KR20200051585A

KR20200051585A - 펜타시클릭 화합물

Info

Publication number: KR20200051585A
Application number: KR1020207004232A
Authority: KR
Inventors: 요시아키 오하시; 요시히코 노리미네; 다마키 호시카와; 유 요시다; 요시히사 고바야시; 노부히로 사토; 고지 하기와라
Original assignee: 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤
Priority date: 2017-09-07
Filing date: 2018-09-05
Publication date: 2020-05-13
Anticipated expiration: 2038-09-05
Also published as: BR112020003197A2; RU2754557C1; PL3680243T3; JP6557441B1; CN111051316B; DK3680243T3; MA50093A; PE20200860A1; ZA202007737B; NZ761699A; MA50093B1; HRP20220019T1; KR102307738B1; IL272652A; WO2019049869A1; PT3680243T; CY1125355T1; ES2903172T3; EP3680243A1; MX2020001786A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 I 내지 화학식 VI으로 표현되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
[화학식 I]

[화학식 II]

[화학식 III]

[화학식 IV]

[화학식 V]

[화학식 VI]

Description

펜타시클릭 화합물

본 발명은 콜린성 뉴런 활성화 및/또는 신경보호 효과를 갖는 펜타시클릭 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 이의 약제학적 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 활성 성분으로서 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

전달물질로서 아세틸콜린을 방출하는 콜린성 뉴런은 마이네르트 기저핵 및 기저 전뇌의 격막핵으로부터 해마, 편도체 및 대뇌 피질까지의 전뇌에서 광범위하게 나타나고, 기억, 학습, 인지 및 주의력의 조정에 관여된다(비특허문헌 1). 더욱이, 대뇌각교뇌 피개핵(pedunculopontine tegmental nucleus) 및 뇌줄기의 옆등면 피개핵(laterodorsal tegmental nucleus)에서 콜린성 뉴런은 선조체, 측중격핵, 흑질 및 시상에서 나타나고, 동기 부여 및 각성의 제어에 관련된다고 간주된다(비특허문헌 2 내지 비특허문헌 4).

특히, 기저 전뇌에서의 콜린성 뉴런의 역할은 다수의 동물 모델, 예컨대, 병변 모델을 사용한 분석에 의해서 보다 명확해졌다. 특히, 콜린성 뉴런의 기능 장애와 저하된 기억 및 학습 간의 상관관계가 동물 모델에서 밝혀져 있고(비특허문헌 5 내지 비특허문헌 7), 콜린에스테라제 저해제를 사용하여 아세틸콜린의 양을 증가시킴으로써 그리고 콜린성 뉴런의 기능을 향상시킴으로써 인지 수행이 개선된다고 밝혀져 있다(비특허문헌 8 내지 비특허문헌 12).

신경 성장 인자(Nerve Growth Factor: NGF)는 콜린성 뉴런의 손실을 나타내는 동물 모델에서 콜린성 뉴런에 대한 신경보호 효과를 나타낸다고 보고되어 있다. (비특허문헌 13 내지 비특허문헌 15).

특히 알츠하이머병(Alzheimer's disease: AD)의 경우, 콜린성 뉴런의 손실은 AD의 초기 단계로부터 발견되며, AD의 병리학적 특징 중 하나이다. 아밀로이드 베타의 침착에 의한 노인성 반점의 축적 및 tau 단백질 응집에 의한 신경섬유 엉킴이 또한 AD의 병리학적 특징이며, 특히 신경섬유 엉킴은 이러한 질병 상태의 진행으로 증가되고 뉴런 사멸을 야기한다고 공지되어 있다. 신경섬유 엉킴은 초기 단계의 AD로부터의 마이네르트 기저핵 및 내후각 피질에서 발견된다. 이들 중에서, tau 단백질 응집에 의한 마이네르트 기저핵에서의 콜린성 뉴런의 손실은 초기 단계에서 발견되고, 그러한 손실과 인지 기능 점수의 감소 간에 상관관계가 존재한다고 보고되어 있다(비특허문헌 16 및 비특허문헌 17). AD와 유사하게, 가족성 전측두엽 치매(familial frontotemporal dementia)에서 발견된 P301S 돌연변이를 갖는 유전자 변형된 마우스(인간 tau P301S 트랜스제닉 마우스)에서 tau 단백질의 과인산화(hyperphosphorylation) 및 비정상적인 축적이 발견된다. 결론적으로, AD의 병리학적 특징인 신경섬유 엉킴이 형성되고(비특허문헌 18), 시냅스 손상, 신경변성 및 뉴런의 손실에 의해서 인지 기능 장애가 야기된다. 이러한 발견을 기초로, 인간 tau P301S 트랜스제닉 마우스가 AD-유사 동물 모델로서 널리 사용되며(비특허문헌 19 내지 비특허문헌 22), 인간 tau P301S 트랜스제닉 마우스에서의 AD-유사 병리학적 변화를 억제시킴으로써 알츠하이머병에서의 인지 감소의 개선 및 질병 상태 진행의 억제가 예측될 수 있다.

추가로, 유전자 변형된 마우스 및 장애의 동물 모델을 사용한 다양한 분석법은, 축삭돌기 수송 부족이 콜린성 뉴런의 손실의 원인 중 하나라는 것을 시사한다(비특허문헌 23 내지 비특허문헌 25). 이들 중에서, 중격 영역으로부터 해마로 돌출된 콜린성 뉴런의 축삭돌기가 핌브리아-포르닉스(fimbria-fornix) 병변 모델에서 손상되며, 생존 및 기능에 관련된 분자의 후방 수송의 손상이 뉴런의 손실을 야기한다(비특허문헌 26 내지 비특허문헌 28). 후방 수송의 손상이 또한 유전자 변형된 마우스에서 발견되며(비특허문헌 23 및 비특허문헌 24), 핌브리아-포르닉스 병변에 의한 콜린성 뉴런의 손실이 질병 상태의 하나의 양태를 반영한다. 따라서, 이러한 장애 모델에서 콜린성 뉴런의 손실의 억제 또는 개선에 의해서 알츠하이머병에서의 인지 감소의 개선 및 질병 상태의 억제가 예측될 수 있다.

루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies: DLB) 및 파킨슨병(Parkinson disease: PD)은 알파 시누클레인으로 주로 구성된 비정상적인 봉입체(루이소체)가 뉴런에 나타나고, 뉴런의 퇴화 및 손실을 야기하는 진행성 신경변성 장애이다. 루이소체가 대뇌 피질에 주로 분포되면 인지 기능 장애가 발생하고, 루이소체가 뇌줄기에 주로 분포되면 파킨슨증이 발생한다. 이것에 더하여, 정신의학적 증상, 예컨대, 환시, 환각 및 망상, 수면 장애 및 자율신경 증상이 또한 발생한다. 치매가 파킨슨증의 발병 이전에 또는 발병으로부터 1년 이내에 나타나면 진단은 루이소체 치매이고, 파킨슨증이 치매 발병으로부터 1년 이상 이전에 나타나면 진단은 치매 동반 파킨슨병(Parkinson disease with dementia: PDD)이다. 루이소체 치매, 치매 동반 파킨슨병 및 파킨슨병은 병리학적으로 동일한 질병이며, 이들이 인지 기능장애 및 파킨슨증의 겉보기 상태 및 정도가 상이하더라도, 광범위하게 루이소체 질병(Lewy body disease: LBD)이라고 지칭된다. 루이소체 치매 및 치매 동반 파킨슨병에서, 알츠하이머병과 유사하게, 마이네르트 기저핵의 뉴런, 콜린성 신경의 기원핵이 퇴화 및 손실되고, 심한 콜린성 뉴런 장애가 해마 및 피질에 나타난다고 보고되어 있다(비특허문헌 29 내지 비특허문헌 31). 추가로, 콜린성 뉴런 장애와 인지 기능장애 사이에 상관관계가 존재하며(비특허문헌 29), 콜린에스테라제 저해제가 인지 기능을 개선시킨다는 것이 입증되어 있다. 이러한 발견을 기초로, 인지 기능은 콜린성 뉴런의 기능의 개선에 의해서 개선되며, 알츠하이머병과 유사하게, 루이소체 치매 및 치매 동반 파킨슨병에서의 인지 감소 및 질병 상태 진행의 억제는 장애의 몇몇 모델에서 콜린성 뉴런의 손실의 억제 및 개선에 의해서 예측될 수 있다.

따라서, 이러한 발견을 기초로, 임상 실시에서 콜린성 뉴런에 대한 기능적 활성화 및/또는 신경보호 효과를 달성함으로써 콜린성 뉴런의 기능장애에 의해서 유발되는 감소된 인지 수행의 개선이 예측될 수 있다.

상기 질병에 더하여, 인지 기능의 감소와 콜린성 뉴런의 기능장애 간의 연관이 보고된 질병의 예는 헌팅턴 무도병(Huntington's chorea), 다운 증후군(Down's syndrome), 근위축성 축삭경화증(amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 주우울증, 조현병 등을 포함한다.

[비특허문헌 1] Everitt BJ et al. "Central cholinergic systems and cognition." Annu. Rev. Psychol. 48 (1997) 649-684. [비특허문헌 2] Gulledge AT. et al. "Cholinergic inhibition of neocortical pyramidal neurons." J. Neurosci. 25 (2005) 10308-20. [비특허문헌 3] Daniel Dautan D. et al. "A major external source of cholinergic innervation of the striatum and nucleus accumbens originates in the brainstem." J. Neurosci. 34 (2014) 4509-18. [비특허문헌 4] M Steriade M. et al. "Neuronal activities in brain-stem cholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocortical systems." J. Neurosci. 10 (1990) 2541-59. [비특허문헌 5] Fischer W. et al. "Progressive decline in spatial learning and integrity of forebrain cholinergic neurons in rats during aging." Neurobiol. Aging 13 (1992) 9-23. [비특허문헌 6] Leanza G.et al. "Selective lesioning of the basal forebrain cholinergic system by intraventricular 192 IgG-saporin: behavioural, biochemical and stereological studies in the rat." Eur. J. Neurosci. 7 (1995) 329-43. [비특허문헌 7] Leanza G. et al. "Selective immunolesioning of the basal forebrain cholinergic system disrupts short-term memory in rats." Eur. J. Neurosci. 8 (1996) 1535-44. [비특허문헌 8] Ogura H. et al. "Donepezil, a centrally acting acetylcholinesterase inhibitor, alleviates learning deficits in hypocholinergic models in rats." Methods Find Exp Clin Pharmacol. 22 (2000) 89-95. [비특허문헌 9] Spowart-Manning L. et al. "Spatial discrimination deficits by excitotoxic lesions in the Morris water escape task." Behav Brain Res. 156 (2005) 269-76. [비특허문헌 10] Bruce AP. et al. "Choline acetyltransferase activity and cognitive domain score of Alzheimer's patients." Neurobiol. Aging. 21 (2000) 11-17 [비특허문헌 11] Rogers SL. et al. "The efficacy and safety of donepezil in patients with Alzheimer's disease: results of a US Multicentre, Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial. The Donepezil Study Group." Dementia. 7 (1996) 293-303 [비특허문헌 12] Mori E. et al. "Donepezil for dementia with Lewy bodies: a randomized, placebo-controlled trial." Ann Neurol. 72 (2012) 41-52 [비특허문헌 13] Mufson EJ. et al. "Human cholinergic basal forebrain: chemoanatomy and neurologic dysfunction." J. Chem. Neuroanat. 26 (2003) 233-242 [비특허문헌 14] Mufson EJ. et al. "Cholinergic system during the progression of Alzheimer's disease: therapeutic implication." Expert. Rev. Neurother. 8 (2008) 1703-1718 [비특허문헌 15] Schliebs R. et al. "The significance of the cholinergic system in the brain during aging and in Alzheimer's disease." J. Neural. Transm 113 (2006) 1625-1644 [비특허문헌 16] Vana L et al. "Progression of tau pathology in cholinergic Basal forebrain neurons in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease." Am J Pathol. 179 (2011) 2533-2550.

본 발명의 목적은 콜린성 뉴런 활성화 및/또는 신경보호 효과를 갖고, 알츠하이머병, 루이소체 치매 및 치매 동반 파킨슨병용 치료제의 잠재적인 용도를 갖는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다.

상기 문제를 해결하기 위한 광범위한 연구의 결과로서, 본 발명자들은 콜린성 뉴런 활성화 및/또는 신경보호 효과를 갖는 펜타시클릭 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 발견하였다.

즉, 본 발명은 하기 <1> 내지 <26>에 관한 것이다.

<1> 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물:

3-플루오로-6,11-디메틸-6,7,10,11,12,13-헥사히드로벤조[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-5,14-디온:

[화학식 I]

,

5,10-디메틸-5,6,9,10,11,12-헥사히드로피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a]티에노[2,3-f][1,4]디아제핀-4,13-디온:

[화학식 II]

,

5,10-디메틸-5,6,9,10,11,12-헥사히드로피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a]티에노[3,2-f][1,4]디아제핀-4,13-디온:

[화학식 III]

,

(3aS,14aR)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온:

[화학식 IV]

,

(3aR,14aR)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온:

[화학식 V]

및

(3aS,14aS)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온:

[화학식 VI]

또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.

<2> 3-플루오로-6,11-디메틸-6,7,10,11,12,13-헥사히드로벤조[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-5,14-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:

[화학식 I]

.

<3> 5,10-디메틸-5,6,9,10,11,12-헥사히드로피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a]티에노[2,3-f][1,4]디아제핀-4,13-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:

[화학식 II]

.

<4> 5,10-디메틸-5,6,9,10,11,12-헥사히드로피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a]티에노[3,2-f][1,4]디아제핀-4,13-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:

[화학식 III]

.

<5> (3aS,14aR)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:

[화학식 IV]

.

<6> (3aR,14aR)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:

[화학식 V]

.

<7> (3aS,14aS)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:

[화학식 VI]

.

<8> <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는, 약제학적 조성물.

<9-1> <8>에 있어서, 뉴런 활성화제인, 약제학적 조성물.

<9-2> <8>에 있어서, 뉴런 보호제인, 약제학적 조성물.

<10> <8>에 있어서, 인지 기능장애의 치료를 위한, 약제학적 조성물.

<11> <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 인지 기능장애용 치료제.

<12> <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인지 기능장애의 치료 방법.

<13> 인지 기능장애의 치료에 사용하기 위한, <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.

<14> 인지 기능장애용 치료제의 제조를 위한, <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도.

<15> <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 알츠하이머병용 치료제.

<16> <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병의 치료 방법.

<17> 알츠하이머병의 치료에 사용하기 위한, <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.

<18> 알츠하이머병용 치료제의 제조를 위한, <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도.

<19> <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 루이소체 치매용 치료제.

<20> <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 루이소체 치매의 치료 방법.

<21> 루이소체 치매의 치료에 사용하기 위한, <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.

<22> 루이소체 치매용 치료제의 제조를 위한, <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도.

<23> <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 치매 동반 파킨슨병용 치료제.

<24> <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치매 동반 파킨슨병의 치료 방법.

<25> 치매 동반 파킨슨병의 치료에 사용하기 위한, <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.

<26> 치매 동반 파킨슨병용 치료제의 제조를 위한, <1> 내지 <7> 중 어느 하나에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용도.

본 발명에 따른 화학식 I 내지 화학식 VI으로 표현되는 펜타시클릭 화합물(이하 "화합물 I 내지 화합물 VI"이라고 지칭됨) 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염은, 하기에 제공된 약리학적 시험 실시예에서 활성 데이터에 나타낸 바와 같이, 뉴런 활성화 및/또는 신경보호 효과를 갖는다. 본 발명의 화합물 I 내지 화합물 VI은 이의 뉴런 활성화 및/또는 신경보호 효과로 인해서 인지 수행의 개선으로 이어지며, 따라서 알츠하이머병, 루이소체 치매 및 치매 동반 파킨슨병용 치료제로서의 잠재적인 용도를 갖는다.

이하, 본 발명의 내용을 상세히 기술할 것이다.

본 명세서에서, 화합물의 화학 구조는 편의를 위해서 구체적인 이성질체를 나타낼 수 있지만, 본 발명은 회전 이성질체 및 호변이성질체, 뿐만 아니라 이성질체 혼합물을 포함할 수 있고, 편의를 위해서 기재된 화학식에 제한되지 않고, 이성질체 중 임의의 것 또는 임의의 비율로 이성질체를 함유하는 혼합물일 수 있다.

추가로, 다형성 결정이 또한 존재할 수 있지만; 본 발명은 또한 그들 중 임의의 것에 제한되지 않고, 단일 결정형 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 더욱이, 본 발명은 또한 무정형 형태를 포함하고, 본 발명에 따른 화합물은 무수물 및 용매화물(특히 수화물)을 포함한다.

본 발명은 또한 화합물 I 내지 화합물 VI의 동위원소-표지된 화합물을 포함한다. 동위원소-표지된 화합물은, 하나 이상의 원자가 자연에서 일반적으로 발견되는 것과 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 하나 이상의 원자에 의해서 대체된 것을 제외하고는 화합물 I 내지 화합물 VI과 동일하다. 본 발명의 화합물에 혼입될 수 있는 동위원소의 예는 수소, 탄소, 질소, 산소, 플루오린, 인, 황, 아이오딘 및 염소의 동위원소를 포함하고, 구체적으로 ²H, ³H, ¹¹C, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁸O, ¹⁸F, ³²P, ³⁵S, ¹²³I, ¹²⁵I 등을 포함한다.

상기 동위원소-표지된 화합물, 예를 들어, 방사성 동위원소, 예컨대, ³H 및/또는 ¹⁴C가 혼입된 화합물이 의약 및/또는 기질의 조직 분포 검정에 유용하다. ³H 및 ¹⁴C는 이의 제조 및 검출 용이성으로 인해서 유용하다고 간주된다. 동위원소 ¹¹C 및 ¹⁸F는 PET(양전자 방출 단층촬영술(positron emission tomography))에 유용하다고 간주되며, 동위원소 ¹²⁵I는 SPECT(단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영술(single-photon emission computed tomography))에 유용하다고 간주되며, 이들 모두는 뇌 영상화에 유용하다. 더 무거운 동위원소, 예컨대, ²H에 의한 대체는, 생체내 반감기 증가 또는 더 높은 대사 안정성에 기반한 필요 용량의 감소를 비롯한, 일부 유형의 치료 이점을 초래하고, 따라서 특정 상황 하에서 유용하다고 간주된다. 상기 동위원소-표지된 화합물은 동위원소로 표지되지 않은 시약 대신에 동위원소로 표지된 용이하게 사용 가능한 시약을 사용하여 하기 실시예에 개시된 절차를 수행함으로써 유사하게 제조될 수 있다.

본 명세서에서 "약제학적으로 허용 가능한 염"은, 그것이 본 발명에 따른 화합물을 사용하여 형성된 염인 한 특별히 제한되지 않으며, 구체적인 예는 산 부가 염, 예컨대, 무기산 염, 유기산 염 및 산성 아미노산 염을 포함한다.

본 명세서에서 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 임의의 특별한 제한 설명이 존재하지 않는 한 적합한 비로 형성된 임의의 염이며, 형성된 염에서 화합물 분자당 산 분자의 수는 특별히 제한되지 않지만; 화합물 분자당 산 분자의 수가 약 0.5개 내지 약 2개인 것이 바람직하고, 화합물 분자당 산 분자의 수가 약 0.5개, 약 1개 또는 약 2개인 것이 보다 바람직하다.

무기산 염의 바람직한 예는 염산염, 브로민화수소산염, 황산염, 질산염 및 인산염을 포함하고; 유기산 염의 바람직한 예는 아세트산염, 석신산염, 푸마르산염, 말레산염, 타르타르산염, 시트르산염, 락트산염, 스테아르산염, 벤조산염, 메탄설폰산염, p-톨루엔설폰산염 및 벤젠설폰산염을 포함한다.

산성 아미노산 염의 바람직한 예는 아스파르트산염 및 글루탐산염을 포함한다.

본 발명에 따른 화합물 I 내지 화합물 VI이 유리 형태로 수득되는 경우, 이것은 종래의 방법에 따라서 화합물 I 내지 화합물 VI 또는 이의 수화물에 의해서 형성될 수 있는 염으로 전환될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물 I 내지 화합물 VI이 화합물 I 내지 화합물 VI 또는 화합물 I 내지 화합물 VI의 수화물로서 수득되는 경우, 이것은 종래의 방법에 따라서 화합물 I 내지 화합물 VI의 유리 형태로 전환될 수 있다.

더욱이, 본 발명에 따른 화합물 I 내지 화합물 VI으로부터 수득된 다양한 이성질체(예를 들어, 광학 이성질체, 회전 이성질체, 입체이성질체 등)는 일반적인 분리 수단, 예컨대, 재결정화, 부분입체이성질체 염 방법, 효소적 분할 방법 및 다양한 크로마토그래피 기술(예를 들어, 박막 크로마토그래피, 컬럼 크로마토그래피, 기체 크로마토그래피 등)에 의해서 분리 및 단리될 수 있다.

[약제학적 제제]

본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 화합물 I 내지 화합물 VI의 군으로부터 선택된 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염과 혼합함으로써 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은, 공지된 방법, 예를 들어, 문헌[General Rules for Preparations of The Japanese Pharmacopoeia Seventeenth Edition]에 기재된 방법에 의해서 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 이의 투여형에 따라서 환자에게 적절하게 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물 I 내지 화합물 VI 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 용량은 증상의 중증도, 연령, 성별, 체중, 투여형, 염의 유형, 질병의 구체적인 유형 및 다른 질환에 따라서 달라지지만; 일반적으로 성인의 경우 경구 투여에 의한 1일당 용량은 약 30 μg 내지 10 g, 바람직하게는 100 μg 내지 5 g, 보다 바람직하게는 100 μg 내지 1 g이고; 성인의 경우 주사에 의한 1일당 용량은 약 30 μg 내지 1 g, 바람직하게는 100 μg 내지 500 mg, 보다 바람직하게는 100 μg 내지 300 mg이고; 상기 용량은 1회 또는 수 회 투여된다.

본 발명의 화합물은 생물활성 저분자량 화합물의 표적 단백질을 포획하기 위한 화학 프로브로서 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 화합물은 예를 들어, 문헌[J. Mass Spectrum. Soc. Jpn. Vol. 51, No. 5, 2003, pp. 492-498], 특허 WO2007/139149 등에 기재된 방법을 사용하여 화합물의 활성의 발생에 본질적인 구조 모이어티와 상이한 모이어티에 표지기, 링커 등을 도입함으로써 친화성 크로마토그래피 프로브, 광친화성 프로브 등으로 전환될 수 있다.

화학 프로브에서 사용되는 표지기, 링커 등의 예는 하기 (1) 내지 (5)로 이루어진 군에 나타낸 기를 포함한다:

(1) 단백질-표지기, 예컨대, 광친화성-표지기(예를 들어, 벤조일 기, 벤조페논 기, 아지드 기, 카르보닐아지드 기, 디아지리딘 기, 엔온 기, 디아조 기, 니트로 기 등) 및 화학 친화성 기(예를 들어, 알파 탄소 원자가 할로겐 원자에 의해서 대체된 케톤 기, 카르바모일 기, 에스테르 기, 알킬티오 기, 마이클 받개(Michael acceptor), 예컨대, α,β-불포화 케톤 또는 에스테르 및 옥시란 기);

(2) 절단 가능한 링커, 예컨대, -S-S-, -O-Si-O-, 단당류(글루코스 기, 갈락토스 기 등), 또는 이당류(락토스 등); 및 효소 반응에 의해서 절단 가능한 올리고펩타이드 링커;

(3) 피싱 태그 기(fishing tag group), 예컨대, 비오틴 및 3-(4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4H-3a,4a-디아자-4-보라-s-인다센-3-일)프로피오닐 기;

(4) 방사성 표지기, 예컨대, ¹²⁵I, ³²P, ³H 및 ¹⁴C; 형광 표지기, 예컨대, 플루오레세인, 로다민, 단실, 움벨리페론, 7-니트로푸라잔일 및 3-(4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4H-3a,4a-디아자-4-보라-s-인다센-3-일)프로피오닐 기; 화학발광기, 예컨대, 루시페린 및 루미놀; 및 중금속 이온, 예컨대, 란탄족 금속 이온 및 라듐 이온을 검출할 수 있는 마커; 또는

(5) 고체 담체, 예컨대, 유리 비드, 유리층(glass bed), 마이크로타이터 플레이트, 아가로스 비드, 아가로스층(agarose bed), 폴리스티렌 비드, 플리스티렌층(polystyrene bed), 나일론 비드 및 나일론층(nylon bed).

상기 (1) 내지 (5)로 이루어진 군으로부터 선택된 표지기 등을 상기 문헌 등에 기재된 방법에 의해서 본 발명의 화합물에 도입함으로써 제조된 프로브는 신규 약물 설계 표적 등을 탐색하는 데 유용한 표지된 단백질을 식별하기 위한 화학 프로브로서 사용될 수 있다.

실시예

본 발명의 화합물 I 내지 화합물 VI은, 예를 들어 하기 실시예에 기재된 방법에 의해서 제조될 수 있고, 화합물의 효과는 하기 시험 실시예에 기재된 방법에 의해서 확인될 수 있다. 그러나, 이것은 단지 예이며, 본 발명은 어떠한 경우에도 하기 구체적인 실시예에 제한되지 않고, 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다.

문헌명 등과 함께 기재된 화합물은 그 화합물이 그 문헌 등에 따라서 제조되었다는 것을 나타낸다.

또한, 본 명세서에서 사용된 약어는 널리 공지되어 있고, 당업자에게 일반적이다. 본 명세서에서, 하기 약어를 사용한다.

DCE: 1,2-디클로로에탄

DCM: 디클로로메탄

DIPEA: N,N-디이소프로필에틸아민

DMT-MM: 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트라이진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드

DMSO: 디메틸설폭시드

EDC: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 염산염

HATU: O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

HOBT: 1-히드록시벤조트리아졸

n-: 노르말

NMM: N-메틸모르폴린

t-: 3차

TBD: 1,3,4,6,7,8-헥사히드로-2H-피리미도[1,2-a]피리미딘

TBME: 3차 부틸 메틸 에테르

TEA: 트리에틸아민

THF: 테트라히드로푸란

¹H-NMR: 양성자 핵 자기 공명 분광분석법

MS: 질량 분광분석법

HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피

하기 실시예 및 제조 실시예에서 용어 "실온"은 일반적으로 약 10℃ 내지 약 35℃를 지칭한다. %는 달리 명시되지 않는 한 중량 백분율을 지칭한다.

양성자 핵 자기 공명 스펙트럼의 화학적 이동은 테트라메틸실란에 대한 δ-단위(ppm)를 나타내고, 커플링 상수는 헤르츠(Hz)로 기록된다. 패턴은 s: 단일항, d: 이중항, t: 삼중항, q: 사중항, m: 다중항, br: 넓음, br.s: 넓은 단일항으로 지정된다.

화합물의 광학 분할을 위해서, 바이오티지(Biotage)에 의해 제조된 Parallex Flex(TM)(컬럼: 다이셀(DAICEL)에 의해서 제조된 CHIRALPAK (R) AD-H, IA, IB 및 IC 중 하나; 및 다이셀에 의해서 제조된 CHIRALCEL (R) OD-H 및 OJ-H)를 사용하였다.

제조 실시예, 참조 실시예 및 실시예에서 마이크로파 반응기를 사용한 반응에서, 바이오티지에 의해서 제조된 개시제(TM) 또는 개시제+ (TM)를 사용하였다.

크로마토그래피와 관련하여, 실리카겔로서, 머크(Merck)에 의해서 제조된 실리카겔60(70 내지 230 메시 또는 230 내지 400 메시 ASTM) 또는 후지 실리시아 케미컬 엘티디.(Fuji Silysia Chemical Ltd.)에 의해서 제조된 PSQ60B를 사용하거나, 또는 사전 충전된 컬럼{컬럼: 야마젠(YAMAZEN)에 의해서 제조된 Hi-Flash(TM) 컬럼(실리카겔), 크기: S(16 x 60 mm), M(20 x 75 mm), L(26 x 100 mm), 2L(26 x 150 mm) 및 3L(46 x 130 mm) 중 하나; 또는 바이오티지에 의해서 제조된 바이오티지(TM) SNAP Ultra Silica Cartridge, 크기: 10 g, 25 g 및 50 g 중 하나}을 사용하였다.

NH 실리카겔로서, 후지 실리시아 케미컬 엘티디.에 의해서 제조된 CHROMATOREX NH-DM2035를 사용하거나, 또는 사전 충전된 컬럼{컬럼: 야마젠에 의해서 제조된 Hi-Flash(TM) 컬럼(아미노), 크기: S(16 x 60 mm), M(20 x 75 mm), L(26 x 100 mm), 2 L(26 x 150 mm) 및 3 L(46 x 130 mm) 중 하나; 또는 와코 퓨어 케미컬 인더스트리즈, 엘티디.(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)에 의해서 제조된 Presep(TM)(Luer Lock) NH2(HC), 크기: 타입 M(14 g/25 mL), 타입 L(34 g/70 mL), 타입 2 L(50 g/100 mL) 및 타입 3 L(110 g/200 mL) 중 하나}을 사용하였다.

일반적으로 사용되는 시약을 제외하고 하기에 나타낸 화합물의 명칭으로서, "E-Notebook" Version 12(PerkinElmer)에 제시된 것을 사용하였다.

제조 실시예 1

에틸 2-아미노-6-메틸-4,5,6,7-테트라히드로티에노[2,3-c]피리딘-3-카르복실레이트의 합성

TEA(61.6 mL, 442 mmol)를 실온에서 1-메틸-4-피페리돈(카스 번호 1445-73-4)(51.5 mL, 442 mmol), 에틸 시아노아세테이트(카스 번호 105-56-6)(47.2 mL, 442 mmol), 황(카스 번호 7704-34-9)(14.2 g, 442 mmol) 및 에탄올(800 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 15시간 동안 교반하고, 이어서 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(NH 실리카겔, 에틸 아세테이트)에 의해서 정제하였다. 수득된 농축된 잔류물을 에틸 아세테이트로 배산처리하였다. 침전물을 여과에 의해서 수집하고, 에틸 아세테이트로 세척하고, 감압 하에서 건조시켜 표제 화합물(58.4 g)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 1.33 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.62-2.70 (m, 2H), 2.79-2.88 (m, 2H), 3.37 (t, J = 2.0 Hz, 2H), 4.26 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 5.97 (br. s, 2H).

MS (ESI) m/z: 241 [M+H]⁺

제조 실시예 2

7-플루오로-4-메틸-3,4-디히드로-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-2,5-디온의 합성

사르코신(카스 번호 107-97-1)(5.16 g, 58.0 mmol)을 실온에서 피리딘(100 mL) 중의 6-플루오로-1H-벤조[d][1,3]옥사진-2,4-디온(카스 번호 321-69-7)(10.0 g, 55.2 mmol)의 용액에 첨가하고, 반응 혼합물을 100℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시켰다. 침전물을 여과에 의해서 수집하고, 디에틸 에테르로 세척하였다. 수득된 고형물을 감압 하에서 건조시켜 표제 화합물(5.34 g)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 3.30 (s, 3H), 3.90 (s, 2H), 6.97 (dd, J = 8.8, 4.5 Hz, 1H), 7.20 (ddd, J = 8.6, 7.6, 2.9 Hz, 1H), 7.67 (dd, J = 9.0, 3.1 Hz, 1H), 7.99 (br. s, 1H).

MS (ESI) m/z: 209 [M+H]⁺

제조 실시예 3

4-메틸-3,4-디히드로-1H-티에노[3,2-e][1,4]디아제핀-2,5-디온의 합성

1H,2H,4H-티에노[3,2-d][1,3]옥사진-2,4-디온(카스 번호 78756-28-2)(300 mg, 1.77 mmol), 사르코신(395 mg, 4.43 mmol) 및 물(10 mL)의 혼합물을 2시간 동안 환류 하에서 가열하였다. 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시켰다. 침전물을 여과에 의해서 수집하고, 물 및 디에틸 에테르로 순차적으로 세척하였다. 수득된 고형물을 감압 하에서 건조시켜 표제 화합물(165 mg)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 3.24 (s, 3H), 4.00 (s, 2H), 6.72 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 7.52 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 7.96 (br. s, 1H).

MS (ESI) m/z: 197 [M+H]⁺

제조 실시예 4

4-메틸-3,4-디히드로-1H-티에노[2,3-e][1,4]디아제핀-2,5-디온의 합성

1H,2H,4H-티에노[2,3-d][1,3]옥사진-2,4-디온(카스 번호 103979-54-0)(600 mg, 3.55 mmol)을 물(12 mL) 중의 사르코신(790 mg, 8.87 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.5시간 동안 환류 하에서 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시켰다. 클로로포름을 반응 혼합물에 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수층을 클로로포름(2회) 및 에틸 아세테이트(3회)로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 수득된 고형물을 건조시켜 표제 화합물(430 mg)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 3.23 (s, 3H), 3.99 (s, 2H), 6.90 (d, J = 5.9 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 8.39 (br. s, 1H).

MS (ESI) m/z: 197 [M+H]⁺

제조 실시예 5

(5aS,8aR)-4-메틸옥타히드로시클로펜타[e][1,4]디아제핀-2,5-디온의 합성

(1) 메틸 2-((1S,2R)-2-((t-부톡시카르보닐)아미노)-N-메틸시클로펜탄카르복스아미드)아세테이트의 합성

TEA(22.2 mL, 159 mmol), HOBT/일수화물(11.7 g, 76.3 mmol) 및 EDC(14.6 g, 76.3 mmol)를 얼음 냉각 하에서 (1S,2R)-2-((t-부톡시카르보닐)아미노)시클로펜탄-1-카르복실산(카스 번호 137170-89-9)(14.6 g, 63.6 mmol), 사르코신 메틸 에스테르 염산염(카스 번호 13515-93-0)(10.7 g, 76.3 mmol), 및 THF(150 mL)의 혼합물에 순차적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15시간 동안 교반한 후, 에틸 아세테이트 및 물을 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 중탄산나트륨 수성 용액 및 포화 염화나트륨 용액으로 순차적으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 수득된 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 25 내지 30% 에틸 아세테이트/n-헵탄)에 의해서 2회 정제하여 표제 화합물(16.1 g)을 수득하였다.

MS (ESI) m/z: 337 [M+Na]⁺

(2) (5aS,8aR)-4-메틸옥타히드로시클로펜타[e][1,4]디아제핀-2,5-디온의 합성

4 N 염화수소/1,4-디옥산 용액(160 mL, 640 mmol)을 얼음 냉각 하에서 메틸 2-((1S,2R)-2-((t-부톡시카르보닐)아미노)-N-메틸시클로펜탄카르복스아미드)아세테이트(16.1 g, 51.3 mmol)에 첨가하였다. 반응 혼합물을 동일한 온도에서 30분 동안 교반하고, 이어서 실온에서 45분 동안 교반하고, 감압 하에서 농축시켰다. TBD(8.57 g, 61.6 mmol)를 물 냉각 하에서 메탄올(130 ml) 중의 잔류물의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 물 냉각 하에서 3시간 동안 교반하고, 이어서 0℃까지 냉각시켰다. 생성된 고체를 여과에 의해서 수집하고, 얼음 냉각된 메탄올로 3회 세척하고, 감압 하에서 건조시켜 표제 화합물(5.22 g)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 1.41-1.59 (m, 2H), 1.78-1.98 (m, 2H), 2.00-2.15 (m, 1H), 2.36-2.53 (m, 1H), 3.08 (s, 3H), 3.18-3.32 (m, 1H), 3.49 (dd, J = 15.5, 1.7 Hz, 1H), 3.91-4.04 (m, 1H), 4.51 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 5.54 (br. s, 1H).

MS (ESI) m/z: 183 [M+H]⁺

제조 실시예 6

(5aR,8aR)-4-메틸옥타히드로시클로펜타[e][1,4]디아제핀-2,5-디온의 합성

(1) t-부틸 2-((1R,2R)-2-((t-부톡시카르보닐)아미노)-N-메틸시클로펜탄카르복스아미드)아세테이트의 합성

DIPEA(1.81 mL, 10.5 mmol) 및 HATU(1.99 g, 5.23 mmol)를 실온에서 (1R,2R)-t-부톡시카르보닐-2-아미노시클로펜탄카르복실산(카스 번호 245115-25-7)(1.00 g, 4.36 mmol), 사르코신 t-부틸 에스테르 염산염(카스 번호 136088-69-2)(872 mg, 4.80 mmol) 및 DCM(10 mL)의 혼합물에 순차적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 이어서 직접 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 30% 내지 50% 에틸 아세테이트/n-헵탄)에 의해서 정제하여 표제 화합물(1.61 g)을 수득하였다.

MS (ESI) m/z: 357 [M+H]⁺

(2) (5aR,8aR)-4-메틸옥타히드로시클로펜타[e][1,4]디아제핀-2,5-디온의 합성

4 N 염화수소/1,4-디옥산 용액(16 mL, 64 mmol)을 실온에서 t-부틸 2-((1R,2R)-2-((t-부톡시카르보닐)아미노)-N-메틸시클로펜탄카르복스아미드)아세테이트(1.61 g, 4.52 mmol)에 첨가하고, 혼합물을 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시켰다. 중탄산나트륨(0.911 g, 10.8 mmol), 메탄올(24 mL), NMM(0.099 mL, 0.90 mmol) 및 DMT-MM(12.3% H₂O, 1.80 g, 5.70 mmol)을 실온에서 잔류물에 순차적으로 첨가하고, 혼합물을 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 DCM으로 세척하였다. 세척된 액체를 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 5% 내지 20% 메탄올/에틸 아세테이트)에 의해서 정제하여 표제 화합물(745 mg)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 1.56-1.88 (m, 3H), 1.91-2.02 (m, 1H), 2.13-2.23 (m, 1H), 2.26-2.39 (m, 1H), 3.07 (s, 3H), 3.08-3.16 (m, 1H), 3.51-3.62 (m, 1H), 3.79 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 4.58 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 6.76 (br. s, 1H).

MS (ESI) m/z: 183 [M+H]⁺

제조 실시예 7

(5aS,8aS)-4-메틸옥타히드로시클로펜타[e][1,4]디아제핀-2,5-디온의 합성

(1) t-부틸 2-((1S,2S)-2-((t-부톡시카르보닐)아미노)-N-메틸시클로펜탄카르복스아미드)아세테이트의 합성

HATU(1.99 g 5.23 mmol)를 실온에서 (1S,2S)-t-부톡시카르보닐-2-아미노시클로펜탄카르복실산(카스 번호 143679-80-5)(1.00 g, 4.36 mmol), 사르코신 t-부틸 에스테르 염산염(872 mg, 4.80 mmol), DIPEA(1.81 mL, 10.5 mmol) 및 DCM(10 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 이어서 직접 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 30-50% 에틸 아세테이트/n-헵탄)에 의해서 정제하여 표제 화합물(1.55 g)을 수득하였다.

MS (ESI) m/z: 357 [M+H]⁺

(2) (5aS,8aS)-4-메틸옥타히드로시클로펜타[e][1,4]디아제핀-2,5-디온의 합성

4 N 염화수소/1,4-디옥산 용액(16 mL, 64 mmol)을 실온에서 t-부틸 2-((1S,2S)-2-((t-부톡시카르보닐)아미노)-N-메틸시클로펜탄카르복스아미드)아세테이트(1.55 g, 4.35 mmol)에 첨가하고, 혼합물을 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시켰다. 중탄산나트륨(0.877 g, 10.4 mmol), 메탄올(24 mL), NMM(0.096 mL, 0.87 mmol) 및 DMT-MM(12.3% H₂O, 1.73 g, 5.48 mmol)을 실온에서 잔류물에 순차적으로 첨가하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 DCM으로 세척하였다. 세척된 액체를 감압 하에서 농축시키고, 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 0-20% 메탄올/에틸 아세테이트)에 의해서 정제하여 표제 화합물(753 mg)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 1.55-1.88 (m, 3H), 1.91-2.02 (m, 1H), 2.11-2.22 (m, 1H), 2.25-2.40 (m, 1H), 3.07 (s, 3H), 3.07-3.16 (m, 1H), 3.51-3.62 (m, 1H), 3.78 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 18.0 Hz, 1H), 6.54 (br. s, 1H).

MS (ESI) m/z: 183 [M+H]⁺

실시예 1

3-플루오로-6,11-디메틸-6,7,10,11,12,13-헥사히드로벤조[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-5,14-디온의 합성

옥시염화인(4.65 mL, 49.9 mmol)을 실온에서 제조 실시예 1에서 수득된 에틸 2-아미노-6-메틸-4,5,6,7-테트라히드로티에노[2,3-c]피리딘-3-카르복실레이트(6.00 g, 25.0 mmol), 제조 실시예 2에서 수득된 7-플루오로-4-메틸-3,4-디히드로-1H-벤조[e][1,4]디아제핀-2,5-디온 (5.20 g, 25.0 mmol) 및 DCE(300 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 20시간 동안 교반하였다. 얼음 냉각 하에서 교반하면서, 소듐 에톡시드(에탄올 중의 20% 용액, 80 mL, 207 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 포화 중탄산나트륨 수성 용액 및 에틸 아세테이트를 반응 혼합물에 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 순차적으로 컬럼 크로마토그래피(NH 실리카겔, 50% 내지 100% 에틸 아세테이트/n-헵탄) 및 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 0% 내지 50% 메탄올/에틸 아세테이트)에 의해서 정제하였다. 수득된 고형물을 TBME로 배산처리하고, 침전물을 여과에 의해서 수집하였다. 수득된 고형물을 TBME로 세척하고, 감압 하에서 건조시켜 표제 화합물(4.56 g)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 2.51 (s, 3H), 2.66-2.76 (m, 1H), 2.77-2.88 (m, 1H), 3.04-3.18 (m, 2H), 3.25 (s, 3H), 3.57-3.75 (m, 2H), 4.09 (d, J = 15.2 Hz, 1H), 4.47 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 7.25-7.31 (m, 1H), 7.60-7.64 (m, 1H), 7.67 (dd, J = 9.0, 4.7 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 385 [M+H]⁺

실시예 2

5,10-디메틸-5,6,9,10,11,12-헥사히드로피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a]티에노[2,3-f][1,4]디아제핀-4,13-디온의 합성

옥시염화인(0.157 mL, 1.68 mmol)을 실온에서 제조 실시예 1에서 수득된 에틸 2-아미노-6-메틸-4,5,6,7-테트라히드로티에노[2,3-c]피리딘-3-카르복실레이트 (303 mg, 1.26 mmol), 제조 실시예 3에서 수득된 4-메틸-3,4-디히드로-1H-티에노[3,2-e][1,4]디아제핀-2,5-디온(165 mg, 0.841 mmol) 및 1,4-디옥산(10 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 90℃에서 5시간 동안 교반하였다. 소듐 에톡시드(에탄올 중의 20% 용액, 2.60 mL, 6.73 mmol)를 실온까지 냉각된 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 40분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트 및 포화 중탄산나트륨 수성 용액을 반응 혼합물에 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 50% 메탄올/에틸 아세테이트)에 의해서 정제하여 표제 화합물(90.0 mg)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 2.51 (s, 3H), 2.66-2.87 (m, 2H), 3.07-3.20 (m, 2H), 3.26 (s, 3H), 3.56-3.74 (m, 2H), 4.21 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 15.0 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 5.3 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 5.3 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 373 [M+H]⁺

실시예 3

5,10-디메틸-5,6,9,10,11,12-헥사히드로피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a]티에노[3,2-f][1,4]디아제핀-4,13-디온의 합성

옥시염화인(1.43 mL, 15.3 mmol)을 실온에서 제조 실시예 4에서 수득된 4-메틸-3,4-디히드로-1H-티에노[2,3-e][1,4]디아제핀-2,5-디온(1.00 g, 5.10 mmol), 제조 실시예 1에서 수득된 에틸 2-아미노-6-메틸-4,5,6,7-테트라히드로티에노[2,3-c]피리딘-3-카르복실레이트(1.84 g, 7.64 mmol) 및 1,4-디옥산(30 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5분 동안 교반하고, 90℃에서 2시간 동안 교반하였다. 소듐 에톡시드(에탄올 중의 20% 용액, 21.7 mL, 56.1 mmol)를 실온까지 냉각된 반응 혼합물에 5분에 걸쳐서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트, 포화 중탄산나트륨 수성 용액 및 물을 반응 혼합물에 순차적으로 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하고, 여과액을 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(실리카겔, 20% 내지 50% 메탄올/에틸 아세테이트)에 의해서 정제하였다. 수득된 고형물을 에탄올로 배산처리하고, 침전물을 여과에 의해서 수집하였다. 수득된 고형물을 에탄올로 세척하고, 감압 하에서 건조시켜 표제 화합물(712 mg)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 2.52 (s, 3H), 2.71-2.87 (m, 2H), 3.05-3.30 (m, 5H), 3.59-3.75 (m, 2H), 4.23 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 14.8 Hz, 1H), 7.35 (d, J = 6.2 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 5.9 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 373 [M+H]⁺

실시예 4

(3aS,14aR)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온의 합성

옥시염화인(7.93 mL, 85.1 mmol)을 실온에서 제조 실시예 5-(2)에서 수득된 (5aS,8aR)-4-메틸옥타히드로시클로펜타[e][1,4]디아제핀-2,5-디온(3.10 g, 17.0 mmol), 제조 실시예 1에서 수득된 에틸 2-아미노-6-메틸-4,5,6,7-테트라히드로티에노[2,3-c]피리딘-3-카르복실레이트(8.18 g, 34.0 mmol) 및 DCE(300 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃에서 14.5시간 동안 교반하였다. 포화 중탄산나트륨 수성 용액을 0℃에서 반응 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3.5시간 동안 교반하고, 이어서 유기층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 중탄산나트륨 수성 용액 및 포화 염화나트륨 용액으로 순차적으로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(NH 실리카겔, 30% 내지 60% 에틸 아세테이트/n-헵탄)에 의해서 정제하였다. 수득된 농축된 잔류물을 TBME로 배산처리하고, 침전물을 여과에 의해서 수집하였다. 수득된 고형물을 TBME로 3회 세척하고, 감압 하에서 건조시켜 표제 화합물(3.70 g)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 1.51-1.73 (m, 2H), 1.94-2.18 (m, 2H), 2.30-2.41 (m, 1H), 2.44-2.59 (m, 4H), 2.71-2.82 (m, 2H), 3.04-3.19 (m, 5H), 3.42-3.54 (m, 1H), 3.64 (s, 2H), 4.17 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 15.6 Hz, 1H), 5.69-5.82 (m, 1H).

MS (ESI) m/z: 359 [M+H]⁺

비선광도: [α] _D ²⁰ -146.0 (c 0.50, CHCl₃)

HPLC에 의한 분석:

(분석 조건) 컬럼: CHIRALPAK IB(다이셀 케미컬 인더스트리즈, 엘티디.에 의해서 제조됨)(0.46 cm φ x 15 cm), 40℃, 용리: 에탄올/헥산 = 20/80(v/v), 유량: 1 ml/min., 검출: UV(254 nm).

(분석 결과) 표제 화합물을 상기 분석 조건 하에서 분석한 경우, 체류 시간은 10.38분이었고, 광학 순도는 98%ee 초과였고, 광학 회전은 (-)였다. 출발 물질로서 라세미체 혼합물을 사용하여 유사하게 합성된 생성물에 의해서 거울상이성질체의 체류 시간을 확인하였다.

실시예 5

(3aR,14aR)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온의 합성

옥시염화인(0.793 mL, 8.51 mmol)을 실온에서 제조 실시예 6-(2)에서 수득된 (5aR,8aR)-4-메틸옥타히드로시클로펜타[e][1,4]디아제핀-2,5-디온 (310 mg, 1.70 mmol), 제조 실시예 1에서 수득된 에틸 2-아미노-6-메틸-4,5,6,7-테트라히드로티에노[2,3-c]피리딘-3-카르복실레이트(613 mg, 2.55 mmol) 및 DCE(16 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 2.5시간 동안 교반하고, 이어서 실온으로 복귀시키고, 에틸 아세테이트(15 mL) 및 포화 중탄산나트륨 수성 용액(30 mL)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5일 동안 교반하고, 에틸 아세테이트를 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(NH 실리카겔, 50% 내지 70% 에틸 아세테이트/n-헵탄)에 의해서 정제하였다. 수득된 생성물을 디에틸 에테르로 3회 세척하고, 이어서 TBME로 세척하고, 감압 하에서 건조시켜 표제 화합물(143 mg)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 1.29-1.49 (m, 1H), 1.68-1.83 (m, 1H), 1.82-2.21 (m, 3H), 2.50 (s, 3H), 2.76 (t, J = 5.7 Hz, 2H), 2.98-3.23 (m, 6H), 3.40-3.54 (m, 1H), 3.57-3.68 (m, 2H), 4.17-4.34 (m, 2H), 5.30 (d, J = 17.4 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 359 [M+H]⁺

HPLC에 의한 분석:

(분석 조건) 컬럼: CHIRALPAK IC(다이셀 케미컬 인더스트리즈, 엘티디.에 의해서 제조됨)(0.46 cm φ x 15 cm), 40℃, 용리: 에탄올, 유량: 1 mL/min., 검출: UV(254 nm)

(분석 결과) 표제 화합물의 체류 시간은 6.64분이었고, 광학 순도는 99%ee 초과였고, 광학 회전은 (-)였다.

실시예 6

(3aS,14aS)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온의 합성

옥시염화인(0.859 mL, 9.22 mmol)을 실온에서 제조 실시예 7-(2)에서 수득된 (5aS,8aS)-4-메틸옥타히드로시클로펜타[e][1,4]디아제핀-2,5-디온(336 mg, 1.84 mmol), 제조 실시예 1에서 수득된 에틸 2-아미노-6-메틸-4,5,6,7-테트라히드로티에노[2,3-c]피리딘-3-카르복실레이트(665 mg, 2.77 mmol) 및 DCE(17 mL)의 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 3.5시간 동안 교반하고, 이어서 실온까지 복귀시켰다. 에틸 아세테이트(15 mL) 및 포화 중탄산나트륨 수성 용액(30 mL)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5일 동안 교반한 후, 에틸 아세테이트를 첨가하고, 유기층을 분리하였다. 수층을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합한 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에서 농축시켰다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(NH 실리카겔, 40% 내지 80% 에틸 아세테이트/n-헵탄)에 의해서 정제하였다. 수득된 생성물을 디에틸 에테르로 3회 세척하고, 감압 하에서 건조시켜 표제 화합물(166 mg)을 수득하였다.

¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 1.31-1.50 (m, 1H), 1.69-1.83 (m, 1H), 1.84-1.97 (m, 1H), 1.97-2.20 (m, 2H), 2.50 (s, 3H), 2.73-2.80 (m, 2H), 3.02-3.23 (m, 6H), 3.41-3.55 (m, 1H), 3.57-3.69 (m, 2H), 4.19-4.34 (m, 2H), 5.30 (d, J = 17.2 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 359 [M+H]⁺

(분석 결과) 표제 화합물의 체류 시간은 8.34분이었고, 광학 순도는 99%ee 초과였고, 광학 회전은 (+)였다.

약리학적 시험 실시예

실시예 1 내지 6의 화합물을 사용하여 하기 약리학적 시험을 수행하였다.

NGF의 존재 하에서 래트 일차 격벽 뉴런(septal neuron) 배양 시스템에서 아세틸콜린(ACh) 방출의 측정

(1) 래트 일차 격벽 뉴런 배양

태아 연령 18일의 Sprague-Dawley(SD) 래트(찰스 리버 래보러토리즈 재팬, 인크.(Charles River Laboratories Japan, Inc.))로부터 중격 영역을 단리하고, 배양하였다. 구체적으로, 이소플루란 마취 하에서, 임신한 래트로부터 태아를 무균적으로 제거하였다. 각각의 태아로부터 뇌를 추출하고, 얼음 냉각된 L-15 배지(11415-064, 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)) 중에 침지하였다. 중격 영역을 입체 현미경 하에서 추출된 뇌로부터 해부하였다. 해부된 중격 영역을 37℃에서 30분 동안 0.25% 트립신(15050-065, 써모 피셔 사이언티픽) 및 0.01% DNase(D5025-150KU, 시그마(Sigma))를 함유하는 효소 용액 중에서 효소 처리에 적용함으로써, 세포를 분산시켰다. 이 경우, 불활성화된 말 혈청(26050-088, 써모 피셔 사이언티픽)을 첨가함으로써 효소 반응을 중단시켰다. 효소-처리된 용액을 1000 rpm에서 3분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 10 mL의 양의 배지를 수득된 세포 덩어리에 첨가하였다. 사용된 배지는 N2 보충물(17502-048, 써모 피셔 사이언티픽), 1 mM 피루브산나트륨(11360-070, 써모 피셔 사이언티픽) 및 페니실린-스트렙토마이신(15140-1221, 써모 피셔 사이언티픽)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(044-29765, 와코(WAKO))였다. 배지를 첨가한 세포 덩어리의 세포를 약한 피펫팅에 의해서 재분산시키고, 이어서 1000 rpm에서 3분 동안 다시 원심분리하고, 상청액을 제거하였다. 10 mL의 양의 배지를 수득된 세포 덩어리에 첨가하고, 세포 분산액을 40-μm 나일론 메시(셀 스트레이너(Cell Strainer))를 통해서 여과하여 세포 덩어리를 제거함으로써, 뉴런 세포 현탁액을 수득하였다. 뉴런 세포 현탁액을 배지로 희석하고, 10%의 불활성화된 소 혈청(26140-079, 써모 피셔 사이언티픽) 및 10%의 불활성화된 말 혈청을 첨가하였다. 그 후, 초기 배양 밀도가 1.4 x 10⁵개 세포/cm²가 되도록, 100 μL/웰의 현탁액을 폴리-D-리신으로 사전 코팅된 96-웰 플레이트(354461, 코닝(CORNING))에 시딩하였다. 시딩된 세포를 37℃ 인큐베이터 내에서 5% CO₂-95% 공기 하에서 2일 동안 배양한 후, 전체 배지를 120 μL의 새로운 배지로 대체하고, 그 다음 세포를 5일 동안 배양하였다.

(2) 화합물 첨가

배양 7일 째에, 화합물을 하기 방식으로 첨가하였다. 농도가 최종 농도보다 10배 더 높도록 DMSO 중의 시험 화합물의 용액을 배지로 희석시켰다. NGF(450-01, 페프로 테크, 인크.(PEPRO TECH, INC.))를 0.3 ng/mL로 제조하였다. 이러한 두 용액을 각각 15 μL/웰의 양으로 첨가하고, 혼합물을 잘 혼합하였다. 최종 DMSO 농도는 0.1% 이하였다. 추가로, DMSO 및 NGF 만을 대조군에 첨가하였다.

(3) ACh 방출 측정

화합물 첨가 후 1일 째에, 하기 방식으로 HPLC에 의해서 ACh 방출량을 측정하였다. 배지를 제거한 후, 가온된 완충액을 100 μL/웰로 각각의 웰에 첨가하고, 완충액을 즉시 제거하였다. 그 후, 10 μm의 콜린, 10 μm의 피소티그민 및 6 mM의 KCl을 첨가한 완충액을 120 μL/웰로 첨가하였다. 125 mM의 NaCl, 25 mM의 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산, 1.2 mM의 KH₂PO₄, 1.2 mM의 MgSO₄, 2.2 mM의 CaCl₂(2H₂O) 및 10 mM의 글루코스를 멸균수에 첨가함으로써 완충액을 제조하였고, 용액의 최종 pH를 7.4로 설정하였다. 완충액을 첨가한 96-웰 플레이트를 37℃ 인큐베이터 내에서 5% CO₂-95% 공기 하에서 40분 동안 인큐베이션시킨 후, 80 μL의 완충액을 수집하였다. 수집된 완충액에 내부 표준 용액 IPHC(5 x 10^-7 M)를 6 μL의 양으로 첨가하고, 완충액을 HPLC 측정용 튜브로 옮기고, HPLC 측정에 적용하였다. 결과를 대조군의 완충액 중의 ACh 농도의 백분율로서 각각의 화합물의 효과로 나타내었고, 대조군의 완충액 중의 ACh 농도로부터 20% 증가를 나타내는 화합물 농도를 하기 표 1에 나타낸다.

래트 중격 영역에서 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT) mRNA 발현 수준의 측정

(1) 화합물 투여

본 연구에서, 체중이 약 250 g 내지 350 g인 SD 수컷 래트(찰스 리버 래보러토리즈 재팬, 인크.)를 사용하였다. 화합물을 0.01 mol/L 염산 중에 용해시키고, 경구로 투여하였다.

(2) 샘플링

화합물 투여 후 24시간 째에, 전체 뇌 조직을 펜토바르비탈 마취 하에서 수집하였다. 얼음 상에서 내측 중격을 전체 뇌로부터 단리하고, 액체 질소로 동결시키고, 이어서 -80℃에서 저장하였다.

(3) ChAT mRNA 발현 수준의 측정

RNA 정제를 위해서, RNeasy Plus Mini Kit(#74136: 퀴아젠(QIAGEN))를 본 연구에서 사용하였다. 키트에 기재된 방법에 의해서 RNA 정제를 수행하였다. RNA 정제 후에, QIAxpert 기기(퀴아젠)를 사용함으로써 총 RNA 농도를 측정하였다. cDNA를 SuperScript (R) VILO (TM) cDNA Synthesis Kit(#11754: 써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 합성하였다. 키트에 기재된 방법에 의해서 cDNA의 합성을 수행하였다. 합성된 cDNA를 RNase 무함유 물로 4배 희석시키고, 희석된 cDNA 용액을 샘플로서 사용하였다. Taqman Universal PCR Master Mix(#4304437: 써모 피셔 사이언티픽), Taqman (R) Gene Expression Assays, INVENTORIED(#4331182: 써모 피셔 사이언티픽), RNase 무함유 물 및 cDNA 용액을 각각 10 μl, 1 μl, 4 μl 및 5 μl의 양으로 혼합하고, 생성된 혼합물을 측정 샘플 용액으로서 사용하였다. 형광 프로브 방법에 의해서 ABI PRISM (R) 7900HT(써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 수행하였다. 분석을 SDS 2.4(써모 피셔 사이언티픽)에 의해서 수행하였다. 비히클 투여군에서의 ChAT mRNA 발현 수준의 양으로부터 증가된 화합물 투여군에서의 ChAT mRNA 발현 수준의 양의 백분율에 의해서 결과를 계산하였다. 결과를 하기 표 2에 나타낸다.

래트 뇌척수액(CSF) 중의 아세틸콜린 (ACh)의 측정

(1) 배경

설치류에서의 연구에 의해서 뇌내 신경전달물질의 증가 및 감소와 뇌척수액(CSF) 중의 신경전달물질의 증가 및 감소 간의 상관관계가 드러났고, 그러한 상관관계가 인간에서도 인지되었다(문헌[Lowe S et al. Psychopharmacology 219 (2012) 959-970]). 따라서, 시험 화합물에 의한 뇌내 아세틸콜린의 변화를 결정하기 위해서 CSF 중의 아세틸콜린의 변화를 측정하였다.

(2) 화합물 투여

본 연구에서, 체중이 약 150 g 내지 250 g인 Fischer344 수컷 래트(찰스 리버 래보러토리즈 재팬, 인크.)를 사용하였다. 시험 화합물을 3일 동안 10 mg/kg으로 1일 1회 래트에게 경구로 투여하였다. 사용된 비히클은 0.01 mol/L 염산이었다.

(3) 샘플링

비히클 및 시험 화합물 투여 후 24시간 째에, 펜토바르비탈 마취 하에서 AchE 저해제를 함유하는 튜브에 CSF를 대조(cisterna magna)로부터 수집하였다. 수집된 CSF를 3500 x g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 수집하였다. 수집된 상청액을 액체 질소로 동결시키고, 이어서 -80℃에서 저장하였다.

(4) LC-MS에 의한 Ach의 측정

10 μL의 CSF에 내부 표준품으로서 50 μL의 아세틸콜린-d9 클로라이드(ACh-d9)를 0.34 nmol/L의 최종 농도로 첨가하였다. 혼합물을 피펫팅하고, 1500 x g로 4 ℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, LC/MS(NexeraX2(MS), TSQ Altis(HPLC))에 적용하고, Ach를 m/z 146.050에서 전구체 이온으로서 그리고 m/z 87.071에서 생성물 이온으로서 검출하고, 내부 표준품으로서의 ACh-d9를 m/z 155.088에서 전구체 이온으로서 그리고 m/z 87.000에서 생성물 이온으로서 검출하였다. 결과를 비히클 투여군에서의 CSF 중의 ACh 농도에 대한 시험 화합물 투여군에서의 CSF 중의 ACh 농도의 증가 백분율의 계산치(대조군의 %)로 나타내었다. 결과를 표 3에 나타내었다.

인간 tau P301S 트랜스제닉 마우스에서의 평가

(1) 화합물 투여

본 연구에서, 시험 화합물을, 인간 tau P301S 트랜스제닉 마우스에게 4개월령에서 7개월령까지 3개월 동안 1일 1회 경구로 투여하였다. 사용된 비히클은 0.01 mol/L 염산이었다.

(2) 샘플링

최초 투여일(4개월령)에 그리고 최종 투여 다음 날에, 비히클 투여군 및 시험 화합물 투여군의 마우스를 펜토바르비탈(50mg/kg, i.p.) 하에서 마취시키고, PBS로 관류시켰다. 관류 후, 내측 중격 영역을 포함하는 전뇌를 수집하고, 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다.

(3) 뇌 관상면 동결 박편의 제조

내측 중격 영역을 포함하는 수집된 전뇌를 4% 파라포름알데히드 중에 침지하고, 밤새 진탕하였다. 침지 용액을 7.5% 수크로스 용액으로 교체하였다. 그것을 7.5% 수크로스 용액 중에 밤새 침지하고, 진탕하였고, 침지 용액을 15% 수크로스 용액으로 교체하고, 그것을 밤새 침지하고, 진탕하였다. 침지 용액을 30% 수크로스 용액으로 교체하고, 그것을 밤새 침지하고, 진탕하였다. 마이크로톰(Leica, SM2000R)을 사용함으로써 내측 중격 영역을 포함하는 전뇌로부터 30μm의 두께를 갖는 뇌 관상면 동결 박편을 제조하였다.

(4) 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT) 양성 세포의 면역조직화학

제조된 뇌 관상면 동결 박편을 일차 항체로서 ChAT 항체(산타 크루즈(Santa Cruz), SC-20672)를 사용하여 DAB(DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT(벡터, SK-4100))로 염색하였다. "The mouse Brain in stereotaxic coordinates"(COMPACT THIRD EDITION, Keith B.J. Franklin & George Paxinos)에 나타낸 바와 같은 내측 중격 영역을 포함하는 박편 영상을 올-인-원 형광 현미경(KEYENCE, BZ-X710)으로 찍었고, 내측 중격 영역의 주축 주변의 ChAT 양성 세포를 BZ 분석 소프트웨어(KEYENCE)에 의해서 계수하였다. 결과를, 초기 투여 시점(4개월령)에서의 ChAT 양성 세포의 수에 대한, 비히클 투여군 및 시험 화합물 투여군에서의 ChAT 양성 세포의 수의 백분율로서 나타내었다. 데이터를 평균 ± SEM으로서 표현한다. 초기 투여 시점에서의 군과 비히클-처리군 간의 차이(유의함: *)를 비대응 t-검정(unpaired t-test)에 의해서 분석하였고, 또한 비히클-처리군과 화합물-처리군 간의 차이(유의함: #)를 비대응 t-검정에 의해서 분석하였다. 0.05 미만의 P 값이 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다. 통계학적 분석은 GraphPad Prism 버전 7.02를 사용하여 수행하였다. 결과를 표 4에 나타내었다.

핌브리아-포르닉스 병변 래트 모델을 사용한 콜린성 뉴런에 대한 신경보호 및 회복 효과

(1) 핌브리아-포르닉스 병변 래트 모델의 제조

본 연구에서, 체중이 약 250 g 내지 350 g인 Sprague-Dawley 수컷 래트(찰스 리버 래보러토리즈 재팬, 인크.)를 사용하였다. 래트를 3종의 약물: 미다졸람(2 mg/kg s.c.), 메데토미딘 염산염(0.15 mg/kg s.c.) 및 부토르반올 타르트레이트(2.5 mg/kg s.c.)의 조합물 하에서 마취시키고, 뇌 정위술 장치(나리쉬지 코., 엘티디.(Narishige Co., Ltd.))로 고정시켰다. 두개를 노출시키고, 브레그마 2 mm 뒤의 중간선으로부터 두개골에 5 mm 폭을 갖는 구멍을 드릴로 뚫었다. 4 mm 폭을 갖는 면도칼을 5.5 mm 깊이로 브레그마 내에 관통시켜 핌브리아-포르닉스를 절단하였다. 지혈 후에, 두피를 봉합하였다. 수술 후, 래트를 케이지에 다시 넣고, 마취로부터 회복시켰다. 모의 수술 군에서, 브레그마 2 mm 뒤의 중간선으로부터 두개골에 5 mm 폭을 갖는 구멍을 드릴로 뚫었지만, 면도칼을 관통시키지 않았다.

(2) 화합물 투여

수술 후 5일에서 9일까지(실시예 1: 10 mg/kg) 또는 수술 후 7일에서 14일까지(실시예 3: 3 mg/kg) 시험 화합물을 래트에게 1일 1회 경구로 투여하였다. 사용된 비히클은 0.01 mol/L 염산이었다. 모의 수술군에서, 시험 화합물 투여군과 유사하게 비히클을 1일 1회 경구로 투여하였다.

(3) 샘플링

래트를 펜토바르비탈 하에서 마취시키고, 얼음 냉각 PBS로 경심 관류시켰다. 관류 후, 내측 중격 영역을 포함하는 전뇌를 수집하고, 4% 파라포름알데히드에 밤새 침지하고, 진탕하였다. 침지 용액을 7.5% 수크로스 용액으로 교체하였다. 그것을 7.5% 수크로스 용액 중에 밤새 침지하고, 진탕하였고, 침지 용액을 15% 수크로스 용액으로 교체하고, 그것을 밤새 침지하고, 진탕하였다. 침지 용액을 30% 수크로스 용액으로 교체하고, 그것을 밤새 침지하고, 진탕하였다. 마이크로톰(Leica, SM2000R)을 사용함으로써 내측 중격 영역을 포함하는 전뇌로부터 30μm의 두께를 갖는 뇌 관상면 동결 박편을 제조하였다.

(4) 콜린 아세틸트랜스퍼라제(ChAT) 양성 세포 및 소포 아세틸콜린 수송체(VAChT)의 면역조직화학

제조된 뇌 관상면 동결 박편을 일차 항체로서 ChAT 항체(산타 크루즈, SC-20672) 또는 VAChT 항체(머크 밀리포어(Merck Millipore), ABN100)를 사용하여 DAB(DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT(벡터, SK-4100))로 염색하였다. "The mouse Brain in stereotaxic coordinates"(COMPACT THIRD EDITION, Keith B.J. Franklin & George Paxinos)에 나타낸 바와 같은 내측 중격 영역 또는 해마를 포함하는 박편 영상을 올-인-원 형광 현미경(KEYENCE, BZ-X710)으로 찍었고, 내측 중격 영역의 ChAT 양성 세포 또는 해마 VAChT에서의 광학 밀도(OD)를 BZ 분석 소프트웨어(KEYENCE)에 의해서 측정하였다. 결과를, 모의 수술군에서의 내측 중격 영역의 ChAT 양성 세포의 수 또는 해마 VAChT의 OD에 대한, 비히클 투여군 및 시험 화합물 투여군에서의 내측 중격 영역의 ChAT 양성 세포의 수 또는 해마 VAChT의 OD의 백분율로서 나타내었다. 데이터를 평균 ± SEM으로서 표현한다. 비히클-처리군과 화합물-처리군 간의 차이(유의함: #)를 비대응 t-검정에 의해서 분석하였다. 0.05 미만의 P 값이 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다. 통계학적 분석은 GraphPad Prism 버전 7.02를 사용하여 수행하였다. 결과를 표 5 및 표 6에 나타내었다.

Claims

하기로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물:
3-플루오로-6,11-디메틸-6,7,10,11,12,13-헥사히드로벤조[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-5,14-디온:
[화학식 I]

,
5,10-디메틸-5,6,9,10,11,12-헥사히드로피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a]티에노[2,3-f][1,4]디아제핀-4,13-디온:
[화학식 II]

,
5,10-디메틸-5,6,9,10,11,12-헥사히드로피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a]티에노[3,2-f][1,4]디아제핀-4,13-디온:
[화학식 III]

,
(3aS,14aR)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온:
[화학식 IV]

,
(3aR,14aR)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온:
[화학식 V]

및
(3aS,14aS)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온:
[화학식 VI]

또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
3-플루오로-6,11-디메틸-6,7,10,11,12,13-헥사히드로벤조[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-5,14-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 I]

.
5,10-디메틸-5,6,9,10,11,12-헥사히드로피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a]티에노[2,3-f][1,4]디아제핀-4,13-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 II]

.
5,10-디메틸-5,6,9,10,11,12-헥사히드로피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a]티에노[3,2-f][1,4]디아제핀-4,13-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 III]

.
(3aS,14aR)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 IV]

.
(3aR,14aR)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 V]

.
(3aS,14aS)-5,10-디메틸-3,3a,5,6,9,10,11,12-옥타히드로-1H-시클로펜타[f]피리도[4",3":4',5']티에노[2',3':4,5]피리미도[1,2-a][1,4]디아제핀-4,13(2H,14aH)-디온 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염:
[화학식 VI]

.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 및 1종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 알츠하이머병용 치료제.
제1항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 알츠하이머병의 치료 방법.
알츠하이머병의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies)용 치료제.
제1항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 루이소체 치매의 치료 방법.
루이소체 치매의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 치매 동반 파킨슨병용 치료제.
제1항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 치매 동반 파킨슨병의 치료 방법.
치매 동반 파킨슨병의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염.