RS62796B1 - Pentaciklično jedinjenje - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na pentaciklično jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koja ima holinergičku aktivaciju neurona i/ili neuroprotektivno dejstvo, i njegovu farmaceutsku upotrebu. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske sastave koje sadrže gornje jedinjenje kao aktivni sastojak.

Stanje tehnike

[0002] Holinergički neuroni koji oslobađaju acetilholin kao transmiter su u velikoj meri projektovani u prednjem mozgu od Mejnertovog bazalnog jedra i septalnog jezgra bazalnog prednjeg mozga do hipokampusa, amigdale i kore velikog mozga, i uključeni su u modulaciju pamćenja, učenja, spoznaje i pažnje (Nepatentna literatura 1). Štaviše, holinergički neuroni u pedunculopontinskom tegmentalnom jezgru i laterodorsalnom tegmentalnom jezgru moždanog stabla projektovani su u striatum, susedno jezgro, supstancija nigra i talamus, i smatra se da su uključeni u kontrolu motivacije i budnosti (Nepatentna literatura 2 do 4).

[0003] Konkretno, uloga holinergičkih neurona u bazalnom prednjem mozgu je više razjašnjena analizom korišćenjem mnogih životinjskih modela kao što je model lezije.

Posebno, korelacija između funkcionalnog poremećaja holinergičkih neurona i smanjenog pamćenja i učenja je prikazana na životinjskim modelima (Nepatentne literature 5 do 7) i pokazalo se da se kognitivne performanse poboljšavaju povećanjem količine acetilholina korišćenjem inhibitor holinesteraze, i poboljšanje funkcije holinergičkih neurona (Nepatentna literatura 8 do 12).

[0004] Prijavljeno je da faktor rasta nerva (NGF) pokazuje neuroprotektivni efekat na holinergičke neurone u životinjskom modelu što ukazuje na gubitak holinergičkih neurona. (Nepatentna literatura 13 do 15).

[0005] Posebno za Alchajmerovu bolest (AD), gubitak holinergičkih neurona se nalazi u ranoj fazi AD i jedna je od patoloških karakteristika AD. Akumulacija senilnih plakova naslagama amiloidnih beta i neurofibrilarnih čvorova agregacijom tau proteina su takođe patološke karakteristike AD, a poznato je da se posebno neurofibrilarni spletovi povećavaju sa napredovanjem statusa bolesti i dovode do smrti neurona. Neurofibrilarni čvorovi se nalaze u Mejnertovom bazalnom jedru i entorhinalnom korteksu od ranog stadijuma AD. Među njima je prijavljeno da je gubitak holinergičkih neurona u Mejnertovom bazalnom jedru agregacijom tau proteina pronađen u ranijoj fazi i da postoji korelacija između gubitka i smanjenja rezultata kognitivnih funkcija (Nepatentne literature 16 i 17). Slično AD, hiperfosforilacija i abnormalna akumulacija tau proteina je pronađena kod genetski modifikovanih miševa koji imaju mutaciju P301S koja je pronađena kod porodične frontotemporalne demencije (humani tau P301S transgenski miševi). Kao posledica toga, formiraju se neurofibrilarni spletovi, patološka karakteristika AD (Nepatentna literatura 18) i dovode do kognitivne disfunkcije zbog sinaptičkog oštećenja, neurodegeneracije i gubitka neurona. Na osnovu ovih nalaza, humani tau P301S transgeni miševi se široko koriste kao životinjski modeli slični AD (Nepatentne literature 19-22), a poboljšanje kognitivnog opadanja i suzbijanje napredovanja statusa bolesti kod Alchajmerove bolesti može se očekivati supresijom AD- poput patoloških promena kod humanih tau P301S transgenih miševa.

[0006] Štaviše, višestruke analize koje koriste genetski modifikovane miševe i životinjske modele poremećaja sugerišu da je deficit aksonskog transporta jedan od uzroka gubitka holinergičkih neurona (Nepatentne literature 23-25). Među njima, akson holinergičkih neurona koji štrči od septalne oblasti do hipokampusa je oštećen u modelu sa lezijom fimbrije-forniksa i oštećenje retrogradnog transporta molekula uključenih u preživljavanje i funkciju dovodi do gubitka neurona (Nepatentne literature 26-28). Poremećaj retrogradnog transporta nalazi se i kod genetski modifikovanih miševa (Nepatentne literature 23 i 24) i gubitak holinergičkih neurona usled fimbrija-forniks lezije odražava jedan aspekt statusa bolesti. Shodno tome, poboljšanje kognitivnog pada i supresija napredovanja statusa bolesti kod Alchajmerove bolesti može se očekivati supresijom ili poboljšanjem gubitka holinergičkih neurona u ovom modelu poremećaja.

[0007] Demencija sa Levijevim telima (DLB) i Parkinsonova bolest (PD) su progresivni neurodegenerativni poremećaji u kojima se abnormalna inkluziona tela (Levijeva tela) uglavnom sastavljena od alfa sinukleina pojavljuju u neuronima i donose degeneraciju i gubitak neurona. Kognitivna disfunkcija se razvija ako su Levijeva tela uglavnom raspoređena u moždanoj kori, a Parkinsonizam se razvija ako su Levijeva tela uglavnom raspoređena u moždanom stablu. Pored toga, razvijaju se i psihijatrijski simptomi kao što su vizuelne halucinacije, halucinacije i zablude, poremećaj sna i autonomni simptomi.

Dijagnoza je demencija sa Levijevim telima ako se demencija pojavi pre ili u roku od godinu dana od pojave Parkinsonizma, a dijagnoza je Parkinsonova bolest sa demencijom (PDD) ako se Parkinsonizam pojavio pre godinu dana ili više od početka demencije. Demencija sa Levijevim telima, Parkinsonova bolest sa demencijom i Parkinsonova bolest su patološki iste bolesti i sveobuhvatno se nazivaju bolest Levijevih tela (LBD) iako se razlikuju u kognitivnoj disfunkciji i redosledu izgleda i stepenu Parkinsonizma. Kod demencije sa Levijevim telima i Parkinsonove bolesti sa demencijom, slično kao kod Alchajmerove bolesti, neuroni Mejnertovog bazalnog jedra, jezgra porekla holinergičnog nerva, su degenerisani i izgubljeni i prijavljeno je da se teški holinergički neuronski poremećaj pojavljuje u hipokampusu i korteksu. Nepatentne literature 29-31). Štaviše, postoji korelacija između napretka poremećaja holinergičkih neurona i kognitivne disfunkcije (Nepatentna literatura 29), a pokazalo se da inhibitori holinesteraze poboljšavaju kognitivne funkcije. Na osnovu ovih nalaza, kognitivna funkcija se poboljšava poboljšanjem funkcije holinergičkih neurona, a slično kao kod Alchajmerove bolesti, poboljšanje kognitivnog opadanja i supresija napredovanja statusa bolesti kod demencije sa Levijevim telima i Parkinsonove bolesti sa demencijom može se očekivati supresijom ili poboljšanjem.

[0008] Stoga se, na osnovu ovih nalaza, može očekivati poboljšanje smanjenih kognitivnih performansi izazvanih disfunkcijom holinergičkih neurona postizanjem funkcionalne aktivacije i/ili neuroprotektivnog efekta na holinergične neurone u kliničkoj praksi.

[0009] Pored navedenih bolesti, primeri bolesti za koje je prijavljena povezanost između smanjenja kognitivnih funkcija i disfunkcije holinergičkih neurona uključuju Hantingtonovu horeju, Daunov sindrom, amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS), veliku depresiju, šizofreniju i slično.

Lista citata

Ne-patentna literatura

[0010]

[Ne-patentna literatura 1] Everitt BJ i dr. "Central cholinergic systems and cognition." Annu. Rev. Psychol.48 (1997) 649-684.

[Ne-patentna literatura 2] Gulledge AT. i dr. "Cholinergic inhibition of neocortical pyramidal neurons." J. Neurosci.25 (2005) 10308-20.

[Ne-patentna literatura 3] Daniel Dautan D. i dr. "A major external source of cholinergic innervation of the striatum and nucleus accumbens originates in the brainstem." J. Neurosci. 34 (2014) 4509-18.

[Ne-patentna literatura 4] M Steriade M. i dr. "Neuronal activities in brain-stem cholinergic nuclei related to tonic activation processes in thalamocortical systems." J. Neurosci. 10 (1990) 2541-59.

[Ne-patentna literatura 5] Fischer W. i dr. "Progressive decline in spatial learning and integrity of forebrain cholinergic neurons in rats during aging." Neurobiol. Aging 13 (1992) 9-23.

[Ne-patentna literatura 6] Leanza G.i dr. "Selective lesioning of the basal forebrain cholinergic system by intraventricular 192 IgG-saporin: behavioural, biochemical and stereological studies in the rat." Eur. J. Neurosci.7 (1995) 329-43.

[Ne-patentna literatura 7] Leanza G. i dr. "Selective immunolesioning of the basal forebrain cholinergic system disrupts short-term memory in rats." Eur. J. Neurosci.8 (1996) 1535-44.

[Ne-patentna literatura 8] Ogura H. i dr. "Donepezil, a centrally acting acetylcholinesterase inhibitor, alleviates learning deficits in hypocholinergic models in rats." Methods Find Exp Clin Pharmacol.22 (2000) 89-95.

[Ne-patentna literatura 9] Spowart-Manning L. i dr. "Spatial discrimination deficits by excitotoxic lesions in the Morris water escape task." Behav Brain Res.156 (2005) 269-76.

[Ne-patentna literatura 10] Bruce AP. i dr. "Choline acetyltransferase activity and cognitive domain score of Alzheimer's patients." Neurobiol. Aging. 21 (2000) 11-17 [Ne-patentna literatura 11] Rogers SL. i dr. "The efficacy and safety of donepezil in patients with Alzheimer's disease: results of a US Multicentre, Randomized, DoubleBlind, Placebo-Controlled Trial. The Donepezil Study Group." Dementia. 7 (1996) 293-303

[Ne-patentna literatura 12] Mori E. i dr. "Donepezil for dementia with Lewy bodies: a randomized, placebo-controlled trial." Ann Neurol.72 (2012) 41-52

[Ne-patentna literatura 13] Mufson EJ. i dr. "Human cholinergic basal forebrain: chemoanatomy and neurologic dysfunction." J. Chem. Neuroanat.26 (2003) 233-242 [Ne-patentna literatura 14] Mufson EJ. i dr. "Cholinergic system during the progression of Alzheimer's disease: therapeutic implication." Expert. Rev. Neurother.

8 (2008) 1703-1718

[Ne-patentna literatura 15] Schliebs R. i dr. "The significance of the cholinergic system in the brain during aging and in Alzheimer's disease." J. Neural. Transm 113 (2006) 1625-1644

[Ne-patentna literatura 16] Vana L i dr. "Progression of tau pathology in cholinergic Basal forebrain neurons in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease." Am J Pathol. 179 (2011) 2533-2550.

[Ne-patentna literatura 17] Gómez-Isla T i dr. "Neuronal loss correlates with but exceeds neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease." Ann Neurol.41 (1997) 17-24.

[Ne-patentna literatura 18] Lee VM i dr. "Neurodegenerative tauopathies." Annu. Rev. Neurosci.24 (2001) 1121-1159.

[Ne-patentna literatura 19] Allen B i dr. "Abundant tau filaments and nonapoptotic neurodegeneration in transgenic mice expressing human P301S tau protein." J.

Neurosci. 22 (2002) 9340-9351.

[Ne-patentna literatura 20] Xu H i dr. "Memory deficits correlate with tau and spine pathology in P301S MAPT transgenic mice." Neuropathol. prijava. Neurobiol.40 (2014) 833-43.

[Ne-patentna literatura 21] Yoshiyama Y i dr. "Synapse loss and microglial activation precede tangles in a P301S tauopathy mouse model." Neuron.53 (2007) 337-351. [Ne-patentna literatura 22] Hoffmann NA i dr. "Impaired plasticity of cortical dendritic spines in P301S tau transgenic mice." Acta Neuropathol Commun. 1 (2013) 82.

[Ne-patentna literatura 23] Salehi A i dr. "Increased App Expression in a Mouse Model of Down's Syndrome Disrupts NGF Transport and Causes Cholinergic Neuron Degeneration" Neuron 51 (2006) 29-42.

[Ne-patentna literatura 24] Onishi T i dr. "Early-onset cognitive deficits and axonal transport dysfunction inP301S mutant tau transgenic mice" Neuroscience Research 80 (2014) 76-85.

[Ne-patentna literatura 25] Xu W i dr. "Amyloid precursor protein-mediated endocytic pathway disruption induces axonal dysfunction and neurodegeneration" J. Clin. Invest. 126 (2016) 1815-33.

[Ne-patentna literatura 26] Lapchak PA i dr. "Effect of recombinant human nerve growth factor on presynaptic cholinergic function in rat hippocampal slices following partial septohippocampal lesions: measures of [3H]acetylcholine synthesis,

[3H]acetylcholine release and choline acetyltransferase activity" Neuroscience 42 (1991) 639-49.

[Ne-patentna literatura 27] Gilmor ML i dr. "Coordinate expression of the vesicular acetylcholine transporter and choline acetyltransferase following septohippocampal pathway lesions" J. Neurochem.71 (1998) 2411-20.

[Ne-patentna literatura 28] Gu H i dr. "Recombinant human NGF-loaded microspheres promote survival of basal forebrain cholinergic neurons and improve memory impairments of spatial learning in the rat model of Alzheimer's disease with fimbria-fornix lesion" Neurosci. Lett.453 (2009) 204-9.

[Ne-patentna literatura 29] Shimada, H. i dr., "Mapping of brain acetylcholinesterase alterations in Lewy body disease by PET" Neurology, vol,73, pp.273-278,2009. [Ne-patentna literatura 30] Tiraboschi, P. i dr., "Cholinergic dysfunction in diseases with Lewy bodies" Neurology 54 (2000) 407-411.

[Ne-patentna literatura 31] Perry, E. K. et. al., "Neocortical cholinergic activities differentiate Lewy body dementia from classical Alzheimer's disease", NeuroReport, vol,5, pp,747-749 (1994).

Rezime pronalaska

Tehnički problem

[0011] Predmet predmetnog pronalaska je da obezbedi jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so koje ima holinergičku neuronsku aktivaciju i/ili neuroprotektivno dejstvo i ima potencijalnu upotrebu terapeutskog sredstva za Alchajmerovu bolest, demenciju sa Levijevim telima i Parkinsonovu bolest sa demencijom.

Rešenje problema

[0012] Kao rezultat opsežnih ispitivanja za rešavanje gornjih problema, ovi pronalazači su pronašli pentaciklično jedinjenje ili njegove farmaceutski prihvatljive soli koje imaju holinergičku neuronsku aktivaciju i/ili neuroprotektivni efekat.

[0013] Tako da, predmetni pronalazak odnosi se na sledeće <1> do <26>.

<1> Jedinjenje izabrano iz grupe koju čine:

3-fluoro-6,11-dimetil-6,7,10,11,12,13-heksahidrobenzo[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-5,14-dion:

5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-heksahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[2,3-f][1,4]diazepin-4,13-dion:

5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-heksahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[3,2-f][1,4]diazepin-4,13-dion:

(3aS,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion:

(3aR,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion:

i

(3aS,14aS)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion:

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

<2> 3-Fluoro-6,11-dimetil-6,7,10,11,12,13-heksahidrobenzo[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-5,14-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so:

<3> 5,10-Dimetil-5,6,9,10,11,12-heksahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[2,3-f][1,4]diazepin-4,13-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so:

<4> 5,10-Dimetil-5,6,9,10,11,12-heksahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[3,2-f][1,4]diazepin-4,13-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so:

<5> (3aS,14aR)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so:

<6> (3aR,14aR)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so:

<7> (3aS,14aS)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so:

<8> Farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema bilo kom od <1> do <7> i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih aditiva. <9> Terapeutsko sredstvo za upotrebu u lečenju Alchajmerove bolesti koje sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema bilo kom od <1> do <7>. <10> Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema bilo kom od <1> do <7> za upotrebu u lečenju Alchajmerove bolesti.

<11> Terapijsko sredstvo za upotrebu u lečenju demencije sa Levijevim telima koji sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema bilo kom od <1> do <7>.

<12> Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema bilo kom od <1> do <7> za upotrebu u lečenju demencije sa Levijevim telima.

<13> Terapeutsko sredstvo za upotrebu u lečenju Parkinsonove bolesti sa demencijom koje sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema bilo kom od <1> do <7>.

<14> Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema bilo kom od <1> do <7> za upotrebu u lečenju Parkinsonove bolesti sa demencijom.

1

Pogodni efekti pronalaska

[0014] Pentaciklična jedinjenja predstavljena formulama (I) do (VI) (u daljem tekstu "jedinjenja (I) do (VI)") ili njihove farmaceutski prihvatljive soli prema predmetnom pronalasku imaju aktivaciju neurona i/ili neuroprotektivni efekat, kao prikazano u podacima o aktivnostima u primerima farmakoloških ispitivanja datim kasnije. Jedinjenja (I) do (VI) ovog pronalaska dovode do poboljšanja kognitivnih performansi zbog njihove aktivacije neurona i/ili neuroprotektivnog efekta, i stoga imaju potencijalnu upotrebu kao terapeutska sredstva za Alchajmerovu bolest, demenciju sa Levijevim telima i Parkinsonovu bolest sa demencijom.

Opis otelotvorenja

[0015] U daljem tekstu, sadržaj predmetnog pronalaska će biti detaljno opisan.

[0016] U ovoj specifikaciji, strukturne formule jedinjenja mogu predstavljati specifične izomere radi pogodnosti; međutim, predmetni pronalazak može uključiti rotacione izomere i tautomere, kao i izomerne smeše, nije ograničen na formule opisane radi pogodnosti, i može biti bilo koji od izomera ili smeša koja sadrži izomere u bilo kojoj proporciji.

[0017] Dalje, mogu postojati i polimorfni kristali; međutim, predmetni pronalazak takođe nije ograničen ni na jedan od njih i može biti jednokristalni oblik ili njihova mešavina. Štaviše, predmetni pronalazak takođe uključuje amorfne oblike, a jedinjenja prema ovom pronalasku uključuju anhidrate i solvate (posebno hidrate).

[0018] Predmetni pronalazak takođe uključuje izotopom obeležena jedinjenja (I) do (VI). Jedinjenja obeležena izotopom su ista kao jedinjenja (I) do (VI), osim što je jedan ili više atoma zamenjeno jednim ili više atoma koji imaju atomsku masu ili maseni broj različit od onih koji se generalno nalaze u prirodi. Primeri izotopa koji se mogu ugraditi u jedinjenja predmetnog pronalaska uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fluora, fosfora, sumpora, joda i hlora, a posebno uključuju<2>H,<3>H,<11>C,<14>C,<15>N,<18>O,<18>F,<32>P,<35>S,<123>I,<125>I, i slično.

[0019] Gorenavedena jedinjenja obeležena izotopom, na primer, jedinjenja u koja su ugrađeni radioaktivni izotopi, kao što su<3>H i/ili<14>C, korisna su za analizu distribucije lekova i/ili supstrata u tkivima.<3>H i<14>C se smatraju korisnim zbog lakoće njihove pripreme i detekcije. Izotopi<11>C i<18>F se smatraju korisnim za PET (pozitronska emisiona tomografija), izotop<125>I se smatra korisnim za SPECT (jednofotonska emisiona kompjuterska tomografija), a svi su korisni za snimanje mozga. Zamena težim izotopima, kao što je<2>H, dovodi do nekih vrsta terapeutskih prednosti, uključujući povećanje perioda polu-raspada in vivo ili smanjenje potrebne doze zbog veće metaboličke stabilnosti, pa se stoga smatra korisnim pod određenim situacije. Gorenavedena jedinjenja obeležena izotopima mogu se pripremiti na sličan način sprovođenjem postupaka otkrivenih u sledećim Primerima korišćenjem lako upotrebljivih reagensa obeleženih izotopima umesto reagenasa koji nisu obeleženi izotopima.

[0020] "Farmaceutski prihvatljive soli" u ovoj specifikaciji nisu posebno ograničene sve dok su to soli formirane jedinjenjima prema predmetnom pronalasku, a specifični primeri uključuju kisele adicione soli, kao što su soli neorganske kiseline, soli organskih kiselina i kisele soli aminokiselina.

[0021] "Farmaceutski prihvatljiva so" u ovoj specifikaciji je bilo koja so formirana u pogodnom odnosu osim ako ne postoji bilo kakav posebno ograničavajući opis, a broj molekula kiseline po molekulu jedinjenja u formiranoj soli nije posebno ograničen; međutim, poželjno je da broj molekula kiseline po molekulu jedinjenja bude oko 0,5 do oko 2, a poželjnije je da broj molekula kiseline po molekulu jedinjenja bude oko 0,5, oko 1 ili oko 2.

[0022] Poželjni primeri soli neorganskih kiselina su hidrohlorid, hidrobromid, sulfat, nitrat i fosfat; a poželjni primeri soli organskih kiselina uključuju acetat, sukcinat, fumarat, maleat, tartarat, citrat, laktat, stearat, benzoat, metansulfonat, p-toluensulfonat i benzensulfonat.

[0023] Poželjni primeri soli kiselih aminokiselina uključuju aspartat i glutamat.

[0024] Kada se jedinjenja (I) do (VI) u skladu sa predmetnim pronalaskom dobiju u slobodnom obliku, mogu se konvertovati u soli koje mogu biti formirane jedinjenjima (I) do (VI) ili njihovim hidratima u skladu sa konvencionalnim postupkom.

[0025] Kada se jedinjenja (I) do (VI) prema predmetnom pronalasku dobiju kao soli jedinjenja (I) do (VI) ili hidrati jedinjenja (I) do (VI), ona se mogu konvertovati u slobodne forme jedinjenja (I) do (VI) u skladu sa konvencionalnim postupkom.

[0026] Štaviše, različiti izomeri (npr., optički izomeri, rotacioni izomeri, stereoizomeri, itd.) dobijeni od jedinjenja (I) do (VI) u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se prečistiti i izolovati opštim sredstvima za razdvajanje, kao što je rekristalizacija, dijastereomerna so metoda, metoda enzimske rezolucije i različite hromatografske tehnike (npr., tankoslojna hromatografija, kolonska hromatografija, gasna hromatografija, itd.).

[Farmaceutski preparat]

[0027] Farmaceutski sastav prema predmetnom pronalasku može se proizvesti mešanjem farmaceutski prihvatljivih aditiva sa jedinjenjem odabranim iz grupe jedinjenja (I) do (VI) ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli. Farmaceutski sastav prema predmetnom pronalasku može se proizvesti poznatim postupkom, na primer, postupkom opisanim u Opštim pravilima za pripremu Sedamnaestog izdanja Japanske farmakopeje.

[0028] Farmaceutski sastav prema predmetnom pronalasku može se na odgovarajući način davati pacijentu u zavisnosti od njegovog doznog oblika.

[0029] Doza jedinjenja (I) do (VI) prema predmetnom pronalasku ili njihovih farmaceutski prihvatljivih soli varira u zavisnosti od ozbiljnosti simptoma, starosti, pola, telesne mase, oblika doze, vrste soli, specifičnog tipa bolesti i drugi uslovi; međutim, generalno, doza za odraslu osobu dnevno oralnim davanjem je oko 30 µg do 10 g, poželjno 100 µg do 5 g, a poželjnije 100 µg do 1 g; doza za odraslu osobu po danu putem injekcije je oko 30 µg do 1 g, poželjno 100 µg do 500 mg, a poželjnije 100 µg do 300 mg; a gornja doza se daje jednom ili više puta.

[0030] Jedinjenja iz predmetnog pronalaska se mogu koristiti kao hemijske sonde za hvatanje ciljnih proteina bioaktivnih jedinjenja niske molekulske mase. To jest, jedinjenja iz predmetnog pronalaska mogu se konvertovati u sonde za afinitetnu hromatografiju, fotoafinitetne sonde, itd., uvođenjem grupa za obeležavanje, veznika ili sličnog u deo koji se razlikuje od strukturnog dela koji je suštinski za razvoj aktivnosti jedinjenja korišćenjem

1

metode opisane, na primer, u J. Mass Spectrum. Soc. Jpn. Vol.51, No.5, 2003, pp.492-498, WO2007/139149, ili slično.

[0031] Primeri grupa za obeležavanje, veznika, itd., koji se koriste u hemijskim sondama uključuju grupe prikazane u grupi koja se sastoji od sledećeg (1) do (5):

(1) grupe za obeležavanje proteina, kao što su grupe za obeležavanje fotoafiniteta (npr., benzoil grupa, benzofenon grupa, azidna grupa, karbonilazidna grupa, diaziridin grupa, enon grupa, diazo grupa, nitro grupa itd.) i grupe hemijskog afiniteta (npr., ketonska grupa u kojoj je alfa atom ugljenika zamenjen atomom halogena, karbamoil grupom, estarskom grupom, alkiltio grupom, Majklovim akceptorom kao što je α,βnezasićeni keton ili estar i grupa oksirana);

(2) deljivih veznika, kao što su -S-S-, -O-Si-O-, monosaharidi (glukozna grupa, galaktozna grupa, itd.), ili disaharidi (laktoza, itd.); i oligopeptidnih veznika koji se mogu deliti enzimskom reakcijom;

(3) riblje oznake grupa kao što je biotin i 3-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4H-3a,4a-diaza-4-bora-s-indacen-3-il) propionil grupa;

(4) radioaktivnih grupa za označavanje kao što je<125>I,<32>P,<3>H i<14>C; fluorescentnih obeležavajućih grupa kao što je fluorescein, rodamin, danzil, umbeliferon, 7-nitrofurazanil i 3-(4,4-difluoro-5,7-dimetil-4H-3a,4a-diaza-4-bora-s-indacen- 3-il)propionil grupa; hemiluminiscentne grupe, kao što su luciferin i luminol; marker sposoban da detektuje jone teškog metala, kao što je lantanoidni jonski metal i jon radijuma; ili

(5) grupe koje se pričvršćuju na čvrste nosače, kao što su staklene perle, staklene ploče, mikrotitarske ploče, perle agaroze, slojevi agaroze, perle od polistirena, polistirenske kuglice, najlonske perle i najlonske ploče.

[0032] Sonde pripremljene uvođenjem grupa za obeležavanje, itd., izabrane iz grupe koja se sastoji od gore navedenih (1) do (5) u jedinjenja predmetnog pronalaska postupcima opisanim u gornjim dokumentima ili slično, mogu se koristiti kao hemijske sonde za identifikovanje obeleženih proteina korisnih za pretraživanje novih ciljeva dizajna lekova, itd.

Primeri

[0033] Jedinjenja (I) do (VI) predmetnog pronalaska se mogu proizvesti, na primer, postupcima opisanim u sledećim primerima, a efekti jedinjenja mogu biti potvrđeni postupcima opisanim u sledećim primerima ispitivanja. Međutim, ovo su samo primeri, a predmetni pronalazak ni u kom slučaju nije ograničen na sledeće specifične primere i može se modifikovati unutar opsega koji ne odstupa od obima predmetnog pronalaska kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima.

[0034] Jedinjenja opisana nazivima dokumenata, itd., ukazuju na to da su jedinjenja proizvedena prema dokumentima itd.

[0035] Štaviše, skraćenice korišćene u ovoj specifikaciji su dobro poznate i uobičajene za stručnjake. U ovoj specifikaciji, korišćene su sledeće skraćenice.

DCE: 1,2-dihloroetan

DCM: dihlorometan

DIPEA: N,N-diizopropiletilamin

DMT-MM: 4-(4,6-dimetoksi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinijum hlorid DMSO: dimetilsulfoksid

EDC: 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid

HATU: 0-(7-azabenzottiazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat HOBT: 1-hidroksibenzotriazol

n-: normalno

NMM: N-metilmorfolin

t-: tercijarni

TBD: 1,3,4,6,7,8-heksahidro-2H-pirimido[1,2-a]pirimidin

TBME: tercijarni butil metil etar

TEA: trietilamin

THF: tetrahidrofuran

<1>H-NMR: spektrometrija protonske nuklearne magnetne rezonance

MS: masena spektrometrija

HPLC: hromatografija visokih performansi

[0036] Termin "sobna temperatura" u sledećim primerima i primerima proizvodnje se generalno odnosi na oko 10°C do oko 35°C. % se odnosi na maseni procenat osim ako nije drugačije naznačeno.

1

[0037] Hemijski pomaci spektra protonske nuklearne magnetne rezonance su označeni u δjedinicama (ppm) u odnosu na tetrametilsilan, a konstante kuplovanja su zabeležene u hercima (Hz). Obrasci su označeni kao s: singlet, d: duplet, t: triplet, q: kvartet, m: multiplet, br: širok, br.s: široki singlet.

[0038] Za optičku rezoluciju jedinjenja, Parallex Flex (TM) koji proizvodi Biotage (kolona: jedan od CHIRALPAK (R) AD-H, IA, IB i IC proizvođača DAICEL; i korišćen je CHIRALCEL (R) OD-H i OJ-H proizvođača DAICEL).

[0039] U reakcijama korišćenjem mikrotalasnog reaktora u Primerima proizvodnje, Referentnim primerima i Primerima, korišćen je Inicijator (TM) ili Initiator+ (TM) koji proizvodi Biotage.

[0040] Što se tiče hromatografije, kao silika gel, korišćen je silika gel60 koji proizvodi Merck (70-230 okca ili 230-400 okca ASTM) ili PSQ60B koji proizvodi Fuji Silysia Chemical Ltd., ili je prethodno upakovana kolona {kolona: Hi-Flash (TM) kolona (silikagel) proizvođača YAMAZEN, veličina: jedan od S (16 x 60 mm), M (20 x 75 mm), L (26 x 100 mm), 2L (26 x 150 mm), i 3L (46 x 130 mm); ili Biotage (TM) SNAP Ultra Silica Cartridge proizveden od Biotage, veličina: korišćen je jedan od 10 g, 25 g i 50 g}.

[0041] Kao NH silika gel, korišćen je CHROMATOREX NH-DM2035 proizvođača Fuji Silysia Chemical Ltd., ili unapred upakovana kolona {kolona: Hi-Flash (TM) kolona (Amino) proizveden YAMAZEN, veličina: jedan od S (16 x 60 mm), M (20 x 75 mm), L (26 x 100 mm), 2L (26 x 150 mm), i 3L (46 x 130 mm); ili Presep (TM) (Luer Lock) NH2(HC) proizvođača Wako Pure Chemical Industries, Ltd., veličina: korišćen je jedan od tipa M (14 g/25 mL), tipa L (34 g/70 mL), tipa 2L (50 g/100 mL) i tipa 3L (110 g/200 mL)}.

[0042] Kao nazivi jedinjenja prikazanih u nastavku, osim za opšte korišćene reagense, korišćeni su oni prikazani u "E-Notebook" verzija 12 (PerkinElmer).

Primer proizvodnje 1

Sinteza etil 2-amino-6-metil-4,5,67-tetrahidrotieno[2,3-c]piridin-3-karboksilata

1

[0044] TEA (61,6 mL, 442 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi u smešu 1-metil-4-piperidona (CAS br.1445-73-4) (51,5 mL, 442 mmol), etil cijanoacetata (CAS br.105- 56-6) (47,2 mL, 442 mmol), sumpor (CAS br.7704-34-9) (14,2 g, 442 mmol) i etanol (800 mL). Reakciona smeša je mešana na 40°C tokom 15 sati, a zatim koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (NH silika gel, etil acetat).

Dobijeni koncentrovani ostatak je triturisan sa etil acetatom. Precipitati su sakupljeni filtracijom, isprani etil acetatom i osušeni pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (58,4 g).

[0045]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,33 (t, J = 7,0 Hz, 3H), 2,44 (s, 3H), 2,62-2,70 (m, 2H), 2,79-2,88 (m, 2H), 3,37 (t, J = 2,0 Hz, 2H), 4,26 (q, J = 7,3 Hz, 2H), 5,97 (br. s, 2H). MS (ESI) m/z: 241 [M+H]<+>

Primer proizvodnje 2

Sinteza 7-fluoro-4-metil-3,4-dihidro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-2,5-diona

[0046]

[0047] Sarkozin (CAS br.107-97-1) (5,16 g, 58,0 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi u rastvor 6-fluoro-1H-benzo[d][1,3]oksazin-2,4-diona (CAS br.321-69-7) (10,0 g, 55,2 mmol) u piridinu (100 mL), i reakciona smeša je mešana na 100°C tokom 8 sati. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature. Precipitati su sakupljeni filtracijom i isprani dietil etrom. Dobijena čvrsta supstanca je osušena pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (5,34 g).

[0048]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 3,30 (s, 3H), 3,90 (s, 2H), 6,97 (dd, J = 8,8, 4,5 Hz, 1H), 7,20 (ddd, J = 8,6, 7,6,2,9 Hz, 1H), 7,67 (dd, J = 9,0, 3,1 Hz, 1H), 7,99 (br. s, 1H).

1

MS (ESI) m/z: 209 [M+H]<+>

Primer proizvodnje 3

Sinteza 4-metil-3,4-dihidro-1H-tieno[3,2-e][1,4]diazepin-2,5-diona

[0049]

[0050] Smeša 1H,2H,4H-tieno[3,2-d][1,3]oksazin-2,4-diona (CAS br.78756-28-2) (300 mg, 1,77 mmol), sarkozin (395 mg, 4,43 mmol) i voda (10 mL) je zagrevana pod refluksom 2 sata. Reakciona smeša je ohlađena do 0°C. Precipitati su sakupljeni filtracijom, i isprani uzastopno vodom i dietil etrom. Dobijena čvrsta supstanca je osušena pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (165 mg).

[0051]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 3,24 (s, 3H), 4,00 (s, 2H), 6,72 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 7,96 (br. s, 1H).

MS (ESI) m/z: 197 [M+H]<+>

Primer proizvodnje 4

Sinteza 4-metil-3,4-dihidro-1H-tieno[2,3-e][1,4]diazepin-2,5-diona

[0052]

[0053] 1H,2H,4H-tieno[2,3-d][1,3]oksazin-2,4-dion (CAS br.103979-54-0) (600 mg, 3,55 mmol) je dodat u rastvor sarkozina (790 mg, 8,87 mmol) u vodi (12 mL). Reakciona smeša je zagrevana pod refluksom 1,5 sata. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature. U

1

reakcionu smešu je dodat hloroform i organski sloj je odvojen. Vodeni sloj je ekstrahovan hloroformom (dva puta) i etil acetatom (3 puta). Kombinovani organski sloj je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata i filtriran, a filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Dobijena čvrsta supstanca je osušena da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (430 mg).

[0054]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 3,23 (s, 3H), 3,99 (s, 2H), 6,90 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,29 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 8,39 (br. s, 1H).

MS (ESI) m/z: 197 [M+H]<+>

Primer proizvodnje 5

Sinteza (5aS,8aR)-4-metiloktahidrociklopenta[e][1,4]diazepin-2,5-diona

[0055]

(1) Sinteza metil 2-((1S2R)-2-((t-butoksikarbonil)amino)-N-metilciklopentankarboksamid)acetata

[0056] TEA (22,2 mL, 159 mmol), HOBT/monohidrat (11,7 g, 76,3 mmol) i EDC (14,6 g, 76,3 mmol) su uzastopno dodavani uz hlađenje ledom u smešu (1S,2R)-2-((tbutoksikarbonil)amino)ciklopentan-1-karboksilna kiselina (CAS br.137170-89-9) (14,6 g, 63,6 mmol), sarkozin metil estar hidrohlorid (CAS br.13515-93-0) (10,7 g, 76,3 g, 76,3 mmol) amino)ciklopentan-1-karboksilna kiselina. i THF (150 mL). Nakon što je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 15 sati, dodaju se etil acetat i voda i organski sloj se odvoji. Vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom. Kombinovani organski sloj je ispran uzastopno sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata i zasićenim rastvorom natrijum hlorida, osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen dva puta hromatografijom na koloni (silika gel, 25-30% etil acetat/n-heptan) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (16,1 g).

MS (ESI) m/z: 337 [M+Na]<+>

1

(2) Sinteza (5aS,8aR)-4-metiloktahidrociklopenta[e][1,4]diazepin-2,5-diona

[0057] 4N rastvor hlorovodonika/1,4-dioksana (160 mL, 640 mmol) je dodat uz hlađenje ledom u metil 2-((1S,2R)-2-((t-butoksikarbonil)amino)-N-metilciklopentankarboksamid)acetat (16,1 g, 51,3 mmol). Reakciona smeša je mešana na istoj temperaturi 30 minuta, zatim mešana na sobnoj temperaturi 45 minuta, i koncentrovana pod redukovanim pritiskom. TBD (8,57 g, 61,6 mmol) je dodat uz hlađenje vodom u rastvor ostatka u metanolu (130 ml). Reakciona smeša je mešana pod hlađenjem vodom 3 sata, a zatim ohlađena na 0°C. Dobijena čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana 3 puta sa ledom hlađenim metanolom i osušena pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (5,22 g).

[0058]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,41-1,59 (m, 2H), 1,78-1,98 (m, 2H), 2,00-2,15 (m, 1H), 2,36-2,53 (m, 1H), 3,08 (s, 3H), 3,18-3,32 (m, 1H), 3,49 (dd, J = 15,5, 1,7 Hz, 1H), 3,91-4,04 (m, 1H), 4,51 (d, J = 15,4 Hz, 1H), 5,54 (br. s, 1H).

MS (ESI) m/z: 183 [M+H]<+>

Primer proizvodnje 6

Sinteza (5aR,8aR)-4-metiloktahidrociklopenta[e][1,4]diaze-pin-2,5-diona

[0059]

(1) Sinteza t-butil 2-((1R,2R)-2-((t-butoksikarbonil)amino)-N-metilciklopentankarboksamid)acetata

[0060] DIPEA (1,81 mL, 10,5 mmol) i HATU (1,99 g, 5,23 mmol) su uzastopno dodavani na sobnoj temperaturi u smešu (1R,2R)-t-butoksikarbonil-2-aminociklopentankarboksilne kiseline (CAS br.245-7115-25 ) (1,00 g, 4,36 mmol), sarkozin t-butil estar hidrohlorid (CAS br. 136088-69-2) (872 mg, 4,80 mmol) i DCM (10 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 1 sat, a zatim direktno prečišćena hromatografijom na koloni (silika gel,

2

30-50% etil acetat/n-heptan) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1,61 g).

MS (ESI) m/z: 357 [M+H]<+>

(2) Sinteza (5aR,8aR)-4-metiloktahidrociklopenta[e][1,4]diazepin-2,5-diona

[0061] Rastvor A4N hlorovodonika/1,4-dioksana (16 mL, 64 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi u t-butil 2-((1R,2R)-2-((t-butoksikarbonil)amino)-N-metilciklopentankarboksamid )acetat (1,61 g, 4,52 mmol), i smeša je mešana 20 sati.

Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Natrijum hidrogenkarbonat (0,911 g, 10,8 mmol), metanol (24 mL), NMM (0,099 mL, 0,90 mmol) i DMT-MM (12,3% H2O, 1,80 g, 5,70 mmol) su uzastopno dodavani ostatku na sobnoj temperaturi i smeša je mešana 20 sati. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, a ostatak je ispran sa DCM. Isprana tečnost je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silika gel, 5-20% metanol/etil acetat) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (745 mg).

[0062]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,56-1,88 (m, 3H), 1,91-2,02 (m, 1H), 2,13-2,23 (m, 1H), 2,26-2,39 (m, 1H), 3,07 (s, 3H), 3,08-3,16 (m, 1H), 3,51-3,62 (m, 1H), 3,79 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 4,58 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 6,76 (br. s, 1H).

MS (ESI) m/z: 183 [M+H]<+>

Primer proizvodnje 7

Sinteza (5aS,8aS)-4-metiloktahidrociklopenta[e][1,4]diazepin-2,5-diona

[0063]

(1) Sinteza t-butil 2-((1S,2S)-2-((t-butoksikarbonil)amino)-N-metilciklopentankarboksamid)acetata

[0064] HATU (1,99 g 5,23 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi u smešu (1S,2S)-tbutoksikarbonil-2-aminociklopentankarboksilne kiseline (CAS br.143679-80-5) (1,00 g, 4,36 mmol), sarkozin t-butil estar hidrohlorid (872 mg, 4,80 mmol), DIPEA (1,81 mL, 10,5 mmol) i DCM (10 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći, a zatim direktno prečišćena hromatografijom na koloni (silika gel, 30-50% etil acetat/n-heptan) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (1,55 g).

MS (ESI) m/z: 357 [M+H]<+>

(2) Sinteza (5aS,8aS)-4-metiloktahidrociklopenta[e][1,4]diazepin-2,5-diona

[0065] Rastvor A4N hlorovodonika/1,4-dioksana (16 mL, 64 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi u t-butil 2-((1S,2S)-2-((t-butoksikarbonil)amino)-N-metilciklopentankarboksamid )acetat (1,55 g, 4,35 mmol), i smeša je mešana 16 sati.

Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom. Natrijum hidrogenkarbonat (0,877 g, 10,4 mmol), metanol (24 mL), NMM (0,096 mL, 0,87 mmol) i DMT-MM (12,3% H2O, 1,73 g, 5,48 mmol) su uzastopno dodavani ostatku na sobnoj temperaturi i smeša je mešana 3 sati. Reakciona smeša je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, a ostatak je ispran sa DCM. Isprana tečnost je koncentrovana pod redukovanim pritiskom, a ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silika gel, 0-20% metanol/etil acetat) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (753 mg).

[0066]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,55-1,88 (m, 3H), 1,91-2,02 (m, 1H), 2,11-2,22 (m, 1H), 2,25-2,40 (m, 1H), 3,07 (s, 3H), 3,07-3,16 (m, 1H), 3,51-3,62 (m, 1H), 3,78 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 4,57 (d, J = 18,0 Hz, 1H), 6,54 (br. s, 1H).

MS (ESI) m/z: 183 [M+H]<+>

Primer 1

Sinteza 3-fluoro-6,11-dimetil-6,7,10,11,12,13-heksahidrobenzo[f]pirido[4"3":4',5]tieno[2'3':4,5 ]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-5,14-diona

[0068] Fosfor oksihlorid (4,65 mL, 49,9 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi u smešu etil 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridin-3-karboksilata (6,00 g, 25,0 mmol) dobijeno u Primeru proizvodnje 1, 7-fluoro-4-metil-3,4-dihidro-1H-benzo[e][1,4]diazepin-2,5-dion (5,20 g, 25,0 mmol) dobijen u Primeru proizvodnje 2, i DCE (300 mL). Reakciona smeša je mešana na 80°C tokom 20 sata. Uz mešanje uz hlađenje ledom, u reakcionu smešu je dodat natrijum etoksid (20% rastvor u etanolu, 80 mL, 207 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 20 minuta. U reakcionu smešu su dodati zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata i etil acetat i organski sloj je odvojen. Vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom. Kombinovani organski sloj je osušen iznad magnezijum sulfata i filtriran, a filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je sekvencijalno prečišćen hromatografijom na koloni (NH silika gel, 50-100% etil acetat/n-heptan) i hromatografijom na koloni (silika gel, 0-50% metanol/etil acetat). Dobijena čvrsta supstanca je razmućena sa TBME, a talozi su sakupljeni filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca je isprana sa TBME i osušena pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (4,56 g).

[0069]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 2,51 (s, 3H), 2,66-2,76 (m, 1H), 2,77-2,88 (m, 1H), 3,04-3,18 (m, 2H), 3,25 (s, 3H), 3,57-3,75 (m, 2H), 4,09 (d, J = 15,2 Hz, 1H), 4,47 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 7,25-7,31 (m, 1H), 7,60-7,64 (m, 1H), 7,67 (dd, J = 9,0, 4,7 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 385 [M+H]<+>

Primer 2

Sinteza 5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-heksahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[2,3-f][1,4]diazepin-4,13-diona

2

[0071] Fosfor oksihlorid (0,157 mL, 1,68 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi u smešu etil 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridin-3-karboksilata (303 mg, 1,26 mmol) dobijeno u Primeru proizvodnje 1, 4-metil-3,4-dihidro-1H-tieno[3,2-e][1,4]diazepin-2,5-dion (165 mg, 0,841 mmol) dobijen u Primeru proizvodnje 3, i 1,4-dioksan (10 mL). Reakciona smeša je mešana na 70°C tokom 2 sata, a zatim mešana na 90°C tokom 5 sati. Natrijum etoksid (20% rastvor u etanolu, 2,60 mL, 6,73 mmol) je dodat u reakcionu smešu ohlađenu na sobnu temperaturu. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 40 minuta. U reakcionu smešu su dodati etil acetat i zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata i organski sloj je odvojen. Vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom. Kombinovani organski sloj je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silika gel, 50% metanol/etil acetat) da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (90,0 mg).

[0072]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 2,51 (s, 3H), 2,66-2,87 (m, 2H), 3,07-3,20 (m, 2H), 3,26 (s, 3H), 3,56-3,74 (m, 2H), 4,21 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 4,56 (d, J = 15,0 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 7,59 (d, J = 5,3 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 373 [M+H]<+>

Primer 3

Sinteza 5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-heksahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[3,2-f][1,4]diazepin-4,13-diona

[0073]

[0074] Fosfor oksihlorid (1,43 mL, 15,3 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi u smešu 4-metil-3,4-dihidro-1H-tieno[2,3-e][1,4]diazepin-2,5-diona (1,00 g, 5,10 mmol) dobijen u Primeru proizvodnje 4, etil 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridin-3-karboksilat (1,84 g, 7,64 mmol) dobijen u Primeru proizvodnje 1, i 1,4-dioksan (30 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 5 minuta, i mešana na 90°C tokom 2 sata. Natrijum etoksid (20% rastvor u etanolu, 21,7 mL, 56,1 mmol) je dodat tokom 5 minuta u reakcionu smešu ohlađenu do sobne temperature. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi u trajanju od 1,5 sati. Etil acetat, zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata i voda su uzastopno dodavani u reakcionu smešu, a organski sloj je odvojen.

Vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom. Kombinovani organski sloj je osušen iznad bezvodnog magnezijum sulfata i filtriran, a filtrat je koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (silika gel, 20%-50% metanol/etil acetat). Dobijena čvrsta supstanca je razmućena sa etanolom, a talozi su sakupljeni filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca je isprana sa etanolom i osušena pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (712 mg).

[0075]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 2,52 (s, 3H), 2,71-2,87 (m, 2H), 3,05-3,30 (m, 5H), 3,59-3,75 (m, 2H), 4,23 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 4,57 (d, J = 14,8 Hz, 1H), 7,35 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 7,39 (d, J = 5,9 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 373 [M+H]<+>

Primer 4

Sinteza (3aS,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-diona

[0076]

[0077] Fosfor oksihlorid (7,93 mL, 85,1 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi u dobijenu smešu (5aS,8aR)-4-metiloktahidrociklopenta[e][1,4]diazepin-2,5-diona (3,10 g, 17,0 mmol) u

2

Primeru proizvodnje 5-(2), etil 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridin-3-karboksilat (8,18 g, 34,0 mmol) dobijen u Primeru proizvodnje 1, i DCE (300 mL).

Reakciona smeša je mešana na 80°C tokom 14,5 sata. Zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata je dodat u reakcionu smešu na 0°C, smeša je mešana na sobnoj temperaturi 3,5 sata, a zatim je organski sloj odvojen. Vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom. Kombinovani organski sloj je ispran uzastopno sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata i zasićenim rastvorom natrijum hlorida, osušen preko anhidrovanog magnezijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom.

Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (NH silika gel, 30-60% etil acetat/n-heptan). Dobijeni koncentrovani ostatak je triturisan sa TBME, a talozi su sakupljeni filtracijom. Dobijena čvrsta supstanca je isprana 3 puta sa TBME, i osušena pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (3,70 g).<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,51-1,73 (m, 2H), 1,94-2,18 (m, 2H), 2,30-2,41 (m, 1H), 2,44-2,59 (m, 4H), 2,71-2,82 (m, 2H), 3,04-3,19 (m, 5H), 3,42-3,54 (m, 1H), 3,64 (s, 2H), 4,17 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 4,75 (d, J = 15,6 Hz, 1H), 5,69-5,82 (m, 1H).

MS (ESI) m/z: 359 [M+H]<+>

Specifična rotacija: [α]D<20>-146,0 (c 0,50, CHCl3)

Analiza pomoću HPLC:

(Uslovi analize) Kolona: CHIRALPAK IB (proizvodi Daicel Chemical Industries, Ltd.) (0,46 cm ϕ x 15 cm), 40°C, eluent: etanol/heksan = 20/80 (v/v), brzina protoka: 1 ml/min., detekcija: UV (254 nm).

(Rezultati analize) Kada je jedinjenje iz naslova analizirano pod gornjim uslovima analize, vreme zadržavanja je bilo 10,38 minuta, optička čistoća je bila >98%ee, a optička rotacija je bila (-). Vreme zadržavanja enantiomera je potvrđeno proizvodom sintetizovanim na sličan način korišćenjem racemične smeše kao početnog materijala.

Primer 5

Sinteza (3aR,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-diona

2

[0079] Fosfor oksihlorid (0,793 mL, 8,51 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi u dobijenu smešu (5aR,8aR)-4-metiloktahidrociklopenta[e][1,4]diazepin-2,5-diona (310 mg, 1,70 mmol) u Primeru proizvodnje 6-(2), etil 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridin-3-karboksilat (613 mg, 2,55 mmol) dobijen u Primeru proizvodnje 1, i DCE (16 mL).

Reakciona smeša je mešana na 70°C tokom 2,5 sata, a zatim vraćena na sobnu temperaturu, pa su dodati etil acetat (15 mL) i zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata (30 mL). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 5 dana, dodat je etil acetat i organski sloj je odvojen. Vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom. Kombinovani organski sloj je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (NH silika gel, 50-70% etil acetat/n-heptan). Dobijeni proizvod je ispran 3 puta dietil etrom, zatim ispran sa TBME, i osušen pod redukovanim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (143 mg).

[0080]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,29-1,49 (m, 1H), 1,68-1,83 (m, 1H), 1,82-2,21 (m, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,76 (t, J = 5,7 Hz, 2H), 2,98-3,23 (m, 6H), 3,40-3,54 (m, 1H), 3,57-3,68 (m, 2H), 4,17-4,34 (m, 2H), 5,30 (d, J = 17,4 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 359 [M+H]<+>

Analiza pomoću HPLC:

(Uslovi analize) Kolona: CHIRALPAK IC (proizvodi Daicel Chemical Industries, Ltd.) (0,46 cm ϕ x 15 cm), 40°C, eluent: etanol, brzina protoka: 1 mL/min., detekcija: UV (254 nm)

(Rezultati analize) Vreme zadržavanja jedinjenja iz naslova je 6,64 minuta, optička čistoća je bila >99% ee, a optička rotacija je bila (-).

Primer 6

Sinteza (3aS,4aS)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4"3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-diona

2

[0082] Fosfor oksihlorid (0,859 mL, 9,22 mmol) je dodat na sobnoj temperaturi u dobijenu smešu (5aS,8aS)-4-metiloktahidrociklopenta[e][1,4]diazepin-2,5-diona (336 mg, 1,84 mmol) u Primeru proizvodnje 7-(2), etil 2-amino-6-metil-4,5,6,7-tetrahidrotieno[2,3-c]piridin-3-karboksilat (665 mg, 2,77 mmol) dobijen u Primeru proizvodnje 1, i DCE (17 mL).

Reakciona smeša je mešana na 60°C tokom 3,5 sata, a zatim vraćena na sobnu temperaturu. U reakcionu smešu su dodati etil acetat (15 mL) i zasićeni vodeni rastvor natrijum hidrogen karbonata (30 mL). Nakon što jer reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 5 dana, dodat je etil acetat i organski sloj je odvojen. Vodeni sloj je ekstrahovan etil acetatom.

Kombinovani organski sloj je osušen preko anhidrovanog natrijum sulfata, filtriran i koncentrovan pod redukovanim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (NH silika gel, 40-80% etil acetat/n-heptan). Dobijeni proizvod je ispran 3 puta dietil etrom i osušen pod sniženim pritiskom da bi se dobilo jedinjenje iz naslova (166 mg).

[0083]<1>H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 1,31-1,50 (m, 1H), 1,69-1,83 (m, 1H), 1,84-1,97 (m, 1H), 1,97-2,20 (m, 2H), 2,50 (s, 3H), 2,73-2,80 (m, 2H), 3,02-3,23 (m, 6H), 3,41-3,55 (m, 1H), 3,57-3,69 (m, 2H), 4,19-4,34 (m, 2H), 5,30 (d, J = 17,2 Hz, 1H).

MS (ESI) m/z: 359 [M+H]<+>

(Uslovi analize) Kolona: CHIRALPAK IC (proizvodi Daicel Chemical Industries, Ltd.) (0,46 cm ϕ x 15 cm), 40°C, eluent: etanol, brzina protoka: 1 mL/min., detekcija: UV (254 nm)

(Rezultati analize) Vreme zadržavanja jedinjenja iz naslova je 8,34 minuta, optička čistoća je bila >99% ee, a optička rotacija je bila (+).

Primeri farmakoloških ispitivanja

[0084] Sledeći farmakološki testovi su sprovedeni korišćenjem jedinjenja iz Primera 1 do 6.

Merenje oslobađanja acetilholina (ACh) u sistemu kulture primarnog septalnog neurona pacova u prisustvu NGF

2

(1) Kultura primarnog septalnog neurona pacova

[0085] Septalna oblast je izolovana od Sprague-Dawley (SD) pacova (Charles River Laboratories Japan, Inc.) u fetalnoj starosti od 18 dana i kultivisana. Konkretno, fetusi su aseptični uklonjeni od trudnih pacova pod anestezijom izofluranom. Mozak je izvađen iz svakog fetusa i uronjen u ledom hlađen medijum L-15 (11415-064, Thermo Fisher Scientific). Područje septuma je secirano iz ekstrahovanog mozga pod steroskopskim mikroskopom. Secirano područje septuma je podvrgnuto enzimskom tretmanu u rastvoru enzima koji sadrži 0,25% tripsina (15050-065, Thermo Fisher Scientific) i 0,01% DNaze (D5025-150KU, Sigma) na 37°C tokom 30 minuta, čime se ćelije raspršuju. U ovom slučaju, enzimska reakcija je prekinuta dodavanjem inaktiviranog konjskog seruma (26050-088, Thermo Fisher Scientific). Enzimom tretiran rastvor je centrifugiran na 1000 rpm tokom 3 minuta, a supernatant je uklonjen. U dobijenu ćelijsku masu dodat je medijum u količini od 10 mL. Korišćeni medijum je bio Dulbekov modifikovani orlov medijum (044-29765, VAKO) sa dodatkom N2 dodatka (17502-048, Thermo Fisher Scientific), 1 mM natrijum piruvata (11360-070, Thermo Fisher Scientific-105), i Penicilin-Streptomicin (15140-1221, Thermo Fisher Scientific). Ćelije ćelijske mase kojoj je dodat medijum ponovo su dispergovane blagim pipetiranjem, a zatim ponovo centrifugirane na 1000 rpm tokom 3 minuta, a supernatant je uklonjen. U dobijenu ćelijsku masu je dodat medijum u količini od 10 mL, a ćelijska disperzija je filtrirana kroz 40-µm najlonsku mrežicu (Cell Strainer) da bi se uklonila ćelijska masa, čime se dobija suspenzija neuronskih ćelija. Suspenzija neuronskih ćelija je razblažena sa medijumom i dodato je 10% inaktiviranog goveđeg seruma (26140-079, Thermo Fisher Scientific) i 10% inaktiviranog konjskog seruma. Nakon toga, 100 µL/bunariću suspenzije je zasejano u ploču sa 96 udubljenja (354461, CORNING) prethodno obloženu poli-D-lizinom tako da je početna gustina kulture bila 1,4 x 10<5>ćelija/cm<2>. Nakon što su zasejane ćelije kultivisane pod 5% CO2-95% vazduha u inkubatoru na 37°C tokom 2 dana, ceo medijum je zamenjen sa 120 µL svežeg medijuma, a ćelije su potom kultivisane 5 dana.

(2) Dodatak jedinjenja

[0086] Sedmog dana kultivisanja, jedinjenje je dodato na sledeći način. Rastvor ispitivanog jedinjenja u DMSO je razblažen medijumom tako da je koncentracija bila 10 puta veća od

2

konačne koncentracije. NGF (450-01, PEPRO TECH, INC.) je pripremljen na 0,3 ng/mL. Ova dva rastvora su dodata svaki u količini od 15 µL/udubljenju, i smeša je dobro izmešana. Konačna koncentracija DMSO bila je 0,1% ili manje. Štaviše, samo DMSO i NGF su dodati kontrolnoj grupi.

(3) Merenje oslobađanja ACh

[0087] Jedan dan nakon dodavanja jedinjenja, količina oslobađanja ACh je merena pomoću HPLC na sledeći način. Zagrejani pufer je dodat na 100 µL/udubljenju u bunar nakon što je medijum eliminisan, a pufer je odmah uklonjen. Zatim je dodat pufer u koji je dodato 10 µm holina, 10 µm fizostigmina i 6 mM KCl u količini od 120 µL/udubljenju. Pufer je pripremljen dodavanjem 125 mM NaCl, 25 mM 4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonske kiseline, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM MgSO4, 2,2 mM CaCl2(2H2O) i 10 mM vode u sterilizovanoj vodi. konačni pH rastvora je podešen na 7,4. Nakon što je ploča sa 96 udubljenja na koju je dodat pufer inkubirana u 5% CO2-95% vazduha u inkubatoru na 37°C tokom 40 minuta, sakupljeno je 80 µL pufera. U sakupljeni pufer dodat je interni standardni rastvor IPHC (5 x 10<-7>M) u količini od 6 µL, a pufer je prebačen u epruvetu za HPLC merenje i podvrgnut HPLC merenju. Rezultati su predstavljeni efektom svakog jedinjenja kao procentom (% kontrole) koncentracije ACh u puferu kontrolne grupe i koncentracijama jedinjenja koje pokazuju povećanje od 20% od koncentracije ACh u puferu kontrolne grupe prikazani su u sledećoj Tabeli 1.

[Tabela 1]

Merenje nivoa ekspresije holin acetiltransferaze (ChAT) mRNK u predelu septuma pacova

(1) Davanje jedinjenja

[0088] U ovom ispitivanju korišćeni su SD mužjaci pacova (Charles River Laboratories Japan, Inc.) telesne mase od oko 250 do 350 g. Jedinjenje je rastvoreno u 0,01 mol/L hlorovodonične kiseline i oralno davano.

(2) Uzorkovanje

[0089] 24 sata nakon davanja jedinjenja, celokupno moždano tkivo je sakupljeno pod pentobarbitalnom anestezijom. Medijalni septum je izolovan iz celog mozga na ledu i zamrznut tečnim azotom, a zatim čuvan na -80°C.

(3) Merenje nivoa ekspresije ChAT mRNK

[0090] Za prečišćavanje RNK, RNaziPlus Mini Kit (#74136: QIAGEN) korišćen u ovom ispitivanju. Prečišćavanje RNK je izvedeno postupkom opisanim u kompletu. Nakon prečišćavanja RNK, ukupna koncentracija RNK je merena korišćenjem QIAkpert instrumenta (QIAGEN). cDNK je sintetizovan korišćenjem SuperScript (R) VILO (TM) kompleta za sintezu cDNK (#11754: Thermo Fisher Scientific). Sinteza cDNK je izvedena postupkom opisanim u kompletu. Sintetizovana cDNK je razblažena 4 puta sa vodom bez RNaze, a razblaženi rastvor cDNK je korišćen kao uzorak. Taqman Universal PCR Master Mix (#4304437: Thermo Fisher Scientific), Taqman (R) testovi ekspresije gena, INVENTORIED (#4331182: Thermo Fisher Scientific), voda bez RNaze i rastvor cDNK su pomešani u količinama od 10 µl, 1 µl, 4 µl, i 5 µl, respektivno, i dobijena smeša je korišćena kao rastvor uzorka za merenje. Kvantitativna lančana reakcija polimeraze (qPCR) je sprovedena korišćenjem ABI PRISM (R) 7900HT (Thermo Fisher Scientific) postupkom fluorescentne sonde. Analiza je izvršena pomoću SDS 2,4 (Thermo Fisher Scientific). Rezultati su izračunati na osnovu procenta količine nivoa ekspresije ChAT mRNK u grupi sa davanjem jedinjenja povećane od količine nivoa ekspresije ChAT mRNK u grupi koja je davala vehikulum. Rezultati su prikazani u sledećoj Tabeli 2.

[Tabela 2]

1

Merenje acetilholina (ACh) u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) pacova

(1) Pozadina

[0091] Korelacija između povećanja i smanjenja intracerebralnih neurotransmitera i onih u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) otkrivena je ispitivanjima na glodarima, a korelacija je uočena i kod ljudi (Love S i dr. Psychopharmacology 219 (2012) 959-970). Dakle, merene su promene acetilholina u CSF da bi se utvrdile promene intracerebralnog acetilholina ispitivanim jedinjenjima.

(2) Davanje jedinjenja

[0092] U ovom ispitivanju korišćeni su Fischer344 mužjaci pacova (Charles River Laboratories Japan, Inc.) telesne mase od oko 150 do 250 g. Test jedinjenja su oralno davana pacovima jednom dnevno u dozi od 10 mg/kg tokom tri dana. Korišćeni nosač je bio 0,01 mol/L hlorovodonične kiseline.

(3) Uzorkovanje

[0093] 24 sata nakon davanja sredstva za prenošenje i testiranog jedinjenja, CSF je sakupljen iz cisterne magna u epruvetu koja sadrži AchE inhibitore pod pentobarbitalnom anestezijom. Sakupljeni CSF je centrifugiran na 3500 x g na 4 °C tokom 10 minuta i supernatant je sakupljen. Sakupljeni supernatant je zamrznut tečnim azotom, a zatim čuvan na -80°C.

(4) Merenje Ach pomoću LC-MS

2

[0094] U 10 µL CSF je dodato 50 µL acetilholin-d9 hlorida (ACh-d9) u konačnoj koncentraciji od 0,34 nmol/L kao interni standard. Smeša je pipetirana i centrifugirana na 1500 x g na 4 °C tokom 10 minuta. Supernatant je sakupljen i podvrgnut LC/MS (NekeraX2 (MS), TSQ Altis (HPLC)), a Ach je detektovan kao prekursorski jon na m/z 146,050 i kao jon proizvoda na m/z 87,071 i ACh-d9 kao interni standard je detektovan kao jon prekursora na m/z 155,088 i kao jon proizvoda na m/z 87,000. Rezultati su prikazani kao kalkulacije procenta povećanja koncentracije ACh u CSF u grupi sa primenom testiranog jedinjenja u odnosu na grupu koja je davala sredstvo za prenošenje (% kontrole). Rezultati su prikazani u Tabeli 3.

[Tabela 3]

Procena kod humanog tau P301S transgenskog miša

(1) Davanje jedinjenja

[0095] U ovom ispitivanju, testiranog jedinjenja su oralno davana humanim tau P301S transgenim miševima jednom dnevno tokom tri meseca od četiri meseca do sedam meseci. Korišćeni nosač je bio 0,01 mol/L hlorovodonične kiseline.

(2) Uzorkovanje

[0096] Početnog dana primene (četvoromesečne) i sledećeg dana konačnog davanja, miševi iz grupe za davanje sredstva za prenošenje i grupe za davanje testiranog jedinjenja su anestezirani pod pentobarbitalom (50 mg/kg, i.p.) i perfuzirani sa PBS. Nakon perfuzije, prednji mozak uključujući medijalni septalni deo je sakupljen i fiksiran sa 4% paraformaldehida.

(3) Priprema zamrznutog preseka krunice mozga

[0097] Sakupljeni prednji mozak uključujući medijalni septalni deo je uronjen i protresen preko noći u 4% paraformaldehida. Rastvor za uranjanje je zamenjen sa 7,5% rastvorom saharoze. Potopljen je i mućkan preko noći u 7,5% rastvor saharoze, a rastvor za uranjanje je zamenjen 15% rastvorom saharoze i potopljen je i mućkan preko noći. Rastvor za uranjanje je zamenjen 30% rastvorom saharoze i potopljen je i mućkan preko noći. Zamrznuti koronalni preseci mozga debljine 30 µm su pripremljeni iz prednjeg mozga uključujući medijalni septalni deo korišćenjem mikrotoma (Leica, SM2000R).

(4) Imunohistohemija ćelija pozitivnih na holin acetiltransferazu (ChAT)

[0098] Pripremljeni zamrznuti preseci krune mozga su obojeni DAB (DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT (Vector, SK-4100)) korišćenjem ChAT antitela (Santa Cruz, SC-20672) kao primarnog antitela. Slika preseka uključujući medijalni septalni deo kao što je prikazano u „Mozak miša u stereotaksičkim koordinatama“ (COMPACT THIRD EDITION, Keith B.J. Franklin & George Paxinos) uzeta je sve-u-jednom fluorescentnim mikroskopom (KEYENCE, BZ-Ks710) i ChAT pozitivne ćelije oko glavne ose medijalnog septalnog područja su izbrojane pomoću softvera za analizu BZ (KEYENCE). Rezultati su prikazani kao procenat broja ChAT pozitivnih ćelija u grupi koja je davala vehikulum i grupi sa primenom test jedinjenja u odnosu na broj ChAT pozitivnih ćelija u vreme inicijalne administracije (četvoromesečne). Podaci su izraženi kao srednja vrednost ±SEM. Razlike između grupe u vreme inicijalne primene i grupe tretirane sredstvom za prenošenje (značajne: *) je analiziran neuparenim t-testom, kao i razlike između grupe tretirane nosačem i grupe tretirane jedinjenjem (značajne: #) je analiziran neuparenim t-testom. Vrednost P<0,05 smatrana je statistički značajnom. Statističke analize su obavljene korišćenjem GraphPad Prism verzije 7,02. Rezultati su prikazani u Tabeli 4.

[Tabela 4]

4

Neuroprotektivni i restorativni efekat na holinergičke neurone korišćenjem modela pacova sa lezijom fimbrije-forniksa

(1) Priprema modela pacova sa lezijama fimbrije-forniksa

[0099] U ovom ispitivanju korišćeni su Sprague-Dawley mužjaci pacova (Charles River Laboratories Japan, Inc.) telesne mase od oko 250 do 350 g. Pacov je anesteziran kombinacijom tri leka: midazolam (2 mg/kg s.c.), medetomidin hidrohlorid (0,15 mg/kg s.c.) i butorfanol tartarat (2,5 mg/kg s.c.) i fiksiran sa aparatom za stereotaksiju mozga (Narishige Co., Ltd.). Izložena je lobanja i izbušena je rupa širine 5 mm u lobanji od srednje linije 2 mm pozadi od Bregme. Brijač širine 4 mm je probušen u Bregmu na dubini od 5,5 mm da bi se presekao fimbrija-forniks. Nakon hemostaze, skalp je zašiven. Nakon operacije, pacov je vraćen u kavez i oporavljen od anestezije. U grupi koja je bila lažno operisana, rupa širine 5 mm je izbušena u lobanji od srednje linije 2 mm pozadi od Bregme, ali nijedan brijač nije probušen.

(2) Davanje jedinjenja

[0100] Test jedinjenja su oralno davana pacovima jednom dnevno od pet dana do devet dana nakon operacije (primer 1:10 mg/kg) ili od sedam dana do četrnaest dana nakon operacije (Primer 3: 3 mg/kg). Korišćeni nosač je bio 0,01 mol/L hlorovodonične kiseline. U grupi koja je lažno operisana, vehikulum je davan oralno jednom dnevno, slično grupi koja je davala testirano jedinjenje.

(3) Uzorkovanje

[0101] Pacovi su anestezirani pod pentobarbitalom i transkardijalno perfuzirani sa ledeno hladnim PBS. Nakon perfuzije, prednji mozak uključujući medijalni septalni deo je sakupljen i uronjen i protresen preko noći sa 4% paraformaldehida. Rastvor za uranjanje je zamenjen sa 7,5% rastvorom saharoze. Potopljen je i mućkan preko noći u 7,5% rastvor saharoze, a rastvor za uranjanje je zamenjen 15% rastvorom saharoze i potopljen je i mućkan preko noći. Rastvor za uranjanje je zamenjen 30% rastvorom saharoze i potopljen je i mućkan preko noći. Zamrznuti koronalni preseci mozga debljine 30 µm su pripremljeni iz prednjeg mozga uključujući medijalni septalni deo korišćenjem mikrotoma (Leica, SM2000R).

(4) Imunohistohemija ćelija pozitivnih na holin acetiltransferazu (ChAT) i vezikularnog transportera acetilholina (VAChT)

[0102] Pripremljeni zamrznuti koronalni preseci mozga su obojeni DAB (DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT (Vector, SK-4100)) koristeći ChAT antitelo (Santa Cruz, SC-20672) ili VAChT antitelo (Merck Millipore, ABN100) kao primarno antitelo. Slika preseka uključujući medijalni septalni deo ili hipokampus kao što je prikazano u „Mozak miša u stereotaksičkim koordinatama“ (COMPACT THIRD EDITION, Keith B.J. Franklin & George Paxinos) snimljen je sve-u-jednom fluorescentnim mikroskopom (KEYENCE, BZ-Ks710) i ChAT pozitivne ćelije medijalnog septalnog područja ili optička gustina (OD) u hipokampalnom VAChT su izmerene softverom za analizu BZ (KEIENCE). Rezultati su prikazani kao procenat broja ChAT pozitivnih ćelija medijalnog septalnog područja ili OD u hipokampalnom VAChT u grupi koja je davala sredstvo za prenošenje i grupi koja je davala test jedinjenje u odnosu na broj ChAT pozitivnih ćelija medijalne septalne oblasti ili OD u hipokampalnom VAChT u lažno operisanoj grupi. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ±SEM. Razlike između grupe koja je tretirana nosačem i grupe koja je tretirana jedinjenjem (značajne: #) je analiziran neuparenim t-testom. Vrednost P<0,05 smatrana je statistički značajnom. Statističke analize su obavljene korišćenjem GraphPad Prism verzije 7,02.

Rezultati su prikazani u Tabelama 5 i 6.

[Tabela 5]

[Tabela 6]

Claims (1)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje izabrano iz grupe koju čine: 3-fluoro-6,11-dimetil-6,7,10,11,12,13-heksahidrobenzo[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-5,14-dion:

   5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-heksahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[2,3-f][1,4]diazepin-4,13-dion:

   5,10-dimetil-5,6,9,10,11,12-heksahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[3,2-f][1,4]diazepin-4,13-dion:

   (3aS,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion:

   (3aR,14aR)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion:

   i (3aS,14aS)-5,10-dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion:

   ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 2. 3-Fluoro-6,11-dimetil-6,7,10,11,12,13-heksahidrobenzo[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-5,14-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1:

   3. 5,10-Dimetil-5,6,9,10,11,12-heksahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[2,3-f][1,4]diazepin-4,13-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1:

   4. 5,10-Dimetil-5,6,9,10,11,12-heksahidropirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a]tieno[3,2-f][1,4]diazepin-4,13-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1:

   5. (3aS,14aR)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1:

   6. (3aR,14aR)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1:

   7. (3aS,14aS)-5,10-Dimetil-3,3a,5,6,9,10,11,12-oktahidro-1H-ciklopenta[f]pirido[4",3":4',5']tieno[2',3':4,5]pirimido[1,2-a][1,4]diazepin-4,13(2H,14aH)-dion ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema patentnom zahtevu 1:

   8. Farmaceutski sastav koji sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih aditiva. 9. Terapeutsko sredstvo za upotrebu u lečenju Alchajmerove bolesti koje sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7. 10. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7 za upotrebu u lečenju Alchajmerove bolesti. 4 11. Terapijsko sredstvo za upotrebu u lečenju demencije sa Levijevim telima koji sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7. 12. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7 za upotrebu u lečenju demencije sa Levijevim telima. 13. Terapeutsko sredstvo za upotrebu u lečenju Parkinsonove bolesti sa demencijom koje sadrži jedinjenje ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7. 14. Jedinjenje ili njegova farmaceutski prihvatljiva so prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7 za upotrebu u lečenju Parkinsonove bolesti sa demencijom. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5