KR20140101748A - 지질-핵산입자를 멸균생성을 위한 단일 용도 시스템 - Google Patents

지질-핵산입자를 멸균생성을 위한 단일 용도 시스템 Download PDF

Info

Publication number
KR20140101748A
KR20140101748A KR1020147014822A KR20147014822A KR20140101748A KR 20140101748 A KR20140101748 A KR 20140101748A KR 1020147014822 A KR1020147014822 A KR 1020147014822A KR 20147014822 A KR20147014822 A KR 20147014822A KR 20140101748 A KR20140101748 A KR 20140101748A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lipid
sirna
ethanol
drug
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020147014822A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102046968B1 (ko
Inventor
빅토르 크노포브
리처드 피. 위트
프리야 카르마리
로빈 리
데이비드 웨브
Original Assignee
닛토덴코 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 닛토덴코 가부시키가이샤 filed Critical 닛토덴코 가부시키가이샤
Publication of KR20140101748A publication Critical patent/KR20140101748A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102046968B1 publication Critical patent/KR102046968B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4833—Encapsulating processes; Filling of capsules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1277—Preparation processes; Proliposomes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
    • B01J13/12—Making microcapsules or microballoons by phase separation removing solvent from the wall-forming material solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Abstract

본 발명은 무균 조건하에서 단일용도 성분을 포함하는 지질-핵산 나노 입자를 간단하고 재생적으로 형성하는 공정에 관한 것이다.

Description

지질-핵산입자를 멸균생성을 위한 단일 용도 시스템{SINGLE USE SYSTEM FOR STERILELY PRODUCING LIPID-NUCLEIC ACID PARTICLES}
본 발명은 무균 조건하에서 단일용도 성분을 포함하는 지질-핵산 나노 입자를 간단하고 재생적으로 형성하는 공정에 관한 것이다.
지질은 치료 분자의 운반, 특히 핵산의 운반을 위한 담체(carriers)로서 잠재적으로 유용하다. 지질은 복합체(complex)를 피막형성(encapsulate)할 수 있는 리포좀(liposome)을 형성하거나, 또는 핵산 분자를 잡아서, 투여, 예를 들면, 순환계에 정맥 내 투여에 따라 표적 세포로 이런 종류의 치료 분자의 운반을 증강시킨다. 약학적 조성물에 있어서 이들의 유용성은 지질-핵산 나노 입자를 재생적으로 생성하는 활용가능한 방법에 의해 제한된다. 다양한 방법이 이러한 나노입자를 생성하는데 고안되어 왔다.
단독 지질 (소포체(vesicles))로 구성하는 나노입자를 초음파처리 없이 간단하고 재생적으로 생성하는 한가지 방법은 Batzri et al., 1973, Biophys Biochem Acta 298:1015-19, 및 Kremer et al., 1977, Biochemistry 16:3932-35에 의해 설명된, 에탄올에 용해된 지질을 수용액으로 주사하여 자발적으로 리포좀을 형성하는 에탄올 주사를 활용한다
Van Buitenen et al. US 7468151은 리포좀을 포함하는, 멸균 미세입자를 위한 페쇄회로 시스템을 개시한다. 회로 시스템은 운반흐름 여과(trasnflow filteration) (TFF) 장치(unit)에 연결된 혼합챔버 시스템을 포함한다. TFF 장치는 무균 조건하에서 미세입자의 액체분산을 정제한다. 액체는 TFF를 통하여 혼합챔버로부터 무균적으로 펌프된다. TFF (잔류물)에 남아있는 물질은 정제될 때까지 혼합챔버 및 TFF 장치를 통하여 재생된다. 정제공정은 TFF 잔류물에 있는 미세입자 제거 없이 하나의 기구에서 무균적으로 수행된다.
기타는 지질 및 핵산을 포함하는 특정 방법을 사용하여 핵산-리포좀입자를 생성하는 공정을 설명한다. Hirota et al., 1999, BioTecjniques 27:286-89은 핵산분자로 코팅된 리포좀은 에탄올에 있는 양이온 지질이 핵산의 수용액으로 주사될 때 자발적으로 형성한다는 것을 설명한다. Maurer et al., 2001, Biophysical J, 80:2310-26 및 Maurer et al. US 7094423은 리포좀에 있는 핵산 분자를 피막형성하는 방법을 설명한다. 상기 방법은 양이온지질을 포함하는 수행된 리포좀의 용도를 포함한다. 상기 리포좀은 수용액에 에탄올 첨가에 의해 불안정화된다. 핵산 분자를 지질에 첨가한다. 에탄올 제거에 따라, 리포좀은 재형성 동안에 핵산을 피막형성한다. 리포좀에 있는 핵산을 피막형성하는 대안적 방법이 Semple et al., 2001, Biophys Biochem Acta 1510:152-66 and Semple et al. US 6858225에 의해 설명되었다. 상기 방법은 리포좀을 형성하는 이온화 양이온지질을 사용하여 피막형성의 효율을 증가시킨다. 지질의 에탄올 용액은 낮은 pH에서 버퍼된 수용액에 있는 핵산과 혼합된다. 그 다음 pH가 중성 값으로 상승되는 동안에 에탄올은 제거된다. 모든 방법은 재구성 동안에 응집체가 크기에서 넓은 다양성을 생성하기 때문에 얻어지는 리포좀의 방법을 추가적으로 요구한다.
MacLachlan et al. US 7901708는 핵산을 피막형성하는 균일한 크기로 된 리포좀을 생성하기 위한 공정 및 기구를 설명한다. 수성버퍼에 있는 줄기 RNA(stream RNA)는 지질 소포체가 높은 에탄올 농도 (45%)에서 즉시 형성하는 T 연결장치에서 대략 동일한 유속(flow rate)으로 에탄올에 있는 양이온 지질의 줄기와 혼합된다. 상기 용매 및 용질 농도는 혼합공정에 걸쳐 일정하게(constant) 계속되었다. 리포좀이 희석된 정적 혼합기(static mixers)를 포함하지 않았다. 안정적인 핵산리포좀을 멸균 충전단계(fill step) 전에 즉시, 공정의 말미에서 멸균하였다.
상기 언급된 방법은 가압증기멸균, 세척, 및 규제부담(regulatory burdens)을 만족시키는 것을 포함하는 리포좀 생성공정 중에 박테리아 오염을 최소화하기 위해 광범위한 노동력을 요구한다. 수행된 리포좀을 제조하기 위한 과도한 기계적 공정단계가 필요 없고 집단을 단분산(monodisperse) 시키기 위한 지질-핵산입자를 감소시키는 공정단계가 필요 없이 핵산을 피막형성하는 제작방법을 위한 충족되지 않는 필요가 남아있다.
상기 적용은 자체의 전부로서 참조에 의하여 본 명세서에서 일부분이 된 2011년 11월 4일에 파일된 미국 잠정 번호(United States Provisional Application No.) 61/556,124의 이익을 청구한다.
도 1은 본 설명의 단일-용도 시스템을 나타낸다.
요약
본 명세서의 하나의 측면은 하기를 포함하는 지질-핵산 나노 입자(lipid-nucleic acid nanoparticle)를 멸균제조하는 시스템이다:
수 혼화성(water-miscible) 유기용매에서 지질을 포함하는 유기지질용매를 위한 첫 번째 유지장치(holding unit);
치료약물을 포함하는 수용액을 위한 두 번째 유지장치;
정적 혼합기(static mixer)를 갖는 혼합장치;
유기지질용매를 혼합챔버(mixing chamber)에 첨가하는 주사 수단;
수성버퍼(aqueous buffer)를 위한 세 번째 유지장치;
희석장치(dilution unit);
리포좀 현탁액을 농축하고 유기용매를 제거하기 위한 운반흐름 여과기(transflow filter)를 포함하는 농축장치(concentrating unit); 및
유기용매 제거 후에 농축된 리포좀 현탁액을 수집하기 위한 단일 용도 층(single use bed);
여기서, 상기 혼합장치는 수성 약물용액을 포함하고, 지질:RNA 비가 최대 12:1을 가지는 지질-약물 혼합물을 생산하기 위하여 지질용액은 적어도 5분 동안 혼합장치에 있는 약물용액으로 꾸준히 첨가되고,
여기서, 상기 지질-약물 혼합물은 희석장치로 옮겨지고 수성버퍼를 첨가하여 희석되고; 및
여기서, 상기 요소로 구성된 시스템은 단일 묶음 용도(single batch usage)를 위해 적응되도록 멸균되고 일회용 성분으로 구성된다. 상기 시스템은 첫 번째 유지장치에 연결된 유기지질용매를 제조하는 장치를 추가적으로 포함한다. 상기 시스템은 상기 용액이 첫 번째 유지장치로 옮겨지는 동안에 유기지질용매를 멸균하는 여과기를 포함한다. 상기 시스템은 멸균인 지질용액, 약물용액, 지질-약물 혼합, 및 현탁액을 추가적으로 포함한다. 상기 농축장치는 단일용도 펌프 챔버가 있는 격막정량펌프(diaphragm metering pump)를 포함할 수 있다. 상기 지질은 양이온지질, 헬퍼지질, 스테롤(sterol), 및 폴리에틸렌 (PEG)-지질 접합체를 포함할 수 있고, 표적 지질을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 치료 약물은 dsRNA 분자이다. 혼합물에 있는 지질 및 dsRNA의 농도는 2.5의 지질:RNA전하 비를 구성한다. 상기 수 혼화성 유기용매는 에탄올일 수 있다. 첫 번째 및 두 번째 용액은 35 내지 40℃의 온도에서 혼합될 수 있다. 두 번째 유지장치는 pH 3.5 내지 pH 4.5에서 수성버퍼에 있는 치료약물을 포함할 수 있다. 세 번째 유지장치는 중성 pH에서 수성버퍼를 포함할 수 있다. 치료약물을 피막형성하는 리포좀의 평균 입자지름은 80 nm 내지 150 nm일 수 있다. 주사 수단은 혼합장치에 있는 수용액의 공기 물 경계면에 유기용매를 운반하는 주사 포트(injection port), 또는 대안적으로 혼합장치에서 수용액에 잠긴 주사 포트를 포함하고 유기용매를 거기에 운반한다. 상기 시스템은 동결건조단계를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 동결건조단계는 냉각단계 및 건조단계를 포함할 수 있다. 수성버퍼는 수크로오스 또는 트레할로오스를 포함할 수 있다. 상기 냉동단계는 20 부터지 -40℃까지 1℃./분으로 지질-약물 혼합물을 냉각시킬 수 있다. 상기 건조단계는 약 -15 내지 약 -35℃에서 지질-약물 혼합물의 건조단계를 포함한다.
본 명세서의 설명은, 예를 들면, 핵산, 단백질, 및 펩티드와 같은 음전하를 띠는 치료 중합체를 포함하는 지질-피막형성된 치료 분자를 만드는 방법에 관한 것이다. 제공된 본 명세서의 설명은 지질-피막형성된 핵산 분자를 만드는 방법을 포함한다. 상기 방법은 리포좀 피막형성된 분자로 구성된 입자의 대규모 제작에 특히 익숙할 수 있다. 상기 방법은 생성된 입자가 50과 150 nm 사이의 좁고 균일한 크기분포를 갖는 단분산(monodisperse) (예: 본 명세서에서 한정된 것으로서, 0.2 다분산 지수(PDI)보다 적은)인 예기치 않고 놀랄만한 결과를 제공한다. 상기 방법은 에탄올과 같은, 수용액에서 용해된 음전하를 띠는 치료 중합체를 갖는, 수 혼화성 유기용매에서 용해된 지질을 혼합하고 유기용매를 제거하여 피막형성하는 수단을 제공한다. 지질 및 음전하를 띠는 치료 중합체의 절대적 및 상대적 농도는 소입자를 생성하기 위해 충분하다. 본 명세서의 방법에 따라 생성된 입자는 단분산 집단을 얻기 위하여 분출과 같은 기계적 공정을 요구하지 않는다.
본 명세서의 방법은 큰 부피로 규모를 상승시킬 수 있는 용이성 및 넓은 범위의 온도, 용질, pH 및 공정시간에 대한 탄탄함으로 인하여 기존의 방법에 대해서 장점을 가진다.
본 명세서의 방법은 수행된 소포체를 생성하기 위해 요구되는 여분의 단계 없이 균일한 집단의 입자를 재생적으로 생성하는 기존의 방법에 대해서 장점을 가진다.
본 명세서의 방법은 지질 및 음전하를 띠는 치료 중합체의 혼합물에 따라 생성된 기계적 공정 입자에 요구되는 여분의 단계 없이 균일한 집단의 나노입자 재생적으로 생성하는 기존의 방법에 대해서 장점을 가진다. 상기 여분의 단계는 자체의 크기를 감소시키고 치료적으로 허용가능한 범위에 균일성을 얻기 위해서, 예를 들면 초음파처리, 균질화, 또는 분출(extrusion)을 포함한다.
본 명세서의 방법은 나노 입자를 생성하는 여분의 공정 단계 없이 기존의 방법보다 같거나 더 나은 핵산 피막형성 효율을 얻는데 장점을 가진다.
본 명세서의 방법의 다른 장점은 지질 성분 및 조건에 관하여 본 명세서에서 제공된 추가 세부사항으로서 명백해질 것이다
하기의 약어가 본 명세서에서 사용되었다.
VF: 배출여과기(vent filter)
TG: 온도 측정기(temperature gauge)
SUB:단일용도 층(single use bed)
TFF: 운반흐름 여과기(transflow filter)
PP: 연동펌프(peristaltic pump)
PG:압력 측정기(pressure gauge)
저울(Scale): 무게측정 수단(a means of measuring weight)
도 1은 하기 요소를 포함하는 단일-용도 시스템을 나타낸다.
지질 스톡(lipid stock): 상기 관(vessel)은 유기, 수 혼화성 용매에서 선택된 지질을 포함한다. 에탄올은 바람직한 용매로서 나타낸다. 지질의 농도는 생산량(throughput)을 증가시키기 위해 조정될 수 있다. 상기 관은 TG 및 혼합 수단을 갖는 일회용 백(bag)을 구성한다. 상기 백은 96-100% 에탄올, VF, 및 출구 튜브에서 지질을 첨가하기 위한 구멍을 가지고, 발브(valve)에 위해 통제된다. 상기 백은 가열되고, 재사용되고, 전기가 밑에 깔린 용기(container)에 장착되어 있다. 상기 백은 지질용액을 조작상의 농도로 희석하기 위한 추가 에탄올을 첨가하기 위한 수단이다.
PP1: 연동펌프 1(peristaltic pump 1). 상기는 지질 스톡 관(Lipid Stock vessel)으로부터 0.45/0.22 ㎛ 여과기를 통해서 여과된 지질 스톡 관(Filtered Lipid Stock vessel)으로 지질 스톡을 펌프한다.
여과된 지질 스톡: 상기 관은 작용하는 농도의 지질을 포함한다. 상기 관은 혼합 수단 및 TG를 갖는 일화용 백이다. 이는 지질 스톡, VF 및 출구 튜브의 입구를 위한 구멍을 가지고, 발브에 위해 통제된다. 상기 백은 가열되고, 재사용되고, 전기가 밑에 깔린 저울(Scale)이 있는 용기(container)에 장착되어 있다.
sRNA 스톡: 상기 관은 수성버퍼에 선택된 약물을 포함한다. siRNA는 바람직한 약물이고, 구연산염 버퍼(citrate buffer)는 바람직한 버퍼이다. 농도는 생산량을 증가시키기 위해 조정될 수 있다. 상기 관은 혼합수단을 갖는 일화용 백이다. 상기 백은 용질 및 용매를 첨가하기 위한 구멍 및 발브에 의해 통제되는 출구 튜브를 가진다. 상기 백은 RNA용액을 작용 농도로 희석하기 위한 추가 버퍼를 첨가하기 위한 수단을 가진다.
PP2: 연동펌프 2. 상기는 siRNA 스톡 관으로부터 0.45/0.22 ㎛ 여과기를 통해서 여과된 지질 스톡 관(Filtered Lipid Stock vessel)으로 지질 스톡을 펌프한다.
여과된 siRNA 스톡: 상기 관은 작용 농도의 siRNA를 포함한다. 상기 요소는 저울을 포함한다. 상기 관은 재사용 용기에 장착되어 있는 일화용 백이다. 이것은 siRNA 스톡 및 발브에 의해 통제되는 출구튜브를 위한 구멍을 가진다. 상기 백은 저울을 갖는 재사용 용기에 장착되어 있다.
PP3: 여과된 지질 스톡을 35% 에탄올의 리포좀 siRNA로 레벨된 관으로 옮기기 위한 연동펌프 3. 상기는 PG (PG1)로 장비를 갖추어져 있다.
PP4: 여과된 siRNA 스톡을 35% 에탄올의 리포좀 siRNA로 옮기기 위한 연동펌프 4. 또한, 상기는 PG (PG2)로 장비를 갖추어져 있다.
35%에탄올의 리포좀 siRNA: 상기 관은 리포좀 및 35%에탄올의 약물의 혼합물을 포함한다. 상기 요소는 VF 및 TG를 포함한다. 여과된 지질 및 siRNA 스톡을 위한 구멍은 발브에 의해 통제되는 출구튜브로부터 분리된다. 바람직한 장치는 재사용 용기에 장착된 일회용 백이다
인산염 버퍼(Phosphate budffer): 상기 관은 버퍼 (바람직하게는 인산염 버퍼),혼합수단, 및 저울을 포함한다. 상기는 구멍마개 및 발브가 있는 출구튜브를 갖는 큰 관이다.
여과된 인산염 버퍼: 상기 관은 배관(tubing), 0.45/0.22 ㎛ 여과기 및 연동펌프에 의해 인산염 버퍼 관으로 연결된다. 상기는 10%에탄올 관 및 TFF SUB 관에 있는 리포좀 siRNA으로 PP 5를 통해서 배관을 유도하는 발브가 있는 혼합수단 및 출구튜브를 가진다. 상기 관은 일회용 라이너(liner)로 연결된 재사용 용기이다.
PP 5: 상기는 여과된 인산염 버퍼 관으로부터 35%에탄올 관에 있는 리포좀 siRNA 및 TFF SUB 관으로 여과된 인산염 버퍼를 펌프한다. PP 5는 PG (PG4)로 연결된다.
10%에탄올에 있는 리포좀 siRNA: 상기 관은 여과된 인산염 버퍼 관에 있는 버퍼에 의해 리포좀및 35%에탄올의 약물을 희석한 후에 리포좀 및 10%에탄올에 있는 약물의 혼합물을 포함한다. 상기 관은 리포좀 siRNA용액을 위한 입구(inlet), VF, 저울 및 TFF SUB 관으로 유도하는 발브가 있는 출구 포트가 있는 일화용 라이너(liner)로 연결된 재사용 용기이다.
PP 6: 상기는 0.45/0.22 ㎛ 여과기를 통해서 10%에탄올 관에 있는 리포좀 siRNA로부터 TFF SUB 관으로 리포좀 및 10%에탄올에 있는 약물을 펌프한다.
TFF SUB: 상기 관은 10%에탄올 관에 있는 리포좀 siRNA로부터 리포좀 및 10%에탄올에 있는 약물을 위해서, 여과된 인산염 버퍼 관으로부터 버퍼를 위해서, 및 TFF 장치로부터 잔류물을 위해서, 각각 발브를 가지는, 입구포트(entry port)를 포함한다. 이것은 또한 자체의 발브가 있는 VF 및 출구 포트를 포함한다.
일화용 펌프헤드가 있는 측정용 펌프: 상기 고압력 펌프는 2개의 PGs (PG 3 및 PG 4)와 연결되어 있다. 상기는 리포좀및 약물을 TFF SUB로부터 TFF 장치로 옮긴다.
TFF: 상기 장치는 대각선을 갖는 사각형 쌍으로서 식별된다. 작용 동안에 에탄올용액의 리포좀/약물은 에탄올을 제거하기 위해 TFF 장치를 통해서 지나간다. 상기 TFF 장치에 의해 제거된 에탄올은 시스템을 나온다. 단일 TFF보다 더 많이 발브에 의해 연결되어 평행하게 작동될 수 있다. 보유된 용액(retained solution)(잔류물) 은 모둔 에탄올을 제거하기 위한 필요로서 TFF를 나오고, TFF SUB를 재순환하고, TFF 장치를 통해서 재사용한다. 압력 측정기(PG 4)는 잔류물의 압력을 모니터한다. 질소탱크에 저장된 질소 가스는 배압(backpressure)을 제조하기 위한 필요로서, 첫 번째 10L SUB 관으로 TFF 잔류물의 이동을 최종적으로 용이하게 하고 계량펌프를 증대시키기 위해 사용된다.
10L SUB: 상기는 저울로 장착된 단일용도 관이다. 선택적으로, 상기 SUB는 연속의 3개의 10L SUB 관을 포함한다. TFF 잔류물은 공정 줄기(processing stream)에 들어갈 수 있었던 미생물 오염으로부터 원인이 된 미생물 오염도(bioburden)을 줄이고 생성물이 완전히 미생물 오염(microbial contamination)으로부터 자유롭게 하기 위해서 0.45/0.22 ㎛ 여과기를 통해서 펌프한다. 만약 전체 공정 일련이 실제 무균이면, 후기의 여과단계를 뺄 수 있는 가능성도 있다. 얻어진 TFF 잔류물은 무균 충전(Aseptic Filling)동안에 포장된다.
무균충전: 상기 단계는 다른 장비를 사용하여 공정을 분리하는 것으로 수행되는 동결건조를 앞선다. 동결건조 이전의 무균충전 단계는 대량을 제공하기 위해서나 동결건조단계 동안에 RNA 안정화를 위해서, 만노스(mannose), 글루코오스(glucose), 또는 다른 물질과 같은 담체 물질의 첨가를 포함할 수 있다.
상기 시스템은 각각의 단계를 통해서 물질 이동의 수동통제를 위해 배열된다. 지질, 약물, 용매 및 버퍼와 접촉하는 모든 성분은 단일용도이고 일회용이다. 상기 시스템은 10L 묶음을 위해 나타내고 1000L 이상까지 저울 할 수 있다. 성분은 리포좀/약물의 묶음 당 하나로 사용되도록 디자인되었다.
상기 제작공정을 성취하기 위한 수단은 하기의 흐름 디아그램(flow diagram)(도 1)에서 나타낸 단계 서열에 놓여있다.
지질 및 약물 스톡용액은 지질스톡 및 siRNA 스톡 관에서 독립적으로 제조된다. 상기 스톡용액은 고농도에서 제조될 수 있다. 혼합은 스톡 관에서 교반으로 일어난다. 지질스톡용액의 온도는 온도를 세트하여 조정될 수 있다. 지질스톡을 제조하기 위한 사용되는 관은 순수 유기용매가 상승된 온도에서 사용될 때 최소 여과할 수 있는 물질을 가지도록 선택되었다.
상기 스톡용액은 0.45/0.22 ㎛ 여과기를 통해서 여과된 지질스톡 관 및 여과된 siRNA스톡 관으로 독립적으로 펌프된다. 스톡용액은 여과된 스톡 관으로 옮기기 전 또는 동안에 스톡용액을 희석하기 위하여 더 많은 용매와 혼합될 수 있다.
동일한 방법으로, 수성버퍼는 인산염 버퍼 관에서 제조되고, 인산염 버퍼 관으로 펌프에 의해 여과 멸균된다.
여과된 siRNA용액은 35%에탄올 관에 있는 리포좀 siRNA로 펌프된다.
유기용매에 있는 지질은 수용을 혼합하는 동안에 통제되는 세트 온도하에서 35%에탄올의 최종 농도로 지질-약물입자를 형성하기 효과적인 비율에서 35%에탄올 관에 있는 리포좀 siRNA의 수성 siRNA용액으로 펌프된다.
지질의 첨가는 하나의 바늘 또는 바늘 세트를 통하여, 단일 포트 또는 다수 포트를 경유하여 일어날 수 있다. 상층으로부터 수용액의 표면으로 일어날 수 있거나 또는 표면의 아래로부터 수용액으로 주사될 수도 있다. 첨가 및 혼합을 통하여, 35%에탄올 관에 있는 리포좀 siRNA의 용액의 에탄올 농도는 30% 내지 40%로, 바람직하게는 35%로 증가한다. 증가는 초기부터(바람직하게는 0%) 최종(바람직하게는 35%) 값까지 기울기(gradient)를 형성하면서 점진적이다. 상기 기울기는 1 분 부터 60 분까지 또는 더 길게 연장할 수 있다.
일단 35%에탄올 관에 있는 리포좀 siRNA의 용액이 최종 에탄올 농도 (바람직하게는 35%)에 도달하면, 상기 용액은 35%에탄올 관에 있는 리포좀 siRNA 밖으로 펌프되고 수 혼화성 알코올(water miscible alcohol), 바람직하게는 10% 내지 20% 에탄올, 가장 바람직하게는 10%에탄올에 있는 혼합물을 희석하기 위하여 여과된 인산염 버퍼 관으로부터 독립적으로 펌프된 버퍼와 연결되어 혼합되고, 10%에탄올 관에 있는 리포좀 siRNA로 옮겨진다.
10%에탄올용액은 수성버퍼에 대하여 정용여과(정용여과)하여 에탄올을 제거하였다.
TFF 잔류물 (0%에탄올, 100 수성버퍼)을 첫 번째 10L SUB에 저장하였다.
TFF 잔류물을 선택적으로 여과하여 무균충전을 위하여 미생물 오염도를 제거하였다.
무균충전은 동결건조 단계를 포함한다. 동결건조단계는 단계 10에서 멸균 TFF 잔류물을 생성하는 공정과 불연속이다. 즉, 산기 단계는 TFF 잔류물을 제공하는 SUB 장치보다 다른 장소에서 수행된다. 수크로오스 또는 글루코오스와 같은 탄수화물(carbohydrate)은 나노 입자를 안정시키거나 또는/및 대량을 첨가하기 위해서 동결건조 전에 첨가될 수 있다.
본 명세서의 방법에 사용된 지질 혼합물은 음전하를 띠는 치료 중합체와 복합체를 형성하기 위해 적어도 양전하를 띠는 지질(양이온지질), 및 응집을 방지하기 위해 지질 접합체(PEG-지질)을 포함하는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)을 포함한다. 양이온지질은 넓은 범위의 pH 조건에 대한 영구적 양이온전하, 낮은 pH(pH 6보다 적은) 및 중성 pH (pH 6.5 내지 8)에서 네트전하(net charge)없이 전하되는 이온화 양이온지질, 또는 영구적이고 이온화 양이온 지질의 혼합체일 수 있다. 또한, 지질혼합물은 표적지질, 중합체, 스테로이드, 인지질, 또는 지방, 왁스(wax) , 지용성 비타민(fat-soluble vitamin), 모노글리세리드(monoglyceride) 또는 디글리세리드(diglyceride), 지방 아실(fatty acyls), 글리세로지질(glycerolipids), 글리세로인산지질(glycerophospholipids), 스핑고지질(sphingolipids), 사카로지질(saccharolipids) 및 폴리케티드(polyketides)을 포함하는 또 다른 군의 구성원을 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 단지 중성 또는 음전하를 띠는성분을 갖는 리포좀의 형성을 위해 사용될 수 있다.
바람직하게는 지질혼합물의 성분을 하기의 군으로부터 선택할 수 있다.
양이온지질
본 명세서의 범위 내에서 공식 I의 양이온 지질이다.
Figure pct00001
여기서
Z = 알킬 링커, C2-C4 알킬
Y = 알킬 링커, C1-C6 알킬
R1 및 R2은 각각 독립적으로 C10-C30알킬, C10-C30알켄닐, 또는 C10-C30알키닐, C10-C30알킬, C10-C20알킬, C12-C18알킬, C13-C17알킬, C13알킬, C10-C30알켄닐, C10-C20알켄닐. C12-C18알켄닐, C13-C17알켄닐, C17알켄닐이고; R3 및 R4은 각각 독립적으로 수소, C1-C6알킬, 또는 -CH2CH2OH, C1-C6알킬, C1-C3알킬이고; n은 1-6이고; 및 상기 용어는 당업계에서 쉽게 이해될 수 있는 것으로서, X는 임의 질소 반대이온을 포함하여, 반대이온(counterion)이다. 바람직한 질소 반대이온은, 특히 바람직한 클로라이드(chloride) 및 브로마이드(bromide)와 같이 할로겐(halogens)을 포함한다. 다른 바람직한 반대이온은 메실레이트(mesylate)(-SO3CH3)이다.
공식 I의 시범적 화합물은 하기를 포함한다:
Figure pct00002
및
Figure pct00003

다른 생리학적 pH의 양이온 전하된 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드(N,N-dioleyl-N,N-dimethylammonium chloride)("DODAC"); N-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로이드(N-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride)("DOTMA"); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide)("DDAB"); N-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로이드(N-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride) ("DOTAP"); N-(l,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸암모늄 브로마이드(N-(l,2-dimyristyloxyprop-3-yl)-N,N-dimethyl-N-hydroxyethylammonium bromide) ("DMRIE"), 3β-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일)콜레스테롤(3β-(N-(N',N'-dimethylaminoethane)carbamoyl)cholesterol)("DC-Chol"), 디옥타데실아미도글리실카르복시스페르미딘(dioctadecylamidoglycyl carboxyspermidine)("DOGS"); 및 N-(l-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N-(2-(스페르민카르복스아미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트(N-(l-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N-(2-(sperminecarboxamido)ethyl)-N,N-dimethylammonium trifluoroacetate)("DOSPA")를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이온화 양이온 지질( Ionizable cationic lipids).
본 명세서의 범위 내는 공식 Ⅱ의 이온화 양이온 지질이다.
Figure pct00004
여기서
Z = 알킬 링커, C2-C4 알킬, -CH2SCH2CH2-
Y = 알킬 링커, C1-C6 알킬
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C10-C30알킬, C10-C30알켄닐, 또는 C10-C30알키닐, C10-C30알킬, C10-C20알킬, C12-C18알킬, C13-C17알킬, C13알킬, C10-C30알켄닐, C10-C20알켄닐. C12-C18알켄닐, C13-C17알켄닐, C17알켄닐이고; R3 및 R4은 각각 독립적으로 수소, C1-C6알킬, 또는 -CH2CH2OH, C1-C6알킬, C1-C3알킬이다.
일부 양전하를 띠는 지질은 생리학적 pH에서 또는 근처에서 pKa를 가지고 약산(mild acid) 조건의 양이온 및 생리학적 pH에서 약한 양이온이다. 상기 이온화 양이온 지질은 ((2-((2-(디메틸아미노)에틸)티오)아세틸)아자네디일)비스(에탄-2,1-디일) 디테트라데카노에이트 ((2-((2-(dimethylamino)ethyl)thio)acetyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) ditetradecanoate ("S104"), (Z)-((3-(디메틸아미노)프로페노일)아잔네디일)비스(에탄-2,1-디일) 디올레이트((Z)-((3-(dimethylamino)propanoyl)azanediyl)bis(ethane-2,1-diyl) dioleate)("i-Et-DODC"), N-(2,3-디올레일옥시)프로필)N,N-디메틸암노늄 클로라이드(N-(2,3-dioleyloxy)propyl)N,N-dimethylammonium chloride)("DODMA") 및 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane)("DODAP")를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
Figure pct00005
하기에 나타낸 바와 같이, 이온화 지질은 결합 및/또는 활성 약학적 성분(active pharmaceutical ingredient(API))의 방출을 용이하게 할 수 있음을 알았다.
Figure pct00006

중성 지질( Neutral lipids )
중성 지질의 예는 포스포지질(phospholipids), 아미노지질(aminolipids) 및 스핑고지질(sphingolipids)을 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 중성지질은 양친매성 지질(amphipathic lipids)를 포함한다. 포스포지질의 대표적 예는 포스페티딜콜린(phosphatidylcholine), 포스페티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), 포스페티딜세린(phosphatidylserine), 포스페티딜이노시톨(phosphatidylinositol), 포스파티드산(phosphatidic acid), 팔미토일올레오일 포스페티딜콜린(palmitoyloleoyl phosphatidylcholine), 리소포스페티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 리소포스페티딜에탄올아민(lysophosphatidylethanolamine), 디팔미토일포스페티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine), 디올레오일포스페티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine), 디스테아로일포스페티딜콜린 오르딜린올레오일일포스페티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine ordilinoleoylphosphatidylcholine)를 포함하나, 이에 한정하는 것은 아니다.
또한, 스핑고지질, 글리코스핑고지질 페밀리(glycosphingolipids families), 디아실글리세롤(diacylglycerols) 및 3-아실옥시산(3-acyloxyacids)와 같은 포스포러스(phosphorus)가 부족한 다른 화합물은 양친매성 지질(amphipathic lipids)로서 지정된 군(group) 내에 있다. 추가적으로, 상기에서 설명된 양친매성 지질은 트리글리세리드 및 스테롤(sterols)를 포함하는 다른 지질과 혼합될 수 있다.
PEG -지질
이중층 안정화 성분(bilayer stabilizing component)은 지질헤드 군, 예를 들면, 포스페티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)에 결합된 폴리에틸렌글리콜 ("PEG") 이다. 또 다른 이중층 성분은 세라마이드(ceramide)에 결합된 PEG이다. PEG를 당업자에 의해 알려지고 사용되는 표준 결합반응을 사용하여 포스페티딜에탄올아민 또는, 선택적으로, 세라미이드에 결합할 수 있다. 추가적으로, 수행된 PEG-포스페티딜에탄올아민("PEG-PE")접합체는 상업적으로 활용가능하다.
다양한 분자량의 PEG는 본 발명의 이중층 안정화 성분을 형성하기 위하여 사용될 수 있다. 다양한 분자량의 PEG는 다수의 다른 출처로부터 상업적으로 구입할 수 있거나 또는, 선택적으로, 당업자에 의해 알려진 표준 중합체 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 폴리에틸린 글리콜은 200 내지 10000 Da, 바람직하게는 500 내지 4000 Da, 및 가장 바람직하게는 1000 내지 2000 Da 범위의 분자량을 가진다. 일반적으로, PEG 분자량의 증가는 안정화를 얻는데 요구되는 이중층 안정화 성분의 농도를 감소시킴을 알았다.
사슬 길이 및 포화 정도가 다양한 아실 사슬기(acyl chain groups)이 다양성을 갖는 포스페티딜에탄올아민은 이중층 안정화 성분을 형성하기 위하여 PEG에 결합할 수 있다. 상기 포스페티딜에탄올아민은 상업적으로 활용가능하고, 또는 당업자에게 알려진 종래의 기술을 사용하여 분리하거나 합성할 수 있다. C10 내지 C20의 범위에서 탄소(carbon)사슬 길이를 갖는 포화 또는 불포화 지방산을 포함하는 포스페티딜에탄올아민이 바람직하다. 모노- 또는 디불포화(mono- or diunsaturated) 지방산 및 포화 및 불포화 지방산의 혼합물을 갖는 포스페티딜에탄올아민을 또한 사용할 수 있다. 적절한 포스페티딜에탄올아민은 디미리스토일포스페티딜에탄올아민 (dimyristoylphosphatidylethanolamine) (DMPE), 디팔미토일포스페티딜에탄올아민(dipalmitoylphosphatidylethanolamine) (DPPE), 디올레오일포스페티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine) (DOPE) 및 디스테아로일포스페티딜-에탄올아민(distearoylphosphatidyl-ethanolamine) (DSPE)를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 조성물은 PEG-포스포지질 및 PEG-세라마이드를 포함하고, 하기로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 분자를 포함하는 자체 당업계에 알려진, PEG-결합된 지질을 또한 포함한다: PEG2000-DSPE, PEG2000-DPPE, PEG2000-DMPE, PEG2000-DOPE, PEG1000-DSPE, PEG1000-DPPE, PEG1000-DMPE, PEG1000-DOPE, PEG550-DSPE, PEG550-DPPE, PEG-550DMPE, PEG-1000DOPE, PEG-콜레스테롤, PEG2000-세라마이드, PEG1000-세라마이드, PEG750-세라마이드, 및 PEG550-세라마이드.
추가적으로, 조성물은 예로써, 83-하이드록시-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81-헵타코사옥사트리옥타콘틸(2,3-비스(테트라데실록시)프로필)카바메이트(83-hydroxy-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81-heptacosaoxatrioctacontyl (2,3-bis(tetradecyloxy)propyl)carbamate)("HO-PEG1251-cBTP") 및 134-하이드록시-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132-테트라테트라콘타옥사테트라트리아콘타헥틸(2,3-비스(테트라데실록시)프로필)카바메이트
(134-hydroxy-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,99,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132-tetratetracontaoxatetratriacontahectyl (2,3-bis(tetradecyloxy)propyl)carbamate)("HO-PEG2000-cBTP")을 포함하나, 이에 한정하지 않는 일반적 공식 mdPEG-링커-지질을 갖는, 단분산(monodisperse)(md) peg-지질을 또한 포함할 수 있다.
Figure pct00007

스테로이드( Steroids )
스테로이드는 콜레스탄(cholestanes)(예, 콜레스테롤), 콜란(cholanes) 및 담즙산(bile acids) (예, 케노디옥시콜레이트(chenodeoxycholate) 및 콜레이트(cholate)), 에르고스테롤(ergosterol), 라노스테롤(lanosterol), 코르티코스테로이드(corticosteroids)(예, glucocorticoid), 프레그난(pregnane) (예, 프로제스테론(progesterone)), 및 피토스테롤(phytosterols)을 포함한다. 상기는 또한 치수성 부분(hydrophilic moiety), 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과 결합을 형성할 수 있다. 바람직한 스테로이드는 콜레스테롤이다.
표적지질( Targeting lipids )
표적지질이 예는 공식(A)의 화합물이다.
L-X-R A
여기서 지질(L)은 DSPE, DOPE, 및 DC로 구성된 군으로부터 선택되고; 링커 (X)는 DSPE, DOPE, 및 DC; 링커 (X)는 아무것도 없음, PEG550, PEG2000, PEG-글루타메이트(-Glu), 글루(Glu), C6, 글라이신, 및 글루NH(GluNH), N1,N19-비스(3-(2-(2-(3-아미노프로폭시)에톡시)에톡시)프로필)-4,7,10,13,16-펜타옥사논아데칸-1,19-디아미드 (N1,N19-bis(3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide)로부터 구성된 군으로부터 선택되고; 레티노이드(retinoid (R))은 트레티노인(tretinoin), 아다팔렌(adapalene), 레티놀(retinol), 4-하이드록시(페닐)레틴아미드(4-hydroxy(phenyl)retinamide)(4-HPR), 레티노산(retinoic acid)(vitamin A), 9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난산(9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoic acid), 3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난산(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoic acid), 3,7-디메틸-9-(2,2,6-트리메틸사이클로헥실)노난산(3,7- dimethyl-9-(2,2,6-trimethylcyclohexyl)nonanoic acid)), 및 임의 부분적 또는 완전히 포화된 레티노이드 또는 이의 유도체로부터 구성되는 군으로부터 선택된다.
표적지질의 도 다른 예는 공식(B)의 화합물이다.
R-X-R B,
여기서 링커 (X)는 N1,N19-비스(3-(2-(2-(3- 아미노프로폭시)에톡시)에톡시)프뢸)-4,7,10,13,16-펜타옥사논아데칸-1,19-디아미드(N1,N19-bis(3-(2-(2-(3-aminopropoxy)ethoxy)ethoxy)propyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide )("bisamido-PEG") 또는 (N1,N19-비스(16,20-디아미노-15-옥소-4,7,10-트리옥사-14-아자이코실)-4,7,10,13,16-펜타옥사논아데칸-1,19-디아미드)N1,N19-bis(16,20-diamino-15-oxo-4,7,10-trioxa-14-azaicosyl)-4,7,10,13,16-pentaoxanonadecane-1,19-diamide ("lys-bisamido-PEG-lys")이고; 및 레티노이드(R)은 트레티노인(tretinoin), 아다팔렌(adapalene), 레티놀(retinol), 4-하이드록시(페닐)레틴아미드(4-hydroxy(phenyl)retinamide)(4-HPR), 레티노산(retinoic acid)(vitamin A), 9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난산(9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoic acid), 3,7-디메틸-9-(2,6,6-트리메틸사이클로헥스-1-엔-1-일)노난산(3,7-dimethyl-9-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-en-1-yl)nonanoic acid), 3,7-디메틸-9-(2,2,6-트리메틸사이클로헥실)노난산(3,7- dimethyl-9-(2,2,6-trimethylcyclohexyl)nonanoic acid)), 및 임의 부분적 또는 완전히 포화된 레티노이드 또는 이의 유도체로부터 구성되는 군으로부터 선택된다.
다른 표적분자는 지질혼합물, 예를 들면, 엽산( folic acid), 비타민 E, 펩티드 리간드 및/또는 단클론 항체를 포함할 수 있다.
RNA -지질 입자조성물 및 제제
본 명세서는 존재하는 활성제가 지질입자와 관련되어 있을 때, 활성제가 있고 없는 지질입자를 포함하는 조성물을 포함한다. 특정실시형태에서, 활성제는 치료제이다. 특정실시형태에서, 활성제는 지질입자의 수용성 내부 내에 피막형성된다. 다른 실시형태에서, 상기 활성제는 지질입자의 하나 이상의 지질층 내에 존재한다. 다른 실시형태에서 활성제는 지질입자의 외부 또는 내부 지질표면에 묶여있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 지질입자는 핵산과 연관되어 있고, 핵산-지질 입자를 유도한다. 특정실시형태에서, 상기 핵산은 지질입자에서 완전히 피막형성된다. 본 명세서에서 사용된 것처럼, 상기 용어 "핵산" 은 임의 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 의미한다. 50 뉴클레오티드까지를 포함하는 조각(fragments)은 일반적으로 올리고뉴클레오티드라고 불리고, 긴 조각은 폴리뉴클레오티드라고 불린다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 길이에서 15-50 뉴클레오티드이다.
본 명세서의 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 자연적으로 발생하는 베이스(bases), 슈가(sugars) 및 인터-슈가(백본) (inter-sugar (backbone))결합으로 구성된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 단량체(nucleotide 또는 nucleoside monomers) 의 중합체 또는 올리고머를 의미한다. 또한, 상기 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드" 는 비자연적으로 발생하는 유사하게 기능하는 단량체, 또는 이의 일부를 포함하는 중합체 또는 올리고머를 포함한다. 상기 변형되거나 대체된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들면, 핵산분해효소(nuclease)의 존재하에서 증강된 세포 내 섭취 및 증가된 안정성과 같은 특성 때문에 종종 자연적 형태를 선호한다.
올리고뉴클레오티드는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 또는 올리고리보뉴클레오티드일 수 있다. 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 교대로 가지없는 중합체를 형성하는 상기 슈가(sugar)의 5' 및 3' 탄소에서 포스페이트에 공유결합된 디옥시리보즈로 구성한다. 올리고리보뉴클레오티드는 각각의 뉴클레오티드가 리보즈 슈가 기(ribose sugar group)를 가지는 비슷한 반복 구조를 구성한다. 변형된 리보즈 분자는 올리고리보뉴클레오티드에서 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 지질-핵산 입자에서 존재하는 핵산은 알려진 임의 핵산형태를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 핵산은 단일-가닥 DNA 또는 RNA, 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA, 또는 DNA-RNA 하이브리드 또는 RNA-PNA 및/또는 PNA 듀플렉스의 DNA-PNA 하이브리드일 수 있다. 이중-가닥 DNA의 예는 조절 및 종결영역, 및 바이러스 또는 플라스미드와 같은 DNA자가-복제 시스템을 포함하는 구조적 유전자를 포함한다. 이중-가닥 RNA의 예는 siRNA 및 다른 RNA간섭제를 포함한다. 단일-가닥 핵산은, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임(ribozymes), 마이크로RNA(microRNA), 및 트리플렉스-형성(triplex-forming) 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
핵산은 일반적으로 특정한 형태의 핵산에 따라 다양한 길이일 수 있다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 플라스미드 또는 유전자는 길이에서 약 1,000부터 100,000까지의 뉴클레오티드 잔류물일 수 있다. 특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 약 10부터 약 100까지의 뉴클레오티드 범위일 수 있다. 다양성에 관련된 실시형태에 있어서, 단일-가닥, 이중-가닥, 및 3중-가닥이든지 간에, 올리고뉴클레오티드는 길이에서 약 10부터 약 50까지의 뉴클레오티드, 약 21부터 약 50까지의 뉴클레오티드, 약 15부터 약 30까지의 뉴클레오티드, 약 20부터 약 30까지의 뉴클레오티드 범위일 수 있다.
특정 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드(또는 이의 가닥)는 특히 표적 폴리뉴클레오티드에 하이브리드하거나 또는 상호보완할 수 있다. "특히 하이브리드화(Specifically hybridizable)" 및 "상호보완(complementarity)"은 안정적인 특정 결합이 DNA 또는 RNA표적과 올리고뉴클레오티드 사이에 발생하는 것과 같은 충분한 정도의 상호보완을 나타내는데 사용하는 용어이다. 올리고뉴클레오티드는 특정 하이브리드화 되는 자체의 표적핵산 서열에 100% 상호보완일 필요가 없다는 것이 이해된다. 표적으로의 올리고뉴클레오티드의 결합이 이로부터 유용성 또는 발현의 손실의 원인이 되는 표적 분자의 정상기능을 간섭할 때, 올리고뉴클레오티드는 특정적으로 하이브리드화되고, 특정 결합을 원하는 조건하에서, 예를 들면, 생체 내 분석 또는 치료인 경우에 생리학적 조건하에서, 또는 시험관 내 분석인 경우에 분석이 수행되는 조건하에서 비표적서열에 올리고뉴클레오티드의 비특정 결합을 피하기 위한 충분한 정도의 특정 베이스-짝짓기(base-pairing)가 있다. 따라서, 다른 실시형태에서 상기 올리고뉴클레오티드는 표적되는 유전자 또는 mRNA서열 또는 특정적으로 하이브리드 하는 것에 비교하여 1, 2, 또는 3 베이스(base) 치환기를 포함한다.
특정 실시형태에서, 핵산-지질입자는 RNA간섭 (RNAi) 분자와 관련될 수 있다. RNAi 분자를 이용한 RNA간섭방법은 관심있는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 방해하는데 사용할 수 있다. siRNAs는 RNAi-유도된 침묵 복합체(RNAi-induced silencing complex (RISC))로 알려진 세포질 다중-단백질 복합체와 연관될 수 있는 보통 15-30뉴클레오티드인 RNA 듀플렉스(RNA duplexes)이다. siRNA로 로드된 RISC는 상동 mRNA 전사(homologous mRNA transcripts)의 분해를 매개한다; 따라서 siRNA는 높은 특이성으로 단백질 발현을 녹다운(knock down)시키도록 디자인될 수 있다. 다른 안티센스 기술과 같지않게, 자연적 기전을 통한 siRNA 기능은 비코드화 RNA를 통하여 유전자 발현을 통제하도록 진화하였다. 상기는 이들의 활성이 안티센스 올리고뉴클레오티드또는 리보자임( ribozymes) 보다 시험관 내 및 생체 내에서 더욱 강력한 이유가 되도록 일반적으로 고려된다. RNAi 시약은 DNA센스:RNA안티센스 하이브리드, RNA센스:DNA안티센스 하이브리드, 및 DNA:DNA 하이브리드가 RNAi를 매개할 수 있는 것을 포함한다. 따라서, 임의 상기 다른 타입의 이중-가닥 분자를 포함하는 RNAi 분자는 사용될 수 있다. 추가적으로, RNAi 분자는 다양한 형태로 세포에 사용되고 소개될 수 있음이 이해된다. 따라서, 본 명세서에서 사용한 것처럼, RNAi 분자는 2개의 분리된 가닥을 포함하는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 센스가닥 및 안티센스가닥, 예, 소간섭 RNA (siRNA); 이중-가닥영역을 형성하는 상호보완서열의 헤어핀 루프를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 예, shRNAi 분자, 및 단독 또는 또 다른 폴리뉴클레오티드와 혼합으로 이중-가닥 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 표현하는 발현 벡터를 포함하나, 이에 한정하지 않는, 세포에 반응하는 RNAi를 유도할 수 있는 임의 및 모든 분자를 포함한다.
RNA간섭(RNAi)는 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 특정적으로 억제하도록 사용될 수 있다. 이중가닥 RNA가 매개된 유전자 및 핵산 발현의 억제는 세포 또는 유기체로 dsRNA, siRNA 또는 shRNA를 소개함으로써 본 발명에 따라 성취될 수 있다. siRNA는 RNA및 DNA 모두, 예를 들면, 하나의 RNA가닥 및 하나의 DNA가닥, 또는 sisiRNA를 포함하는 이중-가닥 RNA, 또는 하이브리드 분자일 수 있다.
RNAi 분자표적 특정 폴리뉴클레오티드는 당업게에 알려진 절차에 따라 쉽게 제조될 수 있다. 따라서, 당업자는 넓은 다양한 siRNA 분자는 특정 유전자 또는 전사체를 표적하는 데 사용할 수 있다는 것을 이해한다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 siRNA 분자는 사이에서 각각의 완전체를 포함하여, 길이에서 이중-가닥 및 16-30 또는 18-25 뉴클레오티드이다.
일반적으로, siRNA 분자는 표적 DNA 분자의 단일 가닥에 완전히 상호보완적이다. 다른 실시형태에서, siRNA는, 예를 들면, 2'-데옥시(2'-deoxy) 또는 2'-O-메틸(2'-O-methyl)변형과 같은 변형된 조성물을 가진다. 그러나, 바람직한 실시형태에서, siRNA의 전체 가닥은 2' 데옥시 또는 2'-O-변형된 베이스로 만들지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 핵산이 지질층 내에 피막된 지질-피막된 핵산입자를 생성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. siRNA 올리고뉴클레오티드가 결합하는 상기 핵산-지질입자는 하기를 포함하는 다양한 생물리학 파라미터를 사용하여 특징화된다: (1)지질에 대한 핵산 비율; (2) 피막형성 효율; 및 (3) 입자크기. 높은 피막형성 효율, 좋은 핵산분해효소 저항 및 혈청 안정성 및 일반적으로 지름에서 20 nm보다 적은, 통제할 수 있는 입자크기가 바람직하다. 추가적으로, 핵산분해효소 저항을 주기 위한 노력으로 핵산 변형은 단지 제한된 저항을 제공하는 많은 경우임에도 치료비용에 첨가되기 때문에, 핵산 중합체의 성질이 중요하다. 굳이 서술되지 않는다면, 상기 기준은 하기와 같이 본 명세서에서 계산되었다:
지질에 대한 핵산 비율은 한정된 제조부피의 핵산이 양을 동일한 부피의 지질이 양으로 나눈 것으로 정의된다. 상기는 몰 베이시스 당 몰(mole per mole basis) 또는 무게 베이시스 당 무게(weight per weight basis)상에서, 또는 몰 베이시스 당 무게(weight per mole basis)상으로 나타낼 수 있다. 최종 투여-준비 제제를 위하여, 핵산:지질 비는 투석(dialysis)후에 게산되고, 크로마토그래피 및/또는 효소 (예,핵산분해효소) 소화는 가능한 외부 핵산만큼 제거하도록 사용된다.
피막형성(Encapsulation)
지질-핵산입자에서 피막된 siRNA를 퍼센트로서 표현된, siRNA 피막형성 효율 (EE)을 결정하기 위하여, 리보그린(RiboGreen)분석을 하기와 같이 활용하였다. 상기 절차는 용액에서 듀플렉스 및 단일 가닥 RNA 또는 DNA를 결정하도록 사용되었다.
장비는 BioTek 기구, Inc. FLx800, 다양한 파이펫, 및 볼텍스 혼합기를 포함한다. 시약은 RNAse-없는 물(MilliQ 등급, 또는 동등), 20x TE버퍼 "RNAses free"(Invitrogen, T11493, 또는 동등), Quant-iT 리보그린 시약 (Invitrogen, R11491), 및 물에 있는 10% 트리톤 X-100(Thermo Scientific, 28314, 또는 동등)을 포함한다.
1X TE버퍼의 제조는 50 mL 눈금 실린더를 사용하여 38 mL의 RNAse-없는 물을 50 mL원심분리튜브로 트랜스퍼하고; 및 2 mL의 20X TE버퍼용액을 원심분리튜브에서 파이펫팅하고 교반기를 사용하여 혼합을 포함한다.
1X TE버퍼에서 2% 트리톤 X-100 및 1% 트리톤 X-100의 제조는 각각 트리톤 10% X-100의 2 mL 또는 1 mL를 RNAse-없는 15 mL 코니컬 튜브로 파이펫팅하고, 1X TE버퍼를 각각 8 mL 또는 9 mL 첨가하고 흔들어서 잘 혼합한다.
리보그린 작동 용액(RiboGreen working solution)의 제조는 상온으로 가온한 리보그린 시약의 냉동 스톡의 제거, 및 TE 버퍼로 1:200을 희석하는 것을 포함한다. 원심분리 튜브를 용액으로부터의 임의적인 초과 빛을 방지하기 위하여 알루미늄 호일로 싼다.
표준은 TE버퍼에서 RNA용액을 제조하여 준비하고, 96웰 플레이트로 분주한다. 시료를 대략 80 ㎍/mL siRNA의 최종농도로 희석하고 도 1에서 나타낸 96-웰 플이트로 옮긴다. 리보그린 작용용액을 첨가하고 각각의 시료 및 표준과 혼합한다. 상기 시료를 분석하기 전에 어둠속에서 1-2분 동안 배양한다.
그 다음, TE버퍼의 1% 트리톤 X-100을 시료를 복제하기 위하여 첨가하고 리보그린 작용 용액이 첨가되었다.
피막형성 효율은 외부시료의 평균의 기저 측정(RNA가 없는 리보그린 시약의 형광)을 위해 정정되고 트리톤 X-100의 존재로 인해 신호 강도에서 8%감소에 대해 정정한 후에, 각각의 시료로부터 형광 결과의 평균을 사용하여 형광측정으로부터 결정되었다. 그 다음, 피막형성 효율은 하기의 방정식을 이용하여 계산하였다:
EE = (트리톤시료 - 리포좀 시료)/(트리톤 시료)
즉, 피막형성 효율은 총 RNA 값(세척제로 리포좀을 용해시킨 후 측정) 및 완전한 리포좀 값을 총 RNA 값으로 나눈 차이이다. 완전한 리포좀 시료로부터 얻어진 형광은 용액에 RNA가 없는 것에 더하여 리포좀의 바깥표면 상에 흡수된 RNA로 구성할 것이다.
크기
크기는 형성된 입자의 크기(지름)를 나타낸다. 크기 분포를 Malvern Zetasizer Nano-ZS dynamic light scattering (DLS) 기구를 사용하여 결정할 수 있다.
상기 절차는 부피 평균 지름, Z-평균지름, 및 내공정(in-process) 리포좀 시료를 위한 다분포(polydispersity)의 측정에 적용한다. 다분포는 특정 크기 분포를 위한 수치 값이다.
측정은 상온에서 수행된다. 시료 및 시약은 상온에서 평형되어야만 한다. 부피-무게 평균 입자 지름 및 다분포 지수를 결정하였다.
제작방법
리포좀의 제조
지질혼합물은 물 혼화성 유기용매, 바람직하게는 순수에탄올에 용해될 수 있다. 대부분의 실시형태에서, 유기용매는 상업적으로 시판되는 형태로 사용될 수 있다.
하나의 실시에 형태에서, 지질 혼합물은 양이온 아미노 지질, 중성지질(아미노 지질외에 다른), 스테로이드(예, 콜레스테롤), 및 PEG-변형된 지질(예, PEG-S-DMG, PEG-C-DOMG 또는 PEGDMA)의 혼합체를 유기용매에서 공-용해되었다. 바람직한 실시형태에서, 지질 혼합물은 양이온 아미노 지질, 중성지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형된 지질을 필수적으로 포함한다. 추가적으로 바람직한 실시형태에서, 지질혼합물은 다양한 몰라(molar) 비에서, 양이온지질, DOPE (또는 이온화 또는 영구 양이온 전하를 갖는 다른 헬퍼지질), 콜레스테롤 및 PEG-결합된 지질을 구성한다. 바람직한 몰라범위는 40 내지 60 몰% 양이온지질, 10 내지 30% 중성지질, 20 내지 40% 콜레스테롤과 1 내지 10% PEG-변형된지질 사이에 있다.
표적지질은 지질혼합물, 예, 0.1 내지 5 (표적지질 : 총지질)의 몰라 비에서 diVA-PEG750-diVA (또는 다른 VA-결합된 표적지질)에 첨가될 수 있다.
지질의 총 농도는 25 mg/ml보다 적고, 바람직하게는 5mg/ml보다 적다. 지질혼합물은 멤브린, 예, 0.45 또는 0.2 ㎛ 여과기를 통해서 여과된다.
본 발명에 따라서, 지질혼합물은 버퍼된 수용액과 혼합된다. 버퍼된 수용액은 버퍼가 지질혼합물에서 양성자화된 지질의 pKa보다 적은 pH를 가지는 용액일 수 있다. 적절한 버퍼의 실시예는 시트레이트(citrate), 포스페이트, 및 아세테이트를 포함한다. 특정 바람직한 버퍼는 시트레이트 버퍼이다. 바람직한 버퍼는 피막된 핵산의 화학에 따라, 음이온의 1-1000 mM의 농도범위에 있을 것이고, 버퍼 농도의 최적화는 높은 로딩 수준을 얻는데 현저할 수 있다. 이는, 예를 들면, 상기 입자가 에탄올을 제거하고, pH를 증가시키기 위해 투석되거나 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합될 때, 입자 멤브린을 가로질러 삼투능을 발란스할 것인 동결방지제(cryoprotectant), 및/또는 비이온 용질(non-ionic solute)을 첨가하는데 적절할 수 있다. 버퍼에서 핵산의 양은 약 0.08부터 0.8 mg/mL까지이다.
에탄올을 첨가할 때에, 수용액의 온도는 25 내지 45℃, 바람직하게는 30 내지 40℃이다. 에탄올용액을 좁은 줄기(stream)에서, 공기-물 경계면 상에 스프레이에 의하거나 또는 수용액에서 물속에 잠긴 튜브를 통하여 운반된 에탄올 사이의 액체-액체 경계면을 통하여 수용액으로 첨가한다.
유기용매를 통제되는 비율에서, 바람직하게는 일정한 비율에서 중력에 의해 또는 유기용매를 수용액으로 운반하는 펌프에 의해 첨가한다. 유기용매의 운반은 1 분 내지 100 분에서, 바람직하게는 1 내지 25 분에서 완성될 수 있다. 유기용매를 단일 스프레이 또는 줄기를 통하여, 튜브 또는 노즐(nozzle)을 통하여, 또는 다수-노즐 시스템을 통하여 첨가할 수 있다. 유기용매가 수용으로 첨가되는 동안에, 얻어진 용액은 교반, 흔들기, 또는 재순환에 의해 혼합될 수 있다. 첨가단계는 바람직하게는 25 내지 45%에탄올, 가장 바람직하게는 35%에탄올인 최종 농도를 초래한다.
최종용액을 투석 또는 여과에 의해, 바람직하게는 여과작용(diafiltration)에 의해, 유기용매를 제거하기 위해 처리한다. 에탄올이 제거되는 동안에, 수용액은 중성 pH, pH 6.8 내지 pH 7.5에서, 바람직하게는, pH 7.2, 예를 들면 포스페이트 또는 헤페스(HEPES)버퍼의 하나의 버퍼로 전환될 수 있다. 바람직하게는 얻어㎛진 수용액은 저장 또는 용도 전에, 예를 들면, 0.22 ㎛ 여과기를 통해서 멸균될 수 있다.
리포좀을 피막형성하는 음전하를 띠는 치료 중합체
본 명세서에서 설명된 방법은 음전하를 띠는 치료 중합체, 예를 들면, RNA 분자를 갖는 지질입자를 제조하는데 유용하다. 본 명세서에서 설명된 방법에서, 지질의 혼합물은 중합체의 수용액과 혼합된다. 중합체는 얻어진 지질입자에서 효과적으로 피막형성된다.
나노 입자는 다음이온 활성제(polyanionic active agent) 또는 치료제, 예를 들면, RNA 및 하나, 두 개, 또는 세 개의 생체적합성 중합체를 포함할 수 있다. 치료제의 실시예로는 핵산, 탁산(taxanes)과 같은 항종양제(antineoplastic agents)를 포함한다.
첨가시에 지질혼합물에 있는 다수의 양전하와 적거나 같아야만 하는 음전하를 띠는 중합체의 총 전하는 바람직하게는 0.06 내지 0.16 (w:w)이다. 예를 들면, RNA가 사용될 때, 피막형성된 핵산은 RNA:지질 0.06 내지 0.16, 전하:전하 (-/+), 바람직하게는 1:2.5 내지 1:1의 최종 비율에 존재한다.
지질 혼합물이 전하를 갖는 양이온지질을 구성할 때, 지질소포체는 중합체를 피막형성하고 덫에 걸리게 하기 위해 음전하를 띠는 중합체의 존재하에서 형성될 수 있다. 얻어진 입자는 비지의 pH를 생리학적 pH 또는 더 높은 것으로 증가시켜 중성화할 수 있다. 상기 방법으로 형성된 소포체는 고함유량의 핵산을 갖는 균일한 소포체 크기의 제제를 제공한다.
양쪽 경우에, 중합체 (나노 입자)를 피막형성하는 소포체는 50부터 150 nm 까지 범위의 크기를 가진다.
본 명세서에서 설명된 방법에 따라서, 지질혼합물은 음전하를 띠는 중합체를 포함하는 버퍼로 된 수용액과 혼합된다. 버퍼로 된 수용액은 지질혼합물에서 양성자화된 지질의 pKa보다 적은 pH를 가지는 버퍼인 용액일 수 있다. 적절한 버퍼의 실시예로는 시트레이트(citrate), 포스페이트, 아세테이트 및 MES를 포함한다. 특정 바람직한 버퍼는 시트레이트 버퍼이다. 바람직한 버퍼는 피막된 중합체의 화학에 따라 1-1000 mM의 음이온의 범위에 있을 것이고, 버퍼 농도의 최적화는 높은 로딩 수준을 얻는데 현저할 수 있다.
상기는 상기 입자가 에탄올을 제거하고, pH를 증가시키기 위해 투석되거나 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합될 때, 입자 멤브린을 가로질러 삼투능을 발란스할 것인 동결방지제(cryoprotectant), 및/또는 비이온 용질(non-ionic solute)을 첨가하는데 적절할 수 있다.
RNA에 관하여, 본 명세서 설명된 상기 공정의 도면은 도 1에 나타냈다. 용액은 물에서, 예를 들면, 50 mM 시트레이트로 바라직하게는 pH 3.5-4.5에서 버퍼화된 동결건조 또는 고체물질의 용해에 의해 제조된다. 버퍼의 핵산 양은 0.08 부터 0.8 mg/mL까지이다. 에탄올을 첨가할 시에, 수용액의 온도는 25 내지 45℃, 바람직하게는 30 내지 40℃이다. 만약 단일 가닥 핵산이 사용된다면, 상승된 온도에서 간단한 가열은, 예를 들면, 65℃에서 1-2분 동안 유용할 수 있다.
에탄올용액을 좁은 줄기(stream)에서, 공기-물 경계면 상에 스프레이에 의하거나 또는 수용액이 있는 용기와 연결된 튜브를 통하여 운반된 에탄올 사이의 액체-액체 경계면을 통하여 수용액에 첨가한다.
유기용매는, 통제되는 비율에서, 바람직하게는 일정한 비율에서 유기용매를 수용액으로의 운반에 의해 첨가된다. 유기용매의 운반은 1 분 내지 100 분에서, 바람직하게는 1 내지 25 분에서 완성될 수 있다. 유기용매를 단일 스프레이 또는 줄기를 통하여, 튜브 또는 노즐(nozzle)을 통하여, 또는 다수-노즐 시스템을 통하여 첨가할 수 있다. 유기용매가 수용으로 첨가되는 동안에, 얻어진 용액은 교반, 흔들기, 또는 재순환에 의해 혼합될 수 있다. 첨가단계는 리포좀 이중충 구조를 파괴하기에 충분한 최종농도, 바람직하게는 25 내지 45% 에탄올, 가장 바람직하게는 35% 에탄올의 결과를 가진다.
지질-핵산입자에 관하여, 최종 RNA 농도는 .001 내지 1 mg/ml, 바람직하게는 0.01 내지 0.5 mg/ml, 가장 바람직하게는 0.05 내지 0.5 mg/ml이다. 최종 약물/지질 비는 0.06 내지 0.16 w:w (2.5:1 내지 1:1, 전하:전하 비)이다.
최종용액은 유기용매를 제거하기 위하여, 투석 또는 여과에 의해, 바람직하게는 여과작용에 의해 처리된다. 에탄올이 제거되는 동안에, 상기 수용액은 중성 pH, pH 6.8 내지 pH 7.5, 바람직하게는, pH 7.2, 예를 들면, 포스페이트 버퍼에서 하나의 버퍼로 전환된다. 바람직하게는 얻어진 수용액은 예를 들면, 0.22 ㎛ 여과기에 의해, 저장 또는 사용 전에 멸균된다.
최종 피막형성효율은 85%보다 크다. 최종 평균입자 지름은 50 내지 150 nm이다. 다분산 지수(polydispersity index) PDI는 0.2 보다 적고, 바람직하게는 0.1보다 적다.
동결건조
본 개시는 재구성될 때, 큰 응집체의 최소양을 가지는 동결건조된 약학적조성물의 부분에 관한 것이다. 상기 큰 응집체는 약 0.2 ㎛보다 큰, 약 0.5 ㎛보다 크거나 또는 약 1 ㎛보다 큰 크기를 가질 수 있고, 재구성된 용액에서 바람직하지 않을 수 있다. 응집체 크기는 미국약전(U.S. Pharmacopeia) 32<788>에서 나타낸 것과 여기서 참조로 껴 넣은것을 포함하여 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있다. 상기 테스트는 빛 암흑화 입자 카운트 테스트(light obscuration particle count test), 현미경 입자 카운트 테스트(microscopic particle count test), 레이저 회절법(laser diffraction), 및 단일입자 광학 센싱(single particle optical sensing)을 포함할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 주어진 시료에서 입자크기는 레이저 회절법 및/또는 단일입자 광학 센싱을 사용하여 측정된다. 다이나믹 빛 산란(Dynamic light scattering (DLS))은 입자크기를 사용하는데 사용할 수 있으나, 상기는 브로우니언 모션( Brownian motion)에 의존하므로 상기 기술이 일부 큰 입자를 발견하지 않을 수 있다. 레이저 회절법(Laser diffraction)은 입자와 현탁액 배지 사이의 굴절(refraction) 지수의 차이에 의존한다. 상기 기술은 하위-마이크론(sub-micron) 내지 밀리미터(millimeter) 범위에서 입자를 발견할 수 있다. 상대적으로 소량(예, 약 1-5 무게 %)의 큰 입자는 나노 입자 현탁액에서 결정될 수 있다. 단일입자 광학 센싱single particle optical sensing(SPOS))는 약 0.5 pm의 각각의 입자를 세기(count)위하여 희석 현탁액의 빛 암흑화(light obscuration)를 사용한다. 측정된 시료의 입자농도를 알게됨으로 인해, 응집체의 무게 퍼센트 또는 응집체 농도 (입자/mL)를 계산할 수 있다.
응집체 형성은, 예를 들면, 입자표면의 탈수로 인한, 동결건조의 냉동 및/또는 건조단계 동안에 발생할 수 있다. 냉동공정은 얼음형태로서 입자사이의 거리를 감소시킬수 있는 농축효과를 가진다(Alison et al., Biochim Biophys Acta. 2000 Sep 29;1468(1-2):127-38; Armstrong and Anchordoquy, J Pharm Sci. 2004 Nov;93(11):2698-709). 상기 탈수는 동결건조 전에 현탁액에서 다당류와 같은 동결건조 보호제(lyoprotectants)를 사용하여 피할 수 있다. 적절한 다당류는 수크로오스(sucrose), 락툴로오스(lactulose), 락토오스(lactose), 말토오스(maltose), 트레할로오스(trehalose), 또는 셀로비오스(cellobiose), 코지비오스(kojibiose), 니게로오스(nigerose), 이소말토오스(isomaltose), 트레할로오스(trehalose), 소포로오스(sophorose), 라미나리비오스(laminaribiose), 겐티오비오스(gentiobiose), 튜라노스(turanose), 말툴로오스(maltulose), 팔라티노스(palatinose), 겐티오비울로스(gentiobiulose), 만노비아세(mannobiase), 멜리비오스(melibiose), 멜리비우로오스(melibiulose), 루티노스(rutinose), 루티누로오스(rutinulose), 및 자일로비오스(xylobiose)를 포함한다. 일실시형태에서, 상기 조성물은 스크로오스인 다당류를 구성한다. 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 트레할로오스인 다당류를 포함한다. 적용 결과는, 초기 현택액과 비교했을 때, 동등한 DLS 크기분포가 재구성에 따라 얻어지는 것을 나타낸다.
유리첨가제(glassy excipient)에서 매크로분자(macromolecules)를 고정하는 공정인 유리화(vitrification)는 리포좀의 응집을 방지하는 기여 요인이 아니라고 기존에 생각되었고, 슈가의 고장성(hypertonic) 용액이 요구되었다(Alison et al.). 본 발명자들은 동결건조의 냉동 및 건조단계의 결과는 리포좀의 응집, 리포좀 확산 장벽의 붕괴, 및 핵산 지방고정을 형성하기 위해 피막된 RNA 방출을 방지하는 수단을 제공하는 지질: 다당류 비(w:w)에 의존한다는 것을 발견하였다. 일실시형태에서, 상기 조성물은 12 내지 15% (w:w) 수크로오스 및 5 내지 20 mg/ml 지질, 바람직하게는 12% 수크로오스 및 9 mg/ml 지질을 구성한다. 더욱 바람직하게는, 상기 조성물은 버퍼, 가장 바람직하게는 중성 pH에서 헤페스(HEPES)를 또한 구성한다.
동결건조단계는 적절한 유리 용기(glass receptacle), 바람직하게는 10 ml, 원통형 유리 바이알(vial)에서 수행된다. 유리 바이알은 짧은 시간에 -40℃보다 적고 상온보다 큰 온도에서 극도한 변화를 이겨내야만 하고, 균일한 모양으로 잘려야만 한다. 충전제(bulking agent) 및 핵산을 피막형성하는 리포좀을 포함하는 조성물을 바람직하게는 3 ml 부피로, 및 바람직하게는 9 mg/ml지질과 같이 바이알에 첨가한다.
동결건조단계는 -40℃보다 크고, 또는 예를 들면, 냉동 조성물을 형성하는 -30℃보다 적은 온도에서 냉동 조성물을 구성할 수 있고; 동결건조된 조성물을 형성하기 위해 냉동 조성물을 건조할 수 있다. 냉각단계는 바람직하게는 최종 약 6분 동안까지, 바람직하게는 20 내지 -40까지 1°C./분으로, 온도에서 직선 감소 결과를 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 12-15%의 수크로오스를 사용할 수 있고, 건조단계는 50-150 mTorr이고, 첫 번째 약 -15 내지 약 -35℃의 낮은 온도이고, 이후로 약 25℃까지 상온의 높은 온도이고, 3일 내지 7일 동안 완성된다. 본 개시의 다른 실시형태에서, 트레할로오스를 사용할 수 있고, 건조단계는 약 50-100 mTorr에서, 첫 번째 약 0 내지 약 -15℃의 낮은 온도에서, 그 다음 높은 온도에서 이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 리포좀 내부로부터 핵산의 응집 및 방출을 방지하는 동결건조된 제제에 슈가 및 염의 첨가를 포함하는 약학적 나노입자 조성물에서 입자의 상당한 응집을 방지하는 방법을 제공한다.
약학적 조성물
본 발명의 지질입자는, 특히 치료제와 연관되어 있을 때, 예를 들면, 투여 경로 및 표준 약학적 실행과 연관되어 선택되는 식염수(saline) 또는 포스페이트 버퍼와 같은 약학적으로 허용가능한 희석제(diluent), 부형제(excipient), 또는 담체(carrier)를 추가적으로 구성하는 약학적조성물로서 제제화될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 지질-핵산입자를 포함하는 약학적조성물은 표준 기술에 따라 제조되고, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 구성한다. 일반적으로, 보통 식염수는 약학적으로 허용가능한 담체로서 사용될 것이다. 다른 적절한 담체는 증강된 안정성을 위하여 알부민, 지질단백질(lipoprotein), 글로불린(globulin)과 같은 지질 단백질을 포함하여, 예를 들면, 물, 버퍼로 된 물, 0.9% 식염수, 0.3% 글라이신(glycine), 슈가 또는 다당류, 예를 들면, 수크로오스 및/또는 트레할로오스, 등을 포함한다. 금속 제거제(metal scavengers), 예를 들면, EDTA 뿐만 아니라 충전제, 동결방지제(cyroprotectants) 및/또는 동결건조보호제(lyoprotectants)가 포함될 수 있다. 식염수 또는 담체를 포함하는 다른 염을 포함하는 조성물에서, 담체는 하기의 지질입자 형성에 첨가된다. 따라서, 지질-핵산조성물이 형성된 후에, 상기 조성물은 보통 식염수와 같은 약학적으로 허용가능한 담체로 희석될 수 있다.
얻어진 약학적 제조는 종래의 잘 알려진 멸균기술에 의해 멸균될 수 있다. 그런 다음, 수용액은 사용을 위해 포장될 수 있거나 또는 무균 조건 및 투여 전에 멸균 수용액과 혼합된 동결건조된 제조, 동결건조하에서 여과될 수 있다. 조성물은 pH 조절제 및 버퍼제, 강장조절제(tonicity adjusting agents) 등, 예를 들면, 소듐아세테이트(sodium acetate), 소듐락테이트(sodium lactate), 소듐클로라이드(sodium chloride), 포타슘클로라이드(potassium chloride), 칼슘클로라이드(calcium chloride), 등과 같은 대략적 생리학적 조건에 요구되는 것으로서 약학적으로 허용가능한 보조 물질을 포함할 수 있다. 추가적으로, 지질현탁액은 자유-래디컬(free-radical) 및 축척상에서 지질 과산화 손상에 대하여 지질을 보호하는 지질-보호제(lipid-protective agents)를 포함할 수 있다. a-토코페롤(a-tocopherol) 및 페리옥사민(ferrioxamine)과 같은 수용성 특정철환제(iron-specific chelators)와 같은 지방친화성(Lipophilic) 자유래디컬 제거물질(free-radical quencher)이 적절하다.
약학적 제제에서 지질입자 또는 지질-핵산 입자의 농도는, 예를 들면, 무게에 의해 약 0.01% 미만으로부터 10 내지 30% 만큼까지, 항상 약 0.05-5%에서 또는 적어도 약 0.05-5%에서, 넓게 다양할 수 있고 선택된 투여의 특정 모드에 따라서 액체(fluid)부피, 점도(viscosities) 등에 의해 우선 선택될 것이다. 예를 들면, 농도는 치료와 연관된 액체로드(fluid load)를 낮게 하여 증가시킬 수 있다. 상기는 특히 죽상동맥경화증-관련 울혈성심장기능상실(atherosclerosis-associated congestive heart failure) 또는 심각한 고혈압(hypertension)을 갖는 환자에게 바람직할 수 있다. 선택적으로, 자극 지질로 구성된 복합체는 투여부위의 염증을 약하게 하기 위하여 농도를 줄이도록 희석될 수 있다. 실시형태의 하나의 군에서, 핵산은 부착된 라벨을 가질 것이고 진단(상호보완 핵산 존재의 지적에 의해)을 위해 사용될 것이다. 상기 예에서, 투여되는 복합체의 양은 사용되는 특정 라벨 및 임상의사의 판단에 따를 것이나 일반적으로 신체무게의 킬로그램 당 약 0.01과 약 50 mg 사이, 바람직하게는 신체무게의 약 0.001 과 약 5 mg/kg 사이가 될 것이다.
사용방법
본 명세서에서 설명된 지질입자는 핵산을 세포, 시험관 내 또는 생체 내로 운반하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 지질입자 및 관련 약학적조성물을 사용한 다양한 방법의 하기 설명이 핵산-지질입자와 관련된 설명에 의해 실시예되는 동안에, 상기 방법 및 조성물이 상기 치료로부터 혜택받을 수 있는 임의 질환 또는 장애의 치료를 위한 임의 치료제 운반을 위해 쉽게 적응될 수 있다는 것은 이해되었다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 핵산을 세포로 소개하는 방법을 제공한다. 세포로 소개하는 바람직한 핵산은 siRNA, 면역-촉진 올리고뉴클레오티드, 플라스미드, 안티센스 및 라이소자임(ribozymes)이다. 상기 방법은 발생하는 세포 내 운반을 위해 충분한 시간의 기간을 위하여 본 발명의 입자 또는 조성물을 세포와 접촉하여 수행될 수 있다.
본 발명의 조성물은 거의 임의 세포타입에 흡수될 수 있다. 일단 흡수되면, 핵산-지질입자는 세포 일부에 의해, 지질과 세포 멤브린을 교환하는 엔도사이토스(endocytosed)될수 있거나 또는 세포와 융합될 수 있다. 복합체의 핵산 일부의 옮김 또는 결합은 상기 경로의 임의 하나를 경유하여 장소를 차지할 수 있다. 본 발명의 범위에 대하여 제한되는 의도 없이, 엔도사이토스에 의해 세포로 차지되는 입자 경우에서 입자는 엔도좀 멤브린(endosomal membrane)과 상호작용하고, 아마도 비이중층 상의 형성에 의해, 엔도좀 멤브린의 안정화를 초래하고, 피막된 핵산을 세포 세포질로 소개를 초래한다는 것을 믿게된다. 유사하게 세포 형질막을 갖는 입자의 직접적 용합의 경우에서, 융합이 일어날 때, 상기 리포좀 멤브린은 세포 멤브린으로 통합되고 리포좀의 내용물은 세포내 액체와 혼합된다. 시험관 내에서 수행될 때, 세포 및 지질-핵산조성물 사이의 접촉은 생체 적합적 배지에서 일어날 것이다. 조성물의 농도는 특정 적용에 따라 넓게 다양할 수 있으나, 일반적으로 1 ｕmol과 10 mmol 사이이다. 특정 실시형태에서, 지질-핵산조성물로 세포의 치료는 일반적으로 1부터 24시간까지, 바람직하게는 2부터 8시간까지의 시간의 기간 동안 생리학적 온도(37℃.)에서 수행될 것이다. 시험관 내 적용을 위하여, 식물 또는 동물 기원, 척추동물 또는 무척추동물, 및 임의 조직 또는 타입이든지 간에, 핵산의 운반은 배양에서 자란 임의 세포일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 세포는 동물세포일 것이고, 더욱 바람직하게는 포유동물세포이고, 가장 바람직하게는 인간세포이다.
실시형태의 하나의 군에서, 지질-핵산 입자 현탁액은 약 103으로부터 약 105 세포/mL까지, 더욱 바람직하게는 약 2xl04세포/mL의 세포농도를 갖는 60-80% 치밀함으로 분주된 세포에 첨가되었다. 세포에 첨가된 현탁액의 농도는 바람직하게는 약 0.01 부터 20 ㎍/mL까지, 더욱 바람직하게는 약 1 ㎍/mL이다.
통상의 적용은 잘 알려진 절차를 사용하여 특정 세포 내 표적을 녹다운 또는 침묵하기 위하여 siRNA의 세포내 운반을 제공하는 것을 포함한다. 선택적으로 적용은 치료적으로 유용한 폴리펩티드를 위한 코드하는 DNA 또는 mRNA서열의 운반을 포함한다.
본 발명의 방법은 시험관 내, 생체 외, 또는 생체 내에서 실행될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물은 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 핵산을 세포 생체 내로 운반하기 위하여 또한 사용될 수 있다.
생체 내 투여를 위하여, 약학적 조성물은 바람직하게는 비경구적으로(parenterally), 예를 들면, 관절내(intraarticularly), 정맥내(intravenously), 복강내(intraperitoneally), 피하 내(subcutaneously),또는 근육내(intramuscularly)에 투여된다. 특정 실시형태에서 약학적조성물은 일시주사(bolus injection)에 의해 정맥내에 또는 복강내에 투여된다.
다른 방법에서, 약학적 제조는 조직으로 제조의 직접 적용에 의해 표적조직과 접촉될 수 있다. 상기 적용은 국소(topical), "개방(open)" 또는 "폐쇄(Closed)" 절차에 의해 만들어질 수 있다. "국소"에 의하면, 입인두(oropharynx), 외이도(external auditory canal), 등과 같은 환경에 노출된 조직에 약학적 제조의 직접 적용을 의미한다. "개방" 절차는 환자의 피부를 절개하고 약학적 제조가 적용된 조직 밑을 직접 육안으로 보는 것을 포함하는 이러한 절차를 포함한다. 상기는 일반적으로 폐에 접근하기 위한 개흉술(thoracotomy), 복부내장(abdominal viscera)에 접근하기 위한 복부개복술(abdominal laparotomy), 또는 표적조직에 접근하기 위한 다른 직접 수술과 같은 외과적 절차에 의해 완성된다. "폐쇄" 절차는 내부 표적조직이 직접적으로 보이지 않으나, 피부의 작은 상처를 통하여 기구를 삽입하여 접근되는 침습(invasive) 절차이다. 예를 들면, 상기 제조는 바늘세척(needle lavage)에 의해 복막(peritoneum)으로 투여될 수 있다. 이와 같이, 약학적 제조는 허리천자(lumbar puncture) 에 뒤이어 척추마비(spinal anesthesia) 또는 척수의 메트라자미드 이미징(metrazamide imaging)을 위해 통상 실행되었던 것으로 환자의 적합한 위치화 동안에 주입에 의해 수막(meninges) 또는 척수(spinal cord)로 투여될 수 있다. 선택적으로 상기 제조는 내시경 장치(endoscopic device)를 통하여 투여될 수 있다.
또한 지질-핵산 조성물은 폐로 흡입된 분무제로 또는 질환 부위의 직접 주사에 의하여 투여될 수 있다.
본 발명의 방법은 다양한 개체 또는 숙주에서 실행될 수 있다. 바람직한 개체 또는 숙주는 인간, 비인간 영장류, 개, 고양이, 가축, 말, 양, 등과 같은 포유종을 포함한다. 실험실시형태에서, 개체는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방의 필요에서, 예를 들면, 질환 또는 장애를 위한 위험에서 진단되거나 또는 고려되는 개체, 인간과 같은 포유동물이다.
본 발명의 지질-치료제 입자의 용량은 지질에 대한 치료제의 비와 연령, 무게, 및 환자의 조건에 기초한 의사의 의견 투여에 의존할 것이다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 모듈레이팅하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 모듈레이팅할 수 있는 핵산과 연관된 본 발명의 지질입자와 접촉하는 것을 구성한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "모듈레이팅(modulating)"은 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 변경시키는 것을 의미한다. 다른 실시형태에서, 모듈레이팅은 증가(increasing)시키거나 증강시키는 것(enhancing)을 의미할 수 있고, 또는 감소(decreasing)시키거나 축소(reducing)시키는 것을 의미할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현수준을 측정하는 방법은 당업계에서 잘 알려지고 활용되고 예를 들면, 역전사-중합효소 사슬 반응(reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR) 및 면역조직화학(immunohistochemical) 기술을 포함한다. 특정 실시형태에서, 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현 수준은 적절한 대조군 값과 비교하여 50%보다 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 또는 그 이상에 의해 증가되거나 감소된다.
예를 들면, 만약 증가되는 폴리펩티드의 발현을 원한다면, 핵산은 원하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터일 수 있다. 다른 한편으로, 감소된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 원한다면, 그 다음 핵산은 표적 폴리펩티드응 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특정적으로 하이브리드하여, 표적 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현을 방해하는 폴리뉴클레오티드서열을 구성하는, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 또는 마이크로 RNA(microRNA)일 수 있다. 선택적으로, 핵산은 안티센스올리고뉴클레오티드, siRNA, 또는 마이크로 RNA(microRNA)를 발현하는 플라스미드일 수 있다.
특정 실시형태에서, 핵산 활성제 또는 치료제는 siRNA, 마이크로RNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드,및 siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현시킬 수 있는 플라스미드로부터 선택되고, siRNA, 마이크로RNA, 또는 안티센스 RNA는 폴리펩티드의 발현을 감소시키는 것과 같은 폴리펩티드 또는 이의 보완체(complement)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특정적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 핵산은 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체(variant) 또는 조각의 발현이 증가되는 것과 같은, 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 조각을 암호화하는 플라스미드이다.
관련된 실시형태에서, 치료제가 siRNA, microRNA,안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 siRNA, microRNA, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 발현할 수 있는 플라스미드로부터 선택되고, siRNA, microRNA, 또는 안티센스 RNA는 폴리펩티드 또는 이의 보완물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특정적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 경우에, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 제공하는 것을 포함하는, 개체에서 폴리펩티드 과발현에 의해 특징되는 질환 및 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
다른 관련된 실시형태에서, 치료제가 폴리펩티드 또는 이의 기능적 변이체 또는 조각을 암호화하는 플라스미드인 경우에, 본 발명은 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 제공하는 것을 포함하는, 개체에서 폴리펩티드의 저발현에 의해 특징되는 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 포함한다.
실시예
실시예 1
리포좀/RNA 나노 입자 및 지질 단독 나노 입자는 2개의 다른 siRNA를 사용하여 20L부터 200L까지 범위를 갖는 다양한 스케일에서 도 1의 참조에 의하여 제조되었다.
스톡(stock) 지질용액을 하기와 같이 혼합하였다. 모든 지질성분(양이온지질, DOPE, 콜레스테롤, PEG가 접합된 지질, 및 diVA-PEG750-diVA)을 4.5 mg/mL의 무게 농도까지 순수에탄올에서 용해시켰다. 에탄올에 있는 지질을 35 내지 40℃까지 올렸고 육안으로 보일 때까지 혼합하였다.
지질용액을 0.45/0.22 ㎛ 여과기를 통하여 지질스톡 관으로부터 여과된 지질스톡 관까지 펌프하였다.
siRNA를 지질 비에 대한 최종 siRNA에 의존한 농도 0.26 mg/mL 또는 0.16 mg/ml에서 siRNA 스톡 관에 있는 50 mM 시트레이트(citrate)버퍼에 용해하였다. siRNA용액은 0.45/0.22 ㎛ 여과기를 통하여 siRNA 스톡 관으로부터 35%에탄올 관에 있는 리포좀 siRNA로 펌프하였다.
내용물을 계속적으로 교반하는 동안에 35%에탄올 관에 있는 리포좀 siRNA를 35 내지 40℃로 가져왔다. siRNA가 로드된 리포좀을 자발적으로 형성하기 위하여 노즐을 사용하여 siRNA를 포함하는 버퍼의 표면상에 지질용액을 스프레이 하였다. 지질은 siRNA와 혼합되어 14:1 또는 9:1 (wt:wt)의 siRNA 비에 대한 최종 총 지질 및 35%의 에탄올 농도에 도달하였다.
리포좀 용액을 20 리터 플렉스 보이(liter Flex Boy)단일용도 백으로 0.22 ㎛ 여과된 PBS 버퍼를 이용하여 대략 10%의 최종 에탄올 농도가 되도록 희석하였다. 얻어진 리포좀 용액은 농축되고 PBS의 10x부피에 대하여 정용여과(정용여과)되어 에탄올을 제거하고 버퍼를 교환하였다. 전체 농도 및 여과작용단계는 단일용도 펌프챔버, 단일용도 구부릴 수 있는 튜빙(flexible tubing), 및 단일용도 할로우-파이버(hollow-fiber) 멤브린 카트리지에 고정시킨 쿠아트로 플로우 펌프(Quattro Flow (diaphragm) pump)를 사용하여 수행되었다. 최종 현탁액은 미생물 오염도 감소를 위해서 0.45/0.22 ㎛ 여과기를 통해 최종 단일용도 수집 병으로 여과되었다. 결과를 표 1에 나타냈다.
배치 부피
(Batch Vol)
[L]		 약물 물질 지질:약물
[wt/wt]		 입자크기 EE
[%]		 생산량 수율
[siRNA 회수]
평균 [nm] PDI
20 siRNA 1 14:1 79.6 0.144 95% >90%
20 리포좀 없음 (siRNA 없음) na 78.1 0.129 na >90%
20 siRNA 2 9:1 88.8 0.156 92% >90%
50 siRNA 2 14:1 80.2 0.146 94% >90%
120 리포좀 없음 (siRNA 없음) na 79.1 0.107 na >90%
120 siRNA 2 9:1 89.9 0.138 92% >90%
200 siRNA 1 14:1 89.1 0.154 94% >90%
200 siRNA 2 14:1 83.7 0.143 94% >90%
리포좀의 제조
일실시예 실시형태에서, 지질 혼합물은 양이온 아미노 지질, 중성 지질(아미노지질보다 다른), 스테로이드(예, 콜레스테롤), 및 PEG-변형된 지질(예, PEG-S-DMG, PEG-C-DOMG 또는 PEGDMA)의 혼합물이고 유기용매에 공-용해되었다. 바람직한 실시형태에서, 지질혼합물은 양이온 아미노지질, 중성지질, 콜레스테롤 및 PEG-변형된 지질을 필수적으로 구성한다. 추가적으로 바람직한 실시형태에서, 지질혼합물은 다양한 몰라(molar) 비에서 양이온지질, DOPE (또는 다른 헬퍼지질, 이온화 또는 영구적 양이온전하로 된), 콜레스테롤 및 PEG-접합된 지질을 구성한다. 바람직한 몰라(molar) 범위는 40 내지 60 몰(mole)% 양이온지질, 10 내지 30% 중성지질, 20 내지 40% 콜레스테롤, 및 1 내지 10% PEG-변형된지질 사이에 있다. 표적지질은 지질혼합물, 예를 들면, 0.1 내지 5의 몰라 비(표적지질:총지질)에서 diVA-PEG750-diVA (또는 다른 VA-접합된 표적지질)에 첨가할 수 있다. 또한, 지질혼합물은 자연적(예, 키토산) 또는 합성(예, PEI) 기원일 수 있는 중합체 또는 공정보조의 혼합물을 포함할 수 있다. 지질의 총농도는 25 mg/ml보다 적게, 바람직하게는 5mg/ml보다 적다. 지질혼합물은 예를 들면, 0.45 또는 0.2 ㎛ 여과기, 메브린을 통하여 여과된다.
본 발명에 따라서, 지질혼합물은 버퍼로된 수용액과 혼합된다. 버퍼로된 수용액은 지질혼합물에서 양자성공여성(protonatable) 지질의 pKa 보다 적은 pH를 갖는 버퍼인 용액일 수 있다. 적절한 버퍼의 실시예는 시트레이트(citrate), 포스페이트, 아세테이트 및 MES를 포함한다. 특히 바람직한 버퍼는 스트레이트 버퍼이다. 바람직한 버퍼는 피막된 핵산의 화학에 의존하여, 1-1000 mM 음이온의 농도범위에 있을 것이고, 버퍼 농도의 최적화는 높은 로딩 수준을 얻는데 현저할 것이다.선택적으로, HCl, H2SO4, 등으로 pH 5-6으로 산성화된 순수 물을 사용할 수 있다. 상기는 예를 들면, 에탄올을 제거하고, pH를 증가시키거나 또는 보통 식염수와 같은 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합하기 위하여 입자가 투석될 때, 입자 멤브린을 가로질러 삼투능(osmotic potential)을 발란스할 비이온 용질에 적절할 수 있다. 또한 버퍼는 공정보조(processing aids)(예, 폴록사머(poloxamers), 계면활성제(surfactants), 세정제(detergents)), 충전제(bulking agents)(예, 만니톨) 또는동결방지제(예, 수크로오스, 트레할로오스, 갈락토오스, 이눌린(inulin))을 포함한다. 버퍼에 있는 핵산의 양은 0.08부터 0.8 mg/mL까지이다.
에탄올 첨가시에, 수용액 및 에탄올의 온도는 25 내지 45℃, 바람직하게는 30 내지 40℃이다. 에탄올용액을 액체-액체 경계면을 통해서 수용액에 첨가되고 에탄올은 수용액에 잠긴 튜브 또는 노즐을 통해서 운반된다.
유기용매는 통제되는 비율에서, 바람직하게는 일정한 비율에서 수용액으로 유기용매를 운반하는 펌프에 의해 첨가된다. 유기용매의 운반은 1 분 내지 100 분, 바람직하게는 2 내지 20 분에 완성될 수 있다. 유기용매는 단일 구멍(orifice) 또는 노즐(nozzle)을 통해서, 또는 다수-구멍 또는 노즐 시스템을 통해서 첨가될 수 있다. 단일구멍(또는 다수노즐 어레이) 지름은 10부터 1000 ㎛까지, 바람직하게는 300부터 600 ㎛까지 일 수 있다. 첨가는 분산에서 보조하기 위하여 유기 줄기(organic stream) 0 부터 30 psi 까지 적용하여 수행될 수 있다. 유기용매를 수용액으로 첨가하는 동안에, 얻어진 용액을 교반 또는 재순환하여 혼합한다. 첨가단계는 25 내지 45% 에탄올, 가장 바람직하게는 35%에탄올인 최종 농도 결과를 가진다.
유기용매를 제거하기 위해 최종용액을 투석 또는 바람직하게는 여과작용에 의해 처리한다. 에탄올을 제거되는 동안에, 수용액을 중성 pH, pH 6.8 내지 pH 7.5, 바람직하게는, pH 7.2, 예를 들면, 포스페이트 버퍼에서 버퍼된 하나로 전환한다. 또한 버퍼는 공정보조(processing aids)(예, 폴록사머(poloxamers), 계면활성제(surfactants), 세정제(detergents)), 충전제(bulking agents)(예, 만니톨) 또는 동결방지제(예, 수크로오스, 트레할로오스, 갈락토오스, 이눌린(inulin))을 포함한다. 얻어진 수용액은 바람직하게는 축적 또는 사용되기 전에, 예를 들면, 0.22 ㎛ 여과기를 통해서 여과를 통해, 여과된다.
상기 리포좀 생산 방법은 SUS 사브-유닛의 시스템을 포함하는 다양한 SUS에 관련되어 사용될 수 있다. 상기 다양한 시스템은 하기의 서브-유닛으로 구성될 수 있다: 수 혼화성 유기용매에서 지질용액을 제조하기 위한 지질 혼합백, 지질 유지백 및 지질용액을 지질유닛(lipid unit)으로부터 지질 유지장치(holding unit)로 옮기는 수단을 구성하는 지질혼합장치; RNA용액을 제조하기 위한 RNA 혼합백, RNA 유지백, 및 RNA용액을 RNA 유닛으로부터 RNA유지장치로 옮기는 수단을 구성하는 RNA 혼합장치; 및 할로우 파이버 메브린(hollow fiber membranes), 단일용도격막펌프헤드(diaphragm pump head), 및 다양한 유지백을 구성하는 여과작용 시스템.
SUS 장비는 무균공정을 사용하여 리포좀을 생성하는 멸균 연결/단절장치를 사용하여 전처리-멸균 및 작동될 수 있다. 무균공정은 최종 멸균 (0.22 ㎛)여과 요구를 없앤다. 0.22 ㎛ 여과기의 부재는 공정되는 입자크기(> 200 nm)의 큰 범위를 허가하고 임의 가능한 필터/약물 생산 호환성 이슈를 해결한다.
실시예 2: RNA -지질 입자크기에 대한 농도 효과.
상기 실시예는 입자크기에 대한 siRNA및 지질농도의 효과를 설명한다.
본 명세서에서 설명된 방법에 의해 나노 입자를 제조하기 위하여, 양이온지질, DOPE, 콜레스테롤, PEG-BML, 및 diVA-PEG750-diVA을 각각 50:10:38:2:5의 몰라비에서 순수에탄올에 용해시켰다. 상기 siRNA를 pH 4.5에서 50 mM 시트레이트 버퍼에 용해시켰다.
siRNA-포함하는 버퍼를 혼합관에서 계속해서 교반하는 동안에 35 내지 40℃로 가져왔다. siRNA로드된 리포좀을 자발적으로 형성하기 위하여 에탄올/지질 혼합물을 매니폴드/노즐 어레이를 사용하여 siRNA를 포함하는 버퍼 표면으로 스프레이 하였다. 지질 및 RNA 농도를 0.05부터 0.5 mg/mL까지 최종 siRNA 농도범위, 0.08 (wt:wt)의 약물:지질 비, 및 35%의 에탄올 농도에 도달하도록 조정한다. siRNA에 대한 지질 비는 테스트된 모드 조건을 위해 일정하게 유지되었다.
siRNA 로드된 리포좀을 입자를 안정시키기 위하여 ~10%에탄올에 희석시킨 후 에탄올을 제거하고 버퍼를 교환하기 위하여 10X부피의 PBS (pH 7.2)에 대해 정용여과(diafiltered) 하였다. 미생물 오염도 감소를 위하여 최종 생성물을 0.22 ㎛, 멸균등급, PES 여과기를 통하여 여과하였다. 부피,평균 입자크기 및 다분산 지수(PDI)를 다이나믹 빛 산란(dynamic light scattering (DLS))을 사용하여 결정하였다. 결과를 표2에 나타냈다.
Figure pct00008
상기 결과는 입자크기가 siRNA 농도(mg/ml에서)가 증가함에 따라 증가하는 것을 나타냈다. 지질 및 siRNA 농도(동일한 상대적 비를 유지)의 감소는 입자크기를 감소시키고, 농도 증가는 입자크기를 증가시킨다. 0.05 내지 0.5 mg/ml 사이의 최종 siRNA 농도는 96.7 내지 141.9 nm, 150 nm보다 작은 평균 입자지름을 갖고, 모든 경우에서 0.2보다 작은 다분산 지수로 된 나노입자를 생성한다.
0.2보다 작은 PDI를 갖는 150보다 작은 입자크기는 속이 빈 수행된 지질 소포체 제조없이 및/또는 기계적 공정없이, 본 명세서에서 설명된 방법에 의해 생성된다.
실시예 3: RNA -지질 입자 형성에 공정 파라미터의 효과
상기 실시예는 RNA-지질 입자 형성에 다양한 공정 파라미터의 효과를 설명한다. 몇 개의 파라미터는 온도, 에탄올 농도, 버퍼, 지질:siRNA 비, 및 지질용액을 분산에 사용되는 노즐 타입을 포함하는 상기 실험동안에 스크리닝되었다.
HEDC, DOPE, 콜레스테롤, a PEG-BML, 및 diVA-PEG750-diVA를 40:30:25:5:2의 몰라비에서 순수에탄올에 용해시켰다. 혼합관에서 계속해서 교반하는 동안에 버퍼를 포함하는siRNA를 지적된 온도로 가져왔다. siRNA로드된 리포좀을 자발적으로 형성하기 위하여 노즐을 사용하여 siRNA를 포함하는 버퍼 표면으로 에탄올/지질 혼합물을 스프레이 하였다. 지적된 약물/지질 비 및 지적된 최종 에탄올 퍼센트에서 0.1 mg/mL의 최종 siRNA 농도에 도달하도록 지질을 siRNA와 혼합하였다.
siRNA를 25부터 100 mM까지 및 pH 3.5 내지 pH 6.5 강도에서 다양화된 시트레이트 버퍼에 용해시켰다. 혼합 온도는 25부터 45℃까지 다양하였다. 최종 에탄올 농도는 25부터 45%까지 다양하였다. 약물:지질 비 (wt/wt)는 0.07부터 0.11까지 다양하였다. 수화(hydration) 노즐 내부지름(ID)은 0.005부터 0.125인치까지 다양하였다. 각각의 조건은 각각의 공정 파라미터의 효과를 비교하기 위한 측정으로서 수행되었다. 지적되지 않는 한, 각각의 조건은 50 mM 시트레이트 버퍼, pH 4.5, 35℃, 35% 최종 에탄올, 0.07의 약물:지질 비, 및 0.005 인치의 노즐 ID에서 수행되었다.
siRNA로드된 리포좀은 입자를 안정시키기 위해 10% 에탄올에 희석된 후에 에탄올을 제거하고 버퍼를 교환하기 위하여 10X부피의 PBS (pH 7.2)에 대해 정용여과하였다. 미생물 오염도 감소를 위해 최종 생성물은 0.22 ㎛, 멸균등급, PES 여과기를 통하여 여과되었다.
표 3은 지질-핵산 나노 입자의 평균지름 및 PDI 상의 pH 효과를 나타낸다. 비록 150 nm평균 입자크기보다 작을지라도, 증가하는 버퍼 pH는 증가하는 입자크기 결과를 나타냈다.
Figure pct00009
표 4는 다양한 파라미터상에서 버퍼농도의 효과를 나타낸다. 상기 결과는 증가하는 버퍼 농도는 siRNA 회수를 감소시켰다. 평균 입자지름 및 PDI는 영향이 없는 것처럼 나타났다. 최소 입자크기는 pH 3.5에 대해서 관찰되었고 최소 siRNA 회수는 25 mM 시트레이트 버퍼에 대해서 관찰되었다.
Figure pct00010
표 5는 25℃부터 45℃까지 증가하는 수화(hydration)온도는 80%부터 87%까지 siRNA 회수를 개선하는 반면에 135.7부터 102.2 nm까지 입자크기를 감소시킨다. 증가하는 최종 에탄올 퍼센트는 siRNA 회수에 영향 없이 입자크기를 증가시켰으나 88%까지 피막형성 효율을 감소시키는 입자크기를 증가시킨다.
Figure pct00011
표 6은 증가하는 약물:지질 비는 80부터 87%까지 증가된 siRNA 회수를 감소시켰다. 최소 회수는 0.07 약물:지질 (w:w)의 비에서 관찰되었다. 모든 다른 측정 성질은 약물:지질 비에 의해 영향받지 않았다. 상기 결과는 놀랍고 최적 회수가 0.16보다 동등하거나 더 큰 약물:지질 (w:w)(지질:약물 (w:w) 6.26보다 동등하거나 적은)에서라고 설명한 마우러 등(Maurer et al.) 및 셈플 등(Semple et al.)의 개사 관점에서 예상되지 않았다. 현재 결과는 반대 추세가 본 명세서에서 설명된 방법을 사용하여 얻어진다는 것을 제시한다.
Figure pct00012
표 7은 25 배까지 증가하는 노즐 ID는 입자크기, 피막형성 효율 또는 siRNA 회수에 영향을 주지 않았다. 버퍼표면에 에탄올/지질을 첨가하기 위해 사용된 노즐 구멍에 상당한 유연성이 있다. 상기 유연성은 스케일 업(scale up)하는 동안에 주요 장점을 제공할 수 있다.
Figure pct00013
실시예 4: 리포좀의 배치생산을 위한 참조 방법에 대한 설명된 공정의 비교
셈플 등 미국 특허 6,858,225(Semple, et al. US Patent 6,858,225)(대조군 방법에 의해 사용된 대조군 방법 또는 대조군 조성물)에 의해 설명된 방법에 지질/핵산입자를 준비하기 위한 본 명세서에서 설명된 공정을 비교한 상기 결과는 실시예 3의 조성물에 따라 또는 대조군 방법에 의해 제조되었다.
실시예 3의 조성물은 40:30:25:5:2의 몰라 비(molar ratio)에서 공-용해된 양이온지질, DOPE, 콜레스테롤, PEG 접합된 지질, 및 표적 지질로 구성되었다(상기 실시예 2 참조).
대조군 조성물은 25:20:45:10의 몰라 비에서 공-용해된 DODAP, DSPC, 콜레스테롤, 및 PEG-CER-14로 구성되었다.
실시예 3의 방법에서, 지질은 순수에탄올에서 4.32 mg/ml에서 용해되었고, siRNA는 50 mM 시트레이트, pH 4.5에서 0.163 mg/ml에서 용해되었다. siRNA용액은 혼합관에서 계속해서 교반하는 동안에 35 내지 40℃로 가져왔다. 그런 다음 에탄올/지질 혼합물을 매니폴드/노즐 어레이를 사용하여 siRNA를 포함하는 버퍼의 표면상에 스프레이하였다. 최종 에탄올 농도는 35%였고 최종 지질/siRNA 비는 14:1 (w:w)였다. 그런 다음 얻어진 입자를 10%에탄올에 희석하였고 10x부피의 PBS(pH 7.2)에 대하여 정용여과하였다.
대조군 방법에서, 지질은 순수에탄올에서 25 mg/ml로 용해되었고, siRNA는 300 mM 시트레이트, pH 4.0에서 4.17 mg/ml로 용해되었다. siRNA를 포함하는 버퍼는 혼합관에서 계속해서 교반하는 동안에 상온에서 보존시켰다. 에탄올/지질 혼합물을 siRNA 로드된 리포좀을 자발적으로 형성하기 위하여 단일 노즐을 사용하여 siRNA를 포함하는 버퍼의 표면상에 스프레이 하였다. 최종 에탄올 농도는 40%였고, 최종 지질/siRNA 비는 6:1(wt:wt)이었다. 혼합 후에, 지질/siRNA 현탁액은 2개, 100 nm 폴리카보네이트 멤브린으로 제조되고 65℃에서 전-평형된 10 mL 압출기(extruder)로 옮겨졌다. 현탁액은 300 psi에서 10 통과를 사용하여 압출되었다. 얻어진 입자는 10x부피의 PBS, pH 7.2에 대하여 정용여과되었다.
각각의 방법으로부터 얻어진 입자는 0.22 ㎛ 여과기를 통해서 통과되었다. 평균 입자크기, PDI, 및 EE는 본 명세서에서 설명된 바와 같이 측정되었다.
실시예 3의 방법은 압출단계 없이 대조군 방법보다 작은 지질나노 입자를 생성한다. 대조군 방법에 의해 입자생성의 크기는 압출 전에 측정되었다. 대조군 방법을 사용하여 NDT-0009조성물로부터 제조된 입자는 250 nm 입자보다 큰 평균 입자크기를 가진다. 압출 및 여과작용 후에 평균 입자크기가 128 nm로 감소하였다. 실시예 3의 방법은 압출 없이 150 nm보다 적은 평균 입자크기를 갖는 입자를 생성하였다. 유사한 추세는 대조군 조성물로 시작하는 것을 관찰되었다.
실시예 3의 방법은 대조군 방법보다 siRNA를 지질나노 입자로 피막형성하는 것에 더욱 효과적이다. 실시예 3의 방법에 의해 제조된 입자의 피막형성 효율 (EE)은 대조군 방법에 의해 형성된 입자의 것보다 더 높다(두 개의 생성물에서 정용여과전에 측정됨). 실시예 3의 방법에 의해 제조된 EE 입자는 대조군 방법에 의해 형성된 입자의 것보다 더 높은 95%보다 더 높다. 대조군 방법에서, 자유 siRNA의 대다수는 최종 생성물의 EE에서 개선 결과를 나타내는 정용여과 후에 제거되었다.
실시예 3의 방법은 대조군 방법보다 더 높은 피막형성 효율을 갖는 나노 입자를 생성한다. 두 개의 생성물에서 정용여과 후에 측정된 것으로서, 실시예 3의 방법에 의한 siRNA의 최종 회수는 대조군 방법에 의해 얻은 것 2배 이상이었다(72% 대 33%). 상기 데이타는 실시예 3의 방법에서 압출 단계의 부족뿐만 아니라 EE에서 개선을 반영한다. 대조군 방법의 여분의 압출단계는 리포좀을 구조저긍로 변화하고, 입자로부터 siRNA를 명백히 분리하기 때문에 실시예 3의 방법은 더 나은 siRNA 회수를 제공한다. 상기 결과는 본 명세서에서 설명된 방법이 150 nm보다 적은 평균 입자크기를 갖는 나노입자의 피막형성 효율 및 수율을 개선하는 동안에 대조군 방법에 비해 다수의 공정단계를 감소시켜 몇가지 장점을 제공하는 것을 나타낸다.
실시예 5: 리포좀 배치 생성물의 스케일 업 동안에 가변성 ( Variability ) 비교
실시예 3에서 설명된 것처럼 상기 공정은 영구적으로 전하된 (HEDC) 양이온지질 및 이온화 (S104) 양이온지질분자의 혼합이 포함된 다른 지질 조성물로 수행되었다. HEDC, S104, DOPE, 콜레스테롤, PEG-BML, 및 diVA-PEG750-diVA는 순수에탄올에 20:20:30:25:5:2의 몰라 비로 용해되었다. 다른 siRNA 분자를 스케일 업하는 동안에, 다른 배치 부피, 및 다른 siRNA (약물)/지질 비를 평가하였다. 표 8은 조건의 범위로부터 원인이 되는 나노 입자의 성질 결과를 요약한다.
배치
부피		 약물 물질 약물/
지질		 입자크기 PDI EE 생성물 수율
[L] [wt/wt] [nm] [%] [siRNA 회수]
5 siRNA 1 0.07 93 0.14 97% >90%
20 siRNA 1 0.07 83 0.15 95% >90%
20 Empty리포좀 (no siRNA) na 83 0.14 na na
20 siRNA 2 0.11 90 0.16 92% >90%
50 siRNA 2 0.07 82 0.14 94% >90%
120 Empty리포좀 (no siRNA) na 86 0.14 na na
120 siRNA 2 0.11 82 0.14 94% >90%
200 siRNA 1 0.07 86 0.17 94% >90%
200 siRNA 2 0.07 86 0.17 96% >90%
상기 결과는 본 명세서에서 설명된 방법이 꽤 강건함을 나타낸다. 유사한 입자크기 및 PDI는 50-배 범위 기간을 스케일 업 동안에 얻었다. 입자크기는 >90% 생성물 수율로, 시종일관 100 nm보다 적다. 다분산 지수 값은 매우 적은 범위이고, 이는 거의 소포체(vesicles)의 단분산 집단을 나타낸다.
실시예 6: 제제를 포함하는 수크로오스를 위한 리포좀 배치 생성물의 스케일 업 동안 가변성 비교
실시예 3에서 설명된 공정은 20:20:30:25:5:2 몰라 비로 에탄올에 용해된 HEDC, S104, DOPE, 콜레스테롤, PEG-BML, 및 diVA-PEG750-diVA로 수행되었다. 수크로오스는 본 명세서 설명된 것처럼 소포체의 제조에 포함되었다. 다른 배치 부피는 평가되었고 냉동-해동에 대상이었다. 표 9는 조건의 범위로부터 원인이 되는 나노 입자의 성질 결과를 요약한다.
절반 단일용도 제작 무리(semi single-use manufacturing train)를 사용하여 제조된 냉동 (수크로오스 포함) 제제
배치
부피		 약물 물질 약물/지질 냉동 전 해동 후 생성물
수율
[L] [wt/wt] 크기 [nm] PDI EE [%] 크기 [nm] PDI EE [%] [siRNA
회수]
5 siRNA 2 0.11 94 0.12 95 96 0.14 93 >90%
20 siRNA 2 0.11 98 0.15 94 97 0.16 90 >90%
120 siRNA 2 0.11 96 0.14 90 96 0.14 89 >90%
120 siRNA 2 0.11 97 0.15 91 99 0.15 89 >90%
120 siRNA 2 0.11 100 0.15 91 tbd tbd tbd >90%
상기 결과는 냉동 해동은 지질 나노입자의 성질을 변화하지 않는다. 또한 결과는 배치(batches) 사이에 가변성이 꽤 낮고 상기 공정은 재생가능적으로 균일한 나노입자를 생성한다는 것을 나타냈다.
조건은 동결건조에 의해 약물:지질입자의 안정화를 수립하였다. 실시예 2에 따라 제조된 약물:지질입자는 활성의 손실 없이 동결건조될 수 있다. 약물:지질입자가 형성된 스크로오스의 최종농도는 8% (w/v)였다. 동결건조된 제조는 증류수에를 첨가하여 재구성되고 i.v. 주사 후에 마우스의 폐에 자체의 형질감염 활성을 측정하였다. 재구성된 제조를 냉동 및 해동하는 것은 활성에 영향을 주지 않았다. 표 10에서 나타낸 결과는 본 명세서에서 설명된 방법을 사용하여 제조된 입자가 동결건조 동안에 자체의 성질을 보존하고, 따라서 안정적임을 나타낸다. 특히, 입자크기는 동결건조 전, 동안, 및 후에 안정되고 보존된다.
Figure pct00014
입자의 안정성은 지질 조성물, 지질:RNA(w:w) 값, 및 제제에서 사용된 다당류의 선택의 기능성이다. 생체 내에서 높은 생물활성을 나타내는 지질:RNA 복합체의 안정적인 제제를 생성하기 위한 본 명세서에서 설명된 방법적 접근은 약학적으로 허용가능한 제조를 수립하는 장점을 수여하므로, 리포좀 기반 RNA 운반을 용이하게 한다.
실시예 7: 지질의 침하된 주사( Submerged injection of Lipid )
실시예 3에서 설명된 것과 같은 공정은 침하된 주사를 사용하여 소포체 제조에 의해 변형되어 수행되었다. HEDC, S104, DOPE, 콜레스테롤, PEG-BML, 및 diVA-PEG750-diVA을 20:20:30:25:5:2의 몰라 비로 에탄올에 용해되었다. 표 11은 표면 첨가공정과 비교하여 침하 첨가공정으로부터 원인이 되는 나노입자 특징을 나타낼 수 있는 결과를 요약한다. 결과는 지질이 침하된 주사에 의해 수성층에 첨가될 때 평균 입자크기가 상당히 감소하는 놀랍고 예상치 못한 결과를 나타낸다.
Figure pct00015
동일한 공정방법은 버퍼에 있는 수크로오스를 포함하는 리포좀을 제조하기 위해 사용되었다. 표 12는 다른 첨가 시간으로부터 원인이 되는 나노 입자를 특징으로 하는 결과를 요약하고 표 13은 침하 첨가와 비교하여 표면을 사용하여 제조된 나노입자의 특징으로 하는 결과를 요약한다.
절반 단일용도 제작 무리를 사용하여 제조된 액체 제제
첨가 시간
[분]		 첨가 방법 입자크기 EE 생성물 수율
평균 [nm] PDI [%] [siRNA 회수]
0.5 침하(Submerged) 66 0.140 90 >90%
2.0 침하 93 0.112 94 >90%
5.0 침하 99 0.133 92 >90%
10 침하 98 0.137 91 >90%
절반 단일용도 제작 무리를 사용하여 제조된 액체 제제
배치
부피		 첨가 시간
[분]		 첨가 방법 입자크기 EE 생성물 수율
[L] 평균 [nm] PDI [%] [siRNA 회수]
5 15 표면 93 0.136 95 >90%
1 1.5 침하 63 0.102 95 >90%
상기 결과는 지질이 2 분 보다 적은 첨가 시간으로 침하 주사에 의해 수성층에 첨가될 때 평균 입자크기가 상당히 감소하는 놀랍고 예상치 못한 결과를 나타낸다. 또한 결과는 지질이 침하 주사에 의해 수성층에 첨가될 때 평균 입자크기가 상당히 감소하는 놀라운 결과를 나타낸다.

Claims (21)

  1. 하기를 포함하는 지질-핵산 나노 입자(lipid-nucleic acid nanoparticle)를 멸균제조하는 시스템:
    수 혼화성(water-miscible) 유기용매에서 지질을 포함하는 유기지질용매를 위한 첫 번째 유지장치(holding unit);
    치료약물을 포함하는 수용액을 위한 두 번째 유지장치;
    정적 혼합기(static mixer)를 갖는 혼합장치;
    유기지질용매를 혼합챔버(mixing chamber)에 첨가하는 주사 수단;
    수성버퍼(aqueous buffer)를 위한 세 번째 유지장치;
    희석장치(dilution unit);
    리포좀 현탁액을 농축하고 유기용매를 제거하기 위한 운반흐름 여과기(transflow filter)를 포함하는 농축장치(concentrating unit); 및
    유기용매 제거 후에 농축된 리포좀 현탁액을 수집하기 위한 단일 용도 층(single use bed);
    여기서, 상기 혼합장치는 수성 약물용액을 포함하고, 지질:RNA 비가 최대 12:1을 가지는 지질-약물 혼합물을 생산하기 위하여 지질용액은 적어도 5분 동안 혼합장치에 있는 약물용액으로 꾸준히 첨가되고,
    여기서, 상기 지질-약물 혼합물은 희석장치로 옮겨지고 수성버퍼를 첨가하여 희석되고; 및
    여기서, 상기 요소로 구성된 시스템은 단일 묶음 용도(single batch usage)를 위해 적응되도록 멸균되고 일회용 성분으로 구성된다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시스템은 첫 번째 유지장치에 연결된 유기지질용매를 제조하는 장치를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  3. 제1항 내지 제2항의 어느 항에 있어서, 상기 용액이 첫 번째 유지장치로 옮겨지는 동안에 상기 유기지질용매를 멸균하기 위한 여과기(filter)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항의 어느 항에 있어서, 상기 지질용액, 약물용액, 지질-약물 혼합물, 및 현탁액은 멸균인 것을 특징으로 하는 시스템.
  5. 제1항 내지 제4항의 어느 항에 있어서, 상기 농축장치는 단일용도 펌프챔버 를 갖는 격막정량펌프(diaphragm metering pump)를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  6. 제1항 내지 제5항의 어느 항에 있어서, 상기 지질은 양이온지질(cationic lipid), 헬퍼지질(helper lipid), 스테롤(sterol), 및 폴리에틸렌-지질 접합체(polyethylene(PEG)-lipid conjugate)를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  7. 제1항 내지 제6항의 어느 항에 있어서, 상기 지질은 표적 지질을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  8. 제1항 내지 제7항의 어느 항에 있어서, 상기 치료약물은 dsRNA 분자인 것을 특징으로 하는 시스템.
  9. 제1항 내지 제8항의 어느 항에 있어서, 상기 혼합물에서 지질 및 dsRNA의 농도는 2.5:1의 지질:RNA 전하 비(lipid:RNA charge ratio)로 구성되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항의 어느 항에 있어서, 상기 수-혼화성 유기용매(water-miscible organic solvent)는 에탄올인 것을 특징으로 하는 시스템.
  11. 제1항 내지 제10항의 어느 항에 있어서, 상기 첫 번째 및 두 번째 용액은 35 내지 40℃의 온도에서 혼합되는 것을 특징으로 하는 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항의 어느 항에 있어서, 상기 두 번째 유지장치는 pH 3.5 내지 pH 4.5의 수성버퍼에 치료약물을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항의 어느 항에 있어서, 상기 세 번째 유지장치는 중성 pH의 수성버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항의 어느 항에 있어서, 상기 치료약물을 피막형성(encapsulating)하는 리포좀(liposome)의 평균 입자 지름은 80 nm 내지 150 nm인 것을 특징으로 하는 시스템.
  15. 제1항 내지 제14항의 어느 항에 있어서, 상기 주사 수단은 혼합장치에서 유기용매를 수용액의 공기 물 경계면으로 운반하는 주사포트(injection port)를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  16. 제1항 내지 제14항의 어느 항에 있어서, 상기 주사 수단은 혼합장치에서 수용액에 잠겨있고 거기에 유기용매를 운반하는 주사포트를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  17. 제1항 내지 제14항의 어느 항에 있어서, 동결건조단계(lyophilization step)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  18. 제17항에 있어서, 상기 동결건조단계는 냉동단계 및 건조단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  19. 제17항 내지 제18항의 어느 항에 있어서, 상기 수성버퍼는 수크로오스(sucrose) 또는 트레할로오스(trehalose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  20. 제18항 내지 제19항의 어느 항에 있어서, 상기 냉동단계는 20℃부터 -40℃까지 1°C./분으로 지질-약물 혼합물을 냉각시키는 것을 특징으로 하는 시스템.
  21. 제18항 내지 제20항의 어느 항에 있어서, 상기 건조단계는 약 -15℃ 내지 약 -35℃에서 지질-약물 혼합물을 건조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
KR1020147014822A 2011-11-04 2012-11-02 지질-핵산입자를 멸균생성을 위한 단일 용도 시스템 Active KR102046968B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161556124P 2011-11-04 2011-11-04
US61/556,124 2011-11-04
PCT/IB2012/002916 WO2013064911A2 (en) 2011-11-04 2012-11-02 Single use system for sterilely producing lipid-nucleic acid particles

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140101748A true KR20140101748A (ko) 2014-08-20
KR102046968B1 KR102046968B1 (ko) 2019-12-02

Family

ID=47178988

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147014826A Active KR102056702B1 (ko) 2011-11-04 2012-11-02 약물 전달을 위한 지질 나노입자 생산 방법
KR1020147014822A Active KR102046968B1 (ko) 2011-11-04 2012-11-02 지질-핵산입자를 멸균생성을 위한 단일 용도 시스템

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147014826A Active KR102056702B1 (ko) 2011-11-04 2012-11-02 약물 전달을 위한 지질 나노입자 생산 방법

Country Status (22)

Country Link
US (1) US8956572B2 (ko)
EP (4) EP3485875A1 (ko)
JP (3) JP6133883B2 (ko)
KR (2) KR102056702B1 (ko)
CN (2) CN103906504B (ko)
AU (2) AU2012356239B2 (ko)
CA (2) CA2853689C (ko)
CY (1) CY1121495T1 (ko)
DK (1) DK2773326T3 (ko)
ES (1) ES2721325T3 (ko)
HR (1) HRP20190481T1 (ko)
HU (1) HUE043809T2 (ko)
LT (1) LT2773326T (ko)
PL (1) PL2773326T3 (ko)
PT (1) PT2773326T (ko)
RS (1) RS58562B1 (ko)
RU (2) RU2647476C2 (ko)
SI (1) SI2773326T1 (ko)
SM (1) SMT201900197T1 (ko)
TR (1) TR201904389T4 (ko)
TW (3) TWI615156B (ko)
WO (2) WO2013064911A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102475540B1 (ko) * 2022-04-26 2022-12-08 주식회사 무진메디 약물이 담지된 지질 나노입자 제조 방법 및 제조 장치

Families Citing this family (144)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DE19216461T1 (de) 2011-10-03 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US9320297B2 (en) 2012-03-22 2016-04-26 Lemniscate Innovations Llc Spherification/reverse spherification automated and integrated system and method
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
HRP20181855T1 (hr) 2012-06-08 2018-12-28 Nitto Denko Corporation Lipidi za formulacije namijenjene unosu terapijskog sredstva
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
AU2014215421A1 (en) 2013-02-05 2015-08-13 1Globe Health Institute Llc Biodegradable and clinically-compatible nanoparticles as drug delivery carriers
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
CA2917348A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3041934A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US10195291B2 (en) 2013-09-24 2019-02-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the manufacture of lipid nanoparticles
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
CN103599549A (zh) * 2013-11-22 2014-02-26 大连民族学院 一种siRNA/抗癌药物联合转运复合载体及其制备方法和应用
US20170143848A1 (en) * 2014-03-24 2017-05-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for the treatment of ocular diseases
PL4023249T3 (pl) 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
BR112016030852A2 (pt) * 2014-07-02 2018-01-16 Shire Human Genetic Therapies encapsulação de rna mensageiro
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
CN106794141B (zh) * 2014-07-16 2021-05-28 诺华股份有限公司 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
WO2016045732A1 (en) * 2014-09-25 2016-03-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stable formulations of lipids and liposomes
BR112017014090A2 (pt) * 2014-12-29 2018-03-06 Bonac Corporation composição, e, métodos para produção de uma composição e estabilização de uma molécula de ácido nucleico.
WO2016138175A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The University Of British Columbia Continuous flow microfluidic system
EP3288671A4 (en) 2015-04-28 2019-01-16 The University Of British Columbia DISPOSABLE MICROFLUIDIC CARTRIDGE
EP4660315A3 (en) 2015-05-29 2026-03-18 CureVac Manufacturing GmbH A method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration
HUE053990T2 (hu) * 2015-07-22 2021-08-30 Nitto Denko Corp Nanorészecske liofilizált formák készítményei és eljárások
US11564893B2 (en) 2015-08-17 2023-01-31 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
US9938572B1 (en) * 2015-09-08 2018-04-10 Raindance Technologies, Inc. System and method for forming an emulsion
EP3350333B2 (en) 2015-09-17 2025-08-06 ModernaTX, Inc. Polynucleotides containing a stabilizing tail region
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
PL3386484T3 (pl) 2015-12-10 2022-07-25 Modernatx, Inc. Kompozycje i sposoby dostarczania środków terapeutycznych
LT3394030T (lt) 2015-12-22 2022-04-11 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
PL3394093T3 (pl) 2015-12-23 2022-05-16 Modernatx, Inc. Metody stosowania polinukleotydów kodujących ligand ox40
EP3400097B1 (en) 2016-01-06 2021-01-27 The University Of British Columbia Bifurcating mixers and methods of their use and manufacture
MA43587A (fr) 2016-01-10 2018-11-14 Modernatx Inc Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4
WO2017156420A1 (en) 2016-03-10 2017-09-14 Lonza Ltd Customizable facility
US10689873B2 (en) 2016-03-10 2020-06-23 Lonza Ltd Customizable facility
WO2017223135A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles
CN109563511A (zh) * 2016-06-30 2019-04-02 阿布特斯生物制药公司 用于递送信使rna的组合物和方法
SG11201900528PA (en) * 2016-08-02 2019-02-27 Lonza Ag Customizable facility
WO2018035387A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
EP4485466A3 (en) 2016-08-17 2025-04-02 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US11052158B2 (en) * 2016-08-18 2021-07-06 Troy Bremer Delivery of urea to cells of the macula and retina using liposome constructs
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
EP3315125A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-02 Silence Therapeutics (London) Ltd Lipid nanoparticle formulation
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
WO2018170322A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
EP4186888B1 (en) 2017-03-15 2025-11-26 ModernaTX, Inc. Compound and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2018191750A2 (en) 2017-04-14 2018-10-18 The Broad Institute Inc. Novel delivery of large payloads
WO2018232120A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
WO2019010560A1 (en) * 2017-07-10 2019-01-17 Immmunovaccine Technologies Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS, METHODS OF PREPARATION USING LIPID VESICLE PARTICLES OF A DEFINED SIZE, AND USES THEREOF
WO2019027055A1 (ja) 2017-08-04 2019-02-07 協和発酵キリン株式会社 核酸含有脂質ナノ粒子
JP2019043216A (ja) 2017-08-30 2019-03-22 いすゞ自動車株式会社 ステアリング装置
EP3675817A1 (en) 2017-08-31 2020-07-08 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
RS67724B1 (sr) 2017-10-20 2026-03-31 BioNTech SE Priprema i skladištenje lipozomskih rnk formulacija koje su pogodne za terapiju
WO2019135816A2 (en) 2017-10-23 2019-07-11 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifiers
US11638695B2 (en) 2017-11-01 2023-05-02 Osaka University Development of method and apparatus for producing lipid particles having desired particle diameter
AU2017438994A1 (en) * 2017-11-09 2020-05-28 Immunovaccine Technologies Inc. Pharmaceutical compositions, methods for preparation comprising sizing of lipid vesicle particles, and uses thereof
EP3710039A4 (en) 2017-11-13 2021-08-04 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF CANCER BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH
US10968257B2 (en) 2018-04-03 2021-04-06 The Broad Institute, Inc. Target recognition motifs and uses thereof
WO2019204451A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Carnegie Mellon University Enhanced lipid nanoparticle drug delivery using a negatively charged polymer
KR20210091120A (ko) * 2018-08-29 2021-07-21 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 Mrna-로딩된 지질 나노입자를 제조하는 개선된 공정
CA3113025A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Peg lipids and uses thereof
WO2020061295A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
WO2020061367A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2020061457A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
IL281615B2 (en) * 2018-09-21 2026-01-01 Acuitas Therapeutics Inc Systems and methods for producing lipid nanoparticles and liposomes
HRP20240586T1 (hr) 2018-10-09 2024-07-19 The University Of British Columbia Sastavi i sustavi koji sadrže transfekcijske sposobne vezikle bez organskih otapala i deterdženta i s njim povezanim postupcima
CA3116576A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
CA3112837A1 (en) * 2018-10-19 2020-04-23 Translate Bio, Inc. Pumpless encapsulation of messenger rna
CN118697900A (zh) * 2019-01-31 2024-09-27 摩登纳特斯有限公司 制备脂质纳米颗粒的方法
US12215382B2 (en) 2019-03-01 2025-02-04 The General Hospital Corporation Liver protective MARC variants and uses thereof
US12534714B2 (en) 2019-03-18 2026-01-27 The Broad Institute, Inc. Type VII CRISPR proteins and systems
SG11202110036RA (en) * 2019-03-19 2021-10-28 Arcturus Therapeutics Inc Method of making lipid-encapsulated rna nanoparticles
CN118203546A (zh) 2019-05-07 2024-06-18 米尼翁大学 生产脂质体的方法
WO2020236972A2 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
CN114901253A (zh) 2019-08-14 2022-08-12 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的改进的脂质纳米颗粒
WO2021046265A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions comprising closed-ended dna and cleavable lipids and methods of use thereof
JP7271374B2 (ja) * 2019-09-10 2023-05-11 株式会社東芝 分析方法、分析基体、分析キット及び分析装置。
CA3155015A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Carbonate containing lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
AU2020350759A1 (en) 2019-09-19 2022-03-31 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
US12297426B2 (en) 2019-10-01 2025-05-13 The Broad Institute, Inc. DNA damage response signature guided rational design of CRISPR-based systems and therapies
JP2023502576A (ja) 2019-11-22 2023-01-25 ジェネレーション バイオ カンパニー イオン化可能な脂質およびそれらのナノ粒子組成物
KR102409145B1 (ko) 2020-03-23 2022-06-15 프레스티지바이오로직스 주식회사 항체 의약품 제조 공정을 위한 버퍼 조제 및 이송 시스템
CN111467321A (zh) * 2020-03-26 2020-07-31 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种mRNA核酸类药物胞内递送系统、制备方法和应用
JP7746280B2 (ja) 2020-03-27 2025-09-30 ジェネレーション バイオ カンパニー 新規脂質及びそれらのナノ粒子組成物
BR112022026233A2 (pt) 2020-06-24 2023-01-17 Bristol Myers Squibb Co Processo para sintetizar lipídios catiônicos
ES3054438T3 (en) 2020-07-16 2026-02-03 Acuitas Therapeutics Inc Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
EP4196128A4 (en) * 2020-08-14 2024-06-12 Arcturus Therapeutics, Inc. METHOD FOR FREEZE DILIZATION OF LIPID NANOPARTICLES
IL301253A (en) 2020-09-13 2023-05-01 Arcturus Therapeutics Inc As a mass of large RNA lipid nanoparticles
EP4228658A4 (en) * 2020-10-14 2025-02-19 George Mason Research Foundation, Inc. IONIZABLE LIPIDS AND METHODS FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
CN112843019A (zh) * 2021-01-27 2021-05-28 江苏普瑞康生物医药科技有限公司 一种核酸脂质纳米粒组合物，包含其的药物制剂，及其制备方法和应用
JP2024509743A (ja) * 2021-02-16 2024-03-05 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのための規定サイズのプラスミドＤＮＡ／脂質粒子の調製方法
WO2022175366A1 (en) 2021-02-17 2022-08-25 Secoya Technologies Method for producing lipid nanoparticles and lipid nanoparticles resulting therefrom
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
US20240165044A1 (en) * 2021-04-22 2024-05-23 Inventage Lab Inc. Lipid nanoparticle preparation method and preparation apparatus therefor
KR20240008872A (ko) * 2021-05-06 2024-01-19 아크투루스 쎄라퓨틱스, 인크. Rna 전달을 위한 이온화 가능한 양이온성 지질
AU2022291742A1 (en) 2021-06-14 2023-12-21 Generation Bio Co. Cationic lipids and compositions thereof
EP4412591A1 (en) * 2021-10-06 2024-08-14 leon-nanodrugs GmbH Method for preparing lipid nanoparticles
TW202334080A (zh) 2021-11-08 2023-09-01 美商歐納醫療公司 用於遞送環狀聚核苷酸之脂質奈米粒子組合物
CN116549626A (zh) * 2022-01-27 2023-08-08 深圳瑞吉生物科技有限公司 一种载核酸脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法与应用
US20250327041A1 (en) 2022-02-24 2025-10-23 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
IL316038A (en) 2022-04-04 2024-11-01 Univ California Preparations and methods for genetic complementation
EP4536197A1 (en) 2022-06-07 2025-04-16 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
WO2024102730A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024119103A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids and lipid-anchored polymers
WO2024119074A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticle compositions for cell targeting
AU2023406303A1 (en) 2022-12-01 2025-05-29 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids, ionizable lipids, sterols, lipid anchored polymers and helper lipids, their uses
EP4626400A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Generation Bio Co. Novel polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
AU2023398825A1 (en) 2022-12-15 2025-06-26 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2024136254A1 (ko) * 2022-12-20 2024-06-27 (주)인벤티지랩 저농도 이온화 지질을 포함하는 지질나노입자 및 이의 제조 방법
WO2024205657A2 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
EP4705481A2 (en) 2023-05-05 2026-03-11 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2025049690A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Orna Therapeutics, Inc. Circular polyethylene glycol lipids
EP4520345A1 (en) 2023-09-06 2025-03-12 Myneo Nv Product
WO2025052180A2 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
WO2025051994A1 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Coave Therapeutics Ionizable lipid nanoparticles
WO2025072383A1 (en) 2023-09-25 2025-04-03 The Broad Institute, Inc. Viral open reading frames, uses thereof, and methods of detecting the same
WO2025097055A2 (en) 2023-11-02 2025-05-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of t cells in immunotherapy
WO2025101501A1 (en) 2023-11-07 2025-05-15 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2025114520A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Coave Therapeutics Ionizable lipid nanoparticles
EP4570361A1 (en) * 2023-12-11 2025-06-18 Sartorius Stedim Biotech GmbH Device assembly and method for a production-scale tangential flow filtration
WO2025129158A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineered arc delivery vesicles and uses thereof
WO2025166238A1 (en) 2024-01-31 2025-08-07 Orna Therapeutics, Inc. Fast-shedding polyethylene glycol lipids
WO2025250808A1 (en) 2024-05-29 2025-12-04 The Brigham And Women’S Hospital, Inc. Anti-crispr delivery compositions and methods
WO2026003582A2 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
DE102024002527A1 (de) * 2024-08-02 2026-02-05 Rommelag Engineering Gmbh Vorrichtung
WO2026064512A1 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Generation Bio Co. Polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7901708B2 (en) * 2002-06-28 2011-03-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Liposomal apparatus and manufacturing methods

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988001864A1 (en) * 1986-09-18 1988-03-24 Liposome Technology, Inc. High-concentration liposome processing method
US4781871A (en) * 1986-09-18 1988-11-01 Liposome Technology, Inc. High-concentration liposome processing method
US4895452A (en) 1988-03-03 1990-01-23 Micro-Pak, Inc. Method and apparatus for producing lipid vesicles
CA2163860A1 (en) * 1993-06-30 1995-01-12 Chung C. Hsu Method for preparing liposomes
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5976567A (en) 1995-06-07 1999-11-02 Inex Pharmaceuticals Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US6395302B1 (en) 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
AU733310C (en) * 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
WO2000029103A1 (en) 1998-11-13 2000-05-25 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production
US6855296B1 (en) 1998-11-13 2005-02-15 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production
BR0012624B1 (pt) 1999-07-15 2011-08-09 métodos para a preparação de agentes terapêuticos envolvidos por lipìdeos.
US7094423B1 (en) 1999-07-15 2006-08-22 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for preparation of lipid-encapsulated therapeutic agents
EP1203614A1 (de) 2000-11-03 2002-05-08 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Lipidvesikeln
DE60132094T3 (de) * 2001-10-26 2012-02-02 Octoplus Polyactive Sciences B.V. Verfahren zur Herstellung von gereinigten Partikeln
US7223887B2 (en) 2001-12-18 2007-05-29 The University Of British Columbia Multivalent cationic lipids and methods of using same in the production of lipid particles
AU2003205048B2 (en) 2002-01-09 2009-02-26 Transave, Inc. Efficient liposomal encapsulation
US6712963B2 (en) 2002-06-14 2004-03-30 Scilog, Llc Single-use manifold for automated, aseptic transfer of solutions in bioprocessing applications
FR2856940B1 (fr) * 2003-07-04 2007-02-09 Stedim Sa Systeme clos a usage unique de melange, de stockage et d'homogeneisation de liquides en conditions propres ou steriles
WO2005090403A2 (en) * 2004-03-12 2005-09-29 Biovest International, Inc. Method and apparatus for antibody purification
DK1773976T4 (da) 2004-06-04 2020-02-10 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Engangsbioreaktorsystemer og -fremgangsmåder
US7410587B2 (en) 2004-08-03 2008-08-12 Scilog, Inc. Liquid handling for filtration and preparative chromatography
US7404969B2 (en) * 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
CN101267805A (zh) 2005-07-27 2008-09-17 普洛体维生物治疗公司 制造脂质体的系统和方法
CN101346393B (zh) * 2005-11-02 2015-07-22 普洛体维生物治疗公司 修饰的siRNA分子及其应用
JPWO2007117024A1 (ja) 2006-04-11 2009-08-20 株式会社ウイングターフ ガス処理方法
EP1920765A1 (en) 2006-11-07 2008-05-14 Medigene AG Liposome preparation by single-pass process
WO2009086558A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
JP5322476B2 (ja) 2008-03-31 2013-10-23 テルモ株式会社 リポソームの製造装置およびリポソームの製造方法
US8231787B2 (en) 2008-05-06 2012-07-31 Spf Innovations, Llc Tangential flow filtration system
WO2010021865A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
JP2012505913A (ja) 2008-10-16 2012-03-08 マリーナ バイオテック，インコーポレイテッド 遺伝子発現を抑制する治療におけるリポソームによる効率的な送達のプロセスおよび組成物
TW201021853A (en) * 2008-11-17 2010-06-16 Enzon Pharmaceuticals Inc Releasable cationic lipids for nucleic acids delivery systems
WO2010080724A1 (en) * 2009-01-12 2010-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
ES2443147T3 (es) * 2009-01-20 2014-02-18 Med Coat Ab Composición de recubrimiento y su empleo
FR2943560B1 (fr) * 2009-03-24 2011-05-27 Jean Pascal Zambaux Bioreacteur jetable et systeme d'agitation a usage unique
CN107028886A (zh) * 2009-11-04 2017-08-11 不列颠哥伦比亚大学 含有核酸的脂质粒子及相关的方法
EP3318248B1 (en) * 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
EP2525781A1 (en) * 2010-01-22 2012-11-28 Schering Corporation Novel cationic lipids for oligonucleotide delivery
US20130037977A1 (en) 2010-04-08 2013-02-14 Paul A. Burke Preparation of Lipid Nanoparticles
EP2718261B1 (en) * 2011-06-08 2016-02-24 Nitto Denko Corporation Compounds for targeting drug delivery and enhancing sirna activity

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7901708B2 (en) * 2002-06-28 2011-03-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Liposomal apparatus and manufacturing methods

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102475540B1 (ko) * 2022-04-26 2022-12-08 주식회사 무진메디 약물이 담지된 지질 나노입자 제조 방법 및 제조 장치

Also Published As

Publication number Publication date
CA2853685C (en) 2019-09-03
SMT201900197T1 (it) 2019-05-10
WO2013064911A3 (en) 2013-10-24
AU2012356239A1 (en) 2014-05-29
TWI626952B (zh) 2018-06-21
TWI618548B (zh) 2018-03-21
JP6149041B2 (ja) 2017-06-14
SI2773326T1 (sl) 2019-04-30
CA2853685A1 (en) 2013-05-10
RU2647476C2 (ru) 2018-03-15
EP2773326B1 (en) 2019-02-20
KR20140097276A (ko) 2014-08-06
WO2013064911A2 (en) 2013-05-10
EP3485875A1 (en) 2019-05-22
EP2773328A2 (en) 2014-09-10
KR102046968B1 (ko) 2019-12-02
CN103906504A (zh) 2014-07-02
CN103906504B (zh) 2017-11-17
RS58562B1 (sr) 2019-05-31
RU2642640C2 (ru) 2018-01-25
CN103906503A (zh) 2014-07-02
TR201904389T4 (tr) 2019-04-22
HRP20190481T1 (hr) 2019-05-03
EP3673898A1 (en) 2020-07-01
JP2014534232A (ja) 2014-12-18
CY1121495T1 (el) 2020-05-29
EP2773326A2 (en) 2014-09-10
CA2853689A1 (en) 2013-06-27
TW201731491A (zh) 2017-09-16
ES2721325T3 (es) 2019-07-31
AU2012330819B2 (en) 2017-08-31
TW201325634A (zh) 2013-07-01
WO2013093648A2 (en) 2013-06-27
TWI615156B (zh) 2018-02-21
JP2017165748A (ja) 2017-09-21
US20130164400A1 (en) 2013-06-27
KR102056702B1 (ko) 2019-12-17
RU2014122432A (ru) 2015-12-10
RU2014122433A (ru) 2015-12-10
US8956572B2 (en) 2015-02-17
JP6133883B2 (ja) 2017-05-24
JP6442551B2 (ja) 2018-12-19
AU2012356239B2 (en) 2016-09-22
TW201323020A (zh) 2013-06-16
DK2773326T3 (en) 2019-04-15
PL2773326T3 (pl) 2019-06-28
WO2013093648A3 (en) 2013-10-24
PT2773326T (pt) 2019-04-23
AU2012330819A1 (en) 2014-05-15
CA2853689C (en) 2020-06-30
HUE043809T2 (hu) 2019-09-30
CN103906503B (zh) 2016-12-14
LT2773326T (lt) 2019-04-25
JP2015502345A (ja) 2015-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102046968B1 (ko) 지질-핵산입자를 멸균생성을 위한 단일 용도 시스템
US10155945B2 (en) Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
EP2675918B1 (en) Compositions and methods for delivering nucleic acid to a cell
US20140056970A1 (en) Efficient method for loading amphoteric liposomes with nucleic acid active substances

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20140530

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20170915

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20190311

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20190902

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20191114

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20191115

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20221019

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20221019

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20231019

Start annual number: 5

End annual number: 5