KR20160060164A - 메탈로프로테이나제가 연관된 병리 치료에 사용하기 위한 설로덱사이드 - Google Patents
메탈로프로테이나제가 연관된 병리 치료에 사용하기 위한 설로덱사이드 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 순환 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 특히 MMP-9의 감소에서 사용하기 위한 설로덱사이드 또는 그의 하나 이상의 구성성분을 기술한다.
설로덱사이드 또는 그의 구성성분은 심혈관계질환, 당뇨에 의해 야기된 심혈관계질환, 정맥류, 만성정맥부전 (chronic venous insufficiency, CVI), 위장 궤양, 폐질환, 및 종양성 병리 (neoplastic pathology)와 같은, MMP가 연관된 병리의 치료에 유용하다.
설로덱사이드 또는 그의 구성성분은 심혈관계질환, 당뇨에 의해 야기된 심혈관계질환, 정맥류, 만성정맥부전 (chronic venous insufficiency, CVI), 위장 궤양, 폐질환, 및 종양성 병리 (neoplastic pathology)와 같은, MMP가 연관된 병리의 치료에 유용하다.
Description
본 발명은 순환 매트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinase, MMP), 특히 MMP-9의 감소에서 사용하기 위한 설로덱사이드, 또는 그의 하나 이상의 구성성분을 기술한다.
설로덱사이드와 그의 조성물은 심혈관계 질환, 당뇨에 의해 야기된 심혈관계 질환, 정맥류, 만성 정맥 부전 (chronic venous insufficiency, CVI), 위장 궤양 (gastrointestinal ulcer), 폐질환 및 종양성 병리 (neoplastic pathology)와 같은, MMP가 연관된 병리의 치료에 유용하다.
최근 연구는 매트릭신 패밀리 (matrixin family)에 속하는 아연-의존성 엔도펩티다제 (zinc-dependent endopeptidase) 그룹, 이른바 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)가 심혈관계 병리 상태 (cardiovascular pathologic condition)에서 혈관 변화 (vascular alteration)에 연관된다는 것을 입증하였다.
정맥 고혈압 (venous hypertension)은 매크로 및 마이크로 순환 이상과 관련되고, Bergam J. 등에 의해 Ann. Vasc. Surg. 21 (2007), 260-266에 기술된 바와 같이, 내피로의 백혈구 침윤, 심장 판막 (cardiac valve)의 손상 (deterioration)을 야기하고, 최종적으로, 역류, 또는 정맥류 및 피부 병리 형성을 제공할 수 있는, 정맥벽의 리모델링/재배열 (remodeling/rearrangement)을 제공하는 수개의 병리의 원인이다. Raffetto JD. 등은 Thromb. Res. 123 (2009) S66-S71 에서, 만성 정맥 병리 (chronic venous pathology)의 진행 중 관찰되는 변형 (modification)은 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)와 그들의 조직 억제제 (tissue inhibitor) 수준 간의 혈액 내 균형 (hematic balance)과 연관될 수 있다는 것을 기술한다.
새포외 기질의 생리적 리모델링 (physiologic remodeling)에 관여되는, MMP 및 TIMP 모두는 세포 소통 (cellular communication)에서 또한 중요한 역할을 수행한다.
Mannello F. 등에 의해 Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005), 285-298에서 보고된 바와 같이, 높은 MMP 농도가 상이한 병리에서 발견되었다. Rahko E. 등에 의해 Tumor Biol., 30 (5-6) (2009), 574-64에 기술된 바와 같이, MMP 중, MMP-9 (젤라티나제 B, (Gelatinase B), 92, 130 및 225 KDa의 EC3.4.24.35)가 종양성 병리를 포함한, 수개의 병리에 연관되어, 순환 효소로서의 그들의 존재 및 그들의 증가가 유방, 폐, 난소 및 전립선암 및 흑색종 (melanoma)과 같은 상이한 종류의 암의 진행과 관련된다는 것을 시사한다.
또한 당뇨에 의해서도 야기되는, 혈관 병리 상태 (vascular pathological condition)에서, MMP의 병원적 (pathogenic) 역할이 명백하게 확인된다. Galis Z.S.등이 Circ. Res. 90 (2002), 251-262에서, Kadoglou N.P. 등이 Angiology 56 (2005), 173-189에서, Derosa G. 등이 Diabetes Metab. 33 (2007), 129-134에서, 및 Tayebjee M.H. 등이 Diabetes Care 27 (2004), 2049-2051에서, 당뇨 환자의 순환 MMP의 증가된 수준을 기술한다.
Raffetto JD. 등은 Biochem. Pharmacol. 75 (2008), 346-359에서, 정맥벽 내의 증가된 세포외 기질 (ECM) 분해 (degradation)가 정맥 이완, 정맥류의 형성, 피부 변형 (dermal modification)의 초기 단계에 관여하며, 최종적으로 정맥 궤양의 형성으로 이어진다는 것을 보고하면서, 혈관 질환 (vascular disease)에서의 MMP의 중요성을 입증한다.
증가된 MMP 발현과 관련된 수개의 병리 기작 (pathological mechanism) 중, 백혈구-내피 상호작용은 중요하며 약리적 치료를 위한 가능성 있는 목표를 제시한다. Mannello F. 등은 Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28 (2008), 611-614에서, 백혈구와 혈소판은, 더 높은 양의 MMP를 포함하고, 이들은 세포외 환경 (extracellular milieu) 내로 방출될 수 있어서 백혈구 활성화/탈과립을 초래하거나 또는 혈소판 응집 동안 방출될 수 있다는 것을 기술한다. 더욱이, 응고 과정에 의해서 유도된 반응과 같은 자극 후에, MMP-9는 혈소판과 백혈구로부터 방출된다.
응고 단계 동안 활성화된, 플라스민이 MMP 활성제로 변화한다는 것이 알려져 있다.
인간 벽 (human wall)에 존재하고 잠재적으로 암 침습과 연관된 단백질분해성 효소 중, MMP는 간질성 매트릭스 (interstitial matrix) 및 기저막의 대부분의 단백질을 분해하는 능력과 연관되어 세포의 확산 및 이웃하는 벽으로의 침투를 가능하게 한다는 것이 입증되었다.
부착 세포 분자의 성장인자 수용기, 케모카인, 사이토카인, 세포사멸 리간드 (apoptotic ligand) 및 혈관형성 인자 (angiogenic factor)와 같은 수개의 화합물은, MMP와 상호작용하여 그의 발현 및 활성을 변형시킬 수 있다.
이러한 단백질분해 효소는 다수의 생활성 기질 (bioactive substrate)에 작용하여, 원발성 종양의 성장, 혈관형성, 종양세포 (neoplastic cell)의 혈관 외 유출 (extravasation) 및 혈관 내 주입 (intravasation), 이동 (migration), 이차 기관으로의 전이 세포의 침습, 종양 성장의 개시 및 유지와 같은 종양 발달 (neoplastic development) 단계에 관여한다.
순환 매트릭스 메탈로프로테이나제 감소의 중요성을 평가하기 위하여, 수개의 임상 연구가 동물과 인간의 종양 모델에서 수행되었다. Ramnath N. 등에 의해 Curr. Oncol. Rep. 6 (2004), 96-102에서 기술된 바와 같이. 얻어진 결과는 합성 억제제 개발로 이어졌다.
연구된 주요 억제제는 콜라겐, 테트라사이클린 (tetracycline) 및 비스포스포네이트 (bisphosphonate) 유도체의 모방 펩티드 (mimetic peptide)와 비 모방 펩티드 (non mimetic peptide)를 포함한다.
이용가능한 화합물로 수행된 임상시험은, 장기적인 치료가 근-골격 통증 및 염증을 야기한다는 것을 보여주었다. 비록 이러한 발생 (event)은 가역적인 것으로 확인되었고 환자는 짧은 중단 기간 (suspension period) 후 치료를 다시 시작했지만, 예상치 못한 유해 작용 발생은 투여 용량을 제한하였다.
더욱이, Mannello F. 등에 의해 Curr. Cancer Drug Targets 5 (2005), 285-298에서 기술된 바와 같이, 종양성 질환의 치료를 위한 임상 시험이 보다 많은 수의 환자에게 확대된 경우, 세포증식억제 효과로 인한 일련의 독성 문제 이외의, 유의성 있는 치료적 이득은 관찰되지 않았다.
임상시험에서 연구된 일부 MMP 저해제는 바티마스타트 (Batimastat), 마리마스타트 (Marimastat), 프리노마스타트 (Prinomastat), BAY 12-9566, CGS27023A 및 테트라시클린의 유도체이다.
바티마스타트인 BB-94 (WO 90057191)는, 천연 물질의 펩티드 구조를 모방한 히드록삼산 (hydroxamic acid) 유도체이다. 바티마스타트는 MMP의 강력한 저해제이고 임상시험에서 사용된 MMP의 최초 저해제였으나, 낮은 용해도 및 흡수에 의해 야기된 낮은 선택성을 보였다. 또한, 바티마스타트는 흉막강 또는 복강에 주사에 의해서만 투여될 수 있기 때문에, 더 낮은 순응도를 가졌다. Tu G. 등에 의해 Curr. Med. Chem. 15 (2008), 1388-1395에서 보고된 바와 같이, 3상 임상시험은 대부분 강한 국소 염증성 조직 반응, 메스꺼움, 복부 통증과 같은 심각한 부작용 때문에 거의 즉시 중단되었다.
마리마스타트, BB-2516 (WO 9402447)는 바티마스타트와 유사한 구조이고, 그러나 더 높은 용해도 및 그에 따른 경구 투여시 더 용이한 흡수를 보이는, 히드록삼산 유도체이다. Vihinen 등이 Int. J. Cancer 99 (2002), 157-166에 기술한 바와 같이, 바티마스타트 뿐만 아니라 마리마스타트도 낮은 특이도 (specificity)를 갖고, 치료된 환자 전체 중 약 30 %에서, 작은 손 관절로부터 시작하여 팔과 어깨, 특히 인대 삽입 지점 (tendinous insertion point) 주변으로 이동하는, 근-골격 통증 및 경직, 섬유증 (fibrosis), 및 발목 및 무릎 관절주위 벽 (periarticular wall)의 괴사, 및 체중감소와 연관된 위 이상 (gastric disorder)을 나타내는 유독성이 있었다.
프리노마스타트, AG3340 (WO 90720824)는 히드록삼산 유도체이며, 종양 침습 및 전이 (metastasis)와 연관된 MMP에 대하여 선택적이다. Ramnath N. 등에 의해 Curr. Oncol. Rep. 6 (2004), 96-102에 기술된 바와 같이, 임상 시험 동안 어깨, 무릎, 및 손 관절에 발생하는 부작용이 나타났으며 치료가 즉각적으로 중단되었다.
BAY 12-9566 (US 4,705,798)은 부탄산 유도체이고, Nelson A. 등이 J. Clin. Oncol. 18 (2000), 1135-1149에 기술한 바와 같이, 수개의 임상시험에서, 혈소판감소증(thrombocytopenia), 빈혈, 빌리루빈 (bilirubin)과 간 효소 (hepatic enzyme)의 증가, 메스꺼움, 피로 및 두통으로 나타나는 유독성을 보였다.
CGS27023A (US 5,455,258)는 넓은 피부 자극 (wide cutaneous irritation), 근육통 및 관절통에 따른 독성 효과를 보고하였다.
또한, Hidalgo M. 등에 의해 J. Natl. Cancer Inst. 93 (2001), 178-193에 기술된 바와 같이, 테트라사이클린 유도체는 피로, 정신 혼란, 메스꺼움, 구토, 피부 광독성 (cutaneous phototoxicity), 췌장 효소 증가와 같은 심각한 유해 작용 발생을 보였고, 이는 투여가능한 투여량을 제한시켰다.
자이모그래피 (zymography)와 리버스 자이모그래피 (reverse zymography)는 생물학적 샘플 내의 MMP 및 TIMP의 분석에 현재 사용되는 기술이다. 모든 종류의 기질 자이모그래피는 젤라틴 자이모그래피 방법으로부터 유래한다. 이 기법은 MMP 또는 TIMP의 종류에 따라 기질이 다른 것을 제외하고는 동일하다. 이러한 기법에서, 단백질은 변성, 비환원 조건에서, SDS (sodium dodecyl sulphate)의 존재하에서, 전기영동에 의해 분리된다. 젤라틴-자이모그래피는 젤라티나제 MMP의 결정에 주로 사용되는 기법이며, 수 피코그램 (picograms) 농도의 MMP-2 및 MMP-9를 검출하는데에 매우 실용적이다. MMP-1, MMP-8 및 MMP-13과 같은 다른 MMP가 또한 기질을 분해할 수 있음이 고려되어야 한다.
전술된 기법은 특이적 기질을 이용하여 폴리아크릴아미드 겔에서의, 전기영동 분리에 기초한다; SDS가 MMP를 변성시켜 불활성화되고 전기영동 이동 뒤에, 적합한 버퍼에 의해 SDS는 겔로부터 제거되고, MMP 구조와 기능을 회복된다. 그 후, Mannello F. 등에 의해 Clin. Chem. 49 (2003), 339-34에 기술된 바와 같이, 겔이 인큐베이션 되면, 활성화된 젤라티나제가 젤라틴을 분해하여 저분자량 펩타이드로 전환시키고 이는 세척에 의해서 제거된다.
수득된 겔을, 예를 들어 쿠마시를 포함하는 현상 용액 (development solution)에 배치하고, 그 후, 메틸 또는 에틸 알코올 및 아세트산을 포함하는 용액으로 탈색시킨다. 겔의 염색된 구역은 분해되지 않은 젤라틴의 존재에 기인하는 반면, 염색되지 않은 구역은 MMP의 효소적 활성 (enzymatic activity)에 기인한다. 효소적 활성은 깨끗한 밴드 (band)의 연장에 비례적이며, 따라서 이는 영상 분석기를 갖춘 농도계 장치로 분석 및 정량화될 수 있다.
자이모그램은 MMP, 특히 MMP-2 및 MMP-9에 대해 특이적이고 뚜렷한 정보를 제공하고, 이는 그들의 분자량에 따른 상이한 전기영동 이동도 (electrophoresis mobility)에 기초하여 두 효소가 분리될 수 있기 때문이다. 이 목적을 위하여, pro-MMP-2 72 kDa, 및 pro-MMP-9와 MMP-9의 복합체에 해당하는 적합한 분자량 표준, 92, 130 및 225 kDa이 비교를 위하여 동일한 겔에 배치된다.
Mannello F. 등은 Clin. Biochem. 41 (2008), 1466-73에서, 혈액 중 MMP 및 TIMP 발현에 대한 HMWH의 효과를 평가하기 위하여, 말초혈액 (peripheral blood) 샘플로의 고분자량 리튬 헤파린 (high-molecular-weight lithuim heparin) 첨가 효과를 연구하였다. 기술된 효과는, HMWH가 순환 MMP 및 TIMP의 양을 변형시키고, TIMP-2의 방출을 증가시키는, 직접 및 간접적인 효과를 모두 갖는다는 것이었다. 이 간행물의 목적은, 근본적으로, MMP 측정 방법에 있어서, 혈액 샘플 취급 절차를 표준화하기 위하여, 혈액 조작 (blood manipulation)에서 MMP 발현에 대한 고분자량 헤파린 (high-molecular-weight heparin, HMWH)의 효과를 기술하는 것이었다. 이 간행물에는 헤파린의 약리적 사용에 관한 언급 및/또는 암시가 존재하지 않는다. 더욱이, 효과가 관찰된 리튬 헤파린 농도가 보고되어 있지 않다. 결과적으로, 관찰된 효과가 제공되는 리튬 헤파린 농도가 치료적으로 유용한지 여부를 아는 것은 불가능하고, HMWH가 연관된 출혈의 높은 위험성은 잘 알려져 있다. 그럼에도 불구하고, 헤파린이 일반적으로 주사에 의해 투여된다는 것이 알려져 있기 때문에, MMP 혈장 농도를 변화시키기 위한 목적으로 수행된 가능한 헤파린 용도는, 동일한 경로를 따를 것으로 따라 추정되어야한다.
Caenazzo I. 등에 의해 Nephrol. Dial. Transplant 2001, 16, 1769-75에서, MMP-2 및 TIMP- 2 mRNA 발현에 대한 헤파린의 효과가 보고된다.
따라서, 염증, 감염성 또는 종양성 또는 심혈관계 질환의 발병으로서, MMP가 연관된 모든 병리를 치료할 의도로, 혈액 순환 MMP 농도의 감소에 유용한, 의약 제제를 위한 활성 성분의 발견에 대한 요구가 여전히 존재한다. 이러한 병리는 예를 들어, 당뇨에 의해 유도된 병리, 정맥류, 만성정맥부전, 죽상동맥경화증, 심근 경색 (myocardium infarct) 후 심정지 (cardiac break), 복부 대동맥류 (abdominal aortic aneurysm), 폐질환 (pulmonary pathology), 종양의 증가 및 진행, 원발성 종양의 성장, 이상 혈관형성 (abnormal angiogenesis), 종양세포의 혈관 외 유출 및 혈관 내 주입 등을 포함한다.
혈관 질환은 정맥류, 인간 죽상동맥경화증, 심근 경색 후 심정지 (cardiac break), 복부 대동맥류 군으로부터 선택된다.
또한, MMP가 연관된 모든 병리의 치료를 위하여 경구 경로, 근육 내 또는 정맥 내 주사에 의해 투여가능하고, 환자에 의해 허용가능한, 치료적 유효 투여량에서 부작용 또는 독성 효과가 없는 의약을 수득해야 하는 요구가 존재한다.
설로덱사이드, 또는 그의 구성성분 중 하나, 특히, 설로덱사이드로 수득한 데르마탄 술페이트 (SDX-DS) 또는 설로덱사이드로 수득한 헤파린 (SDX-HEP)이 순환 MMP의 수준을 억제 및/또는 감소시킨다는 것이 예상 밖으로 밝혀졌으며, 이는 본 발명의 목적이다.
설로덱사이드는, 평균 분자량이 7 kDa인 고속-이동 헤파린 (fast-moving heparin, SDX-HEP), 평균 분자량이 25 kDa인 데르마탄 술페이트 (SDX-DS)를 포함하는, US 3,936,351에 기재된, 표유류 장점막 (intestinal mammalian mucosa)으로부터 추출된, 천연 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan, GAG)의 천연 혼합물이다. 설로덱사이드에 포함된 다른 가능한 구성성분은 콘드로이틴 (chondroitin), 헤파린 술페이트 (heparin sulfate)이다. 약 80 중량 %의 SDX-HEP 및 약 20 중량 %의 SDX-DS를 포함하는, 설로덱사이드는 다른 글리코사미노글리칸과는 다른, 독특한 활성 성분으로 간주되어야 한다. 이러한 구성성분은 지금까지 단리된 바가 없으며, 설로덱사이드의 구성성분은 겔 침투 크로마토그래피 및 전기영동와 같은 분석학적 방법으로 결정된다.
Ofosu F.A.에 의해 Semin. Thromb. Hemost. 24 (1998), 127-38에서, 및 Ceriello A. 등에 의해 in Diab. Nutr. Metab., 6 (1993), 1-4.에서 개시된 바와 같이, 설로덱사이드는 헤파린-보조인자 II (Heparin-cofactor II) 및 안티트롬빈 III에 대해 높은 친화도를 보이며, 인자 Xa 및 트롬빈을 억제하고, 조직 플라스미노겐 (tissular plasminogen)을 활성화하며 피브리노겐 수준을 감소시킨다는 것이 알려져있다.
플라스미노겐으로부터의 플라스민 활성화가 MMP의 국소 활성화 기작 중 하나라는 것이 알려져 있기 때문에, 설로덱사이드의 알려진 특징은 이 화합물이 순환 MMP의 농도를 증가시켰을 것이라는 결론을 가져온다.
본 발명은 다수의 질병, 특히, 감염 또는 종양 질환, 높은 수준의 MMP를 특징으로 하는 혈관 질환, 위장 궤양, 종양의 증가 및 진행, 원발성 종양 (primary tumor)의 성장, 변화된 혈관형성 (altered angiogenesis), 종양세포의 혈관 외 유출 및 혈관 내 주입 및 이들의 조합에 관여된 순환 MMP, 특히 MMP-9, 이른바 젤라티나제 B를 억제 및/또는 감소시키기 위한, 설로덱사이드 또는 그의 구성성분 중 하나, 특히 SDX-DS 또는 SDX-HEP를 기술한다. 높은 수준의 MMP를 특징으로 하는 혈관 질환과 관련하여, 본 발명은 특히 만성정맥부전; 부정맥, 심근경색 후 심정지, 복부 대종맥류, 정맥 이완, 폐질환, 및 종양성 병리에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 예상치 못한 중요한 양태는 설로덱사이드로부터 단리된 데르마탄 술페이트 (SDX-DS) 및 저분자량 헤파린 (SDX-HEP), 그들을 수득하는 방법 및 단독 또는 그들의 혼합물로 생체 외 (in vitro) 및 (in vivo)에서 MMP 방출을 억제 및/또는 감소시키기 위한 그들의 용도이다.
이 결과는 명백히 에상치 못한 것이며, 이는 문헌에서, 예를 들어 Cell Biol. Int. 2003, 27, 779-84에서, Isnard N. 등이 데르마탄 술페이트가 MMP-2 및 MMP-9의 발현을 활성화한다고 기술하기 때문이다.
SDX-DS의 놀라운 특징은 상용 데르마탄 술페이트와 비교하는 것에 의해 입증되었고, 결과는 실시예 2 내지 9에 나타난다.
이러한 증거는 설로덱사이드가 다른 글리코사미노글리칸과 다른, 독특한 화합물이 되게 하며, MMP가 관련된 모든 병리의 치료를 위하여, 시장에서 입수가능한, 저분자량 헤파린과 데르마탄 술페이트로 조제할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 설로덱사이드로부터 단리된 SDX-DS이다.
본 발명의 또 다른 양태는 설로덱사이드로부터 단리된 SDX-HEP이다.
본 발명의 또 다른 특정한 양태는 AT III 관능화된 매질 (AT III functionalized medium)을 이용한 친화성 크로마토그래피와 같은, 정제 방법을 통하여 설로덱사이드로부터 수득한 데르마탄 술페이트이다.
본 발명의 또 다른 양태는 SDX-DS 또는 SDX-HEP를 포함하는 약제학적 조성물 및 그들의 의약으로서의 용도이다.
본 발명의 목적은 설로덱사이드, 또는 그의 구성성분 중 하나, 특히 설로덱사이드로부터 단리된 SDX-DS, 또는 SDX-HEP, 및 MMP가 연관된 모든 병리에 대한 의약으로서의 그들의 용도이다. 특히, 본 발명은 혈액 내 순환 MMP의 농도 감소가 결과로 일어나는, 설로덱사이드, 또는 SDX-DS, 또는 SDX-HEP의 순환 MMP, 특히 젤라티나제 MMP-9의 유도형 (inducible form)의 감소 및/또는 억제를 위한 용도를 기술한다. 단리된 구성성분은 그 자체로 또는 그들의 혼합물로써 의약으로 이용될 수 있다.
설로덱사이드는 VESSEL 2 F®의 상표로 시판되며, 이는 Harenberg J. 에 의해 Med. Res. Rev. 18 (1998), 1-20에서 및, Tamarin R.에 의해 Medical Praxis 8 (1997), 1.에서 기술된 바와 같이, 말초동맥질환 (peripheral arterial disorder), 후 정맥염 증후군 (post phlebitis syndrome)과 같은 혈전증 위험 (thrombotic risk)을 동반하는 혈관 질환 (vascular pathology)의 치료, 신증 (nephropathy)에서의 단백뇨 (albuminuria)의 치료를 위하여, 경구 경로, 근육 내 또는 정맥 내 주사에 의해 투여된다.
설로덱사이드 및 그의 유도체, 특히 SDX-DS 및 SDX-HEP는 본 발명에서 그들의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물 (solvant), 수화물 (hydrate), 및 포접화합물 (clathrate)을 포함하도록 한다.
본 발명의 중요한 양태는 정맥 이완, 정맥류, 만성정맥부전 및 하지의 궤양에 관련된, MMP-9, 이른바 젤라티나제 B의 억제/감소에 대한 설로덱사이드의 특이도 (specificity)이다.
설로덱사이드 또는 SDX-DS 또는 SDX-HEP은 구성적(constitutive) MMP-2에 대한 영향 없이, 유도성 (inducible) MMP-9의 증가를 특징으로 하는 모든 병리에서 활성 성분으로 사용될 수 있다. 설로덱사이드 또는 그의 구성성분의 장점은 경구 또는 근육 내 또는 정맥 내 주사 경로에 의한 투여 가능성이다. 설로덱사이드 또는 그의 구성성분의 또 다른 장점은 EP 1292315에서 기술한 바와 같은 부작용 없이 고용량 (high dosage)을 투여할 수 있는 가능성이며, 1000 mg/일 및 그 이상까지 용인 (tolerate)될 수 있다.
본 발명은 MMP, 특히 MMP-9 (젤라티나제 B, 92, 130 또는 225 kDa의 EC3.4.24.35)의 농도를 감소 및/또는 억제하는, 설로덱사이드 또는 SDX-DS 또는 SDX-HEP의 신규한 용도를 기술한다.
본 발명은 20 % 보다 높은 양으로, MMP, 특히 MMP-9를 억제 또는 감소시키는데 사용하기 위한 설로덱사이드 또는 그의 구성성분 중 하나, 특히 SDX-DS 및 SDX-HEP를 기술한다.
본 발명은 혈액 세포로부터 혈장 순환 (plasma circulation)으로의 MMP-9 방출의 감소 및/또는 억제를 수득하고, 그 결과로 정맥기관 (venous apparatus)에서의 순환 MMP의 활성을 감소시키고, 결과적으로 정맥 벽에서의 인 시투 (in situ) 효소적 활성을 감소시기에 충분한, 설로덱사이드 또는 SDX-DS 또는 SDX-HEP의 양을 기술한다. 그와 같은 효과는 8 ㎍/ml 내지 12 ㎍/ml 범위의 생체 외 (in vitro) 및 탈체 (ex-vivo) 설로덱사이드 농도에서 발생한다. 이 농도는 20 mg 내지 1000 mg/일 에 포함된 투여량으로 설로덱사이드의 정맥 내, 근육 내 또는 경구 경로로의 투여를 통하여 혈액에 이를 수 있는 치료적으로 허용가능한 투여량과 일치한다. 설로덱사이드, SDX-DS, SDX-HEP의 기술된 농도에서의 MMP에 대한 효과는 생물학적 샘플에 대한 탈체 실험으로 증명되었다.
구체적으로, 혈액 샘플을 50명의 남성 및 여성의 건강한 지원자로부터 수집하였다. 상응하는 혈장 및 혈청 샘플을 수득하기 위하여 조작된 샘플을, 설로덱사이드, SDX-DS 및 SDX-HEP의 가변적인 농도 첨가의 존재 또는 부재하에 분석하였다.
또한, 본 발명은 설로덱사이드에 약 20 중량 % 농도로 포함된 SDX-DS, 약 80 중량 % 농도의 SDX-HEP, 그들을 수득하는 방법, 및 의약으로의 및 MMP가 연관된 모든 병리의 치료를 위한 용도를 기술한다. SDX-DS 및 SDX-HEP는 정제 및 추출 방법으로 수득될 수 있다.
특히, 실시예 1은 친화성 크로마토그래피 정제를 통하여 설로덱사이드로부터 SDX-DS 및 SDX-HEP를 수득하는 방법에 있어서, 헤파린 분획은 AT III로 관능화된 (functionalized) 정지상에 흡수되고, 데르마탄 분획은 비흡수된 통과액에 수집되는 방법을 기술한다.
실시예 2는 약 10 ㎍/ml 내지 약 50 ㎍/ml의 최종 농도까지의 증가하는 설로덱사이드 양 및, 약 0 내지 약 10 ㎍/ml 의 최종 농도의, 설로덱사이드로부터 추출한 SDX-DS를 전혈에 첨가한 효과를 기술한다. Mannello F. et 등에 의해 Clin. Chem. 2003, 49, 339-34에 기술된 바와 같이, 원심 분리 후, 전혈 샘플로부터의 혈청이 수집되었고, 젤라틴-자이모그래피로 분석되었다. 상이한 샘플에서의 MMP 활성을 정규화하기 위하여, 샘플의 양은 동일한 총단백질 양으로 조절되었다. 젤라틴-자이모그래피의 농도계적 결과는 표 2에 나타나며, 이는 설로덱사이드 또는 MMP 억제제의 첨가가 없는 혈청 샘플의 MMP 면적에 100 %의 값을 부여하였으며, 설로덱사이드 및 SDX-DS의 존재하에서 MMP 면적 억제가 계산된 것이다.
약 10 ㎍/ml에 해당하는 설로덱사이드 농도에서 20% 이상으로, 약 50 ㎍/ml에 해당하는 설로덱사이드 농도에서 십분의 일보다 낮게, MMP-9에 해당하는 밴드의 면적이 감소하는 것을 관찰되었다.
MMP-2의 농도는 설로덱사이드의 첨가 (addiction)에 의해서, 영향받지 않고 유지된다.
10 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml의 최종 농도의, 전혈 샘플로의 설로덱사이드의 첨가는, 혈청 샘플 내에서 비례적으로 순환 MMP, 특히 MMP-9의 농도를 감소시키는 반면, MMP-2의 농도는 변하지 않게 유지시킨다는 것을 도출한다.
또한, 표 2는 MMP-9에 관한 밴드 범위가 최종농도가 약 2.5 ㎍/ml에 해당할 때 약 20 % 이상, 최종 농도가 약 10 ㎍/ml에 해당할 때 약 60% 이상으로, 감소된 SDX-DS가 처리된 샘플의 농도계적 결과를 보고한다.
이러한 결과로부터, MMP의 감소/억제 효과는 설로덱사이드에 포함되는 SDX-DS의 존재에서 더 유리하다는 것이 추론될 수 있으며 이러한 결과는 글리코사미노글리칸 중 설로덱사이드를 특유한 활성성분으로 만든다.
이러한 데이터는 0.37 내지 0.25 ㎍/ml에 해당하는 검출 한계 (limit of detection, LOD)로 젤라티나제의 proMMP를 인식하는, Biotrak® MMP Amersham 키트로 수행되는 정량적 Elisa 분석으로도 확인된다.
표 3은 약 25 ㎍/ml 농도의 설로덱사이드가 MMP-9에 관한 밴드의 약 20 % 이상, 약 50 ㎍/ml의 농도에서 약 60 % 이상을 감소시킨다는 것을 확인시킨다. 실시예 1에서 수득한 SDX-DS의 첨가는 약 2.5 ㎍/ml의 농도에서 약 20 % 이상, 약 10 ㎍/ml의 농도에서 약 60 % 이상의 MMP의 양을 감소시킨다.
설로덱사이드가 혈소판 및 백혈구에 의한 MMP 방출의 감소에도 작용한다는 것의 입증은, 혈장 샘플에 설로덱사이드가 첨가되고, 그 뒤 원심분리를 이용하여 전혈의 세포 구성성분을 제거한, 실시예 3에서 분명하다.
실시예 3은 37세의 평균 나이의, 50 명의 건강한 지원자로부터 수집된, 사전에 0.13 M 시트르산나트륨 용액으로 처리된 후 원심분리된, 혈액 샘플에의 설로덱사이드 첨가에 관한 결과를 보고한다. 샘플 상청액에 대하여, 약 10 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml의 최종 농도로 설로덱사이드 양이 첨가되었다. 샘플은 실시예 2에서 기술된 젤라틴 자이모그래피에 의하여 분석되었다.
100 %에 해당하는 값이 첨가가 없는 혈청 샘플 (대조군)에 부여되었고, 혈청 샘플에의 능가하는 설로덱사이드 양에 따른 비례적인 면적 감소가 결정되었다.
MMP-9의 단백질분해성 활성에 관한 젤라틴 분해의 명확한 밴드는 설로덱사이드의 첨가 후에는 변하지 않도록 유지되는 것이 관찰되었으며, 이러한 결과는 일단 효소가 혈장에 이미 방출되면, 설로덱사이드는 MMP 활성을 방해하지 않는다는 것을 입증한다.
증가하는 설로덱사이드의 양이 첨가된, 실시예 4에서 보고된 바과 같이, 설로덱사이드가 혈청 샘플에 첨가한 경우에 유사한 결과를 얻을 수 있다. 특히, 실시예 4는 평균 나이 37세의 50 명의 건강한 지원자로부터 수집한 혈액을 후에 원심분리함으로써 수득한 혈청 샘플에 첨가된, 약 10 ㎍/ml 내지 50 ㎍/ml의 증가하는 설로덱사이드의 양의 효과를 기술한다. 수득된 혈청 (sera) 샘플은 실시예 2에서 기술된 자이모그래피로 분석된다.
MMP-2 및 MMP-9 젤라틴분해성 (gelatinolytic) 밴드와 연관성을 갖는 젤라틴분해성 면적의 상대적인 농도계 값이 표 5에 보고되며, 이는 설로덱사이드 첨가가 없는 샘플의 밴드에 대하여 감소가 관찰되지 않는다.
특히, 실시예 2에서 얻은 결과는, MMP-9의 존재가 질병의 과정에 직접 또는 간접적으로 연관성이 있는, 모든 병리의 치료를 위한 가능한 치료적 용도를 확인하면서, MMP-9의 유도형 (inducible form)에 선택적으로 작용하는, 작용 기작을 통하여 설로덱사이드와 설로덱사이드에 포함되는 SDX-DS가 혈액 내의 MMP의 증가를 막고, 감소시킨다는 것을 입증한다.
실시예 5 혈청에 존재하는 MMP에 대한, 설로덱사이드, 파르나파린 및 설로덱사이드로부터 추출한 SDX-DS의 비교를 보고한다. 건강한 지원자로부터 수집된 전혈 샘플은 실시예 2와 같이 처리되고, 일 샘플군은 최종 농도 약 25 ㎍/ml의 설로덱사이드로 처리되고, 일 샘플군은 최종 농도 약 5 ㎍/ml의 데르마탄 술페이트로 처리되며, 일 샘플군은 최종 농도 약 20 ㎍/ml의 저분자량 헤파린 (파르나파린)으로 처리된다. 표 8과 표 9는 자이모그램 및 Elisa로부터 얻은 결과를 각각 보고하며, 이는 첨가가 없는 대조군 샘플에 대하여, 설로덱사이드가 50% 내지 70 %의 MMP-9 감소를 나타내며, 파르나파린은 약 20 % 내지 30 %의 감소를, SDX-DS는 약 50 % 내지 70 %의 감소를 나타낸다는 것이다.
MMP의 분비에서의 설로덱사이드의 특유한 특징은 설로덱사이드를 구성하는 GAG의 천연 혼합물의 결과로 보아야 한다.
실시예 6은 2개의 상이한 시판되는 상용 데르마탄 술페이트와 비교하여, MMP 감소에 대한 SDX-DS의 특징에 대한 뒷받침을 제공한다. 5 ㎍/ml의 동일한 농도에서, SDX-DS는 MMP-9 감소를 50 % 보다 높게 유도한 반면, 2개의 상용 데르마탄 술페이트 (Sigma 및 Calbiochem)가 10 % 미만으로 유도하였다.
SDX-DS가 상용 DS 제제에 비하여 적어도 3 배 이상으로 MMP, 특히 MMP-9를 감소시킨다는 것이 밝혀졌다.
실시예 7은 SDX-HEP도 특유한 특징을 갖으며, 사실 설로덱사이드에 포함되는 저분자량 헤파린과 데르마탄 술페이트의 혼합물은, 상용 데르마탄 술페이트에 파르나파린를 첨가한 합성 혼합물 및 SDX-DS에 대하여, 상이하게 작용한다는 것을 입증한다.
더 구체적으로,설로덱사이드는, 약 80 %의 파르나파린과 약 20 %의 데르마탄 술페이트의 설로텍사이드에서 나타나는 비율과 동일하게 혼합된, 저분자량 헤파린과 데르마탄 술페이트의 혼합물과 비교된다. 표 11에서 보고된 데이터는 설로덱사이드가 파르나파린/DS 및 파르나파린/SDX-DX 혼합물에 대하여, 유의적으로 높은 억제 퍼센트를 나타낸다는 것을 시사한다.
특히, 설로덱사이드가 헤파린/SDX-DS 혼합물에 대하여, 우수한 활성을 갖는다는 관찰은, 설로덱사이드에 포함되는 헤파린 구성성분이 순환 MMP 수준에 대해 영향을 주는 특유한 특성을 갖는다는 것을 입증한다.
생물학적 샘플의 정맥의 내벽 중 MMP에 대한 설로덱사이드의 능력 또한 입증되었다.
정맥의 내벽은 특히 중요하고, 이것은 새포외 기질의 단백질분해적 리모델링과 관련한 수개의 병리를 유발하는, MMP의 작용 지점이기 때문이다.
실시예 8은 면역조직화학 실험에서, 정맥벽에서 MMP에 대한 설로덱사이드, SDX-DS 및 파르나파린의 상대적인 효과를 나타낸다. 이 실험은 MMP가 연관된 모든 병리에서의, 및 특히MMP 발현 농도의 감소 및/또는 억제에서의 설로덱사이드와 SDX-DX의 효과를 확인시킨다. 농도가 각각 25, 5, 20 ㎍/ml인 설로덱사이드, SDX-DS 및 파르나파린은 정맥류를 위하여 복재정맥절제술 (saphenectomy)를 받은, 10 명의 건강한 여성 (평균나이 42세)로부터 외과 수술에 의해 수득한, 인간 복재 정맥 (saphenous vein) 단편에 첨가되었다.
적절한 조직 인클루전 (tissue inclusion) 후, 약 5 ㎛ 두께의 연속적인 절편 (serial section)이 모노클로날 항체 항 MMP-9와 함께 인큐베이션 되었고, 비오틴화된 (biotinylated) 2차 항체와의 인큐베이션 후, 그 복합체는 표준 방법에 따라서 페록시다제 (peroxidase) 반응에 의하여 검출되었다. 인큐베이션 후의 복합체는 표준 방법에 따라서, 아비딘-페록시다제에 의해 검출되었다.
설로덱사이드로 처리된 조직 샘플은, 대조군 및 헤파린 처리된 샘플에 대하여, MMP의 더 낮은 국소 농도를 입증하면서, 염색된 면적의 감소된 표면을 나타냈다.
표 12는 첨가가 없는 샘플에 100에 해당하는 값을 부여하면서, 약 25 ㎍/ml의 농도에서의 설로덱사이드는 약 60 %에 해당하는 MMP-9의 염색 면적 강도를 감소시키며; 약 5 ㎍/ml 농도의 SDX-DS는 약 70 %의 강도를 감소시키고, 약 20 ㎍/ml 농도의 파르나파린은 MMP-9의 강도를 감소시키지 않는다는 것을 입증한다. 이러한 설로덱사이드 및 SDX-DS의 생체 외 결과는 생체외 이용으로 전환 가능하며, MMP가 연관되는 모든 병리에서의 MMP의 감소에 적용가능하다.
실시예 9는 인 시투 (in situ) 자이모그래피 (세포화학)을 이용하여, 정맥벽의 MMP에 대한 설로덱사이드, SDX-DS 및 파르나파린의 영향을 나타낸다.
각각 약 25, 5 및 20 ㎍/ml의 농도의 설로덱사이드, SDX-DS 및 파르나파린이 정맥류를 위하여 복재정맥절제술을 받은, 10 명의 건강한 여성(평균 나이 42세)로부터 외과수술에 의해 수득한, 인간 복재 정맥 단편에 첨가되었다.
처리 뒤, 정맥 절편은 형광 젤라틴 물질과 함께 인큐베이션되었으며, 530 nm에서의 정맥 부분의 현미경 영상 비교를 이용하여 단백질분해성 활성이 관찰되었다.
이러한 실험에서, 형광 수준은 조직상에서 MMP 활성과 비례적이며, 신 시투 자이모그래피의 결과는 표 13에 보고된다.
표 13은 첨가가 없는 샘플에 100에 해당하는 값은 부여하며, 약 25 ㎍/ml 농도의 설로덱사이드가 약 MMP-9의 강도를 약 50 %로 감소시키고; 약 5 ㎍/ml 농도의 SDX-DS는 MMP-9의 강도를 약 80 %로 감소시키며 약 20 ㎍/ml 농도의 파르나파린은 MMP-9의 강도를 약 40 %로 감소시킨다는 것을 입증하였다.
설로덱사이드, SDX-DS 및 SDX-HEP의 정맥 조직에서의 감소 및/또는 억제의 효과는 MMP가 연관된 모든 조직으로 확대될 수 있다.
예를 들어 제한 없이, 설로덱사이드, SDX-DS 및 SDX-HEP는 장궤양 및 MMP에 전가할 수 있는 다른 손상에 사용될 수 있다.
MMP, 특히 MMP-9의 감소에 대한 생체 내 효능 (efficacy) 농도를 얻기 위하여, 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 약 60 mg/ml 설로덱사이드를 포함하는 용액의 1 내지 4 바이알 (vial)을 주사하는, 정맥 내 경로로 투여될 수 있다. 대안적으로, 치료적으로 동등한 투여량으로 근육 내 또는 경구 경로로 투여될 수 있다. 후자의 경우, EP 1292315에서 개시된 바와 같은 유해 작용 발생 없이, 1000 mg/일 및 그 이상의 투여량으로 투여하는 것이 가능하다.
순환 MMP의 감소에서의 설로덱사이드의 특성 및 특히 MMP-9에 대항하는 선택적인 작용은, 알려지지 않으며 예상치 못한 효과이며, MMP, 특히 MMP-9가 연관된 모든 병리, 예를 들어 혈관 질환, 만성정맥부전, 부정맥, 정맥 궤양, 폐질환, 종약의 증가 및 진행, 원발성 종양의 성장, 혈관형성, 종양 세포의 혈관 외 유출 및 혈관 내 주입에 특히 유용할 수 있다.
보고되며 제한하지 않는 실험은, 백혈구 및 혈소판에 의해 방출되는 MMP, 특히 MMP-9 방출의 감소/억제 및, 정맥 내벽에서의 MMP 값의 억제를 위한 설로덱사이드, SDX-DS 및 설로덱사이드의 헤파린 분획의 새로운 용도를 입증한다. 약 20 내지 1000 mg 및 더 높은 설로덱사이드; 약 4 mg 내지 약 200 mg 및 더 높은 SDX-DS; 및 16 내지 약 700 또는 더 높은 SDX-HEP를 포함하는 약제학적 조성물에 의해, 탈체 (Ex-vivo) 결과는 설로덱사이드, SDX-DS 및 설로덱사이드의 헤파린 분획의 생체 내로의 용도로 완전하게 전환 가능하다.
더욱이, 설로덱사이드, SDX-DS 및 SDX-HEP 투여는, 제한 없이 근육 내 및/또는 정맥 내 또는 경구 경로의 주사 경로에 의해 발생할 수 있다.
유효성분 설로덱사이드, SDX-DS 및 SDX-HEP의 투여량은 투여 방식, 환자의 나이, 체중, 환자의 일반적 상태, 및 질병의 중증도에 따라서 상당히 달라질 수 있으며, 표준 기술로 결정될 수 있다. 또한, 생체 외 및 동물 실험이 선택적인 투여량 범위 확인을 돕기 위하여 선택적으로 이용될 수 있다. 바람직하게 약제학적 조성물은 경구 투여에 허용가능한 형태이다. 본 발명에서의 설로덱사이드, SDX-DS 및 설로덱사이드의 헤파린 분획은 정제, 캡슐, 과립제, 현탁액, 용액 또는 에어로졸 형태로 조성물에 포함될 수 있다.
경구 약제학적 조성물은 제어된 방출을 제공할 수 있다.
경구 약제학적 조성물은 점액접착성 (mucoadhesivity)를 증가시키는 바이오접착(bioadhesive) 특성을 제공할 수 있다,
경구 제제를 위한 부형제는 리간트 (ligant), 활택제 (glidant), 붕해제 (disintegrant), 희석제, 천연 물질 중 하나 이상 선택된다.
경구 사용을 위한 부형제는 붕해제, 희석제, 및 그들의 결합을 포함할 수 있다. 붕해제는 크로스포비돈 (crospovidone), 소디움 스타치 클리콜레이트 (sodium starch glycolate), 콘 스타치 (corn starch), 셀룰로스 유도체 및 그들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 희석제는 락토스, 만니톨, 자일리톨, 미세결정 셀룰로스, 당, 덱스트린, 친수성 탄수화물, 및 그들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 경구 약제학적 형태는 바이오접착 부형제를 포함할 수 있다.
정제는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스 (hydroxypropyl methylcellulose), 히드록시메틸 셀룰로스 (hydroxymethyl cellulose), 폴리비닐-피롤라이던, 폴리에틸렌 글리콜, 덱스트린, 말토덱스트린, 아세트산 폴리비닐 (polyvinyl acetate) 기초 화합물, 하이드록시프로필 셀룰로스 (hydroxypropyl cellulose), 아세트산 셀룰로스 (cellulose acetate), 셀룰로스프탈레이트 (cellulosephtalate), 그들의 유도체, 또는 그들의 조합으로 구성된 코팅을 더 포함할 수 있다.
경구 형태는 가미제, 착색 또는 감미제를 포함할 수 있다.
설로덱사이드 또는 SDX-DS 및 SDX-HEP를 포함하는 약제학적 조성물은 MMP의 제어된 방출의 감소/억제를 위한 알려지고 연구된 화합물에 대하여, 많은 장점을 제공하고, MMP-9에 대한 특이적 선택성, 내약성 (tolerability), 안정성 및 수용성과 같은 많은 문제점을 해결한다.
이 발명은 혈전증 위험 (thrombotic risk)에 의한 혈관 병리의 예방으로 시판되는 설로덱사이드의 용도에 대하여 상이한, 신규한 치료적 용도를 언급한다.
약제학적 수행에 있어서, 설로덱사이드, SDX-DS 및 SDX-HEP는 통상의 기술자에게 관습적인 기술을 이용하여, 허용가능한 부형제와 조합될 수 있다.
조성물은 단일 또는 다중의 투여량으로, 제어된 방출 조성물로 하루에 1회 또는 수회 투여될 수 있다.
종래 기술은 신증과 같은 당뇨와 관련된 병리에 대한 설로덱사이드의 용도를 기술하는 반면, 본 발명 후인, 현재만이 설로덱사이드에 대한 새로운 약학적 용도를 갖는 것이 가능하다.
본 발명의 또 다른 목적은, 제한 없이, MMP, 특히 MMP-9가 연관된 모든 병리의 치료에 유용한 SDX-DS 및 SDX-HEP를 포함하는 약제학적 조성물이다.
본 발명의 특정한 양태는 정맥 이완이 연관된 병리, 예를 들어 정맥류 형성, 만성정맥부전; 위장 궤양, 폐질환, 및 종양성 병리의 치료에 대한 상기의 용도이다.
본 발명의 중요하고 특정한 양태는 설로덱사이드로부터 단리된 SDX-DS 및 그의 생체 외 및 생체 내에서 MMP의 방출을 억제 및/또는 감소시키는 용도이다.
본 발명의 또 다른 양태는 정제 방법을 이용하여 설로덱사이드로 수득한 SDX-DS이다.
또다른 양태는, AT III로 관능화된 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피를 이용한 SDX-DS이다.
SDX-DS 단리 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 5 내지 10 mg/ml 겔 농도로 ATIII를 포함하 친화성 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계;
b) pH 7.4에서, TRIS 50 mM, NaCl 50 mM를 포함하는 버퍼 중 0.1 내지 5 mg/ml 겔에 속하는 농도로, 상기 단계 a)의 컬럼에 설로덱사이드를 로딩하는 단계;
c) 흡수되지 않은 분획 (non absorbed fraction) 내의 용출된 데르마탄 술페이트 분획을 통합 (pool)하고, 선택적으로 통합된 데르마탄 술페이트를 동결건조하는 단계;
d) 선택적으로 상기 데르마탄 술페이트를 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 수화물, 포접화합물로 변형하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태는 정제 방법을 이용하여 설로덱사이드로 수득한 SDX-HEP이다.
또 다른 양태는 AT III로 관능화된 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피를 이용한 SDX-HEP이다.
SDX-HEP를 단리하는 방법은 하기의 단계를 포함한다:
a) 5 내지 10 mg/ml 겔 농도로 ATIII를 포함하는 친화성 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계;
b) pH 7.4에서, TRIS 50 mM, NaCl 50 mM를 포함하는 버퍼 용액 중 0.1 내지 5 mg/ml 겔에 속하는 농도로 설로덱사이드를 로딩하는 단계;
c) pH 7.4에서 TRIS 50 mM, NaCl 3 M을 포함하는 버퍼 용액으로 상기 크로마토그래피 컬럼으로부터 저분자량 헤파린을 용출하는 단계;
d) 용출된 저분자량 헤파린 분획을 통합하고 선택적으로 통합된 헤파린을 동결건조하는 단계;
e) 선택적으로 상기 저분자량 헤파린을 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 수화물, 포접화합물로 변형하는 단계.
본 발명의 중요하고 특정한 양태는 SDX-HEP 및 그의 생체 외 및 생체 내에서 MMP의 방출을 억제 및/또는 감소시키는 용도이다.
또 다른 양태는, 고체형, 현탁액, 과립제, 에어로졸인, MMP가 연관되고 감소가 필요한 병리의 치료를 위한 설로덱사이드를 포함하는 약제학적 조성물이다.
또 다른 양태는, 설로덱사이드, SDX-DS 및 DSX-HEP를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트이다.
또 다른 양태는, 약 5 mg/일 이상의 투여에 적합한 투여량의, 설로덱사이드 또는 그의 구성성분 중 하나, 특히 SDX-DS 또는 SDX-HEP 또는 그들의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물의 용도이다. 일일 투여량의 예는, 제한 없이, 1회 이상의 투여로, 5 내지 1000 mg/일, 15 내지 800 mg/일, 50 내지 200 mg/일, 20 내지 1000 mg/일 또는 그 이상이다.
SDX-DS의 바람직한 일일 투여량은, 제한 없이, 단일 또는 다중 투여로, 1 내지 300 mg 또는 그 이상, 특히 4 내지 300 mg 이다.
SDX-HEP의 바람직한 일일 투여량은, 제한 없이, 단일 또는 다중 투여로, 16 내지 900 mg 또는 그 이상, 특히 19 내지 800 mg 이다.
설로덱사이드, SDX-DS 및 SDX-HEP를 포함하는 약제학적 조성물은 부정적인 효과 없이, 병용 치료 (concomitant therapy)를 받는 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명에 기술된 설로덱사이드, SDX-DS 및 SDX-HEP의 용도는 MMP가 연관되며, 그들의 감소 및/또는 억제가 요구되는 모든 병리 치료를 위한 신규한 의학적 용도로 고려되어야 한다. 설로덱사이드, 설로덱사이드의 SDX-DS 및 헤파린 분획의 용도는, 종래 기술에서 연구된 화합물과 비교하여 볼 때, 특이적 선택성, 컴플라이언스 (compliance) 및 용이한 투여와 같은 중요한 수개의 문제점을 극복한다.
도 1: 설로덱사이드의 겔 침투 프로파일 (gel permeation profile);
도 2: 설로덱사이드로 수득한 데르마탄 술페이트 (dermatan sulfate)의 겔 침투 프로파일;
도 3: 설로덱사이드로 수득한 헤파린 (heparin)의 겔 침투 프로파일.
도 2: 설로덱사이드로 수득한 데르마탄 술페이트 (dermatan sulfate)의 겔 침투 프로파일;
도 3: 설로덱사이드로 수득한 헤파린 (heparin)의 겔 침투 프로파일.
본 발명은 본 발명의 한정으로 간주되어서는 안되는 하기의 실시예에 의하여 상세하게 나타난다.
실시예
1
설로덱사이드로부터
데르마탄
술페이트
분획을 수집하는 방법
8 mg에 해당하는, 동물 장점막 (intestinal animal mucosa)으로부터 추출한 설로덱사이드의 양을, pH 7.4 에서 TRIS 50 mM 와 NaCl 50 mM로 구성된 결합 버퍼에 용해시키고, CNBr-활성화 세파로스 겔 (CNBr-activated Sepharose gel) (GE) ml 당 7.5 mg ATIII의 결합으로 제조된 친화성 컬럼에 로딩시켰다.
수득된 컬럼을 상기와 동일한 버퍼용액으로 세척하고, 흡수된 물질을 pH 7.4에서 TRIS 50 mM, NaCl 3 M로 이루어진 버퍼용액을 이용하여 용출시켰다.
데르마탄 술페이트 분획은 통과액 (flow-through)에 존재하는 비흡수된 물질로 수집하고 헤파린 분획은 용출된 분획로 수집했다.
데르마탄 술페이트 및 헤파린 분획은 -20℃에서 보관하거나 선택적으로 동결건조 시킬 수 있었다.
헤파린이 통합된 분획 (pooled fraction) 및 데르마탄 술페이트가 통합된 분획을 겔 침투 크로마토그래피 (gel permeation chromatography, GPC)와 아가로스 겔를 이용하여 분석하였다.
크로마토그래피 프로파일은 GPC 컬럼 TSK 겔, G2000 SWXL (7.8 X 300 mm)을 갖춘 HPLC 시스템 HP 1090를 이용하고, 0.2 ml/분에 해당하는 유속 (flow rate)으로 pH 5에서 Na2SO4 0.2 M로 용출시키고, 굴절률 검출기 (Refraction Index detector)로 검출하여 수득했다.
도 1은 약 30분에 해당하는 체류 시간 (RT)에 최대 피크 (maximum sharp peak)를 갖는 넓은 크로마토그래피 GPC 프로파일로, 친화성 크로마토그래피에 로딩된 설로덱사이드의 크로마토그래피 프로파일을 나타낸다.
도 2는 약 27 분의 RT에 최대인 보다 짧은 피크를 갖는, 친화성 크로마토그래피의 통과액에 존재하는 데르마탄 술페이트를 나타낸다.
도 3은 넓은 피크를 특징으로 하는 친화성 크로마토크래피에 의해 용출된 헤파린 분획을 나타낸다.
아가로스 겔 분석은 아가로스를 0.04 M pH 5.8의 아세트산 바륨 버퍼 (Barium Acetate Buffer)에 0.6 % (w/v)의 농도로 용해시켜 수득하였다. 수득된 따뜻한 용액 (warm solution)를 약 7.5 cm x 4.5 cm의 크기를 갖는 유리 플레이트 (glass plate)상에 배치하고, 소량의 착색제 크레졸 레드 (Gresol Red)를 포함한, 설로덱사이드, SDX-DS 및 SDX-HEP를 약 10 mg/ml의 농도로, 아가로스 겔에 로딩시켰다. 전기영동 분리 (electrophoretic separation)는 두 단계로 수행하였다: 100 V에서 약 25 분 동안 0.04 M pH 5.8의 아세트산 바륨 버퍼에서의 제1 단계 및 110 V에서 약 30 분 내지 40 분 동안 0.05 M, pH 9의 1,3-다이아미노프로판 (1,3-diamminopropane)에서의 제2 단계로 수행하였다. 그 후, 약 3시간 동안 상기 플레이트를 물 중 0.1 % (w/v)의 세틸피리디늄 클로라이드 (cetylpyridinium chloride)로 이루어진 고정 용액 (fixing solution)에 담갔다. 따뜻한 공기 하에 플레이트를 건조시킨 후, 그 플레이트를 50:50:1 (v/v/v)의 에탄올/물/아세트산 중의 0.1% (w/v) 톨니딘 블루 (Tolnidine Blue)로 이루어진 착색 용액 (staining solution)에 담갔으며, 착색제가 없는 동일한 용액으로 탈염 (destain) 시키고, 따뜻한 공기하에서 건조시켰다.
설로덱사이드, 그의 분리된 구성성분인 SDX-DS 및 SDX-HEP와 상용 데르마탄 술페이트의 상대적 이동도 (relative mobility)가 표 1에 표시된다.
| 구성 성분 (㎍/ml) | Rf |
| 설로덱사이드 | 0.86 0.75 |
| 데르마탄 술페이트 분획 (SDX-DS) | 0.84 |
| 헤파린 분획 (SDX-DS) | 0.75 |
| 상용 데르마탄 술페이트(Sigma) | 0.86 |
실시예
2
혈액 샘플 중의 순환
MMP
에 대한
설로덱사이드의
효과
50명의 건강한 지원자, 25세 내지 58세, 평균 37세의 25명의 여성과 25명의 남성으로부터 수집한 혈액 샘플을 시험관에 넣고 두개의 샘플 세트를 준비하였다; 제1 세트에는 0, 12, 24, 48 ㎍/ml에 해당하는 최종 농도를 얻을 때까지 가변적인 양의 설로덱사이드를 첨가하고, 제2 세트에는 0, 2.5, 5, 및 10 ㎍/ml의 최종 농도까지, 실시예 1에서 수득한 가변적인 양의 데르마탄을 첨가하였다. 설로덱사이드 및 데르마탄의 첨가가 없는 샘플을 대조군으로 사용하였고, 이 샘플의 MMP 밴드 (band)를 100% 강도 (intensity)의 임의 값 (arbitrary value)으로 정했다. 처리된 샘플의 MMP 밴드의 강도를 비처리된 샘플에 대한 퍼센트로 보고하였다.
전 샘플을 1550 g로 4℃에서 10 분 동안 원심분리하고, 브래드포드법 (Bradford method)으로 결정한, 150 ㎍ 의 총단백질에 해당하는 혈청 샘플 상청액 (S) 양을 자이모그래피 (zymography)-젤라틴 (gelatin)으로 분석하였다. 비환원 (non reducing) 조건에서, 상기 샘플을 겔 자이모그래피에 로딩시키고, 전기영동 분리를 15 부피 (volume)의 라엠리 (Laemmli) U.K 버퍼 (Nature, 227 (1970), 680-685)를 이용하여 건강한 지원자로부터 수집한 모세혈관 혈액을 희석하여 준비한 MMP 표준과 비교하였다.
젤라틴 중 자이모그램 (zymogram)을 돼지 큐트 (swine cute) (Type A 90 Bloom, Sigma)에 의해 단리된 0.2% (p/v) 젤라틴을 포함하는 7.5% (p/v)의 폴리아크릴아미드 (polyacrylamide)로 준비하였다.
전기영동을 75 분 동안 35 mA에서 수행하고, 겔을 2.5 % (v/v) 농도의 Triton X-100 용액으로 세척하고, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM CaCl2, 100 mM NaCl, 1 mM ZnCl2, 0,3 mM NaN3, 0.02 % (p/v)의 디터젼트 (detergent) Brij®-35 및 0.25 %(v/v)의 Triton X-100으로 구성된 용액에서 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 인 시투 (in situ) 젤라티나제 활성 (gelatinase activity)의 검출은 0.2 % (p/v)의 농도의 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant blue)에 의한 겔의 염색 및 뒤이은 80/20 부피비의 메탄올-아세트산 용액을 이용한 표백 (bleach)에 의해 발생한다.
설로덱사이드와 실시예 1에서 수득한 SDX-DS는 MMP-9와 관련한 밴드에만 작용하는 반면, MMP-2 밴드의 강도는 대조군에 대하여 변하지 않게 유지되고 100 %값으로 정한다. 면적의 계산은 영상 분석기 (imagine analyzer)를 갖춘 농도계 (densitometer)로 수행했다. 설로덱사이드의 포함 또는 불포함, 데르마탄 분획의 포함 또는 불포함 혈청 샘플 중 MMP-9와 관련한 젤라틴용해성 분해 (gelatinolytic digestion)의 면적 퍼센트를 표 1에 보고한다.
| 설로덱사이드 (㎍/ml) |
면적 % MMP-9 |
실시예 1로 수득한 데르마탄 술페이트 (㎍/ml) | 면적 % MMP-9 |
| 0 | 100±7 | 0 | 100±7 |
| 12 | 57±4 | 2.5 | 46±3 |
| 24 | 41±5 | 5 | 30±7 |
| 48 | 7±1 | 10 | 4±7 |
또한, 메탈로프로테이나제의 효소적 활성 (enzymatic activity) 측정을 위하여, Biotrak MMP 분석 (Amersham)을 이용하여, 샘플 중 MMP-9의 농도를 Elisa로 결정하며, 0.37-0.25 ㎍/L의 LOD를 갖는 MMP-9 및 MMP-2의 젤라티나제의 pro-MMP의 형태를 확인했고, 수득한 결과를 표 2에 보고한다. Elisa 결과는 자이모그래피에서 관찰된 젤라틴용해성 (activity gelatinolytic) 활성과 통계학적으로 유의성이 있는 차이를 나타내지 않는다.
| 설로덱사이드 (㎍/ml) |
% MMP-9 | 실시예 1로 수득한 데르마탄 술페이트 | % MMP-9 |
| 0 | 100±4 | 0 | 100±4 |
| 12 | 61±6 | 2.5 | 47±4 |
| 24 | 43±8 | 5 | 31±5 |
| 48 | 6±3 | 10 | 5±1 |
실시예
3
혈장 중의 순환
MMP
양에 대한
설로덱사이드의
효과
50명의 건강한 지원자, 25세 내지 58세, 평균 37세의 25명의 여성과 25명의 남성으로부터 혈액 샘플을 수집하고, 각 샘플의 1 ml를 시트르산 나트륨 0.13 M 용액의 38 ㎕에 첨가하며 1550 g으로 10분간 4℃에서 원심분리하였다.
각각 0, 12, 24 및 48 ㎍/ml에 해당하는 최종 농도를 수득할 때까지 증가하는 양의 설로덱사이드를 샘플에 첨가한다.
브래드포드법으로 측정한, 150 ㎍에 해당하는 원심분리로 수득한 플라즈마 샘플 (P) 상청액의 총단백질 양은 자이모그래피-젤라틴으로 분석한다. 비 환원 조건에서, 15 부피의 라엠리 (Laemmli) 버퍼를 이용하여 건강한 지원자로부터의 모세혈관 혈액을 희석하여 준비한 젤라티나제 표준을 겔에 로딩시킨다.
젤라틴-자이모그램 및 전기영동 진행 (rune)은 실시예 2에서 기술한 바와 같이 수행한다.
밴드의 자이모그램 면적을 영상 분석기를 갖춘 농도계를 이용하여 결정하고, 메탈로프로테이나제에 관한 밴드 면적의 증가를 설로덱사이드 첨가 하지 않은 혈장의 밴드 면적 증가와 비교하여 계산했다. 설로덱사이드를 포함하거나 포함하지 않는 혈액 샘플 중의 MMP-9에 관한 젤라틴용해성 분해 (gelatinolytic digestion)의 면적 퍼센트를 표 4에 보고한다.
| 설로덱사이드 농도 (㎍/ml) | MMP-9 면적 % |
| 0 | 100±5 |
| 12 | 98±4 |
| 24 | 101±4 |
| 48 | 99±4 |
자이모그램의 MMP-9의 농도계 분석 (densitometric analysis)을 Elisa의 정량적 분석으로 확인하며, 표 4에 보고한 데이터는, 자이모그램의 농도계 분석과 비교하여 볼 때 유의성 있는 차이를 나타내지 않는다.
| 설로덱사이드 농도 (㎍/ml) | MMP 농도 % |
| 0 | 100±7 |
| 12 | 99±5 |
| 24 | 100±3 |
| 48 | 98±4 |
실시예
4
혈장 형성 (serum formation) 후, 혈장 순환 MMP 양에 대한 설로덱사이드의 효과
50명의 건강한 지원자, 25세 내지 58세, 평균 37세의 25명의 여성과 25명의 남성으로부터 수집한 혈액 샘플을 시험관에 넣고 1500 g으로 10 분간 4 ℃에서 원심분리한다.
각각 0, 12, 24, 48 ㎍/ml에 해당하는 설로덱사이드의 최종 농도를 수득하기 위하여 설로덱사이드의 증가하는 양을, 브래드포드법으로 측정한 혈청단백질 150㎍에 첨가한다. 비환원 조건에서, 15 부피의 라엠리 버퍼를 이용하여 건강한 지원자로부터의 모세혈관 혈액을 희석시켜 준비한 젤라티나제 표준과 비교하여, 수득한 샘플을 자이모그래피-젤라틴으로 분석한다.
자이모그램, 전기영동 과정 및 염색/탈색은 실시예 2에서 기술한 바와 같이 수행한다.
밴드의 자이모그램 면적은, 영상분석기를 갖춘 농도계를 이용하여 결정하고, 메탈로프로테이나제에 관한 밴드 면적의 감소를 설로덱사이드 첨가가 없는 혈청의 밴드 면적 감소와 비교하여 계산하였다. 설로덱사이드를 포함하거나 또는 포함하지 않는 혈청 샘플 중의 MMP에 관한 젤라틴용해성 분해 (gelatinolytic digestion)의 면적 퍼센트를 표 6에 보고한다.
| 설로덱사이드 농도 (㎍/ml) | MMP-9 면적 % |
| 0 | 100±6 |
| 12 | 98±4 |
| 24 | 101±3 |
| 48 | 99±4 |
자이모그래피로 수득한 데이터는 표 7에 보고하는 Elisa로 수득한 것과 비교하여 볼 때, 유의성 있는 차이를 나타내지 않는다.
| 설로덱사이드 농도 (㎍/ml) | MMP-9 농도 % |
| 0 | 100±5 |
| 12 | 99±2 |
| 24 | 101±4 |
| 48 | 97±6 |
실시예
5 :
비교예
설로덱사이드 , 실시예 1로 수득한 데르마탄 술페이트 및 파르나파린 (Parnaparin)의 평가
실시예 2에서 기술한 바와 같이 준비한 혈액 샘플을 3개의 군으로 분리하였으며, 하나의 군은 24 ㎍/ml에 해당하는 최종 농도의 설로덱사이드를 처리하였고, 또 하나의 군은 5 ㎍/ml에 해당하는 최종 농도의 파르나파린을 처리하였으며 마지막 군은 5 ㎍/ml의 농도의 실시예 1로 수득한 데르마탄 분획을 처리하였으며, 자이모그래피 및 Elisa로 비교하였다.
결과는 표 8과 표 9에 보고한다.
| 설로덱사이드 (㎍/ml) | % MMP-9 | 파르나파린 (㎍/ml) |
% MMP-9 | 실시예1의 데르르마탄 술페이트(㎍/ml) | MMP-9 면적 % |
| 0 | 100±7 | 0 | 100±7 | 0 | 100±7 |
| 24 | 41±5 | 19 | 69±7 | 5 | 30±6 |
| 설로덱사이드 (㎍/ml) | % MMP-9 | 파르나파린 (㎍/ml) |
% MMP-9 | 실시예 1의 데르마탄 술페이트(㎍/ml) | MMP-9 면적 % |
| 0 | 100±7 | 0 | 100±7 | 0 | 100±7 |
| 24 | 43±8 | 19 | 67±9 | 5 | 32±8 |
실시예는 MMP, 특히 MMP 9를 감소 및/또는 억제하는 설로덱사이드 및 설로덱사이드에 존재하는 데르마탄 술페이트 분획의 효과를 확인시켜준다.
실시예
6:
비교예
상용
데르마탄
술페이트와
실시예1로
수득한
데르마탄
술페이트간의
비교
실시예 2에서 기술한 바와 같이 준비한 혈액 샘플을 3개의 군으로 분리하였으며, 5 ㎍/ml에 해당하는 최종 농도로 모두, 제1 군은 Sigma Aldrich (이탈리아)에 의해 상업화된 상용 데르마탄 술페이트를 처리하였고; 제2 군은 Calbiochem (이탈리아)에 의해 상업화된 데르마탄 술페이트를 처리하였으며 제3 군은 실시예 1과 같이 설로덱사이드로부터 추출한 DS를 처리하였다. 샘플은 실시예2에서와 같이 Elisa에 의해 분석되었고, 최종 결과를 표 10에 보고하였다.
| 데르마탄 술페이트 (Sigma Aldrich) (㎍/ml) |
% MMP-9 | 데르마탄 술페이트 Calbiochem (㎍/ml) |
% MMP-9 |
실시예1의 데르마탄 술페이트 (㎍/ml) |
MMP-9 면적 % |
| 0 | 100±5 | 0 | 100±5 | 0 | 100±7 |
| 5 | 89±8 | 5 | 95±7 | 5 | 32±8 |
실시예
7 :
비교예
상용
데르마탄
술페이트와
실시예
1로 수득한
데르마탄
술페이트간의
비교
실시예 2에 기술한 바와 같이 준비한 혈액 샘플을 5개 군으로 분리하였다:
1 군: 19 ㎍/ml 농도의 상용 파르나파린을 처리한 혈액 샘플;
2 군: 24 ㎍/ml 농도의 설로덱사이드를 처리한 혈액 샘플;
3 군: 5 ㎍/ml 농도의 실시예 1에서와 같이 설로덱사이드로 수득한 DS를 처리한 혈액 샘플;
4 군: 19 ㎍/ml 농도의 파르나파린과 5 ㎍/ml 농도의 실시예 1에서와 같이 설로덱사이드로 수득한 DS의 혼합물을 처리한 혈액 샘플;
5 군: 19 ㎍/ml 농도의 파르나파린과 5 ㎍/ml 농도의 상용 DS의 혼합물을 처리한 혈액 샘플.
샘플은 실시예 2에서 기술한 바와 같이 Elisa로 분석하였으며 결과를 표 11에 보고하였다.
첨가가 없었던 샘플에 대한 MMP-9의 감소를 계산하고, 100 %에 해당하는 면적 값을 부여했다.
| 비교 | 농도 (㎍/ml) |
MMP-9 면적 % |
| 설로덱사이드 | 24 | 43±8 |
| SDX-DS | 5 | 31±6 |
| 파르나파린 | 19 | 73±9 |
| 파르나파린+SDX-DS | 19 + 5 | 55±4 |
| 파르나파린+DS-Sigma | 19 + 5 | 87±6 |
Sigma 및 Calbiochem의 상용 DS는 동일한 결과를 나타냈다.
실시예
8
면역조직화학 ( immunophistochemistry )에서의 정맥벽 (venous wall) 중 설로덱사이드, 데르마탄 술페이트 (SDX-DS) 및 파르나파린에 대한 탈체 (Ex-vivo) 평가
정맥류 (varicose vein)를 위한 복재정맥절제술 (saphenectomy)를 받는 10명의 건강한 여성 (평균나이 42세)로부터 외과수술에 의해 수득한, 인간 복재 정맥 (saphenous vein) 단편을 NaCl 0.9 % 중 무균 조건하에서 CO2 인큐베이터 (5 % CO2, 37°C에서 24 시간 동안) 내에서 유지시키고, 3개의 부분으로 분리하였다. 제1 부분은 24 ㎍/ml 농도의 설로덱사이드로 처리하였고; 제2 부분은 19 ㎍/ml 농도의 파르나파린으로 처리하였으며 제3 부분은 5 ㎍/ml 농도의 실시예 1로 수득한 SDX-DS로 처리하였다. 정맥 단편을 10 %의 포르말린 용액에서 고정시키고 처리하고, 파라핀 왁스내에 포매 (embed)시켰다. 완성된 포매 블록 (block)은 혈류의 본래 방향에 대해 직교로 배향시키고 (orthogonally oriented), 그 후 횡행 (transverse) 5 mm의 두깨의 절편 (section)으로 절단하고 3-아미노프로필-트리에톡시실란 (3-aminopropyl-triethoxysilane) 코팅된 슬라이드에 배치하였다. 정맥벽의 부분을 5 ㎛ 두께의 연속적인 절편으로 절단했다. 연속적인 절편을 Miller’s elastic van Gieson 및 Harris’헤마톡실린 및 에오신 염색으로 검사하였다. 정상 염소 혈청을 이용하여 상기 절편을 단백질 폐색 (protein blockage)에 제공하였으며 그 후, PBS (phosphate buffered saline)에 1:50으로 희석시킨 일차 모노클로날 항체 항-MMP-9 (Santa Cruz)와 함께, 4℃에서 하루 밤 동안 인큐베이션하였다.
그 뒤, 표준 방법 및 사용된 아비딘 비오틴 페록시다제 복합체 (avidin biotin peroxidase complex)로 정맥 절편을 이차 항체 (비오틴화된 (biotinylated) 염소 항-마우스 IgG)와 함께 인큐베이션 하였다.
PBS를 이용한 세척 후, 정맥 절편을 표준 방법에 따라 DAB 용액 및 H2O2를 이용하여 염색하였다.
뒤이어, 절편을 Mayer’s 헤마톡실린으로 대비 염색 (counterstain)하고, 타탈수시키고, 세척하고, 배치 (mount)하였다. 연속적인 진행 간의 일관성을 보장하기 위하여 염색의 각 회분 (batch)에 양성 및 음성 대조군를 언제나 포함시켰다.
전자 현미경 (40X)으로 영상을 수득하고 그 결과를 표 12에 요약하였다. 색의 강도를 광학적 검사 (optical inspection)로 측정하고, 100 값을 첨가가 없었던 조직 (대조군)에 부여하였으며 SDX-DS, SDX-HEP 및 파르나파린의 첨가 (addiction)에 의해 결정된 흑색의 시각적 감소를 평가하였다. 값을 표 12에 보고한다.
| 농도 (㎍/ml) |
강도의 감소 % |
|
| 설로덱사이드 | 24 | 60 |
| SDX-DS | 5 | 70 |
| 파르나파린 | 19 | 0 |
실시예
9
인 시투 (in situ) 자이모그래피 (세포화학)에서의 정맥벽 중 설로덱사이드 , 데르마탄 술페이트 및 파르나파린의 탈체 평가
정맥류를 위한 복재정맥절제술를 받는 10명의 건강한 여성 (평균 나이 42세)으로부터 외과 수술에 의해 수득한, 인간 복재 정맥 단편을 NaCl 0.9 % 중에 무균 조건하에서 CO2 인큐베이터 (5 % CO2, 37°C에서 24 시간 동안)내에서 유지시키고, 3개의 부분으로 분리하였다. 제1 부분은 24 ㎍/ml 농도의 설로덱사이드를 처리하고; 제2 부분은 19 ㎍/ml 농도의 파르나파린을 처리하며 제3 부분은 5 ㎍/ml 농도의 실시예 1로 수득한 SDX-DS를 처리하였다. 정맥 단편을 10 %의 포르말린 용액으로 고정시키고 처리하고, 파라핀 왁스 내에 포매시켰다. 완성된 포매 블록을 혈류의 본래 방향에 대해 직교로 배향시키고, 그 후 횡행 5 mm 두께의 절편을 절단하고 3-아미노프로필-트리에톡시실란 코팅된 슬라이드에 배치했다. 정맥벽의 단편을 5㎛ 두께의 연속적인 절편으로 절단했다. 혈관 절편을 50 mM Tris-HCl, pH 7.5; 5 mM CaCl2; 100 mM NaCl; 1 mM ZnCl2; 0,3mM NaN3로 구성된 버퍼 중 25 ㎍/ml 농도의 형광 젤라틴 기질 (DQ Gelatin, Molecular probe)과 함께 37℃에서 5시간 동안 인큐베이션시켰다.
단백질 분해 활성 (proteolytic activity)를 인 시투 (in situ)로 관찰하고, 530 nm에서 정맥 단편을 비교하고 그들을 녹색 형광으로 식별했다.
대조군에 대한, SDX-DS, SDS-HEP 및 파르나파린의 존재에서의 형광 젤라틴 (fluorogenic gelatin)에 의한 MMP-9의 세포화학적 염색을 통한, 정맥 조직 중, 시투 자이모그래피의 농도계 분석 (densitometric analysis) 및 그 데이터를 표 13에 보고한다. 첨가가 없었던 조직에 100의 값을 부여하고 SDX-DS, SDS-HEP 및 파르나파린의 첨가 후 형광 감소를 측정하였다.
| 농도 (㎍/ml) | 강도의 감소 % |
|
| 설로덱사이드 | 24 | 50 |
| SDX-DS | 5 | 80 |
| 파르나파린 | 19 | 50 |
Claims (8)
- AT III로 관능화된 정지상을 이용한 친화성 크로마토그래피 방법을 의해 술로덱사이드로부터 얻어지는 데르마탄 술페이트로서, 상기 데르마탄 술페이트는 비흡수된 통과액 (flow-through)에 수집되고, 평균 분자량이 25 kDa 이고, 아가로스 겔에서 전기영동 상대적 이동도 (Rf)가 0.84인 것으로 규명된 것인 데르마탄 술페이트, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 포접화합물 (clathrate).
- 청구항 1에 있어서, 감염 또는 종양 질환 (neoplastic disease), 높은 수준의 MMPs가 특징인 혈관 질환, 위장 궤양 (gastrointestinal ulcer), 종양의 증가 및 진행, 원발성 종양 (primary tumor)의 성장, 혈관 형성 (angiogenesis), 종양 세포의 혈관 외 유출 및 혈관 내 주입, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환의 치료에 사용하기 위한 것인 데르마탄 술페이트.
- 청구항 2에 있어서, 상기 혈관 질환은 만성 정맥 부전 (chronic venous insufficiency, CVI), 정맥류 (varicose vein), 심근 경색 후 심정지 (cardiac break), 및 복부 대동맥류 (abdominal aortic aneurysm)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 데르마탄 술페이트.
- 청구항 1에 있어서, 5 ㎍/ml의 농도에서 50 %보다 높은 양으로 MMPs의 억제 또는 감소에 사용하기 위한 것인 데르마탄 술페이트.
- 청구항 1에 있어서, 5 ㎍/ml의 농도에서 50 %보다 높은 양으로 MMP-9의 억제 또는 감소에 사용하기 위한 것인 데르마탄 술페이트.
- 청구항 1에 따른 데르마탄 술페이트를 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는, 정제, 캡슐, 현탁액, 용액, 또는 에어로졸 형태인 것인 조성물.
- 청구항 6에 있어서, 상기 부형제는 하나 이상의 리간트 (ligants), 활택제 (glidant), 붕해제 (disintegrants), 천연 물질(natural agents) 중에서 선택되는 것인 조성물.
- 하기의 단계를 포함하는, 청구항 1의 데르마탄 술페이트를 제조하는 방법:
a) 5 내지 10 mg/ml 겔 농도로 ATIII을 포함하는 친화성 크로마토그래피 컬럼을 준비하는 단계;
b) pH 7.4에서, TRIS 50 mM, NaCl 50 mM를 포함하는 버퍼 중 0.1 내지 5 mg/ml 겔에 속하는 농도로, 상기 단계 a)의 컬럼에 설로덱사이드를 로딩하는 단계;
c) 흡수되지 않은 분획 (non absorbed fraction) 내의 용출된 데르마탄 술페이트 분획을 통합 (pool)하고, 선택적으로 통합된 데르마탄 술페이트를 동결건조하는 단계;
d) 선택적으로 상기 데르마탄 술페이트를 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 용매화물, 수화물, 포접화합물로 변형하는 단계.
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