KR20200085302A - 지카 백신 및 면역원성 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원 (예를 들어, 지카 바이러스 클론 분리주, 비-인간 세포에 적응된 지카 바이러스 등)을 갖는 지카 바이러스 백신 및 면역원성 조성물 및 이의 치료 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

지카 백신 및 면역원성 조성물 및 이의 사용 방법
연방 정부의 지원을 받은 연구에 관한 진술
본 발명은 미국 보건복지부 산하의 질병예방대응본부의 생물의약품첨단연구개발국과의 계약 번호 HHSO100201600015C 하에 정부 지원을 받아 만들어졌다. 본 발명은 미국 보건복지부의 산하 기관인 질병통제예방센터와의 공동 연구 개발 협약의 성과로 창출되었다. 미국 정부는 본 발명에서 일정한 권리를 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 갖는 지카 바이러스 백신 및 면역원성 조성물 (예를 들어, 지카 바이러스 클론 분리주, 비-인간 세포에 적응된 지카 바이러스 등) 및 이의 치료 방법 및 용도에 관한 것이다.
배경
플라비바이러스과 (Flaviviridae) 내에 다른 모기 매개 바이러스 (예를 들면, 황열병, 뎅기, 웨스트 나일, 그리고 일본 뇌염 바이러스)와 함께 분류되는 플라비바이러스인 지카 바이러스는 상기 바이러스가 2013년에 브라질 내로 도입된 이후로, 반구 전역에 걸친 유행병으로 급속하게 확산되었다. 상기 바이러스는 미국의 영토를 비롯한 중앙아메리카와 북아메리카에 도달하였고, 결과적으로 현재 US 본토를 위협하고 있다. 실제로, 지카 바이러스 균주 PRVABC59는 2015년에 푸에르토리코를 여행했던 한 사람으로부터 얻은 혈청으로부터 단리되었다. 이러한 균주의 게놈은 적어도 3회 염기서열결정되었다 (참조: Lanciotti 외 Emerg. Infect. Dis. 2016 May;22(5):933-5 및 GenBank 수탁 번호 KU501215.1; GenBank 수탁 번호 KX087101.3; 그리고 Yun 외 Genome Announc. 2016 Aug 18;4(4) 및 GenBank 수탁 번호 ANK57897.1).
1947년에 우간다에서 최초 단리되었던 상기 바이러스는 1952년에 인간 질병에 우선 연계되었고, 그리고 아프리카 및 동남아시아에서 경등도, 자기 한정 열성 질병의 원인으로서 산발적으로 인식되었다 (Weaver 외 (2016) Antiviral Res. 130:69-80; Faria 외 (2016) Science. 352(6283):345-349).. 하지만, 2007년에, 북태평양의 얍 섬에서 발병이 발생하였고, 그리고 이후, 태평양의 전역에서 섬에서 섬으로 전파되어, 2013-2014년에 프랑스령 폴리네시아에서 광범위한 발병을 야기하였고, 이후 뉴칼레도니아, 쿡 섬, 그리고 궁극적으로, 이스터 섬까지 확산되었다. 아시아 계통 바이러스가 차후에, 미확인 상태로 남아있는 루트에 의해 서반구로 이전되었다 (Faria 외 (2016) Science. 352(6283):345-349).. 상기 바이러스는 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti), 아에데스 알보픽투스 (A. albopictus), 그리고 아마도 아에데스 헨실리 (A. hensilli) 및 아에데스 폴리니에세인시스 (A. polynieseinsis)에 의해 인수공통으로 전염될 수 있다 (Weaver 외 (2016) Antiviral Res. 130:69-80).. 추가적으로, 상기 바이러스를 전파하기 위한 다른 벡터가 존재할 수 있고, 그리고 상기 바이러스가 수혈에 의해, 경태반으로 및/또는 성적 전염을 통해 전파될 수 있는 것으로 생각된다.
2015년 말에, 광범위한 지카 바이러스 감염의 지역에서 태아 이상 (예를 들면, 소두증) 및 길랭 바레 증후군 (GBS)의 유의미한 증가는 지카 바이러스가 초기에 생각했던 것보다 훨씬 독성일 수도 있다는 경종을 울렸고, 이로 인해 세계 보건 기구 (WHO)는 세계 공중보건 비상사태 (PHEIC)를 선언해야만 했다 (Heymann 외 (2016) Lancet 387(10020): 719-21).. WHO가 이후 PHEIC의 종식을 선포했지만 지카는 임산부와 태아에게 특히 심각한 위협이 되고 있다.
지카 바이러스가 실제적인 공중 보건 위협을 촉발하고 있음에도 불구하고, 어떤 FDA-승인된 백신 또는 치료제도 현재 존재하지 않으며, 그리고 지카 바이러스를 제어하기 위한 유일한 방지적 조치는 모기 개체군을 관리하는 것을 수반한다.
잠재적인 백신의 개발을 위한 재조합 지카 바이러스를 특징짓기 위한 최근 노력에서, 위치 330에서 바이러스 외피 단백질에서 돌연변이를 품는 비인간 세포 적응된 지카 바이러스가 확인되었다 (Weger-Lucarelli 외 (2017) Journal of Virology 91(1): 1-10). 이 연구의 저자들은 지카 바이러스 균주 PRVABC59의 전장 감염성 cDNA 클론이 클로닝 동안 증폭될 때 유전적으로 불안정하다는 것을 발견하였고, 그리고 관찰된 불안정을 다루기 위해 바이러스 게놈을 분할하여, 2개 플라스미드 시스템을 개발하고 적용하기로 선택하였다. 하지만, 지카 백신의 개발을 위한 2개 플라스미드 시스템은 별로 바람직하지 않다.
간단한 요약
따라서, 지카 바이러스를 치료 및/또는 예방하기 위한 백신 및 면역원성 조성물을 개발할 필요가 있다. 따라서, 본 발명의 특정 양상은 지카 바이러스로부터의 하나의 항원 1μg 내지 40μg 용량을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것으로, 여기서 항원은 비활성화된 전체 바이러스이다.
따라서, 본 발명의 특정 양상은 지카 바이러스로부터의 하나의 항원 1μg 내지 40μg 용량을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서 지카 바이러스는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함한다.
따라서, 본 발명의 특정 양상은 지카 바이러스로부터의 하나의 항원 1μg 내지 40μg 용량을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 가진다.
상기 및 다른 요구를 충족시키기 위해, 본 발명은 적어도 부분적으로 비-구조 단백질 1 (야생형 외피 단백질)에서의 적응을 보유하는 유전자적으로 안정한 비-인간 세포 적응된 지카 바이러스에 관한 것이며, 이는 백신 생산을 위해 단일 바이러스/바이러스 게놈 시스템을 사용할 수 있게 한다. 본 발명은 또한 적어도 부분적으로는 유전적으로 균질하고 및/또는 하나 이상의 외래성 물질로부터 정제된 지카 바이러스 클론 분리주에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이 (예를 들어, 지카 바이러스 비-구조 단백질 1에서의 돌연변이)를 보유하는 지카 바이러스 및/또는 지카 바이러스 클론 분리주로부터의 하나 이상의 지카 바이러스 항원 (예를 들어, 전체 비활성화된 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원)을 포함하는, 지카 바이러스 감염 (예를 들어, 인간에서)을 치료 및/또는 예방함에 유용한 백신 및 면역원성 조성물을 제공한다.
본 발명은 적어도 부분적으로, 개별적으로 유도된 비-인간 세포 적응된 지카 바이러스의 클론 바이러스 개체군으로부터의 하나 이상의 항원을 포함하는 고용량 및 저용량 백신 두 가지 모두가 강력한 면역 반응을 유도하고 지카 바이러스 감염으로부터 상당한 보호를 제공 할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다 (아래 실시예 2 및 실시예 4 참조). 지카 바이러스 균주의 클론 단리는 또한 다음을 가능하게 하였다: 1) 오염 물질 (예를 들어, 모 균주와 함께 정제 될 수 있는 외인성 물질)로부터 바이러스의 성공적 정제, 및 2) 유전자적으로 균질한 바이러스 개체군의 생산. 더욱이, 본 발명은 적어도 부분적으로 단백질 NS1에서 적응 돌연변이를 보유하는 클론 단리된 지카 바이러스가 Vero 세포에서 높은 역가까지 예측가능하게 잘 자랐으며 놀랍게도 바이러스 외피 단백질에서 검출가능한 돌연변이 없이 유전적으로 안정/유전적으로 균일하였다는 발견에 기초한다 (하기 실시예 1 및 2 참조). 지카 바이러스 비-구조 단백질 1에서의 유사한 돌연변이가 지카 바이러스 균주 PRVABC59의 공개된 3개의서열 중 1개의 게놈 염기서열분석 분석에서 관찰되었을 수 있으나 (Yun 외 Genome Announc. 2016 Aug 18;4(4)), 이 참고 문헌은 NS1에서의 돌연변이가 바이러스의 안정성을 향상시킬 수 있음을 교시하거나 제시하지 못하고; 돌연변이를 보유한 바이러스가 지카 바이러스에 대한 효과적인 백신의 개발에 사용될 수 있음을 교시하거나 제시하지 못하며; 이러한 백신이 저용량 및 고용량 모두에서 사용될 때 강력한 면역 반응을 유도하고 지카 바이러스 감염으로부터 상당한 보호를 제공함에 효과적일 수 있음을 교시하거나 제시하지 못한다. 따라서, 이론에 구속되지 않고, 본 발명의 발명자들은 단백질 NS1에서의 적응 돌연변이가 지카 바이러스 내에서 유전자 안정성을 향상시켜, 복제 효율을 증가/향상시키는 것으로 보인다는 결론을 내렸다. 또한, 단백질 NS1에서 적응 돌연변이를 보유하는 지카 균주는 추가 돌연변이를 발생시키지 않고 여러 번 계대배양 될 수 있었다. 이러한 안정한 지카 바이러스 균주는, 마스터 바이러스 씨드 (MVS)가 바람직하지 않은 돌연변이를 발생시킬 위험이 감소되기 때문에, 백신 생산 및 제조를 위한 마스터 바이러스 씨드 (MVS) 또는 MVS로부터 유래된 후속 씨드로서 이점을 가진다. 또한, 이론에 한정되지 않고, 본 발명의 지카 균주의 단백질 NS1에서의 적응 돌연변이는 바람직하지 않은 돌연변이, 가령, 지카 바이러스 균주의 외피 단백질 E (Env) 내부에서의 돌연변이의 발생을 감소시키거나 또는 다른 방식으로 억제할 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 양상은 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 함유하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서 지카 바이러스는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1)에 존재한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 적응 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 적응 돌연변이는 Trp98Gly 돌연변이이다.
따라서, 본 발명의 특정 양상은 지카 바이러스로부터의 하나의 항원 1μg 내지 40μg 용량을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서 지카 바이러스는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함한다.
따라서, 본 발명의 특정 양상은 지카 바이러스로부터의 하나의 항원 1μg 내지 40μg 용량을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것이며, 여기서 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 가진다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 하나 이상의 적응 돌연변이는 하나 이상의 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여 유전자 안정성을 향상시킨다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 하나 이상의 적응 돌연변이는 하나 이상의 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여 바이러스 복제를 향상시킨다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 외피 단백질 E (Env)에서의 돌연변이를 포함하지 않는다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 비-인간 세포는 포유동물 세포이다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 비-인간 세포는 원숭이 세포이다. 일부 구체예들에서, 원숭이 세포는 Vero 세포주로부터 유래된다. 일부 구체예들에서, Vero 세포주는 WHO Vero 10-87 세포주이다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 아프리카 계통 바이러스 또는 아시아 계통 바이러스이다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 아시아 계통 바이러스이다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 균주 PRVABC59로부터 유래된다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 항원 백신 또는 면역원성 조성물, 소단위 백신 또는 면역원성 조성물, 비활성화된 전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물, 또는 약독화된 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 비활성화된 전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 포함한다. 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 포함한다. 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 포함한다. 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 균주 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서의 Trp98Gly 돌연변이에서 균주 PRVABC59와 상이한 정제된 비활성화 전체 지카를 포함한다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 바이러스는 화학적으로 비활성화되었다. 일부 구체예들에서, 바이러스는 세제, 포르말린, 베타-프로피오락톤 (BPL), 2성분 에틸아민 (BEI), 아세틸 에틸렌이민, 메틸렌 블루 및 소랄렌 중 하나 이상을 이용하여 화학적으로 비활성화되었다. 일부 구체예들에서, 바이러스는 포르말린을 이용하여 화학적으로 비활성화되었다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 어쥬번트를 추가로 함유한다. 일부 구체예들에서, 어쥬번트는 알루미늄 염, 톨 유사 수용체 (TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, MLA 유도체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩티드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 지질다당류 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀션, 비로솜, 카클리어트, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA), 및/또는 불완전 프로인트 어쥬번트 (IFA)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 알루미늄 염이다. 일부 구체예들에서, 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 및 알하이드로겔 85에서 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 항원의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%가 어쥬번트에 흡착된다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 저용량 또는 중간 용량의 백신 또는 면역원성 조성물 (예를 들어, 약 1μg 내지 약 5μg 항원 또는 5μg 또는 항원 2μg 항원 또는 5μg 항원을 함유함)이다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 고용량 백신 또는 면역원성 조성물 (예를 들어, 약 10μg 항원 함유)이다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 μg 내지 약 25 μg의 하나 이상의 항원, 특히, 2 μg, 5 μg 또는 10 μg, 또는 특히 10 μg의 하나 이상의 항원을 함유한다. 이러한 특정 구체예에서, 항원은 정제된 비활성화 전체 바이러스, 가령, 서열 번호:1의 위치 98에서 또는 본원에 기재된 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판의 글리신으로의 치환인 돌연변이를 가지는 지카 바이러스이다. 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 균주 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59로부터 유래된다. 이러한 특정 구체예들에서, 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 약 0.1 μg 내지 약 100 μg의 지카 바이러스 항원 또는 Env를 함유한다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 어쥬번트 처리되지 않는다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 클론 분리주이다. 일부 구체예들에서, 클론 분리주에는 하나 이상의 외인성 물질이 실질적으로 없다 (예를 들어, 모 균주와 함께 정제될 수 있는 하나 이상의 외인성 물질이 없다).
본 발명의 다른 양상들은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 가지는 지카 바이러스를 포함하는 백신에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 백신은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 균주 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 백신은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59로부터 유래된다. 이러한 특정 구체예들에서, 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다.
본 발명의 다른 양상들은 다음을 함유하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것이다: a) 알루미늄 염 어쥬번트; 및 b) 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스, 이 때 지카 바이러스는 비-인간 적응 돌연변이를 함유하며, 여기서 비-인간 세포 적응 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서의 Trp98Gly 돌연변이.
본 발명의 다른 양상들은 치료적 효과량의 본원에 기재된 임의의 백신 또는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방, 특히 예방하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양상은 대상에게 면역원성 양의 본원에 기재된 임의의 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
한 양상에서 본 발명은 백신 또는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방, 특히 예방하는 방법에 관한 것이다.
한 양상에서 본 발명은 대상에게 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
한 양상에서 본 발명은 백신 또는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 질병의 예방 방법에 관한 것이다. 이 경우 이 질병은 가벼운 열, 황반 발진, 결막염 및 관절통과 관련이 있다. 또한 지카 바이러스는 중추 신경계와 길랭-바레 증후군 (GBS) 내에서 질병을 유발할 수있는 신경성 플라비바이러스이다.
한 양상에서 본 발명은 임신한 대상 또는 임신하고자 하는 대상 또는 임신 가능성이 있는 여성에게 상기 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 태아 또는 신생아에서 지카 바이러스 질병의 예방 방법에 관한 것이다. 이 경우 지카 질병은 태아와 신생아에 대한 심각한 결과와 관련되어 있다. 선천성 지카 증후군 (CZS)으로 알려진 지카 바이러스 감염과 관련된 선천성 기형의 스펙트럼은 두개골이 부분적으로 붕괴된 심각한 소두증, 피질 석회화가 있는 대뇌피질, 황반 흉터 및 국소 색소성 망막 반점형성, 선천성 수축 및 추체외로 관여 증상을 수반한 두드러진 조기 근육긴장항진증으로 구성된다.
한 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서, 이를 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에서, 그리고 이를 필요로 하는 태아 또는 신생아 대상에서 지카 바이러스 질병의 예방 방법에서 사용하기 위한 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
한 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법, 이를 필요로 하는 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법, 그리고 이를 필요로 하는 태아 또는 신생아 대상에서 지카 바이러스 질병의 예방 방법을 위한 약제의 제조에서 상기 백신 또는 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 특정 양상들은 이를 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에 관한 것으로서, 지카 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 300 초과, 또는 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 2000 초과, 또는 3000 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도한다.
따라서, 본 발명의 특정 양상들은 이를 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에 관한 것으로서, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 추가접종 투여 후 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 일차접종 투여 후 28일에 유도되는 기하 평균 중화 항체 역가보다 10 배 이상, 또는 15 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 25 배 이상 더 높은 기하 평균 중화 항체 역가를 유도한다. 따라서 추가접종 투여는 장기간 보호의 원인이 되는 매우 높은 기하학적 평균 중화 항체 역가를 제공한다.
따라서, 본 발명의 특정 양상들은 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에 관한 것으로서, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 단회 용량 또는 일차접종 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 단회 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 10 초과, 또는 50 초과, 또는 100 초과, 또는 200 초과, 또는 250 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도한다. 높은 기하 평균 중화 항체 역가는 조기 보호 개시를 나타내며, 이는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하고 짧은 시기 이내에 발병 상황에서 또는 발병 지역을 방문하는 여행자에게 유익하다.
본원의 의미 내에서 PRNT는 전술한 바와 같이 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정된 지카 바이러스 중화 항체 역가를 지칭한다 (Sun, W. 외 Protection of Rhesus monkeys against dengue virus challenge after tetravalent live attenuated dengue virus vaccination. J. Infect. Dis. 193, 1658-1665 (2006). Muthumani K, Griffin BD, Agarwal S, 외 In vivo protection against ZIKV infection and pathogenesis through passive antibody transfer and active immunisation with a prMEnv DNA 백신. NPJ 백신 2016; 1: 16021 참고). PRNT 분석 개발에 사용된 지카 균주는 PRVABC59였다.
본 발명의 의미내에서, 혈청양성은 플라크 감소 중화 시험 (PRNT)으로 결정시 역가 ≥ 10으로 정의되고; 플라크 감소 중화 시험 (PRNT)으로 결정시 지카 바이러스 혈청 음성 대상 (역가 <10), 혈청전환은 다음과 같이 정의된다: 지카 바이러스 혈청음성 대상 (역가 <10)는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 결정시 백신접종 후 역가 ≥10을 가지며; 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 결정된 결과 < 10에 역가 5가 할당되고; 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 결정된 역가 ≥ 10 (검출 한도) 및 < 26 (정량 하한)에 13 값이 할당된다.
본 발명에서 플라비바이러스 나이브 대상은 반응성 항체 기반 분석법 (루미넥스, Luminex)에 의해 측정 될 때 플라비바이러스 패널에 대해 검출 가능한 혈청 항체가 없는 대상으로 정의된다. 플라비바이러스 스크리닝 분석은 루미넥스 플랫폼을 기반으로하여 동일한 시료에서 여러 표적 항원을 동시에 검출한다. 이러한 비드 기반 분석은 민감하고 구체적이며 재현가능하다. ZIK101의 경우, 표적된 항원은 지카, 뎅기열, 황열병, JEV, USUV, SLEV 및 WNV이다. 플라비바이러스 사이의 교차 반응성으로 인해, 현재의 항원 세트는 임의의 기존 플라비바이러스 노출을 검출하는 데 도움이 될 것이다. 루미넥스 개념에 대한 참고 문헌은 다음과 같다. Dias D, Van Doren J, Schlottmann S, Kelly S, Puchalski D, Ruiz W, Boerckel P, Kessler J, Antonello JM, Green T, Brown M, Smith J, Chirmule N, Barr E, Jansen KU, Esser MT. 2005. Optimization and validation of a multiplexed Luminex assay to quantify antibodies to neutralizing epitopes on human papillomaviruses 6, 11, 16, and 18. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:959-969 [PMC free article] [PubMed]. Ayouba A et al Development of a Sensitive and Specific Serological Assay Based on Luminex Technology for Detection of Antibodies to Zaire Ebola Virus. J Clin Microbiol. 2017 Dec 28;55(1):165-176. doi: 10.1128/JCM.01979-16.
본 발명의 내용에서 풍토병의 의미는, 질병 통제 및 예방 센터에 의해 정의된 감염 위험이 있는 지역으로 정의되며, 가령, 예를 들어, 2018 년 3 월 현재 다음과 같은 지역이다: 아시아: 방글라데시, 버마 (미얀마), 캄보디아, 인도, 인도네시아, 라오스, 말레이시아, 몰디브, 파키스탄, 필리핀, 싱가포르, 태국, 동-티모르 (동 티모르), 베트남. 태평양 제도: 피지, 마샬 제도, 파푸아 뉴기니, 사모아, 솔로몬 제도, 통가. 캐리비안: 앵귈라; 앤티가 바부다; 아루바; 바베이도스; 보네르; 영국령 버진 아일랜드; 쿠바; 쿠라 사오; 도미니카; 도미니카 공화국; 그레나다; 아이티; 자메이카; 몬세라트; 미국 영토 푸에르토리코 연방; 사바; 세인트 키츠 네비스; 세인트 루시아; 세인트 마틴; 세인트 빈센트 그레나딘; 신트 유스타티우스; 신트 마르턴; 트리니다드 토바고; 터크스 케이커스 제도; 미국령 버진 아일랜드. 북아메리카: 멕시코 중미: 벨리즈, 코스타리카, 엘살바도르, 과테말라, 온두라스, 니카라과, 파나마 남아메리카: 아르헨티나, 볼리비아, 브라질, 콜롬비아, 에콰도르, 프랑스령 기아나, 가이아나, 파라과이, 페루, 수리남, 베네수엘라 아프리카: 앙골라, 베냉, 부르키나 파소, 부룬디, 카메룬, 카보 베르데, 중앙 아프리카 공화국, 차드, 콩고 (콩고-브라자빌), 코트디부아르, 콩고 민주 공화국 (콩고-킨샤사), 적도 기니, 가봉, 감비아 가나, 기니, 기니 비사우, 케냐, 라이베리아, 말리, 니제르, 나이지리아, 르완다, 세네갈, 시에라 리온, 남 수단, 수단, 탄자니아, 토고, 우간다. 이 지역은 변경될 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 양상들은 이를 필요로 하는 대상 개체군에서 면역 반응의 유도 방법에 관한 것으로서, 지카 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 리포터 바이러스 입자 중화 분석 (RVP)으로 결정시 상기 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상의 대상 개체군에서 300 초과, 또는 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 2000 초과, 또는 3000 초과, 또는 5000 초과, 또는 10,000 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도한다.
따라서, 본 발명의 특정 양상들은 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에 관한 것으로서, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 단회 용량 또는 일차접종 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 리포터 바이러스 입자 중화 분석 (RVP)으로 측정시 상기 단회 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 300 초과, 또는 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 2000 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도한다. 높은 기하 평균 중화 항체 역가는 조기 보호 개시를 나타내며, 이는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하고 짧은 시기 이내에 발병 상황에서 또는 발병 지역을 방문하는 여행자에게 유익하다.
본 발명의 의미에서 리포터 바이러스 입자 (RVP) 중화 분석은 지카 중화 항체 역가가 96-웰 플레이트에서 성장한 Vero 세포에서 일정량의 지카 RVP를 갖는 혈청 샘플의 적정에 의해 분석되었음을 나타낸다. RVPs는 지카 (계열 SPH2012)의 prME 단백질 및 뎅기-기초된 레닐라 루시페라아제 리포터를 함유하였다. 간단히 말하면, 혈청은 56 ℃에서 30 분 동안 열 비활성화되고, 희석되고, 그리고 이후, 37℃에서 RVPs와 함께 배양되었다. 혈청/RVP 혼합물은 이후, Vero 세포와 혼합되고, 그리고 루시페라아제 기질로 검출 전 37℃± 2℃, 5% CO2에서 72 시간 동안 배양되었다. 데이터는 양성 추적 대조에 대해 정규화된 JMP11 비선형 4 파라미터 분석을 이용하여 분석되었고, 그리고 유효 용량 50% (EC50)이 보고되었다.
따라서, 본 발명의 특정 양상들은 이를 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에 관한 것으로서, 지카 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 상기 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 혈청음성 대상 개체군에서 100%의 혈청전환율을 유도한다.
따라서, 본 발명의 특정 양상들은 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에 관한 것으로서, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 단회 용량 또는 일차접종 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 상기 단회 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 60%, 70%, 80% 또는 90%의 혈청전환율을 유도한다. 높은 혈청전환율은 조기 보호 개시를 나타내며, 이는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하고 짧은 시기 이내에 발병 상황에서 또는 발병 지역을 방문하는 여행자에게 유익하다.
상기 방법은 또한 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방용 약제의 제조를 위한 본원에 개시된 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물의 상응하는 용도에 관한 것으로 이해되어야 한다.
상기 방법은 또한 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본원에 개시된 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것으로 이해되어야 한다.
일부 구체예들에서, 상기 투여는 근육내 또는 피하이다. 일부 구체예들에서 상기 투여는 약 1 내지 약 16주 간격으로 (제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여) 제공되는 본원에 기재된 백신 또는 면역원성 조성물 2회 용량 (예컨대, 10 μg의 정제된 비활성화 전체 바이러스, 가령, 본원에 기재된 서열 번호:1의 위치 98에서 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판의 글리신으로의 치환인 돌연변이를 가지는 지카 바이러스)의 투여를 포함한다. 이러한 특정 구체예들에서, 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다.
본 발명의 다른 양상은 이를 필요로하는 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 이를 필요로하는 대상에서 면역 반응을 유도하는데 사용하기 위한, 및 이를 필요로하는 대상, 태아 또는 신생아에서 지카 바이러스 질병의 예방에 사용하기 위한 본원에 기재된 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 투여는 근육내 또는 피하이다. 일부 구체예들에서 상기 투여는 약 1 내지 약 16주 간격으로 (제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여) 제공되는 본원에 기재된 백신 또는 면역원성 조성물 2회 용량 (예컨대, 10 μg의 정제된 비활성화 전체 바이러스, 가령, 본원에 기재된 서열 번호:1의 위치 98에서 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판의 글리신으로의 치환인 돌연변이를 가지는 지카 바이러스)의 투여를 포함한다. 이러한 특정 구체예들에서, 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다.
본 발명의 다른 양상은 이를 필요로하는 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 그리고 이를 필요로하는 대상에서 면역 반응을 유도하기 위한 약제의 제조에서, 및 이를 필요로하는 대상, 태아 또는 신생아에서 지카 바이러스 질병의 예방에 있어서 본원에 기재된 백신 또는 면역원성 조성물의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 투여는 근육내 또는 피하이다. 일부 구체예들에서 상기 투여는 약 1 내지 약 16주 간격으로 (제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여) 제공되는 본원에 기재된 백신 또는 면역원성 조성물 2회 용량 (예컨대, 10 μg의 정제된 비활성화 전체 바이러스, 가령, 본원에 기재된 서열 번호:1의 위치 98에서 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판의 글리신으로의 치환인 돌연변이를 가지는 지카 바이러스)의 투여를 포함한다. 이러한 특정 구체예들에서, 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 대상은 인간이다. 일부 구체예에서, 대상은 임신했거나 또는 임신하고자 하거나 임신 가능성이 있는 여성이다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 대상에서 보호 면역 반응을 유도한다. 일부 구체예들에서, 대상에서 유도된 보호 면역 반응은 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원들을 함유하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여받은 상응하는 대상에서 유도된 보호 면역 반응보다 크다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체의 생성을 유도한다. 일부 구체예에서, 대상에서 생성된 중화 항체의 농도는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여한 상응하는 대상에서 생성된 중화 항체의 농도보다 높다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 피하 투여, 경피 투여, 피내 투여, 진피하 투여, 근육내 투여, 경구 투여, 비강내 투여, 협측 투여, 복강내 투여, 질내 투여, 항문 투여 및/또는 두개내 투여로부터 선택된 경로에 의해 투여된다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 1회 이상 투여된다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로 투여된다. 일부 구체예들에서, 제 2 (추가접종) 투여는 제 1 (일차접종) 투여 후 최소한 28일에 투여된다. 일부 구체예들에서 상기 투여는 약 1 내지 약 16주 간격으로 (제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여) 제공되는 본원에 기재된 백신 또는 면역원성 조성물 2회 용량 (예컨대, 10 μg의 정제된 비활성화 전체 바이러스, 가령, 본원에 기재된 서열 번호:1의 위치 98에서 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판의 글리신으로의 치환인 돌연변이를 가지는 지카 바이러스)의 투여를 포함한다. 이러한 특정 구체예들에서, 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 바이러스 제재는 어쥬번트와 혼합된다. 일부 구체예들에서, 어쥬번트는 알루미늄 염, 톨 유사 수용체 (TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, MLA 유도체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩티드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 지질다당류 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀션, 비로솜, 카클리어트, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA), 및/또는 불완전 프로인트 어쥬번트 (IFA)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 알루미늄 염이다. 일부 구체예들에서, 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 및/또는 알하이드로겔 85에서 선택된다. 일부 구체예에서, 바이러스 조직표본 내에 하나 이상의 항원 중에서 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%가 어쥬번트에 흡착된다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 지카 바이러스 NS1에 존재한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 적응 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 적응 돌연변이는 Trp98Gly 돌연변이이다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 하나 이상의 적응 돌연변이는 하나 이상의 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여 유전자 안정성을 향상시킨다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 하나 이상의 적응 돌연변이는 하나 이상의 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여 바이러스 복제를 향상시킨다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 외피 단백질 E (Env)에서의 돌연변이를 포함하지 않는다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 지카 바이러스의 개체군은 이종성이다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 지카 바이러스의 개체군은 지카 바이러스 임상 분리주를 포함한다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스 임상 분리주는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 지카 바이러스 개체군은 세포 배양물에서 1회 이상 사전에 계대배양된 지카 바이러스를 포함한다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 접종물은 인간 혈청을 포함한다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 접종물은 하나 이상의 외인성 물질을 포함한다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 클론 분리주에는 하나 이상의 외인성 물질이 실질적으로 없다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 상기 방법은 지카 바이러스 클론 분리주의 1회 이상의 추가 플라크 정제를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 클론 분리주는 2회 이상 추가로 플라크 정제된다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 상기 방법은 세포 배양물에서 지카 바이러스 클론 분리주를 1회 이상 계대배양하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 클론 분리주는 2회 이상 계대배양된다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 상기 방법은 지카 바이러스 클론 분리주로부터의 하나 이상의 항원들을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 제제화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 항원 백신 또는 면역원성 조성물, 소단위 백신 또는 면역원성 조성물, 비활성화된 전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물, 또는 약독화된 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 비활성화 전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 클론 분리주는 화학적으로 비활성화된다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 클론 분리주는 세제, 포르말린, 베타-프로피오락톤 (BPL), 2성분 에틸아민 (BEI), 아세틸 에틸렌이민, 메틸렌 블루 및 소랄렌 중 하나 이상을 이용하여 화학적으로 비활성화되었다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 클론 분리주는 포르말린으로 화학적으로 비활성화된다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 상기 방법은 백신 또는 면역원성 조성물을 어쥬번트와 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 어쥬번트는 알루미늄 염, 톨 유사 수용체 (TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, MLA 유도체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩티드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 지질다당류 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀션, 비로솜, 카클리어트, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA), 및 불완전 프로인트 어쥬번트 (IFA)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 알루미늄 염이다. 일부 구체예들에서, 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 및 알하이드로겔 85에서 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 항원의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%가 어쥬번트에 흡착된다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 1 μg 내지 약 40 μg의 정제된 비활성화 전체 바이러스, 또는 1 μg 내지 약 30 μg의 정제된 비활성화 전체 바이러스, 또는 1 μg 내지 약 20 μg의 정제된 비활성화 전체 바이러스, 특히 2 μg, 또는 5 μg, 또는 10 μg, 또는 15 μg 또는 20 μg 또는 특히 10 μg의 정제된 비활성화 전체 바이러스, 가령, 서열 번호:1의 위치 98에서 또는 본원에 기재된 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판의 글리신으로의 치환인 돌연변이를 가지는 지카 바이러스를 포함한다. 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 1 μg 내지 약 30 μg of 정제된 비활성화 전체 바이러스, 특히 2 μg, 5 μg 또는 10 μg, 또는 특히 10 μg의 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 균주 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 1 μg 내지 약 30 μg of 정제된 비활성화 전체 바이러스, 특히 2 μg, 5 μg 또는 10 μg, 또는 특히 10 μg의 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 서열 번호:2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59로부터 유래된다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 약 0.1 μg Env 내지 약 100 μg Env을 포함한다. 이러한 특정 구체예들에서, 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 어쥬번트 처리되지 않는다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 지카 바이러스 클론 분리주는 동종 유전자 개체군이다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 클론 분리주는 외피 단백질 E (Env)에서 돌연변이를 함유하지 않는다. 일부 구체예들에서, 지카 바이러스 클론 분리주는 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 돌연변이는 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1)에 존재한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 돌연변이는 Trp98Gly 돌연변이이다. 일부 구체예에서 하나 이상의 돌연변이는 외피 단백질 E (Env)에 존재하지 않는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여, 유전적 안정성을 향상시킨다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여, 바이러스 복제를 향상시킨다.
본 발명의 다른 양상은 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주로부터 하나 이상의 항원을 함유하는 백신 또는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 지카 바이러스 개체군을 포함하는 접종물과 접촉된 세포로부터 플라크 정제되었다. 일부 구체예에서, 세포는 비인간 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 곤충 세포이다. 일부 구체예들에서, 곤충 세포는 모기 세포이다. 일부 구체예들에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구체예들에서, 포유동물 세포는 원숭이 세포이다. 일부 구체예들에서, 원숭이 세포는 Vero 세포주에서 유래된다. 일부 구체예들에서, Vero 세포주는 WHO Vero 10-87 세포주이다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 지카 바이러스 개체군은 이종성이었다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 지카 바이러스 개체군은 지카 바이러스 임상 분리주를 포함하였다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스 임상 분리주는 계열 PRVABC59로부터 유래된다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 지카 바이러스 개체군은 세포 배양물에서 1회 이상 사전에 계대배양되었던 지카 바이러스를 포함하였다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 접종물은 인간 혈청을 포함하였다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 접종물은 하나 이상의 외인성 물질을 포함하였다. 일부 구체예들에서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주에는 하나 이상의 외인성 물질이 실질적으로 없다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 야생형 지카 바이러스와 비교하여 변형된다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 동종 유전자 개체군이다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 외피 단백질 E (Env)에 돌연변이를 포함하지 않는다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 돌연변이는 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1)에 존재한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 돌연변이는 Trp98Gly 돌연변이이다. 일부 구체예들에서, 하나 이상의 돌연변이는 지카 바이러스 외피 단백질 E (Env)에 존재하지 않는다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여, 유전적 안정성을 향상시킨다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여, 바이러스 복제를 향상시킨다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 아프리카 계통 바이러스 또는 아시아 계통 바이러스이다. 일부 구체예들에서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 아시아 계통 바이러스이다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 정제된 항원 백신 또는 면역원성 조성물, 소단위 백신 또는 면역원성 조성물, 비활성화된 전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물, 또는 약독화된 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 비활성화된 전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 화학적으로 비활성화되었다. 일부 구체예들에서, 플라크 정제된 지카 바이러스는 세제, 포르말린, 베타-프로피오락톤 (BPL), 2성분 에틸아민 (BEI), 아세틸 에틸렌이민, 메틸렌 블루 및 소랄렌 중 하나 이상을 이용하여 화학적으로 비활성화되었다. 일부 구체예들에서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 포르말린으로 화학적으로 비활성화된다.
임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 어쥬번트를 추가로 포함한다. 일부 구체예들에서, 어쥬번트는 알루미늄 염, 톨 유사 수용체 (TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, MLA 유도체, 사이토킨, 사포닌, 뮤라밀 디펩티드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 지질다당류 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀션, 비로솜, 카클리어트, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA), 및 불완전 프로인트 어쥬번트 (IFA)로 구성된 군에서 선택된다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 알루미늄 염이다. 일부 구체예들에서, 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 및 알하이드로겔 85에서 선택된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 항원의 적어도 75%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%가 어쥬번트에 흡착된다. 임의의 상기 구체예와 조합 될 수 있는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 0.1 μg 내지 약 25 μg의 정제된 비활성화 전체 바이러스, 가령, 본원에 기재된 서열 번호:1의 위치 98에서 트립토판의 글리신으로의 치환인 돌연변이를 가지는 지카 바이러스, 특히 2 μg, 5 μg 또는 10 μg, 또는 특히 10 μg의 정제된 비활성화 전체 바이러스 또는 약 0.1 μg Env 내지 약 100 μg Env를 함유한다. 이러한 특정 구체예들에서, 지카 바이러스는 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주이다. 일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 어쥬번트 처리되지 않는다.
상기 및 본원에 기재된 다양한 구체예의 특성 중 하나, 일부 또는 전부는 조합되어 본 발명의 다른 구체예를 형성할 수 있음을 이해하여야 한다. 본 발명의 이러한 그리고 다른 양상들은 당업계의 숙련된 기술자에게 명확할 것이다. 본 발명의 이러한 및 다른 구체예는 하기의 상세한 설명에 의해 보다 상세히 설명된다.
도 1은 모의 감염된 (위쪽) 또는 ZIKAV 균주 PRVABC59로 감염된 (아래쪽) Vero 세포 단층의 명시야 현미경검사 이미지를 도시한다.
도 2는 TCID50에 의해 결정될 때, Vero 세포 단층에서 ZIKAV PRVABC59 P1의 성장 동역학을 도시한다.
도 3은 지카 바이러스 PRVABC59 P5 클론 a-f의 효능 검정 검사 (TCID50)를 도시한다.
도 4는 Vero 세포 단층에 대한, 지카 바이러스 PRVABC59 P6 클론 a-f의 성장의 세포변성 효과 (CPE)를 묘사하는 명시야 현미경검사 이미지를 도시한다.
도 5는 지카 바이러스 PRVABC59 P6 클론 a-f의 효능 검정 검사 (TCID50)를 도시한다.
도 6은 지카 바이러스 계열 PRVABC59 P6e (서열 번호: 8) 및 PRVABC59 (서열 번호: 9)로부터 잔기 330 인근에서 지카 바이러스의 외피 당단백질 서열을 여러 다른 플라비바이러스 (WNV (서열 번호: 10); JEV (서열 번호: 11); SLEV (서열 번호: 12); YFV (서열 번호: 13); DENV 1 16007 (서열 번호: 14); DENV 2 16681 (서열 번호: 15); DENV 3 16562 (서열 번호: 16); 그리고 DENV 4 1036 (서열 번호: 17))와 비교하는 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 7은 지카 바이러스 계열 PRVABC59 P6e (서열 번호: 18) 및 PRVABC59 (서열 번호: 19)로부터 잔기 98 인근에서 지카 바이러스의 NS1 단백질 서열을 여러 다른 플라비바이러스 (WNV (서열 번호: 20); JEV (서열 번호: 21); SLEV (서열 번호: 22); YFV (서열 번호: 23); DENV 1 16007 (서열 번호: 24); DENV 2 16681 (서열 번호: 25); DENV 3 16562 (서열 번호: 26); 그리고 DENV 4 1036 (서열 번호: 27))와 비교하는 아미노산 서열 정렬을 도시한다.
도 8은 ZIKAV PRVABC59 P1 바이러스와 비교하여, ZIKAV PRVABC59 P6 바이러스 클론 a-f의 플라크 표현형을 도시한다.
도 9는 ZIKAV PRVABC59 P1 바이러스와 비교하여, ZIKAV PRVABC59 P6 바이러스 클론의 평균 플라크 크기를 도시한다.
도 10은 혈청 없는 성장 조건 하에 Vero 세포에서 ZIKAV PRVABC59 P6 클론 a-f의 성장 동역학을 도시한다.
도 11은 면역화 실험을 위한 PRVABC59 P6b와 P6e 조제된 의약품을 제조하기 위해 취해진 단계의 도식도를 도시한다.
도 12A는 ZIKAV PRVABC59 P6b와 P6e 클론으로부터 유래된 백신 제제로 CD-1 생쥐의 투약의 일정을 도시한다. PBS가 위약으로서 이용되었다.
도 12B는 ZIKAV PRVABC59 P6b와 P6e 클론으로부터 유래된 백신 제제를 이용하여, 도 12A에서 설명된 바와 같이 면역화된 CD-1 생쥐의 혈청 ZIKAV 중화 항체 역가를 도시한다. ZIKAV 중화 항체 역가는 리포터 바이러스 입자 (RVP) 중화 검정에 의해 결정되었다. 실선은 군의 기하 평균을 나타낸다. 검출 한계 (1.93 log10)는 파선에 의해 표시된다.
도 13A는 ZIKAV PRVABC59 P6b와 P6e 클론으로부터 유래된 백신 제제로 AG129 생쥐의 투약의 일정을 도시한다. PBS가 위약으로서 이용되었다.
도 13B는 ZIKAV PRVABC59 P6b와 P6e 클론으로부터 유래된 백신 제제를 이용하여, 도 13A에서 설명된 바와 같이 면역화된 AG129 생쥐의 혈청 ZIKAV 중화 항체 역가를 도시한다. 실선은 군의 기하 평균을 나타낸다. 검출 한계 (1.30 log10)는 파선에 의해 표시된다. 검출가능한 역가를 갖지 않는 동물 (<1.30)에는 0.5의 역가가 할당되었다.
도 14는 시작 체중의 백분율로서 표시된, 공격접종후 AG129 검사 군의 평균 체중을 도시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다.
도 15는 PFU/mL로서 보고된, 공격접종후 2 일에 개별 AG129 생쥐의 혈청 바이러스혈증을 도시한다. 실선은 군의 평균을 나타낸다. 검출 한계 (2.0 log10)는 파선에 의해 표시된다.
도 16은 공격접종후 AG129 검사 군의 생존 분석을 도시한다.
도 17은 예방접종된 및 공격접종된 AG129 생쥐로부터 혼합 혈청의 수동 전달 이후에, 공격접종전 혈청 순환 ZIKAV 중화 항체 (Nab) 역가를 도시한다.
도 18은 지카 바이러스로 공격접종된 수동 전달 생쥐 및 대조 생쥐의 평균 체중을 도시한다.
도 19는 PFU/mL로서 보고된, 공격접종후 3 일에 개별 AG129 생쥐의 혈청 바이러스혈증을 도시한다.
도 20은 지카 바이러스로 공격접종된 수동 전달 생쥐 및 대조 생쥐의 생존 분석을 도시한다.
도 21은 수동 전달 생쥐에서 관찰된, ZIKAV 중화 항체 역가 및 바이러스혈증 사이에 상관을 도시한다.
도 22는 카플란 마이어 생존 곡선을 이용하여, P6a와 P6e의 preMVS 스톡으로 공격접종 후 AG129 생쥐의 생존 분석을 도시한다.
도 23은 P6a와 P6e의 preMVS 스톡으로 공격접종 후, 발명의 시점에서 시작 체중의 백분율에서 표현된 바와 같은 평균 체중을 도시한다. 파선은 참조를 위한, 시작 체중의 100%를 나타낸다.
도 24는 PFU/mL로서 보고된, P6a와 P6e의 preMVS 스톡으로 공격접종후 3 일에 개별 AG129 생쥐의 혈청 바이러스혈증을 도시한다. 파선은 검정의 검출 한계를 나타낸다.
도 25는 실시예 4의 임상 연구 설계의 요약을 보여준다.
도 26은 실시예 4에서 대상의 PRNT를 사용하여 결정된 기하 평균 역가 (GMTs)를 도시한다.
도 27은 실시예 4에 기재된 연구의 29일차 (일차접종 투약 후 28일차) 및 57일차 (추가접종 투약 후 28일)에 PRNT를 사용하여 결정된 혈청전환을 달성한 대상의 백분율을 도시한다.
도 28은 실시예 4에 기재된 연구 29일차 (일차접종 투약 후 28일차)에 특정 기하 평균 역가 (PRNT를 사용하여 결정)를 달성한 대상의 백분율의 플롯을 도시한다.
도 29는 실시예 4에 기재된 연구 57일차 (일차접종 투약 후 56일차)에 특정 기하 평균 역가 (PRNT를 사용하여 결정)를 달성한 대상의 백분율의 플롯을 도시한다.
상세한 설명
일반적 기술
본원에서 설명되거나 또는 언급된 기술과 절차는 일반적으로, 당업자에 의해 전통적인 방법론, 가령, 예를 들면, Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, 외 eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995)), Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds. (1988), and Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)); 올리고뉴클레오티드 Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology (J. M. Walker, ed. Humana Press (1983)); Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Celis, ed., Academic Press (1998)) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, eds. Plenum Press (1998)); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons (1993-8)); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian 세포 (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987)); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 외, eds., Springer (1994)); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan 외, eds., Wiley (1991)); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, (1997)); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, (1988-1989)); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, (2000)); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1999)); and The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, (1995))에서 설명된 폭넓게 활용되는 방법론을 이용하여 충분히 이해되고 통상적으로 이용된다.
지카 바이러스
본 발명의 특정 양상들은, 제한없이, 정제된 바이러스, 비활성화 바이러스, 약독화 바이러스, 재조합 바이러스, 또는 소단위 백신을 위한 정제된 및/또는 재조합 바이러스 단백질을 포함하는 백신 및/또는 면역원성 조성물에 유용할 수 있는 하나 이상의 지카 바이러스 (예컨대, 지카 바이러스 클론 분리주, 본원에 기재된 방법으로 정제된 지카 바이러스, 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스 등)에 관한 것이다.
지카 바이러스 (ZIKV)는 1947년에 우간다의 지카 숲에서 센티넬 붉은 털 원숭이로부터 최초 단리된 모기 매개 플라비바이러스이다. 그 이후로, 아프리카와 아시아 둘 모두에서, 그리고 더욱 최근에는, 아메리카에 거주하는 인간으로부터 단리가 이루어졌다. ZIKV는 2가지 (아마도 3가지) 계통에서 발견된다: 아프리카 계통 (아마도 별개의 동아프리카와 서아프리카 계통) 및 아시아 계통. 따라서, 본 발명의 적합한 지카 바이러스의 실례는 제한 없이, 아프리카 및/또는 아시아 계통으로부터 바이러스를 포함한다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 아프리카 계통 바이러스이다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 아시아 계통 바이러스이다. 또한, 지카 바이러스의 아프리카 계 및 아시아계 계통에 속하는 다수의 균주가 이전에 확인된 바 있다. 예를 들면, 계열 Mr 766, ArD 41519, IbH 30656, P6-740, EC Yap, FSS13025, ArD 7117, ArD 9957, ArD 30101, ArD 30156, ArD 30332, HD 78788, ArD 127707, ArD 127710, ArD 127984, ArD 127988, ArD 127994, ArD 128000, ArD 132912, 132915, ArD 141170, ArD 142623, ArD 149917, ArD 149810, ArD 149938, ArD 157995, ArD 158084, ArD 165522, ArD 165531, ArA 1465, ArA 27101, ArA 27290, ArA 27106, ArA 27096, ArA 27407, ArA 27433, ArA 506/96, ArA 975-99, Ara 982-99, ArA 986-99, ArA 2718, ArB 1362, Nigeria68, Malaysia66, Kedougou84, Suriname, MR1429, PRVABC59, ECMN2007, DakAr41524, H/PF/2013, R103451, 103344, 8375, JMB-185, ZIKV/시, sapiens/Brazil/Natal/2015, SPH2015, ZIKV/Hu/Chiba/S36/2016 및/또는 Cuba2017을 포함하는, 당업계에서 공지된 지카 바이러스의 하나 이상의 적합한 계열이 본 발명에서 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 균주 PRVABC59가 본 발명에서 이용된다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스 게놈 서열의 실례는 아래에 서열 번호: 2로 제시된다:
1 gttgttgatc tgtgtgaatc agactgcgac agttcgagtt tgaagcgaaa gctagcaaca
61 gtatcaacag gttttatttt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa
121 aaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtgag
181 cccctttggg ggcttgaaga ggctgccagc cggacttctg ctgggtcatg ggcccatcag
241 gatggtcttg gcgattctag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct
301 catcaataga tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaacaataa agaagttcaa
361 gaaagatctg gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaaga agagacgagg
421 cgcagatact agtgtcggaa ttgttggcct cctgctgacc acagctatgg cagcggaggt
481 cactagacgt gggagtgcat actatatgta cttggacaga aacgatgctg gggaggccat
541 atcttttcca accacattgg ggatgaataa gtgttatata cagatcatgg atcttggaca
601 catgtgtgat gccaccatga gctatgaatg ccctatgctg gatgaggggg tggaaccaga
661 tgacgtcgat tgttggtgca acacgacgtc aacttgggtt gtgtacggaa cctgccatca
721 caaaaaaggt gaagcacgga gatctagaag agctgtgacg ctcccctccc attccaccag
781 gaagctgcaa acgcggtcgc aaacctggtt ggaatcaaga gaatacacaa agcacttgat
841 tagagtcgaa aattggatat tcaggaaccc tggcttcgcg ttagcagcag ctgccatcgc
901 ttggcttttg ggaagctcaa cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat
961 tgccccggca tacagcatca ggtgcatagg agtcagcaat agggactttg tggaaggtat
1021 gtcaggtggg acttgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggttgtgtca ccgtaatggc
1081 acaggacaaa ccgactgtcg acatagagct ggttacaaca acagtcagca acatggcgga
1141 ggtaagatcc tactgctatg aggcatcaat atcagacatg gcttctgaca gccgctgccc
1201 aacacaaggt gaagcctacc ttgacaagca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac
1261 gttagtggac agaggctggg gaaatggatg tggacttttt ggcaaaggga gcctggtgac
1321 atgcgctaag tttgcatgct ccaagaaaat gaccgggaag agcatccagc cagagaatct
1381 ggagtaccgg ataatgctgt cagttcatgg ctcccagcac agtgggatga tcgttaatga
1441 cacaggacat gaaactgatg agaatagagc gaaagttgag ataacgccca attcaccgag
1501 agccgaagcc accctggggg gttttggaag cctaggactt gattgtgaac cgaggacagg
1561 ccttgacttt tcagatttgt attacttgac tatgaataac aagcactggt tggttcacaa
1621 ggagtggttc cacgacattc cattaccttg gcacgctggg gcagacaccg gaactccaca
1681 ctggaacaac aaagaagcac tggtagagtt caaggacgca catgccaaaa ggcaaactgt
1741 cgtggttcta gggagtcaag aaggagcagt tcacacggcc cttgctggag ctctggaggc
1801 tgagatggat ggtgcaaagg gaaggctgtc ctctggccac ttgaaatgtc gcctgaaaat
1861 ggataaactt agattgaagg gcgtgtcata ctccttgtgt actgcagcgt tcacattcac
1921 caagatcccg gctgaaacac tgcacgggac agtcacagtg gaggtacagt acgcagggac
1981 agatggacct tgcaaggttc cagctcagat ggcggtggac atgcaaactc tgaccccagt
2041 tgggaggttg ataaccgcta accccgtaat cactgaaagc actgagaact ctaagatgat
2101 gctggaactt gatccaccat ttggggactc ttacattgtc ataggagtcg gggagaagaa
2161 gatcacccac cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcatttg aagccactgt
2221 gagaggtgcc aagagaatgg cagtcttggg agacacagcc tgggactttg gatcagttgg
2281 aggcgctctc aactcattgg gcaagggcat ccatcaaatt tttggagcag ctttcaaatc
2341 attgtttgga ggaatgtcct ggttctcaca aattctcatt ggaacgttgc tgatgtggtt
2401 gggtctgaac acaaagaatg gatctatttc ccttatgtgc ttggccttag ggggagtgtt
2461 gatcttctta tccacagccg tctctgctga tgtggggtgc tcggtggact tctcaaagaa
2521 ggagacgaga tgcggtacag gggtgttcgt ctataacgac gttgaagcct ggagggacag
2581 gtacaagtac catcctgact ccccccgtag attggcagca gcagtcaagc aagcctggga
2641 agatggtatc tgcgggatct cctctgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggagatcagt
2701 agaaggggag ctcaacgcaa tcctggaaga gaatggagtt caactgacgg tcgttgtggg
2761 atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acagagattg cccgtgcctg tgaacgagct
2821 gccccacggc tggaaggctt gggggaaatc gtatttcgtc agagcagcaa agacaaataa
2881 cagctttgtc gtggatggtg acacactgaa ggaatgccca ctcaaacata gagcatggaa
2941 cagctttctt gtggaggatc atgggttcgg ggtatttcac actagtgtct ggctcaaggt
3001 tagagaagat tattcattag agtgtgatcc agccgttatt ggaacagctg ttaagggaaa
3061 ggaggctgta cacagtgatc taggctactg gattgagagt gagaagaatg acacatggag
3121 gctgaagagg gcccatctga tcgagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt cccacacatt
3181 gtggacagat ggaatagaag agagtgatct gatcataccc aagtctttag ctgggccact
3241 cagccatcac aataccagag agggctacag gacccaaatg aaagggccat ggcacagtga
3301 agagcttgaa attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaacatg
3361 tggaacaaga ggaccatctc tgagatcaac cactgcaagc ggaagggtga tcgaggaatg
3421 gtgctgcagg gagtgcacaa tgcccccact gtcgttccgg gctaaagatg gctgttggta
3481 tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agaaagcaac ttagtaaggt caatggtgac
3541 tgcaggatca actgatcaca tggaccactt ctcccttgga gtgcttgtga tcctgctcat
3601 ggtgcaggaa gggctgaaga agagaatgac cacaaagatc atcataagca catcaatggc
3661 agtgctggta gctatgatcc tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcta agcttgcaat
3721 tttgatgggt gccaccttcg cggaaatgaa cactggagga gatgtagctc atctggcgct
3781 gatagcggca ttcaaagtca gaccagcgtt gctggtatct ttcatcttca gagctaattg
3841 gacaccccgt gaaagcatgc tgctggcctt ggcctcgtgt cttttgcaaa ctgcgatctc
3901 cgccttggaa ggcgacctga tggttctcat caatggtttt gctttggcct ggttggcaat
3961 acgagcgatg gttgttccac gcactgataa catcaccttg gcaatcctgg ctgctctgac
4021 accactggcc cggggcacac tgcttgtggc gtggagagca ggccttgcta cttgcggggg
4081 gtttatgctc ctctctctga agggaaaagg cagtgtgaag aagaacttac catttgtcat
4141 ggccctggga ctaaccgctg tgaggctggt cgaccccatc aacgtggtgg gactgctgtt
4201 gctcacaagg agtgggaagc ggagctggcc ccctagcgaa gtactcacag ctgttggcct
4261 gatatgcgca ttggctggag ggttcgccaa ggcagatata gagatggctg ggcccatggc
4321 cgcggtcggt ctgctaattg tcagttacgt ggtctcagga aagagtgtgg acatgtacat
4381 tgaaagagca ggtgacatca catgggaaaa agatgcggaa gtcactggaa acagtccccg
4441 gctcgatgtg gcgctagatg agagtggtga tttctccctg gtggaggatg acggtccccc
4501 catgagagag atcatactca aggtggtcct gatgaccatc tgtggcatga acccaatagc
4561 catacccttt gcagctggag cgtggtacgt atacgtgaag actggaaaaa ggagtggtgc
4621 tctatgggat gtgcctgctc ccaaggaagt aaaaaagggg gagaccacag atggagtgta
4681 cagagtaatg actcgtagac tgctaggttc aacacaagtt ggagtgggag ttatgcaaga
4741 gggggtcttt cacactatgt ggcacgtcac aaaaggatcc gcgctgagaa gcggtgaagg
4801 gagacttgat ccatactggg gagatgtcaa gcaggatctg gtgtcatact gtggtccatg
4861 gaagctagat gccgcctggg atgggcacag cgaggtgcag ctcttggccg tgccccccgg
4921 agagagagcg aggaacatcc agactctgcc cggaatattt aagacaaagg atggggacat
4981 tggagcggtt gcgctggatt acccagcagg aacttcagga tctccaatcc tagacaagtg
5041 tgggagagtg ataggacttt atggcaatgg ggtcgtgatc aaaaacggga gttatgttag
5101 tgccatcacc caagggagga gggaggaaga gactcctgtt gagtgcttcg agccctcgat
5161 gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttaga cttgcatcct ggagctggga aaaccaggag
5221 agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaacaaga ctccgtactg tgatcttagc
5281 tccaaccagg gttgtcgctg ctgaaatgga ggaggccctt agagggcttc cagtgcgtta
5341 tatgacaaca gcagtcaatg tcacccactc tggaacagaa atcgtcgact taatgtgcca
5401 tgccaccttc acttcacgtc tactacagcc aatcagagtc cccaactata atctgtatat
5461 tatggatgag gcccacttca cagatccctc aagtatagca gcaagaggat acatttcaac
5521 aagggttgag atgggcgagg cggctgccat cttcatgacc gccacgccac caggaacccg
5581 tgacgcattt ccggactcca actcaccaat tatggacacc gaagtggaag tcccagagag
5641 agcctggagc tcaggctttg attgggtgac ggatcattct ggaaaaacag tttggtttgt
5701 tccaagcgtg aggaacggca atgagatcgc agcttgtctg acaaaggctg gaaaacgggt
5761 catacagctc agcagaaaga cttttgagac agagttccag aaaacaaaac atcaagagtg
5821 ggactttgtc gtgacaactg acatttcaga gatgggcgcc aactttaaag ctgaccgtgt
5881 catagattcc aggagatgcc taaagccggt catacttgat ggcgagagag tcattctggc
5941 tggacccatg cctgtcacac atgccagcgc tgcccagagg agggggcgca taggcaggaa
6001 tcccaacaaa cctggagatg agtatctgta tggaggtggg tgcgcagaga ctgacgaaga
6061 ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct ccttgacaat atttacctcc aagatggcct
6121 catagcctcg ctctatcgac ctgaggccga caaagtagca gccattgagg gagagttcaa
6181 gcttaggacg gagcaaagga agacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atcttcctgt
6241 ttggctggcc tatcaggttg catctgccgg aataacctac acagatagaa gatggtgctt
6301 tgatggcacg accaacaaca ccataatgga agacagtgtg ccggcagagg tgtggaccag
6361 acacggagag aaaagagtgc tcaaaccgag gtggatggac gccagagttt gttcagatca
6421 tgcggccctg aagtcattca aggagtttgc cgctgggaaa agaggagcgg cttttggagt
6481 gatggaagcc ctgggaacac tgccaggaca catgacagag agattccagg aagccattga
6541 caacctcgct gtgctcatgc gggcagagac tggaagcagg ccttacaaag ccgcggcggc
6601 ccaattgccg gagaccctag agaccataat gcttttgggg ttgctgggaa cagtctcgct
6661 gggaatcttc ttcgtcttga tgaggaacaa gggcataggg aagatgggct ttggaatggt
6721 gactcttggg gccagcgcat ggctcatgtg gctctcggaa attgagccag ccagaattgc
6781 atgtgtcctc attgttgtgt tcctattgct ggtggtgctc atacctgagc cagaaaagca
6841 aagatctccc caggacaacc aaatggcaat catcatcatg gtagcagtag gtcttctggg
6901 cttgattacc gccaatgaac tcggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatct
6961 aatgggaagg agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgcggcc
7021 agcctcagct tgggccatct atgctgcctt gacaactttc attaccccag ccgtccaaca
7081 tgcagtgacc acctcataca acaactactc cttaatggcg atggccacgc aagctggagt
7141 gttgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct
7201 aatgataggt tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct
7261 cgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca
7321 gaagagaacg gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga
7381 cattgacaca atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat
7441 agcagtagcc gtctccagcg ccatactgtc gcggaccgcc tgggggtggg gggaggctgg
7501 ggctctgatc acagccgcaa cttccacttt gtgggaaggc tctccgaaca agtactggaa
7561 ctcctctaca gccacttcac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagcttc
7621 tctaatctac acagtaacaa gaaacgctgg cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagg
7681 agagaccctg ggagagaaat ggaaggcccg cttgaaccag atgtcggccc tggagttcta
7741 ctcctacaaa aagtcaggca tcaccgaggt gtgcagagaa gaggcccgcc gcgccctcaa
7801 ggacggtgtg gcaacgggag gccatgctgt gtcccgagga agtgcaaagc tgagatggtt
7861 ggtggagcgg ggatacctgc agccctatgg aaaggtcatt gatcttggat gtggcagagg
7921 gggctggagt tactacgtcg ccaccatccg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa
7981 aggaggccct ggtcatgaag aacccgtgtt ggtgcaaagc tatgggtgga acatagtccg
8041 tcttaagagt ggggtggacg tctttcatat ggcggctgag ccgtgtgaca cgttgctgtg
8101 tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtcct
8161 ctccatggtg ggggattggc ttgaaaaaag accaggagcc ttttgtataa aagtgttgtg
8221 cccatacacc agcactatga tggaaaccct ggagcgactg cagcgtaggt atgggggagg
8281 actggtcaga gtgccactct cccgcaactc tacacatgag atgtactggg tctctggagc
8341 gaaaagcaac accataaaaa gtgtgtccac cacgagccag ctcctcttgg ggcgcatgga
8401 cgggcctagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat ctcggctctg gcacgcgggc
8461 tgtggtaagc tgcgctgaag ctcccaacat gaagatcatt ggtaaccgca ttgaaaggat
8521 ccgcagtgag cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc
8581 ttaccatgga agctatgagg cccccacaca agggtcagcg tcctctctaa taaacggggt
8641 tgtcaggctc ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac
8701 cgacaccaca ccgtatggtc agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgcc
8761 agacccccaa gaaggcactc gtcaggttat gagcatggtc tcttcctggt tgtggaaaga
8821 gctaggcaaa cacaaacggc cacgagtctg caccaaagaa gagttcatca acaaggttcg
8881 tagcaatgca gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga
8941 agctgtgaac gatccaaggt tctgggctct agtggacaag gaaagagagc accacctgag
9001 aggagagtgc cagagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga
9061 atttggaaag gccaagggca gccgcgccat ctggtatatg tggctagggg ctagatttct
9121 agagttcgaa gcccttggat tcttgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg
9181 aggtggtgtt gaagggctgg gattacaaag actcggatat gtcctagaag agatgagtcg
9241 tataccagga ggaaggatgt atgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagcag
9301 gtttgatctg gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg gagaaagggc acagggcctt
9361 ggcattggcc ataatcaagt acacatacca aaacaaagtg gtaaaggtcc ttagaccagc
9421 tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttcgagacaa gaccaaaggg ggagcggaca
9481 agttgtcact tacgctctta acacatttac caacctagtg gtgcaactca ttcggaatat
9541 ggaggctgag gaagttctag agatgcaaga cttgtggctg ctgcggaggt cagagaaagt
9601 gaccaactgg ttgcagagca acggatggga taggctcaaa cgaatggcag tcagtggaga
9661 tgattgcgtt gtgaagccaa ttgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga
9721 tatgggaaaa gttaggaagg acacacaaga gtggaaaccc tcaactggat gggacaactg
9781 ggaagaagtt ccgttttgct cccaccactt caacaagctc catctcaagg acgggaggtc
9841 cattgtggtt ccctgccgcc accaagatga actgattggc cgggcccgcg tctctccagg
9901 ggcgggatgg agcatccggg agactgcttg cctagcaaaa tcatatgcgc aaatgtggca
9961 gctcctttat ttccacagaa gggacctccg actgatggcc aatgccattt gttcatctgt
10021 gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac tacctggtca atccatggaa agggagaatg
10081 gatgaccact gaagacatgc ttgtggtgtg gaacagagtg tggattgagg agaacgacca
10141 catggaagac aagaccccag ttacgaaatg gacagacatt ccctatttgg gaaaaaggga
10201 agacttgtgg tgtggatctc tcatagggca cagaccgcgc accacctggg ctgagaacat
10261 taaaaacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta
10321 cctatccacc caagttcgct acttgggtga agaagggtct acacctggag tgctgtaagc
10381 accaatctta atgttgtcag gcctgctagt cagccacagc ttggggaaag ctgtgcagcc
10441 tgtgaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagcctatag tcaggccgag aacgccatgg
10501 cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac
10561 gcgcttggag gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg
10621 gcctgaactg gagatcagct gtggatctcc agaagaggga ctagtggtta gagga
일부 구체예에서, 지카 바이러스는 GenBank 수탁 번호 KU501215.1의 게놈 서열을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 균주 PRVABC59로부터 유래된다. 일부 구체예에서 GenBank 수탁 번호 KU501215.1의 게놈 서열은 서열 번호: 2의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 서열 번호: 2의 서열과 적어도 70%, 적어도 71%, 적어도 72%, 적어도 73%, 적어도 74%, 적어도 75%, 적어도 76%, 적어도 77%, 적어도 78%, 적어도 79%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 게놈 서열을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스는 서열 번호: 2의 서열에 의해 인코딩된 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 서열 번호: 2의 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 발명의 지카 바이러스는 본원에서 개시된 임의의 백신 및/또는 면역원성 조성물에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 지카 바이러스는 치료가 필요한 개체에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는데 유용한 및/또는 치료가 필요한 개체에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는데 유용한 하나 이상의 항원을 제공하는데 이용될 수 있다.
바이러스 항원
일부 구체예들에서, 본 발명은 제한없이, 정제된 바이러스, 비활성화 바이러스, 약독화 바이러스, 재조합 바이러스, 또는 소단위 백신을 위한 정제된 및/또는 재조합 바이러스 단백질을 포함하는 백신 및/또는 면역원성 조성물에 유용한 본원에 기재된 임의의 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 백신 및/또는 면역원성 조성물은 비활성화 전체 바이러스를 포함한다.
본 발명의 항원은 면역 반응을 유발할 수있는 임의의 물질 일 수있다. 적합한 항원의 예는 전체 바이러스, 약독화 바이러스, 비활성화 바이러스, 단백질, 폴리펩티드 (단백질 내의 활성 단백질 및 개별 폴리펩티드 에피토프 포함), 당폴리펩티드, 리포폴리펩티드, 다당류 및 다른 분자들의 펩티드 및 비-펩티드 모방체, 소분자, 지질, 당지질 및 탄수화물을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 항원들은 세포 배양물의 하나 이상의 세포들로부터 생성된 (예컨대, 플라크 정제) 임의의 지카 바이러스 (예컨대, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 곤충 세포 (예를 들면, 모기 세포, 예컨대 CCL-125 세포, Aag-2 세포, RML-12 세포, C6/36 세포, C7-10 세포, AP-61 세포, A.t. GRIP-1 세포, A.t. GRIP-2 세포, A.t. GRIP-3 세포, UM-AVE1 세포, Mos.55 세포, Sua1B 세포, 4a-3B 세포, Mos.42 세포, MSQ43 세포, LSB-AA695BB 세포, NIID-CTR 세포, TRA-171, 세포, 그리고 모기 종, 예컨대 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus), 아에데스 슈도스쿠텔라리스 (Aedes pseudoscutellaris), 아에데스 트리세리아투스 (Aedes triseriatus), 아에데스 벡산스 (Aedes vexans), 아노펠레스 감비아에 (Anopheles gambiae), 아노펠레스 스테펜시 (Anopheles stephensi), 아노펠레스 알비무스 (Anopheles albimus), 쿨렉스 퀸쿠에파시아투스 (Culex quinquefasciatus), 쿨렉스 테일레리 (Culex theileri), 쿨렉스 트리타에니오힌쿠스 (Culex tritaeniorhynchus), 쿨렉스 비타에니오린쿠스 (Culex bitaeniorhynchus) 및/또는 톡소린치테스 암보이넨시스 (Toxorhynchites amboinensis))로부터 추가 세포 또는 세포주, 그리고 포유동물 세포 (예를 들면, VERO 세포 (원숭이 신장으로부터), LLC-MK2 세포 (원숭이 신장으로부터), MDBK 세포, MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 세포, MDCK 33016 (WO97/37001에서 설명된 바와 같은 수탁 번호 DSM ACC 2219) 세포, BHK21-F 세포, HKCC 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)를 비롯하여, 지카 바이러스를 생산하기 위한 당업계에서 공지된 임의의 적합한 세포가 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항원은 비-인간 세포로부터 생성된 (예컨대, 플라크 정제를 통해) 지카 바이러스 (예컨대, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항원은 곤충 세포로부터 생성된 (예컨대, 플라크 정제를 통해) 지카 바이러스 (예컨대, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항원은 모기 세포로부터 생성된 (예컨대, 플라크 정제를 통해) 지카 바이러스 (예컨대, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항원은 포유동물 세포로부터 생성된 (예컨대, 플라크 정제를 통해) 지카 바이러스 (예컨대, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항원은 VERO 세포로부터 생성된 (예컨대, 플라크 정제를 통해) 지카 바이러스 (예컨대, 지카 바이러스 클론 분리주)로부터 유래한다. 플라크 정제를 수행하여 바이러스를 정제하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어,하기 실시예 1 참조).
본 발명의 항원은 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함할 수 있다. 적응 돌연변이는 특정 세포주에서의 성장에 바이러스를 적응시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 세포는 바이러스, 바이러스로부터 전사된 RNA (예컨대, 감염성 바이러스, 또는 감염성 클론), 및/또는 전체 바이러스로부터 정제된 RNA로 형질감염 또는 전기천공될 수 있으며, 그리하여 바이러스 및/또는 바이러스 RNA가 복제하고 그 핵산이 돌연변이된다. 핵산 돌연변이는 점 돌연변이, 삽입 돌연변이, 또는 결실 돌연변이일 수 있다. 핵산 돌연변이는 비-인간 세포에서 바이러스의 성장을 촉진시키는 바이러스 단백질 내에서 아미노산 변화를 야기 할 수 있다. 적응 돌연변이는 플라크 크기의 변화, 성장 동역학, 온도 민감성, 약물 내성, 발병력 및 세포 배양에서의 바이러스 수율을 포함하여 바이러스의 표현형 변화를 촉진 할 수 있다. 이러한 적응 돌연변이는 세포주에서 배양 된 바이러스의 속도, 수율 및 일관성을 증가시킴으로써 백신 제조에 유용 할 수 있다. 적응 돌연변이는 면역원성 에피토프의 구조를 변경함으로써 바이러스 항원의 면역원성을 변화 (예컨대, 향상 또는 감소)시킬 수 있다. 이외에도, 적응 돌연변이는 또한 다수회 (예컨대, 5회 이상, 6회 이상, 7회 이상, 8회 이상, 9회 이상, 10회 이상, 11회 이상, 12회 이상, 13회 이상, 14회 이상, 15회 이상, 16회 이상, 17회 이상, 18회 이상, 19회 이상, 20회 이상, 또는 그 이상) 계대배양을 통해 바이러스의 유전자 안정성을 증가시키고 및/또는 바이러스에서 바람직하지 않은 돌연변이의 발달을 감소 또는 다른 방식으로 억제할 수 있다.
따라서, 특정 구체예들에서, 본 발명의 항원들은 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함한다. 특정 구체예들에서, 적응 돌연변이는 비-인간 세포에 대한 바이러스 항원의 돌연변이이다. 일부 구체 예에서, 비-인간 세포는 포유동물 세포이다. 제한 없이, VERO 세포 (원숭이 신장의 것), LLC-MK2 세포 (원숭이 신장의 것), MDBK 세포, MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 세포, MDCK 33016 (WO97/37001에 기재된 수탁 번호 DSM ACC 2219) 세포, BHK21-F 세포, HKCC 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)를 비롯한 당업계에 공지된 임의의 적합한 포유동물 세포가 사용될 수 있다. 일부 구체 예에서, 비-인간 세포는 원숭이 세포이다. 일부 구체예들에서, 원숭이 세포는 Vero 세포주로부터 유래된다. 제한 없이, WHO Vero 10-87, ATCC CCL-81, Vero 76 (ATCC 수탁 번호 CRL-1587), 또는 Vero C1008 (ATCC 수탁 번호 CRL-1586)을 비롯한, 당업계에 공지된 임의의 적합한 Vero 세포가 사용될 수 있다. 일부 구체예들에서, Vero 세포주는 WHO Vero 10-87이다.
지카 바이러스는 구조적 및 비구조적 폴리펩티드 둘 모두를 인코딩하는 양성 센스, 단일 가닥 RNA 게놈을 보유한다. 상기 게놈은 또한, 바이러스 복제에서 일정한 역할을 수행하는 5'-와 3'- 말단 영역 둘 모두에서 비코딩 서열을 함유한다. 이들 바이러스에 의해 인코딩된 구조적 폴리펩티드는 제한 없이, 캡시드 (C), 전구체 막 (prM) 및 외피 (E)를 포함한다. 이들 바이러스에 의해 인코딩된 비구조적 (NS) 폴리펩티드는 제한 없이, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5를 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 항원은 하나 이상 (예컨대, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 또는 10 모두)의 바이러스 항원/폴리펩티드 내부에, 제한 없이, C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, 및 NS5를 비롯하여 1 이상 (예컨대, 1 이상, 예컨대, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상 등)의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항원은 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1)에서 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항원들은 하나 이상 (예컨대, 1 이상, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상 등)의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유할 수 있는 전체, 비활성화된 바이러스를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항원들은 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1)에서 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유할 수 있는 전체, 비활성화된 바이러스를 포함한다.
일부 구체예들에서, 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 NS1 폴리펩티드 내부에 존재한다. 예시적인 지카 바이러스 균주로부터의 야생형, 비-세포 적응된 NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 아래와 같이 제시된다:
DVGCSVDFSKKETRCGTGVFVYNDVEAWRDRYKYHPDSPRRLAAAVKQAWEDGICGISSVSRMENIMWRSVEGELNAILEENGVQLTVVVGSVKNPMWRGPQRLPVPVNELPHGWKAWGKSYFVRAAKTNNSFVVDGDTLKECPLKHRAWNSFLVEDHGFGVFHTSVWLKVREDYSLECDPAVIGTAVKGKEAVHSDLGYWIESEKNDTWRLKRAHLIEMKTCEWPKSHTLWTDGIEESDLIIPKSLAGPLSHHNTREGYRTQMKGPWHSEELEIRFEECPGTKVHVEETCGTRGPSLRSTTASGRVIEEWCCRECTMPPLSFRAKDGCWYGMEIRPRKEPESNLVRSMVT (서열 번호: 1).
일부 구체예에서, NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호: 1의 서열과 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구체예에서, NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 GenBank 수탁 번호 KU501215.1 (서열 번호: 2)의 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열로부터 유래될 수 있다. 일부 구체예에서, NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 GenBank 수탁 번호 KU501215.1의 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열의 아미노산 위치 795 내지 1145일 수 있다. 일부 구체예에서, NS1 폴리펩티드의 아미노산 서열은 지카 바이러스 균주 PRVABC59로부터 유래될 수 있다.
“서열 동일성”, “% 서열 동일성”, “% 동일성”, “% 동일한” 또는 “서열 정렬”은 두 번째 아미노산 서열에 대한 첫 번째 아미노산 서열의 비교, 또는 두 번째 핵산 서열에 대한 첫 번째 핵산 서열의 비교를 의미하고, 그리고 상기 비교에 근거한 백분율로서 계산된다. 이러한 계산의 결과는 “동일한 퍼센트” 또는 “퍼센트 ID”로 기재될 수 있다.
일반적으로, 서열 정렬은 2가지 상이한 접근법 중에서 한 가지에 의해 서열 동일성을 계산하는데 이용될 수 있다. 첫 번째 접근법에서, 단일 위치에서 부정합 및 단일 위치에서 갭 둘 모두 최종 서열 동일성 계산에서 비동일한 위치로서 계수된다. 두 번째 접근법에서, 단일 위치에서 부정합은 최종 서열 동일성 계산에서 비동일한 위치로서 계수된다; 하지만, 단일 위치에서 갭은 최종 서열 동일성 계산에서 비동일한 위치로서 계수되지 않는다 (무시된다). 다시 말하면, 두 번째 접근법에서 갭은 최종 서열 동일성 계산에서 무시된다. 이들 2가지 접근법 사이에 차이점, 다시 말하면, 단일 위치에서 갭을 비동일한 위치로서 계수하는 것 대 갭을 무시하는 것은 두 서열 사이에 서열 동일성 값에서 가변성을 야기할 수 있다.
서열 동일성은 정렬을 산출하고, 그리고 단일 위치에서 부정합 및 단일 위치에서 갭을 둘 모두를 최종 서열 동일성 계산에서 비동일한 위치로서 계수하는, 동일성을 계산하는 프로그램에 의해 결정된다. 예를 들면, 프로그램 Needle (EMBOS)은 Needleman 및 Wunsch의 알고리즘 (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)을 실행하였고, 그리고 먼저, 첫 번째 서열 및 두 번째 서열 사이에 정렬을 산출하고, 이후 정렬의 길이에 걸쳐 동일한 위치의 숫자를 계수하고, 이후 동일한 잔기의 숫자를 정렬의 길이로 나누고, 이후 이러한 숫자에 100을 곱하여 % 서열 동일성 [% 서열 동일성 = (동일한 잔기의 #/ 정렬의 길이) x 100)]을 산출함으로써 디폴트 세팅마다 서열 동일성을 계산한다.
서열 동일성은 전장에 걸쳐 양쪽 서열을 보여주고, 따라서 첫 번째 서열 및 두 번째 서열을 그들의 전장에서 보여주는 쌍별 정렬로부터 계산될 수 있다 (“전역 서열 동일성”). 예를 들면, 프로그램 Needle (EMBOSS)이 이런 정렬을 산출한다; % 서열 동일성 = (동일한 잔기의 # / 정렬의 길이) x 100)].
서열 동일성은 단지 첫 번째 서열 또는 두 번째 서열의 국부 영역만을 보여주는 쌍별 정렬로부터 계산될 수 있다 (“국부 동일성”). 예를 들면, 프로그램 Blast (NCBI)가 이런 정렬을 산출한다; % 서열 동일성 = (동일한 잔기의 # / 정렬의 길이) x 100)].
서열 정렬은 바람직하게는, Needleman 및 Wunsch의 알고리즘 (J. Mol. Biol. (1979) 48, p. 443-453)을 이용함으로써 산출된다. 바람직하게는, 프로그램 “NEEDLE” (The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS))은 프로그램 디폴트 파라미터 (갭 개방=10.0, 갭 연장=0.5, 그리고 단백질의 경우에 매트릭스=EBLOSUM62 및 뉴클레오티드의 경우에 매트릭스=EDNAFULL)에서 이용된다. 이후, 전장에 걸쳐 양쪽 서열을 보여주고, 따라서 첫 번째 서열 및 두 번째 서열을 그들의 전장에서 보여주는 정렬로부터 서열 동일성이 계산될 수 있다 (“전역 서열 동일성”). 예를 들면: % 서열 동일성 = (동일한 잔기의 # / 정렬의 길이) x 100)].
일부 구체예들에서, 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 NS1 폴리펩티드 내부의 하나 이상의 아미노산 위치에서 발생한다. 일부 구체예에서, 돌연변이는 쌍별 정렬 알고리즘을 이용하여 서열 번호: 1에 맞춰 정렬될 때, 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생한다. 일부 구체예에서, 위치 98에서 돌연변이는 트립토판에서 글리신으로 치환이다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함한다. 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치는 쌍별 정렬 알고리즘을 이용하여, NS-1 단백질의 아미노산 서열을 서열 번호: 1에 맞춰 정렬함으로써 결정될 수 있다. 서열 번호: 1의 위치 98에서 트립토판 잔기에 상응하는, 지카 바이러스 이외의 바이러스에서 아미노산 잔기가 본 출원의 도 7에서 도시되는데, 여기서 이들 잔기는 상자로 표시된다. 일부 구체예에서, 위치 98에서 돌연변이는 트립토판에서 글리신으로의 치환이다. 일부 구체예에서, 위치 98에서 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서 트립토판에서 글리신으로 치환이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 항원은 NS1 단백질 내에 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유하고, 하나 이상의 C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 바이러스 단백질 내에 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 적응 돌연변이)를 함유한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항원은 NS1 단백질 내에 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유하고, 하나 이상의 C, prM, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5 바이러스 단백질 내에 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이)를 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항원은 NS1 단백질 내에 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유하고 외피 단백질 E 내에 하나 이상의 돌연변이 (예컨대, 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이)를 함유하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항원은 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1)에 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유하는 전체 비활성화된 바이러스를 포함하고, 지카 바이러스 외피 단백질 E (Env)에 돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항원은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하고, 외피 단백질 E 내부에 임의의 돌연변이를 함유하지 않는다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 항원은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 함유하는 전체, 비활성화된 바이러스를 포함하고 지카 바이러스 외피 단백질 E (Env)에서 돌연변이를 포함하지 않는다. 일부 구체예에서, 전체, 비활성화된 바이러스는 지카 바이러스 비구조 단백질 1 (NS1)에서 하나 이상의 돌연변이를 함유하고, 그리고 외피 단백질을 인코딩하는 서열은 서열 번호: 2에서 상응하는 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 함유하고, 그리고 외피 단백질을 인코딩하는 서열은 서열 번호: 2에서 상응하는 서열과 동일하다. 일부 구체예에서, 전체, 비활성화된 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 함유하고, 그리고 외피 단백질을 인코딩하는 서열은 서열 번호: 2에서 상응하는 서열과 동일하다.
일부 구체예들서, 지카 바이러스와 같은 본 발명의 항원은 하나 이상의 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여 유전자 안정성을 향상시키는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유한다. 일부 구체예들서, 지카 바이러스와 같은 본 발명의 항원은 하나 이상의 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여 바이러스 복제를 향상시키는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항원, 가령, 지카 바이러스는 예컨대, 지카 바이러스의 외피 단백질 E (Env) 내에서 바람직하지 않은 돌연변이의 발생을 감소 또는 다른 방식으로 억제하는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 함유한다.
본 발명의 상기 구체예에서, 예시적인 쌍별 정렬 알고리즘은 디폴트 파라미터 (예를 들면, EBLOSUM62 채점 매트릭스를 이용하여, 갭 개방 페널티=10.0 및 갭 연장 페널티=0.5에서)를 이용한 Needleman-Wunsch 전역 정렬 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 EMBOSS 패키지 내에 니들 도구에서 편의하게 실행된다.
일부 구체예들에서, 지카 바이러스로부터의 본 발명의 항원은 본 발명의 임의의 백신 및 면역원성 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 항원은 치료가 필요한 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 대상에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는데 유용할 수 있다.
백신 및 면역원성 조성물의 생산
본 발명의 다른 양상은 하나 이상의 지카 바이러스로부터 본 발명의 하나 이상의 항원을 함유하는 지카 바이러스 백신 및 면역원성 조성물에 관한 것이다. 이런 백신 및 면역원성 조성물은 예를 들면, 치료가 필요한 개체에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 제한 없이, 정제된 바이러스, 비활성화 바이러스, 약독화 바이러스, 재조합 바이러스, 또는 소단위 백신을 위한 정제된 및/또는 재조합 바이러스 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 정제된 항원 백신 또는 면역원성 조성물, 소단위 백신 또는 면역원성 조성물, 비활성화된 전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물, 또는 정제된 비활성화 전체 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물 또는 약독화된 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 생산은 지카 바이러스의 성장을 포함하고, 항원은 성장한 바이러스로부터 제조된다. 세포 배양 동안 성장은 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물을 제조하기 위한 방법이다. 바이러스 성장을 위한 세포는 현탁 상태에서 또는 유착성 조건에서 배양될 수 있다.
본 발명의 하나 이상의 바이러스의 성장에 적합한 세포주는 바람직하게는 포유동물 기원이고, 그리고 곤충 세포 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은 모기 세포, VERO 세포 (원숭이 신장으로부터), 말, 소 (예를 들면, MDBK 세포), 양, 개 (예를 들면, 개 신장으로부터 MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 또는 MDCK 33016, WO97/37001에서 설명된 바와 같은 수탁 번호 DSM ACC 2219), 고양이 및 설치류 (예를 들면, 햄스터 세포, 예컨대 BHK21-F, HKCC 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포))를 포함하지만 이들에 한정되지 않고, 그리고 예를 들면, 성체, 신생아, 태아 및 배아를 비롯한, 매우 다양한 발달 시기로부터 획득될 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포는 영속화된다 (예를 들면, WO 01/38362 및 WO 02/40665에서 설명되고, 그리고 ECACC 수탁 번호 96022940 하에 기탁된 바와 같은 PERC.6 세포). 바람직한 구체예에서, 포유동물 세포가 활용되고, 그리고 하기의 제한없는 세포 유형 중 하나 이상에서 선택되고 및/또는 이들로부터 유래될 수 있다: 섬유모세포 세포 (예를 들면, 진피, 폐), 내피 세포 (예를 들면, 대동맥, 관상, 폐, 혈관, 진피 미세혈관, 배꼽), 간세포, 각질세포, 면역 세포 (예를 들면, T 세포, B 세포, 대식세포, NK, 수지상), 유방 세포 (예를 들면, 상피), 평활근 세포 (예를 들면, 혈관, 대동맥, 관상, 동맥, 자궁, 기관지, 경부, 망막 혈관주위세포), 멜라닌세포, 신경 세포 (예를 들면, 별아교세포), 전립선 세포 (예를 들면, 상피, 평활근), 신장 세포 (예를 들면, 상피, 사구체간질, 근위 세뇨관), 골격 세포 (예를 들면, 연골세포, 파골세포, 조골세포), 근육 세포 (예를 들면, 근모세포, 골격, 평활근, 기관지), 간 세포, 망막모세포, 그리고 간질 세포. WO97/37000 및 WO97/37001은 현탁 상태에서 및 혈청 없는 배지에서 성장할 수 있고, 그리고 바이러스의 생산과 복제에서 유용한 동물 세포와 세포주의 생산을 설명한다.
상기 세포 유형에 대한 배양 조건은 알려져 있고, 그리고 다양한 간행물에서 설명된다. 대안으로 배양 배지, 보충물, 그리고 조건은 예를 들면, Cambrex Bioproducts (East Rutherford, N.J.)의 카탈로그 및 추가 문헌에서 설명된 바와 같이, 상업적으로 구입될 수 있다.
일정한 구체예에서, 본원에서 설명된 방법에서 이용되는 세포는 혈청 없는 및/또는 단백질 없는 배지에서 배양된다. 배지는 본 발명의 내용에서 혈청 없는 배지로서 지칭되며, 내부에 인간 또는 동물 기원의 혈청으로부터의 첨가제는 없다. '단백질 없는' 은 세포의 증식이 단백질, 성장 인자, 다른 단백질 첨가제 및 비-혈청 단백질을 배제하고 발생하지만, 바이러스 성장에 필요할 수 있는 단백질, 예컨대 트립신 또는 다른 프로테아제를 임의적으로 포함할 수 있는 배양액을 의미하는 것으로 이해된다. 이런 배양액에서 성장하는 세포는 그들 자체가 자연적으로 단백질을 함유한다.
공지된 혈청 없는 배지는 Iscove의 배지, Ultra-CHO 배지 (BioWhittaker) 또는 EX-CELL (JRH Bioscience)를 포함한다. 일상적인 혈청-함유 배지는 Eagle의 기초 배지 (BME) 또는 최소 필수 배지 (MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) 또는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM 또는 EDM)을 포함하는데, 이들은 통상적으로, 10%까지의 소 태아 혈청 또는 유사한 첨가제와 함께 이용된다. 임의적으로, 최소 필수 배지 (MEM) (Eagle, Science, 130, 432 (1959)) 또는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지 (DMEM 또는 EDM)는 임의의 혈청 함유 보충물 없이 이용될 수 있다. 단백질 없는 배지, 예컨대 PF-CHO (JHR Bioscience), 화학적으로-규정된 배지, 예컨대 ProCHO 4CDM (BioWhittaker) 또는 SMIF 7 (Gibco/BRL Life Technologies) 및 유사분열성 펩티드, 예컨대 프리막톤, 펩티카아제 또는 HyPep.TM. (이들 모두 Quest International로부터) 또는 락트알부민 가수분해물 (Gibco 및 다른 제조업체) 또한 선행 기술에서 적절하게 공지된다. 식물 가수분해물에 기초된 배지 첨가제는 바이러스, 미코플라스마 또는 알려지지 않은 감염체로 오염이 배제될 수 있다는 특수한 이점을 갖는다.
세포 배양 조건 (온도, 세포 밀도, pH 값 등)은 본 발명에 따라서 이용된 세포주의 적합성으로 인해 매우 넓은 범위에 걸쳐 가변적이고, 그리고 특정 바이러스 계열의 요건에 적합될 수 있다.
배양된 세포에서 바이러스를 증식하기 위한 방법은 일반적으로, 배양된 세포를 배양되는 바이러스 계열로 접종하는 단계, 감염된 세포를 예컨대, 예를 들면, 바이러스 역가 또는 항원 발현에 의해 결정될 때 바이러스 증식을 위한 원하는 기간 (예를 들면, 접종 후 24 및 168 시간 사이에) 동안 배양하는 단계, 그리고 증식된 바이러스를 수집하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 바이러스는 플라크 정제를 통해 수집된다. 배양된 세포는 1:500 내지 1:1, 바람직하게는 1:100 내지 1:5의 바이러스 (PFU 또는 TCID50에 의해 측정됨) 대 세포 비율로 접종된다. 바이러스는 세포의 현탁액에 첨가되거나 또는 세포의 단층에 적용되고, 그리고 바이러스는 25℃내지 40℃바람직하게는 28℃내지 38℃에서 적어도 10 분, 적어도 20 분, 적어도 30 분, 적어도 40 분, 적어도 50 분, 적어도 60 분, 하지만 통상적으로 300 분 이하 동안 세포 상에서 흡수된다. 감염된 세포 배양액 (예를 들면, 단층)은 동결-해동, 또는 수확된 배양 상층액의 바이러스 함량을 증가시키기 위한 효소적 작용에 의해 제거될 수 있다. 수확된 유체는 비활성화되거나 동결 보관된다. 배양된 세포는 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.002 내지 5, 더욱 바람직하게는 0.001 내지 2의 감염 다중도 (“MOI”)에서 감염될 수 있다. 훨씬 바람직하게는, 이들 세포는 약 0.01의 MOI에서 감염된다. 감염된 세포는 감염후 30 내지 60 시간, 또는 감염후 3 내지 10 일부터 수확될 수 있다. 일정한 바람직한 구체예에서, 세포는 감염후 3 내지 7 일에 수확된다. 더욱 바람직하게는, 세포는 감염후 3 내지 5 일에 수확된다. 일부 구체예에서, 바이러스 방출을 허용하기 위해 프로테아제 (예를 들면, 트립신)가 세포 배양 동안 첨가될 수 있고, 그리고 이들 프로테아제는 배양 동안 임의의 적합한 시기에서 첨가될 수 있다. 대안으로, 일정한 구체예에서, 감염된 세포 배양액의 상층액이 수확될 수 있고, 그리고 바이러스가 상기 상층액으로부터 단리되거나 또는 만약 그렇지 않으면 정제될 수 있다.
바이러스 접종물 및 바이러스 배양액은 바람직하게는, 단순 헤르페스 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 3, SARS 코로나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 레오바이러스, 폴리오마바이러스, 버나바이러스, 써코바이러스 및/또는 파보바이러스가 없다 (다시 말하면, 이들에 의한 오염에 대해 검사되고 음성 결과가 제공될 것이다) [WO2006/027698].
바이러스가 세포주 상에서 성장된 경우에, 숙주 세포 DNA의 임의의 종양원성 활성을 최소화하기 위해, 최종 백신에서 잔여 세포주 DNA의 양을 최소화하는 것이 표준 관례이다. 오염 DNA는 표준 정제 절차, 예를 들면, 크로마토그래피 등을 이용하여 백신 제조 동안 제거될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거는 뉴클레아제 처리에 의해, 예를 들면, DNA분해효소를 이용함으로써 향상될 수 있다. 참고문헌 (Lundblad (2001) Biotechnology and Applied Biochemistry 34:195-197, Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Center for Veterinary Medicine (CVM). May 2001.)에서 개시된 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키기 위한 편의한 방법은 먼저, 바이러스 성장 동안 이용될 수 있는 DNA분해효소 (예를 들면, 벤조나아제), 그리고 이후, 비리온 붕괴 동안 이용될 수 있는 양이온성 세정제 (예를 들면, CTAB)를 이용하는 2-단계 처리를 수반한다. β-프로피올락톤 처리에 의한 제거 또한 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 오염 DNA는 배양 상층액의 벤조나아제 처리에 의해 제거된다.
항원의 생산
제한 없이, 정제된 바이러스, 비활성화 바이러스, 비활성화 전체 바이러스, 약독화된 바이러스, 재조합 바이러스, 또는 소단위 백신을 위한 정제된 및/또는 재조합 바이러스 단백질을 포함하는, 지카 바이러스 감염을 치료 및/또는 예방 및/또는 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 가령, 보호 면역 반응을 유도하기 위한, 백신 및/또는 면역원성 조성물에 사용하기 위한 본 발명의 항원이 제조되고 및/또는 정제되거나 그렇지 않으면 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 단리될 수 있다. 본 발명의 항원은, 제한 없이, 전체 바이러스, 약독화 바이러스, 비활성화 바이러스, 비활성화 전체 바이러스, 단백질, 폴리펩티드 (단백질 내의 활성 단백질 및 개별 폴리펩티드 에피토프 포함), 당폴리펩티드, 리포폴리펩티드, 다당류 및 다른 분자들의 펩티드 및 비-펩티드 모방체, 소분자, 지질, 당지질 및 탄수화물을 포함한다. 예를 들어, 적합한 항원은 제한없이 C, prM 및/또는 E와 같은 구조적 폴리펩티드, 및 지카 바이러스의 NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및/또는 NS5와 같은 비-구조적 폴리펩티드를 포함 할 수 있다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스는 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스이다.
본 발명의 항원은 화학적으로 또는 효소적으로 합성되거나, 재조합적으로 생성되거나, 천연 공급원으로부터 단리되거나, 또는 전술한 것들의 조합 일 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항원은 본 발명의 하나 이상의 지카 바이러스로부터 생산, 정제, 단리 및/또는 유래된다. 본 발명의 항원은 정제되거나, 부분적으로 정제되거나, 또는 미정제 추출물 일 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항원은 바이러스, 가령, 비활성화된 바이러스는 “백신 및 면역원성 조성물의 생산”이라는 제목의 상기 섹션에서 설명된 바와 같이 생산되었다.
일정한 구체예에서, 본 발명의 하나 이상의 항원은 비-인간 세포를 배양함으로써 생산될 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 항원의 생산에 적합한 세포주는 곤충 세포 (예를 들면, 본원에서 설명된 임의의 모기 세포)를 포함할 수 있다. 본 발명의 하나 이상의 항원의 생산에 적합한 세포주는 또한, 포유동물 기원의 세포일 수 있고, 그리고 하기를 포함하지만 이들에 한정되지 않고: VERO 세포 (원숭이 신장으로부터), 말, 소 (예를 들면, MDBK 세포), 양, 개 (예를 들면, 개 신장으로부터 MDCK 세포, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) 또는 MDCK 33016, WO 97/37001에서 설명된 바와 같은 수탁 번호 DSM ACC 2219), 고양이 및 설치류 (예를 들면, 햄스터 세포, 예컨대 BHK21-F, HKCC 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포)), 그리고 예를 들면, 성체, 신생아, 태아 및 배아를 비롯한, 매우 다양한 발달 시기로부터 획득될 수 있다. 일정한 구체예에서, 세포는 영속화된다 (예를 들면, WO01/38362 및 WO02/40665에서 설명되고, 그리고 ECACC 수탁 번호 96022940 하에 기탁된 PERC.6 세포). 바람직한 구체예에서, 포유동물 세포가 활용되고, 그리고 하기의 제한없는 세포 유형 중 하나 이상에서 선택되고 및/또는 이들로부터 유래될 수 있다: 섬유모세포 세포 (예를 들면, 진피, 폐), 내피 세포 (예를 들면, 대동맥, 관상, 폐, 혈관, 진피 미세혈관, 배꼽), 간세포, 각질세포, 면역 세포 (예를 들면, T 세포, B 세포, 대식세포, NK, 수지상), 유방 세포 (예를 들면, 상피), 평활근 세포 (예를 들면, 혈관, 대동맥, 관상, 동맥, 자궁, 기관지, 경부, 망막 혈관주위세포), 멜라닌세포, 신경 세포 (예를 들면, 별아교세포), 전립선 세포 (예를 들면, 상피, 평활근), 신장 세포 (예를 들면, 상피, 사구체간질, 근위 세뇨관), 골격 세포 (예를 들면, 연골세포, 파골세포, 조골세포), 근육 세포 (예를 들면, 근모세포, 골격, 평활근, 기관지), 간 세포, 망막모세포, 그리고 간질 세포. WO97/37000 및 WO97/37001은 현탁 상태에서 및 혈청 없는 배지에서 성장할 수 있고, 그리고 바이러스 항원의 생산에서 유용한 동물 세포와 세포주의 생산을 설명한다. 일정한 구체예에서, 비인간 세포는 혈청 없는 배지에서 배양된다.
폴리펩티드 항원은 액체 크로마토 그래피 (예를 들어, 고성능 액체 크로마토 그래피, 고속 단백질 액체 크로마토 그래피 등), 크기 배제 크로마토 그래피, 겔 전기 영동 (1차원 겔 전기영동, 2차원 겔 전기영동 포함), 친화성 크로마토 그래피 또는 기타 정제 기술을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 방법을 사용하여 천연 공급원으로부터 단리 될 수 있다. 많은 구체예들에서, 항원은, 예컨대, 약 50% 내지 약 75% 순도, 약 75% 내지 약 85% 순도, 약 85% 내지 약 90% 순도, 약 90% 내지 약 95% 순도, 약 95% 내지 약 98% 순도, 약 98% 내지 약 99% 순도, 또는 99% 이상 순도의 정제된 항원이다. 정제된 항원의 순도는 크기 배제 크로마토그래피로 결정될 수 있으며, %-순도는 곡선아래 총 면적에 대한 주요 피크의 %에 해당한다. 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 항원의 주요 피크는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 90% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 95% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 98% 이상, 또는 99% 이상일 수 있다. 이러한 결과는 본 발명의 의미에 속하는 “정제된” 항원으로 간주된다.
순도에 관한 상기 설명에 따르면, 용어 “정제된 지카 바이러스”는, 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 지카 바이러스의 주요 피크가 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 90% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 95% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 98% 이상, 또는 99% 이상임을 의미한다.
순도에 관한 상기 설명에 따르면, 용어 “정제된 비활성화 전체 지카 바이러스”는, 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스의 주요 피크가 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 90% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 95% 이상, 또는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 98% 이상, 또는 99% 이상임을 의미한다.
고체상 펩티드 합성 기술을 사용할 수 있으며, 이러한 기술은 당업자에게 공지되어 있다. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford) (1994)참조. 일반적으로, 이러한 방법에서, 펩티드는 활성화된 단량체 단위를 고체상 결합된 성장 펩티드 사슬에 순차적으로 첨가하여 생성된다.
폴리펩티드의 생산을 위해 잘 확립된 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있는데, 여기서, 예컨대, 폴리펩티드를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 구조체가 적절한 숙주 세포 (예컨대, 시험관내 세포 배양에서 단세포 개체로서 성장한 진핵생물 숙주 세포, 예컨대, 효모 세포, 곤충 세로, 포유동물 세포, 등) 또는 원핵생물 세포 (예컨대, 시험관내 세포 배양에서 성장시킴)에 도입되어, 유전자 변형 숙주 세포가 생성되며; 적절한 배양 조건하에서, 상기 단백질은 유전자 변형된 숙주 세포에 의해 생산된다.
사멸 및 약독화 바이러스 면역원성 조성물 이외에, 동물에 지카 바이러스의 항원 성분을 제시하는 소단위 면역원성 조성물 또는 다른 유형의 면역원성 조성물을 사용할 수 있다. 항원 성분은 단백질, 당단백질, 지질-접합된 단백질 또는 당단백질, 변형된 지질 모이어티, 또는 인간에 주사 될 때 인간에서 면역 반응을 자극하여 인간이 지카 바이러스에 대한 보호 면역성을 발달시키도록 하는 다른 바이러스 성분 일 수 있다. 소단위 면역원성 조성물의 경우, 바이러스는 상기한 바와 같이 포유동물 세포에서 배양 될 수 있다. 세포 배양물은 균질화 될 수 있고, 면역원성 조성물은 세포 배양 균질액을 적절한 컬럼 또는 적절한 공극 크기 필터를 통해 통과시키거나 세포 배양 균질액의 원심분리를 통해 단리 될 수 있다.
항원 성분이 단백질인 경우, 그 단백질을 인코드하는 핵산을 단리하고 그 단리된 핵산을 함유하는 면역원성 조성물을 생성 할 수 있다. 항원 성분을 인코드하는 핵산은 진핵생물 프로모터의 신호 서열의 하류의 플라스미드 상에 위치 될 수 있다. 상기 플라스미드는 하나 이상의 선별 마커를 함유 할 수 있으며, 약독화된 원핵생물, 가령, 살모넬라 종, 시겔라 종, 또는 다른 적합한 박테리아에 형질감염 될 수 있다. 박테리아는 인간에게 투여될 수 있으며, 그 결과 인간은 항원 성분에 대한 보호 면역 반응을 생성 할 수 있다. 대안적으로, 항원 성분을 인코드하는 핵산은 원핵생물 프로모터의 하류에 위치될 수 있으며, 하나 이상의 선별 마커를 가질 수 있으며, 약독화된 원핵생물, 가령, 살모넬라 종, 시겔라 종, 또는 다른 적합한 박테리아에 형질감염 될 수 있다. 이후 박테리아는 관심 항원에 대한 면역 반응을 필요로 하는 진핵생물 대상에 투여될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제 6,500,419를 참조하라.
소단위 면역원성 조성물의 경우, 지카 바이러스의 단백질성 항원 성분을 인코드하는 핵산은 국제 특허 출원 공개 공보 WO 00/32047 (Galen) 및 국제 특허 출원 공개 공보 WO 02/083890 (Galen)에 기재된 것과 같은 플라스미드에 클로닝 될 수 있다. 이어서, 플라스미드를 박테리아에 형질감염 시킬 수 있고 박테리아는 원하는 항원 단백질을 생성 할 수 있다. 상기 두 특허 출원에 기재된 다양한 방법들에 의해 원하는 항원 단백질을 단리 및 정제할 수 있다.
바이러스 비활성화
본 발명의 특정 양상은 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 함유하는 지카 바이러스 백신 및 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 정제된 바이러스, 전체 바이러스, 재조합 바이러스, 생 약독화 전체 바이러스, 또는 바람직하게는 비활성화 전체 바이러스, 또는 소단위, 폴리펩티드 및/또는 비활성화 바이러스로부터의 항원을 포함 할 수있다. 이와 같이, 본 발명의 특정 구체예는 하나 이상의 비활성화 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 함유하는 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
바이러스를 비활성화시키거나 또는 사멸시켜, 포유동물 세포를 감염시키는 이들의 능력을 파괴하지만 바이러스의 구조를 파괴하지 않는 방법은 당업계에서 공지된다. 이런 방법은 화학적 및 물리적 수단 둘 모두를 포함한다. 바이러스를 비활성화시키기 위한 적합한 수단은 제한 없이, 세정제, 포르말린 (본원에서 “포름알데히드”로서 또한 지칭됨), 베타-프로피올락톤 (BPL), 이성분 에틸아민 (BEI), 아세틸 에틸렌이민, 열, 전자파 방사선, X선 방사, 감마선 방사, 자외선 방사 (UV 방사), UV-A 방사, UV-B 방사, UV-C 방사, 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시풀러렌 (C60), 그리고 이들의 임의의 조합에서 선택되는 하나 이상의 작용제의 효과량으로 처리를 포함한다.
본 발명의 일정한 구체예에서 하나 이상의 바이러스는 화학적으로 비활성화된다. 화학적 비활성화를 위한 작용제 및 화학적 비활성화의 방법은 당업계에서 널리 공지되고 본원에서 설명된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 바이러스는 BPL, 포르말린, 또는 BEI 중 하나 이상으로 화학적으로 비활성화된다. 하나 이상의 바이러스가 BPL로 화학적으로 비활성화되는 일정한 구체예에서, 바이러스는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 변형은 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 핵산은 알킬화된 핵산이다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 변형은 변형된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 폴리펩티드는 변형된 시스테인, 메티오닌, 히스티딘, 아스파르트산, 글루타민산, 티로신, 리신, 세린 및 트레오닌 중에서 하나 이상을 포함하는 변형된 아미노산 잔기를 함유한다.
하나 이상의 바이러스가 포르말린으로 화학적으로 비활성화되는 일정한 구체예에서, 비활성화된 바이러스는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 변형은 변형된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 변형은 교차연결된 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 하나 이상의 바이러스가 포르말린으로 화학적으로 비활성화되는 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 포르말린을 더욱 포함한다. 하나 이상의 바이러스가 BEI로 화학적으로 비활성화되는 일정한 구체예에서, 바이러스는 하나 이상의 변형을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 변형은 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 변형된 핵산은 알킬화된 핵산이다.
하나 이상의 바이러스가 포르말린으로 화학적으로 비활성화되는 일부 구체예에서, 임의의 잔여 반응하지 않은 포르말린은 이러한 잔여 반응하지 않은 포르말린을 제거하기 위해, 메타중아황산나트륨으로 중화될 수 있고, 투석될 수 있고 및/또는 완충제 교체될 수 있다. 일부 구체예에서, 메타중아황산나트륨은 과량으로 첨가된다. 일부 구체예에서, 이들 용액은 혼합기, 예컨대 직렬 정적 혼합기를 이용하여 혼합되고, 그리고 차후에 여과되거나 또는 더욱 정제될 수 있다 (예를 들면, 직교류 여과 시스템을 이용하여).
본 발명의 일정한 구체예는 지카 바이러스 조직표본을 비활성화시키기 위한 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 상기 방법은 (a) 바이러스 조직표본을 생산하는데 이용되는 하나 이상의 비-인간 세포들로부터 지카 바이러스 조직표본을 단리 후 정제하는 단계 및 (b) 이러한 바이러스 조직표본을 효과량의 포르말린으로 처리하는 단계를 포함한다. 특정 구체예들에서, 효과량의 포르말린으로 처리하는 단계는, 제한 없이, 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 처리하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 효과량의 포르말리능로 처리하는 단계는 약 0.001% 내지 약 3.0% v/v, 약 0.005% 내지 약 2.0% v/v, or 약 0.01% 내지 약 1.0% v/v, or in an amount of 약 0.001%, 약 0.0025%, 약 0.005%, 약 0.0075%, 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.25%, 약 1.5%, 약 1.75%, 약 2.0%, 약 2.25%, 약 2.5%, 약 2.75%, 또는 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 처리하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법의 특정 구체예에서, 지카 바이러스 조직표본은 약 2℃내지 약 42℃범위의 온도에서 포르말린으로 처리된다. 예를 들면, 지카 바이러스 조직표본은 약 2℃ 내지 약 42℃, 약 2℃ 내지 약 8℃, 약 15℃ 내지 약 37℃, 약 17℃ 내지 약 27℃, 약 20℃ 내지 약 25℃ 또는 of 약 2℃, 약 4℃, 약 8℃, 약 10℃, 약 15℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 37℃, 또는 약 42℃, 범위 온도에서 포르말린으로 처리될 수 있다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스 조직표본은 실온에서 포르말린으로 처리된다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 1 일 동안 포르말린으로 처리된다. 예를 들면, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 1 일, 적어도 약 2 일, 적어도 약 3 일, 적어도 약 4 일, 적어도 약 5 일, 적어도 약 6 일 동안, 그리고 예컨대, 15 일 이하 동안, 예컨대, 5 내지 15 일 동안 포르말린으로 처리될 수 있다. 예를 들면, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 7 일, 적어도 약 8 일, 적어도 약 9 das, 적어도 약 10 일, 적어도 약 11 일, 적어도 약 12 일, 적어도 약 13 일, 적어도 약 14 일, 적어도 약 15 일, 적어도 약 16 일, 적어도 약 17 일, 적어도 약 18 일, 적어도 약 19 일, 적어도 약 20 일, 적어도 약 21 일, 적어도 약 22 일, 적어도 약 23 일, 적어도 약 24 일, 적어도 약 25 일, 적어도 약 26 일, 적어도 약 27 일, 적어도 약 28 일, 적어도 약 29 일, 적어도 약 30 일, 또는 그 이상 동안 포르말린으로 처리될 수 있다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 9 일 동안 포르말린으로 처리된다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 11 일 동안 포르말린으로 처리된다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 14 일 동안 포르말린으로 처리된다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 20 일 동안 포르말린으로 처리된다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스 조직표본은 적어도 약 30 일 동안 포르말린으로 처리된다.
일부 구체예에서, 상기 방법은 반응하지 않은 포르말린을 메타중아황산나트륨의 효과량으로 중화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 메타중아황산나트륨의 효과량은 약 0.01 mM 내지 약 100 mM의 범위이다. 예를 들면, 메타중아황산나트륨은 약 0.01 mM 내지 약 100 mM, 약 0.1 mM 내지 약 50 mM, 약 0.5 mM 내지 약 20mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM의 효과적인 농도에서, 또는 약 0.01mM, 약 0.05mM, 약 0.1mM, 약 0.25mM, 약 0.5mM, 약 0.75mM, 약 1mM, 약 2mM, 약 3mM, 약 4mM, 약 5mM, 약 6mM, 약 7mM, 약 8mM, 약 9mM, 약 10mM, 약 20mM, 약 30mM, 약 40mM, 약 50mM, 약 75mM 또는 약 100mM의 농도에서 첨가될 수 있다. 일부 구체예에서, 포르말린은 약 2mM 메타중아황산나트륨으로 중화된다.
일부 구체예들에서, 상기 방법은 바이러스 조직표본을 생산하는데 이용되는 하나 이상의 비-인간 세포들로부터 지카 바이러스 조직표본을 단리 후 정제하는 단계; (b) 이러한 바이러스 조직표본을 효과량의 포르말린으로 처리하는 단계; (c) 바이러스 조직표본을 효과량의 메타중아황산나트륨으로 중화하는 단계; 및 (d) 중화된 바이러스 조직표본을 정제하는 단계를 포함한다. 제한 없이, 직교류 여과 (CFF), 다중모드 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 것을 비롯하여, 당업계에서 공지된, 바이러스 조직표본을 정제하는 임의의 방법이 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 중화된 바이러스 조직표본은 직교류 여과 (CFF)에 의해 정제된다. 일부 구체예에서, 바이러스 조직표본은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 그 이상인 양으로 고도로 정제된다.
그러므로 본 발명의 특정 구체예들은 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를 함유하는 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에 관한 것이다. 본원에서 사용된 용어 “비활성화 전체 지카 바이러스”는 효과량의 포르말린으로의 처리와 같은 비활성화 방법으로 처리된 지카 바이러스를 포함하고자 한다. 이러한 치료는 바이러스의 구조를 파괴하지 않는 것으로 간주된다, 즉, 바이러스의 이차, 삼차 또는 사차 구조 및 면역원성 에피토프를 파괴하지는 않지만, 비활성화된 지카 바이러스는 비활성화되지 않은 지카 바이러스로 감염될 수 있는 숙주 세포를 더 이상 감염시킬 수 없다. 한 구체예에서, 비활성화 지카 바이러스는 더 이상 VERO 세포를 감염시킬 수 없고 VERO 세포에 세포 변성 효과를 발휘할 수 없다.
아르보바이러스 조직표본의 비활성화의 완결도를 결정하기 위한 방법은 다음 단계를 포함한다:
(i) 곤충 세포를 비활성화 단계에 종속된 아르보바이러스 조직표본으로 접종하고, 그리고 이들 곤충 세포를 첫 번째 기간 동안 배양하고, 따라서 곤충 세포 상층액을 생산하는 단계;
(ii) 포유동물 세포를 (i)에서 생산된 곤충 세포 상층액으로 접종하고, 그리고 이들 포유동물 세포를 두 번째 기간 동안 배양하고; 그리고
(iii) 바이러스 조직표본이 포유동물 세포에 대한 세포변성 효과를 발생시키는 잔여 복제 바이러스를 함유하는 지를 결정하는 단계.
플라크에 의해 잔여 복제 바이러스가 검출 될 수 없는 경우 비활성화가 완결된 것으로 간주된다.
그러므로 본 발명에 있어서 용어 “비활성화 전체 지카 바이러스”는 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 5 내지 15일 동안 약 15℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서, 특히, 0.02 % v/v 포름알데히드로 10일 동안 22 ℃에서 또는 특히 0.01 % v/v 포름알데히드로 10일 동안 22 ℃에서 처리되는 방법으로 획득가능한 지카 바이러스를 지칭한다. 상기 정의는 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 5 내지 15일 동안 약 15℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서, 특히, 0.02 % v/v 포름알데히드로 10일 동안 22 ℃에서 또는 특히 0.01 % v/v 포름알데히드로 10일 동안 22 ℃에서 처리되는 방법으로 획득가능한 지카 바이러스를 포함함을 의미하나, 이러한 지카 바이러스에 제한되는 것으로 이해되는 것은 아니며, 다른 방법들도 동일한 비활성화 전체 지카 바이러스를 생성할 수 있다. 그러나 이러한 특정 구체예들에서, 지카 바이러스는 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 5 내지 15일 동안 약 15℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서, 특히, 0.02 % v/v 포름알데히드로 10일 동안 22 ℃ 에서 또는 특히 0.01 % v/v 포름알데히드로 10일 동안 22 ℃ 에서 처리되는 방법으로부터 획득된다.
대안적으로, 본 발명에 속하는 “비활성화 전체 지카 바이러스”는 다음과 같은 단계 (i) 내지 (iii)을 포함하는 방법에 의해 테스트되었으며 단계 (iii)에서 임의의 플라크 형성을 나타내지 않는 지카 바이러스를 지칭한다:
곤충 세포를 비활성화 단계에 종속된 아르보바이러스 조직표본으로 접종하고, 그리고 이들 곤충 세포를 첫 번째 기간 동안 배양하고, 따라서 곤충 세포 상층액을 생산하는 단계;
포유동물 세포를 (i)에서 생산된 곤충 세포 상층액으로 접종하고, 그리고 이들 포유동물 세포를 두 번째 기간 동안 배양하고; 그리고
바이러스 조직표본이 포유동물 세포에 대한 세포변성 효과를 발생시키는 잔여 복제 바이러스를 함유하는지를 결정하는 단계.
상기 용어 “정제된 비활성화 전체 지카 바이러스”는 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 5 내지 15일 동안 약 15 ℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서, 특히, 0.02 % v/v 포름알데히드로 10일 동안 22 ℃에서 또는 특히 0.01 % v/v 포름알데히드로 10일 동안 22 ℃에서 처리되는 방법으로, 또는 대안적으로 비활성화 완결도를 결정하는 전술한 방법에 의해, 그리고 필요에 따라 정제 단계를 거쳐 획득가능한 또는 획득되는 지카 바이러스를 지칭한다. 그러므로 정제된 지카 바이러스는 비정제된 지카 바이러스보다 더욱 낮은 함량의 숙주 세포 단백질, 예컨대 Vero 세포 단백질 및 숙주 세포 DNA, 예컨대 Vero 세포 DNA를 갖는다. 상기 용어 “정제된 비활성화 전체 지카 바이러스”는 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 5 내지 15일 동안 약 15℃ 내지 약 37℃ 범위의 온도에서, 특히, 0.02 % v/v 포름알데히드로 10일 동안 22 ℃에서 또는 특히 0.01 % v/v 포름알데히드로 10일 동안 22 ℃에서 처리되는 방법으로, 또는 대안적으로 비활성화 완결도를 결정하는 전술한 방법에 의해, 그리고 필요에 따라 정제 단계를 거쳐 획득가능한 또는 획득되는 지카 바이러스를 지칭하며, 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총 면적의 적어도 85%의 주요 피크를 제공한다.
일정한 구체예에서 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스는 또한 플라크 정제에 의해 획득된 또는 획득가능한 클론 분리주이다.
이러한 특정 구체예들에서 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스, 선택적으로 또한 플라크 정제에 의해 획득되거나 획득가능한 클론 분리주는, 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 함유하며 외피 단백질 E 내부에 임의의 돌연변이를 함유하지 않는다. 이러한 특정 구체예들에서 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서의 Trp98Gly 돌연변이이다. 이러한 특정 구체예들에서 지카 바이러스는 균주 PRVABC59에서 유래된다. 이러한 특정 구체예에서 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59로부터 유래된다.
하나 이상의 비활성화된 지카 바이러스로부터 하나 이상의 항원을 함유하는 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 치료가 필요한 개체에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 또는 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는데 유용할 수 있다.
어쥬번트
본 발명의 다른 양상은 하나 이상의 어쥬번트와 조합으로, 본원에 설명된 하나 이상의 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 함유하는 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에 관계한다. 본 발명의 이런 보조된 백신 및/또는 면역원성 조성물은 치료가 필요한 개체에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 개체에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는데 유용할 수 있다.
백신에 대한 어쥬번트 효과를 달성하는 다양한 방법이 알려져 있고, 그리고 본원에서 개시된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 이용될 수 있다. 일반적인 원리와 방법은 “The Theory and Practical Application of Adjuvants”, 1995, Duncan E. S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6에서, 그리고 또한, “백신s: New Generation Immunological Adjuvants”, 1995, Gregoriadis G 외 (eds.), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9에서 상술된다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물은 항원 및 어쥬번트를 포함한다. 항원은 하나 이상의 어쥬번트와, 약 10:1 내지 약 1010:1의 항원:어쥬번트, 예컨대, 약 10:1 내지 약 100:1, 약 100:1 내지 약 103:1, 약 103:1 내지 약 104:1, 약 104:1 내지 약 105:1, 약 105:1 내지 약 106:1, 약 106:1 내지 약 107:1, 약 107:1 내지 약 108:1, 약 108:1 내지 약 109:1, 또는 약 109:1 내지 약 1010:1의 항원:어쥬번트의 중량-기준 비율의 혼합물로 존재할 수 있다. 당업자는 최적의 비율을 결정하기 위해 어쥬번트에 관한 정보 및 일상적인 실험을 통해 적절한 비율을 쉽게 결정할 수 있다.
예시적인 어쥬번트는 알루미늄 염, 인산칼슘, 톨 유사 수용체 (TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), MLA 유도체, 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 사이토킨, 사포닌, 무라밀 디펩티드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 지질다당류 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀션 (오일 에멀션), 키토산, 비타민 D, 스테아릴 또는 옥타데실 티로신, 비로솜, 카클리어트, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA), 그리고 불완전 프로인드 어쥬번트 (IFA)를 포함할 수 있지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예에서, 어쥬번트는 알루미늄 염이다.
일부 구체예들에서, 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 및 알하이드로겔 85 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 알루미늄 염 어쥬번트는 본 발명의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물의 항원의 흡착을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 구체예에서, 항원 중에서 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%가 알루미늄 염 어쥬번트에 흡착된다.
일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 약 100 μg 내지 약 600 μg, 약 100 μg 내지 약 500 μg, 약 125 μg 내지 약 500 μg, 약 150 μg 내지 약 500 μg, 약 175 μg 내지 약 500 μg, 약 100 μg 내지 약 450 μg, 약 125 μg 내지 약 450 μg, 약 150 μg 내지 약 450 μg, 약 175 μg 내지 약 450 μg, 약 100 μg 내지 약 400 μg, 약 125 μg 내지 약 400 μg, 약 150 μg 내지 약 400 μg, 약 175 μg 내지 약 400 μg, 약 100 μg 내지 약 350μg, 약 125 μg 내지 약 350μg, 약 150 μg 내지 약 350μg, 약 175 μg 내지 약 350μg, 약 100 μg 내지 약 300 μg, 약 125 μg 내지 약 300 μg, 약 150 μg 내지 약 300 μg, 약 175 μg 내지 약 300 μg, 약 100 μg 내지 약 250 μg, 약 125 μg 내지 약 250 μg, 약 150 μg 내지 약 250 μg, 약 175 μg 내지 약 250 μg, 약 100 μg 내지 약 225 μg, 약 125 μg 내지 약 225 μg, 약 150 μg 내지 약 225 μg, 약 175 μg 내지 약 225 μg, 또는 약 200 μg의 알루미늄 염 어쥬번트 (예컨대, 백반)를 포함한다. 일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 약 100μg 내지 약 600μg 또는 약 100μg 내지 약 300μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200μg의 알루미늄 염 어쥬번트 (예컨대, 수산화 알루미늄과 같은 백반)를 포함한다.
일부 구체예들에서, 백신 및/또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스, 가령, 서열 번호:1의 위치 98에서 또는 본 발명에 기재된 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판의 글리신으로의 치환인 돌연변이를 가지는 지카 바이러스를, 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유한다.
일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를, 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유하며, 이 때 지카 바이러스는 균주 PRVABC59에서 유래된다.
일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를, 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유하며, 이 때 지카 바이러스는 서열 번호:2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59에서 유래된다.
일부 구체예들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 플라크 정제된 지카 바이러스 분리주를, 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유하며, 이 때 지카 바이러스는 서열 번호:2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59에서 유래된다.
본 발명의 일정한 구체예는 어쥬번트 처리된 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물을 제조하기 위한 방법을 포함하고, 상기 방법은 (a) 백신 또는 면역원성 조성물을 알루미늄 염 어쥬번트와 혼합하는 단계, 이 때 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 본원에 기재된 하나 이상의 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 포함하고, 그리고 (b) 혼합물을 적합한 조건 하에 약 1 시간 내지 약 24 시간 (예를 들면, 약 16 시간 내지 약 24 시간) 범위의 기간 동안 항온처리하는 단계를 포함하는데, 상기 항원의 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%가 알루미늄 염 어쥬번트에 흡착된다. 상기 방법의 일정한 구체예에서, 하나 이상의 지카 바이러스는 비인간 세포 적응 돌연변이 (예를 들면, 단백질 NS1에서 비인간 세포 적응 돌연변이, 예컨대 Trp98Gly 돌연변이)를 포함하는 지카 바이러스이다.
상기 방법의 일부 구체예에서, 혼합물은 약 2º내지 약 8º범위의 온도에서 배양된다. 상기 방법의 일부 구체예에서, 혼합물은 당업계에 공지된 임의의 적합한 혼합장치에서 지속적인 혼합하에 배양된다. 상기 방법의 일부 구체예에서, 상기 혼합물은 약 6.5 내지 약 8.5, 약 6.5 내지 약 8, 약 6.8 내지 약 7.8, 약 6.9 내지 약 7.6, 약 7 내지 약 7.5, 약 6.8 내지 약 8.5, 약 6.9 내지 약 8.5, 또는 약 7 내지 약 8.5 수치 범위의 pH에서 배양된다. 바람직한 특정 구체예들에서, 혼합물은 중성 pH에서 배양된다. 상기 방법의 일부 구체예들에서, 알루미늄 염 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 및 알하이드로겔 85에서 선택된다.
살모넬라 (Salmonella)로부터 얻은 지질 A의 비-독성 유도체인 모노포스포릴 지질 A (MLA)는 백신 어쥬번트로서 개발된 강력한 TLR-4 효현제이다 (Evans 외 (2003) Expert Rev. 백신s 2(2): 219-229). 전임상 뮤린 연구에서 비강내 MLA는 전신 및 체액성 반응 뿐만 아니라 분비를 향상시키는 것으로 나타났다 (Baldridge 외 (2000) 백신 18(22): 2416-2425; Yang 외 (2002) Infect. Immun. 70(7): 3557-3565). 또한 120,000명 이상의 환자를 대상으로 한 임상 연구에서 백신 어쥬번트로서 안전하고 효과적임이 입증되었다 (Baldrick 외 (2002) Regul. Toxicol. Pharmacol. 35(3): 398-413; Baldrick 외 (2004) J. Appl. Toxicol. 24(4): 261-268). MLA는 TLR-4 수용체를 통해 선천 면역의 유도를 자극하여 그람 음성 및 그람 양성 박테리아, 바이러스 및 기생충 모두를 포함한 광범위한 감염성 병원체에 대해 비특이적 면역 반응을 이끌어 낼 수 있다 (Baldrick 외 (2004) J. Appl. Toxicol. 24(4): 261-268; Persing 외 (2002) Trends Microbiol. 10(10 Suppl): S32-37). 비강내 제형에 MLA를 포함시키면, 선천적 반응의 신속한 유도를 제공하여, 바이러스 공격으로부터 비특이적 면역 반응을 유도하면서 백신의 항원 성분에 의해 생성된 특이적 반응을 향상시켜야 한다.
따라서, 한 구체예에서, 본 발명은 적응성 및 선천성 면역의 향상제로서 모노포스포릴 지질 A (MLA), 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A (3D-MLA) 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 화학적으로 3D-MLA는 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6개의 아실화 사슬의 혼합물이다. 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 유럽 특허 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA)에 개시되어 있다. 다른 구체예에서, 본 발명은 TLR-4 효현제와 같이 기능하도록 설계된, 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 예컨대, BioMira사의 PET 지질 A, 또는 합성 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 예시적인 어쥬번트는 제한없이 폴리펩티드 성분과의 공동-발현 또는 폴리펩티드 성분과의 융합에 의해 본원에 기재된 항원에 용이하게 첨가되어 키메라 폴리펩티드를 생성 할 수 있는 폴리펩티드 어쥬번트를 포함한다. 편모의 주요 단백질 성분인 박테리아 플라젤린은 톨-유사 수용체 TLR5에 의한 선천성 면역계에 의한 인식으로 인해 어쥬번트 단백질로서 주목을 받고 있는 어쥬번트이다. TLR5를 통한 플라젤린 신호 전달은 대식세포, 호중구 및 장 상피 세포의 활성화 뿐만 아니라 DC 성숙 및 이동을 유도함으로써 선천성 및 적응성 면역 기능 모두에 영향을 미치며, 전 염증성 매개체의 생성을 초래한다.
TLR5는 이 단백질에 고유하고 편모 기능에 필요한 플라젤린 단량체 내에서 보존된 구조를 인식하며, 면역학적 압력에 반응하는 그 돌연변이는 배제시킨다. 수용체는 100 fM 농도에 민감하지만 무손상 필라멘트를 인식하지 못한다. 결합 및 자극을 위해 단량체로의 편모 분해가 필요하다.
어쥬번트로서, 플라젤린은 비경구 또는 비강내 투여된 이종 항원에 대한 보호 반응의 유도에 강력한 활성을 가지며 DNA 백신에 대한 어쥬번트 효과도 보고되었다. 호흡기 바이러스, 가령, 인플루엔자에 적합한 플라젤린이 사용될 때 Th2 바이어스가 관찰되지만, 마우스 또는 원숭이에서 IgE 유도에 대한 증거는 전혀 관찰된 바 없다. 또한, 원숭이에서 비강내 또는 전신 투여 후 국소 또는 전신 염증 반응은 보고되지 않았다. 플라젤린을 사용한 후에 도출된 반응의 Th2 특성은 다소 놀라운데, 왜냐하면, MyD88-의존 방식의 TLR5를 통한 플라젤린 신호 및 TLR을 통한 다른 모든 MyD88-의존 신호가 Th1 바이어스를 초래하는 것으로 나타났기 때문이다. 중요한 것은, 플라젤린에 대한 기존의 항체는 어쥬번트 효능에 뚜렷한 영향을 미치지 않으므로 다용도 어쥬번트로서 매력적이다.
많은 최근의 비강내 백신 시험에서 공통적인 주제는 백신 효능을 향상시키기 위한 어쥬번트 및/또는 전달 시스템의 사용이다. 이러한 한 연구에서, 유전적으로 해독된 대장균 열-불안정성 장독소 어쥬번트 (LT R192G)를 함유하는 인플루엔자 H3 백신은 비강내 전달에 의할 경우에만 H5 공격접종에 대한 이종아형 보호를 초래하였다. 보호는 교차 중화 항체의 유도에 기초하였으며 이는 새로운 백신의 개발에서 비강내 경로에 대한 중요한 의미를 입증한 것이다.
사이토카인, 콜로니-자극 인자 (예를 들어, GM-CSF, CSF 등); 종양 괴사 인자; 인터루킨-2, -7, -12, 인터페론 및 다른 유사한 성장 인자 또한 폴리펩티드 성분과의 혼합 또는 융합에 의해 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물에 용이하게 포함될 수 있기 때문에 어쥬번트로서 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 톨-유사 수용체를 통해 작용하는 다른 어쥬번트, 가령, 5'-TCG-3 '서열을 포함하는 핵산 TLR9 리간드; 이미다조퀴놀린 TLR7 리간드; 치환된 구아닌 TLR7/8 리간드; 다른 TLR7 리간드, 가령, 록소리빈, 7-데아자데옥시구아노신, 7-티아-8-옥소데옥시구아노신, 이미퀴모드 (R-837) 및 레시퀴모드 (R-848)를 포함할 수 있다.
특정 어쥬번트는 수지상 세포와 같은 APC에 의한 백신 분자의 흡수를 촉진하고 이들을 활성화시킨다. 비-제한적 예는 면역 표적화 어쥬번트; 면역 조절 어쥬번트, 가령, 독소, 사이토카인 및 마이코박테리아 유도체; 오일 제형; 중합체; 마이셀 형성 어쥬번트; 사포닌; 면역 자극 복합체 매트릭스 (ISCOM 매트릭스); 입자; DDA; 알루미늄 어쥬번트; DNA 어쥬번트; MLA; 및 캡슐화 어쥬번트로 구성된 군에서 선택된다.
또 다른 어쥬번트의 예에는 물질, 가령, 완충 식염수 중 0.05 내지 0.1 % 용액으로 일반적으로 사용되는 알루미늄 염, 가령, 수산화물 또는 인산화물 (백반) (예컨대, Nicklas (1992) Res. Immunol. 143:489-493 참고), 0.25 퍼센트 용액으로 사용되는 당의 합성 중합체와의 혼합물 (예컨대, Carbopol®이 포함되며, 70℃ 내지 101℃ 범위의 온도에서 각각 30초 내지 2분의 기간 동안 열 처리에 의한 백신 내 단백질의 응집 그리고 또한 가교 결합 물질에 의한 응집이 가능하다. 알부민에 대한 펩신 처리된 항체 (Fab 단편)로 재활성화된 응집, C. 파붐 (C. parvum) 또는 내독소와 같은 박테리아 세포 또는 그람 음성 박테리아의 지질다당류 성분과의 혼합물, 생리학적으로 허용가능한 오일 비히클에서의 에멀전, 예컨대, 만니드 모노-올레에이트 (Aracel A) 또는 블록 치환기로 사용된 20 % 퍼플루오로 카본 용액과의 에멀전 (Fluosol-DA)이 또한 사용될 수 있다. 스쿠알렌 및 IFA와 같은 오일과의 혼합물 또한 사용될 수 있다.
DDA (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드)는 관심 어쥬번트 후보이며, 프로인트의 완전 및 불완전 어쥬번트 뿐만 아니라 QuilA 및 QS21과 같은 키라야 사포닌 또한 관심 대상이다. 또 다른 가능한 것에는 지질다당류의 폴리[디(카르복실라토페녹시) 포스파젠 (PCPP) 유도체, 가령, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 뮤라밀 디펩티드 (MDP) 및 트레오닐 뮤라밀 디펩티드 (tMDP)가 포함된다. 예를 들면, 모노포스포릴 지질 A, 가령, 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A과, 알루미늄 염과의 조합을 비롯한 지질다당류계 어쥬번트 또한 우세하게 Th1-형 반응을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
리포좀 제형 또한 어쥬번트 효과를 부여하는 것으로 공지되어 있고, 따라서 리포좀 어쥬번트는 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용될 수 있다.
면역자극 복합체 매트릭스 유형 (ISCOM®매트릭스) 어쥬번트 또한 지카 바이러스 백신 항원 및 면역원성 조성물과 함께 사용될 수 있는데, 이는 특히 이러한 유형의 어쥬번트가 APC에 의한 MHC II형 발현을 상향 조절할 수 있는 것으로 밝혀졌기 때문이다. ISCOM 매트릭스는 키라야 사포나리아, 콜레스테롤 및 인지질로부터의 (선택적으로 분별된) 사포닌 (트리테르페노이드)으로 구성된다. 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물 항원과 같은 면역원성 단백질과 혼합 될 때, 생성된 미립자 제형은 사포닌 60-70 % w/w, 콜레스테롤 및 인지질 10-15 % w/w, 및 단백질 10-15 % w/w로 구성될 수 있는 ISCOM 입자로 공지되어 있는 것이다. 면역 자극 복합체의 조성 및 사용에 관한 세부 사항은 예를 들어, 어쥬번트를 다루는 상기 언급된 교과서에서 찾을 수 있으며, 또한 B 외 (1995) Clin. Immunother. 3: 461-475 뿐만 아니라 Barr I G and Mitchell G F (1996) Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25는 완전한 면역 자극 복합체의 제조에 유용한 지침을 제공한다.
본원에 개시된 지카 바이러스 백신 및 면역원성 조성물과의 어쥬번트 조합에서 사용될 수 있는 사포닌은 아이소형인지 여부에 관계없이, Quil A로 명명된 키라야 사포나리아 몰리나 (Quillaja Saponaria Molina)의 껍질로부터 유래한 것들 및 이들의 분획을 포함하며, 이는 미국 특허 제 5,057,540 및 “Saponins as 백신 adjuvants”, Kensil, C. R. (1996)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 12 (1-2):1-55; 및 EP 0 362 279 B1에 기재되어 있다. Quil A의 예시 분획들은 QS21, QS7, 및 QS17이다.
β-에신 (Escin)은 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물의 어쥬번트 조성물에 사용하기 위한 또 다른 용혈성 사포닌이다. 에신은 Merck index (12판: entry 3737)에 말 밤나무 씨앗, Lat:에스쿨루스 히포카스타눔 (Aesculus hippocastanum) 종에서 발생하는 사포닌의 혼합물로 설명되어 있다. 이의 단리는 크로마토그래피 및 정제 (Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953)) 및 이온 교환 수지 (Erbring 외, US 특허 제 3,238,190)에 의해 설명된다. 에신의 분획들이 정제되었으며 생물학적으로 활성인 것으로 밝혀졌다 (Yoshikawa M, 외 (Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 August; 44(8):1454-1464)). β-에신은 에신 (aescin)이라고도 한다.
지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에 사용하기 위한 또 다른 용혈성 사포닌은 디기토닌이다. 디기토닌은 Merck index (12판, entry 3204)에 사포닌으로 기재되어 있으며, 디기탈리스 푸르푸레아 (Digitalis purpurea) 씨드로부터 유래되고 Gisvold 외 (1934) J.Am.Pharm.Assoc. 23: 664; 및 Ruhenstroth-Bauer (1955)Physiol.Chem., 301, 621에 기재된 절차에 따라 정제된다. 그 용도는 콜레스테롤 측정을 위한 임상 시약으로 설명되어 있다.
어쥬번트 효과를 달성할 수 있는 또 다른 흥미로운 가능성은 Gosselin 외, 1992에 설명된 기술을 사용하는 것이다. 요컨대, 본 발명의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물 중의 항원과 같은 관련 항원의 제시는 항원을 단핵구/대식세포의 FC 수용체에 대한 항체 (또는 항원 결합 항체 단편)에 접합시킴으로써 향상 될 수 있다. 특히 항원과 항-FCRI 사이의 접합체는 백신접종의 목적을 위한 면역원성을 향상시킴이 입증되었다. 항체는 생성 후 또는 생성의 일부로서 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물 항원들에 접합될 수 있으며, 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물 항원의 폴리펩티드 성분들 중 하나에 대한 융합체로서 발현시킴에 의한 것을 포함한다. 다른 가능성은 표적화 및 면역 조절 물질 (예컨대, 사이토카인)의 사용을 포함한다. 또한, 폴리 I:C와 같은 사이토카인의 합성 유도제 또한 사용될 수 있다.
적합한 마이코박테리아 유도체는 뮤라밀 디펩티드, 완전 프로인트 어쥬번트, RIBI (Ribi ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Mont.) 및 트레할로스의 디에스터, 예컨대 TDM 및 TDE로 이루어진 군으로부터 선택 될 수 있다.
적합한 면역 표적화 어쥬번트의 예는 CD40 리간드 및 CD40 항체 또는 이의 특이적 결합 단편 (상기 논의 참조), 만노스, Fab 단편 및 CTLA-4를 포함한다.
적합한 중합체 어쥬번트의 예는 탄수화물, 가령, 덱스트란, PEG, 전분, 만난 및 만노스; 플라스틱 폴리머; 라텍스 비드와 같은 라텍스를 포함한다.
면역 반응을 조절하는 또 다른 흥미로운 방법은 “가상 림프절” (VLN) (ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, N.Y. 10017-6501에 의해 개발된 독점 의료 장치)에 면역원 (선택적으로 어쥬번트 및 제약학적으로 허용가능한 담체와 함께)을 포함시키는 것이다. VLN (얇은 관형 장치)은 림프절의 구조와 기능을 모방한다. 피부 아래에 VLN을 삽입하면 사이토카인 및 케모카인의 급증으로 무균 염증 부위가 생성된다. T- 및 B-세포 뿐만 아니라 APC는 위험 신호에 신속하게 반응하여, 염증 부위로 귀화하여 VLN의 다공성 매트릭스 내부에 축적한다. VLN을 사용하는 경우 항원에 대한 면역 반응을 일으키는데 필요한 항원 용량이 감소되고, VLN을 사용한 백신접종에 의해 부여되는 면역 보호가 어쥬번트로서 Ribi를 사용하는 종래의 면역을 능가하는 것으로 나타났다. 이러한 기술은 Gelber C 외의, 1998, “Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node”, in: “From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, Oct. 12-15, 1998, Seascape Resort, Aptos, Calif”에 간단히 설명되어 있다.
올리고뉴클레오티드는 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물 항원과 함께 어쥬번트로서 사용될 수 있고, 3개 이상 또는 심지어 6개 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된 2개 이상의 디뉴클레오티드 CpG 모티프를 함유 할 수 있다. CpG-함유 올리고뉴클레오티드 (CpG 디뉴클레오티드가 메틸화되지 않은)는 주로 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 널리 공지되어 있으며, 예를 들면, WO 96/02555, WO 99/33488 및 미국 특허 제 6,008,200 및 5,856,462에 기재되어 있다.
이러한 올리고뉴클레오티드 어쥬번트는 데옥시뉴클레오티드일 수 있다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 골격은 포스포로 디티오에이트 또는 포스포로티오에이트 결합이지만, 포스포디에스터 및 혼합된 골격 링키지를 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 PNA와 같은 다른 뉴클레오티드 골격이 또한 사용될 수 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로디티오에이트의 제조 방법은 미국 특허 제 5,666,153, 미국 특허 제 5,278,302 및 WO 95/26204에 기재되어 있다.
예시적인 올리고뉴클레오티드들은 다음 서열들을 가진다. 서열들은 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드 골격을 함유할 수 있다:
(서열 번호: 3) 올리고 1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826);
(서열 번호: 4) 올리고 2: TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758);
(서열 번호: 5) 올리고 3: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG;
(서열 번호: 6) 올리고 4: TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006); 및
(서열 번호: 7) 올리고 5: TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)
대안적인 CpG 올리고뉴클레오티드는 중요하지 않은 결실 또는 부가를 가진 상기 서열들을 포함한다. 어쥬번트로서 CpG 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 (예컨대, EP 468520) 합성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 올리고뉴클레오티드는 자동 합성장치를 사용하여 합성 될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드 어쥬번트는 10-50 염기 길이일 수 있다. 또 다른 어쥬번트 시스템은 CpG-함유 올리고뉴클레오티드 및 사포닌 유도체의 조합을 포함하며, 특히 CpG와 QS21의 조합은 WO 00/09159에 개시되어 있다.
많은 단일 또는 다중상 에멀전 시스템이 기재된 바 있다. 당업자는 에멀전이 항원 구조를 방해하지 않도록 하기 위하여 이러한 에멀전 시스템을 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물 항원과 함께 사용할 용도로 용이하게 개조할 수 있다. 수중유 에멀전 어쥬번트는 그 자체로 어쥬번트 조성물 (EP 399 843B)로서 유용한 것으로 제시된 바 있으며, 또한 수중유 에멀전과 다른 활성 물질의 조합 또한 백신에 대한 어쥬번트로서 기재된 바 있다 (WO 95/17210; WO 98/56414 WO 99/12565; WO 99/11241). 기타 오일 에멀전 어쥬번트, 가령, 유중수 에멀전 (U.S, 특허 제 5,422,109; EP 0 480 982 B2) 그리고 수중유중수 에멀전 (U.S. 특허 제 5,424,067; EP 0 480 981 B)가 기재되어 있다.
본원에 기술된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용하기 위한 오일 에멀전 어쥬번트는 천연 또는 합성 일 수 있고, 무기 또는 유기 일 수 있다. 무기 및 유기 오일들의 예는 당업자에게 용이하게 자명할 것이다.
수중유 조성물이 인간 투여에 적합하도록 하기 위해, 에멀전 시스템의 유상은 대사가능한 오일을 포함 할 수 있다. 용어 대사가능한 오일의 의미는 당업자에게 잘 공지되어 있다. 대사가능함은 “대사에 의해 변형될 수 있는 것”으로 정의될 수 있다 (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, W.B. Sanders Company, 25th edition (1974)). 오일은 수용자에게 유독하지 않고 대사에 의해 변형 될 수 있는 임의의 식물성 오일, 어유, 동물성 오일 또는 합성 오일 일 수 있다. 견과류 (가령, 땅콩 오일), 씨앗 및 곡물은 식물성 기름의 일반적인 공급원이다. 합성 오일 또한 사용될 수 있으며 상업적으로 이용가능한 오일, 가령, NEOBEE®및 다른 것들을 포함 할 수 있다. 스쿠알렌 (2,6,10,15,19,23- 헥사메틸-2,6,10,14,18,22- 테트라코사헥사엔)은 불포화 오일이며, 상어 간 기름에서 대량으로, 그리고 올리브 오일, 밀 배아 오일, 쌀겨 오일 및 효모에서 더 적은 양으로 발견되며, 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용될 수 있다. 스쿠알렌은 그것이 콜레스테롤의 생합성에서 중간체라는 사실 때문에 대사가능한 오일이다 (Merck index, 10th Edition, entry no.8619).
예시적인 오일 에멀전은 수중유 에멀전, 특히 수중스쿠알렌 에멀전이다.
또한, 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용하기 위한 오일 에멀전 어쥬번트는 항산화제, 가령, 오일 α-토코페롤 (비타민 E, EP 0 382 271 B1)을 포함할 수 있다.
WO 95/17210 및 WO 99/11241은 스쿠알렌, α-토코페롤, 및 TWEEN 80 (TM)에 기반한, 선택적으로 면역자극제 QS21 및/또는 3D-MLA와 배합된 에멀전 어쥬번트를 개시한다. WO 99/12565는 오일상에 스테롤을 첨가함에 의한 이들 스쿠알렌 에멀전의 개선을 개시하고 있다. 또한, 에멀전을 안정화시키기 위해 트리카프릴린 (C27H50O6)과 같은 트리글리세리드가 오일상에 첨가 될 수 있다 (WO 98/56414).
안정한 수중유 에멀전 내에서 발견되는 오일 방울의 크기는 1 마이크론 미만일 수 있고, 광자 상관 분광법으로 측정시 실질적으로 30-600 nm, 실질적으로 대략 30-500 nm 직경, 또는 실직절으로 150-500 nm 직경, 그리고 특히 약 150 nm 직경 범위일 수 있다. 이와 관련하여, 숫자로 오일 방울의 80%가 이 범위에 속할 수 있으며, 숫자로 오일 방울의 90% 이상 또는 95% 이상이 정의된 크기 범위에 속한다. 오일 에멀전에 존재하는 성분의 양은 통상적으로 2 내지 10% 오일, 가령, 스쿠알렌 범위이고; 존재하는 경우, 2 내지 10% 알파 토코페롤; 그리고 0.3 내지 3% 계면활성제, 가령, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레레이트 범위이다. 오일:알파 토코페롤의 비율은 1 이하 일 수 있으며, 이 때 보다 안정한 에멀전을 제공한다. SPAN 85 (TM) 또한 약 1% 수준으로 존재할 수도 있다. 일부 경우에, 본원에 개시된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 안정화제를 추가로 함유하는 것이 유리할 수 있다.
수중유 에멀전의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 유상을 PBS/TWEEN80 용액과 같은 계면활성제와 혼합한 다음 균질화기를 사용하여 균질화하는 단계를 포함하며, 상기 혼합물을 주사 바늘을 통해 2번 통과시키는 단계를 포함하는 방법이 작은 부피의 액체를 균질화함에 적합할 것임은 당업자에게 자명할 것이다. 마찬가지로, 미세 유동화장치에서의 유화 공정 (M110S 미세유동화 기기, 6 바의 최대 압력 입력 (약 850 바의 출력 압력)에서 2분의 기간 동안 최대 50회 통과)은 보다 작은 또는 보다 큰 부피의 에멀전을 생산하기 위해 당업자에 의해 조정될 수 있다. 이러한 조정은 필요한 직경의 오일 방울을 가진 조직표본이 구현될 때까지 생성된 에멀전의 측정을 포함하는 관례적인 실험에 의해 구현될 수 있다.
대안적으로, 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 키토산 (상기 기재됨) 또는 다른 폴리양이온성 중합체, 폴리락티드 및 폴리락티드-코글리콜라이드 입자, 폴리-N-아세틸 글루코사민계 중합체 매트릭스, 다당류 또는 화학적으로 변형된 다당류로 구성된 입자, 리포좀 및 지질계 입자, 글리세롤 모노에스터로 구성된 입자 등으로 구성된 백신 비히클과 함께 조합될 수 있다. 사포닌은 또한 콜레스테롤의 존재하에 제제화되어 리포좀 또는 ISCOM과 같은 미립자 구조를 형성 할 수 있다. 또한, 사포닌은 비-미립자 용액 또는 현탁액에서, 또는 파우클라멜라 리포좀 또는 ISCOM과 같은 미립자 구조에서 폴리옥시에틸렌 에터 또는 에스터와 함께 제제화 될 수 있다.
본 발명에 기재된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물에서 사용하기 위한 또 다른 예시적인 어쥬번트는 SAF (Chiron, Calif., 미국), MF-59 (Chiron, 예컨대, Granoff 외 (1997) Infect Immun. 65 (5):1710-1715 참고), SBAS 계열의 어쥬번트 (예컨대, SB-AS2 (MLA 및 QS21을 함유하는 수중유 에멀전); SBAS-4 (백반 및 MLA를 함유하는 어쥬번트 시스템), 벨기에, Rixensart, SmithKline Beecham사로부터 구입가능), Detox (Enhanzyn®(GlaxoSmithKline), RC-512, RC-522, RC-527, RC-529, RC-544, 및 RC-560 (GlaxoSmithKline) 및 다른 아미노알킬 글루코사미나이드 4-포스페이트 (AGPs), 가령, 출원 중인 U.S. 특허 출원 제 08/853,826 및 09/074,720에 기재된 것들을 포함한다.
다른 어쥬번트의 예에는, Hunter's TiterMax®어쥬번트 (CytRx Corp., Norcross, Ga.); Gerbu 어쥬번트 (독일, Gaiberg, Gerbu Biotechnik GmbH); 니트로셀룰로스 (Nilsson and Larsson (1992) Res. Immunol. 143:553-557); including 미네랄 오일, 비-미네랄 오일, 유중수 또는 수중유 에멀전을 포함하는 백반 (예컨대, 수산화 알루미늄, 인산 알루미늄) 에멀전계 제제, 가령, Montamide 어쥬번트의 Seppic ISA 계열 (예컨대, ISA-51, ISA-57, ISA-720, ISA-151, 등; 프랑스, Paris, Seppic); 및 PROVAX®(IDEC Pharmaceuticals); OM-174 (지질 A와 관련된 글루코사민 이당류); 리슈만편모충 연장 인자; 마이셀을 형성하는 비-이온성 블록 공중합체, 가령, CRL 1005; 및 Syntex 어쥬번트 제제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예컨대, O'Hagan 외 (2001) Biomol Eng. 18(3):69-85; 및 “Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols” D. O'Hagan, ed. (2000) Humana Press를 참고하라.
다른 예시적인 어쥬번트는 다음 일반식의 어쥬번트 분자를 포함한다: HO(CH 2CH2O)n-A-R, (I) 이 때, n은 1-50이고, A는 결합 또는 --C(O)--이고, R은 C1-50 알킬 또는 페닐 C1-50 알킬이다.
한 구체예는 일반식 (I)의 폴리옥시에틸렌 에터를 포함하는 백신 제제를 구성하며, 이 때 n은 1 내지 50, 4-24, 또는 9이고; R 성분은 C1-50, C4-C20 알킬, 또는 C12 알킬이고 A는 결합이다. 폴리옥시에틸렌 에터의 농도는 0.1-20%, 0.1-10%, 또는 0.1-1%이어야 한다. 예시적인 폴리옥시에틸렌 에터는 다음 군에서 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에터, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에터, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에터, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에터, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에터, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에터. 폴리옥시에틸렌 에터, 가령, 폴리옥시에틸렌 라우릴 에터는 Merck index (12판: entry 7717)에 기재되어 있다. 이들 어쥬번트 분자는 WO 99/52549에 기재되어 있다.
상기 일반식 (I)에 따른 폴리옥시에틸렌 에터는, 필요에 따라 또 다른 어쥬번트와 조합될 수 있다. 예를 들면, 어쥬번트 조합은 상기 기재한 CpG를 포함할 수 있다.
본 발명에 개시된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물과 함께 사용하기 적합한 제약학적으로 허용가능한 부형제의 추가 예들은 물, 포스페이트 완충 식염수, 등장성 완충 용액을 포함한다.
바이러스 정제
본 발명의 추가 양상은 지카 바이러스를 정제하는 방법에 관계한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 복수의 세포를 지카 바이러스의 개체군을 함유하는 접종물로 접종하고, 그리고 접종된 세포 중에서 하나 이상으로부터 지카 바이러스 클론 분리주를 플라크 정제에 의해 획득하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 비인간 세포 (예를 들면, 곤충 세포, 포유동물 세포 등)이다. 일부 구체예에서, 세포는 곤충 세포 (예컨대, 본원에서 설명된 임의의 모기 세포/세포주)이다. 일부 구체예에서, 세포는 포유동물 세포 (예컨대, 본원에서 설명된 임의의 포유동물 세포/세포주)이다. 일부 구체예들에서, 포유동물 세포는 원숭이 세포이다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스의 개체군은 이질성 (예를 들면, 둘 이상의 유전자형을 포함)이다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스의 개체군은 지카 바이러스 클론 분리주 (예를 들면, 계열 PRVABC59로부터) 및/또는 세포 배양 동안 이전에 계대된 하나 이상의 지카 바이러스를 포함한다. 일부 구체예에서, 플라크 정제 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은)는 이질성 바이러스 개체군으로부터 (유전적으로 균질한) 클론 분리주의 실제적인 및/또는 완전한 분리를 허용한다. 일부 구체예에서, 원숭이 세포는 VERO 세포주 (예를 들면, VERO 10-87 세포)로부터 유래된다. 일부 구체예에서, 접종물은 인간 혈청을 포함한다. 일부 구체예에서, 접종물은 하나 이상의 외래성 오염인자 (예를 들면, 하나 이상의 오염 바이러스)를 포함한다. 일부 구체예에서, 플라크 정제 (예를 들면, 본원에서 설명된 바와 같은)는 하나 이상의 외래성 오염인자로부터 멀리, (유전적으로 균질한) 클론 분리주의 실제적인 및/또는 완전한 정제를 허용한다.
일부 구체예에서, 지카 바이러스 클론을 단리하고 및/또는 정제하기 위한 설명된 방법은 지카 바이러스 클론 분리주의 1회 이상 (예를 들면, 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상 등)의 추가 플라크 정제를 포함한다. 일부 구체예에서, 지카 바이러스 클론 분리주를 단리하고 및/또는 정제하기 위한 설명된 방법은 지카 바이러스 클론 분리주를 1회 이상 (예를 들면, 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 5회 이상 등) 세포 배양액에서 (예를 들면, 곤충 세포, 예컨대 모기 세포주에서 및/또는 포유동물 세포, 예컨대 VERO 세포주에서) 계대하는 것을 포함한다.
본 발명의 추가 양상은 백신 또는 면역원성 조성물의 제조를 위해 지카 바이러스를 정제하는 방법에 관계한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 하기 단계 중에서 하나 이상 (예를 들면, 하나 이상, 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 또는 6개)을 포함한다 (하기 순서를 비롯한 임의의 순서로): 지카 바이러스를 함유하는 표본 또는 조직표본의 심층 여과를 수행하는 단계; 완충제 교체하고 및/또는 지카 바이러스를 함유하는 표본을 희석하여 (예를 들면, 직교류 여과 (CFF)에 의해) 농축물을 생산하는 단계; 지카 바이러스를 포함하는 표본을 이온 교환 막 (예를 들면, 음이온 교환 막, 양이온 교환 막)에 결합시켜 결합된 분획물 (여기서 결합된 분획물은 지카 바이러스를 포함한다)을 생산하고, 그리고 결합된 분획물을 이온 교환 막으로부터 용리하는 단계; 지카 바이러스를 함유하는 표본을 본원에서 설명된 임의의 화학적 불활성화 물질의 효과량으로 처리하는 단계; 화학적으로 비활성화된 지카 바이러스를 함유하는 표본을 메타중아황산나트륨으로 중화하는 단계; 및/또는 화학적으로 비활성화된 지카 바이러스를 포함하는 중화된 표본을 정제하는 단계 (예를 들면, 직교류 여과 (CFF)에 의해). 일부 구체예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 지카 바이러스를 함유하는 표본을 첫 번째 심층 필터에 통과시켜 첫 번째 용출액 (여기서 첫 번째 용출액은 지카 바이러스를 함유한다)을 생산하는 단계; (b) 완충제 교체하고 및/또는 첫 번째 용출액을 직교류 여과 (CFF)에 의해 희석하여 첫 번째 농축물 (여기서 첫 번째 농축물은 지카 바이러스를 함유한다)을 생산하는 단계; (c) 첫 번째 농축물을 이온 교환 막에 결합시켜 첫 번째 결합된 분획물 (여기서 첫 번째 결합된 분획물은 지카 바이러스를 함유한다)을 생산하고, 그리고 첫 번째 결합된 분획물을 이온 교환 막으로부터 용리하여 두 번째 용출액 (여기서 두 번째 용출액은 지카 바이러스를 함유한다)을 생산하는 단계; (d) 두 번째 용출액을 두 번째 심층 필터에 통과시켜 두 번째 농축물 (여기서 두 번째 농축물은 지카 바이러스를 함유한다)을 생산하는 단계; (e) 두 번째 농축물을 화학적 불활성화 물질의 효과량으로 처리하는 단계; (f) 처리된 두 번째 농축물을 메타중아황산나트륨으로 중화하는 단계; 그리고 (g) 중화된 두 번째 농축물을 직교류 여과 (CFF)에 의해 정제하는 단계.
심층 필터는 카트리지 또는 캡슐 형식으로, 가령, Bio 20 SEITZ®심층 필터 시트를 사용하는 SUPRACAP™계열의 심층 필터 캡슐 (Pall Corporation)과 함께 적용될 수 있다. 다른 적합한 심층 여과 기술 및 장치들은 당업계에 공지이며 Sartorius PP3 필터를 포함한다. 일부 구체예들에서, 심층 필터는 약 0.2μm a내지 약 3μm의 공극 크기를 가진다. 일부 구체예들에서, 심층 필터의 공극 크기는 다음 공극 크기 중 약 어느 하나 미만이다 (μm 단위): 3, 2.8, 2.6, 2.4, 2.2, 2.0, 1.8, 1.6, 1.4, 1.2, 1.0, 0.8, 0.6, 및 0.4. 일부 구체예들에서, 심층 필터의 공극 크기는 다음 공극 크기 중 약 어느 하나 초과이다 (μm 단위): 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 또는 2.8. 즉, 심층 필터의 공극 크기는 3, 2.8, 2.6, 2.4, 2.2, 2.0, 1.8, 1.6, 1.4, 1.2, 1.0, 0.8, 0.6, 및 0.4의 상한 그리고 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6, 또는 2.8의 독립적으로 선택된 하한을 가지는 범위의 공극 크기 (μm 단위) 일 수 있으며; 이 때 하한은 상한보다 작다.
상기 설명한 바와 같이, 양이온 교환 및 음이온 교환 크로마토그래피가 본 발명의 세포로부터 수확된 지카 바이러스를 정제하는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 정화된 바이러스 수확물은 염기화되고, 음이온 교환 막 상에 부하되고, 염 또는 pH에 의해 용리되고, 여과되고, 비활성화 될 수 있다. 이는 예시적인 방식 일 뿐이며, 당업자는 대체, 삭제, 삽입 또는 재정렬된 단계를 갖는 이의 변형을 용이하게 고려할 수 있다.
음이온 및 양이온 교환 크로마토그래피 모두는 이동상에서 하전된 관심 거대분자 (예를 들어, 바이러스)의 반대 전하를 갖는 기질로의 끌림에 의존한다. 양이온 교환 크로마토그래피에서, 음으로 하전된 시질 또는 막은 양으로 하전된 거대분자를 끌어당긴다. 음이온 교환 크로마토그래피에서, 양으로 하전된 시질 또는 막은 음으로 하전된 거대분자를 끌어당긴다. 일단 거대분자가 기질 상에 결합 또는 부하되면, 이들은 그 특성에 의존하는 방식으로 기질로부터 선형 또는 단계 방식으로 용리 될 수 있으며, 이에 의해 상이하게 하전된 분자의 분리를 수행 할 수있다. 이러한 원리는 다른 거대분자로부터 바이러스를 정제함에 사용될 수 있다. 이동상 완충제의 pH 또는 염 함량을 변화시킴으로써 용리가 이루어질 수 있다. 용리는 구배식 또는 단계식일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 용리는 이동상의 pH 변화를 사용하거나 이동상의 이온 강도 변화를 사용하여 (예를 들어, 염의 첨가를 통해) 이루어 질 수 있다. 제한 없이 염화 나트륨, 염화 칼륨, 황산 나트륨, 황산 칼륨, 황산 암모늄, 아세트산 나트륨, 인산 칼륨, 염화 칼슘 및 염화 마그네슘을 비롯한 다양한 염들이 용리에 사용된다. 특정 구체예들에서, 염은 NaCl이다. 다양한 적합한 완충제들은 당업계에 공지이며 본원에 기재된다. 이온 교환 크로마토그래피를 사용한 바이러스 정제 방법 또한 일반적으로 공지이며; 예컨대, www.pall.com/pdfs/Biopharmaceuticals/MustangQXT_AcroPrep_USD2916.pdf의 온라인에서 이용가능한 인플루엔자 바이러스의 정제를 참고하라.
양이온 교환 크로마토그래피 (선택적으로 여과 포함)에 적합한 당업계에 공지된 다양한 장치들이 적합하며, 예컨대, Mustang®S 시스템 (Pall Corporation)은 0.65μm 공극 크기의 양이온 교환 막을 사용한다. 제한 없이, 가교결합된 중합체 코팅에서 부속 설포닉 작용기를 비롯하여 다양한 작용기들이 양이온 교환 막에 사용된다. 본 발명의 지카 바이러스를 함유하는 용출액을 양이온 교환 막에 결합시키기 위하여 다양한 완충제들이 사용될 수 있다. 예시적인 완충제들에는, 제한 없이, 시트레이트 및 포스페이트 완충제 (추가 완충제는 하기 기재됨)가 포함된다. 일부 구체예들에서, 양이온 교환 크로마토그래피에서 (예컨대, 부하 및/또는 용리에서) 사용되는 완충제는 폴리소르베이트 (예컨대, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 또는 0.5%에서 TWEEN®-80)를 함유한다.
음이온 교환 크로마토그래피 (선택적으로 여과 포함)에 적합한 당업계에 공지된 다양한 장치들이 적합하며, 예컨대, Mustang®Q 시스템 (Pall Corporation)은 0.8μm 공극 크기의 음이온 교환 막을 사용한다. 또 다른 적합한 음이온 교환 막은 SartobindQ IEXNano이다. 제한 없이, 가교결합된 중합체 코팅에서 부속 4차 아민 작용기를 비롯하여 다양한 작용기들이 음이온 교환 막에 사용된다. 본 발명의 지카 바이러스를 함유하는 용출액을 음이온 교환 막에 결합시키기 위하여 다양한 완충제들이 사용될 수 있다. 예시적인 완충제들에는, 제한 없이, 포스페이트 완충제 (추가 완충제는 하기 기재됨)가 포함된다. 일부 구체예들에서, 음이온 교환 크로마토그래피에서 (예컨대, 부하 및/또는 용리에서) 사용되는 완충제는 폴리소르베이트 (예컨대, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 또는 0.5%에서 TWEEN®-80)를 함유한다. 일부 구체예들에서, 바이러스는 단계 용리, 예컨대, 250 mM NaCl, 500 mM NaCl 및 750 mM NaCl을 사용하여 용리된다.
백신 및/또는 면역원성 조성물의 제제 및 용량
본 발명의 추가 양상은 본원에서 설명된 지카 바이러스로부터 하나 이상의 항원을 함유하는 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 제제에 관계한다.
본원에서 설명된 지카 바이러스로부터 하나 이상의 항원을 함유하는 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 치료가 필요한 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료하거나 예방하고 및/또는 치료가 필요한 대상에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응, 예컨대 보호 면역 반응을 유도하는데 유용할 수 있다.
전형적으로, 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 액체 용액 또는 현탁액 중에서 어느 한 가지로서 주사가능물질로서 제조된다; 주사에 앞서 액체에서 용해, 또는 액체에서 현탁에 적합한 고체 형태 또한 제조될 수 있다. 이런 제조물은 또한, 유화되거나 또는 건성 분말로서 생산될 수 있다. 활성 면역원성 성분은 종종, 제제약학적으로 허용되고 활성 성분과 양립하는 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는 예를 들면, 물, 식염수, 덱스트로스, 수크로오스, 글리세롤, 에탄올, 또는 기타 유사한 것, 그리고 이들의 조합이다. 이에 더하여, 원하는 경우에, 백신 또는 면역원성 조성물은 보조 물질, 예컨대 침윤제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 백신 또는 면역원성 조성물의 유용성을 향상하는 어쥬번트를 함유할 수 있다.
백신 또는 면역원성 조성물은 전통적으로, 예를 들면, 피하, 경피, 피내, 피하 또는 근육내 주사 중에서 어느 한 가지에 의해 비경구 투여될 수 있다. 특정 구체예들에서 상기 조성물은 근육내 또는 피하 투여된다. 다른 투여 방식에 적합한 또 다른 제형으 좌약, 그리고 일부 사례에서, 구강, 경구, 비강내, 협측, 설하, 복막내, 질내, 항문 및 두개내 제제를 포함한다. 좌약의 경우에, 전통적인 결합제와 담체는 예를 들면, 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세리드를 포함할 수 있다; 이런 좌약은 0.5% 내지 10%, 또는 심지어 1-2%의 범위에서 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다.일정한 구체예에서, 낮은 용융 왁스, 예컨대 지방산 글리세리드 또는 코코아 버터의 혼합물이 먼저 용융되고, 그리고 본원에서 설명된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물이 예를 들면, 교반에 의해 균질하게 분산된다. 용융된 균질 혼합물을 이후, 편의하게 크기산정된 주형 내에 붓고, 그리고 냉각시켜 굳어지게 한다.
비강 내 전달에 적합한 제형은 액체 (예를 들어, 에어로졸 또는 비강 방울로 투여하기 위한 수용액) 및 건조 분말 (예를 들어, 코 통로 내부에의 빠른 침착을 위해)을 포함한다. 제제는 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 수 크로스, 트레할로스, 자일리톨 및 키토산과 같은 통상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 키토산과 같은 점막부착제는 비강 내 투여 제제의 점액섬모 청소를 지연시키기 위해 액체 또는 분말 제제로 사용될 수 있다. 만니톨, 소르비톨, 트레할로스 및/또는 수크로스와 같은 당은 액체 제제에서 안정성 물질로서 그리고 건조 분말 제제에서 안정성, 벌크화 또는 분말 유동 및 사이즈제로서 사용될 수있다. 또한, 어쥬번트, 가령, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 또는 이의 유도체, 또는 CpG 올리고뉴클레오티드는 액체 및 건조 분말 제제 모두에서 면역자극성 어쥬번트로 사용될 수 있다.
경구 전달에 적합한 제형은 액체, 고체, 반고체, 겔, 정제, 캡슐, 로젠지제 등을 포함한다. 경구 전달에 적합한 제형은 정제, 로젠지제, 겔, 액체, 식품, 음료, 기능식품 등을 포함한다. 제제는 예를 들어 제약 등급의 만니톨, 소르비톨, 트레할로스, 폴리올, 가령, 수크로스, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등과 같은 통상적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 다른 지카 바이러스 백신 및 면역원성 조성물은 용액, 현탁액, 알약, 서방형 제제 또는 분말의 형태를 취할 수 있으며 10-95%, 또는 25-70%의 활성 성분을 함유한다. 경구 제형의 경우, 콜레라 독소는 흥미로운 제제 파트너 (그리고 또한 가능한 접합 파트너)이다.
질 투여 용으로 제형화 될 때 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이의 형태 일 수 있다. 전술한 제형들은 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물 이외의 물질, 가령, 당업계에서 적절한 것으로 공지된 담체를 함유할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 전신 또는 국소 전달용으로 제형화될 수 있다. 이러한 제형은 당업계에 널리 공지이다. 비경구 담체에는, 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 젖산화 링거용액 및 고정 오일이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 정맥내 비히클들은 체액 및 영양소 보충제, 전해질 보충제, 가령, 링거 덱스트로스 등에 기반한 것들을 포함한다. 전신 및 국소 투여 경로에는, 예컨대, 피내, 국소 도포, 정ㅈ맥내, 근육내 등이 포함된다.
본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 투약형에 적합한 방식으로 그리고 치료적으로 유효한 그리고 면역원성이 되는 양으로 투여될 것이다. 항원의 용량은 특히, 약 1 μg 내지 약 100 μg, 약 1 μg 내지 약 40 μg, 약 1 μg 내지 약 30 μg, 약 1 μg 내지 약 20 μg , 약 1 μg 내지 약 15 μg, 또는 약 2 μg 내지 약 15 μg, 또는 약 5 μg 내지 약 15 μg, 또는 약 10 μg 내지 약 15 μg 범위일 수 있다. 용량은 특히 약 2 μg, 약 5 μg, 약 10 μg, 약 15 μg 또는 약 20 μg, 특히 약 10 μg 일 수 있다. 항원, 즉, 정제된 비활성화된 지카 바이러스의 양은 표준 곡선을 확립하기 위한 규정된 양의 재조합 지카 외피 단백질을 이용하여, Bradford 검정 (Bradford 외 (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254)에 의해 결정될 수 있다. 그러므로, 항원의 용량은 또한 지카 외피 단백질 E (μg Env)의 마이크로그램 (μg)으로서 지칭될 수 있다. 그러므로 μg 항원 및 μg Env은 본 발명에서 동일한 의미이다. 일부 구체예들에서, 백신 및/또는 면역원성 조성물은 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스 형태의 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 항원, 가령, 서열 번호:1의 위치 98에서 또는 본 발명에 기재된 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판의 글리신으로의 치환인 돌연변이를 가지는 지카 바이러스를 함유한다.
일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스 형태의 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 항원을 함유하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 균주 PRVABC59로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스 형태의 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 항원을 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59로부터 유래된다.
일부 구체예에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는 정제된 비활성화 전체 플라크 정제된 지카 바이러스 분리주 형태의 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 항원을 포함하고, 여기서 상기 지카 바이러스는 서열 번호: 2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59로부터 유래된다.
이러한 특정 구체예들에서 상기 백신 또는 면역원성 조성물은
약 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 바이러스
약 200 μg의 수산화 알루미늄,
완충제; 그리고 선택적으로
당, 가령, 수크로스를 포함한다.
초기 투여 및 추가 접종을 위한 적합한 섭생 역시 가변적이지만, 초기 투여, 그 이후에 후속 접종 또는 기타 투여로 전형화된다.
투여의 방식은 광범위하게 변할 수 있다. 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하기 위한 임의의 전통적인 방법을 사용가능하다. 이들은 고형의 생리학적으로 허용가능한 기재에 또는 생리학적으로 허용가능한 분산액에서의 경구 투여, 비경구로, 예컨대, 근육내 또는 피하 투여의 경우 주사 등에 의한 것, 등을 포함한다. 백신 또는 면역원성 조성물의 용량은 투여 경로에 따라 다를 것이고, 그리고 예방접종되는 대상의 연령 및 항원의 제형에 따라서 다를 수 있다. 백신 또는 면역원성 조성물은 본원에서 설명된 바와 같이, 0.5mL 이상, 0.5mL 또는 0.5mL 이하의 단위 용량 체적을 가질 수 있다. 예를 들면, 이것은 0.25mL의 체적으로 투여될 수 있다. 근육내 또는 피하 투여에 0.5mL 체적이 적합하다.
특히 비강내, 경구, 또는 폐 기반 전달 제형들의 경우 전달 및 면역원성을 개선하기 위하여 점막부착을 개선하는 전달 물질이 또한 사용될 수 있다. 이러한 한 화합물인 키토산은 키틴의 N-데아세틸화 형태로, 많은 제약학 제제들에서 사용된다. 이것은 점액섬모 청소를 지연시키고 점막 항원 흡수 및 처리에 보다 많은 시간을 걸리게 하는 능력으로 인해 비강내 백신 전달에 있어 흥미로운 점막부착제이다. 또한, 이것은 단단한 연결부를 일시적으로 개방시킬 수 있어, NALT로의 항원의 경상피 전달을 향상시킬 수 있다. 최근의 인간 시험에서, 추가 어쥬번트 없이 키토산과 함께 비강내로 투여된 3가 비활성화 인플루엔자 백신은 근육내 접종 후 얻은 것보다 단지 약간 더 낮은 혈청전환 및 HI 역가를 산출했다.
키토산은 또한 비강내에서 우수하게 기능하는 어쥬번트, 가령, 유전적으로 해독된 대장균 열-불안정성 장독소 돌연변이체 LTK63와 함께 제제화 될 수 있다. 이것은 키토산에 의해 부여되는 전달 및 부착상의 이점 외에 면역자극 효과를 더하여 점막 및 전신 반응을 향상시킨다.
마지막으로, 키토산 제형은 또한 건조 분말 형태로 제조 될 수 있음에 주목해야 하는데, 이는 백신 안정성을 개선시키고 액체 제형에 비해 점액섬모 청소를 더욱 지연시키는 것으로 나타났다. 이는 키토산과 함께 제제화된 비강내 건조 분말 디프테리아 톡소이드 백신과 관련된 최근의 인간 임상 시험에서 밝혀졌는데, 여기서 비강내 경로는 전통적인 근육내 경로만큼 효과적이었으며 분비 IgA 반응의 부가적인 이점이 있었다. 상기 백신은 또한 내약성이 매우 우수하였다. 키토산 및 MLA를 함유하는 탄저병에 대한 비강내 건조 분말 백신 또는 이의 유도체는 토끼에서 근육내 접종보다 더 강한 반응을 유도하고 또한 에어로졸 포자 공격접종에 대해 보호성이다.
비강내 백신은, 하부 호흡기에 영향을 미침에 더 우수한 비경구 투여 백신과 대조적으로, 상부 및 하부 호흡기에 영향을 줄 수 있으므로 예시적인 제형을 대표한다. 이것은 알레르겐-기반 백신에 대한 내성을 유도하고 병원체-기반 백신에 대한 면역을 유도하는데 유리할 수 있다.
비강내 백신은 상부 및 하부 호흡기 보호를 제공 할 뿐만 아니라 니들 접종의 합병증을 피하게 하고, 미립자 및/또는 가용성 항원과 비인두 관련 림프절 조직 (NALT)의 상호 작용을 통해 점막 및 전신의 체액성 및 세포성 반응을 유도하는 수단을 제공한다.
본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 제제약학적으로 허용된다. 이들은 상기 항원 및 어쥬번트 이외의 성분들을 포함할 수 있다, 예컨대, 이들은 전형적으로 하나 이상의 제제약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함할 것이다. 이러한 성분들에 대한 자세한 논의는 Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472에 기재되어 있다.
긴장성을 제어하기 위해, 생리학적 염, 예컨대, 나트륨 염을 포함시키는 것이 바람직하다. 염화나트륨 (NaCl)이 선호되는데, 이것은 1 내지 20 mg/ml로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 인산이나트륨 탈수물, 염화마그네슘, 염화칼슘 등을 포함한다.
본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 전형적인 완충제는 다음을 포함한다: 포스페이트 완충제; Tris 완충제; 붕산염 완충제; 숙신산염 완충제; 히스티딘 완충제 (특히, 수산화알루미늄 어쥬번트와 함께); 또는 구연산염 완충제. 완충제는 전형적으로, 5-20mM 범위로 포함될 것이다.
백신 또는 면역원성 조성물의 pH는 일반적으로, 5.0 및 8.5 사이 또는 5.0 및 8.1 사이, 그리고 더욱 전형적으로, 6.0 및 8.5 사이, 예를 들면, 6.0 및 8.0 사이, 6.5 및 8.0 사이, 6.5 및 7.5 사이, 7.0 및 8.5 사이, 7.0 및 8.0 사이, 또는 7.0 및 7.8 사이일 것이다. 본 발명의 제조 공정은 이런 이유로, 포장에 앞서 벌크 백신의 pH를 조정하는 단계를 포함할 수 있다.
백신 또는 면역원성 조성물은 바람직하게는 무균이다. 이것은 바람직하게는 비발열성이다, 예를 들면, 용량당 <1 EU (내독소 단위, 표준 척도), 그리고 바람직하게는 용량당 <0.1 EU를 함유한다. 이것은 바람직하게는 글루텐이 없다.
특정 구체예에서, 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은 효과 농도의 세정제를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 세정제의 효과량은 제한 없이, 약 0.00005% v/v 내지 약 5% v/v 또는 약 0.0001% v/v 내지 약 1% v/v를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 세정제의 효과량은 약 0.001% v/v, 약 0.002% v/v, 약 0.003% v/v, 약 0.004% v/v, 약 0.005% v/v, 약 0.006% v/v, 약 0.007% v/v, 약 0.008% v/v, 약 0.009% v/v, 또는 약 0.01% v/v이다. 이론에 한정됨 없이, 세정제는 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물을 용해 상태로 유지하는데 도움을 주고, 그리고 백신 및/또는 면역원성 조성물이 응집하는 것을 방지하는데 도움을 준다.
적합한 세정제는 예를 들면, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 계면활성제 ('Tweens'로서 알려져 있음), 옥톡시놀 (예컨대, 옥톡시놀-9 (Triton X 100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 ('CTAB'), 그리고 소듐 데옥시콜레이트를 포함한다. 세정제는 소량으로만 존재할 수 있다. 소량의 다른 잔여 성분은 항생제 (예를 들면, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B)일 수 있다. 일부 구체예에서, 세정제는 폴리소르베이트를 함유한다. 일부 구체예에서, 세정제의 효과 농도는 약 0.00005% v/v 내지 약 5% v/v의 범위를 포함한다.
백신 및/또는 면역원성 조성물은 바람직하게는, 2℃및 8℃사이에서 보관된다. 이들은 이상적으로는, 직사광이 닿지 않아야 한다. 항원 및 에멀전은 전형적으로 혼합물로 존재할 것이나, 처음에 즉석 혼합을 위한 별개 성분의 키트의 형태로 제공될 수 있을 것이다. 백신 및/또는 면역원성 조성물은 일반적으로, 대상에게 투여될 때 수성 형태일 것이다.
본 발명의 방법
본 발명은, 특히, 대상 또는 대상 개체군에 본 발명에 기재된 치료적 효과량의 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히, 예방 및/또는 지카 바이러스 질병 예방 방법에 관한 것이다.
이러한 질병은 일반적으로 경증이고 단기간이다. 일부 임상 소견은, 가벼운 열, 황반 발진, 결막염 및 관절통을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 임산부에서 경증 임상 증상에도 불구하고, 임신 중 지카 바이러스 감염은 태아 및 신생아의 심각한 결과와 관련이 있어 왔다. 이 질병의 중증도는 임신 중 지카 바이러스 감염 여성의 태아와 신생아에서의 결과와 관련이 있다. 선천성 지카 증후군 (CZS)으로 알려진 지카 바이러스 감염과 관련된 선천성 기형의 스펙트럼은 두개골이 부분적으로 붕괴된 심각한 소두증, 피질 석회화가 있는 대뇌피질, 황반 흉터 및 국소 색소성 망막 반점형성, 선천성 수축 및 추체외로 관련 증상을 수반한 두드러진 조기 근육긴장항진증으로 구성된다. 또한 지카 바이러스는 중추 신경계 내에서 질병을 유발할 수있는 신경성 플라비바이러스이다. 길랭-바레 증후군 (GBS)을 유발하는 지카 바이러스에 대하여 전세계적인 우려가 또한 존재한다.
따라서 지카 바이러스 질병의 예방은 치료되는 대상과 관련이 있을 뿐만 아니라 치료중인 대상이 임신 중이거나 임신 할 경우 태아 및 신생아까지 확대된다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 백신 또는 면역원성 조성물을 대상에게 투여함으로써 대상을 치료하는 것 및 임신 대상 또는 임신하고자 하는 대상 또는 임신 가능성이 있는 여성에게 백신 또는 면역원성 조성물을 투여함으로써 태아 및 신생아를 치료하는 것을 포함한다. 특히 대상은 인간이다.
본 발명의 또 다른 양상은 하나 이상의 지카 바이러스 (예컨대, 클론 지카 바이러스 분리주, 비-인간 세포 적응 돌연변이, 가령, 단백질 NS1에서의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스)로부터의 하나 이상의 항원들을 함유하는 본 발명에 기재된 백신 및/또는 면역원성 조성물을 사용하여, 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스를 치료 또는 예방 및/또는 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
이러한 특정 방법들에서, 백신 및/또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 또는 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스, 가령, 서열 번호:1의 위치 98에서 또는 본 발명에 기재된 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판의 글리신으로의 치환인 돌연변이를 가지는 지카 바이러스를, 선택적으로 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 300μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유한다.
이러한 특정 방법들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를, 선택적으로 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유하며, 이 때 지카 바이러스는 균주 PRVABC59에서 유래된다.
이러한 특정 방법들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를, 선택적으로 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유하며, 이 때 지카 바이러스는 서열 번호:2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59에서 유래된다.
이러한 특정 방법들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 플라크 정제된 지카 바이러스 분리주를, 선택적으로 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유하며, 이 때 지카 바이러스는 서열 번호:2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59에서 유래된다.
일부 구체예들에서, 본 발명은 하나 이상의 지카 바이러스 (예컨대, 클론 지카 바이러스 분리주, 비-인간 세포 적응 돌연변이, 가령, 단백질 NS1에서의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스)로부터의 하나 이상의 항원들을 함유하는 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 치료적 효과량을 필요로 하는 대상에 투여함으로써 이러한 대상의 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예들에서, 본 발명은 하나 이상의 지카 (예컨대, 클론 지카 바이러스 분리주, 비-인간 세포 적응 돌연변이, 가령, 단백질 NS1에서의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스)로부터의 하나 이상의 항원들을 함유하는 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 치료적 효과량을 필요로 하는 대상에 투여함으로써 이러한 대상의 지카 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 투여하는 단계는 개체에서 지카 바이러스에 대한 보호 면역 반응을 유도한다. 일부 구체예들에서, 대상은 인간이다. 일부 구체예에서, 대상은 임신했거나 또는 임신하고자 하거나 임신 가능성이 있는 여성이다.
본원에 개시된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 상기 백신을 비강내, 경구, 구강, 협측, 설하, 근육내, 복강내, 피내, 경진피, 진피하, 질내, 항문, 두개내, 정맥내, 경피 또는 피하 투여, 특히 근육내 투여에 의해 투여함으로써 바이러스 감염에 취약한 또는 이를 앓고 있는 대상 (예컨대, 포유동물, 가령, 인간)를 보호 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 전신 투여 방법은 통상적인 주사기와 니들, 또는 고형 백신의 탄도 전달을 위해 고안된 장치 (WO 99/27961), 또는 무바늘 압력 액체 제트 장치 (U.S. 특허 제 4,596,556; U.S. 특허 제 5,993,412), 또는 경피 패치 (WO 97/48440; WO 98/28037)를 포함할 수 있다. 본 발명의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 또한 피부에 도포될 수 있다 (경진피 또는 경피 전달 WO 98/20734; WO 98/28037). 그러므로 본 발명의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 지카 바이러스 백신 또는 면역원성 조성물이 사전-충전된, 전신 투여용 전달 장치를 포함할 수 있다. 따라서 선택적으로 어쥬번트 및/또는 담체를 포함하는 본 발명의 백신 또는 면역원성 조성물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 대상 (예컨대, 포유동물, 가령, 인간)에서 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방 및/또는 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 비경구 또는 전신 경로로 투여된다.
본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물은, 백신 또는 면역원성 조성물을 점막 경로, 가령, 구강/소화기 또는 비강 경로를 통해 투여함으로써 바이러스 감염에 취약한 또는 이를 앓고 있는 대상 (예컨대, 포유동물, 가령, 인간)를 보호 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 다른 점막 경로는 질내 그리고 직장내이다. 점막 투여 경로는 비강 경로를 통한 것일 수 있으며, 이는 비강내 백신접종으로 명명된다. 면역화될 개체의 비인두 내부로의 비말, 분사 또는 건조 분말 형태의 백신 투여를 포함한 비강내 백신접종 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 분무 또는 에어로졸화 백신 제형은 본원에 개시된 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물의 가능한 형태이다. 장용 제형, 가령, 경구 투여용 위 내성 캡슐 및 과립, 직장 또는 질 투여용 좌약은 또한 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물의 제형이다.
본 발명의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 경구 경로를 통해 투여될 수도 있다. 이러한 경우 제약학적으로 허용가능한 부형제는 또한 알칼리성 완충제, 또는 장용 캡슐 또는 마이크로과립을 포함할 수 있다. 본 발명의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 질 경로를 통해 투여될 수도 있다. 이러한 경우, 제약학적으로 허용가능한 부형제는 또한 질 크림 및 좌약에 관한 유화제, 중합체, 가령, CARBOPOL®그리고 다른 공지된 안정화제를 포함할 수 있다. 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물은 직장 경로를 통해 투여될 수도 있다. 이러한 경우 부형제는 또한 직장 좌약 형성용으로 당업계에 공지된 왁스 및 중합체를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 투여하는 단계는 1회 이상의 투여를 포함한다. 투여는 단일 투약 일정 또는 복수 투약 (일차 접종-추가 접종) 일정에 의할 수 있다. 복수 투약 일정에서 다양한 용량이 동일하거나 또는 상이한 경로, 예를 들면, 비경구 일차 접종 및 점막 추가 접종, 점막 일차 접종 및 비경구 추가 접종, 기타 등등에 의해 제공될 수 있다. 전형적으로 이들은 동일한 경로, 가령, 근육내 또는 피하 투여에 의해 제공될 것이다. 복수 투약은 전형적으로, 적어도 1 주 간격으로 (예를 들면, 약 1 주, 약 2 주, 약 3 주, 약 4 주, 약 5 주, 약 6 주, 약 7 주, 약 8 주, 약 9 주, 약 10 주, 약 11 주, 약 12 주, 약 16 주 등, 가령, 1 내지 16 주 간격) 투여될 것이다. 25-30 일 (예를 들면, 28 일, 4주) 간격의 2회 투약을 제공하는 것이 특히 유용하다. 이러한 특정 구체예에서, 투여 방식은 근육내 또는 피하 투여이다.
본 발명의 방법은 본 발명의 지카 바이러스 백신 및/또는 면역원성 조성물의 치료 효과량 또는 면역원성 양의 투여를 포함한다. 치료 효과량 또는 면역원성 양은 본 발명의 백신 및/또는 면역원성 조성물이 투여되는 감염되지 않은, 감염된 또는 노출되지 않은 개체에서 보호 면역학적 반응을 유도할 이들의 양일 수 있다. 이런 반응은 일반적으로, 개체에서 백신에 대한 분비성, 세포성 및/또는 항체-매개된 면역 반응의 발달을 유발할 것이다. 통상적으로, 이런 반응은 하기 효과 중에서 하나 이상을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다; 면역학적 분류, 예컨대 면역글로불린 A, D, E, G 또는 M 중 어느 하나로부터 항체의 생산; B와 T 림프구의 증식; 면역학적 세포에 활성화, 성장 및 분화 신호의 제공; 보조 T 세포, 억제 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포의 확대.
이러한 특정 방법들에서, 백신 및/또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스, 가령, 서열 번호:1의 위치 98에서 또는 본 발명에 기재된 서열 번호:1의 위치 98에 상응하는 위치에서 트립토판의 글리신으로의 치환인 돌연변이를 가지는 지카 바이러스를, 선택적으로 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유한다.
이러한 특정 방법들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를, 선택적으로 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유하며, 이 때 지카 바이러스는 균주 PRVABC59에서 유래된다.
이러한 특정 방법들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 지카 바이러스를, 선택적으로 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유하며, 이 때 지카 바이러스는 서열 번호:2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59에서 유래된다.
이러한 특정 방법들에서, 백신 또는 면역원성 조성물은 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 Trp98Gly 돌연변이를 포함하는, 1μg 내지 15μg, 또는 2μg, 또는 5μg 또는 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 플라크 정제된 지카 바이러스 분리주를, 선택적으로 하나 이상의 어쥬번트, 가령, 100 μg 내지 약 600μg 또는 약 150μg 내지 약 250μg 또는 약 200 μg 백반, 가령, 수산화 알루미늄과 조합하여 함유하며, 이 때 지카 바이러스는 서열 번호:2에 따른 게놈 서열을 포함하는 균주 PRVABC59에서 유래된다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 대상에서 지카 바이러스에 대하여, 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시, 10 초과, 또는 50 초과, 또는 100 초과, 또는 200 초과 또는 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 2000 초과, 또는 2000 초과, 또는 3000 초과의 중화 항체 역가 생성을 유도한다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 대상에서 지카 바이러스에 대하여, 리포터 바이러스 입자 중화 검사 (RVP)로 측정시, 300 초과, 또는 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 2000 초과, 또는 2000 초과, 또는 3000 초과, 또는 5000 초과, 또는 10,000 초과의 중화 항체 역가 생성을 유도한다.
이러한 특정 방법에서, 상기 중화 항체 역가는 투여 후 14 및/또는 28일에 구현된다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 후 14 및/또는 28일에 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가 생성은, 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시, 250 초과이다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 후 14 및/또는 28일에 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가 생성은, 리포터 바이러스 입자 중화 검사 (RVP)로 측정시, 1000 초과이다.
이러한 특정 방법에서, 상기 역가는 투여 후 14 및/또는 28일에 구현된다. 이러한 중화 항체 생성은 20 이상의 대상의 지카 바이러스 혈청음성 개체군에서 높은 혈청전환율을 제공한다. 이러한 특정 구체예에서 혈청전환율은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다.
이러한 특정 방법에서, 상기 역가는 투여 후 14 및/또는 28일에 구현된다. 이러한 중화 항체 생성은 개체군에서, 특히 20 이상의 대상의 지카 바이러스 혈청음성 개체군에서 높은 혈청양성 비율을 제공한다. 이러한 특정 구체예에서 혈청양성 비율은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다.
이러한 특정 방법에서, 혈청전환율 및/또는 혈청양성 비율은 투여 후 14 및/또는 28일에 구현된다.
이러한 특정 방법에서 심각한 유해 효과가 동시에 최소화되거나 발생하지 않는다. 이러한 특정 방법에서 39℃ 및 그 이상의 열은 발생하지 않는다.
본 발명의 방법에 따라 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 단일 투약으로 또는 복수 투약, 가령, 예컨대, 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로 투여된다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 단일 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 대상, 특히 플라비바이러스 나이브 대상에서, 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가는, 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시, 200 초과이다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 단일 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 특히 20 이상 대상의 플라비바이러스 나이브 개체군에서, 지카 바이러스에 대한 기하 평균 중화 항체 역가는, 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시, 200 초과이다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 단일 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 대상, 특히 플라비바이러스 나이브 대상에서, 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가는, 리포터 바이러스 입자 중화 검사 (RVP)로 측정시, 1000 초과이다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 단일 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에, 특히 20 이상 대상의 플라비바이러스 나이브 개체군에서, 지카 바이러스에 대한 기하 평균 중화 항체 역가는, 리포터 바이러스 입자 중화 검사 (RVP)로 측정시, 1000 초과이다.
이러한 중화 항체 생성은 단일 투약 또는 일차접종 투여 후 20 이상 대상의 플라비바이러스 나이브 개체군에 높은 혈청전환율을 제공한다. 이러한 특정 구체예에서 혈청전환율은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다.
이러한 중화 항체 생성은 단일 투약 또는 일차접종 투여 후 개체군에, 특히 20 이상 대상의 플라비바이러스 나이브 개체군에 높은 혈청양성 비율을 제공한다. 이러한 특정 구체예에서 혈청양성 비율은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다.
특정 방법에서 투여는 일차접종 및 추가접종 투여를 포함하고, 이 때 일차접종 및 추가접종 투여는 약 1 내지 약 16 주 간격으로 한다. 이러한 특정 구체예들에서, 제 2 (추가접종) 투여는 제 1 (일차접종) 투여 후 최소한 28일에 투여된다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 대상, 특히 플라비바이러스 나이브 대상에서, 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가는, 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시, 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 3000 초과이다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 특히 20 이상 대상의 플라비바이러스 나이브 개체군에서, 지카 바이러스에 대한 기하 평균 중화 항체 역가는, 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시, 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 3000 초과이다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 대상, 특히 플라비바이러스 나이브 대상에서, 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가는, 리포터 바이러스 입자 중화 검사 (RVP)로 측정시, 3000 초과, 또는 5000 초과, 또는 10000 초과이다.
이러한 특정 방법에서 백신 또는 면역원성 조성물의 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 특히 20 이상 대상의 플라비바이러스 나이브 개체군에서, 지카 바이러스에 대한 기하 평균 중화 항체 역가는, 리포터 바이러스 입자 중화 검사 (RVP)로 측정시, 3000 초과, 또는 5000 초과, 또는 10000 초과이다.
이러한 중화 항체 생성은 추가접종 투여 후 20 이상 대상의 플라비바이러스 나이브 개체군에 높은 혈청전환율을 제공한다. 이러한 특정 구체예에서 혈청전환율은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100%이다.
이러한 중화 항체 생성은 추가접종 투여 후 개체군에, 특히 20 이상 대상의 플라비바이러스 나이브 개체군에 높은 혈청양성 비율을 제공한다. 이러한 특정 구체예에서 혈청양성 비율은 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%이다.
특정 방법에 따른 대상 또는 대상 개체군은 지카 풍토병 지역 출신이다. 특정 방법에 따른 대상 또는 대상 개체군은 지카 풍토병 발병 대상 지역 출신이다. 특정 방법에 따른 대상 또는 대상 개체군은 플라비바이러스 나이브다.
특정 방법에 따른 대상 또는 대상 개체군은 지카 비-풍토병 지역 출신이다. 특정 방법에 따른 대상 또는 대상 개체군은 풍토병 지역을 여행하는 지카 비-풍토병 지역 출신이다. 특정 방법에 따른 대상 또는 대상 개체군은 플라비바이러스 나이브다.
특정 방법에 따른 대상 또는 대상 개체군은 히스패닉, 라틴계, 아메리칸 인디언, 알래스카 원주민, 아시아인, 흑인 또는 아프리카 계 미국인, 하와이 원주민 또는 백인 또는 이들의 혼합이다.
특정 방법에 따른 대상 또는 대상 개체군은 연령이 18 내지 29세이다.
특정 방법에 따른 대상 또는 대상 개체군은 연령이 30 내지 49세이다.
본 발명에 개시된 백신 또는 면역원성 조성물은 또한 본 발명에 개시된 방법에서의 용도에 관해 개시되어 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 개시된 방법을 위한 약제의 제조에 있어서의 본 발명에 개시된 백신 또는 면역원성 조성물의 용도를 개시한다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 비-인간 세포 적응된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물 투여 후 대상에서 유도된 보호 면역 반응은 비-인간 세포 성장에 대해 적응되지 않은 및/또는 상이한 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여한 상응하는 대상에서 유도된 면역 반응 보다 크다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 비-인간 세포 적응된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물 투여 후 대상에서 유도된 보호 면역 반응은, 비-인간 세포 성장에 대해 적응되지 않은 및/또는 상이한 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여한 상응하는 대상에서 유도된 면역 반응 보다 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%,적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 더 크다. 보호 면역 반응의 측정 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 비-인간 세포 적응된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물의 투여는 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 생성을 유도한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 비-인간 세포 적응된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물의 투여는, 비-인간 세포 성장에 대해 적응되지 않은 및/또는 상이한 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여한 상응하는 대상에서 유도된 중화 항체의 양보다 큰 양으로 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 생성을 유도한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 비-인간 세포 적응된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물의 투여는, 비-인간 세포 성장에 대해 적응되지 않은 및/또는 상이한 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여한 상응하는 대상에서 유도된 중화 항체의 양보다 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%,적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99% 큰 양으로 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체의 생성을 유도한다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 비-인간 세포 적응된 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물의 투여는, 비-인간 세포 성장에 대해 적응되지 않은 및/또는 상이한 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는 지카 바이러스를 함유하는 백신 및/또는 면역원성 조성물을 투여한 상응하는 대상에서 유도된 중화 항체의 양보다 적어도 약 1-배, 적어도 약 2-배, 적어도 약 3-배, 적어도 약 4-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 6-배, 적어도 약 7-배, 적어도 약 8-배, 적어도 약 9-배, 적어도 약 10-배, 적어도 약 100-배, 또는 적어도 약 1000-배 큰 양으로 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 생성을 유도한다. 대상에서 중화 항체 측정 방법은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다.
바람직하게는, 치료 효과량 또는 면역원성 양은 질병 증상의 치료 또는 예방을 가져오는데 충분하다. 약 2μg, 약 5μg 또는 약 10μg, 특히 약 10μg의 용량이 적합하다.
본 발명은 하기 실시예를 참조하면 더욱 충분히 이해될 것이다. 그러나 이들 실시예는, 본 발명의 임의의 양상 또는 범위를 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: 클론 지카 바이러스 균주 생성
본 실시예에서는 공지된 연구 이력을 갖는 지카 바이러스 (ZIKAV) 균주의 생산을 설명한다.
재료와 방법
Vero 세포 유지
한 바이알의 WHO Vero 10-87 세포를 수조에서 신속하게 해동시키고, 그리고 36℃±2℃, 5% CO2에서 T-75cm2 플라스크에서 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민 40mM 및 10% FBS를 함유하는 19mL 예열된 DMEM (Dulbecco의 변형된 최소 필수 배지) 내에 직접적으로 접종하였다. 세포를 합류상태까지 성장시키고 TryplE를 이용하여 계대배양하였다. 이 플라스크를 2개의 T-185cm2 플라스크로 확장시키고, 합류상태로 성장시키고, 그리고 31 xT-185cm2 플라스크로 계대배양하였으며 세포가 100% 합류상태에 도달할 때까지 성장시켰다. 세포를 트립신처리에 의해 수확하고, 800 x g에서 10 분 동안 원심분리하여, 10% FBS 및 10% DMSO를 함유하는 DMEM에서 1.9x107 세포/mL의 농도로 재현탁시켰다. 한 바이알의 Vero 세포를 신속하게 해동시키고 전술된 바와 같이 T-75cm2 플라스크에 소생시켰다. 이들을 13 x T-185cm2 플라스크에서 2회 계대배양하여 세포 은행을 생산하였다. 트립신처리 후, 이들 세포는 800 x g에서 원심분리되고, 그리고 동결 배지 (10% FBS 및 10% DMSO를 함유하는 DMEM)에서 4.68x105 세포/mL의 농도로 재현탁되었다. 이러한 세포 은행을 저온바이알에 분취하였다.
이들 Vero 세포를 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민 및 10% FBS를 함유하는 DMEM (cDMEM-10%-FBS)에서 성장시키고 유지시켰다. TryplExpress가 세포를 유지하고 트립신화하는데 이용되었다. 바이러스 흡착 2 일 전에, 6-웰 평판에 3 mL의 cDMEM-10%-FBS에서 4-5 x 105 세포/웰, 또는 T-25cm2 플라스크에 5 mL cDMEM-10%-FBS에서 7 x 105 세포, 또는 96-웰 평판에 0.1mL cDMEM-10%-FBS에서 1 x 104 세포/웰로 파종되었다. 지시된 온도를 유지하기 위해 배양기를 매일 모니터하였다. VERO 세포주는 액체 질소에서 보관되었다.
플라크 검정
바이러스 역가는 6-웰 평판에서 성장한 새로이 합류상태가 된 Vero 세포 단층에서 플라크 적정에 의해 결정되었다. 동결된 분취량을 해동시키고, 이들 분취량의 10 배 연속 희석액을 96-웰 평판에서 cDMEM-0%-FBS에서 만들었다. 희석된 바이러스는 Vero 세포 단층의 접종에 앞서 얼음에서 유지되었다. 검정 시점에, 성장 배지를 6-웰 평판으로부터 흡인하고, 100 μL의 각 바이러스 희석액을 웰에 첨가하였다. 세포 시트의 건조를 방지하기 위해 평판을 빈번하게 (10 분마다) 좌우로 흔들면서, 36℃±2℃, 5% CO2에서 60 분 동안 바이러스를 흡착시켰다. 바이러스 흡착 이후에, 40-41℃에서 유지된 4 mL의 첫 번째 아가로오스 오버레이 (1X cDMEM-2%-FBS + 0.8% 아가로오스)를 각 웰에 첨가하였다. 아가로오스를 실온에서 30 분 동안 굳힌 다음, 평판을, 36℃+/2℃, 5% CO2에서 4-6 일 동안 뒤집어서 배양하였다. 160 μg/mL의 중성 적색 생체 염료를 함유하는 2 mL의 두 번째 아가로오스 오버레이를 4 일차에 첨가하였다. 플라크를 5 일차 및 6 일차에 가시화하였다.
TCID50 검정에 의한 바이러스 정량
바이러스 역가는 96-웰 평판에서 성장한 새로이 합류상태가 된 Vero 세포 단층에서 적정에 의해 결정되었다. 동결된 분취량을 해동시키고, 이들 분취량의 10 배 연속 희석액을 96-웰 평판에서 cDMEM-2%-FBS에서 만들었다. 희석된 바이러스는 Vero 세포 단층의 접종에 앞서 얼음에서 유지되었다. 검정 시점에, 성장 배지를 96-웰 평판으로부터 흡인하고, 100 μL의 각 바이러스 희석액을 웰에 첨가하였다. 평판은 336℃+/2℃, 5% CO2에서 5 일 동안 배양되었다. 50% 조직 배양 감염 용량 (TCID50) 역가는 Reed/Muench 계산기를 이용하여 계산되었다.
검사 물품
지카 바이러스 균주 PRVABC59 (드라이아이스에서의 하나의 0.5 mL 바이알)를 미국 질병통제예방센터 (CDC)로부터 제공받았다. 지카 바이러스 식별은 RT-PCR을 통해 확인되었다. 상기 균주는 PCR에 의해 알파바이러스와 미코플라스마 오염에 대해 음성으로 검사되었다. 이러한 정보는 표 1에 요약된다.
표 1: PRVABC59 균주 정보
Figure pct00001
염기서열결정
제조업체 프로토콜에 따라 QIAampViral RNA 미니 스핀 키트를 이용하여, 각 분리주의 안정화된 바이러스 수확물로부터 RNA를 추출하였다. 각 분리주로부터 추출된 RNA를 이용하여 전체 지카 바이러스 게놈을 포괄하는 6개의 cDNA 단편을 생성하고 증폭시켰다. 증폭된 cDNA 단편을 1% 아가로오스/TBE 겔에서 크기와 순도에 대해 분석하고, 후속하여 Qiagen Quick Gel 추출 키트를 이용하여 겔 정제하였다. ABI 3130XL 유전자 분석장치 서열분석기를 사용하여 자동 염기서열결정 반응을 수행하였다. Lasergene SeqMan 소프트웨어를 이용하여 염기서열결정 데이터를 분석하였다.
결과
아메리카에서 현재 ZIKAV 발병과 관련되었던 공지된 연구 이력을 갖는 ZIKAV 균주를 구하였다. 이런 이유로, ZIKAV 균주 PRVABC59가 선택되었다. Vero 세포에서의 성장을 위해 적응된 충분히 특징화된 바이러스를 생성하기 위해, ZIKAV PRVABC59를 먼저, Vero 세포에서 증폭시켰다 (P1).
100% 합류상태의 Vero 세포 (T-175cm2) 플라스크를 4mL의 cDMEM-0%-FBS에서 0.01의 MOI로 감염시켰다. 바이러스를 36℃±2℃, 5% CO2에서 60 분 동안 단층에 흡착시키고, 이후 바이러스 증폭을 위해 20 mL의 cDMEM-0%-FBS를 36℃±2℃, 5% CO2에서 처리하였다. 접종 이후에 세포 층을 세포변성 효과 (CPE)에 대해 매일 모니터하였다 (도 1). 96 시간 후, 배지를 수집하고 원심분리 (600 x g, 4℃, 10 분)에 의해 투명하게 하여 상층액을 수확하였다. 트레할로스를 18% w/v의 최종 농도까지 첨가함으로써 수확물을 안정화시켰다. 벌크를 0.5mL 저온바이알에 분취하고 -80 ℃에서 보관하였다.
안정화된 P1 수확물을 Vero 세포 단층에서 감염성 바이러스의 존재에 대해 TCID50 검정으로 분석하였다. 0 시에서 시작하여 매일 분취량을 채취함으로써 성장 동역학을 모니터하였다. 피크 역가는 72 시에 도달되었다 (도 2).
6-웰 Vero 세포 단층에서 3 일차로부터 수확물을 적정함으로써 P1 물질을 플라크-정제하였다. 플라크를 6 일차에 가시화하였으며, 그리고 플라스틱 평판의 바닥에서 상이한 별개의 플라크 주변에 원을 그려 단리될 10개의 플라크가 식별되었다. 웰의 바닥을 긁어내고 cDMEM-10%-FBS로 헹구면서, 무균의 넓은 보어 피펫을 이용하여 아가로오스의 플러그를 추출함으로써 플라크를 선발하였다. 아가로오스 플러그를 0.5 mL의 cDMEM-10%-FBS에 첨가하고, 볼텍스처리하고, PRVABC59 P2a-j로서 표지하고, 36℃±2℃, 5% CO2의 배양기에서 하룻밤 동안 두었다.
3개의 플라크 (PRVABC59 P2a-c)를 추가 정제를 위해 옮겼다. 각 분리주를 새로운 Vero 세포 6-웰 단층 위에 적절하게 2회 도말하였다. 이러한 P2/P3 전이를 플라크 정제하고, PRVABC59 P3a-j로 표지하였다.
6개의 플라크 (PRVABC59 P3a-f)를 최종 라운드의 정제를 위해 옮겼다. 각 분리주를 새로운 Vero 세포 6-웰 단층 위에 적절하게 2회 도말하였다. 이러한 P3/P4 전이를 플라크 정제하고, PRVABC59 P4a-j로 표지하였다.
P4 플라크 정제로부터 얻은 6개의 플라크 (PRVABC59 P4a-f)를 T-25 cm2 플라스크에서 Vero 세포의 단층에서 블라인드 계대하였다. 각 플라크 선택물을 2 mL cDMEM-0%-FBS에 희석시켰다- 1 mL는 36℃±2℃, 5% CO2에서 1 시간 동안 흡착되었고; 다른 1 mL은 트레할로스 (18% v/v 최종)로 안정화되어 <-60℃에서 보관되었다. 바이러스 흡착 이후에, cDMEM-0%-FBS가 각 플라스크에 첨가되고 36℃±2℃, 5% CO2에서 4 일 동안 성장하게 두었다. 바이러스 상층액을 수확하고, 원심분리 (600 x g, 4℃, 10 분)하여 투명하게 하고, 18% 트레할로스에서 안정화시키고, 분취하여, <-60℃에서 보관하였다. 이러한 P5 씨드를 지카 바이러스 효능에 관한 TCID50에 의해 검사하였다 (도 3).
Vero 세포의 T-175cm2 플라스크의 합류상태 단층을 4mL cDMEM-0%-FBS에서 0.01의 MOI로 PRVABC59의 6개 클론 (P5a-f) 각각으로 감염시켰다. 상기 바이러스를 36℃±2℃, 5% CO2에서 60 분 동안 흡착되게 한 후, 20 mL의 cDMEM-0%-FBS를 각 플라스크에 첨가하고 36℃±2℃, 5% CO2에서 성장시켰다. Vero 세포 단층 건강과 CPE는 매일 모니터하였다. 바이러스는 지시된 바와 같이 3 일차 및 5 일차에 수확되었다 (도 4). 3 일차 및 5 일차의 P6 계열 수확물을 모으고, 18% 트레할로스로 안정화시키고, 분취하여, <-60℃에서 보관하였다.
PRVABC59의 6개 클론 (P6a-f) 각각을 지카 바이러스 시험관내 효능에 대해 검사하였다 (도 5). 상기 효능은 2가지 상이한 방법, TCID50 및 플라크 적정에 의해 결정되었다. TCID50은 CPE의 시각 검사 (현미경)에 의해, 그리고 적색 (CPE 없음)과 비교하여 CPE (황색)를 나타내는 웰의 흡광도 차이 (A560-A420)를 측정함으로써 계산되었다. 평판을 평판 판독기에서 판독하고, 현미경 판독-평판 (흡광도)과 동일한 계산기에 적용되었다. 이들 2가지 점수화 기법 간 TCID50 값은 상당히 유사한 반면, 플라크 적정에 의해 획득된 값은 더욱 낮다.
P6 바이러스의 생성 및 특징화의 요약은 아래 표 2에 도시된다.
표 2: 클론 ZIKAV 균주의 생성을 위한 바이러스 계대와 특징화의 요약
Figure pct00002
최초 분리주의 외피 당단백질 서열과 매우 유사한 단리된 지카 바이러스 클론을 구하였는데, 그 이유는 플라비바이러스의 외피 단백질이 상기 바이러스의 지배적인 면역원성 부분이기 때문이다. PRVABC59 클론 P6a, P6c, P6d와 P6f는 외피 잔기 330에서 Val→의 아미노산 돌연변이를 유발하는, 외피 영역 내에 뉴클레오티드 990에서 G→돌연변이 (G990T)를 함유하였고, 반면 PRVABC59 클론 P6b와 P6e의 외피 유전자는 표준 계열과 비교하여 동일하였다 (GenBank 참조 KU501215.1) (표 3 및 도 6).
표 3: PRVABC59 P6 클론의 염기서열결정
Figure pct00003
외피 서열에 돌연변이가 없는 2개의 클론을 이후, 전체 게놈 염기서열결정하였다. 염기서열결정 결과는 상기 표 3에 요약된다. 서열 분석 결과 두 클론 모두에 대해 NS1 영역의 뉴클레오티드 292에서 T→치환이 나타났으며, 이는 NS1 잔기 98에서 Trp→돌연변이를 유발하였다. 이러한 돌연변이는 또한, 심층 염기서열결정을 통해 추후 확증되었다. NS1 W98G 돌연변이는, 막 연관, 외피 단백질과의 상호작용 및 잠재적인 육합체 NS1 형성에 관여하는, ZIKAV NS1의 날개 도메인의 뒤얽힌 루프 (intertwined loop)에 위치한다. 다른 트립토판 잔기 (W115, W118)는 플라비바이러스의 전역에서 매우 보존되는 반면, W98은 그렇지 않다 (도 7). 하지만 흥미롭게도, 아프리카와 아시아 계통의 것들을 비롯한, 11가지 상이한 ZIKAV 균주 전반에 걸쳐 W98 잔기의 100% 보존이 관찰된다. 각 균주에서 확인된 돌연변이는 표 4에 요약된다.
표 4: PRVABC59 P6 클론에서 확인된 돌연변이들의 요약
Figure pct00004
이들 ZIKAV 클론을 특징화하기 위해 ZIKAV PRVABC59 P6 스톡의 표현형 분석이 수행되었다. 도 8에서 도시되고 도 9에서 정량된 바와 같이, 각 클론 분리주는 크고 작은 플라크의 혼합된 개체군을 가진 P1 바이러스와 비교하여, 상대적으로 균질한 큰-크기 플라크의 개체군으로 구성되었다. 이들 데이터는 단일 ZIKAV 클론의 성공적인 단리를 제시한다.
그 다음, ZIKAV PRVABC59 P6 클론의 Vero 세포에서 성장 동역학 분석물이 분석되었다. Vero 세포를 혈청 없는 성장 배지에서 0.01 TCID50/세포의 각 ZIKAV P6 클론으로 감염시켰다. 바이러스 상층액 표본을 매일 채취하고, 동시에 TCID50 검정하여 감염성 역가를 검정하였다. 모든 P6 클론의 경우에, 피크 역가가 3 일차 및 4 일차 사이에 발생하였다 (~9.0 log10 TCID50/mL). 다양한 P6 클론의 성장 동역학에서 어떤 유의미한 차이도 없었다 (도 10).
종합하면, 이들 결과는 지카 바이러스 씨드가 성공적으로 생성되었음을 나타낸다. 이러한 씨드 선별은 상기 바이러스의 성장 이력, 동역학, 수율, 유전자형 및 표현형에 관한 이해를 필요로 하였다. 중요하게는, 지카 바이러스 균주의 클론 단리는 오염 물질 (예컨대, 모체 인간 분리주 내에 있을 수 있는 외인성 오염인자)로부터 분리된, 상기 바이러스의 성공적인 정제를 가능하게 하였다. 흥미롭게도, 3번의 순차적 플라크 정제에서 Vero-세포 적응된 바이러스 (균주 P6a-f)가 성공적으로 빠르게 선별되었고, 여기서 이들 균주는 혈청 없는 Vero 세포 배양액에서 충분히 복제될 수 있었는데, 균주 P6a, c, d와 f는 바이러스 외피 단백질에서 돌연변이를 보유한 반면, 균주 p6b와 p6e는 바이러스 NS1 단백질에서 돌연변이를 획득하였다 (바이러스 외피에 대한 변형 없음). 추가적으로, Vero-적응된 균주는 이들 균주로부터 증식된 후속 바이러스 계대의 효율적이고 재현가능한 성장과 제조가 가능하였다. 이론에 한정됨 없이, 균주 P6a, c, d와 f에서 관찰된 Env-V330L 돌연변이는 잠재적으로, 시험관내 적응의 결과일 수 있는데, 그 이유는 Env 330에서 돌연변이가 Vero 세포에서 계대 시에도 관찰되었기 때문이다 (Weger-Lucarelli 외 2017. Journal of Virology). 외피 단백질이 지카 바이러스의 지배적인 면역원성 에피토프이기 때문에, Env에서 Vero 적응성 돌연변이를 함유하는 균주는 백신 면역원성에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 이론에 한정됨 없이, 단백질 NS1에서 적응 돌연변이는 바이러스 복제를 향상시킬 뿐만 아니라, 예컨대, 지카 바이러스의 외피 단백질 E (Env)에서 바람직하지 않은 돌연변이의 발생을 감소시키거나 또는 다른 방식으로 저해할 수 있는 것으로 보인다. 이에 더하여, NS1은 상기 바이러스의 생활 주기 동안 외피 단백질에 결합하는 것으로 공지될 수도 있다. 이러한 돌연변이 (NS1 W98G)는 하류 프로세싱 중에 상기 바이러스와 결합하고, 가능하게는 공동-정제되는 NS1의 능력 변화에 관계된 것일 수 있다. NS1은 또한, 면역원성인 것으로 알려져 있으며, 백신에 대한 면역 반응에 관계될 수 있을 것이다.
실시예 2: P6b와 P6e 균주로부터 유래된 정제된 비활성화 지카 바이러스 백신 (PIZV)의 전임상 면역원성 및 효능
하기 실시예는 CD1과 AG129 생쥐에서, P6b와 P6e 균주로부터 유래된 비활성화 지카 바이러스 백신 (PIZV)의 전임상 면역원성과 효능을 설명한다. 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 유행병과 유관한 PRVABC59 균주로부터 6개의 클론을 생성하였으며, 2개 (P6b와 P6e)가 추가 전임상 면역원성 및 효능 연구를 위해 선택되었다.
재료와 방법
정제, 비활성화 및 지카 바이러스 백신의 조제
전임상 면역원성 및 효능 연구에 이용하기에 적합한 많은 비활성화 ZIKAV 백신을 생성하고 특징화하였다. 바이러스를 P6b와 P6e 균주로부터 합류상태 Vero 세포의 플라스크를 0.01의 MOI로 감염시킴으로써 증폭시켰다. 바이러스는 36℃± 2℃/ 5% CO2에서 1 시간 동안 흡착되었다. 흡착 이후에, 20 mL의 cDMEM-0%-FBS를 각 플라스크에 첨가하고, 36℃±2℃/ 5% CO2에서 5 일 동안 배양하였다. 세포 상층액을 감염후 3 일차 및 5 일차에 수확하였고, 세포 조직파편은 원심분리에 의해 투명해졌다.
각 분리주에 대해, 투명해진 상층액들을 모으고, 18% 트레할로스를 함유하는 DMEM에서 안정화시키고, <-60℃에서 보관하였다. 모으고, 투명해진 바이러스 상층액을 37℃수조에서 해동시키고 4℃에서 하룻밤 동안 벤조나아제 처리하였다. 벤조나아제 처리 이후에, 각 표본을 Sartorius PP3 심층 필터에 처리하였다. 심층 여과 이후에, 각 표본은 Centricon Plus-70 접선 유동 여과 (TFF) 장치로 처리하였다. 잔류액을 완충제 교환처리 하고, 희석시켜, Sartorius SartobindQ IEXNano에 처리하였다. 각 표본을 두 번째 Sartorius SartobindQ IEXNano에 처리하고, 그리고 250 mM, 500 mM 및 750 mM NaCl의 3 단계-용리 과정을 이용하여 용리시켰다. MonoQ 크로마토그래피 및 희석 이후에, 각 250 mM 용출액을 완충제 교체를 위해 Centricon Plus-70 직교류 여과 (CFF) 장치에 처리하고, PBS로 35 mL까지 희석시키고, 2-8℃에서 보관하였다.
포르말린 비활성화를 위해, 각 정제된 표본에 새로이 제조된 1% 포름알데히드를 부드럽게 빙빙 돌리면서 0.02%의 최종 포름알데히드 농도가 얻어질 때까지 점적하여 첨가하였다.표본은 실온 (~22℃에서 14 일 동안 매일 반전시키면서 배양하였다. Centricon Plus-70 접선 유동 여과 (TFF) 장치에 처리하기 전, 포름알데히드를 실온에서 15' 동안 메타중아황산나트륨으로 중화시켰다. 완충제 교체는 50 mL의 원료의약품 완충제 (10 mM NaH2PO4 , 50 mM NaCl, 6% 수크로스, pH 7.4)를 첨가하여 4회 수행되었다. 각 표본은 이후, 원료의약품 완충제로 15 mL까지 희석되고, 0.2m 주사기 필터를 이용하여 살균되고, 마개가 있는 무균 유리 바이알에 분취하고 (바이알 당 0.5 mL), <-60℃에서 동결시켰다.
바이러스 비활성화를 TCID50 검정 및 이중 감염성 검정에 의해 확증하였다. 간단히 말하면, 원료의약품 표본을 C6/36 세포에 처리하고 6 일 동안 증폭시켰다. C6/36 세포의 상층액을 Vero 세포에 처리하고, CPE를 8 일 동안 모니터하였다. 의약품 조제를 위해, PIZV 원료의약품의 바이알을 해동시키고, 표본 유형에 따라 모으고, 알하이드로겔 (Brenntag ; 0.5 mg/mL 최종, 0.050 mg/용량)이 있거나 없는 PBS에서 1 μg/mL 또는 10 μg/mL까지 희석시키고, 부드럽게 교반하면서 2-8℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 생성된 의약품 로트를 이후, 마개가 있는 무균 유리 바이알에 분취하고 이용시까지 2-8℃에서 보관하였다. 도 11은 의약품을 제조하는데 사용된 단계들의 요약을 제공한다.
생쥐 면역화와 공격접종
면역원성 연구를 위해, 6-주령 수컷과 암컷 Swiss-ICR (CD-1) 생쥐를 6개 군 (n = 10/군)으로 나누었다. 0 일차에, 군 1-5의 생쥐에 0.1 mL의 백신을 근육내 (i.m.) 경로 (2 x 0.05 mL 주사)로 접종하였다. 군 6의 생쥐에는 위약 대조로서 PBS를 접종하였다. 0 일차와 동일한 용량과 백신 유형을 이용하여 28 일차 및 56 일차에 생쥐를 추가 접종하였다. -1 일차 (면역전), 27 일차 (일차 접종), 42 일차 (추가 접종 1) 및 70 일차 (추가 접종 2)에 혈액 표본을 수집하였다.
면역원성 및 효능 연구를 위해, 4-주령 수컷과 암컷 AG129 생쥐들을 7개 군 (n = 5/군)으로 나누었다. 0 일차에, 군 1-6의 생쥐에 0.1 mL의 백신을 근육내 (i.m.) 경로 (2 x 0.05 mL 주사)로 접종하였다. 군 7의 생쥐에는 위약 대조로서 PBS를 접종하였다. 0 일차와 동일한 용량과 백신 유형을 이용하여 28 일차에 생쥐를 추가 접종하였다. -1 일차 (면역전), 27 일차 (일차 접종), 및 55 일차 (추가 접종)에 혈액 표본을 꼬리 혈관으로부터 수집하였다. 안락사 시점에서, 생쥐는 아이소플루오레인으로 깊은 마취 하에 심장 천자를 통해 채혈되었다 (최종). 56일차에, 104 플라크 형성 단위 (PFU)의 ZIKAV PRVABC59를 생쥐에게 복막내 공격접종하였다.
혈청 전달
PIZV-예방접종된 및 공격접종된 AG129 생쥐로부터 혈청을 수집하고, 그리고 모은 후 동결시켰다 (표 6의 군 1, 2, 4 및 5). 혈청 풀을 해동시키고, PBS에서 혈청 풀을 3 배 희석하여 검사 품목들을 생성하였다. 위약은 PBS에서 AG129 정상 생쥐 혈청의 3-배 희석을 이용하여 생성하였다.
검사 품목을 AG129 생쥐에 0.1 mL 복막내 주사로서 투여하였다 (동등 체적의 위약 품목을 대조 생쥐에게 투여하였다). 이후, 100μL에서 104 플라크 형성 단위의 지카 바이러스 균주 PRVABC59를 생쥐에게 복막내 공격접종하였다.
-11 일자 (면역화전)에 10마리 생쥐로부터 꼬리 채혈하여 허용가능한 혈액 체적 중량을 전혈로서 수집하였다. 1 일차 (일차, 순환 Nab) 및 4 일차 (바이러스혈증)에 각 생쥐로부터 꼬리 채혈에 의해 전혈을 수집하였다. 경부 탈구하여 안락사시키기 전 보다 큰 체적을 위해 치명적인 공격접종 후 최종 채혈을 깊은 마취하에 심장 천자하여 실시하였다. 혈액 표본을 마이크로테이너 SST 혈청 분리 겔 튜브에 수집하고, 적어도 30 분 동안 응고시킨 후, 원심분리 (10,000 x g 2 분 동안)하여 혈청을 분리하고, -80℃에서 동결시켰다.
플라크 감소 중화 검사
중화 항체 역가는 기존 문헌에서 설명된 바와 같은 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정되었다 (예를 들면, Osorio 외 Lancet Infect Dis. 2014 Sep;14(9):830-8 참조).
리포터 바이러스 입자 (RVP) 중화 검정
96-웰 평판에서 성장한 Vero 세포에서 일정한 양의 지카 RVPs로 혈청 표본을 적정하여 중화 항체 역가를 분석하였다. RVPs는 지카 (계열 SPH2012)의 prME 단백질 및 뎅기-기초된 레닐라 루시페라아제 리포터를 함유하였다. 간단히 말하면, 혈청을 56 ℃에서 30 분 동안 열 비활성화시키고, 희석시킨 후, 37℃에서 RVPs와 함께 배양하였다. 이후 혈청/RVP 혼합물을, Vero 세포와 혼합하고, 37℃± 2℃, 5% CO2에서 72 시간 동안 배양한 다음, 루시페라아제 기질로 검출하였다. 양성 추적 대조에 대해 정규화된 JMP11 비선형 4 파라미터 분석을 이용하여 데이터를 분석하였으며, 유효 용량 50% (EC50)를 기록하였다.
반대의 지시가 없는 한, 모든 추가 실험 방법은 상기 실시예 1에 설명된 바와 같이 실시되었다.
결과
6 주령 수컷과 암컷 CD-1 생쥐에서 PIZV 후보의 면역원성을 평가하기 위해, CD-1 생쥐의 군 (N=10/군)을 i.m. 경로로, ZIKAV PRVABC69 P6b 또는 P6e 바이러스 균주 중에서 어느 하나에서 유래한 0.1 μg (+ 백반), 1.0 μg (+ 백반) 용량의 백신 중 어느 한 가지로 면역화시켰다. 어쥬번트에 대한 필요성을 평가하기 위해, P6e으로부터 유래되고 백반 어쥬번트가 없는 0.1 μg의 백신을 하나의 동물 군에 예방접종하였다. 예방접종은 0, 28 및 56 일차에 일어났으며, 군 6에는 위약 대조로서 PBS를 제공하였다 (도 12A 및 표 5).
표 5: CD-1 생쥐에서 PIZV 제제와 공격접종
Figure pct00005
예방접종 이후에, 일차 (27 일차), 이차 (40 일차) 및 삼차 (70 일차) 면역화 후 수집된 혈청 표본을 ZIKAV-특이적 중화 항체에 대해 RVP 중화 검정하여 검사하였다 (도 12B). 첫 번째 투약을 제공받은 후 27 일차에, 어느 한쪽 클론으로부터 유래된 백반을 함유하는 PIZV를 예방접종한 생쥐에서 PBS 위약 대조군과 비교하여 약간의 중화 항체 반응이 관찰되었다. 중요하게는, 이러한 반응은 두 번째 면역화 (40 일차) 시에는 유의미하게 증가하였지만, 세 번째 투약 (70 일자)으로 면역화 시에는 추가적으로 향상되지 않았다. 어쥬번트 처리되지 않은 백신을 예방접종한 생쥐에서는 어떤 중화 항체 반응도 관찰되지 않았다 (도 12B).
PIZV 후보의 면역원성 및 보호 효능을 평가하기 위해, 4 주령 AG129 생쥐의 군 (n=5/군)을 1 일차 및 28 일차에 ZIKAV PRVABC59 P6b 또는 P6e 스톡 중에서 어느 한 가지로부터 유래된 0.1 μg 용량 (+ 백반), 1.0 μg 용량 (+ 백반) 또는 0.1 μg 용량 (- 백반)의 백신 중에서 어느 한 가지로 i.m. 경로로 면역화시켰다 (도 13A 및 표 6).
표 6: AG129 생쥐에서 PIZV 제제와 공격접종
Figure pct00006
예방접종 이후, 56 일차에 예방접종된 생쥐 및 대조 생쥐를 104 PFU의 ZIKAV PRVABC59 (낮은 계대)로 복막내 공격접종하였다. 일차 (D27) 및 이차 (D55) 면역화 후 수집된 혈청 표본을 ZIKAV-특이적 중화 항체 반응에 대해 검사하였다 (도 13B 및 표 7). 단일 면역화 이후, 높은 용량의 백반-어쥬번트 처리된 백신을 제공받은 군 (군 2와 5)만 중화 항체 반응을 이끌어 냈으며, 상기 반응은 추가 접종 후 두드러지게 증가하였다. 대조적으로, 낮은 또는 높은 용량 중 어느 하나의 백반-어쥬번트 처리된 백신을 제공받은 군은 두 번째 투약 후 높은 중화 항체 반응을 생성하였다. 2회 백신 투약을 제공받았을 때, 용량 또는 P6 클론으로부터의 유도여부와 상관없이, 백반-어쥬번트 처리된 백신을 제공받은 생쥐 군들 사이에는 통계학적 차이가 없었다.
표 7: ZIKAV-특이적 중화 항체 반응
Figure pct00007
또한 공격접종후 21 일 동안 사망률, 이환율 및 체중 감소에 대해 모든 군을 모니터하였다. 공격접종 이후 바이러스혈증을 플라크 적정에 의해 검출하고 정량하였다. 백반과 함께 제제화된 낮은 또는 높은 용량의 PIZV 후보로 예방접종한 생쥐 (군 1, 2, 4 및 5)는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT) 검정, 뿐만 아니라 이에 필적하는 이차 중화 검정에 의해 평가시, 치명적인 ZIKAV 공격접종으로부터 완전히 보호되었다 (표 8). 예방접종한 생쥐에서 체중 감소 또는 질병의 임상적 징후가 전혀 관찰되지 않았고, 공격접종후 3 일에 이들 생쥐에서 감염성 바이러스혈증이 전혀 검출되지 않았고, 그리고 낮은 또는 높은 용량 항원 + 백반 어쥬번트 중에서 어느 한 가지로 예방접종한 모든 생쥐는 공격접종후 21 일까지 생존하였다 (도 14-16). 대조적으로, 모든 나이브 생쥐의 공격접종은 공격접종후 2 일차에서 높은 바이러스혈증, 그리고 공격접종후 10 일차와 18 일차 사이에서 높은 이환율/사망율 (중앙 생존값= D13)을 초래하였다. 추가적으로, 균주 P6b로부터 유래된 백반-어쥬번트 비처리된 낮은 용량 백신을 예방접종한 생쥐의 공격접종은 공격접종후 2 일차에서 높은 바이러스혈증 및 위약 대조군과 유사한 중앙 생존일 값을 초래하였던 반면, 클론 e로부터 유래된 백반-어쥬번트 비처리된 낮은 용량을 예방접종한 생쥐는 부분적으로 보호된 상태로 유지되었으며, 중앙 생존값은 19 일이었다. 이들 결과는 백반이 있는 면역화가 더욱 효과적이고, 이차 면역화는 요건이 될 수도 있으며, 낮은 용량이 높은 용량만큼 효과적임을 나타낸다.
표 8: 혈청 중화 항체 역가
Figure pct00008
추가적으로, 전체 비활성화된 P7b와 P7e 바이러스 (각각, P6b와 P6e 균주로부터 1회 추가 계대)로부터 생산된 백신 원료의약품 (DS)에서 NS1의 존재를 검사하였다. 지카 바이러스 NS1의 아시아와 아프리카 계통 둘 모두에 반응성이지만, 뎅기 NS1에 비-교차반응성인 단일클론 항체로 예비 코팅된 평판을 이용하여 샌드위치 ELISA를 수행하였다. DS의 2-, 4-, 8-, 16- 및 32-배 희석 복제물을 제조하고, 0-8 ng/mL 농도의 재조합 정제된 NS1을 2번 이용하여 표준 곡선과 비교하였다. DS 완충제 단독의 희석 복제물을 음성 대조로서 제조하였다. 결합된 NS1은 항-NS1 HRP-접합체로 검출되었고, 그리고 정합 DS 표본을 함유하는 웰에서 계측된 흡광도로부터 DS 완충제만을 포함하는 웰의 흡광도 (A450-A630)를 감산하였다. 샌드위치 ELISA의 결과는 아래의 표 9에 나타낸다. 흥미롭게도, NS1은 백신 원료의약품 제조물과 공동-정제되는 것으로 관찰되었는데, 이것은 바이러스 NS1이 전체 비활성화된 바이러스 백신의 면역원성 성분일 수 있음을 제시한다.
표 9: NS1 ELISA
Figure pct00009
항체의 수동 전달 후 야생형 지카 바이러스 공격접종으로부터 보호를 부여하는데 필요한 중화 항체 (Nab)의 역치를 그 다음 검사하였다. (표 10A 및 B).
표 10A: AG129 생쥐에서 수동 전달 연구의 설계
Figure pct00010
표 10B: AG129 생쥐에서 수동 전달 연구의 시기
Figure pct00011
예방접종된 및 공격접종된 AG129 생쥐로부터의 혼합 혈청을 PBS에서 3-배 연속 희석시키고 5-6 주령 AG129 생쥐의 7개 군 (N=5/군)에 복막내 주사하였다. 면역전 AG129 생쥐 혈청을 위약 대조 (군 8)로서 이용하였다. 수동 전달 이후에 (~16-19 시간 후), 전혈을 수집하였고, 순환하는 중화 항체 역가의 결정을 위한 바이러스 공격접종에 앞서 각 생쥐의 혈청을 원심분리하여 분리하였다 (도 17). 바이러스 공격접종 직전에, 생쥐의 군 (군 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8로서 지정됨)은 각각, 2.69, 2.26, 1.72, 1.30, <1.30, <1.30, <1.30, <1.30의 평균 log10 중화 항체 역가를 가졌다.
ZIKV nAbs의 수동 전달 후 24 시에, 생쥐에게 104 pfu의 ZIKV PRVABC59를 복막내 공격접종하였다. 공격접종 후, 동물들을 매일 계량하고 28일 동안 질병의 징후에 대해 하루 1-3회 모니터하였다. 증상에 근거하여 각 동물에 임상 점수가 제공되었다 (표 11). 빈사 및/또는 명백한 신경학적 징후 (임상적 점수 ≥2)를 보여주는 동물은 인도적으로 안락사되고 비-생존자로서 계수되었다.
표 11: 이환율과 사망률에 대해 모니터하는 동안 제공된 임상적 점수에 관한 설명
Figure pct00012
질병 징후는 대조군 (군 8) 및 군 5-7에서 공격접종 후 9 일차에, 상응하는 체중 상실과 함께 나타나기 시작하였다 (도 18). 공격접종후 3 일에 전혈을 수집하고, 각 동물로부터 원심분리에 의해 혈청을 분리하였다. 플라크 적정 검정을 이용하여 감염성 ZIKV의 존재에 대해 혈청 표본을 분석하였다 (도 19). 군 1-8의 생쥐에 대한 평균 감염성 역가 (log10 pfu/mL)는 각각, 1.66, 2.74, 4.70, 4.92, 7.24, 7.54, 7.54 및 7.46이었다. 중요하게는, 검출가능한 수준의 ZIKV 중화 항체 (≥1.30 log10)를 갖는 군 1-4의 생쥐는 대조 생쥐보다 통계학적으로 유의한 더욱 낮은 수준 (102.5- 내지 106.0-배 낮은 역가)의 바이러스혈증을 가졌다 (p = 0.0001, 0.0003, 0.0007 및 0.0374). 이들 결과는 검출가능한 수준의 ZIKV 중화 항체 (≥1.30 log10)가 바이러스혈증을 용량 의존 방식으로 감소시킨다는 것을 제시하였다.
군 1-8의 생쥐의 중앙 생존일은 각각, 측정되지 않음, 17 일, 17 일, 13 일, 11 일, 11 일, 11 일, 그리고 10 일이었다 (도 20). 중요하게는, 검출가능한 ZIKV 중화 항체 역가를 갖는 생쥐군 (군 1-4)에 대한 생존 곡선은 대조군 (군 8)과 비교하여 통계학적으로 상이하였다 (각각, p = 0.0019, 0.0019, 0.0019, 0.0153). 이들 결과는 검출가능한 수준 (≥1.30 log10)의 ZIKV 중화 항체가 질병의 발병을 용량 의존 방식으로 지연시킨다는 것을 제시하였다.
최종적으로, 각 동물의 ZIKV 중화 항체 역가를 이의 상응하는 바이러스혈증 역가에 대해 도표화하였으며, 선형 회귀 분석을 수행하였다. 공격접종후 3 일차에 ZIKV 중화 항체 역가 및 바이러스혈증 수준 사이에서 높은 역 상관관계가 관찰되었다 (도 21). 수동 전달 연구로부터 얻은 결과의 요약은 아래의 표 12에 도시된다.
표 12: 수동 전달 결과의 요약
Figure pct00013
ZIKAV 중화 항체를 제공받은 생쥐군 모두 본 실험에서 치명적인 ZIKAV 공격접종으로부터 완전히 보호되지 못하였으나, 검출가능한 수준의 순환하는 ZIKAV 중화 항체 역가를 갖는 생쥐군들 사이에서는 용량 의존 방식의, 바이러스혈증 수준 감소 및 질병의 발병 지연이 증명되었다.
종합하면, CD-1과 AG129 생쥐 연구 둘 모두로부터 얻은 전임상 데이터는, 별개의 충분히 특징화된 바이러스 클론으로부터 유래된 PIZV가 면역원성이며, 야생형 ZIKAV의 공격접종에 대항한 보호를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 중요하게는, 낮은 및 높은 백신 용량은 2회 투약 후 유사한 중화 항체 반응을 유도하였고, 치명적인 ZIKAV 공격접종에 대항하여 유사한 수준의 보호를 제공하였다. 흥미롭게도, 어쥬번트 처리되지 않은 PIZV 후보를 예방접종한 생쥐는 또한, ZIKAV 공격접종으로부터 부분적인 보호를 보여주었다. 백신 항혈청은 수동적으로 면역화된 AG129 생쥐에서 바이러스혈증을 유의미하게 축소시키고, 그리고 치명적인 ZIKAV 공격접종에 대항하여 생존을 연장시켰다. 이들 결과는 또한, 충분히 특징화된 PIZV 후보가 매우 ZIKAV-감수성인 AG129 생쥐 모형에서 ZIKAV 감염에 대항하여 매우 효능이 있음을 증명한다.
추가적으로, 계대 7에서 (PRVABC59 P6e로부터의) PRVABC59의 서열은 계대 6의 것과 유전적으로 동일한 것으로 밝혀졌다. 플라비바이러스가 일반적으로, 유전적으로 불안정한 것으로 간주된다는 점을 고려하면, 이것은 놀라운 것이다. PRVABC59 P6e는 부분적으로는, 7 계대에 걸친 이의 유전적 안정성으로 인해 마스터 바이러스 씨드로서 선별되었다. 이론에 한정됨 없이, 이러한 향상된 유전적 안정성은 NS1의 날개 도메인에서의 단일 아미노산 치환 (W98G)으로 인한 것일 수 있는 것으로 생각되는데, 그 이유는 이것이 Vero 세포-적응된 PRVABC59 P6 게놈에서 관찰된 유일한 돌연변이였기 때문이다. 추가적으로, 유전적 안정성과 균질성은 백신 제제에 이용될 수 있는 후속 균주의 가변성을 감소시키고 이들 균주의 재현 가능한 생산을 증가시킨다는 점에서 유리하다.
실시예 3: P6a와 P6e 균주의 표현형에 관한 전임상 평가
재료와 방법
AG129 생쥐 (인터페론 α/β및 γ수용체 없음)는 ZIKV 감염 및 뇌에서의 심각한 병리를 비롯한 질병에 감수성이다. 14-주령 AG129 생쥐는 104와 103 pfu의 ZIKV 계대 6 클론 a (P6a)와 e (P6e)로 복막내 감염되었다.
생쥐를 계량하고, 질병의 임상적 징후 (체중 감소, 헝클어진 털, 웅크린 자세, 기면, 사지 허약, 부분적인/완전 마비)에 대해 매일 모니터하였다 (28 일차까지). 추가적으로, 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 공격접종후 3 일차에 수집한 혈청 표본을 플라크 적정하여, 바이러스혈증의 분석이 수행되었다.
결과
P6e로의 감염은 100% 사망율 (중앙 생존 시간 = 12.5 일)을 유발하였고, 반면 P6a로의 감염은 단지 33% 사망율 (중앙 생존 시간 = 결정되지 않음)만을 유발하였다 (도 22). 이것과 합치하게, preMVS P6e 감염된 생쥐는 PRVABC59 P6a 감염된 생쥐와 비교하여 더욱 큰 체중 감소를 보여주었다 (3). PRVABC59 P6a 또는 P6e으로 감염된 생쥐군들 간의 평균 군 바이러스혈증 수준에서 어떤 통계학적 차이도 발견되지 않았다 (도 24). 이들 데이터는 성장 동역학은 단독으로 핵심 결정인자일 수 없고 (그 이유는 두 균주 모두가 유사한 바이러스혈증, 그리고 시험관내에서 유사한 피크 역가를 생성하였기 때문), 그리고 외피 단백질의 특징이 (야생형 균주의) 발병력 및 (비활성화 후보의) 면역원성에 중요할 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 4: P6e 균주로부터 유래된 정제된 비활성화 지카 바이러스 백신 (PIZV)의 임상 면역원성 및 효능
표본 준비:
상기 설명한 바와 같이 4개의 정제된 비활성화 지카 백신 (PIZV) 로트 (Tox 로트 1-4)가 Vero 세포에서 성장에 의해 제조되었다. 4일차부터 매일 수확한 상층액들 (각각 매일 1000mL 수확, 총 약 4000 mL)을 여과 및 크로마토그래피로 정제하고, 농축시키고, 최종 농도 0.01%까지 포르말린을 첨가하여 비활성화시켰다. 22℃에서 10일 동안 비활성화를 진행시킨 후, 샘플을 원료의약품 완충제 (10 mM NaH2PO4, 50 mM NaCl, 6% 수크로스, pH 7.4)로 완충제 교체하였다.
비활성화된 지카 바이러스는 비활성화되지 않은 지카 바이러스로 감염될 수 있는 숙주 세포를 더 이상 감염시킬 수 없다. 비활성화는 다음과 같은 검사 프로토콜로 결정되었다. 비활성화는 플라크가 전혀 검출되지 않는 경우 인정된다.
상세한 COI (비활성화 완결도) 프로토콜:
1. 상기 검정의 제 1 부: Vero (1.4E+05 세포/mL) 및 아에데스 아에집티 (Aedes aegypti) 모기 C6/36 (4E+05 세포/mL) 세포를 표본 첨가 2 일 전에 96-웰 평판에 씨딩하였다. Vero 세포는 37℃에서 DMEM + 10% 최종 FBS + 2% L-글루타민 + 1% 페니실린/스트렙토마이신에서 배양되었다. C636 세포는 DMEM + 10% FBS + 2% L-글루타민 + 1% 페니실린/스트렙토마이신 + 1% 비필수 아미노산에서 28º에서 배양되었다.
2. 200 TCID50 대조 바이러스 (바이러스 역적정 대조 검사에서 준비됨) 또는 DS 표본의 3개의 독립 복제물이 2% FBS를 함유하는 배지 내로 희석되었다 (5-배와 10-배 희석).
3. 96-웰 평판의 세포에 표본을 접종하였다. 96-웰 평판에서 세포 단층의 감염에 앞서, 임의의 가능한 응집을 파괴하기 위해 표본을 볼텍스처리하였다. 100 μL의 각 희석액을 각각, Vero 세포 및 C636 세포를 함유하는 2개의 별개의 96-웰 평판의 5 웰 각각에 처리하였다.
4. 배지 단독은 각 세포 유형에 대해 음성 CPE 대조로서 또 다른 웰 내에 포함되었다.
5. 평판을 세포주에 적절한 온도에서 6 일 동안 배양하였다.
6. 상기 검정의 제 2 부: 살아있는 바이러스를 추가로 증폭시키고 허용적 세포주 상에서 CPE에 의한 가시화가 가능하도록 하기 위해, Vero와 C636 세포 둘 모두로부터 얻은 각 96-웰 상층액의 전체 체적을 6-웰 Vero 세포 평판의 개별 웰로 이동시켰다. 15 분 간격으로 좌우로 흔들면서, 접종이 90 분 동안 진행되었다.
7. 2% FBS를 함유하는 배지를 웰에 첨가하였고, CPE의 함수로서, 증폭된 표본의 후속 검출을 위해 평판을 추가 8 일 동안 배양하였다. 만약 DS의 임의의 복제물이 8 일차 종결 시점에서 CPE를 보여주면, 비활성화는 불완전한 것으로 간주되었다.
7. 6-웰 평판으로 이동시킨 후 감수성 세포 단층 상에서 플라크 또는 CPE의 형성, 그리고 8일간 배양하여 바이러스를 복제시킴에 의해 살아있는/복제 비리온의 존재가 가시화되었다. 상기 검정의 종결 시점에서 6-웰 평판에서의 % CPE 점수화는 하기와 같이 계산되었다:
- - 각 6-웰 Vero 세포 평판은 비색 변화를 가시화함으로써 CPE에 대해 조사한 후, 도립 광학 현미경하에서 검사하여 CPE를 확증하였다.
- - 각 6-웰 평판은 전술한 5와 10-배 희석으로 제조된 DS 희석액의 복제물 중에서 한 가지를 나타냈다 (5개 웰, 이에 더하여 배지 단독을 함유하는 1개 웰).
이런 이유로, 각 복제물에 대한 % CPE는 표본마다 총 5개 웰 중에서 CPE를 갖는 웰의 숫자를 반영하였다 (검정마다 총 120개 웰이 이용된다). 평균 % CPE 및 표준 편차는 각 희석액의 3개 복제물에 근거하여 계산되었다.
정제된 비활성화 지카 바이러스의 양은 표준 곡선을 확립하기 위하여 규정된 양의 재조합 지카 외피 단백질을 이용하여, Bradford 검정 (Bradford 외 (1976) Anal. Biochem. 72: 248-254)에 의해 결정될 수 있다.
정제된 지카 바이러스의 순도는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다. 본 실시예에서, 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 지카 바이러스의 주요 피크는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상이었다.
연구 백신 (PIZV)은 인산염 완충 식염수 용액 (PBS)에서 어쥬번트로서 200 μg 수산화 알루미늄, Al(OH)3와 함께 제제화된 지카 정제된 포르말린-비활성화 바이러스를 지칭한다. 최종 액체 제형화 생성물을 일회용 바이알에 채우고 훼손되지 않은 씰로 밀봉한다. 연구 백신은 투약 당 2, 5, 또는 10 μg 항원의 0.5 mL 2회-투약 요법으로 28일 간격으로 IM (근육내) 투여된다.
주사용의 염화 나트륨 (NaCl) 0.9% 용액이 위약으로 사용된다. 이는 일회용 바이알로 공급된다. 이는 비경구용으로만 사용하도록 고안된 방부제가 없는 무균의 무색 염화나트륨 용액이다. 위약은 투약 당 0.5 mL 2회-투약 요법으로 28일 간격으로 IM 투여된다.
검사 방법
PRNT 검정: 중화 항체 역가는 전술한 바와 같이 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)에 의해 결정된다 (Sun, W. 외 Protection of Rhesus monkeys against dengue virus challenge after tetravalent live attenuated dengue virus vaccination. J. Infect. Dis. 193, 1658-1665 (2006). Muthumani K, Griffin BD, Agarwal S, 외 In vivo protection against ZIKV infection and pathogenesis through passive antibody transfer and active immunisation with a prMEnv DNA vaccine. NPJ Vaccines 2016; 1: 16021 참고). PRNT 분석 개발에 사용된 지카 균주는 PRVABC59였다.
면역 결과 측정:
정의:
혈청양성 (PRNT): 역가 ≥LOD (검출 한계)
혈청음성 (PRNT): 역가 <LOD (검출 한계)
혈청전환 (PRNT): 최초 혈청음성 대상에서 예방접종 후 역가 ≥LOD
LOD (PRNT) = 10
LOD 미만에 할당되는 값= 5
LLoQ (정량 하한, PRNT) = 26
LLoQ (정량 하한) 미만에 할당되는 값 = 13
리포터 바이러스 입자 (RVP) 중화 검정: 96-웰 평판에서 성장한 Vero 세포에서 일정한 양의 지카 RVPs로 혈청 표본을 적정하여 중화 항체 역가를 분석하였다. RVPs는 지카 (계열 SPH2012)의 prME 단백질 및 뎅기-기초된 레닐라 루시페라아제 리포터를 함유하였다. 간단히 말하면, 혈청을 56 ℃에서 30 분 동안 열 비활성화시키고, 희석시킨 후, 37℃에서 RVPs와 함께 배양하였다. 이후 혈청/RVP 혼합물을, Vero 세포와 혼합하고, 37℃± 2℃, 5% CO2에서 72 시간 동안 배양한 다음, 루시페라아제 기질로 검출하였다. 양성 추적 대조에 대해 정규화된 JMP11 비선형 4 파라미터 분석을 이용하여 데이터를 분석하였으며, 유효 용량 50% (EC50)를 기록하였다.
연구 설명
플라비바이러스 나이브 및 일차접종된 18 내지 49세의 건강한 성인에서 정제된 비활성화 지카 바이러스 백신 (PIZV)의 제 1 상, 무작위, 관찰자-맹검, 위약 대조, 안전성, 면역원성 및 용량 범위 연구
본 연구 설계는 도 25에 도시된다. 본 연구는 플라비바이러스-나이브 그리고 플라비바이러스-일차접종된 18 내지 49세의 건강한 성인을 순차적으로 등록하도록 설계되었다. 이러한 2가지 순차적 코호트는 각각 120명의 대상 (예정)로 구성되며, 30명의 대상으로 된 4개 군 중 하나에 무작위로 할당되고, 3개 중 하나 용량의 PIZV 백신 또는 식염수 위약을 제공받는다. 예방접종 요법은 28일 간격으로 투여되는 2회 투약으로 구성된다. 본 실시예의 데이터는 플라비바이러스 나이브 대상 (n = 124)와만 관련되며, 플라비바이러스 일차접종된 대상에 대한 추가 데이터가 예측될 것이다. 본 실시예는 “플라비바이러스-나이브 코호트”에 대해 57 일 (투약 2 이후 28일차) 후 첫 번째 임시 분석의 데이터를 제공한다. 플라비바이러스-일차접종된 코호트의 데이터는 본 임시 분석의 일부가 아닌데, 왜냐하면 이 그룹의 모집이 첫번째 임시 분석시에도 계속 진행중이었기 때문이다.
요약하면, 대상들을 4개 연구 군에 무작위 배정하고, 대상들에게 위약 (식염수) 또는 2 μg, 5 μg 및 10 μg 농도의 정제된 비활성화 지카 백신 (PIZV) 2회 투약을 제공하였다. 본 연구는 1일차 및 29일차에서 백신 (또는 위약)의 근육내 주사를 포함하며, 혈액 표본은 -15, 1, 8, 29, 36, 57, 211, 393, 767 연구일에 채취되었다. -15일차의 혈액 표본을 사용하여 플라비바이러스 혈청상태 스크리닝 및 적격성 스크리닝을 결정하였다. 1, 29, 57일차 표본은 면역원성 평가를 위한 것이었다. 안전성 실험실 검사를 8 및 36일차에 실시하였다. 면역원성의 지속성은 211, 393 및 767일차에 평가할 것이다.
투약 2 이후 28일차의 데이터에 기초하여, 정제된 비활성화 지카 바이러스 백신 (PIZV)은 18-49세 연령의 플라비바이러스-나이브 성인들에서 안전하고 면역원성이었다.
일차 목적
본 연구의 일차 목적은 28 일 간격으로 제공된, 2회 PIZV 투약의 안전성을 설명하고, 차후 임상 연구에 사용하기 위해 3 가지 다른 항원 농도 (2, 5 또는 10 μg)에서 용량 수준을 선택하는 것이었다. 일차 변수는 다음과 같다: 각 용량의 PIZV 또는 위약 투여 후, 7-일 기간 동안 예측된 국소 및 전신 이상 반응 (AE)을 경험한 대상의 백분율, 그리고 백신접종 후 28-일 기간 동안 심각하지-않은 예측되지 않은 AEs 및 심각한 이상 반응 (SAEs)을 경험한 대상의 백분율.
이차 목적
이차 목적은 플라비바이러스 나이브 성인에서 투여 1 이후 28 일차 및 투여 2 이후 28 일차에 정제된 비활성화 지카 바이러스 백신 (PIZV)에 대한 면역 반응을 설명하는 것이었다. 이들 목적과 관련된 이차 변수는 고려된 시점에서 중화 항-ZIKV 항체의 기하 평균 역가 (GMTs), 혈청양성 비율 (SPR) 및 혈청전환율 (SCR)이다.
데이터의 분석은 개체 처리 배정을 알고 있었던 비맹검 통계학자와 프로그래머의 개별 팀에 의해 수행되었다. 시험 수행에 관련된 모든 인력은 개별 대상 처리 배정에 대해 알지 못하였다. 상기 연구팀은 군 수준의 비맹검 결과만 알 수 있었다.
연구 개체군:
총 124 명의 대상이 플라비바이러스-나이브 코호트에 등록되었고, 한 번 이상 PIZV 또는 위약을 투약받은 모든 무작위 배정된 대상으로 구성된 안전성 피험자군 (Safety Set: SS)에 포함되었다. 그중, 118 명 (상기 SS의 95.2 %)은 한 번 이상 연구 백신 (PIZV)/위약을 투약받은 무작위 배정된 대상의 무작위배정된 피험자군 (Full Analysis Set: FAS)에 포함되었으며, 기준선에서 그리고 예방접종-후 한 번 이상 유효한 혈청학 결과를 제공했다. 면역원성 분석과 관련된 주요 프로토콜 위반이 없었던 FAS 내 대상들의 계획서순응 피험자군 (Per Protocol Set: PPS)에 113 명의 대상 (상기 SS의 91.1%)가 포함되었다. 상기 분석 세트가 표 14에 제시된다.
표 14: 분석 대상군
Figure pct00014
안전성 피험자군 = 한 (1) 번 이상 PIZV 또는 위약을 투약받은 모든 무작위 배정된 대상
무작위배정된 피험자군 = 한 번 이상 PIZV/위약을 투약받고 기준선 및 예방접종 후 한 번 이상 혈청학 결과를 제공한 모든 무작위 배정된 대상
계획서순응 피험자군 = 주요 계획서 위반이 없었던 FAS 내 모든 대상
SS의 대상은 35.3 ± 8.91세 연령이었으며 (평균 ± 표준 편차), 18-29세 연령-범위에 28.2% 그리고 30-49세 연령 범위에 71.8%가 분포하였다. 여성은 코호트의 54.8%를 차지하였다. 연구 참가자들은 인종 및 민족과 관련하여 백인 (81.5%), 흑인 (14.5%), 및 “비-히스패닉” (93.5%) 이었다. SS에서 평균 BMI는 27.5 ± 4.05 (평균 ± 표준 편차)였다. 인구통계학적 특성 (연령, 성별, 신장, 체중, BMI 및 인종)은 4개의 연구군 전반에 걸쳐 전반적으로 유사했다. 여성은, 성별 분포가 더 균형 잡힌 다른 군에서보다 위약군에서 더 많이 나타났는데, 연구 참가자의 66%를 구성하였다. 인구통계 및 기준 특성이 표 15에 제시된다.
포함 기준의 일부로서 안전성 실험실 파라미터 및 활력 징후들을 연구 시작시 점검하였다. 이들은 활력 징후가 정상 한계 내에 있어야 한다고 규정하고 (즉, FDA 독성 등급 척도에 표시된 등급 1 미만), 안전성 실험실 검사가 정상 한계 내에 있거나 FDA 독성 등급 척도에 정의된 대로 등급 1 이상이 아니어야 함을 명시했다.
표 15: 인구통계 및 기준 특성 (안전성 피험자군)
Figure pct00015
Figure pct00016
BMI=체중 (kg)/신장2 (m2).
비고 1: 연령은 동의서에 기재된 날짜를 사용하여 계산된다.
비고 2: 대상은 여러 인종 범주가 선택된 경우에만 다인종 범주에 포함된다.
안전성/반응성
예측된 국소 이상 반응 (AE)의 전체 보고 발생률은 위약군에서 보다 백신 (PIZV)을 투여받은 군에서 더 높았다. 주사 부위에서 가장 자주 보고된 예측된 AE는 통증이었다. 투약 1 이후, 위약군에서 13.8%와 비교하여 PIZV군에서 30.0% 내지 38.7%의 대상이 통증을 경험하였다. 투약 2 이후, 통증의 발생률은 투약 1 후 발생률과 유사하였다: PIZV군에서 29.6% 내지 40%, 그리고 위약군에서 14.3%. 통증 강도는 투약 1 이후 경증 및 투약 2 이후 경증 내지 중등도로 보고되었으며, 5μg PIZV군에서 2 명의 대상 (6.7 %) 및 10μg PIZV군에서 1 명의 대상(3.3 %)가 중등도 통증을 보고 하였다. 기타 예측된 국소 AEs (홍반, 붓기 및 경화)가 대상의 9.7% 이하에서 보고되었다.
통증의 발병은 1 일차에 90%의 대상에서 발생하거나, 또는 2 일차에 (3 명의 대상에서) 발생하였다. 위약 또는 PIZV 군의 어떠한 대상도 5 일차 이후 통증을 보고하지 않았다.
임의의 성질의 예측된 전신 AEs는 투약 1 이후 PIZV군 전체에 걸쳐 대상의 30% 내지 48.4%에서 그리고 위약군의 41.4%에서 보고되었다. 투약 2 이후, 발생률은 APIZV군 전체에 걸쳐 10%　내지 33.3% 그리고 위약군에서 27.6% 였다. 종합하면 81.3% (투약 1) 및 75% (투약 2)의 예측된 전신 AEs가 연구 예방접종과 관련된 것으로 판단되었다. 2회 투약 모두 이후. 가장 많이 보고된 전신 사건은 두통, 피로 및 근육통이었다.
대부분의 전신 AEs는 경증인 것으로 보고되었다, 즉, 일상 활동을 방해하지 않았다. 몇 번의 발생 강도는 중등도였다:
투약 1 이후, PIZV군에서 6.7-12.9%의 대상 및 위약 수용자의 17.2%;
투약 2 이후, PIZV 군 전체에 걸쳐 0 - 3.3%의 대상 그리고 위약군에서 10.3%.
한 차례 중증 AE 보고가 있었다: 위약군의 한 대상이 발열을 경험하였다. 본 연구 참가자는 2차 연구 예방접종을 받은 후 4일차에 경구 측정하여 39.4℃의 체온을 나타내었다. 이 발열은 연구자에 의해, 본 연구에-관련된 것으로 판단되지 않았다.
예측된 전신 AE가 4개 군에서 7일 기간에 걸쳐 다양하게 보고되었다. 열, 피로, 관절통 및 근육통에 관한 사건의 발병은 주로 백신접종-후 2 일차 중에 존재하였으며, 두통 및 불쾌감은 가변적이었다. 4 일차 위약군에서 대상이 중증 열을 보고한 경우를 제외하고, 백신접종 후 2 일차 중에 열이 보고되었다.
예방접종 후 7일차에 예측된 국소 및 전신 이상 반응의 발병율은 표 16에 도시된다.
표 16: 예방접종 후 7일차에 예측된 국소 및 전신 이상 반응의 발병율 (안전성 피험자군)
Figure pct00017
N= 이용가능한 정보를 가진 대상의 수; n (%) = 특정 AE를 보고한 대상의 수 (백분율).
총 30.6 %의 대상에서, 임의의 투약 후 28 일 이내 예측되지 않은 AEs가 보고되었다 (장기적인 예측된 AEs는 포함되지 않음): PIZV 군에서 21.9-38.7%, 그리고 위약군에서 36.7%. 이 AEs는 주로 감염(infections), 감염(infestations) (13.7%) 및 신경계 장애 (3.2%: 두통, 편두통, 현기증)이었다. 강도는 모두 경증 내지 중등도였다.
예측되지 않은 AEs는 3명의 대상(2.4%)에 대한 연구 예방접종과 관련된 것으로 간주되었다. 보고된 반응들은 다음과 같았다:
투약 1 이후, 5μg PIZV군의 한 명의 대상에서 어지럼증 그리고 2μg PIZV군의 한 명의 대상에서 홍조;
투약 2 이후, 10μg PIZV군의 한 명의 대상에서 눈 가려움 및 눈물분비 증가.
이들은 강도가 경증 내지 중등도였으며, 백신접종 후 1 일 또는 2 일차에 시작하였고, 1 일 내지 3 일의 지속 기간을 가졌으며, 모두 해소되었다.
한 명의 대상은 투약 1 이후 두통으로 인해 연구 백신접종을 중단했다. 이 대상은 PIZV를 투여받았으며 백신접종 후 1 일차에 두통을 경험했다. 두통은 발병 후 36 일차에 해소되었다. 투약 1에서 시작하여 투약 2 이후 28 일차까지의 기간 동안 중증 이상 반응 (SAE)이 보고되지 않았다.
백신접종 후 7 일차에, 혈액 안전성 실험실 파라미터에 대해 기준선으로부터 약간의 변화가 관찰되었는데, 예를 들어, 정상 내지 경증, 또는 경증 내지 중등도의 AEs가 4개 군에 걸쳐 비슷한 백분율의 대상에서 발생했다. 소변검사 파라미터는 모든-시점에서 정상이었으며, 또는 등급화 범주는 군 및 방문 전반에 걸쳐 유사하였다.
면역원성
표 17은 각 백신 투약 후 PRNT에 의해 측정된 지카 바이러스 중화 항체 (EC50)의 기하 항체 역가 뿐만 아니라 혈청양성 비율 및 혈청전환율을 제시한다.
PIZV 백신은 플라비바이러스-나이브 성인에서 면역원성이었다. 모든 대상들은 기준선에서 혈청음성 이었다. 지카 바이러스에 대한 항체에 대해 최초에 혈청음성이었던 대상의 예방접종은 임의 용량의 PIZV 백신 2회 투약 후 모든 대상에서 혈청양성을 유도하였다: 혈청전환율은 투약 1 이후 69.23% 내지 96.43% 범위였으며 투약 2 이후 100% 였다. 위약군의 모든 대상들은 고려된 기간 전체에 걸쳐 혈청음성을 유지하였다.
투약 1 이후 혈청양성 비율에 대해 그리고 각 투약 후 GMT에 대해 용량-범위 효과가 관찰되었다. 첫 번째 투약 후, 10 μg PIZV 용량을 제공받은 거의 모든 대상 (96.4%)가 지카 바이러스에 대한 중화 항체를 가졌다. 두 번째 투약은 3개 PIZV군들에서 투약 1로부터의 GMT를 10-배 이상 증가시켰다.
표 17: 각 용량의 PIZV 투여 전 및 투여 후 28일차에서 지카 바이러스 중화 항체 (EC 50 ) (PRNT)의 혈청양성, 혈청전환율 및 GMT (계획서순응 피험자군)
Figure pct00018
N= 이용가능한 PRNT 데이터를 가진 PPS에서의 대상의 수;
혈청양성은 역가 ≥ 10으로 정의되고; 혈청전환은 다음과 같이 정의된다: 기준선(역가 <10)의 혈청음성 대상들은 예방접종 후 역가 ≥10을 가진다; 결과 < 10에는 역가 5가 할당되고; 역가 ≥ 10 (검출 한계) 및 < 26 (정량 하한)에는 13 값이 할당된다.
표 17에 따라 PRNT를 사용하여 결정한 기하 평균 역가는 도 26에 그래프로 도시된다. 혈청전환을 구현한 대상들의 백분율을 표 17에 따라 PRNT를 사용하여 결정하며, 이는 도 27에 그래프로 도시된다.
투약 1 이후 그리고 투약 2 이후 중화 역가의 분포는 각각 도 28 및 29에 역 누적 분포 곡선으로 도시된다.
PRNT 검정으로 면역 반응을 측정하는 것에 더하여, 표본을 또한 RVP 중화 검정으로 검사하였다. 표 18은 RVP 검정으로 측정한 지카 바이러스 중화 항체 (EC50)의 기하 항체 역가를 제시한다. RVP 검정 결과는 PRIZ 데이터의 유사한 용량-범위 효과를 보여주며, PIZV 용량이 증가함에 따라, 점차적으로 GMTs가 높아진다.
표 18: 예방접종 전 및 후 28일차에 지카 바이러스 중화 항체 (EC 50 )의 GMT (RVP) (계획서순응 피험자군)
Figure pct00019
N= 이용가능한 RVP 데이터를 가진 PPS에서의 대상의 수.
결론
PIZV 백신은 플라비바이러스-나이브 코호트에서 평가된 모든 항원 용량에 대해 내약성이 우수하고, 안전하였다. 용량 강도 증가에 따라 명확한 증가가 없는 모든 군에서 예측된 전신 AEs가 보고되었으며 강도는 경증 내지 중등도였다. 보고된 국소적 예측 AEs는 또한 군 전체에 걸쳐 경증 내지 중등도였다. 예측되지 않은 증상들이 4개 연구군에서 비슷한 빈도로 보고되었다. 종합적으로, 상기 백신은 플라비바이러스-나이브 대상에서 면역원성이었으며, 양성의 용량-범위 반응이 관찰되었다.
본 발명의 추가 양상들:
1. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원 1μg 내지 40μg 용량을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
2. 항목 1에 있어서, 지카 바이러스는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
3. 항목 1에 있어서, 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 가지는, 백신 또는 면역원성 조성물.
4. 항목 1 또는 2에 있어서, 항원은 정제된 비활성화 전체 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
5. 항목 4에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 항원의 주요 피크는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상인, 백신 또는 면역원성 조성물.
6. 항목 5에 있어서, 항원은, 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 5 내지 15일 동안 약 15º내지 약 37º범위의 온도에서 처리되는 방법으로부터 수득가능한 비활성화 전체 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
7. 항목 5 또는 6에 있어서, 비활성화 전체 바이러스는 화학적으로 비활성화되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
8. 항목 7에 있어서, 비활성화 전체 바이러스는 세제, 포르말린, 베타-프로피오락톤 (BPL), 2성분 에틸아민 (BEI), 아세틸 에틸렌이민, 메틸렌 블루 및 소랄렌 중 하나 이상을 이용하여 화학적으로 비활성화되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
9. 항목 8에 있어서, 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 5 내지 15일 동안 약 15º내지 약 37º범위의 온도에서 처리되는 방법에서 포르말린으로 화학적으로 비활성화되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물은 약 2μg 용량의 정제된 비활성화 전체 바이러스를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
11. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물은 약 5μg 용량의 정제된 비활성화 전체 바이러스를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
12. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물은 약 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 바이러스를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
13. 항목 1에 있어서, 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이는 지카 바이러스 비-구조 단백질 1 (NS1)에 존재하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
14. 항목 1에 있어서, 하나 이상의 적응 돌연변이는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 발생하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
15. 항목 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 적응 돌연변이 또는 돌연변이는 Trp98Gly 돌연변이인, 백신 또는 면역원성 조성물.
16. 항목 1-15 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 적응 돌연변이 또는 돌연변이는 하나 이상의 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여 유전자 안정성을 향상시키는, 백신 또는 면역원성 조성물.
17. 항목 1-16 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 적응 돌연변이 또는 돌연변이는 하나 이상의 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스와 비교하여 바이러스 복제를 향상시키는, 백신 또는 면역원성 조성물.
18. 항목 1-17 중 어느 하나에 있어서, 지카 바이러스는 외피 단백질 E (Env)에 돌연변이를 포함하지 않는, 백신 또는 면역원성 조성물.
19. 항목 1에 있어서, 비-인간 세포는 포유동물 세포인, 백신 또는 면역원성 조성물.
20. 항목 1에 있어서, 비-인간 세포는 원숭이 세포인, 백신 또는 면역원성 조성물.
21. 항목 20에 있어서, 원숭이 세포는 Vero 세포주로부터 유래되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
22. 항목 21에 있어서, Vero 세포주는 WHO Vero 10-87 세포주인, 백신 또는 면역원성 조성물.
23. 항목 1-22 중 어느 하나에 있어서, 지카 바이러스는 아프리카 계통 바이러스 또는 아시아 계통 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
24. 항목 1-22 중 어느 하나에 있어서, 지카 바이러스는 아시아 계통 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
25. 항목 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 지카 바이러스는 균주 PRVABC59에서 유래되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
26. 항목 1-25 중 어느 하나에 있어서, 어쥬번트를 추가로 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
27. 항목 26에 있어서, 어쥬번트는 알루미늄 염, 톨 유사 수용체 (TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A (MLA), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, MLA 유도체, 사이토카인, 사포닌, 무라밀 디펩티드 (MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람 음성균의 지질다당류 (LPS), 폴리포스파젠, 에멀션, 비로솜, 카클리어트, 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLG) 마이크로입자, 폴록사머 입자, 마이크로입자, 리포솜, 완전한 프로인드 어쥬번트 (CFA), 그리고 불완전 프로인드 어쥬번트 (IFA)로 구성된 군에서 선택되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
28. 항목 27에 있어서, 어쥬번트는 알루미늄 염인, 백신 또는 면역원성 조성물.
29. 항목 28에 있어서, 어쥬번트는 백반, 인산알루미늄, 수산화알루미늄, 황산 알루미늄칼륨 및 알하이드로겔 85에서 선택되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
30. 항목 29에 있어서, 어쥬번트는 수산화 알루미늄인, 백신 또는 면역원성 조성물.
31. 항목 30에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물은 100 μg 내지 600μg 수산화 알루미늄, 또는 100 μg 내지 300μg 수산화 알루미늄, 또는 150μg 내지 250μg 수산화 알루미늄, 또는 약 200 μg 수산화 알루미늄을 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
32. 항목 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 지카 바이러스는 클론 분리주, 특히, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주로부터 얻은 클론 분리주인, 백신 또는 면역원성 조성물.
33. 항목 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 포스페이트 완충제 및 폴리올, 가령, 당, 가령, 수크로스를 추가로 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
34. 항목 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 다음을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물:
- 약 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 바이러스
- 약 200 μg의 수산화 알루미늄,
- 완충제; 그리고 선택적으로
- 당, 가령, 수크로스.
35. 항목 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 건조 물질 또는 수성 조성물의 형태인 백신 또는 면역원성 조성물.
36. 항목 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 0.1 내지 0.8 ml, 또는 약 0.5ml 부피의 수성 조성물 형태인, 백신 또는 면역원성 조성물.
37. 항목 1 내지 36 중 어느 하나의 백신 또는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방, 특히 예방하는 방법.
38. 대상에게 항목 1 내지 36 중 어느 하나의 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
39. 임신한 대상 또는 임신하고자 하는 대상 또는 임신 가능성이 있는 여성에게 항목 1 내지 36 중 어느 하나의 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 태아 또는 신생아에서 지카 바이러스 질병의 예방 방법.
40. 항목 1 내지 36 중 어느 하나의 백신을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 지카 바이러스 질병의 예방 방법.
41. 항목 37 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 대상은 임신했거나 또는 임신하고자 하거나 임신 가능성이 있는 여성인, 방법.
42. 항목 37 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 상기 대상에서 보호 면역 반응을 유도하는, 방법.
43. 항목 42에 있어서, 대상에서 유도된 보호 면역 반응은 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원들을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여받은 상응하는 대상에서 유도된 보호 면역 반응보다 큰, 방법.
44. 항목 37 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 대상에서 지카 바이러스에 대한 중화 항체 생성을 유도하는, 방법.
45. 항목 37 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 대상에서 지카 바이러스에 대하여, 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시, 10 초과, 또는 50 초과, 또는 100 초과, 또는 200 초과 또는 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 2000 초과, 또는 2000 초과, 또는 3000 초과의 중화 항체 역가 생성을 유도하는, 방법.
46. 항목 37 내지 46 중 어느 하나에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 대상에서 지카 바이러스에 대하여, 리포터 바이러스 입자 중화 검사 (RVP)로 측정시, 300 초과, 또는 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 2000 초과, 또는 3000 초과, 또는 5000 초과, 또는 10,000 초과의 중화 항체 역가 생성을 유도하는, 방법.
47. 항목 45 또는 46에 있어서, 이러한 역가는 투여 후 28일차에 구현되는, 방법.
48. 항목 37 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 심각한 이상 반응이 나타나지 않는, 방법.
49. 항목 37 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 39℃ 및 그 이상의 발열이 나타나지 않는, 방법.
50. 항목 37 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 대상에서 생성된 중화 항체의 농도는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이가 없는 지카 바이러스로부터의 하나 이상의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 투여한 상응하는 대상에서 생성된 중화 항체의 농도보다 높은, 방법.
51. 항목 37 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 피하 투여, 경피 투여, 피내 투여, 진피하 투여, 근육내 투여, 경구 투여, 비강내 투여, 협측 투여, 복강내 투여, 질내 투여, 항문 투여 및/또는 두개내 투여로 구성된 군에서 선택된 경로에 의해 투여되는, 방법.
52. 항목 37 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물은 근육내 또는 피하 투여로 투여되는, 방법.
53. 항목 37 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물은 1회 이상 투여되는, 방법.
54. 항목 37 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 10μg 용량을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물이 1회 투여되는, 방법.
55. 항목 54에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 후 14 및/또는 28일에 대상에서 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시, 200 초과 또는 250 초과의 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가 생성이 유도되는, 방법.
56. 항목 54에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 후 14 및/또는 28일에 대상에서 리포터 바이러스 입자 중화 검사 (RVP)로 측정시, 1000 초과 또는 2000 초과의 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가 생성이 유도되는, 방법.
57. 항목 37 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 10 μg 용량을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물은 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로 투여되는, 방법.
58. 항목 57에 있어서, 일차접종 및 추가접종 투여는 약 1 내지 약 16 주 간격으로 발생하는, 방법.
59. 항목 57 및 58에 있어서, 제 2 (추가접종) 투여는 제 1 (일차접종) 투여 후 최소한 28일차에 투여되는, 방법.
60. 항목 57 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물의 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 대상에서 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시, 1000 초과 또는 1500 초과의, 또는 2000 초과 또는 3000 초과의 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가 생성이 유도되는, 방법.
61. 항목 57 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여 후 14 및/또는 28일에 대상에서 리포터 바이러스 입자 중화 검사 (RVP)로 측정시, 3000 초과, 또는 5000 초과, 또는 10000 초과의 지카 바이러스에 대한 중화 항체 역가 생성이 유도되는, 방법.
62. 항목 37 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 대상은 지카 풍토병 지역 출신인, 방법.
63. 항목 37 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 대상은 지카 풍토병 발병 대상 지역 출신인, 방법.
64. 항목 37 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 대상은 지카 비-풍토병 지역 출신인, 방법.
65. 항목 37 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 대상은 풍토병 지역을 여행하는 지카 비-풍토병 지역 출신인, 방법.
66. 항목 37 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 대상은 플라비바이러스 나이브인, 방법.
67. 항목 37 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 대상은 히스패닉인, 방법.
68. 항목 37 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 대상은 라틴계인, 방법.
69. 항목 37 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 대상은 아메리카계 인디언인, 방법.
70. 항목 37 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 대상은 알래스카 원주민인, 방법.
71. 항목 37 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 대상은 아시아인인, 방법.
72. 항목 37 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 대상은 흑인 또는 아프리카계 미국인인, 방법.
73. 항목 37 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 대상은 하와이 원주민인, 방법.
74. 항목 37 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 대상은 백인인, 방법.
75. 항목 37 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 대상은 연령이 18 내지 29세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 방법.
76. 항목 37 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 대상은 연령이 30 내지 49세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 방법.
77. 항목 1 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 항목 37 내지 76 중 어느 하나의 방법에서 사용하기 위한 백신 또는 면역원성 조성물.
78. 항목 37 내지 76 중 어느 하나의 방법을 위한 약제의 제조에 있어서 항목 1 내지 36 중 어느 하나의 백신 또는 면역원성 조성물의 용도.
79. 항목 32에 있어서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 지카 바이러스 개체군을 포함하는 접종물과 접촉된 세포로부터 플라크 정제된, 백신 또는 면역원성 조성물.
80. 항목 79에 있어서, 세포는 비-인간 세포인, 백신 또는 면역원성 조성물.
81. 항목 79 또는 항목 80에 있어서, 세포는 곤충 세포인, 백신 또는 면역원성 조성물.
82. 항목 81에 있어서, 곤충 세포는 모기 세포인, 백신 또는 면역원성 조성물.
83. 항목 79 또는 항목 80에 있어서, 세포는 포유동물 세포인, 백신 또는 면역원성 조성물.
84. 항목 83에 있어서, 포유동물 세포는 원숭이 세포인, 백신 또는 면역원성 조성물.
85. 항목 84에 있어서, 원숭이 세포는 Vero 세포주로부터 유래되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
86. 항목 85에 있어서, Vero 세포주는 WHO Vero 10-87 세포주인, 백신 또는 면역원성 조성물.
87. 항목 79 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 지카 바이러스 개체군은 이종성이었음을 특징으로 하는 백신 또는 면역원성 조성물.
88. 항목 79 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 지카 바이러스 개체군은 지카 바이러스 임상 분리주를 포함하였던, 백신 또는 면역원성 조성물.
89. 항목 88에 있어서, 지카 바이러스 임상 분리주는 균주 PRVABC59에서 유래되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
90. 항목 79 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 지카 바이러스 개체군은 세포 배양물에서 1회 이상 사전에 계대배양되었던 지카 바이러스를 포함하였던, 백신 또는 면역원성 조성물.
91. 항목 79 내지 89 중 어느 하나에 있어서, 접종물은 인간 혈청을 포함하였던, 백신 또는 면역원성 조성물.
92. 항목 79 내지 90 중 어느 하나에 있어서, 접종물은 하나 이상의 외인성 물질을 포함하였던, 백신 또는 면역원성 조성물.
93. 항목 91에 있어서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주에는 하나 이상의 외인성 물질이 실질적으로 없는, 백신 또는 면역원성 조성물.
94. 항목 79 내지 92 중 어느 하나에 있어서, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주는 동종 유전자 개체군인, 백신 또는 면역원성 조성물.
95. 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법으로서, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 300 초과, 또는 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 2000 초과, 또는 3000 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 방법.
96. 필요로 하는 대상 개체군에서 면역 반응의 유도 방법으로서, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 리포터 바이러스 입자 중화 분석 (RVP)으로 결정시 상기 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상의 대상 개체군에서 300 초과, 또는 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 2000 초과, 또는 3000 초과, 또는 5000 초과, 또는 10,000 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는 방법.
97. 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법으로서, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 상기 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 100%의 혈청전환율을 유도하는, 방법.
98. 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법으로서, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 단회 용량 또는 일차접종 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 단회 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 10 초과, 또는 50 초과, 또는 100 초과, 또는 200 초과, 또는 250 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 방법.
99. 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법으로서, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 단회 용량 또는 일차접종 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 리포터 바이러스 입자 중화 분석 (RVP)으로 측정시 상기 단회 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 300 초과, 또는 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 2000 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는 방법.
100. 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법으로서, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 단회 용량 또는 일차접종 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 상기 단회 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 60%, 70%, 80% 또는 90%의 혈청전환율을 유도하는 방법.
101. 항목 95 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 40μg 용량의 항원을 포함하고, 이 때 항원은 비활성화 전체 바이러스인, 방법.
102. 항목 100 또는 101에 있어서, 지카 바이러스는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는, 방법.
103. 항목 101 또는 102에 있어서, 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 가지는, 방법.
104. 항목 101 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 항원은 정제되는, 방법.
105. 항목 104에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 항원의 주요 피크는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상인, 방법.
106. 항목 101 내지 105에 있어서, 항원은, 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 5 내지 15일 동안 약 15º내지 약 37º범위의 온도에서 처리되는 방법으로부터 수득가능한 비활성화 전체 바이러스인, 방법.
107. 항목 100 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 대상은 지카 풍토병 지역 출신인, 방법.
108. 항목 107에 있어서, 대상은 지카 풍토병 발병 대상 지역 출신인, 방법.
109. 항목 100 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 대상은 지카 비-풍토병 지역 출신인, 방법.
110. 항목 109에 있어서, 대상은 풍토병 지역을 여행하는 지카 비-풍토병 지역 출신인, 방법.
111. 항목 100 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 대상은 플라비바이러스 나이브인, 방법.
112. 항목 100 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 대상은 연령이 18 내지 29세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 방법.
113. 항목 100 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 대상은 연령이 30 내지 49세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 방법.
114. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 300 초과, 또는 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 2000 초과, 또는 3000 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 상기 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
115. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 리포터 바이러스 입자 중화 분석 (RVP)으로 결정시 상기 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상의 대상 개체군에서 300 초과, 또는 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 1500 초과, 또는 2000 초과, 또는 3000 초과, 또는 5000 초과, 또는 10,000 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 상기 대상 개체군에서 면역 반응을 유도하는 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
116. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 상기 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 100%의 혈청전환율을 유도하는, 상기 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
117. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 단회 용량 또는 일차접종 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 단회 투약 또는 일차접종 투여 후 18 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 10 초과, 또는 50 초과, 또는 100 초과, 또는 200 초과, 또는 250 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 상기 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
118. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 단회 용량 또는 일차접종 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 리포터 바이러스 입자 중화 분석 (RVP)으로 측정시 상기 단회 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 300 초과, 또는 500 초과, 또는 1000 초과, 또는 2000 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 상기 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
119. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 단회 용량 또는 일차접종 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 상기 단회 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 60%, 70%, 80% 또는 90%의 혈청전환율을 유도하는, 상기 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
120. 항목 114 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 40μg 용량의 항원을 포함하고, 이 때 항원은 비활성화 전체 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
121. 항목 120에 있어서, 지카 바이러스는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
122. 항목 120 또는 121에 있어서, 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 가지는, 백신 또는 면역원성 조성물.
123. 항목 120 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 항원은 정제되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
124. 항목 123에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 항원의 주요 피크는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상인, 백신 또는 면역원성 조성물.
125. 항목 120 내지 124에 있어서, 항원은, 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 5 내지 15일 동안 약 15º내지 약 37º범위의 온도에서 처리되는 방법으로부터 수득가능한 비활성화 전체 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
126. 항목 114 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 대상은 지카 풍토병 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
127. 항목 126에 있어서, 대상은 지카 풍토병 발병 대상 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
128. 항목 114 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 대상은 지카 비-풍토병 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
129. 항목 128에 있어서, 대상은 풍토병 지역을 여행하는 지카 비-풍토병 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
130. 항목 114 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 대상은 플라비바이러스 나이브 및/또는 지카 바이러스 혈청음성인, 백신 또는 면역원성 조성물.
131. 항목 114 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 대상은 연령이 18 내지 29세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 백신 또는 면역원성 조성물.
132. 항목 114 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 대상은 연령이 30 내지 49세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 백신 또는 면역원성 조성물.
133. 필요로 하는 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법으로서, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 상기 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 추가접종 투여 후 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 일차접종 투여 후 28일에 유도되는 기하 평균 중화 항체 역가보다 10 배 이상, 또는 15 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 25 배 이상 더 높은 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는 방법.
134. 항목 133에 있어서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 40μg 용량의 항원을 포함하고, 이 때 항원은 비활성화 전체 바이러스인, 방법.
135. 항목 133 또는 134에 있어서, 지카 바이러스는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는, 방법.
136. 항목 133 또는 134에 있어서, 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 가지는, 방법.
137. 항목 133 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 항원은 정제되는, 방법.
138. 항목 137에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 항원의 주요 피크는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상인, 방법.
139. 항목 133 내지 138에 있어서, 항원은, 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 5 내지 15일 동안 약 15º내지 약 37º범위의 온도에서 처리되는 방법으로부터 수득가능한 비활성화 전체 바이러스인, 방법.
140. 항목 134 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 대상은 지카 풍토병 지역 출신인, 방법.
141. 항목 140에 있어서, 대상은 지카 풍토병 발병 대상 지역 출신인, 방법.
142. 항목 133 내지 139 중 어느 하나에 있어서, 대상은 지카 비-풍토병 지역 출신인, 방법.
143. 항목 142에 있어서, 대상은 풍토병 지역을 여행하는 지카 비-풍토병 지역 출신인, 방법.
144. 항목 133 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 대상은 플라비바이러스 나이브인, 방법.
145. 항목 133 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 대상은 연령이 18 내지 29세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 방법.
146. 항목 133 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 대상은 연령이 30 내지 49세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 방법.
147. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 추가접종 투여 후 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 일차접종 투여 후 28일에 유도되는 기하 평균 중화 항체 역가보다 10 배 이상, 또는 15 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 25 배 이상 더 높은 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 상기 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
148. 항목 147에 있어서, 상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 40μg 용량의 항원을 포함하고, 이 때 항원은 비활성화 전체 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
149. 항목 147 또는 148에 있어서, 지카 바이러스는 하나 이상의 비-인간 세포 적응 돌연변이를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
150. 항목 147 또는 148에 있어서, 지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 가지는, 백신 또는 면역원성 조성물.
151. 항목 147 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 항원은 정제되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
152. 항목 151에 있어서, 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 항원의 주요 피크는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상인, 백신 또는 면역원성 조성물.
153. 항목 148 내지 152에 있어서, 항원은, 지카 바이러스가 약 0.001% v/v 내지 약 3.0% v/v 범위 양의 포르말린으로 5 내지 15일 동안 약 15º내지 약 37º범위의 온도에서 처리되는 방법으로부터 수득가능한 비활성화 전체 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
154. 항목 147 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 대상은 지카 풍토병 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
155. 항목 154에 있어서, 대상은 지카 풍토병 발병 대상 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
156. 항목 147 내지 153 중 어느 하나에 있어서, 대상은 지카 비-풍토병 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
157. 항목 156에 있어서, 대상은 풍토병 지역을 여행하는 지카 비-풍토병 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
158. 항목 147 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 대상은 플라비바이러스 나이브 및/또는 지카 바이러스 혈청음성인, 백신 또는 면역원성 조성물.
159. 항목 147 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 대상은 연령이 18 내지 29세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 백신 또는 면역원성 조성물.
160. 항목 147 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 대상은 연령이 30 내지 49세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 백신 또는 면역원성 조성물.
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virus <400> 2 gttgttgatc tgtgtgaatc agactgcgac agttcgagtt tgaagcgaaa gctagcaaca 60 gtatcaacag gttttatttt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 120 aaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtgag 180 cccctttggg ggcttgaaga ggctgccagc cggacttctg ctgggtcatg ggcccatcag 240 gatggtcttg gcgattctag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct 300 catcaataga tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaacaataa agaagttcaa 360 gaaagatctg gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaaga agagacgagg 420 cgcagatact agtgtcggaa ttgttggcct cctgctgacc acagctatgg cagcggaggt 480 cactagacgt gggagtgcat actatatgta cttggacaga aacgatgctg gggaggccat 540 atcttttcca accacattgg ggatgaataa gtgttatata cagatcatgg atcttggaca 600 catgtgtgat gccaccatga gctatgaatg ccctatgctg gatgaggggg tggaaccaga 660 tgacgtcgat tgttggtgca acacgacgtc aacttgggtt gtgtacggaa cctgccatca 720 caaaaaaggt gaagcacgga gatctagaag agctgtgacg ctcccctccc attccaccag 780 gaagctgcaa acgcggtcgc aaacctggtt ggaatcaaga gaatacacaa agcacttgat 840 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gactcttggg gccagcgcat ggctcatgtg gctctcggaa attgagccag ccagaattgc 6780 atgtgtcctc attgttgtgt tcctattgct ggtggtgctc atacctgagc cagaaaagca 6840 aagatctccc caggacaacc aaatggcaat catcatcatg gtagcagtag gtcttctggg 6900 cttgattacc gccaatgaac tcggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatct 6960 aatgggaagg agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgcggcc 7020 agcctcagct tgggccatct atgctgcctt gacaactttc attaccccag ccgtccaaca 7080 tgcagtgacc acctcataca acaactactc cttaatggcg atggccacgc aagctggagt 7140 gttgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct 7200 aatgataggt tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct 7260 cgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca 7320 gaagagaacg gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga 7380 cattgacaca atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat 7440 agcagtagcc gtctccagcg ccatactgtc gcggaccgcc tgggggtggg gggaggctgg 7500 ggctctgatc acagccgcaa cttccacttt gtgggaaggc tctccgaaca agtactggaa 7560 ctcctctaca gccacttcac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagcttc 7620 tctaatctac acagtaacaa gaaacgctgg cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagg 7680 agagaccctg ggagagaaat ggaaggcccg cttgaaccag atgtcggccc tggagttcta 7740 ctcctacaaa aagtcaggca tcaccgaggt gtgcagagaa gaggcccgcc gcgccctcaa 7800 ggacggtgtg gcaacgggag gccatgctgt gtcccgagga agtgcaaagc tgagatggtt 7860 ggtggagcgg ggatacctgc agccctatgg aaaggtcatt gatcttggat gtggcagagg 7920 gggctggagt tactacgtcg ccaccatccg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa 7980 aggaggccct ggtcatgaag aacccgtgtt ggtgcaaagc tatgggtgga acatagtccg 8040 tcttaagagt ggggtggacg tctttcatat ggcggctgag ccgtgtgaca cgttgctgtg 8100 tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtcct 8160 ctccatggtg ggggattggc ttgaaaaaag accaggagcc ttttgtataa aagtgttgtg 8220 cccatacacc agcactatga tggaaaccct ggagcgactg cagcgtaggt atgggggagg 8280 actggtcaga gtgccactct cccgcaactc tacacatgag atgtactggg tctctggagc 8340 gaaaagcaac accataaaaa gtgtgtccac cacgagccag ctcctcttgg ggcgcatgga 8400 cgggcctagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat ctcggctctg gcacgcgggc 8460 tgtggtaagc tgcgctgaag ctcccaacat gaagatcatt ggtaaccgca ttgaaaggat 8520 ccgcagtgag cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc 8580 ttaccatgga agctatgagg cccccacaca agggtcagcg tcctctctaa taaacggggt 8640 tgtcaggctc ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac 8700 cgacaccaca ccgtatggtc agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgcc 8760 agacccccaa gaaggcactc gtcaggttat gagcatggtc tcttcctggt tgtggaaaga 8820 gctaggcaaa cacaaacggc cacgagtctg caccaaagaa gagttcatca acaaggttcg 8880 tagcaatgca gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga 8940 agctgtgaac gatccaaggt tctgggctct agtggacaag gaaagagagc accacctgag 9000 aggagagtgc cagagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga 9060 atttggaaag gccaagggca gccgcgccat ctggtatatg tggctagggg ctagatttct 9120 agagttcgaa gcccttggat tcttgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg 9180 aggtggtgtt gaagggctgg gattacaaag actcggatat gtcctagaag agatgagtcg 9240 tataccagga ggaaggatgt atgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagcag 9300 gtttgatctg gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg gagaaagggc acagggcctt 9360 ggcattggcc ataatcaagt acacatacca aaacaaagtg gtaaaggtcc ttagaccagc 9420 tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttcgagacaa gaccaaaggg ggagcggaca 9480 agttgtcact tacgctctta acacatttac caacctagtg gtgcaactca ttcggaatat 9540 ggaggctgag gaagttctag agatgcaaga cttgtggctg ctgcggaggt cagagaaagt 9600 gaccaactgg ttgcagagca acggatggga taggctcaaa cgaatggcag tcagtggaga 9660 tgattgcgtt gtgaagccaa ttgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga 9720 tatgggaaaa gttaggaagg acacacaaga gtggaaaccc tcaactggat gggacaactg 9780 ggaagaagtt ccgttttgct cccaccactt caacaagctc catctcaagg acgggaggtc 9840 cattgtggtt ccctgccgcc accaagatga actgattggc cgggcccgcg tctctccagg 9900 ggcgggatgg agcatccggg agactgcttg cctagcaaaa tcatatgcgc aaatgtggca 9960 gctcctttat ttccacagaa gggacctccg actgatggcc aatgccattt gttcatctgt 10020 gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac tacctggtca atccatggaa agggagaatg 10080 gatgaccact gaagacatgc ttgtggtgtg gaacagagtg tggattgagg agaacgacca 10140 catggaagac aagaccccag ttacgaaatg gacagacatt ccctatttgg gaaaaaggga 10200 agacttgtgg tgtggatctc tcatagggca cagaccgcgc accacctggg ctgagaacat 10260 taaaaacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10320 cctatccacc caagttcgct acttgggtga agaagggtct acacctggag tgctgtaagc 10380 accaatctta atgttgtcag gcctgctagt cagccacagc ttggggaaag ctgtgcagcc 10440 tgtgaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagcctatag tcaggccgag aacgccatgg 10500 cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10560 gcgcttggag gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg 10620 gcctgaactg gagatcagct gtggatctcc agaagaggga ctagtggtta gagga 10675 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 1 (CpG 1826) <400> 3 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 2 (CpG 1758) <400> 4 tctcccagcg tgcgccat 18 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 3 <400> 5 accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 4 (CpG 2006) <400> 6 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligo 5 (CpG 1668) <400> 7 tccatgacgt tcctgatgct 20 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> Zika virus <400> 8 Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu 1 5 10 15 Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln 20 25 30 <210> 9 <211> 31 <212> PRT <213> Zika virus <400> 9 Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu 1 5 10 15 Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln 20 25 30 <210> 10 <211> 31 <212> PRT <213> West Nile Virus <400> 10 Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu 1 5 10 15 Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser 20 25 30 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Japanese Encephalitis Virus <400> 11 Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu 1 5 10 15 Leu Thr Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val 20 25 30 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Saint Louis Encephalitis Virus <400> 12 Phe Ser Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Ile Val Glu 1 5 10 15 Leu Gln Tyr Thr Gly Ser Asn Gly Pro Cys Arg Val Pro Ile Ser 20 25 30 <210> 13 <211> 30 <212> PRT <213> Yellow Fever Virus <400> 13 Phe Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met Gln 1 5 10 15 Val Lys Val Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile 20 25 30 <210> 14 <211> 31 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 14 Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln 1 5 10 15 Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser 20 25 30 <210> 15 <211> 31 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 15 Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg 1 5 10 15 Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu 20 25 30 <210> 16 <211> 31 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 16 Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys 1 5 10 15 Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser 20 25 30 <210> 17 <211> 31 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 17 Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys 1 5 10 15 Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu 20 25 30 <210> 18 <211> 29 <212> PRT <213> Zika virus <400> 18 Ser Val Lys Asn Pro Met Gly Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro 1 5 10 15 Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys 20 25 <210> 19 <211> 29 <212> PRT <213> Zika virus <400> 19 Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro 1 5 10 15 Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys 20 25 <210> 20 <211> 29 <212> PRT <213> West Nile Virus <400> 20 Lys Gln Glu Gly Met Tyr Lys Ser Ala Pro Lys Arg Leu Thr Ala Thr 1 5 10 15 Thr Glu Lys Leu Glu Ile Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys 20 25 <210> 21 <211> 29 <212> PRT <213> Japanese Encephalitis Virus <400> 21 Lys Pro Val Gly Arg Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr 1 5 10 15 Gln Glu Lys Phe Glu Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys 20 25 <210> 22 <211> 29 <212> PRT <213> Saint Louis Encephalitis Virus <400> 22 Glu Asp Pro Lys Tyr Tyr Lys Arg Ala Pro Arg Arg Leu Lys Lys Leu 1 5 10 15 Glu Asp Glu Leu Asn Tyr Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys 20 25 <210> 23 <211> 29 <212> PRT <213> Yellow Fever Virus <400> 23 Asp Pro Lys Asn Val Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro Phe Ser Arg Ile 1 5 10 15 Arg Asp Gly Leu Gln Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly Lys 20 25 <210> 24 <211> 29 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 24 Asp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg Pro Gln 1 5 10 15 Pro Met Glu His Lys Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys 20 25 <210> 25 <211> 29 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 25 Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg Pro Gln 1 5 10 15 Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys 20 25 <210> 26 <211> 29 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 26 Asp Ile Thr Gly Val Leu Glu Gln Gly Lys Arg Thr Leu Thr Pro Gln 1 5 10 15 Pro Met Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys 20 25 <210> 27 <211> 29 <212> PRT <213> Dengue virus <400> 27 Asp Val Lys Gly Val Leu Thr Lys Gly Lys Arg Ala Leu Thr Pro Pro 1 5 10 15 Val Asn Asp Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys 20 25

Claims (54)

  1. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원 1μg 내지 40μg 용량을 포함하고, 이 때 항원은 비활성화된 전체 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 가지는, 백신 또는 면역원성 조성물.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    항원은 정제되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서,
    크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 항원의 주요 피크는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  5. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 또는 면역원성 조성물은 약 2μg 용량의 정제된 비활성화 전체 바이러스를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 또는 면역원성 조성물은 약 5μg 용량의 정제된 비활성화 전체 바이러스를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
  7. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 또는 면역원성 조성물은 약 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 바이러스를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 적응 돌연변이 또는 돌연변이는 Trp98Gly 돌연변이인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    지카 바이러스는 균주 PRVABC59에서 유래되는, 백신 또는 면역원성 조성물.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    어쥬번트를 추가로 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서,
    어쥬번트는 수산화 알루미늄인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서,
    백신 또는 면역원성 조성물은 100 μg 내지 600μg 수산화 알루미늄, 또는 100 μg 내지 300μg 수산화 알루미늄, 또는 150μg 내지 250μg 수산화 알루미늄, 또는 약 200 μg 수산화 알루미늄을 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물.
  13. 청구항 1 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
    지카 바이러스는 클론 분리주, 특히, 플라크 정제된 클론 지카 바이러스 분리주로부터 얻은 클론 분리주인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  14. 청구항 1 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    다음을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물:
    - 약 10μg 용량의 정제된 비활성화 전체 바이러스
    - 약 200 μg의 수산화 알루미늄,
    - 완충제; 그리고 선택적으로
    당, 가령, 수크로스.
  15. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 백신 또는 면역원성 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 감염을 치료 또는 예방, 특히 예방하는 방법.
  16. 대상에게 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상에서 지카 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
  17. 임신한 대상 또는 임신하고자 하는 대상 또는 임신 가능성이 있는 여성에게 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 백신을 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 태아 또는 신생아에서 지카 바이러스 질병의 예방 방법.
  18. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 백신을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 지카 바이러스 질병의 예방 방법.
  19. 청구항 15 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 임신했거나 또는 임신하고자 하거나 임신 가능성이 있는 여성인, 방법.
  20. 청구항 15 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    심각한 이상 반응이 나타나지 않는, 방법.
  21. 청구항 15 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    39℃ 및 그 이상의 발열이 나타나지 않는, 방법.
  22. 청구항 15 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 또는 면역원성 조성물은 근육내 또는 피하 투여로 투여되는, 방법.
  23. 청구항 15 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 또는 면역원성 조성물은 1회 이상 투여되는, 방법.
  24. 청구항 15 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
    10μg 용량을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물이 1회 투여되는, 방법.
  25. 청구항 23 또는 청구항 24에 있어서,
    백신 또는 면역원성 조성물의 제 1 투여 후 14 및/또는 28일에 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시, 대상에서 지카 바이러스에 대해 200 초과 또는 250 초과의 중화 항체 역가 생성이 유도되는, 방법.
  26. 청구항 15 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
    10 μg 용량을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물은 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로 투여되는, 방법.
  27. 청구항 26에 있어서,
    일차접종 및 추가접종 투여는 약 1 내지 약 16 주 간격으로 발생하는, 방법.
  28. 청구항 26 및 청구항 27에 있어서,
    제 2 (추가접종) 투여는 제 1 (일차접종) 투여 후 최소한 28일차에 투여되는, 방법.
  29. 청구항 26 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    백신 또는 면역원성 조성물의 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시, 대상에서 지카 바이러스에 대해 1000 초과 또는 1500 초과의, 또는 2000 초과 또는 3000 초과의 중화 항체 역가 생성이 유도되는, 방법.
  30. 청구항 15 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 지카 풍토병 지역, 선택적으로 지카 풍토병 발병 대상 지역 출신인, 방법.
  31. 청구항 15 내지 청구항 29 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 풍토병 지역을 여행하는 지카 비-풍토병 지역 출신인, 방법.
  32. 청구항 15 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 연령이 18 내지 29세이고, 특히 대상은 여성 대상인, 방법.
  33. 청구항 15 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 연령이 30 내지 49세이고, 특히 대상은 여성 대상인, 방법.
  34. 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    청구항 15 내지 청구항 33 중 어느 한 항의 방법에서 사용하기 위한 것인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  35. 청구항 15 내지 청구항 33 중 어느 한 항의 방법을 위한 약제의 제조에 있어서 청구항 1 내지 청구항 14 중 어느 한 항의 백신 또는 면역원성 조성물의 용도.
  36. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 1500 초과, 또는 2000 초과, 또는 3000 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 상기 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
  37. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 상기 추가접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 100%의 혈청전환율을 유도하는, 상기 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
  38. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 단회 투약 또는 일차접종 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 단회 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 200 초과, 또는 250 초과의 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 상기 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
  39. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 단회 투약 또는 일차접종 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 상기 단회 투약 또는 일차접종 투여 후 14 및/또는 28일에 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 60%, 70%, 80% 또는 90%의 혈청전환율을 유도하는, 상기 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
  40. 청구항 36 내지 청구항 39 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 40μg 용량의 항원을 포함하고, 이 때 항원은 비활성화 전체 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  41. 청구항 40에 있어서,
    지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 가지는, 백신 또는 면역원성 조성물.
  42. 청구항 40 내지 청구항 41에 있어서,
    항원은 정제되고, 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 항원의 주요 피크는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  43. 청구항 36 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 지카 풍토병 지역, 선택적으로 지카 풍토병 발병 대상 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  44. 청구항 36 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 풍토병 지역을 여행하는 지카 비-풍토병 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  45. 청구항 36 내지 청구항 44 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 연령이 18 내지 29세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  46. 청구항 36 내지 청구항 44 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 연령이 30 내지 49세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  47. 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 필요로 하는 대상 개체군의 개개 대상에 투여하는 것을 포함하며, 이 때 백신 또는 면역원성 조성물은 약 1 내지 약 16 주 간격으로 제 1 (일차접종) 및 제 2 (추가접종) 투여로서 투여되고, 백신 또는 면역원성 조성물의 투여는 플라크 감소 중화 검사 (PRNT)로 측정시 상기 추가접종 투여 후 14일 및/또는 28일에 20명 이상의 플라비바이러스 나이브 대상 및/또는 20명 이상의 지카 바이러스 혈청음성 대상 개체군에서 일차접종 투여 후 28일에 유도되는 기하 평균 중화 항체 역가보다 10 배 이상, 또는 15 배 이상, 또는 20 배 이상, 또는 25 배 이상 더 높은 기하 평균 중화 항체 역가를 유도하는, 상기 대상 개체군에서 지카 바이러스 감염의 치료 또는 예방, 특히 예방 방법에서 사용하기 위한, 지카 바이러스로부터의 하나의 항원을 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물.
  48. 청구항 47에 있어서,
    상기 백신 또는 면역원성 조성물은 1μg 내지 40μg 용량의 항원을 포함하고, 상기 항원은 비활성화 전체 바이러스인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  49. 청구항 48에 있어서,
    지카 바이러스는 서열 번호: 1의 위치 98에서, 또는 서열 번호: 1의 위치 98에 상응하는 위치에서 돌연변이를 가지는, 백신 또는 면역원성 조성물.
  50. 청구항 47 내지 청구항 49에 있어서,
    항원은 정제되고, 크기 배제 크로마토그래피에서 정제된 항원의 주요 피크는 이러한 크기 배제 크로마토그래피에서 곡선 아래 총면적의 85% 이상인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  51. 청구항 47 내지 청구항 50 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 지카 풍토병 지역, 선택적으로 지카 풍토병 발병대상 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  52. 청구항 47 내지 청구항 50 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 풍토병 지역을 여행하는 지카 비-풍토병 지역 출신인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  53. 청구항 47 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 연령이 18 내지 29세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 백신 또는 면역원성 조성물.
  54. 청구항 47 내지 청구항 52 중 어느 한 항에 있어서,
    대상은 연령이 30 내지 49세이고, 특히 대상은 임신 가능성이 있는 여성인, 백신 또는 면역원성 조성물.
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