KR20170091773A - 높은 글리세린 농도를 사용하는 1,3-프로판디올의 생성을 위한 연속 배양법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 미생물을 높은 글리세린 함량을 갖는 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올을 생성하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 높은 글리세린 함량을 포함하는 배지로부터 1,3-프로판디올을 생성하도록 조정된 신규한 미생물, 또는 미생물의 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 글리세롤 대사가 1,3-프로판디올의 생성으로 향하고, 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에서 성장할 수 있도록 "조정된 미생물"에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그 방법으로 수득되는 생물근원(biosourced) 1,3-프로판디올에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 상기 기술한 생물근원 1,3-프로판디올의 열가소성 폴리우레탄에서 사슬 연장제로서, 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트에서의 단위체로서, 및 화장품 제제 내 성분으로서의 용도에 관한 것이다.

Description

높은 글리세린 농도를 사용하는 1,3-프로판디올의 생성을 위한 연속 배양법{CONTINUOUS CULTURE FOR 1,3-PROPANEDIOL PRODUCTION USING HIGH GLYCERINE CONCENTRATION}
본 발명은 미생물을 높은 글리세린 함량을 갖는 배양 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 1,3-프로판디올을 생성하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 높은 글리세린 함량을 포함하는 배지로부터 1,3-프로판디올을 생성하도록 조정된 신규한 미생물, 또는 미생물의 균주에 관한 것이다. 본 발명은 또한 글리세롤 대사가 1,3-프로판디올의 생성으로 향하고, 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에서 성장할 수 있도록 "조정된 미생물"에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 수득되는 생물근원(biosourced) 1,3-프로판디올에 관한 것이다. 마지막으로, 본 발명은 상기 기술한 생물근원 1,3-프로판디올의 열가소성 폴리우레탄에서 사슬 연장제로서, 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트에서의 단위체로서, 및 화장품 제제 내 성분으로서의 용도에 관한 것이다.
1,3-프로판디올(PDO)는 가장 오래된 공지된 발효 생성물 중 하나이다. 이는 일찍이 1881년에 어거스트 프레운드(August Freund)에 의해, 명백하게 클로스트리디움 파스튜리아늄(Clostridium pasteurianum)을 활성 생물로 함유하는 글리세롤-발효 혼합 배지에서 확실히 동정되었다. 다른 장내 새균 생성 PDO(트리메틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜)의 발효의 정량 분석을 일찍이 1928년에 델프트(Delft)의 미생물학 학교에서 시작했고 에임스, 아이오와(Ames, Iowa)에서 1940대에도 성공적으로 지속되었다. 1960년대에는, 관심은 글리세롤-공격 효소로, 특히 글리세롤 및 디올 데히드라타아제로 옮겨갔는데, 이들 효소는 조효소 B12를 요구하는 독특했기 때문이다. PDO-형성 클로스트리디아(Clostridia)는 1983년에 글리세롤-분비 조류로부터 특질 생성물을 수득하는 공정의 부분으로서 처음 설명되었다(Nakas et al., 1983). PDO는 글리세롤 발효의 전형적인 생성물이고 다른 유기 기질의 혐기성 전환은 밝혀지지 않았다. 극히 소수의 생물(모두 박테리아임)만이 그것을 형성하는 것이 가능하다. 그들은 클렙시엘라(클렙시엘라 폐렴균(K. pneumoniae), 엔테로박터(엔테로박터 아글로메란스(E. agglomerans) 및 시트로박터(시트로박터 프레운디(C. freundii), 락토바실리(락토바실러스 브레비스(L. brevis) 및 락토바실러스 부치네리(L. buchneri)) 및 클로스트리디움 부틸리쿰(C. butyricum) 및 클로스트리디움 파스튜리아늄 군의 클로스트리디아 속의 장내 세균을 포함한다.
발효 생성물의 분석은 글리세롤의 부분이 다른 종의 당(sugar) 발효에서와 동일한 생성물, 즉, 아세트산, 2,3-부탄디올, 부티르산, 락트산, 에탄올 및 숙신산으로 전환되는 것을 나타낸다. 이 전환은 성장에 필수적인 에너지를 제공하지만, 많은 생성물에 대해, 글리세롤의 PDO로의 환원성 전환에 사용되는 환원성 균등물 또한 방출된다. 클로스트리디아에서 PDO 수율을 낮추는 부티레이트 형성은 클렙시엘라 내 에탄올 형성과 어느 정도 비교할만 하지만, 성장률에 더 좌우되는 것으로 보인다. 부티레이트는 희석률에 따라 빠르게 감소하며, 심지어 과량의 기질이 없을 때에도 그러하다. 임의의 경우, 아세테이트/부티레이트 비율의 변화는 PDO 수율에 그렇게 큰 영향을 미치지 않는다.
이관능성(bi-functional) 유기 화합물로서 PDO는 잠재적으로 많은 합성 반응에서, 특히 폴리에스테르, 폴리에테르 및 폴리우레탄을 생성하기 위한 중축합의 단위체로서 사용될 수 있다. PDO는 다른 화학적 경로로 생성될 수 있지만, 그들은 극도의 오염 물질을 함유하는 폐기물 흐름을 발생시키고, 생성 가격이 그로써 높아지며 화학적으로 생성된 PDO는 석유화학적으로 입수 가능한 1,2-에탄디올, 1,2-프로판디올, 및 1,4-부탄디올과 같은 디올과 경쟁이 되지 않는다. 그러므로, 과거에는 PDO는 단지 무시할 수 있는 시장 크기의 틈새 분야에서만 발견되었다. 이는 왜 1995년에 듀퐁(Dupont)이 포도당의 PDO로의 생물학적 전환에 대한 연구 프로그램을 시작했는지의 이유이다. 비록 이 공정이 환경 친화적이지만 ⅰ) 매우 비싼 보조인자인 비타민 B12를 사용하고 ⅱ) 생성 균주의 불안정성으로 인한 불연속적인 공정이 되는 단점을 가지고 있다. 바이오-디젤 업계에서 나오는 많은 양의 글리세롤의 이용가능성으로 인해, 비타민 B12가 필요 없고 높은 탄소 수율을 갖는 연속적인 공정이 유리할 것이다.
염 및 물과 혼합된 대략 80 내지 85%의 글리세롤을 함유하는 원하지 않는 바이오디젤 생성의 부산물인, 글리세린으로부터 PDO가 생성될 수 있음은 당업계에 공지되어 있다.
클로스트리디움 부틸리쿰은 배치에서 성장 가능하고 공업용 글리세롤로부터 PDO 생성이 가능하며 2-단계 연속 발효할 수 있는 것으로 이미 기술되었다[Papanikolaou et al., 2000]. 그러나, 높은 글리세롤 농도에서, 수득되는 최대 PDO 역가는 0.02h-1의 희석률에서 48.1 g/L였고, 이는 0.9 g/L/H의 생산성을 의미한다. 배양을 90 g/L의 최대 글리세롤 농도로 유가 배지(fed medium)에서, 당업자에게 박테리아 생물량 생성 증가시키도록 돕는 것으로 공지된 유기 질소를 함유하는 비싼 화합물인, 효모 추출물의 존재 하에 수행했다.
WO 2006/128381는 천연 PDO 생성 생물, 이를테면 클렙시엘라 폐렴균, 클로스트리디움 부틸리쿰 또는 클로스트리디움 파스튜리아늄을 사용하여 배치 및 유가식 배양(fed-batch culture)으로 PDO을 생성하기 위한 이 글리세린의 용도를 개시한다. 추가로, WO2006/128381에서 사용된 배지는 또한 효모 추출물을 함유한다. 본 특허 명세서에서 기재한 것과 같이, 도달한 최대 생산성은 0.8 내지 1.1 g.l.h-1를 포함한다.
클로스트리디움 부틸리쿰으로부터 비타민 B12-비의존성 글리세롤-데히드라타아제 및 PDO-탈수소효소를 함유하도록 변형된, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5라 불리는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) 균주의 성능은 문헌[Gonzalez-Pajuelo et al., 2005]에 기재되어있다. 이 균주는 원래 순수한 글리세롤의 120 g.l-1 이하를 함유하는 유가 배지에서 성장하고 PDO를 생성한다. 추가로, 순수한 또는 공업용 글리세롤을 최대 60 g.l-1을 함유하는 유가 배지의 분석에서 어떤 차이도 확인되지 않았다. 클로스트리디움 부틸리쿰과 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5를 비교할 때, 문헌[Gonzalez-Pajuelo et al., 2006.]의 저자에 의해 전체적으로 비슷한 행동이 관찰되었다.
그러나, 유기 질소 없는 합성 유가 배지에서 공업용 글리세롤의 105 g.l- 1으로 시험된 동일한 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 균주는 동일한 농도의 순수한 글리세롤에서와 동일한 성능을 나타내지 못했다(실시예 1을 참조).
본 발명은 더 높은 PDO 역가 및 생산성에 도달할 수 있는, 높은 농도의 공업용 글리세린으로 1,3-프로판디올을 생성하기 위한 수단을 제공한다.
본 발명은 생성 미생물을 배양 배지에서 배양하는 단계, 상기 생성 미생물로 하여금 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하게 하는 단계, 및 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는, 1,3-프로판디올을 글리세린의 연속 발효 공정에서 생성하는 방법에 관한 것이며, 배양 배지가 높은 농도의 공업용 글리세린을 포함하고, 상기 공업용 글리세린은 글리세롤을 포함하며, 상기 생성 미생물은 미리 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 미생물인 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시양태에서, 글리세롤은 배양 배지 내에 90 내지 120 g/L을 포함하는 농도로, 바람직하게는 약 105 g/L의 농도로 존재한다.
배양 배지는 바람직하게는 합성 배지이고, 어떤 유기 질소원의 첨가도 없으며, 특히 효모 추출물이 없다.
공업용 글리세린은 특히 바이오디젤 생성으로부터의 부산물이다.
생성 미생물은 바람직하게는 박테리아이고, 더욱 바람직하게는 클로스트리디움 속의 구성원에서 선택되며, 특히 클로스트리디움 아세토부틸리쿰이다.
생성 미생물은 유리하게는 글리세롤로부터 1,3-프로판디올의 개선된 생성을 하도록 유전적으로 변형된 미생물이다.
바람직한 실시양태에서, 생성 미생물에서 글리세롤 데히드라타아제 활성은 조효소 B12 또는 그것의 전구체 중 하나의 존재에 비의존성이고 클로스트리디움 부틸리쿰(Clostridium butyricum)으로부터 유도된다.
바람직하게는, 생성 미생물은 미리 미생물을 높은 농도의 공업용 글리세린을 포함하는 낮은 희석률의 배양 배지에서 배양하고 조정된 미생물을 선별함으로써 높은 농도의 공업용 글리세린을 갖는 배양 배지에서 성장할 수 있도록 조정된 미생물이다.
결국, 1,3-프로판디올은 추가로 정제된다.
본 발명은 또한 미생물을 높은 농도의 공업용 글리세린을 포함하는 낮은 희석률의 배양 배지에서 배양하는 단계 및 높은 농도의 공업용 글리세린을 갖는 배양 배지에서 성장 가능하도록 조정된 미생물을 선별하는 단계를 포함하는, 미생물의 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장할 수 있도록 조정된 미생물로의 변형을 위한 방법에 관한 것이다.
미생물은 유리하게는 낮은 희석률에서 24시간 내지 10일의 범위의 기간, 바람직하게는 2일 초과, 더욱 바람직하게는 약 8일 동안 배양된다.
희석률은 일반적으로 0.005 내지 0.1 h-1, 바람직하게는 0.005 내지 0.02 h-1을 포함한다. 희석률은 조정 방법 동안 변할 수 있고, 결국 첫번째 단계에서는 0.005 내지 0.02 h-1이고 두번째 단계에서는 희석률은 0.1 h-1 이하, 바람직하게는 0.06 h-1 이하로 증가한다.
본 발명은 또한 조정된 미생물, 상기 및 하기에 기재된 방법으로 얻을 수 있는 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 생성 미생물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 수득될 수 있는 생물근원 1,3-프로판디올에 관한 것이다.
본 발명은 또한 -34‰보다 더 낮은 δ13C 및 21.9‰ 내지 0.5‰인 δ18O 중에서, 바람직하게는 -35‰보다 더 낮은 δ13C 및 21.9‰ 내지 0.5‰인 δ18O 중에서 선택된 13C 및 18O 동위원소 값의 조합, 더욱 바람직하게는 δ13C은 -35.05‰ 내지 -36.09‰이고 δ18O는 21.9‰ 내지 17.34‰인 것을 특징으로 하는, 생물근원 1,3-프로판디올에 관한 것이다.
바람직한 실시양태에서, 생물근원 1,3-프로판디올은 -2 내지 0, 바람직하게는 -1 내지 -0.2, 그리고 더욱 바람직하게는 -0.65 내지 -0.4를 포함하는 δ13C/δ18O 동위원소 비율 값을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 수득되는 생물근원 1,3-프로판디올의 용도, 또는 상기에서 규정한 것과 같이, 열가소성 폴리우레탄에서 사슬 연장제로서, 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트에서의 단위체로서, 또는 화장품 제제 내 성분으로서의 생물근원 1,3-프로판디올의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 더 높은 PDO 역가 및 생산성에 도달할 수 있는, 높은 농도의 공업용 글리세린으로 1,3-프로판디올을 생성하기 위한 수단을 제공한다.
도 1 : 국제 표준 : PDO1 : 기재된 공정에 따라 생성된 PDO의 ‰에서 PDO δ13C 및 δ18O ; PDO2 : 기질로서 포도당으로부터 생성된 PDO; PDO3 : 화학 공정으로 생성된 PDO.
도 2 : PDO : PDO1 : 기재된 공정에 따라 생성된 PDO의 δ18O/δ13C 비율; PDO2 : 기질로서 포도당으로부터 생성된 PDO; PDO3 : 화학 공정으로 생성된 PDO.
본 발명은 생성 미생물을 배양 배지에서 배양하는 단계, 상기 생성 미생물로 하여금 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하게 하는 단계, 및 1,3-프로판디올을 회수하는 단계를 포함하는, 1,3-프로판디올을 글리세린의 연속 발효 공정에서 생성하는 방법에 관한 것이며, 배양 배지가 높은 농도의 공업용 글리세린을 포함하고, 상기 공업용 글리세린은 글리세롤을 포함하며, 상기 생성 미생물은 미리 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 미생물인 것을 특징으로 한다.
용어 "미생물"은 박테리아, 효모 및 진균으로 이루어진 군 중에서 선택된 미생물을 의미한다. 우선적으로 미생물은 바람직하게는 장내 세균과(Enterobacteriaceae), 간균과(Bacillaceae), 클로스트리디움과(Clostridiaceae), 방선균과(Streptomycetaceae) 및 코리네박테리아과(Corynebacteriaceae)로 이루어진 군 중에서 선택된 박테리아이다. 더욱 우선적으로, 박테리아는 에스처리치아 속(Escherichia sp.)(바람직하게는 대장균(Escherichia coli)), 클렙시엘라(Klebsiella sp.)(바람직하게는, 클렙시엘라 폐렴균), 바실러스 속(Bacillus sp.)(바람직하게는 고초균(Bacillus subtilis)), 클로스트리디움 속(Clostridium sp.)(바람직하게는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 및 클로스트리디움 부틸리쿰) 및 코리네박테리아 속(바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로 이루어진 군 중에서 선택된다.
용어 "에스처리치아", "클렙시엘라", "바실러스", "클로스트리디움" 및 "클로스트리디아" 및 "코리네박테리움"은 그들 과 또는 속에 속하는 모든 종류의 박테리아를 지칭한다.
용어 "생성 미생물" 또는 "미생물의 생성 균주"는 미생물의 글리세롤 대사가 1,3-프로판디올의 생성으로 향하는 미생물 또는 미생물의 균주를 의미한다.
"조정된 미생물"은 높은 농도의 공업용 글리세린에서 성장할 수 있도록 변형된 미생물을 의미한다.
"적절한 배양 배지" 또는 "배양 배지"는 생성 균주의 성장 및 디올-생성에 최적화된 배양 배지를 지칭한다.
용어 "높은 글리세린 함량" 또는 "높은 농도의 글리세린"은 배양 배지 내 90 g/l 초과의 글리세롤을 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 배양 배지는 90 내지 120 g/L를 포함하는 농도로, 바람직하게는 약 105 g/L의 글리세롤을 포함한다.
"공업용 글리세린"은 실질적인 정제 없이 공업 공정으로부터 수득되는 글리세린 생성물을 의미한다. 공업용 글리세린은 또한 "미처리(raw) 글리세린", "미처리 글리세롤" 또는 "공업용 글리세롤"로 명명될 수 있다. 공업용 글리세린은 약 70% 초과, 바람직하게는 약 80% 초과의 글리세롤, 15% 미만의 물 및 불순물, 이를테면 광물 염 및 지방산을 함유한다. 광물 염의 농도는 10% 미만, 바람직하게는 5% 미만이다. 지방산의 농도는 20% 미만, 바람직하게는 5% 미만이다. 공업용 글리세린에서 가장 대표적인 지방산은 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀렌산, 리놀레산 및 아라키돈산이다.
공업용 글리세린이 수득되는 공업 공정은, 그중에서도, 지방 및 오일, 특히 식물 기원의 지방 및 오일이 공산품, 이를테면 세제 또는 윤활제로 가공되는 제조 방법이다. 그러한 제조 방법에서, 공업용 글리세린은 부산물로 간주된다.
특정 실시양태에서, 공업용 글리세린은 바이오디젤 생성으로부터의 부산물이고 바이오디젤 생성으로부터 수득되는 글리세린의 공지된 불순물을 포함하고, 염, 물 및 몇몇 다른 유기 화합물, 이를테면 지방산을 갖는 약 80 내지 85%의 글리세롤을 포함한다. 바이오디젤 생성으로부터 수득되는 공업용 글리세린은 추가 정제 단계를 받지 않는다.
용어 "합성 배지"는 생물이 성장하는 화학적으로 규정된 기질을 포함하는 배양 배지를 의미한다.
본 발명의 배양 배지에서, 글리세롤은 유리하게는 탄소의 단일 공급원(single source)이다. 바람직하게는, 이 배양 배지는 어떤 유기 질소원도 함유하지 않는다. 질소는 식물 및 동물 모두에서 성장 및 번식에 필수적인, 자연적으로 존재하는(naturally occurring) 원소이다. 이는 아미노산 및 많은 다른 유기 및 무기 화합물에서 발견된다. 본 발명에 따른 "유기 질소"는 살아있는 생물로부터 얻어진 유기 화합물을 포함하는 질소를 의미한다. 박테리아 배양을 위한 유기 질소의 일반적인 공급원은 효모 추출물을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 생성 미생물은 클로스트리디움 균주, 더욱 바람직하게는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 생성 미생물은 유전적으로 변형된 박테리아이다.
어구 "유전적으로 변형된 박테리아"는 균주가 그것의 유전적 특징을 변화시킬 목적으로 형질전환된 것을 의미한다. 내인성 유전자는 감쇠, 제거 또는 과-발현될 수 있다. 외인성 유전자는 세포 내에서 발현되기 위해 균주의 게놈에 도입, 플라스미드에 의한 운반, 또는 통합될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "플라스미드" 또는 "벡터"는 종종 세포의 중심 대사의 부분이 아닌 유전자를 운반시키고, 흔히 환상 이중-가닥 DNA 분자의 형태인 염색체 외 요소(extra chromosomal element)를 지칭한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 방법은 생성 미생물이 조효소 B12 또는 그것의 전구체 중 하나의 존재에 비의존성이고, 클로스트리디움 부틸리쿰으로부터 유도된 글리세롤 데히드라타아제 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
특히, 생성 미생물은 클로스트리디움 부틸리쿰으로부터 1,3-프로판디올 오페론(비타민 B12 비의존성 1,3-프로판디올 경로에 관여된 효소를 코딩함)의 추가 복사본을 도입함으로써(플라스미드에 의해 과다-발현되거나 또는 미생물의 염색체에 통합됨) 1,3-프로판디올의 생성의 증가한 흐름을 나타낸다. 예를 들어, pSPD5 플라스미드는 1,3-프로판디올의 과다-발현에 사용될 수 있다.
글리세롤 대사를 1,3-프로판디올의 생성으로 향하게 하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어 문헌[WO2006/128381, Gonzalez-Pajuelo & al. 2006]을 참조).
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 생성 미생물은 미리 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 미생물이다. 상기 생성 미생물의 "조정"은 미생물을 높은 농도의 공업용 글리세린을 포함하는 낮은 희석률의 배양 배지에 배양하는 단계, 및 높은 농도의 공업용 글리세린을 갖는 배양 배지에서 성장할 수 있도록 조정된 미생물을 선별하는 단계로 얻어진다.
본 발명은 또한 미생물을 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 미생물로의 변형을 위한 방법에 관한 것이다.
몇몇 "조정 공정"이 당업자에 의해 선택되어 생성 미생물을 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장 가능한 생성 미생물로 형질전환시킬 수 있다.
본 발명에 따라, 미생물을 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 미생물로의 변형은 미생물을 높은 농도의 공업용 글리세린을 포함하는 낮은 희석률의 배양 배지에서 배양하는 단계 및 높은 농도의 공업용 글리세린을 갖는 배양 배지에서 성장할 수 있도록 조정된 미생물을 선별하는 단계를 포함한다.
미생물은 유리하게는 낮은 희석률에서 24시간 내지 10일의 범위의 기간, 바람직하게는 2일 초과, 더욱 바람직하게는 약 8일 동안 배양된다.
희석률은 일반적으로 0.005 내지 0.1 h-1, 바람직하게는 0.005 내지 0.02 h-1을 포함한다. 희석률은 조정 방법 동안 변할 수 있고, 결국 첫번째 단계에서는 0.005 내지 0.02 h-1이고 두번째 단계에서는 희석률은 0.1 h-1 이하, 바람직하게는 0.06 h-1 이하로 증가한다. 희석률이 조정 방법 동안 변형될 경우, 0.02 내지 0.1 h-1의 희석률은 통상적인 희석률인 반면, 0.005 내지 0.02 h-1의 희석률은 "낮은 희석률"이라 불린다.
본 발명은 또한 상기 기재한 것과 같은 방법으로 얻기 쉽도록 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 미생물 관한 것이다.
본 발명의 방법으로 조정된 미생물은 바람직하게는 추가로 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 생성 미생물이다.
상기 조정된 미생물은 또한 먼저 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정되고 추가로 그것의 글리세롤 대사가 1,3-프로판디올의 생성으로 향하도록 조정된 미생물일 수 있다.
본 발명에 따른 "조정 미생물"은 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 생성 미생물이고 다음 두가지 필수적인 특징을 갖는다:
-그것의 글리세롤 대사가 1,3-프로판디올의 생성으로 향함, 및
-높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 자랄 수 있음.
본 발명의 특정 실시양태에서, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 DG1 pSPD5 균주는 바이오디젤 생성으로부터의 105 g.l-1의 미처리 글리세롤을 함유하는 유가 배지를 사용하는 연속 배양에서, 0.005 내지 0.02h-1를 포함하는, 바람직하게는 0.02h-1의 낮은 희석률로 배양된다. 최대 10일의 기간 동안, 바람직하게는 5 내지 8일 동안, 균주는 유가 배지에 존재하는 높은 글리세린 농도에 조정되고, 낮은 희석률은 0.1 h-1 이하, 바람직하게는 0.06 h-1 이하로 증가될 수 있다(실시예 2를 참조).
희석률의 점차적인 증가는 배치기(batch phase)의 끝 내지 10일에서, 우선적으로는 5일 후, 5 내지 8일, 약 7일에서 끝날 수 있고, 연속 배양의 개선된 생산성을 야기한다(실시예 3을 참조).
유리하게는, 조정기(adaptation phase) 후, 유가 배지 내 글리세롤 농도는 120 g.l-1 이하로 증가될 수 있다. 그러나, 균주를 공업용 글리세롤의 120 g.l-1에 조정하려고 직접 시도하는 것은 불가능하며, 심지어 105 g.l-1의 글리세롤 농도에 대한 0.02 h-1의 희석률에서도 마찬가지이고, 이는 균주가 선행 조정 없이는 유가 배지 내 높은 글리세린 농도의 존재 하에서는 자랄 수 없다는 것을 다시 입증한다.
본 발명의 방법은, 그것의 다른 실시양태에서(유전적으로 변형된 미생물의 사용 및/또는 추가 유기 질소원이 없는 배지의 사용) 0.4 내지 0.6 g.g-1의 수율로 1,3-프로판디올의 생성 및 0.05 내지 0.6 g.h-1을 포함하는 희석률에 대해 1.8 내지 3.5 g.l-1.h-1의 생산성을 야기한다. 바람직하게는 수율은 0.5 내지 0.56 g.g-1을 포함하고, 생산성은 2 내지 2.9 g.l-1.h-1을 포함한다.
본 발명의 특정 측면에서, 생성된 1,3-프로판디올은 추가로 정제된다.
연속 발효 공정은 당업자에게 공지되어있다.
발효 공정은 일반적으로 박테리가 이용하도록 조정된 공지의 규정된 조성물의 무기 배양 배지를 갖는 반응기에서 수행되며, 적어도 글리세린, 글리세롤을 함유하는 바이오디젤 생성으로부터의 부산물, 및 만약 필요하다면 대사물의 생성을 위한 보조-기질을 함유한다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 연속 공정으로 구현된다. 당업자는 어떻게 이들 실험 조건을 취급할지, 본 발명의 미생물을 위한 배양 조건을 규정할지를 안다. 특히 클로스트리디아는 20℃ 내지 60℃, 우선적으로 클로스트리디움 아세토부틸리쿰에서는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 발효한다.
발효 배지로부터 1,3-프로판디올을 회수하고 정제하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 1,3-프로판디올은 증류로 분리될 수 있다. 대부분의 실시양태에서, 1,3-프로판디올은 부산물, 이를테면 아세테이트를 갖는 발효 배지로부터 증류되고, 그 후 추가로 공지된 방법으로 정제된다.
본 발명은 또한 상기 기재된 방법에 따라 수득되는 생물근원 1,3-프로판디올에 관한 것이다.
본 발명은 또한 동위원소 비율을 특징으로 하는, 생물근원 1,3-프로판디올에 관한 것이다. 수소(D/H) 및 탄소(13C/12C)의 동위원소 비율의 분석은 특성 생성물, 이를테면 꿀[Grenier-Loustalot et al., 2006] 또는 와인[Guillou et al, 2001]에 대한 진본성 지표(authenticity indicator)를 제공한다. 13C/12C 동위원소 비율은 공급원 식별에 대한 표시를 제공하고 특성 생성물 및 사용된 원료의 생물합성 대사 경로를 반영한다. 캘빈-벤슨 광합성 회로를 사용하는 C3 식물과 해치-슬랙 광합성 회로를 사용하는 C4 식물 사이에서 실제 차이가 날 수 있다. 특허 출원 WO 01/11070은 화학적으로 생성된 1,3-프로판디올의 13C/12C 동위원소 비율은 -17.95 내지 -18.33을 포함하는데 반해, 포도당으로부터 생성된 생물근원 1,3-프로판디올의 13C/12C 동위원소 비율은 -10.9 내지 -15.4이고; 글리세롤로부터 생성된 생물근원 1,3-프로판디올의 13C/12C 동위원소 비율은 -22.41 및 -22.60임을 기술한다.
본 발명에 따라, 1,3-프로판디올 D/H 비율(δD로 표시), 13C/12C 비율(δ13C로 표시), 18O/16O 비율(δ18O로 표시)을 연소 후 질량 분석법으로 측정했다. 동위원소 13C/12C 비율은 국제 표준(PDB = 피 디 벨레마이트(Pee Dee Belemite))을 참조로 하여 밀(mill) 당 δ(‰)로 계산했다. 동위원소 18O/16O 비율은 국제 표준 평균 해수(SMOW)를 참조로 하여 밀 당 δ(‰)로 계산했다. 동위원소 D/H 비율은 국제 표준 평균 해수(SMOW)와 비교하여 ppm으로 계산했다.
비록 D/H 비율 및 13C/12C 비율은 주어진 생성물의 특성화(characterisation)에 대해 공지되었지만, 18O/16O 비율은 주로 고기후(paleoclimatic)의 지표로 물 분석에 대해 사용되었다.
1,3-프로판디올의 상이한 유형들간 비교는 δD가 구별적이지 않음을 나타낸다. 포도당으로부터 생물근원된 1,3-프로판디올에 대한 δD는 145 ppm이고, 화학적 1,3-프로판디올에 대해서는 150.19 ppm 내지 139.37 ppm인 반면, 글리세롤로부터 생물근원된 1,3-프로판디올(본 발명의 목적)에 대해서는 147.38 ppm 내지 145.84 ppm이다.
본 발명은 상기 기재된 방법에 따라 수득되기 쉬운 생물근원 1,3-프로판디올에 관한 것이고, -34‰보다 더 낮은, 바람직하게는 -35‰보다 더 낮은, 그리고 더욱 바람직하게는 -35.05‰ 내지 -36.09‰를 포함하는 δ13C 동위원소 값으로 특징된다.
본 발명은 또한 상기 기재된 방법에 따라 수득되기 쉬운 생물근원 1,3-프로판디올에 관한 것이고, 21.5‰ 내지 0.5‰, 바람직하게는 21.9‰ 내지 15‰, 그리고 더욱 바람직하게는 21.9‰ 내지 17.34‰를 포함하는 δ18O 동위원소 값을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 하기 특징 중 하나 또는 그것의 조합으로 특징되는 생물근원 1,3-프로판디올에 관한 것이다:
- -34‰보다 더 낮은 δ13C 및 21.9‰ 내지 0.5‰의 δ18O 중에서 선택된 13C 및 18O 동위원소 값,
- 바람직하게는 δ13C는 -35‰보다 더 낮고 δ18O는 21.9‰ 내지 0.5‰이고,
- 더욱 바람직하게는 δ13C는 -35.05‰ 내지 -36.09‰이고 δ18O는 21.9‰ 내지 17.34‰임(실시예 4를 참조).
본 발명의 한 실시양태에서, 생물근원 1,3-프로판디올은 -2 내지 0; 바람직하게는 -1 내지 -0.2, 그리고 더욱 바람직하게는 -0.65 내지 -0.4을 포함하는 18O/13C 동위원소 비율 값을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 동위원소 비율을 특징으로 하는 생물근원 1,3-프로판디올은 원료로서 글리세롤을 기초로 한 발효로 수득된다. 더욱 바람직하게는, 상기 동위원소 비율을 특징으로 하는 생물근원 1,3-프로판디올은 1,3-프로판디올의 생성을 위한 본 발명의 방법으로 수득된다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 수득되는 생물근원 1,3-프로판디올의 용도, 또는 상기에서 규정한 것과 같이, 열가소성 폴리우레탄에서 사슬 연장제로서, 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트에서의 단위체로서, 또는 화장품 제제 내 성분으로서의 생물근원 1,3-프로판디올의 용도에 관한 것이다. 생물근원 1,3-프로판디올은 공지된 화학적 1,3-프로판디올의 모든 분야에 사용될 수 있다. 당업자는 어떻게 1,3-프로판디올로부터 이들 최종 생성물을 수득할지 알고 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 생물근원 1,3-프로판디올을 사슬 연장제로서 사용하는 열가소성 폴리우레탄의 제조 방법에 관한 것이다. 이는 또한 본 발명에 따른 생물근원 1,3-프로판디올을 함유하는 화장품 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 이는 또한 본 발명에 따른 생물근원 1,3-프로판디올을 단위체로서 사용하는 폴리트리메틸렌 테레프탈레이트의 합성 방법에 관한 것이다.
실시예
실시예 1
클로스트리디움 배치 배양에 대해 사용한 합성 배지는 탈이온수의 리터 당: 글리세롤, 30 g; KH2PO4, 0.5; K2HPO4, 0.5 g; MgSO4, 7H2O, 0.2 g; CoCl2 6H2O, 0.01 g, H2SO4, 0.1 ml; NH4Cl, 1.5 g, 비오틴, 0.16 mg; p-아미노 벤조산, 32 mg 및 FeSO4, 7H2O, 0.028 g을 함유했다. 배지의 pH는 NH4OH 3N으로 6.3으로 조정했다. 배치 배양에 대해 시그마(Sigma)에서 구입한 시판 글리세롤(순도 99.5%)을 사용했다. 연속 배양을 위한 공급 배지(feed medium)는 수돗물 리터 당: 미처리 글리세롤, 105 g; KH2PO4, 0.5; K2HPO4, 0.5 g; MgSO4, 7H2O, 0.2 g; CoCl2 6H2O, 0.026 g; NH4Cl, 1.5 g, 비오틴, 0.16 mg; p-아미노 벤조산, 32 mg; FeSO4, 7H2O, 0.04 g, 거품 억제제, 0.05 ml; ZnSO4, 7H2O, 8 mg; CuCl2, 2H2O, 4 mg; MnSO4, H2O, 40 mg, H3BO3, 2 mg; Na2MoO4, 2H2O, 0.8 mg을 함유했다. 배지의 pH는 이 경우 조정하지 않았다. 바이오디젤 생성의 에스테르 교환반응 공정으로부터 생성된 미처리 글리세롤은 SAIPOL(Le Meriot, France)가 공급했고 83% 글리세롤(w/w)을 함유했다.
연속 배양을 1000 ml의 작업 용량(working volume)을 갖는 2L 생물반응기 트리톤(Tryton)(Pierre Guerin, France)에서 수행했다. 배양 부피는 배양 수준의 자동 조절로 일정하게 1000 ml로 유지했다. 배양은 200 RPM으로 35℃에서 교반했고 pH는 NH4OH 3N의 자동 첨가로 6.5로 유지했다. 실험 동안 mV로 표현한 배양 배지의 산화-환원력을 조절하고 기록했다. 혐기성 조건을 만들기 위해, 용기에서 멸균된 배지를 멸균 무-O2 질소로 한시간 동안 60℃에서 플러슁하였고 다시 35℃에 도달할 때까지 플러슁하였다. 생물반응기 가스 배출구를 피로가롤 장치(pyrogallol arrangement)[Vasconcelos et al., 1994]로 산소로부터 보호했다. 멸균 후 공급 배지 또한 멸균 무-O2 질소로 실온이 될 때까지 플러슁했고, 200 mbar의 질소 압력 하에 유지하여 O2의 진입을 피했다.
세포 농도를 탁도계로 620 nm에서 측정했고 바로 평가된 세포 건조 중량과 연관성이 있었다. 글리세롤, 1,3-프로판디올, 에탄올, 부탄올, 아세트산 및 부티르산 및 다른 미량 수준의 산 농도를 HPLC 분석으로 측정했다. 바이오라드 아미넥스(Biorad Aminex) HPX-87H 컬럼에서 분리를 행했고 굴절 지수로 검출을 얻었다. 작동 조건은 다음과 같았다: 이동상 황산 0.5 mM; 유속 0.5 ml/분, 온도, 25℃.
지수성장기의 끝에서 취한, 합성 배지(상기 기술된 배치 배양 배지와 동일하지만 2.2 g.l-1의 아세트산 및 23.03 g.l-1의 MOPS의 첨가가 있음)에서의 100 ml 플라스크 내 성장 배지를 접종물(inoculum)로 사용했다(5% v/v). 배양은 먼저 배치-방식(batch-wise)으로 성장했다. 지수성장기의 초기에서 시판 글리세롤의 펄스(pulse)를 추가했다: 펄스는 시판 글리세롤 120 g.l-1을 갖는 합성 배지(배치 배양에 대해 기술한 것과 동일함)의 50 ml.h-1의 유속에서 3시간 동안의 첨가(즉 18 g의 글리세롤의 첨가)로 규정된다. 그 후 성장을 배치-방식으로 지속시켰고 지수성장기가 끝나기 전에 연속 공급을 0.06 h-1 희석률 및 105 g.l-1의 미처리 글리세롤 함유하는 공급 배지로 시작했다.
Figure pat00001
Y1,3-PDO : PDO 수율(소모된 글리세롤의 g/g)
Q1,3PDO : PDO 부피 생산성
탄소 회수 계산에 대해서, 최종-생성물 농도로부터 이산화탄소 농도를 추정하였다.
실시예 2
사용된 합성 배지는 실시예 1에 기술한 것과 동일했다. 상기 기술한 것과 동일한 조건에서 전-배양, 접종 및 배치-방식 성장을 행했다.
연속 공급을 0.02 h-1 희석률 및 105 g.l-1의 미처리 글리세롤 함유하는 공급 배지로 시작했다. 이들 조건에서의 며칠 후(즉 적어도 3 부피 변화에 상응하는 생물반응기의 접종으로부터 8 내지 10일 후) 희석률은 하기 방식에 따라 0.02 h-1에서 0.05 h-1로 증가했다: ⅰ) 48시간 내에 0.01 h-1 단위의 증가 및 ⅱ) 24 내지 48 시간의 휴지 단계, 3번 반복함. 배양의 안정성은 이전에 기술한 HPLC 프로토콜을 사용하는 생성물 분석으로 뒤따랐다. 특히, 발명자들은 48시간 내 0.06 h-1로의 희석률의 최종 증가가 가능할 만큼 낮은 잔류 글리세롤을 기다렸다.
Figure pat00002
Y1,3-PDO : PDO 수율(소모된 글리세롤의 g/g)
Q1,3PDO : PDO 부피 생산성
탄소 회수 계산에 대해서, 최종-생성물 농도로부터 이산화탄소 농도를 추정하였다.
동일한 조건에서 행한 또 다른 배양도 동일한 결과를 야기했다.
실시예 3
사용된 합성 배지는 공급 배지가 120 g.l-1의 미처리 글리세롤을 함유한다는 것을 제외하고는, 실시예 1에 기술한 것과 동일했다. 상기 기술한 것과 동일한 조건에서 전-배양, 접종 및 배치-방식 성장을 행했다.
A) 연속 공급을 0.02 h-1 희석률 및 바로 120 g.l-1의 미처리 글리세롤 함유하는 공급 배지로 시작했다.
Figure pat00003
Y1,3-PDO : PDO 수율(소모된 글리세롤의 g/g)
Q1,3PDO : PDO 부피 생산성
탄소 회수 계산에 대해서, 최종-생성물 농도로부터 이산화탄소 농도를 추정하였다.
B) 연속 공급을 0.02 h-1 희석률 및 첫번째 105 g.l-1의 미처리 글리세롤 함유하는 공급 배지로 시작했다. 이들 조건에서의 며칠 후(적어도 3 부피 변화에 상응) 희석률은 이전에 기술한 방식에 따라 0.02 h-1에서 0.06 h-1로 증가했다. 그 후 공급을 0.05 h-1의 희석률 및 120g.l-1의 미처리 글리세롤을 함유하는 공급 배지로 전환했다.
Figure pat00004
Y1,3-PDO : PDO 수율(소모된 글리세롤의 g/g)
Q1,3PDO : PDO 부피 생산성
탄소 회수 계산에 대해서, 최종-생성물 농도로부터 이산화탄소 농도를 추정하였다.
실시예 4
δ13C 및 δ18O 값의 계산 방법
13C 및 18O의 수준은 관습상 상대 값으로 표현했다. 일반적으로 그들은 두 국제 기준(internationals reference)와 비교할 경우 백분율(δ)의 형태로 표현된다.
13C에 대해, 기준은 13C 값이 공지된 화석 탄산염인 "비엔나, PD 벨렘나이트(Vienna. PD belemnite)"이다.
δ의 계산 공식은 하기와 같다:
Figure pat00005
18O에 대해, 기준은 공지된 18O의 값을 갖는 "표준 평균 해수"(SMOW)이다. 공식은 18O 기준 값을 적용한 13C의 것과 동일하다.
사용한 물밀 및 샘플 제조
13C
PDO의 13C/12C 동위원소 비율을 실험적으로 측정된 이산화탄소 시료(specimen)를 기초로 계산했다. 이 목적으로 원소 분석기에서 샘플을 연소하고 동위원소 비율을 측정하기 위해 수득된 이산화탄소를 원소 분석기(CARLO ERBA NA 2100)와 연결된 질량 분석기(Finnigan MAT DELTA)에 주입했다. 이 방법에서 이산화탄소의 44, 45 및 46 질량을 분리하고 정량화했다. 13C/12C 동위원소 비율은 그 후 사전에 국제 표준 대해 검정한 작업 표준 중 하나(글루탐산)와 결과를 비교하여 천 규모 당 델타(delta per thousand scale)로 계산했다.
18O
18O/16O 동위원소 비율의 측정은 유기 화합물의 연속 흐름에서 이루어졌다. 이 목적을 위해 샘플을 미세분석기(microanalyzer) 오븐의 수준에서의 열분해로 연소하고 생성된 일산화탄소를 질량 분석기(원소 분석기(Fisons NA1500 2 시리즈)와 연결된 옵티마(OPTIMA), 또는 원소 분석기(Thermoelectron의 TC/EA)와 연결된 질량 분석기(Delta V)) 내로 보냈다. 다른 동위원소 28, 29, 30을 열분해로 생성된 일산화탄소에서 측정했다. 18O/16O 동위원소 비율을 그 후 SMOW와 결과를 비교하여 천 규모 당 델타로 계산했다.
결과
미처리 글리세롤로부터 생성된 PDO에 대해 발명자들은 평균 -35.57 ± 0.52‰의 δ13C 값을 수득했고, 포도당으로부터 생성된 PDO는 평균 -12.6‰의 δ13C 값을 가졌으며, 화학적으로 생성된 PDO는 평균 -30.05 ± 5.02‰의 δ13C을 가졌다.
미처리 글리세롤로부터 생성된 PDO는 평균 19.76 ± 2.42‰의 δ18O 값을 가졌고, 포도당으로부터 생성된 PDO는 평균 22.0‰의 δ18O 값을 가졌으며, 화학적으로 생성된 PDO는 평균 -0.80 ± 1.27‰의 δ18O 값을 가졌다.
그러므로, δ13C의 측정은 발효 공정으로 생성된 PDO를 다양한 원료로부터 구별하게 한다. 화학적으로 생성된 PDO의 δ13C는 높은 가변성(-30.05 ± 5.02)을 나타냈고 글리세롤로부터 생성된 PDO의 δ13C보다 단지 약간 더 높았다. 화학적으로 생성된 PDO의 δ18O는 매우 낮은 값(-0.8± 1.27)을 가졌고, 이는 화학적으로 생성된 PDO와 포도당 또는 글리세롤 기초의 생물학적 기원으로부터의 PDO를 구별할 수 있게 한다(도 1).
δ18O/δ13C 값은 명백하게, δ18O/δ13C 비율이 글리세롤 기초 PDO에 대해서는 -0.56, 포도당 기초 PDO에 대해서는 -1.75, 화학적으로 생성된 PDO에 대해서는 0.03인 다른 PDO(도 2)들을 동정할 수 있게 한다. 결론적으로, 글리세롤로부터 생성된 PDO는 δ13C 및 δ18O을 측정한 후 δ18O/δ13C을 측정하는 것을 통해 동정될 수 있다.
참고문헌
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Claims (12)

  1. 클로스트리디움(Clostridium) 속의 생성 미생물을 배양 배지에서 배양하는 단계;
    상기 생성 미생물로 하여금 글리세롤을 1,3-프로판디올로 전환하게 하는 단계; 및
    1,3-프로판디올을 회수하는 단계
    를 포함하고,
    상기 배양 배지는 90 내지 120 g/L로 포함된 높은 농도의 공업용 글리세린을 포함하고, 상기 공업용 글리세린은 글리세롤을 포함하며, 상기 배양 배지는 유기 질소원의 첨가가 없는 합성 배지이고, 상기 생성 미생물은 미리 상기 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 미생물인 것을 특징으로 하는,
    글리세린의 연속 발효 공정에서의 1,3-프로판디올의 생성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 배양 배지 내에서 글리세롤이 105 g/L의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 공업용 글리세린은 바이오디젤 생성으로부터의 부산물인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배양 배지는 효모 추출물의 첨가가 없는 합성 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생성 미생물이 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생성 미생물이 유전적으로 변형된 박테리아인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 생성 미생물에서 글리세롤 데히드라타아제 활성은 조효소 B12 또는 그것의 전구체 중 하나의 존재에 비의존성이고 클로스트리디움 부틸리쿰(Clostridium butyricum)으로부터 유도된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생성 미생물이 상기 높은 농도의 공업용 글리세린을 포함하는 0.005 내지 0.1 h-1의 희석률의 배양 배지에서 미생물을 배양하는 단계 및 상기 높은 농도의 공업용 글리세린을 갖는 상기 배양 배지에서 성장할 수 있도록 조정된 미생물을 선별하는 단계에 의해 생성 미생물로 조정된 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1,3-프로판디올이 추가로 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 90 내지 120 g/L로 포함된 높은 농도의 공업용 글리세린을 포함하는 0.005 내지 0.1 h-1의 희석률의 배양 배지에서 클로스트리디움 속의 미생물을 배양하는 단계이며, 여기서 상기 배양 배지는 유기 질소원의 첨가가 없는 합성 배지인 단계; 및
    상기 높은 농도의 공업용 글리세린을 갖는 상기 배양 배지에서 성장할 수 있도록 조정된 미생물을 선별하는 단계
    를 포함하는, 클로스트리디움 속의 미생물을 상기 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 미생물로 변형하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 미생물은 0.005 내지 0.1 h-1의 희석률에서 24시간 내지 10일의 범위의 기간 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 따른 방법으로 수득된, 90 내지 120 g/L로 포함된 높은 농도의 공업용 글리세린의 존재 하에 성장하도록 조정된 클로스트리디움 속의 미생물.
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