RS58562B1 - Postupak za sterilnu proizvodnju čestica lipid-nukleinska kiselina - Google Patents

Postupak za sterilnu proizvodnju čestica lipid-nukleinska kiselina

Info

Publication number
RS58562B1
RS58562B1 RS20190426A RSP20190426A RS58562B1 RS 58562 B1 RS58562 B1 RS 58562B1 RS 20190426 A RS20190426 A RS 20190426A RS P20190426 A RSP20190426 A RS P20190426A RS 58562 B1 RS58562 B1 RS 58562B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
lipid
solution
sirna
ethanol
nucleic acid
Prior art date
Application number
RS20190426A
Other languages
English (en)
Inventor
Victor Knopov
Richard P Witte
Priya Karmali
Robin Lee
David Webb
Original Assignee
Nitto Denko Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nitto Denko Corp filed Critical Nitto Denko Corp
Publication of RS58562B1 publication Critical patent/RS58562B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4833—Encapsulating processes; Filling of capsules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1277—Preparation processes; Proliposomes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
    • B01J13/12—Making microcapsules or microballoons by phase separation removing solvent from the wall-forming material solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Ovaj opis usmeren je na postupak formiranja nanočestica lipid-nukleinska kiselina , jednostavno i reproduktibilno pod aseptičnim uslovima, koji obuhvata upotrebu komponenti za jednokratnu upotrebu.
POZADINA
[0002] Lipidi su potencijalno upotrebljivi kao nosači za isporuku terapeutskih molekula, naročito za isporuku nukleinskih kiselina . Lipidi formiraju lipozome koji mogu da inkapsuliraju, kempleksuju, ili uhvate molekule nukleinske kiseline čime se proširuje isporuka ove klase terapeutskih molekula ciljanim ćelijama posle davanja, npr., intravenozno u krvotok. Njihova upotrebljivost u farmaceutskim kompozicijama je ograničena dostupnim postupcima za reproduktibilnu proizvodnju nanočestica lipidnukleinska kiselina . Osmišljeni su razni postupci za proizvodnju takvih nanočestica.
[0003] Jedan postupak za proizvodnju nanočestica koje se sastoje jedino od lipida (nosači), jednostavno i reproduktibilno, bez sonifikacije, koji koristi etanol injekt, opisan je od Batzri et al., 1973, Biophys Biochem Acta 298:1015-19, i Kremer et al., 1977, Biochemistry 16:3932-35, pri čemu se lipidi rastvoreni u etanolu injektiraju u vodeni rastvor da spontano formiraju lipozome.
[0004] Van Buitenen et al. US 7468151 opisuje sistem zatvorenog toka za sterilizovanje mikro čestica, ukjljučujući lipozome. Taj zatvoreni tok ukjljučuje komoru za mešanje povezanu sa jedinicom za protočnu filtracija (TFF). Ta TFF jedinica prečišćava tečnu disperziju mikro čestica pod aseptičnim uslovima. Ta tečnost pumpa se aseptično iz komore za mešanje kroz TFF. Materijal zadržan u TFF (ostatak) se recikluje kroz komoru za mešanje i TFF jedinicu dok se ne prečisti. Postupak prečišćavanje se izvodi aseptično u jednom uređaju bez uklanjanje mikro čestica u TFF ostatku.
[0005] Drugi opisuju postupak proizvodnje čestica nukleinska kiselina -lipozom korišćenjem specifičnih postupaka za kombinovanje lipida i nukleinskih kiselina. Hirota et al., 1999, BioTehnika 27:286-89, uči da se lipozomi obloženi molekulima nukleinske kiseline spontano formiraju kada se katjonski lipidi u etanolu injektiraju u vodeni rastvor nukleinske kiseline. Maurer et al., 2001, Biophysical J, 80:2310-26 i Maurer et al. US 7094423 opisuju postupku inkapsulacije molekula nukleinske kiseline u lipozomu. Ovaj postupak uključuje upotrebu prethodno formiranog lipozoma koji obuhvata katjonski lipid. Taj lipozom se destabilizuje dodavanjem etanola u vodeni rastvor. Molekuli nukleinske kiseline su dodati u destabilizovan lipid. Posle uklanjanja etanola, taj lipozom inkapsuliše nukleinsku kiselinu dok se reformiše. Alternativni postupak za inkapsulaciju nukleinske kiseline u lipozom opisan je od Semple et al., 2001, Biophys Biochem Acta 1510:152-66 i Semple et al. US 6858225. Ovaj postupak povećava efikasnost inkapsulacije korišćenjem jonizabilnog katjonskog lipida da formira lipozome. Etanolski rastvor lipida se kombinuje sa nukleinskim kiselina ma u vodenom rastvoru puferovanom na nisku pH. Etanol se tada uklanja dok se podiže pH do neutralne vrednosti. Oba postupka zahtevaju dalju preradu rezultujućih lipozoma, jer agregacija tokom rekonstitucije proizvodi široku varijaciju po veličini.
[0006] MacLachlan et al. US 7901708 opisuju postupku i uređaju za proizvodnju uniformno dimenzionisanih lipozomima koji inkapsuliraju nukleinsku kiselinu. Protok RNK u vodenom rastvoru pufera meša se sa protokom katjonskog lipida u etanolu u približno jednakim protocima u T konektotru, u kojem se nosači lipida trenutno formiraju u visokoj koncentraciji etanola (45%). Rastvarač i koncentracije rastvora održavaju se konstantnimt tokom čitavog postupka mešanja. Statičke mešalice nisu involvirane čime su ti lipozomi razblaženi. Stabilni lipozomi nukleinske kiseline sterilišu se na kraju ovog postupka, odmah pre sterilne faze ulivanja.
[0007] WO 2010/045512 A2 opisuje postupke i kompozicije za lipozomsku isporuku terapeutika pripremljene kontaktiranjem vodenog rastvora aktivnog agensa sa rastvorom of lipozom-formirajućim komponentama koje sadrže jedno ili više jedinjenja DILA2 amino kiselina ili lipide u organskom rastvaraču radi formiranja udarnog protoka. Koristi se protokol koji ukjljučuje protoke, pH, i period inkubacije radi kontrole formiranja lipozomske komponente za terapeutske primene. Udarni protok može biti sakupljen i inkubisan radi pripreme lipozomske formulacija koja inkapsuliše aktivni agens. Ta kompozicija može biti brzo ohlađena sa puferom i filtrirana tangencijalnim tokom i dijafiltracijom i ostalim sredstvima za finiširanje kao farmaceutske kompozicije. Obezbeđeno je sredstvo za isporuku tovara leka. Kompozicije može da uključuje lipozom koj sadrži jednu ili više nosećih čestica, gde svaka noseća čestica ima aktivni agens i peptid, pri čemu je odnos mase peptida plus masa tog lipozoma u masi aktivnog agensa manji od oko 15.
[0008] Gore opisani postupci zahtevaju obiman rad kako bi se minimalizovala bakterijska kontaminacija tokom postupka proizvodnje lipozoma, ukjljučujući zagrevanje u autoklavu, pranje, i zadovoljavanje regulatornih opterećenja. Ostaje neostvarena potreba za proizvodnim postupkom za inkapsulaciju nukleinske kiseline bez potrebe za obimnim fazama mehaničke prerade radi pripreme prethodno formiranih lipozomi i bez potrebe za fazama prerade radi redukovanja čestica lipid-nukleinska kiselina u monodisperznu populaciju.
KRATAK SADRŽAJ
[0009] Ovaj pronalazak odnosi se na postupak za sterilno pripremanje nanočestice lipid-nukleinska kiselina pod aseptičnim uslovima kako je specificirano u priloženom patentnom zahtevu 1. Sistem koji se može primeniti u postupku ovog pronalaska može dalje da obuhvata jedinicu za pripremanje organskog lipidnog rastvora, povezana sa prvom rezervoarskom jedinicom. Sistem koji se može primeniti u postupku ovog pronalaska može dalje da obuhvata filter za sterilizovanje organskog lipidnog rastvora dok se pomenuti rastvor transferiše u prvu rezervoarsku jedinicu. Sistem koji se može primeniti u postupku ovog pronalaska obuhvata lipidni rastvor, rastvor leka, lipid-lek mešavina, i suspenziju koji su sterilni, kako je specificirano u priloženom patentnom zahtevu 1. Jedinica za koncentrovanje može da obuhvata pumpa za doziranje dijafragme sa komorom pupme za jednokratnu upotrebu. Lipidi mogu da obuhvataju katjonski lipid, neutralni lipid, sterol, i polietilen (PEG)-lipidni konjugat, i može dalje da obuhvata ciljajući lipid, kako je specificirano u priloženom patentnom zahtevu 2. U primeru izvođenja priloženog patentnog zahteva 3, terapeutski lek je dsRNK molekul. Koncentracija lipida i dsRNK u mešavini može da se sastoji od lipid:RNK odnosa naelektrisanja od 2.5. Sa vodom mešljiv organski rastvarač je etanol. Prvi i drugi rastvori mogu se kombinovati pri temperaturi od 35 do 40° C.
Druga rezervoarska jedinica mogu da sadrže terapeutski lek u vodenom rastvoru pufera na pH 3.5 do pH 4.5. Treća rezervoarska jedinica može da sadrži vodeni rastvori pufera pri neutralnoj pH. Srednji prečnik čestice lipozoma koji inkapsulira terapeutski lek može biti 80 nm do 150 nm. Injekciona sredstva mogu da obuhvataju injekcioni port koji dostavlja organski rastvor u intefejsu vazdušne vode vodenog rastvora u jedinici za mešanje, ili alternativno injekcioni port koji je potopljen u vodeni rastvor u jedinici za mešanje i u nju dostavlja taj organski rastvor. Postupak može dalje da obuhvata fazu liofilizacije. Faza liofilizacije može da obuhvata fazu zamrzavanja i fazu sušenja. Vodeni pufer može da obuhvata saharozu ili trehalozu. Faza zamrzavanja može da ohladi lipid-lek mešavinu na 1° C./minuta od 20 do -40° C. Faza sušenja može da obuhvata fazu sušenja lipid-lek mešavine na oko -15 do oko -35° C.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0010] Fig.1 prikazuje sistem za jednokratnu upotrebu pogodan za upotrebu u postupku ovog pronalaska.
DETALJAN OPIS ILUSTRATIVNIH PRIMERA IZVOĐENJA
[0011] Ovde opisani pronalazak odnosi se na postupak za sterilno pripremanje nanočestica lipidnukleinska kiselina pod aseptičnim uslovima kako je specificirano u priloženom patentnom zahtevu 1. Postupak se naročito može prilagoditi na proizvodnju čestica na velikoj skali, koje se sastoje lipozominkapsuliranih terapeutskih molekula. Postupak obezbeđuje neočekivan i iznenađujuć rezultat u tome što su proizvedene čestice monodisperzne (tj. indeks polidisperznosti (PDI) manji od 0.2, kako je ovde definisano), i imaju usku i uniformnu distribuciju veličine između 50 i 150 nm. Čestice proizvedene postupkom ovog pronalaska ne zahtevaju mehaničku preradu, kao što je istiskivanje, da bi se dobila monodisperzna populacija.
[0012] Postupak ovog pronalaska ima prednost u odnosu na prethodne postupke u lakoći kojom se može prebaciti na izvodnju velikih zapremina i što je robustan u širokom rasponu temperatura, rastvora, pH, i vremenima prerade.
[0013] Postupak ovog pronalaska ima prednost u odnosu na prethodne postupke u reproduktibilnoj proizvodnji uniformne populacije čestica bez dodatnih faza potrebnih za proizvodnju prethodno formiranih nosača.
[0014] Postupak ovog pronalaska ima prednost u odnosu na prethodne postupke u reproduktibilnoj proizvodnji uniformne populacije nanočestica bez dodatnih faza potrebnih za mehaničku obradu čestica proizvedenih posle mešanja lipida i negativno naelektrisanih polimera nukleinske kiseline. Ove dodatne faze uključuju, na primer sonifikaciju, homogenizaciju, ili istiskivanje, radi smanjivanja njihove veličine i postizanja uniformnosti do terapeutski prihvatljiv opseg.
[0015] Postupak ovog pronalaska ima prednost u postizanju efikasnosti inkapsulacije nukleinskih kiselina jednake ili bolje od prethodnih postupaka bez dodatnih faza prerade za proizvodnju nanočestica.
[0016] Ostale prednosti postupka ovog pronalaska postaće jasne iz detaljnog opisa koji sledi koji se odnosi na lipidne komponente i uslove.
[0017] Sledeće skraćenice korišćene su u ovom opisu.
VF: ispusni filter
TG: termometar
SUB: posuda za jednokratnu upotrebu
TFF: protočni filter
PP: peristaltička pumpa
PG: manometar
Graduisani merač: sredstvo za merenje masa
[0018] Fig.1 prikazuje sistem za jednokratnu upotrebu koji obuhvata sledeć elemente, koji se mogu primeniti u jednom primeru izvođenja postupka ovog pronalaska.
[0019] Zaliha lipida: ova posuda sadrži odabrane lipide u organskom, sa vodom mešljivom rastvaraču, koji je etanol. Koncentracija lipida može biti podešena za povećavanje propusnosti. Posuda se sastoji od zamenljive kese sa TG i mešača. Kesa ima otvore za dodavanje lipida u 96-100% etanol, VF, i izlaznu cev, koja se kontroliše ventilom. Kesa je smeštena u kontejner koji se može zagrevati,ponovo koristiti, koji je električno uzemljen. Kesa ima sredstva za dodavanje dodatnog etanola radi razblaživanja lipidnog rastvora do radne koncentracije.
[0020] PP1: peristaltička pumpa 1. Ona pumpa zalihu lipida iz posude zalihe lipida kroz 0.45/0.22 µm Filter u posudu zalihe filtriranih lipida.
[0021] Zaliha filtriranih lipida: ova posuda sadrži lipide u radnoj koncentraciji. Posuda je zamenljiva kesa sa mešačem i TG. Ona ima otvore za ulaz zaliha lipida, VF i izlaznu cev, koja se kontroliše ventilom. Kesa je smeštena u graduisani kontejner koji se može zagrevati, ponovo koristiti, i koji je električno uzemljen.
[0022] Zaliha sRNK: ova posuda sadrži odabrani lek u vodenom rastvoru pufera. siRNK je poželjan lek, a citratni pufer je poželjan pufer. Koncentracija može biti podešena za povećavanje propusnosti. Posuda je zamenljiva kesa sa mešačem. Kesa ima otvore za dodavanje rastvora i rastvarača, i izlaznu cev, koja se kontroliše ventilom. Kesa ima sredstva za dodavanje dodatnog pufera radi razblaživanja RNK rastvora do radne koncentracije.
[0023] PP2: peristaltička pumpa 2. Ona pumpa zalihu siRNK iz posude zalihe siRNK kroz 0.45/0.22 µm Filter u Posudu zalihe filtrirane siRNK.
[0024] Zaliha filtrirane siRNK: ova posuda sadrži siRNK u radnoj koncentraciji. Ovaj element je graduisan. Posuda je zamenljiva kesa smeštena u kontejner za višekratnu upotrebu. On ima otvor(e) za zalihu siRNK i izlaznu cev, koja se kontroliše ventilom. Kesa je smeštena u graduisani kontejner za višekratnu upotrebu.
[0025] PP3: peristaltička pumpa 3 za transferovanje zaliha filtriranih lipida u posudu koja je obeležena ka Lipozomska siRNK u 35% Etanol. Ona je opremljena sa PG (PG1).
[0026] PP4: peristaltička pumpa 4 za transferovanje filtrirane zalihe siRNK u Lipozomsku siRNK u 35% etanolsku posudu. Takođe je opremljena sa PG (PG2).
[0027] Lipozomska siRNK u 35% Etanolu: ova posuda sadrži mešavinu lipozoma i leka u 35% etanolu. Ovaj element sadrži VF i TG. Otvori za filtrirani lipid i zalihu siRNK odvojeni su od izlazne cevi, koja se kontroliše ventilom. Poželjna jedinica je zamenljiva kesa smeštena u kontejner za višekratnu upotrebu.
[0028] Fosfatni pufer: ova posuda sadrži pufer (poželjno fosfatni pufer), mešač, i graduisani merač. Ona je velika posuda sa poklopcem za otvaranje, i izlaznom cevi sa ventilom.
[0029] Filtrirani Fosfatni pufer: ova posuda je povezana sa posudom fosfatnog pufera cevovodom, 0.45/0.22 µm Filterom, i peristaltičkom pumpom. Ona ima mešač i izlaznu cev sa ventilom koja vodi u cevovod kroz PP 5 u posudu lipozomske siRNK u 10% etanolu i TFF SUB posudu. Posuda je kontejner za višekratnu upotrebu obložen oblogom za jednokratnu upotrebu.
[0030] PP 5: ona pumpa filtriran fosfatni pufer iz posude filtriranog fosfatnog pufera u posudu lipozomske siRNK u 35% etanolu i u TFF SUB posudu. PP 5 je spojena sa PG (PG4).
[0031] Lipozomska siRNK u 10% Etanolu: ova posuda sadrži mešavinu lipozoma i leka u 10% etanolu posle razblaživanja lipozoma i leka u 35% etanolu pomoću pufera u posudi filtriranog fosfatnog pufera. Posuda je kontejner za višekratnu upotrebu obložen oblogom za jednokratnu upotrebu , sa ulazom za lipozomski siRNK rastvor, VF, graduisanim meračem, i izlaznim otvorom sa ventilom koji vodi u TFF SUB posudu.
[0032] PP 6: ona pumpa lipozome i lek u 10% etanol iz posude lipozomske siRNK u 10% etanolu kroz 0.45/0.22 µm Filter u TFF SUB posudu.
[0033] TFF SUB: ova posuda sadrži ulazne otvore za lipozome i lek u 10% etanolu iz posude lipozomske siRNK u 10% etanolu, za pufer iz posude filtriranog fosfatnog pufera, i za ostatak iz TFF jedinice, svaka sa ventilom. Ona takođe sadrži VF i izlazni otvor sa svojim ventilom.
[0034] Merna pumpa sa pristupačnom glavom pupme: ova pumpa pod visokim pritiskom spojena je sa dve PG (PG 3 i PG 4). Ona transferuje lipozom i lek iz TFF SUB u TFF jedinicu.
[0035] TFF: ovaj jedinica identifikovana je kao par pravougaonika sa dijagonalnom linijom. Tokom rada taj rastvor lipozom/lek u etanolu prolazi kroz TFF jedinicu radi uklanjanja etanola. Etanol se uklanja tako što TFF jedinica izlazi iz sistema. Više od jedne TFF mogu paralelno raditi, pri čemu su povezane ventilima. Preostali rastvor (ostatak) izlazi iz TFF, recirkuliše u TFF SUB, i reciklira kroz TFF jedinicu po potrebi radi uklanjanja svog etanola. Manometar (PG 4) prati pritisak ostatka. Gas azota u rezevoaru N2koristi se da poveća mernu pumpu, po potrebi radi stvaranja povratnog pritiska, i eventualno olakšao transfer TFF ostatka u prvu 10L SUB posudu.
[0036] 10L SUB: ona je posuda za jednokratnu upotrebu opremljena graduisanim meračem. Opciono, SUS uključuje seriju od tri 10L SUB posude. TFF ostatak se pumpa kroz 0.45/0.22 µm Filter radi smanjivanja bioopterećenja i kako bi se obezbedilo da je proizvod potpuno oslobođen mikrobne kontaminacije koja rezultuje mikrobnom kontaminaciju koja je mogla da uđe u prerađivački tok. Ako je celi obrađivački tok zaista aseptičan, tada je moguće izostaviti poslednje faze filtracije. Dobijeni TFF ostatak pakuje se tokom aseptičnog punjenja.
[0037] Aseptično punjenje: Ova faza prethodi liofilizaciji, koja is izvodi kao odvojeni postupak koji koristi različitu opremu. Faza aseptičnog punjenja pre liofilizacije može da uključuje dodavanje materijala nosača, kao što je manoza, glukoza, ili ostali materijali radi obezbeđivanja mase, ili za stabilizaciju RNK tokom faze liofilizacije.
[0038]Ovaj sistem je postavljen za ručnu kontrolu pomeranja materijala kroz svaku fazu. Sve komponente u kontaktu sa lipidima, lekom, rastvaračima, i puferim su jednokratni i za jednokratnu upotrebu. Sistem je prikazan za 10L šaržu, a može se prilagoditi na više od 1000L. Komponente su konstruisane da se koriste jednom po šarži lipozom/lek.
[0039] Način da se izvede postupak proizvodnje u skladu sa jednim primerom izvođenja ovog pronalaska leži u sekvenci faza kakva je prikazana u dijagramu toka (Fig.1) kako sledi.
[0040] Rastvori zaliha lipida i leka odvojeno su pripremljeni u posuduma zaliha lipida i zaliha siRNK. Rastvori zaliha moggu biti pripremljeni pri visokoj koncentraciji. Mešanje se izvodi umešavanjem u posuduma zaliha. Temperatura rastvora zaliha lipida može biti podešena na podešenu temperaturu. Posuda koja se koristi za pripremanje zaliha lipida bira se da ima minimalni materijal za ispiranje kada se koristi čisti organski rastvarač pri povišenoj temperaturi.
[0041] Rastvori zaliha odvojeno se pumpaju kroz 0.45/0.22 µm Filter u posudu zalihe filtriranih lipida i posudu zalihe filtrirane siRNK. Rastvori zaliha mogu se kombinovati sa dodatnim rastvaračem radi razblaživanja rastvora zaliha pre ili tokom transfera u posude filtriranih zaliha.
[0042] Na isti način, vodeni pufer je pripremljen u posudi fosfatnog pufera, i filterom sterilisan pumpanjem u posudu filtriranog fosfatnog pufera.
[0043] Rastvor filtrirane siRNK se pumpa u posudu lipozomske siRNK u 35% etanolu.
[0044] Lipidni neorganski rastvarač se pumpa u vodeni siRNK rastvor u posudu lipozomske siRNK u 35% etanolu brzinom efektivnom za formiranje lipid-lek čestice u konačnoj koncentraciji od 35% etanola pod kontrolisanom podešenom temperaturom uz mešanje vodenog rastvora.
[0045] Dodavanje lipida može se izvesti putem jednog otvora ili više otvora otvori, kroz iglu ili skup igala. Može se izvesti od gore na površinu vodenog rastvora, ili može injektiovati vodeni rastvor od ispod površine. Putem dodavanja i mešanja, koncentracija etanola rastvora u posudi lipozomske siRNK u 35% etanolu povećava se na 30% do 40%, poželjno 35%. To povećanje je postepeno, formirajući gradijent od početne (poželjno 0%) do konačne (poželjno 35%) vrednosti od 25-45% etanola. Ovaj gradijent može trajati od 1 minuta do 60 minuta ili duže, određenije do 100 minuta.
[0046] Kada rastvor posude lipozomske siRNK u 35% etanolu dostigne konačnu koncentraciju etanola (poželjno 35%), rastvor se ispumpava iz posude lipozomske siRNK u 35% etanolu i meša u liniji sa puferom koji se odvojeno pumpa iz posude filtriranog fosfatnog pufera tako da razblažuje mešavinu u vodi mešljivog alkohola, do poželjno 10% do 20% etanola, najpoželjnije 10% etanola, i transferiše u posudu lipozomske siRNK u 10% etanolu.
[0047] Rastvor 10% etanola je dijafiltriran u odnosu na vodeni pufer radi uklanjanja etanola.
[0048] TFF ostatak (0% etanol, 100 vodeni pufer) skladišti se u prvoj 10L SUB.
[0049] TFF ostatak može opciono biti filtriran radi smanjivanja bioopterećenja za aseptično punjenje.
[0050] Aseptično punjenje ukjljučuje fazu liofilizacije. Faza liofilizacije je isprekidana postupkom generisanja sterilnog TFF ostatka u fazi 10. To jest, ovaj faza poželjno se izvodi na različitim lokacijama od SUS jedinica obezbeđivanjem TFF ostatka. Ugljenihidrat kao što je saharoza ili glukoza mogu se dodati pre liofilizacije radi stabilizacije nanočestica i/ili dodavanja mase.
[0051] Lipidna mešavina korišćena u jednom primeru izvođenja postupka ovog pronalaska sadrži najmanje pozitivno naelektrisan lipid (katjonski lipid) za kompleksovanje sa negativno-naelektrisanim terapeutskim polimerima, i polietilen glikol-sadržavajući lipidni konjugat (PEG-lipid) radi sprečavanja agregacije. Katjonski lipid može biti trajno katjonsko naelektrisanje tokom širokok opsega pH uslova, jonizabilni katjonski lipid, koji je naelektrisan na nisku pH (manju od pH 6) i bez naelektrisanja mreže pri neutralnoj pH (pH 6.5 do 8), ili kombinacija trajnih i jonizabilnih katjonskih lipida. Lipidna mešavina može takođe da sadrži ciljajući lipid, polimer, steroid, fosfolipid, ili član druge lipidne grupe, ukjljučujući masnoću, vosak, u masnoći rastvorljiv vitamin, monoglierid ili diglicerid, masni acili, glicerolipidi, glicerofosfolipidi, sfingolipidi, saharolipidi i poliketidi. Ovaj postupak može takođe biti korišćen za formiranje lipozoma sa komponentama sa samo neutralnim ili negativnim naelektrisanjem.
[0052] Poželjno komponente lipidne mešavine mogu se odabrati iz sledećih grupa.
Katjonski lipid
[0053] Pogodni za upotrebu u postupku ovog pronalaska su katjonski lipidi Formule I
u kojoj
Z = alkil linker, C2-C4alkil
Y = alkil linker, C1-C6alkil
R1i R2su svaki nezavisno C10-C30alkil, C10-C30alkenil, ili C10-C30alkynil, C10-C30alkil, C10-C20alkil, C12-C18alkil, C13-C17alkil, C13alkil, C10-C30alkenil, C10-C20alkenil. C12-C18alkenil, C13-C17alkenil, C17alkenil; R3i R4su svaki nezavisno vodonik , C1-C6alkil, ili -CH2CH2OH, C1-C6alkil, C1-C3alkil; n je 1-6; a X je kontrajon, ukjljučujući bilo koji kontrajon azota, kao što je taj pojam lako razumljiv u struci. Poželjni kontrajoni azota uključuju halogene, pri čemu su hlorid i bromid naročito poželjni. Još jedan poželjan kontrajon je mezilat (-SO3CH3).
[0054] Primerna jedinjenja Formule I uključuje:
i
[0055] Ostali katjonski naelektrisan lipidi pri fiziološkoj pH uključuju N,N-dioleil-N,N-dimetilamonijum hlorid ("DODAC"); N-(2,3-dioleiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid ("DOTMA"); N,N-distearil-N,N-dimetilamonijum bromid ("DDAB"); N-(2,3-dioleiloksi)propil)-N,N,N-trimetilamonijum hlorid ("DOTAP"); N-(1,2-dimiristiloksiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroksietilamonijum bromid ("DMRIE"), 3β-(N-(N',N'-dimetilaminoetan)karbamoil)holesterol ("DC-Chol"), dioctadecilamidoglicil karboksispermidin ("DOGS"); i N-(1-(2,3-dioleiloksi)propil)-N-(2-(sperminekarboksamido)etil)-N,N-dimetilamonijum trifluoroacetat ("DOSPA").
Jonizabilni katjonski lipidi.
[0056] Pogodni za upotrebu u postupku ovog pronalaska su jonizabilni katjonski lipidi Formule II
u kojoj
Z = alkil linker, C2-C4alkil, -CH2SCH2CH2-Y = alkil linker, C1-C6alkil
R1i R2su svaki nezavisno C10-C30alkil, C10-C30alkenil, ili C10-C30alkynil, C10-C30alkil, C10-C20alkil, C12-C18alkil, C13-C17alkil, C13alkil, C10-C30alkenil, C10-C20alkenil. C12-C18alkenil, C13-C17alkenil, C17alkenil; R3i R4su svaki nezavisno vodonik , C1-C6alkil, ili -CH2CH2OH, C1-C6alkil C1-C3alkil.
1
[0057] Neki pozitivno naelektrisani lipidi imaju pKa pri ili blizu fiziološke pH i katjonski su u blago kiselim uslovima i slabo katjonski pri fiziološkoj pH. Takvi jonizabilni katjonski lipidi uključuju ((2-((2-(dimetilamino)etil)tio)acetil)azanediil)bis(etan-2,1-diil) ditetradekanoat ("S104"), (Z)-((3-(dimetilamino)propanoil)azanediil)bis(etan-2,1-diil) dioleat ("i-Et-DODC"), N-(2,3-dioleiloksi)propil)N,N-dimetilamonijum hlorid ("DODMA") i 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum-propan ("DODAP").
[0058] Predviđa se da jonizabilni lipidi mogu da olakšaju vezivanje i/ili oslobađanje aktivnog farmaceutskog sastojka (API), kako je prikazano u nastavku.
Neutralni lipidi
[0059] Primeri neutralnih lipida uključuju fosfolipide, aminolipide i sfingolipide. Neutralni lipidi uključuju amfipatične lipide. Reprezentativni primeri fosfolipida uključuju fosfatidilholin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilinositol, fosfatidnu kiselinu, palmitoiloleoil fosfatidilholin, lizofosfatidilholin, lizofosfatidiletanolamin, dipalmitoilfosfatidilholin, dioleoilfosfatidilholin, distearoilfosfatidilholin ordilinoleoilfosfatidilholin. Ostala jedinjenja koja nemaju fosfor, kao što su sfingolipid, glikosfingolipid familije, diacilgliceroli i 3-aciloksi kiseline, takođe su u grupi označenoj kao amfipatični lipidi. Dodatno, prethodno opisan amfipatični lipid može se mešati sa drugim lipidima ukjljučujući trigliceride i sterole.
PEG-lipidi
[0060] Komponenta za stabilizaciju dvosloja je polietilenglikol ("PEG") konjugovan sa grupom lipidne glave, npr., fosfatidiletanolaminom. Još jedna komponenta za stabilizaciju dvosloja je PEG konjugovan sa ceramidom. PEG može biti konjugovan sa fosfatidiletanolaminom ili, alternativno, sa ceramidom upotrebom standardnih reakcija kuplovanja poznatih i koje primenjuju stručnjaci iz ove oblasti. Pored toga, prethodno formirani PEG-fosfatidiletanolamin ("PEG-PE") konjugati su komercijalno dostupni.
[0061] PEG varirajućih molekulskih masa mogu biti korišćeni radi formiranja komponenti koje stabilizuju dvosloj, prema ovom pronalasku. PEG varirajućih molekulskih masa su komercijalno dostupni iz većeg broja različitih izvora ili, alternativno, mogu biti sintetizovani upotrebom standardnih tehnika polimerizacije dobro poznatih stručnjacima iz ove oblasti. U ovom poželjnom primeru izvođenja, polietilen glikol ima molekulsku masa u opsegu od 200 do 10000 Da, poželjno 500 do 4000 Da, i najpoželjnije 1000 do 2000 Da. Uopšteno, pronađeno je da povećanje molekulske mase PEG-a redukuje koncentraciju komponente za stabilizaciju dvosloja potrebnu za postizanje stabilizacije.
[0062] Fosfatidiletanolamin koji ima raznolikost grupa acilnih lanaca varirajućih dužina lanaca i stepena zasićenosti može biti konjugovan sa PEG radi formiranja komponente za stabilizaciju dvosloja. Takvi fosfatidiletanolamini su komercijalno dostupni, ili se mogu izolovati ili sintetizovati upotrebom konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima iz ove oblasti. Fosfatidiletanolamini koji sadrže zasićene ili nezasićene masne kiseline sa dužinom ugljeničnih lanaca u opsegu od C10 do C20 su poželjni.
Fosfatidiletanolamini sa mono- ili dinezasićenim masnim kiselina ma i mešavinama zasićenih i nezasićenih masnih kiselina može se takođe koristiti. Pogodni fosfatidiletanolamini uključuju sledeće: dimiristoilfosfatidiletanolamin (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamin (DPPE), dioleoilfosfatidiletanolamin (DOPE) i distearoilfosfatidil-etanolamin (DSPE).
[0063] Pomenute kompozicije mogu takođe da uključuju PEG-konjugovane lipidi, koji su poznati u struci per se, ukjljučujući PEG-fosfolipide i PEG-ceramide, ukjljučujući jedan ili više molekula odabranih od sledećih: PEG2000-DSPE, PEG2000-DPPE, PEG2000-DMPE, PEG2000-DOPE, PEG1000-DSPE, PEG1000-DPPE, PEG1000-DMPE, PEG1000-DOPE, PEG550-DSPE, PEG550-DPPE, PEG-550DMPE, PEG-1000DOPE, PEG-holesterol, PEG2000-ceramid, PEG1000-ceramid, PEG750-ceramid, i PEG550-ceramid.
[0064] Dalje, kompozicije mogu takođe da uključuju monodisperzne (md) peg-lipide, sa opštom formulom mdPEG-linker-lipid, sa primerima koji ukjljučuju 83-hidroksi-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81-heptakosaoksatrioktakontil (2,3-bis(tetradeciloksi)propil)karbamat ("HO-PEG1251-cBTP") i 134-hidroksi-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60,63,66,69,72,75,78,81,84,87,90,93,96,9 9,102,105,108,111,114,117,120,123,126,129,132-tetratetrakontaoksatetratriakontahektil (2,3bis(tetradeciloksi)propil)karbamat ("HO-PEG2000-cBTP") kao primeri.
Steroidi
[0065] Steroidi uključuju holestane (npr., holesterol), holane i žučne kiseline (npr., henodeoksiholat i holat), ergosterol, lanosterol, kortikosteroidi (npr., glucokortikoid), pregnan (npr., progesteron), i fitosteroli. Oni takođe mogu biti uključeni u formiranje konjugata sa hidrofilnom grupom, npr., polietilen glikolom. Poželjan steroid je holesterol.
Ciljajući lipid
[0066] Primer ciljajućeg lipida je jedinjenje formule (A),
L-X-R A
u kojoj lipid (L) je odabran iz grupe koju čine DSPE, DOPE, i DC; linker (X) je odabran iz grupe koju čine ništa, PEG550, PEG2000, PEG-glutamat (-Glu), Glu, C6, glicin, i GluNH, N1,N19-bis(3-(2-(2-(3-aminopropoksi)etoksi)etoksi)propil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid; i retinoid (R) je odabran iz grupe koju čine tretinoin, adapalen, retinol, 4-hidroksi(fenil)retinamid (4-HPR), retinoinska kiselina (vitamin A), 9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanska kiselina , 3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanska kiselina , 3,7- dimetil-9-(2,2,6-trimetilcikloheksil)nonanska kiselina , i bilo koji delimično ili potpuno zasićen retinoid ili njegov derivat.
[0067] Još jedna primer ciljajućeg lipida je jedinjenje formule (B),
R-X-R B,
u kojoj linker (X) je N1,N19-bis(3-(2-(2-(3-aminopropoksi)etoksi)etoksi)propil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid ("bisamido-PEG") ili N1,N19-bis(16,20-diamino-15-okso-4,7,10-trioksa-14-azaikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid ("liz-bisamido-PEG-liz"); i retinoid (R) je odabran iz grupe koju čine tretinoin, adapalen, retinol, 4-hidroksi(fenil)retinamid (4-HPR), i retinoinska kiselina (vitamin A), 9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanska kiselina , 3,7-dimetil-9-
1
(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanska kiselina , 3,7-dimetil-9-(2,2,6-trimetilcikloheksil)nonanska kiselina , i bilo koji delimično ili potpuno zasićen retinoid ili njegov derivat.
[0068] Ostali ciljajući molekuli mogu biti uključeni u lipidnu mešavinu, npr., folna kiselina , vitamin E, peptidni ligandi i/ili monoklonalna antitela.
Kompozicije i formulacije RNK-lipidnih čestica
[0069] Postupak ovog pronalaska daje kompozicije koje obuhvataju lipidnu česticu sa aktivni agensom nukleinske kiseline, u kojima kada je aktivni agens prisutan, vezan je sa lipidnom česticom. U određenim primerima izvođenja postupka ovog pronalaska, dobijaju se kompozicije u kojima je aktivni agens nukleinske kiseline inkapsuliran unutar vodene unutrašnjosti lipidne čestice. U ostalim primerima izvođenja postupka ovog pronalaska, dobijaju se kompozicije u kojima je aktivni agens nukleinske kiseline prisutan unutar jednog ili više lipidnih slojeva lipidne čestice. U ostalim primerima izvođenja postupka ovog pronalaska, dobijaju se kompozicije u kojima je aktivni agens nukleinske kiseline vezan izvan ili unutar lipidne površine lipidne čestice.
[0070] U postupku ovog pronalaska, dobijaju se lipidne čestice, koje su povezane sa nukleinskom kiselinom, što rezultuje u nukleinska kiselina -lipidna čestica. U određenijim primerima izvođenja postupka ovog pronalaska, dobijaju se čestice u kojima su nukleinska kiseline potpuno inkapsulirane u lipidnu česticu. Kako je ovde korišćeno, pojam "nukleinska kiselina " namenjen je uključi bilo koji RNK oligonukleotid ili RNK polinukleotid. Fragmenti koji sadrži do 50 nukleotida su uopšteno nazvani oligonukleotidi, a duži fragmenti su nazvani polinukleotidi. U određenijim primerima izvođenja postupka ovog pronalaska, korišćeni oligonukleotidi su oni od 15-50 nukleotida u dužini.
[0071] Pojmovi "polinukleotid" i "oligonukleotid" ovde se odnose na polimer ili oligomer nukleotida ili nukleozidne monomere koji se sastoje od prirodno javljajućih baza, šećera i inter-šerernih (kičma) veza. Pojmovi "polinukleotid" i "oligonukleotid" takođe ukjljučuju polimere ili oligomere koji obuhvataju neprirodno javljajuće monomere, ili njihove delove, koji funkcionišu na sličan način. Takvi modifikovani ili suptituisani oligonukleotidi često su poželjniji od nativnih oblika zbog osobina kao što je, na primer, prošireno intracelularno preuzimanje i povećana stabilnost u prisustvu nucleaza. U ovom pronalasku, upotrebljeni su "polinukleotidi" i "oligonukleotidi" tipa RNK.
[0072] Oligonukleotidi upotrebljeni u ovom pronalasku su tako oligoribonukleotidi.
Oligodeoksiribonukleotid se sastoji od deoksiriboze kovalentno spojene sa fosfatom na 5' i 3' uljenicima ovog šećera radi formiranja naizmeničnog, nerazgranatog polimera. Oligoribonukleotid se sastoji od slične ponavljajuće strukture u kojoj svaki nukleotid ima grupu šećera riboze. Modifikovani riboza molekuli mogu biti uključeni u oligoribonukleotid.
[0073] Nukleinska kiselina koja je prisutna u čestici lipid-nukleinska kiselina dobijenom u skladu sa ovim pronalaskom ukjljučuje bilo koji oblik RNK nukleinske kiseline koja je poznata. Nukleinske kiseline koje su ovde korišćene mogu biti jedno-lančane RNK, ili dvo-lančane RNK, ili DNA-RNK hibridi ili RNK-PNA hibridi PNA dupleksa. Primeri dvo-lančanih RNK uključuju siRNK i ostale reagense RNK interferencije. Jedno-lančane nukleinske kiseline uključuju, npr., antismisaone oligonukleotide, ribozime, mikroRNK, i tripleks-formirajuće oligonukleotide.
[0074] Nukleinske kiseline mogu biti raznih dužina, uopšteno zavisnih od određenih oblika nukleinske kiseline. Na primer, u određenim primerima izvođenja, plazmidi ili geni mogu biti od oko 1,000 do 100,000 nukleotidnih ostataka u dužini. U određenim primerima izvođenja, oligonukleotidi mogu biti u opsegu od oko 10 do 100 nukleotida u dužini. U razni povezanim primerima izvođenja, oligonukleotidi, bilo jedno-lančani, dvo-lančani, i tro-lančani, mogu u opsegu imati dužinu od oko 10 do oko 50 nukleotida, od oko 21 do oko 50 nukleotida, od oko 15 do oko 30 nukleotida, od oko 20 do oko 30 nukleotida u dužini.
[0075] U određenim primerima izvođenja, postupak ovog pronalaska može koristiti oligonukleotid (ili njegov lanac) koji može specifično da se hibridizuje za ili je komplementaran ciljanom polinukleotidu. "Specifično hibridizujuć" i "komplementaran" su pojmovi koji su korišćeni da ukažu na dovoljan stepen komplementarsnosti tako da se stabilno i specifično vezivanje javlja između DNK ili RNK cilja i oligonukleotida. Podrazumeva se da oligonukleotid ne mora 100% da bude komplementaran sa svojom ciljanom sekvencom nukleinske kiseline da bi bio specifično hibridizujuć. Oligonukleotid je specifično hibridizujuć kada se vezivanje oligonukleotida u cilju meša sa normalnom funkcijom ciljanog molekula radi izazivanja gubitka upotrebljivisti ili ekspresije, i tamo postoji dovoljan stepen specifičnog baznoguparivanja radi izbegavanja ne-specifičnog vezivanja oligonukleotida za ne-ciljajuće sekvence pod uslovima u kojima je poželjno specifično vezivanje, tj., pod fiziološkim uslovima u slučaju in vivo ogleda ili terapeutskih lečenja, ili, u slučaju in vitro ogleda, pod uslovima u kojima se ogledi sprovode. Tako, u ostalim primerima izvođenja, ovaj oligonukleotid ukjljučuje 1, 2, ili 3 bazne supstitucije kako je upoređeno sa regionom gena ili mRNK sekvence koja je ciljajuća ili za koju se specifično hibridizuje.
[0076] U određenim primerima izvođenja, postupak ovog pronalaska može dati nukleinska kiselina -lipidne čestice koje mogu biti povezane sa molekulima RNK interferencije (RNKi). Postupci RNK interferencije upotrebom RNKi molekula mogu se koristiti da prekinu ekspresiju gena ili polinukleotid od interesa. siRNK su RNK dupleksi obično 15-30 nukleotida u dužini koji se mogu povezati sa citoplazmatskim multi-proteinskim kompleksom poznatim RNKi-indukovani utišujući kompleks (RISC). RISC opterećena sa siRNK posreduje degradaciju homolognih mRNK transkripta; tako siRNK može biti određena da uspori proteinsku ekspresiju sa visokom specifičnošću. Za razliku od ostalih antismisaonih tehnologija, siRNK funkcioniše kroz prirodni mehanizam razvijen radi kontrole genske ekspresije kroz nekodirajućih RNK. Ovo se uopšteno smatra razlogom zbog kog kojeg je njihova aktivnost potentnija in vitro i in vivo bilo kod antismisaonog oligonukleotida ili ribozima. RNKi reagensi mogu da uključe DNK smisaone:RNK antismisaone hibride, RNK smisaone:DNK antismisaone hibride. Tako, RNKi molekuli koji
1
obuhvataju bilo koji od ovih različitih vrsta dvo-lančanih molekula, može biti korišćen. Pored toga, podrazumeva se da RNKi molekuli mogu biti korišćeni i uvedeni u ćeliju u raznim oblicima. Saglasno, kako je ovde korišćeno, RNKi molekuli obuhvataju bilo koji i sve molekule sposobne da indukuju RNKi odgovor u ćeliji, ukjljučujući dvo-lančane polinukleotide koji obuhvataju dva odvojena lanca, tj. smisaoni lanac i antismisaoni lanac, npr., mala mešajuća RNK (siRNK); polinukleotidi koji obuhvataju petlju ukosnice komplementarne sekvence, koji formira dvo-lančani region, npr., shRNKi molekule, i ekspresione vektore koji eksprimiraju jedan ili više polinukleotida sposobnih da formiraju sam dvolančani polinukleotid ili u kombinacija sa još jednim polinukleotidom.
[0077] RNK interferencija (RNKi) može biti korišćena da specifično inhibira ekspresiju ciljanih polinukleotida. Dvo-lančana RNK-posredovana supresija ekspresije gena i nukleinske kiseline može se postići u skladu sa ovim pronalaskom uvođenjem dsRNK, siRNK ili shRNK u ćeliju ili organizme. siRNK može biti dvo-lančana RNK, ili hibrid molekul koji obuhvata i RNK i DNK, npr., jedan RNK lanac i jedan DNK lanac, ili sisiRNK.
[0078] RNKi molekuli koji ciljaju specifične polinukleotide mogu se lako pripremiti u skladu sa procedurama poznatim u struci. Saglasno, stručnjak iz ove oblasti shvata da se širok spektar različitih siRNK molekula mogu koristiti za ciljanje specifičnog gena ili transkripta. U određenim primerima izvođenja, siRNK molekuli prema ovom pronalasku su dvo-lančani i 16-30 ili 18-25 nukleotida u dužini, ukjljučujući svaki ceo broj između.
[0079] Uopšteno, siRNK molekuli su potpuno komplementarni jednom lancu ciljanog DNK molekula. U ostalim primerima izvođenja, siRNK mogu imati modifikovanu kompoziciju, kao što je, na primer, 2'-deoksi ili 2'-O-metil modifikacije. Međutim, u poželjnim primerima izvođenja, ceo lanac siRNK nije izrađen bilo sa 2' deoksi ili 2'-O-modifikovanim bazama.
[0080] U određenim primerima izvođenja, ovaj pronalazak odnosi se na postupke za proizvodnju lipidinkapsuliranih čestica nukleinske kiseline u kojima su nukleinske kiseline inkapsulirane unutar lipidnog sloja. Takve nukleinska kiselina -lipidne čestice, koje inkorporišu siRNK oligonukleotide, su okarakterisane upotrebom različitih biofizičkih parametara ukjljučujući: (1) odnos nukleinske kiseline prema lipidu; (2) efikasnost inkapsulacije; i (3) veličina čestice. Visoka efikasnost inkapsulacije, dobra nukleaza rezistencija i serumska stabilnost i kontrolišuća veličina čestice, uopšteno manja od 200 nm u prečniku su poželjni. Pored toga, priroda polimera nukleinske kiseline je od značaja, budući da modifikacija nukleinskih kiselina u nastojanju da premese nucleaza resistenciju dodaje troškove terapeuticima dok u mnogim slučajevima obezbeđuje samo ograničenu rezistenciju. Ukoliko nije drugačije naznačeno, u ovom opisu, ovi kriterijumi se izračunavaju kako sledi:
Odnos nukleinska kiselina prema lipidu je količina nukleinske kiseline u definisanoj zapremini preparata podeljena sa količinom lipida u istoj zapremini. To se može izraziti na bazi mol po molu ili na bazi masa po masi, ili na bazi masa po molu. Za konačne, formulacije spremne za davanje, odnos nukleinska
1
kiselina :lipid izračunava se posle dijalize, pri čemu je hromatografska i/ili enzimatska (npr., nukleaza) digestija upotrebljena radi uklanjanja što je više moguće spoljašnjih kiselina .
Inkapsulacija
[0081] Da bi se odredila siRNK efikasnost inkapsulacije (EE), izražena kao procenat inkapsulirane siRNK u česticama lipid-nukleinska kiselina , primenjen je RiboGreen ogled kako sledi. Ovaj postupak može biti korišćen da bi se odredila dupleks i jedno-lančana RNK ili DNK koncentracija u rastvoru.
[0082] Oprema ukjljučuje BioTek Instruments, Inc. FLx800, razne pipete, i vorteks mešalicu. Reagensi uključuj RNKse-oslobođenu vodu (MilliQ klase, ili ekvivalent), 20x TE pufer "bez RNKse" (Invitrogen, T11493, ili ekvivalent), Quant-iT RiboGreen Reagens (Invitrogen, R11491), i 10% Triton X-100 u vodi (Thermo Scientific, 28314, ili ekvivalent).
[0083] Priprema IX TE Pufera uključuje transfer 38 mL RNKse-oslobođene vode u 50 mL epruvetu za centrifugiranje upotrebom 50 mL graduisanog cilindra; i pipetiranje 2 mL 20X TE Pufer rastvora u epruvetu za centrifugiranje i mešanje upotrebom mešača.
[0084] Priprema 2% Triton X-100 i 1% Triton X-100 u IX TE Puferu, uključuje pipetiranje 2 mL ili 1 mL, respektivno, 10% Triton X-100 u RNKse-oslobođenu 15 mL koničnu epruvetu, dodavanje 8 mL ili 9 mL, respektivno, IX TE pufera, i mnje radi dobrog miksovanja.
[0085] Priprema RiboGreen radnog rastvora, uključuje uklanjanje zamrznutih zaliha RiboGreen Reagensa zagrevanje na sobnoj temperaturi, i razblaživanje do 1:200 sa TE puferom. Epruveta za centrifugiranje obavija se aluminijumskom folijom radi sprečavanja da bilo koja dodatna svetlost dođe do rastvora.
[0086] Standard je pripremljen pripremanjem RNK rastvora u TE puferuu, i raspoređivanjem u ploču sa 96 bazenčića. Uzorci su razblaženi do konačne koncentracije od približno 80 µg/mL siRNK i transferisane u ploču sa 96 bazenčića kako je prikazano na FIG.1. RiboGreen radni rastvor de dodaje i umešava sa svakim uzorkom i standardom. Uzorci su inkubisani u tami tokom 1-2 minuta pre analiziranja.
[0087] 1% Triton X-100 u TE puferu se tada dodaje u duplikatu uzorcima i tada se RiboGreen radni rastvor dodaje.
[0088] Efikasnost inkapsulacije određuje se iz fluorescentnih merenja upotrebom proseka fluorescencionih rezultata iz svakog uzorka, korigovanjem za merenja osnovne linije proseka spoljnih uzoraka (fluorescencija RiboGreen reagensa u odsustvu RNK), i naknadno korigovanje za 8% redukcije u signalnom intenzitetu u prisustvu Triton X-100. Efikasnost inkapsulacije se tada izračunava upotrebom sledeć jednačine:
1
[0089] Drugim rečima, efikasnost inkapsulacije predstavlja razliku između ukupnih RNK vrednosti (merene posle rastvaranja tog lipozoma sa deterdžentom) i intaktnih lipozomskih vrednosti, podeljeno sa ukupnim RNK vrednostima. Fluorescencija dobijena iz intaktnog lipozomskog uzorka sastoji se od slobone RNK u rastvoru plus RNK apsorbovana na spoljnoj površini lipozoma.
Veličina
[0090] Veličina ukazuje na veličinu (prečnik) formiranih čestica. Distribucija veličine može biti određena upotrebom instrumenta Malvern Zetasizer Nano-ZS dinamičkog prelamanja svetla (DLS).
[0091] Ovaj postupak promenjuje merenje zapremine srednjeg prečnika, Z-prosečnog prečnika, i polidisperznosti za uzorke lipozoma u-postupku. Polidisperznost je numerička vrednost za distribuciju veličine čestica.
[0092] Merenja se izvode na sobnoj temperaturi. Uzorci i reagensi bi trebalo da se ekvilibrišu na sobnu temperaturu. Određuju se zapreminski izmereni srednji prečnik čestice i indeks polidisperznosti.
Postupak proizvodnje
Priprema lipozoma
[0093] Lipidna mešavina rastvorena je u vodi mešljivog organskog rastvarača, koji je etanol i poželjno apsolutni etanol. U većini primera izvođenja, organski rastvarač etanol je korišćen u obliku u kojem je komercijalno dostupan.
[0094] U jednom primeru izvođenja postupka ovog pronalaska, koristi se mešavina lipida, pri čemu je ta mešavina lipida mešavina katjonskih amino lipida, neutralnih lipida (različitih od amino lipida), steroida (npr., holesterola), i PEG-modifikovanog lipida (npr., PEG-S-DMG, PEG-C-DOMG ili PEGDMA) koji su zajedno rastvoreni u organskom rastvaraču. U poželjnim primerima izvođenja, lipidna mešavina se sastoji suštinski od katjonskog amino lipida, neutralnog lipida, holesterol i PEG-modifikovanog lipida. U daljim poželjnim primerima izvođenja, lipidna mešavina se sastoji od katjonskog lipida, DOPE (ili još jednog pomoćnog lipida, bilo sa jonizabilnim ili trajnim katjonskim naelektrisanjem), holesterola i PEG-konjugovanog lipida pri raznim molarnim odnosi. Poželjni molarni opsezi su između 40 do 60 mol% katjonskog lipida, 10 do 30% neutralnog lipida, 20 do 40% holesterola, i 1 do 10% PEG-modifikovanog lipida.
[0095] Ciljajući lipid može biti dodat u lipidnu mešavine, npr., diVA-PEG750-diVA (ili drugi VA-konjugovan ciljajući lipid) pri molarnom odnosu od 0.1 do 5 (ciljajući lipid:ukupan lipid).
[0096] Ukupna koncentracija lipida manja je od 25 mg/ml, poželjno manja od 5mg/ml. Lipidna mešavina filtrira se kroz membranu, npr.0.45 ili 0.2 µm filter.
[0097] U skladu sa jednim primerom izvođenja postupka ovog pronalaska, lipidna mešavina se kombinuje sa puferovanim vodenim rastvorom. Puferovani vodeni rastvor može biti rastvor u kojem
1
pufer ima pH manju od pKa protonisanog lipida u lipidnoj mešavini. Primeri pogodnih pufera uključuje citratni, fosfatni, i acetatni. Naročito poželjan pufer je citratni pufer. Poželjni puferi biće u koncentracionom opsegu od 1-1000 mM anjona, zavisno od hemije nukleinske kiseline koja se inkapsulira, a optimizacija koncentracije pufera može biti značajna za postizanje visokih nivoa unosa. Može biti pogodno za dodavanje krioprotektanta, i/ili ne-jonskih rastvora, koji bi balansirali osmotski potencijal između čestica membrane, npr., da kada se čestice dijalizuju radi uklanjanja etanola, poveća se pH, ili meša se sa farmaceutski prihvatljivim nosač ili razblaživačem. Količina nukleinske kiselina u puferu je od oko 0.08 do 0.8 mg/mL.
[0098] U trenutku dodavanja etanola u jednom primeru izvođenja postupka ovog pronalaska, temperatura vodenog rastvora je 25 do 45° C, poželjno 30 do 40° C. Rastvor etanola dodaje se u vodeni rastvor ili prskanjem na vazduh-voda međuprostor, pri suženom protoku, ili kroz tečnost-tečnost međuprostor između etanola dostavljenog kroz cev koja je potopljena u vodeni rastvor.
[0099] Organski rastvor dodaje se gravitacijom ili pumpom koja dostavlja organski rastvor u vodeni rastvor pri kontrolisanoj brzini, poželjno konstantnoj brzini. Isporuka organskog okončava se kroz 1 minut do 100 minuta, poželjno od 1 do 25 minuta. Organski rastvor može biti dodat kroz jedan aprej ili protok, kroz cev ili mlaznica, ili kroz sistem multi-mlaznica. Dok se organski rastvor dodaje u vodeni rastvor, rezultujući rastvor može da se umeša umešavanjem, protresanjem ili recirkulisanjem. Faza dodavanja rezultuje u konačnoj koncentraciji koja je 25 do 45% etanol, najpoželjnije 35% etanol.
[0100] Konačni rastvor tretira se radi uklanjanja organskog rastvarača, dijalizom ili filtriranjem, poželjno dijafiltiranjem. Dok se uklanja etanol, vodeni rastvor se konvertuje u puferovan pri neutralnoj pH, pH 6.8 do pH 7.5, poželjno, pH 7.2, na primer fosfatni ili HEPES pufer. Rezultujući vodeni rastvor poželjno je sterilisan pre odlaganja ili upotrebe, npr., filtriranjem kroz 0.22 µm filter.
Lipozomi koji inkapsuliraju negativno naelektrisane terapeutske polimere
[0101] Postupci ovog pronalaska su upotrebljivi za pripremanje lipidnih čestica sa negativno naelektrisanim polimerom terapeutske nukleinske kiseline, tj., RNK molekulom. U ovde opisanim postupcima, mešavina lipida se kombinuje sa vodenim rastvorom polimera nukleinske kiseline. Polimer je efikasno inkapsuliran u rezultujuće lipidne čestice.
[0102] Nanočestice mogu da uključuju polianjonsi aktivni agens ili terapeutski agens, tj., RNK i jedan, dva ili tri biokompatibilna polimera. Terapeutski agensi su nukleinske kiseline.
[0103] Ukupno naelektrisanje negativno naelektrisanog polimera mora biti manje od ili jednako u broju pozitivnih naelektrisanja u lipidnoj mešavini u trenutku dodavanja koji poželjno 0.06 do 0.16 (masa:masa). Drugim rečima, inkapsulirane nukleinske kiseline prisutne su u konačnom odnosu RNK:lipid 0.06 do 0.16, naelektrisanje:naelektrisanje (-/+),poželjno 1:2.5 do 1:1.
1
[0104] Kada mešavina lipida obuhvata katjonski lipid sa nekim naelektrisanjem, nosači lipida mogu biti formirani u prisustvu negativno naelektrisanog polimera nukleinske kiseline za inkapsulaciju i zarobiti taj polimer. Rezultujuće čestice mogu biti neutralizovane povećavanjem pH medijuma na fiziološku pH ili višu. Nosači formirani na ovaj način obezbeđuju formulacije uniformnih veličina vezikula sa visokim sadržajem nukleinske kiseline.
[0105] Bilo kom slučaju, nosači koji inkapsuliraju polimer (nanočestice) imaju opseg veličine od 50 do 150 nm.
[0106] U skladu sa primerom izvođenja ovog pronalaska, lipidna mešavina se kombinuje sa puferovanim vodenim rastvorom koji može da sadrži negativno naelektrisan polimer nukleinske kiseline. Puferovani vodeni rastvor može biti rastvor u kojem pufer ima pH od manje od pKa protonisanog lipida u lipidnoj mešavini. Primeri pogodnih pufera uključuju citratni, fosfatni, acetatni, i MES. Naročito poželjan pufer je citratni pufer. Poželjni puferi su u opsegu od 1-1000 mM anjona, zavisno od hemije polimera koji se inkapsulira, a optimizacija koncentracije pufera može biti značajna za postizanje visokih nivoa unosa.
[0107] Može biti pogodno za dodavanje krioprotektanta i/ili ne-jonskih rastvora koji bi balansirali osmotski potencijal između čestica membrane da kada se čestice dijalizuju radi uklanjanja etanola, poveća se pH, ili meša se sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i/ili razblaživačem.
[0108] Za RNK, šema ovog postupka opisanog kao primer izvođenja postupka ovog pronalaska prikazana je na Fig.1. Rastvori su pripremljeni rastvaranjem liofilizovanog ili čvrstog materijala u vodi, poželjno puferovanoj na pH 3.5-4.5, na primer sa 50 mM citratom. Količina nukleinske kiselina u puferu je od 0.08 do 0.8 mg/mL. U trenutku dodavanja etanola, temperatura vodenog rastvora je 25 do 45° C, poželjno 30 do 40° C. Ako je korišćena jednolančana nukleinska kiselina , kratko zagrevanje pri povišenoj temperaturi može biti korisno, npr., 1-2 minuta na 65° C.
[0109] Rastvor etanola dodaje se u vodeni rastvor ili prskanjem na vazduh-voda međuprostor, pri suženom protoku, ili kroz tečnost-tečnost međuprostor između etanola dostavljen kroz cev koja je povezana sa kontejnerom sa vodenim rastvorom.
[0110] Organski rastvor dodaje se dostavljanjem organskog rastvora u vodeni rastvor pri kontrolisanoj brzini, poželjno pri konstantnoj brzini. Isporuka organskog rastvora okončava se kroz 1 minut do 100 minuta, poželjno od 1 do 25 minuta. Organski rastvor može biti dodat kroz jedan sprej ili protok, kroz cev ili mlaznicu, ili kroz multimlaznica sistem. Dok se organski rastvor dodaje u vodeni rastvor, rezultujući rastvor može da se umeša umešavanjem, protresanjem ili recirkulisanjem. Faza dodavanja rezultuje u konačnoj koncentraciji dovoljnoj da prekine lipozomsku dvoslojnu strukturu, određenije 25 do 45% etanol, najpoželjnije 35% etanol.
[0111] Za čestice lipid-nukleinska kiselina dobijene postupkom ovog pronalaska, konačna RNK koncentracija je 0.001 do 1 mg/ml, poželjno 0.01 do 0.5 mg/ml, najpoželjnije 0.05 do 0.5 mg/ml.
Konačni odnos lek/lipid, je 0.06 do 0.16 masa:masa (2.5:1 do 1:1, naelektrisanje:naelektrisanje odnos).
2
[0112] Konačni rastvor tretira se radi uklanjanja organskog rastvarača, dijalizom ili filtriranjem, poželjno dijafiltiranjem. Dok se uklanja etanol, vodeni rastvor se konvertuje u puferovan pri neutralnoj pH, pH 6.8 do pH 7.5, poželjno, pH 7.2, na primer fosfatni pufer. Rezultujući vodeni rastvor poželjno je sterilisan pre odlaganja ili upotrebe, npr., filtriranjem kroz 0.22 µm filter.
[0113] Konačna efikasnost inkapsulacije veća je od 85%. Konačni srednji prečnik čestice je 50 do 150 nm. Indeks polidisperznosti PDI manji je od 0.2, poželjno manji od 0.1.
Liofilizacija
[0114] Ovaj opis delimično se odnosi na liofilizovanu farmaceutsku kompoziciju koja, kada rekonstituiše, ima minimalnu količinu velikih agregata. Takve liofilizovane farmaceutske kompozicije nisu primeri izvođenja ovog pronalaska. Takvi veliki agregati mogu imati veličinu veću od oko 0.2 µm, veću od oko 0.5 µm, ili veću od oko 1 µm, i mogu biti nepoželjni u rekonstituisanom rastvor. Veličine agregata mogu biti merene upotrebom raznih tehnika ukjljučujući one naznačene u U.S. Pharmacopeia 32<788>. Ta ispitivanja mogu da uključe test brojanja čestica zatamljivanjem svetlosti, test brojanja čestica pod mikroskopom, laserska difrakcija, i jedno čestično optičko zapažanje. U jednom primeru izvođenja, veličina čestice u datom uzorku merena je upotrebom laserkom difrakcijom i/ili jedno čestičnim optičkim zapažanjem. Dinamično raspršivanje svetlosti (DLS) može biti korišćeno za merenje veličine čestice, ali se ono oslanja na Brownian-skom pokretu tako da ta tehnika može da ne zapazi neke veće čestice. Laserka difrakcija oslanja se razlike u indeks refrakcije između čestice i suspenzionog medijuma. Tehnike su sposobne za detektovanje čestica u podmikronskom do milimetarskom opsegu. Relativno male (npr., oko 1-5 Masenih %) količine većih čestica može biti određena u suspenzijama nanočestica. Jedno čestično optičko zapažanje (SPOS) koristi zatamljivanje svetlosti razblažene suspenzije radi brojanja pojedinačnih čestica od oko 0.5 pm. Poznavanjem koncentracije čestice izmerenog uzorka, maseni procenat agregata ili koncentracija agregata (čestice/mL) može biti izračunat.
[0115] Formiranje agregats može se javiti tokom faza zamrzavanja i/ili sušenja liofilizacije, npr., usled dehidratacije površine čestica. Postupak zamrzavanja ima efekat koncentrovanja koji može da redukuje rastojanje između čestica kako se formira led (Alison et al., Biochim Biophys Acta.2000 Sep 29;1468(1-2):127-38; Armstrong i Anchordoquy, J Pharm Sci.2004 Nov;93(11):2698-709). Ovakva dehidratacija može se zaobići korišćenjem looprotektanata, kao što su polisaharidi, u suspenziji pre liofilizacije.
Pogodni polisaharidi uključuju saharozu, laktulozu, laktozu, maltozu, trehalozu, ili celobiozu, kojibiozu, nigerozu, izomaltozu, trehalozu, soforozu, laminaribiozu, gentiobiozu, turanozu, maltulozu, palatinozu, gentiobiulozu, mannobiazu, melibiozu, melibiulozu, rutinozu, rutinulozu, i ksilobiozu. U jednom primeru izvođenja, kompozicija obuhvata polisaharid koji je saharoza. U još jednom primeru izvođenja, kompozicija obuhvata polisaharid koji je trehaloza. Rezultati prijavioca pokazuju, u poređenju sa početnom suspenzijom, da su posle rekonstrukcije dobijene ekvivalentne DLS distribucije veličine.
[0116] Prethodno je smatrano da vitrifikacija, postupak imobilizovanja makromolekula u staklastom ekscipijensu, nije doprinoseći faktor koji sprečava agregaciju lipozoma i da su potrebi hipertonični rastvori šećera (Alison et al.). Pronalazači su pronašli da rezultati faza zamrzavanja i sušenja zavise od određenog lipid:polisaharid odnosa (masa:masa), koji obezbeđuje sredstva za sprečavanje agregacije lipozoma, prekida lipozomske difuzione barijere, i oslobađanja inkapsulirane RNK radi formiranja lipopleksa nukleinska kiselina . U jednom primeru izvođenja ovog opisa, koji nije primer izvođenja zaštićenog pronalaska, kompozicija obuhvata 12 do 15% (masa:masa) saharoze i 5 do 20 mg/ml lipida, poželjno 12% saharoze i 9 mg/ml lipida. Poželjnije, kompozicija takođe obuhvata pufer, najpoželjnije HEPES pri neutralnoj pH.
[0117] Faze liofilizacije izvode u pogodnoj staklenoj posudi, poželjno 10 ml, cinidrična staklena fiola. Staklena fiola mora da pretrpi ekstrene promene u temperaturama od manje od -40° C. i više od sobne temperature u kratkim vremenskim periodima, i izrezana u uniformnom obliku. Kompozicija koja obuhvata agens za punjenje i nukleinske kiseline koje inkapsuliraju lipozome dodaje se u fiolu, poželjno u 3 ml zapremine, i poželjno sa 9 mg/ml lipida.
[0118] Faza liofilizacije može da obuhvata zamrzavanje kompozicije pri temperaturi od veće od oko -40° C., ili npr. manje od oko -30° C., koje formira zamrznutu kompoziciju; i sušenje zamrznute kompozicije radi formiranja liofilizovane kompozicije. Faza zamrzavanja poželjno daje linerano snižavanje temperature do kraja tokom perioda od oko 6 minuta, poželjno na 1° C./minuta od 20 do -40° C.
Poželjnije, saharoza pri 12-15% može biti korišćena, a faza sušenja je na oko 50-150 mTorr, prvo pri niskim temperaturama od oko -15 do oko -35° C., a zatim pri višim temperaturama od sobne temperature do oko 25° C., i okončava se za tri do sedam dana. U još jednom primeru izvođenja ovog opisa, trehaloza se može koristiti, a faza sušenja je na oko 50-100 mTorr, prvo pri niskim temperaturama od oko 0 do oko -15° C., a zatim pri višim temperaturama.
[0119] U još jednom aspektu, ovaj opis obezbeđuje postupak sprečavanja suštinske agregacije čestica u farmaceutskoj kompoziciji nanočestica, koji obuhvata dodavanje šećera i soli u liofilizovanu formulaciju radi sprečavanja agregacije i oslobađanja nukleinske kiseline iz unutrašnjosti lipozoma. Ovaj aspekat takođe nije primer izvođenja zaštićenog pronalaska.
Farmaceutske kompozicije
[0120] Lipidne čestice koje se mogu dobiti postupkom ovog pronalaska, koje su povezane sa terapeutskim agensom nukleinskom kiselinom, može biti formulisan kao farmaceutska kompozicija, npr., koja dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv razblaživačem, ekscipijens, ili nosač, kao što je fiziološki slani rastvor ili fosfatni pufer, odabran u skladu sa putem davanja i standardnom farmaceutskom praksom. Ove farmaceutske kompozicije nisu zaštićene kao primeri izvođenja ovog pronalaska.
[0121] U određenim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije koje obuhvataju čestice lipidnukleinska kiselina dobijene postupkom ovog pronalaska su pripremljene u skladu sa standardnim tehnikama i dalje obuhvataju farmaceutski prihvatljiv nosač. Uopšteno, uobičajeni slani rastvor primenjuje se kao farmaceutski prihvatljiv nosač. Ostali pogodni nosači uključuju, npr., vodu, puferovanu vodu, 0.9% slani rastvor, 0.3% glicin, šećer ili polisaharid, npr., saharoza i/ili trehaloza, ukjljučujući glikoproteine za proširenu stabilnost, kao što je albumin, lipoprotein, globulin. Agensi za punjenje, kiro-protektanti i/ili lioprotektanti, kao i metalni prečišćavači, npr., EDTA, mogu biti uključeni. U kompozicije koje obuhvataju slani rastvor ili ostale soli koje sadrže nosači, nosač se poželjno dodaje po formiranju lipidnih čestica. Tako, posle formiranja kompozocoja lipid-nukleinska kiselina , kompozicije se mogu razblažiti u farmaceutski prihvatljive nosače kao što je uobičajeni slani rastvor.
[0122] Rezultujući farmaceutski preparati mogu biti sterilisani konvencionalnim, dobro poznatim tehnikama sterilizacije. Vodeni rastvori se zatim mogu upakovati za upotrebu ili filtrirati pod aseptičnim uslovima i liofilizovati, pri čemu se liofilizovani proizvod kombinuje sa sterilnim vodenim rastvorom pre davanja. Kompozicije mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance po potrebi da bi se približilie fiziološkim uslovima, kao što su agensi za podešavanje pH i puferovanje, agensi za podešavanje toničnosti, na primer, natrijum acetat, natrijum laktat, natrijum hlorid, kalijum hlorid, kalcijum hlorid, itd. Dodatno, lipidna suspenzija može da uključi lipid-zaštitine agense koji štite lipide od slobodnih radikala i lipidnih peroksidativnih oštećenja tokom čuvanja. Lipofilni zagašivači oslobođeni od slobodnih radikala, kao što je a-tokoferol i vodo-rastvorljivi železo-specifični hetalori, kao što je ferioksamin, su pogodni.
[0123] Koncentracija lipidnih čestica ili čestica lipid-nukleinska kiselina u farmaceutskim formulacijama može široko da varira, tj., od manje od oko 0.01%, obično ili najmanje oko 0.05-5% do kao 10 do 30mas.% i bira se primarno zavisno od zapremina fluida, viskoziteta, itd., u skladu sa određenim načinom davanja koji je odabran. Na primer, koncentracija se može povećati da bi snizila fluidno opterećenje povezano sa lečenjem. To može biti naročito poželjno kod pacijenata koji imaju ateroskleroza-povezano sa kongestivnom srčanom insuficijencijom ili tešku hipertenziju. Alternativno, kompleksi sastavljeni od iritirajućih lipida mogu se razblažiti do nižih koncentracija da bi se umanjilo zapaljenje na mestu davanja. U jednoj grupi primera izvođenja, nukleinska kiselina imaće prikačenu oznaku i biće korišćena za dijagnozu (ukazivajući na prisustvo komplementarne nukleinske kiseline). U ovom slučaju, količina kompleksa koja se daje zavisiće od određene oznake koja je primenjena, stanja bolesti koje se dijagnostikuje, procene lekara, ali će uopšteno biti između oko 0.01 i oko 50 mg po kilogramu telesne mase, poželjno između oko 0.001 i oko 5 mg/kg telesne mase.
Postupak upotrebe
2
[0124] Lipidne čestice dobijene postupkom ovog pronalaska mogu se koristiti za dostavu nukleinske kiseline do ćelije, in vitro ili in vivo. Pomenute upotrebe nisu primeri izvođenja pronalaska za koji se traži zaštita. Doku su sledeći opis raznih postupaka upotrebe lipidnih čestica i povezanih farmaceutskih kompozicija dati kao primer u opisu koji je povezan sa nukleinska kiselina -lipidnim česticama, podrazumeva se da se ovi postupci i kompozicije mogu lako prilagoditi za isporuku bilo kog terapeutskog agensa za lečenje bilo koje bolesti ili poremećaja koji bi imao neku dobrobit od ovakvog lečenja.
[0125] Ovde su takođe opisani, ali ne kao primeri izvođenja pronalaska za koji se traži zaštita, postupci za uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju. Poželjne nukleinske kiseline za uvođenje u ćeliju su siRNK, imuno-stimulišući oligonukleotidi, plazmidi, antismisaoni i ribozimni. Ovi postupci mogu se izvesti kontaktiranjem čestice ili kompozicije dobijene postupkom ovog pronalaska sa ćelijama tokom vremenskog perioda dovoljnog za intracelularnu isporuku do koje će doći.
[0126] Kompozicije dobijene postupkom ovog pronalaska mogu biti adsorbovane od strane gotovo svakog ćelijskog tipa. Kada se adsorpbuju, nukleinska kiselina -lipidne čestice mogu ili biti endocitozivone delom ćelije, izmeniti lipide sa ćelijskim membranama, ili se fuzionisati sa ćelijom.
Transfer ili inkorporacija dela nukleinske kiseline kompleksa može da se odigra putem bilo kog od ovih puteva. Veruje se da u slučaju čestice preuzetr od strane ćelija putem endocitoze, ta čestica zatim zajednički interaktuje sa endozomalnom membranom, što rezultuje u destabilizaciji endozomalne membrane, verovatno formiranjem ne-dvoslojnih faza, što rezultuje u uvođenju inkapsulirane nukleinske kiseline u ćelijsku citoplazmu. Slično slučaju direktne fuzije čestica sa membranom ćelijske plazme, kada se odvija fuzija, ta lipozomska membrana integriše se u ćelijsku membranu, a sadržaji lipozoma kombinuju se sa intracelularnim fluidom. Kontakt između ćelije i kompozicije lipid-nukleinska kiselina , kada se izvodi in vitro, odvija se u biološki kompatibilnom medijumu. Koncentracija kompozicije može da široko varira zavisno od određene primene, ali je uopšteno između 1 µmol i 10 mmol. U određenim primerima izvođenja, lečenje ćelija sa kompozicijama lipid-nukleinska kiselina uopšteno se izvodi pri fiziološkim temperaturama (37° C.) tokom vremenskih perioda od 1 do 24 sata, poželjno od 2 do 8 sati. Za in vitro primene, isporuka nukleinske kiseline može biti u bilo koju ćeliju koja se uzgaja u kulturi, bilo biljnog ili životinjskog porekla, kičmenjaka ili beskičmenjaka, i bilo kog tkiva ili vrste. Ćelija može biti životinjska ćelija, specifično sisarska ćelija, a specifičnije humana ćelija.
[0127] Suspenzija čestica lipid-nukleinska kiselina može se dodati 60-80% konfluentnim zasejanim ćelijama koje imaju ćelijsku gustinu od oko 103 do oko 10<5>ćelija/mL, poželjnije oko 2x10<4>ćelija/mL. Koncentracija suspenzije dodate u ćelije poželjno je od oko 0.01 do 20 µg/mL, poželjnije oko 1 µg/mL.
[0128] Tipične primene uključuju upotrebu dobro poznatih procedura radi obezbeđivanja intracelularne isporuke siRNK radi obaranja ili utišavanja specifičnih intracelularnih ciljeva. Alternativne primene uključuju isporuku DNK ili mRNK sekvenci koje kodiraju terapeutski upotrebljive polipeptide. Ove primene nisu primeri izvođenja pronalaska za koji se traži zaštita.
[0129] Ovde opisani postupci, koji nisu primeri izvođenja pronalaska za koji se traži zaštita, mogu se izvesti in vitro, ex vivo, ili in vivo. Na primer, kompozicije dobijene postupcima ovog pronalaska mogu takođe biti korišćene za dostavu nukleinske kiseline u ćeliju in vivo, upotrebom postupaka koji su poznati stručnjacima iz ove oblasti.
[0130] Za in vivo davanja, farmaceutske kompozicije se poželjno daju parenteralno, tj., intraartikularno, intravenozno, intraperitonealno, subkutano, ili intramuskularno. U određenim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije se daju intravenozno ili intraperitonealno bolus injektovanjem.
[0131] U ostalim ovde opisanim postupcima, koji nisu primeri izvođenja pronalaska za koji se traži zaštita, farmaceutski preparati mogu se dovesti u kontakt sa ciljanim tkivom direktnom primenom pripreme u tkivu. Taprimena može se izvesti topikalnim, "otvorenim" ili "zatvorenim" pocedurama. Pod "topikalni," misli se na direktnu primenu farmaceutskog pripravka na tkivo izloženo okruženju, kao što je koža, orofarinks, i spoljni služni kanal. "Otvorene" pocedure su one pocedure koje uključuju isecanje kože pacijenta i direktno vizualizovanje tkiva koje je ispod nje na koje se primenjuju farmaceutski preparati. To se uopšteno postiže hirurškom procedurom, kao što je torakotomija kako bi se pristupilo plućima, abdominalna laparotomija da bi se prisutupilo abdominalnim organima, ili ostali direktni hirurški pristupi do ciljanog tkiva. "Zatvorene" pocedure su invazivne pocedure u kojima unutrašnja ciljana tkiva nisu direktno vizualizovana, već im se pristupa umetanjem isntrumenata kroz male otvore na koži. Na primer, pripravci se mogu dostaviti u peritoneum lavažom sa iglom. Slično, farmaceutski pripravci mogu se naneti na meninge ili kičmenu moždinu infuzijom tokom lumbalne punkcije praćeno pogodnim pozicioniranjem pacijenta kako je u skladu sa uobičajenom praksom za spinalnu anesteziju ili metrazamidno slikanje kičmene moždine. Alternativno, ti preparati mogu se primeniti kroz endoskopse uređaje.
[0132] Kompozicije lipid-nukleinska kiselina dobijene postupkom ovog pronalaska mogu se takođe davati aerosolom koji se inhalira u pluća ili direktnim injektovanjem na mesto bolesti.
[0133] Postupci ovog opisa, koji nisu primeri izvođenja pronalaska za koji se traži zaštita, može se primeniti kod raznih subjekata ili domaćina. Poželjni subjekti ili domaćini uključuju sisarske vrste, kao što su ljudi, ne-humani primati, psi, mačke, stoka, i konji, ovde. Subjekat može biti sisar, kao što je čovek, kome je potrebno lečenje ili prevencija bolesti ili poremećaja, npr., subjekat dijagnostikovan sa ili koji je pod rizikom od razvijanja bolesti ili poremećaja.
[0134] Doziranja čestica lipid-terapeutski agens dobijenih postupkom ovog pronalaska zavisiće od odnosa terapeutskog agensa prema lipidu i mišljenja lekara koji ih daje zavisno od godina, težine, i stanja pacijenta.
[0135] U jednom primeru izvođenja, ovaj opis obezbeđuje postupak, koji nije primer izvođenja pronalaska za koji se traži zaštita, modulisanja ekspresije ciljanog polinukleotida ili polipeptida. Ovi postupci uopšteno obuhvataju dovođenje u kontakt ćelije sa lipidnom česticom ovog pronalaska koja je
2
povezana sa nukleinskom kiselinom sposobnom za modulisanja ekspresije ciljanog polinukleotida ili polipeptida. Kako je ovde korišćeno, pojam "modulisanje" odnosi se na menjanje ekspresije ciljanog polinukleotida ili polipeptida. U različitim primerima izvođenja, modulisanje može se umreno povećati ili ojačati, ili se može umereno smanjiti ili redukovati. Postupci merenja nivoa ekspresije ciljanog polinukleotida ili polipeptida poznati su i dostupni u struci i uključuju, npr., postupke koji koriste lančanu reakciju reverzne transkripcije-polimeraze (RT-PCR) i imunohistohemijske tehnike. U određenim primerima izvođenja, nivo ekspresije ciljanih polinukleotida ili polipeptida je povećan ili redukovan za najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, ili više od 50% u poređenju sa pogodnim kontrolnim vrednostima.
[0136] Na primer, ako je poželjno povećanje ekspresije polipeptida, nukleinska kiselina može biti ekspresioni vektor koji ukjljučuje polinukleotid koji kodira željeni polipeptid. Sa druge strane, ukoliko je poželjna redukovana ekspresija polinukleotida ili polipeptida, tada nukleinska kiselina može biti, npr., antismisaoni oligonukleotid, siRNK, ili mikroRNK koja obuhvata polinukleotidnu sekvencu koja se specifično hibridizuje sa polnukleotidom koji kodira ciljani polipeptid, čime se prekida ekspresija ciljanog polinukleotida ili polipeptida. Alternativno, nukleinska kiselina može biti plazmid koji eksprimira takav antismisaoni oligonukletoid, siRNK, ili mikroRNK.
[0137] Aktivni agens nukleinske kiseline ili terapeutski agens može biti odabran od siRNK, mikroRNK, antismisaonog oligonukleotida, i plazmida sposobnog da eksprimira siRNK, mikroRNK, ili antismisaoni oligonukleotid, i u kojem siRNK, mikroRNK, ili antismisaona RNK obuhvata oligonukleotid koji se specifično vezuje za polinukleotid koji kodira polipeptid, ili njegov komplement, tako da se redukuje ekspresija tog polipeptida.
[0138] Nukleinska kiselina može alternativno biti plazmid koji kodira polipeptid ili njegovu funkcionalnu varijantu ili fragment, tako da se ekspresija polipeptida ili njegove funkcionalne varijante ili fragmenta povećava.
[0139] U povezanim primerima izvođenja, ovaj opis obezbeđuje postupak, koji nije primer izvođenja pronalaska za koji se traži zaštita, lečenja bolesti ili poremećaja okarakterisanog prekomernom ekspresijom polipeptida kod subjekta, koji obuhvata obezbeđivanje subjektu farmaceutske kompozicije ovog pronalaska, u kojoj je terapeutski agens odabran od siRNK, mikroRNK, antismisaonog oligonukleotida, i plazmida sposobnog da eksprimira siRNK, mikroRNK, ili antismisaoni oligonukleotid, i u kojoj siRNK, mikroRNK, ili antismisaona RNK obuhvata oligonukleotid koji se specifično vezuje za polinukleotid koji kodira polipeptid, ili njegov komplement.
[0140] U još jednom povezanom primeru izvođenja, ovaj opis ukjljučuje postupak, koji nije primer izvođenja pronalaska za koji se traži zaštita, lečenja bolesti ili poremećaja okarakterisane podekspresijom polipeptida kod subjekta, koji obuhvata obezbeđivanje subjektu farmaceutske kompozicije ovog pronalaska, u kojoj terapeutski agens je plazmid koji kodira polipeptid ili njegovu funkcionalnu varijantu ili fragment.
2
Primeri
Primer 1 (Referentni primer)
[0141] Lipozom/RNK nanočestice i samo lipid nanočestice pripremljene su pozivanjem na Fig.1 u raznim graduisanim meračima u opsegu od 20L do 200L upotrebom 2 različite siRNK.
[0142] Zaliha lipidnog rastvora umešana je kako sledi. Sve lipidne komponente (katjonski lipid, DOPE, holesterol, PEG konjugovan lipidi, i diVA-PEG750-diVA rastvoreni su u apsolutnom etanolu do masene koncentracije od 4.5 mg/mL. Lipidi u etanolu su podignuti od 35 do 40° C i mešaju se dok se vidno ne rastvore.
[0143] Lipidni rastvor se pumpa iz posude zalihe lipida kroz 0.45/0.22 µm Filter u posudu zalihe filtriranih lipida.
[0144] siRNK je rastvorena u 50 mM citratnom puferu u posudi zalihe siRNK pri koncentraciji od 0.26 mg/mL ili 0.16 mg/ml zavisno od konačnog odnosa siRNK prema lipidu. siRNK rastvor se pumpa iz posuda zalihe siRNK kroz 0.45/0.22 µm Filter u posudu lipozomske siRNK u 35% etanolu.
[0145] Posuda lipozomske siRNK u 35% etanolu dovodi se do 35 do 40° C uz kontinulano mešanje sadržaja. Lipidni rastvor se napsrkava na površinu siRNK koja sadrži pufer upotrebom mlaznica da bi se spontano formirali siRNK opterećeni lipozomi. Lipidi su kombinovani sa siRNK da bi se dostigao konačan ukupan odnos lipid prema siRNK ili od 14:1 ili od 9:1 (masa:masa) i koncentracija etanola od 35%.
[0146] Taj lipozomski rastvor zatim je razblažen sa 0.22 µm filtriranog PBS pufera u 20 litarskog Flex Boy kesi za jednokratnu upotrebu do konačne koncentracija etanola od približno 10%. Rezultujući lipozomski rastvor koncentrovan je i zatim dijafiltriran u odnosu na 10x zapremina PBS radi uklanjanja etanola i izmenjivačkog pufera. Ukupne faze koncentrovanja i dijafiltracije izvode se upotrebom Quattro Flow (dijafragme) pumpa opremljena sa komorom pupme za jednokratnu upotrebu , fleksibilni cevovod za jednokratnu upotrebu, i patrone sa membranom od šupljih vlakana, za jednokratnu upotrebu. Konačna suspenzija je filtrirana kroz 0.45/0.22 µm Filter za redukciju bioopterećenja u konačnu bocu za sakupljanje za jednokratnu upotrebu. Rezultati su prikazani u Tabeli 1.
Tabela 1
2
Priprema lipozoma
[0147] U jednom primeru izvođenja, mešavina lipida je mešavina katjonskih amino lipida, neutralnih lipida (različitih od amino lipida), steroidni (npr., holesterol), i PEG-modifikovani lipid (npr., PEG-S-DMG, PEG-C-DOMG ili PEGDMA) koji su zajedno rastvoreni u organskom rastvaraču, koji je etanol. U poželjnim primerima izvođenja, lipidna mešavina se sastoji suštinski od katjonskog amino lipida, neutralnog lipida, holesterola i PEG-modifikovanog lipida. U daljim poželjnim primerima izvođenja, lipidna mešavina se sastoji od katjonskog lipida, DOPE (ili još jedan pomoćni lipid, bilo sa jonizabilnim ili trajnim katjonskim naelektrisanjem), holesterol i PEG-konjugovani lipid ri raznim molarnim odnosima. Poželjni molarni opsezi su između 40 do 60 mol% katjonski lipid, 10 do 30% neutralni lipid, 20 do 40% holesterola, i 1 to 10% PEG-modifikovani lipid. Ciljajući lipid može se dodati u lipidnu mešavinu, npr., diVA-PEG750-diVA (ili ostali VA-konjugovan ciljajući lipid) pri molarnom odnosu od 0.1 do 5 (ciljajući lipid:ukupan lipid).
Lipidna mešavina takođe može da uključuje mešavinu polimera ili pomoćna sredstva za preradu koja mogu biti prirodnog (npr., hitosan) ili sintetičkog (npr. PEI) porekla. Ukupna koncentracija lipida manja je od 25 mg/ml, poželjno manja od 5mg/ml. Lipidna mešavina filtrira se kroz membranu, npr.0.45 ili 0.2 µm filter.
[0148] U skladu sa jednim primerom izvođenja ovog pronalaska, lipidna mešavina se kombinuje sa puferovanim vodenim rastvorom nukleinske kiseline. Puferovani vodeni rastvor može biti rastvor u kojem pufer ima pH manju od pKa protonatabilnog lipida u lipidnoj mešavini. Primeri pogodnih pufera uključuju citratne, fosfatne, acetatne, i MES. Naročito poželjan pufer je citratni pufer. Poželjni puferi biće u koncentracionom opsegu od 1-1000 mM anjona, zavisno od hemije nukleinske kiseline koja se inkapsulira, a optimizacija koncentracije pufera može biti značajna za postizanje visokih nivoa unosa. Alternativno, čista voda zakišeljena do pH 5-6 sa HCl, H2SO4, ili slično, može se koristiti. Ona može biti pogodna u ne-jonskom rastvoru koji bi balansirao osmotski potencijal između čestica membrane, npr.,
2
da kada se čestice dijalizuju radi uklanjanja etanola, poveća se pH, ili meša se sa farmaceutski prihvatljivim nosačem kao što je normalni slani rastvor. Pufer takođe može da uključuje pomoćna sredstva za preradu (npr. poloksamere, surfaktante, deterdžente), agense za punjenje (npr., manitol) ili krioprotektante (npr., saharoza, trehaloza, galaktoza, inulin). Količina nukleinske kiselina u puferu je od oko 0.08 do 0.8 mg/mL.
[0149] U trenutku dodavanja etanola, temperatura vodenog rastvora i etanola je 25 do 45° C, poželjno 30 do 40° C. Rastvor etanola dodaje se u vodeni rastvor kroz tečnost-tečnost međuprostor, a etanol je dostavljen kroz cev ili mlaznicu koja je potopljena u vodeni rastvor.
[0150] Organski rastvor dodaje se pumpom koja dostavlja organski rastvor u vodeni rastvor pri kontrolisanoj brzini, poželjno konstantnoj brzini. Isporuka organskog okončava se kroz 1 minut do 100 minuta, poželjno od 2 do 20 minuta. Organski rastvor može biti dodat kroz jednu prskalicu ili mlaznicu, ili kroz sistem sa više prskalica ili mlaznica. Prečnik prskalice jedno (ili više mlazničkog niza) može biti od 10 do 1000 µm, poželjno od 300 do 600 µm. Dodavanje se može izvesti primenjivanjem od 0 do 30 psi u organskom toku radi pomaganja dispergovanja. Dok se organski rastvor dodaje u vodeni rastvor, rezultujući rastvor meša se umešavanjem ili recirkulacijom. Faza dodavanja rezultuje u konačnoj koncentraciji koja je 25 do 45% etanol, najpoželjnije 35% etanol.
[0151] Konačni rastvor tretira se radi uklanjanja organskog rastvarača, dijalizom ili poželjno dijafiltiranjem. Dok se uklanja etanol, vodeni rastvor se konvertuje u nekom puferu pri neutralnoj pH, pH 6.8 do pH 7.5, poželjno, pH 7.2, na primer fosfatni pufer. Pufer takođe može da uključuje pomoćna sredstva za preradu (npr. poloksamere, surfaktante, deterdžente), agense za punjenje (npr., manitol) ili krioprotektante (npr., saharoza, trehaloza, galaktoza, inulin). Rezultujući vodeni rastvor poželjno je sterilisan pre odlaganja ili upotrebe, npr., filtriranjem kroz 0.22 µm filter.
[0152] Ovaj postupak proizvodnje lipozoma može biti korišćen u vezi sa vodom SUS koji obuhvata sistem SUS pod-jedinica. Ovaj sistem vodova može da obuhvata sledeće pod-jedinice: lipidna jedinica za mešanje koja se sastoji od kese za mešanje lipida za pripremanje lipidnog rastvora u organskom rastvaraču mešljivim sa vodom, kesu za držanje lipida, i sredstva za transferovanje lipidnog rastvora iz lipidne jedinice u lipidnu rezervoarsku jedinicu; RNK jedinica za mešanje koja se sastoji od kese za mešanje RNK za pripremanje RNK rastvora, kesa za držanje RNK, i sredstva transferovanja RNK rastvora iz RNK jedinice u RNK rezervoarsku jedinicu; sredstva transferovanja lipidnog rastvora iz kese za držanje lipida u RNK rastvor; i sistem za diafiltraciju koji se sastoji of membrana od šupljih vlakana, digafragmna pupma sa pristupačnom glavom, i razne kese za držanje.
[0153]SUS oprema može biti pred-sterilisana i upravljana upotrebom sterilnih konekcija/diskonekcija za proizvodnju lipozoma upotrebom aseptičnog postupka. Aseptična prerada eliminiše potrebu za konačnom sterilnom (0.22 µm) filtracijom. Odsustvo 0.22 µm filtera omogućava veću opseg veličina
2
čestica (> 200 nm) da se obradi i time se rešavaju bilo kakvi mogući problemi koji su povezani sa kompatibilnošću filter/proizvod leka.
Primer 2: Efekat koncentracije na veličinu RNK-lipidne čestice.
(Referentni primer)
[0154] Ovaj primer opisuje efekat siRNK i lipidne koncentracije na veličinu čestice.
[0155] Da bi se pripremile nanočestice ovde opisanim postupkom. Katjonski lipid, DOPE, holesterol, PEG-BML, i diVA-PEG750-diVA rastvoreni su u apsolutnom etanolu pri molarnom odnosu od 50:10:38:2:5, respektivno. SiRNK je rastvorena u 50 mM citratnom puferu pri pH 4.5.
[0156] siRNK-sadržavajući pufer dovodi se do 35 do 40° C uz kontinulano mešanje u posudi za mešanje. Etanol/lipidna mešavina zatim je poprskana na površinu siRNK koja sadrži pufer upotrebom voda/niza mlaznica radi spontanog formiranja siRNK opterećenih lipozoma. Lipid i RNK koncentracije su podešene da bi se dostigao konačan opseg siRNK koncentracije od 0.05 do 0.5 mg/mL, lek:lipid odnos od 0.08 (masa:masa), i koncentracija etanola od 35%. Odnos lipid prema siRNK održavan je konstantnim u svim testiranim uslovima.
[0157] siRNK opterećeni lipozomi razblaženi su u ∼10% etanolu radi stabilizacije čestica a zatim dijafiltrirani prema 10X zapreminama od PBS (pH 7.2) radi radi uklanjanja etanola i izmene pufera. Krajnji proizvod filtriran je kroz 0.22 µm, sterilizacionog razreda, PES filter za redukciju bioopterećenja. Zapremina, srednja veličina čestica i indeks polidisperznosti (PDI) određeni su upotrebom dinamičnog raspršivanja svetlosti (DLS). Rezultati su prikazani u Tabeli 2.
Tabela 2.
[0158] Rezultati pokazuju da se veličina čestice povećava sa povećavanjem siRNK Koncentracije (u mg/ml). Redukovanjem koncentracije lipida i siRNK (održavajući istog relativnog odnosa) redukuje se veličina čestica, dok se povećavanjem koncentracije povećava veličina čestice. Konačne siRNK koncentracije između 0.05 do 0.5 mg/ml proizvode nanočestice sa srednjim prečnikom čestice od 96.7 do 141.9 nm, manje od 150 nm, i sa indeks polidisperznosti manjim od 0.2 u svim slučajevima.
[0159] Veličina čestica manja od 150 nm sa PDI manjim od 0.2 proizvedi se ovde opisanim postupkom, bez pripremanje praznih prethodno formiranih nosača lipida i/ili bez mehaničke prerade.
Primer 3: Efekat parametara prerade na formiranje RNK-lipidnih čestica
(Referentni primer)
[0160] Ovaj primer opisuje efekat raznih parametara prerade na formiranje RNK-lipidnih čestica. Nekoliko parametara skrinovano je tokom ovog eksperimenta, ukjljučujući temperaturu, koncentraciju etanola, pufer, lipid:siRNK odnos, i tip mlaznica korišćen za dispegovanje lipidnog rastvora.
[0161] HEDC, DOPE, holesterol, PEG-BML, i diVA-PEG750-diVA rastvoreni su u apsolutnom etanolu pri molarnom odnosu od 40:30:25:5:2. siRNK koja sadrži pufer dovedena je do naznačene temperature uz kontinulano mešanje u posudi za mešanje. Etanol/lipidna mešavina zatim je poprskana na površinu siRNK koja sadrži pufer upotrebom mlaznica radi spontanog formiranja siRNK opterećenih lipozoma. Lipidi su kombinovani sa siRNK da bi se dostigla konačna siRNK koncentracija od 0.1 mg/mL pri indikovanom lek/lipid odnosu i indikovanom konačnom procentu etanola.
[0162] siRNK je rastvorena u citratnom puferu koji varira u jačini od 25 do 100 mM i pH 3.5 do pH 6.5. Temperatura mešavine varira od 25 do 45° C. Konačna koncentracija etanola varira od 25 do 45%. Lek:lipid odnos (masa/masa) varira od 0.07 do 0.11. Prečnik hidratacione mlaznice (ID) varira od 0.005 do 0.125 inča. Svaki uslov izvodi se kao merenje u poređenju sa efektom svakog parametra prerade. Ukoliko nije naznačeno, svaki uslov izvodi se u 50 mM citratnom puferu, pH 4.5, 35° C., 35% konačnog etanola, lek:lipid odnosu od 0.07, i mlaznicama ID od 0.005 inča.
[0163] siRNK opterećeni lipozomi razblaženi su u 10% etanolu radi stabilizacije čestica a zatim dijafiltrirani u odnosu na 10X zapremine PBS (pH 7.2) radi uklanjanja etanola i izmene pufera. Krajnji proizvod filtriran je kroz 0.22 µm, sterilizacionog razreda, PES filter za redukciju bioopterećenja.
[0164] Tabela 3 pokazuje efekat pH na srednji prečnik i PDI lipid-nukleinska kiselina nanočestica. Povećavajuća pH pufera rezultuje u povećanju veličine čestica, čak manje od 150 nm srednje veličine čestice.
Tabela 3
1
[0165] Tabela 4 prikazuje efekat koncentracije pufera na razne parametre. Rezultati pokazuju da povećanje koncentracije pufera redukuje siRNK izolovanje. Srednji prečnik čestica i PDI čine se neizmenjenim. Minimalna veličina čestice primećena je za pH 3.5, a maskimalno siRNK izolovanje primećeno je za 25 mM citratni pufer.
Tabela 4
[0166] Tabela 5 prikazuje that povećanje temperature hidracije od 25 do 45° C. snižava veličinu čestica od 135.7 do 102.2 nm dok poboljšava siRNK izolovanje od 80% do 87%. Povećanje konačnog procenta etanola povećava veličinu čestica bez efekta na siRNK izolovanje, ali redukuje efikasnost inkapsulacije do 88%.
Tabela 5
[0167] Tabela 6 prikazuje da povećanje lek:lipid odnosa smanjuje, siRNK izolovanje povećano od 80 do
2
87%. Maksimalno izolovanje primećeno je pri odnosu od 0.07 lek:lipid (masa:masa). Sve ostale merne karakteristike nisu bile izmenjenje lek:lipid odnosom. Ovaj rezultat je začuđujuć i neočekivan u pogledu opisa Maurer et al. i Semple et al., koji opisuju da je optimalno izolovanje lek:lipid (masa:masa) jednako ili veće od 0.16 (lipid:lek (masa:masa) jednako ili manje od 6.25). Trenutni rezultati sugerišu da je suprotan trend dobijen upotrebom ovde opisanog postupka.
Tabela 6
[0168] Tabela 7 prikazuje da povećanje mlaznica ID 25 puta nije uticalo na na veličinu čestica, efikasnost inkapsulacije ili siRNK izolovanje. Postoji potpuna fleksibilnost u pogledu mlaznica prskalica koje se koriste za dodavanje etanola/lipida u pufersku površina. Ova fleksibilnost mogla bi da obezbedi glavnu prednost tokom podizanja na veću skalu.
Tabela 7
Primer 4: Poređenje opisanog postupka sa refenetnim serijskim postupcima
(Referentni primer)
Proizvodnja lipozoma
[0169] Ovi rezultati porede postupak opisan ovde za pripremanje čestica lipid/nukleinska kiselina u postupku opisanom od strane Semple, et al. US Patent 6,858,225 (kontrolni postupak ili kontrolna kompozicija korišćena kontrolnim postupkom) koje su pripremljene u skladu sa kompozicijom Primera 3 ili upotrebom kontrolnog postupka.
[0170] Kompozicija iz Primera 3 koja se sastoji od katjonskog lipida, DOPE, holesterola, PEG konjugovanog lipida, i ciljajućeg lipida zajednički rastvoreni pri molarnom odnosu od 40:30:25:5:2 (videti Primer 2, gore).
[0171] Kontrolna kompozicija sastoji se od DODAP, DSPC, holesterola, i PEG-CER-14, zajednički rastvoreni pri molarnom odnosu od 25:20:45:10.
[0172] U postupku iz Primera 3, lipidi su rastvoreni pri 4.32 mg/ml u apsolutnom etanolu, a siRNK je rastvorena pri 0.163 mg/ml u 50 mM citratu, pH 4.5. siRNK rastvor dovodi se do 35 do 40° C uz kontinulano mešanje u posudi za mešanje. Etanol/lipidna mešavina zatim je poprskana na površinu siRNK koja sadrži pufer upotrebom vode/niza mlaznica. Konačna koncentracija etanola bila je 35% a konačni lipid/siRNK odnos bio je 14:1 (masa:masa). Rezultujući čestice zatim su razblažene u 10% etanolu, a zatim dijafiltrirane u 10x zapreminama od PBS (pH 7.2).
[0173] U kontrolni postupak, lipidi su rastvoreni pri 25 mg/ml u apsolutnom etanolu, a siRNK je rastvorena pri 4.17 mg/ml u 300 mM citratu, pH 4.0. siRNK koja sadrži pufer održavana je na sobnoj temperaturi uz kontinulano mešanje u posudi za mešanje. Etanol/lipidna mešavina zatim je poprskana na površinu siRNK koja sadrži pufer upotrebom jedne mlaznice radi spontanog formiranja siRNK opterećenih lipozoma. Konačna koncentracija etanola bila je 40%, a konačni lipid/siRNK odnos bio je 6:1 (masa:masa). Posle mešanja, lipid/siRNK suspenzija transferiše se u 10 mL istiskivač pripremljen sa dve, 100 nm polikarbonatne membrane i prethodno ekvilibrisane na 65° C. Ta suspenzija se istiska upotrebom deset prolaza pri 300 psi. Rezultujuće čestice dijafiltrirane su u 10x zapreminama od PBS, pH 7.2.
[0174] Čestice koje su rezultat svakog postupak provučene su kroz 0.22 µm filter. Srednja veličina čestice, PDI, i EE merene su kako je ovde opisano.
[0175] Postupak iz Primera 3 proizvodi manje lipidne nanočestice od kontrolnog postupka bez faze istiskivanja. Veličina čestica proizvedena kontrolnim postupkom merena je pre istiskivanja. Čestice pripremljen iz NDT-0009 kompozicije upotrebom kontrolnog postupka imale su srednju veličinu čestica veću od 250 nm čestica. Posle istiskivanje i diafiltracije, srednja veličina čestica redukovana je na 128 nm. Postupak iz Primera 3 proizvedi čestice sa srednjom veličinom čestica manjom od 150 nm bez istiskivanja. Sličan trend primećen je počevši sa kontrolnom kompozicijom.
[0176] Postupak iz Primera 3 bio je efikasniji u inkapsulaciji siRNK u lipidnim nanočesticama od kontrolnog postupka. Efikasnost inkapsulacije (EE) čestica pripremljenih postupkom iz Primera 3 viša je od onih formiranih kontrolnim postupkom (merene pre diafiltracije u oba proizvoda). EE čestica pripremljenih postupkom iz Primera 3 veća je od 95% viša od one pronađene za čestice formirane
4
kontrolnim postupkom. U kontrolnom postupku, veći deo slobodne siRNK se uklanja posle diafiltracije što rezultuje u poboljšanju EE konačnog proizvoda.
[0177] Postupak iz Primera 3 proizvodi nanočestice sa višom efikasnošću inkapsulacije od kontrolnog postupka. Konačno izolovanje siRNK postupkom iz Primera 3 bilo je veće od dvostrukog koje je obezbeđeno kontrolnim postupkom (72% vs.33%), kako je izmereno posle diafiltracije u oba proizvoda. Ovi podaci pokazuju poboljšanje u EE kao i izostavljanje faze istiskivanja u postupku iz Primera 3.
Postupak iz Primera 3 obezbeđuje bolje siRNK izolovanje jer dodatna faza istiskivanja kontrolnog postupka strukturalno menja te lipozome, i očigldno izdvaja siRNK iz čestica. Ovi rezultati pokazuju da ovde opisan postupak obezbeđuje nekoliko prednosti u odnosu na kontrolni postupak redukovanjem broja faza postupaka uz poboljšavanje efikasnosti inkapsulacije i daje nanočestice sa srednjom veličinom čestica manjom od 150 nm.
Primer 5: Poređenje varijabilnosti Tokom podizanja skale na serijsku proizvodnju lipozoma (Referentni primer)
[0178] Postupak kao što je opisano u Primeru 3 izvodi se sa različitim lipidnim kompozicijama koje uključuju kombinacijo trajno naelektrisanog (HEDC) katjonskog lipidnog i jonizabilnog (S104) katjonskog lipidnog molekula. HEDC, S104, DOPE, holesterol, PEG-BML, i diVA-PEG750-diVA rastvoreni su u apsolutnom etanolu pri molarnom odnosu od 20:20:30:25:5:2. Tokom podizanja skale, različiti siRNK molekuli, različite zapremine šarže, i različiti siRNK (lek)/lipid odnosi su procenjeni. Tabela 8 sumira rezultate karakterizacije nanočestica koja rezultuje iz spektra uslova.
Tabela 8
[0179] Rezultati pokazuju da postupak opisan ovde je veoma robustan. Slične veličina čestica i PDI dobijene tokom podizanja na veću skalu obuhvataju 50-struki opseg. Veličina čestica konzistentno je manja od 100 nm, sa> 90% prinosima proizvoda. Vrednosti indeksa polidisperznosti veoma su niskog opsega, što ukazuje na gotovo monodisperznu populaciju nosača.
Primer 6: Poređenje varijabilnosti tokom podizanja skale na serijsku proizvodnju lipozoma za formulacije koje sadrže saharozu
[0180] Postupak kao što je opisan u Primeru 3 izvodi se sa HEDC, S104, DOPE, holesterolom, PEG-BML, i diVA-PEG750-diVA rastvorenim u etanolu pri molarnom odnosu od 20:20:30:25:5:2. Saharoza je uključen u pripremanje nosača kao što je opisano ovde. Različie zapremine šarži procenjene su i podvrgnute zamrzavanju-odmrzavanju. Tabela 9 sumira rezultate karakterizacije nanočestica koja rezultuje iz spektra uslova.
Tabela 9
[0181] Rezultati pokazuju zamrzavanje odmrzavanje nije promenilo osobine lipidnih nanočestica.
Rezultati takođe pokazuju da varijabilitet između šarži je veoma nizak i da postupak reproduktibilno proizvodi uniformne nanočestice.
[0182] Uslovi su utvrđeni za stabilizaciju lek: lipidne čestice liofilizacijom. Lek:lipidne čestice pripremljene u skladu sa Primerom 2 mogle bi biti liofilizovane bez gubitka aktivnosti. Konačna koncentracija saharoze u kojoj su formirane lek:lipidne čestice bila je 8% (w/v). Liofilizovani preparati rekonstituisani su dodavanjem destilovane vode, a posle je merena njihova transfekciona aktivnost u plućima miševa posle i.v. injektovanja. Zamrzavanje i odmrzavanje rekonstituisanog pripravka nije uticalo na aktivnost. Rezultati prikazani u Tabeli 10 pokazuju da čestice pripremljene korišćenjem ovde opisanog postupka čuva njihove karakteristike tokom liofilizacije, i prema tome su stabilne. Specifično, veličina čestice je stabilizovana i sačuvana pre, tokom, i posle liofilizacije.
Tabela 10
[0183] Stabilnost čestica je funkcija lipidne kompozicije, lipid:RNK (masa:masa) vrednosti, i odabira polisaharida korišćenog u formulaciji. Metodološki pristup opisan ovde za proizvodnju stabilnih formulacija lipid:RNK kompleksa koji ispoljavaju visoku biodostupnost in vivo potvrđuje prednosti za utvrđivanje farmaceutski prihvatljivih preparata, i prema tome olakšava RNK isporuku na bazi lipozoma.
Primer 7: Potopljeno injektovanje lipida (Referentni primer)
[0184] Postupak kao što je opisan u Primeru 3 izvodi se modifikovan pripremanjem nosača upotrebom potopljenog injektovanja. HEDC, S104, DOPE, holesterol, PEG-BML, i diVA-PEG750-diVA rastvoreni su u etanolu pri molarnom odnosu od 20:20:30:25:5:2. Tabela 11 sumira rezultate karakterizacija nanočestice koja rezultuje iz postupka potopljenog dodavanja u poređenju sa postupkom površinskog dodavanja. Rezultati pokazuju začuđujuć i neočekivan rezultat koji se ogleda u tome što se srednja veličina čestica suštinski smanjuje kada su lipidi dodati vodenoj fazi potopljenim injektovanjem.
Tabela 11
[0185] Isti proizvodni postupak korišćen za pripremanje lipozoma koji sadrže saharozu u puferu. Tabela 12 sumira rezultate karakterizacije nanočestica koje rezultuje iz različitih vremena dodavanja, a Tabela 13 sumira rezultate karakterizacije nanočestica pripremljenih upotrebom površinskog u poređenju sa potopljenim dodavanjem.
Tabela 12
Tabela 13
[0186] Rezultati pokazuju začuđujuć i neočekivan rezultat koji se ogleda u tome što se srednja veličina čestica suštinski snižava kada se lipidi dodaju vodenoj fazi potopljenim injektovanjem sa vremenom dodavanja od manje od 2 minuta. Rezultati takođe pokazuju začuđujuće i neočekivane rezultate koji se ogledaju u tome što se srednja veličina čestica suštinski smanjuje kada se lipidi dodaju vodenoj fazi potopljenim injektovanjem.

Claims (3)

Patentni zahtevi
1. Postupak za sterilno pripremanje nanočestice lipid-nukleinska kiselina pod aseptičnim uslovima, koji obuhvata upotrebu sistema koji obuhvata komponente za jednokratnu upotrebu, koji obuhvata:
prvu rezervoarsku jedinicu za organski lipidni rastvor koji obuhvata lipide u organskom rastvaraču mešljivim sa vodom;
drugu rezervoarsku jedinicu za vodeni rastvor koji obuhvata terapeutski lek;
jedinicu za mešanje sa statičkom mešalicom;
injekciona sredstva za dodavanje tog organskog lipidnog rastvora iz prve rezervoarske jedinice u komoru za mešanje na način da se formira gradijent koncentracije organskog rastvarača rastvora u jedinici za mešanje, tako da je povećanje postepeno od injekcione-početne vrednosti do injekcione-konačne vrednosti;
treću rezervoarsku jedinicu za vodeni pufer;
jedinicu za razblaživanje;
jedinicu za koncentrovanje koja obuhvata protočni filter za koncentrovanje suspenzije lipozoma i uklanjanje organskog rastvarača; i
posudu za jednokratnu upotrebu za sakupljanje koncentrovane suspenzije lipozoma posle uklanjanja organskog rastvarača;
i u kome se sve komponente ovog sistema, koji su u kontaktu sa lipidima, lekovima, rastvaračima i puferima sterilišu i raspoložive su tako da budu prilagođene za upotrebu u jednoj šarži;
pri čemu se ovaj postupak izvodi tako da
je sa vodom mešljiv organski rastvarač etanol;
jedinica za mešanje sadrži vodeni rastvor leka, a lipidni rastvor se postupno dodaje u rastvor leka u jedinici za mešanje čime se formira pomenuti gradijent tako da se isporuka organskog rastvora okončava za 1 minut do 100 minuta, tako da se dostigne RNK:lipid odnos od 0.06 do 0.16 (masa:masa) i tako da se postigne konačna koncentracija etanola od 25-45%; i
pri čemu se lipid-lek mešavina transferiše u jedinicu za razblaživanje i razblažuje dodavanjem vodenog pufera.
2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu lipidi obuhvataju katjonski lipid, neutralni lipid, sterol, i polietilen (PEG)-lipid konjugat, pri čemu lipidi opciono dalje obuhvataju ciljajući lipid odabran iz grupe koju čine folna kiselina, vitamin E, jedinjenja sledeće formule (A) i jedinjenja sledeće formule (B):
L-X-R (A)
4
u kojoj je lipid (L) odabran iz grupe koju čine DSPE, DOPE, i DC; linker (X) je odabran iz grupe koju čine ništa, PEG550, PEG2000, PEG-glutamat (-Glu), Glu, glicin, i GluNH, i N1,N19-bis(3-(2-(2-(3-aminopropoksi)etoksi)etoksi)propil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid; i retinoid (R) je odabran iz grupe koju čine tretinoin, adapalen, retinol, 4-hidroksi(fenil)retinamid (4-HPR), retinoinska kiselina (vitamin A), 9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanska kiselina, 3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanska kiselina, 3,7- dimetil-9-(2,2,6-trimetilcikloheksil)nonanska kiselina;
R-X-R (B),
u kojoj linker (X) pretstavlja N1,N19-bis(3-(2-(2-(3-aminopropoksi)etoksi)etoksi)propil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid ("bisamido-PEG") ili N1,N19-bis(16,20-diamino-15-okso-4,7,10-trioksa-14-azaikozil)-4,7,10,13,16-pentaoksanonadekan-1,19-diamid ("liz-bisamido-PEG-liz"); i retinoid (R) je odabran iz grupe koju čine tretinoin, adapalen, retinol, 4-hidroksi(fenil)retinamid (4-HPR), i retinoinska kiselina (vitamin A), 9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanska kiselina, 3,7-dimetil-9-(2,6,6-trimetilcikloheks-1-en-1-il)nonanska kiselina, 3,7-dimetil-9-(2,2,6-trimetilcikloheksil)nonanska kiselina.
3. Postupak prema bilo kom od zahteva 1 i 2, pri čemu je terapeutski lek dsRNK molekul.
RS20190426A 2011-11-04 2012-11-02 Postupak za sterilnu proizvodnju čestica lipid-nukleinska kiselina RS58562B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161556124P 2011-11-04 2011-11-04
EP12829180.4A EP2773326B1 (en) 2011-11-04 2012-11-02 Method for sterilely producing lipid-nucleic acid particles
PCT/IB2012/002916 WO2013064911A2 (en) 2011-11-04 2012-11-02 Single use system for sterilely producing lipid-nucleic acid particles

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58562B1 true RS58562B1 (sr) 2019-05-31

Family

ID=47178988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190426A RS58562B1 (sr) 2011-11-04 2012-11-02 Postupak za sterilnu proizvodnju čestica lipid-nukleinska kiselina

Country Status (22)

Country Link
US (1) US8956572B2 (sr)
EP (4) EP3485875A1 (sr)
JP (3) JP6133883B2 (sr)
KR (2) KR102056702B1 (sr)
CN (2) CN103906504B (sr)
AU (2) AU2012356239B2 (sr)
CA (2) CA2853689C (sr)
CY (1) CY1121495T1 (sr)
DK (1) DK2773326T3 (sr)
ES (1) ES2721325T3 (sr)
HR (1) HRP20190481T1 (sr)
HU (1) HUE043809T2 (sr)
LT (1) LT2773326T (sr)
PL (1) PL2773326T3 (sr)
PT (1) PT2773326T (sr)
RS (1) RS58562B1 (sr)
RU (2) RU2647476C2 (sr)
SI (1) SI2773326T1 (sr)
SM (1) SMT201900197T1 (sr)
TR (1) TR201904389T4 (sr)
TW (3) TWI615156B (sr)
WO (2) WO2013064911A2 (sr)

Families Citing this family (145)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DE19216461T1 (de) 2011-10-03 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US9320297B2 (en) 2012-03-22 2016-04-26 Lemniscate Innovations Llc Spherification/reverse spherification automated and integrated system and method
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
HRP20181855T1 (hr) 2012-06-08 2018-12-28 Nitto Denko Corporation Lipidi za formulacije namijenjene unosu terapijskog sredstva
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
AU2014215421A1 (en) 2013-02-05 2015-08-13 1Globe Health Institute Llc Biodegradable and clinically-compatible nanoparticles as drug delivery carriers
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
CA2917348A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3041934A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US10195291B2 (en) 2013-09-24 2019-02-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the manufacture of lipid nanoparticles
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
CN103599549A (zh) * 2013-11-22 2014-02-26 大连民族学院 一种siRNA/抗癌药物联合转运复合载体及其制备方法和应用
US20170143848A1 (en) * 2014-03-24 2017-05-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for the treatment of ocular diseases
PL4023249T3 (pl) 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
BR112016030852A2 (pt) * 2014-07-02 2018-01-16 Shire Human Genetic Therapies encapsulação de rna mensageiro
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
CN106794141B (zh) * 2014-07-16 2021-05-28 诺华股份有限公司 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
WO2016045732A1 (en) * 2014-09-25 2016-03-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stable formulations of lipids and liposomes
BR112017014090A2 (pt) * 2014-12-29 2018-03-06 Bonac Corporation composição, e, métodos para produção de uma composição e estabilização de uma molécula de ácido nucleico.
WO2016138175A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The University Of British Columbia Continuous flow microfluidic system
EP3288671A4 (en) 2015-04-28 2019-01-16 The University Of British Columbia DISPOSABLE MICROFLUIDIC CARTRIDGE
EP4660315A3 (en) 2015-05-29 2026-03-18 CureVac Manufacturing GmbH A method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration
HUE053990T2 (hu) * 2015-07-22 2021-08-30 Nitto Denko Corp Nanorészecske liofilizált formák készítményei és eljárások
US11564893B2 (en) 2015-08-17 2023-01-31 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
US9938572B1 (en) * 2015-09-08 2018-04-10 Raindance Technologies, Inc. System and method for forming an emulsion
EP3350333B2 (en) 2015-09-17 2025-08-06 ModernaTX, Inc. Polynucleotides containing a stabilizing tail region
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
PL3386484T3 (pl) 2015-12-10 2022-07-25 Modernatx, Inc. Kompozycje i sposoby dostarczania środków terapeutycznych
LT3394030T (lt) 2015-12-22 2022-04-11 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
PL3394093T3 (pl) 2015-12-23 2022-05-16 Modernatx, Inc. Metody stosowania polinukleotydów kodujących ligand ox40
EP3400097B1 (en) 2016-01-06 2021-01-27 The University Of British Columbia Bifurcating mixers and methods of their use and manufacture
MA43587A (fr) 2016-01-10 2018-11-14 Modernatx Inc Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4
WO2017156420A1 (en) 2016-03-10 2017-09-14 Lonza Ltd Customizable facility
US10689873B2 (en) 2016-03-10 2020-06-23 Lonza Ltd Customizable facility
WO2017223135A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles
CN109563511A (zh) * 2016-06-30 2019-04-02 阿布特斯生物制药公司 用于递送信使rna的组合物和方法
SG11201900528PA (en) * 2016-08-02 2019-02-27 Lonza Ag Customizable facility
WO2018035387A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
EP4485466A3 (en) 2016-08-17 2025-04-02 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US11052158B2 (en) * 2016-08-18 2021-07-06 Troy Bremer Delivery of urea to cells of the macula and retina using liposome constructs
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
EP3315125A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-02 Silence Therapeutics (London) Ltd Lipid nanoparticle formulation
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
WO2018170322A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
EP4186888B1 (en) 2017-03-15 2025-11-26 ModernaTX, Inc. Compound and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2018191750A2 (en) 2017-04-14 2018-10-18 The Broad Institute Inc. Novel delivery of large payloads
WO2018232120A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
WO2019010560A1 (en) * 2017-07-10 2019-01-17 Immmunovaccine Technologies Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS, METHODS OF PREPARATION USING LIPID VESICLE PARTICLES OF A DEFINED SIZE, AND USES THEREOF
WO2019027055A1 (ja) 2017-08-04 2019-02-07 協和発酵キリン株式会社 核酸含有脂質ナノ粒子
JP2019043216A (ja) 2017-08-30 2019-03-22 いすゞ自動車株式会社 ステアリング装置
EP3675817A1 (en) 2017-08-31 2020-07-08 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
RS67724B1 (sr) 2017-10-20 2026-03-31 BioNTech SE Priprema i skladištenje lipozomskih rnk formulacija koje su pogodne za terapiju
WO2019135816A2 (en) 2017-10-23 2019-07-11 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifiers
US11638695B2 (en) 2017-11-01 2023-05-02 Osaka University Development of method and apparatus for producing lipid particles having desired particle diameter
AU2017438994A1 (en) * 2017-11-09 2020-05-28 Immunovaccine Technologies Inc. Pharmaceutical compositions, methods for preparation comprising sizing of lipid vesicle particles, and uses thereof
EP3710039A4 (en) 2017-11-13 2021-08-04 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF CANCER BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH
US10968257B2 (en) 2018-04-03 2021-04-06 The Broad Institute, Inc. Target recognition motifs and uses thereof
WO2019204451A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Carnegie Mellon University Enhanced lipid nanoparticle drug delivery using a negatively charged polymer
KR20210091120A (ko) * 2018-08-29 2021-07-21 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 Mrna-로딩된 지질 나노입자를 제조하는 개선된 공정
CA3113025A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Peg lipids and uses thereof
WO2020061295A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
WO2020061367A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2020061457A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
IL281615B2 (en) * 2018-09-21 2026-01-01 Acuitas Therapeutics Inc Systems and methods for producing lipid nanoparticles and liposomes
HRP20240586T1 (hr) 2018-10-09 2024-07-19 The University Of British Columbia Sastavi i sustavi koji sadrže transfekcijske sposobne vezikle bez organskih otapala i deterdženta i s njim povezanim postupcima
CA3116576A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
CA3112837A1 (en) * 2018-10-19 2020-04-23 Translate Bio, Inc. Pumpless encapsulation of messenger rna
CN118697900A (zh) * 2019-01-31 2024-09-27 摩登纳特斯有限公司 制备脂质纳米颗粒的方法
US12215382B2 (en) 2019-03-01 2025-02-04 The General Hospital Corporation Liver protective MARC variants and uses thereof
US12534714B2 (en) 2019-03-18 2026-01-27 The Broad Institute, Inc. Type VII CRISPR proteins and systems
SG11202110036RA (en) * 2019-03-19 2021-10-28 Arcturus Therapeutics Inc Method of making lipid-encapsulated rna nanoparticles
CN118203546A (zh) 2019-05-07 2024-06-18 米尼翁大学 生产脂质体的方法
WO2020236972A2 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
CN114901253A (zh) 2019-08-14 2022-08-12 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的改进的脂质纳米颗粒
WO2021046265A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions comprising closed-ended dna and cleavable lipids and methods of use thereof
JP7271374B2 (ja) * 2019-09-10 2023-05-11 株式会社東芝 分析方法、分析基体、分析キット及び分析装置。
CA3155015A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Carbonate containing lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
AU2020350759A1 (en) 2019-09-19 2022-03-31 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
US12297426B2 (en) 2019-10-01 2025-05-13 The Broad Institute, Inc. DNA damage response signature guided rational design of CRISPR-based systems and therapies
JP2023502576A (ja) 2019-11-22 2023-01-25 ジェネレーション バイオ カンパニー イオン化可能な脂質およびそれらのナノ粒子組成物
KR102409145B1 (ko) 2020-03-23 2022-06-15 프레스티지바이오로직스 주식회사 항체 의약품 제조 공정을 위한 버퍼 조제 및 이송 시스템
CN111467321A (zh) * 2020-03-26 2020-07-31 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种mRNA核酸类药物胞内递送系统、制备方法和应用
JP7746280B2 (ja) 2020-03-27 2025-09-30 ジェネレーション バイオ カンパニー 新規脂質及びそれらのナノ粒子組成物
BR112022026233A2 (pt) 2020-06-24 2023-01-17 Bristol Myers Squibb Co Processo para sintetizar lipídios catiônicos
ES3054438T3 (en) 2020-07-16 2026-02-03 Acuitas Therapeutics Inc Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
EP4196128A4 (en) * 2020-08-14 2024-06-12 Arcturus Therapeutics, Inc. METHOD FOR FREEZE DILIZATION OF LIPID NANOPARTICLES
IL301253A (en) 2020-09-13 2023-05-01 Arcturus Therapeutics Inc As a mass of large RNA lipid nanoparticles
EP4228658A4 (en) * 2020-10-14 2025-02-19 George Mason Research Foundation, Inc. IONIZABLE LIPIDS AND METHODS FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
CN112843019A (zh) * 2021-01-27 2021-05-28 江苏普瑞康生物医药科技有限公司 一种核酸脂质纳米粒组合物，包含其的药物制剂，及其制备方法和应用
JP2024509743A (ja) * 2021-02-16 2024-03-05 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのための規定サイズのプラスミドＤＮＡ／脂質粒子の調製方法
WO2022175366A1 (en) 2021-02-17 2022-08-25 Secoya Technologies Method for producing lipid nanoparticles and lipid nanoparticles resulting therefrom
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
US20240165044A1 (en) * 2021-04-22 2024-05-23 Inventage Lab Inc. Lipid nanoparticle preparation method and preparation apparatus therefor
KR20240008872A (ko) * 2021-05-06 2024-01-19 아크투루스 쎄라퓨틱스, 인크. Rna 전달을 위한 이온화 가능한 양이온성 지질
AU2022291742A1 (en) 2021-06-14 2023-12-21 Generation Bio Co. Cationic lipids and compositions thereof
EP4412591A1 (en) * 2021-10-06 2024-08-14 leon-nanodrugs GmbH Method for preparing lipid nanoparticles
TW202334080A (zh) 2021-11-08 2023-09-01 美商歐納醫療公司 用於遞送環狀聚核苷酸之脂質奈米粒子組合物
CN116549626A (zh) * 2022-01-27 2023-08-08 深圳瑞吉生物科技有限公司 一种载核酸脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法与应用
US20250327041A1 (en) 2022-02-24 2025-10-23 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
IL316038A (en) 2022-04-04 2024-11-01 Univ California Preparations and methods for genetic complementation
KR102475540B1 (ko) * 2022-04-26 2022-12-08 주식회사 무진메디 약물이 담지된 지질 나노입자 제조 방법 및 제조 장치
EP4536197A1 (en) 2022-06-07 2025-04-16 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
WO2024102730A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024119103A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids and lipid-anchored polymers
WO2024119074A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticle compositions for cell targeting
AU2023406303A1 (en) 2022-12-01 2025-05-29 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids, ionizable lipids, sterols, lipid anchored polymers and helper lipids, their uses
EP4626400A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Generation Bio Co. Novel polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
AU2023398825A1 (en) 2022-12-15 2025-06-26 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2024136254A1 (ko) * 2022-12-20 2024-06-27 (주)인벤티지랩 저농도 이온화 지질을 포함하는 지질나노입자 및 이의 제조 방법
WO2024205657A2 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
EP4705481A2 (en) 2023-05-05 2026-03-11 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2025049690A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Orna Therapeutics, Inc. Circular polyethylene glycol lipids
EP4520345A1 (en) 2023-09-06 2025-03-12 Myneo Nv Product
WO2025052180A2 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
WO2025051994A1 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Coave Therapeutics Ionizable lipid nanoparticles
WO2025072383A1 (en) 2023-09-25 2025-04-03 The Broad Institute, Inc. Viral open reading frames, uses thereof, and methods of detecting the same
WO2025097055A2 (en) 2023-11-02 2025-05-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of t cells in immunotherapy
WO2025101501A1 (en) 2023-11-07 2025-05-15 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2025114520A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Coave Therapeutics Ionizable lipid nanoparticles
EP4570361A1 (en) * 2023-12-11 2025-06-18 Sartorius Stedim Biotech GmbH Device assembly and method for a production-scale tangential flow filtration
WO2025129158A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineered arc delivery vesicles and uses thereof
WO2025166238A1 (en) 2024-01-31 2025-08-07 Orna Therapeutics, Inc. Fast-shedding polyethylene glycol lipids
WO2025250808A1 (en) 2024-05-29 2025-12-04 The Brigham And Women’S Hospital, Inc. Anti-crispr delivery compositions and methods
WO2026003582A2 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
DE102024002527A1 (de) * 2024-08-02 2026-02-05 Rommelag Engineering Gmbh Vorrichtung
WO2026064512A1 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Generation Bio Co. Polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988001864A1 (en) * 1986-09-18 1988-03-24 Liposome Technology, Inc. High-concentration liposome processing method
US4781871A (en) * 1986-09-18 1988-11-01 Liposome Technology, Inc. High-concentration liposome processing method
US4895452A (en) 1988-03-03 1990-01-23 Micro-Pak, Inc. Method and apparatus for producing lipid vesicles
CA2163860A1 (en) * 1993-06-30 1995-01-12 Chung C. Hsu Method for preparing liposomes
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5976567A (en) 1995-06-07 1999-11-02 Inex Pharmaceuticals Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US6395302B1 (en) 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
AU733310C (en) * 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
WO2000029103A1 (en) 1998-11-13 2000-05-25 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production
US6855296B1 (en) 1998-11-13 2005-02-15 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production
BR0012624B1 (pt) 1999-07-15 2011-08-09 métodos para a preparação de agentes terapêuticos envolvidos por lipìdeos.
US7094423B1 (en) 1999-07-15 2006-08-22 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for preparation of lipid-encapsulated therapeutic agents
EP1203614A1 (de) 2000-11-03 2002-05-08 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Lipidvesikeln
DE60132094T3 (de) * 2001-10-26 2012-02-02 Octoplus Polyactive Sciences B.V. Verfahren zur Herstellung von gereinigten Partikeln
US7223887B2 (en) 2001-12-18 2007-05-29 The University Of British Columbia Multivalent cationic lipids and methods of using same in the production of lipid particles
AU2003205048B2 (en) 2002-01-09 2009-02-26 Transave, Inc. Efficient liposomal encapsulation
US6712963B2 (en) 2002-06-14 2004-03-30 Scilog, Llc Single-use manifold for automated, aseptic transfer of solutions in bioprocessing applications
EP1519714B1 (en) * 2002-06-28 2010-10-20 Protiva Biotherapeutics Inc. Method and apparatus for producing liposomes
FR2856940B1 (fr) * 2003-07-04 2007-02-09 Stedim Sa Systeme clos a usage unique de melange, de stockage et d'homogeneisation de liquides en conditions propres ou steriles
WO2005090403A2 (en) * 2004-03-12 2005-09-29 Biovest International, Inc. Method and apparatus for antibody purification
DK1773976T4 (da) 2004-06-04 2020-02-10 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Engangsbioreaktorsystemer og -fremgangsmåder
US7410587B2 (en) 2004-08-03 2008-08-12 Scilog, Inc. Liquid handling for filtration and preparative chromatography
US7404969B2 (en) * 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
CN101267805A (zh) 2005-07-27 2008-09-17 普洛体维生物治疗公司 制造脂质体的系统和方法
CN101346393B (zh) * 2005-11-02 2015-07-22 普洛体维生物治疗公司 修饰的siRNA分子及其应用
JPWO2007117024A1 (ja) 2006-04-11 2009-08-20 株式会社ウイングターフ ガス処理方法
EP1920765A1 (en) 2006-11-07 2008-05-14 Medigene AG Liposome preparation by single-pass process
WO2009086558A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
JP5322476B2 (ja) 2008-03-31 2013-10-23 テルモ株式会社 リポソームの製造装置およびリポソームの製造方法
US8231787B2 (en) 2008-05-06 2012-07-31 Spf Innovations, Llc Tangential flow filtration system
WO2010021865A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
JP2012505913A (ja) 2008-10-16 2012-03-08 マリーナ バイオテック，インコーポレイテッド 遺伝子発現を抑制する治療におけるリポソームによる効率的な送達のプロセスおよび組成物
TW201021853A (en) * 2008-11-17 2010-06-16 Enzon Pharmaceuticals Inc Releasable cationic lipids for nucleic acids delivery systems
WO2010080724A1 (en) * 2009-01-12 2010-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
ES2443147T3 (es) * 2009-01-20 2014-02-18 Med Coat Ab Composición de recubrimiento y su empleo
FR2943560B1 (fr) * 2009-03-24 2011-05-27 Jean Pascal Zambaux Bioreacteur jetable et systeme d'agitation a usage unique
CN107028886A (zh) * 2009-11-04 2017-08-11 不列颠哥伦比亚大学 含有核酸的脂质粒子及相关的方法
EP3318248B1 (en) * 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
EP2525781A1 (en) * 2010-01-22 2012-11-28 Schering Corporation Novel cationic lipids for oligonucleotide delivery
US20130037977A1 (en) 2010-04-08 2013-02-14 Paul A. Burke Preparation of Lipid Nanoparticles
EP2718261B1 (en) * 2011-06-08 2016-02-24 Nitto Denko Corporation Compounds for targeting drug delivery and enhancing sirna activity

Also Published As

Publication number Publication date
CA2853685C (en) 2019-09-03
SMT201900197T1 (it) 2019-05-10
WO2013064911A3 (en) 2013-10-24
AU2012356239A1 (en) 2014-05-29
TWI626952B (zh) 2018-06-21
TWI618548B (zh) 2018-03-21
JP6149041B2 (ja) 2017-06-14
SI2773326T1 (sl) 2019-04-30
CA2853685A1 (en) 2013-05-10
RU2647476C2 (ru) 2018-03-15
EP2773326B1 (en) 2019-02-20
KR20140097276A (ko) 2014-08-06
WO2013064911A2 (en) 2013-05-10
EP3485875A1 (en) 2019-05-22
EP2773328A2 (en) 2014-09-10
KR102046968B1 (ko) 2019-12-02
CN103906504A (zh) 2014-07-02
CN103906504B (zh) 2017-11-17
KR20140101748A (ko) 2014-08-20
RU2642640C2 (ru) 2018-01-25
CN103906503A (zh) 2014-07-02
TR201904389T4 (tr) 2019-04-22
HRP20190481T1 (hr) 2019-05-03
EP3673898A1 (en) 2020-07-01
JP2014534232A (ja) 2014-12-18
CY1121495T1 (el) 2020-05-29
EP2773326A2 (en) 2014-09-10
CA2853689A1 (en) 2013-06-27
TW201731491A (zh) 2017-09-16
ES2721325T3 (es) 2019-07-31
AU2012330819B2 (en) 2017-08-31
TW201325634A (zh) 2013-07-01
WO2013093648A2 (en) 2013-06-27
TWI615156B (zh) 2018-02-21
JP2017165748A (ja) 2017-09-21
US20130164400A1 (en) 2013-06-27
KR102056702B1 (ko) 2019-12-17
RU2014122432A (ru) 2015-12-10
RU2014122433A (ru) 2015-12-10
US8956572B2 (en) 2015-02-17
JP6133883B2 (ja) 2017-05-24
JP6442551B2 (ja) 2018-12-19
AU2012356239B2 (en) 2016-09-22
TW201323020A (zh) 2013-06-16
DK2773326T3 (en) 2019-04-15
PL2773326T3 (pl) 2019-06-28
WO2013093648A3 (en) 2013-10-24
PT2773326T (pt) 2019-04-23
AU2012330819A1 (en) 2014-05-15
CA2853689C (en) 2020-06-30
HUE043809T2 (hu) 2019-09-30
CN103906503B (zh) 2016-12-14
LT2773326T (lt) 2019-04-25
JP2015502345A (ja) 2015-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2012330819B2 (en) Single use system for sterilely producing lipid-nucleic acid particles
US10155945B2 (en) Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
JP2020183411A (ja) 脂質ナノ粒子ホスト中に核酸を封入する方法
US20120021042A1 (en) Efficient Method For Loading Amphoteric Liposomes With Nucleic Acid Active Substances
AU2005326371A1 (en) Composition for inhibiting expression of target gene