KR100352425B1

KR100352425B1 - 테트라하이드로이소퀴놀린계 화합물을 함유하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR100352425B1
Application number: KR1019990041208A
Authority: KR
Inventors: 윤혜숙; 장기철; 이덕형; 류재천
Original assignee: 한국과학기술연구원; 윤혜숙; 장기철; 이덕형
Priority date: 1998-10-21
Filing date: 1999-09-22
Publication date: 2002-09-11
Anticipated expiration: 2019-09-22
Also published as: DE69911633T2; KR20000028711A; CN100488508C; EP1124554A1; DE69911633D1; JP2002527479A; EP1124554B1; WO2000023078A1; AU6370299A; JP3963301B2; CN1331593A; US6562837B1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 테트라하이드로이소퀴놀린 (tetrahydroisoquinoline)계 화합물의 새로운 용도에 관한 것으로서, 이들 화합물들은 강심 작용, 혈압 강하 작용 외에도 혈소판 응집 억제 작용 및 iNOS (유도 NO 합성효소) 억제 작용을 나타내므로 이들을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 심부전증 치료제, 항혈전제, iNOS에 의한 조직 손상 억제제, 패혈증 치료제 또는 파종성 혈관내 응고증의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

테트라하이드로이소퀴놀린계 화합물을 함유하는 약학적 조성물{Pharmaceutical compositions containing tetrahydroisoquinoline compounds}

본 발명은 하기 화학식 1 및 화학식 2로 표시되는 테트라하이드로이소퀴놀린 (tetrahydroisoquinoline)계 화합물의 새로운 용도에 관한 것으로서, 구체적으로 이들 화합물들은 강심 작용, 혈압 강하 작용 외에도 혈소판 응집 억제 작용 및 iNOS (유도 NO 합성효소) 억제 작용을 나타내므로 화학식 1의 화합물인 1-α-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 및 화학식 2의 화합물인 1-β-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 심부전증 치료제, 항혈전제, iNOS에 의한 조직 손상 억제제, 패혈증 치료제 또는 파종성 혈관내 응고증 (Disseminated intravascular coagulation; 이하 'DIC'라 약칭함) 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

화학식 1

화학식 2

테트라하이드로이소퀴놀린 (tetrahydroisoquinoline; 이하 'THI'라 약칭함)계 화합물들은 N-알킬페닐에틸아민이 폐환 (ring closing)된 상태의 물질로서, 특히 6,7-디하이드록시테트라하이드로이소퀴놀린들은 화학 구조에 카테콜아민 (catecholamine)의 기본골격을 가지고 있다. 즉 에피네프린 (epinephrine), 노르에피네프린 (norepinephrine), 도파민 (dopamine) 등으로 대표되는 카테콜아민의 기본골격인 3,4-디하이드록시페닐에틸아민을 구조상에 가진다. 따라서 많은 THI 계열 화합물들이 각종 아드레날린 수용체 (adrenergic receptor)에 친화력을 보이며, 치환기의 종류 및 치환기의 결합 위치에 따라 α- 또는 β-수용체들에 작용하여 항진 효과 (agonistic effect) 또는 길항 효과 (antagonistic effect)를 가짐으로써 여러 가지 약리 작용을 가진다는 것이 보고되고 있다.

특히 1 위치의 탄소에 OH, OCH₃, 할로겐 등으로 치환된 벤질기를 가진 THI 계열 화합물들은 기관지 이완 작용, 혈소판 응집 억제 작용, 칼슘 통로 억제 작용 등 강력한 작용들을 가지고 있다는 사실이 보고되어 있다 (King, V. F. et al., J. Biol. Chem., 263, 2238-2244, 1988; Triggle, D. J. et al., Med. Res. Rev., 9, 123-180, 1989; Lacorix, P. et al., Eur. J. Pharmacol., 192, 317-327, 1991; Chang, K. C. et al., Life. Sci., 51, 64-74, 1992; Chang, K. C. et al., Eur. J. Pharmacol., 238, 51-60, 1993).

또한 최근 비스벤질-테트라하이드로이소퀴놀린계열 화합물인 테트란드린 (tetrandrine), 이소테트란드린 (isotetrandrine) 및 콘도큐린 (chondocurine) 등의 물질들이, 내독소 (endotoxin)인 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide; 이하 'LPS' 라 약칭함)에 의해 일산화질소 (nitrogen monoxide; NO)가 다량 생성되는 것을 강력하게 억제하는 것이 보고된 바 있다 (Kondo, Y. et al., Biochem. Pharmacol., 46, 1861-1863, 1993).

한편 하이게나민 (Higenamine)은 1번 탄소에 4-하이드록시벤질기를, 6 및 7 위치에 2개의 하이드록시기를 가진 THI 계열 화합물로서, 임상에서 강심 작용 약물로 사용되고 있는 도부타민 (dobutamine)과 구조적으로 매우 유사하다. 이 화합물은 적출 심장에서 심근수축력 및 심박동수 증가 작용, 혈소판 응집 억제 작용 등의 생체외 (in vitro) 작용, 랫트 또는 토끼를 이용한 실험에서 심박출량 증가, 혈압강하 작용 및 혈소판 응집 억제 작용 등이 보고된 바 있다. 하이게나민은 또한 마우스 복강 대식세포 및 랫트 적출 혈관에서 LPS에 의해 유도 NO 합성효소 (inducible NO synthase; 이하 'iNOS'라 약칭함)가 발현되고 이에 의해 NO가 다량 생성되는 것을 저하시켰으며 LPS에 의한 혈관 반응성 저하를 억제하고 내독소 쇼크 (endotoxin shock)에 의한 사망율을 낮춘다는 것이 보고된 바 있다. 또한 관절염 모델에서 항염증 작용 및 진통 작용을 가진다는 사실도 관찰되었다 (Park, C. W. et al., Arch. Int. Pharmacodyn., 267, 279-288, 1984; Chang, K. C. et al., Can. J. Physiol. Pharmacol., 72, 327-334, 1994; Yun-Choi, H. S. et al., Yakhak Hoeju, 38, 191-196, 1994; Kang, Y. J. et al., Kor. J. Physio. Phamacol. 1, 297-302, 1997; Shin, K. H. et al., Natural Products Sciences, 2, 24-28, 1996). 그러나 하이게나민의 경우 그 작용 지속 시간이 매우 짧고, 상기에서 언급한 작용들이 나타내는 효과도 미흡하다는 단점이 있다.

본 발명자들은 하이게나민의 구조를 변화시켜 우수한 약리 효과를 나타내는 물질을 얻고자 노력한 결과, 작용 지속 시간이 매우 긴 신규 물질인 화학식 1 및 화학식 2의 화합물을 합성하고, 이들이 강심 작용 및 혈압 강하 작용을 갖는 것을 밝혀내고 특허출원하여 특허권을 획득한 바 있다 (대한민국 특허 제148755호). 또한 하이게나민과 유사하게 랫트 적출 심장을 이용한 실험에서 화학식 1 및 화학식 2의 화합물이 강력한 심근수축력 증강 작용 및 심박동수 증가 작용을 나타내고, 페닐에프린 (phenylephrine)으로 수축시킨 적출 혈관에 대하여 강력한 이완 작용을가지며, 또한 화학식 1 및 화학식 2의 화합물을 토끼에 투여하였을 때 심박동수가 증가하고 혈압이 하강하는 것을 보고한 바 있다 (Lee, Y. H. et al., Life Sciences, 55, PL415-420, 1994, Chong W. S. et al. Kor. J. Physiol. Pharmacol. 2, 323-330, 1998, Chang K. C. et al., Kor. J. Physiol. Pharmacol. 2, 461-469, 1998).

현재 울혈성 심부전증 치료제로서는 디기탈리스 강심 배당체와 도파민류가 있는데, 디기탈리스 강심 배당체는 경구 투여가 가능한 이점이 있으나 안전역이 매우 좁아 사용에 위험성이 따르며 부정맥을 야기시키는 문제점이 있다. 또한 도파민이나 도부타민 등과 같은 교감신경 모방 약물들은 울혈성 심부전증 치료제로서의 효과는 있으나 정맥주사해야 하는 단점이 있으며 교감신경계의 다운 레규레이션 (down regulation) 등의 문제점이 있다.

심부전증 환자에게는 저하된 심근수축력을 증가시킬 수 있는 강심 작용 약물과 함께, 혈관을 이완시켜 심장의 과부하를 덜어주거나 혈전 생성을 억제하여 혈관에서의 혈액의 흐름을 원활하게 함으로써 심장의 과부하를 덜어주는 약물을 동시에 투여함으로써 좋은 치료효과를 얻고 있다. 따라서 디기탈리스 강심 배당체와 도파민류 약물들은 강심 작용만을 가지기 때문에 투여시 혈관을 이완시킬 수 있는 혈관 이완제 (혈압 강하제) 및 혈소판 응집 억제제를 별도로 함께 투여하여 치료효과를 증대시킬 수 있다. 그러나 여러 약물의 복합적인 투여로 인하여 각 약물들에 의한 약물 상호작용에 따라 각 약물의 생체내 흡수, 약물대사 등이 영향을 받아 부작용이 발생할 위험성이 높아지는 등 사용에 많은 제약이 따른다는 문제점이 있다.

한편 최근 NO를 포함하여, 과도하게 많이 생성된 산소 유리기 (oxygen free radical)가 관절염 등의 염증성 질환이나, 심근경색증, 뇌졸증 또는 허혈성 질환에 있어서 재관류시의 조직 손상 또는 세균 감염에 따른 내독소에 의한 복합적 장기 손상 등 각종 급만성 조직/장기 손상을 일으키는 중요 원인의 하나인 것으로 밝혀지고 있다. 따라서 iNOS의 발현을 억제하거나 NO의 다량 생성을 억제하는 물질들을 확보하여, NO가 다량 생성되어 발생하는 각종 질병의 치료제로서 이용하고자 하는데 많은 관심이 집중되고 있다. 또한 이들 물질들은 급성 심근경색증, 허혈성 심장 질환 등에 의한 심근 손상을 억제함으로써 심부전증의 진행을 억제하거나 또는 치료하는 효과를 가질 것으로 기대된다.

이에 본 발명자들은 상기한 여러 가지 문제점을 해결하기 위하여 노력하여 오던 중, 화학식 1 및 화학식 2의 화합물들이 강심 작용, 혈관 이완 작용 (혈압 강하 작용), 혈소판 응집 억제 작용 및 iNOS 억제 작용을 복합적으로 동시에 나타냄으로써 심부전증 치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 혈소판 응집 억제 작용에 의해 항혈전제, iNOS 발현 억제 작용 및 iNOS 발현에 따른 NO의 다량 생성 억제 작용에 의해 조직 손상 억제제, 패혈증 치료제 또는 파종성 혈관내 응고증 치료제로도 사용될 수 있음을 알아냄으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 심부전증 치료제, 항혈전제, iNOS에 의한 조직 손상 억제제, 패혈증 치료제 또는 파종성 혈관내 응고증 치료제로 유용하게 사용될 수 있는 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

도 1은 랫트의 적출 혈관에서 리포폴리사카라이드 (LPS)에 의한 유도 NO 합성효소 (iNOS) mRNA의 발현을 화학식 1의 화합물이 억제하는 것을 나타낸 노던 블랏 (Northern blotting) 결과이고,

레인 1 : 대조군

레인 2 : LPS (300 ng/㎖)

레인 3 : LPS (300 ng/㎖) + 화학식 1의 화합물 (10μM)

레인 4 : LPS (300 ng/㎖) + 화학식 1의 화합물 (30μM)

레인 5 : LPS (300 ng/㎖) + 화학식 1의 화합물 (100μM)

도 2는 대식세포 (RAW 264.7 cell)에서 LPS와 인터페론-Υ (IFN-Υ)에 의한 iNOS mRNA의 발현을 화학식 2의 화합물이 억제하는 것을 나타낸 노던 블랏 결과이고,

레인 1 : 대조군

레인 2 : LPS (100 ng/㎖) + IFN-γ (10 U/㎖)

레인 3 : LPS (100 ng/㎖) + IFN-γ (10 U/㎖) + 화학식 2의 화합물 (1μM)

레인 4 : LPS (100 ng/㎖) + IFN-γ (10 U/㎖) + 화학식 2의 화합물 (10μM)

레인 5 : LPS (100 ng/㎖) + IFN-γ (10 U/㎖) + 화학식 2의 화합물(100μM)

도 3은 하이게나민, 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 경구 투여한 후 LPS (20 mg/㎏)를 3시간에 걸쳐 랫트에 투여했을 때, 혈중 혈소판 수의 변화를 나타낸 것이고,

도 4는 하이게나민, 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 경구 투여한 후 LPS (20 mg/㎏)를 3시간에 걸쳐 랫트에 투여했을 때, 프로트롬빈 시간 (PT)의 변화를 나타낸 것이고,

도 5는 하이게나민, 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 경구 투여한 후 LPS (20 mg/㎏)를 3시간에 걸쳐 랫트에 투여했을 때, 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPPT)의 변화를 나타낸 것이고,

도 6은 하이게나민, 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 경구 투여한 후 LPS (20 mg/㎏)를 3시간에 걸쳐 랫트에 투여했을 때, 혈중 피브리노겐 농도의 변화를 나타낸 것이고,

도 7은 하이게나민, 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 경구 투여한 후 LPS (20 mg/㎏)를 3시간에 걸쳐 랫트에 투여했을 때, 혈중 피브린/피브리노겐 분해산물 (FDP) 농도의 변화를 나타낸 것이고,

도 8은 하이게나민, 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 경구 투여한 후 LPS (20 mg/㎏)를 3시간에 걸쳐 랫트에 투여했을 때, S-GOT의 변화를 나타낸 것이고,

도 9는 하이게나민, 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 경구 투여한 후 LPS (20 mg/㎏)를 3시간에 걸쳐 랫트에 투여했을 때, S-GPT의 변화를 나타낸 것이고,

도 10은 하이게나민, 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 경구 투여한 후 LPS (20 mg/㎏)를 3시간에 걸쳐 랫트에 투여했을 때, BUN 농도의 변화를 나타낸 것이고,

도 11a는 하이게나민이 LPS에 의한 마우스의 사망율을 저하시키는 정도를 나타낸 것이고,

--○-- : LPS (20 mg/kg)

--△-- : LPS (20 mg/kg) + 하이게나민 (10 mg/kg)

--□-- : LPS (20 mg/kg) + 하이게나민 (20 mg/kg)

도 11b는 화학식 1의 화합물이 LPS에 의한 마우스의 사망율을 저하시키는 정도를 나타낸 것이고,

--○-- : LPS (20 mg/kg)

--△-- : LPS (20 mg/kg) + 화학식 1의 화합물 (10 mg/kg)

--□-- : LPS (20 mg/kg) + 화학식 1의 화합물 (20 mg/kg)

도 11c는 화학식 2의 화합물이 LPS에 의한 마우스의 사망율을 저하시키는 정도를 나타낸 것이다.

--○-- : LPS (20 mg/kg)

--△-- : LPS (20 mg/kg) + 화학식 2의 화합물 (10 mg/kg)

--□-- : LPS (20 mg/kg) + 화학식 2의 화합물 (20 mg/kg)

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 강심 작용, 혈압 강하 작용, 혈소판 응집 억제 작용 및 iNOS 억제 작용을 복합적으로 동시에 나타내는 하기 화학식 1의 화합물인 1-α-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 및 하기 화학식 2의 1-β-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.

화학식 1

화학식 2

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 THI계 화합물인 상기 화학식 1로 표시되는 1-α-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 및 화학식 2로 표시되는 1-β-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린의 새로운 용도를 제공한다.

이 때 화학식 1 및 화학식 2의 화합물에는 이들의 토토머 이성체가 포함되며, 본 발명에 해당하는 화합물에는 최소한 하나의 비대칭 중심을 갖고 있으므로 이에 의한 에난티오머도 포함된다. 또한 두 개 이상의 비대칭 중심을 갖고 있다면, 다이아스테레오 이성체가 존재할 수 있다. 이러한 모든 이성체와 그들의 혼합체는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 또한 본 발명에는 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 이들의 프로드러그 (prodrug)가 포함된다.

여기에서 화학식 1 또는 화학식 2의 염은 약제학적으로 사용되는 통상의 염을 의미하며, 염의 제조에 사용되는 각종 산으로는 염산, 브롬산, 황산, 메탄술폰산, 프로피온산, 숙신산, 글루타르산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 타르타르산, 글루탐산, 글루콘산, 글루쿠론산, 갈락투론산, 아스코르브산, 카본산, 인산, 질산, 아세트산, L-아스파르트산, 락트산, 바닐릭산 및 하이드로 아이오딕산 등이 있다.

전술한 바와 같이 본 발명에서는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물의 프로드러그를 포함하는데, 일반적으로 이러한 프로드러그란 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물의 작용성 유도체들로서, 생체에 들어가서 약효를 나타내기 위하여 쉽게 변화될 수 있어야 한다. 적당한 프로드러그 유도체들의 선택 및 제법에 대한 통상적 과정은 기존의 문헌에 기술되어 있다 (Design of Prodrug, ed. H. Bundgaard, 1985).

화학식 1의 화합물인 1-α-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 및 화학식 2의 화합물인 1-β-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린은 강심 작용, 혈압 강하 작용, 혈소판 응집 억제 작용 및 iNOS 억제 작용을 복합적으로 동시에 나타냄으로써 이들 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 심부전증 예방 또는 치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

심부전증을 치료하기 위하여 현재 임상에서는, 저하된 심근수축력을 향상시키고 심장에 부담을 덜어주기 위하여 강심배당체인 디기탈리스 제제, 혈관확장제, 칼슘 길항제, 안지오텐신 전환 효소 (angiotensin converting enzyme; ACE) 억제제 등을 단독 또는 병용 요법으로 사용하고 있는데, 혈관 확장으로 순환기능을 향상시키고 강심 작용을 나타낼 목적으로 이들 약물을 병용투여하여 소위 혈역학적 (hemodynamic) 호전을 기대하기 때문이다. 한편, 본 발명의 화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 강심 작용과 혈관 이완 작용을 동시에 나타낼 수 있는 강심-이완제 (inodilator)라는 점에서 두가지 요건을 모두 충족하고 있다.

또한 심부전증은 동맥경화증, 고혈압 등의 순환기계 질환이 장기간 지속되어 심장에 부담을 가중시킬 때 또는 혈전에 의한 관상동맥 질환이나 심근경색증 등의 허혈성 심장질환 등에 의하여 증상이 심화되는데, 이러한 심장병 위험인자가 높은 사람들은 각종 심장, 순환기계 질환의 진행 방지, 재발 방지 또는 예방을 목적으로 혈소판 응집 억제제의 지속적인 투여가 적극 권장되고 있다. 따라서 본 발명의 화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 혈소판 응집을 억제함으로써 항혈전작용을 가져 심부전증 치료제로서의 또 한가지의 요건을 충족한다. 또한 만성 심부전증 환자들은 면역활성이 증가되어 있고 장, 혈관 등에 iNOS의 발현이 증가되며 이 때 NO가 다량 생성되어 심근의 수축력을 억제시키고 조직에도 손상을 입히게 되는데, 본 발명의 화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 iNOS의 발현을 억제하여 NO 생성을 억제하는 작용도 갖고 있어서 산소 유리기에 의한 조직 손상을 억제하며, 만성 심부전증 환자의 심근수축력 저하의 원인물질 중 하나인 NO의 발생을 줄일 수 있는 장점도 있다. 즉 본 발명의 화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 상기 다양한 작용을 동시에 복합적으로 나타내는바 획기적인 심부전증 치료제로 사용될 수 있다.

상기에서 심부전증 치료제는 급성 심근경색에 의한 심근 수축 기능 저하, 만성염증 등의 면역활성 증가에 의한 심근 수축 기능 저하, 허혈성 심장질환에 의한심근 수축 기능 저하 또는 지속적인 고혈압, 동맥경화, 관상동맥질환 등으로 인한 울혈성 심부전에 의한 심근 수축 기능 저하를 원인으로 하는 심부전증의 진행을 억제하거나 치료하는 것이다.

또한 본 발명의 화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 혈소판 응집 억제 작용에 의한 항혈전 작용 및 iNOS 억제 작용을 나타내므로 이들 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 항혈전제, 조직 손상 억제제, 패혈증 치료제 또는 파종성 혈관내 응고증 등의 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

상기에서 항혈전제는 혈전에 의해 유도되는 허혈성 뇌혈관장애, 관상동맥질환, 허혈성 심근경색, 만성 동맥폐색증, 수술 후의 혈전 또는 색전에 있어서의 혈전의 생성을 예방하거나 그 진행을 억제하거나 치료하는 것이다.

또한 iNOS에 의한 조직 손상 억제제는 조직 또는 장기 손상에 의한 관절염 등의 염증성 질환, 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸증을 포함하는 허혈 및 재관류에 의한 조직 손상을 예방하거나 그 진행을 억제하거나 치료하는 것이다.

또한 패혈증 치료제는 파종성 혈관내 응고 및 복합적 장기 손상으로 인한 패혈증을 치료하는 것이다.

또한 파종성 혈관내 응고증 치료제는 급격한 혈액응고 과정의 활성화로 인한 혈소판 수의 급격한 감소, 출혈, 쇼크, 혈전, 혈관폐색으로 인하여 일어나는 증상을 치료하는 것이다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구, 정맥, 비경구 또는 직장 투여가 가능하고, 주사제, 캡슐, 정제, 당의정, 좌약, 과립, 용액, 현탁액, 유제, 좌제 등의 투여 형태가 가능하다.

약학적 조성물은 본 발명의 화합물을 유효성분으로 하여 유기나 무기, 고체, 반고체 또는 액체 부형제와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 사용할 수 있고, 필요하다면 보조물질, 안정제, 습윤 또는 유화제, 완충액, 그밖에 통상적으로 쓰이는 부가제들이 이들 약학적 조성물에 포함될 수 있다.

본 발명에서는 실험을 통하여 본 발명의 화합물은 경구로 투여하였을 경우에도 상당 시간 동안 혈중 농도가 유지됨을 밝혔으며, 이에 따라 본 발명의 화합물의 투여용량은 주사제의 경우는 0.01∼5 mg/kg, 경구 투여제의 경우는 2∼200 mg/kg 이다.

본 발명의 화합물을 마우스에 경구 투여시 및 복강내 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50 % 치사량 (LD₅₀)은 적어도 1000 mg/kg 이상인 것으로 나타났다. 또한 복강내 독성시험 결과 화학식 1의 1-α-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린의 경우 LD₅₀값은 290.0 mg/kg, 95% 신뢰한계는 235.1∼359.9 mg/kg 이었으며, 화학식 2의 1-β-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린의 경우 LD₅₀값은 438.6 mg/kg, 95% 신뢰한계는 350.9∼548.2 mg/kg 이었다.

본 발명에서는 화학식 1의 1-α-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 및 화학식 2의 1-β-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린이 전술한 바와 같은 다양한 작용을 복합적으로 나타낸다는 점을 확인하고, 유사한 작용을 하리라고 예상되는 하이게나민과 그 효과를 비교하기 위하여 다양한 실험을 수행하였다. 그 결과, 상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물이 혈소판 응집 억제 작용을 가지며, 특히 아데노신 디포스페이트 (adenosine diphosphate; 이하 'ADP'라 약칭함)나 콜라겐 (collagen)에 의한 혈소판 응집 억제 작용보다는 에피네프린에 의한 혈소판 응집을 강하게 억제하였다. 또한 아드레날린 α-수용체에 친화력을 가지며, 따라서 이들 물질은 α-수용체 억제 작용을 통해 혈관을 이완시키며 혈소판 응집을 억제하는 것으로 생각된다.

또한 화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 내독소에 의한 iNOS의 발현을 억제하고 NO의 생성을 억제하며, 특히 농도 의존적인 억제 효과를 나타낸다. 따라서 과량의 NO 생성에 의한 장기손상을 억제함으로써 관절염을 포함한 각종 염증성 질환, 뇌졸증, 심근경색증 등을 포함하는 각종 허혈성 질환 및 재관류에 의한 조직 손상 등의 예방, 진행억제 및 치료제로서 또는 이 밖의 급격한 복합 조직 손상을 증상으로 하는 패혈증 또는 파종성 혈관내 응고증 등의 질병의 치료에 본 발명의 화합물들을 응용할 수 있다.

화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 생체내 (in vivo) 실험에서도 급성 혈전 생성에 의한 마우스의 사망율을 현저하게 낮추며, 동맥-정맥 션트 (arterio-venous shunt; 이하 'A-V 션트'라 약칭함)용 튜브 (AVS 튜브) 내에 생성되는 혈전의 생성을 억제하는 등 우수한 항혈전 작용을 나타내었다.

한편 LPS 등의 내독소에 의해서는 여러 가지 파종성 혈관내 응고증이 유발된다. 이들 파종성 혈관내 응고증 (DIC)에 대한 지표로서는 혈중 혈소판수의 감소, 피브리노겐 (fibrinogen)의 농도 감소 및 피브린/피브리노겐 분해산물 (fibrin/fibrinogen degradation products; FDP)의 농도 증가, 프로트롬빈 시간 (prothrombin time; PT) 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 (activated partial thromboplastin time; aPTT)의 연장 등을 들 수 있다. 본 발명의 화합물들은 LPS에 의해 혈중 혈소판수와 피브리노겐의 농도가 감소하는 것을 억제하고 피브린/피브리노겐 분해산물의 농도가 증가하는 것을 억제하며, 프로트롬빈 시간 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간이 연장되는 것을 억제하여 그 시간을 단축시키는 등 LPS에 의하여 유도되는 파종성 혈관내 응고증의 각종 지표를 개선하였다. 한편, 내독소에 의해 S-GOT (serum glutamic-oxaloacetic transaminase), S-GPT (serum glutamic-pyruvic transaminase) 및 BUN (blood urea nitrogen)이 증가하는 것으로 알려져 있는데, 본 발명의 화합물들은 LPS에 의해 S-GOT, S-GPT 및 BUN가 증가하는 것을 저하시키는 등, LPS에 의하여 유도되는 다발성 조직 손상 (multiple organ failure; MOF) 증상의 각종 지표들도 개선하였다. 더불어 본 발명의 화합물들은 LPS에 의한 사망율도 현저하게 낮추기 때문에 내독소에 의한 쇼크로부터 보호하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

이하 본 발명을 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실험예는 본발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> 혈소판 응집을 억제하는 효과

서울대학교 병원 혈액은행에서 구입한 사람 혈소판 농축액을 혈소판 측정기 (Platelet Analyzer, PLT-4, Texas Instruments)를 사용하여 혈소판 수를 측정하고, 인산완충식염수 (phosphate buffered saline; 이하 'PBS'라 약칭함)로 희석하여 혈소판의 수를 300∼400×10⁶/㎖로 조정하여 혈소판 풍부혈장 (Platelet Rich Plasma; 이하 'PRP'라 약칭함)을 제조하고 이를 실험에 사용하였다. PRP를 37℃에서 3분간 배양한 후 혈소판 응집유도 물질로서 아데노신 디포스페이트 (ADP), 콜라겐 또는 에피네프린을 가한 다음, 혈소판 응집 측정기 (Platelet Aggregometer, Chrono-Log Corp. 미국, 500VS)를 사용하여 혈소판 응집에 따른 혼탁도 (turbidity)의 변화로서 응집도를 측정하였다.

시험물질에 의한 응집 억제 정도는 하기 수학식 1에 의해 억제율을 산출하여 계산하였다.

A : 응집 유도 물질에 의한 혈소판 응집도

B : 응집 유도 물질과 시료를 동시에 가하였을 때의 혈소판 응집도

사람 혈소판을 사용하여 측정한 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물의 응집억제 효과를표 1에 나타내었다. 한편, 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물과 화학 구조가 유사하며 항혈소판 응집 및 항혈전 작용을 가진다고 알려진 하이게나민을 비교물질로 하였다.

화학식 1과 화학식 2의 화합물 및 하이게나민의 혈소판 응집 억제 작용

	IC₅₀(M)
	ADP	콜라겐	에피네프린
하이게나민	1 × 10^-3	7.0 × 10^-5	1.9 × 10^-5
화학식 1의 화합물	7.3 × 10^-4	9.2 × 10^-5	3.4 × 10^-6
화학식 2의 화합물	8.6 × 10^-4	9.6 × 10^-6	6.0 × 10^-6
ADP ; 1× 10^-5M, 콜라겐 ; 2∼4 × 10^-6g/㎖, 에피네프린 : 2 × 10^-6M

그 결과, 하이게나민은 1×10^-3M의 높은 농도에서도 ADP에 의한 혈소판 응집에 대하여 억제 작용이 없는 반면 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물은 IC₅₀이 7.3×10^-4∼8.6×10^-4M 로서 약하지만 억제 작용을 보였다. 콜라겐에 의한 혈소판 응집에 대해서는 화학식 1의 화합물은 IC₅₀이 9.2×10^-5M로서 하이게나민과 비슷한 정도의 억제 작용을 보였으며, 화학식 2의 화합물은 하이게나민 또는 화학식 1의 화합물에 비하여 약 10배의 혈소판 응집 억제 작용을 나타내었다. 에피네프린에 의한 혈소판 응집에 대해서는 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물의 IC₅₀값이 각각 3.4×10^-6M 및 6.0×10^-6M로서, 하이게나민 (IC₅₀19×10^-6M)보다 강력하게 에피네프린에 의한 혈소판 응집을 억제하였다. 이와 같이, 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물은 ADP 또는 에피네프린에 의하여 유도되는 혈소판 응집에 대하여 하이게나민보다 강력한 억제 작용을 보였으며, 콜라겐에 의한 혈소판 응집에 대해서도 하이게나민과 유사하거나 더 강력한 억제 작용을 보였다.

<실험예 2> α-수용체 결합 억제 작용

시험물질들이 아드레날린 α-수용체 (α-adrenoceptor)에 경쟁적으로 결합함으로써 상기와 같은 혈소판 응집 억제 작용을 갖거나 이미 보고된 바와 같이 혈관 이완 작용을 갖는지를 검토하기 위하여, α-수용체가 풍부한 랫트의 대뇌 피질막 (cerebral cortical membrane)을 준비하여 α-수용체 결합 억제 작용을 조사하였다.

우선 랫트 (Sprague-Dawley; 250±20 g, 특별한 언급이 없는 한 이하 모든 실험에서 갈은 종류의 랫트를 사용함) 뇌조직 (cerebral cortex)을 20배의 완충용액 (50 mM Tris, 5 mM MgSO₄, 1 mM EDTA, 1 mM 아스코르빈 산 (ascorbic acid), pH 7.7)과 균일하게 혼합한 후 35,000 ×g에서 15분간 3회 원심분리하여 침전물을 얻고 -70℃에서 보관하였다. 상기 침전물 5 mg을 상기 완충용액 1 ㎖에 녹이고, [³H]프라조신 ([³H]prazosin; 200pM)과 실험시료를 25℃에서 30분간 배양한 후 10 ㎖의완충용액 (50 mM Tris, pH 7.7)을 가하여 반응을 중단시켰으며, 이것을 와트만 (Whatman) GF/C 유리 미세섬유 (glass microfiber) 여과지를 사용하여 여과하였다. 여과지는 신틸레이션 반응용액 (scintillation cocktail)에서 2시간 동안 흔들어 준 후 신틸레이션 카운터 (Scintillation Counter, Beckman, LS6500)로 방사능 (radioactivity)을 측정하였다.

α-수용체에 대한 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물 및 하이게나민의 랫트 뇌에서의 해리상수 (Ki) 및 랫트 대동맥에서의 IC₅₀값 비교

화합물	Ki (M)	IC₅₀(M)
하이게나민	1.26 × 10^-6	1.02 × 10^-6
화학식 1의 화합물	0.27 × 10^-6	2.75 × 10^-6
화학식 2의 화합물	0.15 × 10^-6	2.81 × 10^-6

프라조신의 결합반응을 시행하여 133.5±8.91 pM의 Kd값과 15.15±0.64 fmol/mg의 Bmax을 얻었다. 시험물질들의 해리상수 (Ki)는 0.15∼1.26 μM를 나타내어 α-수용체에 대하여 친화력이 있음을 확인할 수 있었다 (표 2참조). 또한 이들 해리상수는 페닐에프린으로 수축된 랫트 혈관에서 나타난 IC₅₀값 (1.02∼2.81μM) 및 에피네프린에 의한 혈소판 응집 억제치 (IC₅₀; 3.4∼19μM)와 유사하므로, 본 발명의 화합물이 α-수용체를 차단하여 혈관을 이완시키고 혈소판 응집을 억제한다는 것을 알 수 있었다.

<실험예 3> 랫트 적출 혈관에서 LPS에 의한 iNOS mRNA 발현을 억제하는 효과

펜토바르비탈 소듐 (Pentobarbital sodium) 50 ㎎/㎏으로 랫트를 마취시키고 대동맥을 적출하여 내피세포를 제거하였다. 이를 37℃에서 LPS 300 ng/㎖가 함유된 크렙스 (Krebs) 용액에서 8시간 동안 배양시킨 후, 전체 RNA를 트리졸 (TRIZOL) 용액 (GibcoBRL; Life Technologies사)을 이용하여 추출하였다. 전체 RNA는 자외선 분광광도계 (Shimadzu, UV-1201)로 정량하고 포름아마이드-포름알데하이드 아가로스 겔 (formamide-formaldehyde agarose gel)에서 전기영동한 후 나일론 막 (nylon membrane)으로 옮겼다. 이후 iNOS (유도 NO 합성효소)의 cDNA를 탐침 (probe)으로 하여 혼성화 (hybridization)함으로써 iNOS의 mRNA가 발현되는 양을 관찰하였다. 이 때, iNOS의 cDNA는 랜덤-프라이머 (random-primer) 방법에 의해³²P-dCTP로 표지 (label)하여 사용하였고, 나일론 막을 X선 필름에 감광시켜 감광의 크기를 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)가 발현된 것과 비교하여 mRNA가 발현된 양을 정량화하였다.

혈관을 생체외 (in vitro)에서 LPS와 함께 배양하면 iNOS mRNA 발현이 다량으로 유도되는데, 화학식 1의 화합물을 넣어 함께 배양한 경우 iNOS mRNA의 발현이 억제되었다. 즉, LPS (300 ng/ml) 투여군에서는 iNOS mRNA가 강하게 발현되었으나 화학식 1의 화합물 10 μM 또는 30 μM과 함께 배양했을 때는 용량 의존적으로 LPS에 의한 iNOS mRNA 발현이 억제되었다 (도 1참조).

<실험예 4> 대식세포에서 LPS와 IFN-Υ에 의한 iNOS mRNA의 발현을 억제하는 효과

열처리한 10% 소 태아 혈청 (fetal calf serum), 100 U/ml 페니실린 (penicillin) 및 100 mg/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin)을 넣은 DMEM 배지에서,대식세포 (RAW 264.7 cell)를 충분히 자라도록 (confluent) CO₂인큐베이터에서 배양하였다. 배양된 세포는 혈청이 없는 (serum-free) DMEM 배지로 옮겨 24시간 더 배양한 후, LPS 100 ng/ml, 인터페론-Υ (interferon-Υ; 이하 'IFN-Υ'라 약칭함) 10 U/ml 및 화학식 2의 화합물 (0 μM , 1 μM , 10 μM 및 100 μM) 존재 하에서 18시간 동안 배양하고 전체 RNA를 트리졸 용액을 이용하여 추출하였다. 전체 RNA는 분광광도계로 정량하고 포름아마이드-포름알데하이드 아가로스 겔에서 전기영동한 후 나일론 막으로 옮겼다. 이후 iNOS의 cDNA를 탐침으로 하여 혼성화함으로써 NO 합성효소의 mRNA가 발현되는 양을 관찰하였다. 이 때, iNOS의 cDNA는 랜덤-프라이머 방법에 의해³²P-dCTP로 표지하여 사용하였고, 나일론 막을 X선 필름에 감광시켜 감광의 크기를 GADPH가 발현된 것과 비교하여 mRNA가 발현된 양을 정량화하였다.

대식세포를 LPS (100 ng/ml) 및 IFN-γ (10 U/ml)와 함께 18시간 배양했을 때 iNOS mRNA가 발현된 것이 확인되었다. 이때 화학식 2의 화합물이 iNOS mRNA의 발현을 농도 의존적으로 억제하는지 알아보기 위하여, 화학식 2의 화합물을 각각 1μM, 10 μM, 100 μM씩 LPS 및 IFN-γ와 동시에 처리하였다. 그 결과 화학식 2의 화합물은 농도 의존적으로 iNOS mRNA의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었다 (도 2참조).

<실험예 5> 대식세포에서 LPS와 IFN-γ에 의한 NO의 생성을 억제하는 효과

열처리한 10% 소 태아 혈청, 100U/ml 페니실린 및 100mg/ml 스트렙토마이신이 들어있는 DMEM 배지에, 대식세포 (RAW 264.7 cell)을 넣고 CO₂인큐베이터에서 충분히 자라도록 배양하였다. 배양된 세포는 혈청이 없는 DMEM 배지에서 24 시간 동안 더 배양한 후, LPS 100 ng/ml, IFN-γ 10 U/ml 및 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 (0 μM, 1 μM , 10 μM 및 100 μM) 존재 하에서 18시간 동안 계속 배양하였다. 이 때 생성된 NO는 NO 산화물인 아질산염 (nitrite)의 양으로 간접 측정하였으며, 아질산염은 그리이스 시약 (Griess reagent) [0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 1% sulphanilamide, 5% 인산 용액]으로 정색시킨 후 550 nm에서의 흡광도를 분광광도계로 측정하여 그 양을 정량하였다. 아질산염의 양은 NaNO₂를 표준으로 하여 계산하였으며, 그 결과를표 3에 나타내었다.

화학식 1 및 화학식 2의 화합물이 대식세포에서 LPS 및 IFN-γ에 의한 NO 생성을 억제하는 효과

	아질산염의 농도 (μM)
	화학식 1	화학식 2
대조군	8 ± 0.1	8 ± 1.1
LPS + IFN-γ	57 ± 3.3	57 ± 4.2
화합물 1μM + LPS + IFN-γ	30 ± 2.9	34 ± 3.1
화합물 10μM + LPS + IFN-γ	25 ± 3.4	22 ± 2.8
화합물 100μM + LPS + IFN-γ	9 ± 3.0	11 ± 2.0

표 3에 나타낸 바와 같이, 대식세포를 내독소와 함께 배양했을 때 다량의 아질산염이 검출되어 NO가 대량 생산되었음을 알 수 있었다. 즉, 내독소 및 IFN-γ를 가하지 않은 대조군의 경우 8 μM 의 아질산염이 검출되었으나 LPS와 IFN-γ를 가한 배양액에서는 57 μM의 아질산염이 검출되었다. LPS, IFN-γ와 함께 화학식 1 및 화학식 2의 화합물을 각각 1 μM 씩 배양액에 가한 경우 배양액에서 아질산염의 농도는 각각 30 μM, 34 μM로서, LPS와 IFN-γ만을 가한 경우보다 아질산염의 농도가 감소하였다. 또한 화학식 1 및 화학식 2의 화합물의 첨가량이 증가할수록 아질산염의 농도가 낮게 검출되어, 본 발명에 의한 화학식 1 및 화학식 2의 화합물이 내독소에 의한 NO 생성을 농도 의존적으로 강력하게 억제함을 알 수 있었다.

<실험예 6> 급성 혈전생성에 의한 마우스 사망을 억제하는 효과

마우스 (ICR; 20±20 g, 이하 모든 실험에서 같은 종류의 마우스를 사용함)의 꼬리 정맥에 콜라겐 (300 ㎍/kg)과 에피네프린 (30 ㎍/kg)의 혼합 용액을 주사하여 짧은 시간 안에 폐동맥에 대량의 혈전이 형성되도록 유도함으로써, 혼합 용액 주사 후 1∼3분이 경과하면 전신마비가 일어나고 대다수가 15분 이내에 사망하는 급성 혈전 모델을 유도하였다. 시료 물질은 1일간 또는 3일간 경구 투여하였으며, 마지막으로 경구 투여하고 1시간 지난 후에 콜라겐과 에피네프린의 혼합 용액을 주사하였다. 이 후 사망율이 감소하는 정도, 마비된 상태에서 회복되는 정도를 관찰하였으며, 그 결과를표 4및표 5에 나타내었다.

화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물 또는 하이게나민을 마우스에 1회 경구 투여한 경우, 혈전 생성으로 인한 마비 상태로부터의 회복율

화합물	투여량(mg/kg)	실험에 사용된 마우스 총수	15분 이내에 혈전 마비 로부터 회복된 마우스
화합물	투여량(mg/kg)	실험에 사용된 마우스 총수	수	%
대조군	-	60	13	17
아스피린	50	53	32	52
하이게나민	50	30	11	37
하이게나민	100	27	13	48
화학식 1의 화합물	50	17	8	47
화학식 1의 화합물	100	20	9	45
화학식 2의 화합물	50	28	14	50
화학식 2의 화합물	100	24	12	50

화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물 또는 하이게나민을 마우스에 3일 동안 연속으로 경구 투여한 경우, 혈전 생성으로 인한 마비 상태로부터의 회복율

화합물	투여량(mg/kg)	실험에 사용된 마우스 총수	15분 이내에 혈전 마비 로부터 회복된 마우스
화합물	투여량(mg/kg)	실험에 사용된 마우스 총수	수	%
대조군	-	20	4	20
아스피린	50	20	11	55
하이게나민	10	12	2	17
하이게나민	50	11	5	45
화학식 1의 화합물	10	10	3	30
화학식 1의 화합물	50	12	5	42
화학식 2의 화합물	10	10	7	70
화학식 2의 화합물	50	11	7	64

마우스에 콜라겐과 에피네프린 혼합용액을 정맥주사하면 단시간에 폐동맥 내에 다량의 혈전이 생성되어 폐색됨으로써, 주사 후 1분 이내에 대부분이 전신 마비되어 움직이지 못하게 되고 동공이 커지며 호흡곤란과 경련이 뒤따르고, 5분 이내에 약 70∼80%의 마우스가 사망하고 나머지도 15분 이내에 대부분 사망하거나 15분 이상 마비가 지속된다.표 4와표 5에서 보는 바와 같이, 시험물질을 투여하지 않고 콜라겐과 에피네프린 혼합용액만을 투여한 대조군의 마우스는 15분 이내에 17∼20% 만이 마비로부터 회복되어 자유롭게 움직였다. 양성 대조약물로 사용한 아스피린이나 하이게나민의 경우 50 mg/kg을 1회 경구 투여했을 때는 각각 52%, 37%의 회복율을 보였으며 하이게나민을 100 mg/kg 투여했을 때는 48%의 회복율을 보였다. 본 발명의 화합물인 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 50 mg/kg 또는 100 mg/kg 씩 1회 투여하였을 경우에는 약 50%의 회복율을 보여 아스피린의 경우와 유사하였다. 또한 화학식 1의 화합물은 50 mg/kg씩 3일간 연속 투여해도 회복율은 별로 상승하지 않았으나, 화학식 2의 화합물은 10 mg/kg 또는 50 mg/kg씩 3일간 연속 투여하였을 때는 회복율이 64∼70%로 증가하였다.

<실험예 7> 랫트 동맥-정맥 션트(arterio-venous shunt; A-V shunt) 내의 혈전 형성을 저해하는 효과

A-V 션트용 튜브 (AVS 튜브)를 다음과 같이 준비하였다. 두피 정맥 세트 (Scalp vein set)의 한쪽 끝을 잘라 18 cm 길이가 되도록 만든 후, 양쪽 끝에 18G 주사바늘을 연결시켰다. 그리고 튜브 중앙에는 100% 면실 5 cm를 고정시켰다. 랫트는 케타민 (ketamine; 250 mg/kg)을 주사 (i.m.)하여 마취시키고 복부를 절개한 후, 상기에서 준비한 AVS 튜브에 생리식염수를 채우고 한쪽 바늘은 복부 대동맥에 다른 한쪽은 신정맥에 삽입하고 혈액이 흐르도록 하여 면실에 혈전이 생성되도록하였다. 15분이 지난 후 튜브에서 실을 꺼내 그 무게를 달아 생성된 혈전의 양을 무게의 변화로 측정하였고, 시험물질의 경구 투여에 의한 혈전 형성 저해 효과를 관찰하여 그 결과를표 6및표 7에 나타내었다.

화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물 또는 하이게나민을 랫트에 1회 경구 투여한 경우 A-V 션트 내의 혈전형성을 저해하는 효과

화합물	투여량(mg/kg)	실험에 사용한 랫트의 총수	무게(mg)	억제 %
대조군	-	4	33.61 ± 7.620
아스피린	50	6	19.89 ± 7.213^*	40.8
하이게나민	25	8	22.98 ± 11.271	31.6
화학식 1의 화합물	25	8	20.27 ± 5.366^**	39.7
화학식 2의 화합물	25	8	22.68 ± 10.127	32.5

대조군	-	9	39.54 ± 5.625
아스피린	50	7	25.18 ± 6.725^***	36.3
하이게나민	50	8	29.61 ± 5.059^**	25.1
화학식 1의 화합물	50	8	29.72 ± 5.975^**	24.8
화학식 2의 화합물	50	6	28.58 ± 4.234^***	27.7
; p<0.05,* ; p<0.01, ***; p<0.001

화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물 또는 하이게나민을 랫트에 3일 동안 연속으로 경구 투여한 경우 A-V 션트 내의 혈전형성을 저해하는 효과

화합물	투여량(mg/kg)	실험에 사용한 랫트의 총수	무게(mg)	억제 %
대조군	-	8	42.67 ± 5.381
아스피린	50	9	37.37 ± 7.369	12.4
하이게나민	10	12	36.76 ± 7.964	13.9
하이게나민	50	12	34.68 ± 8.513^*	18.7
화학식 1의 화합물	10	11	31.78 ± 8.385**	25.5
화학식 1의 화합물	50	11	30.72 ± 6.334^***	28.0
화학식 2의 화합물	10	11	32.24 ± 4.836^***	24.4
화학식 2의 화합물	50	9	30.18 ± 6.571^***	29.3
* ; p<0.05, ; p<0.01, *; p<0.001

생성된 혈전의 무게는 실험 당일의 기후 (기압, 습도 등)에 따라 상당한 차이를 보여, 항혈전 작용 약물인 아스피린 50 ㎎/㎏을 투여한 아스피린 투여군과 비교실험을 행하였다. 시험물질을 투여하지 않은 대조군의 경우 33∼42 mg의 혈전이 생성되었다. 양성 대조약물인 아스피린을 50 mg/kg 1회 투여했을 때는 36∼40%의 혈전 형성 억제를 보였으며, 하이게나민을 25 mg/kg 또는 50 mg/kg 1회 투여했을 때는 25∼31%의 혈전 억제 효과가 있었다. 반면, 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물은 25 mg/kg 또는 50 mg/kg씩 1회 투여한 경우 24∼39%의 혈전 억제 효과를 보였으며, 이로부터 본 발명의 화합물이 하이게나민과 유사하거나 더 강한 혈전 형성 저해 효과가 있음을 알 수 있었다.

시험물질을 3일 동안 연속 투여한 경우에 있어서, 아스피린을 50 mg/kg씩 3회 투여한 실험군에서는 혈전 억제 효과가 12%로서 약했다. 실험 당일의 기후 조건에 따라 대조군 A-V 션트 내에 평균보다 많은 양의 혈전이 생성되었을 경우 시료 약물에 의한 혈전형성 억제효과는 상대적으로 낮았으며 따라서 동일 실험기간에서의 양성 대조군 (본 실험의 경우 아스피린 투여군)과의 상대적 비교가 필수적이었다.

하이게나민을 10 mg 또는 50 mg씩 3일간 연속 투여하였을 때는 13∼18%의 혈전 억제 작용을 보여 아스피린 투여군과 유사하였다. 그러나 화학식 1의 화합물 및 화학식 2의 화합물을 10 mg/kg씩 3일간 투여한 경우에는 약 24%, 50 mg/kg씩 투여한 경우에는 약 28%의 혈전 형성 억제 작용을 보여, 아스피린 또는 하이게나민 투여군과 비교해 볼 때 혈전 형성 억제 작용이 향상되었음을 알 수 있었다.

<실험예 8> 세균성 내독소 (Bacterial endotoxin; LPS)에 의한 DIC 및 MOF 유발 랫트에서 각종 지표를 개선하는 효과

케타민 (Ketamin) (250 mg/kg)을 주사 (i.m.)하여 랫트 (250±50 g)를 마취시키고 30분 후부터 LPS (20 mg/kg)를 꼬리정맥에 3시간 동안에 걸쳐 주입 (infusion)하였다. 그 후 대동맥으로부터 혈액을 채취하여 하기와 같이 혈소판수, 프로트롬빈 시간, aPPT 시간, 피브리노겐, 피브린/피브리노겐 분해산물, S-GOT, S-GPT 및 BUN의 농도를 측정하였다. 시험물질들은 2 일간 경구 투여하였으며 두 번째 투여하고 나서 1시간 지난 후에 실험을 시작하였다.

우선 항응고제로는 시트르산 나트륨 (sodium citrate)를 사용하였으며, 혈소판 측정기를 이용하여 혈액의 혈소판 수를 측정하였다. 한편, 항응고 혈액을 1,500 ×g에서 10분간 원심분리 한 후 혈장을 얻어 하기 실험에 사용하였다.

프로트롬빈 시간은, 상기에서 얻은 혈장 100 ul를 37℃에서 3분간 배양한 후, 여기에 37℃에서 미리 5분간 배양한 트롬보플라스틴 시약 (Thromboplastin reagent, Sigma사, 미국) 50 ul를 넣고 피브로미터 (Fibrometer, Becton Dickinson Co., 캐나다)를 이용하여 혈전 형성 시간 (clotting time)을 측정하여 구하였다. 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간은, 상기 혈장 100 ul를 37℃에서 3분간 배양한 후, 여기에 37℃에서 1분간 미리 배양한 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간 시약 (Activated Partial Thromboplastin Time Reagent, Sigma사, 미국) 100 ul와 37℃에서 미리 가온한 0.02 M CaCl₂100ul를 첨가하여 피브로미터를 이용하여 혈전 형성 시간을 측정하여 구하였다.

피브리노겐의 농도는, 상기 혈장 20 ul에 완충용액 (buffer) 180 ul를 넣고 2분간 37℃에서 배양한 후 여기에 트롬빈 시약 (thrombin reagent, Sigma사, 미국) 100 ul를 첨가하여 혈전 형성 시간을 측정하고, 피브리노겐 기준시약 (fibrinogen reference)를 사용하여 미리 그려 놓은 보정 곡선 (calibration curve)을 이용하여 구하였다.

또한 피브린/피브리노겐 분해산물의 농도는 트롬보-웰코테스트 키트 (Murex Biotech Limit, 영국)을 사용하여 하기와 같은 방법에 의해 구하였다. 우선 혈액 (non-citrated)을 콩 트립신 차단제 (soybean trypsin inhibitor)와 사독 (Bothrops Atrox venom)과 잘 섞어 응고시킨 후 1,500 ×g에서 10분간 2회 원심분리하여 혈청을 얻었으며, 글리신 염수 완충 용액 (Glycine saline buffer)으로 희석하여 실험하였다. 이렇게 얻은 희석 혈청 50 ul를 슬라이드 글래스 (slide glass)에 가한 후 라텍스 현탁액 (latex suspension)을 한방울 첨가하여 잘 섞어 고루 펴주었으며, 2분간 쉐이커 (shaker)에서 흔들어 준 다음 응집 여부를 관찰하였다. FDP의 농도는 반정량적 (semiquantitative)으로 결정하였다. 즉, 1:0 희석시에는 (-) 0 ㎍/㎖, (+) 1 ㎍/㎖, (++) 2 ㎍/㎖; 1:1 희석시에는 (+) 3 ㎍/㎖, (++) 4 ㎍/㎖; 1:2 희석시에는 (+) 5 ㎍/㎖, (++) 6 ㎍/㎖ 등으로 판정하였다.

S-GOT, S-GPT 및 BUN의 농도는 의료법인 녹십자 의료재단 (Green CrossReference Lab.)에 의뢰하여 진단 키트 (diagnostic kits, Boehringer Mannheim사)들과 자동 생화학 분석기 (Automatic Biochemical Analyzer, Hitachi 747)를 이용하여 측정하였다. S-GOT 측정에는 AST 키트, S-GPT 측정에는 ALT 키트, BUN측정에는 요소 키트를 각각 사용하였다.

LPS를 장기간에 걸쳐 주입하여 실험동물에서 패혈성 쇼크 (septic shock)를 야기시켰을 때 나타난 DIC 및 MOF 증상의 각종 지표들은 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물의 경구 투여에 의하여 개선되었다. 즉, LPS만을 투여한 대조군의 경우 혈액 내의 혈소판 수와 피브리노겐 농도가 급격히 감소하였고, 프로트롬빈 시간과 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간이 연장되었으며, 혈액 내 피브린/피브리노겐 분해산물의 농도가 급격히 증가하였다. 또한 간이나 신장 기능이 저하됨으로서 S-GOT, S-GPT, BUN 등의 수치가 높아졌다. 이와 같은 DIC 및 MOF 증상의 각종 지표들이 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 경구 투여하였을 때 개선되는 것을 확인할 수 있었다.

구체적으로 하이게나민, 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 경구 투여한 후 LPS 20 mg/kg을 랫트에 3시간에 걸쳐 투여하여 DIC 및 MOF 상태를 유도했을 때, LPS만을 투여한 대조군에 비하여 DIC 및 MOF 증상의 지표가 개선되는지를 관찰하였다.

LPS만을 투여한 대조군에서는 혈소판 수가 296 × 10³/ul로서 정상군의 747× 10³/ul보다 반 이하로 현격히 감소하였으며 (도 3참조), 프로트롬빈 시간 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간은 각각 19초 및 33초로서 정상군의 14초 및 20초보다 약 50% 증가하였다 (도 4및도 5참조). 한편, 대조군에서 피브리노겐은 104 mg/ml, 피브린/피브리노겐 분해산물은 168 ug/ml인 반면 정상군에서는 각각 202 mg/ml와 1 ug/ml로 나타나, 피브리노겐의 경우 대조군에서는 정상군에 비하여 약 반으로 감소한 반면 피브린/피브리노겐 분해산물은 급격한 증가를 보여 DIC 증상이 상당히 진전되었음을 시사하였다 (도 6및도 7참조). 또한 S-GOT, S-GPT 및 BUN의 농도가 각각 231.0 U/ℓ, 60.8 U/ℓ 및 25.6 ㎎/㎗로서 정상군의 167 U/ℓ, 49.3 U/ℓ 및 15.0 ㎎/㎗에 비하여 증가하였으므로, MOF 증상 또한 진전되었음을 알 수 있었다.

그러나 하이게나민, 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물을 각각 10 mg/㎏ 또는 50 mg/kg을 경구 투여한 후 LPS를 주입하였을 때, LPS만을 투여한 대조군에 비하여 혈소판 수가 증가하였고 프로트롬빈 시간 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간이 짧아졌으며, 피브리노겐의 농도가 증가하고 피브린/피브리노겐 분해산물의 농도가 감소하였다 (도 3∼도 7참조). 따라서 이들 물질들이 DIC 증상을 개선하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 또한, LPS만을 투여한 대조군에 비하여 S-GOT, S-GPT 및 BUN 의 농도도 감소하여 (도 8∼도 10참조), 이로부터 본 발명의 화합물들이 LPS에 의한 간 또는 신장의 손상 등의 MOF 증상 또한 경감시킬 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 9> 세균성 내독소(Bacterial endotoxin; LPS)에 의한 사망을 억제하는 효과

다량의 LPS를 동물에 주사하면 파종성 혈관내 응고증의 각종 증상이 표출되며 대부분 짧은 시간 안에 패혈성 쇼크에 의해 사망하게 된다. 본 실험에서는 LPS 20 mg/kg을 마우스 복강내에 주사하고 48시간 동안 생존한 마우스의 마리수를 세었으며 시험물질 투여에 의하여 생존율이 증가하는가를 관찰하였다.

마우스에 LPS 20 mg/kg를 복강내 (i.p.)에 주사하고, 이후 48시간 동안 매 6시간마다 생존한 마우스의 수를 세었다. 또한, 시험물질들은 LPS를 주사하기 30분 전에 복강내 주사하여 이들 시험물질들에 의한 마우스의 사망 억제 효과를 관찰하였다.

LPS만을 투여한 경우 48시간 후의 생존율은 약 20%였으나, LPS를 투여하기 전에 하이게나민 (도 11a참조), 화학식 1의 화합물 (도 11b참조) 또는 화학식 2의 화합물 (도 11c참조)을 각각 20 mg/kg 씩 투여한 경우 30시간까지는 사망한 마우스가 없었으며 48시간이 지난 후에도 90% 이상의 마우스가 생존하였다. 하이게나민과 화학식 2의 화합물은 10 mg/kg 투여한 경우 48시간 후의 생존율이 80% 이상이었다. 화학식 1의 화합물은 10 mg/kg 투여한 경우 48시간 후의 생존율이 약 60%로서 하이게나민이나 화학식 2의 화합물보다는 생존율이 낮았으나 대조군보다는 생존율이 높았다. 따라서 화학식 1의 화합물 또는 화학식 2의 화합물은 LPS에 의한쇼크를 보호하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 화학식 1 및 화학식 2의 화합물은 본 발명자들에 의해 이미 밝혀진 강심 작용 및 혈압 강하 작용과 더불어 혈소판 응집 억제 작용 및 iNOS 억제 작용을 동시에 복합적으로 나타내므로 심부전증 치료제로서 유용히 사용될 수 있다. 또한 이들 화합물은 혈소판 응집 억제 작용 (항혈전작용)에 의해 항혈전제로 사용될 수 있고, iNOS 발현 억제 작용 및 이에 의한 NO 생성 억제 작용에 의해 조직 손상 억제제, 패혈증 치료제 또는 파종성 혈관내 응고증 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다. 더욱이 본 발명의 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 안전영역이 넓으며 작용지속시간이 길다는 장점도 갖는다.

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하기 화학식 1로 표시되는 1-α-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 및 화학식 2로 표시되는 1-β-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항혈전용 약학적 조성물.

화학식 1

화학식 2
제 3 항에 있어서, 항혈전용 약학적 조성물은 혈전에 의해 유도되는 허혈성 뇌혈관장애, 관상동맥질환, 허혈성 심근경색, 만성 동맥폐색증, 수술 후의 혈전 또는 색전에 있어서의 혈전의 생성을 예방하거나 그 진행을 억제하거나 치료하는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 3 항의 화학식 1로 표시되는 1-α-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 및 화학식 2로 표시되는 1-β-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 iNOS에 의한 조직 손상 억제용 약학적 조성물.
제 5 항에 있어서, iNOS에 의한 조직 손상 억제는 조직 또는 장기손상에 의한 관절염 등의 염증성 질환, 동맥경화증, 심근경색, 뇌졸증을 포함하는 허혈 및 재관류에 의한 조직 손상을 예방하거나 그 진행을 억제하거나 치료하는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 3 항의 화학식 1로 표시되는 1-α-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 및 화학식 2로 표시되는 1-β-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 패혈증 치료용 약학적 조성물.
제 7 항에 있어서, 패혈증 치료는 파종성 혈관내 응고 및 복합적 장기손상으로 인한 패혈증을 치료하는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 3 항의 화학식 1로 표시되는 1-α-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 및 화학식 2로 표시되는 1-β-나프틸메틸-6,7-디하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린 중 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 파종성 혈관내 응고증 치료용 약학적 조성물.
제 9 항에 있어서, 파종성 혈관내 응고증 치료는 급격한 혈액응고 과정의 활성화로 인한 혈소판 수의 급격한 감소, 출혈, 쇼크, 혈전, 혈관폐색으로 인하여 일어나는 증상을 치료하는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.