JPWO1995007710A1 - 創傷治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 成長因子や成長因子誘発性のタンパク質とは異なる性質と作用を有し、かつ強力な治療効果を有する創傷治療剤が開示されている。本発明の創傷治療剤は、単球走化性因子若しくは単球走化性を有するその変異体又はそれらの誘導体を有効成分とする。

Description

【発明の詳細な説明】 創傷治療剤技術分野 本発明は創傷治療剤に関する。背景技術 単球に対する走化性を有する因子はいくつか知られている。その中で単球走化 活性化因子（monocyte chemotactic and activating factor（以下、「ＭＣＡＦ 」という）は、ＭＣＰ−１（Monocyte chemoatractant protein-1）やＧＤＣＦ （glioma-derived monocyte chemotactic factor）とも称され、アミノ酸７６個 からなる蛋白質であり、４個のシステイン基を持つ。これらは単球に対して強力 な走化性および活性化作用を有することが知られている。

ＭＣＡＦとＭＣＰ−１およびＧＤＣＦについてはその同定と遺伝子クローニン グが次の論文に、 1）K. Matsushima et al., J. Exp. Med., 169, 1485-1490, 1989. 2）Y. Furutani et al.,Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 249-255,198 9. 3）E.A. Robinson et al., Proc．Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1850-1854,198 9. 4）T. Yoshimura et al., FEBS Letters, 244, 487-493, 1989. また、総説が次の文献に記載されている。

5）N.Mukaida et al., Microbiol. Immunol. 36, 773-789, 1992 文献３）、４）に記載されたＭＣＰ−１、ＧＤＣＦは、文献１）、２）に記載さ れたＭＣＡＦと同一である。

ＭＣＡＦが単球に対して強力な走化性および活性化の作用を有することは知ら れており、免疫活性化作用や抗腫瘍作用への用途が前記文献などに示唆されてい る。また、一般的概念として、創傷部位に集まった単球が創傷の自然治癒に役割 を果たすことは知られている。しかしＭＣＡＦが直接に創傷の治療を促進する作 用を有することについては知られていない。

幾つかの蛋白性成長因子が創傷の治療を促進する作用を有することが知られて いる。例えば線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トラン スフォーミング成長因子（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β）、血小板由来成長因子（Ｐ ＤＧＦ）、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、ケラチノサイト成長因子などの成長 因子は創傷治療効果を持つことが期待されている（文献６）。

6）T.A. Mustoe et al., J. Clin. lnvest., 87, 694-703(1991). 最近インターロイキン１（ＩＬ−１）が創傷治療効果を持つことが米国特許第５ ２０２１１８号に記載されている。発明の開示 本発明の目的はこれら成長因子や成長因子誘発性の蛋白質を使用するのではな く、これらの物質とまったく異なる性質と作用をもち、かつ強力な治療効果を有 する創傷治療剤を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、ＭＣＡＦ若しくは単球走化性を有するその変異体又はそ れらの誘導体を有効成分とする創傷治療剤を提供する。

本発明により、創傷、すなわち、熱傷、外傷、手術等の外傷性潰瘍、内因性要 因（消化液性）などの基礎疾患性潰瘍等の治療を促進する有用な創傷治療剤が提 供された。図面の簡単な説明 図１は、切傷をつけた７日後のサンプル皮膚の引張強度を示す図である。

図２は、切傷をつけた１４日後のサンプル皮膚の引張強度を示す図である。

図３は、ＭＣＡＦの創傷治療効果を他の成長因子による創傷治療効果と比較し て示す図である。

図４は、ＭＣＡＦによる創傷治療効果を示す図である。発明を実施するための最良の形態 ＭＣＡＦは、７６個のアミノ酸から成り、単球走化作用及び活性化作用を有す る蛋白質であり、具体的には上記文献１）〜５）に示されるものである。

ＭＣＡＦのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。

本発明においては、上記ＭＣＡＦのアミノ酸配列を実質的に有し、かつ、単球 走化作用又は活性化作用を有するＭＣＡＦの変異体をも有効成分として用いるこ とができる。ここで、ＭＣＡＦの変異体とは、ＭＣＡＦのアミノ酸配列を実質的 に有することを意味し、ＭＣＡＦの単球走化性を失わない範囲でアミノ酸配列が 自然又は人工的に欠失、追加又は置換されたものを含む。特にＮ末端やＣ末端の 配列は、天然型ＭＣＡＦあるいは組換えＭＣＡＦにおいて、産生条件によって変 化する可能性（アミノ酸残基の増減の可能性）があるが、これらは本発明のＭＣ ＡＦに含まれる。さらに、本発明においては、上記ＭＣＡＦ又はＭＣＡＦ変異体 を化学的又は生化学的に修飾した誘導体（例えは、ポリエチレングリコール若し くはその類似体を化学的に結合したもの、リン酸化や硫酸化したもの、エンドペ プチダーゼ等のペプチダーゼで処理したもの、シアリダーゼ等の糖鎖修飾若しく は糖鎖付加酵素で処理したもの）も有効成分として用いることができる。ＭＣＡ Ｆにはそのアミノ酸数とシステイン残基の配置が類似した、ＭＣＡＦ類縁体が知 られている。ヒトではＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＬＤ７８、ＡＣ Ｔ２、Ｉ−３０９、マウスではＪＥ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＣＡ−３ などがＭＣＡＦの構造的類縁体として知られている（上記の文献４、５）。また 最近はＭＣＡＦ類縁体としてＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３も知られている（文献6）J . Van Damme ら、J. Exp. Med., 176, 59-65, 1992）。これらの中で単球（モノ サイト）やマクロファージに対して走化性又は活性化作用をもつ物質は、本発明 でいうＭＣＡＦ変異体に含まれ、本発明の創傷治療剤の有効成分として用いるこ とができる。特に、ＲＡＮＴＥＳＮ、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＪＥは単球（モ ノサイト）やマクロファージに対して走化性を示すことが既に示されている（前 記文献５、６）ので、これら若しくはこれらの変異体又はこれらの誘導体は本発 明の創傷治療剤の有効成分として用いることができる。

本発明で使用するＭＣＡＦの製造方法にはとくに制限はなく、既知の方法で得 られるＭＣＡＦが好適に使用される。例えば前述の文献２）、もしくは４）に記 述されたｃＤＮＡを適切な発現制御領域遺伝子すなわちＳＶ４０やサイトメガロ ウイルスのプロモーター、バキュロウイルスのプロモーター、アミノ酸合成代謝 遺伝子のプロモーター、糖合成代謝遺伝子のプロモーターなどの下流に連結して 得られた発現ベクターを動物細胞や、昆虫細胞、真核単細胞、原核細胞などに導 入してＭＣＡＦを産生させ、親和性担体、イオン交換担体、疎水性担体あるいは 抗体担持担体などのカラムクロマトグラフィーを組み合わせた適切な精製手段に よって精製ＭＣＡＦが得られる。遺伝子組換え手法による物質の生産は現在多様 な方法が知られており、現時点で知られた方法の組み合わせで本発明のＭＣＡＦ を生産することができる。

またＭＣＡＦを本来的に、またはなんらかの刺激により産生する細胞、すなわ ち単核白血球、線維芽細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、平滑筋細胞、アストロ サイト、あるいはＴＨＰ−１（ミエロモノサイト）、Ｕ−１０５ＭＧ（グリオー マ）などの株化細胞を培養し、そのままもしくは必要なら適当な刺激によってＭ ＣＡＦを産生させ、続いて上記精製手段で精製することによっても生産すること ができる。ＭＣＡＦの産生細胞とその刺激条件については、前記文献４）および ５）に記載されている。

なお、配列表の配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するヒトＭＣＡＦは市 販されており（下記実施例１参照）、本発明において、このような市販のＭＣＡ Ｆを好適に用いることができる。

本発明で言う創傷は、皮膚や粘膜を含む組織の損傷を意味し、皮膚潰瘍が含ま れる。皮膚潰瘍には、熱傷、外傷、手術等の外傷性潰瘍、褥蒼、下腿潰瘍等の循 環障害性潰瘍、皮膚疾患、内因性要因（消化液性）等の基礎疾患性潰瘍等が含ま れる。実施例には、ウサギの皮膚創傷モデルで、本発明の有効性が明確に示され ている。実施例に示した創傷における顕著な有効性から、容易にＭＣＡＦの皮膚 潰瘍、特に外傷性潰瘍の治療効果を期待することができる。

本発明の目的である創傷を治療するためには、上記ＭＣＡＦ若しくはその変異 体又はそれらの誘導体を有効成分とし、これに医薬的に許容し得る担体に配合し て得られる組成物を生体に投与する。投与対照としての創傷は、上述の通り、皮 膚や粘膜を含む組織の損傷を意味し、皮膚潰瘍が含まれ、皮膚潰瘍には、熱傷、 外傷、手術等の外傷性潰瘍、褥蒼、下腿潰瘍等の循環障害性潰瘍、皮膚疾患、内 因性要因（消化液性）等の基礎疾患性潰瘍等が含まれる。

配合する他の成分としては、水や有機溶剤の他に、医薬的に許容しうる一般的 な医薬添加物が選ばれる。もちろん添加物が無くとも本発明の目的は達成される 。そのような医薬添加物としては、コラーゲン、ヘパリン、ポリビニルアルコー ル、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチル セルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、ヒ アルロン酸、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペク チン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、 カゼイン、ゼラチン、寒天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリ ン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、 ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニ ト−ル、ソルビト−ル、ラクト−ス、医薬添加物として許容され得る界面活性剤 などがあげられる。実際の添加物は本発明治療剤の剤形に応じて上記の中から適 宜あるいは組み合わせて選ばれるが、もちろんこれらに限定するものではない。

本発明はまた、ＭＣＡＦと他の薬剤、生物学的製剤や合成医薬製剤などとの、 同時もしくは逐次的併用投与をも包含する。他の薬剤としては、抗炎症作用、末 梢循環改善作用、血栓生成抑制作用、組織修復作用を有するもの、消化管潰瘍に 対して治療効果の知られたもの、ヘパリン、あるいは本発明の目的である効果を 増強もしくは補助するような創傷治療剤の中から選ばれる。

投与方法としては、特に限定するものではないが、本発明の目的から局所投与 が望ましい。局所投与形態として外用剤、座剤、注射剤あるいは、消化管の潰瘍 に対する処置としての経口投与が好適に実施し得る。外用剤としては、軟膏、ゲ ル、クリ−ム、乳液、液剤などの塗布剤、テープ剤、パッチ剤などの貼付剤、あ るいはスプレー剤、粉剤などの噴霧剤から選択される。

有効投与量としては、１日につき創傷１部位当たり０．００１μｇから１００ ｍｇの範囲で選ばれる。好適には創傷１部位当たり０．０１μｇから１ｍｇの範 囲で選ばれる。前述の投与量は創傷部位の大きさや症状によっても異なり、これ らの値に限定されるものでは勿論ない。外用剤として使用する場合、製剤中の有 効成分量としては０．０００００１重量％から１０重量％、好ましくは０．００ ００１重量％から０．１重量％の範囲から選ばれる。投与回数としては創傷時に １回、あるいは１日１ないし数回、もしくは２ないし数日に１回の範囲で選ばれ るがこれに限定されるものではない。

実施例 以下に本発明を実施例によって、より詳細に、より具体的に説明するが、もち ろんこれによって本発明が制限されるものではない。実施例１ ウサギ創傷に対するＭＣＡＦの効果： １）試験方法 ウサギはＮＺＷ（ニュージーランドホワイト）を用い、１群４羽とした。

各７５ｍｇのペントバルビタールで麻酔後、背部に５か所５ｃｍ長の切り傷を 与えた。単球走化性活性化因子としては、ペプロテク社(Pepro tech, Inc.,Rock yHill, New Jersey 08553, USA)から購入した遺伝子組換えにより調製されたヒ トＭＣＡＦを使用した。

局部に次の配合剤（薬剤および対照薬剤）を、１ケ所の創傷部位につき合計１ mlを０. １mlずつ複数に分けて局所注射した。

（１）ＰＢＳ（１ｍｌ） （２）ＰＢＳ（１ｍｌ）＋牛コラーゲン（１ｍｇ） （３）ＰＢＳ（１ｍｌ）＋牛コラーゲン（１ｍｇ）＋ＩＬ−８（５μｇ） （４）ＰＢＳ（１ｍｌ）＋牛コラーゲン（１ｍｇ）＋ＩＬ−１（５μｇ） （５）ＰＢＳ（１ｍｌ）＋牛コラーゲン（１ｍｇ）＋ＭＣＡＦ（５μｇ） ７日後、および１４日後にウサギを屠殺した。次いで、背部皮膚全面を剥がし 、切傷部を直角に含んだ幅１．５ｃｍのテープ状にサンプルを調製し、引っ張り 強度を測定した。引っ張り強度測定には島津制作所、Autograph TensionTester を用い、Watanabe, Y. et al., Surg. Res. Comm., 10, 267-277, 1991に記載さ れた方法によった。

２）試験結果 ７日後の結果を表１と図１に、１４日後の結果を表２と図２に示す。

表１は７日後のサンプル皮膚の引っ張り強度実測値を、表２は１４日後のサン プル皮膚の引っ張り強度実測値をそれぞれグラムで表示したものである。実測値 として示した各４個の値はそれぞれ左からウサギ４匹の個体別に対応するもので ある。平均値と標準偏差（ＳＤ）を右端に示した。

表１、図１、表２、および図２から、ＭＣＡＦを投与したものにおいて、明ら かに引っ張り強度の増加が認められ、ＭＣＡＦが創傷治療剤として有効であるこ とが結論される。表１について統計処理（スチューデントｔ検定）を行ったとこ ろ、ＭＣＡＦ投与群すなわち上記剤型（５）投与群は、対照群としてのＰＢＳの み投与群すなわち上記剤型（１）投与群、およびコラーゲン投与群すなわち上記 剤型（２）投与群に対して０．０５以下の危険率で有意差を示した。群内の例数 の関係で、他の値および表２の値の間では、本統計処理で有意差は見られなかっ たが、表１および表２のウサギ個体別の実測値を詳細に比較すると明らかに、Ｍ ＣＡＦ投与群に引っ張り強度の増加が認められる。実施例２ ＭＣＡＦの皮膚創傷治療効果を他の成長因子の効果と比較した。またＭＣＡＦ の用量依存性の効果を調べた。

１）試験方法 原則として実施例１の方法に従って以下の実験を行った。

ＭＣＡＦとしてはヒト線維芽細胞をポリＩ：ポリＣ５０mgｌで刺激した培養上 清から、疎水性クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相Ｈ ＰＬＣによって精製したものを用いた。このヒト細胞由来ＭＣＡＦは実施例１で 用いたペプロテク社製ＭＣＡＦと同じ生理作用を示した。

ＮＺＷウサギ雌（体重２．５〜３．５kg）を使用した。麻酔は２５mg kg のペ ントバルビタールを投与した。背部皮膚の切傷は６cm長である。傷口は１．５cm ずつ離して外科用ステープルで閉じた。ＭＣＡＦや他の成長因子類を含んだ投与 剤はエマルジョン化したコラーゲン（Zyderm Collagen Corp., Palo Alto,Calif .）１０mg ml を含んだリン酸緩衝液にて調製した。傷口をステープルで閉じる 時に、１ケ所の傷口につき０．５mlの前記エマルジョン溶液を投与した。７日後 にウサギを殺しテープ状の中央部に直角に傷口が位置するようにした１．５cm 幅の皮膚のテープ状サンプルを調製した。成長因子類としてＥＧＦ（recombinan thuman epidermal growth factor）は、Becton Dickinson社のものを各２μｇ、 ｂＦＧＦ（recombinant human basic fibroblast growth factor）はGenzoyme社 のものを各２μｇ、ＴＧＦ−α（recombinant human transforming growthfacto r-α）はBecton Dickinson社のものを各２μｇ、ＴＧＦ−β（humantransformin g growth factor）は、Becton Dickinson社のものを各２μｇを１ケ所の傷口に 対して使用した。

ＭＣＡＦの用量依存的効果の試験では、傷口１ケ所当りのＭＣＡＦ投与量を０ ．２、１．０および５．０μｇとした。

いずれの場合もテープ状に調製した皮膚サンプルは実施例１と全く同じように 引張り強度を測定し、ｇｍ（グラム）で表示した。結果は図３と図４に示した。

結果は平均±ＳＤ（標準偏差）で表示し、統計処理（スチューデントｔ検定）を 行った。

引張り強度試験とは別に、各試験から得られた皮膚サンプルにつき、フォルマ リン固定を行った後、ヘマトキシリン−エオシン（hematoxylin-eosin）で染色 し、顕微鏡で吻合部の肉芽形成を観察した。

２）結果 他の成長因子類とＭＣＡＦの効果の比較を図３に示した。断裂強度はＰＢＳの み投与においては２６７．５±５９．６グラム、ｂＦＧＦ投与においては３８５ ．４±１８９．９グラム、ＭＣＡＦにおいては６４５．０±１８８．８グラムで あった。ＭＣＡＦの結果は、ｐ＜０．０５でＰＢＳに比べて有意であった。また ＭＣＡＦは、ｂＦＧＦよりももっと有効であった。顕微鏡による観察ではどの例 においても病理学的な異常は認められなかった。

ＭＣＡＦの用量依存的効果を図４に示した。断裂強度は、ＰＢＳのみ投与にお いては、２７５．１±９０．５グラム、０．２μｇＭＣＡＦにおいては４７１． ０±１９３．３グラム、１．０μｇＭＣＡＦにおいては５０４．６±２３．７グ ラム、５．０μｇＭＣＡＦにおいては６４４．０±１２８．２グラムであった。

ＭＣＡＦの投与量の違いに基づく病理学的所見の差は認められなかった。産業上の利用可能性 上記のように、本発明の創傷治療剤は、創傷に対し優れた治療効果を発揮する 。従って、本発明の創傷治療剤は、医療分野において、創傷の治療に大いに貢献 するものと期待される。

───────────────────────────────────────────────────── （注）この公表は、国際事務局（ＷＩＰＯ）により国際公開された公報を基に作 成したものである。 なおこの公表に係る日本語特許出願（日本語実用新案登録出願）の国際公開の 効果は、特許法第１８４条の１０第１項（実用新案法第４８条の１３第２項）に より生ずるものであり、本掲載とは関係ありません。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．単球走化性因子若しくは単球走化性を有するその変異体又はそれらの誘導体 を有効成分とする創傷治療剤。
2. ２．単球走化性活性化因子を有効成分とする請求項１記載の創傷治療剤。
3. ３．創傷が皮膚潰瘍である請求項１又は２に記載の創傷治療剤。
4. ４．皮膚潰瘍が外傷性潰瘍、循環障害性潰瘍又は基礎疾患性である請求項３記載 の創傷治療剤。
5. ５．外傷性潰瘍が外傷又は手術によるものである請求項４記載の創傷治療剤。
6. ６．単球走化性因子若しくは単球走化性を有するその変異体又はそれらの誘導体 を医薬的に許容できる担体中に含む創傷治療組成物。
7. ７．単球走化性活性化因子を有効成分とする請求項６記載の組成物。