RS58253B1

RS58253B1 - Mutant gdf-5 za indukciju formiranja hrskavice

Info

Publication number: RS58253B1
Application number: RS20190038A
Authority: RS
Inventors: Frank Plöger; Florian Wagner
Original assignee: Biopharm Ges Zur Biotechnologischen Entwicklung Von Pharmaka Mbh
Priority date: 2011-12-05
Filing date: 2012-12-05
Publication date: 2019-03-29
Also published as: AU2012347305A1; HUE033025T2; MX2014006465A; KR102067724B1; HUE042191T2; ES2708675T3; EP2788374B1; HRP20170205T1; US20140369978A1; CA2856458A1; EA201491119A1; ES2630853T3; MX351809B; EA028554B1; DK3168230T3; AU2012347305B2; CN104039820A; HRP20190160T8; PT3168230T; CA2856458C

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak je usmeren na proteine srodne sa GDF-5 koji imaju poboljšanu sposobnost indukcije formiranja hrskavice i smanjenu sposobnost indukcije formiranja kosti. Novi proteini su naročito korisni u lečenju defekata hrskavice, pri čemu je formiranje tkiva kosti nepoželjno.

[0002] Sinovijalni zglobovi su esencijalni za biomehaničku funkciju skeleta. Nepodesna funkcija kao što je zabeležena kod artritičkih bolesti direktno rezultira u teškom gubitku kvaliteta života. Prema tome, biologija zgloba je bila fokus ekstenzivnog istraživanja godinama dovodeći do razumevanja anatomije i histologije zgloba kao i biomehaničkih osobina i uloga artikularne hrskavice i drugih komponenti u funkciji i održavanju zgloba.

[0003] GDF-5 (Hötten et al. 1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652) je morfogen za koji je pokazano da stimuliše ćelijsku proliferaciju, diferencijaciju i/ili formiranje tkiva kod nekoliko tkiva. Protein je takođe poznat kao morfogeni protein MP52, morfogenetički protein-14 kosti (BMP-14) ili morfogenetički protein-1 poreklom iz hrskavice (CDMP-1). GDF-5 pokazuje hondrogenu aktivnost i kongenitalne mutacije GDF-5 izazivaju defekte u prstu, ručnim i nožnim zglobovima kod miševa i ljudi (Storm et al., 1994; Thomas et al., 1997). Ekspresija GDF-5 je najupečatljivije ograničena na regione gde će se razviti zglobovi i to je jedan od najranijih markera formiranja zgloba (Storm and Kingsley, 1999). Prenos signala BMP receptora je potreban za postnatalno održavanje zglobne hrskavice (Rountree, 2004, PLoS Biol.2004 November, 2(11))

[0004] GDF-5 je blisko srodan sa GDF-6 i GDF-7. Ova tri proteina formiraju posebnu podgrupu TGF-β superfamilije, na taj način ispoljavajući slične biološke osobine i izuzetno visok stepen identičnosti aminokiselinskih sekvenci (videti Wolfman et al. 1997, J. Clin. Invest. 100, 321-330). Svi članovi familije su početno sintetisani kao veći prekursorski proteini koji zatim podležu proteolitičkom odvajanju na klasteru baznih ostataka približno 110-140 aminokiselina sa C-terminusa, na taj način oslobađajući C-terminalne zrele proteinske delove sa N-terminalnog prodomena. Zreli polipeptidi su strukturno srodni i sadrže konzervativan bioaktivni domen koji sadrži šest ili sedam kanonskih cisteinskih ostataka koji je odgovoran za karakterističan trodimenzionalni "cistinski-čvor" motiv ovih proteina. Nativni proteini srodni sa GDF-5 su homodimerni molekuli i deluju uglavnom preko interakcije sa specifičnim receptornim kompleksima koji su sastavljeni od tipa I i tipa II serin/treonin receptor kinaza. Receptor kinaze zatim aktiviraju Smad proteine, koji zatim umnožavaju signale u jedru da bi se regulisala ekspresija ciljnog gena.

[0005] Više puta je pokazano da su članovi GDF-5/-6/-7 podgrupe primarno značajni induktori i regulatori kostiju i hrskavice (Cheng et al.2003, J. Bone & Joint Surg.85A, 1544-1552; Settle et al.2003, Developm. Biol.254, 116-130). GDF-5 i srodni proteini se vezuju za i oligomerizuju dva tipa serin-treonin kinaznih receptora vezanih za membranu označenih kao tip I i II. Posle vezivanja liganda, ovi kompleksi transdukuju signale preko fosforilišućih članova SMAD familije transkripcionih faktora, koji posle aktivacije ulaze u jedro i regulišu transkripciju responsivnih gena (Massague, 1996). Nedavni eksperimenti su uključili dva različita tip I receptora u strukturiranju skeleta, BMPR-IA i BMPR-IB. Oba receptora su eksprimirana u dinamičkim obrascima u toku normalnog razvoja. U nekoliko struktura uda, na primer, u interzonama i perihondrijumu zgloba, zabeležena je preklapajuća ekspresija BMPR-IA i BMPR-IB (Mishina et al., 1995; Zou et al, 1997; Baur et al, 2000). U vezi sa obrascima ekspresije BMPR-IA i BMPR-IB, transdukcija GDF-5 signala bi trebalo da je postignuta interakcijom sa oba BMPR-IA i BMPR-IB (Chang et al., 1994; Zou et al., 1997). Nula mutacije u bmpr-1b genu proizvode vijabilne miševe sa defektima u formiranju kosti i zgloba koji su veoma slični onima zabeleženim kod miševa kojima nedostaje GDF-5 (Storm and Kingsley, 1996; Yi et al, 2000), dok je poznato da bmpr-Ia/ miševi umiru rano u embriogenezi (Mishina et al, 1995). Međutim, uslovni „knockout“ BMPR-IA pod kontrolom drajvera GDF-5-Cre izbegava embrionalnu letalnost i proizvodi vijabilne miševe sa normalno formiranim zglobovima. Ali, posle rođenja zglobna hrskavica unutar zglobova se izliže u postupku koji podseća na osteoartritis, što ukazuje na značaj ovog receptora u homeostazi i popravci hrskavice (Rountree et al., 2004).

[0006] Aktivnost proteina divljeg tipa familije proteina srodnog sa GDF-5 generalno rezultira u formiranju hrskavice i kosti. Međutim, postoje različita medicinska stanja, gde je formiranje hrskavice poželjno, međutim, formiranje koštanog tkiva je nepoželjno. Na primer, očigledno je da je u slučaju defekata zgloba, formiranje hrskavice poželjno, dok bi osifikacija trebalo da se izbegava.

[0007] Prema tome, cilj predmetnog pronalaska je da specifično koristi efekat indukcije formiranja hrskavice proteina srodnih sa GDF-5 i da isključi indukcioni efekat formiranja kosti. Ovaj cilj je rešen obezbeđivanjem varijantnih proteina zrelog humanog GDF-5 kao što je predstavljen aminokiselinama 382 do 501 iz SEQ ID NO: 2 koji sadrže aminokiselinsku supstituciju izabranu od R399M, W414R i I449V. Iznenađujuće, nađeno je da je moguće obezbediti varijante proteina srodnih sa GDF-5 koji imaju poboljšanu sposobnost da indukuju formiranje hrskavice i smanjenu sposobnost indukcije formiranja kosti. Ovo se može postići modifikacijom proteina srodnih sa GDF-5 tako da oni imaju povećani afinitet za BMPR-IB i/ili smanjeni afinitet za BMPR-IA.

[0008] Divlji tip GDF-5 vezuje BMPR-IB in vitro sa oko 40- do 120-puta većim afinitetom (KD ~ 8-27 pM) u poređenju sa BMPR-IA (KD ~ 1-1,1 nM). Nađeno je da je putem modifikacije afiniteta vezivanja proteina srodnih sa GDF-5 tako da je afinitet za BMPR-IB povećan, dok je afinitet za BMPR-IA smanjen, formiranje hrskavice olakšano dok je formiranje kosti smanjeno. Ovo se može postići specifičnim supstitucijama jednog ili više aminokiselinskih ostataka vezanih za BMPR-IB i/ili BMPR-IA vezujuće mesto u aminokiselinskoj sekvenci proteina srodnog sa GDF-5.

[0009] Vezujući afinitet proteina srodnih sa GDF-5 koji imaju specifične supstitucije je upoređivan sa vezujućim afinitetom humanog divljeg tipa proteina srodnog sa GDF-5, naročito humanog divljeg tipa GDF-5.

[0010] U cilju izbegavanja nerazumevanja i dvosmislenosti, neki često korišćeni termini su ovde definisani i ilustrovani kao što sledi:

Termin "cistin-čvor domen" kao što je ovde korišćen označava dobro poznati i konzervativni cisteinom bogat aminokiselinski region koji je prisutan u zrelim delovima proteina TGF-beta superfamilije kao što je npr. humani GDF-5 i formira trodimenzionalnu proteinsku strukturu poznatu kao cistin-čvor. U ovom domenu odgovarajuća lokacija cisteinskih ostataka međusobno je važna i dozvoljeno je da samo neznatno varira u cilju da se ne izgubi biološka aktivnost. Pokazano je da je sam cistin-čvor domen dovoljan za biološku funkciju proteina (Schreuder et al. (2005), Biochem Biophys Res Commun. 329, 1076-86). Koncenzus sekvence za cistin-čvor domene su dobro poznate u stanju tehnike. Prema definiciji koja ovde data cistin-čvordomen proteina počinje sa prvim cisteinskim ostatkom koji učestvuje u cistin-čvoru odgovarajućeg proteina i završava se sa ostatkom koji sledi nakon poslednjeg cisteina koji učestvuje u cistin-čvoru odgovarajućeg proteina. Na primer, cistin-čvor domen humanog GDF-5 prekursorskog proteina (SEQ ID NO: 2) se sastoji od aminokiselina 400-501 (videti takođe SL.1).

[0011] Termin "protein srodan sa GDF-5" kao što je ovde korišćen označava bilo koji prirodni ili veštački stvoren protein koji je veoma srodan sa humanim faktorom rasta/faktorom diferencijacije 5 (hGDF-5). Zajednička karakteristika svih proteina srodnih sa GFD-5 je pojava cistin-čvor-domena sa aminokiselinskom identičnošću od najmanje 60% sa 102 aa cistin-čvor domenom humanog GDF-5 (aminokiseline 400-501 od SEQ ID NO: 2), što je dovoljno za biološku funkciju proteina. Termin "protein srodan sa GDF-5" obuhvata proteine koji pripadaju grupi GDF-5, GDF-6 i GDF-7 proteina iz vrsta kičmenjaka ili sisara kao i njihove rekombinantne varijante sve dok ovi proteini pokazuju gore navedeni procenat identičnosti sa cistin-čvor domenom humanog GDF-5. Ograničavajuća vrednost od 60% je pogodna za posebne članove GDF-5/-6/-7 grupe proteina kao i njihove varijante od dodatnih proteina kao što su udaljeno srodni GDFs i BMPs. Poređenje 102 aa cistin-čvor-domena humanog GDF-5, humanog GDF-6 i humanog GDF-7 (videti SL. 2) otkriva visok stepen aminokiselinske identičnosti između ovih proteina. Humani GDF-6 deli 87 (85%) i humani GDF-7 deli 83 (81 %) identičnih ostataka sa cistin-čvor-domenom humanog GDF-5. Odgovarajući domeni GDF-5/-6/- 7 molekula iz drugih vrsta kičmenjaka i sisara koji su identifikovani do sada pokazuju veoma visoke procente identičnosti od najmanje 75% (između 79% i 99%), u poređenju sa humanim GDF-5. Nasuprot tome, GDFs i BMPs koji ne pripadaju GDF-5/-6/-7 podgrupi ispoljavaju mnogo niže vrednosti identičnosti ispod 60%.

[0012] Određivanje odgovarajućih aminokiselinskih položaja u srodnim aminokiselinskim sekvencama kao i određivanje procenata identičnosti može se lako izvesti uz pomoć dobro poznatih algoritama poravnanja i izborno kompjuterskih programa upotrebom ovih algoritama. Na primer, aminokiselinske identičnosti u ovoj patentnoj prijavi (tj. SL. 2) su izračunavane poravnanjem sekvenci sa besplatnim programom ClustalX (verzija 1.81) sa unapred izabranim parametrima i zatim brojanjem identičnih ostataka ručno. Unapred izabrana podešavanja za parno poravnanje (sporo-tačno) su: parametar otvaranja praznine: 10.00; parametar gap produžetka praznine 0.10; matrica proteinske težine: Gonnet 250. The ClustalX program je detaljno opisan u Thompson, J. D., Gibson, T.J., Plewniak.F., Jeanmougin.F. and Higgins.D.G. (1997): The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research 24:4876-4882. ClustalX je windows interfejs za ClustalW program poravnanja višestrukih sekvenci i on je npr. dostupan iz različitih izvora, tj. preko anonimnog ftp iz ftp-igbmc.ustrasbg.fr, ftp.embl-heidelberg.de, ftp.ebi.ac.uk ili skidanjem sa interneta sa sledeće web stranice: http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/. ClustalW program i algoritam je takođe detaljno opisan u Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994): CLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research 22:4673-4680. Naročito poželjni proteini srodni sa GDF-5 ispoljavaju aminokiselinske identičnosti od najmanje 70%, 80%, 90% ili 95% sa 102 aa cistin-čvor domenom humanog GDF-5.

[0013] Neograničavajući primeri za kičmenjačke i sisarske proteine srodne sa GDF-5 su prekursori i zreli proteini humanog GDF-5 (opisani kao MP52 u WO95/04819 i kao humani GDF-5 u Hotten et al.1994, Biochem. Biophys Res. Commun. 204, 646-652), rekombinantni humani (rh) GDF-5/MP52 (WO96/33215), MP52 Arg (WO97/06254); HMW humani MP52s (WO97/04095), CDMP-1 (WO96/14335), mišji (Mus musculus) GDF-5 (US 5,801 ,014), zečji (Oryctolagus cuniculus) GDF-5 (Sanyal et al. 2000, Mol Biotechnol. 16, 203-210), kokošji (Gallus gallus) GDF-5 (NCBI pristupni br. NP_989669), GDF-5 afričke kandžaste žabe (Xenopus laevis) (NCBI pristupni br. AAT99303), monomerni GDF-5 (WO 01/11041 i WO 99/6161 1), humani GDF-6/BMP-13 (US 5,658,882), mišji GDF-6 (NCBI pritupni br. NP_038554), GDF-6/CDMP-2 (WO96/14335), humani GDF-7/BMP-12 (US 5,658,882), mišji GDF-7 (NCBI pristupni br. AAP97721), GDF-7/CDMP-3 (WO96/143335). Pronalaskom su takođe pokriveni proteini srodni sa GDF-5 koji imaju dodatne mutacije kao što su supstitucije, adicije i delecije, sve dok ove dodatne mutacije potpuno ne poništavaju biološku aktivnost proteina.

[0014] Predmetni pronalazak je zasnovan na nalazu pronalazača da je moguće pomoću specifičnih modifikacija u regionu aminokiselinske sekvence proteina srodnog sa GDF-5 koji je uključen u vezivanje za BMPR-IB i/ili BMPRIA promeniti protein na takav način da isti ima poboljšanu sposobnost da indukuje formiranje hrskavice i smanjenu sposobnost za indukciju formiranja kosti.

[0015] Nađeno je da su proteini koji imaju povećani afinitet za BMPR-IB i/ili proteini koji imaju smanjen afinitet za BMPR-IA sposobniji za indukciju formiranja hrskavice, dok je formiranje kosti smanjeno. Ove osobine su naročito izražene u proteinima koji pokazuju povećani afinitet za BMPR-IB i smanjeni afinitet za BMPR-IA.

[0016] Proteini srodni sa GDF-5 prema predmetnom pronalasku mogu biti dobijeni pomoću hemijske modifikacije ili tehnologije genetičkog inženjeringa, pri čemu su poželjni rekombinantni proteini. Proteini se mogu dobiti zamenom najmanje jednog aminokiselinog ostatka srodnog sa BMPR-IB i/ili BMPR-IA vezujućim mestom u aminokiselinskoj sekvenci proteina srodnog sa GDF-5.

[0017] Inventivni protein je varijanta humanog GDF-5, gde je triptofan ostatak na položaju 414 zamenjen za arginin (W414R). U vezi sa zrelom sekvencom GDF-5 (za zreli monomerni GDF-5 prikazan u SEQ ID NO:4), ovo odgovara supstituciji na položaju 33. Iznenađujuće, nađeno je da ova proteinska varijanta ima značajno smanjen afinitet za BMPR-IA. Nasuprot tome, afinitet za BMPR-IB je skoro nepromenjen.

[0018] Dodatni inventivni varijantni protein sadrži aminokiselinsku supstituciju R399E. U vezi sa zrelom sekvencom GDF-5 (za zreli monomerni GDF-5 prikazan u SEQ ID NO: 4), ovo odgovara supstituciji na položaju 18. Navedena proteinska varijanta ima smanjeni afinitet za BMPR-IA.

[0019] Poželjno, proteini srodni sa GDF-5 prema predmetnom pronalasku su prisutni kao "izolovani" proteini. Ovo znači da je protein prema predmetnom pronalasku značajno odvojen od drugih proteina i peptidnih molekula koji su prisutni u prirodnom izvoru izolovanog proteina (npr. drugi polipeptidi proteina prirodnog izvora). Na primer, rekombinantno eksprimirani peptid se smatra izolovanim. Prema poželjnom primeru izvođenja prema pronalasku, varijantni protein je rekombinantni protein. Pored toga, peptid se takođe smatra izolovanim, ako je promenjen humanom intervencijom ili eksprimiran od strane organizma koji nije njegov prirodni izvor. Pored toga, "izolovani" protein je bez nekog drugog ćelijskog materijala sa kojim je prirodno povezan ili medijuma za ćelijsku kulturu, kada je proizveden pomoću rekombinantnih tehninika ili hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetisan. Specifično isključen iz definicije "izolovanog" proteina, su neprečišćene smeše ili kompozicije.

[0020] Prema sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira protein predmetnog pronalaska. Nukleinska kiselina ima sekvencu takvu da je postignuta supstitucija određenih ostataka srodnih sa BMPR-IB i/ili BMPR-IA vezujućim mestom odgovarajućeg divljeg tipa proteina srodnog sa GDF-5. Tripleti baza koji kodiraju ove aminokiseline i degeneracija genetičkog koda su dobro poznati. Nukleinska kiselina može biti DNK-sekvenca i/ili RNK-sekvence sve dok se protein prema pronalasku može dobiti od ove nuleinske kiseline ekspresijom u pogodnom sistemu. Nukleinska kiselina prema pronalasku može biti u potpunosti ili delimično sintetička. Nukleinske kiseline sadrže jednolančane i/ili potpuno ili delimično dvolančane polinukleotidne sekvence. Nukleinska kiselina može biti proizvedena pomoću bilo kojih sredstava uključujući genomske preparate, cDNK preparate, in vitro sintezu, PCR, RT-PCR i/ili in vitro ili in vivo transkripciju.

[0021] Naročito su poželjne "izolovane" nukleinske kiseline, koje su značajno odvojene od nukleinsko kiselinskih molekula koji su prisutni u prirodnom izvoru nukleinske kiseline (npr. sekvence koje kodiraju druge polipeptide). Poželjno, "izolovana" nukleinska kiselina je bez najmanje nekih od sekvenci koja prirodno flankiraju nukleinsku kiselinu (tj. sekvenci lociranim na 5’ i 3’ krajevima nukleinske kiseline) u njegovom prirodnom replikonu. Na primer, klonirana nukleinska kiselina se smatra izolovanom. Nukleinska kiselina se takođe smatra izolovanom, ako je promenjena humanom intevencijom ili postavljena na lokus ili lokaciju koja nije prirodna strana ili ako je uvedena u ćeliju. Pored toga, izolovana nukleinska kiselina može biti bez nekog od drugog ćelijskog materijala sa kojim je ona prirodno povezana ili medijumom za kulturu kada je proizvedena pomoću rekombinantnih tehnika ili hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetisana.

[0022] Na poželjan način, nukleinske kiseline prema pronalasku mogu biti pripremljene pomoću ukupne genske sinteze ili pomoću mutageneze usmerene na stranu nukleinske kiseline koja kodira divlji tip ili modifikovane proteine srodne sa GDF-5. Postupci koji se mogu koristiti obuhvataju ligaciju usmerenu na obrazac, ponovljivu PGR, kasetnu mutagenezu, mutagenezu usmerenu na stranu ili druge tehnike koje su dobro poznate u tehnici.

[0023] Nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže dodatne nukleinsko kiselinske sekvence koje mogu da dodaju dodatne funkcije izolovanoj nukleinskoj kiselini prema pronalasku. Na primer, takve dodatne nukleinsko kiselinske sekvence mogu da sadrže nukleinsko kiselinske sekvence koje omogućavaju pogodnu ekspresiju proteina prema pronalasku i mogu da obuhvataju promotorske sekvence, regulatorne sekvence, stop signale, oridžine replikacije i slično. Stručnjak iz date oblasti tehnike zna takve funkcionalne nukleinsko kiselinske sekvence i kako ih rasporediti u cilju dobijanja molekula sa željenim osobinama.

[0024] Ekspresioni vektori predstavljaju dalji predmet ovog pronalaska, u kojima je nukleinska kiselina inserirana u pogodan vektorski sistem, pri čemu je vektorski sistem izabran prema željenoj ekspresiji proteina. Vektorski sistem može biti eukariotski vektorski sistem, ali poželjno je prokariotski vektorski sistem sa kojim proteini mogu biti proizvedeni na naročito lak i čist način. Pogodan ekspresioni vektor je na primer prikazan u WO 96/33215. Ekspresioni vektor takođe može biti virusni vektor koji može biti korišćen na primer u pristupima genske terapije.

[0025] Ćelije domaćini i transgeni organizmi takođe predstavljaju predmet ovog pronalaska. Ćelije domaćini i transgeni organizmi su okarakterisani time što sadrže nukleinsku kiselinu ili ekspresioni vektor prema pronalasku i time što su sposobni da koriste informacije prisutne u nukleinskim kiselinama u ekspresionom vektoru, respektivno za ekspresiju proteina prema pronalasku. Na taj način, predmetni pronalazak se odnosi na transgene organizme ili ćelije prolazno ili stabilno transformisane ili transficirane sa najmanje jednom nukleinskom kiselinom ili najmanje jednim vektorom koji kodira protein prema pronalasku ili na potomstvo takvih transgenih organizama ili ćelija. Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na ćelije, ćelijske kulture, tkiva i/ili delove transgenih organizama prema ovom pronalasku. Razume se da za svrhe predmetnog pronalaska termin "transgeni organizam" ne samo da obuhvata organizam u koji je nukleinska kiselina prema pronalasku prolazno ili stabilno uvedena, već se takođe odnosi na potomstvo takvih organizama nezavisno od udaljenosti generacija, uz uslov da ovi organizmi još uvek sadrže nukleinsku kiselinu prema pronalasku i eksprimiraju protein prema pronalasku.

[0026] Poželjno, transgeni organizam ili ćelija je prokariotskog ili eukariotskog porekla. Poželjno, transgeni organizam je mikroorganizam. Poželjni mikroorganizmi su bakterije, kvasci, alge ili gljive. Pogodne ćelije domaćini su poželjno prokariotske ćelije, naročito E.coli sojevi. Naročito korisne ćelije domaćini su E.coli W3110 kao što je pokazano na primer u WO 96/33215. U poželjnom primeru izvođenja, ćelije domaćini, poželjno humanog porekla, takođe mogu biti korisne za transplantaciju kod pacijenata kod kojih postoji potreba za tim.

[0027] Priprema transformisanog organizma ili transformisane ćelije zahteva uvođenje odgovarajuće DNK u odgovarajući organizam domaćina ili ćeliju. Dostupni su višestruki postupci za ovaj postupak koji je označen kao transformacija. Na taj način, na primer, DNK može biti uvedena direktno mikroinjekcijom ili bombardovanjem mikročesticama ili nanočesticama obloženim sa DNK. Ćelija takođe može biti permeabilizovana hemijski, na primer upotrebom polietilen glikola, tako da DNK može da uđe u ćeliju preko difuzije. DNK takođe može biti transformisana preko fuzije protoplasta sa drugim jedinicama koje sadrže DNK kao što su minićelije, ćelije, lizozomi ili lipozomi. Sledeći pogodan postupak za uvođenje DNK je elektroporacija u kojoj su ćelije reverzibilno permeabilizovane pomoću električnog impulsa.

[0028] Ovde je takođe opisan postupak za proizvodnju proteina koji ima poboljšanu sposobnost indukovanja formiranja hrskavice i smanjenu sposobnost indukcije formiranja kosti, koji sadrži korake:

(i) randomizacije najmanje jednog aminokiselinskog položaja u regionu proteina srodnog sa GDF-5 koji se odnosi na BMPR-IB i/ili BMPR-IA vezujuće mesto u cilju dobijanja proteinskih varijanti,

(ii) analiziranja proteinskih varijanti dobijenih u (i) u vezi sa njihovim afinitetom za BMPR-IB i/ili BMPR-IA,

(iii) selekcije onih proteinskih varijanti koje obezbeđuju povećani afinitet za BMPR-IB i/ili sniženi afinitet za BMPR-IA.

[0029] Regioni proteina srodnog sa GDF-5 uključeni u vezivanje za BMPR-IA ili BMPR-IB su poznati u tehnici. U koraku (i) najmanje jedan aminokiselinski položaj u jednom ili oba od ovih regiona je randomizovan. Poželjno je randomizovati najmanje dva, tri ili više aminokiselinska položaja. Aminokiseline prisutne u divljem tipu sekvence proteina srodnog sa GDF-5 su zamenjene drugim aminokiselinama putem hemijskih modifikacija ili poželjno pomoću tehnologije genetičkog inženjeringa. Postupci za proizvodnju randomizovanih proteinskih varijanti iz koraka (i) obuhvataju sintetičku de novo sintezu proteina i/ili ekspresiju proteina od nukleinske kiseline koja ih kodira. Na naročito poželjan način, proteinske varijante iz koraka (i) su pripremljene ekspresijom upotrebom odgovarajućih nukleinskih kiselina.

[0030] Poželjno, proteinske varijante su dobijene za sve druge moguće aminokiseline na relevantnom položaju. Međutim, takođe je moguće izvesti samo specifičnu zamenu jedne ili više aminokiselina za druge aminokiseline. Na primer, hidrofilne aminokiseline mogu biti zamenjene hidrofobnim aminokiselinama. Alternativno, hidrofobne aminokiseline mogu biti zamenjene hidrofilnim aminokiselinama. Konzervativna supstitucija, gde je hidrofilni ili hidrofobni karakter održavan, je takođe moguća. Supstitucijom, poželjno je izvršena izmena za aminokiselinu koja ima drugu steričnu potrebu.

[0031] Višestruke proteinske varijante dobijene u koraku (i) su zatim analizirane u odnosu na njihov afinitet za BMPR-IB i/ili za BMPR-IA. Ovo se može postići na način koji je poznat i uobičajen u oblasti tehnike. Postupci za procenu protein-receptor interakcija su uobičajena praksa.

[0032] U koraku (iii), izabrane su one proteinske varijante koje obezbeđuju povećani afinitet za BMPR-IB i/ili smanjen afinitet za BMPR-IA. Iznenađujuće je nađeno da ovi određeni proteini imaju poboljšanu sposobnost da indukuju formiranje hrskavice i smanjenu sposobnost da indukuju formiranje kosti.

[0033] Dalje su opisana antitela na opisane proteine srodne sa GDF-5. Ova antitela su specifična za rekombinantne proteine srodne sa GDF-5 za koje je tražena zaštita. Poželjno, ona su specifična za regione proteina srodnih sa GDF-5 koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih zamena koje su ovde opisane. Poželjno, antitela su specifična za region rekombinantnog proteina poreklom od proteina srodnog od GDF-5 koji se odnosi na BMPR-IB i/ili BMPR-IA vezujuće mesto. Ova antitela mogu biti generisana upotrebom onih fragmenata proteina kao što su opisani u prethodnom tekstu kao imunogeni za generisanje antitela pomoću poznatih postupaka. Antitela mogu biti monoklonska ili poliklonska i mogu biti bilo koji izotipovi. Takođe su opisani fragmenti antitela kao što su Fab fragmenti ili Fab2fragmenti. Antitela takođe mogu biti humanizovana antitela ili generička antitela itd.

[0034] Antitela su, pored ostalog, pogodna kao analitičko sredstvo. Ona se mogu koristiti za ispitivanje apsorpcije i raspodele proteina prema pronalasku u telu. Pored toga, gore navedena antitela su pogodna za ispitivanje kinetike oslobađanja.

[0035] Sledeći predmet predmetnog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži rekombinantni protein srodan sa GDF-5 ili nukleinsku kiselinu ili vektor ili ćeliju domaćina prema pronalasku. U principu, pogodne su bilo koje farmaceutske kompozicije koje su već objavljene u kontekstu sa proteinima srodnim sa GDF-5. Ekspresioni vektor ili ćelija domaćin mogu se smatrati povoljnim kao aktivne supstance u farmaceutskoj kompoziciji. Takođe se kombinacije proteina prema pronalasku sa drugim proteinima mogu koristiti u poželjnim farmaceutskim kompozicijama. Naravno, pronalazak takođe sadrži farmaceutske kompozicije koje dalje sadrže supstance kao što su npr. farmakološki prihvatljivi aditivi ili nosači. Formulacija može da obuhvata antioksidante, konzervanse, boje, aromu i emulgatore, suspendujuća sredstva, rastvarače, punioce, sredstva za povećanje zapremine, pufere, prenosioce, ekscipijente i/ili farmaceutske adjuvante. Na primer, pogodan nosač ili prenosilac mogu biti voda za injekciju, fiziološki rastvor ili fiziološki reastvor pomešan sa pogodnim nosačkim proteinom kao što je serum albumin. Poželjan antioksidant za pripremu kompozicije prema predmetnom pronalasku je askorbinska kiselina.

[0036] Rastvarač ili razblaživač farmaceutske kompozicije mogu biti vodeni ili nevodeni i mogu da sadrže druge farmaceutski prihvatljive ekscipijente koji su sposobni za modifikaciju i/ili održavanje pH, osmolariteta, viskoziteta, bistrine, razmere, sterilnosti, stabilnosti, stope rastvaranja ili mirisa formulacije. Slično druge komponente mogu biti uključene u farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku u cilju modifikacije i/ili održavanja stope oslobađanja farmaceutski efikasne supstance. Takve modifikujuće komponente su supstance koje se uobičajeno koriste u tehnici u cilju formulacije doza za parenteralnu primenu u obliku jedinične doze ili višestruke doze.

[0037] Konačno formulisana farmaceutska kompozicija pripremljena prema predmetnom pronalasku može biti čuvana u sterilnim bočicama u obliku rastvora, suspenzije, gela, emulzije, čvrste supstance ili dehidratisanog ili liofilizovanog praha. Ove formulacije mogu biti čuvane bilo u obliku koji je spreman za upotrebu ili u obliku, npr. u slučaju liofilizovanog praha, koji zahteva rekonstituciju pre primene. Gore navedene i dodatne pogodne farmaceutske formulacije su poznate u tehnici i opisane su u, na primer, Gus Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th Ed. , Mack Publishing Co., Eastern, Pa., 1990, 1435-1712).

Takve formulacije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, stopu in vivo oslobađanja i stopu in vivo klirensa farmaceutski efikasne komponente.

[0038] Drugi efikasne oblici primene sadrže parenteralne formulacije sa sporim oslobađanjem, tj. usporene formulacije, inhalirajuće aerosolove ili oralno aktivne formulacije. Na primer, formulacija sa sporim oslobađanjem može da sadrži proteine vezane za ili ugrađene u čestične preparate polimernih jedinjenja (kao što je polimlečna kiselina, poliglikolna kiselina, itd.) ili lipozome.

[0039] Farmaceutska kompozicija prema predmetnom pronalasku takođe može biti formulisana za parenteralnu primenu, npr., infuzijom ili injekcijom, i takođe može da obuhvata formulacije sa sporim oslobađanjem ili odloženim oslobađenjem. Takve parenteralno primenjene terapeutske kompozicije su tipično u obliku parenteralno prihvatljivih vodenih rastvora bez pirogena koji sadrže farmaceutski efikasnu komponentu (komponente) u farmaceutski prihvatljivom nosaču i/ili razblaživaču.

[0040] Farmaceutska kompozicija može da sadrži matriksni materijal, npr. u slučajevima gde je nameravana regeneracija hrskavice. Povoljno je kada se protein, nukleinska kiselina, ekspresioni vektor ili ćelija domaćin primenjuju u i/ili na biokompatibilnom matriksnom materijaliu. Matriksni materijal kao što je korišćen ovde označava nosač ili matriks koji deluje kao skela za ćelijsko privlačenje, vezivanje, proliferaciju i diferencijaciju i/ili kao potencijalni uređaj za primenu i čuvanje za rekombinantne proteine srodne sa GDF-5 prema pronalasku. Nasuprot čvrstim matriksima, nosači se sastoje od amorfnih materijala koji nemaju definisane površine i kojima nedostaje specifičan oblik, tj. alkil celuloza, pluronics, želatini, polietilen glikoli, dekstrini, biljna ulja, šećeri i druge tečne i viskozne supstance.

[0041] Primeri matriksnih materijala su na primer opisani u WO 98/21972. Ovi matriksni materijali su jednako pogodni za proteine prema pronalasku. Matriksni materijal može biti transplantiran u pacijenta, npr. hirurški, pri čemu protein ili DNK koja kodira protein mogu biti sporo oslobođeni iz matriksnog materijala i zatim biti efikasni tokom dužeg vremenskog perioda. Svi tipovi matriksnih materijala su korisni u skladu sa predmetnim pronalaskom sve dok su kompatibilni i izabrani za određenu oblast ili indikaciju upotrebe. Matriksni materijal može biti prirodni materijal, modifikovani prirodni materijal kao i sintetički materijal. Obuhvaćeni su svi već poznati matriksni za morfogenetičke proteine. Ekstracelularni matriks sadrži na primer različite kolagene kao što su na primer tipovi I, II, V, IX, X, XI i XIII, dodatno proteoglikane i glikozaminoglikane kao što su na primer hondroitin sulfati, biglikani, dekorini i/ili hijaluronska kiselina ili nekolageni proteini kao što su npr. osteopontin, laminin, fibronektin, vitronektin i protein matriksa hrskavice. Svi navedeni prirodni materijali takođe mogu biti korišćeni u veštački modifikovanim oblicima. Za neograničavajući spisak korisnih nosača i matriksa (videti dalje Kirker-Head, 2000, Advanced Drug Delivery 43, 65-92).

[0042] Sledeća mogućnost se odnosi na lipozomalne formulacije koje sadrže rekombinantni protein srodan sa GDF-5 prema pronalasku. Lipozomi korišćeni u navedenim formulacijama su uobičajeno poznati stručnjaku iz date oblasti tehnike. Naročito, poželjne lipozomalne formulacije su opisane u WO 2008/049588. Poželjnije lipozomalne formualcije su opisane na stranicama 9 do 13 u WO 2008/049588.

[0043] Pored toga, varijantni proteini GDF-5 prema pronalasku mogu biti primenjeni u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim supstancama. Navedene farmaceutski aktivne supstance mogu biti, na primer, sredstva protiv bolova kao što su lokalno efikasna sredstva protiv bolova ili druge supstance koje imaju pozitivan efekat na bolesti, gde je formiranje hrskavice poželjno, kao što su inhibitori proteaze. To su samo primeri mogućih aditiva, i stručnjak iz date oblasti tehnike lako može da doda druge ekscipijente koji su u upotrebi u farmaceutskim preparatima ili koji se generalno smatraju bezbednim.

[0044] Zahvaljujući njihovoj poboljšanoj sposobnosti indukovanja formiranja hrskavice, rekombinantni varijantni proteini GDF-5 prema predmetnom pronalasku su naročito pogodni za upotrebu u lečenju bolesti, gde je formiranje hrskavice poželjno, ali je formiranje kosti nepoželjno. Na taj način, sledeći aspekat predmetnog pronalaska je upotreba predmetnih proteina, nukleinskih kiselina, vektora ili ćelija domaćina u lečenju ovih bolesti. Naročito, predmetni proteini, nukleinske kiseline, vektori ili ćelije domaćini su za upotrebu u lečenju defekata hrskavice ili za lečenje traumatske rupture ili odvajanja hrskavice, naročito defekata hrskavice povezanih sa starenjem na primer kao posledica habanja, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, povreda povezanih sa sportom, bolesti koje mogu da utiču na hrskavicu kao što su hondrodistrofije, bolesti okarakterisane poremećajem rasta i kasnije osifikacije hrskavice, ahondroplazija, kostohondritis, hernija kičmenog diska i popravka kičmenog diska, relapsirajući polihondritis, popravka defekata hrskavice povezanih sa tumorima, benignim ili malignim, kao što je hondrom ili hondrosarkom.

[0045] Sledeći aspekt je postupak za lečenje bolesti, gde je formiranje hrskavice poželjno, ali je formiranje kosti nepoželjno, koji sadrži korak primene proteina, nukleinske kiseline, vektora ili ćelije domaćina prema pronalasku na pacijenta kod koga postoji potreba za takvim tretmanom.

[0046] Kao što je ovde korišćen, termin "lečenje/tretman" označava reverziju, ublažavanje ili inhibiciju napredovanja bolesti, poremećaja ili stanja ili jednog ili više simptoma takve bolesti, poremećaja ili stanja na koji se ovaj termin odnosi. Kao što je ovde korišćeno, lečenje/tretman takođe može da se odnosi na smanjenje verovatnoće ili incidence pojave bolesti, poremećaja ili stanja kod sisara u poređenju sa netretiranom kontrolnom populacijom ili u poređenju sa istim sisarom pre tretmana. Na primer, kao što je ovde korišćeno, lečenje/tretman mjože da označava prevenciju bolesti, poremećaja ili stanja i može da obuhvata odlaganje ili prevenciju početka bolesti, poremećaja ili stanja ili odlaganje ili prevenciju simptoma povezanih sa bolešću, poremećajem ili stanjem. Kao što je ovde korišćeno, lečenje/ tretman takođe može da označava redukciju težine bolesti, poremećaja ili stanja ili simptoma povezanih sa takvom bolešću, poremećajem ili stanjem pre nego što je sisar pogođen bolešću, poremećajem ili stanjem. Takva prevencija ili redukcija težine bolesti, poremećaja ili stanja pre nego što se desi odnosi se na primenu kompozicije prema predmetnom pronalasku kao što je obvde opisan na subjekta koji u vreme primene nije pogođen bolešću, poremećajem ili stanjem. Kao što je ovde korišćeno, lečenje/tretman takođe može da se odnosi na ponovnu pojavu bolesti, poremećaja ili stanja ili jednog ili više simptoma povezanih sa takvom bolešću, poremećajem ili stanjem.

[0047] Sledeći primeri zajedno sa slikama i protokolima sekvenci su namenjeni da dalje ilustruju pronalazak.

SEQ ID NO: 1 prikazuje DNK sekvencu, i SEQ ID NO: 2 prikazuje proteinsku sekvencu humanog GDF-5 prekursora.

SEQ ID NO: 3 prikazuje DNK sekvencu, i SEQ ID NO: 4 prikazuje proteinsku sekvencu humanog zrelog monomernog GDF-5.

Slike

[0048]

SL. 1 prikazuje dodatne karakteristike humanog GDF-5 prekursorskog proteina prema SEQ ID NO:2:

aa 001-381 pre-prodomen (masnim slovima)

aa 001-027 signalni peptid (masna slova i podvučena)

aa 382-501 deo zrelog proteina

aa 400-501 cistin-čvor-domen (podvučen)

SL. 2 prikazuje poređenje 102 aa cistin-čvor domena humanog GDF-5 (SEQ ID NO:2), humanog GDF-6 (sekvenca 26 iz SAD Pat. br. 5,658,882) i humanog GDF-7 (sekvenca 2 iz SAD Pat. br.5,658,882).

Aminokiselinski ostaci koji su identični u sva tri molekula su istaknuti granicama.

SL. 3 prikazuje rezultate analize sa alkalnom fosfatazom (ALP) mutanta W414R rekombinantnog humanog GDF-5 (kao što je opisano u primeru 2).

SL. 4 prikazuje rezultate analize sa alkalnom fosfatazom (ALP) mutanta I449V rekombinantnog humanog GDF-5 (kao što je opisano u primeru 3).

SL. 5 prikazuje rezultate analize sa alkalnom fosfatazom (ALP) mutanta R399E rekombinantnog humanog GDF-5 (kao što je opisano u primeru 3).

SL. 6 prikazuje rezultate analize sa alkalnom fosfatazom (ALP) mutanta S439E rekombinantnog humanog GDF-5 (kao što je opisano u primeru 3).

SL. 7 prikazuje rezultate analize sa alkalnom fosfatazom (ALP) mutanta R399M rekombinantnog humanog GDF-5 (kao što je opisano u primeru 3).

SL. 8 prikazuje rezultate analize sa alkalnom fosfatazom (ALP) mutanta W414R rekombinantnog humanog GDF-5 (kao što je opisano u primeru 3).

Primer 1: stvaranje, ekspresija i prečišćavanje proteina srodnih sa GDF

[0049] DNK kiseline koje kodiraju zrele delove humanog GDF-5, humanog GDF-6 i humanog GDF-7 proteina izolovane su iz humanih ROB-C26 osteoprogenitorskih ćelija (Yamaguchi et al. 1991, Calcif. Tissue Int. 49, 221-225) preko RT-PCR tehnike i zatim ligatirane u prokariotske plazmidne vektore. U cilju identifikacije funkcionalno značajnih aminokiselinskih ostataka u zrelim delovima GDF-5, -6 i -7, različite pojedinačne mutacije su uvedene u ove sekvence preko mutageneze usmerene na mesto.

Sve pojedinačne mutacije su stvorene upotrebom QuickChangeTM kompleta za mutagenezu usmerenu na mesto sa PfuTurboTm DNK polimerazom i DPN I endonukleazom iz Stratagene prema uputstvu za upotrebu proizvođača.

[0050] Upotrebom bakterijskog soja W3110BP transformisanog sa plazmidima i indukovanog sa IPTG, proteini su eksprimirani u inkluzionim telima. Ova inkluziona tela su izolovana upotrebom homogenizacionog pufera (25 mM Tris HCl pH 7.3, 10 mM EDTA NaOH pH 8, 8 M Urea) i pufera za ispiranje (1 M Urea, 20 mM Tris HCl, pH 8.3, 10 mM EDTA NaOH pH 8.0) prema standardnim postupcima. Dodatno prečišćavanje je izvedeno na reverzno faznoj koloni Aquapore Octyl (Applied Biosys, (CV = 7,8 ml) 100x10, 20μ, br. 186470) sa gradijentom od 100% eluenta A (0.1 % TFA, HPLC H2O) do 100% eluenta B (0.1 % TFA, 90 % CH3N, HPLC H2O) za 104 minuta (stopa protoka: 3 ml/min). Posle kontrole pomoću western blot-a, frakcije koje sadrže mutantni protein su sakupljene i liofilizovane.

[0051] Mutantni proteini su rastvoreni u puferu za rastvaranje (6 M Guanidin HCl, 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 3 mM DTT, pH = 8.0), koncentracija proteina je tačno podešena do 2.6 mg/ml i pH je podešen između 8 i 9. Posle 2 časa inkubacije na sobnoj temperaturi, dodat je pufer za ponovno savijanje (1 M NaCl, 50 mM Tris, 5 mM EDTA, 1 mM GSSG, 2 mM GSH, 33 mM Chaps, pH = 9.5) uz lagano mešanje da bi se dostigla krajnja koncentracija od 0.16 mg/ml.

[0052] Rastvor je zatim inkubiran u trajanju od 48 časova na 22°C i ponovno savijanje je zaustavljeno promenom pH do 3-4 dodavanjem 18% HCl. Posle centrifugiranja, monomer koji nije ponovno savijen je odvojen od dimernog oblika izbođenjem druge RP-HPLC pod istim uslovima. Frakcije koje sadrže dimerizovani protein su sakupljene, liofilizovane i čuvane na -70°C.

Primer 2: Merenje biološke aktivnosti različitih varijanti proteina srodnih sa GDF in vitro pomoću ALP analize

[0053] 2.0x10<5>ćelija C2C12-lb (ćelijska linija koja stabilno prekomerno eksprimira BMPR-IB receptor) i ćelije C2C12 su inkubirane 3-4 dana u 20 ml medijuma za ćelijsku kulturu (alfa-MEM, Penicilin/streptomicin, 2 mM L-glutamin, 10% FCS) na 37°C, 5% CO2, H2O-zasićen. Ćelije su zatim isprane sa PBS (fosfatno puferisani fiziološki rastvor), tripsinizovane i resuspendovane u medijumu za kulturu do gustine od 3x10<4>ćelija/ml.150 μl je prebačeno u svaku komoricu 96-komorne ploče za kulturu i inkubirano 24 časa na 37°C, 5% CO2, H2O-zasićeno. Posle ispiranja sa medijumom komorice su napunjene sa 120 μl novog medijuma za kulturu. Dodato je 40 μl različitih razblaženja mutantnog ili divljeg tipa proteina (rastvoren u 10 mM HCl i razblažen najmanje 250-puta u medijumu), a zatim je usledio sledeći korak inkubacije u trajanju od 72 časa na 37°C, 5% CO2, H2O-zasićen. Posle ispiranja sa PBS, dodato je 150 μl rastvora za lizu (0,2% Nonidet P40, 0,2g MgCl2x 6H2O, podešen do 1000 ml sa vodom), a zatim je sledila inkubacija od 15-18 časova na 37°C, 5% CO2, H2O-zasićena. Zatim je 50 μl svake komorice prebačeno u novu 96 –komornu ploču.50 μl rastvora supstrata (2,5x koncentrovani dietanolamin supstratni pufer 148g/l PNPP (natrijum p-nitrofenilfosfat)) je zatim dodato u svaku komoricu i ploče su inkubirane 4 min na 37°C, 5% CO2, H2O-zasićen. ALP-reakcija je zaustavljena nakon toga sa 100 μl od 30g/l NaOH i konačno je merena optička gustina sa automatskim uređajem za očitavanje mikroploče na 405 nm uzimajući u obzir oduzimanje blanko vrednosti.

[0054] Na primer, rezultati (prosečne vrednosti 2 nezavisna eksperimenta) u vezi sa hGDF-5 mutantom W414R za C2C12-lb ćelije su prikazani na SL. 3. Pet različitih koncentracija proteina (14 ng/mL, 44.5 ng/mL, 133.2 ng/mL, 400 ng/mL i 1200 ng/mL) je korišćeno u ovoj analizi. Mutantni protein W414R ispoljava biološku aktivnost u ćelijama gde je BMPR-IB receptor (C2C12-lb ćelije) prekomerno eksprimiran, ukazujući na to da je BMPR-IB vezujuće mesto za W414R funkcionalno aktivno. Divlji tip proteina (rhGDF-5) je služio kao kontrola u sistemu za analizu.

[0055] Dalji rezultati biološke aktivnosti dodatnih mutanata hGDF-5 za ćelijske linije C2C12 i C2C12-lb prikazani su u tabeli 1.

Primer 3: Merenje biološke aktivnosti različitih varijanti proteina srodnih sa GDF in vitro pomoću ALP analize

[0056] 5x10<5>ćelija ATDC-5 ćelija i 5x10<5>ćelija za MCHT1/26 inkubirano je 3-4 dana u 20 ml medijuma ćelijske kulture (alfa-MEM, 2 mM L-glutamne, 10% FCS, za MCHT1/26; DMEM/F12 (1:1), 5% FCS) na 37°C, 5% CO2, H2O-zasićen. Ćelije su zatim isprane sa PBS (fosfatno puferisani fiziološki rastvor), tripsinizovane i resuspendovane u medijumu za kulturu do gustine od 3x10<4>ćelija/ml. 150 μl je prebačeno u svaku komoricu 96-komorne ploče za kulturu i inkubirano 24 časa na 37°C, 5% CO2, H2O-zasićeno. Posle ispiranja medijumom komorice su napunjene sa 120 μl novog medijuma za kulturu za MCHT1/26 i 120 μl test medijuma za ATDC-5 (DMEM/F12 (1:1), 0.5% FCS) plus 40 μl različitih razblaženja mutantnog ili divljeg tipa proteina (rastvoren u 10 mM HCl i razblažen najmanje 250 puta u medijumu), nakon čega je usledio sledeći korak inkubacije u trajanju od 72 časa na 37°C, 5% CO2, H2O-zasićen. Posle ispiranja sa PBS, dodato je 150 μl rastvora za lizu (MCHT1/26 rastvor za lizu: 0,2% Nonidet P40, 1 mM MgCl2; ATDC-5 rastvor za lizu: 100 mM Na-glicin, 1% Nonidet P40, 1 mM MgCl2), nakon čega je usledila 1-časovna inkubacija ATDC-5 i inkubacija od 15 – 18 časova za MCHT1/26 na 37°C, 5% CO2, H2O-zasićen.50 μl svake komorice je zatim prebačeno u novu 96-komornu ploču. 50 μl rastvora supstrata (2,5x koncentrovani dietanolamin supstratni pufer 148g/l PNPP (natrijum p-nitrofenil-fosfat)) je zatim dodato u svaku komoricu i ploče su inkubirane još 60 min na 37°C, 5% CO2, H2O-zasićen. ALP-reakcija je zaustavljena nakon toga sa 100 μl od 30g/l NaOH i konačno je optička guistina merena sa automatskim uređajem za očitavanje mikroploče na 405 nm uzimajući u obzir oduzimanje blanko vrednosti.

[0057] Primeri rezultata (prosečne vrednosti 2 nezavisna eksperimenta) u vezi sa hGDF-5 mutantima I449V, R399E, S439E, R399M, W414R prikazani su na SL.4-8, respektivno. Pet različitih koncentracija proteina (14.8 ng/ml, 44.5 ng/ml, 133.2 ng/ml, 400 ng/ml, 1200 ng/ml) je korišćeno u ovoj analizi. U poređenju sa divljim tipom GDF-5, mutantni proteini ispoljavaju veću biološku aktivnost na ATDC-5 ćelijama u poređenju sa MCHT1/26 ćelijama u ovom sistemu za analizu.

Primer 4: Biacore merenje afiniteta proteina srodnih sa GDF-5

[0058] BiacoreT100 sistem (Biacore, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, GB) je korišćen za sve biosenzorne eksperimente. Približno 200 rezonantnih jedinica (RU) Fc-fuzionih proteinskih receptornih ektodomena BMPR-IB, BMPR-IA ili BMPRII je imobilizovano za protein G CM5 biosenzorne čipove. Senzogrami interakcije su beleženi na stopi protoka od 60 ml/min na 30°C u 10 mM HEPES (pH 7.4), 300 mM NaCl, 3.4 mM EDTA, 0.005% Tween 20. Eksperimenti su izvedeni u duplikatu upotrebom koncentracija liganda od 0.05 do 100 nM. Svi vidljivi vezujući afiniteti su dobijeni upotrebom BIAevaluation v.2.2.4 (Biacore, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, GB). Afiniteti interakcije liganda i receptora tipa I su izvedeni aproksimacijom kinetičkih podataka sa 1:1 Langmuir vezujućim modelom (KD (kin)). Zahvaljujući prebrzoj kinetici vezivanja (prelazi 106 M-1 s-1 (za kon) i 10-2 s-1 (za koff)) vidljivi afiniteti vezivanja za interakcije ligand:BMPR-II su određeni iz zavisnosti od doze ravnotežnog vezivanja (KD (eq)).

[0059] Rezultati Biacore afinitetnih merenja za različite varijente humanog GDF-5 prikazani su u tabeli 1.

* = Rezultati merenja afiniteta 1 u vezi sa GDF-5 divljim tipom, afinitet za BMPR-IA: 1 nm, afinitet za BMPR-IB: 8 pM ;* = Rezultati merenja afiniteta 2 u vezi sa GDF-5 divljim tipom, afinitet za BMPR-IA: 1,1 nm, afinitet za BMPR-IB: 27 pM

0 = Bez ALP aktivnosti

+10+++++ = ALP aktivnost, broj predstavlja intenzitet ALP aktivnosti

n.d. = nije određen

LISTING SEKVENCI

Claims

Patentni zahtevi

1. Varijantni protein zrelog humanog GDF-5 kao što je predstavljen aminokiselinama 382 -501 iz SEQ ID NO: 2 i koji sadrži aminokiselinsku supstituciju, izabranu iz grupe koja se sastoji od R399M, W414R i I449V.

2. Nukleinska kiselina koja kodira varijantni protein prema patentnom zahtevu 1.

3. Varijantni protein prema patentnom zahtevu 1 ili nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 2, za upotrebu u lečenju bolesti, gde je formiranje hrskavice poželjno, ali je formiranje kosti nepoželjno.

4. Varijantni protein ili nukleinska kiselina za upotrebu prema patentnom zahtevu 3 za upotrebu u lečenju defekata hrskavice ili za lečenje traumatske rupture ili odvajanja hrskavice, naročito defekata hrskavice povezanih sa starenjem na primer kao posledica habanja, osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, povreda povezanih sa sportom, bolesti koje mogu da utiču na hrskavicu kao što su hondrodistrofije, bolesti naznačene poremećajem rasta i kasnijom osifikacijom hrskavice, ahondroplazijom, kostohondritisom, hernijom kičmenog diska i popravkom kičmenog diska, relapsom polihodritisa, popravkom defekata hrskavice povezanih sa tumorima, bilo benignim ili malignim, kao što je hondrom ili hondrosarkom.

5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži varijantni protein prema patentnom zahtevu 1, nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 2, vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 2 ili ćelija domaćin koja sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 2 kao aktivno sredstvo, izborno u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim aditivima ili nosačima.