KR20120006072A - 종양에서 특이적으로 발현되는 유전 산물 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양과 관련하여 발현되는 유전자 산물의 동정 및 상기 산물의 코딩 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 유전자 산물이 종양과 관련하여 비정상적으로 발현되는 질병의 치료 및 진단, 종양과 관련하여 발현되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 및 상기 폴리펩타이드, 펩타이드 및 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다.

Description

종양에서 특이적으로 발현되는 유전 산물 및 그의 용도{GENETIC PRODUCTS DIFFERENTIALLY EXPRESSED IN TUMORS AND THE USE THEREOF}
본 발명은 종양에서 특이적으로 발현되는 유전 산물 및 그의 용도에 관한 것이다.
다분야에 걸칠 접근 및 모든 통상적인 치료 방법의 사용에도 불구하고, 암은 여전히 주된 사망 원인 중 하나이다. 보다 최근의 치료 개념은 재조합 종양 백신 및 항체 요법 등의 다른 특이적 방법을 사용하여 환자의 면역계를 전체적인 치료 개념에 포함시키는 것을 목적으로 한다. 이와 같은 치료 계획의 성공을 위한 필요 조건은 그 효과기 작용이 간섭적으로 증진되어 있는 환자의 면역계가 종양 특이적 또는 종양 관련 항원 또는 에피토프를 인지하는 것이다. 종양 세포는 그들이 유래하는 비악성 세포와 본질적 및 생물학적 차이점을 갖는다. 이러한 차이점은 종양 발생 동안 발생한 유전자 변형에 의한 것이며, 특히, 암세포에서 질적 또는 양적으로 변형된 분자 구조물의 형성을 유발한다. 종양 내재 숙주의 특이적 면역계에 의하여 인지되는 이러한 종류의 종양 관련 구조물들을 종양 관련 항원이라 부른다. 종양 관련 항원의 특이적 인지는 두 개의 기능적 상호 연결 단위인 세포성 기전 및 체액성 기전을 수반한다: CD4+ T 림프구 및 CD8+ T 림프구는 각각 MHC (major histocompatibility complex, 주 조직 적합 복합체) 클래스 II 및 I 분자 상에 제시되는 가공된 항원을 인지하는 한편, B 림프구는 기가공된 항원에 직접 결합하는 혈중 항체 (circulating antibody) 분자를 생산한다. 종양 관련 항원의 잠재적인 임상-치료적 중요성은 T 헬퍼 세포의 존재시 면역계에 의한 종양 세포 상의 항원 인지가 세포 독성 효과기 기전이 개시되도록 하여, 암세포를 제거할 수 있도록 한다는 사실에서 유래한다 (Pardoll, Nat . Med . 4: 525-31, 1998). 따라서, 종양 면역학의 주요 목적은 이러한 구조물을 분자적으로 밝히는 것이다. 이들 항원의 분자적 본질은 오랫 동안 알려지지 않았었다. 적절한 클로닝 기술이 개발되고 나서야, 세포 독성 T 림프구 (CTL) (van der Bruggen et al ., Science 254: 1643-7, 1991)의 표적 구조물을 본석하거나 또는 프로브로서 혈중 자가 항체 (Sahin et al ., Curr. Opin . Immunol . 9: 709-16, 1997) 를 사용하여, 종양의 cDNA 발현 라이브러리를 종양 관련 항원에 대하여 체계적으로 스크리닝하는 것이 가능해졌다. 이를 위하여, 새로 발생한 종양 조직으로부터 cDNA 발현 라이브러리를 제조하고, 적합한 시스템에서 단백질로서 재조합적으로 발현시켰다. 환자로부터 분리된 면역 효과기, 즉, 종양 특인적 용해 패턴을 갖는 CTL 클론, 또는 혈중 자가 항체를 각각의 항원을 클로닝하는데 사용하였다.
최근 수 년간, 이러한 접근에 의하여 항원 다중성이 다양한 종양에서 밝혀졌다. 그러나, 전술한 통상적인 방법에서 항원 동정을 위하여 사용되는 프로브들은 일반적으로 이미 암이 진행된 환자로부터 얻은 면역 효과기 (혈중 자가 항체 또는 CTL 클론)이다. 많은 데이터가 종양이 예컨대 T 세포를 내성화(tolerization) 및 무기력화(anergization)시킬 수 있고, 특히, 질병의 진행 동안에, 효과적인 면역 인지를 하도록 할 수 있는 특이성이 면역 효과기 레퍼토리로부터 상실된다는 것을 보여준다. 현재 환자 연구는 아직 이전에 발견되고 사용되는 종양 관련 항원의 실제 작용에 대한 어떠한 확실한 증거도 얻어내지 못하고 있다. 따라서, 자발적 면역 반응을 일으키는 단백질이 잘못된 표적 구조물이라는 것을 배제할 수 없었다.
본 발명의 목적은 암의 진단 및 치료를 위한 표적 구조물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 이러한 목적은 청구의 범위의 주요 내용에 의하여 달성할 수 있다.
본 발명에 따르면, 종양 또는 이를 코딩하는 핵산과 관련하여 발현되는 항원을 동정하고 제공하기 위한 전략이 제공된다. 이러한 전략은, 기관 특이적 방법으로 발현하는, 예컨대, 결장, 폐 또는 신장에서만 배타적으로 발현하는, 특정 유전자는 상기 각 기관의 종양 세포 및 더 나아가 이소적 (etopic) 및 금단적 방법 (forbidden manner)으로 다른 조직의 종양 세포에서도 재활성화된다는 사실에 기초한 것이다. 우선, 데이터 마이닝 (data mining)에 의하여 모든 공지된 기관 특이적 유전자에 대한 가능한 한 완벽한 리스트를 얻은 후, 특이적 RT-PCR을 사용한 발현 분석에 의하여 상이한 종양에서의 상기 유전자들의 이상 활성화를 평가한다. 데이터 마이닝은 잘 알려진 종양 관련 유전자 동정 방법이다. 그러나, 종래의 방법에 있어서, 일반적으로 정상 조직 라이브러리의 전사체(transcriptoms)를 종양 조직 라이브러리로부터 전자적 방법으로 제외시키고, 잔존하는 유전자를 종양 특이적 유전자라고 가정하였다 (Schmitt et al., Nucleic Acids Res. 27: 4251-60, 1999; Vasmatzis et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA. 95: 300-4. 1998; Scheurle et al., Cancer Res . 60: 4037-43, 2000). 그러나, 본 발명의 개념은, 보다 더 성공적인 것으로 입증된 것으로, 모든 기관 특이적 유전자를 전자적 방법으로 추출한 후 상기 유전자의 종양에서의 발현을 평가하기 위하여 데이터 마이닝 방법을 사용하는 것을 기초로 한다.
따라서, 한 가지 측면에서, 본 발명은 종양에서 특이적으로 발현하는 종양 특이적 유전자를 동정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 공개된 서열 라이브러리 ("in silico")의 데이터 마이닝과 후속하는 실험실 시험 ("wet bench") 연구의 평가를 조합한 것이다.
본 발명에 따르면, 두 개의 상이한 바이오인포매틱 스크립트에 기초하는 조합된 방법에 의하여 새로운 종양 유전자를 동정할 수 있게 된다. 이들은 이미 순수하게 기관 특이적인 것으로 분류되어 있는 것들이다. 이러한 유전자가 종양 세포에서 비정상적으로 (aberrantly) 활성화된다는 발견은 상기 유전자에 기능적 관련을 갖는 실질적으로 새로운 특질을 할당한다. 본 발명에 따르면, 독립적으로 면역 작용하는 이들 종양 관련 유전자 및 이들에 의하여 코딩되는 유전 산물이 동정 및 제공된다.
본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원은 (a) 서열 번호 1 내지 8, 41 내지 44, 51 내지 59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 유도체, (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산, (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 축퇴된(degenerate) 핵산 및 (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)와 상보적인 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 갖는다. 한 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원은 서열 번호 1 내지 8, 41 내지 44, 51 내지 59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 아미노산 서열을 갖는다. 더욱 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원은 서열 번호 9 내지 19, 45 내지 48, 60 내지 66, 85, 90 내지 97, 100 내지 102, 105, 106, 111 내지 116, 118, 120, 123, 124 및 135 내지 137로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열, 그의 일부분 또는 유도체를 포함한다.
본 발명은 일반적으로 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그의 일부분 또는 유도체, 이들을 코딩하는 핵산 또는 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원에 반대하여 유도된 핵산, 그의 일부분 또는 유도체의 치료 및 진단을 위한 용도에 관련된 것이다. 이러한 이용은 상기 항원, 기능적 단편, 핵산, 항체 등을 각각 또는 사용하는 것 뿐 아니라, 이들 중 두 가지 이상을 조합하여 사용하는 것과 관련된 것일 수 있으며, 한 구체예에 있어서, 진단, 치료 및 진행 조절을 위한 다른 종양 관련 유전자 및 항원과 조합하여 사용할 수도 있다.
치료 및/또는 진단 대상 질병은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 중 한 가지 이상이 선택적으로 발현되거나 비정상적으로 발현되는 질병인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 종양 세포와 관련하여 발현되는 핵산 및 유전 산물과 관련된 것이다.
또한, 본 발명은 유전 산물, 즉, 공지된 유전자의 변형된 스플라이싱 (스플라이스 변이체) 또는 교대 개방 리딩 프레임을 사용하여 변형된 번역에 의하여 생산되는 핵산 및 단백질 또는 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 측면에서, 본 발명은 서열 목록의 서열 번호 3 내지 5에 따른 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산에 관한 것이다. 또한, 이러한 측면에서, 본 발명은 서열 목록의 서열 번호 10 및 12 내지 14에 따른 서열로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 펩타이드에 관한 것이다. 본 발명의 스플라이스 변이체는 종양 질병의 진단 및 치료를 위한 표적으로서 본 발명에 따라서 사용할 수 있다.
특히, 본 발명은 서열 목록의 서열 번호 10에 따른 아미노산 서열에 관한 것으로, 상기 아미노산 서열은 본 발명에 따라 동정된 교대 개방 리딩 프레임에 의하여 코딩되고 단백질의 N 말단에 85 아미노산이 추가로 포함되어 있다는 점에서 전술한 단백질 서열 (서열 번호 9)과 상이한 것이다.
예컨대, 다음과 같은 매우 다양한 기작에 의하여 스플라이스 변이체들을 생산할 수 있다:
- 다양한 전사 개시 부위의 사용,
- 추가적인 엑손의 사용,
- 하나 또는 둘 또는 그 이상의 엑손의 완전 또는 불완전한 스플라이싱,
- 돌연변이 (새로운 공여/수여 서열의 결실 또는 생성)을 통하여 변형된 스플라이스 조절 서열,
- 인트론 서열의 불완전한 제거.
유전자의 변형된 스플라이싱은 변형된 전사체 서열 (스플라이스 변이체)를 생성한다. 변형된 서열 부위에서의 스플라이싱 변이체의 번역은 변형된 단백질을 생성하고, 상기 변형된 단백질은 원래 단백질과 뚜렷하게 구별되는 구조 및 기능을 가질 것이다. 종양 관련 스플라이스 변이체는 종양 관련 전사체 및 종양 관련 단백질/항원을 생산할 수 있다. 이들은 종양 세포의 검출 및 종양의 치료적 표적화 양자를 위한 분자 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따라서, 예컨대, 스플라이스 변이체 특이적 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 PCR 증폭에 의하여 핵산을 추출한 후, 예컨대, 혈청, 골수, 가래(sputum), 기관지 세정(bronchial lavage), 체분비물 및 조직 생검에서의 종양 세포의 검출을 수행할 수 있다. 특히, 프라이머 쌍은 엄격한 조건 하에서 종양 관련인 스플라이스 변이체 부위에 결합하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드로서 적합하다. 본 발명에 따르면, 이러한 목적으로 실시예에 기재된 올리고뉴클레오타이드가 적합하며, 특히, 서열 목록의 서열 번호 34 내지 36, 39, 40 및 107 내지 110 중에서 선택된 서열을 갖거나 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 적합하다. 본 발명에 따르면, 모든 서열 의존성 검출 시스템이 검출에 적합하다. PCR과 별도로, 이들은, 예컨대, 유전자 칩/마이크로어레이 시스템, 노던 블러트, RNAse 보호 분석법 (RNAse protection assays, RDA) 등일 수 있다. 모든 검출 시스템은 검출이 하나 이상의 스플라이스 변이체 특이적 핵산 서열과의 특이적 혼성화에 기초한다는 점에서 공통적이다. 그러나, 종양 세포는 스플라이스 변이체에 의하여 코딩되는 특이적 에피토프를 인지하는 항체를 사용하여 본 발명에 따라서 검출할 수도 있다. 상기 항체는 상기 스플라이스 변이체에 특이적인 면역화 펩타이드를 사용하여 제작할 수 있다. 이러한 측면에서, 본 발명은, 특히, 서열 목록의 서열 번호 17 내지 19, 111 내지 115, 120 및 137로부터 선택되는 서열을 갖거나 포함하는 펩타이드 및 이들로 유도되는 특이적 항체와 관련된 것이다. 좋게는 건강한 세포에서 생산되고, 유전 산물의 변이체와 뚜렷한 차이점을 갖는 에피토프를 갖는 아미노산이 특히 면역화에 적합하다. 항체를 사용하는 종양 세포의 검출을 환자에서 분리한 시료 상에서 또는 정맥내 투여 항체의 조영으로서 수행할 수 있다. 진단에서의 유용성 이외에도, 새롭거나 변형된 에피토프를 갖는 스플라이스 변이체는 면역 치료를 위한 강력한 표적이다. 본 발명의 에피토프는 치료적으로 활성인 모노클로날 항체 또는 T 림프구를 표적화하기 위하여 사용할 수 있다. 수동 면역 치료에 있어서, 스플라이스 변이체 특이적 에피토프를 인지하는 항체 또는 T 림프구를 여기에 채택적으로 전달시킬 수 있다. 다른 항원의 경우, 항체를 또한 이들 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 사용하는 표준 기술 (동물의 면역화, 재조합 항체의 분리를 위한 패닝법)에 의하여 생산할 수도 있다. 대안적으로, 상기 에피토프를 함유하는 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 면역화 핵산을 사용하는 것이 가능하다. 에피토프 특이적 T 림프구의 생체외 또는 생체내 생성을 위한 다양한 기술이 알려져 있고, 상세하게 기재되어 있으며 (예컨대, Kessler JH et al. 2001 및 Sahin et al., 1997), 마찬가지로, 스플라이싱 변이체 특이적 에피토프를 함유하는 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 상기 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산을 사용하는 것에 기초한다. 스플라이스 특이적 에피토프를 함유하는 올리고펩타이드 또는 폴리펩타이드 또는 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산은 또한 활성 면역 치료 (백신화, 백신 치료)에 있어서 약학적 활성 물질로서 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 정상 조직 및 종양 조직에서의 성질 및 이차적 변형 정도에 있어서 상이한 단백질들을 기재한다 (예컨대, Durand & Seta, 2000; Clin. Chem. 46: 795-805; Hakomori, 1996; Cancer Res. 56: 5309-18).
웨스턴 블롯에 의하여 단백질 변형을 분석할 수 있다. 특히, 일반적으로 수 kDa 크기를 갖는 글라이코실화는 SDS-PAGE에서 분리할 수 있는 표적 단백질의 전체적인 질량의 증가를 유발한다. 특이적 O-글라이코사이드 결합 및 N-글라이코사이드 결합을 검출하기 위하여, 단백질 분해물을 SDS를 사용하여 변성시키기 전에 O-글라이코실라아제 또는 N-글라이코실라아제 (예컨대, H, Roche Diagnostics의 PNgase, 엔도글라이코시다아제 F, 엔도글라이코시다아제 등의 각각의 제조물의 사용 지시에 따라서)와 함께 인큐베이팅한다. 그리고 나서, 웨스턴 블롯을 수행한다. 표적 단백질의 크기가 감소하면, 글라이코시다아제와 함께 인큐베이팅한 후 이러한 방법으로 특이적 글라이코실화를 검출하고, 이에 의해서, 변형의 종양 특이성을 분석할 수 있다. 종양 세포 및 건강한 세포에서 차별적으로 글라이코실화되는 단백질 부위가 특히 중요하다. 그러나, 지금까지는 이러한 글리코실화의 차이가 소수의 세포 표면 단백질 (예컨대, Muc1)에 대하여서만 기재되어 있었다.
본 발명에 따르면, 종양에서의 Claudin-18에 대한 특이적 글리코실화를 검출하는 것이 가능하였다. 폐 종양 뿐 아니라 위장관 암종, 췌장 암종, 식도 종양, 전립선 종양은 낮은 수준으로 글라이코실화되는 형태의 Claudin-18을 갖는다. 건강한 조직에서의 글라이코실화는 글라이코실화 결핍에 의하여 종양 세포 표면을 덮지 아니하는 Claudin-18의 단백질 에피토프들을 은폐시킨다. 이에 상응하여, 본 발명에 있어서, 이들 도메인에 결합하는 리간드 및 항체를 선별하는 것이 가능하다. 본 발명에 따른 이러한 리간드 및 항체는 건강한 세포 상의 Claudin-18에는 결합하지 않는데, 여기서는 에피토프가 글라이코실화에 의하여 덮여있기 때문이다.
종양 관련 스플라이스 변이체로부터 유래하는 단백질 에피토프에 대하여 전술한 바와 같이, 진단 뿐 아니라 치료 목적으로, 특이적인 글라이코실화를 사용하여 정상 세포와 종양 세포를 구별하는 것이 가능하다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원을 인지하고, 바람직하게는 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현을 갖는 세포에 대하여 선택적인 제제를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 특정 구체예에 있어서, 상기 제제는 세포 사멸, 세포 증식 감소, 세포막 손상 또는 사이토카인의 분비를 유도할 수 있고, 바람직하게는 종양 억제 활성을 갖는다. 한 구체예에 있어서, 상기 제제는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 선택적으로 혼성화하는 안티센스 핵산이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 제제는 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 항체, 특히, 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 보체 활성화 항체 또는 독소 결합 항체이다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 제제는, 상이한 종양 관련 항원을 선택적으로 인지하는 각각의 제제를 두 가지 이상 함유하는 것으로, 상기 항원 중 한 가지 이상은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원이다. 인지는 항원의 활성 또는 발현의 억제를 직접적으로 동반할 것을 요구하지 않는다. 본 발명의 이러한 측면에 있어서, 종양으로 선택적으로 제한된 항원은 이러한 특이적 위치에 효과기 기전을 보강하기 위한 표지로서 역할을 하는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 제제는 HLA 분자 상의 항원을 인지하고 이러한 방법으로 표지된 세포를 용해시키는 세포 독성 T 림프구이다. 또 다른 구체예에 있어서, 제제는 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하여 상기 세포에 천연 또는 인공 효과기 기전을 보강하는 항체이다. 또 다른 구체예에 있어서, 제제는 상기 항원을 특이적으로 인지하는 다른 세포의 효과기 기능을 증진시키는 T 헬퍼 림프구이다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 활성 또는 발현을 억제하는 제제를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구체예에 있어서, 제제는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 선택적으로 혼성화하는 안티센스 핵산이다. 또 다른 구체예에 있어서, 제제는 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 항체이다. 또 다른 구체예에 있어서, 제제는 적어도 하나가 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원인 서로 다른 종양 관련 항원의 활성 또는 발현을 선택적으로 억제하는 각각의 제제를 두 가지 이상 함유하는 것이다.
또한, 본 발명은, 투여시, 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 유래의 펩타이드 에피토프와 HLA 분자 간의 복합체의 양을 선택적으로 증가시키는 제제를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 제제는 (i) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분, (ii) 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산, (iii) 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 발현하는 숙주 세포, 및 (iv) 상기 종양 관련 항원 유래의 펩타이드 에피토프 및 MHC 분자 간의 분리된 복합체로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 성분을 함유한다. 한 구체예에 있어서, 제제는 적어도 하나가 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원인 서로 다른 종양 관련 항원의 펩타이드 에피토프와 MHC 분자 간의 복합체의 양을 선택적으로 증가시키는 각각의 제제를 두 가지 이상 함유하는 것이다.
또한, 본 발명은 (i) 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그의 일부분, (ii) 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산, (iii) 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 항체, (iv) 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 특이적으로 혼성화하는 안티센스 핵산, (v) 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 발현하는 숙주 세포, 및 (vi) 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과 HLA 분자 간의 분리된 복합체로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 성분을 함유하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산은 발현 벡터 내에서 프로모터에 기능적으로 연결되어 약학 조성물에 존재할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 존재하는 숙주 세포는 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 분비하거나, 이를 표면 상에서 발현시키거나, 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 HLA 분자를 추가로 발현시키는 것일 수 있다. 한 구체예에 있어서, 숙주 세포는 HLA 분자를 내인적으로 (endogeneously) 발현시킨다. 또 다른 구체예에 있어서, 숙주 세포는 HLA 분자 및/또는 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 재조합적 방법으로 발현시킨다. 숙주 세포는 비증식적인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 숙주 세포는 항원 제시 세포, 특히, 수지상 세포, 단핵 세포 또는 대식 세포이다.
본 발명의 약학 조성물에 존재하는 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 항체는 키메라 또는 인간화 항체, 천연 항체 또는 합성 항체의 단편일 수 있으며, 이들 모두는 복합적인 기술에 의하여 생산할 수 있는 것이다. 항체는 치료적 또는 진단적으로 유용한 제제와 결합된 것일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 존재하는 안티센스 핵산은, 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 인접한 뉴클레오타이드인, 6 내지 50 서열, 특히 10 내지 30, 15 내지 30 및 20 내지 30 서열을 포함하는 것일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 직접적으로 또는 핵산 발현을 통하여 본 발명의 약학 조성물에 의하여 제공되는 종양 관련 항원 또는 그의 일부분은 세포 표면의 MHC 분자에 결합하고, 상기 결합은 세포 독성 반응을 유발하거나 및/또는 사이토카인 방출을 유도하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 적합한 담체 및/또는 면역 보강제를 함유할 수 있다. 면역 보강제는 사포닌, GM-CSF, CpG 뉴클레오타이드, RNA, 사이토카인 또는 케모카인 중에서 선택된 것일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 종양 관련 항원의 선택적 발현 또는 비정상적 발현에 의하여 특징지워지는 질병의 치료를 위하여 사용되는 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 질병은 암이다.
또한, 본 발명은 한 가지 이상의 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현에 의하여 특징지워지는 질병의 치료 또는 진단 방법에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 치료는 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
한 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현의 특징을 갖는 질병의 진단 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 환자로부터 분리한 생물학적 시료에서의 (i) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산의 검출, 및/또는 (ii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분의 검출, 및/또는 (iii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 대하나의 항체의 검출 및/또는 (iv) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 특이적인 세포 독성 림프구 또는 T 헬퍼 림프구의 검출을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 검출은 (i) 생물학적 시료를 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산, 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분, 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 특이적인 항체 또는 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구에 특이적으로 결합하는 제제와 접촉시키고, (ii) 제제와 핵산 또는 그 일부분, 종양 관련 항원 또는 그 일부분, 항체 또는 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구와의 복합체 형성을 검출하는 것을 포함한다. 한 구체예에 있어서, 질병은 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현의 특징을 갖는 것이며, 검출은 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 또는 그 일부분을 코딩하는 두 가지 이상의 핵산의 검출, 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 또는 그 일부분의 검출, 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 도는 그 일부에 결합하는 두 가지 이상의 항체의 검출, 또는 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원에 특이적인 두 가지 이상의 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구의 검출을 포함한다. 또 다른 구체예에 있어서, 환자로부터 분리한 생물학적 시료를 비교 가능한 정상 생물학적 시료와 비교한다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현의 특징을 갖는 질병의 발병, 경과 및 퇴행을 측정하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 질병을 갖고 있거나 상기 질병에 걸린 것으로 의심되는 환자로부터 얻은 시료를, (i) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산의 양, (ii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분의 양, (iii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 항체의 양, 및 (iv) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과 MHC 분자 간의 복합체에 대하여 특이적인 세포 독성 T 세포 또는 T 헬퍼 세포의 양으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 파라미터에 대하여 모니터링하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 상기 방법은 첫 번째 시점에서 첫 번째 시료에서의 파라미터를 측정하고, 두 번째 시점에서는 또 다른 시료에서 측정하며, 두 개의 시료를 비교하여 질병의 경과를 측정한다. 특정 구체예에 있어서, 상기 질병은 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현에 의하여 특징지워지며, 모니터링은 (i) 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 또는 그 일부분을 코딩하는 두 가지 이상의 핵산의 양, 및/또는 (ii) 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 또는 그 일부분의 양, 및/또는 (iii) 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 또는 그 일부분에 결합하는 항체의 양, 및/또는 (iv) 상기 두 가지 이상의 서로 다른 종양 관련 항원 또는 그 일부분과 MHC 분자 간의 복합체에 대하여 특이적인 두 가지 이상의 세포 독성 T 세포 또는 T 헬퍼 세포의 양을 모니터링하는 것을 포함한다.
본 발명에 따르면, 핵산 또는 그 일부분의 검출 또는 핵산 또는 그 일부분의 양의 모니터링은 상기 핵산 또는 상기 일부분에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 수행하거나, 상기 핵산 또는 상기 일부분의 선택적인 증폭에 의하여 수행할 수 있다. 한 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 프로브는 상기 핵산의 인접한 뉴클레오타이드로서, 6 내지 50 서열, 특히, 10 내지 30 서열, 15 내지 30 서열 및 20 내지 30 서열을 포함하는 것이다.
특정 구체예에 있어서, 검출될 종양 관련 항원 또는 그의 일부분은 세포내에 존재하거나 세포 표면에 존재한다. 본 발명에 따르면, 종양 관련 항원 또는 그의 일부분의 검출 또는 종양 관련 항원 또는 그의 일부분의 양의 모니터링은 상기 종양 관련 항원 또는 상기 그의 일부분에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 수행할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 검출될 종양 관련 항원 또는 그의 일부분은 MHC 분자와의 복합체, 특히, HLA 분자와의 복합체 내에 존재할 수 있다.
본 발명에 따르면, 항체의 검출 또는 항체의 양의 모니터링은 상기 항체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질을 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따르면, 항원 또는 그의 일부분과 MHC 분자 간의 복합체에 특이적인 세포 독성 T 세포 또는 T 헬퍼 세포의 검출 또는 세포 독성 T 세포 또는 T 헬퍼 세포의 양의 모니터링은 상기 항원 또는 상기 일부분과 MHC 분자 간의 복합체를 제시하는 (presenting) 세포를 사용하여 수행할 수 있다.
검출 또는 모니터링에 사용되는, 폴리뉴클레오타이드 프로브, 항체, 단백질 또는 펩타이드를 검출 가능한 방법으로 표지하는 것이 바람직하다. 특정 구체예에 있어서, 검출 가능한 마커는 방사성 마커 또는 효소 마커이다. T 림프구는 증식, 사이토카인 생산 및 MHC와 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과의 복합체를 사용하는 특이적 자극에 의하여 유발되는 세포 독성 활성을 검출함으로써 추가적으로 검출할 수 있다. T 림프구는 또한 재조합 MHC 분자를 통하여 검출할 수 있으며, 이 외에도 한 가지 이상의 종양 관련 항원의 특정 면역원성 단편이 로딩되고 특이적 T 세포 수용체와 접촉하여 특이적 T 림프구를 동정할 수 있는 두 가지 이상의 MHC 분자의 복합체를 통하여 검출할 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현의 특징을 갖는 질병을 치료, 진단 또는 모니터링하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 항체를 치료제 또는 진단제와 함께 투여하는 것을 포함한다. 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 항체는 키메라 또는 인간화 항체 또는 천연 항체의 단편이다.
본 발명은 또한 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현의 특징을 갖는 질병을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 상기 환자로부터 면역활성 세포를 포함하는 시료를 채취하고, (ii) 상기 시료를 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 대한 세포 독성 T 세포의 생산에 유리한 조건 하에서 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 발현하는 숙주 세포와 접촉시키고, (iii) 세포 독성 T 세포를 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 발현하는 세포를 용해시키기에 적절한 양으로 환자에게 도입시키는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 종양 관련 항원에 대한 세포 독성 T 세포의 T 세포 수용체를 클로닝하는 것에 관한 것이다. 상기 수용체는 다른 T 세포로 전달되어 상기 세포에 목적하는 특이성을 부여할 수 있으며, 단계 (iii) 하에서와 같이, 환자에게 도입될 수 있다.
한 구체예에 있어서, 숙주 세포는 HLA 분자를 내인적으로 발현시키는 것이다. 또 다른 구체예에 있어서, 숙주 세포는 HLA 분자 및/또는 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 재조합적으로 발현시키는 것이다. 숙주 세포는 비증식성인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 숙주 세포는 항원 제시 세포, 특히, 수지상 세포, 단핵 세포 또는 대식 세포이다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적인 발현으로 특징지워지는 질병을 갖는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원을 코딩하고 상기 질병과 관련된 세포에 의하여 발현되는 핵산을 동정하고, (ii) 상기 핵산 또는 그의 일부분으로 숙주 세포를 형질감염시키고, (iii) 상기 핵산의 발현을 위하여 상기 형질 감염된 숙주 세포를 배양하고 (높은 비율의 형질 감염이 얻어지는 경우, 이 단계는 필수적이지 않음), 및 (iv) 상기 숙주 세포 또는 그의 추출물을 질병과 관련된 환자의 세포와의 면역 반응을 증가시키기에 적절한 양으로 환자에게 도입시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 동정된 MHC 분자를 발현하고 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 제시하는 숙주 세포를 사용하여 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 제시하는 MHC 분자를 동정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 면역 반응은 B 세포 반응 또는 T 세포 반응을 포함할 수 있다. 또한, T 세포 반응은 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 제시하는 숙주 세포에 특이적이거나, 또는 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 발현하는 환자의 세포에 특이적인 세포 독성 T 세포 및/또는 T 헬퍼 세포를 생산하는 것을 포함할 수 있다 .
본 발명은 또한 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현의 특징을 갖는 질병을 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 환자로부터 종양 관련 항원을 비정상적 양으로 발현하는 세포를 동정하고, (ii) 상기 세포를 분리하고, (iii) 상기 세포를 배양하고, (iv) 상기 세포를 상기 세포에 대한 면역 반응을 유발시키기에 적절한 양으로 환자에게 도입시키는 것을 포함한다.
본 발명에서 사용된 숙주 세포는 비증식성이거나, 비증식적으로 된 것이 바람직하다. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현의 특징을 갖는 질병은 특히 암이다.
또한, 본 발명은 (a) 서열 번호 3 내지 5로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그 일부분 또는 유도체, (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산, (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 축퇴된 핵산, 및 (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)와 상보적인 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열 번호 10 및 12 내지 14로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산, 그 일부분 또는 유도체에 관한 것이다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 핵산의 프로모터 서열에 관한 것이다. 이들 서열은, 바람직하게는 발현 벡터 내에서, 다른 유전자와 기능적으로 연결되어서 적합한 세포 내에서 상기 유전자의 선택적 발현을 확실하게 할 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 핵산 분자, 특히, DNA 또는 RNA 분자에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
또한, 숙주 세포는 HLA 분자를 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 한 구체예에 있어서, 숙주 세포는 HLA 분자를 내인적으로 발현하는 것이다. 또 다른 구체예에 있어서, 숙주 세포는 HLA 분자 및/또는 본 발명의 핵산 또는 그의 일부분을 재조합적으로 발현하는 것이다. 숙주 세포는 비증식성인 것이 바람직하다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 숙주 세포는 항원 제시 세포, 특히, 수지상 세포, 단핵 세포 또는 대식 세포이다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 핵산과 혼성화하고 유전자 프로브 또는 안티센스 분자로서 사용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따라서 동정된 핵산 또는 그의 일부분과 혼성화하는, 컴피턴트 시료 (competent sample) 또는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 형태의 핵산 분자를 상기 본 발명에 따라서 동정된 핵산과 상동인 핵산을 조사하는데 사용할 수 있다. 상동 핵산의 조사를 위하여 PCR 증폭, 서던 혼성화 및 노던 혼성화를 사용할 수 있다. 혼성화를, 덜 엄격한 조건 하에서, 보다 바람직하게는 중간 정도의 엄격한 조건 하에서, 가장 바람직하게는 매우 엄격한 조건 하에서 수행할 수 있다. 본 발명에 있어서, "엄격한 (stringent) 조건 "이란 용어는 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미하는 것이다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 (a) 서열 번호 3 내지 5로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 유도체, (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)에 혼성화하는 핵산, (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 축퇴된 핵산, 및 (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 상보적인 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 관한 것이다. 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 서열 번호 10 및 12 내지 14로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드, 그의 일부분 또는 유도체에 관한 것이다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 면역원성 단편에 관한 것이다. 상기 단편은 인간 HLA 수용체 또는 인간 항체에 결합하는 것이 바람직하다. 본 발명의 단편은 6 이상의 아미노산 서열, 특히, 8 이상, 10 이상, 12 이상, 15 이상, 20 이상, 30 이상 또는 50 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
이러한 측면에 있어서, 본 발명은, 특히, 서열 번호 17 내지 19, 90 내지 97, 100 내지 102, 105, 106, 111 내지 116, 120, 123, 124 및 135 내지 137로 이루어진 군 중에서 선택된 서열을 갖거나 포함하는 펩타이드, 그의 일부분 또는 유도체에 관한 것이다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 제제에 관한 것이다. 바람직한 구체예에 있어서, 제제는 항체이다. 다른 구체예에 있어서, 항체는 키메라, 인간화 항체 또는 복합적인 기술에 의하여 생산된 항체 또는 항체의 단편이다. 또한, 본 발명은 (i) 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과 (ii) 상기 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그의 일부분이 결합하는 MHC 분자와의 복합체에 선택적으로 결합하는 항체에 관한 것이며, 상기 항체는 (i) 또는 (ii) 단독에는 결합하지 않는 것이다. 본 발명의 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 항체는 키메라 또는 인간화 항체 또는 천연 항체의 단편이다.
특히, 본 발명은, 서열 번호 17 내지 19, 90 내지 97, 100 내지 102, 105, 106, 111 내지 116, 120, 123, 124 및 135 내지 137로 이루어진 군 중에서 선택된 서열을 갖거나 포함하는 펩타이드, 그의 일부분 또는 유도체에 특이적으로 결합하는, 특히, 항체와 같은 제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 본 발명의 제제 또는 본 발명의 항체와 치료제 또는 진단제와의 컨쥬게이트에 관한 것이다. 한 구체예에 있어서, 상기 치료제 또는 진단제는 독소이다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현을 검출하기 위한 키트에 관한 것으로, 상기 키트는 (i) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산, (ii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분, (iii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 항체, 및/또는 (iv) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과 MHC 분자 간의 복합체에 특이적인 T 세포를 검출하기 위한 제제를 포함한다. 한 구체예에 있어서, 핵산 또는 그의 일부분을 검출하기 위한 제제는 상기 핵산을 선택적으로 증폭시키기 위한 핵산 분자이며, 특히, 상기 핵산 분자에 인접한 뉴클레오타이드로서, 6 내지 50 서열, 특히, 10 내지 30, 15 내지 30 및 20 내지 30 서열을 포함하는 것이다.
본 발명에 있어서, 종양 세포에서 선택적 또는 이상적으로 발현하고, 종양 관련 항원인 유전자가 개시된다.
본 발명에 따르면, 이들 유전자 및/또는 이들의 유전 산물 및/또는 이들의 유도체 및/또는 일부분은 치료적 접근을 위한 표적 구조물인 것이 바람직하다. 개념상으로, 상기 치료적 접근은 선택적으로 발현된 종양 관련 유전 산물의 활성을 억제하는 것을 목표로 한다. 이는, 상기 비정상적인 각각의 선택적 발현이 종양 병원성에 기능적으로 중요하지 않고 그 연결이 대응 세포의 선택적인 손상을 수반하는 경우, 유용하다. 다른 치료 개념은 종양 관련 항원을 종양 세포에 선택적으로 세포 손상 잠재성을 갖는 효과기 기전을 리쿠르트하는 (recruit) 표지라고 예측한다. 여기서, 표적 분자 자체의 기능 및 종양 발달에 있어서의 그의 역할은 전적으로 관련이 없다.
본 발명에 있어서, 핵산의 "유도체"는 상기 핵산에 단일 또는 다수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 및/또는 부가가 존재하는 것을 의미한다. 또한, "유도체"라는 용어는 또한 뉴클레오타이드의 염기, 당 또는 인산 상에서의 핵산의 화학적 유도체화를 포함한다. "유도체"라는 용어는 또한 뉴클레오타이드 및 자연적으로 발생한 것이 아닌 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 핵산을 포함한다.
본 발명에 있어서, 핵산은 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA)인 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 핵산은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합적으로 생산되고 화학적으로 합성된 분자를 포함한다. 본 발명에 있어서, 핵산은 단일 가닥 분자 또는 이중 가닥 분자 및 선형 분자 또는 공유적으로 원형으로 폐쇄된 분자로서 존재할 수 있다.
본 발명에 개시된 핵산은 분리된 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서, "분리된 핵산"이란 용어는 상기 핵산이 (i) 예컨대, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의하여, 생체외적으로 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의하여 재조합적으로 생산되거나, (iii) 예컨대, 절단 및 겔-전기영동 분획화에 의하여, 정제되거나, 또는 (iv) 예컨대, 화학적 합성에 의하여, 합성된 것임을 의미한다. 분리된 핵산은 재조합 DNA 기술에 의한 조작에 사용 가능한 핵산이다.
두 개의 서열이 서로 혼성화하여 안정한 이중 가닥을 형성할 수 있을 때, 한 핵산 분자를 다른 핵산 분자에 대하여 "상보적"이라고 하며, 상기 혼성화는 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건 (엄격한 조건) 하에서 수행되는 것이 바람직하다. 엄격한 조건은 예컨대 다음과 같은 문헌에 기재되어 있으며: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989" 또는 "Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York", 예컨대, 65 ℃ 및 혼성화 버퍼 (3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소 혈청 알부민, 2.5　mM NaH2PO4 (pH 7), 0.5% SDS, 2　mM EDTA)에서의 혼성화를 의미한다. SSC는 pH 7의 0.15　M 염화나트륨/0.15　M 시트르산나트륨이다. 혼성화 후, DNA가 전달되어 있는 멤브레인을, 예컨대, 상온에서 2×SSC로 세척한 후, 68 ℃ 이하의 온도에서 0.1 내지 0.5×SSC/0.1×SDS로 세척한다.
본 발명에 있어서, 상보적 핵산은 적어도 40%, 특히, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 및 바람직하게는, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 동일한 뉴클레오타이드를 갖는다.
본 발명에 있어서, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산은 단독으로 존재하거나 다른 핵산, 특히 이종 핵산과 함께 존재할 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 핵산은, 상기 핵산에 대하여 동종 또는 이종인, 발현 제어 서열 (expression control sequence) 또는 조절 서열 (regulatory sequence)과 기능적으로 연결되어 있다. 코딩 서열과 조절 서열이 상기 코딩 서열의 전사가 상기 조절 서열의 조절 또는 영향 하에서 일어나도록 서로 공유적으로 연결되어 있는 경우, 이들은 서로 "기능적으로" 연결되어 있다고 한다. 코딩 서열이 기능적 단백질로 번역된 후 상기 코딩 서열에 기능적으로 연결되어 있는 조절 서열과 함께 기능적 단백질로 번역된다면, 상기 조절 서열의 도입 결과, 상기 코딩 서열에서의 프레임 쉬프트를 발생시키거나 상기 코딩 서열이 목적하는 단백질 또는 펩타이드로 번역될 수 없도록 하지 않으면서, 상기 코딩 서열의 전사를 유발한다.
본 발명에 있어서, "발현 제어 서열" 또는 "조절 서열"이란 용어는 프로모터, 인핸서 및 유전자 발현을 조절하는 다른 조절 요소들을 포함하는 것이다. 본 발명의 특정 구체예에 있어서, 발현 제어 서열은 조절될 수 있다. 조절 서열의 정확한 구조는 종의 기능 또는 세포 유형에 따라 달라질 수 있지만, 일반적으로, 5' 비전사 서열 및 5' 비번역 서열을 가지며, 이들 서열은 각각 전사 및 번역의 개시시에 사용되는 것으로, 예컨대, TATA 박스, 캡형성 서열, CAAT 서열 등이 있다. 보다 상세하게, 5' 비전사 조절 서열은 기능적으로 연결되어 있는 유전자의 전사 조절을 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 부위를 포함한다. 조절 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성화 부위 서열을 포함한다.
따라서, 한편으로는, 본 명세서에 예시된 종양 관련 항원은 모든 발현 제어 서열 및 프로모터와 결합될 수 있다. 그러나, 다른 한편으로는, 본 발명에 있어서, 본 명세서에 예시된 종양 관련 유전 산물의 프로모터는 모든 다른 유전자와 결합 가능하다. 이는 사용될 이들 프로모터의 선택적인 활성을 가능하게 한다.
본 발명에 있어서, 핵산은 또한 단백질 분비 (secretion)를 제어하는 폴리펩타이드 또는 숙주 세포로부터 상기 핵산에 의하여 코딩되는 폴리펩타이드를 코딩하는 다른 핵산과 함께 존재할 수 있다. 본 발명에 있어서, 핵산은 또한 상기 코딩된 단백질 또는 폴리펩타이드가 숙주 세포의 세포막에 부착되거나 상기 세포의 특정 세포내 소기관으로 분획화되도록 하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산과 함께 존재할 수도 있다. 유사하게, 리포터 유전자 또는 모든 "택(tag)"을 나타내는 핵산과 결합하는 것도 가능하다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명에 있어서, 재조합 DNA 분자는, 적절한 경우, 예컨대, 본 발명의 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 같은 핵산의 발현을 조절하는 프로모터를 갖는 벡터이다. 본 명세서에 사용된 "벡터"라는 용어는 그의 가장 일반적인 의미로 사용된 것이며, 상기 핵산이, 예컨대 원핵 세포 및/또는 진핵 세포에 도입되거나, 적절한 경우, 게놈내에 통합되도록 하는 핵산에 대한 중간 운반체를 포함하는 것이다. 이러한 종류의 벡터는 세포 내에서 복제 및/또는 발현되는 것이 바람직하다. 중간 운반체를 예컨대 전기 천공, 미세 분출을 이용하는 충격, 리포좀 투여, 아그로박테리아에 의한 전달 또는 DNA 또는 RNA 바이러스를 통한 삽입 등에 적합화시킬 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지미드(phagemid) 또는 바이러스 게놈을 포함한다.
본 발명에 따라서 동정된 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 사용하여 숙주 세포를 형질 감염시킬 수 있다. 여기서, 핵산은 재조합 DNA와 RNA를 모두 의미하는 것이다. 재조합 RNA는 DNA 주형의 생체외 전사에 의하여 제작할 수 있다. 또한, 이것은 적용 전에 안정화 서열, 캡형성 및 폴리아데닐화에 의하여 변형될 수 있다.
본 발명에 있어서, "숙주 세포"라는 용어는 외인성 핵산으로 형질 전환 또는 형질 감염 가능한 모든 세포와 관련된 것이다. 본 발명에 있어서, "숙주 세포"는 원핵 세포 (예컨대. E. coli) 또는 진핵 세포 (예컨대, 수지상 세포, B 세포, CHO 세포, COS 세포, K562 세포, 효모 세포 및 곤충 세포)를 포함한다. 인간, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소, 영장류 등으로부터 유래하는 포유류 세포가 특히 바람직하다. 상기 세포들은 다양한 유형의 조직으로부터 유래한 것일 수 있으며, 일차 세포 및 세포주를 포함한다. 특수한 예로서, 각질 세포, 말초혈 백혈구, 골수 줄기 세포 및 배아 줄기 세포 등이 있다. 다른 구체예에 있어서, 숙주 세포는 항원 제시 세포, 특히, 수지상 세포, 단핵 세포 또는 대식 세포이다. 핵산은 단일 복제본 또는 두 개 이상의 복제본의 형태로 숙주 세포에 존재할 수 있으며, 한 구체예에 있어서, 숙주 세포 내에서 발현한다.
본 발명에 따르면, "발현"은 그의 가장 일반적인 의미로 사용되며, RNA 또는 RNA와 단백질의 생산을 포함한다. 이는 또한 핵산의 부분적 발현도 포함한다. 또한, 발현을 일시적 또는 지속적으로 수행할 수 있다. 바람직한 포유 세포 내의 발현 시스템은 pcDNA3.1 및 pRc/CMV (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 포함하며, 이들은 G418에 대한 내성을 부여하는 유전자 등과 같은 선별 마커를 포함하고 (따라서 안정적으로 형질 감염된 세포주를 선별 가능하게 함), 사이토메갈로바이러스(CMV)의 인핸서-프로모터 서열을 포함한다.
본 발명의 HLA 분자가 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 제시하는 이들 경우에 있어서, 발현 벡터는 또한 상기 HLA 분자를 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. HLA 분자를 코딩하는 핵산 서열이 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산과 동일한 발현 벡터 상에 존재할 수 있으며, 이들 핵산이 모두 상이한 발현 벡터 상에 존재할 수도 있다. 후자의 경우, 두 개의 발현 벡터를 하나의 세포로 공동 형질 감염시킬 수 있다. 숙주 세포가 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과 HLA 분자를 모두 발현하지 않는 경우, 이들을 코딩하는 두 핵산 모두를 동일한 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터 상에서 상기 세포로 형질 감염시킨다. 세포가 이미 HLA 분자를 발현하는 경우에는, 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산 서열만을 세포 내로 형질 감염시킬 수 있다.
본 발명은 또한 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 증폭시키기 위한 키트를 포함한다. 이러한 키트는, 예컨대, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 혼성화하는 증폭 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머 다이머가 형성되지 않도록 하기 위하여, 프라이머는 핵산의 인접 뉴클레오타이드 6 내지 50 서열, 특히, 10 내지 30 서열, 15 내지 30 서열 및 20 내지 30 서열을 함유하고, 중복되지 않는 것이 바람직하다. 프라이머 중 하나는 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 한 쪽 가닥과, 다른 프라이머는 상보적인 가닥과, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 증폭을 가능하게 하는 배열로, 혼성화할 것이다.
"안티센스" 분자 또는 "안티센스" 핵산은 핵산의 발현의 조절, 특히, 핵산 발현의 감소를 위하여 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, "안티센스 분자" 또는 "안티센스 핵산"은, 생리적 조건 하에서 특정 유전자를 포함하는 DNA 또는 상기 유전자의 mRNA과 혼성화하여 상기 유전자의 전사 및/또는 상기 mRNA의 번역을 억제하는, 올리고리보뉴클레오타이드, 올리고데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 올리고리보뉴클레오타이드 또는 변형된 올리고-데옥시리보뉴클레오타이드 등의 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명에 있어서, "안티센스" 분자는 또한 핵산 또는 그의 일부분을 그의 천연 프로모터에 대하여 역방향으로 포함하는 구조물을 포함한다. 핵산 또는 그의 일부분의 안티센스 전사체는 효소를 특이적으로 만드는 (specifying) 자연 발생적 mRNA와의 이중 가닥을 형성하여 mRNA의 축적 또는 mRNA의 활성 효소로의 번역을 억제할 수 있다. 또 다른 가능성은 리보자임을 핵산 불활성화에 사용하는 것이다. 본 발명에 있어서 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산의 인접 뉴클레오타이드, 6 내지 50 서열, 특히 10 내지 30 서열, 15 내지 30 서열 및 20 내지 30 서열을 갖고, 표적 핵산 또는 그의 일부분에 완전하게 상보적인 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 번역 개시 부위, 전사 개시 부위 또는 프로모터 부위와 같은 5' 상류 부위 또는 N-말단 부위와 혼성화한다. 다른 구체예에 있어서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 3' 비번역 부위 또는 mRNA 스플라이싱 부위와 혼성화한다.
한 구체예에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는, 하나의 뉴클레오타이드의 5' 말단과 다른 뉴클레오타이드의 3' 말단이 포스포디에스테르 결합에 의하여 서로 결합되어 있는, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 이들의 조합으로 구성된다. 이들 올리고뉴클레오타이드는 통상적인 방법에 의하여 합성하거나 재조합적으로 생산할 수 있다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 "변형된" 올리고뉴클레오타이드이다. 이 때, 올리고뉴클레오타이드는, 예컨대, 안정성 또는 치료 효과를 증진시키기 위하여, 표적에 결합하는 능력을 손상시키지 않고, 매우 다양한 방법으로 변형시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, "변형된 올리고뉴클레오타이드"는 (i) 적어도 두 개의 뉴클레오타이드가 합성 뉴클레오사이드간 결합 (즉, 포스포디에스테르 결합이 아닌 뉴클레오사이드간 결합)에 의하여 서로 연결되어 있거나, 및/또는 (ii) 핵산에서 일반적으로 발견되지 않는 화학 작용기가 올리고뉴클레오타이드에 공유적으로 연결되어 있는, 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 바람직한 합성 뉴클레오타이드간 결합에는 포스포로티오에이트, 알킬 포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 포스페이트 에스테르, 알킬 포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카바메이트, 카보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세트아미데이트, 카르복시메틸 에스테르 및 펩타이드 등이 있다.
"변형된 올리고뉴클레오타이드"는 또한 공유적으로 변형된 염기 및/또는 당을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. "변형된 올리고뉴클레오타이드"는, 예컨대, 3' 위치의 하이드록시기 이외의 저분자량 유기 작용기 및 5' 위치의 포스페이트기에 공유적으로 결합하는 당 잔기를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 변형된 올리고뉴클레오타이드는, 예컨대, 리보오스 대신에, 2'-O-알킬화된 리보오스 잔기 또는, 아라비노오스와 같은 다른 당을 포함할 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따라서 개시된 단백질 또는 폴리펩타이드는 분리된 것이다. "분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"라는 용어는 그의 천연 환경으로부터 분리된 것을 의미한다. 분리된 단백질 또는 폴리펩타이드는 본질적으로 정제된 상태일 수 있다. "본질적으로 정제된"이라는 표현은 단백질 또는 폴리펩타이드가 자연 상태 또는 생체 내에서 그것이 결합되어 있는 다른 물질에서 본질적으로 유리되어 있음을 의미하는 것이다.
이러한 단백질 및 폴리펩타이드는, 예컨대, 항체 생산 및 면역학적 또는 진단 분석법에 사용되거나 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따라서 기재된 단백질 및 폴리펩타이드는 조직 또는 세포 균질액과 같은 생물학적 시료로부터 분리될 수 있으며, 또한, 다수의 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 재조합적으로 발현될 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 아미노산 서열의 "유도체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다.
아미노산 삽입 변이체는 아미노-말단 및/또는 카르복시-말단 융합을 포함하고, 또한 특정 아미노산 서열에 하나 또는 두 개 이상의 아미노산 삽입을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우, 얻어진 산물의 적절한 스크리닝에 의한 무작위 삽입도 가능하지만, 하나 이상의 아미노산 잔기를 아미노산 서열의 특정 위치에 삽입한다. 아미노산 결실 변이체는 서열로부터 하나 이상의 아미노산이 제거된 것을 특징으로 하는 것이다. 아미노산 치환 변이체는 서열 내의 적어도 하나 이상의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 그 위치에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 것이다. 동종 단백질 또는 펩타이드 간의 보존적이지 않은 아미노산 서열의 위치에서 변형이 일어나는 것이 바람직하다. 아미노산을 소수성, 친수성, 전기 음성도, 측쇄의 크기 등과 같은 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것이 바람직하다 (보존적 치환). 보존적 치환은, 예컨대, 하기에 열거된 아미노산 중 하나의 아미노산을 상기 치환될 아미노산과 동일한 군에 속하는 다른 아미노산으로 교체하는 것을 의미하는 것이다:
1. 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly)
2. 음으로 하전된 잔기 및 이들의 아마이드: Asn, Asp, Glu, Gln
3. 양으로 하전된 잔기: His, Arg, Lys
4. 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val (Cys)
5. 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp.
단백질 구조의 특정 부분 때문에, 세 개의 잔기를 괄호 안에 표시하였다. Gly는 측쇄를 함유하지 않은 유일한 잔기이기 때문에 사슬에 유연성을 부여한다. Pro는 사슬을 매우 제한하는 흔하지 않은 기하학적 구조를 갖는다. Cys는 디설파이드 브리지를 형성할 수 있다.
상기의 아미노산 변이체는, 예컨대, 고상 합성법 (Merrifield, 1964) 및 유사 방법 또는 재조합 DNA 조작과 같은 잘 알려진 펩타이드 합성 기술을 사용하여 용이하게 제작할 수 있다. 예정된 위치에서의 치환 돌연변이를 그 서열이 알려지거나 부분적으로 알려진 DNA에 도입하는 기술은 잘 알려져 있으며, 예컨대, M13 돌연변이 유발을 포함한다. 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 단백질을 제조하기 위한 DNA 서열의 조작 기술이 예컨대, "Sambrook et al. (1989)"에 상세하게 기재되어 있다.
본 발명에 있어서, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 "유도체"는, 또한, 탄수화물, 지질 및/또는 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드와 같이, 효소와 관련된 모든 분자의 단일 또는 다중 치환, 결실 및/또는 부가를 포함한다. "유도체"라는 용어는 또한 상기 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 기능적 화학 동등물로 확장된다.
본 발명에 있어서, 종양 관련 항원의 일부분 또는 단편은 그들이 유래된 폴리펩타이드의 기능적 특성을 갖는다. 이러한 기능적 특성은 항체와의 상호 작용, 다른 폴리펩타이드 또는 단백질과의 상호 작용, 핵산의 선택적 결합 및 효소 활성을 포함한다. 특수한 성질은 HLA와 복합체를 형성하고, 적절한 경우, 면역 반응을 일으키는 능력이다. 이러한 면역 반응은 세포 독성 또는 T 헬퍼 세포의 자극에 기초한 것일 수 있다. 본 발명의 종양 관련 항원의 일부분 또는 단편은 종양 관련 항원의 연속적인 아미노산 서열을 적어도 6, 특히 적어도 8, 적어도 10, 적어도 12, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 30 또는 적어도 50 개 이상 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 일부분 또는 단편은, 상기한 바와 같이, 종양 관련 항원 및/또는 상기 종양 관련 항원의 일부분 또는 단편을 코딩하는 핵산의 일부분을 의미하는 것이다.
종양 관련 항원을 코딩하는 유전자의 분리 및 동정은 또한 한 가지 이상의 종양 관련 항원에 발현에 의한 특징을 갖는 질병의 진단을 가능하게 한다. 이들 방법은 종양 관련 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 결정 및/또는 상기 코딩되는 종양 관련 항원 및/또는 그로부터 유도된 펩타이드의 결정을 포함한다. 핵산은 중합 효소 연쇄 반응 또는 표지된 프로브와의 혼성화 등의 통상적인 방법으로 결정할 수 있다. 종양 관련 항원 또는 이로부터 유래된 펩타이드는 항원 및/또는 펩타이드를 인지하는 것에 관해 환자의 항혈청을 스크리닝함으로써 결정할 수 있다. 이들은 또한 대응하는 종양 관련 항원에 특이적인 환자의 T 세포를 스크리닝함으로써 결정할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 종양 관련 항원의 항체 및 세포내 결합 파트너를 포함하여, 본 명세서에 기재된 종양 관련 항원에 결합하는 단백질의 분리를 가능하도록 한다.
*본 발명에 있어서, 특정 구체예는 종양 관련 항원으로부터 유래된 "지배적 음성 (dominant negative)" 폴리펩타이드를 제공한다. 지배적 음성 폴리펩타이드는, 세포 기구(machinery)과의 상호 작용을 위하여, 활성 단백질을 그의 세포 기관과의 상호작용으로부터 이동시키거나, 활성 단백질과 경쟁하여 상기 활성 단백질의 효과를 감소시키는, 불활성 단백질 변이체이다. 예컨대, 리간드에는 결합하지만 상기 리간드에 결합하는 응답으로서의 어떠한 신호도 발생시키지 않는 지배적 음성 수용체는 상기 리간드의 생물학적 효과를 감소시킬 수 있다. 유사하게, 일반적으로 표적 단백질과는 상호 작용하지만 상기 표적 단백질을 인산화시키지 않는 지배적 음성 촉매적 불활성 키나아제는 세포 신호에 대한 응답으로서의 상기 표적 단백질의 인산화를 감소시킬 수 있다. 유사하게, 유전자의 조절 부위 내의 프로모터 부위에는 결합하지만 상기 유전자의 전사를 증가시키지 않는 지배적 음성 전사 인자는 전사를 증가시키지 않으면서 프로모터 결합 부위를 차지하여 정상적인 전사 인자의 활성을 감소시킨다.
세포 내 지배적 음성 폴리펩타이드의 발현 결과로 활성 단백질의 작용이 감소된다. 숙련된 기술자는, 예컨대, 통상적인 돌연변이 유발 방법 및 폴리펩타이드 변이체의 지배적 음성 효과를 평가함으로써, 지배적 음성 변이체를 제작할 수 있다.
본 발명은 또한 종양 관련 항원에 결합하는 폴리펩타이드와 같은 물질을 포함한다. 이러한 결합 물질들은, 예컨대, 종양 관련 항원 및 종양 관련 항원과 그의 결합 파트너와의 복합체의 검출을 위한 스크리닝 검사, 및 종양 관련 항원 및 상기 종양 관련 항원과 그의 결합 파트너와의 복합체의 정제에 사용할 수 있다. 이와 같은 결합 물질은 또한, 종양 관련 항원의 활성을, 예컨대, 이러하나의 항원에 결합함으로써, 억제시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명은, 예컨대, 종양 관련 항원에 선택적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편 등의 결합 물질을 포함한다. 항체는 통상적인 방법으로 생산되는 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체를 포함한다.
이러하나의 항체는 단백질을 천연 상태 및/또는 변성된 상태로 인지할 수 있다 (Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000; Kayyem et al., Eur. J. Biochem. 208: 1-8, 1992; Spiller et al., J. Immunol. Methods 224　: 51-60, 1999).
표적 단백질에 특이적으로 결합하는 특이적 항체를 함유하는 항혈청은 다양한 통상적 방법에 의하여 제조할 수 있다; 예컨대, "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" (Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9); "Antibodies: A Laboratory Manual" (Ed Harlow, David Lane, ISBN: 0879693142) 및 "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" (Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN 0879695447) 참조. 이에 의해서, 복합 막 단백질을 그의 천연 형태로 인지하는 친화적 및 특이적 항체를 생성하는 것이 가능하다 (Azorsa et al., J. Immunol. Methods 229: 35-48, 1999; Anderson et al., J. Immunol. 143: 1899-1904, 1989; Gardsvoll, J. Immunol. Methods 234: 107-116, 2000). 이는 특히 치료적으로 사용되는 항체의 제조 뿐 아니라 많은 진단적 적용과도 관련된 것이다. 이러한 점에 있어서, 표적 분자를 생리학적으로 접힌 (folding) 형태로 발현하는 세포 뿐 아니라 세포외 부분적 서열을 갖는 완전한 단백질을 사용하여 면역화시키는 것이 가능하다.
모노클로날 항체는 하이브리도마 기술을 사용하여 통상적으로 제조할 수 있다. [상세한 기술은 다음의 문헌을 참조: "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach" (Philip Shepherd, Christopher Dean ISBN 0-19-963722-9); "Antibodies: A Laboratory Manual" (Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142); "Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO" (Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447)].
항체 분자의 작은 부분, 즉 파라토프만이 항체의 에피토프에의 결합에 수반된다고 알려져 있다 [Clark, W.R. (1986), The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991), Essential Immunology, 7th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford 참고]. pFc'와 Fc 부위는, 예컨대, 보체 연쇄 증폭 반응 (complement cascade)의 효과기 이지만, 항원 결합에 수반되지는 않는다. "F(ab')2 단편"이라고 칭해지는, pFc' 부위가 효소적으로 제거되었거나 또는 pFc' 부위 없이 제조된 항체는 완전하나의 항체의 모든 항원 결합 부위를 운반한다. 유사하게, "Fab 단편"이라고 칭해지는, Fc 부위가 효소적으로 제거되었거나 상기 Fc 부위 없이 제조된 항체는 무손상 항체 분자의 하나의 항원 결합 부위를 운반한다. 또한, Fab 단편은 항체의 공유적으로 결합된 경쇄 및 Fd라고 칭해지는 상기 항체의 중쇄의 일부로 구성된다. Fd 단편은 항원 특이성의 주요 결정기이며 (단일 Fd 단편은 항체의 특이성을 변경시키지 않고 10 개 이하의 서로 다른 경쇄와 결합할 수 있음), Fd 단편은 분리되어도 에피토프에 결합하는 능력을 보유한다.
항원 에피토프와 직접적으로 상호 작용하는 상보적 결정부 (CDRs) 및 파라토프의 삼차 구조를 유지시키는 골격부 (FRs)가 항체의 항원 결합 부분 내에 위치한다. IG 면역글로불린의 경쇄와 중쇄의 Fd 단편 모두는 3 개의 상보적 결정부 (CDR1 내지 CDR3)에 의하여 각각의 구획으로 나뉘어진 4 개의 골격부 (FR1 내지 FR4)를 포함한다. CDRs, 특히, CDR3 부위, 보다 구체적으로는, 중쇄의 CDR3 부의가 항체 특이성에 크게 영향을 미친다.
포유류 항체의 비CDR 부위는, 원래 항체의 에피토프에 대한 특이성은 유지하면서, 동일하거나 상이한 특이성을 갖는 항체의 유사 부위로 대체될 수 있다는 것이 알려져 있다. 이는 비인간 CDRs이 인간 FR 및/또는 Fc/pFc' 부위에 공유적으로 결합하여 기능적 항체를 생산하는 "인간화" 항체의 개발을 가능하게 하였다.
이는 소위 "SLAM" 기술에 사용되며, 여기서, 전혈로부터 B 세포를 분리하고 상기 세포를 모노클로닝한다. 그리고 나서, 단일 B 세포의 상청액을 그의 항체 특이성에 대하여 분석한다. 하이브로도마 기술과 달리, 항체 유전자의 다양한 부위를 단일 세포 PCR을 사용하여 증폭시키고, 적절한 벡터내로 클로닝한다. 이러한 방법으로, 모노클로날 항체의 공급이 촉진된다 (de Wildt et al., J. Immunol. Methods 207: 61-67, 1997).
또 다른 예로서, WO 92/04381에 쥐의 FR 부위의 적어도 일부분이 인간 기원의 FR 부위로 대체되어 있는 인간화된 쥐 RSV 항체의 생산 및 용도가 개시되어 있다. 항원 결합 능력을 갖는 무손상 항체의 단편을 포함하는 이러한 종류의 항체를 종종 "키메라" 항체라고 부른다.
본 발명은 또하나의 항체의 F(ab')2, Fab, Fv 및 Fd 단편, Fc 및/또는 FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄-CDR3 부위가 상동 인간 또는 비인간 서열로 대체되어 있는 키메라 항체, FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄-CDR3이 상동 인간 또는 비인간 서열로 대체되어 있는 키메라 F(ab')2 단편 항체, FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 및/또는 경쇄-CDR3 부위가 상동 인간 또는 비인간 서열로 대체되어 있는 키메라 Fab 단편 항체 및 FR 및/또는 CDR1 및/또는 CDR2 부위가 상동 인간 또는 비인간 서열로 대체되어 있는 키메라 Fd 단편 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 "단일 사슬" 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 종류의 물질에 결합하는 폴리펩타이드는, 예컨대, 단순히 용액 내에서 고정화된 형태 또는 파아지 디스플레이(phage-display) 라이브러리로서 제조할 수 있는 축퇴 펩타이드 라이브러리를 제작하여, 제공할 수 있다. 하나 이상의 아미노산을 갖는 펩타이드의 조합적 라이브러리를 제작하는 것 또한 가능하다. 비펩타이드 합성 잔기 및 펩토이드(peptoid)의 라이브러리를 또한 제작할 수 있다.
파아지 디스플레이가 본 발명의 결합 펩타이드를 동정하는데 특히 효과적일 수 있다. 이와 관련하여, 예컨대, 4 내지 약 80 아미노산 잔기 길이의 삽입체를 나타내는 파아지 라이브러리를 (예컨대, M13, fd 또는 람다 파아지를 사용하여) 제작한다. 그리고 나서, 종양 관련 항원에 결합하는 삽입체를 운반하는 파아지를 선별한다. 이러한 공정을 2회 이상의 종양 관련 항원에 결합하는 파아지의 재선별을 통하여 반복할 수 있다. 반복적인 공정 수행에 의하여 특정 서열을 운반하는 파아지가 농축된다. 발현된 폴리펩타이드의 서열을 동정하기 위하여 DNA 서열 분석을 수행할 수 있다. 종양 관련 항원에 결합하는 서열 중 가장 작은 선형 부분을 결정할 수 있다. 종양 관련 항원에 결합하는 폴리펩타이드를 동정하기 위하여 효모의 "이중 하이브리드 시스템 (two-hybrid system)"을 사용할 수 있다. 종양 관련 항원의 펩타이드 결합 파트너를 동정하고 선별하기 위하여, 본 발명에 기재된 종양 관련 항원 또는 그의 단편을 사용하여 파아지 디스플레이 라이브러리 등의 펩타이드 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 이러한 분자들은, 예컨대, 스크리닝 분석, 정제 프로토콜, 종양 관련 항원 기능의 간섭 및 숙련된 기술자에게 알려진 다른 목적을 위하여 사용할 수 있다.
전술하나의 항체 및 다른 결합 분자를, 예컨대, 종양 관련 항원을 발현하는 조직을 동정하기 위하여 사용할 수 있다. 항체는 또한 종양 관련 항원을 발현하는 세포 및 조직을 나타내기 위하여 특이적 진단 물질과 커플링될 수 있다. 이들은 또한 치료적으로 유용한 물질과 커플링될 수 있다. 이들은 또한 치료적으로 유용한 물질과 커플링될 수도 있다. 진단 (Diagnostic) 물질은 황산바륨, 이오세탐산(iocetamic acid), 이오파노산(iopanoic acid), 칼슘 이포데이트(calcium ipodate), 소듐 디아트리조에이트(sodium diatrizoate), 메글루민 디아트리조에이트(meglumine diatrizoate), 메트리즈아미드(metrizamide), 소듐 티로파노에이트(sodium tyropanoate) 및, 플루오린-18 및 카본-11 등의 양전자 방출제, 요오드-123, 테크네튬-99m, 요오드-131 및 인듐-111 등의 감마 방출제, 플루오린 및 가돌리늄 등의 핵자기공명용 핵종(nuclide)를 포함하는 방사성 진단제를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명에 있어서, "치료적으로 유용한 물질"이라는 용어는, 항암제, 방사성 요오드 표지 화합물, 독소, 세포증식 억제제 또는 세포 용해제 등을 포함하여, 목적하는 바와 같이, 한 가지 이상의 종양 관련 항원을 발현하는 세포로 선택적으로 인도되는 치료적 분자를 의미한다. 항암제는, 예컨대, 아미노글루테치미드(aminoglutethimide), 아자티오프린(azathioprine), 블레오마이신 설페이트(bleomycin sulfate), 부설판(busulfan), 카무스틴(carmustine), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라스틴(cisplatin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 사이클로스포린(cyclosporine), 시타라비딘(cytarabidine), 다카바진(dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루빈(daunorubin), 독소루비신(doxorubicin), 택솔(taxol), 에토포사이드(etoposide), 플루오로우라실(fluorouracil), 인터페론-α, 로무스틴(lomustine), 머캅토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미토탄(mitotane), 프로카바진(procarbazine) HCl, 티오구아닌(thioguanine), 빈블라스틴 설페이트((vinblastine sulfate) 및 빈크리스틴 설페이트를 포함한다. 이 외의 다른 항암제들이, 예컨대, "Goodman 및 Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc.," 특히, Chapter 52, Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner)에 기재되어 있다. 독소는 포크위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 콜레라 독소, 백일해 독소, 리신(ricin), 겔로닌(gelonin), 아브린(abrin), 디프테리아 외독소 또는 Pseudomonas 외독소와 같은 단백질일 수 있다. 독소 잔기는 또한 코발트-60과 같은 고 에너지 방출 방사성 핵종일 수 있다.
본 발명에 있어서, "환자"는 인간, 인간 이외의 영장류 또는 다른 동물, 특히 소, 말, 돼지, 양, 염소, 개, 고양이 또는 마우스와 래트 등의 설치류와 같은 포유류이다. 특히 바람직한 구체예에 있어서, 환자는 인간이다.
본 발명에 있어서, "질병"은 모든 종양 관련 항원이 발현하거나 비정상적으로 발현하는 모든 병리학적 상태를 의미한다. 본 발명에 있어서, "비정상적 발현"은 발현이 건강한 개체에서의 상태와 비교하여 변화된 것, 특히, 증가된 것을 의미한다. 발현의 증가란 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50% 또는 적어도 100%의 증가를 의미한다. 한 구체예에 있어서, 종양 관련 항원은 질병에 걸린 개체의 조직에서만 발현하는 반면, 정상 개체에서의 발현은 억제된다. 이러한 질병의 한 예로서 암을 들 수 있으며, 본 발명에 있어서, "암"은 백혈병, 정상피종(seminomas), 흑색종, 기형종(teratomas), 신경아교종(gliomas), 신장암, 부신암, 갑상선암, 소장암, 간암, 결장암, 위암, 위장관암, 림프절암, 식도암, 결장직장암, 췌장암, 이비인후 (ENT) 암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 난소암 및 폐암 및 이들의 전이를 포함한다.
본 발명에 있어서, 생물학적 시료는 조직 시료 및/또는 세포 시료일 수 있으며, 본 명세서에 기재된 다양한 방법에 사용하기 위하여, 펀치 생검 등의 조직 생검 및 혈액, 기관지 흡인물, 가래, 소변, 대변 또는 다른 체액을 채취하는 등의 통상적인 방법에 의하여 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서, "면역 반응성 세포"는 적절한 자극에 의하여 면역 세포 (B 세포, T 헬퍼 세포 및 세포독성 T 세포)로 성숙할 수 있는 세포를 의미한다. 면역 반응성 세포는 CD34+ 조혈 줄기세포, 미성숙 및 성숙 T 세포 및 미성숙 및 성숙 B 세포를 포함한다. 종양 관련 항원을 인지하는 세포 독성 또는 T 헬퍼 세포를 생산하는 것을 목적하는 경우, 세포 독성 T 세포 및 T 헬퍼 세포의 생산, 분화 및/또는 선택에 유리한 조건 하에서 면역 반응성 세포를 종양 관련 항원을 발현하는 세포와 접촉시킨다. 항원에 노출시, T 세포 전구체의 세포 독성 T 세포로의 분화는 면역계의 클론 선택과 유사하다.
몇 가지 치료 방법은 환자의 면역계의 작용에 기초한 것일 수 있으며, 이에 의하여, 한 가지 이상의 종양 관련 항원을 제시하는 암 세포와 같은 항원 제시 세포의 용해를 일으킬 수 있다. 이와 관련하여, 예컨대, 종양 관련 항원과 MHC 분자와의 복합체에 특이적인 자기 유래의 세포 독성 T 림프구를 세포적 비정상성을 갖는 환자에게 투여한다. 이러한 세포 독성 T 림프구의 시험관내 (in vitro) 생산이 알려져 있다. T 세포의 분화 방법의 일례를 WO-A-9633265에서 찾을 수 있다. 일반적으로, 환자로부터 혈구와 같은 세포를 함유하는 시료를 채취하고, 상기 세포를 복합체를 제시하고 세포 독성 T 림프구의 증식을 유발할 수 있는 세포 (예컨대, 수지상 세포)와 접촉시킨다. 표적 세포는 COS 세포와 같은 형질 감염 세포일 수 있다. 이들 형질 감염 세포는 이들 표면에 목적하는 복합체를 제시하고, 세포 독성 T 림프구와 접촉시, 세포독성 T 림프구의 증식을 자극한다. 그리고 나서, 상기 클론 확장된 자기 유래의 세포 독성 T 림프구를 환자에게 투여한다.
항원 특이적 세포 독성 T 림프구를 선택하는 또 다른 방법에 있어서, MHC 클래스 I 분자/펩타이드 복합체의 형광 (fluorogenic) 테트라머를 사용하여 세포 독성 T 림프구의 특이적 클론을 검출한다 (Altman et al., Science 274:94-96, 1996; Dunbar et al., Curr . Biol . 8:413-416, 1998). 가용성 MHC 클래스 I 분자는 β2 마이크로글로불린 및 상기 클래스 I 분자에 결합하는 펩타이드 항원의 존재 하에서 시험관내에서 접힐 수 있다. MHC/펩타이드 복합체를 정제한 후, 바이오틴으로 표지한다. 바이오틴화된 펩타이드-MHC 복합체를 표지된 아비딘 (예컨대, 피코에리트린)과 4:1의 몰비로 혼합하여 테트라머를 형성한다. 그리고 나서, 테트라머를 말초혈 또는 림프절과 같은 세포 독성 T 림프구와 접촉시킨다. 상기 테트라머는 펩타이드 항원/ MHC 클래스 I 복합체를 인지하는 세포 독성 T 림프구에 결합한다. 상기 테트라머에 결합하는 세포를 형광 조절 세포 분류(sorting)에 의하여 분류하여, 반응성 세포 독성 T 림프구를 분리한다. 그리고 나서, 분리된 세포 독성 T 림프구를 시험관내에서 증식시킬 수 있다.
인입 전달 (adoptive transfer) [Greenberg, J. Immunol . 136(5):1917, 1986; Riddel et al., Science 257:238, 1992; Lynch et al., Eur . J. Immunol . 21:1403-1410, 1991; Kast et al., Cell 59:603-614, 1989]이라고 칭해지는 치료 방법에 있어서, 목적하는 복합체를 제시하는 세포를 치료할 환자의 세포 독성 T 림프구와 결합시켜, 특이적 세포 독성 T 림프구의 증식을 유발시킨다. 그리고 나서, 증식된 세포 독성 T 림프구를 특이적 복합체를 제시하는 특정 비정상 세포에 의하여 특징지워지는 세포 비정상 (anomaly)을 갖는 환자에게 투여한다. 그리고 나서, 세포 독성 T 림프구가 비정상 세포를 용해시켜, 목적하는 치료 효과를 얻을 수 있다.
종종, 환자의 T 세포 레퍼토리 중에서, 이러한 종류의 특이적 복합체에 대하여높은 친화성을 갖는 T 세포들은 내성의 발생에 기인하여 소멸되기 때문에, 상기의 특이적 복합체에 대하여 낮은 친화성을 갖는 T 세포만이 증식될 수 있다. 여기서의 대안은 T 세포 수용체 자체의 전달일 수 있다. 이를 위하여 또한, 소망하는 복합체 (예컨대, 수지상 세포)를 제시하는 세포를 건강한 개체 또는 다른 종 (예컨대, 마우스)의 세포 독성 T 림프구와 결합시킨다. 이는, T 림프구가 특이적 복합체와 미리 접촉하지 않은 공여 기관으로부터 유래된 것인 경우, 높은 친화성을 갖는 특이적 세포 독성 T 림프구의 증식을 발생시킨다. 이들 증식된 특정 T 림프구의 고친화성 T 세포 수용체를 클로닝한다. 고친화성 T 세포 수용체가 다른 종에서 클로닝된 경우, 이들을 상이한 정도로 인간화시킬 수 있다. 그리고 나서, 이러한 T 세포 수용체를, 예컨대, 레트로바이러스 벡터를 사용하는, 유전자 전달을 통하여, 목적하는 바와 같이, 환자의 T 세포 내로 형질 도입시킨다. 그리고 나서, 이들 유전자적으로 변형된 T 림프구를 사용하여 인입 전달을 수행한다 (Stanislawski et al., Nat Immunol. 2:962-70, 2001; Kessels et al., Nat Immunol. 2:957-61, 2001).
상기의 치료적 측면은 환자의 비정상적 세포 중 적어도 일부가 종양 관련 항원과 HLA 분자와의 복합체를 제시한다는 사실로부터 시작한다. 이러한 세포들은 원래 알려진 방법으로 동정할 수 있다. 상기 복합체를 제시하는 세포를 동정하자마자, 이들을 환자로부터 얻은 세포 독성 T 림프구를 포함하는 시료와 혼합할 수 있다. 세포 독성 T 림프구가 상기 복합체를 제시하는 세포를 용해시키는 경우, 종양 관련 항원이 제시되었음을 추측할 수 있다.
본 발명에 따라서 적용 가능한 치료 형태에 인입 전달만이 있는 것은 아니다. 세포 독성 T 림프구는 또한 본래 알려진 방법으로 생체내에서 생성할 수 있다. 한 방법은 복합체를 발현하는 비증식성 세포를 사용하는 것이다. 이 때 사용된 세포는, 방사선 조사 종양 세포 또는 복합체 (즉, 항원성 펩타이드 및 제시 HLA 분자)를 제시하는데 필요한 유전자 중 하나 또는 모두로 형질 감염된 세포와 같이, 일반적으로 복합체를 발현하는 것들일 수 있다. 다양한 유형의 세포를 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 유전자 중 하나 또는 모두를 운반하는 벡터를 사용하는 것도 가능하다. 바이러스 또는 박테리아 벡터가 특히 바람직하다. 예컨대, 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산을 특정 유형의 조직 또는 세포에서 상기 종양 관련 항원 또는 그의 단편의 발현을 조절하는 프로모터 또는 인핸서 서열과 기능적으로 연결시킬 수 있다. 핵산을 발현 벡터에 통합시킬 수 있다. 발현 벡터는 외래 핵산이 삽입될 수 있는 비변형된 염색체외 핵산, 플라스미드 또는 바이러스 게놈일 수 있다. 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 또한 레트로바이러스 게놈 내에 삽입하여, 상기 핵산이 표적 조직 또는 표적 세포의 게놈 내에 통합될 수 있도록 할 수 있다. 이들 시스템에 있어서, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스 등의 미생물이 목적하는 유전자를 운반하고 사실상 숙주 세포를 "감염"시킨다. 또 다른 바람직한 형태는 종양 관련 항원을, 예컨대, 리포좀 전달 또는 전기 천공을 사용하여, 세포 내 도입 가능한 재조합 RNA 형태로 세포 내로 도입시키는 것이다. 얻어진 세포는 목적하는 복합체를 제시하고, 자기 유래 세포 독성 T 림프구가 이를 인지한 후 증식한다.
생체내에서 항원 제시 세포로의 통합을 가능하게 하기 위하여 종양 관련 항원 또는 그의 단편을 면역 보강제와 결합시킴으로써 유사한 효과를 얻을 수 있다. 종양 관련 항원 또는 그의 단편은 단백질, DNA (예컨대, 벡터 내에서) 또는 RNA로서 나타날 수 있다. 종양 관련 항원은 HLA 분자에 대한 펩타이드 파트너를 생산하도록 가공하는 한편, 그의 단편은 추가적으로 가공할 필요 없이 제시할 수 있다. 후자는 특히 이들이 HLA 분자에 결합할 수 있는 경우이다. 완전하나의 항원이 생체 내에서 수지상 세포에 의하여 가공되어 있는 투여 형태가, 상기 가공된 항원이 또한 효과적인 면역 반응에 필요한 T 헬퍼 세포 반응을 발생시킬 수 있기 때문에 바람직하다 (Ossendorp et al., Immunol Lett . 74:75-9, 2000; Ossendorp et al., J. Exp. Med . 187:693-702, 1998). 일반적으로, 종양 관련 항원의 유효량을, 예컨대, 피부내 주사에 의하여, 환자에게 투여하는 것이 가능하다. 그러나, 림프절 내로의 절내 주사도 또한 수행 가능하다 (Maloy et al., Proc Natl Acad Sci USA 98: 3299-303, 2001). 수지상 세포로의 흡수를 촉진하는 시약과 함께 수행할 수도 있다. 바람직한 종양 관련 항원은 많은 암 환자의 T 세포 또는 동종이형(allogenic) 암 항혈청과 반응하는 것들을 포함한다. 그러나, 특히 중요한 것은, 그에 대한 자발적 면역 반응이 미리 존재하지 않는 것들이다. 명백하게, 종양을 용해시킬 수 있는 이들 면역 반응을 유도하는 것이 가능하다 (Keogh et al., J. Immunol . 167:787-96, 2001; Appella et al., Biomed Pept Proteins Nucleic Acids 1:177-84, 1995; Wentworth et al., Mol Immunol . 32:603-12, 1995).
본 발명에 따라서 기재된 약학 조성물은 또한 면역화용 백신으로서 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서, "면역화" 또는 "백신화"는 항원에 대한 면역 반응을 증진시키거나 활성화시키는 것을 의미한다. 암에 대한 면역화 효과를 시험하기 위하여 종양 관련 항원 또는 이를 코딩하는 핵산을 사용하여 동물 모델을 사용하는 것이 가능하다. 예컨대, 인간 암세포를 마우스에 도입시켜 종양을 발생시키고, 종양 관련 항원을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 투여할 수 있다. 암세포에 대한 효과 (예컨대, 종양 크기의 감소)를 핵산에 의한 면역화의 유효성에 대한 평가로서 측정할 수 있다.
면역화용 조성물의 일부로서, 하나 이상의 종양 관련 항원 또는 그의 자극 단편을 면역 반응을 유도하거나 면역 반응을 증가시키기 위한 한 가지 이상의 면역 보강제와 함께 투여한다. 면역 보강제는 항원 내로 통합되거나 이와 함께 투여되어 면역 반응을 증진시키는 물질이다. 면역 보강제는 항원 저장소 (세포외 또는 대식 세포 내)의 제공, 대식 세포의 활성화 및/또는 특정 림프구의 자극에 의하여 면역 반응을 증진시킬 수있다. 면역 보강제들은 잘 알려져 있으며, 모노포스포릴 리피드 A (MPL, SmithKline Beecham), QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO　96/33739), QS7, QS17, QS18 및 QS-L1 (So et al., Mol. Cells 7:178-186, 1997) 등의 사포닌, 불완전 프로인트 면역 보강제, 완전 프로인트 면역 보강제, 비타민 E, 몬타나이드, 백반, CpG 올리고뉴클레오타이드 (cf. Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995) 및 스쿠알렌 및/또는 토코페롤 등의 생분해성 오일로부터 제조된 다양한 유중수 에멀젼을 포함하지만, 이에 한정하지는 않는다. 바람직하게는, 펩타이드를 DQS21/MPL와 혼합하여 투여한다. MPL에 대한 DQS21의 비율은 일반적으로 약 1:10 내지 10:1이며, 바람직하게는 약 1:5 내지 5:1이고 특히 바람직하게는 1:1이다. 인간 투여용의 경우, 백신 제제는 DQS21와 MPL를 약 1　㎍ 내지 약 100　㎍ 범위로 함유하는 것이 일반적이다.
환자의 면역 반응을 자극하는 다른 물질을 또한 투여할 수 있다. 예컨대, 사이토카인류가 림프구에 대한 조절 특성을 갖기 때문에, 백신화에 사이토카인을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 사이토카인류에는, 예컨대, 백신의 보호 작용을 증가시키는 것으로 나타난 인터루킨-12 (IL-12) (cf. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF 및 IL-18 등이 있다.
면역 반응을 증진시켜서 백신화에 사용 가능한 화합물들이 많이 있다. 상기 화합물에는 단백질 또는 핵산 형태로 제공되는 공자극 분자 등이 있다. 이러한 공자극 분자의 예로서, 수지상 세포 (DC) 상에서 발현되고, T 세포상에서 발현되는 CD28과 상호 작용하는 B7-1 및 B7-2 (각각, CD80 및 CD86) 등이 있다. 이러한 상호 작용은 항원/MHC/TCR-자극 (신호 1) T 세포에 대한 공자극 (신호 2)를 제공하여, 상기 T 세포의 증식 및 효과기 작용을 증진시킨다. B7는 또한 T 세포 상의 CTLA4 (CD152)와 상호 작용하며, CTLA4 및 B7 리간드를 수반하는 연구들은 B7-CTLA4 상호 작용이 항종양 면역성 및 CTL 증식을 강화시킬 수 있다는 것을 보여준다 (Zheng, P. et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95(11):6284-6289 (1998)).
B7는 일반적으로 종양 세포 상에서 발현되지 않기 때문에, 이들은 T 세포에 대한 효과적인 항원 제시 세포 (APCs)가 아니다. B7 발현의 유도는 종양 세포가 세포 독성 T 림프구의 증식과 효과기 작용을 보다 효과적으로 자극하도록 할 것이다. B7/IL-6/IL-12의 조합에 의한 공자극은 T 세포 집단에서의 IFN-감마 및 Th1-사이토카인 프로필의 유도를 나타내어, T 세포 활성을 보다 증진시킨다 (Gajewski et al., J. Immunol . 154:5637-5648 (1995)).
세포 독성 T 림프구의 완전한 활성화 및 완전한 효과기 작용은 수지상 세포에 의하여 발현되는 CD40 분자와 상기 T 헬퍼 세포 상의 CD40 리간드 간의 상호 작용을 통한 T 헬퍼 세포의 수반을 필요로 한다 (Ridge et al., Nature 393:474 (1998), Bennett et al., Nature 393:478 (1998), Schonberger et al., Nature 393:480 (1998)). 이러한 공자극 신호의 기전은 B7의 생산 및 상기 수지상 세포 (항원 제시 세포)에 의한 관련된 IL-6/IL-12 생산의 증가와 관련있을 것이다. 따라서, CD40-CD40L 상호 작용은 신호 1 (항원/MHC-TCR) 및 신호 2 (B7-CD28)를 보완한다.
수지상 세포를 자극하기 위하나의 항 CD40 항체의 사용에 의하여, 일반적으로 염증 반응의 범위 밖이거나, 비전문적 항원 제시 세포 (종양 세포)에 의하여 제시되는 종양 항원에 대한 반응이 직접적으로 증진될 것으로 기대된다. 이러한 상황에서, T 헬퍼 및 B7 공자극 신호는 제공되지 않는다. 이러한 기전은 항원 플러스 수지상 세포에 기초하는 치료법과 관련하여 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 핵산, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 투여에 관한 것이다. 폴리펩타이드 및 펩타이드는 본래 알려진 방법에 의하여 투여할 수 있다. 한 구체예에 있어서, 핵산은 생체외적(ex vivo) 방법, 예컨대, 환자로부터 세포를 제거하거나, 종양 관 항원을 통합시키기 위하여 상기 세포를 유전자적으로 변형시키거나, 상기 변형된 세포를 환자내로 재도입시키는 등의 방법에 의하여 투여한다. 이는 일반적으로 유전자의 기능적 복제본을 환자의 세포로 시험관내(in vitro)적으로 도입시키고, 유전자적으로 변형된 세포를 환자에게 재도입시키는 것을 포함한다. 유전자의 기능적 복제본은 상기 유전자가 유전자적으로 변형된 세포에서 발현되도록 하는 조절 요소의 기능적 제어 하에 있는 것이다. 형질 감염 및 형질 도입 방법은 이 기술 분야의 숙련된 기술자에게 잘 알려져 있다. 본 발명은 또한 표적 제어된 리포좀 및 바이러스 등의 벡터를 사용하여 핵산을 생체내적으로 투여하는 것에 관한 것이다.
바람직한 구체예에 있어서, 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산을 투여하기 위한 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 백시니아 바이러스 및 약독화 폭스 바이러스 등을 포함하는 폭스 바이러스, 셈리키 삼림 바이러스(Semliki Forest virus), 레트로바이러스, 신드비스 바이러스(Sindbis virus) 및 Ty 바이러스 유사 입자로 이루어진 군 중에서 선택된다. 특히 바람직한 것은 아데노바이러스 및 레트로바이러스이다. 레트로바이러스는 일반적으로 복제 결핍이다 (즉, 이들은 감염성 입자를 생성할 수 없다).
본 발명에 있어서, 핵산을 세포내로 시험관내 또는 생체내적으로 도입하기 위하여 다양한 방법을 사용할 수 있다. 이러한 종류의 방법은 핵산 CaPO4 침전물의 형질 감염, DEAE와 결합된 핵산의 형질 감염, 목적하는 핵산을 운반하는 상기 바이러스를 이용하는 형질 감염 또는 감염, 리포좀 매개 형질 감염 등을 포함한다. 특정 구체예에 있어서, 핵산을 특정 세포로 유도하는 것이 바람직하다. 이러한 구체예에 있어서, 핵산의 세포(예컨대, 레트로바이러스 또는 리포좀)로의 투여를 위한 담체를 표적 조절 분자에 결합시킬 수 있다. 예컨대, 표적 세포 상의 표면 막단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등과 같은 분자를 핵산 담체 내로 통합시키거나 여기에 부착시킬 수 있다. 바람직한 항체는 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 항체를 포함한다. 리포좀을 통한 핵산의 투여가 소망되는 경우, 표적 제어 및/또는 흡수를 가능하게 하기 위하여, 엔도사이토시스와 관련된 표면 막단백질에 결합하는 단백질을 리포좀 제제에 통합시킬 수 있다. 이러한 단백질은 특정 유형의 세포에 특이적인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 내재화된 단백질에 대하나의 항체, 세포내 위치를 지정(addressing)하는 단백질 등을 포함한다.
본 발명의 치료적 조성물은 약학적 적합 제제로서 투여할 수 있다. 이러한 제제는 일반적으로 약학적으로 적합한 농도의 염, 완충 물질, 보존제, 담체, 면역 보강제, CpG 및 사이토카인류 등과 같은 보충적 면역 증강 물질을 함유할 수 있으며, 적절한 경우, 다른 치료적 활성 화합물을 함유할 수 있다.
본 발명의 치료적 활성 화합물을, 주사 또는 주입 등에 의하여, 통상적인 경로를 통하여 투여할 수 있다. 예컨대, 경구, 정맥내, 복막내, 근육내, 피하 또는 경피적으로 투여를 수행할 수 있다. 바람직하게는, 항체를 폐 에어로졸에 의하여 투여할 수 있다. 안티센스 핵산은 서서히 정맥내 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 유효량으로 투여한다. "유효량"이란 단독 또는 추가적인 분량과 함께 목적하는 작용 또는 목적하는 효과를 달성할 수 있는 양을 의미하는 것이다. 한 가지 이상의 종양 관련 항원의 발현에 의하여 특징지워지는 특정 증상 또는 특정 질병의 치료의 경우, 목적하는 작용은 질병의 경과를 억제하는 것과 관련있다. 이는 질병의 진행을 늦추고, 특히, 질병의 진행을 중단시키는 것을 포함한다. 질병 또는 증상의 치료에 있어서의 목적하는 작용은 또한 상기 질병 또는 상기 증상의 발병의 지연 또는 그 발병의 예방일 수 있다.
본 발명의 조성물의 유효량은 치료될 증상, 질병의 경중, 연령, 생리적 조건, 크기 및 체중 등의 환자의 개인적 파라미터, 치료 기간, 병행 치료가 수행되는 경우 그 유형, 특정 투여 경로 및 유사한 인자들에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 멸균된 것이 바람직하고, 목적하는 반응 또는 목적하는 효과를 발생시키기 위하여 치료적 활성 물질의 유효량을 함유하는 것이다.
본 발명의 조성물의 투여 분량은 투여 유형, 환자의 상태, 목적하는 투여 기간, 등의 다양한 파라미터에 따라 달라질 수 있다. 초기 분량의 사용시의 환자의 반응이 불충분한 경우, 보다 많은 분량 (또는 상이하고 보다 국부화된 투여 경로에 의하여 달성되는 실질적 고분량)을 사용할 수 있다.
일반적으로, 면역 반응의 발생 또는 증가 또는 치료를 위하여, 1 ng 내지 1 mg, 바람직하게는 10 ng 내지 100 ㎍ 분량의 종양 관련 항원을 제제화하고 투여할 수 있다. 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 (DNA 및 RNA)의 투여를 목적하는 경우, 1 ng 내지 0.1 mg 분량을 제제화하고 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 일반적으로 약학적으로 적합한 양 및 약학적으로 적합한 조성으로 투여한다. "약학적으로 적합한"이란 약학적 조성물의 활성 성분의 작용과 상호 작용하지 않는 비독성 물질을 의미한다. 이러한 종류의 제제는 일반적으로 염, 완충 물질, 보존제, 담체를 함유하며, 적절한 경우, 다른 치료적 활성 화합물을 함유할 수 있다. 의약에 사용되는 경우, 염은 약학적으로 적합한 것이어야 한다. 그러나, 약학적으로 적합하지 않은 염도 약학적으로 적합한 염의 제조에 사용될 수 있으며, 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 종류의 약리적 및 약학적으로 적합한 염은 다음의 산으로부터 제조된 것들을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산, 숙신산 등. 약학적으로 적합한 염은 또한 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염 등과 같은 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염으로서 제조할 수도 있다.
*본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 적합한 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 적합한 담체"는 인간에게 투여하기에 적합한 한 가지 이상의 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 피막 형성 물질을 의미한다. "담체"는, 적용을 용이하게 하기 위하여 활성 성분이 결합되어 있는, 천연 또는 합성 종류의 유기 또는 무기 성분을 의미한다. 본 발명의 약학 조성물의 성분은 일반적으로 목적하는 약학적 효능을 실질적으로 손상시키는 어떠한 상호 작용도 일어나지 않는 것들이다.
본 발명의 약학 조성물은 염 상태의 아세트산, 염 상태의 시트르산, 염상태의 붕산 및 염 상태의 인산 등의 완충 물질을 함유할 수 있다.
약학 조성물은 또한, 적절한 경우, 염화벤즈알코늄, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살 등의 적절한 보존제를 함유할 수 있다.
약학 조성물은 일반적으로 균일한 투여 형태로 제공되며, 본래 알려진 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은, 예컨대, 캡슐, 타블렛, 로젠지, 현탁액, 시럽, 엘릭시르 또는 에멀젼의 형태일 수 있다.
비경구 투여에 적합한 조성물은 일반적으로 활성 화합물의 멸균 수성 또는 비수성 제제를 함유하며, 이는 피투여자의 혈액과 등장인 것이 바람직하다. 적합한 담체 및 용매의 예로서, 링거액 및 등장 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 일반적으로, 멸균 및 고정된 오일을 용액 또는 현탁액 매질로서 사용한다.
본 발명을 하기하는 도면 및 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명할 것이나, 이들은 예시를 위하여 사용되는 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들에 의하여 제한되지 않는다. 설명 및 실시예로 인하여, 이 발명의 기술 분야의 숙련된 기술자들은 역시 본 발명에 속하는 추가적인 구체예들을 쉽게 실시할 수 있을 것이다.
도 1. 결장 암종 생검에서의 GPR35 mRNA 발현
DNA-프리 RNA를 사용하는 RT-PCR 조사에서 대부분의 결장 암종 생검에서 GPR35 발현이 관찰된다. 대조적으로, 정상 조직에서는 발현이 검출되지 않는다. (1-유방, 2-폐, 3-림프절, 4-흉선, 5-결장, 6-15 결장 암종, 16-음성 대조군).
도　2.　정상 조직 및 종양 조직에서의 GUCY2C mRNA 발현의 정량적 PCR 분석
GUCY2C 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　22-23)를 사용하는 실시간 PCR 조사에서, 정상 회장, 결장 및 모든 결장 암종 생검에서의 선택적인 mRNA 발현이 관찰된다. 또한, 뚜렷한 양의 GUCY2C 전사체가 간의 결장 암종 전이에서도 검출된다.
도 3. 종양 특이적 GUCY2C 스플라이스 변이체의 동정
정상 결장 조직 또는 결장 암종으로부터 얻은 PCR 산물을 클로닝하고, 두 군으로부터 얻은 클론을 제한 효소 분석 (EcoR I)에 의하여 점검하고 시퀀싱한다.
도 4. 정상 폐 및 폐 암종에서의 선택적인 SCGB3A 발현
유전자 특이적 SCGB3A2 프라이머 (SEQ　ID　NO:　37,　38)를 사용하는 RT-PCR 분석에서, 정상 폐(레인 8, 14-15)과 폐 암종 생검 (레인 16-24)에서의 독점적 cDNA 증폭이 관찰된다. (1-간-N, 2-PBMC-N, 3-림프절-N, 4-위-N, 5-정소-N, 6-유방-N, 7-신장-N, 8-폐-N, 9-흉선-N, 10-난소-N, 11-부신-N, 12-비장-N, 14-15-폐-N, 16-24-폐 암종, 25-음성 대조군).
도 5.　위, 식도, 위 암종 및 췌장 암종에서의 Claudin -18A2.1 발현
본 발명에 있어서, claudin-18A2.1 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　39, 40)를 사용하는 RT-PCR 분석에서, 8/10 위 암종 생검 및 3/6 췌장 암종 생검에서의 뚜렷한 claudin-18A2.1 발현이 관찰된다. 위 및 정상 식도 조직에서도 뚜렷한 발현이 검출되었다. 난소 및 난소 암종에서는 발현이 탐지되지 않는다.
도 6.　신장 또는 신세포 암에서의 SLC13A1 발현
SLC13A1 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　49, 50)를 사용하는 RT-PCR 분석에서, 7/8 신세포 암종 시료에서 발현이 관찰된다. 그러나, 정상 조직에서의 전사체는 신장에서만 검출된다. (1-2-신장, 3-10-신세포 암종, 11-유방, 12-폐, 13-간, 14-결장, 15-림프절, 16-비장, 17-식도, 18-흉선, 19-갑상선, 20-PBMCs, 21-난소, 22-정소).
도 7.　결장, 결장 암종 및 위 암종에서 CLCA1 발현
CLCA1 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　67, 68)을 사용하는 RT-PCR 검사에 의하여 결장에서의 선택적 발현이 확인되고, (3/7) 시험된 결장 암종 및 (1/3) 시험된 위 암종 시료에서의 고발현이 관찰되었다. 다른 정상 조직 (NT)은 매우 미약한 발현을 나타내었거나 발현을 나타내지 않았다.
도 8.　결장 및 결장 암종에서의 FLJ21477 발현
FLJ21477 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　69, 70)를 사용하는 RT-PCR 검사에 의하여, 결장에서의 선택적 발현과 (7/12) 시험된 결장 암종 시료에서의 추가적인 다양한 수준의 발현이 관찰되었다. 다른 정상 조직 (NT)에서는 발현이 나타나지 않았다.
도 9.　 걸장 및 결장 암종에서의 FLJ20694 발현
FLJ20694 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　71, 72)를 사용하는 RT-PCR 조사에 의하여 결장에서의 선택적 발현과 (5/9) 시험된 결장 암종 시료에서의 추가적인 다양한 수준의 발현이 관찰되었다. 다른 정상 조직 (NT)에서는 발현이 나타나지 않았다.
도 10.위, 폐 및 폐 암종에서의 폰 에브너 ( von Ebner ) 발현
폰 에브너 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　73, 74)를 사용하는 RT-PCR 조사에 의하여, 위, 폐 및 (5/10) 시험된 폐암종 시료에서의 선택적 발현이 관찰되었다. 다른 정상 조직 (NT)에서는 발현이 나타나지 않았다.
도 11.　흉선, 폐 및 폐암종에서의 Plunc 발현
Plunc 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　75, 76)를 사용하는 RT-PCR 조사에 의하여, 흉선, 폐 및 (6/10) 시험된 폐암종 시료에서의 선택적 발현이 관찰되었다. 다른 정상 조직에서는 발현이 나타나지 않았다.
도 12. 폐, 폐암종 및 갑상선에서의 SLC26A9 발현
SLC26A9 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　77, 78)를 사용하는 RT-PCR 조사에 의하여, 폐 및 모든 (13/13) 시험된 폐암종 시료에서의 선택적 발현이 관찰되었다. 갑상선을 제외한 다른 정상 조직 (NT)에서는 발현이 관찰되지 않았다.
도 13.　위, 난소, 폐 및 폐암종에서의 THC1005163 발현
THC1005163 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　79) 및 비특이적 올리고 dT 택 프라이머를 사용하는 RT-PCR 조사에 의하여, 위, 난소, 폐 및 (5/9) 폐암종 생검에서의 발현이 관찰되었다. 다른 정상 조직 (NT)에서는 발현이 나타나지 않았다.
도 14.　신장 및 신세포 암종에서의 LOC134288 발현
LOC134288 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　80, 81)를 사용하는 RT-PCR 조사에 의하여, 신장 및 (5/8) 시험된 신세포 암종 생검에서의 선택적 발현이 관찰되었다.
도 15.　신장 및 신세포 암종에서의 THC943866 발현
THC943866 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　82, 83)를 사용하는 RT-PCR 조사에 의하여, 신장 및 (4/8) 시험된 신세포 암종 생검에서의 선택적 발현이 관찰되었다.
도 16.　결장 및 결장 암종에서의 FLJ21458 발현
FLJ21458 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　86, 87)를 사용하는 RT-PCR 조사에 의하여, 결장 및 (7/10) 시험된 결장 암종 생검에서의 선택적 발현이 관찰되었다. (1-2-결장, 3-간, 4-PBMCs, 5-비장, 6-전립선, 7-신장, 8-난소, 9-피부, 10-회장, 11-폐, 12-정소, 13-22 결장 암종, 23-음성 대조군).
도 17.　 GPR35 의 세포내 위치 선정
GPR35-GFP 융합 단백질을 발현하는 플라스미드의 형질 감염 후의 GPR35의 세포내 위치 선정을 탐지하기 위한 면역 형광. 화살표는 형광 색소 GFP의 막결합 형광을 나타내는 것이다.
도 18.　 GPR35 의 정량적 발현
A. GPR35 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　88, 89)를 사용하는 정량적 RT-PCR 에 의하여, 장 종양, 결장 종양 시료 및 간 종양으로부터의 전이에서 선택적 발현이 관찰된다. 다음의 정상 조직들을 분석하였다: 간, 폐, 림프절, 위, 비장, 부신, 신장, 식도, 난소, 정소, 흉선, 피부, 유방, 췌장, 림프구, 활성화된 림프구, 전립선, 갑상선, 난관, 자궁내막, 소뇌, 뇌.
B. 결장 종양 및 이의 전이에서의 GPR35의 우세. GPR35는 90% 이상의 경우에서 종양 및 전이 모두에서 발현하였다.
도 19.　 GUCY2C 의 정량적 발현
GUCY2C 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　98, 99)를 사용하는 정량적 RT-PCR에 의하여 정상 결장 조직 및 위 조직에서의 선택적 발현이 관찰되고 (A), 결장 및 위 종양에서는 GUCY2C 특이적 발현이 관찰된다 (B). GUCY2C은 11/12 결장 암종 및 7/10 위 암종에서 관찰된다.
도 20.　 SCGB3A2 의 정량적 발현
SCGB3A2 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　103, 104)를 사용하는 정량적 RT-PCR에 의하여, 폐 시료 및 폐 종양 시료에서의 선택적 발현이 관찰된다. 19/20 폐 종양 시료는 SCGB3A2-양성이며, 시료의 50% 이상에서 SCGB3A2는 적어도 10 이상의 인자 정도로 과발현된다. 다음의 정상 조직을 분석하였다: 간, 폐, 림프절, 위, 비장, 부신, 신장, 식도, 난소, 정소, 흉선, 피부, 유방, 췌장, 림프구, 활성화된 림프구, 전립선, 갑상선, 난관, 자궁내막, 소뇌, 뇌.
도 21.　 SCGB3A2 특이적 항체를 사용하는 면역 형광
COS7 세포를 SCGB3A2-GFP 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질 감염시켰다. A.　SCGB3A2 특이적 래빗 항혈청 (SEQ　ID　NO:　105에 의한 면역화)에 의한 형질 감염된 융합 단백질의 검출. B.　GFP 형광에 의한 형질 감염된 융합 단백질의 검출. C.　A 및 B에서 얻은 두 형광의 중첩. 두 개의 형광이 중첩되는 지점에서 황색이 나타나며, 이는 SCGB3A2 항혈청의 특이성을 보여주는 것이다.
도 22.　 claudin -18 스플라이스 변이체의 개략적 모식도
두 개의 claudin-18 스플라이스 변이체, A1 및 A2은 N-말단에 있어서 서로 다르며, 상이한 잠재적 글라이코실화 부위를 나타낸다.
도 23.　 claudin -18, 변이체 A1의 정량적 발현
Claudin-A1은 많은 수의 종양 조직에서 고도로 활성화된다. 특히 위 종양, 폐 종양, 췌장 암종 및 식도 암종에서 특히 강력한 발현이 관찰된다.
도 24.　 claudin -18, 변이체 　A2의 정량적 발현
변이체 A2는, 변이체 A1와 같이, 많은 종양에서 활성화된다.
도 25.　 claudin -18A2 특이적 항체 ( 세포외 도메인)의 사용
(상단) 펩타이드 (SEQ　ID　NO:　17)로 면역화되어 생산된 항체를 사용하는 claudin-18A2-양성 위 암종 세포 (SNU-16)의 염색. 멤브레인 염색이 세포/세포 상호 작용 부위에서 특히 강하게 나타난다. A-면역 전, MeOH; B-면역 혈청 MeOH, 5　㎍/ml; (하단) claudin-18A2-GFP 감염된 293T 세포에서의 공동 위치 선정에 의하나의 항체의 특이성 입증. A-Claudin-18A2 GFP; B-항-claudin-A2; C-중첩.
도 26.　 claudin -18A2 특이적 항체 ( 세포외 도메인)의 사용
펩타이드 (SEQ　ID　NO:　113, N-말단 위치 세포외 도메인)에 의한 면역화에 의하여 생산된 항체에 의한 claudin-18A2-양성 위 암종 세포 (SNU-16)의 막 염색. E-카드헤린에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 대조 염색을 위하여 사용하였다. A-항체; B-대조 염색; C-중첩.
도 27.　 claudin -18의 C-말단 세포외 도메인에 대하나의 항체의 사용
(좌측, 상단 및 하단) 펩타이드 (SEQ　ID　NO:　116, C-말단 위치 세포외 도메인)에 의한 면역화에 의하여 생산된 항체에 의한 claudin-18A2-양성 위 암종 세포 (SNU-16)의 막 염색. E-카드헤린에 대하여 유도된 모노클로날 항체를 대조 염색을 위하여 사용하였다 (우측 상단 및 하단).
도 28.　 claudin -18A1 특이적 항체의 사용
(상단) claudin-18A1 특이적 펩타이드 (SEQ　ID　NO:　115)에 의한 면역화에 의하여 생산된 항체에 의한 위암종 세포 (SNU-16; claudin18A2 양성)의 약한 부재 염색. A-항 E-카드헤린; B-항 claudin-18A1; C-중첩.
(하단) claudin-18A1-GFP 감염된 293T 세포에서의 공동 위치 선정에 의하나의 항체의 특이성 입증. A-GFP-claudin-18A1; B-항 claudin-18A1; C-중첩.
도 29.　 웨스턴 블롯에서의 claudin -18A2의 검출
SEQ　ID　NO:　17를 갖는 에피토프에 대하여 유도된 claudin-18A2 특이적 항체를 갖는 다양한 정상 조직에서 얻은 용해물의 웨스턴 블롯. 1-위; 2-정소; 3-피부; 4-유방; 5-간; 6-결장; 7-폐; 8-신장; 9-림프절.
도 30.　위 및 위 종양에서 얻은 시료의 Claudin -18A2 웨스턴 블롯
SEQ　ID　NO:　17를 갖는 에피토프에 대한 claudin-18A2 특이적 항체를 사용하여 위 및 위 종양에서 얻은 용해물을 블롯팅하고 시험하였다. 위 종양은 덜 글라이코실화된 형태의 claudin-18A2를 나타내었다. 위 분해물을 PNGase F 처리하여 낮은 수준으로 글라이코실화된 형태를 생성하였다.
좌측: 1-위 No #A; 2-위 Tu #A; 3-위 No　#B; 4-위 Tu #B
우측: 1-위 No #A; 2-위 No #B; 3-위 No　#B + PNGase F; 4-위 Tu #C; 5-위 Tu #D; 6-위 Tu #D + PNGase F
도 31.　폐 종양에서의 claudin -18의 발현
도 30의 방법을 따라서, 폐 종양에서 낮은 수준의 글라이코실화 claudin-18A2 변이체를 탐지하였다. 1-위　No; 2-위 Tu; 3-9-폐 Tu.
도 32.　위 종양 조직에서의 claudin -18A2 특이적 항체를 사용하는 면역 조직 화학 분석
도 33.　 claudin -18 특이적 폴리클로날 항혈청을 사용하는 위 특이적 Snu16 세포의 간접 면역형광
A.　면역화 전에 생성된 면역전 혈청에 의한 염색; B.　claudin-18 특이적 혈청에 의한 염색.
도 34.　 SLC13A1 의 정량적 발현
SLC13A1 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　121, 122)를 사용하는 정량적 RT-PCR에 의하여 정상 신장 조직에서의 고도의 선택적 발현이 관찰되며 (A), 신세포 암종에서는 SLC13A1 특이적 발현이 관찰된다 (B). SLC13A1 전사체가 5/8 신세포 암종에서 검출된다.
도 35.　 SLC13A1 의 세포내 위치 선정
SLC13A1-GFP 융합 단백질을 제공하는 플라스미드의 형질 감염 후의 SLC13A1의 세포내 위치 선정을 보여주는 면역 형광. SLC13A1 융합 단백질의 막 결합 형광이 명확하게 관찰된다 (형질 감염 세포 주위에 고리 모양으로서).
도 36.　 CLCA1 의 정량적 발현
CLCA1 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　125, 126)를 사용하는 정량적 RT-PCR에 의하여 정상 결장 조직 및 위 조직에서 고도의 선택적 발현이 관찰되며 (A), 결장 종양 및 위 종양 시료에서 CLCA1 특이적 발현이 관찰된다 (B). CLCA1는 6/12 결장 암종 및 7/10 위 암종에서 검출된다.
도 37.　 FLJ21477 의 정량적 발현
FLJ21477 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　127,　128)를 사용하는 정량적 RT-PCR에 의하여, 정상 결장 및 위 조직에서 고도의 선택적 발현이 관찰되고, 흉선, 식도 및 뇌에서는 약한 발현이 관찰되며 (A), 결장 종양 시료에서는 FLJ21477 특이적 발현이 관찰된다 (B). FLJ21477는 11/12 결장 암종에서 관찰된다.
도 38.　 FLJ20694 의 정량적 발현
FLJ20694 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　129, 130)를 사용하는 정량적 RT-PCR에 의하여, 정상 결장 및 위 조직에서 고도의 선택적 발현이 관찰되며 (A), 걸장 종양 및 위 종양 시료에서는 FLJ20694 특이적 과발현이 관찰된다 (B). FLJ20694는 11/12 결장 암종 및 7/10 위 암종에서 검출된다.
도 39.　 FLJ21458 의 정량적 발현
FLJ21458 특이적 프라이머 (SEQ　ID　NO:　133, 134)를 사용하는 정량적 RT-PCR에 의하여, 정소, 위 및 장 조직에서의 선택적 발현이 관찰된다. 또한, FLJ21458 특이적 전사체가 20/20 결장 종양 및 7/11 결장 전이에서 검출된다. 다음의 정상 조직을 분석하였다: 간, 폐, 림프절, 비장, 부신, 신장, 식도, 난소, 정소, 흉선, 피부, 유방, 췌장, 림프구, 활성화된 림프구, 전립선, 갑상선, 난관, 자궁내막, 소뇌, 뇌.
도 40.　 FLJ21458 특이적 항체를 사용하는 면역 형광
(상단) 293 세포를 FLJ21458-GFP 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드로 형질 감염 시켰다. A:　FLJ21458 특이적 래빗 항혈청 (SEQ　ID　NO:　136에 의하여 면역화됨)에 의한 형질 감염된 융합 단백질의 검출. B:　GFP 형광에 의한 형질 감염된 융합 단백질의 검출. C: A 및 B에서의 두 형광의 중첩. 두 형광이 중첩하는 지점에서 황색이 나타나며, 이는 FLJ21458 항혈청의 특이성을 보여주는 것이다.
(하단) 내인적으로 FLJ21458를 합성하는 Snu16 세포의 분석. A: FLJ21458 특이적 래빗 항혈청 (SEQ　ID　NO:　136에 의하여 면역화)를 사용하는 단백질 검출. B:　막 단백질 E-카드헤린의 검출. C: A 및 B에서의 두 형광의 중첩. 두 형광이 중첩하는 지점에서 황색이 나타나며, 이는 FLJ21458의 막 위치 선정을 보여주는 것이다.
도 41.　서열
본 명세서에서 인용된 서열을 나타낸 것이다.
재료 및 방법
"인실리코(in silico)", "전자적" 및 "가상 클로닝(virtual cloning)"의 용어는 데이터베이스에 기초하는 방법의 사용만을 의미하며, 이는 또한 실험실 실험 과정을 가장하기 위하여 사용될 수도 있다.
다르게 명시되어 있지 않는 한, 모든 다른 단어들 및 발현은 이 기술 분야의 숙련된 기술자가 이해하는 바와 같이 사용된다. 상기한 기술 및 방법은 본래 알려진 방법으로 수행되며, 예컨대, "Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y."에 기재되어 있다. 키트 및 시약의 사용을 포함하는 모든 방법은 제조자의 설명서에 따라서 수행한다.
신규의 종양 관련 유전자를 결정하기 위한 데이터 마이닝법
두 in silico 전략, 즉, GenBank 키워드 검색 및 cDNAxProfiler을 조합하였다. 특정 조직에서 특이적으로 발현한다고 주석이 달린 후보자 유전자에 대하여 GenBank 검색인 "NCBI ENTREZ Search and Retrieval System (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Entrez)"를 수행하였다 (Wheeler et al., Nucleic Acids Research 28:10-14, 2000).
"결장 특이적 유전자", "위 특이적 유전자" 또는 "신장 특이적 유전자"와 같은 키워드를 사용하여 질문을 수행하여, 데이터베이스로부터 후보자 유전자 (GOI, 목적하는 유전자를 추출하였다. 이 검색은 "호모 사피언스", 생물, "mRNA", 분자 유형의 제한의 사용에 의하여 이들 데이터베이스의 전체 정보들 중 일부로 제한되었다.
발견된 GOI의 목록을 동일한 서열에 대하여 상이한 이름을 결정하고, 이러한 잉여성을 제거함으로써 큐레이팅하였다.
키워드 검색에 의하여 얻어진 모든 후보자 유전자를 "전자 노던" (eNorthern) 방법에 의하여 이들의 조직내 분포에 대하여 차례로 연구하였다. eNorthern은 GOI의 서열을 EST (발현된 서열 택) 데이터베이스(Adams et al., Science 252:1651, 1991) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)와 공조시키는 것에 기초한다. 삽입되는 GOI에 상동인 것으로 나타난 각각의 EST의 조직 기원을 결정하고, 이러한 방법으로 모든 EST를 합산하여 GOI의 조직 분포의 예비적 평가를 얻었다. 비 기관 특이적 정상 조직으로부터 얻은 EST에 상동성을 갖지 않는 이들 GOI 만을 사용하여 추가적인 연구를 수행하였다. 이러한 평가에는 또한 공개된 도메인이 잘못 주석이 달린 cDNA 라이브러리를 포함한다는 것을 고려하였다 (Scheurle et al., Cancer Res . 60:4037-4043, 2000) (www.fau.edu/cmbb/publications/cancergenes6.htm).
사용된 두 번째 데이터마이닝 방법은 NCBI Cancer Genome Anatomy Project (http://cgap.nci.nih.gov/Tissues/xProfiler)의 cDNA xProfiler이다 (Hillier et al., Genome Research 6:807-828, 1996; Pennisi, Science 276:1023-1024, 1997). 이는 데이터베이스에 축적된 전사체의 풀이 논리 연산자에 의하여 상호 관련되도록 한다. 혼합된 라이브러리를 제외시키고, 예컨대, 결장으로부터 제작된 모든 발현 라이브러리가 할당된 풀 A를 밝혔다. 결장 이외의 정상 조직으로부터 제작된 모든 cDNA 라이브러리를 풀 B에 할당하였다. 일반적으로, 모든 cDNA 라이브러리를 기본적인 제작 방법과 독립적으로 사용하였고, 1000 이상의 크기를 갖는 것들만 인정하였다. BUT NOT 연산자에 의하여 풀 B를 풀 B로부터 디지털 방식으로 공제하였다. 이러한 방법으로 발견된 GOI 세트에 대하여 eNorthern 연구를 수행하고 문헌 검색에 의하여 확인하였다.
이러한 복합된 데이터마이닝은 공개된 도메인의 약 13,000 개의 전장 유전자 모두를 포함하며, 잠재적 기관 특이적 발현을 갖는 이들 유전자를 예측해낸다.
다른 모든 유전자를 우선 특이적 RT-PCR에 의하여 정상 조직에서 평가하였다. 비 기관 특이적 정상 조직에서 발현되는 것으로 입증된 모든 GOI를 거짓 양성으로 간주하여야 했으며, 추가적인 연구에서 제외시켰다. 남아있는 것들을 광범위하게 다양한 종양 조직의 대규모 패널에서 연구하였다. 하기되는 항원들은 종양 세포에서 활성화되는 것으로 입증되었다.
RNA 추출, 폴리 -d(T) 초회감작 cDNA 의 제작 및 통상적인 RT - PCR 분석
무질서 유발제로서 구아니듐 이소티오시아네이트를 사용하여 천연 조직으로부터 전체 RNA를 추출하였다 (Chomczynski & Sacchi, Anal . Biochem . 162:156-9, 1987). 산성 페놀을 사용하여 추출하고 이소프로판올을 사용하여 침전시킨 후, 상기 RNA를 DEPC 처리수에 용해시켰다.
제조자 설명에 따라서 Superscript II (Invitrogen)를 사용하여, 반응 혼합물 20 μl에서 전체 RNA의 2 내지 4 μg으로부터의 첫 번재 가닥 cDNA 합성을 수행하였다. 프라이머로서 dT(18) 올리고뉴클레오타이드를 사용하였다. cDNA의 통합성 및 질을 30 사이클 PCR (센스 CGTGAGCGCTTCGAGATGTTCCG, 안티센스 CCTAACCAGCTGCCCAACTGTAG, 혼성화 온도: 67℃)에서의 p53 증폭에 의하여 점검하였다.
첫 번째 가닥 cDNA의 저장소를 많은 정상 조직 및 종양 실체로부터 제작하였다. 발현 시험을 위하여, GOI 특이적 프라이머 (하기 참조) 및 HotStarTaq DNA 폴리머라아제 (Qiagen) 1　U를 사용하여, 이들 cDNA 0.5　μl를 반응 혼합물 30 μl에서 증폭시켰다. 각각의 반응 혼합물을 0.3　mM dNTPs, 각각 프라이머 0.3　μM 및 10× 반응 완충액 3　μl를 함유하였다.
상이한 두 개의 엑손에 위치시키기 위하여 프라이머를 선택하고, 거짓 양성 결과에 대한 원인으로서 게놈 DNA를 오염시킴에 의한 간섭의 제거를 주형으로서의 비가역적 전사 DNA를 시험하여 확인하였다. 95 ℃에서 15분 후, HotStarTaq DNA 폴리머라이제를 활성화시키기 위하여, 35 사이클의 PCR를 수행하였다 (94 ℃에서 1분, 특정 혼성화 온도에서 1 분, 72 ℃에서 1 분 및 72 ℃에서 6 분동안 마지막 신장).
이러한 반응물 20　μl를 에티디움 브로마이드 염색 아가로오스 젤 상에서 분획화하고 분석하였다.
다음과 같은 프라이머를 표시된 혼성화 온도에서의 해당하는 항원의 발현 분석에 사용하였다.
GPR35 (65℃)
센스: 5'-AGGTACATGAGCATCAGCCTG-3'
안티센스: 5'-GCAGCAGTTGGCATCTGAGAG-3'
GUCY2C (62℃)
센스: 5'-GCAATAGACATTGCCAAGATG-3'
안티센스: 5'-AACGCTGTTGATTCTCCACAG-3
SCGB3A2 (66℃)
센스: 5'-CAGCCTTTGTAGTTACTCTGC-3'
안티센스: 5'-TGTCACACCAAGTGTGATAGC-3'
Claudin18A2 (68℃)
센스1: 5'-GGTTCGTGGTTTCACTGATTGGGATTGC-3'
안티센스1: 5'-CGGCTTTGTAGTTGGTTTCTTCTGGTG-3'
센스2: 5'- tgttttcaactaccaggggc-3'
안티센스2: 5'- tgttggctttggcagagtcc-3'
Claudin18A1 (64℃)
센스: 5'-gaggcagagttcaggcttcaccga-3'
안티센스: 5'- tgttggctttggcagagtcc-3'
SLC13A1 (64℃)
센스: 5'-CAGATGGTTGTGAGGAGTCTG-3'
안티센스: 5'-CCAGCTTTAACCATGTCAATG-3'
CLCA1 (62℃)
센스: 5'-ACACGAATGGTAGATACAGTG-3'
안티센스: 5'-ATACTTGTGAGCTGTTCCATG-3'
FLJ21477 (68℃)
센스: 5'-ACTGTTACCTTGCATGGACTG-3'
안티센스: 5'-CAATGAGAACACATGGACATG-3'
FLJ20694 (64℃)
센스: 5'-CCATGAAAGCTCCATGTCTA-3'
안티센스: 5'-AGAGATGGCACATATTCTGTC
Ebner (70℃)
센스: 5'-ATCGGCTGAAGTCAAGCATCG-3'
안티센스: 5'-TGGTCAGTGAGGACTCAGCTG-3'
Plunc (55℃)
센스: 5'-TTTCTCTGCTTGATGCACTTG-3'
안티센스: 5'-GTGAGCACTGGGAAGCAGCTC-3'
SLC26A9 (67℃)
센스: 5'-GGCAAATGCTAGAGACGTGA-3'
안티센스: 5'-AGGTGTCCTTCAGCTGCCAAG-3'
THC1005163 (60℃)
센스: 5'-GTTAAGTGCTCTCTGGATTTG-3'
LOC134288 (64℃)
센스: 5'-ATCCTGATTGCTGTGTGCAAG-3'
안티센스: 5'-CTCTTCTAGCTGGTCAACATC-3'
THC943866 (59℃)
센스: 5'-CCAGCAACAACTTACGTGGTC-3'
안티센스: 5'-CCTTTATTCACCCAATCACTC-3'
FLJ21458 (62℃)
센스: 5'-ATTCATGGTTCCAGCAGGGAC-3'
안티센스: 5'-GGGAGACAAAGTCACGTACTC-3'
무작위 헥사머 초기감작 cDNA 의 제작 및 정량적 실시간 PCR
몇 가지 유전자의 발현을 실시간 PCR에 의하여 정량화하였다. 인터컬레이팅 리포터 염색으로서 SYBR Green를 사용하여 PCR 산물을 검출하였다. SYBR Green의 리포터 형광은 용액 내에서는 억제되고, 염색은 이중 가닥 DNA 단편에 결합한 후에야 활성적으로 된다. 각각의 PCR 사이클 후의 GOI 특이적 프라이머를 사용하는 특이적 증폭의 결과로서 SYBR Green 형광의 증가를 정량화에 사용하였다. 표적 유전자의 발현을 절대적으로 정량화하거나 시험될 조직에서 일정한 발현을 나타내는 대조군 유전자의 발현에 대하여 상대적으로 정량화한다. ΔΔ-Ct법 (PE Biosystems, USA)을 사용하여 소위 하우스키핑 유전자의 18s RNA에 대한 시료의 표준화 후에, 발현을 측정하였다. 반응을 이중으로 수행하고, 3배하여 측정하였다. QuantiTect SYBR Green PCR 키트 (Qiagen, Hilden)를 제조자의 설명서에 따라서 사용하였다. 제조자의 설명서에 따라서, 헥사머 프라이머를 사용하는 고성능 cDNA Archive Kit (PE Biosystems, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 희석된 cDNA의 각각의 부분 5 μl를 사용하여 총 부피를 25 μl로 하여 PCR에 사용하였다: 센스 프라이머 300　nM, 안티센스 프라이머 300 nM; 초기 변성은 95℃에서 15분동안; 95℃에서 30초 동안; 30　초동안 어닐링; 72℃에서 30　초; 40 사이클. 사용된 프라이머의 서열은 각각의 실시예에서 나타내었다.
클로닝 및 서열 분석
통상적인 방법에 의하여 전장 유전자 및 유전자 단편의 클로닝을 수행하였다. 서열을 확인하기 위하여, 교정(proofreading) 폴리머라아제 pfu (Stratagene)를 사용하여 대응 항원을 증폭시켰다. PCR의 완료 후, 사용자의 설명에 따라서 단편을 TOPO-TA 벡터 내로 클로닝하기 위하여, HotStarTaq DNA 폴리머라아제에 의하여 엠플리콘의 말단에 아데노신을 결합시켰다. 상업적 용역에 의하여 시퀀싱을 수행하였다. 통상적인 예측 프로그램 및 알고리즘을 사용하여 서열을 분석하였다.
웨스턴 블롯
표적 단백질을 함유할 수 있는 세포 배양물에서 얻은 세포 (표적 단백질을 코딩하는 발현 벡터의 형질 감염 후의 표적 유전자의 내인적 발현 또는 표적 단백질의 합성) 또는 조직 시료를 1% SDS 용액에서 용해시켰다. SDS는 용해물에 존재하는 단백질을 변성시킨다. 실험 혼합물의 용해물을 기대되는 단백질 크기에 따른 8 내지 15% 변성 폴리아크릴아미드 젤 (1% SDS 함유) 상에서의 전기 영동 (SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동, SDS-PAGE)에 의하여 크기별로 분획화한다. 그리고 나서, 반건조 전기 블롯팅법 (Biorad)에 의하여 단백질을 그 표면에 목적하는 단백질이 부착할 수 있는 니트로셀룰로오스 멤브레인(Schleicher & Schull)에 전달시킨다. 이러한 목적을 위하여, 멤브레인을 처음에는 차단 (예컨대, 분유를 사용)시킨 후 1:20 내지 1:200으로 희석하여 60분동안 특이적 항체와 함께 인큐베이팅한다. 세척 단계 후, 멤브레인을 첫 번째 항체를 인지하는 마커 (예컨대, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제 등의 효소)에 결합된 두 번째 항체와 함께 인큐베이팅한다. 추가적인 세척 단계 후, 연속하여 효소 작용 (예컨대, ECL, Amersham Bioscience)에 의하여 멤브레인 상에서의 발색 반응 또는 화학 발광 반응에서 표적단백질을 가시화시킨다. 적합한 카메라를 사용하여 사진 촬영하여 상기 결과를 기록하였다.
단백질 변형의 분석은 일반적으로 웨스턴 블롯에 의하여 수행한다. 수 kDa의 크기를 갖는 글라이코실화는 표적 단백질의 총량을 크게하여 SDS-PAGE에서의 분획화가 가능하다. 특이적 O-글라이코실화 결합 및 N-클라이코실화 결합을 유도하기 위하여, O-글리코시다아제 또는 N-글리코시다아제에 의한 변성 전에 조직 또는 세포에서 얻은 단백질 용해물을 인큐베이팅하였다 (이들 각각의 사용자 설명서에 따라서, 예컨대, PNgase, 엔도글리코시다아제 F, 엔도글리코시다아제 H, Roche Diagnostics). 그리고 나서, 전술한 바와 같이 웨스턴 브라팅을 수행한다. 따라서, 글리코시다아제와 함께 인큐베이팅시킨 후 표적 단백질의 크기 감소가 있는 경우, 특이적 글리코실화를 검출하고, 이러한 방법으로 또한 변형의 종양 특이성을 분석하는 것이 가능하다. 글라이코실화된 아미노산의 정확한 위치는 알고리즘과 예측 프로그램에 의하여 예측딘다.
면역 형광
표적 단백질을 내인적으로 합성하거나 (RT-PCR에서의 RNA의 검출 또는 웨스턴 블롯에 의한 단백질 검출), 또는 IF 전에 플라스미드 DNA로 형질 감염된 확립된 세포주의 세포를 사용할 수 있다. 세포주를 DNA로 형질 감염시키기 위한 매우 다양한 방법들 (예컨대, 전기천공, 리포좀 기재 형질 감염, 인산칼슘 침전)이 잘 확립되어 있다 (예컨대, Lemoine et al. Methods Mol. Biol. 1997; 75: 441-7). 형질 감염된 플라스미드는 면역 형광시에 비변형 단백질을 코딩하거나, 아니면, 다양한 아미노산 마커들을 표적 단백질에 결합시킨다. 가장 중요한 마커로서, 예컨대, 다양한 차별적 형광 형태의 "녹색 형광 단백질" (GFP) 및 고 친화도의 특이적 항체가 이용 가능한 6 내지 12 아미노산의 짧은 펩타이드 서열 등이 있다. 표적 단백질을 합성하는 세포는 파라포름알데히드, 사포닌 또는 메탄올로 고정시킨다. 그리고 나서, 필요한 경우, 세포를 계면 활성제 (예컨대, 0.2% Triton X-100)과 함께 인큐베이팅하여 투과성화(permeabilization) 시킨다. 고정/투과성화 후, 세포를 표적 단백질 또는 결합된 마커 중 하나에 대하여 유도된 일차 항체와 함께 인큐베이팅시킨다. 세척 단계 후, 혼합물을 첫 번째 항체에 결합하는 형광 마커 (예컨대, 플루오레신, Texas Red, Dako)에 결합된 두 번째 항체와 함깨 인큐베이팅시킨다. 그리고 나서, 이러한 방법으로 표지된 세포를 글리세롤 층으로 덮고, 제조자 설명서에 따라서 형광 현미경을 사용하여 분석하였다. 이 경우, 사용되는 물질에 따른 특이적 여기에 의하여 특이적 형광 방출이 달성되었다. 분석에 의하여 확실한 표적 단백질의 위치 선정, 항체의 질 및 표적 단백질을, 표적 단백질 뿐 아니라 결합 아미노산 마커 또는 그 위치 선정이 문헌에 기재되어 있는 다른 마커 단백질을 염색하는 이중 염색에서 정상적으로 확인 가능하게 된다. GFP 및 그의 유도체는, 직접적으로 여기되고 그 자체가 형광을 낼 수 있어서 검출에 어떠하나의 항체도 필요하지 않은 특수한 경우를 보여준다.
면역 조직 화학
IHC는 특이적으로 (1) 종양 또는 정상 조직에서의 표적 단백질 양을 평가할 수 있고, (2) 종양 조직 및 건강한 조직의 얼마나 많은 세포들이 표적 유전자를 합성하는지를 분석하고, 및/또는 (3) 표적 단백질이 검출되는 조직 (종양 세포, 건강한 세포) 내의 세포 유형을 밝히는데 사용된다. 개개의 항체에 따라서 상이한 프로토콜을 사용하여야 한다 (예컨대, "Diagnostic Immunohistochemistry by David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667" 또는 "Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy ISBN: 0306467704").
특이적 조직 시료 상에서의 면역 조직 형광 (IHC)은 대응 조직에서 단백질을 검출하는데 사용된다. 이러한 방법의 목적은 기능적 무손상 조직 응집체에서의 단백질의 위치 선정을 밝히는 것이다. IHC는 특이적으로 (1) 종양 또는 정상 조직에서의 표적 단백질 양을 평가할 수 있고, (2) 종양 조직 및 건강한 조직의 얼마나 많은 세포들이 표적 유전자를 합성하는지를 분석하고, 및/또는 (3) 표적 단백질이 검출되는 조직 (종양 세포, 건강한 세포) 내의 세포 유형을 밝히는데 사용된다. 대안적으로, 표적 유전자의 단백질 양을 디지털 카메라와 적절한 소프트웨어 (예컨대, Tillvision, Till-photonics, Germany)를 사용하는 조직 면역 형광에 의하여 정량화할 수 있다. 이러한 기술은 흔히 공개되어 있으며, 따라서, 염색의 상세 사항 및 현미경 검사법에 대하여, 예컨대, "Diagnostic Immunohistochemistry by David J., MD Dabbs ISBN: 0443065667" 또는 "Microscopy, Immunohistochemistry, and Antigen Retrieval Methods: For Light and Electron Microscopy ISBN: 0306467704"에서 찾을 수 있다. 유효한 결과를 얻기 위해서, 항체의 성질에 따라서 상이한 프로토콜이 사용되어야 한다는 것 (그 일례가 하기됨)을 주의하여야 한다.
보통, 조직학적으로 밝혀진 종양 조직 및 참조로서, 비교 가능한 건강한 조직들이 IHC에 사용된다. 또한, 표적 유전자의 존재가 RT-PCR 분석을 통하여 알려진 양성 및 음성 대조군 세포주를 사용하는 것도 가능하다. 배경 조절은 언제나 포함되어야 한다.
두께가 1 내지 10 ㎛인 고정된 조직 (에컨대, 알데히드 함유 물질, 포름알데히드, 파라포름알데히드 또는 알코올 용액으로 고정) 또는 충격 동결 (shock-frozen) 조직 조각을 유리 지지대에 적용할 수 있다. 파라핀 함입 시료를 예컨대 크실렌으로 탈파라핀화시켰다. 시료를 TBS-T로 세척하고 혈정으로 블로킹하였다. 그리고 나서, 첫 번째 항체 (희석: 1:2 내지 1:2000)과 함께 1 내지 18 시간 동안 인큐베이팅하였으며, 친화성 정제된 항체를 정상적으로 사용하였다. 세척한 후, 약 30 내지 60 분간, 알칼라인 포스파타아제 (또는: 예컨대, 퍼옥시다아제)에 결합된 두 번째 항체와 함께 인큐베이팅하여, 첫 번째 항원에 대하여 유도시켰다. 그리고 나서, 결합된 효소에 의하여 전환되는 발색 물질을 사용하여 발색 반응시켰다 (예컨대, Shi et al., J. Histochem. Cytochem. 39: 741-748, 1991; Shin et al., Lab. Invest. 64: 693-702, 1991 참조). 항체 특이성을 나타내기 위하여, 면역원을 미리 첨하가여 반응을 블로킹할 수 있다.
면역화
(Monoclonal Antibodies: A Practical Approach by Philip Shepherd, Christopher Dean isbn 0-19-963722-9; Antibodies: A Laboratory Manual by Ed Harlow, David Lane ISBN: 0879693142; Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow ISBN: 0879695447 참조).
항체 제조 방법을 하기에 간단하게 기술할 것이며, 상세한 내용은 인용 간행물에서 찾을 수 있다. 우선, 동물 (예컨대, 래빗)을 전술한 표적 단백질의 1차 주입에 의하여 면역화시킨다. 면역원에 대한 동물의 면역 반응은 정해진 기간 (선행 면역화 후 약 2 내지 4주) 내에 2차 또는 3차 면역화시킴으로써 강화시킬 수 있다. 다시 다양한 소정의 기간 (첫 번째 출혈이 4 주 후에 있는 경우, 매 2주 마다 5 이하로 샘플링) 후에, 동물로부터 채혈하고, 이로부터 면역 혈청을 얻는다.
일반적으로, 잘 확립된 4 가지 방법 중 한 가지에 의하여 동물을 면역화시키며, 다른 방법들 또한 사용 가능하다. 또한, 표적 단백질에 특이적인 펩타이드, 완전 단백질, 또는 실험실적으로 또는 예측 프로그램을 통하여 동정 가능한 세포외 부분 서열을 사용하여 면역화시키는 것도 가능하다.
(1) 첫 번째 경우, KLH (keyhole limpet hemocyanin)에 접합된 펩타이드 (길이: 8-12 아미노산)을 표준화된 시험관내 방법에 의하여 합성하고, 이들 펩타이드를 면역화에 사용한다. 일반적으로, 5-1000 ㎍/면역화 농도를 사용하여 3 면역화를 수행한다. 면역화는 또한 용역 제공자의 용역으로서 수행할 수도 있다.
(2) 대안적으로, 재조합 단백질을 사용하여 면역화를 수행할 수 있다. 이러한 목적을 위하여, 표적 유전자의 클로닝된 DNA를 발현 벡터에 클로닝시키고, 특정 제조기(예컨대, Roche Diagnostics, Invitrogen, Clontech, Qiagen)의 조건과 유사하게 하여, 예컨대, 무세포 (in vitro), 박테리아 (예컨대, E. coli), 효모 (예컨대, S. pombe), 곤충 세포 또는 포유류 세포에서 표적 단백질을 합성한다. 상기 시스템 중 하나에서 합성 후, 표적 단백질을 정제하고, 이 경우 정제는 일반적으로 표준화 크로마토 그래피법에 의하여 수행된다. 이와 관련하여, 정제를 보조하기 위하여 분자 앵커 (molecular anchor)를 갖는 면역화 단백질을 사용하는 것도 가능하다 (예컨대, His tag, Qiagen; FLAG tag, Roche Diagnostics; Gst fusion proteins). 예컨대, “Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd., Wiley Interscience"에서 많은 프로토콜을 찾을 수 있다.
(3) 목적하는 단백질을 내인적으로 합성하는 세포주를 이용 가능한 경우, 상기 세포주를 사용하여 특이적 항혈청을 생산할 수 있다. 이러한 경우, 각각 약 1 내지 5×107 세포의 양으로 1 내지 3 차례 주사하여 면역화를 수행할 수 있다.
(4) 또한 DNA의 주입에 의하여 면역화를 수행할 수 있다 (DNA 면역화). 이를 위하여, 우선 표적 유전자를 발현 벡터에 클로닝하여 표적 서열을 강력한 진핵 세포 프로모터(예컨대, CMV 프로모터)의 조절 하에 두도록 한다. 이어서, "유전자총"을 사용하여 DNA 5 내지 100 μg을 면역원으로서 생물체 (예컨대, 마우스, 래빗) 내의 강한 혈류를 갖는 모세혈관 부위로 전달한다. 전달된 DNA은 동물 세포에 의하여 흡수되며, 표적 유전자가 발현되고, 최종적으로 동물은 표적 유전자에 대한 면역 반응을 발달시킨다 (Jung et al., Mol Cells 12:41-49, 2001; Kasinrerk et al., Hybrid Hybridomics 21:287-293, 2002).
*폴리클로날 혈청 또는 항체의 특질 제어
특이성을 증명하기에 가장 적합한 분석법은 연속하는 웨스턴 블롯에 의한 세포 배양에 기초하는 분석법이다 (다양한 변이체들이, 예컨대, “Current Protocols in Protein Chemistry”, John Wiley & Sons Ltd., Wiley InterScience에 기재되어 있음). 예시를 위하여, 세포를 강력한 진핵 세포 프로모터 (예컨대, 사이토메갈로바이러스 프로모터)의 조절 하의 표적 단백질에 대한 cDNA로 형질 감염 시킨다. DNA를 사용하여 세포주를 형질 감염시키는 매우 다양한 방법들 (예컨대, 전기 천공, 리포좀 기재 형질 감염, 인산칼슘 침전)이 잘 확립되어 있다 (예컨대, Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75:441-7, 1997). 대안적으로, 표적 세포를 내인적으로 발현 (표적 유전자 특이적 RT-PCR에 의하여 입증됨)시키는 세포주를 사용하는 것 또한 가능하다. 대조군으로서, 이상적인 경우, 분석된 항체의 특이성을 다음의 웨스턴 블롯에서 증명하기 위하여, 상동 유전자를 또한 실험에서 형질 감염시킬 수 있다.
후속하는 웨스턴 블롯에 있어서, 표적 단백질을 함유하는 세포 배양물 또는 조직 시료로부터 얻은 세포를 1% SDS 용액에서 용해시키고, 이에 의해서 단백질을 변성시킨다. 용해물을 8 내지 15% 변성 폴리아크릴아미드 젤 (1% SDS 함유) (SDS 폴리아크릴아미드 젤 전기 영동, SDS-PAGE) 상에서의 전기 영동에 의하여 크기에 따라 분획화하였다. 그리고 나서, 다수의 블롯팅법(예컨대, 반건조 일렉트로블롯; Biorad) 중 하나에 의하여 단백질을 특정 멤브레인(예컨대, 니트로셀룰로오스, Schleicher & Schull)에 전달시킨다. 목적하는 단백질을 멤브레인 상에서 가시화시킬 수 있다. 이를 위하여, 우선 멤브레인을 표적 단백질 (항체의 특이성에 따라서 약 1:20 내지 1:200으로 희석)을 인지하는 항체와 함께 60분간 인큐베이팅한다. 세척 후, 멤브레인을 마커 (예컨대, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 프로파타아제 등의 효소)에 결합되어 있고 첫 번째 항체를 인지하는 두 번째 항체와 함께 인큐베이팅한다. 그리고 나서, 발색 반응 또는 화학 발광 반응을 통하여 표적 단백질을 멤브레인(예컨대, ECL, Amersham Bioscience) 상에 가시화시키는 것이 가능하다. 표적 단백질에 대하여 고도의 특이성을 갖는 항체는, 이상적인 경우, 목적하는 단백질 자체만을 인지하여야 한다.
인실리코 접근에 의하여 동정된 표적 단백질의 멤브레인에서의 위치 선정을 확인하기 위하여 다양한 방법을 사용한다. 전술하나의 항체를 사용하는 중요하고 잘 확립된 방법은 면역 형광법 (IF)이다. 표적 단백질 (RT-PCR에서의 RNA 검출 또는 웨스턴 블롯에서의 단백질 검출)를 합성하거나, 아니면, 플라스미드 DNA로 형질 감염되어 있는 확립된 세포주의 세포들이 이를 위하여 사용된다. DNA를 사용하여 세포주를 형질 감염시키기 위한 매우 다양한 방법들 (예컨대, 전기 천공, 리포좀 기재 형질 감염, 인산칼슘 침전)이 확립되어 있다 (예컨대, Lemoine et al., Methods Mol. Biol. 75:441-7, 1997). 세포 내로 형질 감염된 플라스미드는 면역형광에서 비변형 단백질을 코딩하거나 또는 다양한 아미노산 마커를 표적 단백질에 결합시킬 수 있다. 주요한 마커는, 예컨대, 다양한 특이적 형광 형태의 형광성 "녹색 형광 단백질" (GFP), 고친화성 및 특이성 항체가 사용 가능한 6-12 아미노산의 짧은 펩타이드 서열, 또는 시스테인 특이적 형광 물질 (Invitrogen)을 통하여 결합할 수 있는 짧은 아미노산 서열 Cys-Cys-X-X-Cys-Cys 등이 있다. 표적 단백질을 합성하는 세포는, 예컨대, 파라포름알데히드 또는 메탄올에 의하여 고정된다. 그리고 나서, 필요한 경우, 세포를 계면 활성제 (예컨대, 0.2% Triton X-100)와 함께 인큐베이팅하여 투과성 있게 만든다. 그리고 나서, 세포를 표적 단백질 또는 결합된 마커 중 하나에 대하여 유도된 일차 항체와 함께 인큐베이팅한다. 세척 후, 혼합물을 형광 마커 (예컨대, 플루오레오신, Texas Red, Dako)에 결합하고, 일차 항체에 결합하는 이차 항체와 함께 인큐베이팅한다. 세포를 이러한 방법으로 표지한 후, 글리세롤 층으로 덮고 제조자 설명에 따라서 형광 현미경을 사용하여 분석한다. 이 경우, 사용된 물질에 따른 특이적 여기에 의하여 특이적 형광 방출이 얻어진다. 이러한 분석은 일반적으로 표적 단백질의 확실한 위치 선정, 항체의 특질 및 표적 단백질을 표적 단백질 뿐 아니라, 결합된 아미노산 마커 또는 그 위치 선정이 이미 문헌에 기재되어 있는 다른 마커 단백질도 염색하는 이중 염색에서 확인할 수 있도록 한다. GFP와 그의 유도체는 직접 여기 가능하고 자체적으로 형광을 낼 수 있는 특이한 경우를 보여준다. 계면 활성제의 사용에 의하여 제어 가능한 막투과성에 의하여 면역원성 에피토프가 세포 내부에 위치하는지 외부에 위치하는지를 면역 형광을 통하여 나타내는 것이 가능하다. 따라서, 선택된 단백질의 예측은 실험적으로 지지될 수 있다. 대안적인 가능성은 유동 세포 분석에 의하여 세포외 도메인을 탐지하는 것이다. 이를 위하여, 세포를 비투과적 조건 하에서 고정시키고 (예컨대, PBS/Na 아지드/2% FCS/5 mM EDTA를 사용), 사용자 설명서에 따라서 유동 세포 분석기에서 분석한다. 세포외 에피토프만이 이 방법에 의하여 분석되는 항체에 의하여 인지될 수 있다. 면역 형광과의 차이점은 예컨대, 요오드화프로피듐 또는 트립판 블루를 사용함으로써 사멸 세포와 생존 세포를 구별할 수 있어서, 거짓 양성 결과를 피할 수 있다는 것이다.
친화 정제
계약 업체에 의하여 제공되는 바에 따라, 완전한 펩타이드 항체인 경우 또는 부분적으로 재조합 단백질에 대하나의 항체인 경우에 폴리클로날 혈청의 정제를 수행하였다. 이를 위하여, 두 경우 모두에 있어서, 적절한 펩타이드 또는 재조합 단백질을 기질에 공유적으로 결합시키고, 후자의 경우, 결합 후 음성 완충액 (PBS: 인산 완충 식염수)으로 평형화시킨 후, 미정제 혈청과 함께 인큐베이팅하였다. 추가적인 PBS 세척 후, 항체를 pH 2.7의 100 mM 글리신으로 용출시키고, 용출액을 즉시 pH 8의 2M TRIS에서 중성화시켰다. 그리고 나서, 이러한 방법으로 정제된 항체를 웨스턴 블롯 및 면역 형광 모두에 의한 표적 단백질의 특이적 검출에 사용할 수 있다.
EGFP 형질 감염체의 제작
이종적으로 발현된 종양 관련 항원의 면역 형광 현미경법에 있어서, 항원의 완전 ORF을 pEGFP-C1 및 pEGFP-N3 벡터 (Clontech)에 클로닝하였다. 슬라이드 상에서 배양된 CHO 세포 및 NIH3T3 세포를 Fugene 형질 감염 시약 (Roche)을 제조자 설명에 따라 사용하여 적절한 플라스미드 구조체로 형질 감염시키고, 12 내지 24시간 후, 면역 형광 현미경법에 의하여 분석하였다.
실시예 1: 진단 및 치료 암 표적으로서 GPR35 의 동정
GPR35 (서열 번호 1) 및 이의 번역 산물 (서열 번호 9)가 추정 G 단백질 결합 수용체로서 기재되어 있다. 이 서열은 Genbank에 accession No. AF089087로 공개된다. 이 전사체는 분자량이 34 kDa인 309 아미노산의 단백질을 코딩한다. GPR35은 7 개의 막통과 도메인을 갖는 G 단백질 결합 수용체의 상과(superfamily)에 속한다고 예측되었다 (O’Dowd et al., Genomics 47:310-13, 1998). GPR35의 세포내의 예측된 위치 선정을 확인하기 위하여, 단백질을 리포터 분자로서의 eGFP에 융합시키고, 적절한 플라스미드로 형질 감염시킨 후, 293 세포에서 이종적으로 발현시켰다. 그리고 나서, 형광 형미경에서 위치 선정을 분석하였다. 본 발명에 있어서, GPR35는 통합 막통과 단백질 (도 17)임이 확인되었다. 인간 GPR35에 대한 현재까지의 연구는 (그 중에서도, Horikawa Y, Oda N, Cox NJ, Li X, Orho-Melander M, Hara M, Hinokio Y, Lindner TH, Mashima H, Schwarz PE, del Bosque-Plata L, Horikawa Y, Oda Y, Yoshiuchi I, Colilla S, Polonsky KS, Wei S, Concannon P, Iwasaki N, Schulze J, Baier LJ, Bogardus C, Groop L, Boerwinkle E, Hanis CL, Bell GI Nat Genet. 2000 Oct; 26(2): 163-75 참조), GPR35이 많은 건강한 조직에서 활성화된다고 제안하였다. 유전자의 리딩 프레임은 하나의 엑손을 포함한다. 본 발명에 있어서, GPR35에 대한 유전자 특이적 프라이머 쌍 (서열 번호 20, 21)을 RT-PCR 분석에 사용하여 결장 및 결장 암종 (13/26)의 cDNA를 증폭시켰다. 이와 대조적으로, 다른 정상 조직에서는 어떠한 의미있는 발현도 관찰되지 않았다. GPR이 단일 엑손으로 구성되어 있다는 특수한 사실 때문에, 인트론 스패닝(spanning) 프라이머를 사용하여 게놈 DNA의 불순물을 검출할 수 없다. 따라서, RNA 시료의 게놈 오염 방지를 위하여, 모든 RNA를 DNAse로 처리하였다. 본 발명에 있어서, DNA 프리 RNA를 사용하여, 결장, 직장, 정소 및 결장 암종에서만 GPR35 전사체가 검출되었다.
[표 1]
Figure pat00001
정상 결장 조직 및 결장 암종 생검물 (도 1)에서의 GPR35 전사체의 선택적이고 높은 수준의 발현은 이전에 알려진 바 없으며, 본 발명에 있어서, 혈청 및 골수에서의 종양 세포의 전염 및 다른 조직에서의 전이를 검출하기 위하여 RT-PCR 등의 분자 진단 방법으로서 사용할 수 있다. 특이적 프라이머 (서열 번호 88 및 89)을 사용하는 정량적 RT-PCR에 의하여, GPR35이 고도로 선택적이고, 또한 장 종양 및 장 종양 전이에도 또한 포함된, 장 특이적 분화 항원임을 확인하였다. 몇 가지 장 종양에 있어서, 정상 장과 비교할 때 1 log 만큼 사실상 과발현한다 (도 18). GPR35 단백질 검출을 위하여 래빗을 면역화하여 항체를 생산하였다. 이들 항체를 증식시키기 위하여 다음의 펩타이드를 사용하였다:
서열 번호 90: GSSDLTWPPAIKLGC (AA 9-23)
서열 번호 91: DRYVAVRHPLRARGLR (AA 112-127)
서열 번호 92: VAPRAKAHKSQDSLC (C 말단)
서열 번호 93: CFRSTRHNFNSMR (세포외 도메인 2)
예컨대, 웨스턴 블롯에서 이들 항체를 사용하는 염색에 의하여 종양의 발현을 확인한다. 본 발명에 있어서, 모든 4 개의 세포외 도메인 [서열 번호 9 서열 내의 예측되는 세포외 도메인 자리 AA 1-22 (서열 번호 94); AA 81-94 (서열 번호 95); AA 156-176 (서열 번호 96); AA 280-309 (서열 번호 97)]을 모노클로날 항체의 표적 구조물로서 사용할 수 있다. 이들 항체는 종양 세포의 세포 표면에 특이적으로 결합하며, 진단 및 치료 방법에 사용 가능하다. 종양에서의 GPR35의 과발현은 이러한 용도를 추가적으로 지지한다. 또한, 본 발명의 단백질 코딩 서열은 종양 특이적 면역 반응 (T-세포 및 B-세포 매개 면역 반응)을 유도하기 위한 백신 (RNA, DNA, 펩타이드, 단백질)으로서 사용할 수 있다. 또한, 놀랍게도, 일반적으로 알려진 개시 코돈 앞의 5'부위에 또 다른 개시 코돈이 존재하여 N-말단 확장 단백질을 발현한다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기에서 보편적으로 발현되는 것으로 기재된 단백질인 GPR35이 위장 종양, 특히 결장 종양에서 선택적으로 종양과 관련하여 과발현되는 것으로 나타났다. 따라서, GPR35는 특히 이들 종양의 진단 및 치료를 위한 표적 분자 구조체로서 적합하다. 인간 GPR35에 대한 현재까지의 연구 (예컨대, Horikawa Y, Oda N, Cox NJ, Li X, Orho-Melander M, Hara M, Hinokio Y, Lindner TH, Mashima H, Schwarz PE, del Bosque-Plata L, Horikawa Y, Oda Y, Yoshiuchi I, Colilla S, Polonsky KS, Wei S, Concannon P, Iwasaki N, Schulze J, Baier LJ, Bogardus C, Groop L, Boerwinkle E, Hanis CL, Bell GI Nat Genet. 2000 Oct;26(2):163-75 참조)에서는, GPR35는 많은 건강한 조직에서 활성화된다고 제안되었다. 대조적으로, 본 발명에 따른 연구 결과, GPR35는 놀랍게도 대부분의 정상 조직에서는 의미있게 검출되지 않는 반면, 일차 종양 및 전이 종양에서 고도로 활성화되는 것으로 나타났다. 또한, 전술된 GPR35 서열 이외에도, 본 발명에 따르면, 대체적 개시 코돈을 사용하는 신규한 번역 변이체가 발견되었다 (서열 번호 10).
GPR35는, 매우 큰 단백질 계통이며 그 구조와 기능이 매우 잘 조사되어 있는, G 결합 수용체 (GPCR) 군의 일원이다. GPCR은, 필요한 방법 (예컨대, 수용체 발현, 정제, 리간드 스크리닝, 돌연변이 유발화, 작용 억제, 길항제 및 제제의 선택, 리간드의 방사성 표지 등)이 매우 잘 개발되어 있고 예컨대, "G Protein-Coupled Receptors, Tatsuya Haga, Gabriel Berstein and Gabriel Bernstein ISBN: 0849333849"와 "Identification and Expression of G-Protein Coupled Receptors Receptor Biochemistry and Methodology, Kevin R. Lynch ASIN: 0471183105"에 상세하게 기재되어 있기 때문에, 약학적 활성 물질의 개발을 위한 표적 구조체로서 매우 적합하다. 본 발명에 따르면, GPR35는 대부분의 건강한 조직에서는 검출되지 않지만, 세포 표면 상에서 종양 관련 발현을 거쳐서, 예컨대, 약학적 활성 리간드, 특히, 예컨대 약학 물질로서 방사성 분자와 복합되어 있는 종양 관련 표적 구조물로서 사용가능하게 된다는 것을 인식하였다. 특정 구체예에서, 종양 세포의 검출 또는 생체내 결장 종양의 치료를 위하여 GPR35에 결합하는 방사성 표지된 리간드를 사용하는 것이 가능하다.
실시예 2: 간 및 난소 종양에서의 GUCY2C 및 진단 및 치료적 암 표적으로서의 신규한 GUCY2C 스플라이스 변이체의 동정
구아닐화 시클라아제 2C (서열 번호 2; 번역 산물: 서열 번호 11) - 유형 I 막통과 단백질 - 나트륨 배설(natriuretic) 펩타이드 수용체 계통에 속한다. 이 서열은 Genbank에 accession number NM_004963로 공개된다. 펩타이드 구아닐린 및 유로구아닐린(uroguanylin) 또는 그 밖의 열 안정 장독소 (STa)의 결합에 의하여 세포내 cGMP 농도가 증가하여, 세포 내의 신호 전달(signal transduction)이 유도된다.
최근의 연구들은 GUCY2C의 발현 역시 예컨대, 위 및 식도의 일차 및 전이 샘암종 (adenocarcinomas) 등의 장외 부위로 확장된다는 것을 보여준다 (Park et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 11: 739-44, 2002). 장의 정상 조직 및 형질전환 조직 모두에서 발견되는 GUCYC의 스플라이스 변이체는 엑손 1에서의 142 bp 결손을 포함하여, GUCY2C 유사 산물의 번역을 방해한다 (Pearlman et al., Dig. Dis. Sci. 45:298-05, 2000). 현재까지 기재된 스플라이스 변이체만이 전사 산물을 발생시키지 않는다.
본 발명의 목적은 진단 및 치료용 모두로 사용 가능한 GUCY2C에 대한 종양 관련 스플라이스 변이체를 동정하는 것이다.
GUCY2C 특이적 프라이머 쌍 (서열 번호 22, 23, 98, 99)을 사용하는 RT-PCR 검사에 의하여, GUCY2C 전사체는 정상 결장 및 위에서 뚜렷하게 발현하고, 간, 정소, 난소, 흉선, 비장, 뇌 및 폐에서는 약하게 발현하는 것으로 나타났다 (표 2, 도 19). 결장 및 위에서의 발현은 모든 정상 조직에서보다 적어도 50 배 이상 높게 나타났다. 표지된 GUCY2C 전사체의 수준을 결장 암종 및 위 암종에서 검출하였다 (표 2). 이들 결과를 정량적 PCR 분석에 의하여 구체화하여 정상 결장, 회장 및 시험된 대부분의 결장 암종 시료에서의 명확한 GUCY2C 발현을 나타내었다 (도 2, 19B). 일부 결장 암종 시료에서 대규모의 과발현이 검출되었다. 또한, 7/10 위 종양에서 발현이 나타났다. 또한, 놀랍게도, 유전자는 전술되지 않은 많은 종양, 그 중에서도 난소, 유방, 간 및 전립선 종양에서 활성화되는 것으로 나타났다 (도 19B, 표 2).
[표 2]
Figure pat00002
다음의 프라이머 쌍을 사용하여 결장 조직 및 결장 암종 조직에서의 스플라이스 변이체를 검출하였다:
GUCY2C-118s/GUCY2C-498as (서열 번호 24, 29);
GUCY2C-621s/GUCY2C-1140as (서열 번호 25, 30);
GUCY2C-1450s/GUCY2C-1790as (서열 번호 26, 31);
GUCY2C-1993s/GUCY2C-2366as (서열 번호 27, 32);
GUCY2C-2717s/GUCY2C-3200as (서열 번호 28, 33);
GUCY2C-118s/GUCY2C-1140as (서열 번호 24, 30);
GUCY2C-621s/GUCY2C-1790as (서열 번호 25, 31);
GUCY2C-1450s/GUCY2C-2366as (서열 번호 26, 32);
GUCY2C-1993s/GUCY2C-3200as (서열 번호 27, 33).
결장 암종 조직에서의 스플라이스 변이체 조사시에, 본 발명에 따라서 3 개의 알려지지 않은 형태가 동정되었다.
a) 단지 111 아미노산 길이를 가지며 위치 111의 아스파라긴이 프롤린으로 대체된 GUCY2C 변이체를 유발하는 엑손 3 (서열 번호 3)의 결실.
b) 258 아미노산 길이의 발현 산물을 생성하는 엑손 6 (서열 번호 4)의 결실. 이는 13 아미노산을 포함하는 C-말단 네오에피토프를 생성시킨다.
c) 1606-1614 위치의 뉴클레오타이드 및 대응 아미노산 L(536), L(537) 및 Q(538)이 결실되어 있는 변이체 (서열 번호5).
본 발명에 따른 각각 엑손 3 및 엑손 6 (서열 번호 3 및 4)에서의 결실을 갖는 스플라이스 변이체를 특히 막통과 도메인을 갖지 않는 번역 산물 (서열 번호 12 및 13)에 의하여 구별시켰다. 엑손 6 결실의 경우 13 아미노산의 C-말단 네오에피토프가 생성되며, 이는 이미 알려진 어떠한 단백질과도 상동성을 나타내지 않는다. 따라서, 이러한 네오에피토프는 면역 치료의 표적 구조물로서 사용될 것으로 결정된 것이다. 본 발명에 따른 1606-1614 위치에서의 염기 결실을 갖는 스플라이스 변이체 (서열 번호 5) 및 그의 번역 산물 (서열 번호 14)도 역시 네오에피토프를 포함한다. GUCY2C 단백질 검출용 항체를 면역화 래빗에 의하여 생산하였다. 다음의 펩타이드를 사용하여 이들 항체를 증식시켰다:
서열 번호 100: HNGSYEISVLMMGNS (AA 31-45)
서열 번호 101: NLPTPPTVENQQRLA (AA 1009-1023)
이러하나의 항체는 원칙적으로 진단 및 치료 목적으로 사용할 수 있다.
특히, 본 발명에 있어서, GUCY2C의 세포외 도메인 [서열 번호 11 서열로부터 예측된 세포외 도메인 위치: AA 454-1073 (서열 번호 102)]을 모노클로날 항체의 표적 구조물로서 사용할 수 있다. 그러나, 구조적 예측은 어느정도 불명확하고, 아직 실험적으로 입증되지 않아서, 대체적인 막 방향을 또한 고려할 수 있다. 이러한 경우, 아미노산 1-431은 세포 외부일 것이고, 모노클로날 항체에 대한 개시점으로서 적합할 것이다. 이러하나의 항체는 종양 세포의 세포 표면에 특이적으로 결합하며, 진단 방법 및 치료 방법에 모두 사용할 수 있다. 특히 결장 종양에서의, GUCY2C의 과발현은 이러한 용도를 추가적으로 지지한다. 본 발명에 따른 단백질 코딩 서열은 또한 종양 특이적 면역 반응 (T-세포 및 B-세포 매개 면역 반응)을 유발하기 위한 백신 (RNA, DNA, 펩타이드, 단백질)로서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, GUCY2C 분자의 세포내 기능에 따라서, 종양 세포에 대한 효소의 기능을 조절하는 물질, 특히 소분자를 개발하는 것이 가능하다. 효소 작용의 산물인, cGMP는 매우 다양한 기능을 갖는 알려진 세포 신호 분자이다 (Tremblay et al. Mol Cell Biochem 230, 31).
실시예 3: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 SCGB3A2 의 동정
SCGB3A2 (서열 번호:6) (번역 산물: 서열 번호:15)는 분비글로빈(secretoglobin) 유전자 패밀리에 속한다. 그 서열은 GenBank에 수탁번호 NM_054023으로 공개된 바 있다. SCGB3A2 (UGRP1)는 폐와 기문에서만 발현되는 호모다이머인 분비 단백질로서 그 크기는 17 kDa이다 (Niimi 외, Am J. Hum Genet 70:718-25, 2002). 프라이머쌍 (서열 번호: 37, 38)을 이용한 RT PCR 연구 결과 정상적인 폐 조직에서 선택적으로 발현되는 것으로 확인되었다. 폐와 기관지에 특이적인 유전자들, 예컨대, 계면활성제 단백질들은 탈분화가 진행되는 동안 악성 종양에서 고도로 하향 조절되어 보통 폐 종양에서는 검출할 수 없다. 놀랍게도 SCGB3A2는 일차 및 전이성 폐종양에서 활성적인 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 따른 연구 결과 SCGB3A2는 기관지 암종에서 빈도높게, 그리고 확실히 발현되는 것으로 나타났다 (도 4). 폐 및 기관지와 별도로 시험된 다른 23가지 정상 조직에서는 발현되지 않았다 (도 20 참조).
이것은 특이 정량적인 RT-PCR (서열 번호: 103, 104)에서도 부가적으로 확인되었는데 (도 20), 이는, 부가적으로 기관지 암종의 50% 이상에서 적어도 1 로그만큼 과발현되는 것으로 나타났다. 정상적인 폐 조직 및 폐 암종 생검에서의 SCGB3A2의 이러한 선별적인 고도 발현은, 본 발명에 따라, 혈액 및 골수, 가래, 기관지 흡인물 또는 위세척에서의 종양 세포의 증식을 검출하기 위한 RT-PCR과 같은 분자 수준의 진단법과 예컨대 국소 림프절과 같은 다른 조직에서의 전이를 검출하는데 이용될 수 있다. 건강한 폐에서, SCGB3A2는 특이화된 세포에 의해 기관지로만 분비된다. 따라서, 건강한 개체에 있어서는 SCGB3A2 단백질이 호흡관 이외의 체액에서는 검출되지 않을 것으로 기대된다. 이와 대조적으로, 특정의 전이성 종양 세포들은 그의 단백질 산물을 혈류 내로 직접 생산한다. 본 발명의 한가지 측면은 따라서 폐종양을 진단 발견하기 위한 특이적인 항체 측정법을 통해 환자의 혈청이나 혈장 중에서 SCGB3A2 산물을 검출하는 것에 관한다.
토끼를 면역화시켜 SCGB3A2 단백질을 검출하기 위하나의 항체를 제조하였다. 다음의 펩타이드들을 사용하여 이들 항체를 증식시켰다.
서열 번호:105: LINKVPLPVDKLAPL
서열 번호:106: SEAVKKLLEALSHLV
SCGB3A2-특이 반응은 면역 형광법으로 검출해낼 수 있다 (도 21). 분비된 단백질의 경우 예상되는 바와 같이, 세포내 SCGB3A2의 분포는 세포질 세망과 분비 과립구에 의해 좌우된다 (도 21A). 특이성을 검토하기 위해, SCGB3A2-GFP 융합 단백질을 합성하는 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 이 경우 자가형광 GFP (녹색 형광 단백질)을 이용하여 단백질을 검출하였다 (도 21B). 두가지 형광 다이아그램을 중복시켜 겹쳐보면 면역 혈청이 SCGB3A2 단백질을 특이적으로 인식한다는 것이 명확히 드러난다 (도 21C).
이러하나의 항체는 본 발명에 따라 예컨대, 진단 및 치료 목적으로 면역분석법 형식으로 이용될 수 있다.
실시예 4: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 claudin -18A1 및 claudin -18A2 스플라이스 변이체의 동정
claudin-18 유전자는 4개의 막통과 도메인과 세포내 N 말단 및 C 말단을 갖는 표면 막 분자를 코딩한다. Niimi와 그의 동료들은 (Mol . Cell . Biol . 21:7380-90, 2001) 쥐와 인간의 claudin-18의 두개의 스플라이스 변이체를 설명하였는데 이들은 폐 조직 (claudin-18A1)과 위장 조직 (claudin-18A2)에서 각각 선택적으로 발현된 것으로 설명된 바 있다. 이들 변이체들은 N 말단을 달리한다 (도 22).
본 발명에 따라 스플라이스 변이체 claudin-18A2 (서열 번호: 7)과 claudin-18A1 (서열 번호: 117), 및 이들의 각각의 번역 산물 (서열 번호:16 및 118)이 종양에 대한 마커나 치료적 표적 구조물로서 어느 정도까지나 이용되는지를 조사하였다. 두개의 변이체를 구별할 수 있는 정량적 PCR을 A1-특이적 (서열 번호:109 & 110) 및 A2-특이적 (서열 번호:107 & 108) 프라이머 쌍을 선택함으로써 수립하였다. A2 스플라이스 변이체를 통상적인 PCR (서열 번호: 39 & 40)에서 제2 프라이머 쌍을 이용하여 부가적으로 시험하였다. A1 변이체는 정상적인 폐에서만 활성적인 것으로 설명된다. 그러나, 본 발명에 따라, 놀랍게도 A1 변이체는 위점막에서도 활성적인 것으로 밝혀졌다. 위 및 폐 만이 유의적인 활성화를 나타내는 정상 조직이다. 다른 모든 정상적인 조직들은 claudin-A1에 대해 음성적이다. 종양을 조사하는 과정에서, 놀랍게도 claudin-A1이 다수의 종양 조직에서 고도로 활성화되는 것으로 발견되었다. 특히 위종양, 폐종양, 췌장 암종, 식도암종 (도 23), ENT 종양 및 전립선 암종에서 강하게 발현된다. ENT, 전립선, 췌장 및 식도 종양에서의 claudin-A1 발현 수준은 대응하는 정상 조직에서의 발현 수준의 100 내지 10,000배 더 높다. claudin-A2 스플라이스 변이체를 조사하는데 사용된 올리고뉴클레오타이드는 이러한 전사물을 특이적으로 증폭시킬 수 있다 (서열 번호:39 & 40 및 107 & 108). 조사 결과 A2 스플라이스 변이체는 위점막 이외의 조사된 20개 이상의 정상 조직에서는 전혀 발현되지 않고, 정소 조직에서는 낮은 정도로만 발현된 것으로 나타났다. 본 발명자들은 A2 변이체 역시 A1 변이체와 마찬가지로 많은 종양에서 활성화됨을 발견하였다 (도 24의 예로 설명됨). 이들에는 위종양 (8/10), 췌장 종양 (6/6), 식도암종 (5/10) 및 간 암종이 포함된다. 건강한 폐에서는 비록 claudin-18A2의 활성화가 검출되지 않지만, 놀랍게도 몇몇 폐 종양은 A2.1 스플라이스 변이체를 발현시키는 것으로 나타났다.
[표 3A]
Figure pat00003
[표 3B]
Figure pat00004
독립적인 대조 연구 수단으로서의 통상적인 PCR 역시 정량적 PCR의 결과를 확인해주었다. 이 조사에 이용된 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호:39, 40)은 A2 스플라이스 변이체의 특이적인 증폭을 가능케 한다. 본 발명에 따라 8/10 위암종과 조사된 췌장암종의 절반이 이 스플라이스 변이체를 강력하게 발현시키는 것으로 나타났다 (도 5). 이와 대조적으로, 통상적인 PCR에 의해서는 다른 조직에서의 발현은 검출되지 않았다. 특히, 폐, 간, 혈액, 림프절, 유방 조직 및 신장 조직에서는 발현이 전혀 검색되지 않았다 (표 3).
따라서 본 발명에 따른 스플라이스 변이체들은 상부 위장관의 종양 뿐만 아니라 폐종양, ENT 종양, 전립선암종 및 그의 전이증상에서도 고도로 특이적인 분자 마커가 된다. 이들 분자 마커는 본 발명에 따라 종양 세포를 검출하는데 이용될 수 있다. 본 발명에 따라, 종양은 설명된 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호:39, 40, 107-110)를 이용하여 검출할 수 있다. 특히 적합한 올리고뉴클레오타이드들은 프라이머 쌍의 적어도 하나가 엄격한 조건 하에서 180 염기쌍 길이의 하나의 스플라이스 변이체(서열 번호:8) 또는 다른 스플라이스 변이체(서열번호:119)인 전사 세그먼트에 결합하는 프라이머 쌍이다.
단백질 수준에서 이러한 데이터를 검정하기 위해, 동물을 면역화시킴으로써, claudin에 특이적인 항체와 면역 혈청을 생산하였다. claudin-18의 혈장막 국소화 및 단백질 토폴로지는 바이오인포매틱스 도구 (TMHMM, TMPRED) 및 증강된 GFP로 태그된 claudin-18 융합 단백질을 발현한 세포의 면역 형광 조사를 이용하는 막통과 도메인 분석에 의해 확인되었다. claudin-18은 두개의 세포외 도메인을 갖는다. N-말단 세포외 도메인은 두가지 스플라이스 변이체에 있어서 그 서열을 달리한다 (A1의 경우 서열 번호:111, A2의 경우 서열 번호:112). C-말단 세포외 도메인은 두가지 변이체의 경우 동일하다 (서열 번호:137). 현재까지, claudin-18의 세포외 도메인에 결합하는 항체는 설명된 바 없다. 본 발명에 따라, 세포외에 위치하면서 변이체 A1이나 A2에 특이적이거나 두가지 변이체 모두에서 발생하는 펩타이드 에피토프가 면역화를 위해 선택되었다. claudin-18의 두가지 변이체들은 모두 통상적인 글리코실화 모티프를 갖지 않으며 따라서, 단백질의 글리코실화는 기대되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 에피토프를 선정함에 있어서, 아스파라긴, 세린, 쓰레오닌을 포함하는 에피토프가 통상적인 글리코실화 부위가 없는 경우조차 드물게 잠재적으로 글리코실화되는 것을 고려하였다. 에피토프의 글리코실화는 이 에피토프에 특이적인 항체의 결합을 방지할 수도 있다. 그 중에서도, 생성된 항체가 항원의 글리코실화 상태를 식별할 수 있게 해주도록 본 발명에 따른 에피토프를 선택하였다. 다음의 펩타이드들은 그 중에서도 면역화를 위하나의 항체를 생산하기 위해 선택하였다:
서열 번호:17: DQWSTQDLYN (N-말단 세포외 도메인, A2-특이적, 글리코실화와 독립적으로 결합)
서열 번호:18: NNPVTAVFNYQ (N-말단 세포외 도메인, A2-특이적, 비글리코실화형, N37에 주로 결합)
서열 번호:113: STQDLYNNPVTAVF (N-말단 세포외 도메인, A2-특이적, 비글리코실화형, N37에만 결합)
서열 번호:114: DMWSTQDLYDNP (N-말단 세포외 도메인, A1-특이적)
서열 번호:115: CRPYFTILGLPA (N-말단 세포외 도메인, 주로 A1에 대해 특이적)
서열 번호:116: TNFWMSTANMYTG (C-말단 세포외 도메인, A1 및 A2의 두가지를 모두 인식함)
서열 번호:17에 의한 면역화에 의해 생산된 A2-특이적인 항체에 대한 데이터를 예시를 위해 나타내었다. 면역형광 분석을 위한 다양한 고정화 조건 하에서 특이적인 항체들을 이용할 수 있다. 쉽게 검색할만한 양으로 RT-PCR-양성 및 음성 세포주를 비교 염색하면, 대응하는 단백질이 위암종 세포주에서 양성으로서 특이적으로 검출가능하다 (도 25). 내인성 단백질은 막에 위치하며 비교적 막 상에 비교적 큰 촛점괴(focal aggregates)를 형성한다. 이 항체를 웨스턴 블롯에서 단백질을 검출하는데도 이용하였다. 예상된 바와 같이, 단백질은 위에서만 검출되고 다른 정상 조직에서는 발견되지 않았으며 심지어는 폐에서도 검출되지 않는다 (도 29). 환자들로부터 얻은 위종양 및 인접한 정상적인 위 조직의 비교 염색 결과, 놀랍게도 claudin-18 A2가 이 단백질이 검출된 모든 위종양에서 보다 적은 질량을 갖는 것으로 밝혀졌다 (도 30, 좌측). 본 발명에 따른 일련의 몇가지 실험에서 정상적인 위 조직의 용해물(lysate)를 탈글리코실화제인 PNGase F로 처리한 경우에도 이 수준에서 밴드가 나타난 것으로 발견되었다 (도 30, 우측). A2 변이체의 글리코실화 형태만이 모든 정상적인 위 조직에서 검출가능한데 반하여, A2는 조사된 위암종의 60% 이상에서 검출가능하며, 특히 탈글리코실화 형태로만 그러하다. 비록 claudin-18의 A2 변이체는 단백질 수준으로도 정상적인 폐에서는 검출되지 않지만, 앞서의 정량적 RT-PCR에서와 마찬가지로, 기관지암종에서는 발견된다. 여기서도, 탈글리코실화 변이체만 존재한다 (도 31). claudin-18-A2 스플라이스 변이체의 세포외 도메인을 인식하는 항체들을 본 발명에 따라 제조하였다. 또한, claudin-18-A1 스플라이스 변이체의 N-말단 도메인을 선택적으로 인식하는 항체와(도 28), C-말단 세포외 도메인 대역의 두가지 변이체 모두에 결합하는 항체 (도 27)도 제조하였다. 본 발명에서는 예컨대 면역조직학 (도 32)과 같은 진단 목적에서 뿐만 아니라, 전술한 치료 목적을 위해서도 이러하나의 항체들을 이용할 수 있다. 또 다른 중요한 측면은 claudin-18의 분화적으로 글리코실화된 도메인에 관한 것이다. 비글리코실화 에피토프에만 결합하는 항체들을 본 발명에 따라 제조하였다. claudin-18은 그 자체로 위조직(A2)과 폐 및 위 (A1)에 대해 고도로 선택적인 분화 항원이다. 이것은 종양에서 글리코실화 기구의 변화에 의해 극명하게 영향을 받기 때문에, 특정의 탈그리코실화된 A2의 변이체가 종양에서 생산된다. 이것은 진단학적 및 치료학적으로 이용될 수 있다. 본 명세서에 설명된 것과 같은 면역 혈청 (서열 번호:17에 대한 펩타이드)를 예컨대 웨스턴 블롯에 진단적으로 이용할 수 있다. 예컨대 서열 번호:113 (도 26)의 펩타이드로 면역화시킴으로써 얻어진 글리코실화 에피토프에 전적으로 결합할 수 없는 항체들은, 종양 세포와 정상 세포를 결합에 의해 식별할 수 있다. 특히 이러하나의 항체들은 매우 선택적이기 때문에, 이들을 치료적으로 이용할 수 있다. 생산된 항체들은 키메라 또는 인간화 재조합 항체를 생산하는데도 직접 이용가능하다. 이것은 토끼로부터 얻어진 항체의 경우 직접적으로 이용가능하다 (이것과 관련하여, J Biol Chem. 2000 May 5:275 (18):13668-76, Rader C, Ritter G, Nathan S, Elia M, Gout I, Jungbluth AA, Cohen LS, Welt S, Old LJ, Barbas CF 3판 "The rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation of therapeutic human antibodies" 참조). 이 목적을 위해, 면역화된 동물로부터의 림프구를 보존하였다. 아미노산 1-47 (서열 번호:19 및 20)은 또한 백신 및 항원 특이적인 T 림프구의 인입 전달과 같은 면역치료 방법에 대해서도 특히 우수한 에피토프인 것으로 나타난다.
실시예 5: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 SLC13A1 의 동정
SLC13A1은 황산나트륨 코트랜스포터 패밀리에 속한다. 이 유전자의 마우스 상동체와 대조적으로 사람의 유전자는 신장에서 선택적으로 발현된다 (Lee 외, Genomics 70:354-63). SLC13A1은 595개 아미노산의 단백질을 코딩하며 13개의 잠정적인 막통과 도메인을 갖는다. 또 다른 스플라이싱에 의해 4가지 상이한 전사물 (서열 번호:41-44)과 그의 대응한 번역 산물 (서열 번호:45-48)이 얻어진다. SLC13A1이 신장종양의 마커로서 이용될 수 있는지를 조사하였다. 이 목적을 위해 SLC13A1를 특이적으로 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호:49, 50)를 이용하였다.
[표 4]
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SLC13A1-특이적인 프라이머쌍 (서열 번호:49, 50)을 이용한 RT-PCR 연구 결과 실제로 신장에서의 선택적인 발현이 확인되었으며, 본 발명에 따라 실제로 조사된 모든 (7/8) 신세포 암종 생검에서 고도 발현을 나타내었다 (표 4, 도 6). 특이적인 프라이머 (서열 번호:121, 122)를 이용한 정량적 RT-PCR 역시 이들 데이터를 확인해주었다 (도 34). 다음의 정상 조직들에서는 약한 시그널이 검출되었다: 결장, 위, 정소, 유방, 간 및 뇌. 그러나 신장 암종의 발현은 다른 모든 정상 조직에 비해 적어도 100배 더 높았다.
세포 중의 SLC13A1의 세포하 국소화를 분석하기 위해, 이 단백질을 리포터 분자로서 eGFP에 융합시킨 다음 적절한 플라스미드를 트랜스펙션시킨 후, 293 세포 내에서 이종 발현시켰다. 이어서 형광 현미경 하에서 국소화를 분석하였다. 본 발명의 데이터는 SLC13A1이 인테그럴 막통과 분자라는 것을 극명하게 확인시켜주었다 (도 35).
SLC13A1 단백질을 검출하기 위하나의 항체들을, 토끼를 면역화시킴으로써 제조하였다. 서열 번호:123 및 124의 펩타이드들을 이용하여 이들 항체를 증식시켰다. 이러하나의 항체들은 기본적으로 진단 및 치료 목적을 위해 이용될 수 있다.
SLC13A1 단백질은 13개의 막통과 도메인과 7개의 세포외 대역을 갖는다. 이들 SLC13A1의 세포외 도메인은 특히 본 발명에 따라 모노클로날 항체의 표적 구조로서 이용될 수 있다. SLC13A1은 이온 전달시 채널 단백질로서 관여한다. 건강한 신장의 SLC13A1의 세포외 도메인은 뇨관(관강:luminally)의 방향으로 극 지향된다. 그러나, 치료적으로 사용되는 고분자량의 모노클로날 항체는 뇨관 내로는 분비되지 않기 때문에, 건강한 신장에서는 SLC13A1의 결합이 일어나지 않는다. 이와 대조적으로, SLC13A1의 극성은 종양 세포에서 없어져서, 혈류를 통해 직접적으로 항체 표적을 위한 이 단백질이 이용가능해진다. 신세포 암종에서의 SLC13A1의 현저한 발현 및 높은 빈도로 인해 본 발명에 따른 이 단백질은 진단 및 치료 마커로서 매우 흥미롭다. 본 발명에서 이러한 목적에는 RT-PCR에 의한 혈청, 골수, 뇨에서의 종양 세포의 증식 검출 및 다른 장기에서의 전이 검출이 포함된다. 또한 본 발명에 따른 SLC13A1의 세포외 도메인을 모노클로날 항체를 이용하여 면역 진단 및 치료용 표적 구조로서도 이용할 수 있다. SLC13A1은 또한 본 발명에 따라 종양 특이적인 면역 반응 (T 및 B 세포 매개성 면역 반응)을 유발하기 위한 백신 (RNA, DNA, 단백질, 펩타이드)로서도 이용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 용도에는 SLC13A1의 생물학적 활성을 조절하는 소위 소형 화합물이 포함되며 신장 종양 치료에 이용가능하다.
실시예 6: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 CLCA1 의 동정
CLCA1 (서열 번호:51; 번역 산물: 서열 번호:60)은 Ca++-활성화된 Cl- 채널의 패밀리에 속한다. 이 서열은 GenBank에 수탁번호 NM_001285로서 공개되었다. CLCA1은 소장의 숨겨진(cryptic) 상피와 배상 세포에서만 발현된다 (Gruber 외, Genomics 54:200-14, 1998). CLCA1이 결장 및 위암종의 마커로서 사용될 수 있는지의 여부에 대해 조사가 이루어졌다. CLCA1의 특이적 증식을 가능케 해주는 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호:67, 68)을 이 목적을 위해 사용하였다. 이 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 조사 결과 결장에서의 선택적 발현이 확인되었으며 본 발명에 따라 조사된 결장 (3/7)과 조사된 위암종 샘플 (1/3)에서 고도 발현되는 것으로 나타났다 (도 7). 다른 정상적인 조직들에서는 전혀 발현되지 않거나 단지 아주 약하게만 발현되었다. 이것은 특이 정량적인 RT-PCR (서열 번호:125, 126)을 이용하여 부가적으로 확인되었으며 이 경우 정상 조직에서는 어떠한 발현도 검출되지 않았다 (도 36). 이 실험에서 조사된 종양 샘플 중, 6/12 결장 암종 샘플과 5/10 위암종 샘플이 CLCA1에 대해 양성이었다. 전체적으로 종양에서의 유전자 발현은 조절되지 않는 것으로 나타났다. 매우 강력한 발현 이외에도, CLCA1은 다른 샘플에서 현저하게 하향조절되었다.
이 단백질은 총 2개의 세포외 대역을 비롯하여 4개의 막통과 도메인을 가질 것으로 예측된다. 특히 CLCA1의 이들 세포외 도메인은 본 발명에 따라 모노클로날 항체의 표적 구조로서 이용될 수 있다. 위암종과 결장 암종에서의 CLCA1의 현저한 발현과 높은 빈도로 인해 본 발명에 따른 이 단백질은 진단 및 치료 목적에서 매우 흥미롭다. 이 목적에는 RT-PCR 수단에 의한 혈청, 골수, 뇨 중에서 증식된 종양 세포의 검출과 다른 장기에서의 전이 검출이 포함된다. 또한 본 발명에 따른 CLCA1의 세포외 도메인을 모노클로날 항체를 이용하여 면역 진단 및 치료용 표적 구조로서도 이용할 수 있다. CLCA1은 또한 본 발명에 따라 종양 특이적인 면역 반응 (T 및 B 세포 매개성 면역 반응)을 유발하기 위한 백신 (RNA, DNA, 단백질, 펩타이드)으로서도 이용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 용도에는 CLCA1의 생물학적 활성을 조절하고 위장 종양 치료에 이용가능한 소위 소형 화합물의 개발이 포함된다.
실시예 7: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 FLJ21477 의 동정
FLJ21477 (서열 번호:52)과 그의 예상되는 번역 산물 (서열 번호:61)은 수탁 번호 NM_025153으로 Genbank에 가상적 단백질로서 공개되었다. 이것은 ATPase 활성과 4개의 막통과 도메인을 갖는 인테그랄 막 단백질이므로 특이 항체를 이용한 치료에 적합하다. FLJ21477 특이적 프라이머 (서열 번호:69, 70)를 이용한 RT-PCR 조사 결과 결장에서 선택적으로 발현되었으며, 결장 암종 샘플에서는 부가적으로 다양한 수준으로 발현되었다 (7/12) (도 8). 다른 정상 조직들에서는 발현되지 않았다. 이것은 특이 정량적 RT-PCR에 의해서도 부가적으로 확인되었다 (서열 번호:127, 128). FLJ21477-특이 발현은 결장 (도 37A)과 결장 암종의 11/12에서도 검출가능하였다. 결장 조직에서의 발현 이외에, 위 조직에서도 부가적으로 발현이 검출되었다. 또한, 정량적 RT-PCR 조건하에서, 뇌, 흉선 및 식도에서의 검출가능한 발현은 결장 및 위에 비해 뚜렷하게 더 미약하였다 (도 37A). 뿐만 아니라, 다음의 종양 샘플에서도 FLJ21477-특이 발현을 검출할 수 있었다:위, 췌장, 식도 및 간. 이 단백질은 총 2개의 세포외 대역을 비롯하여 4개의 막통과 도메인을 가질 것으로 예상된다. 특히 FLJ21477의 이들 세포외 도메인은 본 발명에 따라 모노클로날 항체용 표적 구조로서 이용가능하다.
위암종과 결장 암종에서의 FLJ21477의 발현과 높은 빈도로 인해 본 발명에 따른 이 단백질은 진단 및 치료 목적에서 가치가 있다. 이 목적에는 RT-PCR 수단에 의한 혈청, 골수, 뇨 중에서 증식된 종양 세포의 검출과 다른 장기에서의 전이 검출이 포함된다. 또한 본 발명에 따른 FLJ21477의 세포외 도메인을 모노클로날 항체를 이용하여 면역 진단 및 치료용 표적 구조로서도 이용할 수 있다. FLJ21477은 또한 본 발명에 따라 종양 특이적인 면역 반응 (T 및 B 세포 매개성 면역 반응)을 유발하기 위한 백신 (RNA, DNA, 단백질, 펩타이드)로서도 이용할 수 있다.
*실시예 8: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 FLJ20694 의 동정
FLJ20694 (서열 번호:53)과 그의 예상되는 번역 산물 (서열 번호:62)은 수탁 번호 NM_017928로 Genbank에 가상적 단백질로서 공개되었다. 이 단백질은 인테그랄 막통과 분자이며 (막통과 도메인 AA 33-54), 티오레독신 기능을 가질 가능성이 매우 높다. FLJ20694 특이적 프라이머 (서열 번호:71, 72)를 이용한 RT-PCR 조사 결과 결장에서 선택적으로 발현되었으며, 조사된 결장 암종 샘플에서는 부가적으로 다양한 수준으로 발현되었다 (5/9) (도 9). 다른 정상 조직들에서는 발현되지 않았다. 이것은 특이 정량적 RT-PCR에 의해서도 부가적으로 확인되었다 (서열 번호:129, 130). FLJ20694 발현은 결장과 위를 제외한 다른 정상적인 조직에서는 검출되지 않았다 (최초 실험에서는 분석되지 않음). 이 단백질은 세포외 대역을 갖는 하나의 막통과 도메인을 가질 것으로 예상된다. 특히 FLJ20694의 이들 세포외 도메인은 본 발명에 따라 모노클로날 항체용 표적 구조로서 이용가능하다.
또한, 본 발명에 따른 FLJ20694은 또한 본 발명에 따라 종양 특이적인 면역 반응 (T 및 B 세포 매개성 면역 반응)을 유발하기 위한 백신 (RNA, DNA, 단백질, 펩타이드)로서도 이용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 용도에는 FLJ20694의 생물학적 활성을 조절하고 위장 종양 치료에 이용가능한 소위 소형 화합물의 개발이 포함된다.
실시예 9: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 폰 에브너 ( von Ebner's ) 단백질 (c20orf114)의 동정
폰 에브너 단백질 (서열 번호:54)과 그의 번역 산물 (서열 번호:63)은 수탁번호 AF364078로서 Genbank의 코인두 상피 및 상부 기도의 Plunc-관련 단백질로서 공개되었다. 본 발명에서는 폰 에브너 단백질이 폐암종의 마커로서 이용가능한지의 여부에 대해 조사하였다. 폰 에브너 단백질의 특이 증식을 가능케 해주는 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호: 73, 74)를 이 목적에 이용하였다. 이 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 조사 결과 폐와 조사된 폐암종 샘플 (5/10)에서 선택적으로 발현되는 것으로 나타났다 (도 10). 정상적인 조직의 그룹의 경우 위에서도 발현되었다. 다른 정상적인 조직에서는 발현되지 않았다.
실시예 10: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 Plunc 의 동정
Plunc (서열 번호:55)와 그의 번역 산물 (서열 번호:64)는 Genbank에 NM_016583으로서 공개되었다. 사람의 Plunc는 256개의 아미노산 단백질을 코딩하며 쥐의 Plunc 단백질과 72%의 상동성을 나타낸다 (Bingle 및 Bingle, Biochem Biophys Acta 1493:363-7, 2000). Plunc의 발현은 기관지, 상부 기도, 코인두 상피 및 침샘에 국한된다. 본 발명에 따라 Plunc를 폐암종의 마커로서 이용할 수 있는지의 여부에 대해 조사하였다. Plunc의 특이 증식을 가능케 하는 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호:75, 76)를 이 목적에 이용하였다.
이 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 연구 결과 흉선, 폐 및 조사된 폐암종 샘플 (6/10)에서 선택적으로 발현되는 것으로 나타났다 (도 11). 다른 정상 조직에서는 발현되지 않았다.
실시예 11: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 SLC26A9 의 동정
SLC26A9 (서열 번호:56)와 그의 번역 산물 (서열 번호:65)은 Genbank에 수탁번호 NM_134325로서 공개되었다. SLC26A9은 음이온 교환제 패밀리에 속한다. SLC26A9의 발현은 기관지 및 폐의 폐포 상피만으로 국한된다 (Lohi 외, J. Biol. Chem. 277:14246-54, 2002). SLC26A9가 폐암종 마커로서 이용가능한지의 여부에 대하여 조사하였다. 이 목적을 위해 SLC26A9 를 특이 증폭시킬 수 있는 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호:77, 78)를 이용하였다. SLC26A9에 특이적인 프라이머 (서열 번호:77, 78)를 이용한 RT-PCR 조사 결과 폐와 조사된 모든 (13/13) 폐암종 샘플에서 선택적으로 발현되는 것으로 나타났다 (도 12). 갑상선을 제외한 다른 정상 조직에서는, 발현되지 않았다. 서열 번호:131 및 132의 프라이머를 이용한 정량적인 RT-PCR 실험에서 이들 결과를 우선적으로 확인할 수 있었으며, 부가적인 정보를 얻을 수 있었다. 4-5 종양 조직의 수집된 샘플에서 SLC26A9에 특이적인 RNA가 폐, 결장, 췌장 및 위종양에서 고도로 발현된다는 것을 검색할 수 있었다. SLC26A9는 막통과 음이온 전달자의 패밀리이다. 건강한 폐에서는, 이 단백질은 기도 방향으로 관강적으로 (luminally) 지향되어 있기 때문에, 혈액으로부터의 IgG 항체로는 직접 이용할 수 없다. 이와 대조적으로, 이 단백질의 극성은 종양에서는 없어진다. 따라서, 본 발명에 따라, 정의된 종양, 그 중에서도 폐종양, 위암종, 췌장 암종에서 모노클로날 항체를 이용하여 치료 표적으로서 SLC26A9를 지향시킬 수 있다. SLC26A9는 폐, 위, 췌장 및 식도 암종에서 현저하게 고도로 발현되고 빈도가 높기 때문에, 본 발명에 따른 이 단백질은 우수한 진단 및 치료 마커가 된다. 이 목적에는 RT-PCR 수단에 의한 혈청, 골수, 뇨 중에서 증식된 종양 세포의 검출과 다른 장기에서의 전이 검출이 포함된다. 또한 본 발명에 따른 SLC26A9 세포외 도메인을 모노클로날 항체를 이용하여 면역 진단 및 치료용 표적 구조로서도 이용할 수 있다. SLC26A9는 또한 본 발명에 따라 종양 특이적인 면역 반응 (T 및 B 세포 매개성 면역 반응)을 유발하기 위한 백신 (RNA, DNA, 단백질, 펩타이드)로서도 이용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 용도에는 SLC26A9의 생물학적 활성을 조절하고 위장 종양 치료에 이용가능한 소위 소형 화합물의 개발이 포함된다.
실시예 12: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 THC1005163 의 동정
THC1005163(서열 번호:57)은 TIGR 유전자 인덱스로부터 얻어지는 유전자 단편이다. 이 유전자는 3' 대역에서만 정의되며 ORF는 없다. THC1005163에 특이적인 프라이머 (서열 번호:79) 및, 5' 말단에 21개의 특이적인 염기의 특이적 태그를 갖는 올리고 dT18 프라이머를 이용하여 RT-PCR 연구를 수행하였다. 공지 서열과의 상동성을 조사하는 데이터베이스 서치 프로그램을 이용하여 이 태그를 조사하였다. 게놈의 DNA 오염을 방지하기 위해 cDNA 합성에 이 특이적인 프라이머를 우선적으로 이용하였다. 이 프라이머 세트를 이용한 RT-PCR 조사 결과 위, 난소, 폐 및 (5/9) 폐암종 생검물에서 발현되는 것으로 나타났다 (도 13). 다른 정상 조직에서는 발현되지 않았다.
실시예 13: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 LOC134288 의 동정
LOC134288 (서열 번호:58)과 그의 예상되는 번역 산물 (서열 번호:66)은 Genbank에 수탁번호 XM_059703으로서 공개되었다. 본 발명에 따라 LOC134288이 신세포 암종의 마커로서 이용가능한지의 여부에 대하여 조사하였다. LOC134288의 특이 증폭을 가능케 해주는 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호: 80, 81)를 이 목적을 위해 사용하였다. RT-PCR 조사 결과 신장과 조사된 신세포 암종 생검물 (5/8)에서 선택적으로 발현되는 것으로 나타났다 (도 14).
실시예 14: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 THC943866 의 동정
THC943866 (서열 번호:59)는 TIGR 유전자 인덱스로부터 얻어지는 유전자 단편이다. THC943866이 신세포 암종의 마커로서 이용가능한지의 여부에 대하여 조사하였다. THC943866의 특이 증폭을 가능케 해주는 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호: 82, 83)를 이 목적을 위해 사용하였다. THC943866에 특이적인 프라이머 (서열 번호:82, 83)을 이용한 RT-PCR 조사 결과, 신장과 조사된 신세포 암종 생검물 (4/8)에서 선택적으로 발현되는 것으로 나타났다 (도 15).
실시예 15: 진단 및 치료용 암 표적으로서의 FLJ21458 의 동정
FLJ21458 (서열 번호:84)과 그의 예상되는 번역 산물 (서열 번호:85)은 Genbank에 수탁번호 NM_034850으로서 공개되었다. 서열 분석 결과 이 단백질은 부티로필린 패밀리의 새로운 멤버인 것으로 나타났다. 구조를 분석한 결과 이것은 세포외 면역글로불린 도메인을 갖는 1형 막통과 단백질인 것으로 나타났다. FLJ21458의 특이적 증폭을 가능케 해주는 올리고뉴클레오타이드 (서열 번호: 86, 87)을 조사 발현 목적에 이용하였다. FLJ21458에 특이적인 프라이머 (서열 번호: 86, 87)를 이용한 RT-PCR 연구 결과는 결장과 조사된 결장암종 생검물 (7/10)에서 선택적으로 발현된 것을 보여주었다 (도 17, 표 5). 특이적인 프라이머 (서열 번호:133, 134)를 이용한 정량적 RT-PCR 결과도 이 선택적인 발현 프로파일을 확인하여 주었다 (도 39). 또한 이 실험에서는 결장, 및 위, 결장과 맹장 및 정소에서 FLJ21458 위장 특이적으로 검출할 수 있었다. 7/11 결장 전이 샘플 역시 정량적 PCR에서 양성적이었다. FLJ21458에 특이적인 발현은 다른 종양으로까지 확장되었으며, 단백질-특이적 발현은 위, 췌장 및 간 종양에서 검출가능하였다 (표 5). FLJ21458 단백질을 검출하기 위하나의 항체는, 토끼를 면역화시켜 제조하였다. 다음의 펩타이드들을 이용하여 이들 항체를 증식시켰다:
서열 번호:135: QWAVFGPDKPVQAL
서열 번호:136:AKWKGPQGQDLSTDS
FLJ21458에 특이적인 반응은 면역 형광으로 검출가능하였다 (도 40). 이 항체의 특이성을 검토하기 위하여, 293개의 세포를 FLJ21458-GFP 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드로 트랜스펙션시켰다. 특이성은 한편으로는 FLJ21458에 특이적인 항체를 이용한 공동국소화 연구에 의하여, 다른 한편으로는 자가 형광 GFP에 의하여 입증되었다. 두개의 형광 다이아그램을 중복하여 겹치자 면역 혈청이 FLJ21458 단백질을 특이적으로 인식한다는 것 극명하게 나타났다 (도 40a). 이 단백질의 과발현으로 인해, 결과적인 세포 염색이 확산되어 모호한 단백질 국소화는 허용되지 않았다. 이러한 이유로, 위종양에 특이적인 세포주인 Snu16 (FLJ21458를 내인적으로 발현함)을 이용하여 면역형광 실험을 부가적으로 수행하였다 (도 41B). 세포를 FLJ21458에 특이적인 항혈청과 막 단백질 E-cadherin을 인식하는 또 다른 항체로 염색하였다. FLJ21458에 특이적인 항체는 적어도 약하게 세포막을 염색하였기 때문에 이는 FLJ21458가 세포막에 국소화된다는 증거가 된다.
바이오인포매틱스에 기초한 조사 결과 FLJ21458에 의해 코딩된 단백질은 세포 표면 분자를 나타내며 면역글로불린 수퍼분자 도메인을 갖는 것으로 나타났다. 이 표면 분자의 선별적 발현은 이를, 종양 세포의 검출을 위한 진단법의 개발 및 종양 세포의 제거를 위한 치료적 방법을 위한 우수한 표적으로서 만들어준다.
FLJ21458은 위암종과 결장 암종에서 현저하게 발현되고 높은 빈도를 나타내므로 본 발명에 따른 이 단백질은 진단 및 치료용 마커로서 매우 흥미롭다. 본 발명에 따라 여기에는 RT-PCR을 이용한 혈청, 골수, 뇨 중에서 증식된 종양 세포의 검출과 다른 장기에서의 전이 검출이 포함된다. 본 발명에 따른 FLJ21458의 세포외 도메인을 면역 진단을 위한 표적 구조물 및 모노클로날 항체를 사용한 치료에 사용하는 것도 가능하다. FLJ21458은 또한 본 발명에 따라 종양 특이적인 면역 반응 (T 및 B 세포 매개성 면역 반응)을 유발하기 위한 백신 (RNA, DNA, 단백질, 펩타이드)으로서도 이용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 용도에는 FLJ21458의 생물학적 활성을 조절하고 위장 종양 치료에 이용가능한 소위 소형 화합물의 개발이 포함된다.
[표 5]
Figure pat00006
<110> Ganymed Pharmaceuticals AG Sahin Dr., Ugur TURECI DR., Ozlem Koslowski Dr., Michael <120> Genetic Products Differentially Expressed In Tumors And The Use Thereof <130> 342-4PCT <150> DE 102 54 601.0 <151> 2002-11-22 <160> 137 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1875 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 caggccagag tcccagctgt cctggactct gctgtgggga agggctgatg caggtgtgga 60 gtcaaatgtg ggtgcctcct gcagccgggt gccaggaggg gtggaggggc caccctgggc 120 tttgtccggg agcctggtct tcccgtcctt gggctgacag gtgctgctgc ctctgagccc 180 tccctgctaa gagctgtgtg ctgggtaagg ctggtggccc tttgggctcc ctgtccagga 240 tttgtgctct ggagggtagg gcttgctggg ctggggactg gaggggaacg tggagctcct 300 tctgcctcct ttcctgcccc atgacagcag gcagatccca ggagagaaga gctcaggaga 360 tgggaagagg atctgtccag gggttagacc tcaagggtga cttggagttc tttacggcac 420 ccatgctttc tttgaggagt tttgtgtttg tgggtgtggg gtcggggctc acctcctccc 480 acatccctgc ccagaggtgg gcagagtggg ggcagtgcct tgctccccct gctcgctctc 540 tgctgacctc cggctccctg tgctgcccca ggaccatgaa tggcacctac aacacctgtg 600 gctccagcga cctcacctgg cccccagcga tcaagctggg cttctacgcc tacttgggcg 660 tcctgctggt gctaggcctg ctgctcaaca gcctggcgct ctgggtgttc tgctgccgca 720 tgcagcagtg gacggagacc cgcatctaca tgaccaacct ggcggtggcc gacctctgcc 780 tgctgtgcac cttgcccttc gtgctgcact ccctgcgaga cacctcagac acgccgctgt 840 gccagctctc ccagggcatc tacctgacca acaggtacat gagcatcagc ctggtcacgg 900 ccatcgccgt ggaccgctat gtggccgtgc ggcacccgct gcgtgcccgc gggctgcggt 960 cccccaggca ggctgcggcc gtgtgcgcgg tcctctgggt gctggtcatc ggctccctgg 1020 tggctcgctg gctcctgggg attcaggagg gcggcttctg cttcaggagc acccggcaca 1080 atttcaactc catggcgttc ccgctgctgg gattctacct gcccctggcc gtggtggtct 1140 tctgctccct gaaggtggtg actgccctgg cccagaggcc acccaccgac gtggggcagg 1200 cagaggccac ccgcaaggct gcccgcatgg tctgggccaa cctcctggtg ttcgtggtct 1260 gcttcctgcc cctgcacgtg gggctgacag tgcgcctcgc agtgggctgg aacgcctgtg 1320 ccctcctgga gacgatccgt cgcgccctgt acataaccag caagctctca gatgccaact 1380 gctgcctgga cgccatctgc tactactaca tggccaagga gttccaggag gcgtctgcac 1440 tggccgtggc tcccagtgct aaggcccaca aaagccagga ctctctgtgc gtgaccctcg 1500 cctaagaggc gtgctgtggg cgctgtgggc caggtctcgg gggctccggg aggtgctgcc 1560 tgccagggga agctggaacc agtagcaagg agcccgggat cagccctgaa ctcactgtgt 1620 attctcttgg agccttgggt gggcagggac ggcccaggta cctgctctct tgggaagaga 1680 gagggacagg gacaagggca agaggactga ggccagagca aggccaatgt cagagacccc 1740 cgggatgggg cctcacactt gccaccccca gaaccagctc acctggccag agtgggttcc 1800 tgctggccag ggtgcagcct tgatgacacc tgccgctgcc cctcggggct ggaataaaac 1860 tccccaccca gagtc 1875 <210> 2 <211> 3222 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgaagacgt tgctgttgga cttggctttg tggtcactgc tcttccagcc cgggtggctg 60 tcctttagtt cccaggtgag tcagaactgc cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg 120 atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag 180 gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct 240 actttcatgt attcggatgg tctgattcat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt 300 gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca aatgcacaac ggatgggctg tgtcctcata 360 gggccctcat gtacatactc caccttccag atgtaccttg acacagaatt gagctacccc 420 atgatctcag ctggaagttt tggattgtca tgtgactata aagaaacctt aaccaggctg 480 atgtctccag ctagaaagtt gatgtacttc ttggttaact tttggaaaac caacgatctg 540 cccttcaaaa cttattcctg gagcacttcg tatgtttaca agaatggtac agaaactgag 600 gactgtttct ggtaccttaa tgctctggag gctagcgttt cctatttctc ccacgaactc 660 ggctttaagg tggtgttaag acaagataag gagtttcagg atatcttaat ggaccacaac 720 aggaaaagca atgtgattat tatgtgtggt ggtccagagt tcctctacaa gctgaagggt 780 gaccgagcag tggctgaaga cattgtcatt attctagtgg atcttttcaa tgaccagtac 840 ttggaggaca atgtcacagc ccctgactat atgaaaaatg tccttgttct gacgctgtct 900 cctgggaatt cccttctaaa tagctctttc tccaggaatc tatcaccaac aaaacgagac 960 tttgctcttg cctatttgaa tggaatcctg ctctttggac atatgctgaa gatatttctt 1020 gaaaatggag aaaatattac cacccccaaa tttgctcatg ctttcaggaa tctcactttt 1080 gaagggtatg acggtccagt gaccttggat gactgggggg atgttgacag taccatggtg 1140 cttctgtata cctctgtgga caccaagaaa tacaaggttc ttttgaccta tgatacccac 1200 gtaaataaga cctatcctgt ggatatgagc cccacattca cttggaagaa ctctaaactt 1260 cctaatgata ttacaggccg gggccctcag atcctgatga ttgcagtctt caccctcact 1320 ggagctgtgg tgctgctcct gctcgtcgct ctcctgatgc tcagaaaata tagaaaagat 1380 tatgaacttc gtcagaaaaa atggtcccac attcctcctg aaaatatctt tcctctggag 1440 accaatgaga ccaatcatgt tagcctcaag atcgatgatg acaaaagacg agatacaatc 1500 cagagactac gacagtgcaa atacgacaaa aagcgagtga ttctcaaaga tctcaagcac 1560 aatgatggta atttcactga aaaacagaag atagaattga acaagttgct tcagattgac 1620 tattacaacc tgaccaagtt ctacggcaca gtgaaacttg ataccatgat cttcggggtg 1680 atagaatact gtgagagagg atccctccgg gaagttttaa atgacacaat ttcctaccct 1740 gatggcacat tcatggattg ggagtttaag atctctgtct tgtatgacat tgctaaggga 1800 atgtcatatc tgcactccag taagacagaa gtccatggtc gtctgaaatc taccaactgc 1860 gtagtggaca gtagaatggt ggtgaagatc actgattttg gctgcaattc cattttacct 1920 ccaaaaaagg acctgtggac agctccagag cacctccgcc aagccaacat ctctcagaaa 1980 ggagatgtgt acagctatgg gatcatcgca caggagatca ttctgcggaa agaaaccttc 2040 tacactttga 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cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg 120 atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag 180 gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct 240 actttcatgt attcggatgg tctgattcat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt 300 gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca aatgcacaac ggatgggctg tgtcctcata 360 gggccctcat gtacatactc caccttccag atgtaccttg acacagaatt gagctacccc 420 atgatctcag ctggaagttt tggattgtca tgtgactata aagaaacctt aaccaggctg 480 atgtctccag ctagaaagtt gatgtacttc ttggttaact tttggaaaac caacgatctg 540 cccttcaaaa cttattcctg gagcacttcg tatgtttaca agaatggtac agaaactgag 600 gactgtttct ggtaccttaa tgctctggag gctagcgttt cctatttctc ccacgaactc 660 ggctttaagg tggtgttaag acaagataag gagtttcagg atatcttaat ggaccacaac 720 aggaaaagca atgtgaccag tacttggagg acaatgtcac agcccctgac tatatga 777 <210> 5 <211> 3213 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgaagacgt tgctgttgga cttggctttg tggtcactgc tcttccagcc cgggtggctg 60 tcctttagtt cccaggtgag tcagaactgc cacaatggca gctatgaaat cagcgtcctg 120 atgatgggca actcagcctt tgcagagccc ctgaaaaact tggaagatgc ggtgaatgag 180 gggctggaaa tagtgagagg acgtctgcaa aatgctggcc taaatgtgac tgtgaacgct 240 actttcatgt attcggatgg tctgattcat aactcaggcg actgccggag tagcacctgt 300 gaaggcctcg acctactcag gaaaatttca aatgcacaac ggatgggctg tgtcctcata 360 gggccctcat gtacatactc caccttccag atgtaccttg acacagaatt gagctacccc 420 atgatctcag ctggaagttt tggattgtca tgtgactata aagaaacctt aaccaggctg 480 atgtctccag ctagaaagtt gatgtacttc ttggttaact tttggaaaac caacgatctg 540 cccttcaaaa cttattcctg gagcacttcg tatgtttaca agaatggtac agaaactgag 600 gactgtttct ggtaccttaa tgctctggag gctagcgttt cctatttctc ccacgaactc 660 ggctttaagg tggtgttaag acaagataag gagtttcagg atatcttaat ggaccacaac 720 aggaaaagca atgtgattat tatgtgtggt ggtccagagt tcctctacaa gctgaagggt 780 gaccgagcag tggctgaaga cattgtcatt attctagtgg atcttttcaa tgaccagtac 840 ttggaggaca atgtcacagc ccctgactat atgaaaaatg tccttgttct gacgctgtct 900 cctgggaatt cccttctaaa tagctctttc tccaggaatc tatcaccaac aaaacgagac 960 tttgctcttg cctatttgaa tggaatcctg ctctttggac atatgctgaa gatatttctt 1020 gaaaatggag aaaatattac cacccccaaa tttgctcatg ctttcaggaa tctcactttt 1080 gaagggtatg acggtccagt gaccttggat gactgggggg atgttgacag taccatggtg 1140 cttctgtata cctctgtgga caccaagaaa tacaaggttc ttttgaccta tgatacccac 1200 gtaaataaga cctatcctgt ggatatgagc cccacattca cttggaagaa ctctaaactt 1260 cctaatgata ttacaggccg gggccctcag atcctgatga ttgcagtctt caccctcact 1320 ggagctgtgg tgctgctcct gctcgtcgct ctcctgatgc tcagaaaata tagaaaagat 1380 tatgaacttc gtcagaaaaa atggtcccac attcctcctg aaaatatctt tcctctggag 1440 accaatgaga ccaatcatgt tagcctcaag atcgatgatg acaaaagacg agatacaatc 1500 cagagactac gacagtgcaa atacgacaaa aagcgagtga ttctcaaaga tctcaagcac 1560 aatgatggta atttcactga aaaacagaag atagaattga acaagattga ctattacaac 1620 ctgaccaagt tctacggcac agtgaaactt gataccatga tcttcggggt gatagaatac 1680 tgtgagagag gatccctccg ggaagtttta aatgacacaa tttcctaccc tgatggcaca 1740 ttcatggatt gggagtttaa gatctctgtc ttgtatgaca ttgctaaggg aatgtcatat 1800 ctgcactcca gtaagacaga agtccatggt cgtctgaaat ctaccaactg cgtagtggac 1860 agtagaatgg tggtgaagat cactgatttt ggctgcaatt ccattttacc tccaaaaaag 1920 gacctgtgga cagctccaga gcacctccgc caagccaaca tctctcagaa aggagatgtg 1980 tacagctatg ggatcatcgc acaggagatc attctgcgga aagaaacctt ctacactttg 2040 agctgtcggg accggaatga gaagattttc agagtggaaa attccaatgg aatgaaaccc 2100 ttccgcccag atttattctt ggaaacagca gaggaaaaag agctagaagt gtacctactt 2160 gtaaaaaact gttgggagga agatccagaa aagagaccag atttcaaaaa aattgagact 2220 acacttgcca agatatttgg actttttcat gaccaaaaaa atgaaagcta tatggatacc 2280 ttgatccgac gtctacagct atattctcga aacctggaac atctggtaga ggaaaggaca 2340 cagctgtaca aggcagagag ggacagggct gacagactta actttatgtt gcttccaagg 2400 ctagtggtaa agtctctgaa ggagaaaggc tttgtggagc cggaactata tgaggaagtt 2460 acaatctact tcagtgacat tgtaggtttc actactatct gcaaatacag cacccccatg 2520 gaagtggtgg acatgcttaa tgacatctat aagagttttg accacattgt tgatcatcat 2580 gatgtctaca aggtggaaac catcggtgat gcgtacatgg tggctagtgg tttgcctaag 2640 agaaatggca atcggcatgc aatagacatt gccaagatgg ccttggaaat cctcagcttc 2700 atggggacct ttgagctgga gcatcttcct ggcctcccaa tatggattcg cattggagtt 2760 cactctggtc cctgtgctgc tggagttgtg ggaatcaaga tgcctcgtta ttgtctattt 2820 ggagatacgg tcaacacagc ctctaggatg gaatccactg gcctcccttt gagaattcac 2880 gtgagtggct ccaccatagc catcctgaag agaactgagt gccagttcct ttatgaagtg 2940 agaggagaaa catacttaaa gggaagagga aatgagacta cctactggct gactgggatg 3000 aaggaccaga aattcaacct gccaacccct cctactgtgg agaatcaaca gcgtttgcaa 3060 gcagaatttt cagacatgat tgccaactct ttacagaaaa gacaggcagc agggataaga 3120 agccaaaaac ccagacgggt agccagctat aaaaaaggca ctctggaata cttgcagctg 3180 aataccacag acaaggagag cacctatttt taa 3213 <210> 6 <211> 550 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 ggggacactt tgtatggcaa gtggaaccac tggcttggtg gattttgcta gatttttctg 60 atttttaaac tcctgaaaaa tatcccagat aactgtcatg aagctggtaa ctatcttcct 120 gctggtgacc atcagccttt gtagttactc tgctactgcc ttcctcatca acaaagtgcc 180 ccttcctgtt gacaagttgg cacctttacc tctggacaac attcttccct ttatggatcc 240 attaaagctt cttctgaaaa ctctgggcat ttctgttgag caccttgtgg aggggctaag 300 gaagtgtgta aatgagctgg gaccagaggc ttctgaagct gtgaagaaac tgctggaggc 360 gctatcacac ttggtgtgac atcaagataa agagcggagg tggatgggga tggaagatga 420 tgctcctatc ctccctgcct gaaacctgtt ctaccaatta tagatcaaat gccctaaaat 480 gtagtgaccc gtgaaaagga caaataaagc aatgaatact aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 540 aaaaaaaaaa 550 <210> 7 <211> 786 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atggccgtga ctgcctgtca gggcttgggg ttcgtggttt cactgattgg gattgcgggc 60 atcattgctg ccacctgcat ggaccagtgg agcacccaag acttgtacaa caaccccgta 120 acagctgttt tcaactacca ggggctgtgg cgctcctgtg tccgagagag ctctggcttc 180 accgagtgcc ggggctactt caccctgctg gggctgccag ccatgctgca ggcagtgcga 240 gccctgatga tcgtaggcat cgtcctgggt gccattggcc tcctggtatc catctttgcc 300 ctgaaatgca tccgcattgg cagcatggag gactctgcca aagccaacat gacactgacc 360 tccgggatca tgttcattgt ctcaggtctt tgtgcaattg ctggagtgtc tgtgtttgcc 420 aacatgctgg tgactaactt ctggatgtcc acagctaaca tgtacaccgg catgggtggg 480 atggtgcaga ctgttcagac caggtacaca tttggtgcgg ctctgttcgt gggctgggtc 540 gctggaggcc tcacactaat tgggggtgtg atgatgtgca tcgcctgccg gggcctggca 600 ccagaagaaa ccaactacaa agccgtttct tatcatgcct caggccacag tgttgcctac 660 aagcctggag gcttcaaggc cagcactggc tttgggtcca acaccaaaaa caagaagata 720 tacgatggag gtgcccgcac agaggacgag gtacaatctt atccttccaa gcacgactat 780 gtgtaa 786 <210> 8 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 tgcgccacca tggccgtgac tgcctgtcag ggcttggggt tcgtggtttc actgattggg 60 attgcgggca tcattgctgc cacctgcatg gaccagtgga gcacccaaga cttgtacaac 120 aaccccgtaa cagctgtttt caactaccag gggctgtggc gctcctgtgt ccgagagagc 180 180 <210> 9 <211> 309 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Asn Gly Thr Tyr Asn Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Thr Trp Pro 1 5 10 15 Pro Ala Ile Lys Leu Gly Phe Tyr Ala Tyr Leu Gly Val Leu Leu Val 20 25 30 Leu Gly Leu Leu Leu Asn Ser Leu Ala Leu Trp Val Phe Cys Cys Arg 35 40 45 Met Gln Gln Trp Thr Glu Thr Arg Ile Tyr Met Thr Asn Leu Ala Val 50 55 60 Ala Asp Leu Cys Leu Leu Cys Thr Leu Pro Phe Val Leu His Ser Leu 65 70 75 80 Arg Asp Thr Ser Asp Thr Pro Leu Cys Gln Leu Ser Gln Gly Ile Tyr 85 90 95 Leu Thr Asn Arg Tyr Met Ser Ile Ser Leu Val Thr Ala Ile Ala Val 100 105 110 Asp Arg Tyr Val Ala Val Arg His Pro Leu Arg Ala Arg Gly Leu Arg 115 120 125 Ser Pro Arg Gln Ala Ala Ala Val Cys Ala Val Leu Trp Val Leu Val 130 135 140 Ile Gly Ser Leu Val Ala Arg Trp Leu Leu Gly Ile Gln Glu Gly Gly 145 150 155 160 Phe Cys Phe Arg Ser Thr Arg His Asn Phe Asn Ser Met Arg Phe Pro 165 170 175 Leu Leu Gly Phe Tyr Leu Pro Leu Ala Val Val Val Phe Cys Ser Leu 180 185 190 Lys Val Val Thr Ala Leu Ala Gln Arg Pro Pro Thr Asp Val Gly Gln 195 200 205 Ala Glu Ala Thr Arg Lys Ala Ala Arg Met Val Trp Ala Asn Leu Leu 210 215 220 Val Phe Val Val Cys Phe Leu Pro Leu His Val Gly Leu Thr Val Arg 225 230 235 240 Leu Ala Val Gly Trp Asn Ala Cys Ala Leu Leu Glu Thr Ile Arg Arg 245 250 255 Ala Leu Tyr Ile Thr Ser Lys Leu Ser Asp Ala Asn Cys Cys Leu Asp 260 265 270 Ala Ile Cys Tyr Tyr Tyr Met Ala Lys Glu Phe Gln Glu Ala Ser Ala 275 280 285 Leu Ala Val Ala Pro Arg Ala Lys Ala His Lys Ser Gln Asp Ser Leu 290 295 300 Cys Val Thr Leu Ala 305 <210> 10 <211> 394 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Thr Ala Gly Arg Ser Gln Glu Arg Arg Ala Gln Glu Met Gly Arg 1 5 10 15 Gly Ser Val Gln Gly Leu Asp Leu Lys Gly Asp Leu Glu Phe Phe Thr 20 25 30 Ala Pro Met Leu Ser Leu Arg Ser Phe Val Phe Val Gly Val Gly Ser 35 40 45 Gly Leu Thr Ser Ser His Ile Pro Ala Gln Arg Trp Ala Glu Trp Gly 50 55 60 Gln Cys Leu Ala Pro Pro Ala Arg Ser Leu Leu Thr Ser Gly Ser Leu 65 70 75 80 Cys Cys Pro Arg Thr Met Asn Gly Thr Tyr Asn Thr Cys Gly Ser Ser 85 90 95 Asp Leu Thr Trp Pro Pro Ala Ile Lys Leu Gly Phe Tyr Ala Tyr Leu 100 105 110 Gly Val Leu Leu Val Leu Gly Leu Leu Leu Asn Ser Leu Ala Leu Trp 115 120 125 Val Phe Cys Cys Arg Met Gln Gln Trp Thr Glu Thr Arg Ile Tyr Met 130 135 140 Thr Asn Leu Ala Val Ala Asp Leu Cys Leu Leu Cys Thr Leu Pro Phe 145 150 155 160 Val Leu His Ser Leu Arg Asp Thr Ser Asp Thr Pro Leu Cys 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Oligonucleotide <400> 22 gcaatagaca ttgccaagat g 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 23 aacgctgttg attctccaca g 21 <210> 24 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 24 ggatcctcct ttagttccca ggtgagtcag aac 33 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 25 tgctctggag gctagcgttt c 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 26 accaatcatg ttagcctcaa g 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 27 agctatggga tcatcgcaca g 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 28 cctttgagct ggagcatctt c 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 29 ctttctagct ggagacatca g 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 30 caccatggta ctgtcaacat c 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 31 atgtcataca agacagagat c 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 32 tctgccttgt acagctgtgt c 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 33 tctgtggtat tcagctgcaa g 21 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 34 tactcaggaa aatttcacct tg 22 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 35 gaccacaaca ggaaaagcaa tgtgacc 27 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 36 gatagaattg aacaagattg ac 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 37 cagcctttgt agttactctg c 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 38 tgtcacacca agtgtgatag c 21 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 39 ggttcgtggt ttcactgatt gggattgc 28 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 40 cggctttgta gttggtttct tctggtg 27 <210> 41 <211> 3814 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 ctattgaagc cacctgctca ggacaatgaa attcttcagt tacattctgg tttatcgccg 60 atttctcttc gtggttttca ctgtgttggt tttactacct ctgcccatcg tcctccacac 120 caaggaagca gaatgtgcct acacactctt tgtggtcgcc acattttggc tcacagaagc 180 attgcctctg tcggtaacag ctttgctacc tagtttaatg ttacccatgt ttgggatcat 240 gccttctaag aaggtggcat ctgcttattt caaggatttt cacttactgc taattggagt 300 tatctgttta gcaacatcca tagaaaaatg gaatttgcac aagagaattg ctctgaaaat 360 ggtgatgatg gttggtgtaa atcctgcatg gctgacgctg gggttcatga gcagcactgc 420 ctttttgtct atgtggctca gcaacacctc gacggctgcc atggtgatgc ccattgcgga 480 ggctgtagtg cagcagatca tcaatgcaga agcagaggtc gaggccactc agatgactta 540 cttcaacgga tcaaccaacc acggactaga aattgatgaa agtgttaatg gacatgaaat 600 aaatgagagg aaagagaaaa caaaaccagt tccaggatac aataatgata cagggaaaat 660 ttcaagcaag gtggagttgg aaaagaactc aggcatgaga accaaatatc gaacaaagaa 720 gggccacgtg acacgtaaac ttacgtgttt gtgcattgcc tactcttcta ccattggtgg 780 actgacaaca atcactggta cctccaccaa cttgatcttt gcagagtatt tcaatacacg 840 ctatcctgac tgtcgttgcc 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gagcatccat ttgagttgaa ggccacaggg cacaatgagc 2280 tctcccttct accaccagaa agtccctggt caggtctcag gtagtgcggt gtggctcagc 2340 tgggttttta attagcgcat tctctatcca acatttaatt gtttgaaagc ctccatatag 2400 ttagattgtg ctttgtaatt ttgttgttgt tgctctatct tattgtatat gcattgagta 2460 ttaacctgaa tgttttgtta cttaaatatt aaaaacactg ttatcctaca aaaaaaccct 2520 caaaggctga aaataaagaa ggaagatgga gacaccctct gggggtcctc tc 2572 <210> 58 <211> 1324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 58 ctttgcagtg gatgcccttg gcagggtgag cccacaagga gcaatggagc agggcagcgg 60 ccgcttggag gacttccctg tcaatgtgtt ctccgtcact ccttacacac ccagcaccgc 120 tgacatccag gtgtccgatg atgacaaggc gggggccacc ttgctcttct caggcatctt 180 tctgggactg gtggggatca cattcactgt catgggctgg atcaaatacc aaggtgtctc 240 ccactttgaa tggacccagc tccttgggcc cgtcctgctg tcagttgggg tgacattcat 300 cctgattgct gtgtgcaagt tcaaaatgct ctcctgccag ttgtgcaaag aaagtgagga 360 aagggtcccg gactcggaac agacaccagg aggaccatca tttgttttca ctggcatcaa 420 ccaacccatc accttccatg gggccactgt ggtgcagtac atccctcctc 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Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 78 aggtgtcctt cagctgccaa g 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 79 gttaagtgct ctctggattt g 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 80 atcctgattg ctgtgtgcaa g 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 81 ctcttctagc tggtcaacat c 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 82 ccagcaacaa cttacgtggt c 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 83 cctttattca cccaatcact c 21 <210> 84 <211> 2165 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 agaacagcgc agtttgccct ccgctcacgc agagcctctc cgtggcctcc gcaccttgag 60 cattaggcca 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<213> Homo sapiens <400> 106 Ser Glu Ala Val Lys Lys Leu Leu Glu Ala Leu Ser His Leu Val 1 5 10 15 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 107 tgttttcaac taccaggggc 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 108 tgttggcttt ggcagagtcc 20 <210> 109 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 109 gaggcagagt tcaggcttca ccga 24 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 110 tgttggcttt ggcagagtcc 20 <210> 111 <211> 56 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 111 Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val 1 5 10 15 Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln 20 25 30 Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu 35 40 45 Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 50 55 <210> 112 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 112 Asp Gln Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val 1 5 10 15 Phe Asn Tyr Gln Gly Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Glu Ser Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Glu Cys Arg Gly Tyr Phe Thr Leu Leu Gly Leu Pro Ala Met 35 40 45 Leu Gln Ala Val Arg 50 <210> 113 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 113 Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asn Asn Pro Val Thr Ala Val Phe 1 5 10 <210> 114 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 114 Asp Met Trp Ser Thr Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro 1 5 10 <210> 115 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 115 Cys Arg Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala 1 5 10 <210> 116 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 116 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly 1 5 10 <210> 117 <211> 816 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 gccaggatca tgtccaccac cacatgccaa gtggtggcgt tcctcctgtc catcctgggg 60 ctggccggct gcatcgcggc caccgggatg gacatgtgga gcacccagga cctgtacgac 120 aaccccgtca cctccgtgtt ccagtacgaa gggctctgga ggagctgcgt gaggcagagt 180 tcaggcttca ccgaatgcag gccctatttc accatcctgg gacttccagc catgctgcag 240 gcagtgcgag ccctgatgat cgtaggcatc gtcctgggtg ccattggcct cctggtatcc 300 atctttgccc tgaaatgcat ccgcattggc agcatggagg actctgccaa agccaacatg 360 acactgacct ccgggatcat gttcattgtc tcaggtcttt gtgcaattgc tggagtgtct 420 gtgtttgcca acatgctggt gactaacttc tggatgtcca cagctaacat gtacaccggc 480 atgggtggga tggtgcagac tgttcagacc aggtacacat ttggtgcggc tctgttcgtg 540 ggctgggtcg ctggaggcct cacactaatt gggggtgtga tgatgtgcat cgcctgccgg 600 ggcctggcac cagaagaaac caactacaaa gccgtttctt atcatgcctc aggccacagt 660 gttgcctaca agcctggagg cttcaaggcc agcactggct ttgggtccaa caccaaaaac 720 aagaagatat acgatggagg tgcccgcaca gaggacgagg tacaatctta tccttccaag 780 cacgactatg tgtaatgctc taagacctct cagcac 816 <210> 118 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile Leu Gly Leu Pro Ala Met Leu Gln Ala Val Arg 65 70 75 80 Ala Leu Met Ile Val Gly Ile Val Leu Gly Ala Ile Gly Leu Leu Val 85 90 95 Ser Ile Phe Ala Leu Lys Cys Ile Arg Ile Gly Ser Met Glu Asp Ser 100 105 110 Ala Lys Ala Asn Met Thr Leu Thr Ser Gly Ile Met Phe Ile Val Ser 115 120 125 Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gly Val Ser Val Phe Ala Asn Met Leu Val 130 135 140 Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr Gly Met Gly Gly 145 150 155 160 Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly Ala Ala Leu Phe 165 170 175 Val Gly Trp Val Ala Gly Gly Leu Thr Leu Ile Gly Gly Val Met Met 180 185 190 Cys Ile Ala Cys Arg Gly Leu Ala Pro Glu Glu Thr Asn Tyr Lys Ala 195 200 205 Val Ser Tyr His Ala Ser Gly His Ser Val Ala Tyr Lys Pro Gly Gly 210 215 220 Phe Lys Ala Ser Thr Gly Phe Gly Ser Asn Thr Lys Asn Lys Lys Ile 225 230 235 240 Tyr Asp Gly Gly Ala Arg Thr Glu Asp Glu Val Gln Ser Tyr Pro Ser 245 250 255 Lys His Asp Tyr Val 260 <210> 119 <211> 227 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 gccaggatca tgtccaccac cacatgccaa gtggtggcgt tcctcctgtc catcctgggg 60 ctggccggct gcatcgcggc caccgggatg gacatgtgga gcacccagga cctgtacgac 120 aaccccgtca cctccgtgtt ccagtacgaa gggctctgga ggagctgcgt gaggcagagt 180 tcaggcttca ccgaatgcag gccctatttc accatcctgg gacttcc 227 <210> 120 <211> 69 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 120 Met Ser Thr Thr Thr Cys Gln Val Val Ala Phe Leu Leu Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Ala Gly Cys Ile Ala Ala Thr Gly Met Asp Met Trp Ser Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Tyr Asp Asn Pro Val Thr Ser Val Phe Gln Tyr Glu Gly 35 40 45 Leu Trp Arg Ser Cys Val Arg Gln Ser Ser Gly Phe Thr Glu Cys Arg 50 55 60 Pro Tyr Phe Thr Ile 65 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 121 aatgagagga aagagaaaac 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 122 atggtagaag agtaggcaat 20 <210> 123 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 123 Glu Lys Trp Asn Leu His Lys Arg Ile Ala Leu Lys Met Val Cys 1 5 10 15 <210> 124 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 124 Cys Leu Gly Phe Asn Phe Lys Glu Met Phe Lys 1 5 10 <210> 125 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 125 taatgatgaa ccctacactg agc 23 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 126 atggacaaat gccctacctt 20 <210> 127 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 127 agtgctggaa ggatgtgcgt gt 22 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 128 ttgaggtggt tgttgggttt 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 129 agatgtgctg aggctgtaga 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 130 atgaaggttg attatttgag 20 <210> 131 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 131 agccgcatac tcccttaccc tct 23 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 132 gcagcagccc aaacaccaca 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 133 ctgagccgag aggtggaatc 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 134 ctctctcgct tacactggaa 20 <210> 135 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Gln Trp Gln Val Phe Gly Pro Asp Lys Pro Val Gln Ala Leu 1 5 10 <210> 136 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 136 Ala Lys Trp Lys Gly Pro Gln Gly Gln Asp Leu Ser Thr Asp Ser 1 5 10 15 <210> 137 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Asn Met Leu Val Thr Asn Phe Trp Met Ser Thr Ala Asn Met Tyr Thr 1 5 10 15 Gly Met Gly Gly Met Val Gln Thr Val Gln Thr Arg Tyr Thr Phe Gly 20 25 30

Claims (98)

  1. 종양 관련 항원의 발현 또는 활성의 억제하는 작용제를 함유하는 약학 조성물로서, 상기 종양 관련 항원이 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 약학 조성물:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  2. 종양 억제 활성을 갖는 작용제를 함유하는 약학 조성물로서, 종양 관련 항원을 발현하거나 비정상적으로 발현하는 세포에 대하여 선택적이고, 상기 종양 관련 항원이 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 약학 조성물:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  3. 제2항에 있어서, 작용제가 세포 사멸, 세포 증식 감소, 세포막의 손상 도는 사이토카인의 분비를 일으키는 것인 약학 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 작용제가 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 선택적으로 혼성화하는 안티센스 핵산인 약학 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 작용제가 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 항체인 약학 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 작용게가 종양 관련 항원에 선택적으로 결합하는 보체 활성화 항체인 약학 조성물.
  7. 투여시 HLA 분자와 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과의 복합체 양을 선택적으로 증가시키는 작용제를 함유하는 약학 조성물로서, 상기 종양 관련 항원은 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 약학 조성물:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  8. 제7항에 있어서, 작용제가 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 성분을 함유하는 것인 약학 조성물:
    (i) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분,
    (ii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산,
    (iii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 발현하는 숙주 세포, 및
    (iv) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과 HLA 분자 간의 분리된 복합체.
  9. 제1항, 제2항 및 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 작용제가 두 가지 이상의 작용제를 함유하는 것이고, 상기 작용제는 각각의 경우 작용제가 상이한 종양 관련 항원의 발현 또는 활성을 선택적으로 억제하는 것이거나, 각각의 경우 상이한 종양 관련 항원을 발현하는 세포에 대하여 선택적이거나 또는 HLA 분자와 상이한 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과의 복합체 양을 증가시키는 것이고, 다음으로 이루어진 군 중에서 선택되는 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 상기 종양 관련 항원을 한 가지 이상 갖는 것인, 약학 조성물:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  10. 약학 조성물로서, 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 한 가지 이상의 성분을 함유하고:
    (i) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분,
    (ii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산,
    (iii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 항체,
    (iv) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산과 특이적으로 혼성화하는 안티센스 핵산,
    (v) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 발현하는 숙주 세포, 및
    (vi) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과 HLA 분자 간의 분리된 복합체,
    상기 종양 관련 항원이 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 약학 조성물:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  11. 제8항 또는 제10항에 있어서, 핵산 (ii)가 발현 벡터에 존재하는 것인 약학 조성물.
  12. 제8항 또는 제10항에 있어서, 핵산 (ii)가 프로모터에 기능적으로 연결된 것인 약학 조성물.
  13. 제8항 또는 제10항에 있어서, 숙주 세포가 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 분비하는 것인 약학 조성물
  14. 제8항 또는 제10항에 있어서, 숙주 세포가 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 HLA 분자를 추가로 발현하는 것인 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 숙주 세포가 HLA 분자 및/또는 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 재조합적 방법으로 발현하는 것인 약학 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 숙주 세포가 HLA를 내부적으로 발현하는 것인 약학 조성물.
  17. 제8항, 제10항, 제14항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 항원 지시 세포인 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 항원 제시 세포가 수지상 세포 또는 대식 세포인 약학 조성물.
  19. 제8항, 제10항 및 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 비증식성인 것인 약학 조성물.
  20. 제5항 또는 제10항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 약학 조성물.
  21. 제5항 또는 제10항에 있어서, 항체가 키메라 도는 인간화 항체인 약학 조성물.
  22. 제5항 또는 제10항에 있어서, 항체가 천연 항체의 단편인 약학 조성물.
  23. 제5항 또는 제10항에 있어서, 항체가 치료제 또는 진단제와 결합된 것인 약학 조성물.
  24. 제4항 또는 제10항에 있어서, 안티센스 핵산이 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 인접 뉴클레오타이드 6 내지 50 서열을 포함하는 것인 약학 조성물.
  25. 제8항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학 조성물에 의하여 제공되는 종양 관련 항원 또는 그의 일부분이 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 비정상적인 양으로 발현하는 세포 표면의 MHC 분자에 결합하는 것인 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 결합이 세포 용해 작용을 유발시키거나 및/또는 사이토카인 방출을 유도하는 것인 약학 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 면역 보강제를 추가로 함유하는 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 면역 보강제가 사포닌, GM-CSF, CpG, 사이토카인 또는 케모카인인 약학 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현으로 특징지워지는 질병의 치료에 사용될 수 있는 약학 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 질병이 암인 약학 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 질병이 폐종양, 유방 종양, 전립선 종양, 흑색종, 결장 종양, 위 종양, 췌장 종양, ENT 종양, 신세포 암종 또는 자궁 경부 암종, 결장 암종 또는 유방 암종인 약학 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 관련 항원이 서열 번호 9-19, 45-48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 118, 120, 123, 124 및 135-137로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열, 그의 일부분 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 약학 조성물.
  33. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현에 의하여 특징지워지는 질병의 진단 방법으로서, 환자로부터 분리된 생물학적 시료에서의
    (i) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산의 검출, 및/또는
    (ii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분의 검출, 및/또는
    (iii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 대한 항체의 검출, 및/또는
    (iv) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 특이적인 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구의 검출을 포함하고,
    상기 종양 관련 항원은 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 방법:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  34. 제33항에 있어서, 검출이,
    (i) 생물학적 시료를 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 그의 일부분, 종양 관련 항원 또는 그의 일부분, 항체 또는 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구에 특이적으로 결합하는 작용제와 접촉시키고,
    (ii) 작용제와 핵산 또는 그의 일부분, 종양 관련 항원 또는 그의 일부분, 항체 또는 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구 간의 복합체 형성을 검출하는 것을 포함하는 방법.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 검출을 비교가능한 정상 생물학적 시료에서의 검출과 비교하여 수행하는 방법.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 질병이 두 가지 이상의 상이한 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현에 의한 특징을 갖는 것이고, 검출이 상기 두 가지 이상의 상이한 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 두 가지 이상의 핵산의 검출, 두 가지 이상의 상이한 종양 관련 항원 또는 그의 일부분의 검출, 두 가지 이상의 상이한 종양 관련 항원에 결합하는 두 가지 이상의 항체의 검출, 또는 두 가지 이상의 상이한 종양 관련 항원에 특이적인 두 가지 이상의 세포 독성 또는 T 헬퍼 림프구의 검출을 포함하는 것인 방법.
  37. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 그의 일부분을 상기 핵산 또는 그의 일부분에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 프로브가 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 인접 뉴클레오타이드 6 내지 50 서열을 포함하는 것인 방법.
  39. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 그의 일부분을 상기 핵산 또는 그의 일부분을 선택적으로 증폭시킴으로써 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 검출될 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 MHC와의 복합체 내에 존재하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, MHC 분자가 HLA 분자인 방법.
  42. 제33항 내지 제36항 및 제40항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 항체를 상기 항체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질을 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현에 의한 특징을 갖는 질병의 퇴행, 경과 또는 발병의 결정 방법으로서, 상기 질병을 앓고 있거나 상기 질병을 앓는 것으로 의심되는 환자로부터 얻은 다음으로 구성된 군 중에서 선택된 하나 이상의 파라미터에 대하여 시료를 모니터링하는 것을 포함하고:
    (i) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산의 양,
    (ii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분의 양,
    (iii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 항체의 양, 및
    (iv) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과 MHC 분자 간의 복합체에 특이적인 세포 독성 또는 사이토카인 방출 T 세포의 양;
    상기 종양 관련 항원은 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 방법:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  45. 제44항에 있어서, 파라미터의 측정 시, 첫 번째 시점에서는 첫 번째 시료에서 측정하고, 두 번째 시점에서는 다른 시료에서 측정하여, 질병의 경과를 두 시료의 비교에 의하여 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 질병이 두 가지 이상의 상이한 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현에 의한 특징을 갖는 것이고,
    (i) 상기 두 가지 이상의 상이한 종양 관련 항원 또는 그 일부분을 코딩하는 두 가지 이상의 핵산의 양,
    (ii) 상기 두 가지 이상의 상이한 종양 관련 항원 또는 그의 일부분의 양,
    (iii) 상기 두 가지 이상의 상이한 종양 관련 항원 또는 그 일부분에 결합하는 항체의 양, 및/또는
    (iv) 상기 두 가지 이상의 상이한 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과 MHC 분자 간의 복합체에 특이적인 세포 독성 또는 사이토카인 방출 T 세포의 양을 모니터링 하는 것을 포함하는 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 그의 일부분의 양을 상기 핵산 또는 그의 일부분에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 프로브를 사용하여 모니터링하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 프로브가 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 인접 뉴클레오타이드 6 내지 50 서열을 포함하는 것인 방법.
  49. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 또는 그의 일부분을 상기 핵산 또는 그의 일부분을 선택적으로 증폭시킴으로써 모니터링하는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 관련 항원 또는 그의 일부분의 양을 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 모니터링하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 양을 상기 항체에 특이적으로 결합하는 펩타이드 또는 단백질을 사용하여 모니터링하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 독성 또는 사이토카인 방출 T 세포의 양을 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과 MHC 분자 간의 복합체를 제시하는 세포를 사용하여 모니터링 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제37항 내지 제38항, 제42항 내지 제43항, 제47항 내지 제48항 및 제50항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 프로브, 항체, 단백질 또는 펩타이드 또는 세포를 검출 가능한 방법으로 표지하는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 탐지 가능한 마커가 방사성 마커 또는 효소적 마커인 방법.
  55. 제33항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 시료가 체액 및/또는 체조직을 포함하는 것인 방법.
  56. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현에 의한 특징을 갖는 질병의 치료 방법으로서, 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 기재된 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하고, 상기 종양 관련 항원이 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 방법:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  57. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현에 의한 특징을 갖는 질병의 치료, 진단 또는 모니터링 방법으로서, 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분 결합하는 항체를 치료제 또는 진단제와 함께 투여하는 것을 포함하고, 상기 종양 관련 항원이 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 방법:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  58. 제42항, 제50항 및 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  59. 제42항, 제50항 및 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 방법.
  60. 제42항, 제50항 및 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 천연 항체의 단편인 방법.
  61. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현에 의한 특징을 갖는 질병을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서,
    (i) 상기 환자로부터 면역 반응성 세포를 함유하는 시료를 채취하고,
    (ii) 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 대한 세포 독성 또는 사이토카인 방출 T 세포의 생산에 유리한 조건 하에서, 상기 시료를 상기 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 발현하는 숙주 세포와 접촉시키고.
    (iii) 세포 독성 또는 사이토카인 방출 T 세포를 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 발현하는 세포를 용해시키기에 적합한 양으로 환자에게 도입시키는 단계를 포함하고,
    상기 종양 관련 항원이 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 방법:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  62. 제61항에 있어서, 숙주 세포가 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 HLA 분자를 재조합적으로 발현하는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 숙제 세포가 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 HLA 분자를 내부적으로 발현하는 것인 방법.
  64. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현에 의한 특징을 갖는 질병을 앓고 있는 환자의 치료 방법으로서,
    (i) 상기 질병과 관련된 세포에 의하여 발현되고, 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산을 동정하고:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산;
    (ii) 상기 핵산 또는 그의 일부분으로 숙주 세포를 형질 감염 시키고;
    (iii) 상기 핵산을 발현시키기 위하여 형질 감염된 세포를 배양하고;
    (iv) 숙주 세포 또는 그의 추출물을 질병과 관련된 환자의 세포와의 면역 반응을 증가시키기에 적합한 양으로 환자에게 도입시키는 것을 포함하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 제시하는 MHC 분자를 동정하고, 숙주 세포가 상기 동정된 MHC 분자를 발현하고 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 제시하도록 하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 면역 반응이 B 세포 반응 또는 T 세포 반응을 포함하는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 면역 반응이 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 제시하는 숙주 세포 또는 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 발현하는 환자의 세포에 대하여 특이적인 세포 독성 또는 사이토카인 방출 T 세포의 생산을 포함하는 것인 방법.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포가 비증식성인 것인 방법.
  69. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현에 의한 특징을 갖는 질병의 치료 방법으로서,
    (i) 종양 관련 항원을 비정상적 양으로 발현하는 환자의 세포를 동정하고,
    (ii) 상기 세포의 시료를 분리하고,
    (iii) 상기 세포를 배양하고,
    (iv) 상기 세포를 세포에 대한 면역 반응을 유발시키기에 적합한 양으로 환자에게 도입시키는 단계를 포함하며,
    상기 종양 관련 항원은 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 방법:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  70. 제33항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 질병이 암인 방법.
  71. 환자에서의 암 발생 억제 방법으로서, 제1항 내지 제32항 중 어느 항 항에 다른 약학 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 방법.
  72. 제33항 내지 제71항에 있어서, 종양 관련 항원이 서열 번호 9-19, 45-48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 118, 120, 123, 124 및 135-137로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 그의 일부분 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  73. 다음으로 이루어진 군 중에서 선택되는 핵산:
    (a) 서열 번호 3-5로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  74. 서열 번호 10 및 12-14로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드, 그의 일부분 또는 그의 유도체를 코딩하는 핵산.
  75. 제73항 또는 제74항에 기재된 핵산을 포함하는 재조합 DNA 또는 RNA 분자.
  76. 제75항에 있어서, 벡터인 재조합 DNA 분자.
  77. 제76항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 벡터 또는 박테리오파아지인 재조합 DNA 분자.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산의 발현을 제어하는 발현 조절 서열을 추가로 포함하는 재조합 DNA 분자.
  79. 제78항에 있어서, 발현 조절 서열이 핵산과 상동 또는 이종인 것인 재조합 DNA 분자.
  80. 제73항 또는 제74항에 기재된 핵산 또는 제75항 내지 제79항 중 어느 한 항에 기재된 재조합 DNA 분자를 포함하는 숙주 세포.
  81. 제80항에 있어서, HLA 분자를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 숙주 세포.
  82. 제73항에 기재된 핵산에 의하여 코딩되는 단백질 또는 폴리펩타이드.
  83. 서열 번호 10 및 12-14로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열, 그의 일부분 또는 그의 유도체를 포함하는 단백질 또는 폴리펩타이드.
  84. 제82항 또는 제83항에 기재된 단백질 또는 폴리펩타이드의 면역원성 단편,
  85. 인간 HLA 수용체 또는 인간 항체에 결합하는, 제82항 또는 제83항에 기재된 단백질 또는 폴리펩타이드의 단편.
  86. 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 그의 일부분에 특이적으로 결합하는 작용제로서, 상기 단백질 또는 폴리펩타이드는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 것인 작용제:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  87. 제86항에 있어서, 단백질 또는 폴리펩타이드는 서열 번호 9-19, 45-48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 118, 120, 123, 124 및 135-137로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 그의 일부분 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 작용제.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 항체인 작용제.
  89. 제88항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체 또는 항체의 단편인 작용제.
  90. 항체로서,
    (i) 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 그의 일부분 및
    (ii) 상기 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 그의 일부분에 결합하는 MHC 분자와의 복합체에 선택적으로 결합하며,
    상기 항체는 단독으로 존재하는 (i) 또는 (ii)에는 결합하지 않는 것이며,
    상기 단백질 또는 폴리펩타이드는 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 것인 항체:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  91. 제90항에 있어서, 상기 단백질 또는 폴리펩타이드는 서열 번호 9-19, 45-48, 60-66, 85, 90-97, 100-102, 105, 106, 111-116, 118, 120, 123, 124 및 135-137로 이루어진 군 중에서 선택된 아미노산 서열 또는 그의 일부분 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 항체.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 모노클로날 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체 또는 항체의 단편인 항체.
  93. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 기재된 작용제 또는 제90항 내지 제92항 중 어느 한 항에 기재된 항체와 치료제 또는 진단제 간의 복합체.
  94. 제93항에 있어서, 치료제 또는 진단제가 독소인 복합체.
  95. 종양 관련 항원의 발현 또는 비정상적 발현의 검출용 키트로서,
    (i) 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산 또는 그의 일부분,
    (ii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분,
    (iii) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분에 결합하는 항체, 및/또는
    (iv) 종양 관련 항원 또는 그의 일부분과 MHC 분자 간의 복합체에 대하여 특이적인 T 세포를 검출하기 위한 작용제를 포함하며,
    상기 종양 관련 항원이 다음으로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산에 의하여 코딩되는 서열을 갖는 것인 키트:
    (a) 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열을 포함하는 핵산, 그의 일부분 또는 그의 유도체,
    (b) 엄격한 조건 하에서 핵산 (a)와 혼성화하는 핵산,
    (c) 핵산 (a) 또는 (b)에 대하여 변질된 핵산, 및
    (d) 핵산 (a), (b) 또는 (c)에 대하여 상보적인 핵산.
  96. 제95항에 있어서, 종양 관련 항원 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산을 검출하기 위한 작용제가 상기 핵산의 선택적 증폭을 위한 핵산 분자인 키트.
  97. 제95항에 있어서, 핵산의 선택적 증폭을 위한 핵산 분자가 종양 관련 항원을 코딩하는 핵산의 인접 뉴클레오타이드 6 내지 50 서열을 포함하는 것인 키트.
  98. 서열 번호 1-8, 41-44, 51-59, 84, 117 및 119로 이루어진 군 중에서 선택된 핵산 서열로부터 유도된 프로모터 부위를 포함하는 재조합 DNA 분자.
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