KR20200038305A - B7-h4 항체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

B7-h4 항체 및 그의 사용 방법 Download PDF

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마지드 고두시
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케이시 밀러
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Abstract

본 개시내용은, 인간 B7-H4 (및 임의로 시노몰구스 원숭이, 마우스, 및/또는 래트 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편 및 이러한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물을 제공한다. 구체적 양태에서, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 T 세포 증식을 증가시키고, 인터페론-감마 생성을 증가시키고, 및/또는 ADCC 활성을 통해 B7-H4 발현 세포를 고갈시킨다. 본 개시내용 또한, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 것에 의한, 암과 같은 장애의 치료 방법을 제공한다.

Description

B7-H4 항체 및 그의 사용 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 미국가출원 번호 62/550,173 (2017년 8월 25일 출원), 미국가출원 번호 62/579,774 (2017년 10월 31일 출원), 미국가출원 번호 62/607,810 (2017년 12월 19일 출원), 및 미국가출원 번호 62/656,789 (2018년 4월 12일 출원)의 이익을 청구하며, 이들은 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
EFS-웹을 통해 전자 제출된 서열 목록의 참조
전자 제출된 서열 목록의 내용 (파일명:3986.0090004_SL_ST25.txt; 크기:331,354 바이트; 생성일:2018년 8월 3일)은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
분야
본 개시내용은 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 항체, 이러한 항체를 포함하는 조성물, 및 B7-H4에 특이적으로 결합하는 항체의 생성 및 사용 방법에 관한 것이다.
관련 기술의 설명
B7-H4 (또한 B7x, B7-S1, 및 VTCN1로서 공지됨)는 다른 B7 패밀리 구성원과 상동성을 공유하는 면역 조절 분자이며, PD-L1을 포함한다. 이는 IgV 및 IgC 엑토도메인 둘 다를 포함하는 타입 I 막관통 단백질이다. 건강한 조직에서의 B7-H4 발현은 단백질 수준에서 비교적 제한되지만, B7-H4는 유방, 난소, 및 자궁내막의 부인과 암종과 같은 여러 고형 종양에서 발현된다. 종양에서 B7-H4의 발현은 나쁜 예후와 상관되는 경향이 있다. B7-H4에 대한 수용체는 알려지지 않지만, T 세포 상에서 발현되는 것으로 믿어진다. B7-H4는 T 세포 활성을 직접 억제하는 것으로 믿어진다.
B7-H4의 발현 및 기능을 고려할 때, B7-H4에 특이적으로 결합하는 항체 및 예를 들어 암의 치료에서와 같이 B7-H4 활성을 조절하기 위한 이들 항체의 용도가 본원에서 제공된다.
서열 번호:5-10, 각각; 서열 번호:15-20, 각각; 서열 번호:25-30, 각각; 서열 번호:35-40, 각각; 서열 번호:458-463, 각각; 서열 번호:45-50, 각각; 서열 번호:55-60, 각각; 서열 번호:65-70, 각각; 서열 번호:75-80, 각각; 서열 번호:85-90, 각각; 서열 번호:95-100, 각각; 서열 번호:105-110, 각각; 서열 번호:115-120, 각각; 서열 번호:125-130, 각각; 서열 번호:135-140, 각각; 서열 번호:145-150, 각각; 서열 번호:155-160, 각각; 서열 번호:165-170, 각각; 서열 번호:175-180, 각각; 서열 번호:185-190, 각각; 및 서열 번호:195-200, 각각으로 이루어진 구으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:11, 21, 31, 41, 464, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 또는 201의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 또는 202의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 중쇄 가변 영역은 서열 번호:11, 21, 31, 41, 464, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 또는 201의 아미노산 서열을 포함한다.
또한, 항체가 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열 번호:12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 또는 202의 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
또한, 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다: 서열 번호:11 및 12, 각각; 서열 번호:21 및 22, 각각; 서열 번호:31 및 32, 각각; 서열 번호:41 및 42, 각각; 서열 번호:464 및 42, 각각, 서열 번호:51 및 52, 각각; 서열 번호:61 및 62, 각각; 서열 번호:71 및 72, 각각; 서열 번호:81 및 82, 각각; 서열 번호:91 및 92, 각각; 서열 번호:101 및 102, 각각; 서열 번호:111 및 112, 각각; 서열 번호:121 및 122, 각각; 서열 번호:131 및 132, 각각; 서열 번호:141 및 142, 각각; 서열 번호:151 및 152, 각각; 서열 번호:161 및 162, 각각; 서열 번호:171 및 172, 각각; 서열 번호:181 및 182, 각각; 서열 번호:191 및 192, 각각; 또는 서열 번호:201 및 202, 각각.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 중쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 IgGκ 및 IgGλ 경쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하며, 여기서 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역이고, 경쇄 불변 영역은 인간 IgGκ 경쇄 불변 영역이다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:13, 23, 33, 43, 469, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 183, 193, 또는 203의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 또는 204의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함한다: 서열 번호:13 및 14, 각각; 서열 번호:23 및 24, 각각; 서열 번호:33 및 34, 각각; 서열 번호:43 및 44, 각각; 서열 번호:469 및 44, 각각; 서열 번호:53 및 54, 각각; 서열 번호:63 및 64, 각각; 서열 번호:73 및 74, 각각; 서열 번호:83 및 84, 각각; 서열 번호:93 및 94, 각각; 서열 번호:103 및 104, 각각; 서열 번호:113 및 114, 각각; 서열 번호:123 및 124, 각각; 서열 번호:133 및 134, 각각; 서열 번호:143 및 144, 각각; 서열 번호:153 및 154, 각각; 서열 번호:163 및 164, 각각; 서열 번호:173 및 174, 각각; 서열 번호:183 및 184, 각각; 서열 번호:193 및 194, 각각; 또는 서열 번호:203 및 204, 각각.
또한, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 15461, 20500, 20501, 20502, 20502.1, 22208, 15462, 22213, 15465, 20506, 15483, 20513, 22216, 15489, 20516, 15472, 15503, 15495, 15478, 15441, 및 20496으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 것인, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, CDR은 카바트(Kabat)-정의된 CDR, 코티아(Chothia)-정의된 CDR, 또는 AbM-정의된 CDR이다.
또한, 각각, 서열 번호:458-463의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:464의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 항체는 서열 번호:469의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄을 포함한다.
또한, 각각, 서열 번호:35-40의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 항체는 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또한, 각각, 서열 번호:65-70의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 여기서 항체는 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또한, 청구항 1-20 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 인간 B7-H4의 동일한 에피토프에 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 SPR에 의해 측정시 인간 B7-H4의 동일한 에피토프에 결합한다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 뮤린, 인간화된, 또는 키메라 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 T 세포 증식을 유도한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 T-세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 적어도 21%만큼 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 T-세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 약 5% 내지 약 35%만큼 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD4+ T 세포 증식을 유도한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD4+ T 세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 적어도 9%만큼 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD4+ T 세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 약 5% 내지 약 15%만큼 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD8+ T 세포 증식을 유도한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD8+ T 세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 적어도 11%만큼 증가시킨다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD8+ T 세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 약 5% 내지 약 15%만큼 증가시킨다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인터페론-감마 (IFNγ) 생성을 유도한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IFNγ의 생성을 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 및 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 약 2배 내지 약 10배, 또는 약 3배 내지 약 10배만큼 증가시킬 수 있다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 B7-H4-발현 세포에서 항체 의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 B7-H4 발현 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 약 20% 내지 약 50%, 또는 약 30% 내지 약 50%에서 특정 용균을 유도한다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 뮤린 CT26 결장직장 암종 모델, 뮤린 유방 암종 4T1 모델, 또는 흑색종 세포 라인 B16-moB7-H4/H3 모델에서 종양 성장을 억제한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 종양 성장을 대조군 항체로의 처리에 비해 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%만큼 감소시킨다.
하나의 구현예에서, T 세포 증식의 유도, CD4+ T 세포 증식의 유도, CD8+ T 세포 증식의 유도, IFNγ 생성의 유도, ADCC 활성, 및/또는 종양 성장의 억제는 용량-의존적이다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 시노몰구스 원숭이 B7-H4에 결합한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 래트 B7-H4에 결합한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 마우스 B7-H4에 결합한다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4, 원숭이 B7-H4, 래트 B7-H4 및 마우스 B7-H4에 결합한다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4의 IgV 도메인에 결합한다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아푸코실화된다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 전장 항체이다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 항원 결합 단편이다. 하나의 구현예에서, 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 Fv (scFv), 디술파이드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGΔCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc를 포함한다.
하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출가능한 라벨을 추가로 포함한다.
또한, 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, 핵산 분자는 서열 번호:11, 21, 31, 41, 464, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 또는 201의 VH 또는 서열 번호:13, 23, 33, 43, 469, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 183, 193, 또는 203의 중쇄를 코딩한다. 하나의 구현예에서, 핵산 분자는 서열 번호:213, 223, 233, 243, 470, 253, 263, 273, 283, 293, 303, 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373, 383, 393, 또는 403의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 핵산 분자는 (i) 서열 번호:213, 223, 233, 243, 470, 253, 263, 273, 283, 293, 303, 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373, 383, 393, 또는 403의 서열 및 (ii) 서열 번호:408의 서열을 포함한다.
또한, 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, 핵산 분자는 서열 번호:12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 또는 202의 VL 또는 서열 번호:14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 또는 204의 경쇄를 코딩한다. 하나의 구현예에서, 핵산 분자는 서열 번호:214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 또는 404의 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 핵산 분자는 (i) 서열 번호:214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 또는 404의 서열 및 (ii) 서열 번호:406의 서열을 포함한다.
또한, 본원에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.
또한, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 벡터가 본원에서 제공된다.
또한, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드, 본원에서 제공되는 벡터, 본원에서 제공되는 하나의 폴리뉴클레오티드 (예: 가변 중쇄 또는 중쇄 코딩 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 제1 벡터 및 본원에서 제공되는 또 다른 폴리뉴클레오티드 (예: 가변 경쇄 또는 경쇄 코딩 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 조직 배양에서의 대장균, 슈도모나스, 바실루스, 스트렙토미세스, 이스트, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 및 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포이다. 하나의 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 하나의 구현예에서, 숙주 세포 (예: 포유류 숙주 세포, 예컨대 CHO 세포)는 기능적 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 (FUT8) 유전자가 결핍된다.
또한, 본원에서 제공되는 숙주 세포를 배양하여 핵산 분자가 발현되고 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 생성되도록 하는 것을 포함하는, 인간 B7-H4에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생성 방법 (예: 시험관내 방법)이 본원에서 제공된다.
또한, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
또한, 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드, 본원에서 제공되는 벡터, 또는 본원에서 제공되는 숙주 세포; 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는 제약 조성물이 본원에서 제공된다.
또한, (i) 본원에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 아푸코실화된 것인 제약 조성물이 본원에서 제공된다.
또한, (i) 본원에서 제공되는 항체 또는 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 95%는 아푸코실화된 것인 제약 조성물이 본원에서 제공된다.
또한, (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 각각, 서열 번호:458-463의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% , 또는 적어도 99%는 아푸코실화된 것인 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:464의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나, 또는 (ii) 항체는 서열 번호:469의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또한, 하기를 포함하는 제약 조성물이 본원에서 제공된다: (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 하기 서열 번호의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편: 458-463, 각각 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 95%는 아푸코실화된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호 464의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 항체는 서열 번호 469의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또한, (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 각각, 서열 번호:35-40의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% , 또는 적어도 99%는 아푸코실화된 것인 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나, 또는 (ii) 항체는 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또한, (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 각각, 서열 번호:35-40의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 95%가 아푸코실화된 것인 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나, 또는 (ii) 항체는 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또한, (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 각각, 서열 번호:65-70의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 아푸코실화된 것인 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 여기서 항체는 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또한, (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 각각, 서열 번호:65-70의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 95%가 아푸코실화된 것인 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 여기서 항체는 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
하나의 구현예에서, 푸코실화는 조성물에서 검출불가능하다.
또한, T 세포를 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드, 본원에서 제공되는 벡터, 본원에서 제공되는 숙주 세포, 또는 본원에서 제공되는 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, T 세포 증식의 유도 방법이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, T 세포 증식은 (예를 들어 대조군 항체로의 처리에 비해) 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소된다.
또한, CD4+ T 세포를 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드, 본원에서 제공되는 벡터, 본원에서 제공되는 숙주 세포, 또는 본원에서 제공되는 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, CD4+ T 세포 증식의 유도 방법이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, CD4+ T 세포 증식은 (예를 들어 대조군 항체로의 처리에 비해) 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소된다.
또한, CD8+ T 세포를 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드, 본원에서 제공되는 벡터, 본원에서 제공되는 숙주 세포, 또는 본원에서 제공되는 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, CD8+ T 세포 증식의 유도 방법이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, CD8+ T 세포 증식은 (예를 들어 대조군 항체로의 처리에 비해) 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소된다.
또한, T 세포를 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드, 본원에서 제공되는 벡터, 본원에서 제공되는 숙주 세포, 또는 본원에서 제공되는 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 인터페론 감마 생성의 유도 방법이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, 인터페론 감마 생성은 (예를 들어 대조군 항체로의 처리에 비해) 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소된다.
또한, 세포를 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드, 본원에서 제공되는 벡터, 본원에서 제공되는 숙주 세포, 또는 본원에서 제공되는 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, B7-H4를 발현하는 세포의 사멸 방법이 본원에서 제공된다.
또한, 세포의 집단을 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드, 본원에서 제공되는 벡터, 본원에서 제공되는 숙주 세포, 또는 본원에서 제공되는 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포의 집단으로부터의 B7-H4-발현 세포의 고갈 방법이 본원에서 제공된다.
하나의 구현예에서, 사멸 또는 고갈은 ADCC를 통해 일어난다.
하나의 구현예에서, 접촉은 시험관내 접촉이다. 하나의 구현예에서, 접촉은 대상체에서의 접촉이다.
또한, 대상체에게 유효량의 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드, 본원에서 제공되는 벡터, 본원에서 제공되는 숙주 세포, 또는 본원에서 제공되는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 암 치료 방법이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, 암은 유방암, 예컨대 삼중 음성 유방암 또는 침윤성 유관 암종, 자궁내막 암종, 난소암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 유방암은 삼중 음성 유방암이거나 또는 여기서 비-소세포 폐암은 편평 세포 암종이다. 하나의 구현예에서, 비-소세포 폐암은 선암종이다. 하나의 구현예에서, 암은 두경부암, 소세포 폐암, 위암, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 난소암은 장액 선암종이다. 하나의 구현예에서, 유방암은 유관 선암종이다.
하나의 구현예에서, 암은 PD-1 억제제 부적절 응답자 및/또는 PD-L1 억제제 부적절 응답자이다. 하나의 구현예에서, 암은 낮은 수준의 PD-L1을 발현한다.
하나의 구현예에서, 대상체는 인간이다.
또한, 샘플을 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 샘플에서의 B7-H4의 검출 방법이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, 샘플은 인간 대상체에서 암으로부터 얻어진다.
또한, 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드, 본원에서 제공되는 벡터, 본원에서 제공되는 숙주 세포, 또는 본원에서 제공되는 제약 조성물 및 a) 검출 시약, b) B7-H4 항원, c) 인간 투여를 위한 사용 또는 판매의 승인을 반영하는 고지, 또는 d) 이들의 조합을 포함하는 키트가 본원에서 제공된다.
또한, B7-H4의 T 세포 체크포인트 차단 활성을 억제하는 단리된 항체 또는 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, T 세포 체크포인트 차단 활성은 대조군 세포에 대한 IL-2 생성 증가에 의해 측정된다.
또한, (i) 항체 또는 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 B7-H4의 T 세포 체크포인트 차단 활성을 억제하는 것인, 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 일 구현예에서, T 세포 체크포인트 차단 활성은 대조군 세포에 대한 IL-2 생성 증가에 의해 측정된다.
도 1a는 다양한 종양 조직에서의 B7-H4 발현을 나타낸다. (실시예 1 참조.)
도 1b는 IHC에 의한 다양한 종양 유형에서의 B7-H4 우세를 나타낸다. (실시예 1 참조.)
도 2a는 인간, 시노몰구스 원숭이, 또는 마우스 발현 HEK293T 세포에 대한 B7-H4 항체의 결합을 나타낸다. (실시예 6 참조.)
도 2b는 마우스, 시노몰구스 원숭이, 또는 래트 발현 SK-BR-3 세포 및 HEK293T 세포에 대한 B7-H4 항체의 결합을 나타낸다. (실시예 6 참조.)
도 3a는 CD4+, CD8+ 또는 총 T 세포 증식에 대한 B7-H4 항체의 효과를 나타낸다. (실시예 7 참조.)
도 3b는 인터페론-감마 (IFNγ) 생성에 대한 B7-H4 항체의 효과를 나타낸다. (실시예 7 참조.)
도 3c는 CD4+, CD8+ 또는 총 T 세포 증식 및 인터페론-감마 (IFNγ) 생성에 대한 B7-H4 항체의 효과를 나타낸다. (실시예 7 참조.)
도 3d는 인터페론-감마 (IFNγ) 생성에 대한 다양한 농도의 B7-H4 항체의 효과를 나타낸다. (실시예 7 참조.)
도 4a-4d는 SK-BR-3 세포 상의 B7-H4에 대한 (도 4a) 마우스 (도 4b), 시노몰구스 원숭이 (도 4c), 또는 래트 B7-H4 (도 4d) 발현 HEK293T 세포에 대한 푸코실화된 및 아푸코실화된 항체의 결합을 나타낸다. (실시예 9 참조.)
도 5a 및 5b는 인간 Fcγ 수용체 IIIa (FcγRIIIa) V158 대립유전자에 대한 아푸코실화된 및 푸코실화된 B7-H4 항체 (각각)의 결합을 나타낸다. (실시예 10 참조.)
도 6a는 푸코실화된 및 아푸코실화된 B7-H4 항체의 T 세포 체크포인트 차단 활성을 나타낸다. (실시예 11 참조.)
도 6b는 IL-2 생성에 의해 측정시 이소타입 대조군 처리된 세포에 비해 아푸코실화된 B7-H4 항체의 T 세포 체크포인트 리간드 활성을 나타낸다. (실시예 11 참조.)
도 7은 B7-H4 발현 세포 라인에 대한 푸코실화된 및 아푸코실화된 B7-H4 항체의 ADCC 활성을 나타낸다. (실시예 12 참조.)
도 8은 다양한 B7-H4 발현 수준을 갖는 세포에 대한 푸코실화된 및 아푸코실화된 B7-H4 항체의 ADCC 활성을 나타낸다. (실시예 13 참조.)
도 9a는 B7-H4 항체 20502의 생체내 항-종양 효능을 나타낸다. (실시예 14 참조.)
도 9b는 B7-H4 항체 22213의 생체내 항-종양 효능을 나타낸다. (실시예 14 참조.)
도 10은 4T1 (유방 암종) 및 B16 (흑색종) 세포가 이식된 마우스에서의 B7-H4 항체 20502의 뮤린 버전의 생체내 항-종양 효능을 나타낸다. (실시예 14 참조.)
도 11은 MX-1 인간 유방암 이종이식 모델에서의 아푸코실화된 20502의 생체내 항-종양 효능을 나타낸다. 이미지는 MX-1 이종이식 종양에서의 인간 B7-H4 발현 (좌측) 및 4T1 종양에서의 뮤린 B7-H4 발현 (우측)을 나타낸다. (실시예 14 참조.)
도 12a-12c는 항-PD-1 항체와 동일한 날에 투여된 20502-msIgG2a-F 의 생체내 항-종양 효능을 나타낸다. (실시예 15 참조.)*는 p < 0.05를 나타내고; ****는 p < 0.0001을 나타낸다.
도 13은, 아푸코실화된 20502로의 처리 (저부 패널)가 대조군 항체로의 처리 (상단 패널)에 비해 NK 세포 침윤 (좌측 패널), T-세포 침윤 (중앙 패널), 및 PD-L1 상향조절 (우측 패널)을 제공함을 보여준다. (실시예 16 참조.)
도 14a는, 20502-msIgG2a-F 항체가 용량 의존적 방식으로 4T1 유방 암종 세포에서 종양 성장을 현저히 감소시킴을 보여준다. (실시예 17 참조.)
도 14b는, 제30일에 1원 ANOVA에 의해 평가시 20502-msIgG2a-F 항체가 30 mg/kg (p = 0.0003), 20 mg/kg (p = 0.0103), 10 mg/kg (p = 0.0419), 3 mg/kg (p = 0.0277), 및 1 mg/kg (p = 0.0333)에서 종양 성장을 현저히 억제함을 보여준다. (실시예 17 참조.)
도 15a는, 20502-msIgG2a-F 항체가 B7-H4/H3을 발현하는 B16의 성장을 현저히 억제함을 보여준다. (실시예 17 참조.)
도 15b는, 제23일에 1원 ANOVA에 의해 평가시 20502-msIgG2a-F 항체가 30 mg/kg (p = 0.0085), 20 mg/kg (p = 0.0041), 10 mg/kg (p = 0.0017), 및 3 mg/kg (p = 0.0420)에서 종양 성장을 현저히 억제함을 보여준다. (실시예 17 참조.)
B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 항체 (예: 모노클로날 항체) 및 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 항-B7-H4 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어, T 세포 체크포인트 차단 활성 (예를 들어 인터페론-감마 (IFNγ), CD4 T-세포 증식, CD8 T-세포 증식, 및/또는 총 T-세포 증식의 증가에 의해 측정됨)을 제공하고/거나 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC 활성)을 갖는다.
또한, 이러한 항체 및 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산 (폴리뉴클레오티드), 예컨대 상보성 DNA (cDNA)가 제공된다. 추가로, 이러한 항체 및 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산 (폴리뉴클레오티드)을 포함하는 벡터 (예: 발현 벡터) 및 세포 (예: 숙주 세포)가 제공된다. 또한, 이러한 항체 및 그의 항원-결합 단편의 생성 방법이 제공된다. 다른 양태에서는, 특정 병태, 예컨대 암의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 관련 조성물 (예: 제약 조성물), 키트, 및 검출 방법이 도한 제공된다.
1.1 용어
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "B7-H4"는, 네이티브(native) B7-H4 폴리펩티드 및 B7-H4 폴리펩티드의 이소형을 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유류 B7-H4 폴리펩티드를 지칭한다. "B7-H4"는 세포 내에서의 프로세싱으로부터 유래되는 B7-H4 폴리펩티드의 형태 뿐만 아니라 전장 비-프로세싱된 B7-H4 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 B7-H4"는 서열 번호:1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. "B7-H4 폴리뉴클레오티드", "B7-H4 뉴클레오티드", 또는 "B7-H4 핵산"은 B7-H4를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "PD-1"은 본원에서 사용되는 바와 같이, 네이티브 PD-1 폴리펩티드 및 PD-1 폴리펩티드의 이소형을 포함하나 이에 제한되지는 않는 포유류 PD-1 폴리펩티드를 지칭한다. PD-1은 또한 프로그래밍된 사멸 단백질 1 또는 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1로서 언급된다. "PD-1"은 세포에서의 프로세싱으로부터 유래되는 PD-1 폴리펩티드의 형태 뿐만 아니라 전장 비-프로세싱된 PD-1 폴리펩티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 PD-1"은 하기 서열 번호:439의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다:
PGWFLDSPDR PWNPPTFSPA LLVVTEGDNA TFTCSFSNTS ESFVLNWYRM SPSNQTDKLA AFPEDRSQPG QDCRFRVTQL PNGRDFHMSV VRARRNDSGT YLCGAISLAP KAQIKESLRA ELRVTERRAE VPTAHPSPSP RPAGQFQTLV VGVVGGLLGS LVLLVWVLAV ICSRAARGTI GARRTGQPLK EDPSAVPVFS VDYGELDFQW REKTPEPPVP CVPEQTEYAT IVFPSGMGTS SPARRGSADG PRSAQPLRPE DGHCSWPL (서열 번호:439) (신호 서열을 갖지 않는 성숙 인간 PD-1). "PD-1 폴리뉴클레오티드", "PD-1 뉴클레오티드" 또는 "PD-1 핵산"은 PD-1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
용어 "항체"는, 면역글로불린 분자의 가변 영역 내의 적어도 하나의 항원 인식 자리를 통해 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 또는 이들의 조합을 인식하고 그에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는, 항체가 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한, 온전(intact) 폴리클로날 항체, 온전 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화된 항체, 인간 항체, 항체를 포함하는 융합 단백질, 및 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 항체는 면역글로불린의 임의의 하기 부류의 것일 수 있으며: 5개 주요 부류:IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 또는 이들의 하위부류 (이소타입) (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 이는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마, 및 뮤로서 언급되는 이들의 중쇄 불변 도메인의 동일성에 기초한 것이다. 상이한 부류의 면역글로불린은 상이한 널리 공지된 서브유닛 구조 및 3차원 배열을 갖는다. 항체는 독소, 방사성동위원소 등과 같은 다른 분자에 컨쥬게이션되거나 네이키드(naked) 항체일 수 있다.
용어 "항체 단편"은 온전 항체의 일부를 지칭한다. "항원-결합 단편", "항원-결합 도메인", 또는 "항원-결합 영역"은, 항원에 결합하는 온전항체의 일부를 지칭한다. 항원-결합 단편은 온전 항체의 항원 결정 영역 (예: 상보성 결정 영역 (CDR))을 함유할 수 있다. 항체의 항원-결합 단편의 예는, Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, 및 단일쇄 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 항체의 항원-결합 단편은 임의의 동물 종, 예컨대 설치류 (예: 마우스, 래트, 또는 햄스터) 및 인간으로부터 유래될 수 있거나 인공 제조될 수 있다.
용어 "항-B7-H4 항체", "B7-H4 항체" 및 "B7-H4에 결합하는 항체"는, 항체가 B7-H4 표적화에 있어 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 B7-H4에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 비-관련, 비-B7-H4 단백질에 대한 항-B7-H4 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사면역검정 (RIA)에 의해 측정시 B7-H4에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만일 수 있다.
용어 "항-PD-1 항체", "PD-1 항체" 및 "PD-1에 결합하는 항체"는, 항체가 PD-1 표적화에 있어 진단 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화성으로 PD-1에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 비-관련, 비-PD-1 단백질에 대한 항-PD-1 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사면역검정 (RIA)에 의해 측정시 PD-1에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만일 수 있다.
"모노클로날" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단일 항원 결정자, 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관여하는 동종 항체 또는 항원-결합 단편 집단을 지칭한다. 이는, 전형적으로 상이한 항원 결정자에 대하여 지향되는 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체와 대조적인 것이다. 용어 "모노클로날" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 온전 및 전장 모노클로날 항체 뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일쇄 (scFv) 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 자리를 포함하는 임의의 다른 변형된 면역글로불린 분자를 포함한다. 또한, "모노클로날" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 하이브리도마, 파지 선택, 재조합 발현, 및 트랜스제닉 동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의 수의 포유류에서 만들어지는 이러한 항체 및 그의 항원-결합 단편을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 상호교환가능하게 사용되며, 당업계에서 통상적이다. 가변 영역은 전형적으로 항체의 일부, 일반적으로, 경쇄 또는 중쇄의 일부 (전형적으로는 성숙 중쇄에서는 대략 아미노-말단 110 내지 120개 아미노산 또는 110 내지 125개 아미노산 및 성숙 경쇄에서는 약 90 내지 115개 아미노산임)를 지칭하며, 이는 항체마다 서열이 광범위하게 상이하고 그의 특정 항원에 대한 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다. 서열 가변성은 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 영역에 집중되며, 가변 도메인에서 보다 고도로 보존적인 영역은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 임의의 특정 메커니즘 또는 이론에 의해 국한되길 바라지는 않지만, 경쇄 및 중쇄의 CDR이 항체와 항원의 상호작용 및 특이성에 있어 주로 원인이 되는 것으로 여겨진다. 특정 구현예에서, 가변 영역은 인간 가변 영역이다. 특정 구현예에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR 및 인간 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다. 특별한 구현예에서, 가변 영역은 영장류 (예: 비-인간 영장류) 가변 영역이다. 특정 구현예에서, 가변 영역은 설치류 또는 뮤린 CDR 및 영장류 (예: 비-인간 영장류) 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다.
용어 "VL" 및 "VL 도메인"은 상호교환가능하게 항체의 경쇄 가변 영역을 지칭한다.
용어 "VH" 및 "VH 도메인"은 상호교환가능하게 항체의 중쇄 가변 영역을 지칭한다.
용어 "카바트 넘버링" 등은 당업계에서 인식되는 것이며, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 잔기를 넘버링하는 시스템을 지칭한다. 특정 양태에서, CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다 (예를 들어 하기 참조: Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190:382-391 및 Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S.Department of Health 및 Human Services, NIH Publication No. 91-3242). 카바트 넘버링 시스템 사용시, 항체 중쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로, 임의로 35 이후에 1 또는 2개의 추가의 아미노산 (카바트 넘버링 체계에서 35A 및 35B로서 언급됨)을 포함할 수 있는 아미노산 위치 31 내지 35 (CDR1), 아미노산 위치 50 내지 65 (CDR2), 및 아미노산 위치 95 내지 102 (CDR3)에 존재한다. 카바트 넘버링 시스템 사용시, 항체 경쇄 분자 내의 CDR은 전형적으로 아미노산 위치 24 내지 34 (CDR1), 아미노산 위치 50 내지 56 (CDR2), 및 아미노산 위치 89 내지 97 (CDR3)에 존재한다. 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 CDR은 카바트 넘버링 체계에 따라 결정된 것이다.
대신에 코티아는 구조적 루프의 위치를 나타낸다 (Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). 코티아 CDR-H1 루프의 말단은, 카바트 넘버링 규약을 사용하여 넘버링시, 루프의 길이에 따라 H32 내지 H34에서 다양하다 (이는 카바트 넘버링 체계가 H35A 및 H35B에서 삽입을 배치하기 때문임; 35A 및 35B 둘 다 존재하지 않는 경우, 루프는 32에서 종료됨; 35A만 존재하는 경우, 루프는 33에서 종료됨; 35A 및 35B 둘 다 존재하는 경우, 루프는 34에서 종료됨). AbM 초가변 영역은 카바트 CDR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충을 나타내며, Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다.
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본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불변 영역" 또는 "불변 도메인"은 상호교환가능하며 당업계에서 통상적인 그의 의미를 갖는다. 불변 영역은, 항원에 대한 항체의 결합에 직접 관여하지 않지만 Fc 수용체와의 상호작용과 같은 다양한 이펙터(effector) 기능을 나타낼 수 있는 항체 부분, 예를 들어 경쇄 및/또는 중쇄의 카르복실 말단 부분이다. 면역글로불린 분자의 불변 영역은 일반적으로 면역글로불린 가변 도메인에 비해 보다 보존적인 아미노산 서열을 갖는다. 특정 양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 위해 충분한 불변 영역 또는 그의 일부를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "중쇄"는, 항체와 관련하여 사용시, 임의의 별개의 유형, 예를 들어, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ), 및 뮤 (μ)를 지칭할 수 있으며, 이는 각각 항체의 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 부류 (IgG의 하위부류, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4 포함)를 형성한다. 중쇄 아미노산 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 구체적 구현예에서, 중쇄는 인간 중쇄이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "경쇄"는, 항체와 관련하여 사용시, 임의의 별개의 유형, 예를 들어, 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파 (κ) 또는 람다 (λ)를 지칭할 수 있다. 경쇄 아미노산 서열은 당업계에 널리 공지되어 있다. 구체적 구현예에서, 경쇄는 인간 경쇄이다.
용어 "키메라" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 아미노산 서열이 둘 이상의 종으로부터 유래되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은, 요망되는 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 포유류 (예: 마우스, 래트, 토끼 등)의 하나의 종으로부터 유래된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 가변 영역에 상응하며, 불변 영역은 그 종에서 면역 반응을 유발하지 않기 위한 또 다른 종 (통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 서열에 대해 상동성이다. .
용어 "인간화된" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 최소의 비-인간 (예: 뮤린) 서열을 함유하는 특이적 면역글로불린 사슬, 키메라 면역글로불린, 또는 그의 단편인 비-인간 (예: 뮤린) 항체 또는 항원-결합 단편의 형태를 지칭한다. 전형적으로, 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 요망되는 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 비-인간 종 (예: 마우스, 래트, 토끼, 햄스터)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 ("CDR 그래프팅된") 인간 면역글로불린이다 (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 요망되는 특이성, 친화성, 및 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 또는 단편에서의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 특이성, 친화성, 및/또는 능력을 개선 및 최적화하도록 Fv 프레임워크 영역 내의 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내의 추가의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 비-인간 면역글로불린에 상응하는 CDR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부를 함유하는 적어도 하나, 또한 전형적으로는 2 또는 3개의 가변 도메인을 포함할 것이지만, FR 영역의 전부 또는 실질적으로 전부는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것들이다. 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한, 전형적으로 인간 면역글루불린의 것인, 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 인간화된 항체 생성에 사용되는 방법의 예는 하기에 기재되어 있다: 미국특허 5,225,539; [Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994)], 및 [Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996)]. 일부 구현예에서, "인간화된 항체"는 재표면화된 항체이다.
용어 "인간" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 인간 면역글로불린 유전자 장소로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 의미하며, 여기서 이러한 항체 또는 항원-결합 단편은 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조된다. 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 이러한 정의는 온전 또는 전장 항체 및 그의 단편을 포함한다.
"아푸코실화된" 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 "푸코스 결핍" 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 그의 불변 영역 글리코실화에서 푸코스가 결핍된 IgGl 또는 IgG3 이소타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 지칭한다. 인간 IgGl 또는 IgG3의 글리코실화는 최대 2개의 Gal 잔기로 종결된 코어 푸코실화된 바이안테너리(biantennary) 복합 올리고당 글리코실화로서 Asn297에서 일어난다. 일부 구현예에서, 아푸코실화된 항체는 Asn297에서 푸코스가 결핍되어 있다. 이들 구조는, 말단 Gal 잔기의 양에 따라, G0, Gl (1,6 또는 1,3), 또는 G2 글리칸 잔기로서 지정된다. 예를 들어 하기 참조: Raju, T.S., BioProcess Int. 1:44-53 (2003). 항체 Fc의 CHO형 글리코실화는, 예를 들어, 하기에 기재되어 있다: Routier, F.FL, Glycoconjugate J. 14:201-207 (1997).
푸코스의 측정 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 포함한다. 본원에서의 목적상, 푸코스는, 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 WO2015/017600의 실시예 1에 기재된 방법에 의해 검출된다. 간단히, 항체로부터 글리칸을 방출시키고 (예를 들어 효소적 방출에 의해), 글리칸을 안트라닐산 (2-AA)으로 라벨링하고, 이어서 라벨링된 글리칸을 정제함으로써 글리칸 분석을 수행한다. 형광 검출과 함께 정상 상 HPLC를 사용하여 글리칸을 분리하고, 항체 내의 각각의 글리칸의 상대적 양을 측정한다. 글리칸은 질량 분광측정법에 의해 푸코스가 결핍된 또는 푸코스를 포함하는 것으로 포지티브 동정될 수 있다. 일부 구현예에서, 푸코스는 복수의 아푸코실화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물에서 검출불가능하다. 일부 구현예에서, 아푸코실화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 향상된 ADCC 활성을 갖고, 이는 본원 실시예 12에 제공된 검정에 의해 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 아푸코실화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fc 감마 RIIIA에 대한 향상된 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 아푸코실화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fc 감마 RIIIA(V158)에 대한 향상된 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 아푸코실화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fc 감마 RIIIA(F158)에 대한 향상된 친화성을 갖는다. Fc 감마 RIIIA 또는 그의 대립유전자에 대한 친화성은 본원 실시예 10에 제공된 검정에 의해 측정될 수 있다.
"결합 친화성"은 일반적으로, 분자 (예: 항체 또는 그의 항원-결합 단편)의 단일 결합 자리와 그의 결합 파트너 (예: 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합계 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예: 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 그의 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 상수 (KD)에 의해 나타낼 수 있다. 친화성은, 평형 해리 상수 (KD), 및 평형 회합 상수 (KA)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 당업계에 공지된 다수의 방식으로 측정 및/또는 표시될 수 있다. KD는 koff/kon의 몫으로부터 계산되며, KA는 kon/koff의 몫으로부터 계산된다. kon은, 예를 들어, 항원에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 회합 속도 상수를 지칭하고, koff는, 예를 들어, 항원으로부터의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 해리를 지칭한다. kon 및 koff는 당업자에게 공지된 기술, 예컨대 BIAcore® 또는 KinExA에 의해 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 당업계의 용어이며, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 국소화된 영역을 지칭한다. 에피토프는, 예를 들어, 폴리펩티드의 인접 아미노산 (선형 또는 인접 에피토프)일 수 있거나, 또는 에피토프는, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들의 둘 이상의 비-인접 영역으로부터 함께 형성될 수 있다 (형태, 비-선형, 불연속, 또는 비-인접 에피토프). 특정 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 결합하는 에피토프는, 예를 들어, NMR 분광법, X-선 회절 결정학 연구, ELISA 검정, 질량 분광측정법 (예: 액체 크로마토그래피 전기분무 질량 분광측정법)과 커플링된 수소/중수소 교환, 어레이-기초 올리고-펩티드 스캐닝 검정, 및/또는 돌연변이생성 맵핑 (예: 자리-지향 돌연변이생성 맵핑)에 의해 측정될 수 있다. X선 결정학에서, 결정화는 당업계에 공지된 방법 중 임의의 것을 사용하여 달성될 수 있다 (예: Gieg
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R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4):339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189:1-23; Chayen NE (1997) Structure 5:1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251:6300-6303). 항체/그의 항원-결합 단편:항원 결정은 널리 공지된 X-선 회절 기술을 사용하여 연구될 수 있고, 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 X-PLOR을 사용하여 정제될 수 있다 (Yale University (1992), Molecular Simulations, Inc.에 의해 배포됨; 예를 들어 하기 참조:Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,;미국 2004/0014194), 및 BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1):37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A:361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10):1316-1323). 돌연변이생성 맵핑 연구는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어 하기 참조: Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270:1388-1394 및 Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244:1081-1085 (알라닌 스캐닝 돌연변이생성 기술을 포함한 돌연변이생성 기술의 설명에 대한 것).
참조 B7-H4 항체로서 "동일한 에피토프에 결합하는" B7-H4 항체는 참조 B7-H4 항체와 동일한 B7-H4 아미노산 잔기에 결합하는 항체를 지칭한다. B7-H4 항체가 참조 B7-4 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 능력은 수소/중수소 교환 검정에 의해 측정된다 (하기 참조: Coales et al. Rapid Commun.Mass Spectrom.2009; 23:639-647).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "면역특이적으로 결합", "면역특이적으로 인식", "특이적으로 결합", 및 "특이적으로 인식"함은 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 관련하여 유사한 용어이다. 이들 용어는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 그의 항원-결합 도메인을 통해 에피토프에 결합함을, 또한 결합이 항원 결합 도메인과 에피토프 사이의 일부 상보성을 수반함을 나타낸다. 따라서, 인간 B7-H4 (서열 번호:1)에 "특이적으로 결합"하는 항체는 또한 다른 종 (예: 시노몰구스 원숭이, 마우스, 및/또는 래트 B7-H4)으로부터의 B7-H4 및/또는 다른 인간 대립유전자로부터 생성된 B7-H4 단백질에 결합할 수 있지만, 비-관련, 비-B7-H4 단백질 (예: 다른 B7 단백질 패밀리 구성원, 예컨대 PD-L1)에 대한 결합 정도는, 예를 들어, 방사면역검정 (RIA)에 의해 측정시, B7-H4에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다.
구체적 구현예에서, 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 및 래트 B7-H4에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
항체는, 이것이 해당 에피토프 또는 오버랩핑 에피토프에 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 어느 정도 차단할 정도로 우세하게 결합하는 경우, 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 "경쟁적으로 억제한다"고 언급된다. 경쟁적 억제는 당업계에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 경쟁 ELISA 검정에 의해 측정될 수 있다. 항체는 주어진 에피토프에 대한 참조 항체의 결합을 적어도 90%, 적어도 80%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%만큼 경쟁적으로 억제한다고 언급할 수 있다.
"단리된"은, 자연에서 나타나지 않는 형태로 존재하는 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은, 이들이 더 이상 자연에서 나타나는 형태가 아닌 정도로 정제된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, 단리된 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 또는 조성물은 실질적으로 순수하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한"은, 적어도 50% 순수함 (즉, 오염물을 갖지 않음), 적어도 90% 순수, 적어도 95% 순수, 적어도 98% 순수, 또는 적어도 99% 순수함을 지칭한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이는 비-아미노산에 의해 개입될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개재; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 라벨링 성분과의 컨쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 (예를 들어, 비-천연 아미노산 등을 포함)의 하나 이상의 유사체 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드 또한 정의 내에 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기재로 하기 때문에, 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 단일쇄 또는 회합된 사슬로서 나타날 수 있음을 이해한다.
"퍼센트 동일성"은 두 서열 (예: 아미노산 서열 또는 핵산 서열) 사이의 동일성의 정도를 지칭한다. 퍼센트 동일성은, 두 서열을 정렬시키고, 서열 사이의 동일성을 최대화하도록 갭을 도입함으로써 결정될 수 있다. 정렬은 당업계에 공지된 프로그램을 사용하여 생성될 수 있다. 본원에서의 목적상, 뉴클레오티드 서열의 정렬은 디폴트 파라미터로 설정된 blastn 프로그램으로 수행될 수 있고, 아미노산 서열의 정렬은 디폴트 파라미터로 설정된 blastp 프로그램으로 수행될 수 있다 (월드와이드 웹, ncbi.nlm.nih.gov 상의 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "숙주 세포"는 임의의 유형의 세포, 예를 들어 1차 세포, 배양물 내 세포, 또는 세포 라인으로부터의 세포일 수 있다. 구체적 구현예에서, 용어 "숙주 세포"는 핵산 분자로 트랜스펙션된 세포 및 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 지칭한다. 이러한 세포의 자손은, 예를 들어, 후속 세대에서 나타날 수 있는 돌연변이 또는 환경적 영향 또는 핵산 분자의 숙주 세포 게놈으로의 통합으로 인해, 핵산 분자로 트랜스펙션된 모체 세포와 동일하지 않을 수 있다.
용어 "제약 제제"는, 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이 될 수 있게 하는 형태이며, 제제가 투여되는 대상체에게 허용불가능하게 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 조제물을 지칭한다. 제제는 멸균 상태일 수 있다.
용어 "투여하다", "투여하는", "투여" 등은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 약물, 예를 들어, 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생물학적 작용의 요망되는 자리로 전달할 수 있게 하기 위해 사용될 수 있는 방법 (예: 정맥내 투여)을 지칭한다. 본원에 기재된 작용제 및 방법과 함께 사용될 수 있는 투여 기술은, 예를 들어, 하기에 나타나 있다: Goodman 및 Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current edition, Pergamon; 및 Remington's, Pharmaceutical Sciences, current edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa.
하나 이상의 추가의 치료제"와 조합된" 투여는 동시 (동시 발생) 투여 또는 임의 순서의 연속 투여를 포함한다.
조합 요법은 "상승작용", 즉, 함께 사용된 활성제가 활성제를 별도로 사용하여 얻어지는 효과의 합계보다 큰 경우에 달성되는 효과를 제공할 수 있다. 상승작용 효과는 하기 경우에 얻어질 수 있다: 활성제가,(1) 공동-제제화되고 조합된 단위 투여량 제제 중에서 투여 또는 전달됨; (2) 순차적으로, 교대로, 또는 별도의 제제로서 병행하여 전달됨; 또는 (3) 일부 다른 체제(regimen)에 의함.교대 요법으로 전달시, 상승작용 효과는, 활성제가 순차적으로, 예를 들어, 별도의 시린지에서 상이한 주사에 의해 투여 또는 전달되는 경우에 얻어질 수 있다. "상승작용 조합"은, 조합의 개개의 활성제의 효과의 합계보다 큰 효과를 생성한다.
조합 요법은 "부가적" 효과, 즉, 함께 사용된 활성제가 활성제를 별도로 사용하여 얻어지는 효과의 합계와 동등한 경우에 달성되는 효과를 제공할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체" 및 "환자"는 상호교환가능하게 사용된다. 대상체는 동물일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류, 예컨대 비-인간 동물 (예: 소, 돼지, 말, 고양이, 개, 래트, 마우스, 원숭이 또는 다른 영장류 등)이다. 일부 구현예에서, 대상체는 시노몰구스 원숭이이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
용어 "치료 유효량"은 대상체에서의 질환 또는 장애를 치료하기에 효과적인 약물, 예를 들어, 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 양을 지칭한다. 암의 경우, 약물의 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소시키고/거나; 종양 크기 또는 부담을 감소시키고/거나; 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제하고/거나 (즉, 어느 정도 둔화시키고, 일부 구현예에서는 중지시킴); 종양 전이를 억제하고/거나 (즉, 어느 정도 둔화시키고, 일부 구현예에서는 중지시킴); 종양 성장을 어느 정도 억제하고/거나; 암과 관련된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화시키고/거나; 유리한 반응, 예컨대 증가된 무진행 생존 (PFS), 무질환 생존 (DFS), 또는 전체적 생존 (OS), 완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR), 또는, 일부 경우, 안정적 질환 (SD), 진행성 질환 (PD) 감소, 진행까지의 시간 (TTP) 감소, 또는 임의의 이들의 조합을 제공할 수 있다. 약물이 존재하는 암 세포의 성장을 막고/거나 사멸시킬 수 있다면, 이는 세포정지성 및/또는 세포독성일 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기" 또는 "경감" 또는 "경감시키기" 등의 용어는 진단된 병적 상태 또는 장애를 치유하고/거나, 둔화시키고/거나, 그의 증상을 줄이고/거나, 그의 진행을 중단시키는 치료적 수단을 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 것들은 장애를 갖는 것으로 이미 진단된 또는 이를 가질 것으로 의심되는 것들을 포함한다. 특정 구현예에서, 환자가 하기 중 하나 이상을 나타내는 경우, 대상체가 본 발명의 방법에 따라 암에 대해 성공적으로 "치료된" 것이다: 암 세포의 수 감소 또는 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 예를 들어, 연조직 및 뼈로의 암의 확산을 포함한, 말초 기관으로의 암 세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 전이의 억제 또는 부재; 종양 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 관련된 하나 이상의 증상의 완화; 감소된 이환율 및 사망률; 삶의 질 개선; 종양의 종양형성성, 종양형성 빈도수, 또는 종양형성 능력의 감소; 종양에서의 암 줄기 세포의 수 또는 빈도수 감소; 종양형성 세포의 비-종양형성 상태로의 분화; 증가된 무진행 생존 (PFS), 무질환 생존 (DFS), 또는 전체적 생존 (OS), 완전 반응 (CR), 부분 반응 (PR), 안정적 질환 (SD), 진행성 질환 (PD)의 감소, 진행까지의 시간 (TTP)의 감소, 또는 임의의 이들의 조합.
용어 "암" 및 "암성"은, 세포의 집단이 비-조절된 세포 성장에 의해 특성화되는 포유류에서의 생리학적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는, 부인과 암 (예: 유방암 (삼중 음성 유방암, 유관 암종 포함), 난소암, 및 자궁내막암), 비-소세포 폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암 (예: 신세포 암종), 및 방광암 (예: 요로상피 세포 암종)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비-소세포 폐암은 예를 들어 선암종일 수 있다. 암의 추가의 예는, 예를 들어, 두경부암, 소세포 폐암, 위암, 흑색종, 담관암종, 교아종 또는 다형성교아종 (GBM), 및 메르켈 세포 암종을 포함한다. 하나의 구현예에서, 난소암은 장액 선암종이다. 하나의 구현예에서, 유방암은 유관 선암종이다. 암은 "B7-H4를 발현하는 암" 또는 "B7-H4 발현 암"일 수 있다. 이러한 용어는 B7-H4를 발현하는 세포를 포함하는 암을 지칭한다. 암은 원발성 종양일 수 있거나 진행성 또는 전이성 암일 수 있다.
"난치성" 암은, 항-종양 치료를 통해서도, 예컨대 화학요법을 암 환자에게 투여하여도 진행되는 것이다.
"재발성" 암은, 초기 요법에 대한 반응 후, 초기 자리 또는 원위 자리에서 재성장된 것이다.
"재발된" 환자는 차도 후에 암의 징후 또는 증상을 갖는 환자이다. 임의로, 환자는 아주반트 또는 네오아주반트 요법 후에 재발된다.
"T 세포 체크포인트 차단 활성"은 T 세포 체크포인트 활성 또는 반응의 차단 또는 억제를 지칭한다. T 세포 체크포인트 차단 활성은 IFNγ 생성에서의 변화에 기초하여 인공 항원 제시 세포 (aAPC) 검정으로 측정될 수 있다. 1차 인간 T 세포를 T 세포 풍부 키트 (예컨대 EasySep™ 인간 T 세포 풍부화 키트 또는 유사 키트)를 사용하여 PBMC로부터 풍부화시킬 수 있다. 풍부화된 T 세포를 비드 (예: 항-CD3/항-CD28 비드)와 함께 인큐베이션한다. 일정 기간 후, 비드를 자기 제거하고, T 세포를 세척하고 인큐베이션한다. 다음으로, T 세포를 세척하고, B7-H4 항체 용량 적정의 존재 하에 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 함께 인큐베이션한다. aAPC를 미토신(미토마이신) C로 처리하고, 이어서 철저히 세척한 후, T 세포 공동-배양에 첨가할 수 있다. T 세포, aAPC, 및 B7-H4 항체의 공동-배양 후, 플레이트를 원심분리할 수 있고, 상청액을 수확하고 ELISA에 의해 IFNγ 생성에 대하여 평가할 수 있다. IFNγ 생성을 항체 농도에 대하여 플롯팅할 수 있고, 비-선형 회귀 곡선 핏을 사용하여 EC50 효능을 계산할 수 있다. 결과를 EC50 +/- STD (nM 단위)로서 측정할 수 있다. B7-H4 항체에 의한 T 세포 체크포인트 차단 활성은 IFNγ 생성 증가에 의해 입증될 수 있다. "T 세포 체크포인트 차단 활성"은 또한, B7-H4를 내인적으로 발현하는 세포를 사용하는 검정에서 측정할 수 있다. T 세포 단리 키트 (예: 인간 Pan T 세포 단리 키트)를 사용하여 HLA-A2+ 공여체 PBMC로부터 1차 인간 T 세포를 풍부화시킬 수 있다. 먼저 풍부화된 Pan T 세포를 비드 (예: 항-CD3/항-CD28 Dynabeads), IL-2 및 IL-7과 함께 48시간 동안 활성화시킴으로써 MART-I TCR 발현 T 세포를 생성할 수 있다. 이어서, 활성화된 T 세포를 IL-2, IL-7 및 폴리브렌의 존재 하에 MART-I TCR 렌티바이러스 입자로 형질도입할 수 있다. 형질도입 후, MART-I TCR+ Pan T 세포를 IL-2 및 IL-7의 존재 하에 일정 기간에 걸쳐 확장시킬 수 있다. HLA-A2 발현 표적 세포 라인을 생성하기 위해, 내인적 B7-H4 발현 암 세포 라인을 일정 기간 동안 (예: 48시간) HLA-A2 렌티바이러스 입자로 형질도입할 수 있다. 또한, B7-H4를 HLA-A2+ 세포 라인에 대해 녹아웃(knocked-out)시킬 수 있다. 이어서, MART-I TCR+ Pan T 세포를 다양한 표적 세포 라인 (1:1 E:T 비율), MART-I 펩티드 및 B7-H4 항체 또는 인간 이소타입 대조군의 존재 하에 공동-배양할 수 있다. 공동-인큐베이션 후, 플레이트를 원심분리할 수 있고, 상청액을 수확하고 IL-2 생성에 대해 평가할 수 있다. IL-2 생성은 표준 면역검정 키트 (예컨대 AlphaLISA 검정 또는 유사 검정)에 의해 측정할 수 있다.
본 개시내용 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 하나의 ("a", "an"), 및 "the"는 문맥에서 달리 명백히 나타내지 않는 한 복수형을 포함한다.
구현예가 "포함하는"이라는 언어와 함께 기재된다면, "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 구현예 또한 제공됨이 이해된다. 본 개시내용에서, "포함하다", "포함하는", "함유하는" 및 "갖는" 등은 하기 특허법에 기재된 의미를 가질 수 있고: 미국특허법, "포괄하다", "비롯한" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 이루어진" 또는 "본질적으로 이루어지다" 또한 마찬가지로 하기 특허법에 기재된 의미를 갖고: 미국특허법, 용어는 개방형 용어로, 언급 사항의 기본적 또는 신규한 특징이 언급 사항을 넘어서는 사항의 존재에 의해 변하지 않는 한, 언급된 사항을 넘어서는 사항의 존재를 허용하지만, 선행 기술 구현예는 제외된다
달리 구체적으로 언급되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "또는"은 포함적으로 이해된다. 본원에서 "A 및/또는 B" 등의 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A", 및 "B" 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B, 및/또는 C" 등의 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 하기 구현예 각각을 포함하도록 의도된다:A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은, 수치 값 또는 수치 범위를 수식하기 위해 사용되는 경우, 그 값 또는 범위 초과 5% 내지 10% 및 그 미만 5% 내지 10%의 편차가 언급된 값 또는 범위의 의도된 의미 내에 남아있음을 나타낸다.
본원에서 제공되는 임의의 조성물 또는 방법은 본원에서 제공되는 임의의 다른 조성물 및 방법 중 하나 이상과 조합될 수 있다.
1.2 항체
구체적 양태에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 항체 (예: 모노클로날 항체, 예컨대 키메라, 인간화된, 또는 인간 항체) 및 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다. 인간, 시노몰구스 원숭이, 뮤린, 및 래트 B7-H4에 대한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고, 또한 각각 서열 번호:1-4로 나타낸 것으로 본원에서 제공된다.
인간 B7-H4:
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSPYLMLK (서열 번호:1)
시노몰구스 원숭이 B7-H4:
MASLGQILFWSIISIIFILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVIGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFLAISWALLPLAPYLMLK (서열 번호:2)
뮤린 B7-H4
MASLGQIIFWSIINIIIILAGAIALIIGFGISGKHFITVTTFTSAGNIGEDGTLSCTFEPDIKLNGIVIQWLKEGIKGLVHEFKEGKDDLSQQHEMFRGRTAVFADQVVVGNASLRLKNVQLTDAGTYTCYIRTSKGKGNANLEYKTGAFSMPEINVDYNASSESLRCEAPRWFPQPTVAWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTDSEVKRRSQLQLLNSGPSPCVFSSAFVAGWALLSLSCCLMLR (서열 번호:3)
래트 B7-H4
MASLGQIIFWSIINVIIILAGAIVLIIGFGISGKHFITVTTFTSAGNIGEDGTLSCTFEPDIKLNGIVIQWLKEGIKGLVHEFKEGKDDLSQQHEMFRGRTAVFADQVVVGNASLRLKNVQLTDAGTYTCYIHTSKGKGNANLEYKTGAFSMPEINVDYNASSESLRCEAPRWFPQPTVAWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTDSEVKRRSQLELLNSGPSPCVSSVSAAGWALLSLSCCLMLR (서열 번호:4)
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 및 시노몰구스 원숭이 B7-H4에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간, 뮤린, 및 래트 B7-H4에 결합한다. 특정 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간, 시노몰구스 원숭이, 뮤린, 및 래트 B7-H4에 결합한다.
B7-H4는 IgC 엑토도메인 (서열 번호:1의 아미노산 153-241) 및 IgV 도메인 (서열 번호:1의 아미노산 35-146)을 함유한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4의 IgV 도메인에 결합한다. 따라서, 서열 번호:1의 아미노산 35-146으로 이루어진 폴리펩티드에 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함한다.
표 1.VH CDR 아미노산 서열 1
Figure pct00003
Figure pct00004
표 2.VL CDR 아미노산 서열 2
Figure pct00005
Figure pct00006
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 3에 나열된 항체의 VH를 포함한다.
표 3: 가변 중쇄 (VH) 아미노산 서열
Figure pct00007
Figure pct00008
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 4에 나열된 항체의 VL을 포함한다.
표 4: 가변 경쇄(VL) 아미노산 서열
Figure pct00009
Figure pct00010
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 3 및 4에 나열된 항체의 VH 및 VL (즉, 표 3에 나열된 항체의 VH 및 표 4에 나열된 동일한 항체의 VL)을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 5에 나열된 항체의 VH 프레임워크 영역을 포함한다.
표 5. VH FR 아미노산 서열 4
Figure pct00011
Figure pct00012
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 6에 나열된 항체의 VL 프레임워크 영역을 포함한다.
표 6. VL FR 아미노산 서열 3
Figure pct00013
Figure pct00014
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 5 및 6에 나열된 항체의 4개 VH 프레임워크 영역 및 4개 VL 프레임워크 영역 (즉, 표 5에 나열된 항체의 4개 VH 프레임워크 영역 및 표 6에 나열된 동일한 항체의 4개 VL 프레임워크 영역)을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 7에 나열된 항체의 중쇄 서열을 포함한다.
표 7: 전장 중쇄 아미노산 서열
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 8에 기재된 항체의 경쇄 서열을 포함한다.
표 8: 전장 경쇄 아미노산 서열
Figure pct00019
Figure pct00020
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 7 및 8에 나열된 항체의 중쇄 서열 및 경쇄 서열 (즉, 표 7에 나열된 항체의 중쇄 서열 및 표 8에 나열된 동일한 항체의 경쇄 서열)을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 96% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 96% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 97% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 97% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 및/또는 마우스 B7-H4에 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 및/또는 마우스 B7-H4에 결합한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 및/또는 마우스 B7-H4에 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 및/또는 마우스 B7-H4에 결합한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 96% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 96% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 및/또는 마우스 B7-H4에 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 97% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 97% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 및/또는 마우스 B7-H4에 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 및/또는 마우스 B7-H4에 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, 인간, 시노몰구스 원숭이, 래트, 및/또는 마우스 B7-H4에 결합한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 80% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, T 세포 증식을 증가시키고, IFNγ 생성을 증가시키고, B7-H4-발현 세포에 대한 ADCC 활성을 매개한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 85% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, T 세포 증식을 증가시키고, IFNγ 생성을 증가시키고, B7-H4-발현 세포에 대한 ADCC 활성을 매개한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 90% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, T 세포 증식을 증가시키고, IFNγ 생성을 증가시키고, 및/또는 B7-H4-발현 세포에 대한 ADCC 활성을 매개한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, T 세포 증식을 증가시키고, IFNγ 생성을 증가시키고, B7-H4-발현 세포에 한 ADCC 활성을 매개한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 96% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 96% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, T 세포 증식을 증가시키고, IFNγ 생성을 증가시키고, B7-H4-발현 세포에 대한 ADCC 활성을 매개한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 97% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 97% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, T 세포 증식을 증가시키고, IFNγ 생성을 증가시키고, B7-H4-발현 세포에 대한 ADCC 활성을 매개한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 98% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, T 세포 증식을 증가시키고, IFNγ 생성을 증가시키고, B7-H4-발현 세포에 대한 ADCC 활성을 매개한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4에 결합하고, 표 1 및 2에 나열된 항체의 6개 CDR (즉, 표 1에 나열된 항체의 3개 VH CDR 및 표 2에 나열된 동일한 항체의 3개 VL CDR)을 포함하고, 표 3에서의 동일한 항체의 VH 서열과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 VH 및 표 4에서의 동일한 항체의 VL 서열과 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 VL을 포함하고, T 세포 증식을 증가시키고, IFNγ 생성을 증가시키고, B7-H4-발현 세포에 대한 ADCC 활성을 매개한다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 그의 VL 도메인만으로, 또는 그의 VH 도메인만으로, 또는 그의 3개 VL CDR만으로, 또는 그의 3개 VH CDR만으로 기재될 수 있다. 예를 들어, Rader C et al., (1998) PNAS 95:8910-8915를 참조하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함되고, 원래의 항체의 친화성만큼 또는 그보다 높은 친화성을 갖는 인간화된 항체 변이체를 생성하는, 인간 경쇄 또는 중쇄 라이브러리로부터, 각각, 상보성 경쇄 또는 중쇄를 동정하는 것에 의한 마우스 항-αvβ3 항체의 인간화를 기재한다. 또한 하기를 참조하며: Clackon T et al., (1991) Nature 352:624-628, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함되고, 특이적 VL 도메인 (또는 VH 도메인)을 사용하고 상보성 가변 도메인에 대한 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의한 특이적 항원에 결합하는 항체의 생성 방법을 기재한다. 스크린은 특이적 VH 도메인에 대한 14개의 새로운 파트너 및 특이적 VL 도메인에 대한 13개의 새로운 파트너를 생성하였고, 이는 ELISA에 의해 측정시 강한 결합제였다. 또한 하기를 참조하며: Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45:572-577, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함되고, 특이적 VH 도메인을 사용하고 상보성 VL 도메인에 대한 라이브러리 (예: 인간 VL 라이브러리)를 스크리닝하는 것에 의한 특이적 항원에 결합하는 항체의 생성 방법을 기재하며; 여기서는 또한 선택된 VL 도메인을 사용하여 추가의 상보성 (예: 인간) VH 도메인의 선택을 인도할 수 있었다.
특정 양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 CDR은, 면역글로불린 구조적 루프의 위치를 나타내는 코티아 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있다 (예를 들어 하기 참조: Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196:901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273:927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227:799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1):175-82; 및 미국특허 번호 7,709,226). 전형적으로, 카바트 넘버링 규약 사용시, 코티아 CDR-H1 루프는 중쇄 아미노산 26 내지 32, 33, 또는 34에 존재하고, 코티아 CDR-H2 루프는 중쇄 아미노산 52 내지 56에 존재하고, 코티아 CDR-H3 루프는 중쇄 아미노산 95 내지 102에 존재하며, 코티아 CDR-L1 루프는 경쇄 아미노산 24 내지 34에 존재하고, 코티아 CDR-L2 루프는 경쇄 아미노산 50 내지 56에 존재하고, 코티아 CDR-L3 루프는 경쇄 아미노산 89 내지 97에 존재한다. 코티아 CDR-H1 루프의 말단은, 카바트 넘버링 규약을 사용하여 넘버링시, 루프의 길이에 따라 H32 내지 H34에서 다양하다 (이는 카바트 넘버링 체계가 H35A 및 H35B에서 삽입을 배치하기 때문임; 35A 및 35B 둘 다 존재하지 않는 경우, 루프는 32에서 종료됨; 35A만 존재하는 경우, 루프는 33에서 종료됨; 35A 및 35B 둘 다 존재하는 경우, 루프는 34에서 종료됨).
특정 양태에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하고, 표 3 및 4에 나열된 항체의 코티아 VH 및 VL CDR을 포함하는 항체 및 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 코티아 및 카바트 CDR이 동일한 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하고, 카바트 CDR 및 코티아 CDR의 조합을 포함하는 항체 및 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
특정 양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 CDR은 하기에 기재된 IMGT 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다: Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7:132-136 및 Lefranc M-P et al., (1999) Nucleic Acids Res 27:209-212.IMGT 넘버링 체계에 따르면, VH-CDR1은 위치 26 내지 35에 있고, VH-CDR2는 위치 51 내지 57에 있고, VH-CDR3은 위치 93 내지 102에 있고, VL-CDR1은 위치 27 내지 32에 있고, VL-CDR2는 위치 50 내지 52에 있고, VL-CDR3은 위치 89 내지 97에 있다. 특별한 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하고, 표 3 및 4에 나열된 항체의 IMGT VH 및 VL CDR (예를 들어, 상기 문헌 [Lefranc M-P (1999)] 및 [Lefranc M-P et al., (1999)]에 기재됨)을 포함하는 항체 및 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
특정 양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 CDR은 하기에 따라 결정될 수 있다: MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262:732-745. 또한, 예를 들어, 하기 참조: Martin A."Protein Sequence 및 Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann 및 D
Figure pct00021
bel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001). 특별한 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하고, 맥칼룸 등(MacCallum RM et al.)의 방법에 의해 결정시 표 3 및 4에 나열된 항체의 VH 및 VL CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
특정 양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 CDR은, 카바트 CDR과 코티아 구조적 루프 사이의 절충을 나타내는 AbM 초가변 영역을 나타내며, Oxford Molecular's AbM 항체 모델링 소프트웨어 (Oxford Molecular Group, Inc.)에 의해 사용되는 AbM 넘버링 체계에 따라 결정될 수 있다. 특별한 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하고, AbM 넘버링 체계에 의해 결정시 표 3 및 4에 나열된 항체의 VH 및 VL CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
구체적 양태에서, 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체가 본원에서 제공된다. 중쇄에 대하여, 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 중쇄는 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 뮤 (μ) 중쇄일 수 있다. 또 다른 구체적 구현예에서, 기재된 항체의 중쇄는 인간 알파 (α), 델타 (δ), 엡실론 (ε), 감마 (γ) 또는 뮤 (μ) 중쇄를 포함할 수 있다. 특별한 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체는, VH 도메인의 아미노산 서열이 표 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하는, 또한 중쇄의 불변 영역이 인간 감마 (γ) 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체는, VH 도메인의 아미노산 서열이 표 3에 기재된 서열을 포함하는, 또한 중쇄의 불변 영역이 본원에 기재된 또는 당업계에 공지된 인간 중쇄의 아미노산을 포함하는 중쇄를 포함한다. 인간 불변 영역 서열의 비-제한적 예는 당업계에 기재되어 있으며, 예를 들어, 하기를 참조한다: 미국특허 번호 5,693,780 및 상기 문헌 [Kabat EA et al., (1991)].
경쇄에 대하여, 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 경쇄는 카파 경쇄이다. 인간 카파 경쇄의 불변 영역은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (서열 번호:405).
인간 카파 경쇄의 불변 영역은 하기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다:
CGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (서열 번호:406).
또 다른 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 경쇄는 람다 경쇄이다. 또한 또 다른 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 경쇄는 인간 카파 경쇄 또는 인간 람다 경쇄이다. 특별한 구현예에서, B7-H4 폴리펩티드 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체는, VL 도메인의 아미노산 서열이 표 4에 기재된 서열을 포함하는, 또한 경쇄의 불변 영역이 인간 카파 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 또 다른 특별한 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체는, VL 도메인의 아미노산 서열이 표 4에 기재된 서열을 포함하는, 또한 경쇄의 불변 영역이 인간 람다 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체는, VL 도메인의 아미노산 서열이 표 4에 기재된 서열을 포함하는, 또한 경쇄의 불변 영역이 인간 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 인간 불변 영역 서열의 비-제한적 예는 당업계에 기재되어 있으며, 예를 들어, 하기를 참조한다: 미국특허 번호 5,693,780 및 상기 문헌 [Kabat EA et al., (1991)].
구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체는 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY 면역글로불린 분자, 또는 인간 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY 면역글로불린 분자의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체는 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함하고, 여기서 불변 영역은 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY 면역글로불린 분자, 임의의 부류 (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 임의의 하위부류 (예: IgG2a 및 IgG2b)의 면역글로불린 분자의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 특별한 구현예에서, 불변 영역은 인간 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 또는 IgY 면역글로불린 분자, 임의의 부류 (예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2), 또는 임의의 하위부류 (예: IgG2a 및 IgG2b)의 면역글로불린 분자의 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다.
인간 IgG1 중쇄의 불변 영역은 하기 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:407).
인간 IgG1 중쇄 의 불변 영역은 하기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다:
GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA.(서열 번호:408)
인간 불변 영역의 비-제한적 예는 당업계에 기재되어 있으며, 예를 들어, 상기 문헌 [Kabat EA et al., (1991)]을 참조한다.
특정 구현예에서는, 하나, 둘, 또는 그 이상의 돌연변이 (예: 아미노산 치환)가 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 Fc 영역 (예: CH2 도메인 (인간 IgG1의 잔기 231-340) 및/또는 CH3 도메인 (인간 IgG1의 잔기 341-447) 및/또는 힌지(hinge) 영역, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링 시스템 (예: 카바트의 EU 인덱스)에 따름) 내로 도입되어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포성 세포독성을 변경시킨다.
특정 구현예에서는, 하나, 둘, 또는 그 이상의 돌연변이 (예: 아미노산 치환)가 Fc 영역의 힌지 영역 (CH1 도메인) 내로 도입되어, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수를 변경 (예를 들어 증가 또는 감소)시키며, 이는 예를 들어 하기에 기재되어 있다: 미국특허 번호 5,677,425. CH1 도메인의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 어셈블리를 용이하게 하기 위해, 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 안정성을 변경 (예를 들어 증가 또는 감소)시키기 위해 변경될 수 있다.
일부 구현예에서는, 하나, 둘, 또는 그 이상의 돌연변이 (예: 아미노산 치환)가 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 Fc 영역 (예: CH2 도메인 (인간 IgG1의 잔기 231-340) 및/또는 CH3 도메인 (인간 IgG1의 잔기 341-447) 및/또는 힌지 영역, 여기서 넘버링은 카바트 넘버링 시스템 (예: 카바트의 EU 인덱스)에 따름) 내로 도입되어, 이펙터 세포의 표면 상의 Fc 수용체 (예: 활성화된 Fc 수용체)에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화성을 증가 또는 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 친화성을 감소 또는 증가시키는 Fc 영역에서의 돌연변이 및 이러한 돌연변이를 Fc 수용체 또는 그의 단편 내로 도입하기 위한 기술은 당업자에게 공지되어 있다. Fc 수용체에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화성을 변경시키기 위해 이루어질 수 있는 Fc 수용체에서의 돌연변이의 예는, 예를 들어, 하기에 기재되어 있고: Smith P et al., (2012) PNAS 109:6181-6186, 미국특허 번호 6,737,056, 및 국제 공개 번호 WO 02/060919; WO 98/23289; 및 WO 97/34631, 이들은 본원에 참조로 포함된다.
구체적 구현예에서는, 하나, 둘, 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)가 IgG 불변 도메인, 또는 그의 FcRn-결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지-Fc 도메인 단편) 내로 도입되어 생체내에서의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 반감기를 변경 (예를 들어 감소 또는 증가)시킨다. 예를 들어 하기 참조: 국제 공개 번호 WO 02/060919; WO 98/23289; 및 WO 97/34631; 및 미국특허 번호 5,869,046, 6,121,022, 6,277,375 및 6,165,745 (생체내에서의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 반감기를 변경 (예를 들어 감소 또는 증가)시킬 돌연변이에 대한 예). 일부 구현예에서는, 1, 2개 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이 (즉, 치환, 삽입, 또는 결실)가 IgG 불변 도메인, 또는 그의 FcRn-결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지-Fc 도메인 단편) 내로 도입되어 생체내에서의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 반감기를 감소시킨다. 다른 구현예에서는, 하나, 둘 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이 (즉, 치환, 삽입, 또는 결실)가 IgG 불변 도메인, 또는 그의 FcRn-결합 단편 (바람직하게는 Fc 또는 힌지-Fc 도메인 단편) 내로 도입되어 생체내에서의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 반감기를 증가시킨다. 구체적 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 제2 불변 (CH2) 도메인 (인간 IgG1의 잔기 231-340) 및/또는 제3 불변 (CH3) 도메인 (인간 IgG1의 잔기 341-447) (여기서 넘버링은 카바트의 EU 인덱스 (상기 문헌 [Kabat EA et al., (1991)])에 따름)에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이 (예: 치환)를 가질 수 있다. 구체적 구현예에서, IgG1의 불변 영역은 위치 252에서 메티오닌 (M) - 티로신 (Y) 치환, 위치 254에서 세린 (S) - 트레오닌 (T) 치환, 및 위치 256에서 트레오닌 (T) - 글루탐산 (E) 치환 (카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 넘버링됨)을 포함한다. 하기를 참조하며: 미국특허 번호 7,658,921, 이는 본원에 참조로 포함된다. 이러한 유형의 돌연변이 IgG ("YTE 돌연변이"로서 언급됨)는 동일한 항체의 야생형 버전에 비해 4배 증가된 반감기를 보이는 것으로 나타났다 (하기 참조: Dall'Acqua WF et al., (2006) J Biol Chem 281:23514-24). 특정 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 위치 251-257, 285-290, 308-314, 385-389, 및 428-436 (카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 넘버링됨)에서 아미노산 잔기의 1, 2, 3개 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 IgG 불변 도메인을 포함한다.
추가의 구현예에서는, 1, 2개 또는 그 이상의 아미노산 치환이 IgG 불변 도메인 Fc 영역 내로 도입되어 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 이펙터 기능(들)을 변경시킨다. 예를 들어, 아미노산 잔기 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 및 322 (카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 넘버링됨)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 이펙터 리간드에 대한 변경된 친화성을 갖지만 모체 항체의 항원-결합 능력은 유지하도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화성이 변경되는 이펙터 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 성분일 수 있다. 이 접근은 하기에 더욱 상세히 기재되어 있다: 미국특허 번호 5,624,821 및 5,648,260.일부 구현예에서, 불변 영역 도메인의 결실 또는 불활성화 (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한)는 순환 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 Fc 수용체 결합을 감소시킴으로써 종양 국소화를 증가시킬 수 있다. 예를 들어 하기 참조: 미국특허 번호 5,585,097 및 8,591,886 (불변 도메인을 결실 또는 불활성화시키고 이로써 종양 국소화를 증가시키는 돌연변이의 기재에 대한 것). 특정 구현예에서는, 하나 이상의 아미노산 치환이 Fc 영역 내로 도입되어 Fc 영역 상의 잠재적 글리코실화 자리를 제거할 수 있고, 이는 Fc 수용체 결합을 감소시킬 수 있다 (예를 들어 하기 참조: Shields RL et al., (2001) J Biol Chem 276:6591-604).
특정 구현예에서는, 불변 영역 내의 아미노산 잔기 329, 331, 및 322 (카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 넘버링됨)로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 변경된 C1q 결합 및/또는 감소된 또는 무효화된 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이 접근은 하기에 더욱 상세히 기재되어 있다: 미국특허 번호 6,194,551 (Idusogie et al). 일부 구현예에서는, CH2 도메인의 N-말단 영역에서 아미노산 위치 231 내지 238 내의 하나 이상의 아미노산 잔기를 변경시킴으로써 항체가 보체를 고정시키는 능력을 변경시킨다. 이 접근은 국제 공개 번호 WO 94/29351에 추가로 기재되어 있다. 특정 구현예에서는, 하기 위치에서의 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 (예: 아미노산 치환 도입)에 의해 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 항체 의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 매개하는 능력을 증가시키기 위해 및/또는 Fcg 수용체에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 친화성을 증가시키기 위해 Fc 영역을 변형시킨다: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438, 또는 439 (카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 넘버링됨). 이 접근은 국제 공개 번호 WO 00/42072에 추가로 기재되어 있다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 위치 267, 328, 또는 이들의 조합 (카바트에서와 같이 EU 인덱스에 따라 넘버링됨)에서의 돌연변이 (예: 치환)를 갖는 IgG1의 불변 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 S267E, L328F, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이 (예: 치환)를 갖는 IgG1의 불변 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 S267E/L328F 돌연변이 (예: 치환)를 갖는 IgG1의 불변 도메인을 포함한다. 특정 구현예에서, S267E/L328F 돌연변이 (예: 치환)를 갖는 IgG1의 불변 도메인을 포함하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 FcγRIIA, FcγRIIB, 또는 FcγRIIA 및 FcγRIIB에 대한 증가된 결합 친화성을 갖는다.
예를 들어, FcγRIIIA 등의 Fc 수용체에 대한 증가된 친화성을 갖도록 감소된 푸코스 함량을 갖는 항체가 보고되었다. 따라서, 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 감소된 푸코스 함량을 갖거나 푸코스가 결핍되어 있다 (즉, "아푸코실화됨"). 이러한 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 이들은 푸코실화되는 능력이 부족한 또는 결핍된 세포에서 발현될 수 있다. 구체적 예에서, α1,6-푸코실트랜스퍼라제의 대립유전자 둘 다의 녹아웃을 갖는 세포 라인을 사용하여 감소된 푸코스 함량을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생성할 수 있다. Potelligent® 시스템 (Lonza)은 감소된 푸코스 함량을 갖는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 사용하기 위해 사용될 수 있는 이러한 시스템의 일례이다. 대안적으로, 감소된 푸코스 함량을 갖는 또는 푸코스 함량을 갖지 않는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 예를 들어 하기에 의해 제조될 수 있다:(i) 푸코실화를 막거나 감소시키는 조건 하에서의 세포 배양; (ii) 푸코스의 번역후 제거 (예를 들어 푸코시다제 효소 사용); (iii) 예를 들어, 비-글리코실화된 당단백질의 재조합 발현 후, 요망되는 탄수화물의 번역후 첨가; 또는 (iv) 푸코실화되지 않은 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 대한 선택을 위한 당단백질의 정제. 예를 들어 하기 참조: Longmore GD & Schachter H (1982) Carbohydr Res 100:365-92 및 Imai-Nishiya H et al., (2007) BMC Biotechnol.7:84 (푸코스 함량을 갖지 않는 또는 감소된 푸코스 함량을 갖는 항체의 제조 방법에 대한 것). 또한 아푸코실화된 B7-H4 항체의 생성을 기재하는 본원 실시예 8 참조.
일부 구현예에서, B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동일한 아미노산 서열을 갖는 푸코실화된 B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 비해 향상된 시험관내 ADCC 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, 아푸코실화된 B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 푸코실화된 B7-H4 항체에서의 특이적 용균보다 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 35, 적어도 40, 적어도 45, 적어도 50, 적어도 60, 적어도 65, 적어도 70, 또는 적어도 75 퍼센트 포인트 더 큰 특이적 용균을 일으킨다.
일부 구현예에서, B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 동일한 아미노산 서열을 갖는 푸코실화된 B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 비해 Fc 감마 RIIIA에 대한 향상된 친화성을 갖는다. 일부 구현예에서, 아푸코실화된 B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 푸코실화된 B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편보다 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 7배, 적어도 10배, 적어도 12배, 적어도 15배, 적어도 17배, 또는 적어도 20배 더 큰 친화성으로 Fc 감마 RIIIA에 결합한다. 일부 구현예에서, Fc 감마 RIIIA에 대한 친화성은 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 측정한다. 일부 구현예에서, Fc 감마 RIIIA는 Fc 감마 RIIIA(V158) 및 Fc 감마 RIIIA(F158)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, Fc 감마 RIIIA는 Fc 감마 RIIIA(V158)이다.
일부 구현예에서, 푸코스의 존재는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 모세관 전기영동, 또는 MALDI-TOF 질량 분광측정법을 포함하는 방법에 의해 측정될 수 있다.
구체적 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 20502의 CDR 서열 (예: 서열 번호:458-463의 아미노산 서열), 20502의 VH 및 VL 서열 (각각, 서열 번호:464 및 42의 아미노산 서열), 또는 20502의 중쇄 및 경쇄 서열 (각각, 서열 번호:469 및 44의 아미노산 서열)을 포함하고, (ii) 아푸코실화된다.
구체적 구현예에서, 조성물은, (i) 20502의 CDR 서열 (예: 서열 번호:458-463의 아미노산 서열), 20502의 VH 및 VL 서열 (각각, 서열 번호:464 및 42의 아미노산 서열), 또는 20502의 중쇄 및 경쇄 서열 (각각, 서열 번호:469 및 44의 아미노산 서열)을 포함하고, (ii) 아푸코실화되고, 예를 들어, 여기서 조성물 중의 항체의 적어도 95%는 아푸코실화되거나 또는 여기서 푸코실화는 조성물에서 검출불가능한 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
구체적 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 20502.1의 CDR 서열 (예: 서열 번호:35-40의 아미노산 서열), 20502.1의 VH 및 VL 서열 (각각, 서열 번호:41 및 42의 아미노산 서열), 또는 20502.1의 중쇄 및 경쇄 서열 (각각, 서열 번호:43 및 44의 아미노산 서열)을 포함하고, (ii) 아푸코실화된다.
구체적 구현예에서, 조성물은, (i) 20502.1의 CDR 서열 (예: 서열 번호:35-40의 아미노산 서열), 20502.1의 VH 및 VL 서열 (각각, 서열 번호:41 및 42의 아미노산 서열), 또는 20502.1의 중쇄 및 경쇄 서열 (각각, 서열 번호:43 및 44의 아미노산 서열)을 포함하고, (ii) 아푸코실화되고, 예를 들어, 여기서 조성물 중의 항체의 적어도 95%는 아푸코실화되거나 또는 여기서 푸코실화는 조성물에서 검출불가능한 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
구체적 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 (i) 22213의 CDR 서열 (예: 서열 번호:65-70의 아미노산 서열), 22213의 VH 및 VL 서열 (각각, 서열 번호:71 및 72의 아미노산 서열), 또는 22213의 중쇄 및 경쇄 서열 (각각, 서열 번호:73 및 74의 아미노산 서열)을 포함하고, (ii) 아푸코실화된다.
구체적 구현예에서, 조성물은, (i) 22213의 CDR 서열 (예: 서열 번호:65-70의 아미노산 서열), 22213의 VH 및 VL 서열 (각각, 서열 번호:71 및 72의 아미노산 서열), 또는 22213의 중쇄 및 경쇄 서열 (각각, 서열 번호:73 및 74의 아미노산 서열)을 포함하고, (ii) 아푸코실화되고, 예를 들어, 여기서 조성물 중의 항체의 적어도 95%는 아푸코실화되거나 또는 여기서 푸코실화는 조성물에서 검출불가능한 것인 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
조작된 글리코형(glycoform)이, 이펙터 기능의 향상 또는 감소를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 목적상 유용할 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편에서 조작된 글리코형을 생성하는 방법은, 예를 들어, 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 하기에 개시된 것들: Uma
Figure pct00022
a P et al., (1999) Nat Biotechnol 17:176-180; Davies J et al., (2001) Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields RL et al., (2002) J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa T et al., (2003) J Biol Chem 278:3466-3473; Niwa R et al., (2004) Clin Cancer Res 1:6248-6255; Presta LG et al., (2002) Biochem Soc Trans 30:487-490; Kanda Y et al., (2007) Glycobiology 17:104-118; 미국특허 번호 6,602,684; 6,946,292; 및 7,214,775; 미국특허 공개 번호 US 2007/0248600; 2007/0178551; 2008/0060092; 및 2006/0253928; 국제 공개 번호 WO 00/61739; WO 01/292246; WO 02/311140; 및 WO 02/30954; Potillegent™ 기술 (Biowa, Inc.Princeton, N.J.); 및 GlycoMAb® 글리코실화 조작 기술 (Glycart biotechnology AG, Zurich, Switzerland). 또한, 예를 들어, 하기 참조: Ferrara C et al., (2006) Biotechnol Bioeng 93:851-861; 국제 공개 번호 WO 07/039818; WO 12/130831; WO 99/054342; WO 03/011878; 및 WO 04/065540.
특정 구현예에서는, 본원에 기재된 불변 영역 돌연변이 또는 변형 중 임의의 것을 2개의 중쇄 불변 영역을 갖는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 하나 또는 둘 다의 중쇄 불변 영역 내로 도입할 수 있다.
또 다른 특별한 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기서 (i) 중쇄는 표 1에 나열된 항체의 VH CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 아미노산 서열 (예: 서열 번호:458-460, 35-37, 또는 65-67)을 포함하는 VH를 포함하고; (ii) 경쇄는 표 2에 나열된 동일한 항체의 VL CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3 아미노산 서열 (예: 서열 번호:461-463, 38-40, 또는 68-70)을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; (iii) 중쇄는 인간 IgG1 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 불변 중쇄 도메인을 추가로 포함하고; (iv) 경쇄는 인간 카파 경쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 불변 경쇄 도메인을 추가로 포함한다.
또 다른 특별한 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하며, 여기서 (i) 중쇄는 표 3에 나열된 항체의 아미노산 서열 (예: 서열 번호: 464, 41, 또는 71)을 포함하는 VH를 포함하고; (ii) 경쇄는 표 4에 나열된 동일한 항체의 아미노산 서열 (예: 서열 번호: 42 또는 73)을 포함하는 VL 도메인을 포함하고; (iii) 중쇄는 인간 IgG1 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 불변 중쇄 도메인을 추가로 포함하고; (iv) 경쇄는 인간 카파 경쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 불변 경쇄 도메인을 추가로 포함한다.
구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 T 세포 체크포인트 차단 활성을 나타낸다. T 세포 체크포인트 차단 활성을 측정하는 예시적 방법이 본원 실시예 7 및 11에서 제공된다. 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 T 세포에서 인터페론-감마 (IFNγ) 생성을 증가시킨다. IFNγ 생성을 측정하는 예시적 방법이 본원 실시예 7 및 11에서 제공된다. 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 T 세포 증식을 증가시킨다. T-세포 증식을 측정하는 예시적 방법이 본원 실시예 7에서 제공된다. 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD4+ T 세포 증식을 증가시킨다. CD4+ T-세포 증식을 측정하는 예시적 방법이 본원 실시예 7에서 제공된다. 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD8+ T 세포 증식을 증가시킨다. CD8+ T-세포 증식을 측정하는 예시적 방법이 본원 실시예 7에서 제공된다.
구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 나타낸다. 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 300,000개 세포 표면 B7-H4 분자 (예: SK-BR-3 세포)를 갖는 세포 라인 상에서 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 나타낸다. 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 100,000개 세포 표면 B7-H4 분자 (예: HCC 1569 세포)를 갖는 세포 라인 상에서 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 나타낸다. 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 50,000개 세포 표면 B7-H4 분자 (예: ZR-75-1 세포)를 갖는 세포 라인 상에서 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 나타낸다. 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 30,000개 세포 표면 B7-H4 분자 (예: MDA-MB-468 세포)를 갖는 세포 라인 상에서 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 나타낸다. 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 적어도 15,000개 세포 표면 B7-H4 분자 (예: HCC1964 세포)를 갖는 세포 라인 상에서 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 나타낸다. ADCC 활성을 측정하는 예시적 방법이 본원 실시예 13에서 제공된다.
구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 인간 프레임워크 영역인 또는 인간 프레임워크 영역으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예: VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 프레임워크 영역)을 포함한다. 인간 프레임워크 영역의 비-제한적 예는 당업계에 기재되어 있으며, 예를 들어, 상기 문헌 [Kabat EA et al., (1991)]을 참조한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 영장류 (예: 비-인간 영장류) 프레임워크 영역인 또는 영장류 (예: 비-인간 영장류) 프레임워크 영역으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예: VH 도메인 및/또는 VL 도메인의 프레임워크 영역)을 포함한다.
특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 상기 표 5에 기재된 항체에 대한 본원에 기재된 아미노산 서열을 갖는 1, 2개 또는 그 이상의 VH 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다 (상기 서열의 예: 서열 번호:465, 466, 467, 및/또는 469; 서열 번호:235, 236, 237 및/또는 238; 또는 서열 번호:265, 266, 267, 및/또는 268). 일부 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 상기 표 6에 기재된 항체에 대한 본원에 기재된 아미노산 서열을 갖는 1, 2개 또는 그 이상의 VL 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다 (상기 서열의 예: 서열 번호:239, 240, 241, 및/또는 242 또는 서열 번호:269, 270, 271, 및/또는 272). 구체적 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 상기 표 5에 기재된 항체에 대한 본원에 기재된 아미노산 서열을 갖는 1, 2개 또는 그 이상의 VH 프레임워크 영역, 및 상기 표 6에 기재된 동일한 항체에 대한 본원에 기재된 아미노산 서열을 갖는 1, 2개 또는 그 이상의 VL 프레임워크 영역을 포함한다 (상기 서열의 예: (i) 서열 번호:465, 466, 467, 및/또는 469 및 서열 번호:239, 240, 241, 및/또는 242; (ii) 서열 번호:235, 236, 237 및/또는 238 및 서열 번호:239, 240, 241, 및/또는 242 또는 (iii) 서열 번호:265, 266, 267, 및/또는 268 및 서열 번호:269, 270, 271, 및/또는 272).
특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 상기 표 5에서의 본원에 기재된 VH 프레임워크 영역과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다. 특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 상기 표 6에서의 본원에 기재된 VL 프레임워크 영역과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다. 일부 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 상기 표 5에서의 본원에 기재된 VH 프레임워크 영역과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 프레임워크 영역 (FR), 및 상기 표 6에서의 본원에 기재된 VL 프레임워크 영역과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 프레임워크 영역 (FR)을 포함한다.
특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 20502 또는 22213의 VH 도메인의 아미노산 서열 (예: 서열 번호:464 또는 71)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하며, 여기서 항체는 20502 또는 22213의 VH CDR (예: 서열 번호:458-460 또는 65-67)과 동일한 VH CDR을 포함한다.
특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 20502 또는 22213의 VL 도메인의 아미노산 서열 (예: 서열 번호:42 또는 72)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 20502 또는 22213의 VL CDR (예: 서열 번호:461-463 또는 68-70)과 동일한 VL CDR을 포함한다.
특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함하며:(i) 20502 또는 22213의 VH 도메인의 아미노산 서열 (예: 서열 번호:464 또는 71)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인; 및 (ii) 20502 또는 22213의 VL 도메인의 아미노산 서열 (예: 서열 번호:42 또는 72)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인, 여기서 항체는 20502 또는 22213의 VH CDR 및 VL CDR (예: 서열 번호:458-463 또는 서열 번호:65-70)과 동일한 VH CDR 및 VL CDR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예: 20502 또는 22213)과 동일한 B7-H4의 에피토프 (예: 인간 B7-H4의 에피토프)에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 20502.1 또는 22213의 VH 도메인의 아미노산 서열 (예: 서열 번호:41 또는 71)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인을 포함하고, 여기서 항체는 20502.1 또는 22213의 VH CDR과 동일한 VH CDR을 포함한다 (상기 서열의 예: 서열 번호:35-37 또는 65-67).
특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 20502.1 또는 22213의 VL 도메인의 아미노산 서열 (예: 서열 번호:42 또는 72)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하고, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 20502.1 또는 22213의 VL CDR (예: 서열 번호:38-40 또는 68-70)과 동일한 VL CDR을 포함한다.
특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기를 포함하며:(i) 20502.1 또는 22213 VH 도메인의 아미노산 서열 (예: 서열 번호:41 또는 71)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인; 및 (ii) 20502.1 또는 22213의 VL 도메인의 아미노산 서열 (예: 서열 번호:42 또는 72)과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인, 여기서 항체는 20502.1 또는 22213의 VH CDR 및 VL CDR (예: 서열 번호:35-40 또는 서열 번호:65-70)과 동일한 VH CDR 및 VL CDR을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예: 20502.1 또는 22213)과 동일한 B7-H4의 에피토프 (예: 인간 B7-H4의 에피토프)에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
경쟁 결합 검정을 사용하여 두 항체가 오버랩핑 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정할 수 있다. 경쟁 결합은, 시험 하의 면역글로불린이 공통 항원, 예컨대 B7-H4에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정에서 측정될 수 있다. 수많은 유형의 경쟁 결합 검정이 공지되어 있고 예를 들어 하기와 같다: 고체 상 직접 또는 간접 방사면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정 (하기 참조: Stahli C et al., (1983) Methods Enzymol 9:242-253); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (하기 참조: Kirkland TN et al., (1986) J Immunol 137:3614-9); 고체 상 직접 라벨링 검정, 고체 상 직접 라벨링 샌드위치 검정 (하기 참조: Harlow E & Lane D, (1988) Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); I-125 라벨을 사용한 고체 상 직접 라벨 RIA (하기 참조: Morel GA et al., (1988) Mol Immunol 25(1):7-15); 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA (Cheung RC et al., (1990) Virology 176:546-52); 및 직접 라벨링 RIA.(Moldenhauer G et al., (1990) Scand J Immunol 32:77-82). 전형적으로, 이러한 검정은, 비-라벨링 시험 면역글로불린 및 라벨링 참조 면역글로불린, 이들 중 한쪽을 보유하는 세포 또는 고체 표면에 결합된 정제된 항원 (예: B7-H4, 예컨대 인간 B7-H4)의 사용을 포함한다. 경쟁 억제는, 시험 면역글로불린의 존재 하에 세포 또는 고체 표면에 결합된 라벨의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다. 통상적으로 시험 면역글로불린은 과량으로 존재한다. 통상적으로, 경쟁 항체가 과량으로 존재하는 경우, 이는 적어도 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 이상만큼 공통 항원에 대한 참조 항체의 특이적 결합을 억제할 것이다. 경쟁 결합 검정은 라벨링 항원 또는 라벨링 항체를 사용하여 다수의 상이한 포맷으로 구성될 수 있다. 이 검정의 통상적 버전에서는, 항원을 96-웰 플레이트 상에 부동화시킨다. 이어서, 비-라벨링 항체가 항체에 대한 라벨 항체의 결합을 차단하는 능력을 방사성 또는 효소 라벨을 사용하여 측정한다. 추가의 상세사항에 대해서는, 예를 들어, 하기를 참조한다: Wagener C et al., (1983) J Immunol 130:2308-2315; Wagener C et al., (1984) J Immunol Methods 68:269-274; Kuroki M et al., (1990) Cancer Res 50:4872-4879; Kuroki M et al., (1992) Immunol Invest 21:523-538; Kuroki M et al., (1992) Hybridoma 11:391-407 및 Antibodies:A Laboratory Manual, Ed Harlow E & Lane D editors supra, pp. 386-389.
하나의 구현예에서는, 경쟁 검정을, 표면 플라즈몬 공명 (BIAcore®)을 사용하여, 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 것과 같은 ‘탠덤 접근에 의해' 수행하고: Abdiche YN et al., (2009) Analytical Biochem 386:172-180, 이로써 B7-H4 항원을 클립 표면, 예를 들어, CM5 센서 클립 상에 부동화시키고, 이어서 항-B7-H4 항체를 클립 상으로 진행시킨다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에 기재된 항-B7-H4 항체와 경쟁하는지를 결정하기 위해서는, 항-B7-H4 항체를 먼저 클립 표면 상으로 진행시켜 포화를 달성하고, 이어서 잠재적 경쟁 항체를 첨가한다. 이어서, 경쟁 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합을 결정하고, 비-경쟁 대조군에 대하여 정량화할 수 있다.
하나의 구현예에서는, Fortebio Octet 경쟁 결합 (예를 들어 하기 실시예 2에 기재됨)을 사용하여, B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 B7-H4에 대한 B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합을 경쟁적으로 억제하는 것을 결정한다.
또 다른 양태에서, 당업자에게 공지된 또는 본원에 기재된 검정 (예: ELISA 경쟁 검정, 또는 현탁 어레이 또는 표면 플라즈몬 공명 검정)을 사용하여 측정시, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예: 20502, 20502.1 또는 22213)을 B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 대한 결합으로부터 경쟁적으로 억제하는 (예를 들어 용량 의존적 방식으로) 항체가 본원에서 제공된다.
구체적 양태에서, 서열 번호:464에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열 번호:42에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들어 용량 의존적 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
구체적 양태에서, 서열 번호:41에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열 번호:42 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들어 용량 의존적 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
구체적 양태에서, 서열 번호:71에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VH 도메인, 및 서열 번호:72에 기재된 아미노산 서열을 갖는 VL 도메인을 포함하는 항체의, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들어 용량 의존적 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
구체적 양태에서, (i) 표 1에 나열된 VH CDR의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 도메인; 및 (ii) 표 2에 나열된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체와, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 대한 결합을 경쟁적으로 억제하는 (예를 들어 용량 의존적 방식으로) 항체 또는 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
구체적 양태에서, 20502, 20502.1, 또는 22213의 것과 동일한 B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 본원에서 제공된다.
또 다른 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, (i) 표 1에 나열된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 VH CDR1, VH CDR2, 및 VH CDR3을 포함하는 VH 도메인 및 (ii) 표 2에 나열된 CDR의 아미노산 서열을 갖는 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는 VL 도메인을 포함하는 항체의 것과 동일한 B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에피토프에 면역특이적으로 결합한다.
구체적 양태에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는, 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 Fab, Fab', F(ab')2, 또는 scFv는 본원에 기재된 바와 같은 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 서열 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. Fab, Fab', F(ab')2, 또는 scFv는, 하기 섹션 5.3에서 논의되는 것들을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 생성될 수 있다. 특정 구현예에서, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 scFv는 생체내에서 항체의 반감기를 연장시키는 모이어티를 추가로 포함한다. 모이어티는 또한 "반감기 연장 모이어티"라 불린다. 생체내에서의 Fab, Fab', F(ab')2, 또는 scFv의 반감기를 연장시키기 위한 당업자에게 공지된 임의의 모이어티가 사용될 수 있다. 예를 들어, 반감기 연장 모이어티는 Fc 영역, 중합체, 알부민, 또는 알부민 결합 단백질 또는 화합물을 포함할 수 있다. 중합체는 천연 또는 합성, 임의로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌, 폴리옥시알킬렌, 폴리사카라이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리비닐 알콜, 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐, 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 치환체는 하나 이상의 히드록시, 메틸, 또는 메톡시 기를 포함한다. 특정 구현예에서, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 scFv는 반감기 연장 모이어티의 부착을 위한 하나 이상의 C-말단 아미노산의 부가에 의해 변형될 수 있다. 특정 구현예에서 반감기 연장 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜 또는 인간 혈청 알부민이다. 특정 구현예에서, Fab, Fab', F(ab')2, 또는 scFv는 Fc 영역에 융합된다.
항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출가능한 라벨 또는 물질에 융합 또는 컨쥬게이션 (예를 들어 공유 또는 비-공유 연결)될 수 있다. 검출가능한 라벨 또는 물질의 예는 효소 라벨, 예컨대, 글루코스 옥시다제; 방사성동위원소, 예컨대 아이오딘 (125I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 트리튬 (3H), 인듐 (121In), 및 테크네튬 (99Tc); 발광성 라벨, 예컨대 루미놀; 및 형광 라벨, 예컨대 플루오레세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다. 이러한 라벨 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 B7-H4 (예: 인간 B7-H4) 단백질을 검출할 수 있다. 예를 들어, 하기 섹션 5.5.2 참조.
항체 생성
B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 항체 및 그의 항원-결합 단편은, 항체 및 그의 항원-결합 단편의 합성에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 화학적 합성에 의해 또는 재조합 발현 기술에 의해 생성될 수 있다. 본원에 기재된 방법은, 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 유전자 분석, 재조합 DNA, 유기 화학, 생화학, PCR, 올리고뉴클레오티드 합성 및 변형, 핵산 혼성화, 및 당업계의 기술 내에 있는 관련 분야에서의 종래 기술을 사용한다. 이들 기술은, 예를 들어, 본원에서 인용된 참조문헌에 기재되어 있고, 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어 하기 참조: Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 및 annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 및 annual updates) Gait (ed.)(1984) Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.)(1991) Oligonucleotides 및 Analogues:A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (eds.)(1999) Genome Analysis:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
특정 양태에서, 본원에 기재된 세포 또는 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편의 제조 방법이 본원에서 제공된다. 특정 양태에서, 본원에 기재된 세포 또는 숙주 세포 (예: 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 또는 숙주 세포)를 사용하여 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현시키는 (예: 재조합 발현시키는) 것을 포함하는, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조 방법이 본원에서 제공된다. 특별한 구현예에서, 세포는 단리된 세포이다. 특별한 구현예에서는, 외인적 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되었다. 특별한 구현예에서, 방법은 세포 또는 숙주 세포로부터 얻어진 항체 또는 항원-결합 단편의 정제 단계를 추가로 포함한다.
폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 하기 참조: Chapter 11 in:Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., eds., John Wiley 및 Sons, New York).
모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 하이브리도마, 재조합, 및 파지 디스플레이 기술, 이스트 기반 제시 기술, 또는 이들의 조합의 사용을 포함한 당업계에 공지된 폭넓게 다양한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 당업계에 공지된, 또한 예를 들어 하기 문헌에 교시된 것들을 포함한 하이브리도마 기술을 사용하여 생성될 수 있거나: Harlow E & Lane D, Antibodies:A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ et al., in:Monoclonal Antibodies 및 T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981), 또는 하기 문헌에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다: Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256:495.본원에 기재된 항체를 선택하고 생성하기 위해 사용될 수 있는 이스트 기반 제시 방법의 예는, 예를 들어, WO2009/036379A2; WO2010/105256; 및 WO2012/009568에 기재된 것들을 포함하고, 이는 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
구체적 구현예에서, 모노클로날 항체 또는 항원-결합 단편은 클로날 세포 (예: 재조합 항체 또는 항원-결합 단편을 생성하는 하이브리도마 또는 숙주 세포)에 의해 생성된 항체 또는 항원-결합 단편이고, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은, 예를 들어, 당업계에 공지된 또는 본원에서 제공된 실시예에서의 ELISA 또는 다른 항원-결합 검정에 의해 측정시 B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합한다. 특별한 구현예에서, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 키메라 또는 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 특정 구현예에서, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 Fab 단편 또는 F(ab')2 단편일 수 있다. 본원에 기재된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 예를 들어, 하기 문헌에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나: Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256:495, 또는 예를 들어, 예로서 본원에 기재된 바와 같은 기술을 사용하여 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 클로날 세포 라인 및 그에 의해 발현되는 모노클로날 항체 및 그의 항원-결합 단편의 다른 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 하기 참조: Chapter 11 in:Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al. (상기 참조)).
본원에 기재된 항체의 항원-결합 단편은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 Fab 및 F(ab')2 단편은, 파파인 (Fab 단편 제조를 위해) 또는 펩신 (F(ab')2 단편 제조를 위해) 등의 효소를 사용한, 면역글로불린 분자의 단백분해 분열에 의해 생성될 수 있다. Fab 단편은 테트라머 항체 분자의 2개의 동일한 아암(arm) 중 하나에 상응하고 중쇄의 VH 및 CH1 도메인과 쌍을 이룬 완전 경쇄를 함유한다. F(ab')2 단편은 힌지 영역 내의 디술피드 결합에 의해 연결된 테트라머 항체 분자의 2개의 항원-결합 아암을 함유한다.
또한, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 또한, 당업계에 공지된 다양한 파지 디스플레이 및/또는 이스트 기반 제시 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 파지 디스플레이 방법에서는, 단백질을 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 파지 입자의 표면 상에서 디스플레이한다. 특히, VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 동물 cDNA 라이브러리 (예: 침범된 조직의 인간 또는 뮤린 cDNA 라이브러리)로부터 증폭시킬 수 있다. VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA를 PCR에 의해 scFv 링커와 함께 재조합하고 파지미드 벡터로 클로닝한다. 벡터를 대장균에서 전기천공하고, 대장균을 헬퍼 파지로 감염시킨다. 이들 방법에서 사용되는 파지는 전형적으로 fd 및 M13을 포함하는 사상 파지이고, VH 및 VL 도메인은 통상적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII에 재조합 융합된다. 특별한 항원에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현하는 파지를 선택하거나, 예를 들어, 고체 표면 또는 비드에 결합 또는 포획된 항원 또는 라벨링 항원을 사용하여, 항원으로 동정할 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 단편의 제조를 위해 사용될 수 있는 파지 디스플레이 방법의 예는 하기에 개시된 것들을 포함한다: Brinkman U et al., (1995) J Immunol Methods 182:41-50; Ames RS et al., (1995) J Immunol Methods 184:177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur J Immunol 24:952-958; Persic L et al., (1997) Gene 187:9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57:191-280; PCT 출원 번호 PCT/GB91/001134; 국제 공개 번호 WO 90/02809, WO 91/10737, WO 92/01047, WO 92/18619, WO 93/1 1236, WO 95/15982, WO 95/20401, 및 WO 97/13844; 및 미국특허 번호 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743, 및 5,969,108.
인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 임의의 부류의 면역글로불린, 예컨대 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 임의의 이소타입, 예컨대 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택될 수 있다.
1.2.1 폴리뉴클레오티드
특정 양태에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4) 항원에 면역특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 도메인 (예: 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 벡터, 예를 들어, 숙주 세포 (예: 대장균 및 포유류 세포)에서의 재조합 발현을 위한 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에서 제공된다.
특별한 양태에서, B7-H4 폴리펩티드 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하고 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 뿐만 아니라 B7-H4 폴리펩티드에 대한 결합에 대하여 이러한 항체 또는 항원-결합 단편과 경쟁하는 (예를 들어 용량-의존적 방식으로), 또는 이러한 항체 또는 항원-결합 단편의 것과 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.
또한, 서열 번호:11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 464, 42, 51, 52, 61, 62, 71, 72, 81, 82, 91, 92, 101, 102, 111, 112, 121, 122, 131, 132, 141, 142, 151, 152, 161, 162, 171, 172, 181, 182, 191, 192, 201, 및 202로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 B7-H4에 면역특이적으로 결합한다.
또한, 서열 번호:13, 14, 23, 24, 33, 34, 43, 469, 44, 53, 54, 63, 64, 73, 74, 83, 84, 93, 94, 103, 104, 113, 114, 123, 124, 133, 134, 143, 144, 153, 154, 163, 164, 173, 174, 183, 184, 193, 194, 203, 및 204로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 B7-H4에 면역특이적으로 결합한다.
또한, 예를 들어, 표 9에 나타낸 가변 중쇄-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공되며, 여기서 코딩된 가변 중쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 B7-H4에 결합한다.
표 9:가변 중쇄-코딩 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
또한, 표 10에 나타낸 가변 경쇄-코딩 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공되며, 여기서 코딩된 가변 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 B7-H4에 결합한다.
표 10: 가변 경쇄-코딩 폴리뉴클레오티드 서열
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
또한, 서열 번호:213, 214, 223, 224, 233, 234, 243, 470, 244, 253, 254, 263, 264, 273, 274, 283, 284, 293, 294, 303, 304, 313, 314, 323, 324, 333, 334, 343, 344, 353, 354, 363, 364, 373, 374, 383, 384, 393, 394, 403, 또는 404의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 또한, (i) 서열 번호:213, 214, 223, 224, 233, 234, 243, 470, 244, 253, 254, 263, 264, 273, 274, 283, 284, 293, 294, 303, 304, 313, 314, 323, 324, 333, 334, 343, 344, 353, 354, 363, 364, 373, 374, 383, 384, 393, 394, 403, 또는 404의 뉴클레오티드 서열 및 (ii) 서열 번호:408 또는 406의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.
또한, 서열 번호:11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 464, 42, 51, 52, 61, 62, 71, 72, 81, 82, 91, 92, 101, 102, 111, 112, 121, 122, 131, 132, 141, 142, 151, 152, 161, 162, 171, 172, 181, 182, 191, 192, 201, 또는 202를 코딩하고, 각각, 서열 번호:213, 214, 223, 224, 233, 234, 243, 470, 244, 253, 254, 263, 264, 273, 274, 283, 284, 293, 294, 303, 304, 313, 314, 323, 324, 333, 334, 343, 344, 353, 354, 363, 364, 373, 374, 383, 384, 393, 394, 403, 또는 404와 적어도 약 80%, 85%, 또는 90% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.
또한, 서열 번호:11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 464, 42, 51, 52, 61, 62, 71, 72, 81, 82, 91, 92, 101, 102, 111, 112, 121, 122, 131, 132, 141, 142, 151, 152, 161, 162, 171, 172, 181, 182, 191, 192, 201, 또는 202를 코딩하고, 각각, 서열 번호:213, 214, 223, 224, 233, 234, 243, 470, 244, 253, 254, 263, 264, 273, 274, 283, 284, 293, 294, 303, 304, 313, 314, 323, 324, 333, 334, 343, 344, 353, 354, 363, 364, 373, 374, 383, 384, 393, 394, 403, 또는 404와 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.
또한, 서열 번호:11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 464, 42, 51, 52, 61, 62, 71, 72, 81, 82, 91, 92, 101, 102, 111, 112, 121, 122, 131, 132, 141, 142, 151, 152, 161, 162, 171, 172, 181, 182, 191, 192, 201, 또는 202를 코딩하고, 각각, 서열 번호:213, 214, 223, 224, 233, 234, 243, 470, 244, 253, 254, 263, 264, 273, 274, 283, 284, 293, 294, 303, 304, 313, 314, 323, 324, 333, 334, 343, 344, 353, 354, 363, 364, 373, 374, 383, 384, 393, 394, 403, 또는 404와 적어도 약 96% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.
또한, 서열 번호:11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 464, 42, 51, 52, 61, 62, 71, 72, 81, 82, 91, 92, 101, 102, 111, 112, 121, 122, 131, 132, 141, 142, 151, 152, 161, 162, 171, 172, 181, 182, 191, 192, 201, 또는 202를 코딩하고, 각각, 서열 번호:213, 214, 223, 224, 233, 234, 243, 470, 244, 253, 254, 263, 264, 273, 274, 283, 284, 293, 294, 303, 304, 313, 314, 323, 324, 333, 334, 343, 344, 353, 354, 363, 364, 373, 374, 383, 384, 393, 394, 403, 또는 404와 적어도 약 97% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.
또한, 서열 번호:11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 464, 42, 51, 52, 61, 62, 71, 72, 81, 82, 91, 92, 101, 102, 111, 112, 121, 122, 131, 132, 141, 142, 151, 152, 161, 162, 171, 172, 181, 182, 191, 192, 201, 또는 202를 코딩하고, 각각, 서열 번호:213, 214, 223, 224, 233, 234, 243, 470, 244, 253, 254, 263, 264, 273, 274, 283, 284, 293, 294, 303, 304, 313, 314, 323, 324, 333, 334, 343, 344, 353, 354, 363, 364, 373, 374, 383, 384, 393, 394, 403, 또는 404와 적어도 약 98% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.
또한, 서열 번호:11, 12, 21, 22, 31, 32, 41, 464, 42, 51, 52, 61, 62, 71, 72, 81, 82, 91, 92, 101, 102, 111, 112, 121, 122, 131, 132, 141, 142, 151, 152, 161, 162, 171, 172, 181, 182, 191, 192, 201, 또는 202를 코딩하고, 각각, 서열 번호:213, 214, 223, 224, 233, 234, 243, 470, 244, 253, 254, 263, 264, 273, 274, 283, 284, 293, 294, 303, 304, 313, 314, 323, 324, 333, 334, 343, 344, 353, 354, 363, 364, 373, 374, 383, 384, 393, 394, 403, 또는 404와 적어도 약 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.
특정 양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 항원-결합 단편의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 항체의 VH FR 및 CDR (예를 들어 표 1 및 5 참조)을 포함하는 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 항체의 VL FR 및 CDR (예를 들어 표 2 및 6 참조)을 포함하는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
구체적 구현예에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:464에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 코딩한다. 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:42에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 코딩한다.
구체적 구현예에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:41에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 코딩한다. 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:42에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 코딩한다.
구체적 구현예에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:71에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VH 도메인을 코딩한다. 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 서열 번호:72에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 VL 도메인을 코딩한다.
특별한 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 항체 중 어느 하나의 VH CDR1, VH CDR2, VH VL CDR3 (예를 들어 표 1 참조)을 함유하는 3개의 VH 사슬 CDR을 포함하는 항-B7-H4 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 구체적 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 항체 중 어느 하나의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 (예를 들어 표 2 참조)을 함유하는 3개의 VL 사슬 CDR을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 구체적 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 항체 중 어느 하나의 VH CDR1, VH CDR2, VH VL CDR3 (예를 들어 표 1 참조)을 함유하는 3개의 VH 사슬 CDR, 및 예를 들어, 본원에 기재된 항체 중 어느 하나의 VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3 (예를 들어 표 2 참조)을 함유하는 3개의 VL 사슬 CDR을 포함하는 항-B7-H4 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.
특별한 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (예를 들어 표 1 및 5 참조, 예를 들어, 표에 명칭으로 동정된 특별한 항체의 VH CDR 및 VH FR)를 함유하는 VH 도메인을 포함하는 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편이 본원에서 제공된다. 구체적 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 (예를 들어 표 2 및 6 참조, 예를 들어, 표에 명칭으로 동정된 특별한 항체의 VL CDR 및 VL FR)를 함유하는 VL 도메인을 포함하는 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편이 본원에서 제공된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 아미노산 서열 (예: 서열 번호:464, 41, 또는 71)을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역을 함유하는 항체는 B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 본원에서 제공된 중쇄 가변 영역-코딩 서열 (예: 서열 번호:470, 243, 또는 273의 가변 영역-코딩 부분)을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역을 함유하는 항체는 B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 아미노산 서열 (예: 서열 번호:42 또는 72)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 경쇄 가변 영역을 함유하는 항체는 B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 본원에서 제공된 경쇄 가변 영역-코딩 서열 (예: 서열 번호: 244 또는 274의 가변 영역-코딩 부분)을 포함하고, 여기서 중쇄 가변 영역을 함유하는 항체는 B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합한다.
특별한 구현예에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 조합은 B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 조합을 포함하며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 표 3에 기재된 아미노산 서열 (예: 서열 번호:464, 41, 또는 71)을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 인간 감마 (γ) 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함하는 중쇄를 포함한다.
특별한 구현예에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 조합은 B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 조합을 포함하며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 표 4에 기재된 아미노산 서열 (예: 서열 번호:42 또는 72)을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 인간 람다 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
특별한 구현예에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 조합은 B7-H4 (예: 인간 B7-H4) 에 면역특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 조합을 포함하며, 여기서 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, (i) 표 3에 기재된 아미노산 서열 (예: 서열 번호:464, 41, 또는 71)을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 인간 감마 (γ) 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함하는 중쇄 및 (ii) 표 4에 기재된 아미노산 서열 (예: 서열 번호:42 또는 72)을 포함하는 경쇄 가변 도메인 및 인간 람다 경쇄 불변 영역의 아미노산 서열을 포함하는 불변 영역을 포함하는 경쇄를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드의 조합은 서열 번호:470의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호:244의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드의 조합은 서열 번호:243의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호:244의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
하나의 구현예에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드의 조합은 서열 번호:273의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호:274의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
구체적 구현예에서, 본원에 지정된, 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 도메인 (예를 들어 표 1-8 참조)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다.
또한, 예를 들어, 코돈/RNA 최적화, 이종 신호 서열로의 대체, 및 mRNA 불안정성 요소의 제거에 의해 최적화된 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 제공된다. 따라서, 코돈 변화 (예: 유전자 코드의 변성으로 인한 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 변화) 도입 및/또는 mRNA에서의 억제제 영역의 제거에 의한 재조합 발현을 위한 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 도메인 (예: 중쇄, 경쇄, VH 도메인, 또는 VL 도메인)을 코딩하는 최적화된 핵산의 생성 방법은, 예를 들어, 하기에 기재된 최적화 방법을 적합화함으로써 수행할 수 있다: 미국특허 번호 5,965,726; 6,174,666; 6,291,664; 6,414,132; 및 6,794,498.
본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법 (예: PCR 및 다른 분자 클로닝 방법)을 사용하여 적합한 공급원 (예: 하이브리도마)으로부터 핵산으로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 기지의 서열의 3' 및 5' 말단에 대해 혼성화가능한 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭을, 관심 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 얻어진 게놈 DNA를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법을 사용하여 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 얻을 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법을 사용하여 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 얻을 수 있다. 증폭된 핵산을 숙주 세포에서의 발현을 위해, 또한 추가의 클로닝을 위해 벡터로 클로닝하여, 예를 들어, 키메라 및 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 생성할 수 있다.
본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하고, DNA는 이중-가닥형 또는 단일-가닥형일 수 있다. 단일 가닥형의 경우, DNA는 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티센스) 가닥일 수 있다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 내인적 인트론이 결핍된 DNA 또는 cDNA이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 비-천연 발생 폴리뉴클레오티드이다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 재조합 생성된다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 천연 성분으로부터 정제된다.
1.2.2 세포 및 벡터
특정 양태에서, 숙주 세포에서, 바람직하게는 포유류 세포에서의 재조합 발현을 위한 항-B7-H4 항체 및 그의 항원-결합 단편 또는 그의 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 (예: 발현 벡터)가 본원에서 제공된다. 또한, 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예: 인간 또는 인간화된 항체 또는 그의 항원-결합 단편)을 재조합 발현하기 위한 이러한 벡터를 포함하는 세포, 예를 들어 숙주 세포가 본원에서 제공된다. 특별한 양태에서, 숙주 세포에서 이러한 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현시키는 것을 포함하는, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생성 방법이 본원에서 제공된다.
특정 구현예에서, B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 도메인 (예: 본원에 기재된 중쇄 또는 경쇄)의 재조합 발현은, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터의 구성을 포함한다. 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 도메인 (예: 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 얻어지면, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생성을 위한 벡터를 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 재조합 DNA 기술에 의해 생성할 수 있다. 따라서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 도메인 (예: 경쇄 또는 중쇄) 코딩 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의한 단백질의 제조 방법이 본원에 기재된다. 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 도메인 (예: 경쇄 또는 중쇄) 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 대조군 신호를 함유하는 발현 벡터를 구성할 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 또한, 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 중쇄 또는 경쇄, 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능 벡터가 제공된다. 이러한 벡터는, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 (예를 들어 하기 참조: 국제 공개 번호 WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국특허 번호 5,122,464), 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 가변 도메인은 전체 중쇄, 전체 경쇄, 또는 전체 중쇄 및 경쇄 둘 다의 발현을 위해 이러한 벡터로 클로닝될 수 있다.
발현 벡터를 종래 기술에 의해 세포에 전달할 수 있고, 이어서 생성된 세포를 종래 기술에 의해 배양하여 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 6개 CDR, VH, VL, VH 및 VL, 중쇄, 경쇄, 또는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편) 또는 그의 도메인 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 VH, VL, VH 및 VL, 중쇄, 또는 경쇄)을 생성할 수 있다. 따라서, 숙주 세포에서의 해당 서열의 발현을 위해 프로모터에 작동가능하게 연결된, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 6개 CDR, VH, VL, VH 및 VL, 중쇄, 경쇄, 또는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편) 또는 그의 도메인 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 VH, VL, VH 및 VL, 중쇄, 또는 경쇄)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포가 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, 이중-사슬형 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 발현을 위해, 하기에 상술되는 바와 같이, 개별적으로, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 벡터를 전체 면역글로불린의 발현을 위해 숙주 세포에서 공동-발현시킬 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 본원에 기재된 항체의 중쇄 및 경쇄 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 중쇄 및 경쇄) 둘 다 또는 그의 도메인 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 VH 및 VL)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 함유한다. 구체적 구현예에서, 숙주 세포는 2개의 상이한 벡터를 함유하며, 제1 벡터는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제2 벡터는 본원에 기재된 항체 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 6개 CDR을 포함하는 항체)의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역, 또는 그의 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구현예에서, 제1 숙주 세포는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터를 포함하고, 제2 숙주 세포는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 6개 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편)의 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함한다. 구체적 구현예에서, 제1 세포에 의해 발현되는 중쇄/중쇄 가변 영역은 제2 세포의 경쇄/경쇄 가변 영역과 회합되어 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 6개 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편)을 형성한다. 특정 구현예에서, 이러한 제1 숙주 세포 및 이러한 제2 숙주 세포를 포함하는 숙주 세포의 집단이 본원에서 제공된다.
특별한 구현예에서, 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄/경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 및 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편)의 중쇄/중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터의 집단이 본원에서 제공된다. 대안적으로, 코딩하는 단일 벡터가 사용될 수 있고, 이는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 둘 다를 발현할 수 있다.
다양한 숙주-발현 벡터 시스템을 활용하여 본원에 기재된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편)을 발현시킬 수 있다 (예를 들어 하기 참조: 미국특허 번호 5,807,715). 이러한 숙주-발현 시스템은 관심 서열을 생성하고 이어서 정제할 수 있게 하는 비히클을 나타낼 뿐만 아니라, 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 변형 또는 트랜스펙션되는 경우, 계내에서 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이들은 미생물, 예컨대 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 변형된 박테리아 (예: 대장균 및 비. 서브틸리스(B. subtilis)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 이스트 발현 벡터로 변형된 이스트 (예: 사카로미세스 피치아(Saccharomyces Pichia)); 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예: 바쿨로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예: 컬리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 토바코 모자이크 바이러스, TMV)로 감염된 또는 항체 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라즈미드 발현 벡터 (예: Ti 플라즈미드)로 변형된 식물 세포 시스템 (예:녹조, 예컨대 클라미도모나스 레인하르드티(Chlamydomonas reinhardtii)); 또는 포유류 세포의 게놈으로부터 (예: 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유류 바이러스로부터 (예: 아데노바이러스 레이트 프로모터; 박시니아 바이러스 7.5K 프로모터) 유래된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구성물을 은신시키는 포유류 세포 시스템 (예: COS (예: COS1 또는 COS), CHO, BHK, MDCK, HEK 293, NS0, PER.C6, VERO, CRL7O3O, HsS78Bst, HeLa, 및 NIH 3T3, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20 및 BMT10 세포)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편)의 발현을 위한 세포는 CHO 세포, 예를 들어 CHO GS System™ (Lonza)으로부터의 CHO 세포이다. 특별한 구현예에서, 본원에 기재된 항체의 발현을 위한 세포는 인간 세포, 예를 들어, 인간 세포 라인이다. 구체적 구현예에서, 포유류 발현 벡터는 pOptiVEC™ 또는 pcDNA3.3이다. 특별한 구현예에서, 박테리아 세포, 예컨대 대장균, 또는 진핵 세포 (예: 포유류 세포) (특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위한 것)가 재조합 항체 분자의 발현에 사용된다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 주요 중간체 조기 유전자 프로모터 요소와 같은 벡터와 함께 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 포유류 세포가 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다 (Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45:101-105; 및 Cockett MI et al., (1990) Biotechnology 8:662-667). 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CHO 세포 또는 NS0 세포에 의해 생성된다.
추가로, 삽입된 서열의 발현을 조절하는, 또는 요망되는 특이적 방식으로 유전자 생성물을 변형시키고 프로세싱하는 숙주 세포주가 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형 (예: 글리코실화) 및 프로세싱 (예: 분열)은 단백질의 기능에 기여할 수 있다. 이를 위해, 유전자 생성물의 1차 전사, 글리코실화, 및 인산화의 적당한 프로세싱을 위한 세포 기구를 갖는 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유류 숙주 세포는 CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0 (임의의 면역글로불린 사슬을 내인적으로 생성하지 않는 뮤린 골수종 세포 라인), CRL7O3O, COS (예: COS1 또는 COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 및 HsS78Bst 세포를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 구현예에서, 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편)는 포유류 세포, 예컨대 CHO 세포에서 생성된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 (예: 20502, 20502.1, 또는 22213의 CDR을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편)는 Potelligent® CHOK1SV 세포에서 생성된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 포함하며, 기능적 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 (FUT8) 유전자가 결핍되어 있는 숙주 세포가 제공된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 재조합 발현에 의해 생성되면, 이는 면역글로불린 분자의 정제에 대한 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 크로마토그래피 (예: 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 후 특이적 항원에 대한 친화성에 의한 것, 및 사이징 컬럼 크로마토그래피), 원심분리, 용해도 차에 의해, 또는 단백질 정제에 대한 임의의 다른 표준 기술에 의해 정제될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 본원에 기재된 또는 정제를 용이하게 하는 당업계에 달리 공지된 이종 폴리펩티드 서열에 융합될 수 있다.
구체적 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 단리되거나 정제된다. 일반적으로, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 실질적으로 갖지 않는 것이다. 예를 들어, 특별한 구현예에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 제조물은 세포 물질 및/또는 화학적 전구체를 실질적으로 갖지 않는다.
1.3 제약 조성물
생리학상 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA) 중의 요망되는 순도를 갖는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다.
다양한 구현예에서, 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조성물은 제약상 허용가능한 담체와의 제제 중에서 제공된다 (예를 들어 하기 참조: Gennaro, Remington:The Science 및 Practice of Pharmacy with Facts 및 Comparisons:Drugfacts Plus, 20th ed. (2003); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms 및 Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippencott Williams 및 Wilkins (2004); Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed., Pharmaceutical Press (2000)).
본원에 기재된 제약 조성물은 T 세포에 대한 B7-H4의 억제 활성 차단에 있어 및/또는 B7-H4 발현 세포의 ADCC-의존적 고갈에 있어 유용할 수 있다. 본원에 기재된 제약 조성물은 암과 같은 병태의 치료에 있어 유용할 수 있다. 본원에 기재된 방법에 따라 치료될 수 있는 암의 예는, 유방암 (예: 삼중 음성 유방암, 유관 암종), 자궁내막 암종, 난소암, 및 비-소세포 폐암 (예: 편평 세포 암종), 췌장암, 갑상선암, 신장암 (예: 신세포 암종), 및 방광암 (예: 요로상피 세포 암종)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 비-소세포 폐암은, 예를 들어, 선암종일 수 있다. 본원에 기재된 방법에 따라 치료될 수 있는 암의 추가의 예는, 두경부암, 소세포 폐암, 위암, 흑색종, 및 담관암종을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 하나의 구현예에서, 난소암은 장액 선암종이다. 하나의 구현예에서, 유방암은 유관 선암종이다.
본원에 기재된 제약 조성물은 하나의 구현예에서 의약으로서 사용하기 위한 것이다. 본원에 기재된 제약 조성물은 하나의 구현예에서, 예를 들어, 환자 (예: 인간 환자)로부터 얻어진 샘플에서 B7-H4의 존재를 검출하기 위한, 진단제로서 사용하기 위한 것이다.
생체내 투여에 사용되는 조성물은 멸균 상태일 수 있다. 이는, 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
일부 구현예에서, 제약 조성물이 제공되며, 여기서 제약 조성물은 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용가능한 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제약 조성물이 제공되며, 여기서 제약 조성물은 본원에 기재된 아푸코실화된 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용가능한 담체를 포함한다. 구체적 구현예에서, 이러한 제약 조성물은 아푸코실화된 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하며, 예를 들어, 여기서 조성물 중의 항체의 적어도 80%는 아푸코실화된다. 구체적 구현예에서, 이러한 제약 조성물은 아푸코실화된 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하며, 예를 들어, 여기서 조성물 중의 항체의 적어도 85%는 아푸코실화된다. 구체적 구현예에서, 이러한 제약 조성물은 아푸코실화된 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하며, 예를 들어, 여기서 조성물 중의 항체의 적어도 90%는 아푸코실화된다. 구체적 구현예에서, 이러한 제약 조성물은 아푸코실화된 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하며, 예를 들어, 여기서 조성물 중의 항체의 적어도 95%는 아푸코실화된다. 구체적 구현예에서, 이러한 제약 조성물은 아푸코실화된 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하며, 예를 들어, 여기서 조성물 중의 항체의 적어도 96%는 아푸코실화된다. 구체적 구현예에서, 이러한 제약 조성물은 아푸코실화된 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하며, 예를 들어, 여기서 조성물 중의 항체의 적어도 97%는 아푸코실화된다. 구체적 구현예에서, 이러한 제약 조성물은 아푸코실화된 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하며, 예를 들어, 여기서 조성물 중의 항체의 적어도 98%는 아푸코실화된다. 구체적 구현예에서, 이러한 제약 조성물은 아푸코실화된 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하며, 예를 들어, 여기서 조성물 중의 항체의 적어도 99%는 아푸코실화된다. 구체적 구현예에서, 이러한 제약 조성물은 아푸코실화된 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편을 포함하며, 여기서 푸코스는 조성물 중에서 검출불가능하다.
일부 구현예에서, 제약 조성물은, (i) (a) 각각, 서열 번호:458-463의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, (b) 서열 번호:464의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역, 또는 (c) 서열 번호:469의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함한다.
또한, (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 각각, 서열 번호:458-463의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% , 또는 적어도 99%는 아푸코실화된 것인 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:464의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나, 또는 (ii) 항체는 서열 번호:469의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 제약 조성물은 (i) (a) 각각, 서열 번호:35-40의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3, (b) 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역, 또는 (c) 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함한다.
또한, (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, comprise 각각, 서열 번호:35-40의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% , 또는 적어도 99%는 아푸코실화된 것인 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나, 또는 (ii) 항체는 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 제약 조성물은 (i) (a) 각각, 서열 번호:65-70의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열, (b) 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역, 또는 (c) 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함한다.
또한, (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 각각, 서열 번호:65-70의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% , 또는 적어도 99%는 아푸코실화된 것인 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나, 또는 (ii) 항체는 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
1,4 사용 및 방법
1.4.1 치료 용도 및 방법
하나의 양태에서, 하나 이상의 면역 기능의 조절을 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 상기 본원에 기재된 바와 같은 그의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서의 하나 이상의 면역 기능의 조절 방법이 본원에서 제시된다.
또 다른 구현예에서는, 환자에서 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포의 증식을 증가시키기 위해 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제약 조성물을 환자 (예: 인간 환자)에게 투여한다. 또 다른 구현예에서는, 환자에서 인터페론-감마 (IFNγ) 생성을 증가시키기 위해 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제약 조성물을 환자 (예: 인간 환자)에게 투여한다. 또 다른 구현예에서는, 환자에서 T 세포에 대하여 B7-H4의 억제 활성을 차단하기 위해 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제약 조성물을 환자 (예: 인간 환자)에게 투여한다. 또 다른 구현예에서는, 환자에서 B7-H4 발현 암 세포를 고갈시키기 위해 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제약 조성물을 환자 (예: 인간 환자)에게 투여한다. 또 다른 구현예에서는, 상기 효과 중 둘 이상을 달성하기 위해 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제약 조성물을 투여한다.
특정 구현예에서, 암, 예를 들어, B7-H4 발현 암의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 암의 치료 방법은 본원에서 제공되는 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본원에서 제공되는 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물을 이를 필요로 하는 환자 (예: 인간 환자)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 유방암 (예: 삼중 음성 유방암, 유관 암종), 자궁내막 암종, 난소암, 비-소세포 폐암 (예: 편평 세포 암종), 췌장암, 갑상선암, 신장암 (예: 신세포 암종), 및 방광암 (예: 요로상피 세포 암종)으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, 선암종인 비-소세포 폐암의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 특정 구현예에서, 두경부암, 소세포 폐암, 위암, 흑색종, 및 담관암종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, 난소암은 장액 선암종이다. 하나의 구현예에서, 유방암은 유관 선암종이다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 본원에서 제공되는 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 본원에서 제공되는 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 제약 조성물을 이를 필요로 하는 환자 (예: 인간 환자)에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 B7-H4 발현 암이다.
특정 구현예에서, PD-1/PD-L1 억제제 부적절 응답자인 암의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 　 PD-1/PD-L1 억제제 부적절 응답자인 암은, PD-1/PD-L1 억제제에 대하여 미리 반응하였을 수 있지만, PD-1/PD-L1 억제제에 대하여 덜 반응성이 되었을 수 있거나, 또는 암은 PD-1/PD-L1 억제제에 대하여 반응하지 않았을 수 있다. PD-1/PD-L1 억제제에 대한 부적절 응답은, PD-1/PD-L1 억제제의 표준 용량 후 개선이 예상되는 암의 양태가 개선되지 않고/거나, 표준 용량 초과가 투여되는 경우에만 개선이 있음을 의미한다. 　 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 억제제 부적절 응답자인 암을 갖는 대상체는, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 6주, 또는 적어도 12주 동안 표준 용량 수용 후 PD-1/PD-L1 억제제에 대한 부적절 응답을 경험하였거나 경험하고 있다. 　“표준” 용량은 전문 의료진에 의해 결정되고, 대상체의 연령, 체중, 건강 이력, 질환의 중증도, 투여 빈도수 등에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 억제제 부적절 응답자인 암을 갖는 대상체는 항-PD-1 항체 및/또는 항-PD-L1 항체에 대한 부적절 응답을 경험하였거나 경험하고 있다.　일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 억제제 부적절 응답자인 암을 갖는 대상체는 AMP-224에 대한 부적절 응답을 경험하였거나 경험하고 있다. 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 억제제 부적절 응답자인 암을 갖는 대상체는 AMP-224에 대한 부적절 응답을 경험하였거나 경험하고 있다. 　 일부 구현예에서, PD-1/PD-L1 억제제 부적절 응답자인 암을 갖는 대상체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 아테졸리주맙으로부터 선택된 PD-1/PD-L1 억제제에 대한 부적절 응답을 경험하였거나 경험하고 있다.
특정 구현예에서, 낮은 수준의 PD-L1을 발현하는 암의 치료 방법이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, "낮은 수준의 PD-L1"을 발현하는, 또는 "낮은 수준으로 PD-L1"을 발현하는 암은, PD-L1의 수준이, 환자가 PD-L1 발현 수준에 기초한 치료에 대해 선택되는, PD-1 또는 PD-L1 길항제로의 치료에 대해 지시된 암에 대한 발현 수준 하에 있음을 나타낸다. 일부 구현예에서, "낮은 수준의 PD-L1"은 종양에서 세포의 1% 미만이 막 염색을 갖는 것이다. 일부 구현예에서, PD-L1과 관련하여 "낮은 수준"은 종양의 세포의 1% 미만 염색, 예를 들어, 0.9, 0.8, 0.7, 0.6, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1% 또는 0%가 염색됨을 의미한다. 일부 구현예에서, PD-L1 발현 수준은 발색 IHC 또는 면역형광 IHC (아쿠아 스코어링)에 의해 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 5% 이하의 PD-L1 염색 (종양 및/또는 면역 세포 포함)은, 샘플이 "낮은 수준의 PD-L1"을 발현함을 나타낼 수 있다. 특정 구현예에서, 10% 이하의 PD-L1 염색 (종양 및/또는 면역 세포 포함)은, 샘플이 "낮은 수준의 PD-L1"을 발현함을 나타낼 수 있다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 5% 한계치가 본원에서 사용된다 (즉, 5% 이하가 "낮은 수준의 PD-L1"을 나타냄).
또 다른 구현예에서, 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제약 조성물은, 환자에서 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포의 증식을 증가시키기 위해 암으로 진단된 환자 (예: 인간 환자)에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제약 조성물은, 환자에서 인터페론-감마 (IFNγ) 생성을 증가시키기 위해 암으로 진단된 환자 (예: 인간 환자)에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제약 조성물은, 환자에서 T 세포에 대하여 B7-H4의 억제 활성을 차단하기 위해 암으로 진단된 환자 (예: 인간 환자)에게 투여된다. 또 다른 구현예에서, 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제약 조성물은, 환자에서 B7-H4 발현 암 세포를 고갈시키기 위해 암으로 진단된 환자 (예: 인간 환자)에게 투여된다.
추가의 구현예에서, 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제약 조성물은, 환자에게 상기에 제공된 바와 같이, 또한 추가로 추가의 치료제, 예를 들어, 화학요법제 또는 면역 자극제, 예컨대 T 세포 체크포인트 억제제와 조합하여 투여된다.
예시적 구현예에서, 추가의 치료제는 PD-1 길항제, 예컨대 길항제 PD-1 항체이다. 적합한 PD-1 항체는, 예를 들어, OPDIVO (니볼루맙), KEYTRUDA (펨브롤리주맙), 또는 MEDI-0680 (AMP-514; WO2012/145493)을 포함한다. 적합한 PD-1 항체는 또한, 예를 들어, 캄렐리주맙 (SHR-1210), 티슬렐리주맙 (BGB-A317), 또는 스파르탈리주맙 (NPVPDR001, NVS240118, PDR001)을 포함한다. 추가의 치료제는 또한 피딜리주맙 (CT-011)을 포함한다. AMP-224라 불리는, IgG1의 Fc 부분에 융합되는 PD-L2 (B7-DC)의 세포외 도메인으로 구성된 재조합 단백질을 사용하여 PD-1 수용체를 길항시킬 수 있다.
또 다른 예시적 구현예에서, 추가의 치료제는 PD-L1 길항제, 예컨대 길항제 PD-L1 항체이다. 적합한 PD-L1 항체는, 예를 들어, TECENTRIQ (아테졸리주맙), 두르발루맙(MEDI4736), BMS-936559 (WO2007/005874), MSB0010718C (WO2013/79174) 또는 rHigM12B7을 포함한다.
또한 또 다른 예시적 구현예에서, 추가의 치료제는 GITR 효능제, 예컨대 효능제 GITR 항체이다. 적합한 GITR 항체는, 예를 들어, TRX-518 (WO06/105021, WO09/009116), MK-4166 (WO11/028683), 또는 WO2015/031667에 개시된 GITR 항체를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 추가의 치료제는 WO2017/015623에 개시된 GITR 항체이다. 특별한 구현예에서, GITR 항체는 하기로부터 선택된다: a) 서열 번호:411의 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:412의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호:413의 서열을 포함하는 CDR3을 포함하는 GITR 결합 도메인 (GITR-BD)을 포함하는 항체; b) 서열 번호:414의 서열을 포함하는 GITR-BD를 포함하는 항체; c) 구조 (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc를 갖는 폴리펩티드의 2개 카피를 포함하는 4가 분자 (여기서 (i) GITR-BD는 서열 번호: 411의 서열을 포함하는 CDR1, 서열 번호:412의 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열 번호:413의 서열을 포함하는 CDR3을 포함하고, (ii) 링커는 폴리펩티드이고, (iii) 힌지는 면역글로불린 힌지 영역으로부터 유래된 폴리펩티드이고, (iv) Fc는 면역글로불린 Fc 폴리펩티드임); d) 구조 (GITR-BD)-링커-(GITR-BD)-링커-힌지-Fc를 갖는 폴리펩티드의 2개 카피를 포함하는 4가 분자 (여기서 (i) GITR-BD는 서열 번호:414의 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 링커는 폴리펩티드이고, (iii) 힌지는 면역글로불린 힌지 영역으로부터 유래된 폴리펩티드이고, (iv) Fc는 면역글로불린 Fc 폴리펩티드임); 및 e) 서열 번호 415의 서열을 포함하는 2개 카피를 포함하는 4가 분자. 4가 분자의 상기 구현예 중 임의의 것에서, 힌지는 서열 번호:416, 417 또는 418의 서열을 포함할 수 있다. 4가 분자의 상기 구현예 중 임의의 것에서, 링커는 GG, GGG, 및 서열 번호:419-425로부터 선택된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 힌지는 서열 번호:417을 포함하고, 링커는 서열 번호:419-423 중 어느 하나를 포함한다.
또한 또 다른 예시적 구현예에서, 추가의 치료제는 CD80 세포외 도메인 (CD80 ECD), 예를 들어, 서열 번호:426; 또는 CD80 ECD 및 융합 파트너를 포함하는 CD80 ECD 융합 분자 (WO2017/079117에 개시됨)이다. 특정 구현예에서, CD80 ECD 융합 분자는 CD80 ECD-Fc 융합 단백질이다. 구체적 구현예에서, CD80 ECD-Fc 융합 단백질은 서열 번호:427 또는 428의 서열을 포함한다.
또한 또 다른 예시적 구현예에서, 추가의 치료제는 US8,182,813, US8,206,715, US8,263,079, US8,513,199 또는 US9,221,910에 개시된 항-CSF1R 항체이다. 특별한 구현예에서, 항-CSF1R 항체는 하기로부터 선택된다: a) 중쇄 서열 번호:429의 서열을 포함하는 중쇄 서열 및 서열 번호:430의 서열을 포함하는 경쇄 서열을 포함하는 항체; b) 서열 번호:431의 서열을 포함하는 중쇄 (HC) 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 서열 번호:432의 서열을 포함하는 HC CDR2, 및 서열 번호:433의 서열을 포함하는 HC CDR3을 포함하는 중쇄, 및 서열 번호:434의 서열을 포함하는 경쇄 (LC) CDR1, 서열 번호:435의 서열을 포함하는 LC CDR2, 및 서열 번호:436의 서열을 포함하는 LC CDR3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 및 c) 중쇄 서열 번호:437의 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:438의 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체.
통상적으로, 환자는 인간이지만, 트랜스제닉 포유류를 포함한 비-인간 포유류 또한 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 의약으로서의 사용을 위한 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은, 암의 치료 방법에서의 사용을 위한, 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물에 관한 것이다. 일부 양태에서, 본 발명은, 대상체에게 유효량의 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법에서의 사용을 위한, 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물에 관한 것이다.
1.4.1.1 투여 경로 & 투여량
본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물은 다양한 경로, 예컨대 비경구, 피하, 정맥내, 피내, 경피, 비내, 종양내 및 종양 배수 림프절에 대한 투여에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 하나의 구현예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물은 정맥내 경로에 의해 투여된다.
병태의 치료에서 효과적인 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 조성물의 양은 질환의 성질에 따라 달라질 것이다. 조성물에서 사용되는 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 질환의 심각도에 따라 달라질 것이다.
1.4.2 검출 & 진단 용도
본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편 (예를 들어 섹션 5.2 참조)을 사용하여, 면역검정, 예컨대 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA), 면역침전, 또는 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 포함한, 당업자에게 공지된 전형적인 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서의 B7-H4 단백질 수준을 검정할 수 있다. 적합한 항체 검정 라벨은 당업계에 공지되어 있고, 효소 라벨, 예컨대, 글루코스 옥시다제; 방사성동위원소, 예컨대 아이오딘 (125I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 트리튬 (3H), 인듐 (121In), 및 테크네튬 (99Tc); 발광성 라벨, 예컨대 루미놀; 및 형광 라벨, 예컨대 플루오레세인 및 로다민, 및 비오틴을 포함한다. 이러한 라벨을 사용하여 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 라벨링할 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 인식하는 제2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 라벨링하고, 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 조합하여 사용하여 B7-H4 단백질 수준을 검출할 수 있다.
B7-H4 단백질의 발현 수준의 검정은, 제1 생물학적 샘플에서의 B7-H4 단백질의 수준을 직접적으로 (예를 들어 절대적 단백질 수준을 측정 또는 추정함으로써) 또는 상대적으로 (예를 들어 제2 생물학적 샘플에서의 질환 관련 단백질 수준과 비교함으로써) 정량적으로 또는 정성적으로 측정 또는 추정하는 것을 포함하도록 의도된다. 제1 생물학적 샘플에서의 B7-H4 폴리펩티드 발현 수준을 측정 또는 추정하고 표준 B7-H4 단백질 수준과 비교할 수 있고, 여기서 표준은 장애를 갖지 않는 개체로부터 얻어진 제2 생물학적 샘플로부터 얻어지거나 장애를 갖지 않는 개체의 집단으로부터의 수준을 평균냄으로써 결정된다. 당업계에서 인지되는 바와 같이, "표준" B7-H4 폴리펩티드 수준이 알려져 있으면, 이를 비교를 위한 표준으로서 반복적으로 사용할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "생물학적 샘플"은 잠재적으로 B7-H4를 발현하는 대상체, 세포 라인, 조직, 또는 세포의 다른 공급원으로부터 얻어진 임의의 생물학적 샘플을 지칭한다. 동물 (예: 인간)로부터의 조직 생검 및 체액을 얻는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 생물학적 샘플은 말초 단핵 혈액 세포를 포함한다. 생물학적 샘플은 또한, 순환하는 종양 세포 (또는 "CTC")가 B7-H4를 발현하고 검출될 수 있는 혈액 샘플일 수 있다.
본원에 기재된 항-B7-H4 항체는, 널리 공지되고 당업자에게 표준인, 또한 본 설명에 기초한 시험관내 및 생체내 응용을 포함한 예측, 진단, 모니터링 및 스크리닝 응용에 사용될 수 있다. 면역 시스템 상태 및/또는 면역 반응의 예측, 진단, 모니터링 및 스크리닝 검정 및 시험관내 평가 및 사정을 위한 키트를 활용하여, 면역 시스템-기능장애 또는 암을 갖는 것으로 알려진 또는 이것이 의심되는 것들을 포함한 환자 샘플을 평가하기 위해 예측, 진단 및 모니터링할 수 있다. 이러한 유형의 예측 및 진단 모니터링 및 평가는 유방암에서의 HER2 단백질에 대한 항체를 활용하여 이미 실용 중이고 (HercepTestTM, Dako), 여기서 검정은 또한, Herceptin®을 사용한 항체 요법을 위한 환자의 평가에 사용된다. 생체내 응용은 지향 세포 요법 및 면역 시스템 조절 및 면역 반응의 방사선 이미징을 포함한다.
본원에 기재된 항-B7-H4 항체 및 그의 항원-결합 단편은 검출가능 또는 기능적 라벨을 담지할 수 있다. 형광 라벨이 사용되는 경우, 당업계에 공지된 현재 이용가능한 현미경검사 및 형광-활성화된 세포 선별기 분석 (FACS) 또는 두 방법 절차의 조합을 활용하여 특이적 결합 막을 동정하고 정량화할 수 있다. 본원에 기재된 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 형광 라벨을 담지할 수 있다. 예시적 형광 라벨은, 예를 들어, 반응성 및 공액 프로브, 예를 들어, 아미노쿠마린, 플루오레세인 및 텍사스 레드, 알렉사 플루오르 염료, Cy 염료 및 다이라이트 염료를 포함한다. 항-B7-H4 항체는 방사성 라벨, 예컨대 방사성동위원소 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 67Cu, 90Y, 99Tc, 111In, 117Lu, 121I, 124I, 125I, 131I, 198Au, 211At, 213Bi, 225Ac 및 186Re를 담지할 수 있다. 방사성 라벨이 사용되는 경우, 당업계에 공지된 현재 이용가능한 카운팅 절차를 활용하여 B7-H4 (예: 인간 B7-H4)에 대한 항-B7-H4 항체 또는 항원-결합 단편의 특이적 결합을 동정하고 정량화할 수 있다. 라벨이 효소인 경우, 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 현재 활용되는 비색계, 분광광도계, 형광분광광도계, 전류측정 또는 기체측정 기술 중 임의의 것에 의해 달성될 수 있다. 이는, 샘플 또는 대조군 샘플을, 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 B7-H4 사이의 복합체의 형성을 가능하게 하는 조건 하에 항-B7-H4 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 B7-H4 사이에 형성된 임의의 복합체를 검출하고, 샘플 및 대조군에서 비교한다. B7-H4에 대한 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 특이적 결합에 비추어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 사용하여 세포의 표면 상의 B7-H4 발현을 특이적으로 검출할 수 있다. 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 면역친화성 정제를 통한 B7-H4의 정제에 사용할 수도 있다.
예를 들어 B7-H4의 존재 정도의 정량 분석을 위한 시험 키트 형태로 제조될 수 있는 검정 시스템 또한 본원에 포함된다. 시스템 또는 시험 키트는 라벨링된 성분, 예를 들어, 라벨링된 항체 또는 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 추가의 면역화학 시약을 포함할 수 있다. 키트에 대한 추가 사항은 예를 들어 하기 섹션 5.6 참조.
일부 양태에서, 샘플을 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 샘플에서의 B7-H4의 시험관내 검출 방법이 본원에서 제공된다. 일부 양태에서, 샘플에서 B7-H4를 시험관내 검출하기 위한, 본원에서 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도가 본원에서 제공된다. 하나의 양태에서, 대상체에서의 또는 대상체로부터 얻어진 샘플에서의 B7-H4의 검출에서의 사용을 위한 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 하나의 양태에서 진단제로서의 사용을 위한, 본원에서 제공된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 항체는 검출가능 라벨을 포함한다. 하나의 바람직한 구현예에서, B7-H4는 인간 B7-H4이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간이다.
1.5 키트
하나 이상의 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 그의 컨쥬게이트를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다. 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 제약 조성물의 성분 중 하나 이상, 예컨대 본원에서 제공된 하나 이상의 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로 충전된 하나 이상의 컨테이너를 포함하는 제약 팩 또는 키트가 본원에서 제공된다. 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관에 의한 승인을 반영하는, 제약 또는 생물학적 생성물의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 미리 정해진 형태의 고지가, 임의로 이러한 컨테이너(들)과 연합될 수 있다.
또한, 진단 방법에서 사용될 수 있는 키트가 본원에서 제공된다. 하나의 구현예에서, 키트는 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 바람직하게는 정제된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 하나 이상의 컨테이너 내에 포함한다. 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 키트는 대조군으로서 사용될 수 있는 실질적으로 단리된 B7-H4 항원 (예: 인간 B7-H4)을 함유한다. 또 다른 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 키트는 B7-H4 항원과 반응하지 않는 대조군 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 추가로 포함한다. 또 다른 구체적 구현예에서, 본원에 기재된 키트는 B7-H4 항원에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합을 검출하기 위한 하나 이상의 요소를 함유한다 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출가능 기질, 예컨대 형광 화합물, 효소 기질, 방사성 화합물 또는 발광성 화합물, 또는 제1 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 검출가능 기질에 컨쥬게이션될 수 있음을 인식하는 제2 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 컨쥬게이션될 수 있음). 구체적 구현예에서, 본원에서 제공된 키트는 재조합 생성된 또는 화학적으로 합성된 B7-H4 항원을 포함할 수 있다. 키트 내에 제공된 B7-H4 항원은 또한 고체 지지체에 부착될 수 있다. 보다 구체적 구현예에서, 상기에 기재된 키트의 검출 수단은 B7-H4 항원이 부착되는 고체 지지체를 포함한다. 이러한 키트는 또한 비-부착 리포터-라벨링된 항-인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 항-마우스/래트 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 이 구현예에서, B7-H4 항원에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 상기 리포터-라벨링된 항체 또는 항원-결합 단편의 결합에 의해 검출될 수 있다.
하기 실시예는 예로서 제공된 것이며, 제한적인 것은 아니다.
실시예
이 섹션 (즉, 섹션 6)에서 실시예는 예로서 제공된 것이며, 제한적인 것은 아니다.
실시예 1:다중 지시에서의 B7-H4 발현의 우세성 평가
B7-H4 마우스 모노클로날 항체 A57.1 (ATCC 카탈로그 번호 PTA-5180)을 사용하여 기록 샘플 상의 B7-H4의 존재, 전체 섹션의 혼합물, 및 종양 마이크로어레이를 검출하였다. 샘플을 1차 항체로 처리하고, DAB에 부착된 중합체 검출 시스템 (Ventana Medical Systems)을 사용하여 검출하였다.
B7-H4는, 침윤성 유관 암종, 삼중 음성 유방암, 난소암, 비-소세포 폐암 및 자궁내막 암을 포함한, 다양한 암 환자로부터 수확된 종양 조직에서 막 및 시토졸에서 쉽게 검출되었다. (도 1). 또한, 표 11에 나열된 지시에서 발현 빈도수도 높았다.
표 11: 종양에서의 B7-H4 검출
Figure pct00029
B7-H4는 다른 암, 예컨대 신장암 (예: 신세포 암종), 방광암 (예: 요로상피 세포 암종), 췌장암, 및 갑상선암에서도 발현된다. 예를 들어, 하기 참조: Zhu, J., et al., Asian Pacific J. Cancer Prev.14:3011-3015 (2011), Krambeck A, et al., PNAS 103:10391-10396 (2006), Fan, M. et al., Int. J. Clin.Exp. Pathol.7:6768-6775 (2014), Xu, H., et al., Oncology Letters 11:1841-1846 (2016), 및 Liu, W., et al., Oncology Letters 8:2527-2534 (2014).
후속 실험에서, 다양한 종양 유형에서의 B7-H4 우세를 면역조직화학 (IHC)에 의해 평가하였다 (도 1B). 하기 종양 유형 및 질환 단계를 시험하였다: 자궁내막, 유방 침윤성 유관 암종 (IDC), 유방 삼중 음성 (TN), 유방 삼중 음성 (말기), 난소암, 방광암 (조기), 비-소세포 폐암 (sq (편평), 조기), 비-소세포 폐암 (sq, 말기), 두경부암, 방광암 (말기), 소세포 폐암, 담관암종, 비-소세포 폐암 (ad (선암종)), 갑상선암, 췌장암, 위암, 흑색종, 교아종 또는 다형성교아종 (GBM), 및 메르켈 세포 암종.종양 세포 상의 B7-H4 표면 단백질 발현을, 다양한 종양 유형 및 이용가능한 경우 질환의 단계 (조기 (I/II), 말기 (III/IV))로부터의 입수된 종양 샘플 상에서 평가하였다. 항체 A57.1과의 IHC 강도를 카테고리 0 내지 3에 의해 스코어링하였고, 전체 섹션 당 모든 종양 세포의 최소 10% 샘플에서 관찰된 최고 강도에 의해 샘플에 단일 IHC 스코어가 할당되었다. 종양 유형 당 총 50 내지 100개 샘플을 평가하였다.
실시예 2: 인간 B7-H4에 대한 신규 항체의 생성
B7-H4-특이적 항체를 시험관내 이스트 제시 시스템을 사용하여 전장 인간 IgG1 나이브(na
Figure pct00030
ve) 항체 라이브러리로부터 단리하였다. 라이브러리는 면역 시스템을 모방하도록 디자인되고; 이들은 미리 정해진 중쇄 및 경쇄 쌍을 함유하지 않는다. 라이브러리를, B7-H4 단백질을 사용한 포지티브 및 네가티브 선택 전략의 다중 라운드에 적용하여 인간, 및 뮤린 B7-H4 표적에 대해 교차-반응성인 IgG를 풍부화하였다. 4 라운드의 선택 후, 생성된 IgG를 시퀀싱하고, 독특한 항체를 생성시키고, 재조합 B7-H4 엑토도메인에 대한 아비드 및 단량체 결합 친화성, 에피토프 비닝(binning), 및 표적-특이적 세포 결합에 대해 평가하였다.
B7-H4 항체를 생성시키고 특성화하기 위해 사용된 선택, 친화성 성숙, 및 분석 방법에 대한 보다 상세한 설명은 하기에 제공된다.
물질 및 방법
Pierce로부터의 EZ-링크 술포-NHS-비오티닐화 키트를 사용하여 항원을 비오티닐화하였다. 염소 F(ab')2 항-인간 카파-FITC (LC-FITC), ExtrAvidin-PE (EA-PE) 및 Streptavidin-AF633 (SA-633)을 각각 Southern Biotech, Sigma, 및 Molecular Probes로부터 얻었다. Miltenyi Biotec로부터 Streptavidin MicroBeads 및 MACS LC 분리 컬럼을 구입하였다. Southern Biotech로부터 염소 항-인간 IgG-PE (인간-PE)을 얻었다.
나이브 발견
각각 ~109개 다양성을 갖는 8개 나이브 인간 합성 이스트 라이브러리를 이전에 기재된 바와 같이 전파시켰다 (하기 참조: Y.Xu et al, Addressing polyspecificity of antibodies selected from an in vitro yeast presentation system: a FACS-based, high-throughput selection 및 analytical tool.PEDS 26.10, 663-70 (2013); WO2009036379; WO2010105256; 및 WO2012009568.) 최초 2 라운드의 선택에 대하여, Miltenyi MACS 시스템을 활용하는 자기 비드 선별 기술을 수행하였다 (이전에 기재됨) (하기 참조: Siegel et al, High efficiency recovery 및 epitope-specific sorting of an scFv yeast display library."J Immunol Methods 286(1-2), 141-153 (2004). )간단히, 이스트 세포 (~1010 세포/라이브러리)를 30 min 동안 30℃에서 세척 완충제 (인산염 완충 식염수 (PBS)/0.1% 소 혈청 알부민 (BSA)) 중에서 10 ml의 10 nM 비오티닐화된 Fc 융합 항원과 인큐베이션하였다. 40 ml 빙냉 세척 완충제로 1회 세척 후, 세포 펠릿을 20 mL 세척 완충제 중에 재현탁시키고, Streptavidin MicroBeads (500 μl)를 이스트에 첨가하고, 15 min 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 다음으로, 이스트를 펠릿화하고, 20 mL 세척 완충제 중에 재현탁시키고, Miltenyi LS 컬럼 상에 로딩하였다. 20 mL를 로딩한 후, 컬럼을 3 ml 세척 완충제로 3회 세척하였다. 이어서, 컬럼을 자기장으로부터 제거하고, 이스트를 5 mL의 성장 배지로 용리하고, 이어서 밤새 성장시켰다. 하기 라운드의 선택을 유동 세포계측법을 사용하여 수행하였다. 대략 2×107 이스트를 펠릿화하고, 세척 완충제로 3회 세척하고, 평형 조건 하에 비오티닐화된 Fc 융합 항원의 농도를 감소시키며 (10 - 1 nM), 종 교차-반응성을 얻기 위해 상이한 종의 10 nM 비오티닐화된 Fc 융합 항원과, 또는 선택으로부터 비-특이적 항체를 제거하기 위해 다중-특이성 고갈 시약 (PSR)과 30℃에서 인큐베이션하였다. PSR 고갈에 대하여, 라이브러리를 이전에 기재된 바와 같이 비오티닐화된 PSR 시약의 1:10 희석액과 인큐베이션하였다 (하기 참조: Y.Xu et al., addressing polyspecificity of antibodies selected from an in vitro yeast presentation system: a FACS-based, high-throughput selection 및 analytical tool.PEDS 26.10, 663-70 (2013). )이어서, 이스트를 세척 완충제로 2회 세척하고, LC-FITC (희석 1:100) 및 SA-633 (희석 1:500) 또는 EAPE (희석 1:50) 2차 시약으로 15 min 동안 4℃에서 염색하였다. 세척 완충제로 2회 세척 후, 세포 펠릿을 0.3 mL 세척 완충제 중에 재현탁시키고, 스트레이너-캡핑된 선별 튜브로 전달하였다. FACS ARIA 선별기 (BD Biosciences)를 사용하여 선별을 수행하고, 요망되는 특징을 갖는 항체의 선택을 위해 선별 게이트를 결정하였다. 선택 라운드를, 요망되는 특징을 모두 갖는 집단이 얻어질 때까지 반복하였다. 최종 라운드의 선별 후, 이스트를 플레이팅하고, 특성화를 위해 개개의 콜로니를 선택하였다.
항체 최적화
경쇄 배치 셔플 방법을 통해, 또한 이어서 상기에 기재된 바와 같이 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내로 다양성을 도입함으로써 항체의 최적화를 수행하였다. 일부 이들 접근의 조합을 각각의 항체에 대하여 사용하였다.
경쇄 배치 셔플:나이브 선택 결과로부터의 중쇄 플라즈미드를 스매쉬 및 그랩을 통해 이스트로부터 추출하고, 전파시키고, 이어서 대장균으로부터 정제하고, 5 x 106의 다양성을 갖는 경쇄 라이브러리로 변형시켰다. 나이브 발견과 동일한 조건을 사용하는 1 라운드의 MACS 및 4 라운드의 FACS로 선택을 수행하였다.
CDRH1 및 CDRH2 선택:단일 항체의 CDRH3을 1 x 108의 다양성을 갖는 CDRH1 및 CDRH2 변이체를 갖는 미리 제조된 라이브러리로 재조합하고, 나이브 발견에 기재된 바와 같이 1 라운드의 MACS 및 4 라운드의 FACS로 선택을 수행하였다. 각각의 FACS 라운드에 대하여, 라이브러리를 PSR 결합, 종 교차-반응성, 및 친화성 압력에 대해 보고, 요망되는 특징을 갖는 집단을 얻기 위해 선별을 수행하였다. 이들 선택을 위해, 30℃에서 평형 조건 하에 감소하는 농도의 비오티닐화된 HIS-B7-H4 항원 (100 내지 1 nM)을 사용함으로써 친화성 압력을 적용하였다.
VH Mut 선택:오류 경향성 PCR을 통해 중쇄 가변 영역 (VH)을 돌연변이생성시켰다. 이어서, 이 돌연변이생성 VH 및 중쇄 발현 벡터를 모체의 경쇄 플라즈미드를 이미 함유하는 이스트로 변형시킴으로써 라이브러리를 생성하였다. 2 라운드의 FACS 선별을 사용하여 이전 사이클과 유사하게 선택을 수행하였다. 각각의 FACS 라운드에 대하여, 라이브러리를 PSR 결합 및 친화성 압력에 대하여 보고, 요망되는 특징을 갖는 집단을 얻기 위해 선별을 수행하였다. 이들 선택에 대한 친화성 압력을 CDRH1 및 CDRH2 선택에서 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다.
CDRL1 및 CDRL2 선택:단일 항체의 CDRL3을 ~5 x 105의 다양성을 갖는 CDRL1 및 CDRL2 변이체를 갖는 미리 제조된 라이브러리로 재조합하고, 3 라운드의 FACS 선별을 사용하여 이전 사이클과 유사하게 선택을 수행하였다. 각각의 FACS 라운드에 대하여, 라이브러리를 PSR 결합 및 친화성 압력에 대하여 보고, 요망되는 특징을 갖는 집단을 얻기 위해 선별을 수행하였다. 이들 선택에 대한 친화성 압력을 CDRH1 및 CDRH2 선택에서 상기에 기재된 바와 같이 수행하였다.
항체 생성 및 정제
이스트 클론을 포화되도록 성장시키고, 이어서 진탕시키며 48 h 동안 30℃에서 유도하였다. 유도 후, 이스트 세포를 펠릿화하고, 정제를 위해 상청액을 수확하였다. 단백질 A 컬럼을 사용하여 IgG를 정제하고, 아세트산, pH 2.0으로 용리하였다. Fab 단편을 파파인 소화에 의해 생성시키고, KappaSelect (GE Healthcare LifeSciences) 상에서 정제하였다.
ForteBio K D 측정
일반적으로 이전에 기재된 바와 같이 Octet RED384 상에서 ForteBio 친화성 측정을 수행하였다 (하기 참조: Estep et al, High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. Mabs 5(2), 270-278 (2013)). 간단히, AHQ 센서 상으로의 온-라인 IgG 로딩에 의해 ForteBio 친화성 측정을 수행하였다. 센서를 30 min 동안 검정 완충제 중에서 오프-라인 평형화시키고, 이어서 베이스라인 확립을 위해 60초 동안 온-라인 모니터링하였다. 로딩된 IgG를 갖는 완충제를 3분 동안 100 nM 항원에 노출시키고, 그 후 오프-레이트 측정을 위해 3 min 동안 검정 완충제로 전달하였다. 1가 친화성 평가를 위해, IgG 대신에 Fab를 사용하였다. 이 평가를 위해, 비오티닐화되지 않은 Fc 융합 항원을 AHQ 센서 상으로 온-라인 로딩하였다. 센서를 30 min 동안 검정 완충제 중에서 오프-라인 평형화시키고, 이어서 베이스라인 확립을 위해 60초 동안 온-라인 모니터링하였다. 로딩된 항원을 갖는 센서를 3분 동안 100 nM Fab에 노출시키고, 그 후 오프-레이트 측정을 위해 3 분 동안 검정 완충제로 전달하였다. 1:1 결합 모델을 사용하여 모든 동력학을 분석하였다.
ForteBio 에피토프 비닝/리간드 차단
표준 샌드위치 포맷 교차-차단 검정을 사용하여 에피토프 비닝/리간드 차단을 수행하였다. 대조군 항-표적 IgG를 AHQ 센서 상으로 로딩하고, 센서 상의 점유되지 않은 Fc-결합 자리를 비-관련 인간 IgG1 항체로 차단하였다. 이어서, 센서를 100 nM 표적 항원, 그 후 제2 항-표적 항체 또는 리간드에 노출시켰다. 항원 연합 후 제2 항체 또는 리간드에 의한 추가의 결합은 점유되지 않은 에피토프 (비-경쟁자)를 나타내지만, 결합이 없는 것은 에피토프 차단 (경쟁자 또는 리간드 차단)을 나타낸다.
4개의 비-경쟁 항체 ("비닝 항체" 1, 2, 3, 및 4)를 사용하여 SPR에 의해 B7-H4 엑토도메인의 4개의 별개의 부분을 동정하였다. 이어서, 이 캠페인 동안 생성된 모든 항체를 B7-H4 엑토도메인에 대한 이들 4개의 비닝 항체와의 경쟁 결합에 대해 평가하였다. B7-H4 항체가 4개의 비닝 항체 중 1개 (예: 비닝 항체 1)와 경쟁하면, B7-H4 항체를 그 BIN (예: BIN 1)에 있는 것으로 결정하였다. B7-H4 항체가 4개의 비닝 항체 중 2개 (예: 비닝 항체 2 및 3)와 경쟁하면, B7-H4 항체를 이들 BIN 둘 다 (예: BIN 2/3)에 있는 것으로 결정하였다.
IgG 항체는 적어도 2개의 결합 빈에 속하였고, 인간/시노 또는 마우스 B7-H4에 대한 항체 결합의 >90%가 >0.1 nm 내지 <100 nM 범위의 친화성 반응을 가졌다. 재조합 단백질 결합제 중, 대략 75%는 또한 세포 상의 B7-H4에 결합한다.
세포 결합 분석
항원을 과발현하는 100,000개 세포를 세척 완충제로 세척하고, 100 ul 100 nM IgG와 5분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척 완충제로 2회 세척하고, 100ul의 1:100 항-인간 IgGPE와 15분 동안 아이스 상에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세척 완충제로 2회 세척하고, FACS Canto II 분석기 (BD Biosciences) 상에서 분석하였다.
PSR 결합 검정
PSR 검정을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (하기 참조: Xu Y, et al. (2013) Addressing polyspecificity of antibodies selected from an in vitro yeast presentation system:A FACS-based, high-throughput selection 및 analytical tool.Protein Eng Des Sel 26(10):663-670). 간단히, 가용성 막 단백질을 CHO 세포로부터 제조하였다. 풍부화된 막 분획을 NHS-LCBiotin (Pierce, Thermo Fisher)을 사용하여 비오티닐화하였다. 이 다중특이성 시약을 IgG-제시 이스트와 인큐베이션한 후, 세척하였다. 이어서, 2차 라벨링 혼합물 (Extravidin-R-PE, 항-인간 LC-FITC, 및 아이오딘화프로피듐)을 혼합물에 첨가하였다. 샘플을 HTS 샘플 주입기를 사용하여 FACSCanto II 분석기 (BD Biosciences) 상에서 분석하였다. 유동 세포계측법 데이터를 R-PE 채널에서 평균 형광 강도 (MFI)에 대해 분석하여 비특이적 결합을 평가하였다. MFI 값을, 낮은, 중간, 및 높은 PSR MFI 값을 나타내는 3개의 참조 항원에 기초하여 0으로부터 1로 정규화하였다.
동적 스캐닝 형광측정법
10 uL의 20x Sypro Orange를 20 uL의 0.2-1mg/mL mAb 또는 Fab 용액에 첨가한다. RT-PCR 기기 (BioRad CFX96 RT PCR)를 사용하여, 각 온도에서 2분 평형화하며 0.5C 증분으로 40 C로부터 95 C까지 샘플 플레이트 온도를 상승시킨다. 미처리 데이터에 대한 1차 미분의 음수를 사용하여 Tm을 추출한다.
AC-SINS
AC-SINS 검정을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (하기 참조: Liu Y, et al. (2014) High-throughput screening for developability during early-stage antibody discovery using self-interaction nanoparticle spectroscopy.MAbs 6(2):483-492). 간단히, 금 나노입자 (Ted Pella Inc.)를 80% 포획 항-인간 염소 IgG Fc (Jackson ImmunoResearch)로 코팅하고 및 20%는 폴리클로날 염소 비특이적 항체 (Jackson ImmunoResearch)로 코팅하였다. 이어서, 관심 항체를 입자와 2 h 동안 인큐베이션하고, SoftMax Pro6 소프트웨어와 함께 Molecular Devices SpectraMax M2를 사용하여 파장 이동을 측정하였다. 자가-상호작용 클론은 PBS 샘플로부터 떨어져 보다 높은 파장 이동을 나타낸다.
실시예 3:B7-H4에 대한 인간 모노클로날 항체의 구조적 특성화
B7-H4 항체는 인간 IgG1/카파 이소타입이다. 가변 중쇄 (VH) 영역은 생식계열 유전자 VH1, VH3, 및 VH4로부터의 대립유전자로, 또한 가변 경쇄 (VL)은 Vk1 및 Vk3을 포함하는 생식계열 유전자로부터의 대립유전자로 구성된다. 항체의 일부 서브세트는, 72-100%의 범위일 수 있는 VH 및 VL의 각각의 CDR 영역 내에서 높은 동일성을 공유한다. 동일한 생식계열 대립유전자를 공유하는 항체는, 88-100%의 범위인 이들의 VH 및 VL 프레임워크 (FR) 영역에서의 높은 동일성을 갖는다. B7-H4 항체의 서열은 표 1-10에 제공되어 있다.
실시예 4:B7-H4 단백질에 대한 모노클로날 항체 결합의 특성화
B7-H4-세포외 도메인 (ECD)에 대한 항-B7-H4 항체의 결합 친화성을 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정하였다. ForteBio 친화성 검정은 상기 실시예 2에 보다 상세히 기재되어 있다. 간단히, 재조합 인간 B7-H4-huIgG1 (서열 번호:409) 단백질을 단백질 A 팁 상에서 부동화시킨 후, 이소타입 대조군 hIgG1에 대해 수행하여 포획 팁 상의 임의의 남아있는 결합 자리를 포화시켰다. 이어서, 항-B7-H4 항체를 결합에 대해 평가하였다. 추가로, 하기에 대한 항체 결합: 시노몰구스 원숭이 (서열 번호:2) 및 마우스 B7-H4 (서열 번호:3)을 또한 동일한 프로토콜을 사용하여 평가하였다. 결과를 표 12에 요약하였다.
B7-H4-huIgG1:
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:409)
표 12:생물층 간섭측정법에 의한 세포외 도메인에 대한 B7-H4 항체 결합
Figure pct00031
Figure pct00032
추가로, 인간 B7-H4의 N-말단 도메인 (B7-H4 IgV-huIgG1; 서열 번호:410)에 대한 선택된 항-B7-H4 항체의 결합 친화성을 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정하였다. 간단히, 항-인간 Fab 항체를 카르복실-유도체화된 SPR 칩 표면 상에서 부동화시키고, 항-B7-H4 항체를 30초 동안 5 ug/ml로 생성된 표면 상에서 포획하였다. 이어서, 다양한 농도 (0 nM, 3.7 nM, 11.1 nM, 33.3 nM, 100 nM , 및 300 nM)의 B7-H4 IgV-huIgG1을 표면 상으로 유동시키고, 회합기 동안 항-B7-H4 항체에 대하여 결합시킨 후, 해리기 동안 완충제 세척하였다. 데이터를 1:1 결합 모델을 사용하여 핏팅하고, 결과를 표 13에 요약하였다.
B7-H4 IgV-huIgG1:
MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSGSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (서열 번호:410)
표 13:표면 플라즈몬 공명에 의한 N-말단 도메인에 대한 B7-H4 항체 결합
Figure pct00033
따라서, 다중 검정은, 항체가 B7-H4에 결합함을 입증한다.
실시예 5: 에피토프 맵핑
항-B7-H4 항체 결합 빈을 생물층 간섭측정법 (BLI)에 의해 측정하였다. 에피토프 맵핑 검정은 상기 실시예 2에 보다 상세히 기재되어 있다. 간단히, 제1 항-B7-H4 항체를 단백질 A 팁 상에서 포획한 후, 대조군 huIgG1 항체에 대해 수행하여 팁 상의 추가의 결합 자리를 포화시켰다. 다음으로, 센서 팁을 항원 (B7-H4-huIgG1) (서열 번호:409), 그 후 제2 항-B7-H4 항체에 노출시키고, 이어서 이를 결합에 대해 평가하였다. 에피토프 빈을, 비-B7-H4 항체를 제1 항체로서 사용한 후 결합과 비교함으로써 측정하였다. 결과를 표 12에 요약하였다.
실시예 6:세포의 표면 상에서 발현된 B7-H4에 대한 모노클로날 항체 결합의 특성화
HEK293T 세포 라인을 트랜스펙션시켜 전장 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 또는 래트 B7-H4를 발현시켰다. 추가로, 내인적 인간 B7-H4 발현 SK-BR-3 유방암 세포 라인을 사용하여 항체가 세포 표면 상에서 발현된 B7-H4에 결합하는 능력을 평가하였다. 1x105 모체 HEK293T 또는 트랜스펙션된 HEK293T 세포 라인을 100nM의 B7-H4 항체와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 펠릿화하고, 세척하고, 2차 라벨링 항체와 인큐베이션하고, 샘플을 유동 세포계측기 상에서 획득하였다. 모체 세포 라인 (FOP)에 대한 결합 배수를 하기와 같이 계산하였다:MFI 트랜스펙션된 HKE293T 세포/MFI 모체 HEK293T 세포.10 초과의 FOP 값이 특이적 결합을 입증하는 것으로 고려되었다.
B7-H4 항체의 세포 결합 효능을 평가하기 위해, 시노몰구스 원숭이, 마우스 또는 래트 B7-H4를 발현하도록 트랜스펙션된 1x105 SK-BR-3 세포 또는 293 세포를 적정 용량의 B7-H4 항체와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 펠릿화하고, 세척하고, 2차 라벨링 항체와 인큐베이션하고, 샘플을 유동 세포계측기 상에서 획득하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하고, MFI를 항체 농도에 대하여 플롯팅하였다. EC50 세포 결합 효능을 비선형 회귀 곡선 핏 (GraphPad Prism)을 사용하여 계산하였다.
모든 B7-H4 항체는, 인간 B7-H4, 시노몰구스 원숭이 B7-H4, 또는 마우스 B7-H4를 발현한 HEK293T 세포에 대한 결합을 나타내었다. 항체는 또한, 세포 표면 상에서 인간 B7-H4를 내인적으로 발현하는 SK-BR-3 세포 또는 세포 표면 상에서 시노몰구스 원숭이, 마우스, 또는 래트 B7-H4를 발현하도록 트랜스펙션된 HEK293T 세포 라인에 대해 강력한 용량-의존적 결합을 나타내었다. 이들 데이터는, 대부분의 B7-H4 항체가 시노몰구스 원숭이, 마우스, 및 래트 B7-H4에 대해 완전히 교차-반응성임을 입증한다 (도 2a 및 2b, 표 14).
표 14:세포-표면 B7-H4에 대한 B7-H4 항체 결합
Figure pct00034
실시예 7: 모노클로날 항체 T 세포 체크포인트 차단 활성의 특성화
B7-H4 항체의 T 세포 체크포인트 차단 활성을 특성화하기 위해, 1차 인간 T 세포를 제조업자의 지시에 기초하여 EasySep™ 인간 T 세포 풍부화 키트를 사용하여 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 풍부화시켰다. 풍부화된 T 세포를 2x105 세포/mL로 항-CD3/항-CD28 Dynabeads와, 37℃에서, 세포 당 하나의 비드의 비율로 인큐베이션하였다. 6일 후, 비드를 자기 제거하고, T 세포를 세척하고, 1x106 세포/mL로 10 U/mL IL-2와 37℃에서 인큐베이션하였다. 4일 후, T 세포를 세척하고, 1x106 세포/mL로, 2x106 세포/mL의 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 함께 37℃에서 10 ug/mL of 항체 또는 항체 용량 적정의 존재 하에 인큐베이션하였다. aAPC는 세포 표면 상의 항-인간 CD3 클론 OKT3의 scFv 포맷 및 전장 인간 B7-H4를 공동-발현하도록 트랜스펙션시킨 HEK293T 세포 라인이다. aAPC를 미토마이신 C로 1시간 동안 37℃에서 처리하고, 이어서 철저히 세척한 후 T 세포 공동-배양에 첨가하였다. T 세포, aAPC 및 B7-H4 항체의 공동-배양 72시간 후, 플레이트를 원심분리하고, 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 IFNγ 생성에 대해 평가하고, 세포를 수확하고 염색하여 FACS에 의해 증식을 평가하였다 (구체적으로, 각 웰의 세포를 CD4 및 CD8에 대한 항체와 인큐베이션함). 이어서, 세포를 세척하고, 고정시키고, 침투성화시키고, 제조업자의 지시에 따라 Edu-Click 시약과 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, CD4+, CD8+ 또는 총 T 세포 증식의 수를 유동 세포계측법을 사용하여 측정하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 단지 단일 농도의 항체로 처리된 샘플에 대하여, 데이터를 계산하고, 대조군-huIgG 처리된 샘플에 대한 배수 증가로서 기록하였다. 용량 적정의 항체로 처리된 샘플에 대하여, IFNγ 생성을 항체 농도에 대하여 플롯팅하고, EC50 효능을 비선형 회귀 곡선 핏 (GraphPad Prism)을 사용하여 계산하였다.
모든 BIN2/3 및 BIN3 항체는, IFNγ 생성 및/또는 CD4+, CD8+ 또는 총 T 세포 증식의 증가에 의해 측정되는 바와 같이, 재현가능하게 T 세포 체크포인트 차단 활성을 제공하였다. 도 3A는, 항체 15441이 T 세포 증식을 적어도 3%만큼 증가시키고 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 적어도 2%만큼 증가시킴을 보여준다. 도 3A는 또한, 항체 15461이 T 세포 증식을 적어도 21%만큼 증가시키고, CD4+ T 세포 증식을 적어도 9%만큼 증가시키고, CD8+ T 세포 증식을 적어도 11%만큼 증가시킨다. 도 3B-3D는 다른 용량-의존적 T 세포 체크포인트 차단 활성을 나타낸다.
표 15:B7-H4 항체 - T 세포 체크포인트 차단 활성
Figure pct00035
표 16:세포-표면 B7-H4에 대한 B7-H4 항체 결합
Figure pct00036
실시예 8:아푸코실화된 및 푸코실화된 모노클로날 항체의 생성
글리칸 모이어티에서 감소된 푸코스 함량으르 갖는 Fc 영역을 갖는 항체는 완전히 푸코실화된 항체에 비해 높은 ADCC 활성을 나타낼 수 있다 (Niwa R et al., Clinical Cancer Research 11(6):2327-36 (2005)). B7-H4 항체를 CHO-x 세포에서 생성시켜 (Yamane-Ohnuki N, et al. Biotechnology 및 Bioengineering 87(5):614-22 (2004)) 정상적으로 푸코실화된 항체를 생성하고, CHO 세포 라인에서 조작하여 아푸코실화된 항체 (CHO-y 세포)를 생성하였다 (id.).
실시예 9:아푸코실화된 및 푸코실화된 모노클로날 항체의 결합의 특성화
푸코실화된 및 아푸코실화된 항 B7-H4 항체를 실시예 4에 기재된 바와 같은 프로토콜에 따라 SPR에 의해 특성화하였다. 항체는 인간 B7-H4 단백질에 대한 유사한 결합을 나타내었고, 따라서 결합에 대한 글리코실화의 영향은 없다 (표 17).
표 17:아푸코실화된 및 푸코실화된 항체의 결합
Figure pct00037
푸코실화된 및 아푸코실화된 항 B7-H4 항체를 또한 유동 세포계측법에 의해 특성화하였다. 이들 실험에서는, HEK293T 세포 라인을 트랜스펙션시켜 전장 시노몰구스 원숭이, 마우스, 또는 래트 B7-H4를 발현시켰다. 추가로, 내인적 인간 B7-H4 발현 SK-BR-3 유방암 세포 라인을 사용하여 B7-H4 항체의 세포 결합 효능을 평가하였다. 전장 인간, 시노몰구스 원숭이, 마우스, 또는 래트 B7-H4를 발현하도록 트랜스펙션된 1x105 SK-BR-3 세포 또는 293 세포를 적정 용량의 B7-H4 항체와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 펠릿화하고, 세척하고, 2차 라벨링 항체와 인큐베이션하고, 유동 세포계측기 상에서 진행시켰다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. MFI를 항체 농도에 대해 플롯팅하고, EC50 세포 결합 효능을 비선형 회귀 곡선 핏 (GraphPad Prism)을 사용하여 계산하였다.
B7-H4 항체는, 세포 표면 상에서 B7-H4를 내인적으로 발현하는 SK-BR-3 세포 또는 세포 표면 상에서 시노몰구스 원숭이, 마우스, 또는 래트 B7-H4를 발현하도록 트랜스펙션된 293 세포 라인에 대해 강력한 용량-의존적 결합을 나타내었다. 결합 효능 및 종 교차-반응성은, 항체가 항체가 푸코실화되었는지 아푸코실화되었는지에 의해 영향받지 않았다 (도 4a-4d 및 표 17).
실시예 10: 인간 Fcγ 수용체 IIIa (FcγRIIIa) V158 대립유전자에 대한 아푸코실화된 및 푸코실화된 모노클로날 항체의 결합
항체 20502를 푸코실화된 (Ab-F) 및 아푸코실화된 (Ab-A) 것으로서 생성하고, 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 FcgRIIIa (V158)에 대한 Fc 영역의 결합 친화성에 대해 시험하였다. 간단히, 단백질 A를, 차단 시약으로서 100 mM 붕산나트륨 완충제, pH 8.0 중의 100 mM 에틸렌디아민과 아민 커플링 키트를 사용하여 덱스트란 칩에 공유 부착시켰다. Ab-A 또는 Ab-F를 별도의 유동 세포 상에서 2개 밀도로 포획하고, 단백질 A 유도체화된 유동을 참조 대조군으로서 제공하였다. Fc 감마 RIIIA (V158)를 HBS-P+ 진행 완충제 중에 희석하고, 6개 농도 (0 nM, 1.37 nM, 12.3 nM, 37 nM, 111 nM, 333 nM, 및 1000 nM)로 이중으로 주입하였다. Ab-A 결합에 대한 회합 상수, 해리 상수, 및 친화성을 Biacore T200 평가 소프트웨어 1:1 결합 모델을 사용하여 계산하였다. Ab-A 및 Ab-F 결합에 대한 친화성 상수를 Biacore T200 평가 소프트웨어 정상 상태 친화성 모델을 사용하여 측정하였다. 아푸코실화된 B7-H4 항체 (Ab-A)는, 푸코실화된 Fc를 갖는 동일한 항체 (Ab-F)에 비해, Fc 감마 수용체 IIIA (V158)에 대해 140배 더 높은 친화성을 갖는다 (도 5a 및 5b, 표 18).
표 18:Fcγ 수용체 IIIa (FcγRIIIa) V158 대립유전자 결합
Figure pct00038
실시예 11: 아푸코실화된 및 푸코실화된 모노클로날 항체 T 세포 체크포인트 차단 활성
1차 인간 T 세포를 제조업자의 지시에 기초하여 EasySep™ 인간 T 세포 풍부화 키트를 사용하여 PBMC로부터 풍부화시켰다. 풍부화된 T 세포를 2x105 세포/mL로 항-CD3/항-CD28 Dynabeads와, 37℃에서, 세포 당 하나의 비드의 비율로 인큐베이션하였다. 6일 후, 비드를 자기 제거하고, T 세포를 세척하고, 1x106 세포/mL로 10 U/mL IL-2와 37℃에서 인큐베이션하였다. 4일 후, T 세포를 세척하고, 1x106 세포/mL로, 2x106 세포/mL 농도의 인공 항원 제시 세포 (aAPC)와 함께 37℃에서 B7-H4 항체 용량 적정의 존재 하에 인큐베이션하였다. aAPC를 미토마이신 C로 1시간 동안 37℃에서 처리하고, 이어서 철저히 세척한 후 T 세포 공동-배양에 첨가하였다. T 세포, aAPC 및 B7-H4 항체의 공동-배양 72시간 후, 플레이트를 원심분리하고, 상청액을 수확하고, ELISA에 의해 IFNγ 생성에 대해 평가하였다. IFNγ 생성을 항체 농도에 대해 플롯팅하고, EC50 효능을 비선형 회귀 곡선 핏 (GraphPad Prism)을 사용하여 계산하였다.
B7-H4 항체는, IFNγ 생성 증가에 의해 측정되는 바와 같이, 강력한 T 세포 체크포인트 차단 활성을 나타내었다. 또한, 아푸코실화된 항체와 푸코실화된 항체 사이의 입증가능한 효능 차이는 없었다 (도 6a 및 표 19).
표 19: T 세포 체크포인트 차단 효능
Figure pct00039
다음으로, 1차 인간 T 세포를 제조업자의 지시에 따라 인간 Pan T 세포 단리 키트를 사용하여 HLA-A2+ 공여체 PBMC로부터 풍부화시켰다. 먼저 5x106 풍부화된 Pan T 세포를 1.5x107 항-CD3/항-CD28 Dynabeads, 100ng/mL IL-2 및 15ng/mL IL-7와 48시간 동안 활성화시킴으로써 MART-I TCR 발현 T 세포를 생성하였다. 이어서, 5x106 활성화된 T 세포를 200ng/mL IL-2, 30ng/mL IL-7 및 10ug/mL 폴리브렌의 존재 하에 MART-I TCR 렌티바이러스 입자로 형질도입하였다. 형질도입 24시간 후, MART-I TCR+ Pan T 세포를 33.3ng/mL IL-2 및 5ng/mL IL-7의 존재 하에 15일 기간에 걸쳐 확장시켰다. HLA-A2 발현 표적 세포 라인을 생성하기 위해, 내인적 B7-H4 발현 인간 유방암 세포 라인 MDA-MB-468 및 SK-BR-3을 48시간 동안 HLA-A2 렌티바이러스 입자로 형질도입하였다. 또한, B7-H4를 HLA-A2+ SK-BR-3 세포 라인에 대해 녹아웃시켰다. MART-I TCR+ Pan T 세포를 다양한 표적 세포 라인 (1:1 E:T 비율), 500μg/mL의 MART-I 펩티드 및 67nM의 B7-H4 항체 20502 (아푸코실화된) 또는 인간 이소타입 대조군의 존재 하에 공동-배양하였다. 공동-인큐베이션 24시간 후, 플레이트를 원심분리하고, 상청액을 수확하고, 제조업자의 지시에 따라, AlphaLisa에 의해 IL-2 생성에 대해 평가하였다.
도 6b에 나타낸 바와 같이, B7-H4는, SK-BR-3 KO 세포에 비해 SK-BR-3 B7-H4+ 세포를 함유하는 웰에서 IL-2 생성이 감소됨에 따라, 생리적 수준으로 내인적으로 발현되는 경우 이 검정에서 T 세포 체크포인트 리간드 활성을 나타내었다. 또한, B7-H4 항체는 또한, 이소타입 대조군 처리된 세포에 비해 IL-2 생성 증가에 의해 측정되는 바와 같이 T 세포 체크포인트 차단 활성을 나타내었다 (도 6b). 따라서, 이 데이터는 B7-H4 항체 20502 (아푸코실화)의 T 세포 체크포인트 차단 활성을 확인시켜주고, B7-H4 항체 20502가 B7-H4를 내인적으로 발현하는 세포에서 T 세포 체크포인트 차단 활성을 제공함을 보여준다.
실시예 12:아푸코실화된 및 푸코실화된 모노클로날 항체 ADCC 활성
B7-H4 항체를 B7-H4-발현 표적 세포 라인에 대한 ADCC 활성에 대해 평가하였다. 구체적으로, 1차 인간 PBMC 세포를 37℃에서 1x106 세포/mL로 200 IU/mL IL-2로 시토카인 활성화시켰다. 다음 날, 세포를 세척하고, 40:1 이펙터:표적 비율로, 칼세인-AM으로 라벨링된 SK-BR-3 표적 세포와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 4시간 후, 표적 세포 용균을 형광계를 사용하여 정량화하였다. 트리톤/X 처리된 샘플을 최대 용균 대조군 샘플로서 제공하였으며, 매질 단독 처리된 샘플을 백그라운드 용균 대조군 샘플로서 제공하였다. 퍼센트 (%) 특이적 용균을 하기와 같이 계산하였다:[1-((샘플 - 매질 대조군)/(최대 용균 - 매질 대조군))]x100. 퍼센트 (%) 특이적 용균을 항체 농도에 대해 플롯팅하고, EC50 효능을 비선형 회귀 곡선 핏 (GraphPad Prism)을 사용하여 계산하였다.
B7-H4 항체는, 내인적 B7-H4 발현 유방 세포 라인 SK-BR-3에 대하여 강력한 용량-의존적 ADCC 활성을 나타내었다. 또한, 아푸코실화된 항체는 푸코실화된 항체에 비해 현저히 더 강력한 ADCC 활성을 나타내었다 (도 7 및 표 20).
표 20: ADCC 활성
Figure pct00040
실시예 13: ADCC 활성과 수용체 밀도의 상관성
B7-H4 밀도를, 제조업자의 사양에 따라 FACS에 의해 SK-BR-3, HCC1569, ZR-75-1, MDA-MB-48, 및 HCC1964 세포의 표면 상에서 정량화하였다. 구체적으로, 1x105 세포를 아이스 상에서 25분 동안 15 ug/mL B7-H4 항체와 인큐베이션하였다. 병행하여, 1 방울의 QuantumTM Simply Cellular (QSC) 마이크로스피어 (증가하는 농도의 항-마우스 IgG 포획 항체로 예비-코팅됨)를 또한 아이스 상에서 25분 동안 15 ug/mL B7-H4 항체와 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포 및 QSC 마이크로스피어를 펠릿화하고, 세척하고, 샘플을 유동 세포계측기 상에서 획득하였다. 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 평균 형광 강도 (MFI)를 계산하고, QuickCal® 스프레드시트로 도입하였다. 각각의 비드의 형광 채널 값을 그의 예비-할당된 항체 결합능 (ABC) 값에 관련시키는 회귀는 자동으로 계산될 것이다. 라벨링 세포에 대한 MFI 값이 또한 템플레이트 내로 부가되면, ABC 값이 할당되었다.
B7-H4 항체를, 상이한 수준의 B7-H4 세포 표면 밀도를 갖는 B7-H4 발현 표적 세포 라인에 대한 ADCC 활성에 대하여 평가하였다. 구체적으로, 1x104 SK-BR-3, HCC1569, ZR-75-1, MDA-MB-468, 또는 HCC1964 표적 세포를 4oC에서 용량-적정의 B7-H4 항체와 공동-인큐베이션하였다. 25분 후, Promega로부터의 Jurkat-huCD16 리포터 세포의 단일 사용 바이알을 해동시키고, 7.5x104 세포를 표적 세포/B7-H4 항체 혼합물에 첨가하고 37oC에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 샘플을 실온 (RT)으로 만들고 Bio-Glo 완충제와 인큐베이션하였다. 기질 및 발광을 EnVision 다중-라벨 판독기 상에서 정량화하였다. 데이터를 발광 대 항체 농도로서 플롯팅하고, EC50 효능을 비선형 회귀 곡선 핏 (GraphPad Prism)을 사용하여 계산하였다.
B7-H4 항체 ADCC 활성은 B7-H4 세포 표면 밀도에 대해 의존적이었다: 세포 표면 분자의 수가 감소함에 따라, 최대 ADCC 활성의 양 또한 감소하였다. 또한, 아푸코실화된 항체는, 푸코실화된 항체에 비해, 특히 보다 낮은 수준의 B7-H4 세포 표면 밀도를 갖는 표적 세포에 대하여, 개선된 ADCC 활성을 나타내었다 (도 8).
실시예 14: 생체내 항-종양 효능
7주령의 암컷 BALB/c 마우스를 Charles River Laboratories (미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하고, 연구 개시 전 최대 3주 동안 순응시켰다. 뮤린 결장직장 암종 세포 라인 CT26을, 뮤린 B7H3의 막관통 도메인과 뮤린 B7-H4의 세포외 도메인으로 이루어진 키메라 단백질을 발현하도록 조작하였다. 이들 종양 세포를 1.0x106 세포/200 μl/마우스로 마우스의 우측 측면 상에 피하 이식하였다. 접종 전에, 세포를 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청 (FBS), 2mM L-글루타민 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 3회 이하 통과 동안 배양하였다. 세포를 5% CO2를 갖는 가습 분위기에서 37C에서 성장시켰다. 80-85% 컨플루언스(confluence) 도달시, 세포를 수확하고 무혈청 RPMI 1640 및 Matrigel의 1:1 혼합물 중에 5 x106 세포/밀리리터)로 재현탁시켰다.
마우스를 종양 성장에 대하여 세포 이식 후 매주 2회 모니터링하였다. 종양 측정을 위해, 각각의 종양의 길이 및 폭을 캘리퍼를 사용하여 측정하고, 부피를 하기 식에 따라 계산하였다: 종양 부피 (mm3) = (폭 (mm) x 길이 (mm2)/2. 처리 개시일에, 모든 종양을 측정하고, 이상치를 배제하고, 마우스를 치료 그룹으로 랜덤 할당시켰다. 항-B7-H4 처리를 위해, 사용된 항체는 20502 (도 9A) 및 22213 (도 9B)을 포함한다. 대조군으로서, 마우스에 폴리클로날 인간 IgG (Bio X Cell, BE0092) 또는 마우스 IgG2a (Bio X Cell, BE0085)를 투여하였다. 항체를 접종 후 제4 또는 5일에 시작하여 매주 2회 정맥내 (i.v.) 주사를 통해 4회 투여하였다.
종양 부피가 동물 체중의 10%, 또는 대략 2000 mm3을 초과할 때까지 주 당 적어도 2회 종양을 계속하여 측정하였다. 개개의 종양 크기를 동물에 CT26 세포를 접종한 날에 대하여 그래프화함으로써 종양 크기 변화를 나타내었다. 각 연구일에 계산된 종양 부피의 짝을 이루지 않은 양측 t-시험 분석을 사용하여 P-값을 계산하였다. 20502 또는 22213으로의 처리는, 10-20 mg/kg의 용량으로 투여시 인간 IgG 대조군에 비해 종양 성장을 현저히 감소시켰다 (p<0.05) (도 9a 및 9b).
이식된 4T1 세포 (뮤린 유방 암종 세포 라인) 또는 B16 (뮤린 흑색종 세포 라인)을 갖는 마우스를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 이들 마우스를, 푸코실화된 마우스 IgG2a에 융합된 20502 가변 영역을 함유하는, 20502-msIgG2a-F라 불리는 20502의 마우스 대리물 20 mg/kg, 또는 뮤린 IgG 대조군 항체로 처리하였다. 20502-msIgG2a-F로의 처리는 4T1 유방 암종 및 B16 흑색종 모델 둘 다에서 뮤린 IgG 대조군에 비해 종양 성장을 현저히 감소시켰다 (도 10).
MX-1 인간 유방암 이종이식 모델에서 아푸코실화된 20502를 사용하여 추가의 실험을 또한 수행하였다. 암컷 NSG (NOD-scid, IL2R 감마눌(gammanull) 마우스를 Jackson Laboratory (미국 메인주 바 하버)로부터 구입하고, 연구 개시 전 1주 동안 순응시켰다. 　 인간 유방암 세포 라인 MX-1은 이전에 세포-표면 B7H4 단백질을 내인적으로 발현하는 것으로 나타난 바 있다. 이들 종양 세포에 5 x 106 세포/밀리리터로 Matrigel 및 무혈청 RPMI 1640의 1:1 혼합물 중에서 1.0x106 세포/100 μl/마우스로 마우스의 우측 측면 상에 피하 이식하였다.
마우스를 종양 성장에 대하여 세포 이식 후 매주 2회 모니터링하였다. 종양 측정을 위해, 각각의 종양의 길이 및 폭을 캘리퍼를 사용하여 측정하고, 부피를 하기 식에 따라 계산하였다:종양 부피 (mm3) = (폭 (mm) x 길이 (mm)2)/2. 접종 후 제7일에, 모든 종양을 측정하고, 이상치를 배제하고, 마우스를 치료 그룹으로 랜덤 할당시켰다. 연구의 나머지 부분에 대하여 순환에서 구성적 인간 IL-15 발현을 유도한 DNA 구성물을 모든 동물에 투여하였다. 제9일에, 마우스의 절반은, StemCell Technologies (미국 워싱턴주 투퀼라)로부터 얻은, 20x106 인간 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)의 정맥내 주사를 수용하였다. 제11일에 시작하여, 마우스에 아푸코실화된 20502 (20 mg/kg) 또는 네가티브 대조군으로서의 식염수를 투여하였다. 치료제를 매주 2회 정맥내 (i.v.) 주사를 통해 4회 투여하였다.
종양 부피가 동물 체중의 10%를 초과할 때까지 또는 동물이 초기 체중의 15% 이상의 손실을 나타낼 때까지 주 당 적어도 2회 종양을 계속하여 측정하였다. 제28일에 모든 처리 그룹에 걸쳐 평균 종양 부피를 비교하는 1원 ANOVA를 사용하여 P-값을 계산하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 아푸코실화된 20502로의 처리는, 단지 이전에 인간 PBMC로 주사된 마우스에게 투여시 식염수 대조군에 비해 종양 성장을 현저히 감소시켰다 (p<0.05).
실시예 15:항-PD-1 항체와 조합된 생체내 항-종양 효능
방법
8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 Charles River Laboratories (미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하고, 연구 개시 전 최대 2주 동안 순응시켰다. 뮤린 유방 암종 세포 라인 4T1을, 뮤린 B7H3의 막관통 도메인과 뮤린 B7-H4의 세포외 도메인을 함유하는 키메라 단백질을 발현하도록 조작하였다. 종양 세포를 0.5x105 세포/50 μl/마우스로 마우스의 유선 지방 패드 내에 정위 이식하였다. 접종 전에, 세포를 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청 (FBS) 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 3회 이하 통과 동안 배양하였다. 세포를 5% CO2를 갖는 가습 분위기에서 37□C에서 성장시켰다. 80-85% 컨플루언스 도달시, 세포를 수확하고, 유선 지방 패드 내로의 각각의 마우스의 복부 측면 상에서 무혈청 RPMI 1640 중에 재현탁시켰다.
마우스를 종양 성장에 대하여 세포 이식 후 매주 2회 모니터링하였다. 각각의 종양의 길이 및 폭을 캘리퍼를 사용하여 측정하고, 부피를 하기 식에 따라 계산하였다: 종양 부피 (mm3) = (폭 (mm) x 길이 (mm)2)/2. 처리 개시일에, 모든 종양을 측정하고, 이상치를 배제하고, 마우스를 치료 그룹으로 랜덤 할당시켰다. 항-B7-H4 치료를 위해, 푸코실화된 마우스 IgG2a에 융합된 20502 가변 영역을 함유하는, 20502-msIgG2a-F라 불리는 20502의 마우스 대리물을 활용하였다. 대조군으로서, 마우스에 msIgG2a (항-HEL)를 투여하였다. 20502-msIgG2a-F 또는 msIgG2a를 접종 후 제11일에 시작하여 매주 2회 정맥내 (i.v.) 주사를 통해 4회 투여하였다. 항-PD-1 (Fc 사일런트 msIgG2a 도메인을 함유하는 RMP1-14 (Bio X Cell)의 변형된 버전)을 접종 후 제11일에 시작하여 매주 2회 복강내 (i.p.) 주사를 통해 3회 투여하였다. 종양 부피가 동물 체중의 10%, 또는 대략 2000 mm3를 초과할 때까지 주 당 적어도 2회 종양을 계속하여 측정하였다.
결과
종양 크기 변화, 평균 종양 부피 변화, 및 퍼센트 생존을 각각 도 12a, 12b 및 12c에 나타내었다. 20502-msIgG2a-F 또는 항-PD-1로의 처리는 msIgG2a 대조군에 비해 종양 성장을 현저히 감소시켰다 (p<0.05). 20502-msIgG2a-F 및 항-PD-1의 공동-투여는 단일요법에 비해 종양 성장 억제를 현저히 향상시켰다 (p<0.05). 또한, 조합 요법은 12마리의 마우스 중 5마리에서 완전한 종양 퇴행을 제공하였다. 각 그룹 사이의 다중 비교와 함께 각 연구일에 계산된 종양 부피의 1원 ANOVA 분석을 사용하여 P-값을 계산하였다.
실시예 16: 항-B7-H4 항체는 NK-세포 및 T-세포 침윤을 증가시키고 PD-L1을 상향조절함.
8주령의 암컷 BALB/c 마우스를 Charles River Laboratories (미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하고, 0.5x105 세포/50 μl/마우스로 4T1+moB7-H4/H3 세포로 마우스의 유선 지방 패드 내에 정위 이식하였다. 처리 개시일에, 모든 종양을 측정하고, 이상치를 배제하고, 마우스를 치료 그룹으로 랜덤 할당시켰다. 마우스에 2회 (접종 후 제11 및 14일) 정맥내 (i.v.) 주사를 통해 20 mg/kg으로 huIgG1 (항-HEL) 또는 아푸코실화된 20502를 투여하였다.
제2 용량 투여 후 24시간에, 마우스를 안락사시키고, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 관류시켰다. 이어서, 종양을 추출하고, 5시간 동안 10% 포르말린에 고정시키고, PBS 중에서 헹구고, 30% 수크로스 용액 중에 적어도 24시간 동안 배치하였다. 종양을 하기 내에 매립시키고: Tissue-Tek® O.C.T.Compound, -15℃ 챔버 (저온유지장치) 내에서 20 μm로 절단하였다. 조직-마운팅된 슬라이드를 PBS 중 0.3% 트리톤 중에서 헹구고, 5% 정상 염소 혈청으로 차단하고, 1차 항체 (항-NKp46, 항-CD3, 또는 항-PD-L1; 1:500)로 밤새 염색하였다. 각각의 종양으로부터의 2개의 연속적 섹션을 염색하였다.
밤새 인큐베이션 후, 슬라이드를 0.3% 트리톤 중에서 헹구고, 이어서 2차 항체 (1:400)와 3시간 동안 어두운 가습 챔버 내에서 인큐베이션하고, 헹구었다. 이어서, 조직을 1% 파라포름알데히드에 고정시키고, PBS 중에서 헹구었다. 커버슬립을 DAPI와 함께 Vectashield®를 사용하여 마운팅하고, Cytoseal™로 밀봉하고, 어두운 챔버 내에서 건조되도록 방치시켰다. 이미지를 형광 현미경 및 카메라로 수동 획득하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 아푸코실화된 20502로의 처리는 증가된 자연 사멸 (NK) 세포 (항-NKp46 항체에 의해 측정됨)를 제공하고, 종양 코어에서 CD3+ T 세포의 중간 정도의 증가와 함께 종양 연부에서 CD3+ T 세포를 증가시켰다. 증가된 PD-L1 발현이 또한 나타났다.
실시예 17: 항-B7-H4 항체는 용량 의존적 방식으로 4T1- 및 B16-moB7-H4/H3 모델에서 생체내 종양 성장을 현저히 감소시킴
6 내지 8주령의 암컷 BALB/c 또는 C57Bl/6 마우스를 Charles River Laboratories (미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 구입하고, 연구 개시 전 최대 3주 동안 순응시켰다. 뮤린 유방 암종 세포 라인 4T1을, 뮤린 B7H3의 막관통 도메인과 뮤린 B7-H4의 세포외 도메인으로 이루어진 뮤린 키메라 단백질을 발현하도록 조작하였다. 이들 종양 세포를, 4T1+moB7-H4/H3에 대해 0.05x106 세포/50 μl/마우스로 유선 지방 패드 내에 정위 이식하거나 B16+moB7-H4/H3에 대해 0.5x106 세포/100 μl/마우스로 마우스의 우측 측면 상에 피하 이식하였다. 접종 전에, 세포를 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청 (FBS) 및 2mM L-글루타민 보충된 RPMI 1640 또는 DMEM 배지 중에서 3회 이하 통과 동안 배양하였다. 세포를 5% CO2를 갖는 가습 분위기에서 37℃에서 성장시켰다.
마우스를 종양 성장에 대하여 세포 이식 후 매주 2회 모니터링하였다. 종양 측정을 위해, 각각의 종양의 길이 및 폭을 캘리퍼를 사용하여 측정하고, 부피를 하기 식에 따라 계산하였다:종양 부피 (mm3) = (폭 (mm) x 길이 (mm)2)/2. 처리 개시일에, 모든 종양을 측정하고, 이상치를 배제하고, 마우스를 치료 그룹으로 랜덤 할당시켰다. 마우스에, 연구 종료까지 매주 2회 연속적으로 투여한 20 mg/kg 그룹을 제외하고는, 접종 후 제11일 (4T1+moB7-H4/H3) 또는 제6일 (B16+moB7-H4/H3)에 시작하여 매주 2회 정맥내 (i.v.) 주사를 통해 20502-msIgG2a-F 항체 (항-B7-H4, msIgG2a, 푸코실화됨 (또한 "cmFPA150-F"라 불림) 또는 마우스 IgG2a 대조군 항체를 4회 투여하였다.
종양 부피가 동물 체중의 10%, 또는 대략 2000 mm3을 초과할 때까지 주 당 적어도 2회 종양을 계속하여 측정하였다. 평균 종양 크기를 동물에 접종한 날에 대하여 그래프화함으로써 종양 크기 변화를 나타내었다. 20502-msIgG2a-F로의 처리는, 4T1+moB7-H4/H3 모델에서 1 mg/kg 이상의 용량으로 (도 14a 및 14b), 또한 B16+moB7-H4/H3 모델에서 3 mg/kg 이상의 용량으로 (도 15a 및 15b) 투여시 마우스 IgG2a 대조군에 비해 종양 성장을 현저히 감소시켰다 (p < 0.05). 모든 처리 그룹을 msIgG2a와 비교하여 1원 ANOVA를 사용하여 통계적 유의성을 계산하였다.
도 14a 및 14b는, 20502-msIgG2a-F 항체가 B7-H4/H3을 발현하는 4T1의 성장을 현저히 감소시킴으로 보여준다. BALB/c 마우스를 B7-H3 TM에 융합된 뮤린 B7-H4 ECD를 발현하도록 조작된 4T1 유방 암종 세포로 정위 접종하였다. 마우스에, 접종 후 제11일에 시작하여 매주 2회 20502-msIgG2a-F 항체 (항-B7-H4, msIgG2a, 푸코실화)를 투여하였다. 20502-msIgG2a-F 항체는, 제30일에 1원 ANOVA에 의해 평가시 30 mg/kg (p = 0.0003), 20 mg/kg (p = 0.0103), 10 mg/kg (p = 0.0419), 3 mg/kg (p = 0.0277), 및 1 mg/kg (p = 0.0333)에서 현저한 종양 성장 억제를 나타내며, 종양 성장의 용량-의존적 감소를 나타내었다.
도 15a 및 15b는, 20502-msIgG2a-F 항체가 B7-H4/H3을 발현하는 B16의 성장을 현저히 감소시킴을 보여준다. C57Bl/6 마우스를 B7-H3 TM에 융합된 뮤린 B7-H4 ECD를 발현하도록 조작된 B16-F10 흑색종 세포로 피하 접종하였다. 마우스에, 접종 후 제6일에 시작하여 매주 2회 20502-msIgG2a-F 항체 (항-B7-H4, msIgG2a, 푸코실화)를 투여하였다. 20502-msIgG2a-F 항체는, 제23일에 1원 ANOVA에 의해 평가시 30 mg/kg (p = 0.0085), 20 mg/kg (p = 0.0041), 10 mg/kg (p = 0.0017), 및 3 mg/kg (p = 0.0420)에서 현저한 종양 성장 억제를 나타내며(도 15b), 종양 성장의 용량-의존적 감소를 나타내었다 (도 15a).
따라서, 20502-msIgG2a-F 항체는 2개의 상이한 암 모델에서 용량-의존적 방식으로 종양 크기를 현저히 감소시켰다. 유방 암종 및 흑색종 세포 라인에서의 데이터는, 20502-msIgG2a-F 항체를 사용하여 암을 갖는 환자를 치료할 수 있음을 나타낸다.
서열 표
GITR 항체 서열
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
* * *
본 발명은 본원에 기재된 구체적 구현예에 의해 범위에 있어 제한되지 않아야 한다. 실로, 기재된 것들에 추가로 본 발명의 다양한 변형이 상기 설명 및 첨부 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.
본원에서 인용된 모든 참조문헌 (예: 공개 또는 특허 또는 특허 출원)은, 각각의 개개의 참조문헌 예: 공개 또는 특허 또는 특허 출원)이 모든 목적상 그 전체가 참조로 포함된다고 기재된 것과 동일한 정도로, 모든 목적상 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
다른 구현예는 하기 청구범위 내에 포함된다.
<110> FIVE PRIME THERAPEUTICS, INC. <120> B7-H4 Antibodies and Methods of Use Thereof <130> 3986.009PC04 <150> 62/550,173 <151> 2017-08-25 <150> 62/579,774 <151> 2017-10-31 <150> 62/607,810 <151> 2017-12-19 <150> 62/656,789 <151> 2018-04-12 <160> 469 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 282 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile 1 5 10 15 Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser 20 25 30 Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile 35 40 45 Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu 50 55 60 Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val 65 70 75 80 His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu Leu Ser Glu Gln Asp Glu Met 85 90 95 Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Ile Val Gly Asn 100 105 110 Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr Tyr 115 120 125 Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu Glu 130 135 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gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagttctgt gaccgccgca gacacggcgg tgtactactg cgccagagaa 300 ggatcttacc ccaattggtt tgatccatgg ggacagggta cattggtcac cgtctcctca 360 360 <210> 214 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 15461 Variable Light Chain-Encoding Polynucleotide Sequence <400> 214 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag taccactcct tccctttcac ttttggcgga 300 gggaccaagg ttgagatcaa a 321 <210> 215 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20500 VH FR1 <400> 215 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 20 25 <210> 216 <211> 14 <212> PRT 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240 gatgattttg caacttatta ctgccagcag gacaatagct tccctttcac ttttggcgga 300 gggaccaagg ttgagatcaa a 321 <210> 345 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 15472 VH FR1 <400> 345 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 <210> 346 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 15472 VH FR2 <400> 346 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 347 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 15472 VH FR3 <400> 347 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 348 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 15472 VH FR4 <400> 348 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 349 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 15472 VL FR1 <400> 349 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 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acggcggtgt actactgcgc cagaggtggg 300 ccttggtttg atccatgggg acagggtaca ttggtcaccg tctcctca 348 <210> 384 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 15478 Variable Light Chain-Encoding Polynucleotide Sequence <400> 384 gacatccaga tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataaa gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccagcag tacaatagct accctccttt cacttttggc 300 ggagggacca aggttgagat caaa 324 <210> 385 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 15441 VH FR1 <400> 385 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 <210> 386 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 15441 VH FR2 <400> 386 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 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gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcctccagtt tggaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gatgattttg caacttatta ctgccagcag tccaaaagtt accctaggac ttttggcgga 300 gggaccaagg ttgagatcaa a 321 <210> 395 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20496 VH FR1 <400> 395 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 20 25 <210> 396 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20496 VH FR2 <400> 396 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 397 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20496 VH FR3 <400> 397 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 398 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20496 VH FR4 <400> 398 Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 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453 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 light FR2 <400> 453 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 454 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 light CDR2 <400> 454 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 455 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 light FR3 <400> 455 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 456 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 light CDR3 <400> 456 Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr 1 5 <210> 457 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PD-1 light FR4 <400> 457 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 458 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 VH CDR1 <400> 458 Gly Ser Ile Lys Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Gly 1 5 10 <210> 459 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 VH CDR2 <400> 459 Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser 1 5 10 15 <210> 460 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 VH CDR3 <400> 460 Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Pro Asn Gln Phe Asp Pro 1 5 10 <210> 461 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 VL CDR1 <400> 461 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 462 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 VL CDR2 <400> 462 Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 1 5 <210> 463 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 VL CDR3 <400> 463 Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Phe Thr 1 5 <210> 464 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 Variable Heavy Chain <400> 464 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Lys Ser Gly 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Pro Asn Gln Phe Asp Pro Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 465 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 VH FR1 <400> 465 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly 20 25 <210> 466 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 VH FR2 <400> 466 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 <210> 467 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 VH FR3 <400> 467 Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 468 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 VH FR4 <400> 468 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 469 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody 20502 Full Length Heavy Chain <400> 469 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Lys Ser Gly 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Pro Asn Gln Phe Asp Pro Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450

Claims (122)

  1. 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 서열번호:458-463, 각각;
    (b) 서열번호:5-10, 각각;
    (c) 서열번호:15-20, 각각;
    (d) 서열번호:25-30, 각각;
    (e) 서열번호:35-40, 각각;
    (f) 서열번호:45-50, 각각;
    (g) 서열번호:55-60, 각각;
    (h) 서열번호:65-70, 각각;
    (i) 서열번호:75-80, 각각;
    (j) 서열번호:85-90, 각각;
    (k) 서열번호:95-100, 각각;
    (l) 서열번호:105-110, 각각;
    (m) 서열번호:115-120, 각각;
    (n) 서열번호:125-130, 각각;
    (o) 서열번호:135-140, 각각;
    (p) 서열번호:145-150, 각각;
    (q) 서열번호:155-160, 각각;
    (r) 서열번호:165-170, 각각;
    (s) 서열번호:175-180, 각각;
    (t) 서열번호:185-190, 각각; 및
    (u) 서열번호:195-200, 각각.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:11, 21, 31, 41, 464, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 또는 201의 아미노산 서열을 포함하는 VH를 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 또는 202의 아미노산 서열을 포함하는 VL을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  4. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 번호:11, 21, 31, 41, 464, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 또는 201의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  5. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체가 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호:12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 또는 202의 아미노산 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 서열번호:464 및 42, 각각;
    (b) 서열번호:11 및 12, 각각;
    (c) 서열번호:21 및 22, 각각;
    (d) 서열번호:31 및 32, 각각;
    (e) 서열번호:41 및 42, 각각;
    (f) 서열번호:51 및 52, 각각;
    (g) 서열번호:61 및 62, 각각;
    (h) 서열번호:71 및 72, 각각;
    (i) 서열번호:81 및 82, 각각;
    (j) 서열번호:91 및 92, 각각;
    (k) 서열번호:101 및 102, 각각;
    (l) 서열번호:111 및 112, 각각;
    (m) 서열번호:121 및 122, 각각;
    (n) 서열번호:131 및 132, 각각;
    (o) 서열번호:141 및 142, 각각;
    (p) 서열번호:151 및 152, 각각;
    (q) 서열번호:161 및 162, 각각;
    (r) 서열번호:171 및 172, 각각;
    (s) 서열번호:181 및 182, 각각;
    (t) 서열번호:191 및 192, 각각; 또는
    (u) 서열번호:201 및 202, 각각.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2 중쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  10. 제9항에 있어서, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 면역글로불린 IgGκ 및 IgGλ 경쇄 불변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하며, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역이고, 상기 경쇄 불변 영역은 인간 IgGκ 경쇄 불변 영역인, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:13, 23, 33, 43, 469, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 183, 193, 또는 203의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  13. 제1항 내지 제6항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열번호:14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 또는 204의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (a) 서열번호:469 및 44, 각각;
    (b) 서열번호:13 및 14, 각각;
    (c) 서열번호:23 및 24, 각각;
    (d) 서열번호:33 및 34, 각각;
    (e) 서열번호:43 및 44, 각각;
    (f) 서열번호:53 및 54, 각각;
    (g) 서열번호:63 및 64, 각각;
    (h) 서열번호:73 및 74, 각각;
    (i) 서열번호:83 및 84, 각각;
    (j) 서열번호:93 및 94, 각각;
    (k) 서열번호:103 및 104, 각각;
    (l) 서열번호:113 및 114, 각각;
    (m) 서열번호:123 및 124, 각각;
    (n) 서열번호:133 및 134, 각각;
    (o) 서열번호:143 및 144, 각각;
    (p) 서열번호:153 및 154, 각각;
    (q) 서열번호:163 및 164, 각각;
    (r) 서열번호:173 및 174, 각각;
    (s) 서열번호:183 및 184, 각각;
    (t) 서열번호:193 및 194, 각각; 또는
    (u) 서열번호:203 및 204, 각각.
  15. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 15461, 20500, 20501, 20502, 20502.1, 22208, 15462, 22213, 15465, 20506, 15483, 20513, 22216, 15489, 20516, 15472, 15503, 15495, 15478, 15441, 및 20496으로 이루어진 군으로부터 선택된 항체의 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 상기 CDR은 카바트(Kabat)-정의된 CDR, 코티아(Chothia)-정의된 CDR, 또는 AbM-정의된 CDR인, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  17. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 20502.1의 상기 코티아-정의된 또는 AbM-정의된 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, 및 VL CDR3을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  18. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 각각, 서열 번호:458-463의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  19. 제18항에 있어서, (i) 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:464의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 상기 항체는 서열 번호:469의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  20. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 각각, 서열 번호:35-40의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  21. 제20항에 있어서, (i) 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 상기 항체는 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  22. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편으로서, 각각, 서열 번호:65-70의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  23. 제22항에 있어서, (i) 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 상기 항체는 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 인간 B7-H4의 동일한 에피토프에 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 항체 또는 그의 항원-결합 단편인, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  26. 제1항, 제15항 내지 제20항, 제22항 또는 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 뮤린, 인간화된, 또는 키메라 항체 또는 그의 항원-결합인, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 T 세포 증식을 유도하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  28. 제27항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 T-세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 적어도 21%만큼 증가시키는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  29. 제27항에 있어서, 상기 항체 또는 항원-결합 단편은 T-세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 약 5% 내지 약 35%만큼 증가시키는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD4+ T 세포 증식을 유도하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  31. 제30항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD4+ T 세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 적어도 9%만큼 증가시키는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  32. 제30항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD4+ T 세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 약 5% 내지 약 15%만큼 증가시키는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD8+ T 세포 증식을 유도하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  34. 제33항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD8+ T 세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 적어도 11%만큼 증가시키는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  35. 제34항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CD8+ T 세포 증식을 대조군 항체로의 처리에 비해 약 5% 내지 약 15%만큼 증가시키는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인터페론-감마 (IFNγ) 생성을 유도하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  37. 제36항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IFNγ의 생성을 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 및 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 약 2배 내지 약 10배, 또는 약 3배 내지 약 10배만큼 증가시킬 수 있는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 B7-H4-발현 세포에서 항체 의존적 세포 매개된 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 B7-H4 발현 세포의 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 약 20% 내지 약 50%, 또는 약 30% 내지 약 50%에서 특정 용균을 유도하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 뮤린 CT26 결장직장 암종 모델, 뮤린 유방 암종 4T1 모델, 또는 흑색종 세포 라인 B16-moB7-H4/H3 모델에서 종양 성장을 억제하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  41. 제40항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 종양 성장을 대조군 항체로의 처리에 비해 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 45%, 또는 적어도 50%만큼 감소시키는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  42. 제27항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 증식의 유도, CD4+ T 세포 증식의 유도, CD8+ T 세포 증식의 유도, IFNγ 생성의 유도, ADCC 활성, 및/또는 종양 성장의 억제는 용량-의존적인, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 시노몰구스 원숭이 B7-H4에 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 래트 B7-H4에 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 마우스 B7-H4에 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 B7-H4의 IgV 도메인에 결합하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 아푸코실화되는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체인, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  49. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 단편인, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  50. 제49항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 Fv (scFv), 디술파이드 연결된 Fv, V-NAR 도메인, IgNar, 인트라바디, IgGΔCH2, 미니바디, F(ab')3, 테트라바디, 트리아바디, 디아바디, 단일-도메인 항체, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2, 또는 scFv-Fc를 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 검출가능한 라벨을 추가로 포함하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  53. 제52항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열 번호:11, 21, 31, 41, 464, 51, 61, 71, 81, 91, 101, 111, 121, 131, 141, 151, 161, 171, 181, 191, 또는 201의 VH 또는 서열 번호:13, 23, 33, 43, 469, 53, 63, 73, 83, 93, 103, 113, 123, 133, 143, 153, 163, 173, 183, 193, 또는 203의 중쇄를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  54. 제52항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열 번호:213, 223, 233, 243, 470, 253, 263, 273, 283, 293, 303, 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373, 383, 393, 또는 403의 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  55. 제52항에 있어서, 상기 핵산 분자는 (i) 서열 번호:213, 223, 233, 243, 470, 253, 263, 273, 283, 293, 303, 313, 323, 333, 343, 353, 363, 373, 383, 393, 또는 403의 서열 및 (ii) 서열 번호:408의 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  56. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  57. 제56항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열 번호:12, 22, 32, 42, 52, 62, 72, 82, 92, 102, 112, 122, 132, 142, 152, 162, 172, 182, 192, 또는 202의 VL 또는 서열 번호:14, 24, 34, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 124, 134, 144, 154, 164, 174, 184, 194, 또는 204의 경쇄를 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  58. 제56항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열 번호:214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 또는 404의 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  59. 제56항에 있어서, 핵산 분자는 (i) 서열 번호:214, 224, 234, 244, 254, 264, 274, 284, 294, 304, 314, 324, 334, 344, 354, 364, 374, 384, 394, 또는 404의 서열 및 (ii) 서열 번호:406의 서열을 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  60. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역 또는 중쇄 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 경쇄 가변 영역 또는 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  61. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 벡터.
  62. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 제61항의 벡터, 또는 제52항 내지 제55항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터 및 제56항 내지 제59항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터를 포함하는, 숙주 세포.
  63. 제62항에 있어서, 조직 배양에서의 대장균, 슈도모나스, 바실루스, 스트렙토미세스, 이스트, CHO, YB/20, NS0, PER-C6, HEK-293T, NIH-3T3, HeLa, BHK, Hep G2, SP2/0, R1.1, B-W, L-M, COS 1, COS 7, BSC1, BSC40, BMT10 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 및 인간 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는, 숙주 세포.
  64. 제62항 또는 제63항에 있어서, 상기 숙주 세포는 기능적 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 (FUT8) 유전자가 결핍되는, 숙주 세포.
  65. 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항의 숙주 세포를 배양하여 핵산 분자가 발현되고 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 생성되도록 하는 것을 포함하는, 인간 B7-H4에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 생성 방법.
  66. 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  67. 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용가능한 부형제를 포함하는, 제약 조성물.
  68. 제약 조성물로서, (i) 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 상기 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 95%는 아푸코실화된, 제약 조성물.
  69. 제약 조성물로서, (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 각각, 서열 번호:458-460의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 95%가 아푸코실화되는, 제약 조성물.
  70. 제69항에 있어서, (i) 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:464의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 상기 항체는 서열 번호:469의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 제약 조성물.
  71. 제약 조성물로서, (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 각각, 서열 번호: 35-40의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 95%가 아푸코실화되는, 제약 조성물.
  72. 제71항에 있어서, (i) 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:41의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:42의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 항체는 서열 번호:43의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:44의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 제약 조성물.
  73. 제약 조성물로서, (i) 인간 B7-H4에 특이적으로 결합하고, 각각, 서열 번호: 65-70의 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 (CDR) 1, VH CDR2, VH CDR3 및 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, CDR2, 및 CDR3 서열을 포함하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 여기서 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 적어도 95%가 아푸코실화되는, 제약 조성물.
  74. 제73항에 있어서, 상기 (i) 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열 번호:71의 아미노산 서열을 포함하는 가변 중쇄 영역 및 서열 번호:72의 아미노산 서열을 포함하는 가변 경쇄 영역을 포함하거나 또는 (ii) 여기서 항체는 서열 번호:73의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호:74의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 제약 조성물.
  75. 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 푸코실화는 조성물에서 검출불가능한, 제약 조성물.
  76. 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 추가로 포함하는, 제약 조성물.
  77. 제76항에 있어서, 상기 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 니볼루맙, 또는 펨브롤리주맙인, 제약 조성물.
  78. 제76항에 있어서, 상기 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 AMP-514, 캄렐리주맙, 티슬렐리주맙 및 스파르탈리주맙인, 제약 조성물.
  79. 제67항 내지 제75항에 있어서, 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 추가로 포함하는, 제약 조성물.
  80. T 세포를 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 T 세포 증식을 유도하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, T 세포 증식은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소되는, 방법.
  82. CD4+ T 세포를 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, CD4+ T 세포 증식의 유도 방법.
  83. 제82항에 있어서, CD4+ T 세포 증식은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소되는, 방법.
  84. CD8+ T 세포를 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, CD8+ T 세포 증식의 유도 방법.
  85. 제84항에 있어서, CD8+ T 세포 증식은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소되는, 방법.
  86. T 세포를 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 인터페론 감마 생성의 유도 방법.
  87. 제86항에 있어서, 인터페론 감마 생성은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%만큼 감소되는, 방법.
  88. 상기 세포를 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항의 제약 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, B7-H4-발현 세포의 사멸 방법.
  89. 세포의 집단을 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 또는 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항의 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포의 집단으로부터의 B7-H4-발현 세포의 고갈 방법.
  90. 제88항 또는 제89항에 있어서, 상기 사멸 또는 고갈은 ADCC를 통해 일어나는, 방법.
  91. 제80항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포, 세포, 또는 세포 집단을 항 -PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 졉촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제67항 내지 제78항 중 어느 한 항의 제약 조성물과의 접촉시키는 단계 및 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편과의 접촉시키는 단계는 동시에 발생하는, 방법.
  93. 제91항에 있어서, 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제67항 내지 제78항 중 어느 한 항의 제약 조성물과의 접촉시키는 단계 및 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편과의 접촉시키는 단계는 순차적으로 발생하는, 방법.
  94. 제80항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포, 세포, 또는 세포 집단을 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항의 제약 조성물과의 접촉시키는 단계 및 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계는 동시에 발생하는, 방법.
  96. 제94항에 있어서, 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제67항 내지 제75항 중 어느 한 항의 제약 조성물과의 접촉시키는 단계 및 항-PD-L1 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계는 순차적으로 발생하는, 방법.
  97. 제80항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉하는 단계는 시험관 내인, 방법.
  98. 제80항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 접촉하는 단계는 대상체 내인, 방법.
  99. 대상체에서 B7-H4 발현 암을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항에 따른 유효량의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  100. 제99항에 있어서, 상기 암은 유방암, 유관 암종, 자궁내막 암종, 난소암, 비-소세포 폐암, 췌장암, 갑상선암, 신장암 및 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 유방암은 삼중 음성 유방암이거나 또는 여기서 비-소세포 폐암은 편평 세포 암종인, 방법.
  102. 제100항에 있어서, 상기 비-소세포 폐암은 선암종인, 방법.
  103. 제99항에 있어서, 상기 암은 두경부암, 소세포 폐암, 위암, 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  104. 제100항에 있어서, 상기 암은 장액 선암종인 난소암인, 방법.
  105. 제101항에 있어서, 상기 암은 유관 선암종인 유방암인, 방법.
  106. 제99항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 PD-1 억제제 부적절 응답자인, 방법.
  107. 제99항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 PD-L1 억제제 부적절 응답자인, 방법.
  108. 제99항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 낮은 수준의 PD-L1을 발현하는, 방법.
  109. 제99항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  110. 제99항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  111. 제110항에 있어서, 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제67항 내지 제78항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 투여하는 단계 및 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 단계는 동시에 발생하는, 방법.
  112. 제110항에 있어서, 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제67항 내지 제78항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 투여하는 단계 및 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 단계는 순차적으로 발생하는, 방법.
  113. 제112항에 있어서, 상기 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 투여하는 단계는 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제67항 내지 제78항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 투여하는 단계 후에 발생하는, 방법.
  114. 제91항 내지 제93항, 제97항, 제98항, 및 제110항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙인, 방법.
  115. 제91항 내지 제93항, 제97항, 제98항, 및 제110항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항-PD-1 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 AMP-514, 캄렐리주맙, 티슬렐리주맙, 또는 스파르탈리주맙인, 방법.
  116. 샘플에서의 B7-H4의 검출 방법으로서, 상기 샘플을 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  117. 제116항에 있어서, 상기 샘플은 인간 대상체에서 암으로부터 얻어지는, 방법.
  118. 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항의 제약 조성물 및 a) 검출 시약, b) B7-H4 항원, c) 인간 투여를 위한 사용 또는 판매의 승인을 반영하는 고지, 또는 d) 이들의 조합을 포함하는 키트.
  119. 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항에 있어서, B7-H4의 T 세포 체크포인트 차단 활성을 억제하는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  120. 제119항에 있어서, 상기 T 세포 체크포인트 차단 활성은 대조군 세포에 대한 IL-2 생성 증가에 의해 측정되는, 단리된 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  121. 제약 조성물로서, (i) 제1항 내지 제51항 또는 제66항 중 어느 한 항의 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 (ii) 제약상 허용가능한 부형제를 포함하며, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 B7-H4의 T 세포 체크포인트 차단 활성을 억제하는, 제약 조성물.
  122. 제121항에 있어서, 상기 T 세포 체크포인트 차단 활성은 대조군 세포에 대한 IL-2 생성 증가에 의해 측정되는, 제약 조성물.
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