KR20140100969A

KR20140100969A - 연골 형성을 유도하기 위한 gdf-5 돌연변이체

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Publication number: KR20140100969A
Application number: KR1020147017053A
Authority: KR
Inventors: 프란크 플뢰거; 플로리안 바그너
Original assignee: 바이오팜 게젤샤프트 쭈어 바이오테히놀로지셴 엔트비클룽 폰 파르마카 엠베하
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2012-12-05
Publication date: 2014-08-18
Anticipated expiration: 2032-12-05
Also published as: SI2788374T1; DK3168230T3; US20140369978A1; AU2012347305B2; HUE033025T2; AU2012347305A1; RS55686B1; US9718867B2; PL3168230T3; EA201491119A1; TR201901263T4; WO2013083649A1; PT3168230T; HRP20190160T1; MX2014006465A; EP2602264A1; HUE042191T2; EP3168230A1; ES2708675T3; KR102067724B1

Abstract

본 발명은 연골 형성 유도의 증진된 능력 및 골 형성 유도의 감소된 능력을 갖는 GDF-5 관련 단백질에 관한 것이다. 상기 신규 단백질은 골 조직의 형성이 바람직하지 않은 연골 결손의 치료에서 특히 유용하다.

Description

연골 형성을 유도하기 위한 GDF-5 돌연변이체 {GDF-5 mutant for inducing cartilage formation}

본 발명은 연골 형성을 유도하는 개선된 능력 및 뼈 형성을 유도하는 감소된 능력을 갖는 GDF-5 관련 단백질에 관한 것이다. 상기 신규 단백질은 특히 뼈 조직의 형성이 요구되지 않는, 연골 결손의 치료에 유용하다.

윤활 관절(Synovial joint)은 골격의 생체역학적 기능에 대해 필수적이다. 관절염 질환에서 관찰된 부적절한 기능은 심각한 삶의 질의 저하를 초래한다. 따라서, 관절 생물학은 수년 동안 관절 해부학 및 조직학, 및 관절 기능 및 유지aintenance)에서 관절 연골 및 기타 성분의 생체역학적 특징 및 역할에 대한 이해를 가져온 광범위한 연구의 중심이었다.

GDF-5 (Hotten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652)은 여러 조직에서 세포 증식, 분화 및/또는 조직 형성을 촉진시키는 것으로 입증된 형태형성물질(morphogen)이다. GDF-5는 또한 형태형성(morphogenic) 단백질 MP52, 골 형태형성 단백질-14 (bone morphogenetic protein-14, BMP-14) 또는 연골-유래 형태형성 단백질-1 (cartilage-derived morphogenetic protein-1, CDMP-1)로 알려져 있다. GDF-5는 연골원(chondrogenic) 활성을 보여주고, 선천적인 GDF-5 돌연변이는 마우스 및 인간의 손(발)가락(digit), 손목 및 발목 관절에서 결손을 유발한다 (Storm et al., 1994; Thomas et al., 1997). GDF-5의 발현은 관절이 발생할 영역으로 가장 두드러지게 한정되고 관절 형성의 최초 마커 중 하나이다 (Storm and Kingsley, 1999). BMP 수용체 신호전달(signaling)은 관절 연골의 출생 후 유지(postnatal maintenance)를 위해 필요로 한다 (Rountree, 2004, PLoS Biol. 2004 November, 2(11))

GDF-5는 GDF-6 및 GDF-7과 밀접하게 관련된다. 이러한 3개의 단백질은 TGF-β 슈퍼패밀리의 별개의 서브그룹을 형성하며, 따라서 유사한 생물학적 특징 및 놀라운 고도의 아미노산 서열 동일성을 보인다 (즉 Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330 참조). 모든 패밀리 구성원은 처음에 더 큰 전구체 단백질로서 합성되고, 이어서 C-말단의 염기성 잔기 약 110-140개 아미노산의 무리(cluster)에서 단백질 분해성 절단 반응을 거쳐, 그 결과 N-말단 프로도메인(prodomain)으로부터 C-말단 성숙(mature) 단백질 부분을 방출한다. 성숙 폴리펩티드는 구조적으로 관련되어 있으며, 이들 단백질의 특징적인 삼차원 "시스틴-노트(cystine-knot)" 모티프의 원인이 되는 6 또는 7개의 정규(canonical) 시스테인 잔기를 포함하는 보존된 생리활성 도메인을 함유한다. 원형의(native) GDF-5 관련 단백질은 호모다이머 분자이고 I형 및 II형 세린/트레오닌 수용체 키나제로 구성된 특이적 수용체 복합체와의 상호작용을 통해 주로 작용한다. 수용체 키나제는 이어서 Smad 단백질을 활성화시키고, 그 다음에 핵 안으로 신호를 전파하여 표적 유전자 발현을 조절한다.

GDF-5/-6/-7 서브그룹의 구성원이 주된 중요한 골 및 연골의 유도물질(inducer) 및 조절물질(regulator)이라는 것이 반복적으로 입증되었다 (Cheng et al. 2003, J. Bone & Joint Surg. 85A, 1544-1552; Settle et al. 2003, Developm. Biol. 254, 116-130). GDF-5 및 관련 단백질은 I형 및 II형이라 불리는 막 결합 세린-트레오닌 키나제 수용체의 두 가지 형태에 결합하고 올리고머화한다. 리간드 결합시, 이러한 복합체는 전사 인자의 SMAD 패밀리의 구성원을 인산화하는 것에 의해 신호를 변환하며, 이들은 활성화시 핵으로 들어가고 반응성 유전자의 전사를 조절한다 (Massague, 1996). 최근 실험들은 골격 패턴화(skeletal patterning)에 두 개의 상이한 I형 수용체, BMPR-IA 및 BMPR-IB를 관련시켰다. 두 개의 수용체 모두 정상 발달 동안 동적 패턴으로 발현된다. 여러 사지(limb) 구조에서, 예를 들면 관절 인터존(joint interzone) 및 연골막에서, BMPR-IA 및 BMPR-IB의 중복(overlapping) 발현이 관찰된다 (Mishina et al., 1995; Zou et al, 1997; Baur et al, 2000). BMPR-IA 및 BMPR-IB 발현 패턴에 관하여, GDF-5 신호 전달은 BMPR-IA 및 BMPR-IB 모두와의 상호작용에 의해 달성된다 (Chang et al., 1994; Zou et al., 1997). bmpr-1b 유전자 내 삭제 돌연변이(null mutation)는 GDF-5가 결실된 마우스에서 보이는 것과 아주 유사한 골 및 관절 형성의 결손을 갖는 생존가능한 마우스를 생산하며 (Storm and Kingsley, 1996; Yi et al, 2000), 반면 bmpr-Ia/마우스는 배발생(embryogenesis) 초기에 죽는 것으로 알려져 있다 (Mishina et al, 1995). 그러나, GDF-5-Cre 추진자(driver)의 제어 하에 있는 BMPR-IA의 조건부 녹아웃 (conditional knockout)은 배아의 치사율을 우회하고 정상적으로 형성된 관절을 갖는 생존가능한 마우스를 생산한다. 그러나, 출생 후 관절(joint) 안의 관절 연골(articular cartilage)은 골관절염을 연상시키는 과정에서 마모되고, 이는 연골 항성성 및 복원에서의 이 수용체의 중요성을 나타낸다 (Rountree et al., 2004).

GDF-5 관련 단백질 패밀리의 야생형 단백질의 활성은 일반적으로 연골 및 뼈의 형성을 초래한다. 그러나, 연골의 형성은 바람직하지만, 그러나 골 조직의 형성은 바람직하지 않는, 상이한 의학적 상태가 존재한다. 예를 들면, 관절 결손(joint defect)의 경우, 연골의 형성은 바람직한 반면에 골화(ossification)는 피해야 하는 것이 명백하다.

따라서, 본 발명의 목적은 특이적으로 GDF-5 관련 단백질의 연골 형성 유도 효과를 이용하고 골 형성 유도 효과를 막는 것이다. 놀랍게도, 연골 형성 유도의 증진된 능력 및 골 형성 유도의 감소된 능력을 갖는 GDF-5 관련 단백질의 변이체를 제공하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 이것은 GDF-5 관련 단백질이 BMPR-IB에 대한 증가된 친화도 및/또는 BMPR-IA에 대한 감소된 친화도를 갖도록 GDF-5 관련 단백질을 변형시키는 것에 의해 달성할 수 있다.

야생형 GDF-5는 인 비트로에서 BMPR-IA (K_D ~ 1-1,1 nM)와 비교하여 약 40- 내지 120-배 더 높은 친화도 (K_D ~ 8-27 pM)로 BMPR-IB와 결합한다. BMPR-IB에 대한 친화도가 증가하고 BMPR-IA에 대한 친화도가 감소되도록 GDF-5 관련 단백질의 결합 친화도를 변형시키는 것에 의해, 골 형성이 감소되는 반면 연골 형성이 용이하게 되는 것을 발견하였다. 이것은 GDF-5 관련 단백질의 아미노산 서열 내 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위와 관련된 하나 이상의 아미노산 잔기의 특이적 치환에 의해 달성될 수 있다.

특이적 치환을 갖는 GDF-5 관련 단백질의 결합 친화도는 인간 야생형 GDF-5 관련 단백질, 특히 인간 야생형 GDF-5의 결합 친화도와 비교된다.

오해 및 애매모호함을 피하기 위해, 본 명세서에서 일부 자주 사용되는 용어가 다음과 같이 정의되고 예시된다:

본 명세서에서 사용된 용어 "시스틴-노트 도메인 (cystine-knot domain)"은 즉 인간 GDF-5와 같은 TGF-베타 슈퍼패밀리 단백질의 성숙 부분(mature part)에 존재하고 시스틴-노트로 알려진 삼차원적 단백질 구조를 형성하는, 잘 알려지고 보존된 시스테인-풍부 아미노산 영역을 의미한다. 이 도메인에서 시스테인 잔기의 서로에 대한 각각의 위치는 중요하며, 생물학적 활성을 잃지 않기 위해 약간 변하는 것만 허용된다. 단백질의 생물학적 기능을 위해 시스틴-노트-도메인만으로 충분하다는 것이 입증되었다 (Schreuder et al. (2005), Biochem Biophys Res Commun. 329, 1076-86). 시스틴-노트 도메인에 대한 컨센서스 서열(consensus sequence)은 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 본 명세서에서 한정된 정의에 따르면, 단백질의 시스틴-노트-도메인은 각 단백질의 시스틴-노트에 참여하는 첫번째 시스테인 잔기로 시작하고 각 단백질의 시스틴-노트에 참여하는 마지막 시스테인에 뒤따르는 잔기로 끝난다. 예를 들면, 인간 GDF-5 전구체 단백질 (서열번호 2)의 시스틴-노트 도메인은 아미노산 400-501로 구성된다 (또한 도 1 참조).

본 명세서에서 사용된 용어 "GDF-5-관련 단백질 (GDF-5-related protein)"은 인간 성장/분화 인자 5 (human growth/differentiation factor 5, hGDF-5)와 매우 밀접하게 관련된 임의의 천연적으로 발생하거나 또는 인공적으로 제조된 단백질을 의미한다. 모든 GDF-5-관련 단백질의 공통된 특징은 단백질의 생물학적 기능을 위해 충분한, 인간 GDF-5의 시스틴-노트-도메인 102개 aa (서열번호 2의 아미노산 400-501)와 60% 이상의 아미노산 동일성을 갖는 시스틴-노트-도메인의 존재이다. 용어 "GDF-5-관련 단백질들 (GDF-5-related proteins)"은 단백질이 인간 GDF-5의 시스틴-노트 도메인과 전술된 퍼센트의 동일성을 보여주는 한, 척추동물 또는 포유동물 종 유래의 GDF-5, GDF-6 및 GDF-7 단백질의 그룹에 속하는 단백질 및 그의 재조합 변이체를 포함한다. 60%의 제한 값이 단백질들의 GDF-5/-6/-7 그룹의 구성원 및 그의 변이체를 더욱 멀리 관련된 GDF 및 BMP와 같은 추가적인 단백질들로부터 분리하기에 매우 적합하다. 인간 GDF-5, 인간 GDF-6 및 인간 GDF-7의 시스틴-노트-도메인 102개 aa의 비교 (도 2 참조)는 이러한 단백질들 사이에 높은 정도의 아미노산 동일성을 나타낸다. 인간 GDF-6은 인간 GDF-5의 시스틴-노트-도메인과 87개 (85%)의 동일한 잔기를 공유하고 인간 GDF-7은 인간 GDF-5의 시스틴-노트-도메인과 83개 (81%)의 동일한 잔기를 공유한다. 또한 지금까지 확인되었던 다른 척추동물 및 포유동물 종의 GDF-5/-6/-7 분자의 각 도메인은 인간 GDF-5와 비교했을 때, 최소 75% (79% 내지 99%)의 매우 높은 동일성을 보여준다. 대조적으로, GDF-5/-6/-7 서브그룹에 속하지 않는 GDF 및 BMP는 60% 미만의 매우 낮은 동일성 값을 보여준다.

관련된 아미노산 서열 내 대응하는 아미노산 위치의 결정 및 동일성의 퍼센트 계산은 잘 알려진 정렬 알고리즘(alignment algorithm) 및 선택적으로, 이러한 알고리즘을 이용한 컴퓨터 프로그램의 도움으로 용이하게 수행될 수 있다. 예를 들면, 본 특허 출원 중의 아미노산 동일성 (즉, 도 2)은 디폴트 파라미터(default parameter)를 갖는 프리웨어 프로그램 ClustalX (버전 1.81)로 서열을 정렬하고 이어서 수동으로 동일한 잔기를 계수함으로써 계산되었다. 쌍 정렬(pairwise alignment)(느림-정확함)을 위한 디폴트 설정은 다음과 같다: 갭 개시(gap opening) 파라미터: 10.00; 갭 신장(gap extension) 파라미터: 0.10; 단백질 중량 매트릭스(Protein weight matrix): Gonnet 250. ClustalX 프로그램은 Thompson,J.D., Gibson,T.J., Plewniak,F., Jeanmougin,F. and Higgins,D.G. (1997): ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 24:4876-4882에 상세하게 기재된다. ClustalX는 ClustalW 다중 서열 정렬 프로그램을 위한 윈도우 인터페이스이며, 다양한 공급원, 즉 ftp-igbmc.u-strasbg.fr, ftp.embl-heidelberg.de, ftp.ebi.ac.uk로부터 익명의 ftp에 의해, 또는 하기 웹페이지: http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/로부터 다운로드를 통해 입수가능하다. ClustalW 프로그램 및 알고리즘 또한 Thompson, J.D., Higgins, D.G. 및 Gibson, T.J. (1994): CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673-4680에 상세하게 기재된다. 특히 바람직한 GDF-5-관련 단백질은 인간 GDF-5의 102개 aa 시스틴-노트-도메인과 최소 70%, 80%, 90% 또는 95%의 아미노산 동일성을 보인다.

척추동물 및 포유동물 GDF-5-관련 단백질에 대한 비-한정적 예는 인간 GDF-5 (WO95/04819에서 MP52로, 및 Hoten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652에서 인간 GDF-5로 개시됨), 재조합 인간(recombinant human) (rh) GDF-5/MP52 (WO96/33215), MP52 Arg (WO97/06254); HMW 인간 MP52s (WO97/04095), CDMP-1 (WO96/14335), 마우스 (Mus musculus) GDF-5 (US 5,801,014), 토끼 (Oryctolagus cuniculus) GDF-5 (Sanyal et al. 2000, Mol Biotechnol. 16, 203-210), 닭 (Gallus gallus) GDF-5 (NCBI accession no. NP_989669), 아프리카 발톱 개구리(african clawed frog) (Xenopus laevis) GDF-5 (NCBI accession no. AAT99303), 단량체 GDF-5 (WO 01/11041 및 WO 99/61611), 인간 GDF-6/BMP-13 (US 5,658,882), 마우스 GDF-6 (NCBI accession no NP_038554), GDF-6/CDMP-2 (WO96/14335), 인간 GDF-7/BMP-12 (US 5,658,882), 마우스 GDF-7 (NCBI accession no AAP97721), GDF-7/CDMP-3 (WO96/143335)의 전구체 및 성숙 단백질이다. 본 발명에 의해 포함되는 것은 또한 추가적 돌연변이가 완전하게 생물학적 단백질 활성을 없애지 않는 한, 치환, 부가 및 결실과 같은 추가적인 돌연변이를 갖는 GDF-5-관련 단백질이다.

본 발명은 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA로의 결합에 관여되는 GDF-5 관련 단백질의 아미노산 서열의 영역 내 특이적 변형에 의해 GDF-5 관련 단백질이 연골 형성 유도의 증진된 능력 및 골 형성 유도의 감소된 능력을 갖도록 단백질을 변화시키는 것이 가능하다는 본 발명자들의 발견에 기반한다.

BMPR-IB에 대한 증가된 친화도를 갖는 단백질 및/또는 BMPR-IA에 대한 감소된 친화도를 갖는 단백질이 골 형성은 감소되는 반면, 연골 형성은 더욱 잘 유도할 수 있는 것을 발견하였다. 이러한 특징들은 BMPR-IB에 대한 증가된 친화도 및 BMPR-IA에 대한 감소된 친화도 모두를 보여주는 단백질에서 특히 현저하다.

본 발명의 GDF-5 관련 단백질은 화학적 변형 또는 유전 공학 기술에 의해 수득될 수 있고, 재조합 단백질이 바람직하다. 상기 단백질은 GDF-5 관련 단백질의 아미노산 서열 내 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위와 관련된 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환하는 것에 의해 수득될 수 있다. 특히, GDF-5 관련 단백질의 아미노산 서열 내 BMPR-IB 결합 부위 및/또는 BMPR-IA 결합 부위와 관련된 1, 2, 3 개 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 치환이 바람직하다.

전술된 변형은 앞서 정의된 바와 같은 임의의 공지된 GDF-5 관련 단백질에 도입될 수 있다. 상기 단백질의 치료 용도의 양태에 관하여, 단백질은 인간 GDF-5 관련 단백질, 예를 들면 GDF-5, GDF-6 또는 GDF-7과 같은 인간 야생형 GDF-5 관련 단백질로부터 유래하는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명의 단백질은 또한 추가적인 돌연변이가 생물학적 단백질 활성을 완전히 없애지 않는 한, 치환, 부가 또는 결실과 같은 추가적인 돌연변이를 갖는, GDF-5 관련 단백질로부터 유래될 수 있다.

본 명세서에서 정의된 GDF-5 관련 단백질은 인간 GDF-5의 102개 aa 시스틴-노트 도메인과 최소 60%, 바람직하게는 최소 75%, 더욱 바람직하게는 최소 80%, 더욱 바람직하게는 최소 90% 및 가장 바람직하게는 최소 95%의 아미노산 동일성을 갖는 시스틴-노트 도메인을 포함한다.

본 발명의 GDF-5 관련 단백질은 바람직하게는 야생형과 비교하여 BMPR-IB로의 결합에 관여되는 영역 및/또는 BMPR-IA로의 결합에 관여되는 영역 내에 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함한다. BMPR-IA 및/또는 BMPR-IB로의 결합에 관여되는 GDF-5 관련 단백질의 영역은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있거나 또는 주지의 사실에 속하는 방법을 이용하여 쉽게 결정될 수 있다.

GDF-5 야생형의 전장(full-length) 아미노산 서열에 관해, 하나 이상의 하기 아미노산 (1 문자 코드(one letter code))이 임의의 다른 아미노산으로 치환되는 것이 특히 바람직하다:

R 399;

F 409 내지 W 417 중 어느 하나, 바람직하게는 M 412, G 413, W 414, 및/또는 W 417;

E 434 내지 M 456 중 어느 하나, 바람직하게는 F 435, P 436, L 437, R 438, S 439, H 440, P 443, N 445, V 448, I 449, L 452, M 453, S 455, 및/또는 M 456;

S 475;

I 476;

F 478;

K 488 내지 M 493 중 어느 하나, 바람직하게는 K 488, Y 490, 및/또는 D 492.

바람직하게는, 아미노산 R 399는 V, L, I, M, F, Y, W, E 또는 D로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 M 412는 V, L, I, F, Y, W, H, K 또는 R로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 W 414는 R, K, F, Y, H, E 또는 D로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 W 417은 R, K, F, Y, H, E 또는 D로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 F 435는 V, L, I, M, P, Y, W, H, K 또는 R로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 P 436은 V, L, I, M, F, Y 또는 W로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 L 437은 D 또는 E로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 R 438은 K, D, H, N, M, E, Q, S, T, Y 또는 W로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 S 439는 K, D, E, H, R, M, T, N, Q, Y 또는 W로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 H 440은 V, I, M, F, Y, W, E 또는 D로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 P 443은 V, L, I, M, F, Y, W, A 또는 S로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 N 445는 D, Q, H, F, L, R, K, M, S, Y 또는 W로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 V 448은 F, L, I, M, P, Y 또는 W로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 I 449는 F, L, V, M, P, Y 또는 W로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 L 452는 F, I, V, M, P, Y 또는 W로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 M 456은 F, I, L, P, Y, W, S, T, N, Q, K 또는 D로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 S 475는 M, T, N, Q, Y 또는 W로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 K 488은 R, M, S, T, N, Q, Y 또는 W로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 Y 490은 E, H, K, R, Q, F, T, M, S, N, Q 또는 W로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 D 492는 G, E, M, S, T, N, Q, Y, W, H, K 또는 R로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 I 476은 G, A, V, L, M, F, Y 또는 W로 치환된다.

바람직하게는, 아미노산 F 478은 G, A, V, L, I, Y 또는 W로 치환된다.

다른 GDF-5 관련 단백질의 아미노산 서열 내 대응 위치는 야생형 GDF-5에 관한 전술된 정보로부터 용이하게 얻을 수 있다.

제1 구체예에 따르면, GDF-5 관련 단백질의 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위 내에서 하나 이상의 소수성 아미노산이 친수성 또는 극성 아미노산으로 치환된다. 친수성 또는 극성 아미노산 잔기의 예는 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 세린 및 트레오닌이다.

제2 구체예에 따르면, GDF-5 관련 단백질의 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위 내에서 하나 이상의 친수성 또는 극성 아미노산이 소수성 아미노산으로 치환된다. 소수성 아미노산의 예는 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신 및 발린이다.

다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 단백질은 GDF-5 관련 단백질의 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위에 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환(conservative substitution)을 포함한다. 이것은 본래 존재하였던 아미노산의 특성이 유지되는 것을 의미한다. 따라서, 친수성 또는 극성 아미노산이 다른 친수성 또는 극성 아미노산으로 치환되거나 또는 소수성 아미노산이 다른 소수성 아미노산으로 치환된다.

바람직하게는, 보존적 치환은 아미노산이 상이한 입체적 요구(steric demand)를 갖는 다른 아미노산으로 교환되는 방식으로 선택된다. 이러한 본 발명의 양태에 따르면, 소수성 아미노산은 더 작거나 또는 더 큰 소수성 아미노산으로 치환될 수 있거나 또는 친수성 또는 극성 아미노산은 더 작거나 또는 더 큰 친수성 또는 극성 아미노산으로 치환될 수 있다.

GDF-5 관련 단백질에서의 아미노산 치환은 아미노산 특성에 의해 4 그룹으로 나눌 수 있다:

I. 하기로 치환되는, 염기성 아미노산 잔기 (R, K, H)

a) 소수성 (V, L, I, M, P, F, Y, W)

b) 산성 (E, D)

c) I 과 동일하지 않은 염기성 아미노산 잔기 (R, K, H)

d) 극성 (S, T, N, Q).

II. 하기로 치환되는, 산성 아미노산 잔기 (D)

a) 소수성 (M, Y, W, G)

b) 산성 (E)

c) 염기성 (R, K, H)

d) 극성 (S, T, N, Q).

III. 하기로 치환되는, 소수성 아미노산 잔기 (M, V, L, I, P, F, Y, W, A)

a) III 과 동일하지 않은 소수성 아미노산 잔기 (M, V, L, I, P, F, Y, W, G, A)

b) 산성 (E, D)

c) 염기성 (R, K, H)

d) 극성 (S, T, N, Q)

d) 소형(small) (A).

IV. 하기로 치환되는, 극성 아미노산 잔기 (S, T, N)

a) 소수성 (M, V, L, I, P, F, Y, W)

b) 산성 (E, D)

c) 염기성 (R, K, H)

d) IV 와 동일하지 않은 극성 아미노산 잔기 (S, T, N, Q).

바람직한 구체예에서, 본 발명의 GDF-5 관련 단백질은 하기 아미노산 서열 중 하나와 일치(match)되는 서열을 포함한다:

a) ZCX₁X₂KX₃LHVX₄ ZZZZZZZZZX₇IAPLX₈YEAX₉HCX₁₀GX₁₁CZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZX₁₃PX₁₄X₁₅X₁₆PX₁₇X₁₈CCVPX₁₉X₂₀LX₂₁PIZILX₂₂X₂₃DX₂₄X₂₅NNVVYZZZZZZVVEX₂₇CGCR 또는

b) ZCX₁X₂KX₃LHVX₄FX₅X₆ ZZZDDZX₇IAPLX₈YEAX₉HCX₁₀GX₁₁CX₁₂ ZZZZZZLEZTZHAZZQTZZNZZX₁₃PX₁₄X₁₅X₁₆PX₁₇X₁₈CCVPX₁₉X₂₀LX₂₁PIZILX₂₂X₂₃DX₂₄X₂₅NNVVYZX₂₆ ZZZMVVEX₂₇CGCR

및 여기서

모든 X는 임의의 아미노산을 나타내고,

모든 Z는 임의의 아미노산을 나타낸다.

이러한 일반적인 서열은 척추동물 GDF-5, GDF-6 및 GDF-7 서열의 시스틴-노트(cystine-knot) 도메인의 비교로부터 수집되었다. 정렬된 단백질에서 보존되지 않은 위치는 일반적인 서열 중 X로 나타낸다. 본 발명에 따라 돌연변이된 위치는 Z로 나타낸다.

더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명의 GDF-5 관련 단백질은 전술된 일반적인 아미노산 서열 중 하나와 일치되는 서열을 포함하고, 여기서

X₁은 아스파라긴 (N) 또는 세린 (S)을 나타내고

X₂는 아르기닌 (R) 또는 라이신 (K)을 나타내고

X₃은 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 프롤린 (P) 또는 세린 (S)을 나타내고

X₄는 아르기닌 (R) 또는 라이신 (K)을 나타내고

X₅는 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)을 나타내고

X₆은 류신 (L) 또는 메티오닌 (M)을 나타내고

X₇은 이소류신 (I) 또는 발린 (V)을 나타내고

X₈ 은 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)을 나타내고

X₉는 히스티딘 (H), 페닐알라닌 (F) 또는 티로신 (Y)을 나타내고

X₁₀은 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)을 나타내고

X₁₁은 류신 (L), 메티오닌 (M) 또는 발린 (V)을 나타내고

X₁₂는 아스파르트산 (D) 또는 글루탐산 (E)을 나타내고

X₁₃은 알라닌 (A), 아스파라긴 (N) 또는 아스파르트산 (D)을 나타내고

X₁₄는 아르기닌 (R), 아스파라긴 (N), 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E), 글리신 (G) 또는 세린 (S)을 나타내고

X₁₅는 알라닌 (A), 아스파라긴 (N), 세린 (S) 또는 트레오닌 (T)을 나타내고

X₁₆은 알라닌 (A), 메티오닌 (M) 또는 트레오닌 (T)을 나타내고

X₁₇은 알라닌 (A) 또는 프롤린 (P)을 나타내고

X₁₈은 세린 (S) 또는 트레오닌 (T)을 나타내고

X₁₉는 알라닌 (A), 세린 (S) 또는 트레오닌 (T)을 나타내고

X₂₀은 아르기닌 (R) 또는 라이신 (K)을 나타내고

X₂₁은 세린 (S) 또는 트레오닌 (T)을 나타내고

X₂₂는 페닐알라닌 (F) 또는 티로신 (Y)을 나타내고

X₂₃은 이소류신 (I) 또는 트레오닌 (T)을 나타내고

X₂₄는 알라닌 (A) 또는 세린 (S)을 나타내고

X₂₅는 알라닌 (A) 또는 글리신 (G)을 나타내고

X₂₆은 글루탐산 (E) 또는 글루타민 (Q)을 나타내고

X₂₇은 알라닌 (A), 글루타민 (Q), 세린 (S) 또는 트레오닌 (T)을 나타내고 및

모든 Z 는 임의의 아미노산을 나타낸다.

특정 구체예에서, 본 발명의 GDF-5 관련 단백질은 야생형 GDF-5로부터 유래된다. 이러한 특정한 양태에 따르면, GDF-5 관련 단백질은 하기 일반적인 아미노산 서열 중 하나와 일치되는 서열을 포함한다.

a) ZCSRKALHVNZZZZZZZZZIIAPLEYEAFHCEGLCZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZZDPESTPPTCCVPTRLSPIZILFIDSANNVVYZZZZZZVVESCGCR

b) ZCSRKALHVNFKDZZZDDZIIAPLEYEAFHCEGLCEZZZZZZLEZTZHAZZQTZZNZZDPESTPPTCCVPTRLSPIZILFIDSANNVVYZQZZZMVVESCGCR ,

여기서 모든 Z는 임의의 아미노산을 나타낸다.

앞서 기술된 단백질의 예는 414번 위치에서 트립토판 잔기가 아르기닌으로 교환된 (W414R) 인간 GDF-5의 변이체이다. GDF-5의 성숙 서열 (서열번호 4)을 참조하면, 이것은 33번 위치에서의 치환에 대응한다. 놀랍게도, 이 단백질 변이체가 BMPR-IA에 대한 상당히 감소된 친화도를 갖는 것을 발견하였다. 대조적으로, BMPR-IB에 대한 친화도는 거의 영향이 없다. 또한 바람직한 것은 W414R과 다른 아미노산 치환을 포함하는 GDF-5 관련 단백질의 다른 변이체이다.

상기 GDF-5 관련 단백질의 변이체에 대한 예는 449번 위치에서 이소류신 잔기가 발린으로 교환된 (I449V) 인간 GDF-5의 변이체이다. GDF-5의 성숙 서열 (서열번호 4)을 참조하면, 이것은 68번 위치에서의 치환에 대응한다. 상기 단백질 변이체는 BMPP-IA에 대한 감소된 친화도 및 BMPR-IB에 대한 증가된 친화도를 갖는다.

GDF-5 관련 단백질의 다른 예시적인 변이체는 아미노산 치환 R399E를 포함한다. GDF-5 (서열번호 4)의 성숙 서열을 참조하면, 이것은 18번 위치에서의 치환에 대응한다. 상기 단백질 변이체는 BMPR-IA에 대한 감소된 친화도를 갖는다.

인간 GDF-5의 다른 예시적 변이체는 439번 위치에서 세린 잔기가 글루탐산으로 교환된 (S439E) 변이체이다. GDF-5의 성숙 서열 (서열번호 4)을 참조하면, 이것은 58번 위치에서의 치환에 대응한다. 상기 단백질 변이체는 또한 BMPR-IA에 대한 감소된 친화도를 갖는다.

인간 GDF-5의 다른 예시적 변이체는 399번 위치에서의 아르기닌 잔기가 메티오닌으로 교환된 (R399M) 변이체이다. GDF-5의 성숙 서열 (서열번호 4)을 참조하면, 이것은 18번 위치에서의 치환에 대응한다. 상기 단백질 변이체는 BMPR-IB에 대한 상당히 증가된 친화도를 갖는다.

바람직하게는, 본 발명의 GDF-5 관련 단백질은 "단리된(isolated)" 단백질로서 존재한다. 이것은 본 발명의 단백질이 단리된 단백질의 천연 공급원(source)에 존재하는 다른 단백질 및 펩티드 분자 (예를 들면, 천연 공급원의 단백질의 다른 폴리펩티드)로부터 실질적으로 분리되는 것을 의미한다. 예를 들면, 재조합 발현 펩티드는 단리된 것으로 간주된다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, GDF-5 관련 단백질은 재조합 단백질이다. 또한, 펩티드는 또한 인간 개입 (human intervention)에 의해 변경되거나 또는 그것의 천연 공급원이 아닌 유기체에 의해 발현된 경우에도 단리된 것으로 간주된다. 또한, "단리된" 단백질은 일부 자연적으로 결합되는(associated) 기타 세포 물질, 또는 재조합 기법에 의해 생산된 경우 세포 배양 배지, 또는 화학적으로 합성된 경우 화합물 전구체 또는 기타 화합물을 포함하지 않는다. 구체적으로 "단리된" 단백질의 정의로부터 배제되는 것은 정제되지 않은 혼합물 또는 조성물이다.

다른 구체예에 따르면, 본 발명은 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 핵산은 각 야생형 GDF-5 관련 단백질의 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위와 관련된 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환이 얻어지는 서열을 가진다. 이러한 아미노산을 암호화하는 3중 염기 (base triplet) 및 유전 코드의 축퇴성은 일반적으로 알려져 있다. 핵산은 본 발명에 따른 단백질이 적절한 시스템에서의 발현 시 이러한 핵산으로부터 수득될 수 있는 한, DNA-서열 및/또는 RNA-서열일 수 있다. 본 발명의 핵산은 완전히 또는 부분적으로 합성일 수 있다. 핵산은 단일 가닥 및/또는 완전히 또는 부분적으로 이중 가닥인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 핵산은 유전체 제조(genomic preparation), cDNA 제조, 인 비트로 합성, PCR, RT-PCR 및/또는 인 비트로 또는 인 비보 전사를 포함하는 임의의 방식에 의해 생산될 수 있다.

특히 바람직한 것은 "단리된 (isolated)" 핵산이며, 이는 상기 핵산의 천연 공급원에 존재하는 핵산 분자 (예를 들면 다른 폴리펩티드를 코딩하는 서열)로부터 실질적으로 분리된다. 바람직하게는, "단리된" 핵산은 천연 레플리콘에서 상기 핵산 측면(flank)에 천연적으로 위치하는 서열(즉 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)의 적어도 일부가 없다. 예를 들면, 클로닝된 핵산은 단리된 것으로 간주된다. 핵산은 또한 인간 개입에 의해 변경되거나 또는 천연 측면이 아닌 유전자좌(locus) 또는 위치에 배치된 경우, 또는 세포 안으로 도입된 경우, 단리된 것으로 간주된다. 또한, 단리된 핵산은 일부 자연적으로 결합된 다른 세포 물질, 또는 재조합 기술에 의해 생산되는 경우 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화합물 전구체 또는 다른 화합물을 포함하지 않을 수 있다.

바람직한 방식으로, 본 발명의 핵산은 야생형 또는 변형된 GDF-5 관련 단백질을 코딩하는 핵산의 전체 유전자의 합성 또는 부위 지정 돌연변이유발(side-directed mutagenesis)에 의해 제조될 수 있다. 방법들은 주형 지시 라이게이션 (template directed ligation), 순환(recursive) PCR, 카세트 돌연변이유발(cassette mutagenesis), 부위 지정 돌연변이유발 또는 이용될 수 있는 당해 분야에 잘 알려진 기타 기법을 포함한다.

본 발명의 핵산은 본 발명의 단리된 핵산에 추가적인 기능을 부가할 수 있는 추가적 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 그와 같은 추가적 핵산 서열은 본 발명의 단백질의 적절한 발현을 허용하는 핵산 서열을 포함할 수 있고, 프로모터 서열, 조절 서열, 종결 신호, 복제 기점 등을 포함할 수 있다. 당업자는 그와 같은 기능적 핵산 서열 및 바람직한 특징을 갖는 핵산 분자에 도달하기 위해 그들을 배열하는 방법을 잘 알고 있다.

상기 핵산이 적합한 벡터 시스템 내로 삽입되며, 상기 벡터 시스템은 상기 단백질의 바람직한 발현에 따라 선택되는 것인 발현 벡터가 추가적인 본 발명의 주제이다. 상기 벡터 시스템은 진핵생물 벡터 시스템일 수 있으나, 바람직하게는 특히 쉽고 단순한 방식으로 단백질이 생산될 수 있는 원핵생물 벡터 시스템이다. 적합한 발현 벡터는 예를 들면 WO 96/33215에서 보여준다. 발현 벡터는 또한 예를 들면 유전자 치료 시도에서 이용될 수 있는 바이러스 벡터일 수 있다.

숙주 세포 및 형질전환 개체가 또한 본 발명의 주제이다. 상기 숙주 세포 및 형질전환 개체는 그들이 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터를 포함하고, 본 발명에 따른 단백질의 발현을 위해 각각, 상기 핵산 및 발현 벡터 내에 존재하는 정보를 이용할 수 있는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 하나 이상의 벡터로 일시적으로 또는 안정적으로 형질전환된(transformed) 또는 형질감염된(transfected) 개체 또는 세포 또는 그러한 형질전환 개체 또는 세포의 자손(progeny)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 형질전환 개체의 세포, 세포 배양물, 조직 및/또는 일부에 관한 것이다. 본 발명의 목적을 위해 용어 "형질전환 개체(transgenic organism)"는 개체가 여전히 본 발명의 핵산을 포함하고 본 발명의 단백질을 발현한다면, 본 발명의 핵산이 일시적으로 또는 안정적으로 도입된 개체를 포함할 뿐만 아니라 세대 거리(generation distance)와 상관없이 그 개체의 자손을 의미하는 것으로 이해된다.

바람직하게는, 형질전환 개체 또는 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 기원(origin)이다. 바람직하게는, 형질전환 개체는 미생물이다. 바람직한 미생물은 박테리아, 효모, 조류(algae), 또는 균류(fungi)이다. 적합한 숙주 세포는 바람직하게는 원핵 세포, 특히 E. coli 균주이다. 특히 유용한 숙주 세포는, 예를 들면, WO 96/33215에서 보여준 바와 같은 E. coli W3110의 디펜던트(defendant)이다. 바람직한 구체예에서, 바람직하게는 인간 기원의, 숙주 세포가 또한 그를 필요로 하는 환자로의 이식을 위해 유용할 수 있다.

형질전환된 개체 또는 형질전환된 세포의 제조는 적절한 DNA를 적절한 숙주 개체 또는 세포로 도입하는 것을 요구한다. 다수의 방법이 형질전환으로 지칭되는 이러한 과정을 위해 이용가능하다. 따라서, 예를 들면, DNA는 미세주입법(microinjection) 또는 DNA가 코팅된 마이크로입자 또는 나노입자로의 충격(bombardment)에 의해 직접적으로 도입될 수 있다. 세포는 또한 DNA가 확산(diffusion)을 통해 세포로 들어갈 수 있도록, 화학적으로, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 투과성을 갖게 될 수 있다. DNA는 또한 미니세포(minicell), 세포, 리소좀 또는 리포좀과 같은 다른 DNA-함유 단위체와의 원형질체 융합(protoplast fusion)을 통해 형질전환될 수 있다. DNA를 도입하는 다른 적합한 방법은 세포를 전기 임펄스(electric impulse)에 의해 가역적으로 투과성을 갖게 할 수 있는 전기천공법 (electroporation)이다.

본 발명의 다른 주제는 하기의 단계를 포함하는, 연골 형성 유도의 증진된 능력 및 골 형성 유도의 감소된 능력을 갖는 단백질을 생산하는 방법이다:

(i) 단백질 변이체를 얻기 위해 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위와 관련된 GDF-5 관련 단백질의 영역에서 하나 이상의 아미노산 위치를 무작위화하는(randomizing) 단계,

(ii) (i)에서 얻은 단백질 변이체를 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA에 대한 친화도에 관해 분석하는 단계,

(iii) BMPR-IB에 대한 증가된 친화도 및/또는 BMPR-IA에 대한 감소된 친화도를 제공하는 단백질 변이체를 선별하는 단계.

BMPR-IA 또는 BMPR-IB로의 결합에 관여되는 GDF-5 관련 단백질의 영역은 당해 기술 분야에 알려져 있다. 단계 (i)에서 이러한 영역 중 하나 또는 모두에서 하나 이상의 아미노산 위치가 무작위화된다. 최소 2, 3, 또는 그 이상의 아미노산 위치를 무작위화시키는 것이 바람직하다. GDF-5 관련 단백질의 야생형 서열 내에 존재하는 아미노산은 화학적 변형 또는 바람직하게는 유전 공학 기술에 의해 다른 아미노산으로 치환된다. 단계 (i)의 무작위화된 단백질 변이체를 생산하는 방법은 단백질의 인위적 신규 합성(synthetic de novo synthesis), 및/또는 그를 코딩하는 핵산으로부터의 단백질의 발현을 포함한다. 특히 바람직한 방식에서, 단계 (i)의 단백질 변이체는 개별적인 핵산을 이용한 발현에 의해 제조된다.

바람직하게는, 단백질 변이체가 관련된 위치의 모든 다른 가능한 아미노산에 대해 수득된다. 그러나, 다른 아미노산에 대해 하나 이상의 아미노산의 특이적 치환만을 수행하는 것이 또한 가능하다. 예를 들면, 친수성 아미노산이 소수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 대안적으로, 소수성 아미노산이 친수성 아미노산으로 치환될 수 있다. 친수성 또는 소수성 특성이 유지되는 보존적 치환도 역시 가능하다. 치환에 의해, 바람직하게는 다른 입체적 요구를 갖는 아미노산에 대한 교환이 수행된다.

단계 (i)에서 수득되는 다수의 단백질 변이체를 그 다음에 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA에 대한 그들의 친화도에 관하여 분석한다. 이것은 당해 기술분야에서 공지되고 일반적인 방식으로 수행될 수 있다. 단백질-수용체 상호작용을 평가하는 방법은 일반적인 절차이다.

단계 (iii)에서, BMPR-IB에 대한 증가된 친화도 및/또는 BMPR-IA에 대한 감소된 친화도를 제공하는 단백질 변이체를 선별한다. 놀랍게도 이러한 특정 단백질이 연골 형성 유도의 증가된 능력 및 골 형성 유도의 감소된 능력을 갖는 것을 발견하였다.

본 발명의 다른 주제는 본 발명의 GDF-5 관련 단백질에 대한 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 청구된 재조합 GDF-5 관련 단백질에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 그들은 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 GDF-5 관련 단백질의 영역에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 상기 항체는 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위에 관련된 GDF-5 관련 단백질 유래의 재조합 단백질의 영역에 대해 특이적이다. 본 발명에 따른 이러한 항체는 공지된 방법에 의해 항체를 생산하기 위해 면역원으로서 전술된 본 발명의 단백질의 단편을 이용하는 것에 의해 생산될 수 있다. 상기 항체는 단일클론 또는 다중클론일 수 있으며, 그들은 임의의 동종형(isotype)일 수 있다. 또한 Fab 단편 또는 Fab₂ 단편과 같은 항체 단편을 포함한다. 항체는 또한 인간화 항체 또는 제네릭 항체 등일 수 있다.

본 발명의 항체는, 특히 분석 도구로서 적합하다. 그들은 신체에서 본 발명에 따른 단백질의 흡수 및 분포를 조사하는데 이용될 수 있다. 또한, 상기 항체는 방출 역학을 연구하는데 적합하다.

본 출원의 추가 주제는 본 발명에 따른 재조합 GDF-5 관련 단백질 또는 핵산 또는 벡터 또는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물이다. 원칙적으로, GDF-5 관련 단백질과 관련하여 이미 발표된 임의의 약학적 조성물이 적합하다. 발현 벡터 또는 숙주 세포가 약학적 조성물에서 활성 물질로 유리한 것으로 간주될 수 있다. 또한 다른 단백질과 본 발명에 따른 단백질의 조합이 바람직한 약학적 조성물에서 이용될 수 있다. 물론, 본 발명은 또한 예를 들면, 약리학적으로 허용가능한 첨가제 또는 담체와 같은 추가 물질을 함유하는 약학적 조성물을 포함한다. 제제(formulation)는 항산화제, 보존제, 착색제, 향미제 및 유화제, 현탁화제, 용매, 충전제, 증량제(bulking agent), 완충제, 전달 비히클(delivery vehicle), 부형제 및/또는 약학적 보조제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 적합한 담체 또는 비히클은 주사용수, 생리 식염수, 또는 혈청 알부민과 같이 적절한 담체 단백질과 혼합된 식염수(saline solution)일 수 있다. 본 발명의 조성물 제조를 위한 바람직한 항산화제는 아스코르브산이다.

약학적 조성물의 용매 또는 희석제는 수성 또는 비-수성일 수 있으며, 제제의 pH, 삼투압 농도(osmolarity), 점도, 투명도(clarity), 등급(scale), 무균도(steility), 안정성, 용해 속도, 또는 냄새를 변형 및/또는 유지시킬 수 있는 기타 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 유사하게 기타 성분이 약학적으로 유효한 물질의 방출 속도를 변형 및/또는 유지하기 위해 본 발명에 따른 약학적 조성물 안에 포함될 수 있다. 그와 같은 변형시키는 성분은 단위 투여량 또는 복수-투여량 제형으로 비경구 투여를 위한 투여량으로 제제화하기 위해 당해 기술분야에서 일반적으로 이용되는 물질이다.

본 발명에 따라 제조된 최종적으로 제제화된 약학적 조성물은 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체, 또는 탈수되거나(dehydrated) 또는 동결건조된 분말의 형태로 멸균 바이얼(vial) 내에 저장될 수 있다. 이러한 제제는, 바로 사용이 가능한(ready-to-use) 형태 또는, 예를 들면 동결건조된 분말의 경우에, 투여 전 재구성이 요구되는 형태로 저장될 수 있다. 상기 및 추가의 적합한 약학적 제제가 당해 기술 분야에서 공지되었고, 예를 들어, Gus Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., Mack Publishing Co., Eastern, Pa., 1990, 1435-1712)에 기재되었다. 그와 같은 제제는 약학적으로 유효한 성분의 물리적 상태, 안정성, 인 비보 방출 속도 및 인 비보 클리어런스(clearance) 속도에 영향을 줄 수 있다.

다른 효과적인 투여 형태는 비경구 서방성(slow-release), 즉 지연 방출 제제, 흡입 미스트, 또는 경구 활성 제제를 포함한다. 예를 들면, 서방성 제제는 폴리머 화합물 (예를 들면 폴리락트산, 폴리글리콜산 등)의 미립자 제제 또는 리포좀에 결합되거나 또는 혼입된 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 비경구 투여, 예를 들면, 주입(infusion) 또는 주사에 의한 투여를 위해 제제화될 수 있고, 또한 서방성 또는 지속 순환(sustained circulation) 제제를 포함할 수 있다. 그와 같은 비경구 투여 치료 조성물은 전형적으로, 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제 중 약학적으로 유효한 성분(들)을 포함하는, 발열 물질-불포함(pyrogen-free), 비경구 투여에 허용가능한 수성 용액의 형태이다.

약학적 조성물은 예를 들면 연골의 재생이 의도되는 경우에 매트릭스 물질을 포함할 수 있다. 그것은 단백질, 핵산, 발현 벡터 또는 숙주 세포가 생체적합한 매트릭스 재료 내에 및/또는 상에 적용되는 경우 그들에게 유리하다. 본 명세서에서 사용된 매트릭스 물질은 세포 동원(recruitment), 부착, 증식 및 분화를 위한 지지체(scaffold)로서 및/또는 본 발명의 재조합 GDF-5 관련 단백질을 위한 잠재적인 전달 및 저장 장치로서 작용하는 담체 또는 매트릭스를 의미한다. 고체 매트릭스와 대조적으로, 담체는 정의된 표면을 갖지 않고 특정 형태가 결여된 무정형 물질, 즉 알킬 셀룰로스, 플루로닉(pluronic), 젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트린, 식물성 오일(vegetable oil), 당(sugar) 및 기타 액상 및 점성 물질로 구성된다.

예시적 매트릭스 물질은 예를 들면 WO98/21972에서 기술된다. 이러한 매트릭스 물질은 본 발명에 따른 단백질에 대해 동등하게 적합하다. 매트릭스 물질은 환자 내로, 예를 들면, 외과적 수술에 의해 이식될 수 있으며, 상기 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 DNA는 매트릭스 물질로부터 천천히 방출될 수 있고 그리고 나서 장기에 걸쳐 유효할 수 있다. 모든 종류의 매트릭스 물질이 그들이 생체 적합성이고, 의도된 영역 또는 대상 적응증(indication of use)을 위해서 선택되는 한, 본 발명에 따라 유용하다. 매트릭스 물질은 천연 물질, 변형된 천연 물질 및 합성 물질일 수 있다. 형태 형성 단백질에 대해 이미 알려진 모든 매트릭스가 포함된다. 세포외 기질은 예를 들면 I, II, V, IX, X, XI 및 XIII형과 같은 다양한 콜라겐, 예를 들면 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfates), 비글리칸(biglycans), 데코린(decorine)과 같은 추가적인 프로테오글리칸 및 글리코사민 글리칸 및/또는 예를 들면 오스테오폰틴, 라미닌, 피브로넥틴, 비트로넥틴 및 연골 매트릭스 단백질과 같은 히알루론산 또는 비-콜라겐성(non-collageneous) 단백질을 포함한다. 모든 언급된 천연 물질은 또한 인공적으로 변형된 형태로 사용될 수 있다. 유용한 담체 및 매트릭스의 비-한정적 목록을 위해 (추가로 Kirker-Head, 2000, Advanced Drug Delivery 43, 65-92 참조).

본 발명의 추가적인 주제는 본 발명에 따른 재조합 GDF-5 관련 단백질을 포함하는 리포좀 제제에 관한 것이다. 상기 제제에 이용되는 리포좀은 당해 기술분야의 숙련자에게 통상적으로 알려져 있다. 특히, 바람직한 리포좀 제제는 WO 2008/049588에 기재되어 있다. 더욱 바람직한 리포좀 제제는 WO 2008/049588의 9 내지 13 페이지에 기재되어 있다.

또한, 본 발명의 GDF-5 관련 단백질은 다른 약학적 활성 물질과 조합하여 투여될 수 있다. 상기 약학적 활성 물질은 예를 들면, 국소적으로 효과 있는 진통제와 같은 진통제 또는 프로테아제 억제제와 같이, 연골의 형성이 요구되는 질병에 긍정적 효과를 갖는 기타 물질일 수 있다. 이들은 단지 가능한 첨가제의 예이고, 당해 기술 분야의 숙련자들은 약학적 제제에서 사용되거나 또는 일반적으로 안전한 것으로 여겨지는 다른 부형제를 쉽게 첨가할 수 있다.

그들의 연골 형성 유도의 증진된 능력으로 인해, 본 발명의 재조합 GDF-5 관련 단백질은 특히 연골의 형성은 바람직하지만 골 형성은 바람직하지 않는 질병 치료에 이용하기에 적합하다. 따라서 본 발명의 다른 양태는 이러한 질병의 치료에서의 본 발명의 단백질, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포의 용도이다. 특히, 본 발명의 단백질, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포는 연골 결손(cartilage defect)의 치료에 사용하기 위한 것이거나 또는 연골의 외상성 파열(traumatic rupture) 또는 박리(detachment),

특히 예를 들면 마모에서 기인한 연령-연관 연골 결손, 골관절염, 류마티스 관절염, 운동 관련 부상,

연골이영양증(chondrodystrophy)과 같은 연골에 영향을 미칠 수 있는 질병, 성장의 방해 및 후속 연골의 골화로 특징되는 질병, 연골무형성증(achondroplasia), 늑연골염(costochondritis), 추간판 헤르니아(spinal disc herniation) 및 추간판 복원(spinal disc repair), 재발성 다발연골염(relapsing polychondritis)의 치료,

연골종(chondroma) 또는 연골육종(chondrosarcoma)과 같은, 양성 또는 악성인 종양과 관련된 연골 결손의 복원(repair)을 위한 것이다.

본 발명의 다른 구체예는 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명에 따른 단백질, 핵산, 벡터 또는 숙주 세포를 투여하는 단계를 포함하는, 연골의 형성은 바람직하지만 골의 형성은 바람직하지 않는 질병을 치료하는 방법이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "치료(treating)"는 질병, 장애, 상태(condition)의 진행 또는 이 용어가 적용되는 그러한 질병, 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 경감시키거나 또는 억제하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된, 치료는 또한 치료받지 않은 대조군 집단과 비교하거나 또는 치료 전의 동일한 포유동물과 비교하여, 포유 동물에서 질병, 장애 또는 상태의 발생 확률 또는 빈도를 감소시키는 것을 의미할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에서 사용된, 치료는 질병, 장애 또는 상태를 예방하는 것을 의미할 수 있고 질병, 장애 또는 상태의 발병(onset)을 지연하거나 예방하는 것 또는 질병, 장애 또는 상태와 관련된 증상을 지연 또는 예방하는 것을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된, 치료는 또한 질병, 장애 또는 상태를 갖는 포유 동물의 고통 이전에 질병, 장애 또는 상태, 또는 그와 같은 질병, 장애 또는 상태와 관련된 증상의 중등도를 감소시키는 것을 의미한다. 그와 같은 고통 이전에 질병, 장애 또는 상태의 중등도의 예방 또는 감소는 투여 시에 질병, 장애 또는 상태를 앓지 않는 개체에 대한 본 명세서에서 기재한 바와 같은 본 발명의 조성물의 투여와 관련된다. 본 명세서에서 사용된, 치료는 또한 질병, 장애 또는 상태 또는 그와 같은 질병, 장애 또는 상태와 관련된 하나 이상의 증상의 재발을 예방하는 것을 의미할 수 있다.

하기 실시예는 도면 및 서열 프로토콜과 함께 본 발명을 더욱 설명하도록 의도된다.

서열번호 1은 인간 GDF-5 전구체의 DNA 서열을 보여주고, 서열번호 2는 인간 GDF-5 전구체의 단백질 서열을 보여준다.

서열번호 3은 인간 성숙 단량체(monomeric) GDF-5의 DNA 서열을 보여주고, 서열번호 4는 인간 성숙 단량체(monomeric) GDF-5의 단백질 서열을 보여준다.

도 1은 서열번호 2에 따른 인간 GDF-5 전구체 단백질의 추가적인 특징을 보여준다:
aa 001-381 프리-프로도메인(pre-prodomain) (볼드체)
aa 001-027 신호 펩티드 (볼드체 및 밑줄)
aa 382-501 성숙 단백질 부분
aa 400-501 시스틴-노트-도메인 (밑줄)
도 2는 인간 GDF-5 (서열번호 2), 인간 GDF-6 (U.S. 특허 제5,658,882호의 서열 26) 및 인간 GDF-7 (U.S. 특허 제5,658,882호의 서열 2)의 102개 aa 시스틴-노트-도메인의 비교를 보여준다. 3개 분자 모두에서 동일한 아미노산 잔기가 경계(border)에 의해 강조된다.
도 3은 재조합 인간 GDF-5 돌연변이체 W414R (실시예 2에서 기술됨)의 알칼라인 포스포타제(ALP) 분석의 결과를 보여준다.
도 4는 재조합 인간 GDF-5 돌연변이체 I449V (실시예 3에서 기술됨)의 알칼라인 포스포타제(ALP) 분석의 결과를 보여준다.
도 5는 재조합 인간 GDF-5 돌연변이체 R399E (실시예 3에서 기술됨)의 알칼라인 포스포타제(ALP) 분석의 결과를 보여준다.
도 6은 재조합 인간 GDF-5 돌연변이체 S439E (실시예 3에서 기술됨)의 알칼라인 포스포타제(ALP) 분석의 결과를 보여준다.
도 7은 재조합 인간 GDF-5 돌연변이체 R399M (실시예 3에서 기술됨)의 알칼라인 포스포타제(ALP) 분석의 결과를 보여준다.
도 8은 재조합 인간 GDF-5 돌연변이체 W414R (실시예 3에서 기술됨)의 알칼라인 포스포타제(ALP) 분석의 결과를 보여준다.

실시예 1: GDF -관련 단백질의 제조, 발현 및 정제

인간 ROB-C26 골전구세포(osteoprogenitor cell) (Yamaguchi et al. 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225)로부터 RT-PCR 기법을 통해 인간 GDF-5, 인간 GDF-6 및 인간 GDF-7 단백질의 성숙 부분을 코딩하는 DNA를 단리한 후 원핵 플라스미드 벡터로 라이게이션하였다(ligated). GDF-5, -6 및 -7의 성숙 부위 중 기능상 중요한 아미노산을 확인하기 위하여, 여러 단일 돌연변이를 부위 지정 돌연변이 유발을 통해 이들 서열 내에 도입하였다. Stratagene으로부터 입수한 PfuTurboTm DNA 폴리머라제 및 DPN I 엔도뉴클라제를 포함하는 QuickChangeTM 위치-지정 돌연변이 유발 키트를 제조사의 설명 메뉴얼에 따라 사용하여 모든 개별 돌연변이를 제조하였다.

플라스미드로 형질전환시키 IPTG에 의해 유도시킨 박테리아 균주 W3110BP를 이용하여, 단백질을 봉입체(inclusion body)로 발현시켰다. 이 봉입체를 균질화 완충액(homogenization buffer) (25 mM Tris HCl pH 7.3, 10 mM EDTA NaOH pH 8, 8 M 우레아) 및 세척 완충액 (1 M 우레아, 20 mM Tris HCl, pH 8.3, 10 mM EDTA NaOH pH 8.0)을 이용하여 표준 절차에 따라 단리하였다. 역상 컬럼 아쿠아포어 옥틸(Aquapore Octyl) (Applied Biosys, (CV = 7,8 ml) 100x10, 20μ No 186470) 상에서 100%의 용출액 A (0.1 % TFA, HPLC H₂O) 내지 100% 용출액 B (0.1 % TFA, 90 % CH₃N, HPLC H₂O)의 구배를 이용하여 104분 동안 추가 정제를 수행하였다 (유속: 3 ml/min). 웨스턴 블롯 조정(western blot control) 후, 돌연변이 단백질을 함유한 분획을 풀링하고 동결건조하였다.

이 돌연변이 단백질을 용해 완충액(dissolving buffer) (6 M 구아니딘 HCl, 50 m M Tris, 150 mM NaCl, 3 mM DTT, pH = 8.0) 중에 용해하고, 단백질 농도를 2.6 mg/ml 로 정확히 조정하고 pH를 8 내지 9로 조정하였다. 실온에서 2 h 인큐베이션 후, 리폴딩(refolding) 완충액 (1 M NaCl, 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 mM GSSG, 2 mM GSH, 33 mM Chaps, pH = 9.5)을 부드러운 교반(agitation) 하에 0.16 mg/ml의 최종 농도에 도달하도록 첨가하였다.

그 후 용액을 48 h 동안 22℃에서 인큐베이션하고 18% HCl의 첨가에 의해 pH를 3-4로 변화시킴으로써 리폴딩을 중지시켰다. 원심분리 후, 동일 조건 하에서 두 번째 RP-HPLC를 수행함으로써 리폴딩되지 않은 단량체를 이량체 형태로부터 분리하였다. 이량체화된 단백질을 함유한 분획을 풀링하고, 동결건조하고 -70℃에 저장하였다.

실시예 2: 인 비트로에서 ALP 분석에 의한 GDF -관련 단백질의 상이한 변이체 의 생물학적 활성 측정

2.0x10⁵개의 C2C12-Ib 세포 (BMPR-IB 수용체를 안정적으로 과발현하는 세포주) 및 C2C12 세포를 20 ml의 세포 배양 배지 (알파-MEM, 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 10% FCS) 중에서 3-4일 동안 37℃, 5% CO₂, H₂O-포화된 대기(saturated)에서 인큐베이션하였다 . 그 후 세포를 PBS (인산염 완충 식염수)로 세척하고, 트립신 처리하고 3x10⁴개 세포/ml의 밀도로 배양 배지 중에 재현탁하였다. 150 ㎕를 96 웰(well) 배양 플레이트의 각 웰로 옮기고 24 h 동안 37℃, 5% CO₂, H₂O-포화된 대기에서 인큐베이션하였다. 배지로 세척한 후 웰을 120 ㎕의 신선한 배양 배지로 채웠다. 돌연변이 또는 야생형 단백질의 상이한 희석액 40 ㎕ (10 mM HCl 중에 용해되고 배지 중에서 250배 이상 희석됨)를 첨가한 후, 72 h 동안 37℃, 5% CO₂, H₂O-포화된 대기에서 또 다른 인큐베이션 단계를 수행하였다. PBS로 세척한 후, 150 ㎕의 용해 용액 (0,2% Nonidet P40, 0,2g MgCl₂ x 6H₂O, 물을 이용하여 1000 ml로 조정됨)을 첨가한 후, 37℃, 5% CO₂, H₂O-포화된 대기에서 15-18h 인큐베이션을 수행하였다. 그 후 각 웰 중 50 ㎕를 새로운 96 웰 플레이트로 옮겼다. 그 후 50 ㎕의 기질 용액 (2,5x 농축된 디에탄올아민 기질 완충액 + 148g/l PNPP (소듐 p-니트로페닐-포스페이트))를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 4분 동안 37℃, 5% CO₂, H₂O-포화된 대기에서 인큐베이션하였다. 그 뒤 ALP-반응을 100 ㎕의 30g/l NaOH에 의해 중지시키고 최종적으로 405 nm에서 블랭크 값 감산(blank value subtraction)의 고려하에 자동 마이크로플레이트 판독기에 의해 광학 밀도를 측정하였다.

일례로, C2C12-Ib 세포에 있어서 hGDF-5 돌연변이 W414R에 대한 결과 (2개의 독립적인 실험의 평균값)를 도 3에 도시한다. 이 분석에서 5개의 상이한 단백질 농도 (14 ng/mL, 44.5 ng/mL, 133.2 ng/mL, 400 ng/mL 및 1200 ng/mL)를 사용하였다. 돌연변이 단백질 W414R은 BMPR-IB 수용체가 과발현되는 세포 (C2C12-Ib 세포)에서 생물학적 활성을 나타내어, W414R의 BMPR-IB 결합 부위가 기능상 활성 상태라는 것을 나타낸다. 이 분석 시스템에서 야생형 단백질 (rhGDF-5)은 대조군으로 제공되었다.

세포주 C2C12 및 C2C12-Ib에 대한 hGDF-5 돌연변이의 생물학적 활성의 추가의 결과가 표 1에 표시된다.

실시예 3: 인 비트로에서 ALP 분석에 의한 GDF -관련 단백질의 상이한 변이체의 생물학적 활성 측정

ATDC-5 세포의 5x10⁵ 개 세포 및 MCHT1/26의 경우 5x10⁵ 개의 세포를 3-4일 동안 20 ml 세포 배양 배지 (알파-MEM, 2 mM L-글루타민, 10% FCS; MCHT1/26의 경우, DMEM/F12 (1:1), 5% FCS) 중에 37℃, 5% CO₂, H₂O-포화된 대기에서 인큐베이션하였다. 그 후 세포를 PBS (인산염 완충 식염수)로 세척하고, 트립신 처리하고 3x10⁴개세포/ml의 밀도로 배양 배지 중에 재현탁하였다. 150 ㎕를 96 웰 배양 플레이트의 각 웰로 옮기고 24 h 동안 37℃, 5% CO₂, H2O-포화된 대기에서 인큐베이션하였다. 배지로 세척한 후 웰을 MCHT1/26의 경우 120 ㎕의 신선한 배양 배지로 채우고 ATDC-5의 경우 120 ㎕의 분석 배지(DMEM/F12 (1:1), 0.5% FCS) 및 돌연변이 또는 야생형 단백질의 상이한 희석액 40 ㎕ (10 mM HCl 중에 용해되고 배지 중에서 250배 이상 희석됨)를 첨가한 후, 72 h 동안 37℃, 5% CO₂, H₂O-포화된 대기에서 또 다른 인큐베이션 단계를 수행하였다. PBS로 세척한 후, 150 ㎕의 용해 용액 (MCHT1/26 용해 용액: 0,2% Nonidet P40, 1 mM MgCl₂; ATDC-5 용해 용액: 100 mM Na-글리신, 1% Nonidet P40, 1 mM MgCl₂)을 첨가한 후, 37℃, 5% CO₂, H₂O-포화된 대기에서 ATDC-5의 경우 1 h 인큐베이션 및 MCHT1/26의 경우 15 - 18h 인큐베이션을 수행하였다. 그 후 각 웰 중 50 ㎕를 새로운 96 웰 플레이트로 옮겼다. 그 후 50 ㎕의 기질 용액 (2,5x 농축된 디에탄올아민 기질 완충액 + 148g/l PNPP (소듐 p-니트로페닐-포스페이트))를 각 웰에 첨가하고 플레이트를 60분 동안 37℃, 5% CO₂, H₂O-포화된 대기에서 인큐베이션하였다. 그 뒤 ALP-반응을 100 ㎕의 30g/l NaOH에 의해 중지시키고 최종적으로 405 nm에서 블랭크 값 감산의 고려하에 자동 마이크로플레이트 판독기에 의해 광학 밀도를 측정하였다.

hGDF-5 돌연변이 I449V, R399E, S439E, R399M, W414R에 관한 예시적인 결과 (2개의 독립적인 실험의 평균값)를 각각 도 4-8에 도시한다. 이 분석에서 5개의 상이한 단백질 농도 (14.8 ng/ml, 44.5 ng/ml, 133.2 ng/ml, 400 ng/ml, 1200 ng/ml)를 사용하였다. 이 분석 시스템에서 MCHT1/26 세포에 비하여 ATDC-5 세포에서 돌연변이 단백질은 야생형 GDF-5에 비해 보다 높은 생물학적 활성을 나타낸다.

실시예 4: GDF -5-관련 단백질의 Biacore 친화도 측정

모든 바이오센서 실험에서 BiacoreT100 시스템 (Biacore, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, GB)을 사용하였다. BMPR-IB, BMPR-IA, 또는 BMPR-II의 Fc-융합 단백질 수용체 엑토도메인(ectodomain)의 약 200 RU(resonance unit)를 단백질 G CM5 바이오센서 칩에 고정화시켰다.

10 mM HEPES (pH 7.4), 300 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% Tween 20 중에서 30℃에서 60 ㎕/분의 유속으로 상호작용 센소그램(interaction sensorgram)을 기록하였다. 0.05 내지 100 nM의 리간드 농도를 사용하여 실험을 2회로(in duplicate) 수행하였다. BIAevaluation v. 2.2.4 (Biacore, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, GB)를 이용하여 모든 겉보기 결합 친화도(apparent binding affinity)를 수득하였다. 동역학적 데이터(kinetic data)를 1:1 랑뮈르(Langmuir) 결합 모델 (KD (kin))에 피팅(fitting)함으로써 리간드 타입 I 수용체 상호작용에 대한 친화도를 유도하였다. (106 M-1 s-1 (kon의 경우) 및 10-2 s-1 (koff의 경우)을 초과하는) 과도하게 빠른 결합 반응속도(binding kinetics)로 인해 평형 결합(equilibrium binding)(KD (eq))의 용량 의존성(dose dependency)으로부터 리간드:BMPR-II 상호작용에 대한 겉보기 결합 친화도를 결정하였다.

인간 GDF-5의 상이한 변이체에 대한 Biacore 친화도 측정결과가 표 1에 표시된다.

SEQUENCE LISTING <110> Biopharm Gesellschaft zur biotechnologischen Entwicklung von Pharmaka mbH <120> GDF-5 mutant for inducing cartilage formation <130> 52328P EP <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2703 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (640)..(2142) <223> GDF-5 precursor <400> 1 ccatggcctc gaaagggcag cggtgatttt tttcacataa atatatcgca cttaaatgag 60 tttagacagc atgacatcag agagtaatta aattggtttg ggttggaatt ccgtttccaa 120 ttcctgagtt caggtttgta aaagattttt ctgagcacct gcaggcctgt gagtgtgtgt 180 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtga agtattttca ctggaaagga ttcaaaacta 240 gggggaaaaa aaaactggag cacacaggca gcattacgcc attcttcctt cttggaaaaa 300 tccctcagcc ttatacaagc ctccttcaag ccctcagtca gttgtgcagg agaaaggggg 360 cggttggctt tctcctttca agaacgagtt attttcagct gctgactgga gacggtgcac 420 gtctggatac gagagcattt ccactatggg actggataca aacacacacc cggcagactt 480 caagagtctc agactgagga gaaagccttt ccttctgctg ctactgctgc tgccgctgct 540 tttgaaagtc cactcctttc atggtttttc ctgccaaacc agaggcacct ttgctgctgc 600 cgctgttctc tttggtgtca ttcagcggct ggccagagg atg aga ctc ccc aaa 654 Met Arg Leu Pro Lys 1 5 ctc ctc act ttc ttg ctt tgg tac ctg gct tgg ctg gac ctg gaa ttc 702 Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp Leu Asp Leu Glu Phe 10 15 20 atc tgc act gtg ttg ggt gcc cct gac ttg ggc cag aga ccc cag ggg 750 Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly Gln Arg Pro Gln Gly 25 30 35 acc agg cca gga ttg gcc aaa gca gag gcc aag gag agg ccc ccc ctg 798 Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys Glu Arg Pro Pro Leu 40 45 50 gcc cgg aac gtc ttc agg cca ggg ggt cac agc tat ggt ggg ggg gcc 846 Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser Tyr Gly Gly Gly Ala 55 60 65 acc aat gcc aat gcc agg gca aag gga ggc acc ggg cag aca gga ggc 894 Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr Gly Gln Thr Gly Gly 70 75 80 85 ctg aca cag ccc aag aag gat gaa ccc aaa aag ctg ccc ccc aga ccg 942 Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys Leu Pro Pro Arg Pro 90 95 100 ggc ggc cct gaa ccc aag cca gga cac cct ccc caa aca agg cag gct 990 Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro Gln Thr Arg Gln Ala 105 110 115 aca gcc cgg act gtg acc cca aaa gga cag ctt ccc gga ggc aag gca 1038 Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala 120 125 130 ccc cca aaa gca gga tct gtc ccc agc tcc ttc ctg ctg aag aag gcc 1086 Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe Leu Leu Lys Lys Ala 135 140 145 agg gag ccc ggg ccc cca cga gag ccc aag gag ccg ttt cgc cca ccc 1134 Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu Pro Phe Arg Pro Pro 150 155 160 165 ccc atc aca ccc cac gag tac atg ctc tcg ctg tac agg acg ctg tcc 1182 Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu Tyr Arg Thr Leu Ser 170 175 180 gat gct gac aga aag gga ggc aac agc agc gtg aag ttg gag gct ggc 1230 Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val Lys Leu Glu Ala Gly 185 190 195 ctg gcc aac acc atc acc agc ttt att gac aaa ggg caa gat gac cga 1278 Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys Gly Gln Asp Asp Arg 200 205 210 ggt ccc gtg gtc agg aag cag agg tac gtg ttt gac att agt gcc ctg 1326 Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe Asp Ile Ser Ala Leu 215 220 225 gag aag gat ggg ctg ctg ggg gcc gag ctg cgg atc ttg cgg aag aag 1374 Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg Ile Leu Arg Lys Lys 230 235 240 245 ccc tcg gac acg gcc aag cca gcg gcc ccc gga ggc ggg cgg gct gcc 1422 Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly Gly Gly Arg Ala Ala 250 255 260 cag ctg aag ctg tcc agc tgc ccc agc ggc cgg cag ccg gcc tcc ttg 1470 Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg Gln Pro Ala Ser Leu 265 270 275 ctg gat gtg cgc tcc gtg cca ggc ctg gac gga tct ggc tgg gag gtg 1518 Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Gly Trp Glu Val 280 285 290 ttc gac atc tgg aag ctc ttc cga aac ttt aag aac tcg gcc cag ctg 1566 Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys Asn Ser Ala Gln Leu 295 300 305 tgc ctg gag ctg gag gcc tgg gaa cgg ggc agg gcc gtg gac ctc cgt 1614 Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg Ala Val Asp Leu Arg 310 315 320 325 ggc ctg ggc ttc gac cgc gcc gcc cgg cag gtc cac gag aag gcc ctg 1662 Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val His Glu Lys Ala Leu 330 335 340 ttc ctg gtg ttt ggc cgc acc aag aaa cgg gac ctg ttc ttt aat gag 1710 Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp Leu Phe Phe Asn Glu 345 350 355 att aag gcc cgc tct ggc cag gac gat aag acc gtg tat gag tac ctg 1758 Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr Val Tyr Glu Tyr Leu 360 365 370 ttc agc cag cgg cga aaa cgg cgg gcc cca ctg gcc act cgc cag ggc 1806 Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly 375 380 385 aag cga ccc agc aag aac ctt aag gct cgc tgc agt cgg aag gca ctg 1854 Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu 390 395 400 405 cat gtc aac ttc aag gac atg ggc tgg gac gac tgg atc atc gca ccc 1902 His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro 410 415 420 ctt gag tac gag gct ttc cac tgc gag ggg ctg tgc gag ttc cca ttg 1950 Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu 425 430 435 cgc tcc cac ctg gag ccc acg aat cat gca gtc atc cag acc ctg atg 1998 Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met 440 445 450 aac tcc atg gac ccc gag tcc aca cca ccc acc tgc tgt gtg ccc acg 2046 Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr Cys Cys Val Pro Thr 455 460 465 cgg ctg agt ccc atc agc atc ctc ttc att gac tct gcc aac aac gtg 2094 Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val 470 475 480 485 gtg tat aag cag tat gag gac atg gtc gtg gag tcg tgt ggc tgc agg 2142 Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 490 495 500 tagcagcact ggccctctgt cttcctgggt ggcacatccc aagagcccct tcctgcactc 2202 ctggaatcac agaggggtca ggaagctgtg gcaggagcat ctacacagct tgggtgaaag 2262 gggattccaa taagcttgct cgctctctga gtgtgacttg ggctaaaggc ccccttttat 2322 ccacaagttc ccctggctga ggattgctgc ccgtctgctg atgtgaccag tggcaggcac 2382 aggtccaggg agacagactc tgaatgggac tgagtcccag gaaacagtgc tttccgatga 2442 gactcagccc accatttctc ctcacctggg ccttctcagc ctctggactc tcctaagcac 2502 ctctcaggag agccacaggt gccactgcct cctcaaatca catttgtgcc tggtgacttc 2562 ctgtccctgg gacagttgag aagctgactg ggcaagagtg ggagagaaga ggagagggct 2622 tggatagagt tgaggagtgt gaggctgtta gactgttaga tttaaatgta tattgatgag 2682 ataaaaagca aaactgtgcc t 2703 <210> 2 <211> 501 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Arg Leu Pro Lys Leu Leu Thr Phe Leu Leu Trp Tyr Leu Ala Trp 1 5 10 15 Leu Asp Leu Glu Phe Ile Cys Thr Val Leu Gly Ala Pro Asp Leu Gly 20 25 30 Gln Arg Pro Gln Gly Thr Arg Pro Gly Leu Ala Lys Ala Glu Ala Lys 35 40 45 Glu Arg Pro Pro Leu Ala Arg Asn Val Phe Arg Pro Gly Gly His Ser 50 55 60 Tyr Gly Gly Gly Ala Thr Asn Ala Asn Ala Arg Ala Lys Gly Gly Thr 65 70 75 80 Gly Gln Thr Gly Gly Leu Thr Gln Pro Lys Lys Asp Glu Pro Lys Lys 85 90 95 Leu Pro Pro Arg Pro Gly Gly Pro Glu Pro Lys Pro Gly His Pro Pro 100 105 110 Gln Thr Arg Gln Ala Thr Ala Arg Thr Val Thr Pro Lys Gly Gln Leu 115 120 125 Pro Gly Gly Lys Ala Pro Pro Lys Ala Gly Ser Val Pro Ser Ser Phe 130 135 140 Leu Leu Lys Lys Ala Arg Glu Pro Gly Pro Pro Arg Glu Pro Lys Glu 145 150 155 160 Pro Phe Arg Pro Pro Pro Ile Thr Pro His Glu Tyr Met Leu Ser Leu 165 170 175 Tyr Arg Thr Leu Ser Asp Ala Asp Arg Lys Gly Gly Asn Ser Ser Val 180 185 190 Lys Leu Glu Ala Gly Leu Ala Asn Thr Ile Thr Ser Phe Ile Asp Lys 195 200 205 Gly Gln Asp Asp Arg Gly Pro Val Val Arg Lys Gln Arg Tyr Val Phe 210 215 220 Asp Ile Ser Ala Leu Glu Lys Asp Gly Leu Leu Gly Ala Glu Leu Arg 225 230 235 240 Ile Leu Arg Lys Lys Pro Ser Asp Thr Ala Lys Pro Ala Ala Pro Gly 245 250 255 Gly Gly Arg Ala Ala Gln Leu Lys Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gly Arg 260 265 270 Gln Pro Ala Ser Leu Leu Asp Val Arg Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly 275 280 285 Ser Gly Trp Glu Val Phe Asp Ile Trp Lys Leu Phe Arg Asn Phe Lys 290 295 300 Asn Ser Ala Gln Leu Cys Leu Glu Leu Glu Ala Trp Glu Arg Gly Arg 305 310 315 320 Ala Val Asp Leu Arg Gly Leu Gly Phe Asp Arg Ala Ala Arg Gln Val 325 330 335 His Glu Lys Ala Leu Phe Leu Val Phe Gly Arg Thr Lys Lys Arg Asp 340 345 350 Leu Phe Phe Asn Glu Ile Lys Ala Arg Ser Gly Gln Asp Asp Lys Thr 355 360 365 Val Tyr Glu Tyr Leu Phe Ser Gln Arg Arg Lys Arg Arg Ala Pro Leu 370 375 380 Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys Ala Arg Cys 385 390 395 400 Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly Trp Asp Asp 405 410 415 Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys Glu Gly Leu 420 425 430 Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn His Ala Val 435 440 445 Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr Pro Pro Thr 450 455 460 Cys Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu Phe Ile Asp 465 470 475 480 Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met Val Val Glu 485 490 495 Ser Cys Gly Cys Arg 500 <210> 3 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <223> human mature monomeric GDF-5 <400> 3 gca cca cta gca act cgt cag ggc aag cga ccc agc aag aac ctt aag 48 Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys 1 5 10 15 gct cgc tgc agt cgg aag gca ctg cat gtc aac ttc aag gac atg ggc 96 Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly 20 25 30 tgg gac gac tgg atc atc gca ccc ctt gag tac gag gct ttc cac tgc 144 Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys 35 40 45 gag ggg ctg tgc gag ttc cca ttg cgc tcc cac ctg gag ccc acg aat 192 Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn 50 55 60 cat gca gtc atc cag acc ctg atg aac tcc atg gac ccc gag tcc aca 240 His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr 65 70 75 80 cca ccc acc gcc tgt gtg ccc acg cga ctg agt ccc atc agc atc ctc 288 Pro Pro Thr Ala Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu 85 90 95 ttc att gac tct gcc aac aac gtg gtg tat aag cag tat gag gac atg 336 Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met 100 105 110 gtc gtg gag tcg tgt ggc tgt agg 360 Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115 120 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Pro Leu Ala Thr Arg Gln Gly Lys Arg Pro Ser Lys Asn Leu Lys 1 5 10 15 Ala Arg Cys Ser Arg Lys Ala Leu His Val Asn Phe Lys Asp Met Gly 20 25 30 Trp Asp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Leu Glu Tyr Glu Ala Phe His Cys 35 40 45 Glu Gly Leu Cys Glu Phe Pro Leu Arg Ser His Leu Glu Pro Thr Asn 50 55 60 His Ala Val Ile Gln Thr Leu Met Asn Ser Met Asp Pro Glu Ser Thr 65 70 75 80 Pro Pro Thr Ala Cys Val Pro Thr Arg Leu Ser Pro Ile Ser Ile Leu 85 90 95 Phe Ile Asp Ser Ala Asn Asn Val Val Tyr Lys Gln Tyr Glu Asp Met 100 105 110 Val Val Glu Ser Cys Gly Cys Arg 115 120

Claims

연골 형성 유도의 증진된 능력 및 골 형성 유도의 감소된 능력을 갖는 GDF-5-관련 단백질로서, 상기 단백질은 BMP 수용체 IB (BMPR-IB)에 대한 증가된 친화도 및/또는 BMP 수용체 IA (BMPR-IA)에 대한 감소된 친화도를 갖는 것인 GDF-5-관련 단백질.
청구항 1에 있어서, 상기 단백질은 바람직하게는 유전 공학 기술에 의해, GDF-5-관련 단백질의 아미노산 서열 내 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위와 관련된 하나 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 수득되는 것인 단백질.
청구항 2에 있어서, 상기 단백질은 인간 야생형 GDF-5-관련 단백질, 특히 인간 GDF-5, GDF-6 또는 GDF-7로부터 유래되는 것인 단백질.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, GDF-5-관련 단백질의 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위 내 하나 이상의 소수성 아미노산이 친수성 또는 극성 아미노산으로 치환된 것인 단백질.
청구항 4에 있어서, 상기 친수성 아미노산 잔기 또는 극성 아미노산 잔기가 아스파르트산, 글루탐산, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 세린 및 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, GDF-5 관련 단백질의 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위 내 하나 이상의 친수성 또는 극성 아미노산이 소수성 아미노산으로 치환된 것인 단백질.
청구항 6에 있어서, 상기 소수성 아미노산 잔기는 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 티로신, 발린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질.
청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, GDF-5 관련 단백질의 BMPR-IB 및/또는 BMPR-IA 결합 부위 내 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환을 포함하며,
특히 소수성 아미노산이 더 작거나 또는 더 큰 소수성 아미노산으로 치환되거나 또는 친수성 또는 극성 아미노산이 더 작거나 또는 더 큰 친수성 또는 극성 아미노산으로 치환된 것인 단백질.
청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 따른 단백질을 코딩하는 핵산.
연골의 형성은 바람직하지만 골의 형성은 바람직하지 않는 질병의 치료에 사용하기 위한, 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 따른 단백질 또는 청구항 9의 핵산.
청구항 10에 있어서, 연골 결손 치료에서 이용 또는 연골의 외상 파열 또는 박리,
특히 예를 들면 마모에서 기인한 연령-연관 연골 결손, 골관절염, 류마티스 관절염, 운동 관련 부상,
연골위영양증(chondrodystrophy)과 같은 연골에 영향을 미칠 수 있는 질병, 성장의 방해 및 후속 연골의 골화를 특징으로 하는 질병, 연골무형성증(achondroplasia), 늑연골염(costochondritis), 추간판 헤르니아(spinal disc herniation) 및 추간판 복원(spinal disc repair), 재발성 다발연골염(relapsing polychondritis)의 치료,
연골종(chondroma) 또는 연골육종(chondrosarcoma)과 같은, 양성 또는 악성 종양과 관련된 연골 결손의 복원에서 사용하기 위한 것인 단백질 또는 핵산.
선택적으로 약학적으로 허용가능한 첨가제 또는 담체와 조합된, 활성성분으로서 청구항 1-8 중 어느 한 항에 따른 단백질, 청구항 9에 따른 핵산, 청구항 9의 핵산을 포함하는 벡터, 또는 청구항 9의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물.
(i) BMP 수용체 IB 및/또는 BMP 수용체 IA 결합 부위와 관련된 GDF-5-관련 단백질의 영역에서 하나 이상의 아미노산 위치를 무작위화시켜(randomize) 단백질 변이체를 수득하는 단계,
(ii) BMP 수용체 IB 및/또는 BMP 수용체 IA에 대한 친화도에 관하여 (i)에서 수득한 단백질 변이체를 분석하는 단계,
(iii) BMP 수용체 IB (BMPR-IB)에 대한 증가된 친화도 및/ 또는 BMP 수용체 IA (BMPR-IA)에 대한 감소된 친화도를 제공하는 단백질 변이체를 선별하는 단계를
포함하는, 청구항 1-8 중 어느 한 항에 따른 GDF-5-관련 단백질을 생산하는 방법.
청구항 1-8 중 어느 한 항에 따른 단백질에 대한 항체.