi）、B.、スザツ
ツ（Szasz）、I.とガルドス（Gardos）G.（1976）
J.Membrane Biol.、26.357−370；ラベル
（Labell）、E.F.とラツカー（Racker）E.（1977）
J.Menbrore Biol.31、301−315；フアイフアー
（Pfeiffer）、D.R.、テイラー（Taylor）R.W.と
ラーデイー（Lardy）、H.A、（1978）Ann.N.Y.
Acad Sci（印刷中）。A23187が３価陽イオン、例
えばLa⁺³複合体を形成する証拠もある、フアイ
フアー（Pfeiffor）D.R、リード（Reed）P.W.と
ラーデイーH.A.（Lardy）、（1974）
Biochemistry.13、4007−4014。グリゴリアデイス（Gregoriadis）とその共同
研究者は In標識ブレオマイシンを用いること
によつてリポソームに Inを標識した、グレゴ
リアデイス（Gregoriadis）、G.とネーランジヤン
（Neerunjun）E.D.（1975）Biochem.Biophys.
Res.Comm.、65、537−544；グレゴリアデイス
（Gregoriadis）、G.ネーランジヤン
（Neerunjun）、D.E.とハント（Hunt）、R.
（1977）、Life Sci、21 357−369。彼らは負に荷
電したリポソームでは加えられた放射活性の27−
80％がリン脂質に結合し、正に荷電したリポソー
ム中に２〜4.5％が取り込まれたと報告している。より最近では、同時に係属中である1979年、２
月22日に出願された特許出願番号第148102号によ
れば、90％より大きな効率で常に、放射性のイオ
ンを脂質小胞に取り込ます方法が見つけられた。
その方法ではイオノフオアを脂質二重層に取り込
ませて、それは前もつて小胞内に取り込ませてお
いたキレーターまたはキレート剤に外から加えら
れた放射性のイオンを運ぶために用いられる。放
射性イオンのキレート剤への結合は十分強く、放
射性イオンを小胞内へ損失なく取り込ませるため
の推進力を与える。これらの放射性標識小胞では
単に超音波処理によつて負荷せしめたものより
も、比活性において100倍より大きい増加が示さ
れた。本願発明によると、二重層の壁がコレステロー
ルとジステアロイルフオスフアチジルコリン、い
ろいろなコレステロール誘導体あるいは先端に荷
電した親水性基を持つ炭水化物を含む、脂質小胞
は小胞によつて、あるいはその内に取り込まれ
た、どんな薬物でもあるいは他の有益な物質で
も、遊離させることが制御可能であることが見い
だされた。さらに、コレステロールのある種のア
ミノマンノースあるいはアミノガラクトース誘導
体は哺乳動物宿主に注射すると、リンパ系あるい
は肺臓または脾臓、肝臓に急速にそして選択的に
蓄積されるという特性を持つ。これらの小胞は広
範囲の放射性トレーサーや薬物を取り込むことが
できるので、この発明の小胞は病気の特異的な部
位に薬物を運ぶ唯一の方法を与える。この小胞の
壁は数時間、実質的に完全なままで、運び手とし
て有効に働く。結局は小胞の壁は崩壊し、薬物を
遊離する。簡単に言えば、本発明は、ジセチルリン酸やス
テアリルアミン、６−（５−コレステン−3β−イ
ロキシ）ヘキシル１−チオ−β−Ｌ−フコピラノ
シド、６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘ
キシル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、
６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシル
１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−（５
−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシル２−ア
セトアミド−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−3β
−イロキシ）ヘキシル６−アミノ−６−デオキシ
−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−
（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシル６−
アミノ−６−デオキシ−１−チオ−α−Ｄ−マン
ノピラノシドのような細胞表面の受容体の類似物
と、コレステロール、ジステアロイルフオスフア
チジルコリンを含む脂質二重層と、小胞の部分と
して、有効量の生理的に適合できる放射性トレー
サー細胞毒性または治療的物質から成る脂質小胞
を特徴とする。本発明はさらに、ジセチルリン酸またはステア
リルアミン、６−（５−コレステン−3β−イロキ
シ）ヘキシル１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシ
ド、６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキ
シル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６
−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシル１
−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド、６−（５−
コレステン−3β−イロキシ）ヘキシル２−アセ
トアミド−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド、６−（５−コレステン−3β−
イロキシ）ヘキシル６−アミノ−６−デオキシ−
１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシドのような細
胞表面の受容体の類似物とコレステロール、ジス
テアロイルフオスフアチジルコリンを含む脂質二
重層と小胞の部分として、有効量の生理的に適合
できる放射性トレーサー細胞毒性または治療的物
質から成り前記脂質小胞がさらに取り込んだ物質
を遊離させることが制御可能な特性を有する前記
脂質小胞を哺乳動物宿主に投与することを特徴と
する方法を含む。本発明の目的は新規な脂質小胞を与えることで
ある。一般に、本発明の目的は放射性トレーサ
ー、細胞毒性または治療的物質を制御されたそし
て予定された方法でまたは制御されたあるいは予
定された時間に遊離する脂質小胞を与えることで
ある。さらに詳しく述べれば、本発明の一つの具体例
の目的は宿主の哺乳動物に投与すると、急速に、
そして選択的に完全なまま、リンパ系あるいは肺
臓、脾臓または肝臓にまたはそれらの中に蓄積
し、結局はそこで遊離されるいろいろなトレーサ
ーや、薬物、治療剤をその中に包み込む脂質小胞
を与えることである。本発明のこれらの、または、目的そして有効性
は以下に述べる詳細な説明から明らかになろう。本発明において、“小胞”という用語は小胞の
壁内に包み込まれたか取り込まれた液体を含む小
さな袋を指す。特に、小胞壁はジセチルリン酸かステアリルア
ミン、６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘ
キシル１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド、６−
（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシル１−
チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５−
コレステン−3β−ヘキシル１−チオ−α−Ｄ−
マンノピラノシド、６−（５−コレステン−3β−
イロキシ）ヘキシル２−アセトアミド−２−デオ
キシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、
６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシル
６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−3β
−イロキシ）ヘキシル６−アミノ−６−デオキシ
−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド、とコレ
ステロール、ジステアロイルフオスフアチジルコ
リンであり、小胞の部分としては、有効量の生理
的に適合できる放射性トレーサー、細胞毒性また
は治療的物質である。上記で確認したイオノフオアも、小胞が放射性
陽イオンを持つときには入れることができること
は理解されるべきである。そのような具体例にお
いてはキレター、とりわけニトリルロトリ酢酸
（NTA）、も小胞内に入れることができる。しか
し、他のエチレンジアミンテトラー酢酸のよう
な、多価金属に対するキレターでも使うことがで
きる。小胞が薬剤などの有機物質のような他の物
質を持つときはイオノフオアやキレート剤の使用
は不必要である。小胞は酵素交換療法のための酵素類やホルモン
類、放射性核種類、細胞修飾剤、抗原、抗体、イ
ンターフエロン誘起剤、ウイルス構成粒子、
RNAやDNAのような遺伝物質、薬剤そして一般
的に言つて薬品を含むいろいろな物質を持つこと
あるいは取り込むことができる。このように、例
えば小胞は癌化学療法のための、メトトレキセー
トやアクチノマイシンのような抗癌剤を持つこと
ができる。本発明の小胞は、また小胞内に包み込
まれたアミログルコシダーゼを用いてグリコーゲ
ン貯蔵病にも用いることができる。リンパ系に対して親和性のある小胞はリンパ系
の腫瘍や転移の診断と治療のために用いることが
できることは明らかである。 Tc^99mのような放射性同位元素はそれを小胞内
に取り込ませれば、診断の目的のために用いるこ
とができる。小胞はまた、リソゾームの貯蔵病の処理を標的
細胞に満たすことによつて使用することもできる
しまた細胞外空間における望ましからざる物質の
除去においても、また細胞の構造や活動の改変に
おいても用いることができる。放射性標識物細胞毒性または治療的物質、時々
ここでは単に“取り込み物質（carried agent）”
と呼ぶ、は小胞の壁によつて包有することもでき
ることは理解されるべきである。一方、取り込み
物質は小胞壁を形成する物質の一部になりうる、
すなわち小胞壁を形成する物質に分散または溶解
させることができる。取り込み物質の小胞への組み入れはいろいろな
方法によつて遂行することができる。水溶性で安定な物質に、広く適用できる一つの
方法はその物質を水に通常は等張条件下で、溶解
し、いろいろな小胞壁−形成成分に加えそれらに
超音波処理を与えるものである。水溶性の取り込
み物質は本発明の小胞内にスゾカ（Szoka）５
Proc.Natl.Acad.Sci 75、4194−4198（1978）の手
法で組み入れることができる。この手法は酵素類
やホルモン類のようなこわれやすい水溶性物質に
とくに有用である。脂質親和性の取り込み物質は小胞を超音波処理
しその後、脂質親和性の取り込み物質を加えるこ
とによつて組み入れることができる。この手法は
ハング（Huang）５、Biochevistry 18 1702−
1707（1979）にさらに詳細に説明されている。免
疫グロブリンＧはこの手法で小胞壁の中に組み入
れることができる脂質親和性の取り込み物質の例
である。以下の実施例は単に本発明を例証するためにあ
げているのであつて、いずれの場合もそれを限定
するわけではない。実施例中、特に述べない限り
は、分数と百分率は重量によるものである。実施例１ A23187が二重層の内に組み入れられている単
層ラメラ小胞は表１に列設されたコレステロール
誘導体（またはDCPまたはSA）を使用して作製
する。典型的な作製例においては、コレステロー
ル誘導体を遊離のコレステロール、DSPC、
A23187（0.04マイクロモル）とともにクロロホル
ムに溶解し、60゜で窒素気流下にて薄膜にまで乾
燥させ、その後、真空下、一夜乾燥する。１マイクロキユーリーのトリチユウム標識した
コレステリルオレイン酸（比活性11μci1μｇ）を
脂質層のための標識として混合物中に含有せしめ
る。乾燥した脂質は、それから0.9％、Naclと５
ｍＭのリン酸ナトリウムPH7.4の、リン酸で緩衝
化した生理食塩水（PBS）中で再び0.5mlの１ｍ
Ｍ NTAとともに水和する。混合物は前もつて
室温にしたグリセロール浴中で、溶液が透明にな
るまで（約５分）超音波処理する。（チタンの微
小尖端（microtip）を装備したブランソン
（Branson）超音波処理器、高電圧にセツト）。超
音波処理の後、構造の欠陥をならすため60゜で10
分間インキユベートする。次に小胞懸濁液をチタ
ンの破片と高度に凝集した物質を除くため、300
×ｇで遠心する。リポソームの外にあるNTAは
PBSで平衡化して前もつて脂質小胞を不可逆的
結合部位を飽和させてある0.8×35cmのセフアデ
ツクスＧ−50のカラムに調整物を通すことによつ
て除く。小胞はカラムの排除容量にて溶出され典
型的には４倍に希釈されておりトリチユウム標識
したコレステリルオレイン酸標識物をもとにする
と95％が回収される。実施例負荷方法−セフアデツクスクロマトグラフイー
の後小胞の調整物は典型的には500μの小胞と、
35μの3.4μＭ、クエン酸ナトリウム（PH7.4）お
よび、２ｍＭ、HCl中で、目的の活性に依存し
て、１−50μの In³⁺、から成るインキユベー
シヨン混合物を用い、 In³⁺を負荷する。
In³⁺を加えたものに対して２倍量のPBSをインキ
ユベーシヨン混合物に加える。インキユベーシヨ
ン時間と温度は以下に示すように小胞の組成とと
もに変える。50μの、PBS中10ｍＭ EDTA
（エチレンジアミン四酢酸を加え混合物をすぐに、
PBSで平衡化したセフアデツクスＧ−50で、ク
ロマトグラフイーを行なうことによつてインキユ
ベーシヨンを終了させる。EDTAは小胞の外側
にある残つたインジウムを除くのでカラムは放射
能をもたない。以下に示す結果においては小胞に
In³⁺を負荷するためにA23187を用いた。生体内で小胞が崩壊すると、 In³⁺−NTA複
合体が遊離し、この In³⁺は近くの高分子に結
合するのに用いられる。高分子に In³⁺が結合
するとインジウム核の部位における効果的な分子
回転相関時間の大きな変化がおこり、結果的に時
間−積分角相関因子、＜G₂₂（₀₀）＞の減少がおき
る。＜G₂₂（₀₀）＞値はこのような小胞の崩壊量を検
査するのに用いることができる。すなわちその値
は無傷の小胞に含まれている In−NTAに対し
ては約0.62から、血清タンパク質に結合したイオ
ンに対しては0.18に変動する In−NTA複合体
を含む小胞の安定性と透過性はPAC法でも調べ
る事が出来る。表１で列記したすべての系に対し
て熱で不活性化した子牛血清の存在下で37℃で
0.5時間インキユベーシヨンの後において＜G₂₂
（₀₀）＞値は高いままである。少量のイソプロパノ
ールの添加で小胞を崩壊させると＜G₂₂（₀₀）＞値
は血清タンパク質に結合した In³⁺で予想され
る値に低下する。第１図乃至第４図においてPACで調べた本発
明の小胞の“完全性”が示されている。いくつか
の場合では本発明の小胞はいろいろな他の二重層
の組成をもつ小胞と比較出来る。実施例生体内での研究では、 In−NTAを含む小胞
はスイス−ウエブスターマウス（18−22系）に肩
の高さ、背中の正中線の近くに皮下注射する。適
当な時間の後マウスを殺し、すぐにPAC測定を、
有意な放射能を示す皮膚組織の部分において行な
つた。全器官と組織における放射性核種の量は井
戸（welltype）ガンマ計数器を用いて調べる。皮
下注射した小胞の安定性は表面荷電に影響される
（図、５ａと表１）。Δで示される負に荷電された
小胞（ジセチルリン酸）は対照のDSPC：コレス
テロール小胞よりも短かい半減期を示し、一方□
で示される正に荷電された小胞（ステアリルアミ
ン）は長い半減期を示す。小胞表面に中性糖が存
在すると生体内での存在時間はさらに長くなる。
表１はコレステロールのフコースおよびマンノー
ス、アセトアミドガラクトース誘導体で観察され
る安定性の増大を示す。コレステロールのアミノ糖誘導体が存在するこ
とによる生体内での小胞の挙動の変化はもつとも
劇的である。アミノガラクトースおよびアミノマ
ンノース誘導体をもつ小胞の半減期は丸い点で示
すように、他の誘導体のものよりも実質的にはそ
れぞれ100および600時間長い（表１と図５ｂ）。マウスに0.20mlのPBS中で懸濁させせ In−
NTA複合体を包み込んだ小胞を皮下注射する。
小胞はDSPC：Chol：NH₂−Man：A23187また
はDSPC：Chol：NH₂−Gal：A23187より構成す
る。注射する部位は動物の背側正中線；おおよそ
肩甲骨の高さである。放射能は他の小胞の組成でも観察されるように
注射部位に局在してはおらず放射能は主に(1)マウ
スの側部、前足のすぐ後（すなわち“わきの下”
の領域）の皮膚、(2)時々、頭骸の下の首の皮膚に
見られる。小胞が注射部位から除去されるパター
ンはリンパ管を経て局部リンパ節への流れから予
想されるものである。上述したわきの下の部位に
液体の分泌がみられ、水疱様のはれが注射後１時
間以内に肉眼で見られる。この腫れは単層ラメラ
小胞では注射後８時間まで持続し、多層ラメラ小
胞では22時間まで持続した。注射後観察されるはれは放射能の部位に対応す
る。オートラジオグラムで観察されるパターンは
はれは注射した丸薬のありのままの移動を表わし
てはいないことを示す。放射能は不連続な線維ま
たは脈管内のみに見られる。注射した放射能は急速に濃縮され、放射能をも
つ組織では元の注射量の65％以下存在する。放射
能をもつ皮膚の部位＜（G₂₂（₀₀）＞値の測定では他
の小胞の系でみられない初期の低下（＜〜18時間
において）が示される。この低下はPACスペク
トルメーターにおける幾何学的効果に由来するも
のである。例えばサンプルのサイズを200μの
体積の球から75μの球へ減少させると＜G₂₂（₀₀）
＞値が25％低下する。PAC値が放射能をもつ部
分の幾何学のみを反映し、分折したすべての組織
片の幾何学を反映したものではないから、小胞が
組織の小片内の小さな領域に濃縮されることによ
つて無傷の小胞の割合は“見かけ上”減少するこ
とになるはずである。他の小胞の系を調べた限りではどこにも局部的
な腫れは観察されず、小胞は注射された部位の皮
膚に滞まつている。周知のとおり、注射部位に滞留した取り込み物
質を含むこれらの小胞は長期間に渡つて少しづつ
取り込み物質を遊離するためにすぐれた、実益上
の重要性をもつことが理解される。このことは表
２のデータから示される。コレステロールのアミノマンノース誘導体で観
察される効果、（開いた丸と開いた三角で示され
る）は量依存であることがわかる（表１と図５
ｂ）。アミノマンノース誘導体の割合を減らして
ゆくと生体内での存在時間が減少し、水疱の形成
量が減少する。モル比２：0.9：0.1でのDSPC：
Chol：NH₂Manの小胞では腫れは明らかではな
い。コレステロールのマンノース誘導体とステア
リルアミンを組み合わせてもアミノマンノース誘
導体で観察される効果は示さない（表１）。これ
らの組み合わせた群をもつ小胞は注射部位に滞留
しアミノ糖をもつ小胞で観察された如く前足の後
に移動して濃縮されるということはない。そのた
め、アミノ糖誘導体で観察される特異性は表面群
の立体化学の結果であつて単なる糖と電荷の相加
的効果によるものではない。前述のデータはマン
ノースまたはガラクトース残基に存在するNH₂
基は、小胞を皮下注射するときリンパ系に対して
実質的な特異性を与えることを示す。治療剤を制御のもとで移送することを可能にす
る小胞系を開発する際に考慮すべき重要な因子は
遊離される物質の与えられた細胞または細胞内部
位への近づきやすさ、とくに取り込まれた物質が
細胞内に遊離されるがそれとも細胞外に遊離され
るかということである。そのような情報を得るた
めにエチレンジアミンテトラ酢酸〔（ In−
EDTA）^-1〕およびジエチレントリアミンペンタ
酢酸〔（ In−DTPA）^-2〕とインジウム複合体
の生体内での挙動を調べる。これらのインジウム
複合体は非常に安定で、皮下に注射すると腎臓に
よつて循環からすみやかに排除される。事実、こ
のようにして注射した（ In−EDTA）^-1および
（ In−DTPA）^-1の90％以上がそれぞれ2.4およ
び1.4時間以内に排せつされる（図５ｃ、それぞ
れ開かれた四角および開かれた三角）。図５ｃは
小胞で包有することの、これらの複合体の排せつ
速度への影響を示す。DSPC：Chol小胞では（
In−EDTA）^-1の消失は In−NTAを含む調
整物に対するPAC法で測定でみられる小胞の崩
壊より約８時間遅れる。三角で示された（ In
−EDTA）^-1複合体の排せつの遅れと四角で示さ
れた（ In−DTPA）^-2複合体の排せつ遅れは小
胞が細胞あるいは隔室の内で崩壊したことを示唆
する。（ In−DTPA）^-2の排せつの遅れの延長
（図５ｃ）はこの仮設に合致する。何故ならば複
合体の荷電の増大とともに膜透過性が減少するは
ずであるからである。研究したすべての系で注射
した時から小胞の崩壊の開始までに遅れが観察さ
れる（図５ａと５ｂ）。小胞崩壊の生体内での半減期は荷電した。先端
の基を有する炭化水素化合物またはコレステロー
ルの糖およびアミノ糖誘導体を脂質二重層に含有
することによつて50倍の範囲で変化し得る。これ
は皮下注射された治療剤の沈着と遊離を制御する
手段である。このような時間とともに遊離する形
態を並用すればリンパ組織への小胞の局在性はリ
ンパ系の腫瘍と転移の観察と治療を可能にする。
加うるに安定なインジウム複合体を含む小胞の組
織分布の研究とを並用した。PAC観察は小胞の
代謝の機構に価値ある洞察を与える。糖誘導体が
リン脂質小胞に取り込まれるための高度に立体特
異的な効果は本方法におけるすぐれた発展であ
る。表１それぞれ脂質小胞の皮下注射で典型的には総脂
質1.0mgで、１ｍＭ NTAと結合した20μCi
In³⁺を小胞の内部にそして、リン酸−緩衡生理食
塩水（0.9％NaCl、５ミリモラ−リン酸ナトリウ
ム、PH7.4）を小胞の内部と外部にもつ。総注射
量は200μである。データは皮膚のPAC測定を
基にしたものである。100％完全なレベルは注射
する前の小胞のG₂₂（₀₀）値、０％完全なレベルは
血清タンパク質に結合した In³⁺のG₂₂（₀₀）値
に対応する。【表】【表】【表】【表】【表】【表】実施例本実施例においては、小胞を静脈注射する。表
３のデータはNH₂Man誘導体は最初、肺に選択
的に蓄積される。その後、３時間および24時間で
肺および脾臓に、後に体の中でもつとも大きなリ
ンパ器官へ蓄積されることを示す。医薬用担体を用いた従来の方法でこの負荷小胞
を投与することができることは理解されるべきで
ある。このように、経口および非経口投与形を用
いることができる。実施例実施例−の方法に従つて、以下の組成の負
荷脂質小胞を調整する。表４二重層の組成（モル比） DSPC：Chol：AcAmGal （２：0.5：0.5） DSPC：Chol：NH₂Gal （２：0.5：0.5） DSPC：Chol：NH₂Man （２：0.5：0.5）取り込み物質メントレキセートアクチノマイシン Tc^99m 以下の実施例で本発明の参考例において用いら
れる細胞−表面受容体の調製法を説明する。参考例６−デオキシ−１、２：３、４−ジ−Ｄ−イソ
プロピリジン−６−フタルイミド−α−Ｄ−ガ
ラクトースフタールイミドカリウム（4.94ｇ）をＮ、Ｎ−
ジメチルホルムアミド（50ml）中の６−デオキシ
−６−イオド−１、２：３、４−ジ−０−イソプ
ロピリデン−α−Ｄ−ガラクトース（9.0ｇ）に
加える。懸濁液は撹拌しながら８時間130℃（湯
浴の温度）で熱する。もう一方のフタールイミド
カリウム（1.25ｇ）は茶色の冷却溶液に加え、次
に撹拌しながら同じ温度で８時間加熱する。溶液
は真空下で留去し暗色のシロツプにする、これを
エチルエーテルと水で分配する。暗色の不溶物質
はロ過して捨て、エーテル層を３回水洗い乾燥さ
せシロツプになるまで留去する（生成物と原料の
混合物）。この混合物をクロロホルム中５％酢酸
エチルを溶出液としてシリカゲルのカラムクロマ
トグラフイーで分離する。表題の化合物を結晶と
して単離し、メタノールで再結晶して生成物の54
％、5.1ｇを得る。m.p.、138−141℃：〔１：t.m.
p.144.5−145.5℃〕；m.m.r（クロロホルム−ｄ）
25.42（ｄ、J¹ _1,25.0Hz、Ｈ−１）、7.47−7.82（４ア
ロ
マチツク）、1.23、1.37、1.43、および1.52
【式】。参考例６−デオキシ−６−フタールイミド−Ｄ−ガラ
クトースピラノース氷酢酸（50ml）中の６−デオキシ−１、２：
３、４−ジ−０−イソプロピリデン−６−フタル
イミド−α−Ｄ−ガラクノース（5.0ｇ）と水
（18ml）の溶液を32時間80℃（湯浴の温度）で加
熱する。溶液をロ過し、ロ液を真空下留去し、結
晶を得る。無水エタノールから再結晶すると表記
の化合物が得られる。（3.0ｇ、76％）、m.p.155℃
（分解）、95℃で軟化する。参考例工程Ａ１、２、３、４−テトラ−０−アセチル
−６−デオキシ−６−フタールイミド−Ｄ−ガ
ラクトピラノース６−デオキシ−６−フタールイミド−Ｄ−ガラ
クトピラノース（2.9ｇ）を常法によりピリジン
（20ml）中の無水酢酸でアセチル化し、１、２、
３、４−テトラ−０−アセチル−６−デオキシ−
６−フタールイミド−Ｄ−ガラクトピラノース
（4.30ｇ、96％）をαとβ−アノマーが１：1.6の
比である混合物として得る。〔α〕²⁷ _D＋52.5℃（Ｃ
1.0、クロロホルム）；n.m.r（クロロホルム−
ｄ）：∂5.70（ｄ、J_1,28.0Hz、Ｈ−1β）、6.33（ｂ、
Ｈ
−1α）。工程Ｂ２、３、４−トリ−０−アセチル−６−
デオキシ−６−フタールイミド−α−Ｄ−ガラ
クトピラノシルブロマイドジクロロメタン（２ml）中の１、２、３、４−
テトラ−０−アセチル−６−デオキシ−フタール
イミド−Ｄ−ガラクトピラノース（4.2ｇ）の溶
液を氷酢酸（10ml）中の30−32％臭化水素酸溶液
で１時間反応する。反応混合物を冷水に注ぎ入
れ、反応物をすぐにジクロロメタンで抽出する。
有機層を冷炭酸水素ナトリウム水と冷水で洗浄
し、乾燥して真空下で蒸発させ表記の化合物をシ
ロツプの形で得る（4.0ｇ、91％）；n.m.r.（クロロ
ホルム−ｄ）：6.63（ｄ、J_1,24.0Hz、Ｈ−１）、7.53
−7.90（４アロマチツク）、1.96、2.07および2.13
（30Ac）。参考例２、３、４−トリ−０−アセチル−６−デオキ
シ−６−フタールイミド−１−チオ−β−Ｄ−
ガラクトピラノース (A) 乾燥アセトン（20ml）中２、３、４−トリ−
０−アセチル−６−デオキシ−６−フタルイミ
ド−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロマイド
（4.0ｇ）とチオウレア（0.67ｇ）の溶液を還流
下で４時間加熱する。溶液は真空下シロツプに
なるまで留去し、水とジクロロメタンで分配す
る。有機層を水で３回抽出する。合併した水性
抽出物を留去し２−Ｓ−（２、３、４−トリ−
０−アセチル−６−デオキシ−６−フタールイ
ミド−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−２−チオ
プソイドウレア（3.40ｇ）を得る。 (B) クロロホルム（9.0ml）を２−Ｓ−（２、３、
４−トリ−０−アセチル−６−デオキシ−６−
フタルイミド−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
２−チオプソイドウレア（3.4ｇ）のメタ次亜
硫酸カリウムを含む水溶液（10ml）に加える。
混合物を撹拌しながら還流下で15分加熱する。
冷やした溶液を分離し、有機層を乾燥し真空下
で留去し表記の化合物を得る（2.5ｇ）。この物
質は６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘ
キシル２、３、４−トリ−０−アセチル−６−
フタルイミド−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシドの製造に直接用いる。参考例６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシ
ル２、３、４−トリ−０−アセチル−６−デオ
キシ−６−フタルイミド−１−チオ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドトリエチルアミン（0.8ml）を２、３、４−ト
リ−０−アセチル−デオキシ−６−フタルイミド
−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース（2.5
ｇ）と６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘ
キシルイオダイド（3.3ｇ）のジクロロメタン溶
液（20ml）に加える。溶液を室温、窒素気流下で
一夜放置し水洗し、乾燥して真空下でシロツプに
なるまで（4.71ｇ）留去する。この物質をシリカ
ゲルのカラムに置きクロロホルム、続いてクロロ
ホルム中、２％酢酸エチルで溶出する。目的の分
画を合併し真空下で留去し表記の化合物（4.0ｇ、
78％）を得る。 Rf0.2（CHCl₃−EtOAc、95：５）、〔α〕²⁷ _d−93
℃。（Ｃ1.18、クロロホルム）；n.m.r（クロロホル
ム−ｄ）：7.60−7.91（４−アロマチツク）、1.93、
2.03および2.24（30Ac）0.68（CH₃−18）。参考例６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシ
ル６−アミン−６−デオキシ１−チオ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシ
ル２、３、４−トリ−０−アセチル−６−デオキ
シ−６−フタールイミド−１−チオ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシド（710mg）のメタノール（10ml）
及びｎ−ブチルアミン（10ml）の混合液中の懸濁
液を16時間還流下で加熱する。溶液は留去し結晶
化する。クロロホルムを加え固体をロ過しクロロ
ホルムで洗う。合併したロ液はシロツプになるま
で留去しシリカゲルのカラムに置きクロロホルム
−メタノール−アンモニア水（80：20：２）で溶
出する。目的の分画を合併し、シロツプになるま
で留去してエチルエーテルを加え粋砕し結晶を得
る（390mg76％）；Rf0.28（CHCl₃−MeOH−
NH₄OH、80：20：２）、〔α〕²⁷ _D−29.5℃（C1.05、
クロロホルム）；m.S：ｍ／e665（M⁺＋１）参考例６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシ
ル１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシドＡ６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキ
シル２、３、４−トリ−０−アセチル−１−チ
オ−β−Ｌ−フコピラノシド２、３、４−トリ−０−アセチル−１−チオ
−β−Ｌ−フコピラノース（10ｍモル）をトリ
エチルアミン（10ｍモル）を含むジクロロメタ
ン（30ml）中のヨウ化６−（５−コレステン−
3β−イロキシ）ヘキシルと反応せしめる。反応は１日室温中で行なう。反応液は蒸留水
（20ml）で洗浄し、無水酢酸ナトリウムで乾燥
する。ロ液を濃縮してシロツプにし、シリカゲ
ルのカラムに置いてクロロホルム、続いてクロ
ロホルム中1.0％エタノールで溶出する。表題
の化合物を含む分画を薄層クロマトグラフイー
で調べて合併し留去する。表記の化合物を61％
の収率で得る。〔α〕ｃ−4゜（C1.5、クロロホル
ム）Ｂ６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキ
シル１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド工程Ａの生成物を塩基性イオン交換樹脂、
Bio−rad AG−X2（OH）とエタノール−テト
ラヒドロフラン中でまたはナトリウムメトキサ
イドのメタノール溶液中で撹拌し表題の化合物
を針状晶として得る。収率80％、m.p.110−
112゜（酢酸エチル）、〔α〕Ｄ−11゜（Ｃ1.43、クロ
ロホルム）。参考例中性糖脂質の封鎖を解く方法１当量の糖脂質の１：１エタノール−THR（グラムあたり33ml）溶液を
エタノールに懸濁する。これを2.5〜３倍過剰の
Bio−Rad AG1−X2 OH^-イオン交換樹脂で反
応し45分室温で撹拌する。樹脂をロ過して除き温
THF（グラムあたり３×16ml）で洗浄する。合併
したロ液を留去し以下の化合物を得る。６−コレスト−５−エン−3β−イロキシ）ヘ
キシル１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド
（ｂ） 91％無色の針状（THFから）、d.s.c.吸熱転移
点：64−65、81−82および226−227℃；〔α〕²⁵ _D＋
77.9＋0.9゜（C1.11THF）；IR3600−3100（OH）cm
^-1；（Ｓ）、1105（Ｓ）、1070（Ｓ）cm^-1；MS：665
（M⁺）、501、368 元素分析のC₃₉H₆₈O₆Sとして計算値：Ｃ、70.44；H10.31；Ｓ、4.82 実測値：Ｃ、70.20；Ｈ、10.22；Ｓ、4.80 ６−（コレスト−５エン−3β−イロキシ）ヘキ
シル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
（ａ） 66％青白い黄かつ色の粉、 m.p.104−106℃（液晶化）、および219−221℃
（等方性液体化）； IR3600−3100（OH）cm^-1 元素分析のC₃₉H₆₈O₆Sとして計算値：Ｃ、70.44；H10.31；Ｓ、4.82 実測値：Ｃ、70.16；Ｈ、10.03；Ｓ、4.79 参考例６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシ
ル２−アセトアミド−２−デオキシ−１−チオ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシドＡ６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキ
シル２−アセトアミド−３、４、６−トリ−０
−アセチル−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド参考例Ａの方法において２、３、４−トリ
−０−アセチル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラ
ノースの代りに２−アセトアミド−３、４、６
−トリ−０−アセチル−２−デオキシ−１−チ
オ−β−Ｄ−ガラクトピラノース（10ｍモル）
を用いトリエチルアミンの代りに１、５−ジア
ザビシクロ〔５、４、０〕−アンデカ−５−エ
ン（10ｍモル）を用いて反応を行う化合物は結
晶物質として得られ収率は43％、m.p.130−
133゜（エタノール）〔α）_D−37゜（Ｃ1.5、クロロホ
ルム）である。Ｂ６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキ
シル２−アセトアミド−２−デオキシ−１−チ
オ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド表題の化合物は参考例Ｂの方法により得ら
れる。収率85％、m.p.241−243゜、〔α〕_D−35゜
（Ｃ1.5、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド）。参考例２、３、４−トリ−０−アセチル−６−０−メ
チルスルホニル−α−Ｄ−マンノピラノシルブ
ロマイドの製法 J.フエルナンデス−ボラノス（Fernandez−
Bolanos）とR.G.フエルナンデス−ボラノス、
An.Quim、65 1969 1163−1164；Chem.Abstr、
72（1970）133105Wに報告されている方法で製す
る。１、２、３、４−テトラ−０−アセチル−６−
０−メチルスルホニルβ−Ｄ−マンノピラノース
14.9グラム（34.9ｍモル）の乾燥CH₂Cl₂60ml溶液
を21mlの30〜32％HBrの氷酢酸溶液で反応せし
めこれを25℃で2.5時間保持する。混合物を400ml
の撹拌した水の中に注ぎ入れ、分離しそして水層
を20mlのCH₂Cl₂で３回抽出する。合併した有機
層を水と飽和NaHCO₃で洗浄しNa₂SO₄で乾燥さ
せ留去する。石油エーテルbp30−60℃を加えて
粉砕し、ロ過し、空気乾燥させて、固体のα−グ
リコシルブロマイドを14.6グラム（93％）得
る。m.p.167.5−168.8℃（分解）、〔α〕²⁵ _D＋120.0±
0.05゜（C1.01CHCl₃）、IR1740と1725（酢酸）cm^-1 元素分析；C₁₃H₁₉BrO₁₀Sとして計算値 C.34.91；H.4.28；Br17.87； S.7.17 実測値 C.35.04；H.4.18；Br17.61； S.7.27 参考例 XI ６−（コレスト−５−エン−3β−イロキシ）ヘ
キシル２、３、４−トリ−０−アセチル−６−
アジド−６−デオキシ−１−チオ−α−Ｄ−マ
ンノピラノシド参考例で示した方法によつて製したマンノシ
ルブロマイドを、Ｍ、サーニイ（Cerny）、J.スタ
ネク（Stanek）とJ.パカック（Pacak）、
Monatsh94 290−294（1963）の報告されている
方法に従つてインチオウロニウムブロマイド
〔85％、白色の粉、m.p.87−90℃（分解）；
IR3600−3100、1740、1640cm^-1〕を対応するチ
オールXI〔89％白色のガラス、IR2560、1750−
1730cm^-1〕に転換する。チオールXIを参考例の
と反応せしめ、61％６−（コレスト−５−エン
−3β−イロキシ）ヘキシル２、３、４−トリ−
０−アセチル−６−Ｄ−メチルスルホニル−１−
チオ−α−Ｄ−マンノ−ピラノシド（XII）、白色
ガラス、IR1740cm^-1を得る。最終的には、メシ
レート1.14グラム（1.32ｍモル）とNaN₃0.49ｇ
（7.5ｍモル）、乾燥DMF40mlをともに70−75℃で
窒素下4.5時間撹拌する。溶媒を留去した後、残
漬をエーテル20mlに溶解し、水10mlで３回洗浄
し、MgSO₄で乾燥させ留去し表題のアジド
1.05ｇ（97％）を白色のガラスとして得る。TLC
上で単一（ベンゼン中EtOAc、シリカゲル上）、
〔α〕²⁵ _D＋12.6±0.5゜（C1.02CHCl₃）；IR2095（アジ
ド）、および1755（酢酸）cm^-1、0.54ｇのサンプル
はさらにカラムクロマトグラフイー（シリカゲ
ル、ベンゼン中12％EtOAc）で精製し0.417ｇ
（75％収率）の、長期間放置すると固体化する白
色のガラス状物質を得る。m.p.68−70℃ 元素分析 C₄₅H₇₃N₃O₈Sとして計算値：Ｃ、66.22；Ｈ、9.02；Ｎ、5.15；Ｓ、3.93 実測値：Ｃ、66.53；H8.98；Ｎ、5.14；Ｓ、3.98 参考例 XII ６−（コレスト−５エン−3β−イロキシ）ヘキ
シル６−アジド−６−デオキシ−１−チオ−α
−Ｄ−マンノピラノシド（XI）の製法アジドトリ酢酸を参考例で示した方法で
保護基をはずし62％の表題のアジドトリオールXI
をガラス状物質として得る。IR3600−3100
（OH）、2095（アジド）cm^-1 元素分析；C₃₉H₆₇N₃O₆ 計算値Ｃ、67.88；Ｈ、9.79；Ｓ、4.65 実測値Ｃ、67.80；Ｈ、9.55；Ｓ、4.54 参考例６−（コレスト−５エン−3β−イロキシ）ヘキ
シル６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−α
−Ｄ−マンノピラノシド（ｄ）の製法参考例XIIで示した方法で製した。0.163ｇ
（0.236ｍモル）のアジドトリオールの3.0mlのト
リエチルアミンを含む4.0mlのCHCl₃溶液を室温
で乾燥したH₂Sガスで4.5時間反応せしめる。揮
発成分はロータリーエブアポレーターで除き、生
成物をプレパラテイブTLC（シリカゲル、７：
２：1CHCl₃／CH₃OH／濃アンモニア水）で単
離し65.0mg（41％）の白い粉を得る。m.p.不明；
IR3650（NH₂）、3600−3100（OH）cm^-1；MS：
635（Ｍ−CH₂＝NH）、503、470、386、368、
353。１mgの試料をDMF中のビス（トリエチルシ
リル）トリフルオロアセトアミド溶液で65−70℃
15分間過−０−トリメチルシリル化する。 MS：1024（Ｍ）、1009、951（Ｍ−Ｎ CSi
〔CH₃〕₃）₂、523、501、368、174（ベースピーク）
過−０−トリメチルシリル化したサツカライドの
フラグメントを高分解能MSで観測する。元素分析 C₂₁H₅₂NO₄Si₅ ⁺として計算値；522、2744、実測値；522、2721 本発明を十分説明する上で添付した特許請求の
範囲の形態によつてのみ限定される。

【図面の簡単な説明】

第１図−第４図はそれぞれPACで調べた本発
明の小胞の「完全性」を示す。第５Ａ図第５Ｂ図
及び第５Ｃ図はそれぞれ小胞の崩壊の経時変化を
示す。

Claims

【特許請求の範囲】１ジセチルリン酸、ステアリルアミン、６−
（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシル１−
チオ−β−Ｌ−フコピラノシド、６−（５−コレ
ステン−3β−イロキシ）ヘキシル１−チオ−β
−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−（５−コレステ
ン−3β−イロキシ）ヘキシル１−チオ−α−Ｄ
−マンノピラノシド、６−（５−コレステン−3β
−イロキシ）ヘキシル２−アセトアミド−２−デ
オキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド、６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキ
シル６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシドまたは６−（５−コレス
テン−3β−イロキシ）ヘキシル６−アミノ−６
−デオキシ−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシ
ド、ならびにコレステロールおよびジステアロイ
ルフオスフアチジルコリンを含む脂質二重層と、
当該小胞の部分として、有効量の生理的に適合で
きる放射性トレーサー、細胞毒性または治療的物
質とからなることを特徴とする脂質小胞。２６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキ
シル６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシドならびにコレステロール
およびジステアロイルフオスフアチジルコリンを
含む脂質二重層と、当該小胞の部分として、有効
量の生理的に適合できる放射性トレーサー、細胞
毒性または治療的物質とからなることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の脂質小胞。３６−（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキ
シル６−アミノ−６−デオキシ−１−チオ−α−
Ｄ−マンノピラノシドならびにコレステロールお
よびジステアロイルフオスフアチジルコリンから
成る脂質二重層と、当該小胞の部分として、有効
量の生理的に適合できる放射性トレーサー、細胞
毒性または治療的物質とからなることを特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の脂質小胞。４有効量の生理的に適合できる放射性トレーサ
ー、細胞毒性または治療的物質を水に溶解し、ジ
セチルリン酸、ステアリルアミン、６−（５−コ
レステン−3β−イロキシ）ヘキシル１−チオ−
β−Ｌ−フコピラノシド、６−（５−コレステン
−3β−イロキシ）ヘキシル１−チオ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド、６−（５−コレステン−3β
−イロキシ）ヘキシル１−チオ−α−Ｄ−マンノ
ピラノシド、６−（５−コレステン−3β−イロキ
シ）ヘキシル２−アセトアミド−２−デオキシ−
１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、６−
（５−コレステン−3β−イロキシ）ヘキシル６−
アミノ−６−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−ガラ
クトピラノシドまたは６−（５−コレステン−3β
−イロキシ）ヘキシル６−アミノ−６−デオキシ
−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド、ならび
にコレステロールおよびジステアロイルフオスフ
アチジルコリンを加え、得られた混合物を超音波
処理にかけることを特徴とする脂質小胞の製法。