TR201904389T4 - Lipit nükleik asit partiküllerinin steril bir şekilde üretilmesine yönelik yöntem. - Google Patents

Lipit nükleik asit partiküllerinin steril bir şekilde üretilmesine yönelik yöntem. Download PDF

Info

Publication number
TR201904389T4
TR201904389T4 TR2019/04389T TR201904389T TR201904389T4 TR 201904389 T4 TR201904389 T4 TR 201904389T4 TR 2019/04389 T TR2019/04389 T TR 2019/04389T TR 201904389 T TR201904389 T TR 201904389T TR 201904389 T4 TR201904389 T4 TR 201904389T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
lipid
sirna
nucleic acid
ethanol
solution
Prior art date
Application number
TR2019/04389T
Other languages
English (en)
Inventor
Knopov Victor
P Witte Richard
Karmali Priya
Lee Robin
Webb David
Original Assignee
Nitto Denko Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nitto Denko Corp filed Critical Nitto Denko Corp
Publication of TR201904389T4 publication Critical patent/TR201904389T4/tr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4833—Encapsulating processes; Filling of capsules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1277—Preparation processes; Proliposomes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/06—Making microcapsules or microballoons by phase separation
    • B01J13/12—Making microcapsules or microballoons by phase separation removing solvent from the wall-forming material solution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering nucleic acids [NA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)

Abstract

Açıklamada, tek kullanımlık bileşenlerin kullanılmasını içeren aseptik koşullar altından lipit-nükleik asit nanopartiküllerinin kolayca ve tekrar üretilebilir bir şekilde oluşturulmasına yönelik bir proses açıklanmaktadır.

Description

TEKNIK ALAN AçiIZlama, tek kullanIllZJ bilesenlerin kullanllîhaslükseren aseptik kosullar aItIa Iipit-nükleik asit nanopartiküllerinin kolayca ve tekrar üretilebilir bir sekilde olusturulmasi yönelik bir proses ile ilgilidir. ÖNCEKI TEKNIK Lipitler terapötik moleküllerin iletimine yönelik, özellikle nükleik asitlerin iletimine yönelik taslýlîilâr olarak potansiyel bir sekilde kullanlgllîölmaktadlEl Lipitler, nükleik asit moleküllerini kapsülleyebilen, komplekslestirebilen veya yakalayabilen ve böylelikle terapötik moleküllerin bu sI-I uygulama sonrasIa örnegin dolasIa entrevenöz bir sekilde hedef hücrelere iletimini arttßan lipozomlarlZblusturmaktadlEl BunlarI farmasötik bilesimlerdeki kullanlgllilgiü lipit-nükleik asit nanopartiküllerini tekrar üretilebilir sekilde üretmeye yönelik erisilebilir yöntemler ile lellEllandlEllBiaktadlB Bu tür nanopartiküllerin üretilmesi için çesitli yöntemler ortaya konulmustur. Yalnlîta, basitçe ve tekrar üretilebilir sekilde sonikasyon olmaks- etanol enjeksiyonundan faydalanan Iipitlerden (vesiküller) olusan nanopartiküllerin üretilmesine yönelik bir yöntem, Biochemistry 16:3932-35 adlEtlökümanlar ile açllZlanmaktadlÜ burada etanolde çözünmüs lipitler, spontane bir sekilde lipozomlarElolusturmak üzere bir sulu çözeltiye enjekte edilmektedir. Van Buitenen ve ark., US 7468151 numaralEpatent dökümanIa, lipozomlarEkapsayan, mikropartiküllerin sterilizasyonuna yönelik bir kapallîldevre sistemi açlKlamaktadlEl Devre sistemi, bir çapraz akE hitrasyonu (TFF) birimine bagllIlolan bir karlgtlülna haznesini kapsamaktadß TFF birimi aseptik kosullar altIa mikropartiküllerin bir sülîldagililîlllîl arilEinaktadlE SEL-_l TFF aracüglýla karlgtlîiina haznesinden aseptik olarak pompalanmaktadlîl TFF'de tutulan malzeme (filtrelenmeyen k-i) karlStlîilna haznesi araclllgllýla geri dönüstürülmektedir ve TFF birimi arlElcllEllB1aktadlEl Arltîina prosesi, TFF filtrelenmeyen k-idaki mikropartiküller çlKbrllBwaks- bir aparatta aseptik olarak gerçeklestirilmektedir. Digerleri Iipitleri ve nükleik asitleri bir araya getirmek üzere spesifik yöntemler kullanllârak nükleik asit IipozomlarIlEl üretilmesine yönelik prosesi açlElamaktadlB Hirota ve ark., 1999, BioTechniques 27:286-89, adlEljökümanda, etanoldeki katyonik Iipitlerin nükleik asitin bir sulu çözeltisi içine enjekte edilmesi halinde nükleik asit molekülleri ile kaplanan IipozomlarI spontane bir sekilde olustugunu açllZlamaktadlEl Maurer ve ark., 2001, Biophysical J, bir Iipozomdaki nükleik asit moleküllerinin kapsüllenmesine yönelik bir yöntem açllZIamaktadE Bu yöntem, bir katyonik lipit içeren bir önceden olusturulmus Iipozomun kullanllüçermektedir. Lipozom sulu çözeltiye etanolün eklenmesi ile destabilize olmaktadlü Nükleik asit molekülleri destabilize Iipite eklenmektedir. Etanolün çllZlarllBiasII ardlEUan, kapsüllenmesine yönelik alternatif bir yöntem, Semple ve ark., 2001, Biophys Biochem Acta açlEIanmaktadlE Bu yöntem, bir iyonlasabilir katyonik lipit kullanlßrak lipozomlarlIdJIusturmak üzere kapsülleme verimliligini arttHnaktadlEI Lipitlerin bir etanol çözeltisi, düsük pH'da tamponlanan sulu bir çözeltide nükleik asitler ile bir araya getirilmektedir. ArdIan etanol, pH degeri nötr bir degere yükseltilirken çHZlarllßîaktadE Her iki yöntem de, tekrar olusum esnasEtla ylglgml boyut bakIilEtlan genis bir çesitlilik üretmesinden kaynaklüolarak sonuçta olusan IipozomlarIayrlEla islenmesini gerektirmektedir. MacLachIan ve ark., US 7901708 numarallîpatent dökümanüda, bir nükleik asiti kapsülleyen homojen boyutlu IipozomlarI üretilmesine yönelik bir proses ve bir aparat açllZlamaktadB 5qu bir tamponda bir RNA akIiEletanoldeki katyonik lipitlerin bir akIiElile bir T konnektöründeki yaklasllZl olarak esit aklgloranlarIa karlgIlElIBiaktadlB burada lipit vesiküller yüksek bir etanol konsantrasyonuncla bir anda olusmaktadlE(°/o45). Çözücü ve çözünen konsantrasyonlar karlStlElna prosesi boyunca sabit tutulmaktadlîl LipozomlarI seyreltildigi hiçbir statik karlgtlEElîlahil edilmemektedir. Stabil nükleik asit Iipozomlarüprosesin sonunda, bir steril dolum adIiII hemen öncesinde sterilize edilmektedir. daha fazla DILA2 amino asit bilesigi veya lipiti içeren lipozom Olusturucu bir çözelti ile bir çarpan akIi olusturmak üzere organik çözeltide temas ettirilmesi araciligllýla hazlEllanan terapötiklerin Iipozomal iletimine yönelik prosesler ve bilesimler açllZIamaktadE Aklgl oranlarlü pH'lZl/e bir inkübasyon süresini kapsayan bir protokol, terapötik uygulamalara yönelik Iipozomal bilesenlerin olusturulmasIleontrol etmek üzere kullanilüiaktadlîl Çarpan akli toplanabilmektedir ve etken ajanlîkapsülleyen bir Iipozomal formülasyon haziîllanmasü için inkübe edilmektedir. Bilesime tampon ile suverilebilmektedir ve bir farmasötik bilesim olarak bitirilmesi için teget aklg ve diyaûltrasyon ve diger araçlar aracHJgllýla filtrelenebilmektedir. Bir ilaç yükünün iletilmesine yönelik bir verim saglanmaktadE Bilesimler, bir veya daha fazla taslýlûjßartikül içeren bir Iipozom kapsayabilmektedir, her bir taslýlîlîlpartikül bir etken ajana ve bir peptide sahiptir, burada peptidin kütlesinin artEl lipozomun kütlesinin, etken ajanI kütlesine ortanüaklasliî] 15'ten daha azdlEl YukarlZlla açllîlanan yöntemler, IipozomlarI üretilmesine yönelik proses esnasIa, otoklavlama, yllZlama ve düzenleyici yükümlülüklerin karsllânmasIEiçeren bakteriyel kirliligin en aza indirilmesi için ayrlEtlHIbir çaba gerektirmektedir. Önceden olusturulmus IipozomlarEl hazlîilamak üzere ayrlEtiIJEnekanik isleme adli-lar gereksinim duyulmaks ve lipit-nükleik asit partiküllerini monodispers bir popülasyona azaltmak üzere islem adli- gerek duyulmaks- nükleik asitlerin kapsüllenmesine yönelik bir imalat adIiIZIiçin halen, karsüânmayan bir gereksinim bulunmaktadlEI KISA AÇIKLAMA Bulus, Istem 1'de belirtildigi üzere aseptik kosullar altIa bir lipit-nükleik asit nanopartikülün steril bir sekilde hazlHlanmasI yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Bulusa göre yöntemde kullanüâbilen sistem, ayrü 1'inci tutma birime bagIEl olan organik lipit çözeltisinin hazlîllanmaleb yönelik bir birim içermektedir. Bulusa göre yöntemde kullanllâbilen sistem, ayrlEla söz konusu çözelti 1'inci tutma birime aktarlllfken, organik lipit çözeltinin sterilize edilmesi için bir filtre içermektedir. Bulusa göre yöntemde kullanllâbilen sistem, ekteki Istem 1'de belirtildigi üzere steril olan bir lipit çözelti, ilaç çözeltisi, lipit-ilaç karlglmüle süspansiyon içermektedir. Konsantre etme birimi tek kullanIillKl pompa haznesine sahip bir diyafram ölçme pompaslZiçerebilmektedir. Lipitler bir katyonik lipit, bir nötr lipit, bir sterol, ve bir polietilen (PEG)-lipit eslenigi içerebilmektedir, ve ayrlEia ekteki Istem 2'de belirtildigi üzere bir hedeflendirme lipiti içerebilmektedir. Ekteki istem 3'e göre yapüândlElnada, terapötik ilaç bir dsRNA molekülüdür. dsRNA ve lipitin konsantrasyonu karlgliîhda, 25'lik bir lipitzRNA oran-an olusabilmektedir. Su ile karlglabilen organik çözücü etanoldür. 1'inci ve 2'inci çözeltiler 35 ila 40° bir lebklltha birlestirilebilmektedir. 2'inci tutma birimi, pH 3.5 ila pH 4.5 araletla bir sulu tamponda bir terapötik ilaç içerebilmektedir. 3'üncü tutma birimi, nötr pH'ta bir sulu tampon içerebilmektedir. Terapötik ilacükapsülleyen Iipozomun ortalama partikül çapD 80 nm ila 150 nm araliglia olabilmektedir. Enjeksiyon araçlarüorganik çözeltiyi, karlgtBna birimindeki sulu çözeltinin hava su arayüzeyine ileten bir enjeksiyon açÜZIigiÇiveya dönüsümlü olarak karlSIlEna birimindeki sulu çözeltiye daldlEIân ve buraya organik çözeltiyi ileten bir enjeksiyon açlElgiEIçerebilmektedir. Yöntem ayrlEla bir liyofilizasyon adllîlçerebilmektedir. Liyofilizasyon adilÇIbir dondurma adIiEle bir kurutma adlüiçerebilmektedir. Sulu tampon sakaroz veya trehaloz içerebilmektedir. Dondurma adIiÇlZO ila -40°C arasIa 1°C./dakikada lipit-ilaç karlglEiIEbogutabilmektedir. Kurutma adIiülipit-ilaç karlSlEiII yaklasllZl -15 ila yaklasllZl-35°C arasIa kurutulmasIEiberebilmektedir. SEKILLERIN KISA AÇIKLAMASI Sekil 1 mevcut bulusa göre yöntemde kullanIla yönelik bir tek kullanIilllZJ sistem göstermektedir. ÖRNEK NITELIGINDEKI YAPILANDIRMALARIN AYRINTILI AÇIKLAMASI Burada açliîlanan bulus, Istem 1'de belirtildigi üzere aseptik kosullar altIa bir lipit-nükleik asit nanopartikülün steril bir sekilde hazlElianmas- yönelik bir yöntem ile ilgilidir. Yöntem özellikle, lipozom ile kapsüllenen terapötik moleküllerden olusan partiküllerin büyük ölçekli imalat. uygundur. Yöntem, üretilen partiküllerin, monodispers oldugu (yani burada açiElandlgIJJzere ve 50 ve 150 nm arasIia dar ve homojen bir boyut dagilIiîli- sahip oldugu saslEiilEZIve beklenmeyen bir sonuç saglamaktadE Bulusa göre yöntem ile üretilen partiküller, bir monodispers popülasyonu elde etmek üzere ekstrüzyon gibi mekanik islemeleri gerektirmemektedir. Bulusa göre yöntem, büyük hacimlere arttßlâbilme kolayllgilZIle ve genis aralilîta slîaklllîl çözünenler, pH ve isleme sürelerine dayanllZlüilmasülle önceki yöntemlere nazaran avantaja sahiptir. Bulusa göre yöntem, önceden olusturulmus vesikülleri olusturmak üzere gerekli olan ekstra adnlar olmaks- partiküllerin homojen bir popülasyonunun tekrar üretilebilir sekilde üretilmesi ile önceki yöntemlere nazaran avantaja sahiptir. Bulusa göre yöntem, Iipitlerin ve negatif yüklenis nükleik asit polimerlerin karlSIEiII ardIan üretilen partiküllerin mekanik prosesine yönelik gerekli olan ekstra adnlar olmaks- nanopartiküllerin homojen bir popülasyonunu tekrar üretilebilir sekilde üretmesi ile önceki yöntemlere nazaran avantaja sahiptir. Bu ekstra adnlar, boyutlarlßzaltmak ve bir terapötik olarak kabul edilebilir araIlEta bir homojenlige ulasmak üzere örnegin sonikasyon homojenlestirme veya ekstrüzyon gibi adIiIar içermektedir. Bulusa göre yöntem, nanopartikülleri üretmek üzere ekstra isleme adIiIarlIrbImaks- önceki yöntemlere esit veya bu yöntemlerden daha iyi nükleik asit kapsülleme verimliligine ulasmaya yönelik avantaja sahiptir. Bulusa göre yöntemin diger avantajlarü lipit bilesenlere ve kosullara iliskin buradaki açiEIamada ilave ayrlîitllârl saglanmaslýla daha açilZIolacaktB Asag-ki kEaItmalar açllZJamada kullan [IB1aktadlE VF: havalandlEina deligi TG: lelaklllZlgöstergesi SUB: tek kullanIiIlKlyatak TFF: çapraz aklgltiltresi PP: peristaltik pompa PG: baslîil; göstergesi Terazi: ag [ElllgiEölçmeye yönelik bir araç Sekil 1, mevcut bulusa göre yönteme ait bir yapllândlElnada kullanllâbilen, asaglElaki elemanlarEiçeren bir tek kullanIiIlEIsistem göstermektedir. Lipit Stogu: bu kap, etanol olan organik, su ile kargbilen bir çözücüde seçilen Iipitleri kapsamaktadlEl Lipitlerin konsantrasyonu hammadde miktarID arttlElriak üzere uyarlanabilmektedir. Kap, bir TG'ye sahip bir kullanIlEtan sonra atllâbilen bir torba ve bir karlgtlüna aracIan olusmaktadE Torba, %96 ila 100 arasIa lipiti eklemek için açlEIllZlara, bir valf tarafüdan kontrol edilen bir VF'ye ve bir çIEIg borusuna sahiptir. Torba, bir Eflßbilir, tekrar kullanllâbilir, elektriksel olarak topraklanmlglkonteynerde barIlElüiaktadlEl Torba, bir isletim konsantrasyonuna lipit çözeltiyi seyreltmek üzere ek etanol eklemeye yönelik bir araca sahiptir. PP1: peristaltik pompa (1). Bu, Lipit Stok kabIEUan lipit stogunu, Filtrelenmis Lipit Stogu kabi bir 0.45/0.22 pm filtre araciügiûla pompalamaktadlB Filtrelenmis Lipit Stogu: bu kap isletim konsantrasyonunda lipitleri kapsamaktadlE Kap bir karlgtlEina aracü/e bir TG'ye sahip bir kullan-[Ktan sonra atilâbilir bir torbadIE Torba, lipit stogun girisi için açllîlllîlara, bir valf taraflEUan kontrol edilen bir VF ve bir çlElgl borusuna sahiptir. Torba, bir Elfllâbilir, tekrar kullanüâbilir, elektriksel olarak topraklanmlgl bir Teraziye sahip konteynerde barIIElüiaktadE sRNA Stogu: bu kap bir sulu tamponda seçilen bir ilaç kapsamaktadlB siRNA tercih edilen bir ilaçtlEl ve sitrat tamponu tercih edilen tampondur. Konsantrasyon hammadde miktarID arttIEInak üzere uyarlanabilmektedir. Kap bir karEtlElna arac. sahip bir kullanliEtan sonra atüâbilir bir torbadE Torba, çözücüyü ve çözüneni eklemek için açilZlElZJara, bir valf taraflEldan kontrol edilen bir çilZIgl borusuna sahiptir. Torba, bir isletim konsantrasyonuna RNA çözeltisini seyreltmek üzere ek tampon eklemeye yönelik bir araca sahiptir. PP2: peristaltik pompa (2). Bu, siRNA Stok kabIan siRNA stogunu, Filtrelenmis siRNA Stogu kabi bir 0.45/O.22 pm filtre aracülgllýla pompalamaktadlE Filtrelenmis siRNA Stogu: bu kap isletim konsantrasyonunda siRNA'yEkapsamaktadlEI Bu eleman bir terazi kapsamaktadlE Kap bir tekrar kullanllâbilir kapta barIIElân bir kullanIIKtan sonra atllâbilen torbadlB Torba, siRNA stogun girisi için açlEl[gb (açlEllElara), bir valf tarafIan kontrol edilen bir çllîlgl borusuna sahiptir. Torba, Teraziye sahip, bir tekrar kullanilâbilir konteynerde bariEllBiaktadlB PP3: %35'Iik etanolde etiketlenmis Iipozomal siRNA kablEla filtrelenmis lipit stogunun aktarllB1alela yönelik peristaltik pompa (3). Bir PG (PG1) ile donatUBiaktadlB PP4: %35'Iik etanol kabiaki Iipozomal siRNA'ya filtrelenmis siRNA'nI aktarliîhas- yönelik peristaltik pompa (4). Bu da ayri& bir PG (PGZ) ile donatüüiaktadlB kapsamaktadlü Bu eleman bir VF ve bir TG kapsamaktadlB Filtrelenmis lipit ve siRNA stoguna yönelik açiEliKIar bir valf ile kontrol edilen bir çiEig borusundan ayrilîhaktadß Tercih edilen birim bir tekrar kullanilâbilir kapta barIlEilân bir kullan-[Etan sonra atllâbilen torbadIB Fosfat Tamponu: bu kap bir tampon (tercihen bir fosfat tamponu), bir kargtlîiina aracÇive bir Terazi kapsamaktadlrîi Bir açiKlllZi kapag- ve bir valfe sahip bir çliZlS borusuna sahip büyük bir kaptlE Filtrelenmis Fosfat Tamponu: bu kap borulama ile Fosfat Tamponuna, bir a 0.45/0.22 pm filtreye, ve bir peristaltik pompaya baglanmaktadlE %10'Iuk Etanol kabülle TFF SUB kaplEida lipozomal siRNA'ya PP5'ten borulamaya yönlendirilen bir valfe sahip bir çllîlg borusu ve bir karlgtlüina araclEia sahiptir. Kap bir kullan-[Eren sonra atllâbilen Iaynere sahip bir tekrar kullanlßbilir konteynerdir. PP 5: bu %35'Iik etanol kabIZive TFF SUB kabIda lipozomal siRNA'ye Filtrelenmis Fosfat Tamponu kabIan Filtrelenmis Fosfat Tamponunu pompalamaktadE PP 5 bir PG'ye (PG4) birlestirilmektedir. lipozomal siRNA çözeltisine yönelik bir girise, bir VF'ye bir Terazi'ye, ve TFF SUB kab- yönlenen bir valfe sahip bir çilîlglagz- sahip bir tekrar kullanüâbilir konteynerdir. PP 6: bu 0.45/0.22 pm bir filtre aracIDgiiýla %10'Iuk etanol kabIaki lipozomal siRNA'dan TFF SUB: bu kap Filtrelenmis Fosfat Tamponu kabIan tamponlamaya yönelik, ve her biri bir valfe sahip TFF biriminden filtrelenmeyen kEma yönelik %10'Iuk etanol kablEtiaki lipozomal siRNA'dan %10'Iuk etanoldeki ilaç ve lipozomlar için giris agiîlarEkapsamaktadiEJ Ayri& bir VF ve valfe sahip bir çiElglagzEkapsamaktadlB Kullan-[Etan Sonra Atllâbilen Pompa Baslglüb Sahip Ölçme Pompaslîi bu yüksek baleçlEI pompa iki PG (PG 3 ve PG 4) ile birlestirilmektedir. TFF SUB'dan TFF birimine Iipozomlarü/e ilaclâktarmaktadiü TFF: bu birim bir kösegen hatta sahip bir çift dikdörtgen olarak tanIiIanmaktadE Islem esnasiîitla etanol çözeltisindeki Iipozom/ilaç etanolü çiiZlarmak üzere TFF biriminden geçmektedir. TFF birimi ile ç[lZbrlIân etanol sistemden ç[ErnaktadlB Tek bir TFF'den daha fazlaslîibaralel olarak, valfler ile baglanarak isletilebilmektedir. Tutulan çözelti (filtrelenmeyen k-i) TFF'den çlKtnaktadB TFF SUB'EItekrar dolasmaktadEl ve etanolün tamamII çnîarüînaslîgerekliliginden TFF birimi aracHJgJIîla geri kazanUBiaktadlB Bir balelç göstergesi (PG 4) filtrelenmeyen klginI balelcIEgözlemlemektedir. Bir tankta depolanan nitrojen gazlZl (Nz), geri baletI meydana getirilmesi gerekliliginden, ölçüm pompasIElsogaltmak üzere kullanliîhaktadlEl ve nihayetinde TFF filtrelenmeyen klglnII bir birinci 10L SUB kabir-la aktarIiIERolaylastEnaktadlE 10L SUB: bu bir terazi ile donatllân bir tek kullanilllîlkaptlü Opsiyonel olarak, SUS üç 10L ürünün islem aknlEb girmis olabilecek mikrobiyal kirlilikten kaynaklanan mikrobiyal kirlilikten tamamen arIlEllRilgl olmasIEl temin etmek için bir 0.45/0.22 um filtreden pompalanmaktadlEl Tüm proses zincirinin tamamen aseptik olmasEldurumunda, sonraki filtreleme adIiIarIEçlKlarmak mümkün olmaktadE Sonuçta olusan TFF filtrelenmeyen klîinlîl Aseptik Dolgu esnasülda paketlenmektedir. Aseptik Dolgu: Bu adli, farklElakipmanIarI kullanllgllîiayrüair adIi olarak gerçeklestirilen veya kitle olusturmaya yönelik diger malzemeler veya Iiyofilizasyon adlißsnaslütia RNA'nI stabil hale getirilmesine yönelik taslsîlîülnalzemenin eklenmesini Içerebilmektedir. Sistem, her bir adi boyunca malzemelerin hareketinin manüel olarak kontrol edilmesi için düzenlenmektedir. Lipitler, ilaç, çözücüler ve tamponlar ile temasta olan tüm bilesenler tek kullanIiIlEtlE ve kullan-[Etan sonra atllâbilmektedir. Sistem bir 10L y[g]- yönelik gösterilmektedir, ve 1000L'den daha fazlaleb ölçeklendirilebilmektedir. Bilesenler Mevcut bulusun bir yapüândünaslüla göre Imalat prosesini gerçeklestirmeye yönelik araç, asag-ki bir aklglsemasia (Sekil 1) gösterildigi üzere bir dizi ad Iidan olusmaktadlEl Lipit ve ilaç stok çözeltileri Lipit Stogu ve siRNA Stogu kaplarIa ayrIZI olarak hazülanmaktadlü Stok çözeltileri yüksek konsantrasyonda hazlHlanabiImektedir. KarlSIlEma stok kaplarIa karlStlîma ile meydana gelmektedir. Lipit stok çözeltisinin lebkllgElbir ayarlanmlglslîlaklgh uyarlanabilmektedir. Lipit stogun hazlEllainmas- yönelik kap, saf organik çözeltinin bir arttlElIhlgl lebklltha kullanllBrasEldurumunda minimum bir filtre edilebilir malzemeye sahip olmak üzere seçilmektedir. Stok çözeltileri bir 0.45/0.22 pm filtre arac[[[g]Ma bir Filtrelenmis Lipit Stogu kablEla ve Filtrelenmis siRNA Stogu kablEla ayrEblarak pompalanmaktadlEI Stok çözeltileri filtrelenmis stok kaplarlEb aktarlIB1asIan önce veya aktarllB'iasEblßsIa stok çözeltisini seyreltmek üzere daha fazla çözelti ile birlestirilebilmektedir. Aynßekilde, sulu tampon Fosfat Tampon kablötla hazlEllanmaktadlElve bir Filtrelenmis Fosfat Tamponu kab- pompalanarak filtre sterilize edilmektedir. Filtrelenmis siRNA çözeltisi %35'Iik etanol kabIda Lipozomal siRNA'ya pompalanmaktadlü Organik çözücüdeki Iipozomal sulu çözelti karlgtlEIlElken bir kontrollü ayarlanmü lelakllE] altIia %35'Iik etanol oran-a bir nihai konsantrasyondaki Iipit-ilaç partiküllerini olusturmak üzere etkili bir oranda %35'Iik etanol kablEldaki Iipozomal siRNA'da sulu siRNA çözeltisine pompalanmaktadIE Lipitin eklenmesi, bir igne veya bir dizi igne araclllgllýla bir tek aglZ veya çoklu aglîlar vaslüslsîla meydana gelmektedir. Sulu çözeltinin yüzeyinin üstünden meydana gelebilmektedir veya yüzeyin altlEUan sulu çözeltinin içine enjekte edilebilmektedir. Ekleme veya karlStlEna araclIfglüla, çözeltinin %35'Iik etanol kabIaki Lipozomal siRNA'daki etanol bir baslanglg] (tercihen %0) degerinden bir nihai (tercihen %35) degerine bir gradyan olusturarak kademeli bir sekilde olmaktadlEl Bu gradyan 1 dakikadan 60 dakika veya daha fazlaya, yani 100 dakikaya kadar uzayabilmektedir. ulasmasEljurumunda (tercihen %35), çözelti %35'Iik etanol kabIaki Lipozomal siRNA'nI dlglEb pompalanmaktadlîl ve karlglülîbir suda çözünebilir alkolde, tercihen %10 ila %20 etanol'de, en çok tercihen %10'luk etanolde seyreltmek amaclýla Filtrelenmis Fosfat Tamponundan ayrEblarak pompalanan tampon ile uyumlu olarak karlgtlEllEbilmektedir, ve TFF filtrelenmeyen klginEQO/oo etanol, 100 sulu çözelti) birinci 10L SUB'da depolanmaktadlîl TFF filtrelenmeyen klîlnüâseptik Dolguya yönelik biyoyükü azaltmak üzere opsiyonel olarak filtrelenebilmektedir. Aseptik Dolgu bir Iiyofilizasyon adnElkapsamaktadE Liyofilizasyon adIiÇIadI 10'daki steril TFF filtrelenmeyen klîlnII üretilmesine yönelik proses ile kesintili olmaktadlB Yani, bu adIi tercihen TFF filtrelenmeyen klgnlîlsaglayan SUS biriminden daha farklljbir lokasyonda gerçeklestirilmektedir. Sakaraz veya glikoz gibi bir karbonhidrat imkan dahilinde nanopartikülleri stabilize etmek ve/veya kitle ekleme üzere liyofilize edilmesinin öncesinde eklenebilmektedir. Bulusa göre yöntemin bir yapilândlîilnasIa kullanilan Iipit karlglEliÇl negatif-yüklenen terapötik polimerler ile komplekslestirilmek üzere en azlîitlan bir pozitif-yüklenen lipit (katyonik lipit), ve ylgilglmllngellemek üzere bir polietilen glikol içeren Iipit eslenik (PEG-Iipit) içermektedir. Katyonik Iipit genis çapIEbH kosullarEboyunca kaIlEEbir katyonik yük, düsük pH'ta (6 pH'tan daha az) yüklenen ve nötr pH'ta (6.5 ila 8 arasIa pH) net bir yükü olmadan bir iyonlasabilir katyonik Iipit, veya kallEEl ve iyonlasabilir katyonik Iipitlerin bir kombinasyonunu içermektedir. Lipit karmüayrß bir hedeflendirme lipiti, bir polimer, bir steroid, bir fosfolipit, veya bir yag, bir parafin, yagda çözünür vitamin, monogliserid veya digliserid, yag asilleri, gliserolipitler, gliserofosfolipitler, sfingolipitler, sakkarolipitler ve polyketidler kapsayan baska bir Iipit grubunun bir üyesini içerebilmektedir. Yöntem ayrlîla yalnlîta nötr veya negatif olarak yüklenen bilesenlere sahip IipozomlarI olusumuna yönelik kullanliâbilmektedir. Tercihen, Iipit karlgIEhI bilesenleri asaglöiaki gruplardan seçilebilmektedir Katyonik Iipit Formül I'in katyonik Iipitleri, bulusa göre yöntemde kullanilmasüçin uygudur R1 O\Z O R3` + X R2YO/ 2 = bir alkil baglaylElZlCz-Q alkil Y = bir alkil baglaylîÇlCi-Cß alkil R1 ve R2 her biri bagnslîlolarak C10'C3Üaikil, Cio-C3oalkenil, veya Cm-Cgoalkinil, C10'C3oaikil, Cio-Czoalkil, C12'C1gaik", C13-C17alkil, C13alkil, Cio-Cgoalkenil, Cio-Czoalkenil. Ciz-Cigalkenil, R3 ve R4 her biri bagIisE olarak hidrojen, Ci-Cöalkil, veya -CHZCHZOH, Cl-Cöalkil, C1- Cgalkildir; n 1-6 araslîitladlîj ve X teknikte kolayca anlasllâcak bir terim olan, herhangi bir nitrojen tersyükün kapsayan bir tersyükündür. Tercih edilen nitrojen tersyükünleri, klorür ve bromürün özellikle tercih edilmesi ile birlikte halojenleri kapsamaktadlEl Diger tercih edilen tersyükün mesilattlîl(-SO3CH3). Formül I'In örnek niteligindeki bilesikleri asaglâhkileri kapsamaktadlE Fizyolojik pH'ta diger katyonik olarak yüklenmis Iipitler N,N-dioleiI-N,N-dimetilamonyum klorür disteariI-N,N-dimetiIamonyum-bromür ("DDAB");N-(2,3-dioleyoksi)propil)-N,N,N- trimetilamonyum klorür ("DOTAP"),' N-(1,2-dimiril0ksi-prop-3-iI)-N,N-dimetiI-N- hidroksietilamonyum bromür ("DMRIE"), 3ß-(N-(N',N'-dimetilaminoetan)karbamoil)k0lester0l ("DC-Kol"), dioktadesilamitoglisil karboksispermidin ("DOGS"); ve N-(l-(2,3- dioleiloksi)propiI)-N-(2-(sperminkarboksamIdo)etII)-N,N-dimetilamonyum trifloroasetatlîl ("DOSPA") kapsamaktadB Iyonlasabilir katyonik Iipitler. Formül II'nin iyonlasabilir katyonik Iipitleri, bulusa göre yöntemde kullanHh'1aslîbin uygudur R1 O\Z O R3 2 = bir alkil baglayiEÇICZ-Q alkil, -CHZSCHZCHZ- Y = bir alkil baglayEÇIQ-Cs alkil R1 ve R2 her biri bagismolarak C10'C3oalkii, Cm-Cgoalkenil, veya Clo-C3Oalkinil, Cio-C3Üalkil, Cio-Czoalkil, Clz-Cigalkil, C13-C17alkil, C13alkil, Cio-Cgoalkenil, Cio-Czoalkenil. Ciz-Cigalkenil, R3 ve R4 her biri bagnslîl olarak hidrojen, Ci-Csalkil, veya -CHZCHZOH, Ci-Cßalkil, C1- Cgalkildir. Bazlîpozitif olarak yüklü Iipitler fizyolojik pH'ta veya buna yakI olarak bir pKa'ya sahiptir ve hafif asit kosullarIa katyonikdir ve szolojik pH'ta zayif] bir sekilde katyoniktir. Bu tür iyonlasabilir katyonik Iipitler, ((2-((2-(dimetilamino)etil)tiyo)asetil)azanediil)bis(etan-2,1-diil) dioleat ("i-Et-DODC"), N-( ve 1 0 8104 o i-Et-DOD(` Iyonlasabilir Iipitlerin asagi gösterildigi gibi etken farmasötik içerik maddelerin (API) baglanmasIIEle/veya salümasllîllolaylastßbildigi bilinmektedir. Nötr lipitler Nötr Iipitlerin örnekleri fosfolipitler, aminolipitler ve sfingolipitleri kapsamaktadlB Nötr lipitler amfipatik lipitleri kapsamaktadlîl Fosfolipitlerin temsili örnekleri fosfatidilkolin, fosfatidiletanolamin, fosfatidilserin, fosfatidilsinositol, fosfatidik asit, palmitoiloleoil fosfatidilkolin, Iizofosfatidilkolin, Iizofosfatidilkolin, Iizofosfatidiletanolamin, dipalmitoilfosfatidilkolin, dioleoilfosfatidilkolin, distearoilfosfatidilkolin veya dilinoleoilfosfatidilkolini kapsamaktadlü Fosfor bak"an eksik olan diger bilesikler, örnegi sfingolipit, glikosfingolipit aileleri, diasilgliseroller ve 3-asil0ksiasitler ayrlEh amfipatik lipitler olarak belirlenen grup içerisindedir. Buna ek olarak yukari açlKlanan amfipatik lipit, trigliseritler ve sterolleri kapsayan diger lipitler ile karlgtlîllâbilmektedir. PEG-lipitler Bir iki katmanllîttabilize edici bilesen bir lipit basllglügrubuna, örnegin fosfatidiletanolaminine eslenik olan polietilenglikoldür ("PEG"). Diger iki katmanlßtabilize edici bilesen, bir seramide eslenik olan PEG'dir. PEG bir fosfatidiletanolamine, veya alternatif olarak, teknikte uzman kisilerce bilinen ve kullanüân standart birlestirme reaksiyonlarükullanllârak bir seramide eslenik olabilmektedir. Buna ek olarak önceden olusturulmus PEG-fosfatidiletanolamin ("PEG- PE") eslenikleri ticari olarak ulaslßbilirdir. Çesitli moleküler aglHl[gb sahip PEG'ler, mevcut bulusa göre stabilize edici iki katmanllîl bilesenleri olusturmak üzere kullanllâbilmektedir. Çesitli moleküler aglElllgEi sahip PEG'Ier birçok farklElkaynaktan ticari olarak ulasllâbilir olmaktadlB veya alternatif olarak bunlar teknikte uzman olan kisilerce iyi bilinen standart polimerlesme teknikleri kullanllârak sentezlenebilmektedir. Mevcut tercih edilen bir yapllândülnada, polietilen glikol 200 ila 10000 aglEllEg'b sahiptir. Genel olarak, PEG'in moleküler aglEllfgII arttlEllBiasIEl, stabilazasyona ulasmak için gerekli olan iki katmanlEBtabilize edici bilesenin konsantrasyonunu azaltt[glEl kesfedilmistir. Doygunluk dereceleri ve çesitli zincir uzunluklarII çok çesitli asil zincir gruplarlEla sahip fosfatidiletanolamin iki katmanllîlstabilize edici bilesen olusturmak üzere PEG'e eslenik olabilmektedir. Bu tür fosfatidiletanolaminler, ticari olarak ulasüâbilirdir, veya teknikte uzman olan kisilerde geleneksel teknikler kullan [Iârak izole edilebilmektedir ve sentezlenebilmektedir. C10 ila C20 araligilEtla karbon zincir uzunluklarEla sahip doymus veya doymamEyag asitleri içeren fosfatidiletanolaminler tercih edilmektedir. Mono veya di-doymamlgl yag asitlerine sahip fosfatidiletanolaminler ve doymus ve doymamlgl yag asitlerinin karlgüilarlîlayrlîh kullanllâbilmektedir. Uygun fosfatidiletanolaminler asaglâakileri kapsamaktadlE dimiristoilfosfatidiletanolamin (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamin (DPPE), clioleoilfosfatidiletanolamin (DOPE) ve distearoilfosfatidil-etanolamin (DSPE). Yukarlilia bahsedilen bilesimler ayrlEla teknikte bilinen bas/@35% asaglZliakilerden seçilen bir veya daha fazla molekülü kapsayan PEG-fosfolipitlerini ve PEG-seramidlerini kapsayan PEG- eslenikli lipitleri kapsayabilmektedir: PEGZOOO-DSPE, PEGZOOO-DPPE, PEGZOOO-DMPE, Ilaveten, bilesimler ayrüa örnek olarak 83-hidroksi heptakosaoksatrioktakontil ( ve 134-hidroksi- tetraetrakontaoksatetratriakontahestil (2,3-bis(tetradesiIoksi)propil)karbamatEa"HO-PEG2000- cBTP") kapsayan örneklere sahip genel formül mdPEG-baglaylEEllipite sahip monodispers (md) peg-lipitleri kapsayabilmektedir. DNOwOA/OH i/\C/\/O\/\O/\/O\/\O/\/O\)  NûzgßC/V `CAD O\/\ /\/O\/\ U Ü wC/V "/ C/\[|)/\u O CTLIAO HO-PEGIZSI-CBTP HO-PEGZÜÜÜ-CBTP Steroidler Steroidlerler, kolestanlar (örnegin, kolesterol), kolanlar ve safra asitleri (örnegin, kenodeoksikolat ve kolat), ergosterol, Ianosterol, kortikosteroidler (örnegin, glukokortikoid), pregnan (örnegin progesteron) ve fitosterolleri kapsamaktadlü Bunlar ayrlîia bir hidrofilik klîina sahip bir eslenik formunda, örnegin bir polietilen glikolde bulunabilmektedir. Tercih edilen bir steroid kolesteroldür. Hedeflendirme lipiti Bir hedeflendirme lipitinin bir örnegi, formül (A)'nI bir bilesigidir, burada lipit (L) DSPE, DOPE, ve DC'den olusan gruptan seçilmektedir; baglaylîlJX) hiçbiri, PEG, Glu, C6, glisin, ve GIuNH, N1,N19-bis(3-(2-(2-(3- olusan gruptan seçilmektedir; ve retinoid (R) tretinoin, adapalen, retinol, 4- hidroksi(fenil)retinamid (4-HPR), retinoik asit (A vitamini), 9-(2,6,6-trimetilsikloheks-1-en-1- (2,2,6-trimetilsikloheksil)nonanoik asit, ve herhangi bir kiîh'ien veya tamamen doymus retinoid veya bunun bir türevinden olusan gruptan seçilmektedir. Diger bir hedeflendirme lipitinin bir örnegi, formül (B)'nin bir bilesigidir, bisamido-PEG-Iis")'dir; ve retinoid (R) tretinoin, adapalen, retinol, 4-hidroksi(fenil)retinamid trimetilsikloheksil)nonanoik asit, veya herhangi bir klginen veya tamamen doymus retinoid veya bunun bir türevinden olusan gruptan seçilmektedir. Diger hedeflendirme molekülleri, lipit karlglml, örnegin folik asit, E vitamini, peptid RNA-Lipit Partikül Bilesimleri ve Formülasyonlarlîl Bulusa göre yöntem, mevcut oldugunda etken ajanI lipit partikül ile iliskilendirildigi bir nükleik asit etken ajan. sahip bir lipit partikül içeren bilesimleri vermektedir. Bulusa göre yöntemin belirli yapiElndlElnalarIa, bilesimler, nükleik asit etken ajanII lipit partikülün sulu bir iç klîm içerisinde kapsüllendigi sekilde elde edilmektedir. Bulusa göre yöntemin diger yapllândlElnalarIa, bilesimler, nükleik asit etken ajanII lipit partikülün bir veya daha fazla lipit katmanEilçerisinde mevcut oldugu sekilde elde edilmektedir. Bulusa göre yöntemin diger yapllândlElnalarIa, bilesimler, nükleik asit etken ajanII lipit partikülün lipit yüzeyinin dlgl klîln. veya iç klîml baglüldugu sekilde elde edilmektedir. Mevcut bulusa göre yöntemde, bir nükleik asit ile iliskilendirilen lipit partiküller bir nükleik asit-lipit partikülü ile sonuçlanarak elde edilmektedir. Mevcut bulusa göre yöntemin belirli yapllândlElnalarIa, partiküller, nükleik asitin lipit partikülde tamamen kapsüllendigi sekilde elde edilmektedir. Burada kullanllgllîl üzere "nükleik asit" terimi, herhangi bir RNA oligonükleotit veya RNA polinükleotidini kapsamayümaçlamaktadlîl 50 nükleotide kadar olan parçalar genel olarak oligonükleotit olarak terimlestirilmektedir, ve daha uzun parçalara polinükleotid adElverilmektedir. Mevcut bulusa göre yöntemin belirli yapllândlElnalarIa, uzunluk bakIiIian 15-50 nükleotit olan oligonükleotitler kullanIJBiaktadlB sekerler ve ara seker (omurga) baglantllârIan olusan nükleotit veya nükleosit monomerlerin bir polimeri veya oligomerine atlflia bulunmaktadlEl "Polinükleotid" ve bunlari benzer sekilde islev gören bölümlerini içeren polimerleri veya oligomerleri kapsamaktadB Bu tür modifiye veya ikame edilmis oligonükleotitler s[lZl]]Ela, dogal formlara nazaran örnegin gelistirilmis hücresel alIi ve nükleazlarI mevcudiyetinde arttlîllÜilQ stabiliteleri gibi özelliklerinden ötürü tercih edilmektedir. Mevcut bulusta RNA tipi Mevcut bulusta kullanIia sokulan oligonükleotitler, böylelikle oligoribonükleotitlerdir. Bir oligodeoksiribonükleotid, bir alternatif, zincirsiz polimeri olusturmak için bu sekerin 5' ve 3' karbonlarEtla fosfata kovalent bir sekilde tutturulan bir deoksiribozdan olusmaktadlE Bir oligoribonükleotit, her bir nükleotitin bir riboz seker grubuna sahip oldugu bir benzer sekilde tekrarlayan yapin olusmaktadlEl Modifiye edilmis riboz molekülleri bir oligoribonükleotitin içinde bulunabilmektedir. Bulusa göre bir lipit-nükleik asit partikülünde mevcut olan nükleik asit, bilinen herhangi bir RNA nükleik asitini kapsamaktadlEl Burada kullanüân nükleik asitler, tek sarmallERNA veya çift sarmallüRNA veya DNA-RNA hibridleri veya PNA duplekslerinin RNA-PNA hibridleri olabilmektedir. Çift sarmallERNA'nI örnekleri siRNA ve diger RNA engelleme reaktiflerini kapsamaktadlEl Tek sarmallEhükleik asitler, örnegin antisens oligonükleotitler, ribozimler, microRNA ve tripleks olusturan oligonükleotitleri kapsamaktadlE Nükleik asitler genellikle nükleik asitin belirli bir formuna baglEblarak çesitli uzunluklarda olabilmektedir. Örnegin, belirli yaplßndlîilnalarda, plazmidler veya genler, uzunluk yapilândünalarda, oligonükleotitler, uzunluk bak"an yaklasiEl 10 ila 100 nükleotit araslütla olabilmektedir. Çesitli ilgili yapllândlülnalarda, oligonükleotitler, tek sarmalIÇl çift sarmaIIÜ/eya üçlü sarmalllIbImalarlEhan bagIislîl olarak, uzunluk bakIilEdan yaklaslEl 10 ila uzunluk bakIiIan yaklasilg 20 ila yaklasilg30 nükleotit arasIa olabilmektedir. Belirli yapllândlünalarda, bulusa göre yöntem, bir hedeflendirme polinükleotidine bütünleyici olan veya spesifik olarak buna hibridlenebilen bir oligonükleotit (veya bunun bir sarmalD] kullanabilmektedir. "Spesifik olarak hibridlenebilir" ve "bütünleyici" DNA veya RNA hedefi ve oligonükleotit arasßha gelen spesifik ve stabil baglamanI meydana gelecegi sekilde yeterli bir derece bütünleyiciligi belirten terimlerdir. Bir oligonükleotitin spesifik olarak hibridlenebilir olmasEiçin hedef nükleik asit sekans- %100 bir oranda bütünleyici olmasEgerekmedigi kabul edilmektedir. Bir oligonükleotit, bir oligonükleotitin bagüJir fayda kaybÜ/eya buradan ifadeye yol açmak üzere hedef molekülün normal fonksiyonuna müdahale ettiginde, özellikle hibridlenebilir olmaktadlîl ve oligonükleotitin hedef olmayan sekanslara, spesifik bagI istendigi kosullar altIa, yani, in vivo tahliller veya terapötik tedavi durumundaki nzyolojik kosullar altia veya, in vitro tahlillerde, tahlillerin yürütülmedigi kosullar altlEtla spesifik olmayan baglüdan kaçIEmak için spesifik baz eslemenin yeterli bir derecesi mevcuttur. Böylelikle, diger yapllând lîilnalarda bu oligonükleotit, hedeflenen mRNA veya genin bölgesiyle veya bunun spesifik olarak hibridlestirilebildigi bölge ile klýlaslandlgilda 1, 2 veya 3 baz ikamesi kapsamaktadlü Belirli yapilândlElnalarda, bulusa göre yöntem, RNA engelleme (RNAi) molekülleri ile iliskilendirilebilen nükleik asit partiküllerini verebilmektedir. RNAi moleküllerini kullanan RNA engelleme yöntemleri, ilgili gen veya polinükleotid ifadelerini bozmak üzere kullanliâbilmektedir. siRNA'Iar ve RNA dupleksleri genellikle RNAi-ile endüklenen sessizlestirme kompleksi (RISC) olarak bilinen bir sitoplazmik çoklu-protein ile iliskilendirilen -30 nükleotit uzunlugunda olmaktadß siRNA ile yüklü RISC homolog mRNA transkriptlerinin bozunmas. araciliKl etmektedir; dolaylîlsîla siRNA yüksek spesifiklige sahip protein ifadesini klîrlnak üzere tasarlanabilmektedir. Diger antisens teknolojilerinin aksine, siRNA kodlanmayan RNA araclIJJjllîla gen ifadesini kontrol etmek üzere evrimlesen dogal bir mekanizma aracIIJEMa islev görmektedir. Bu durum genel olarak, bunlarlEl etkinliklerinin, antisens oligonükleotit veya ribozimlerden in vitro ve in vivo'da daha etkili olmasi. nedeni olarak kabul edilmektedir. RNAi reaktifleri, DNA sensiz RNA antisens hibridleri, RNA sensizDNA antisens hibridleri kapsayabilmektedir. Böylelikle, bu farkllîltip çift sarmallü moleküllerden herhangi birini içeren RNAI molekülleri kullanllâbilmektedir. Buna ek olarak, RNAI moleküllerinin kullanüâbildigi ve çok çesitli formlarda hücrelere sokulabildigi kabul edilmektedir. Buna uygun olarak, burada kullanllglüizere, RNAI molekülleri, iki ayrBsarmaI yani bir sens sarmalEl/e bir antisens sarmalüçeren çift sarmalllîbolinükleotidleri kapsayan hücrelere bir RNAI yaniÜEEndükleyebilen herhangi bir molekül veya bu moleküllerin hepsini kapsayabilmektedir, örnegin küçük engelleyen RNA (siRNA); bir çift sarmallübölge olusturan bütünleyici sekanslarI keskin bir döngüsünü içeren polinükleotidler, örnegin shRNAi molekülleri, ve yalnEl veya diger polinükleotidler ile birlikte bir çift sarmallEbolinükleotid olusturabilen bir veya daha fazla polinükleotidi ifade eden ifade vektörleri. RNA engelleme (RNAI) hedef polinükleotidlerin ifadesini spesifik olarak inhibe etmek üzere kullanilâbilmektedir. Çift sarmalIERNA- aracllliîlgen basküânmasüve nükleik asit ifadesine, bulusa göre dsRNA, siRNA veya shRNA'nI hücrelere veya organizmalara sokulmasEIile ulasllâbilmektedir. siRNA çift sarmaIIERNA veya hem RNA hem de DNA içerebilen bir hibrid molekül olabilmektedir, örnegin bir RNA sarmalEle bir DNA sarmalEleya sisiRNA. Spesifik polinükleotidleri hedeflendiren RNAI molekülleri teknikte bilinen prosedürlere göre kolaylilîla hazlîllanabilmektedir. Buna uygun olarak, teknikte uzman olan kisi, çok çesitli farklIZI siRNA moleküllerinin bir spesifik gen veya transkripti hedef almak üzere kullanllâbilecegini kabul edecektir. Belirli yapllândlîilnalarda, bulusa göre siRNA molekülleri çift sarmalI-ve uzunluk bakIilIiUan arasiîitla her bir tamsaylsîükapsayan 16-30 veya 18-25 nükleotit arasiEtladlE Genel olarak, siRNA molekülleri, bir hedef DNA molekülün bir sarmal. tamamen bütünleyici olmaktadß Diger yapilând Hnalarda, siRNA'Iar, örnegin 2'-deoksi veya 2'-O-metil modifikasyonu gibi bir modifiye edilmis bilesime sahip olabilmektedir. Bununla birlikte, tercih edilen yapllândlülnalarda, siRNAnI tüm sarmalÇlZ'-deoksi veya 2'-O-metille modifiye edilmis bazlar ile yapHBiamaktadlEl Belirli yapliândlElnalarda, mevcut bulus nükleik asitlerin bir Iipit katmanEl içerisinde kapsüllendigi, Iipitle-kapsüllenen nükleik asitin üretilmesine yönelik yöntemler ile ilgilidir. Bu tür siRNA oligonükleotitlerini içeren nükleik asit-Iipit partikülleri asaglkileri kapsayan birçok biyofiziksel parametrelerin kullanianasEile karakterize edilmektedir: (1) nükleik asite lipit 0ranü(2) kapsülleme verimliligi; ve (3) partikül boyutu. Yüksek kapsülleme verimliligi, iyi bir nükleaz direnci ve serum stabilitesi ve genellikle çap bakIiIdan 200 nm'den daha az kontrol edilebilir partikül boyutu arzu edilmektedir. Buna ek olarak, nükleik asit polimerin dogasi: nükleaz direncini uygulamaya yönelik bir çabasüJlan nükleik asit modifikasyonunun, bir çok durumunda yalntha slBJIBJEl bir direnç saglarken terapötiklerin maliyetine katklElh bulunmasIan kaynaklüalarak önemli olmaktadlEl Aksi belirtilmedigi sürece, bu kriterler, bu tarifnamede asaglilhki gibi hesaplanmaktadlîl Nükleik asite Iipit oranüaynDhacimdeki Iipit miktarlZlile bölünen belirli bir preparasyon hacminde nükleik asitin miktarIlEl Bu durum, bir mol bas. mol baz-a veya bir aglElllZl bas. aglEiIEHJainlizerinde veya bir ag [Elini] bas. mol bazßlarak ifade edilebilmektedir. Nihai, uygulamaya haziEl formülasyonlar için nükleik asitzlipit oranEI diyalizin ardian hesaplanmaktadlîl kromatografi ve/veya enzim (örnegin nükleaz) sindirimi, mümkün oldugunca dlgal nükleik asitin çilZhrilIhasEIçin kullanma sokulmaktadlEl Kapsülleme siRNA kapsülleme verimliligini (EE) belirlemek üzere, Iipit-nükleik asit partikülleri içinde yüzde olarak ifade edilen siRNA kapsüllenmektedir, bir RiboGreen tahlilinden asag-ki gibi faydalanilBiaktadlE Prosedür, çözeltideki tek sarmalIEl ve dupleks RNA veya DNA konsantrasyonunu belirlemek üzere kullanllâbilmektedir. Ekipman BioTek Instruments, Inc. FLx800, çesitli pipetleri ve bir vorteks karlgtlElEEl kapsamaktadlü Reaktifler RNAz-içermeyen su (MiIIiQ derecesi veya esdegeri), 20x TE tamponu "RNaz içermez" (Invitrogen, T11493 veya esdegeri), suda Quant-iT RiboGreen Reaktif (Invitrogen, R11491) ve %10 Triton X- kapsamaktad lü silindir kullanilârak 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarilBralelZi/e 2 mL'lik 20X TE Tampon çözeltisinin santrifüj tüpüne pipetlenmesini ve bir vorteks karSIlElEERullanllârak karlgtlîllBiasIEl içermektedir. mL'Iik konik bir tüpe süslýla %10 Triton X-100'den 2 mL veya 1 mL oranIa pipetlemeyi, sßslîla IX TE tamponuna 8 mL veya 9 mL ilave edilmesini ve iyice karlglnasü Için döndürülmesini içermektedir. RiboGreen çallglna çözeltisinin preparasyonu, RiboGreen Reaktifinin bir dondurulmus stogunun oda lebkliglia Elîllüiak üzere çüîhrtlliiasID/e TE tamponu ile 1:200 oranlEUa seyreltilmesini içermektedir. Santrifüj tüpü çözeltiye herhangi bir aslEEllglgJI ulasmasIEl önlemek üzere alüminyum folyo ile sarilBiaktadlE Bir standart, bir RNA çözeltisinin TE tamponu içerisinde hazlElanmasEl/e 96 çukur katmanEl içine kaplanmasüle halelanmaktadlB Numuneler yaklaslElSO pg/mL siRNA oran-a bir nihai konsantrasyona seyreltilmektedir ve Sekil 1'de görüldügü üzere 96 çukur katmanlEb aktarllmaktadü RiboGreen çallgtna çözeltisi eklenmektedir ve her bir numune ve standart ile karlStlEllIhaktadlB Numuneler analiz edilmesinin öncesinde karanllEta 1-2 dakika boyunca inkübe edilmektedir. TE Tamponunda %1 Triton X-IOO numuneleri kopyalamak Üzere eklenmektedir ve RiboGreen çallglna çözeltisi ardIan eklenmektedir. Kapsülleme verimliligi, her bir numuneden al-n flüoresan sonuçlarII ortalamasEl kullanilârak flüoresan ölçümlerinden belirlenmektedir, dlglnumunelerin ortalamasII referans degeri için (RNA'nI yoklugunda RiboGreen reaktifinin flüoresanm ve Triton x-100'ün mevcudiyetine bagllîlolarak sinyal yogunlugunda azaltiliianl %8'lik bir düzeltilmesinin ardIan düzeltilmektedir. Kapsülleme verimliligi bunun ardIan asaglahki denklem kullanilârak hesaplanmaktadlîl EE = (Triton numunesi- lipozom numunesi)/(Triton numunesi) Yani, kapsülleme verimliligi, toplam RNA degeri (Iipozomun deterjan ile çözülmesinin ardIan ölçülen) ve toplam RNA degerine bölünen intakt lipozom deger arasIdaki farklHJKtlE Intakt lipozom numunesinden elde edilen flüoresan, çözeltide serbest RNA artEl lipozomun dlglyüzeyi üzerinde absorbe edilen RNA'dan olusacaktlEl Boyut olusan partiküllerin boyutunu (çapDIl belirtmektedir. Boyut dagllßlîlbir Malvern Zetasizer Nano-ZS dinamik Eilîlsaçllilîli (DLS) araclîkullanilârak belirlenmektedir. Bu prosedür, ortalama hacim çapIlEl, Z-ortalama çap.. ve proses içi lipozom numunelerinin polidispersitesinin ölçümü için geçerli olmaktadlEI Polidispersite, partikül boyutu dagiülîiilEla Ölçümler oda süklkjlia gerçeklestirilmektedir. Numuneler ve reaktifler oda slîlakl[gilda dengelenmelidir. Hacim-aglEllllZlEl ortalama partikül boyutu ve polidispersite indeksi belirlenmektedir. Imalat yöntemi Lipozam/arßpreparasyonu Lipit karm etanol, tercihen salt etanol olan bir su ile çözünebilir organik çözücüde çözünmektedir. Birçok yapilândlîilnada, organik çözücü etanol, ticari olarak ulasilâbilir formunda kullanEIân organik çözücü etanol olmaktadE Mevcut bulusa göre yöntemin bir örnek niteligindeki yapüândlîilnasia, lipitlerin bir karEIEJiEI kullanilîhaktadlü burada lipitlerin karlglüliükatyonik amino Iipitler, nötr Iipitler (bir amino Iipit dlglüdaki Iipitler), bir steroiddir (örnegin kolesterol) ve bir PEG-ile modifiye edilmis Iipit (örnegin bir PEG-S-DMG, PEG-C-DOMG veya PEGDMA) organik çözücüde es olarak çözünebilmektedir. Tercih edilen yapllândlîilnalarda, Iipit karlglmüesasen bir katyonik amino edilen yapllândlElnalarda, Iipit karmübir katyonik Iipit, DOPE (veya, ya bir iyonlasabilir ya da bir sabit katyonik yüke sahip baska yardncüipit), kolesterol ve çesitli molar oranlarda PEG-eslenik Iipitten olusmaktadlEl Tercih edilen molar aral[lZ]ar mol cinsinden %40 ila 60 edilmis Iipit araliglIadlEl Bir hedeflendirme Iipiti örnegin diVA-PEG750-diVA (veya diger VA-eslenikli hedeflendirme eklenebilmektedir. Lipitin toplam konsantrasyonu 25 mg/ml'dan daha azdlü tercihen 5 mg/ml'dan daha azdlE Lipit karlglühümembran aracilJglýla filtrelenmektedir, örnegin bir 0.45 veya 0.2 pm filtre. Bulusa göre yöntemin bir yapHândlElnaleh uygun olarak, Iipit karlSlEiübir tamponlanmlglsulu çözelti ile birlestirilebilmektedir. Tamponlanmlgl sulu çözelti, tamponun Iipit karßlüli Idaki bir protonlu lipitin pKa'sIan daha az bir pH'a sahip oldugu bir çözelti olabilmektedir. Uygun tamponlarlE] örnekleri, sitrat, fosfat ve asetatlîlkapsamaktadlEI Özellikle tercih edilen bir tampon sitrat tampondur. Tercih edilen tamponlar kapsüllenen nükleik asitin kimyas. baglEl olarak 1 ila 1000 mM aral[g]ia anyon konsantrasyonunda olacaktlîl ve tampon konsantrasyonunun en uygun hale getirilmesi yüksek yükleme seviyelerine ulasmak için önemli olabilmektedir. Partikül membranlZboyunca ozmotik potansiyeli dengeleyecek olan örnegin partiküller etanolün ç[lZlar[lE1asl:liçin diyalize edildiginde, pH'üarttßn, veya bir farmasötik olarak kabul edilebilir taslýlîüeya seyreltici ile karlgan bir kriyoprotektan ve/veya bir iyonik olmayan çözünenin eklenmesi uygun olabilmektedir. Tampondaki nükleik asit miktarEtl).08 ila 0.8 mg/mL araledadlEl Bulusa göre yöntemin bir yapllândünasia etanolün eklenme zamanIda, sulu çözeltinin lelakllgEZS ila 45° C, tercihen 30 ila 40°C araleUadE Etanol çözeltisi, sulu çözeltiye, hava-su ara yüzeyi üzerinde dar bir aknda püskürtülerek veya sulu çözeltiye daldlElIân bir tüp aradIJgllîla iletilen etanol arasIiaki bir slîßmra yüzeyi aracmlîla eklenmektedir. Organik çözelti organik çözeltiyi sulu çözeltiye kontrol edilen bir oranda, tercihen sabit bir oranda ileten bir pompa ile veya yerçekimi ile eklenmektedir. Organik çözeltinin iletilmesi 1 dakika ila 100 dakika arasIda, tercihen 1 ila 25 dakika arasIda tamamlanmaktadlEl Organik çözelti, tek bir püskürtücü veya akIi araclEgllSLla, bir tüp veya nozul aracHJgllýla veya bir çoklu-nozul sistemi araclJEMa eklenebilmektedir. Organik çözelti sulu çözeltiye eklenirken, sonuçta olusan çözelti karStIEllârak, çalkalanarak veya çevrilerek karlgtlEllâbilmektedir. Ekleme adIilZIO/025 ila 45 etanol, en çok tercihen %35'Iik etanol oranIda bir nihai konsantrasyon ile sonuçlanmaktadE Nihai çözelti, diyaliz veya filtreleme, tercihen diyafiltrasyon ile organik çözeltinin ç[lZhr[IB1asü için islenmektedir. Etanol ç[ElarIIlElken, sulu çözelti bir nötr pH, pH 6.8 ila pH 7.5 arasIda, tercihen pH 7.2 oranlEba bir tek tamponlu, örnegin bir fosfat veya HEPES tamponuna dönüstürülmektedir. Sonuçta olusan 5qu çözelti tercihen depolama veya kullanIi öncesinde, örnegin bir 0.22 um filtre araclEgllîLla filtreleme ile sterilize edilmektedir. Negatif olarak yüklenen terapöt/k po//mer/eri kapsül/e yen /i'pozom/ar Bulusa göre yöntem, bir negatif olarak yüklenmis terapötik nükleik asit polimerine, yani bir RNA molekülüne sahip lipit partiküllerinin hazlEllanmasI yönelik kullanlgüblmaktadlü Burada açllZlanan yöntemlerde, Iipitlerin bir karlgmlîlnükleik asit polimerinin bir sulu çözeltisi ile birlestirilmektedir. Polimer, sonuçta olusan Iipit partiküllerinde etkili bir sekilde ka psüllenmektedir. Nanopartiküller, bir polianyonik etken ajan veya terapötik ajan, yani bir RNA ve bir, iki veya üç biyouyumlu polimer kapsayabilmektedir. Terapötik ajanlar nükleik asitlerdir. Negatif olarak yüklenen polimerin toplam yükü, ekleme zamanlEUa Iipit karlglfrlidaki pozitif yüklerin say_ esit veya bu say-n daha az olmalIB tercihen aglElllEJ cinsinden 0.06 ila tercihen 1:2.5 ila 1:1.bir nihai oranIia mevcuttur. Lipitlerin karlglEJiII bir yüke sahip bir katyonik Iipit içermesi durumunda lipit vesikülleri, polimeri kapsüllemesi ve yakalamaslîiçin negatif olarak yüklenen nükleik asit polimerinin mevcudiyetinde olusturulmaktadIEl Sonuçta olusan partiküller, ortamI pH'II fizyolojik pH veya daha fazlasi arttlElIIhasElile nötr hale getirilebilmektedir. Bu sekilde olusturulan vesiküller, nükleik asitin yüksek içerigine sahip homojen vesikül boyutunun formülasyonlarIIZI saglamaktadlîl Her iki durumda da polimerleri (nanopartikülleri) kapsülleyen vesiküller 50 ila 150 nm araletIa bir boyuta sahiptir. Bulusa göre bir yapllând [Elnanl yöntemine uygun olarak, lipit karElînilZl negatif olarak yüklenmis nükleik asit polimer içeren bir tamponlanmgl sulu çözelti ile birlestirilebilmektedir. Tamponlanmlglsulu çözelti, tamponun lipit karlSlElllEUaki bir protonlu Iipitin pKa'sIan daha az bir pH'a sahip oldugu bir çözelti olabilmektedir. Uygun tamponlar. örnekleri, sitrat, fosfat ve asetat ve MES'i kapsamaktadlE Özellikle tercih edilen bir tampon sitrat tampondur. Tercih edilen tamponlar kapsüllenen polimerin kimyas- baglElolarak 1 ila 1000 mM anyon arallglIa olacaktlîlve tampon konsantrasyonunun en uygun hale getirilmesi yüksek yükleme seviyelerine ulasmak Için önemli olabilmektedir. Partikül membranüboyunca ozmotik potansiyeli dengeleyecek olan partiküller etanolün çlEhrlßiasElçin diyalize edildiginde, pH'Darttlßn, veya bir farmasötik olarak kabul edilebilir taslsîIEEI/e/veya seyreltici ile karisan bir kriyoprotektan ve/veya bir iyonik olmayan çözünenin eklenmesi uygun olabilmektedir. RNA için, burada bulusa göre yöntemin bir yapllândlünaslîblarak aç[E]anan prosesin bir semaslZI Sekil 1'de gösterilmektedir. Çözeltiler, Iiyofilize veya katEi malzemenin suda çözünmesi, tercihen örnegin 50 mM sitrat ile pH 3.5-4.5 oranIa tamponlanmasElile haziEianmaktadlB Tampondaki nükleik asit miktarü/aklasllîl 0.08 ila 0.8 mg/mL arasiEUadIEl Etanolün eklenmesi sßslia, sulu çözeltinin leiakI[g]|:I25 ila 45° C, tercihen 30 ila 40°C arasIadlEi Tek sarmallüiükleik asitin kullaniiîhaslîihalinde, yükseltilmis bir slîiakliiZta kisaca, örnegin 65°C'de 1-2 dakika ElfilBiasEllullanEllîdüabilmektedir. Etanol çözeltisi, sulu çözeltiye, hava-su ara yüzeyi üzerinde dar bir akIida püskürtülerek veya sulu çözeltiye sahip bir konteynere baglanan bir tüp aracillglýla iletilen etanol arasIaki bir siýEsiîüra yüzeyi araclügiûla eklenmektedir. Organik çözelti organik çözeltiyi sulu çözeltiye kontrol edilen bir oranda, tercihen sabit bir oranda iletilmesi ile eklenmektedir. Organik çözeltinin iletilmesi 1 dakika ila 100 dakika araletla, tercihen 1 ila 25 dakika arasia tamamlanmaktadlü Organik çözelti, tek bir püskürtücü veya aki araclEIgilîLla, bir tüp veya nozul aracHJgilýla veya bir çoklu-nozul sistemi araclEigilîia eklenebilmektedir. Organik çözelti sulu çözeltiye eklenirken, sonuçta olusan çözelti karlgtlEiiiârak, çalkalanarak veya çevrilerek karlgtlîllâbilmektedir. Ekleme adIIÇIlipozomal ikili katman yap-Ebozmak için yeterli olan, yani %25 ila 45 etanol, en çok tercihen %35'Iik etanol oranEtla bir nihai konsantrasyon ile sonuçlanmaktadlEi Mevcut bulusa göre yöntem ile elde edilen lipit-nükleik asit partikülleri için, nihai RNA yük:yük oranm Nihai çözelti, diyaliz veya filtreleme, tercihen diyafiltrasyon ile organik çözeltinin çilZiarilIhasEl için islenmektedir. Etanol ç[iZiarIIlElken, sulu çözelti bir nötr pH, pH 6.8 ila pH 7.5 arasIa, tercihen pH 7.2 oranlEha bir tek tamponlu, örnegin bir fosfat tamponuna dönüstürülmektedir. Sonuçta olusan sulu çözelti tercihen depolama veya kullanIi öncesinde, örnegin bir 0.22 um filtre araclügiüia filtreleme ile sterilize edilmektedir. Nihai kapsülleme verimliligi %85'ten daha fazladB Nihai ortalama partikül çapEBO ila 150 nm'dir. Polidispersite indeksi (PDI) 0.2'den daha az, tercihen 0.1'den daha azdiEI Liyof'ilizasyon Mevcut açllZIama, kEinen yeniden yapilând-[giia, minimum miktarda bir büyük yigllgima sahip olan bir Iiyofilize edilmis farmasötik bilesim ile ilgilidir. Bu tür liyofilize edilmis farmasötik bilesimler mevcut bulusun yapllândlîiinalarlîldegildir. Bu tür büyük ylgiigülar yaklaslKl 0.2 um'den daha büyük, yaklasilîl 0.5 um'den daha büyük, veya yaklasilZll um'den daha büyük bir boyuta sahip olabilmektedir, ve bir yeniden yapllândlElna çözeltisinde arzu edilmeyebilmektedir. Yigilglm boyutlarElJS Farmakopesi 32<788'de belirtilenler de dahil olmak üzere birçok teknik kullanilârak ölçülebilmektedir. Testler bir !51121 engellemesi ile partikül sayIi testini, mikroskobik partikül sayIi testini, lazer k-IiIl:lve tek partiküllü optik algHâmayEikapsayabiImektedir. Bir yapHândlEnada, belirli bir numunedeki partikül boyutu, lazer k-IiEl/e/veya tek partiküllü optik algllâma ile ölçülmektedir. Dinamik @KI saçll]]î1ll:l(DLS), partikül boyutunu ölçmek üzere kullanilâbilmektedir ancak bu Brownian hareketine dayanmaktadiîl dolayEIýla teknik bain daha büyük partikülleri tespit edemeyebilmektedir. Lazer k-IiÇi partikül ve süspansiyon ortamEIaralebaki kiBlBîa indeksindeki farklÜJKIara dayanmaktadlB Teknik mikron aItIZIiIa milimetre araligiUaki partikülleri tespit edebilmektedir. Göreli olarak küçük (örnegin agiîliiKça yaklasliZl %1 ila 5) miktarlarda daha büyük partiküller, nanopartikül süspansiyonlarIa tespit edilebilmektedir. Tek partiküllü optik algllâma (SPOS) yaklasiKiO.5 pm oran aki tek partikülleri saymak üzere seyrelti süspansiyonlarII @El engellemesini kullanmaktaclE Ölçüleri numunenin partikül konsantrasyonunun bilinmesi ile, yIglElînilarI aglEliiiZJ yüzdeleri veya yigilglînl konsantrasyonu (partiküller/mL) hesaplanabilmektedir. Yglgüllarl olusumu Iiyofilizasyonunun dondurma ve/veya kurutma adIiIlarüesnasa örnegin partiküllerin yüzeyinin dehidrasyonuna bagIEiolarak meydana gelebilmektedir. Dondurma prosesi, partiküller arasIaki mesafeyi buz formlarüolarak azaltabilen, bir Süspansiyonda liyofilizasyon öncesinde polisakkaritier gibi liyoprotektanlar kullanllârak dehidrasyon önlenebilmektedir. Uygun polisakkaritier sukroz, Iaktuloz, Iaktoz, maltoz, trehaloz veya sellobiyoz, kojibiyoz, nigeroz, izomaltoz, trehaloz, sophoroz, Iaminaribiyoz, gentio-biyoz, tranoz, maltuloz, palatinoz, gentiobiuloz, mannoibiyoz, melibiyoz, rutinoz, rutinüloz ve ksilobiyozu kapsamaktadiB Bir yapllândlEinada, bilesim sakaroz olan bir polisakkaridi içermektedir. Baska bir yapilândlûinada, bilesim trehaloz olan bir polisakkaridi içermektedir. Basvuru sahiplerinin sonuçlarü baslanglgl süspansiyonu ile klýhslandlgilütla, esdeger DLS boyut dagHIliilarlElI yeniden yapüândlîilna sonraletla elde edildigini göstermektedir. Önceden bir camsEyardIiclînadde içinde makro moleküllerin hareketsizlestirme prosesi olan camsüâstlünanl IipozomlarI ygllgmuîll önlenmesine katk- bulunmayan bir faktör oldugu ve sekerin hipertonik çözeltilerinin gerektigi düsünülmekteydi (Alison ve ark.). Mevcut bulus sahipleri, IipozomlarI yglglmlülipozomal difüzyon bariyerlerinin bozulmasIüIe nükleik asit oran. baglübldugunu kesfetmistir. Talep edilen bulusun bir yapllândlîrlnasmmayan mevcut bulusa göre bir yapliândlElnada, bilesim agElilEl cinsinden %12 ila 15 sakaroz ve 5 ila 20 mg/ml Iipit, tercihen %12 sakaroz ve 9 mg/ml lipit içermektedir. Daha tercihen, bilesim ayrlîla bir tampon, en çok tercihen bir nötr pH'ta HEPES içermektedir. Liyofilizasyon adnlarüuygun bir cam haznede, tercihen bir 10 ml'lik silindirik cam sisede gerçeklestirilmektedir. Cam sise, kisa süre içerisinde -40°C'de n daha az ve oda slîlakligllîitlan daha fazla aslîlßlîiaklßdegisimlerine dayanilZJEbImalIlElve homojen bir sekilde kesilmelidir. Tercihen bir 3ml'lik hacimde, ve tercihen 9 mg/ml Iipite sahip hacim arttEEEjan ve nükleik asit kapsülleyen lipozomlarEIÇeren bilesim,siseye eklenmektedir. Liyofilize etme adnübilesimi yaklasllZJ-40°C.'de n daha fazla, veya yaklas[lZl-30°C.'den daha az bir leiakllEta dondurmaylZl bir dondurulmus bilesimin olusturulmasllîl ve dondurulmus bilesimin Iiyofilize bilesimi olusturmak üzere kurutulmasIEilçerebiImektedir. Dondurma adli, tercihen yaklasllîlö dakika sonrasIa, tercihen 20 ila -40°C araletla 1°C./dakikada, slîlakllEta nihai bir dogrusal düsüse yol açmaktadlEI Daha tercihen %12 ila 15 oranlEda sakaroz kullanllâbilmektedir, ve kurutma adIiEbnceIikle yaklasiKJ-IS ila yaklas[lZl -35°C. araleUa bir düsük slîiaklllîta, ve bunun ardlEUan yaklaslEl -25°C.'ye bir oda slîakllgiütian daha yüksek lelakIitha yaklasilZJ 50 ila 150 mTorr'da olmaktadlîlve üç ila yedi günde tamamlanmaktadlEl Mevcut aç[ElamanI baska bir yapUândIElnasIa, trehaloz kullanlEbilmektedir, ve kurutma adliüöncelikle yaklasllZl 0 ila yaklasUZJ -15°C.'de, ve ardIian daha yüksek bir leiakIltha yaklaslEl 50 ila 100 mTorr'da olmaktadlE Baska bir yönünde mevcut bulus, bir sekerin ve bir tuzun yEglElEJlElve Iipozomun içinden nükleik asitin salIiIEönlemek için liyofilize formülasyona eklenmesini içeren bir farmasötik nanopartikül bilesimdeki partikül ylgllSlElIEbüyük ölçüde engellemeye yönelik bir yöntem saglamaktadlEl AyrlEla bu yön de talep edilen bulusun bir yapllândlîilnaslîlegildir. Farmasötik bilesimler Mevcut bulusa göre yöntem ile elde edilebilen, bir nükleik asit terapötik ajanEIile iliskilendirilen Iipit partiküller, örnegin ayrlîla bir farmasötik olarak kabul edilebilir seyreltici, yardIiclIilnadde, veya fizyolojik salin veya fosfat tamponu gibi taslýlEEiçeren uygulama yolu ve standart farmasötik pratik ile uyumlu seçilen bir farmasötik bilesim olarak formüle edilebilmektedir. Bu farmasötik bilesimler mevcut bulusun yapllândlünalarüolarak talep edilmemektedir. Belirli yapllândlElnalarda, bulusa göre yöntem ile elde edilen Iipit-nükleik asit partiküllerini içeren farmasötik bilesimler, standart tekniklere göre hazlîllanmaktadlîl ve ilaveten bir farmasötik olarak kabul edilebilir taslsîlîlilçermektedir. Genel olarak, normal salin, farmasötik olarak kabul edilebilir tasMEEblarak kullanla sokulacaktlB Diger uygun taslîlalâr örnegin su, tamponlanmlglsu %0.9 oranlEUa salin, %03 oranlEda glisin, bir seker veya polisakkarid, örnegin albümin, Iipoprotein, globülin gibi gelistirilmis stabiliteye yönelik glikoproteinler kapsayan sakaroz ve/veya trehaloz kapsamaktadE Hacim arttlElEüjanlar, kriyoprotektanlar ve&/veya Iiyoprotektan, ve aynElsekiIde metal radikal temizleyiciler örnegin EDTA dâhil edilebilmektedir. Salin veya diger tuz içeren taslîlEllârElçeren bilesimlerde, taslîlîlîercihen asaglki Iipit partikül formasyonuna eklenmektedir. Böylelikle, Iipit-nükleik asit bilesimlerinin olusturulmasi. ardIan, bilesimler salin gibi farmasötik olarak kabul edilebilir taslýlüârl içine seyreltilebilmektedir. Sonuçta olusan farmasötik preparasyonlar, geleneksel, iyi bilinen sterilizasyon teknikleri ile sterilize edilebilmektedir. Sulu çözeltiler, sonrasIa kullanIia yönelik olarak paketlenebilmektedir veya aseptik kosullar altIa filtrelenip liyofilize edilebilmektedir, liyofilize edilmis preparasyon uygulama öncesinde steril bir sulu çözelti ile birlestirilmektedir. Bilesimler pH ayarlama ve tamponlama ajanlarÇltonisite ayarlama ajanlarlÇlörnegin sodyum asetat, sodyum laktat, sodyum klorür, potasyum klorür, kalsiyum klorür vb. gibi fizyolojik kosullara yaklastlElIIhasElgereken farmasötik olarak kabul edilebilir yardIicEImaddeler Içerebilmektedir. Buna ek olarak, Iipitik süspansiyon, lipitleri serbest radikallere ve depolamadaki Iipit peroksidatif zararlara karslîl koruyan lipit-koruyucu ajanlar kapsayabilmektedir. Lipofilik serbest radikal suvericiler, örnegin bir tokoferol ve suda çözünür demir spesifik selat ajanlarÇlömegin ferrioksamin uygun olmaktadlEI Farmasötik formülasyonlardaki Iipit partikül veya Iipit-nükleik asit partikül konsantrasyonu genis ölçüde degiskenlik gösterebilmektedir, yani yaklasllg %0.01'den daha az, genellikle aglHllKlsa yaklasllZl %005 ila 5 aralfglia veya en az bu miktar ila %10 ila 30'a kadar olabilmektedir, ve öncelikli olarak seçilen uygulamanI belirli moduna uygun olarak akiskan hacimleri, vizkositeler vb. ile seçilecektir. Örnegin, konsantrasyon islem ile iliskilendirilen aklgkan yükünü azaltmak üzere arttElâbilmektedir. Bu durum özellikle aterosklerosis ile iliskili konjestif kalp yetmezligi veya siddetli hipertansiyona sahip hastalarda arzu edilebilir olmaktadlEl Alternatif olarak, irrite edici Iipitlerden olusan kompleksler, uygulama alan-aki yanmayEI azaltmak üzere düsük konsantrasyonlara seyreltilebilmektedir. Bir grup yapllând Hnada, nükleik asit bir eklenmis etikete sahip olacaktIElve (bütünleyici nükleik asitin mevcudiyetini belirterek) tanlýb yönelik kullanllâcaktIE Bu durumda, uygulanan komplekslerin miktarÇl kullanllân belirli etikete tanllânan hastalllîl evresine ve klinisyenin kararlüla bagIEl olacaktlü ancak genellikle vücut aglHl[glElI kilogramlîbas. yaklasllîl 0.01 ve yaklaslEl 50 mg araletla, tercihen vücut ag Ellglll yaklaslKl%0.001 ve yaklaslKlS mg/kg arasIa olacaktE KullanlB1 Yöntemi Bulusa göre yöntem ile elde edilen Iipit partiküller, bir nükleik asitin bir hücreye in vitro veya in vivo olarak iletilmesi için kullanilâbilmektedir. Söz konusu kullanIiIar talep edilen bulusun yapllândülnalarlîdlegildir. Lipit partiküllerin ve ilgili farmasötik bilesimlerin kullan" yönelik çesitli yöntemlerin asag-ki açlKIamaslZlnükIeik asit-Iipit partiküllerine iliskin aç[lZlama ile örneklendirilirken, bu yöntemlerin ve bilesimlerin bu tür bir tedaviden faydalanabilen herhangi bir hastallglEl veya rahatslîligll tedavisine yönelik herhangi bir terapötik ajanI iletimine yönelik kolayl[lZla uyarlanabilecegi kabul edilmektedir. Ayrlîla burada açiEianan ancak yine talep edilen bulusun yapllândlElnalarIJJlmayan yöntemler bir nükleik asitin bir hücre içerisine sokulmasi yöneliktir. Hücrelere sokulmasüçin tercih edilen nükleik asitler, siRNA, baglglKlHletimüle edici oligonükleotitler, plazmidler, antisens ve ribozimlerdir. Bu yöntemler mevcut bulusa göre yöntem ile elde edilen partiküller ve bilesimlerin, hücre içi iletimin meydana gelmesi için yeterli olan bir süre boyunca hücrelere temas ettirilmesi ile gerçeklestirilebiImektedir. Mevcut bulusun yöntemi ile elde edilen bilesimler, neredeyse her hücre tipine absorbe edilebilmektedir. Adsorbe edilmesi halinde, nükleik asit-Iipit partikülleri, Iipitleri hücre membranlarEile degistiren, hücrelerin bir bölümü ile hale getirilebilmektedir veya hücreler ile kaynayabilmektedir. Kompleksin nükleik asit bölümünün aktarIiElveya birlestirilmesi, bu yollardan herhangi biri araciIlgiiýla gerçeklestirilebilmektedir. Partiküllerin hücrelerin içine endositoz ile allEmasD durumunda, partiküllerin kapsüllenen nükleik asitin hücre sitoplazmasII içine sokulmasi yol açan ikili katman olmayan fazlarI olusturulmasEi araciIIgilýla endesomal membranI destabilize edilmesine yol açacak sekilde endosomal membran ile temasa geçtigine inanilîhaktadE Benzer sekilde, kaynasma gerçeklestiginde, partiküllerin hücre plazma membranEiiIe dogrudan kaynasmasüdurumunda, lipozom membranÇlhücre membranEiçine entegre olmaktadlElve lipozom içerikleri hücre içi slýlgüle birlestirilmektedir. Hücreler ve Iipit-nükleik asit bilesimleri arasIaki temas, in vitro olarak gerçeklestirilmesi durumunda, biyolojik olarak uygun ortamda meydana getirilecektir. Bilesimlerin konsantrasyonu, belirli uygulamaya baglEIolarak genis ölçüde degiskenlik gösterebilmektedir, ancak genellikle 1 pmol ve 10 mmol arasIa olmaktadlü Belirli yapilândiîrinalarda, hücrelerin lipit-nükleik asit bilesimleri ile islenmesi genellikle 1 ila 24 saat arasIa, tercihen 2 ila 8 saat arasIa süreler boyunca fizyolojik siElakIlElarda (37°C.) gerçeklestirilecektir. In vitro uygulamalara yönelik olarak, nükleik asitin iletimi, bitki veya hayvan kökenli, omurgalüieya omurgasiîlolmasldan bag Iisiîlolarak kültürdeki herhangi bir hücre büyümesine ve herhangi bir doku veya tipe olabilmektedir. Hücreler hayvan hücreleri, spesifik olarak memeli hücreleri, ve daha spesifik olarak insan hücreleri olabilmektedir. Bir Iipit-nükleik asit partikül süspansiyonu, yaklasilZl 103 ila yaklasilZl 105 hücre/mL, tercihen yaklasIKl 2x104 hücre/mL bir hücre yogunluguna sahip %60 ila 80 araliglIa konflüent kaplanmis] hücrelere eklenebilmektedir. Hücrelere eklenen süspansiyonun konsantrasyonu, tercihen yaklasilîi0.01 ila ZOpg/mL, tercihen yaklasilZi 1 ug/mL olmaktadiEi Tipik uygulamalar, spesifik hücresel hedefleri kümak veya susturmak üzere siRNAnI hücre içi iletimini saglayan iyi bilinen prosedürlerin kullanilüîasIElkapsamaktadIE Alternatif olarak uygulamalar, terapötik olarak kullanElElpolipeptidler için kod olan DNA veya mRNA sekanslarII iletimini kapsamaktadlB Bu uygulamalar talep edilen bulusun yapilândlElnalarEi degildir. Burada açllZJanan, talep edilen bulusun yapllândiîrlnalarlîölmayan yöntemler in vitro, ex vivo, veya in vivo olarak uygulanabilmektedir. Örnegin mevcut bulusun yöntemleri ile elde edilen bilesimler, ayriîb nükleik asitlerin hücrelere iletimine yönelik olarak, teknikte uzman olan kisilerce bilinen yöntemler kullanilârak kullanilâbilmektedir. In vivo uygulamaya yönelik olarak farmasötik bilesimler tercihen parenteral olarak uygulanmaktadlEl yani intraartiküler olarak, intrevenöz olarak, intraperitoneal olarak ,deri aItIan veya kas içinden. Belirli yapilândIElnalarda, farmasötik bilesimler, intravenöz olarak veya intraperitoneal olarak bir bolus enjeksiyonu ile uygulanmaktadiE Talep edilen bulusun yapilândünalarlîiolmayan burada açilZIanan diger yöntemlerde, farmasötik preparasyonlar, dokunun preparasyonunun dogrudan uygulanmaslîlile hedef dokuya temas ettirilebilmektedir. Uygulama topikal olarak "açikT ve "kapaliîiprosedürler ile yapiiâbilmektedir. "Topikal" ile anlatiiüiak istenen, farmasötik preparasyonunun dogrudan ortama maruz kalan cilt, orofarinks, ve digl 0ditori kanal gibi bir dokuya uygulanmasIE uygulanacaglîlbir alttaki dokunun dogrudan görünebilmesini kapsayan prosedürlerdir. Bu genellikle, cigerlere ulasmak üzere bir torakotomi, abdominal iç organlara ulasmak üzere abdominal laparotomi, veya hedef dokuya dogrudan cerrahi müdahele gibi bir cerrahi prosedür ile yapiiüiaktadIE "Kapallîiprosedürler, iç hedef dokular. dogrudan görülemedigi ancak ciltteki küçük yaralar araciIJgIIýia araçlarI sokulmasEl ile erisilebilen invazif prosedürlerdir. Örnegin, preparasyonlar, peritoneuma igne lavajElile uygulanabilmektedir. AynESekilde, farmasötik preparatlar, meninksler veya omurilige Iomber ponksiyon leileda infüzyon yoluyla uygulanabilmektedir, hastanI omurilikte spinal anestezi veya merazamid görüntülemesi için yaygiEl sekilde uyguland[giEiüzere uygun konumlandiîilhaslîlardian gelmektedir. Alternatif olarak, preparasyonlar, endoskopik cihazlar aracinmýla uygulanabilmektedir. Bulusa göre yöntem ile elde edilen lipit-nükleik asit bilesimleri ayrlEla bir cigerlere çekilen bir aerosolde, veya hastallgiI alaniEUa dogrudan enjeksiyon ile uygulanabilmektedir. Talep edilen bulusun yapilândlElnalarüilmayan mevcut açiiZlamanI yöntemleri, çesitli süjeler veya konaklarda uygulanabilmektedir. Tercih edilen süjeler veya konaklar, insanlar, insan olmayan primatlar, köpekler, kediler, sfgliîliar, ve atlar, koyunlar gibi memeli türleri kapsamaktadß Süje, bir hastaligiI veya rahatsiîiigiül tedavisi ve önlenmesine ihtiyaç duyan insan gibi bir memeli olabilmektedir, örnegin bir hastalilîlveya rahatslîligh yönelik riske sahip oldugu düsünülen veya bunun teshisi konulmus bir süje. Mevcut bulusa göre yöntem ile elde edilen Iipit-terapötik ajan partiküllerine yönelik dozajlar, terapötik ajanI Iipite olan oranlEb ve yasa, kiloya ve hastaniEi durumuna baglElolarak doktorun fikrine bagIIZJIacaktlEl Bir yapllândlElnada, mevcut bulus, talep edilen bulusun bir yapllândlünaslîblamayan, hedef polinükleotid veya polipektitelerin ifadelerinin modüle edilmesine yönelik bir yöntem saglamaktadlîi Bu yöntemler genel olarak bir hücrenin mevcut bulusun bir Iipit partikülü olan ve bir hedef polinükleotid veya polipeptidin ifadesini modüle edebilen bir nükleik asit ile iliskilendirilmektedir. Burada kullanIlgiüjzere "modüle etme" terimi, bir hedef polinükleotid veya polipeptidin ifadesinin degistirilmesine atlflia bulunmaktadlü FarklEyapllândlElnalarda, modüle etme arttlEina veya gelistirme anlam. gelebilmektedir, veya düsürme veya azaltma anlam. gelebilmektedir. Bir hedef polinükleotid veya polipeptidin ifadesinin seviyesinin ölçülmesine yönelik yöntemler bilinmektedir ve teknikte ulasllâbilirdir ve örnegin ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ve immünohistokimyasal teknikleri kapsamaktadlEl Belirli yapilândlîilnalarda, bir hedef polinükleotid veya polipeptidin ifadesinin karsllâst-[gilüba %50'den daha fazla olacak sekilde arttlEllBiaktadlElveya azaltilüîaktadlü Örnegin bir polipeptidin arttlEIlEilgl bir ifadesinin istenmesi halinde, nükleik asit istenilen polipeptidi kodlayan bir polinükleotid kapsayan bir ifade vektörü olabilmektedir. Diger taraftan,, bir polinükleotidin veya azaltllBilglifadesinin istenmesi halinde, nükleik asit, örnegin spesifik olarak hedef polipeptidi kodlayan bir polinükleotide hibride olan bir polinükleotid sekansIEiçeren bir antisens oligonükleotit, siRNA, veya mikroRNA olabilmektedir, böylelikle hedef polinükleotid ve polipeptidin ifadesini bozmaktadEl Alternatif olarak, nükleik asit bu tür bir antisens oligonükletoid, siRNA veya mikroRNA Ifade eden bir plazma olabilmektedir. Nükleik asit etken ajanEi/eya terapötik ajan [bir siRNA'dan, bir mikroRNA'dan, bir antisens oligonükleotitden seçilebilmektedir ve bir siRNA, bir mikroRNA, veya bir antisens oligonükleotit ifade edebilen, ve içinde siRNA, mikroRNA, veya antisens RNA'I polipeptidi kodlayan bir polinükleotidi spesifik olarak baglayan bir oligonükleotit, veya bunun bir tamamlay-ülmlipeptidin ifadesinin azaltllâcagßekilde içerdigi bir plazmit olabilmektedir. Nükleik asit alternatif olarak polipeptidi kodlayan bir plazmid veya bunun bir fonksiyonel varyantü/eya parçasEdJIabilmektedir, böylelikle polipeptidin veya bunun fonksiyonel varyantlZI veya fragmanII ifadesi arttiîilîhaktadlîl Ilgili yapllândlEinalarda, mevcut bulus, talep edilen bulusun bir yapliândlEinasElolmayan, süjeye, bir siRNA'dan, bir mikroRNA'dan, bir antisens oligonükleotitden seçildigi ve bir siRNA, bir mikroRNA, veya bir antisens oligonükleotit ifade edebilen, ve içinde siRNA, mikroRNA, veya antisens RNA'I polipeptidi kodlayan bir polinükleotidi spesifik olarak baglayan bir oligonükleotit, veya bunun bir tamamlay-Dçerdigi bir plazmitten seçildigi bir farmasötik bilesimin saglanmasIEiçeren, terapötik ajanI bir süjede bir polipeptidin asiEIEifadesi ile karakterize edilen bir hastalik] veya rahatslîligll tedavi edilmesine yönelik bir yöntem saglamaktadlEl Ilgili baska bir yapllândlîilnada, mevcut bulus, talep edilen bulusun bir yapiiândlElnasEl olmayan, süjeye terapötik ajanI bir polipeptid veya bunun bir fonksiyonel varyantIEi/eya parçasIIZkodlayan bir plazmid oldugu, bir farmasötik bilesimi saglamaylîiçeren bir süjedeki polipeptidin düsük ifadesi ile karakterize edilen hastal[glI veya rahatslîllgll tedavi edilmesine yönelik bir yöntem kapsamaktadlü Örnekler Örnek 1 (Referans Örnegi) Lipozom/RNA nanopartikülleri ve yalnlîta lipit nanopartiküller, Sekil 1'den hareketle 20 L ila 200 L arasIaki çesitli ölçeklerde 2 farklßiRNA kullanilarak hazlEiianmaktadlEl Bir stok lipit çözeltisi asaglölaki gibi hazEllanmaktadE Tüm lipit bilesenler (katyonik lipit, DOPE, kolesterol, PEG eslenikli Iipitler, ve diVA-PEG750-diVA 4.5 mg/mL'lik bir aglîliiKl konsantrasyonunda mutlak etanolde çözünmüstür. Etanoldeki Iipitler, 35 ila 40°C'ye yükseltilmistir ve görünür sekilde çözünene dek karlgtülüilgtlîl Lipit çözeltisi Lipit Stok kabIan, bir Filtrelenmis Lipit Stogu kabi bir O.45/0.22 um filtre araciIlgJMa pompalanmlgtß siRNA bir siRNA Stok kabIa nihai siRNA'ya lipit oran. baglüilarak 0.26 mg/mL veya 0.16 mg/ml orania bir konsantrasyonda 50 mM sitrat tamponu içinde çözünmüstür. siRNA çözeltisi, siRNA Stok kablEUan, bir Lipozomal siRNA'ya %35'Iik etanol kabIa bir 0.45/0.22 pm filtre arac[[[g]lýla pompalanmßtlü 40°C'ye getirilmistir. Lipit çözeltisi siRNA yüklü IipozomlarEtpontane bir sekilde olusturmak üzere bir nozul kullanilârak tampon içeren siRNAnI yüzeyi üzerine püskürtülmüstür. Lipitler aglHllKl cinsinden 14:1 veya 9:1 oranIa bir toplam nihai lipite siRNA oran. ve %35'lik etanol konsantrasyonuna ulasmak üzere siRNA ile birlestirilmistir. Lipozom çözeltisi ardlEUan yaklasllZJ %10 oranIa bir nihai etanol konsantrasyona bir 20 litrelik Flex Boy tek kullanIiIllö torbanI içine 0.22 um filtrelenmis PBS tamponu ile seyreltilmistir. Sonuçta olusan Iipozom konsantre edilmistir ve ardIan etanolü çllîlarmak ve tamponu degistirmek için PBS'nin 10x hacimlerine karsEl diyafiltre edilmistir. Tüm konsantrasyon ve diyafiltrasyon adllarübir tek kullanIil[EIpompa haznesine, tek kullanIilllZl esnek tüpe, ve tek kullannliKl oyuk fiber membran süzgeçlerine monte edilen bir Quattro Flow (diyafram) pompasElkullanilârak gerçeklestirilmistir. Nihai süspansiyon bir nihai tek kullanIiIÜZl toplama sisesinin içine biyoyük azalmaleh yönelik olarak 0.45/0.22 pm filtre aracHJgllýla filtrelenmistir. Sonuçlar Tablo 1'de gösterilmektedir. Y[g]I Aglîllllîl _i Hacmi cinsinden Partikül boyutu EE Urün Verimi L/pozom/arßpreparasyanu Bir örnek niteligindeki yapHândlEnada, Iipitlerin bir karlgüilîkullanufnaktadß burada Iipitlerin karlgöliükatyonik amino lipitler, nötr lipitler (bir amino lipit dlglütlaki lipitler), bir steroiddir (örnegin kolesterol) ve bir PEG-ile modifiye edilmis lipit (örnegin bir PEG-S-DMG, PEG-C- DOMG veya PEGDMA) etanol olan, organik çözücüde es olarak çözünebilmektedir. Tercih edilen yapllând [Elnalarda, lipit karElEJllZlesasen bir katyonik amino lipit, bir nötr lipit, kolesterol ve bir PEG-ile modifiye edilmis lipitten olusmaktadlü Ayrü tercih edilen yapllândlEinalarda, lipit karlSEMIJbir katyonik lipit, DOPE (veya, ya bir iyonlasabilir ya da bir sabit katyonik yüke sahip baska yardncEllipit), kolesterol ve çesitli molar oranlarda PEG-eslenik lipitten olusmaktadlîl Tercih edilen molar arallKlar mol cinsinden %40 ila 60 katyonik lipit, %10 ila 30 nötr lipit, %20 ila 40 kolesterol, ve %1 ila 10 PEG-ile modifiye edilmis lipit aral[g]IadE Bir hedeflendirme Iipiti örnegin diVA-PEG750-diVA (veya diger VA-eslenikli hedeflendirme Iipiti) lipit karlgiiiliîb 0.1 ila 5 (hedeflendirme Iipiti: toplam lipit) molar oranIa eklenebilmektedir. Lipit karElEJiElayrlîla dogal (örnegin kitosan) veya sentetik (örnegin PEI) kaynakIEblabilen islem yardIicllârEl ve polimerlerin bir karlgüililü kapsayabilmektedir. Lipitin toplam konsantrasyonu 25 mg/ml'dan daha azdB tercihen 5 mg/ml'dan daha azdE Lipit karlglüiü membran araclHgllýla filtrelenmektedir, örnegin bir 0.45 veya 0.2 pm filtre. Bulusa göre yapüândlîilnaya uygun olarak, lipit karlglEiEbir tamponlanmlgl sulu nükleik asit çözeltisi ile birlestirilebilmektedir. Tamponlanmgsulu çözelti, tamponun lipit karlgIEiIaki bir protonlu olabilen Iipitin pKa'sIan daha az bir pH'a sahip oldugu bir çözelti olabilmektedir. Uygun tamponlar. örnekleri, sitrat, fosfat ve asetat ve MES'i kapsamaktadlEl Özellikle tercih edilen bir tampon sitrat tampondur. Tercih edilen tamponlar kapsüllenen nükleik asitin kimyas. bagIElolarak 1 ila 1000 mM arallglua anyon konsantrasyonunda olacaktlEI ve tampon konsantrasyonunun en uygun hale getirilmesi yüksek yükleme seviyelerine ulasmak için önemli olabilmektedir. Alternatif olarak, HCI, HZSO4, veya benzerine sahip pH 5-6'ya kadar asitlenmis saf su kullanllâbilmektedir. Partikül membranlloyunca ozmotik potansiyeli dengeleyecek olan örnegin partiküller etanolün çiElarlIBiasEliçin diyalize edildiginde, pH'El arttlün, veya bir farmasötik olarak kabul edilebilir taslýlöîörnegin normal salin ile karlSian bir iyonik olmayan çözünene yönelik uygun olabilmektedir. Tampon ayrlEh islem yardIiclEr (örnegin poloksamerler, surfaktanlar, deterjanlar) hacim arttlElEElajanIar (örnegin manitol) veya kriyoprotektanlar (örnegin sakaroz, trehaloz, galaktoz, inulin) kapsayabilmektedir. Tampondaki nükleik asit miktarEll).08 ila 0.8 mg/mL araletladlB Etanolün eklenme zamanIa, sulu çözeltinin ve etanolün slîlakl[g]l:25 ila 45° C, tercihen 30 ila 40°C arasIdadE Etanol çözeltisi, sulu çözeltiye, sulu çözeltiye bir smüüara yüzeyi araclIlgJMa eklenmektedir ve etanol daldlElIân bir tüp veya nozul aracMgllýla iletilmektedir. Organik çözelti organik çözeltiyi sulu çözeltiye kontrol edilen bir oranda, tercihen sabit bir oranda ileten bir pompa ile eklenmektedir. Organik çözeltinin iletilmesi 1 dakika ila 100 dakika arasIa, tercihen 2 ila 20 dakika araletla tamamlanmaktadE Organik çözelti, tek bir orifis veya nozul araclügllîla, veya bir çoklu-orifis veya nozul sistemi araclIJgilîla eklenebilmektedir. Tek (veya çoklunozul dizisi) orifis çaplZllO ila 1000 um, tercihen 300 ila 600 pm arasIa olabilmektedir. Ekleme, dagllßülestekleme üzere organik akna 0 ila 30 psi uygulanmaslîlile gerçeklestirilebilmektedir. Organik çözelti sulu çözeltiye eklenirken, sonuçta olusan çözelti karlgtlîlllârak veya çevrilerek karlgtlElllBiaktadlEl Ekleme adIiD0/025 ila 45 etanol, en çok tercihen %35'Iik etanol oranIda bir nihai konsantrasyon ile sonuçlanmaktad lEl Nihai çözelti, diyaliz veya tercihen diyafiltrasyon ile organik çözeltinin çilZiarlEhasEliçin islenmektedir. Etanol çiKlarlDElken, sulu çözelti bir nötr pH, pH 6.8 ila pH 7.5 aras-a, tercihen pH 7.2 oranIa bir tek tamponlu, örnegin bir fosfat tamponuna dönüstürülmektedir. Tampon ayrlEh islem yardIicllâr (örnegin poloksamerler, surfaktanlar, deterjanlar) hacim arttlBEßjanlar (örnegin manitol) veya kriyoprotektanlar (örnegin sakaroz, trehaloz, galaktoz, inulin) kapsayabilmektedir. Sonuçta olusan sulu çözelti tercihen depolama veya kullanIi öncesinde, örnegin bir 0.22 um filtre aracHJglýla filtreleme ile sterilize edilmektedir. Lipozom üretimine yönelik bu yöntem, SUS alt birimlerinin bir sistemini içeren bir SUS daglElElîElile baglantElhalinde kullanllâbilmektedir. Bu dagmEElasag-ki alt birimlerden olusabilmektedir, bir su ile karlgiabilen organik çözücüde bir lipit çözeltinin hazlEIhnmas- yönelik bir lipit karlStlEna torbaleldan olusan bir lipit karlStlÜna birimi; bir lipit tutma torbasü ve lipit biriminden lipit tutma birimine lipit çözeltinin aktarilîhasl yönelik bir araç; bir RNA çözeltisinin haziEllanmasEb yönelik bir RNA karlStlElna torbasÇl RNA tutma torbasÇlve RNA çözeltisinin RNA biriminden RNA tutma birimine aktarlBiasElçin bir araçtan olusan bir RNA karlgtlülna birimi; ve lipit çözeltiyi, lipit tutma torbasIan RNA çözeltisine aktarmasEiçin bir araç; ve oyuk fiber membranlar, bir tek kullanlllZl diyafram pompa basllglÇlve çesitli tutma torbalarIan olusan bir diyafiltrasyon sistemi. SUS ekipmanlarEönceden sterilize edilebilmektedir ve bir aseptik proses kullanan IipozomlarEI üretmek üzere steril baglantüâr/kopukluklar kullanilârak isletilebilmektedir. Aseptik isleme, nihai steril (0.22 pm) filtrelemeye olan gereksinimi ortadan kaldlünaktadlîl 0.22 pm filtrenin yoklugu, islenecek daha büyük aralllîta partikül boyutlarßla ( 200 nm) olanak tanIiaktadEI ve herhangi muhtemel bir filtre/ilaç ürün uyumlulugu sorununu çözmektedir. Örnek 2: RNA-Lipit Partikül Boyutu üzerinde Konsantrasyonun Etkisi (Referans Örnegi) Bu örnek siRNA ve Iipit konsantrasyonun partikül boyutu üzerindeki etkisini açIElamaktadIEl Burada açElZlanan yöntem ile nanopartikülleri hazEllamak üzere sunlar gerekmektedir. Bir molar oranda mutlak etanol içinde çözünmüstür. siRNA pH 4.5'te 50 mM sitrat tamponunda çözünmüstür. Bir siRNA içeren tampon, bir karlgtlîilna kabIa kesintisiz olarak karlgtlElIJElken 35 ila 40°C'ye getirilmistir. SonrasIa etanol/Iipit çözeltisi siRNA yüklü IipozomlarElspontane bir sekilde olusturmak üzere bir daglîlüühozul kullanilarak tampon içeren siRNAnI yüzeyi üzerine püskürtülmüstür. Lipit ve RNA konsantrasyonlarLT.] 0.05 ila 0.5 mg/mL arallgllda, aglEllllZ] cinsinden 0.08 bir ilaçzlipit oranlüla, ve %35'Iik bir etanol konsantrasyonunda nihai bir siRNA konsantrasyonuna ulasmak üzere uyarlanmlstlîl Lipite siRNA oranütest edilen tüm kosullar için sabit tutulmustur. siRNA yüklü lipozomlar, partikülleri stabilize etmek için ~%10 etanole seyreltilmistir ve ardIan etanolü çilZlarmak ve tamponu degistirmek üzere PBS'nin 10X hacimlerine (pH 7.2) diyafiltre edilmistir. Nihai ürün 0.22 pm, sterilize dereceli, PES filtresi araclllgllýla biyoyükün azaltllîzhasEüçin filtrelenmistir. Hacim, ortalama partikül boyutu ve polidispersite indeksi (PDI) dinamik lglKlsaçlElîliEdDLS) kullan llârak belirlenmistir. Sonuçlar Tablo 2'de gösterilmektedir. Nihai siRNA Hacim Ortalama Ortalama SD PDI Sonuçlar partikül boyutunun artan siRNA konsantrasyonu ile (mg/ml cinsinden) arttigllü göstermektedir. Lipit ve siRNA konsantrasyonlarII azaltllB1asEQaynügiöreli oranI tutulmasD] partikül boyutunu azaltlElken, konsantrasyonun arttlülBwasEbartikül boyutunu arttlEnaktadIE nm'den daha az ve tüm durumlarda 0.2'den daha az bir polidispersite indeksine sahip bir ortalama partikül çap. sahip nanopartiküller üretmektedir. 0.2'den daha az bir PDI'ye sahip 150 nm'den daha az partikül boyutlarlÇlburada açllZlanan yöntem ile, bos önceden olusturulmus Iipit vesiküllerinin hazlîllanmaslîlolmadan ve/veya mekanik isleme olmaks- üretilmektedir. Örnek 3: RNA-Lipit Partikül Olusumu üzerinde Proses Parametrelerinin Etkisi (Referans Örnegi) Bu örnek RNA-Lipit partikül olusumu üzerinde çesitli proses parametrelerinin etkilerini açMamaktadE Slîaklllîl etanol konsantrasyonu, tampon, Iipit:siRNA oranlZl/e Iipit çözeltisini dagltîlnak üzere kullanllân nozul tipi gibi birçok parametre bu deney esnaleUa gözlemlenmistir. oranda mutlak etanol içinde çözünmüstür. siRNA içeren tampon, bir karlgtlülna kabia kesintisiz olarak karlStlElIJEken belirtilen lelaklEgb getirilmistir. Sonraleda etanol/Iipit çözeltisi siRNA yüklü lipozomlarüipontane bir sekilde olusturmak üzere bir nozul kullanüârak tampon içeren siRNAn yüzeyi üzerine püskürtülmüstür. Belirtilen ilaç/Iipit oranIa ve belirtilen nihai etanol yüzdesinde 0.1 mg/mL'Illg bir nihai siRNA konsantrasyonuna ulasmak için lipitler siRNA ile birlestirilmistir. siRNA pH 3.5 ila pH 6.5 arasIa 25 ila 100 mM gücünde degisen sitrat tamponunda çözünmüstür. Karlgm lelakllglEZS ila 45°C arasüda degiskenlik göstermektedir. Nihai etanol konsantrasyonu %25 ila 45 arasIa degiskenlik göstermektedir. AglîllllZl cinsinden ilaç:lipit oranElD.07 ila 0.11 arasIia degiskenlik göstermektedir. Hidrasyon nozulu iç çapElID) 0.005 ila 0.125 inç arasIda degiskenlik göstermektedir. Her bir kosul her bir proses parametresinin etkisini karsllâstlülnak üzere bir ölçüm olarak gerçeklestirilmistir. Aksi belirtilmedigi sürece her oran-a, ve 0.005 inçlik nozul ID'sinde gerçeklestirilmistir. siRNA yüklü Iipozomlar, partikülleri stabilize etmek için %10 etanole seyreltilmistir ve ardIan etanolü çllZlarmak ve tamponu degistirmek üzere PBS'nin 10X hacimlerine (pH 7.2) diyafiltre edilmistir. Nihai ürün 0.22 um, sterilize dereceli, PES filtresi aracMgllîla biyoyükün azaltlihiasübin filtrelenmistir. Tablo 3 ortalama çap ve Iipit nükleik asit nanopartiküllerinin PDI'si üzerinde pH'I etkisini göstermektedir. Arttlîllân tampon pH'IZlartan partikül boyutu ile sonuçlansa da, ancak 150 nm'den daha az partikül boyutu söz konusudur. Hacim Ortalama Tampon pH Ortalama SD PDI Tablo 4 çesitli parametreler üzerinde tampon konsantrasyonunun etkisini göstermektedir. Sonuçlar, artan tampon konsantrasyonunun siRNA geri kazanIiIIüizalttg]Egöstermektedir. Ortalama partikül çapü/e PDI'nin etkilenmedigi görülmüstür. Minimum partikül çapEpH 3.5 için gözlemlenmistir ve maksimum siRNA geri kazannEIZS mM sitrat tamponu için gözlemlenmistir. Tampon Kons. Hacim Ortalama Çap EE siRNA arasIa düsürürken, siRNA geri kazanIiID %80 ila %87 oranIa iyilestirdigini göstemektedir. Artan nihai etanol yüzdesi, siRNA geri kazannEüzerinde hiçbir etkiye sahip degilken partikül boyutunu arttlElnlStlÜ ancak kapsülleme etkinligini %88 oranIda düsürmüstür. Hidrasyon Nihai Hacim Ortalama Çap EE siRNA SlîlaklllZi[°C] %EtOH Ortalama SD PDI [%] Geri Kazan! [°/o] Tablo 6 artan ilaçzlipit oranII %80'den 87'ye artan siRNA geri kazanIiIEijüsürdügünü göstermektedir. Maksimum geri kazanIi aglEI][El cinsinden 0.07 ilaç:lipit oranlEUa gözlemlenmistir. Ölçülen diger hiçbir özellik ilaçzlipit oranIdan etkilenmemistir. Bu sonuç, aglEliElZi cinsinden ilaçzlipit orani. en uygun geri kazanIiII 0.16'dan daha yüksek ve buna esit oldugunu (aglîiiiKJ cinsinden Iipit:ilaç 0ranE6.25'e esit veya bundan daha az) açilZlayan Maurer ve ark., ve Semple ve ark., açllZIamalarII aç-an sasIlElIk/e beklenmediktir. Güncel sonuçlar, buradaki yöntem kullanüârak tam tersi bir egilimin elde edildigini göstermektedir. Lipit:siRNA Hacim Ortalama Çap EE siRNA Tablo 7 25 kat büyütülen nozul ID'sinin artlgElI partikül boyutunu, kapsülleme verimliligini veya siRNA geri kazanillîétkilemedigini göstermektedir. Etanol/Iipitlerin tampon yüzeyine eklenmesi için kullanilan nozul orifisinde önemli ölçüde esneklik mevcuttur. Bu esneklik çogaltma sÜslüda büyük bir avantaj saglayabilmektedir. Nozul ID Hacim Ortalama EE siRNA Örnek 4: Yigi. yönelik Atüîlia Bulunulan Yöntemler ile AçlElanan Prosesin Karsllâstülüiasü (Referans Örnegi) LipozomlarI üretilmesi Bu sonuçlar burada lipit/nükleik asit partikülleri hazIEIlamaya yönelik açllZJanan prosesin, Semple, ve ark., US Patent 6,858,225 numaralEpatent dökümanElle açiIZlanan yöntem ile karsHâstlEllBiStlEl(k0ntr0l yöntemi veya kontrol yöntemi ile kullanilân kontrol bilesimi) Örnek 3'ü bilesimine göre veya kontrol yöntemi kullanilârak hazlEIlanmIStE Örnek 3'ün bilesimi, 40:30:25:5:2 bir molar oranIa es çözünmüs bir katyonik lipit, DOPE, kolesterol, PEG eslenikli lipit ve hedeflendirme lipitinden 0IusmaktadlE|(bakIlZ yukar-ki Kontrol bilesimi 25:20:45:10 bir molar oranIa es çözünmüs DODAP, DSPC, kolesterol, PEG- CER-14'ten olusmaktadB Örnek 3'ün yönteminde, Iipitler 4.32 mg/ml'de mutlak etanolde çözünmüstür ve siRNA pH 4.5'te, 50 mM'de 0.163 mg/ml'da çözünmüstür. Bir siRNA çözeltisi, bir karlgtüna kablîilda kesintisiz olarak karigtlElIJIlken 35 ila 40°C'ye getirilmistir. Sonraslrîha etanol/lipit çözeltisi siRNA yüklü IipozomlarElbir daglEEIühozul kullanilârak tampon Içeren siRNAnI yüzeyi üzerine püskürtülmüstür. Nihai etanol konsantrasyonu %35'tir ve nihai lipit/siRNA oranlZlaglEllllZl cinsinden 14:1 olmustur. SonrasIda sonuçta olusan partiküller, %10 etanolde seyreltilmistir ve PBS'nin 10x hacmine karslîdiiyafiltre edilmistir (pH 7.2). Kontrol yönteminde, lipitler 25 mg/ml'de mutlak etanolde çözünmüstür ve siRNA pH 4.0'da, 300 mM'de 4.17 mg/ml'da çözünmüstür. siRNA içeren tampon, bir karlgtlElna kablElda kesintisiz olarak karlgtlîiüflken oda sElaklEgiüda tutulmustur. Sonraslüda etanol/lipit çözeltisi siRNA yüklü IipozomlarElspontane bir sekilde olusturmak üzere tek bir nozul kullanilârak tampon içeren siRNAnI yüzeyi üzerine püskürtülmüstür. Nihai etanol konsantrasyonu lipit/siRNA süspansiyonu iki, 100 nm polikarbonat membranEile hazlEllanan bir 10 mL'Iik ekstrüdere aktarlEnlStEve 65°C'de önceden dengelenmistir. Süspansiyon 300 psi'de on geçis kullanilârak ekstrüde edilmistir. Sonuçta olusan partiküller, ve PBS'nin 10x hacmine karslIibH 7.2'de diyafiltre edilmistir. Her bir yöntem sonrasIa sonuçta olusan partiküller, bir 0.22 pm filtre aracHJgJMa geçirilmistir. Ortalama partikül boyutu, PDI, ve EE burada açlEIand[glgibi ölçülmüstür. Örnek 3'ün yöntemi, ekstrüzyon adnEl olmaks- kontrol yöntemine benzer Iipit nanopartiküller üretmistir. Kontrol yöntemi ile üretilen partiküllerin boyutu ekstrüzyon öncesinde ölçülmüstür. Kontrol yöntemi kullanüârak NDT-0009 bilesiminden hazlElhnan partiküller, 250 nm partikülden daha büyük bir ortalama partikül boyutuna sahip olmustur. Ekstrüzyon ve diyafiltrasyonun ardIIan ortalama partikül boyutu 128 nm'ye azaltllü^il3tlB Örnek 3'ün yöntemi, ekstrüzyon olmaks- 150 nm'den daha küçük bir ortalama partikül boyutuna sahip partiküller üretmistir. Benzer bir egilim kontrol bilesiminin baslang-a gözlemlenmistir. Örnek 3'ün yöntemi, kapsüllenen siRNA'nI Iipit nanopartiküllerin içindeki durumunda, kontrol yönteminkinden daha etkili olmustur. Örnek 3'ün yöntemi ile haziîlbnan partiküllerin kapsülleme verimliligi (EE), kontrol yöntemi ile olusturulan partiküllerinkinden daha yüksektir (her iki ürün de diyafiltrasyon öncesinde ölçülmüstür.) Örnek 3'ün yöntemi ile hazlîilanan partiküllerin EE'si kontrol yöntemi ile olusturulan partiküllere yönelik bulunandan %95 oran-a daha yüksek olmustur. Kontrol yönteminde, serbest siRNA'nlEl büyük bir kEinünihai üründeki EE'nin iyilestirilmesi ile sonuçlanacak sekilde diyafiltrasyon sonrasIa ç[Elarl]IhlSIiB Örnek 3'ün yöntemi, kontrol yönteminden daha yüksek kapsülleme verimliligine sahip nanopartiküller üretmektedir. Örnek 3'ün yöntemi ile siRNA'nI nihai geri kazanIiÇlher iki üründe de diyafiltrasyonun ard-an ölçüldügü üzere, kontrol yöntemi ile elde edilenden iki kat daha fazla olmustur (%72'ye karsEP/o33). Bu veri, EE'deki iyilestirmeyi yans[Eii[gil:kadar Örnek 3'teki yöntemde bir ekstrüzyon adII eksikligini yans[tîinaktadlü Örnek 3'ün yöntemi, kontrol yöntemindeki ekstra ekstrüzyon adIiIlEl lipozomlarElyapEal olarak degistirmesinden ve görüldügü üzere siRNA'yiIibartiküllerinden ayrUü1asIan kaynaklljblarak daha iyi bir siRNA geri kazanIiEisaglamaktadlEl Bu sonuçlar, burada açiEIanan yöntemin, kapsülleme verimliligini ve 150 nm'den daha az bir ortalama partikül çapiEb sahip nanopartiküllerin verimini iyilestirirken birkaç proses adnlllzaltmasliile kontrol yöntemine nazaran birkaç avantaja sahiptir. Örnek 5: Lipozom YEgI Üretiminin ÇogaltIJInasD EsnasIda Degiskenligin KarsühstEanasüReferans Örnegi) Örnek 3'te açllZJandlglEüzere proses, bir sabit olarak yüklenen (HEDC) katyonik Iipit ve bir iyonlasabilir (5104) katyonik Iipit molekülünün kombinasyonunu kapsayan farklElbir Iipit bilesimi ile gerçeklestirilmistir. HEDC, 8104 DOPE, kolesterol, bir PEG-BML, ve diVA-PEG750- slüsIa farklEbiRNA molekülleri, farkIIZl/[gll hacimleri ve farklEbiRNA (ilaç)/Iipit oranlarEl degerlendirilmistir. Tablo 8 çesitli kosullardan kaynaklanan nanopartiküllerin karakterize edilen sonuçlarlElERlîhca açlElamaktadE YlglI ilaç/Iipit Partikül EE Ürün Verimi Hacmi boyutu kazanIiEJ] Bos Lipozomlar (siRNA yok) yok 83 0.14 yok yok Sonuçlar burada açlEanan yöntemin büyük ölçüde saglam oldugunu göstermektedir. Bir 50- kat oranIaki çogaltma genislemesi esnasIa benzer partikül boyutu ve PDI, elde edilmistir. Partikül boyutu, istikrarIElbir sekilde %90 ürün verimine sahip 100 nm'den daha az olmaktadB Polidispersite indeks degerleri, vesiküllerin neredeyse monodispers popülasyonunu göstererek oldukça düsük bir aralitha bulunmaktadE Örnek 6: Sakaroz Içeren Formülasyonlar için Lipozom YEgI Üretiminin Çogaltmnasüsnaslda Degiskenligin KarsühstlEBnasüReferans Örnegi) Örnek 3'te açllZIandlglEüzere proses HEDC, 5104 DOPE, kolesterol, bir PEG-BML, ve diVA- açllZlandgEüzere vesiküllerin preparasyonuna sakaroz dahil edilmistir. FarkID/[g'll hacimleri degerlendirilmistir ve donma çözülmeye tabi olmustur. Tablo 9 çesitli kosullardan kaynaklanan nanopartiküllerin karakterize edilen sonuçlarIERElaca açiKlamaktadlEl Donmus (sakaroz içeren) formülasyonlar yarEûek kullan lllîlimalat serisi kullan llârak hazlEllanmlStlEl Y[glEl Hacmi _ Dondurma öncesi Cözülme sonrasEl Ürün Verimi ilaç/lipit [nm] [%] [nm] [%] kazanIiEJ] Sonuçlar donma çözmenin lipit nanopartiküllerin özelliklerini degistirmedigini göstermektedir. Sonuçlar ayrlEb, y[glElar arasIaki degiskenligin oldukça düsük oldugunu ve prosesin tekrar üretilebilir sekilde homojen nanopartikülleri ürettigini göstermektedir. Ilaçzlipit partiküllerinin Iiyofilizasyonunun stabilize edilmesine yönelik kosullar tesis edilmistir. Örnek Z'ye göre hazlElianan ilaç:lipit partikülleri etkenliklerini kaybetmeden liyofilize edilebilmektedir. Ilaç:lipit partiküllerinin olustugu sakarozun nihai konsantrasyonu ag lEliilg'hacim cinsinden %8 olmustur. Liyofilize preparasyonlar, damltîllmlgl suyun eklenmesi ile yeniden yapilândlülßiaktadlü ve bunlar. farelerin cigerlerindeki transfeksiyon aktivitesi i.v.'üncü enjeksiyonun ardlEUan ölçülmüstür. Yeniden yapllândlülân preparasyonun donma ve çözünmesi etkenligi etkilememistir. Tablo 10'da gösterilen sonuçlar burada açiEIanan yöntem kullanüârak hazthnan partiküllerin, Iiyofilizasyon esnaleUa özelliklerini muhafaza ettikler, ve dolaylglýla stabil olduklarIElgöstermektedir. Spesifik olarak, partikül boyutu YarEI tek kullanllilîl imalat dizisi kullanilârak hazlEIianan liyo (sakaroz içeren) formülasyonlar YiglEI ilaç/lipit Dondurma öncesi Çözülme sonrasEl Liyofilizasyon Hacmi sonraslda + Yeniden Maddesi cinsinden [nm] [%1 [nm] [%1 [nm] [%1 Partiküllerin stabilitesi, lipit aglElilKl cinsinden lipit: RNA degerleri, ve formülasyonda kullanilan polisakkaridlerin seçimi bilesimin bir fonksiyonudur. Burada in i//i/o olarak yüksek biyoaktivite sergileyen lipit: RNA komplekslerinin stabil formülasyonlarII üretilmesine yönelik aç[lZlanan metodolojik yaklasIi farmasötik olarak kabul edilebilir preparasyonlarlEl tesis edilmesinde avantajlar sunmaktad [Üye böylelikle Iipozom bazIIJRNA iletimini kolaylastlElnaktadlEJ Örnek 7: Lipitin DaldlIanlSl Enjeksiyonu (Referans Örnegi) Örnek 3'te açllglandlgllîl üzere proses daldlEllBwlg enjeksiyon kullanllârak vesiküllerin hazlEIlanmasEile modifiye edilerek gerçeklestirilmistir. HEDC, 5104 DOPE, kolesterol, bir PEG- çözünmüstür. Tablo 11 çesitli kosullardan kaynaklanan nanopartiküllerin karakterize edilen sonuçlarIElyüzey ekleme proseslerine klýbsla klgiaca açlKIamaktadlEl Sonuçlar, ortalama partikül çapII lipitlerin daldlîllüilglenjeksiyon ile sulu faza eklenmesi halinde büyük ölçüde düstügü sasIlESle beklenmedik sonuçlarügiöstermektedir. yarEllek kullanilllîlimalat serisi kullanilârak hazlEllanan slîlîliormülasyonlar YlglI Hacmi ag IElllg cinsinden Partikül Boyutu EE Ürün Verimi kazanIilJ] Donmus (sakaroz Içeren) formülasyonlar yarEltek kullannlllîl imalat serisi kullanllârak hazlEIlanmStlE YlglI Hacmi . ag IEIIE cinsinden Partikül Boyutu EE Ürün Verimi kazanIilJ] Aynlîibroses yöntemi tamponda sakaroz içeren hazlEIlanmEllipozomlara yönelik kullanllEilStlEl Tablo 12 farkllîlekleme zamanlarian kaynaklanan nanopartiküllerin karakterize sonuçlarID klglaca açlEamaktadlElve Tablo 13 daldElBilSeklemeye klýlasla yüzeyi kullanarak hazlElanmlSl nanopartiküllerin karakterize sonuçlarIEklgbca açllZlamaktadlB yarEllek kullanIilllZlimalat serisi kullanllârak hazlîlbnan slîEliormülasyonlar Ekleme zamanEUdk] Ekleme Yöntemi Ortalama PDI [%] [siRNA geri * Bulusa uygun olarak degil YarEIlek kullanlllKJImalat serisi kullanilarak halelanan slîEIlormülasyonlar Yi'g'llE] Hacmi Partikül Boyutu EE Ürün Verimi [siRNA Sonuçlar, ortalama partikül çapII lipitlerin 2 dakikadan daha az bir ek süreye sahip daldlEllüîlgl enjeksiyon ile sulu faza eklenmesi halinde büyük ölçüde düstügü sasllîlîlve beklenmedik sonuçlarEgöstermektedir. Sonuçlar, ayrlîti ortalama partikül çapIlEl lipitlerin daldßlîhlgenjeksiyon ile sulu faza eklenmesi halinde büyük ölçüde düstügü sasIlEEonuçlarD göstermektedir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR
TR2019/04389T 2011-11-04 2012-11-02 Lipit nükleik asit partiküllerinin steril bir şekilde üretilmesine yönelik yöntem. TR201904389T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161556124P 2011-11-04 2011-11-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201904389T4 true TR201904389T4 (tr) 2019-04-22

Family

ID=47178988

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2019/04389T TR201904389T4 (tr) 2011-11-04 2012-11-02 Lipit nükleik asit partiküllerinin steril bir şekilde üretilmesine yönelik yöntem.

Country Status (22)

Country Link
US (1) US8956572B2 (tr)
EP (4) EP3485875A1 (tr)
JP (3) JP6133883B2 (tr)
KR (2) KR102056702B1 (tr)
CN (2) CN103906504B (tr)
AU (2) AU2012356239B2 (tr)
CA (2) CA2853689C (tr)
CY (1) CY1121495T1 (tr)
DK (1) DK2773326T3 (tr)
ES (1) ES2721325T3 (tr)
HR (1) HRP20190481T1 (tr)
HU (1) HUE043809T2 (tr)
LT (1) LT2773326T (tr)
PL (1) PL2773326T3 (tr)
PT (1) PT2773326T (tr)
RS (1) RS58562B1 (tr)
RU (2) RU2647476C2 (tr)
SI (1) SI2773326T1 (tr)
SM (1) SMT201900197T1 (tr)
TR (1) TR201904389T4 (tr)
TW (3) TWI615156B (tr)
WO (2) WO2013064911A2 (tr)

Families Citing this family (145)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2625189B1 (en) 2010-10-01 2018-06-27 ModernaTX, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
AU2012236099A1 (en) 2011-03-31 2013-10-03 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DE19216461T1 (de) 2011-10-03 2021-10-07 Modernatx, Inc. Modifizierte nukleoside, nukleotide und nukleinsäuren und verwendungen davon
US9579338B2 (en) 2011-11-04 2017-02-28 Nitto Denko Corporation Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
CA3018046A1 (en) 2011-12-16 2013-06-20 Moderna Therapeutics, Inc. Modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US9320297B2 (en) 2012-03-22 2016-04-26 Lemniscate Innovations Llc Spherification/reverse spherification automated and integrated system and method
WO2013151665A2 (en) 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
HRP20181855T1 (hr) 2012-06-08 2018-12-28 Nitto Denko Corporation Lipidi za formulacije namijenjene unosu terapijskog sredstva
PL2922554T3 (pl) 2012-11-26 2022-06-20 Modernatx, Inc. Na zmodyfikowany na końcach
AU2014215421A1 (en) 2013-02-05 2015-08-13 1Globe Health Institute Llc Biodegradable and clinically-compatible nanoparticles as drug delivery carriers
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
CA2917348A1 (en) 2013-07-11 2015-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions comprising synthetic polynucleotides encoding crispr related proteins and synthetic sgrnas and methods of use
WO2015034925A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
EP3041934A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US10195291B2 (en) 2013-09-24 2019-02-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the manufacture of lipid nanoparticles
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
CN103599549A (zh) * 2013-11-22 2014-02-26 大连民族学院 一种siRNA/抗癌药物联合转运复合载体及其制备方法和应用
US20170143848A1 (en) * 2014-03-24 2017-05-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapy for the treatment of ocular diseases
PL4023249T3 (pl) 2014-04-23 2025-03-10 Modernatx, Inc. Szczepionki z kwasem nukleinowym
BR112016030852A2 (pt) * 2014-07-02 2018-01-16 Shire Human Genetic Therapies encapsulação de rna mensageiro
US20170204152A1 (en) 2014-07-16 2017-07-20 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
CN106794141B (zh) * 2014-07-16 2021-05-28 诺华股份有限公司 将核酸包封在脂质纳米粒主体中的方法
EP3171895A1 (en) 2014-07-23 2017-05-31 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of intrabodies
WO2016045732A1 (en) * 2014-09-25 2016-03-31 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Stable formulations of lipids and liposomes
BR112017014090A2 (pt) * 2014-12-29 2018-03-06 Bonac Corporation composição, e, métodos para produção de uma composição e estabilização de uma molécula de ácido nucleico.
WO2016138175A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 The University Of British Columbia Continuous flow microfluidic system
EP3288671A4 (en) 2015-04-28 2019-01-16 The University Of British Columbia DISPOSABLE MICROFLUIDIC CARTRIDGE
EP4660315A3 (en) 2015-05-29 2026-03-18 CureVac Manufacturing GmbH A method for producing and purifying rna, comprising at least one step of tangential flow filtration
HUE053990T2 (hu) * 2015-07-22 2021-08-30 Nitto Denko Corp Nanorészecske liofilizált formák készítményei és eljárások
US11564893B2 (en) 2015-08-17 2023-01-31 Modernatx, Inc. Methods for preparing particles and related compositions
US9938572B1 (en) * 2015-09-08 2018-04-10 Raindance Technologies, Inc. System and method for forming an emulsion
EP3350333B2 (en) 2015-09-17 2025-08-06 ModernaTX, Inc. Polynucleotides containing a stabilizing tail region
JP6948313B6 (ja) 2015-09-17 2022-01-14 モデルナティエックス インコーポレイテッド 治療剤の細胞内送達のための化合物および組成物
AU2016342045A1 (en) 2015-10-22 2018-06-07 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
PL3386484T3 (pl) 2015-12-10 2022-07-25 Modernatx, Inc. Kompozycje i sposoby dostarczania środków terapeutycznych
LT3394030T (lt) 2015-12-22 2022-04-11 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
PL3394093T3 (pl) 2015-12-23 2022-05-16 Modernatx, Inc. Metody stosowania polinukleotydów kodujących ligand ox40
EP3400097B1 (en) 2016-01-06 2021-01-27 The University Of British Columbia Bifurcating mixers and methods of their use and manufacture
MA43587A (fr) 2016-01-10 2018-11-14 Modernatx Inc Arnm thérapeutiques codant pour des anticorps anti-ctla-4
WO2017156420A1 (en) 2016-03-10 2017-09-14 Lonza Ltd Customizable facility
US10689873B2 (en) 2016-03-10 2020-06-23 Lonza Ltd Customizable facility
WO2017223135A1 (en) * 2016-06-24 2017-12-28 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticles
CN109563511A (zh) * 2016-06-30 2019-04-02 阿布特斯生物制药公司 用于递送信使rna的组合物和方法
SG11201900528PA (en) * 2016-08-02 2019-02-27 Lonza Ag Customizable facility
WO2018035387A1 (en) 2016-08-17 2018-02-22 The Broad Institute, Inc. Novel crispr enzymes and systems
EP4485466A3 (en) 2016-08-17 2025-04-02 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
US11052158B2 (en) * 2016-08-18 2021-07-06 Troy Bremer Delivery of urea to cells of the macula and retina using liposome constructs
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
EP3315125A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-02 Silence Therapeutics (London) Ltd Lipid nanoparticle formulation
US11583504B2 (en) 2016-11-08 2023-02-21 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
CA3055653A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle formulation
WO2018170322A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Modernatx, Inc. Crystal forms of amino lipids
EP4186888B1 (en) 2017-03-15 2025-11-26 ModernaTX, Inc. Compound and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2018191750A2 (en) 2017-04-14 2018-10-18 The Broad Institute Inc. Novel delivery of large payloads
WO2018232120A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
MA49421A (fr) 2017-06-15 2020-04-22 Modernatx Inc Formulations d'arn
WO2019010560A1 (en) * 2017-07-10 2019-01-17 Immmunovaccine Technologies Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS, METHODS OF PREPARATION USING LIPID VESICLE PARTICLES OF A DEFINED SIZE, AND USES THEREOF
WO2019027055A1 (ja) 2017-08-04 2019-02-07 協和発酵キリン株式会社 核酸含有脂質ナノ粒子
JP2019043216A (ja) 2017-08-30 2019-03-22 いすゞ自動車株式会社 ステアリング装置
EP3675817A1 (en) 2017-08-31 2020-07-08 Modernatx, Inc. Methods of making lipid nanoparticles
RS67724B1 (sr) 2017-10-20 2026-03-31 BioNTech SE Priprema i skladištenje lipozomskih rnk formulacija koje su pogodne za terapiju
WO2019135816A2 (en) 2017-10-23 2019-07-11 The Broad Institute, Inc. Novel nucleic acid modifiers
US11638695B2 (en) 2017-11-01 2023-05-02 Osaka University Development of method and apparatus for producing lipid particles having desired particle diameter
AU2017438994A1 (en) * 2017-11-09 2020-05-28 Immunovaccine Technologies Inc. Pharmaceutical compositions, methods for preparation comprising sizing of lipid vesicle particles, and uses thereof
EP3710039A4 (en) 2017-11-13 2021-08-04 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF CANCER BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH
US10968257B2 (en) 2018-04-03 2021-04-06 The Broad Institute, Inc. Target recognition motifs and uses thereof
WO2019204451A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-24 Carnegie Mellon University Enhanced lipid nanoparticle drug delivery using a negatively charged polymer
KR20210091120A (ko) * 2018-08-29 2021-07-21 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드 Mrna-로딩된 지질 나노입자를 제조하는 개선된 공정
CA3113025A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Peg lipids and uses thereof
WO2020061295A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. High-purity peg lipids and uses thereof
WO2020061367A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
WO2020061457A1 (en) * 2018-09-20 2020-03-26 Modernatx, Inc. Preparation of lipid nanoparticles and methods of administration thereof
IL281615B2 (en) * 2018-09-21 2026-01-01 Acuitas Therapeutics Inc Systems and methods for producing lipid nanoparticles and liposomes
HRP20240586T1 (hr) 2018-10-09 2024-07-19 The University Of British Columbia Sastavi i sustavi koji sadrže transfekcijske sposobne vezikle bez organskih otapala i deterdženta i s njim povezanim postupcima
CA3116576A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
CA3112837A1 (en) * 2018-10-19 2020-04-23 Translate Bio, Inc. Pumpless encapsulation of messenger rna
CN118697900A (zh) * 2019-01-31 2024-09-27 摩登纳特斯有限公司 制备脂质纳米颗粒的方法
US12215382B2 (en) 2019-03-01 2025-02-04 The General Hospital Corporation Liver protective MARC variants and uses thereof
US12534714B2 (en) 2019-03-18 2026-01-27 The Broad Institute, Inc. Type VII CRISPR proteins and systems
SG11202110036RA (en) * 2019-03-19 2021-10-28 Arcturus Therapeutics Inc Method of making lipid-encapsulated rna nanoparticles
CN118203546A (zh) 2019-05-07 2024-06-18 米尼翁大学 生产脂质体的方法
WO2020236972A2 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
CN114901253A (zh) 2019-08-14 2022-08-12 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的改进的脂质纳米颗粒
WO2021046265A1 (en) 2019-09-06 2021-03-11 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions comprising closed-ended dna and cleavable lipids and methods of use thereof
JP7271374B2 (ja) * 2019-09-10 2023-05-11 株式会社東芝 分析方法、分析基体、分析キット及び分析装置。
CA3155015A1 (en) 2019-09-19 2021-03-25 Modernatx, Inc. Carbonate containing lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
AU2020350759A1 (en) 2019-09-19 2022-03-31 Modernatx, Inc. Branched tail lipid compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
US12297426B2 (en) 2019-10-01 2025-05-13 The Broad Institute, Inc. DNA damage response signature guided rational design of CRISPR-based systems and therapies
JP2023502576A (ja) 2019-11-22 2023-01-25 ジェネレーション バイオ カンパニー イオン化可能な脂質およびそれらのナノ粒子組成物
KR102409145B1 (ko) 2020-03-23 2022-06-15 프레스티지바이오로직스 주식회사 항체 의약품 제조 공정을 위한 버퍼 조제 및 이송 시스템
CN111467321A (zh) * 2020-03-26 2020-07-31 深圳市新合生物医疗科技有限公司 一种mRNA核酸类药物胞内递送系统、制备方法和应用
JP7746280B2 (ja) 2020-03-27 2025-09-30 ジェネレーション バイオ カンパニー 新規脂質及びそれらのナノ粒子組成物
BR112022026233A2 (pt) 2020-06-24 2023-01-17 Bristol Myers Squibb Co Processo para sintetizar lipídios catiônicos
ES3054438T3 (en) 2020-07-16 2026-02-03 Acuitas Therapeutics Inc Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
EP4196128A4 (en) * 2020-08-14 2024-06-12 Arcturus Therapeutics, Inc. METHOD FOR FREEZE DILIZATION OF LIPID NANOPARTICLES
IL301253A (en) 2020-09-13 2023-05-01 Arcturus Therapeutics Inc As a mass of large RNA lipid nanoparticles
EP4228658A4 (en) * 2020-10-14 2025-02-19 George Mason Research Foundation, Inc. IONIZABLE LIPIDS AND METHODS FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF
CN112843019A (zh) * 2021-01-27 2021-05-28 江苏普瑞康生物医药科技有限公司 一种核酸脂质纳米粒组合物，包含其的药物制剂，及其制备方法和应用
JP2024509743A (ja) * 2021-02-16 2024-03-05 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションのための規定サイズのプラスミドＤＮＡ／脂質粒子の調製方法
WO2022175366A1 (en) 2021-02-17 2022-08-25 Secoya Technologies Method for producing lipid nanoparticles and lipid nanoparticles resulting therefrom
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
US20240165044A1 (en) * 2021-04-22 2024-05-23 Inventage Lab Inc. Lipid nanoparticle preparation method and preparation apparatus therefor
KR20240008872A (ko) * 2021-05-06 2024-01-19 아크투루스 쎄라퓨틱스, 인크. Rna 전달을 위한 이온화 가능한 양이온성 지질
AU2022291742A1 (en) 2021-06-14 2023-12-21 Generation Bio Co. Cationic lipids and compositions thereof
EP4412591A1 (en) * 2021-10-06 2024-08-14 leon-nanodrugs GmbH Method for preparing lipid nanoparticles
TW202334080A (zh) 2021-11-08 2023-09-01 美商歐納醫療公司 用於遞送環狀聚核苷酸之脂質奈米粒子組合物
CN116549626A (zh) * 2022-01-27 2023-08-08 深圳瑞吉生物科技有限公司 一种载核酸脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法与应用
US20250327041A1 (en) 2022-02-24 2025-10-23 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
IL316038A (en) 2022-04-04 2024-11-01 Univ California Preparations and methods for genetic complementation
KR102475540B1 (ko) * 2022-04-26 2022-12-08 주식회사 무진메디 약물이 담지된 지질 나노입자 제조 방법 및 제조 장치
EP4536197A1 (en) 2022-06-07 2025-04-16 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
WO2024102730A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024119103A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids and lipid-anchored polymers
WO2024119074A1 (en) 2022-12-01 2024-06-06 Generation Bio Co. Stealth lipid nanoparticle compositions for cell targeting
AU2023406303A1 (en) 2022-12-01 2025-05-29 Generation Bio Co. Lipid nanoparticles comprising nucleic acids, ionizable lipids, sterols, lipid anchored polymers and helper lipids, their uses
EP4626400A1 (en) 2022-12-01 2025-10-08 Generation Bio Co. Novel polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same
AU2023398825A1 (en) 2022-12-15 2025-06-26 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2024136254A1 (ko) * 2022-12-20 2024-06-27 (주)인벤티지랩 저농도 이온화 지질을 포함하는 지질나노입자 및 이의 제조 방법
WO2024205657A2 (en) 2023-03-29 2024-10-03 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
EP4705481A2 (en) 2023-05-05 2026-03-11 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions and methods
WO2025049690A1 (en) 2023-08-29 2025-03-06 Orna Therapeutics, Inc. Circular polyethylene glycol lipids
EP4520345A1 (en) 2023-09-06 2025-03-12 Myneo Nv Product
WO2025052180A2 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
WO2025051994A1 (en) 2023-09-07 2025-03-13 Coave Therapeutics Ionizable lipid nanoparticles
WO2025072383A1 (en) 2023-09-25 2025-04-03 The Broad Institute, Inc. Viral open reading frames, uses thereof, and methods of detecting the same
WO2025097055A2 (en) 2023-11-02 2025-05-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of t cells in immunotherapy
WO2025101501A1 (en) 2023-11-07 2025-05-15 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2025114520A1 (en) 2023-12-01 2025-06-05 Coave Therapeutics Ionizable lipid nanoparticles
EP4570361A1 (en) * 2023-12-11 2025-06-18 Sartorius Stedim Biotech GmbH Device assembly and method for a production-scale tangential flow filtration
WO2025129158A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 The Broad Institute, Inc. Engineered arc delivery vesicles and uses thereof
WO2025166238A1 (en) 2024-01-31 2025-08-07 Orna Therapeutics, Inc. Fast-shedding polyethylene glycol lipids
WO2025250808A1 (en) 2024-05-29 2025-12-04 The Brigham And Women’S Hospital, Inc. Anti-crispr delivery compositions and methods
WO2026003582A2 (en) 2024-06-27 2026-01-02 Axelyf ehf. Lipids and lipid nanoparticles
DE102024002527A1 (de) * 2024-08-02 2026-02-05 Rommelag Engineering Gmbh Vorrichtung
WO2026064512A1 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Generation Bio Co. Polyglycerol-conjugated lipids and lipid nanoparticle compositions comprising the same

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1988001864A1 (en) * 1986-09-18 1988-03-24 Liposome Technology, Inc. High-concentration liposome processing method
US4781871A (en) * 1986-09-18 1988-11-01 Liposome Technology, Inc. High-concentration liposome processing method
US4895452A (en) 1988-03-03 1990-01-23 Micro-Pak, Inc. Method and apparatus for producing lipid vesicles
CA2163860A1 (en) * 1993-06-30 1995-01-12 Chung C. Hsu Method for preparing liposomes
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5976567A (en) 1995-06-07 1999-11-02 Inex Pharmaceuticals Corp. Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US6395302B1 (en) 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
AU733310C (en) * 1997-05-14 2001-11-29 University Of British Columbia, The High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
WO2000029103A1 (en) 1998-11-13 2000-05-25 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production
US6855296B1 (en) 1998-11-13 2005-02-15 Optime Therapeutics, Inc. Method and apparatus for liposome production
BR0012624B1 (pt) 1999-07-15 2011-08-09 métodos para a preparação de agentes terapêuticos envolvidos por lipìdeos.
US7094423B1 (en) 1999-07-15 2006-08-22 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for preparation of lipid-encapsulated therapeutic agents
EP1203614A1 (de) 2000-11-03 2002-05-08 Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Lipidvesikeln
DE60132094T3 (de) * 2001-10-26 2012-02-02 Octoplus Polyactive Sciences B.V. Verfahren zur Herstellung von gereinigten Partikeln
US7223887B2 (en) 2001-12-18 2007-05-29 The University Of British Columbia Multivalent cationic lipids and methods of using same in the production of lipid particles
AU2003205048B2 (en) 2002-01-09 2009-02-26 Transave, Inc. Efficient liposomal encapsulation
US6712963B2 (en) 2002-06-14 2004-03-30 Scilog, Llc Single-use manifold for automated, aseptic transfer of solutions in bioprocessing applications
EP1519714B1 (en) * 2002-06-28 2010-10-20 Protiva Biotherapeutics Inc. Method and apparatus for producing liposomes
FR2856940B1 (fr) * 2003-07-04 2007-02-09 Stedim Sa Systeme clos a usage unique de melange, de stockage et d'homogeneisation de liquides en conditions propres ou steriles
WO2005090403A2 (en) * 2004-03-12 2005-09-29 Biovest International, Inc. Method and apparatus for antibody purification
DK1773976T4 (da) 2004-06-04 2020-02-10 Global Life Sciences Solutions Usa Llc Engangsbioreaktorsystemer og -fremgangsmåder
US7410587B2 (en) 2004-08-03 2008-08-12 Scilog, Inc. Liquid handling for filtration and preparative chromatography
US7404969B2 (en) * 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
CN101267805A (zh) 2005-07-27 2008-09-17 普洛体维生物治疗公司 制造脂质体的系统和方法
CN101346393B (zh) * 2005-11-02 2015-07-22 普洛体维生物治疗公司 修饰的siRNA分子及其应用
JPWO2007117024A1 (ja) 2006-04-11 2009-08-20 株式会社ウイングターフ ガス処理方法
EP1920765A1 (en) 2006-11-07 2008-05-14 Medigene AG Liposome preparation by single-pass process
WO2009086558A1 (en) 2008-01-02 2009-07-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
JP5322476B2 (ja) 2008-03-31 2013-10-23 テルモ株式会社 リポソームの製造装置およびリポソームの製造方法
US8231787B2 (en) 2008-05-06 2012-07-31 Spf Innovations, Llc Tangential flow filtration system
WO2010021865A1 (en) * 2008-08-18 2010-02-25 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
JP2012505913A (ja) 2008-10-16 2012-03-08 マリーナ バイオテック，インコーポレイテッド 遺伝子発現を抑制する治療におけるリポソームによる効率的な送達のプロセスおよび組成物
TW201021853A (en) * 2008-11-17 2010-06-16 Enzon Pharmaceuticals Inc Releasable cationic lipids for nucleic acids delivery systems
WO2010080724A1 (en) * 2009-01-12 2010-07-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel lipid nanoparticles and novel components for delivery of nucleic acids
ES2443147T3 (es) * 2009-01-20 2014-02-18 Med Coat Ab Composición de recubrimiento y su empleo
FR2943560B1 (fr) * 2009-03-24 2011-05-27 Jean Pascal Zambaux Bioreacteur jetable et systeme d'agitation a usage unique
CN107028886A (zh) * 2009-11-04 2017-08-11 不列颠哥伦比亚大学 含有核酸的脂质粒子及相关的方法
EP3318248B1 (en) * 2009-12-01 2019-04-10 Translate Bio, Inc. Delivery of mrna for the augmentation of proteins and enzymes in human genetic diseases
EP2525781A1 (en) * 2010-01-22 2012-11-28 Schering Corporation Novel cationic lipids for oligonucleotide delivery
US20130037977A1 (en) 2010-04-08 2013-02-14 Paul A. Burke Preparation of Lipid Nanoparticles
EP2718261B1 (en) * 2011-06-08 2016-02-24 Nitto Denko Corporation Compounds for targeting drug delivery and enhancing sirna activity

Also Published As

Publication number Publication date
CA2853685C (en) 2019-09-03
SMT201900197T1 (it) 2019-05-10
WO2013064911A3 (en) 2013-10-24
AU2012356239A1 (en) 2014-05-29
TWI626952B (zh) 2018-06-21
TWI618548B (zh) 2018-03-21
JP6149041B2 (ja) 2017-06-14
SI2773326T1 (sl) 2019-04-30
CA2853685A1 (en) 2013-05-10
RU2647476C2 (ru) 2018-03-15
EP2773326B1 (en) 2019-02-20
KR20140097276A (ko) 2014-08-06
WO2013064911A2 (en) 2013-05-10
EP3485875A1 (en) 2019-05-22
EP2773328A2 (en) 2014-09-10
KR102046968B1 (ko) 2019-12-02
CN103906504A (zh) 2014-07-02
CN103906504B (zh) 2017-11-17
RS58562B1 (sr) 2019-05-31
KR20140101748A (ko) 2014-08-20
RU2642640C2 (ru) 2018-01-25
CN103906503A (zh) 2014-07-02
HRP20190481T1 (hr) 2019-05-03
EP3673898A1 (en) 2020-07-01
JP2014534232A (ja) 2014-12-18
CY1121495T1 (el) 2020-05-29
EP2773326A2 (en) 2014-09-10
CA2853689A1 (en) 2013-06-27
TW201731491A (zh) 2017-09-16
ES2721325T3 (es) 2019-07-31
AU2012330819B2 (en) 2017-08-31
TW201325634A (zh) 2013-07-01
WO2013093648A2 (en) 2013-06-27
TWI615156B (zh) 2018-02-21
JP2017165748A (ja) 2017-09-21
US20130164400A1 (en) 2013-06-27
KR102056702B1 (ko) 2019-12-17
RU2014122432A (ru) 2015-12-10
RU2014122433A (ru) 2015-12-10
US8956572B2 (en) 2015-02-17
JP6133883B2 (ja) 2017-05-24
JP6442551B2 (ja) 2018-12-19
AU2012356239B2 (en) 2016-09-22
TW201323020A (zh) 2013-06-16
DK2773326T3 (en) 2019-04-15
PL2773326T3 (pl) 2019-06-28
WO2013093648A3 (en) 2013-10-24
PT2773326T (pt) 2019-04-23
AU2012330819A1 (en) 2014-05-15
CA2853689C (en) 2020-06-30
HUE043809T2 (hu) 2019-09-30
CN103906503B (zh) 2016-12-14
LT2773326T (lt) 2019-04-25
JP2015502345A (ja) 2015-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2773326T3 (en) PROCEDURE FOR STERILE PREPARATION OF LIPID NUCLEIC ACID PARTICLES
US10155945B2 (en) Method of producing lipid nanoparticles for drug delivery
EP2892505B1 (en) Lipid assemblies comprising anionic lysolipids and use thereof
JP2007112768A (ja) 肝指向性リポソーム組成物