LT4120B

LT4120B - Thrombopoetin

Info

Publication number: LT4120B
Application number: LT96-118A
Authority: LT
Inventors: Dan L Eaton; Frederic J De Souvage
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-01-03
Filing date: 1996-08-02
Publication date: 1997-03-25
Also published as: LT96118A; BR9408487A; US6660256B1; ZA9410355B; PL180765B1

Description

Šis išradimas susietas su baltymų, įtakojančių hemopoetinių ląstelių, ypač trombocitų pirmtakų, išlikimą, proliferaciją, diferencijaciją arba brendimą, išskyrimu, gryninimu, o taip pat su genoinžinierine arba chemine sinteze. Šis išradimas susijęs su nukleino rūgščių, koduojančių baltyminį Ugandą, kuris susiriša su citokinų receptorių superšeimos nariu mpl ir aktyvuoja jį, klonavimu ir ekspresija. Toliau šis išradimas susietas su šių baltymų (atskirai ir kartu su kitais citokinais) pritaikymu, gydant imunines arba hemopoetinės sistemos sutrikimus, tame tarpe ir trombocitopeniją .

IŠRADIMO PAGRINDAS

1. Hemopoetinė sistema.

Hemopoetinė sistema produkuoja subrendusias specializuotas kraujo ląsteles, būtinas žinduolių išgyvenimui. Šios subrendusios ląstelės yra: eritrocitai, transportuojantys deguonį ir anglies dvidegini, T- ir B-limfocitai, atsakingi už ląstelinį ir humoralinį imuninį atsaką, trombocitai, būtini kraujo krešėjimui, bei granuliocitai ir makrofagai, kurie yra specilizuoti fagocitozei ir veikia kaip pagalbinės ląstelės kovojant su infekcija. Savo ruožtu tarp granuliocitų išskiriami: neutrofilai, eozinofilai, bazofilai ir tukliosios ląstelės; kiekvienas šių ląstelių tipas turi savo atskiras funkcijas. Pasirodo, visos šios subrendusios specializuotos ląstelės kyla iš vienintelio bendro primytyvaus ląstelių tipo, kuris vadinamas pliuripotentinėmis (daugiapotentinėmis arba totipotentinėmis) kamieninėmis ląstelėmis, pirmą kartą atrastomis kaulų čiulpuose (Dexteer et ai., Am. Rev. Cell Biol., 3:423-441 [1987]) .

Subrendusios specializuotos kraujo ląstelės turi būti produkuojamos dideliais kiekiais per visą žinduolio gyvenimą. Didžioji dauguma šių specializuotų kraujo ląstelių išlieka funkcionaliai aktyvioje būklėje nuo kelių valandų iki kelių savaičių (Cronkite et ai., Blood cells, 2:263-284 [1976]). Todėl žinduolio kraujo ląstelių homeostazei palaikyti būtinas visų brendimo etapų ląstelių pastovus atsinaujinimas: pradedant nuo pačių kamieninių ląstelių, tarpinių, dalinai specializuotų pirmtakų ir baigiant subrendusiomis kraujo ląstelėmis.

Visos hemopoetinės sistemos pagrindas yra pliuripotentinės kamieninės ląstelės. Šių ląstelių kiekis yra sąlyginai mažas; jos pastoviai atsinaujina pasidalindamos i dukterines kamienines ląsteles arba vystosi diferenciacijos keliu, kai transformuojasi per eilę diferenciacijos etapų į vis labiau subrendusias įvairom šakom specifines ląsteles-pirmtakus, kol pasiekia aukščiausią diferenciacijos lygi - specializuotas subrendusias kraujo ląsteles.

Pavyzdžiui, tam tikros multipotentinės ląstelėspirmtakai, vadinamos CFC-Mix, kilusios iš kamieninių ląstelių, gali arba proliferuoti (atsinaujinti) arba diferencijuotis ir sudaryti kolonijas, kurių sudėtyje yra įvairios mieloidinės ląstelės: eritrocitai, neutrofilai, megakariocitai, trombocitų pirmtakai, makrofagai, bazofilai, eozinofilai ir tukliosios ląstelės. Kitos ląstelės-pirmtakai priklauso limfoidinei atšakai ir po proliferacijos bei brandos išsivysto į T- ir Bląsteles.

Be to, tarp CFC-Mix pirmtakų ir mieloidinių ląstelių yra eilė žemesnio rango ląstelių-pirmtakų, kurių galimybės diferencijuotis yra ribotos. Šie specifiniai pirmtakai klasifikuojami pagal jų pali3 kuonis. Žinomi šie tarpiniai mieloidinės atšakos ląstelių pirmtakai: eritroidiniai kolonijas formuojantys vienetai (CFU-E) - eritrocitams; granuliocitų/makrofagų kolonijas formuojančios ląstelės (GMCFC) - neutrofilams ir makrofagams; megakariocitų kolonijas formuojančios ląstelės (Meg-CFC) - megakariocitams; eozinofilų kolonijas formuojančios ląstelės (Eos-CFC) - eozinofilams; ir bazofilų kolonijas formuojančios ląstelės (Bas-CFC) tukliosioms ląstelėms. Tarp pliuripotentinių kamieninių ląstelių ir subrendusių kraujo ląstelių žinomi ir kiti tarpiniai pirmtakai (žiūr. žemiau). Tikimasi atrasti dar daugiau tokio tipo ląstelių-pirmtakų, kurie skirtųsi pagal specifiškumą vienai ar kitai ląstelių atšakai ir pagal savo galimybes atsinaujinti.

Pagrindinis normalios hemopoetinės sistemos vieklos principas yra toks: ląstelių sugebėjimas atsinaujinti sumažėja, mažėjant jų multipotencij ai ir didėjant specifiškumui tam tikrai atšakai. Tokiu būdu, viename hematopoetinių ląstelių spektro gale yra pliuripotentinės kamieninės ląstelės, kurios sugeba atsinaujinti ir diferencijuotis i visų tipų riboto potencialumo ląsteles-pirmtakus. Būtent šia kamieninių ląstelių savybe naudojasi kaulų čiulpų transpalantacijos terapija, kai primityvios kamieninės transplantanto ląstelės iš naujo užsieja visą hemopoetinių ląstelių sistema. Kitame spektro gale yra atskirom hemopoetinėm ląstelių atšakom specifiniai pirmtakai ir jų palikuonys, kurie jau prarado sugebėjimą atsinaujinti, bet įgijo brandų funkcionalų aktyvumą.

Kamieninių ir atšakai specifinių ląstelių-pirmtakų proliferacija ir vystymasis kontroliuojami hematologiniais augimo faktoriais arba citokinais. Šių faktorių vaidmuo in vivo yra sudėtingas ir nevisiškai išaiškintas. Kai kurie augimo faktoriai, kaip interleukinas-3 (IL-3) gali stimuliuoti ir multipotentines kamienines ląsteles, ir kelių atšakų ribotos potencijos ląsteles-pirmtakus, tarp jų ir megakariocitų pirmtakus. Ankščiau buvo manoma, kad kiti faktoriai, tokie kaip granuliocitų makrofagų kolonijas stimuliuojantis faktorius (GM-CSF) veikia tik GM-CFC. Tačiau vėliau buvo išaiškinta, kad GM-CSF taip pat įtakoja interalia magakariocitų proliferaciją ir vystymąsi. Tokiu būdu, buvo parodyta, kad IL-3 ir GM-CSF biologiniai aktyvumai persidengia, tačiau jų poveikis skiriasi. Neseniai buvo taip pat parodyta, kad interleukinas 6 (IL-6) ir interleukinas 11 (IL-11), kurie patys savaime neturi įtakos meg-kolonijų formavimuisi, veikiant kartu su IL-3 žymiai sustiprina pastarojo stimuliuojamą megakariocitų brendimą (Yonemura et ai., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

Tuo būdu, hemopoetiniai augimo faktoriai gali veikti vienos ar daugiau atšakų ląstelių augimą bei diferenciaciją, jų aktyvumai gali persidengti su kito augimo faktoriaus aktyvumu, veikiant tam tikras ląsteles-pirmtakus; vieni augimo faktoriai gali sustiprinti kitų augimo faktorių poveikį ląstelėms.

Taip pat parodyta, kad hemopoetiniai augimo faktoriai gali veikti įvairiose ląstelių vystymosi stadijose: pliuripotentines kamienines ląsteles, visų lygių tarpinius pirmtakus ir subrendusias kraujo ląsteles. Pavyzdžiui, eritropoetinas (EPO) indukuoja tik eritroidinių pirmtakų proliferaciją. IL-3 veikia ankstesnėje vystymosi stadijoje, įtakodamas primityvių kamieninių ląstelių ir tarpinių ląstelių-pirmtakų vystymąsi. Kiti augimo faktoriai, tokie kaip kamieninių ląstelių faktorius (SCF) veikia dar primityvesnių ląstelių vystymąsi.

Vertinant iš ateities perspektyvos, naujų hemopoetinių augimo faktorių, veikiančių kraujo ląstelių ir jų pirmtakų gyvybingumą, proliferaciją, diferencijaciją ir brendimą, atradimas būtų labai svarbus, perspektyvus ir naudingas, ypač atstatant hemopoetinę sistemą, pažeistą ligos, radio- ar chemoterapij os.

II. Megakariocitopoezė - trombocitų produkcija

Megalokariocitopoezės ir tromocitų produkcijos reguliacija nuodugniai aprašyta apžvalginiuose straipsniuose: Mazur, Exp. Hematol., 15:248 [1987] ir Hoffman, Blood, 74:1196-1212 [1989]. Reziumuojant trumpai, kaulų čiulpų pliuripotentinės ląstelės diferencijuojąs! į megakariocitų, eritrocitų ir mielocitų ląstelių linijas (atšakas). Manoma, kad tarp kamieninių ląstelių ir megakariocitų egzistuoja tarpinių megakariocitų ląstelių-pirmtakų hierarchija. Identifikuotos mažiausiai trys megakariocitų pirmtakų klasės: intensyvaus augimo židinius formuojančių vienetų megakariocitai (BFU-MK), kolonijas formuojančių vienetų megakariocitai (CFU-MK) ir mažo tankio megakariocitų ląstelės-pirmtakai (LD-CFU-MK). Megakariocitų brendimas pats savaime yra nenutrūkstantis vystymosi procesas, kurio suskirstymas į atskiras stadijas remiasi standartinais morfologiniais kriterijais. Akstyviausias atpažįstamas megakariocitų (MK arba meg) šeimos narys yra megakarioblastas. Šios ląstelės pradžioje būna 2030 ųm diametro su bazofiline citoplazma ir turi šiek tiek netaisyklingos formos branduolį su netankiu, kiek tinkluotu chromatinu ir keliais branduolėliais. Vėliau megakarioblastai (poliploidiniai) gali turėti iki 32 branduolių, bet citoplazma lieka nesubrendusi. Prasidėjus brendimui, branduolys tampa labiau skiltelėtas, citoplazmos kiekis padidėja, ji pasidaro labiau acidofilinė ir granuliuota. Labiausiai subrendusios šios šeimos ląstelės gali atrodyti kaip yrantys trombocitai periferinėje dalyje. Normaliai mažiau kaip 10 % megakariocitų yra blasto stadijoje ir daugiau kaip 50 % yra visiškai subrendę. Pagal sąlyginę morfologinę klasifikaciją, paprastai taikomą megakariocitams, išskiriami megakarioblastai (ankstyvoji forma), promegakariocitai arba bazofiliniai megakariocitai (tarpinė forma) ir subrendę (acidofiliniai, granuliocitai arba trombocitus produkuojantys) megakariocitai (vėlyvosios formos) . Subrendusieji megakariocitai išleidžia citoplazminius filamentus į sinusoidalinę erdvę, kur šie atsiskiria ir fragmentuojasi į individualius trombocitus (Williams et. ai., Hematology, 1972).

Manoma, kad megakariocitopoezės procese dalyvauja daug reguliatorinių faktorių (Williams et ai., Br. J. Haematol., 52:173 [1982] ir Williams et ai., J. Cell Physiol., 110:101 [1982]). Teigiama, kad ankstyvoji megakariocitopoezės stadija yra mitotinė ir priklauso nuo ląstelių proliferacijos, kolonijų formavimosi iš CFU-MK, bet nepriklauso nuo trombocitų skaičiaus kraujyje (Burstain et ai., J. Cell Physiol., 109:333 [1981] ir Kimura et ai., Exp. , Hematol., 13:1048 [1985]). Vėlyvoji brendimo stadija nemitotinė, susijusi su branduolių poliploidizacij a ir citoplazmos brendimu ir veikiausiai grįžtamai reguliuojama periferinių trombocitų skaičiumi. (Odeli et ai., Blood, 48:765 [1976] ir Ebbe et ai., Blood, 32: 787 [1968]).

Apie atskiro specifinio megakariocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus (MK-CSF) egzistavimą buvo diskutuojama literatūroje (Mazur, Exp. Hematol., 15: 340-350 [1987]). Daugumos autorių nuomone, toks gyvybiškai svarbus procesas kaip trombocitų produkcija turėtų būti reguliuojamas citokino (citokinų), atsakingo būtent už šį procesą. Ši hipotezė paskatino jau 30 metų besitęsiančią tokio specifinio citokino paiešką, tačiau iki šiol nebuvo išskirtas, sekvenuotas ir charakterizuotas joks citokinas, kuris būtų tik MK-CSF (TPO) .

Nors buvo paskelbti darbai, teigiantys, kad iš dalies pasisekė išgryninti MK-CSF iš kelių šaltinių: iš gyvūnų su eksperimentiškai sukelta trombopenij a plazmos (Hil et ai., Exp. Hematol., 14:752 [1986]); iš žmogaus embrioninių inkstų ląstelių kultūros kondicionuotos terpės [CM] (McDonald et ai., J. Lab. , Clin. Med., 85:59 [1975]); iš žmonių, sergančių plastine anemija ir idiopatine trombocitopenija purpura, šlapimo ekstraktų (Kawakita et ai., Blood, 6:556 [1983]) ir plazmos (Hoffman et ai., J. Clin. Invest., 75:1174 [1985]), bet šių faktorių fiziologinė funkcija daugeliu atvejų lieka neišaiškinta.

Kondicionuotos terpės, kurioje augo Phytolacca americana, mitogenų aktyvuotos blužnies ląstelės (PWMSpCM) ar pelių mielomonocitų ląstelių linija WEHI-3 (WEHI-3CM), buvo naudojamos kaip megakariocitų stimuliatoriai. PWM-SpCM sudėtyje yra faktoriai, kurie paskatina CFU-MK augimą (Metcalf et ai., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 72:1744-1748 [1975]; Quesenberry et ai., Blood, 65:214 [1985] ir Iscove, N. N., in Hematopoietic Cell Differentiation, ICN-UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Vol. 10, Golde et ai., eds. [New York, Academy Press] pp 37-52 [1978]). Vienas iš šių faktorių yra interleukinas 3 (IL-3), daugelio ląstelių tipų kolonijas stimuliuojantis faktorius (multi-CSF) (Burstein, Blood Cells, 11:469 [1986]).

Kiti šioje kondicionuotoje terpėje esantys faktoriai dar nebuvo identifikuoti ir išskirti. WEHI-3 yra pelių mielomonocitų linija, kuri sekretuoja palyginti daug IL-3 ir kiek mažiau GM-CSF. Buvo parodyta, kad IL-3 skatina daugelio hemopoetinių ląstelių augimą (Ihle et ai., J. Immunol., 13:282 [1983]), taip pat parodyta, kad IL-3 sustiprina kitų žinomų hemopoetinų hormonų arba augimo faktorių efektą (Bartelmez et ai., J. Cell Physiol., 122:362-369 [1985] ir Warren et ai., Cell,

46:667-674 [1988]), tarp jų ir eritropoetino (EPO) bei interleukino-1 (IL-1) efektą, indukuodamas labai ankstyvius multipotentinius pirmtakus ir labai didelių mišraus tipo hemopoetinių ląstelių kolonijų formavimą.

Kiti megakariocitų stimuliatorių šaltiniai buvo rasti terpėse, kurios buvo kondicionuojamos pelių plaučių, kaulų makrofagų ląstelių linijomis, peritonealinio eksudato ląstelėmis bei žmogaus embrioninių inkstų ląstelėmis. Nors yra prieštaringų duomenų (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1987]), bet yra ir įrodymų (Geissler et ai., Br. J. Haematol., 60:233-238 [1985]), kad ne monocitai, o greičiau aktyvuotos Tląstelės turi stimuliuojančios įtakos magakariocitopoezei. Šis faktas leidžia manyti, kad aktyvuotų Tlimfocitų sekretuojami faktoriai, tokie kaip interleukinai, gali reguliuoti MK vystymąsi (Geissler et ai., Exp. Hematol., 15:845-853 [1987]). Keletas darbų yra skirta išgryninto eritropoetino EPO įtakos megakariocitopoezei tyrinėjimui (Vainchenker et ai., Blood, 54:940 [1979]; McLeod et ai., Nature, 261:492-4 [1976] ir Williams et ai., Exp. Hematol., 12:734 [1984]). Šie tyrimai parodė, kad EPO hormonas skatina MK kolonijų formavimąsi. Šis efektas taip pat parodytas ir beseruminėse kultūrose, ir kultūrose su serumu, net ir be pagalbinių ląstelių (Williams et ai., Exp. Hematol., 12:734 [1984]). Teigiama, kad EPO labiau dalyvauja vienos ir dviejų ląstelių megakariocitopoezės stadijose, tuo tarpu PWM-SpCM, kuris veikia megakariocitų, vystymąsi dalyvauja keturių ląstelių stadijose. Visų šių faktorių sąveika ir ankstyvojoje ir vėlyvoje megakariocitų vystymosi fazėse dar turi būti išaiškinta.

Kelių laboratorijų nepriklausomi duomenys rodo,kad vieninteliai multi-potentiniai faktoriai, kurie turi individualų MK-kolonijas stimuliuojanti aktyvumą, yra GM-CSF, IL-3 ir, mažesniu mastu, B-ląsteles stimuliuo 9 jantis faktorius IL-6 (Ikebuchi et ai., Proc., Natl. Acad. Sci. USA, 84:9035 [1987]). Neseniai keli autoriai paskelbė duomenis, kad IL-11 ir leukemiją inhibuojantis faktorius (LIF) , veikdamas kartu su IL-3, padidina megakariocitų dydį ir ploidiškumą (Yonemura et ai., British Journal of Hematology, 84:16-23 [1993]; Burstein et ai., J. Cell. Physiol., 153:305-312 [1992]; Metcalf et ai., Blood, 76:50-56 [1990]; Metcalf et ai., Blood, 77:2150-2153 [1991]; Bruno et ai., Exp. Hematol., 19:378-381 [1991] ir Yonemura et ai., Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

Kitos įdomios publikacijos yra: Eppsten et ai., JAV patentas Nr. 4962091; Chong, JAV patentas Nr. 4879111; Fernandes et ai., JAV patentas Nr. 4604377; Wissler et ai., JAV patentas Nr. 4512971; Gottlieb, JAV patentas Nr. 4468379; Bennett et ai., JAV patentas Nr. 5215895; Kogan et ai., JAV patentas Nr. 5250732; Kimura et ai., Eur. J. Immunol., 20(9):1927-1931 [1990]; Secor et ai., J. of Immunol., 144(4): 1484-1489 [1990];

Warren	et	ai. ,	J.	of Immunol	., 140(1): 94-99	[1988];
Warren	et	ai. ,	Exp.	Hematol.,	17(11): 1095-1099	[1989];
Bruno	et	ai. ,	Exp.	Hemą tol.,	17 (10) :1038-1043	[1989] ;

Tanikawa et ai., Exp. Hematol., 17(8): 883-888 [1989]; Koike et ai., Blood, 75(12): 2286-2291 [1990]; Lotem, Blood, 75(5): 1545-1551 [1989]; Rennick et ai., Blood, 73(7): 1828-1835 [1989] ir Clutterbuck et ai., Blood, 73 (6) : 1504-1512 [1989] .

III. Trombocitopenija

Trombocitai yra svarbiausias kraujo krešėjimo mechanizmo elementas. Cirkuliuojančių trombocitų kiekio sumažėjimas, vadinamas trombocitopenija, būdingas įvairiems klinikiniams atvejams ir sutrikimams. Pagal viešai priimtą apibūdinimą trombocitopenija yra išskiriamos kategorijos: kaulų čiulpuose, (splenomegalija) trombocitų kiekio sumažėjimas iki 150xl0⁹ ląstelių litre ir dar mažiau. Pagal trombocitų gyvavimo trukmę, trys pagrindinės trombocitopenijos (1) nepakankama trombocitų produkcija (2) trombocitų kaupimasis blužnyje arba (3) padidinta trombocitų destrukcija periferiniame kraujyje (pvz. autoimuninė trombocitopenija, trombocitų pažeidimas radio- arba chemoterapijos metu) . Be to, kai pacientams greitai suleidžiami dideli kiekiai kraujo produktų su sumažintu trombocitų kiekiu, dėl praskiedimo taip pat gali išsivystyti trombocitopenija.

Klinikiniai trombocitopenijos pasireiškimai, pvz., kraujavimas, priklauso nuo trombocitopenijos priežasties, jos sunkumo ir galimų asocijuotų kitų krešėjimo sistemos defektų, trombocitų kiekiu nuo

Kaip taisyklė, pacientai su

20xl0⁹ iki ΙΟΟχΙΟ⁹ litre rizikuoja turėti stiprų kraujavimą po traumos, tuo tarpu pacientai, kurių trombocitų kiekis mažesnis, nei 20xl0⁹ litre - gali kraujuoti spontaniškai. Tokie pacientai yra kandidatai trombocitų transfuzij ai, nepaisant šią procedūrą lydinčios imuninės reakcijos ir virusinio užkrato rizikos. Esant vienodam trombocitų skaičiui kraujavimai sunkesni, jei trombocitopenijos priežastis yra nepakankama trombocitų produkcija, o ne jų padidėjusi destrukcija. Pastaruoju atveju dėl pagreitintos trombocitų apykaitos kraujyje cirkuliuoja jaunesni, didesni ir hemostatiškai efektyvesni trombocitai. Trombocitopenija gali atsirasti dėl daugelio priežasčių, trumpai aprašomų žemiau. Detalų aprašymą galima rasti Schafner, A. I., Trombocitopenija ir trombocitų funkcijos pažeidimai Internal Medicine, 3rd

Ed.

John J. Hutton et ai., Eds. , Little Brown and Co. ,

Boston/Toronto/London [1990;

(a) Trombocitopenija sukelta nepakankamos trombocitų produkcijos

Įgimtos trombocitopenijos priežastimi gali būti aplastinė anemija (Falkonio sindromas) ir įgimta amegakariocitinė trombocitopenija, kuri gali būti asocijuota su kaulų deformacijomis. Įgytus trombocitų produkcijos sutrikimus gali iššaukti arba megakariocitų hipoplazija arba neefektyvi trombopoezė. Megakariocitų hipoplazijos priežastys gali būti įvairios, tarp jų kaulų čiulpų aplazija (įskaitant ir idiopatines formas ir chemoterapinių agentų arba radioterapijos iššauktas mielosupresijas), mielofibrozė, leukemija, metastatinių auglių bei granulomų invazija į kaulų čiulpus. Kai kuriais atvejais toksinai, infekcijos agentai, vaistai gali gana selektyviai veikti trombopoezę, pvz., laikiną trombocitopeniją gali sukelti alkoholis ir tam tikros virusinės infekcijos; nežymi trombocitopenija lydi gydymą triazidiniais diuretikais. Pabaigai reikia paminėti, kad neefektyvi trombopoezė, kaip antrinis megablastinių procesų pasireiškimas, dėl folinės rūgšties ar vitamino B₁₂ trūkumo taip pat gali sukelti trombocitopeniją, tokiais atvejais paprastai lydimą anemijos ir leukopenijos.

Gydant trombocitopenijas, kilusias dėl sumažintos trombocitų produkcijos, stengiamasi išsiaiškinti priežastį, dėl kurios sutriko normali kaulų čiulpų funkcija, ir tą priežastį pašalinti. Trombocitų transfuzija paprastai taikoma tik pacientams su labai rimtais kraujavimais arba tokiems ligoniams atliekant chirurgines operacijas, nes izoimunizacij a gali sukelti nepakantumą pakartotinoms trombocitų trasfuzijoms. Gleivinės- kraujavimo dėl sunkios trombocitopenijos atvejais gali padėti peroralinis arba intraveninis antifibrinolitinių agentų panaudojimas. Tačiau ligoniams su išsėtine intravaskuliarine koaguliacija (DIC) antifibrinolitinių agentų naudojimas gali sukelti trombines komplikacijas.

(b) Trombocitopenija dėl trombocitų kaupimosi blužnyje

Splenomegalija, nepriklausomai nuo ją sukėlusios priežasties, gali būti susijusi su silpna arba vidutine trombocitopenija. Tai didžia dalimi yra pasyvus procesas (hipersplenizmas), kai blužnyje sulaikomi trombocitai ir šis procesas kardinaliai skiriasi nuo aktyviosios trombocitų destrukcijos blužnyje, kuri vyksta imuninių reakcijų sukeltos trombocitopenijos metu (žr. žemiau). Dažniausia hipersplenizmo priežastis yra splenomegalij a, kilusi dėl alkoholinės cirozės, tačiau ir kitos stazinės, infiltracinės ar limfoproliferacinės splenomegalijos formos taip pat susijusios su trombocitopenija. Trombocitų kiekis paprastai būna mažesnis nei 50xl0⁹ litre, jei trombocitopenija kilo dėl hipersplenizmo.

(c) Trombocitopenija dėl neimuninės trombocitų destrukcijos.

Trombocitopenijos priežastimi gali būti pagreitinta trombocitų destrukcija, sukelta įvairių neimuninių procesų. Tokio tipo sutrikimams priklauso išsėtinė intravaskulinė koaguliacija, intravaskulinis protezavimas, ekstrakorporinė kraujo cirkuliacija, trombinės mikroangiopatijos, pvz., trombinė trombocitinė purpura. Visais šiais atvejais cirkuliuojantys trombocitai kontaktuoja su dirbtiniu paviršiumi arba su pažeista kraujagyslių sienele, yra šiose vietose pažeidžiami ir anksčiau laiko pašalinami iš cirkuliacijos retikuloendotelinės sistemos pagalba. Ligos ir sutrikimai, kuriems būdinga išsėtinė intravaskulinė koaguliacija (DIC) detaliai aprašyti Braunwald et ai., (eds.), Harrison's Principles of Internal Medicine, llth Ed., p. 1478, McGraw Hill [1987] . Intravaskuliniai protezai, tarp jų širdies vožtuvai ir intraaortiniai pripučiami kateteriai gali sukelti silpną arba destruk13 kelių vaistų poveikis, auksas, sulfonilamidai, cinę trombocitopeniją. Laikinoji trombocitopenija gali atsirasti pacientams, kuriems atliekama ekstrakorporinė kraujo cirkuliacija arba hemodializė, dėl trombocitų praradimo arba jų pažeidimo ekstrakorporinėje kraujo apytakos ciklo dalyje.

(d) Vaistų indukuota imuninė trombocitopenija Daugiau kaip 100 medikamentų gali sukelti imuninę trombocitopeniją. Tačiau gerai charakterizuotas tik Tai guanidinas, guaninas, cefalotinas ir heparinas.

Vaistų sukelta trombocitopenija dažnai būna labai ūmi ir paprastai išsivysto greitai, po kelių dienų nuo sensibilizuojančio gydymo pradžios.

(e) Imuninė (autoimuninė) trombocitopenija purpura (ITP)

Suaugusiems ITP yra chroniškas susirgimas, charakterizuojamas autoimunine trombocitų destrukcija. Autoantikūnai paprastai būna IgG klasės, kitų klasių antikūnų buvimas taip pat aprašytas literatūroje. Nors autoantikūnai siejami su trombocitų membranos GPIIbUIaz tikslus autoantikūnų specifiškumas daugeliu atvejų neidentifikuotas. Ekstravaskulinė sensibilizuotų trombocitų destrukcija vyksta blužnies ir kepenų retikulo-endotelinėj e sistemoje. Nors apie pusė ITP atvejų yra idiopatiniai, daug tokių pacientų serga reumatinėmis, autoimuninėmis ligomis (pvz., sistemine raudonąja vilklige) arba limfoproliferaciniais susirgimais (pvz., lėtine limfocitinę leukemija).

(f) ŽIV sukelta ITP

ITP vis dažniau pasireiškia kaip ŽIV infekcijos komplikacija (Morris et ai., Ann. Interrn. Med., 96:714-717 [1982]) ir gali atsirasti bet kurioje ligos stadijoje, tiek pacientams su diagnozuotu AIDS, ar AIDS-asocij uotų simptomų kompleksu, tiek ir ŽIV nešiotojams be AIDS simptomų. ŽIV infekcija sukelia ligą, charakterizuojamą dideliu ląstelinio imuniteto defi14 eitu, o taip pat oportunistinių infekcijų bei navikų buvimu. Pirminis imunologinis pažeidimas ŽIV infekcijos metu yra progresuojantis T-limfocitų, ekspresuojančių CD4 glikoproteiną, kiekio bei funkcijos nepakankamumas (Lane et ai., Ann. Rev. Immunol., 3:447 [1985]). Šis funkcionalių CD4 T-helperių praradimas greičiausiai ir yra ta priežastis, dėl kurios kyla dideli ląstelinio bei humoralinio imuniteto sutrikimai, pasireiškiantys AIDS būdingomis oportunistinėmis infekcijomis ir navikais (H. Lane supra).

Nors ŽIV-asocijuotos ITP mechanizmas nežinomas, manoma, kad jis skiriasi nuo kitų, nesusijusių su ŽIV infekcija, ITP mechanizmų (Walsh et ai., N. Eng. J. Med., 311:635-639 [1984]; Ratner, Am J. Med., 86:194198 [1989]).

IV Šiuolaikinė trombocitopenijos terapija

Pacientų su trombocitopenija terapijos būdo pasirinkimą apsprendžia konkreti klinikinė situacija. ŽIV-asocijuotos ir neasocijuotos trombocitopenijos gydymo būdai yra panašūs. Buvo išbandyti keli terapijos būdai, bet gydymo eiga vis dar tebėra ginčytina.

Trombocitų kieki pacientams su trombocitopenija pavyksta padidinti, gydant gliukokortikoidais (pvz., prednizolonu) , tačiau daugeliui pacientų trombocitų kiekis visiškai neatsistato. Be to, kai gliukokortikoido dozė sumažinama arba vaistų vartojimas nutraukiamas, dažnai stebimas ligos recidyvas. Kai kurie ŽIVasocijuotų ITP tyrimai leidžia daryti prielaidą, kad gliukokortikoidų terapija gali sukelti predispoziciją AIDS. Paprastai gliukokortikoidai skiriami, kai trombocitų kiekis sumažėja iki 20xl0⁹ litre, arba kai vyksta spontaninis kraujavimas.

Keliais sunkios ne ŽIV-asocijuotos ITP atvejais, kai gydymas gliukokortikoidais pasirodė neefektyvus, buvo sėkmingai panaudotas junginys:

4-(2-chlorfenil)-9-(metil-2[3-(4-morfolinil)-3propropanon-l-il]6H-tieno [3,2,f] [1,2,4]triazolo [4,3,a] [ 1,4]diazepinas (WEB 2086).

Pacientas, kurio trombocitų kiekis gydymo pradžioje buvo 37000-58000 ląstelių 1 μΐ, buvo gydomas WEB 2086. Po vienos - dviejų savaičių gydymo trombocitų kiekis padidėjo iki 140000-190000 ląstelių 1 μΐ. (EP 361,077 ir Lohman et ai., Lancet, 1147 [1988]).

Nors optimali įgytos amegakariocitinės trombocitopenijos purpura (AATP) gydymo schema dar nesurasta, buvo parodyta, kad antitimocitinis globulinas ATG (arklio antiserumas prieš žmogaus čiobrialiaukės audinį) sukelia visišką ilgalaikę remisiją. (Trimble et ai., Am. J. Hematol., 37:126-127 [1991]). Nauji tyrimai rodo, kad hemopoetinis ATG efektas priskirtinas mertiolatui, kur baltymas veikia kaip gyvsidabrio pernešėjas (Panella et ai., Cancer Research, 50: 4429-4435 [1990]).

Geri rezultatai buvo pasiekti, atliekant blužnies pašalinimą. Daugumai splenektomija pašalina svarbiausią trombocitų destrukcijos vietą ir svarbiausią autoantikūnų produkcijos šaltinį. Dažnaiusias šios procedūros rezultatas yra ilgalaikė remisija, kurios metu pacientams nereikia vartoti jokių medikamentų. Chirurginė intervencija nepageidautina, kai paciento imunitetas yra susilpnėjęs, todėl splenektomija rekomenduojama tik labai sunkais trombocitopenijos atvejais (pvz., sunki ŽIV-asocijuota ITP) ir tik tokiems pacientams, kuriems 2 -3 savaičių kortikoidų terapija nepadeda arba kurių būklė vėl pablogėja, nutraukus gliukokortikoido vartojimą. Šiuolaikinis mokslinių žinių lygis neleidžia tvirtinti arba paneigti, kad splenektomija turi poveikį AIDS predispozicijai.

Be prednizolono terapijos ir splenektomijos, gydant ŽIV-asocijuotos ITP, gauti neblogi preliminarūs rezultatai, naudojant kai kuriuos citotoksinius agentus, pvz., vinkristiną ir azidotimidiną (AZT, zidovudiną).

Vienas perspektyviausių būdų trombocitopenijai gydyti galėtų būti agentas, kuris pagreitintų megakariocitų arba jų pirmtakų diferenciaciją ir brendimą. Tokio agento, paprastai vadinamo trombopoetinu (TPO), atradimui skirta nemažai pastangų. Kiti literatūroje sutinkami TPO pavadinimai: trombocitopoezę stimuliuojantis faktorius (TSF), megakariocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius (MK-CSF), megakariocitus stimuliuojantis faktorius ir megakariocitų potenciatorius. Pirmą kartą TPO aktyvumas buvo pastebėtas 1959 metais (Rak et ai., Med. Exp. , 1:125), bet pastangos šį agenta išgryninti ir charakterizuoti tęsiasi iki šiol. Vienuose darbuose skelbiama apie TPO aktyvumą turinčių polipeptidų dalinį išgryninimą (žiūr., pvz., Tayrien et ai., J. Biol., Chem. , 262: 3262 [1987] ir Hoffman et ai., J. Clin. Invest., 75:1174 [1985]), kituose - teigiama, kad TPO nėra atskiras savarankiškas baltymas, o tik vienas iš žinomo polifunkcionalaus hormono (IL-3) aktyvumų (Sparrow et ai., Prog. Clin. Biol. Res. , 215:123 [1986]). Nepriklausomai nuo savo formos ar kilmės, molekulė, turinti trombopoetinį aktyvumą, turėtų didelę terapinę reikšmę. Nors, iki šiol nė vienas baltymas nebuvo tiksliai identifikuotas kaip TPO, didelį susidomėjimą sukelia atradimas, kad mpl (hipotetinio citokino receptorius) gali vykdyti trombopoetinio signalo perdavimą.

V. Mpl yra megakariocitopoetinio citokino receptorius

Manoma, kad hemapoetinių ląstelių proliferacija ir brendimas griežtai reguliuojami faktoriais, kurie tei5 giamai ar neigiamai moduliuoja pliuripotentinės kamieninės ląstelės proliferaciją ir diferenciaciją. Šie efektai pasiekiami ekstraląsteliniams baltyminiams faktoriams susirišus su didelio afiniškumo ląstelių paviršiaus receptoriais. Minimi ląstelių paviršiaus recepto10 riai turi didelę tarpusavio homologiją ir klasifikuojami kaip citokinų receptorių superšeimos nariai. Į šią superšeimą Įeina šių citokinų receptoriai: IL-2 (β ir γ grandinės) (Hatakeyama et ai., Science, 244:551-556 [1989]; Takeshita et ai., Science, 257:379-382 [1991]),

IL-3 (Itoh et ai., Science, 247:324-328 [1990]; Gorman et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5459-5463 [1990]; Kitamura et ai., Cell, 66:1165-1174 [1991a]; Kitamura et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5082-5086 [1991b]), IL-4 (Mosley et ai., Cell, 59: 335-348 20 [1989]),IL-5 (Takaki et ai., EMBO J., 9: 4367-4374 [1990]; Tavernier et ai., Cell, 66: 1175-1184 [1991]),

IL-6 (Yamasaki et ai., Science, 241:825-828 [1988];

Hibi et ai., Cell, 63: 1149-1157 [1990]), IL-7 (Goodwin et ai., Cell, 60:941-951 [1990]), IL-9 (Renault et ai.,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5690-5694 [1992]), granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojančiam faktoriui (GM-CSF) (Gearing et ai., EMBO J. , 8: 3667-3676 [1991]; Hayashida et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 244: 96559659 [1990]), granuliocitų kolonijas stimuliuojančiam faktoriui (G-CSF) (Fukunaga et ai., Cell, 61: 341-350 [1990a]); Fukunaga et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8702-8706 [1990b]); Larsen et ai., J. Exp. Med., 172: 1559-1570 [1990]), EPO (D'Andrea et ai., Cell, 57:277-285 [1989]; Jonės et ai.,

Blood, 76:31-35 [1990]), leukemijos inhibicijos faktoriui (LIF) (Gearing et ai., EMBO J., 10:2839-2848 [1991]), onkostatinui M (OSM) (Rose et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8641-78645 [1991]), o taip pat receptoriams prolaktinui (Boutin et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7744-7748 [1988]; Edery et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2112-2116 [1989]), augimo hormonui (GH) (Leung et ai., Nature, 330:537-543 [1987]) ir ciliariniam neurotropiniam faktoriui (CNTF) (Davis et ai., Science, 253:59-63 [1991]).

Citokinų superšeimos narius galima sugrupuoti į tris funkcines kategorijas (apžvalga pateikta Nicola et ai., Cell, 67:1-4 [1991]). Pirmąją klasę sudaro viengrandžiai receptoriai, pvz. eritropoetino receptorius (EPO-R) ir granuliocitų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus receptorius (G-CSF-R); šie receptoriai apima ligandą su dideliu afiniškumu per savo ekstraląstelinį domeną ir generuoja viduląstelini signalą. Antroji receptorių klasė, vadinama α-subvienetais, jungia interleukino-6 receptorių (IL6-R), granuliocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojančio faktoriaus receptorių (GMGSF-R), interleukino-3 receptorių (IL3-R) ir kitus citokinų receptorių superšeimos narius. a-Subvienetai gali prisijungti ligandą su nedideliu afiniškumu, tačiau perduoti viduląstelinio signalo nesugeba. Didelio afiniškumo receptoriai, sugebantys perduoti signalą, atsiranda, kai α-subvienetai susijungia į heterodimerą su trečiosios klasės citokinų receptoriais, vadinamais β-subvienetais; tokio receptoriaus pavyzdys yra β_€, kuris sudaro heterodimerus su IL3-R_a ir GM-CSF-R cc-subvienetais.

Įrodymai, kad mpl yra citokinų receptorių superšeimos narys kyla iš struktūros homologijos (Gearing, EMBO J., 8:3667-3676 [1988]; Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6834-6938 [1990]; Davis et ai., Science,

253:59-63 [1991] ir Vigon et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5640-5644 [1992]) ir iš jo sugebėjimo perduoti proliferacijos signalą.

Baltymo amino rūgščių liekanų seka, nustatyta iš klonuoto pelių c-mpl geno įrodo,kad šis baltymas homologiškas kitiems citokinų receptoriams. Ekstraląstelinis domenas sudarytas iš 465 amino rūgščių liekanų ir susideda iš dviejų subdomenų, kiekvienas subdomenas turi keturias konservatyvias cisteino liekanas ir ypatingą motyvą domeno C ir N galuose. Spėjama, kad Ugandą rišantys ekstraląsteliniai domenai turi panašią dvigubą cilindrinę β klosčių erdvinę struktūrą. Šis dublikuotas ekstraląstelinis domenas turi didelę homologiją su signalą perduodančią grandinę, bendrą IL-3, IL-5 ir GM-CSF receptoriams, o taip pat su LIF mažo afiniškumo receptoriaus Ugandą rišančių domenų (Vigon et ai., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]). Tokiu būdu, mpl gali priklausyti mažo afiniškumo Ugandą rišančiai citokinų receptorių klasei.

Pelių mpl ir žmogaus mpl P palyginimas parodė, kad šios baltymų sekos yra identiškos 81 %. Konkrečiau, N galo ekstraląsteliniai domenai identiški 75 %, o C galo identiškumas yra 80 %. Labiausiai konservatyvi mpl dalis yra citoplazminis domenas, turintis net 91 % identiškų amino rūgščių liekanų, o esantys šalia transmembraninio domeno 37 amino rūgščių liekanų peptidai yra visiškai identiški. Atitinkamai, mpl yra vienas iš labiausiai konservatyvių citokinų receptorių superšeimos narių (Vigon, supra).

Įrodymai, kad mpl yra funkcionalus receptorius, galintis perduoti proliferacijos signalą, buvo gauti tiriant chimerinius receptorius, susidedančius iš žinomo specifiškumo didelio afiniškumo citokino receptoriaus ekstraląstelinio domeno ir mpl citoplazminio domeno. Kadangi tikrasis mpl ligandas nežinomas, rei20 kėjo sukonstruoti chimerinį didelio afiniškumo ligandui specifišką ekstraląstelinį domeną iš pirmosios klasės citokino receptoriaus, tokio kaip IL-4R arba GCSFR. Vigon et ai., supra, suliejo G-CSFR ekstraląstelinį domeną su transmembraniniu ir citoplazminiu c-mpl domenais. IL-3 priklausoma ląstelių linija BAF/BO3 (Ba/F3) buvo transfekuota su G-CSFR/mpl chimera ir, lygiagrečiai, kaip kontrolė, su pilnu G-CSFR genu. Transfekuotos chimerine konstrukcija ląstelės vienodai gerai augo terpėje su IL-3 arba G-CSF. Taip pat elgėsi ir kontrolinės ląstelės, transfekuotos G-CSFR. Visos ląstelės žūdavo be augimo faktorių. Analogiškas eksperimentas buvo atliktas Skoda et ai., EMBO J., 12(7): 2645-2653 [1993], jie sujungė žmogaus IL-4R receptorių (hIL-4R) ekstraląstelinį ir transmembraninį domenus su pelių mpl citoplazminiu domenu ir tokia chimerine konstrukcija transformavo pelių nuo IL-3 priklausomą ląstelių liniją Ba/F3. Ba/F3 ląstelės, transfekuotos chimeriniu laukinio tipo hIL-4R genu, normaliai dauginosi esant terpėje IL-3 arba IL-4. Ba/F3 ląstelės transfekuotos chimeriniu hIL-4R/mpl, taip pat normaliai proliferavo terpėje, esant hIL-4 (su ir be IL-3). Tai įrodo,kad Ba/F3 ląstelėse mpl citoplazminis domenas turi visus elementus, reikalingus proliferacijos signalo perdavimui.

Šie eksperimentai su chimeriniais receptoriais įrodo, kad mpl citoplazminis domenas gali perduoti signalą, tačiau jie neatsako į klausimą, ar gali mpl ekstraląstelinis domenas rišti kokį nors Ugandą. Turimi duomenys neprieštarauja dviem galimybėm: 1) mpl yra viengrandis pirmosios klasės receptorius, kaip EPOR arba G-CSFR; 2) mpl yra signalą perduodantis β subvienetas (trečioji klasė), kuriam reikalingas a subvienetas panašus į IL-3 (Skoda, supra).

VI. Mpl ligandas yra trombopoetinas (TPO)

Buvo manyta(žiūr aukščiau), kad serume yra unikalus faktorius, vadinamas trombopoetinu (TPO), kuris, veikiant sinergetiškai su kitais citokinais, paspartina megakariocitų augimą ir brendimą. Tačiau toks faktorius dar niekad nebuvo išskirtas iš jokio natūralaus šaltinio, nepaisant didelių daugelio mokslinių grupių pastangų. Dar nežinoma, ar mpl gali tiesiogiai rišti megakariocitus stimuliuojantį faktorių; neseniai buvo eksperimentiškai parodyta, kad mpl dalyvauja perduodant signalą, gautą iš faktoriaus (ar faktorių), rastų pacientų su aplastiniais kaulų čiulpais serume (Methia et ai., Blood, 82(5): 1395-1401 [1993]).

Įrodymus, kad serume egzistuoja unikalus kolonijas formuojantis faktorius, skirtingas nuo IL-Ια, IL-3, IL4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, G-CSF ir GM-CSF, ir perduodantis proliferacijos signalą per mpl, suteikia c-mpl geno ekspresijos primityviuose ir komutuotuose hemopoetinių ląstelių linijose tyrimai, bei mpl antisensinės DNR poveikio vienai tokių ląstelių linijų tyrimai.

Naudodami atvirkštinės transkriptazės (RT)-PCR analizę ir imunologiniais metodais frakcionuotas hemopoetinėse ląsteles, Methia ir kt. (cituota aukščiau) parodė, kad intensyvi mpl informacinės RNR sintezė vyksta tik CD34⁺ ląstelėse, megakariocituose ir trombocituose. CD34⁺ ląstelės išskirtos iš kaulų čiulpų, kur jos sudaro apie 1 % visų ląstelių. Tarp CD34⁺ ląstelių gausu primityvių ir komituotų visų atšakų ląstelių-pirmtakų (pvz., eritroidinės, granulomakrofaginės bei megakariocitinės atšakų pirmtakų).

Mpl antisensiniai oligodezoksinukleotidai supresuoja megakariocitų kolonijų formavimąsi iš pliuripotentinių CD34⁺ ląstelių, auginamų serume, paimtame iš pacientų su aplastiniais kaulų čiulpais, (toks serumas yra turtingas megakariocitų kolonijas stimuliuojačio aktyvumo [MK-CSA] šaltinis) . Tie patys antisensiniai oligodezoksinukleotidai neturi jokio poveikio eritroidinių ar granulomakrofaginių kolonijų formavimuisi.

Dar neišaiškinta, ar mpl tiesiogiai riša ligandą ir ar seruminis faktorius, kuris iššaukia megakariocitopoezę, veikia tiktai per mpl. Buvo spėjama, kad, jei mpl tikrai tiesiogiai riša ligandą, tai jo amino rūgščių liekanų seka turėtų būti labai konservatyvi ir turėtų vykti kryžminė reakcija tarp pelių ir žmogaus mpl dėl jų ekstraląstelinių domenų sekų identiškumo (Vigon, et ai., supra [1993]).

VII. Tikslas

Įvertinant perspektyvą, šioje mokslo srityje jaučiamas poreikis išskirti ir identifikuoti molekules, sugebančias stimuliuoti · hemopoetinių ląstelių, ypač megakariocitų ir jų pirmtakų, proliferaciją ir brendimą, tam, kad būtų galima naudoti šias medžiagas terapijai, gydant trombocitopeniją. Manoma, kad tokios molekulės yra mpl ligandas ir todėl toliau reikalinga tokį (tokius) ligandą (ligandus) išskirti ir Įvertinti jo (jų) vaidmenų ląstelių augime ir diferenciacijoje.

Taigi, šio išradimo tikslas yra gauti farmaciškai švarias molekules, sugebančias stimuliuoti megakariocitų proliferaciją, diferencijaciją ir/arba brendimą į subrendusią trombocitus produkuojančią formą.

Kitas išradimo tikslas yra šias molekules pateikti taip, kad juos galima būtų naudoti terapijos tikslams, gydant hemopoetinius sutrikimus, ypač trombocitopeniją .

Toliau, šio išradimo tikslas yra išskyrimas, išgryninimas ir specifinis identifikavimas baltyminių ligandų, sugebančių in vivo susirišti su citokinų superšeimos receptoriumi, žinomu kaip mpl, ir perduoti per jį proliferacijos signalą.

Dar vienas išradimo tikslas yra gauti nukleino rūgščių molekules, koduojančias tokius baltyminius ligandus ir jas panaudoti mpl-rišančių ligandų produkcijai rekombinantinių ląstelių kultūroje diagnostikos ir terapijos tikslams.

Dar vienas išradimo tikslas yra pagaminti šių baltyminių ligandų darinius ir modifikuotas formas, įskaitant ir variantus su amino rūgščių liekanų pakeitimais sekoje, įvairiai glikozilintas ligando formas ir jų kovalentinius darinius.

Papildomas išradimo tikslas yra paruošti hibridines mpl ligando formas, suliejant. šį polipeptidą su heterologiniu baltymu ir kovalentiniais dariniais.

Dar vienas išradimo tikslas yra pagaminti pakeistas polipeptido formas, kuriose mpl ligandas būtų papildydtas arba iš dalies pakeistas EPO sekomis, siekiant gauti gauti baltymą, galintį reguliuoti ir trombocitų, ir eritocitų pirmtakų proliferaciją ir augimą.

Dar vienas papildomas išradimo tikslas yra paruošti imunogenišką mpl Ugandą arba jo sulietas formas ir gauti antikūnus, specifinius minėtiems ligandams.

Šie ir kiti išradimo tikslai bus aiškūs specialistui, jei jis laikysis viso išradimo aprašymo.

IŠRADIMO ESMĖ

Išradimo tikslai pasiekti, pateikus išskirtą žinduolių megakariocitų proliferaciją ir brendimą skatinantį baltymą, pavadintą mpl ligandų (ML) arba trombopoetinu (TPO), kuris sugeba stimuliuoti megakariocitų proliferaciją, brendimą ir diferenciaciją i subrendusią trombocitus produkuojančią formą.

Ši homogenišką baltymą galima išgryninti iš natūralių šaltinių būdais, susidedančiais iš šių stadijų:

(1) Plazmai, turinčiai mpl ligando molekulių, kurias reikia išgryninti, leidžiama sąveikauti su mpl ligandų, imobilizuotu receptoriaus polipeptidų, arba mpl hibri24 diniu polipeptidu, imobilizuotu ant nešiklio. Sąveikos sąlygos parinktos taip, kad gryninamo mpl ligando molekulės selektyviai sorbuojasi ant imobilizuoto receptoriaus polipeptido. (2) Sorbentas su imobilizuotu receptoriumi praplaunamas, siekiant pašalinti visas medžiagas, kurios nesusirišo su sorbentu. (3) Eliucijos buferiniu tirpalu mpl ligando molekulės eliujuojamos nuo imobiblizuoto receptorinio polipeptido, prie kurio jos buvo prisijungusios. Geriausias natūralus šaltinis yra žinduolių plazma arba šlapimas, turintys mpl ligando. Pageidautina, kad žinduolis būtų aplastinis, o imobilizuotas receptorius būtų mpl-lgG hibridinis polipeptidas .

Pirmenybė teikiama megakariocitopoetinę proliferaciją ir brendimą skatinančiam baltymui, kuris yra išgrynintas, praktiškai homogeniškas mpl ligando polipeptidas, pagamintas sintetiniu arba genoinžinieriniu būdu.

Šiame išradime aprašytas mpl ligando polipeptidas arba TPO, kurio amino rūgščių liekanų seka yra 70 % homologiška išgrynintam praktiškai homogeniniam kiaulių mpl ligando polipeptido sekai ir mažiausiai 80 % identiška kiaulių mpl ligando polipeptido EPO-domenui. Šiame išradime pateikiamas mpl ligandas yra subrendęs žmogaus mpl ligandas (hML), kurio seka pateikta Fig. 1 (SEQ ID Nr. 1), arba po transkripcijos modifikuotas šio polipeptido variantas, kurio seka 80 % identiška subrendusiams žmogaus mpl ligandui. Šis mpl ligando variantas yra žmogaus subrendusio mpl ligando (hML) fragmentas, konkrečiai EPO-domeno N galas. Šis N baltymo gale esantis fragmentas būtinai turi turėti pilną žmogaus ML amino rūgščių liekanų seką nuo 1 iki 4 cisteino, bet už šios srities ribų gali turėti žymius amino rūgščių liekanų pakeitimus, delecijas ir intarpus Pagal šį variantą fragmentinis polipeptidas gali būti pavaizduotas formule:

X-hML(7-151)-Y, kurioje hML(7-151) atitinka žmogaus TPO (hML) amino rūgščių liekanų seka nuo Cys⁷ iki Cys¹⁵¹ imtinai; X yra Cys⁷amino grupė arba vienos ar kelių N galo amino rūgščių liekanos, prijungtos prie subrendusio hML sekos arba amino rūgščių liekanų papildymas, pvz., Met, Tyr, arba lyderinės sekos, turinčios, pvz., proteolitinio skėlimo vietą (pvz., faktorius Xa ar trombinas); Y - Cys¹⁵¹galinė karboksilinė grupė arba viena ar kelios C galo amino rūgščių liekanos iš subrendusio hML sekos, arba šios sekos papildymas kitomis amino rūgščių liekanomis.

Mpl ligandas arba jo fragmentas gali būti suliejami su heterologiniu polipeptidu ir sudaryti hibridines (chimerines) molekules. Geriausiai tinkantys heterologiniai polipeptidai yra citokinai, kolonijas stimuliuojantys faktoriai, interleukinai, ar jų fragmentai, ypač kit-ligandas (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL11, EPO, GM-CSF arba LIF. Geriausias heterologinis polipeptidas yra imunoglobulinų grandinė, t. y., žmogaus IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, IgM arba jų fragmentai, ypač tie, kurie sudaro IgG sunkiosios grandinės pastoviuosius domenus.

Kitas šio išradimo aspektas apima kompoziciją, turinčią išskirtą mpl agonistą, kuris yra biologiškai aktyvus ir gali stimuliuoti žymėtų nukleotidų (pvz., ³H-timidino) Įsijungimą i IL-3 priklausomų Ba/F3 ląstelių, transfekuotų žmogaus mpl geno, DNR. Mpl agonistas gali būti ne kas kitas, kaip aktyvus mpl ligandas, sugebantis stimuliuoti ³⁵S Įsijungimą į cirkuliuojančius trombocitus, kaip nustatyta pelių atsakomosios trombocitozės medodu. Tinkami mpl agonistai : hMLi53, hML(R153A,R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML ir pML2 arba jų fragmentai.

Kita šio išradimo dalis apima išskirtus antikūnus, surišančius mpl ligandą. Tokie antikūnai arba tokių antikūnų chimeros su kitais polipeptidais gali būti panaudoti mpl ligando išskyrimui bei išgryninimui iš ligando šaltinio, kaip aprašyta aukščiau, su imobilizuotu mpl. Toliau šiame išradime pateiktas mpl ligando nustatymo būdas in vitro ir in vivo. Būdas pagrįstas antikūnų sąveika su pavyzdyje, ypač serume, esančiu ligandu ir susidariusio komplekso detekcija.

Dar kitoje išradimo dalyje pateikta išskirta nukleino rūgšties molekulė, koduojanti mpl ligandą ar jo fragmentą. Ši molekulė gali būti pažymėta detektuojama žyme ir panaudota hibridizacijai (vidutinėse ir griežtose sąlygose) su nukleino rūgšties molekule, turinčia sekas, komplementarias mpl ligandą koduojančiai sekai. Pirmiausia tai nukleino rūgščių molekulės, koduojančios žmogaus, kiaulės ir pelės mpl ligandus; tai gali būti RNR ir DNR, tiek genominė DNR, tiek ir kDNR. Tolesnis šios dalies aspektas apima DNR molekulę, koduojančią mpl ligandą ir ikonstruotą į replikacijos vektorių, kuriame šis DNR fragmentas prijungtas prie kontrolinių sekų, kurias atpažįsta vektoriumi transformuotos ląstelės-šeimininkai. Tinkamiausia DNR yra kDNR, kurios seka pateikta Fig. 1 5' -3' (SEQ ID Nr. 2), 3'5' ar jos fragmentas. Toliau į šį aspektą įtraukiamos lastelės-šeimininkai (geriausiai tinkamos CHO ląstelės, transformuotos minėtu vektoriumi) , o taip pat DNR panaudojimo būdas, stimuliuojantis mpl ligando produkciją, sukeliant kDNR, koduojančios mpl ligandą, ekspresiją transformuotų ląstelių-šeimininkų kultūroje ir išskiriant mpl ligandą iš ląstelių šeimininkų arba kultivavimo terpių, kuriose šios ląstelės buvo auginamos.

Išradimas apima terapiškai efektyvių mpl ligando kiekių panaudojimą žinduolių, turinčių hemopoetinių sutrikimų, ypač trombocitopeniją, terapijai. Pasirin27 ktinai mpl ligandas gali būti suleidžiamas kartu su kitais citokinais, ypač su kolonijas stimuliuojančiu faktoriumi ar interleukinu. Geriausi kolonijas stimuliuojantys faktoriai ar interleukinai yra šie: kitligandas (KL) , LIF, G-CSF, GM-CSF, Mpl-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 ir IL-11.

Toliau išradime aprašomas TPO (ML) išskyrimo ir gryninimo iš TPO produkuojančių mikroorganizmų būdas, kuriame:

(1) ląsteles, turinčias TPO, suardo arba lizuoja;

(2) atskyria tirpias ir netirpias medžiagas, turinčias TPO;

(3) TPO ištirpina iš netirpios medžiagos soliubilizuoj ančių buferiniu tirpalu;

(4) tirpų TPO išskiria iš kitų tirpių ir netirpių medžiagų;

(5) TPO natyvią konformaciją atstato red-oks buferiniame tirpale;

(6) taisyklingos konformacijos TPO molekules atskiria nuo netaisyklingai susiformavusių molekulių.

Netirpaus TPO ištirpinimui naudojamas chaotropinis agentas, kuris pasirenkamas iš šių agentų: guanidino druskos, natrio tiocianato arba karbamido. Tolesnis pro- cesas yra soliubilizuoto TPO atskyrimas iš kitų tirpių bei netirpių medžiagų, naudojant vieną ar daugiau etapų, pasirenkamų iš: centrifugavimo, gel-filtracijos ir atvirkščių fazių chromatografijos. Natyvios konformacijos atstatymas vykdomas red-oks buferiniame tirpale, kurio sudėtyje yra oksidatorius ir reduktorius. Dažniausiai oksiduojantis agentas yra deguonis arba junginys, turintis mažiausiai vieną disulfidinę jungtį, o redukuojantis agentas yra junginys, turintis bent vieną laisvą sulfhidrilinę grupę. Oksiduojantis agentas pasirenkamas iš oksiduoto gliutationo (GSSG) ar cistino, redukuojantis - iš redukuoto gliutationo (GSH) ir cisteino. Geriausias oksiduojantis agentas yra oksiduotas gliutationas (GSSG), o geriausias redukuojantis agentas - redukuotas gliutationas (GSH). Patartina, kad oksiduojančio ir redukuojančio agentų molinis santykis būtų lygus ar didesnis už vienetą. Papildomai į red-oks buferinį tirpalą įeina detergentas, pasirenkamas iš CHAPS ir CHAPSO; jo koncentracija turi būti ne mažesnė kaip 1 %. Be to į red-oks buferinio tirpalo sudėtį įeina 0,1 -0,5 M NaCl ir 15 % ar daugiau glicerino.

Red-oks buferinio tirpalo pH yra 7.5 - 9.0, konformacijos atstatymo procesas vykdomas 12 - 48 valandas

4°C temperatūroje. Po konformacijos atstatymo etapo gaunamas biologiškai aktyvus TPO, kuriame disulfidinė jungtis yra sudaryta tarp Cys, esančio arčiausiai N baltymo galo ir Cys, esančio arčiausiai EPO domeno C galo.

Toliau išradimas apima būdą, skirtą biologiškai aktyvaus TPO išgryninimui iš mikroorganizmo. Šį būdą vykdo taip:

(1) lizuoja bent ekstraląstelinę mikroorganizmo membraną;

(2) lizatą, kuriame yra TPO, apdoroja chaotropiniu agentu;

(3) atstato TPO natyvią konformaciją; ir (4) atskiria piemaišas bei netaisyklingos konformacijos TPO molekules.

TRUMPI FIGŪRŲ APRAŠYMAI

Fig. 1 pateikta žmogaus mpl ligando (hML) išvestinė amino rūgščių liekanų seka iš kDNR (SEQ ID Nr. 1) ir koduojančių nukleotidų sekos (SEQ ID Nr. 2) . Nukleotidai sunumeruoti nuo kiekvienos eilutės pradžios. 5' ir 3' netransliuojamos sritys pavaizduotos mažosiomis raidėmis. Amino rūgščių liekanų sekos sunumeruotos viršuje, pradedant nuo pirmosios subrendusio mpl ligando (ML) amino rūgšties liekanos Ser. Spėjamo egzono 3 ribos pažymėtos rodyklėmis, galimos N-glikozilinimo vietos yra apibrėžtos. Cisteino liekanos yra pažymėtos tašku virš liekanos. Mpl ligando, išskirto iš kiaulės plazmos, nustatytas N galas yra pabrauktas.

Fig. 2 pavaizduota mpl ligando nustatymo procedūra pagal ³H-timidino įsijungimą. Nustatant įvairiuose šaltiniuose mpl ligandą, mpl P Ba/F3 ląstelės auginamos be IL-3 24 valandas inkubatoriuje, prisotintame vandens garais, 37°C temeratūroje, paduodant orą su 5% CO₂. Po ląstelių auginimo be IL-3 ląstelės pernešamos į 96 šulinėlių audinių kultūrų plokšteles ir inkubuojamos 24 valandas su praskiestais mėginiais arba be jų. Paskutines 6-8 valandas į kiekvieną šulinėlį pridedama 20 μΐ beseruminės RPMI terpės su 1 ųCi ³H-timidino. Ląstelės surenkamos 96 šulinėlių filtruojamose plokštelėse ir praplaunamos vandeniu. Įvertinamas filtruose esantis radioaktyvumas.

Fig. 3 pavaizduota pronazės, DTT ir temperatūros įtaka APP sugebėjimui stimuliuoti Ba/F3-mpl ląstelių proliferaciją. Skaldant APP, pronazė (Boehringer Mannheim) arba jaučio serumo albuminas imobilizuojami ant AffigellO (Bio-Rad) ir inkubuojami atskirai su APP 18 valandų 37°C temperatūroje. Pašalinus sorbentus centrifūguojant, analizuojami supernatantai. APP kaitinamas 80°C temperatūroje 4 minutes arba pridedama 100 μΜ DTT ir dializuojama prieš PBS.

Fig. 4 pavaizduota mpl ligando eliucija iš Phenyl-Toyopearl, Blue-Sepharose ir Ultralink-rapi sorbentų. Pažymėtos frakcijos F4 -F8 (dižiausio aktyvumo frakcijos) yra surinktos desorbuojant nuo mpl afininės kolonėlės.

Fig. 5 pavaizduota frakcijų, desorbuotų nuo Ultralinkmpl, SDS-PAGE elektroforegrama. Į kiekvienos (2-8) frakcijos 200 μΐ pridedama 1 ml atšaldyto iki -20°C lmM HCl tirpalo acetone. Išlaikius mėginius tris valandas -20°C temperatūroje, centrifuguojama, nuosėdos praplaunamos du kartus atšaldytu iki -20°C acetonu. Acetoninės nuosėdos ištirpinamos 30 μΐ SDS buferiniame tirpale, pridedama iki 100 μΜ DTT ir kaitinama 90°C temperatūroje 5 minutes. Atliekama mėginių SDS PAGE elektroforezė 4-20% koncentracijos poliakrilamidiniame gelyje, po elektroforezės geliai dažomi sidabru.

Fig. 6 pavaizduotas mpl ligando eliucijos vaizdas iš SDS-PAGE gelio. 6 frakcija nuo mpl-afininio sorbento buvo analizuota 4-20% koncentracijos poliakrilamidiniame gelyje neredukuojančiomis sąlygomis. Po elektroforezės gelis buvo supjaustytas į 12 lygių dalių, baltymas aprašytu pavyzdžiuose būdu buvo elektroeliujuojamas. Eliujuoti mėginiai buvo dializuojami prieš PBS ir tiriami praskiedus 20 kartų. Buvo naudojami Novex Mark 12 molekulinės masės standartai.

Fig. 7 pavaizduota mpl ligando įtaka žmogaus megakariocitopoezės procesui. APP be mpl ligando paruošiama praleidus 1 ml per 1 ml mpl-afininę kolonėlę (700 ųg mpi-IgG/ml NHS-Superose, Pharmacia) . Į žmogaus periferinių kamieninių ląstelių kultūrą įdedama 10 % APP arba 10 % APP be mpl ligando ir auginamos 12 dienų. Megakariocitopoezės procesas kiekybiškai įvertinamas pavyzdžiuose aprašytu būdu.

Fig. 8 pavaizduota mpl-IgG įtaka stimuliuojant žmogaus megakariocitopoezės procesą APP. Į žmogaus periferinių kamieninių ląstelių kultūrą įdedama 10 % APP ir auginamos 12 dienų. Pačioje pradžioje, antrą ir ketvirtą kultivavimo dieną pridedama mpl-IgG (0,5 ųg) arba ANP-R-IgG (0,5 gg) . Po 12 dienų megakariocitopoezės procesas kiekybiškai įvertinamas pavyzdžiuose aprašytu būdu. Dviejų analizių vidurkiai pavaizuoti grafiškai, skliaustuose nurodyti abiejų analizių rezultatai.

Fig. 9 pavaizduotas dvigrandis 390 bp žmogaus genominės DNR fragmentas, koduojanis mpl Ugandą. Taip pat pateiktos išvestinė egzono 3 amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 3), koduojanti seka (SEQ ID Nr. 4) ir komplementari seka (SEQ ID Nr. 5).

Fig. 10 pavaizduotos išvestinė subrendusio mpl ligando (hML) amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 6) ir subrendusio žmogaus eritropoetino (hEPO) išvestinė amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 7). Identiškos amino rūgščių liekanos yra apibėžtos, tam, kad būtų geriau parodyta amino rūgščių sekų homologija, amino rūgščių sekose palikti tarpai, kurie pažymėti punktyru. Potencialios N-glikozilinimo vietos hML sekoje pažymėtos ištisine linija, o hEPO sekoje - punktyru. Dvi cisteino liekanos, svarbios eritropoetino aktyvumui, pažymėtos tašku.

Fig. 11 pavaizduotos išvestinės subrendusių žmogaus mpl ligandų izoformų hML (SEQ ID Nr. 6), hML2 (SEQ ID Nr. 8), hML3 (SEQ ID Nr. 9) ir hML4 (SEQ ID Nr.: 10) amino rūgščių liekanų sekos. Identiškos amino rūgščių liekanos yra apibėžtos, tam, kad būtų geriau parodyta amino rūgščių sekų homologija, amino rūgščių sekose palikti tarpai, kurie pažymėti punktyru.

Fig. 12A, 12B ir 12C pavaizduotas žmogaus mpl ligando poveikis Ba/F3-mpl ląstelių proliferacijai (A), žmogaus megakariocitopoezės procesas in vitro kiekybiškai įvertintas naudojant žymėtus pelės monokloninius IgG antikūnus, specifinius megakariocitų glikoproteinui GPIIbUIa (B) ir pelių trombopoezės procesas įvertintas atsakomosios trombocitozės metodu (C).

293 linijos ląstelės buvo trasfekuotos vien pRK5 vektoriumi, pRK5-hML vektoriumi arba pRK5-MLi53 vektoriumi kalcio fosfatiniu metodu (Gorman, C. in DNA Cloning: A New Approach 2:143-190 [1985]) per naktį (pRK5-MLi53 vektorius buvo sukonstruotas įterpiant PCR metodu stop kodoną po 153 hML baltymo amino rūgšties liekanos). Transformantai buvo auginami 36 valandas ir terpė, kurioje jie augo, buvo įvertinama nustatant: sugebėjimą stimuliuoti Ba/F3-mpl ląstelių proliferaciją, kaip aprašyta Pavyzdyje 1 (A) arba sugebėjimą stimuliuoti žmogaus megakariocitopozę in vitro, kaip aprašyta Pavyzdyje 1 (B) . Megakariocitopozės procesas kiekybiškai buvo įvertinamas naudojant žymėtus ¹²⁵J pelės monokloninius IgG antikūnus (HP1-1D), prieš megakariocitų specifinį glikoproteiną GPII_bIII_a Grant et ai., Blood. 69:1334-1339 [1987] aprašytu būdu.

Dalinai išgryninto rekombinantinio ML baltymo (rML) efektas trombocitų susidarymui in vivo (C) buvo įvertintas, naudojant atsakomosios trombocitozės metodą, kaip aprašyta McDonald, T.P. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 144: 1006-10012 (1973). Dalinai išgrynintas rML buvo paruošiamas iš 200 ml kondicionuotos terpės, turinčios rekombinantinio ML. Terpė buvo gryninama per 2 ml tūrio Blue-Sepharose kolonėlę, nulygsvarintą PBS, kolonėlė praplaunama PBS ir sorbuoti baltymai buvo eliujuojami PBS, pridėjus 2M karbamido ir 2M NaCl. Frakcijos, kuriose buvo nustatytas aktyvumas, buvo dializuojamos PBS ir pridedama iki 1 mg/ml koncentracijos BSA be endotoksinų. Taip paruoštuose preparato mėginiuose endotoksinų koncentracija buvo mažesnė, nei 1 vienetas mililitre. Pelėms buvo suleidžiama 64000, 32000 arba

16000 rML vienetai arba vien tirpiklis. Kiekvieną grupę sudarė šešios pelės. Pateikti vidurkiai ir standartiniai nukrypimai kiekvienai grupei, p reikšmes buvo nustatytos T-analize, įvertinant reikšmių patikimumą.

Fig. 13 palygintas žmogaus mpl ligando izoformų ir variantų poveikis Ba/F3-mpl ląstelių proliferacijai. hML, mock, hML2, hML3, hML(R153A, R154A) ir hMLi₅₃ įtaka buvo Įvertinta įvairiuose preparatų praskiedimuose kaip aprašyta Pavyzdyje 1.

Fig. 14A, 14B 14C, 14D ir 14E pavaizduotos išvestinė mpl ligando (hML) arba TPO (hTPO) amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 1) ir koduojanti žmogaus genominės DNR seka (SEQ ID Nr. 11) . Nukleotidų ir amino rūgščių liekanų numeriai nurodyti·kiekvienos eilutės pradžioje.

Fig. 15 pateikta išgrynintų 293-rhML₃₃2 ir 293-rhMLi₅₃baltymų SDS-PAGE elektroforegrama.

Fig. 16 pateiktos koduojanti kDNR nukleodidų seka (SEQ ID Nr. 12) ir pelių ML baltymo izoformos išvestinė amino rūgščių liekanų seka, koduojama atvirame skaitymo rėmelyje, (SEQ ID Nr. 13). Ši subrendusio pelių mpl ligando baltymo izoforma sudaryta iš 331 amino rūgščių liekanų, taigi, šis baltymas keturiomis amino rūgščių liekanomis trumpesnis, nei visas mML baltymas, todėl jis žymimas mML2. Nukleotidai sunumeruoti kiekvienos eilutės pradžioje. Amino rūgščių liekanos sunumeruotos virš liekanų, pradedant nuo Ser 1. Potencialios Nglikozilinimo vietos yra pabrauktos. Cisteino liekanos pažymėtos tašku.

Fig. 17 pateiktos kDNR nukleodidų seka (SEQ ID Nr. 14) ir išvestinė pelių ML baltymo izoformos (mML) amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 15) . Nukleotidų numeriai nurodyti kiekvienos eilutės pradžioje. Amino rūgščių liekanos sunumeruotos virš liekanų, pradedant nuo Ser 1. Ši subrendusio pelių mpl ligando baltymo izoforma sudaryta iš 335 amino rūgščių liekanų, tai yra pilno ilgio mpl ligando baltymas, žymimas mML. Signalinė seka yra pabraukta punktyru, spėjama skėlimo vieta pažymėta rodykle. 5' ir 3' netransliuojamos sritys pažymėtos mažosiomis raidėmis. Dvi delecijos vietos yra pabrauktos, baltymai, turintys šias delecijas, atsiradusias dėl alternatyvaus splaisingo, žymimi mML2 ir mML3. Keturios cisteino liekanos pažymėtos taškais. Septynios potencialios N-glikozilinimo vietos yra apibrauktos.

Fig. 18 yra palygintos žmogaus ML baltymo izoformos hML3 (SEQ ID Nr. 9) ir pelės ML baltymo izoformos mML3 (SEQ ID Nr. 16) išvestinės amino rūgščių liekanų sekos. Išvestinė žmogaus mpl ligando baltymo amino rūgščių liekanų seka yra sulyginta su pelių mpl ligando baltymo seka. Identiškos amino rūgščių liekanos yra apibrauktos; tam, kad būtų geriau parodyta amino rūgščių sekų homologija, amino rūgščių sekose palikti tarpai, kurie pažymėti punktyru. Amino rūgščių liekanų numeracija yra kiekvienos eilutės pradžioje.

Fig. 19 yra palygintos subrendusių ML baltymo izoformos: pelės-ML (SEQ ID Nr. 17), kiaulės-ML (SEQ ID Nr. 18) ir žmogaus-ML (SEQ ID Nr. 6) sekos. Amino rūgščių liekanų sekose tam, kad būtų geriau parodyta amino rūgščių sekų homologija, palikti tarpai, kurie pažymėti punktyru. Amino rūgščių liekanų numeracija yra kiekvienos eilutės pradžioje, identiškos amino rūgščių liekanos yra apibrauktos. Potencialios N-glikozilinimo vietos yra apibrauktos, cisteino liekanos yra pažymėtos taškais. Konservatyvių dviejų bazinių amino rūgščių liekanų motyvas, nurodantis galimą proteinazių skėlimo vietą, yra pabrauktas. Aptinkamos keturios delecijos vietos visuose trijuose baltymuose (ML2) yra užtušuotos .

Fig. 20 pateiktos kDNR nukleodidų seka (SEQ ID Nr. 19) ir išvestinė subrendusio kiaulės ML baltymo izoformos (pML) amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 18).Ši kiaulės mpl ligando baltymo izoforma sudaryta iš 332 amino rūgščių liekanų, tai yra pilnas subrendęs kiaulės mpl ligando baltymas, žymimas pML. Nukleotidų numeriai nurodyti kiekvienos eilutės pradžioje. Amino rūgščių liekanos sunumeruotos viršuje, pradedant nuo Ser 1.

Fig. 21 pateiktos kDNR nukleodidų seka (SEQ ID Nr. 20) ir išvestinė subrendusio kiaulės ML baltymo izoformos (pML2) amino rūgščių liekanų seka (SEQ ID Nr. 21).Ši kiaulės mpl ligando baltymo izoforma sudaryta iš 328 amino rūgščių liekanų, tai yra pilnas subrendęs kiaulės mpl ligando baltymas be keturių amino rūgščių liekanų, žymimas pML2. Nukleotidų numeriai nurodyti kiekvienos eilutės pradžioje. Amino rūgščių liekanos sunumeruotos viršuje, pradedant nuo Ser 1.

Fig. 22 yra palygintos subrendusio kiaulės ML baltymo izoformos pML (SEQ ID Nr. 18) ir kiaulės ML baltymo izoformos pML2 (SEQ ID Nr. 21) sekos. Išvestinė pML baltymo amino rūgščių liekanų seka yra sulyginta su pML2 baltymo seka. Identiškos amino rūgščių liekanos yra apibrauktos; lengvesniam palyginimui palikti pažymėti punktyru tarpai. Amino rūgščių liekanų numeriai nurodyti kiekvienos eilutės pradžioje.

Fig. 23 yra pateikta plazmidės pSVI5.ID.LL.MLORF (pilno ilgio arba TPO332) konstrukcija, šia plazmide buvo transfekuojamos CHO-DP12 ląstelės CHO-rhTPC>332 produkcijai.

Fig. 24 yra pateikta plazmidės pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (sutrumpinto arba TPO153) konstrukcija, šia plazmide buvo transfekuojamos CHO-DP12 ląstelės CHO-rhTPOi₅₃produkcijai.

Fig. 25A, 25B ir 25C pateiktas E. co2i-rhTPO(_Met ^_1,i₅3) poveikis normalių pelių trombocitams (A), eritrocitams (B) ir leukocitams (C) . Dviems C57 B6 linijos pelių patelių grupėms (po 6 pateles grupėje) buvo kasdien suleidžiama PBS buferinio tirpalo arba 0,3 ųg E.colirhTPO(_Met ^_1,i53) (100 μΐ, sc.) Prieš suleidžiant mėginius (diena 0) ir nuo 3 iki 7 dienos kraujas buvo imamas po 40μ1 iš pelių akiduobės sinuso. Paimtas kraujas buvo iškart praskiedžiamas 10 ml standartiniu skiedikliu ir atliekama pilna kraujo forminių elementų analizė Serrono Baker Hematology Analyzer 9018 aparatu. Duomenys pateikti, kaip vidurkiai ± standartinė paklaida.

Fig. 26A, 26B ir 26C pateiktas E. coli-rhTPO_(Met‘¹(i₅₃) poveikis subletaliai apšvitintų pelių trombocitams (A), eritrocitams (B) ir leukocitams (C) . Dviems C57 B6 linijos pelių grupėms (po 10 patelių grupėje), kurios buvo subletaliai apšvitinamos 750 cGy galingumo gama spinduliais iš ¹³⁷Cs radiacijos šaltinio, kasdien buvo suleidžiama PBS buferinio tirpalo arba 0,3 ųg E. colirhTPO(Met^-1,153) (100 μΐ, sc.). Prieš suleidžiant mėginius (diena 0) ir tam tikrais intervalais kraujas po· 40 μΐ buvo imamas iš pelių akiduobės sinuso. Paimtas kraujas buvo iškart praskiedžiamas 10 ml standartiniu skiedikliu ir atliekama pilna kraujo forminių elementų analizė

Serrono Baker Hematology Analyzer 9018 aparatu. Duomenys pateikti, kaip vidurkiai ± standartinė paklaida.

Fig. 27A, 27B ir 27C pateiktas CHO-rhTPO₃₃2 poveikis normalių pelių trombocitams (A) , eritrocitams (B) ir leukocitams (C) . Dviems C57 B6 linijos pelių grupėms (po 6 pateles grupėje) buvo kasdien suleidžiama PBS buferinio tirpalo arba 0,3 ųg CHO-rhTPO₃₃2 (100 μΐ, sc.) Prieš suleidžiant mėginius (diena 0) ir nuo 3 iki 7 dienos kraujas po 40 μΐ buvo imamas iš pelių akiduobės sinuso. Paimtas kraujas buvo iškart praskiedžiamas 10 ml standartiniu skiedikliu ir atliekama pilna kraujo forminių elementų analizė Serrono Baker Hematology Analyzer 9018 aparatu. Duomenys pateikti, kaip vidurkiai ± standartinė paklaida.

Fig. 28 pateiktos atsako i dozę kreivės įvairių rhTPO, gautų iš Įvairių ląstelių linijų. Pateiktos atsako priklausomybės nuo dozės kreivės rhTPO iš šių ląstelių linijų: hTPO₃₃₂ iš CHO (viso ilgio baltymas, išskirtas iš Kinijos žiurkėnų kiaušidžių ląstelių) , hTPO_met^_1 153 (E. coli produktas sutrumpintas nuo N baltymo galo su Met liekana N baltymo gale) , hTPO₃₃₂ (pilnas TPO baltymas, išskirtas iš žmogaus 293 linijos ląstelių), be Met 155 E. coli (sutrumpintas [rhTPOi₅₅] baltymas be pirmos metionino liekanos, išskirtas iš E. coli) . Šešioms C57B6 linijos pelių patelių grupėms buvo kasdien 7 dienas suleidžiami rhTPO preparatai. Kiekvieną dieną buvo paimama po 40 μΐ kraujo iš pelių akiduobės sinuso pilnai kraujo forminių elementų analizei. Duomenyse, pateiktuose ankščiau, parodytas maksimalus atsakas, kuris visuose bandymuose, išskyrus Metl53 E-Coli, buvo stebimas septintą tyrimų dieną. Minėtoje Metl53 E-Coli grupėje maksimalus efektas buvo stebimas penktą tyrimų dieną. Duomenys pateikti, kaip vidurkiai ± standartinė paklaida.

Fig. 29 pateiktos atsako kreivės lyginant pilno baltymo aktyvumą ir sutrumpintų rhTPO baltymo formų, išskirtų iš CHO ląstelių, aktyvumą su sutrumpintais baltymais, išskirtais iš E. coli. Šešioms C57B6 linijos pelių patelių grupėms buvo kasdien suleidžiami po 0,3 ųg įvairaus tipo rhTPO preparatai. Nuo 2 iki 7 dienos kas dieną buvo paimama po 40 μΐ kraujo iš pelių akiduobės sinuso pilnai kraujo forminių elementų analizei. Buvo tirti šie preparatai: sutrumpintas TPO TPO153, išskirtas iš E. coli; TPO332 (frakcijų mišinys) kuriame yra 80-90% viso ilgio TPO baltymo ir 10-20 % sutrumpintų šio baltymo formų; TPO332 (30K frakcija) išgrynintos iš frakcijų mišinio sutrumpintos formos; TPO332 (70K frakcija) - išgrynintas iš frakcijų mišinio viso ilgio TPO baltymas. Duomenys pateikti kaip vidurkiai ± standartinė paklaida.

Fig. 30 pavaizduotas TPO baltymo nustatymas KIRĄ ELISA analize. Paveikslėlyje pavaizduotos MPL/Rse.gD chimerinė molekulė ir atitinkamos pradinio receptoriaus dalys, taip pat ir galutinis kompleksas (dešinė paveikslėlio dalis) ir analizės diagrama, parodanti tiesiogines matavimo stadijas (kairė piešinėlio pusė) .

Fig. 31 pateikta KIRĄ ELISA analizės eigos schema etapais.

Fig. 32A - 32Z-5 pateikta ekspresijos vektoriaus pSVI17.1D.LL, panaudoto Pavyzdyje 17 Rse.gD ekspresijai, nukleotidų seka (SEQ ID Nr. 22).

Fig. 33A ir 33B pateikta plazmidės pMPl konstravimo

schema.
Fig.	34	pateikta	plazmidės	pMP21	konstravimo	schema.
Fig.	35	pateikta	plazmidės	pMP151	konstravimo	schema.
Fig.	36	pateikta	plazmidės	pMP202	konstravimo	schema.
Fig.	37	pateikta	plazmidės	pMP172	konstravimo	schema.
Fig.	38	pateikta	plazmidės	pMP210	konstravimo	schema.

Fig. 39 pateikti penki geriausiai ekspresuojami TPO klonai, gauti naudojant plazmidės pMP210 banką (SEQ ID

NR.	23,	24, 25,	26, 27 ir	28) .
Fig.	40	pateikta	plazmidės	pMP41	konstravimo	schema.
Fig.	41	pateikta	plazmidės	pMP57	konstravimo	schema.
Fig.	42	pateikta	plazmidės	pMP251	konstravimo	schema

DETALUS IŠRADIMO APRAŠYMAS

I. Apibrėžimai

Žemiau pateikti žodžiai ir frazės turi nurodytą reikšmę, kai jie panaudoti aprašyme, pavyzdžiuose ar išradimo apibrėžtyje.

Chaotropinis agentas - junginys, kuris vandeniniame tirpale, esant jo pakankamai koncentracijai gali sukelti baltymo konfigūracijos ar konformacijos pasikeitimus, visiškai ar ne visiškai pašalinant sąveikas, atsakingas už normalios antrinės bei tretinės baltymo struktūros palaikymą. Tokių junginių pavyzdžiai yra: karbamidas, guanidino hidrochloridas ir natrio tiocianatas. Paprastai baltymo konformacijai pažeisti reikalingos didelės šių junginių koncentracijos, dažniausiai nuo 4 iki 9 M.

Citokinas - bendras terminas, taikomas baltymams, kurie sekretuojami vienos ląstelių populiacijos ir veikia kitą ląstelių populiaciją kaip tarpląsteliniai mediatoriai. Tokių citokinų pavyzdžiai yra: limfokinai, monokinai ir tradiciniai polipeptidiniai hormonai. Prie citokinų priskiriami: augimo hormonas (somatotropinas), į insuliną panašūs augimo faktoriai, žmogaus augimo hormonas, žmogaus N-metionilsomatotropines, galvijų augimo hormonas, paratiroidinis hormonas, tiroksinas, insulinas, proinsulinas, relaksinas, prorelaksinas, glikoproteininiai hormonai, tokie kaip folikulus stimuliuojantis hormonas (FSH), tiroidus stimuliuojantis hormonas (TSH), liuteinizuojantis hormonas (LH) , hemopoetinis augimo faktorius, hepatocitų augimo faktorius, fibroblastų augimo faktorius, prolaktinas, placentinis laktogenas, a- ir β-auglių nekrozės faktoriai, (TNF-α ir TNF-β), pelių gonadotropin-asocij uotas peptidas, inhibinas, aktivinas, vaskuliarinio endotelio augimo faktorius, integrinas, nervų augimo faktoriai, tokie kaip NGF-β, trombocitų augimo faktorius, transformuojantys augimo faktoriai (TGFs), tokie kaip TGF-a ir TGF-β, panašūs į insuliną augimo faktoriai I ir II, eritropoetinas (EPO), osteoinduktyvūs faktoriai, interferonai, tokie kaip interferonas α, β ir γ, kolonijas stimuliuojantys faktoriai (CSFs), tokie kaip makrofagų CSF (M-CSF), granuliocitų-makrofagų CSF (GM-CSF) ir granuliocitų CSF (G-CSF), interleukinai (ILs), tokie kaip IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,

IL-8, IL-9, IL-11, IL-12 ir kiti polipeptidiniai faktoriai, tarp jų ir LIF, SCF ir kit-ligandas. Nurodyti terminai šiame kontekste apima baltymus, išgrynintus iš natūralių šaltinių ir iš rekombinantinių ląstelių kultūrų. Analogiškai šie terminai apima ir biologiškai aktyvius jų ekvivalentus, pvz., variantus, kurie skiriasi viena ar daugiau amino rūgščių liekanomis arba glikozilinimo tipu ir laipsniu.

mpl ligandas, mpl ligando polipeptidas, ML, trombopoetinas ar TPO yra sinonimai, kuriais vadinamas bet koks polipeptidas, kuris gali jungtis su citokinų receptorių superšeimos narių mpl receptoriumi ir kuris turi ML būdingas biologines savybes, apibrėžtas žemiau. Charakteringiausia biologinė savybė yra sugebėjimas stimuliuoti žymėtų nukleotidų (pvz., ³H-timidino) įsijungimą i IL-3 priklausomų, transformuotų žmogaus mpl P genu, ląstelių Ba/F3 DNR. Kita charakteringa biologinė savybė yra sugebėjimas stimuliuoti ³⁵S įsijungimą į cirkuliuojančius pelių atsakomosios trombocitozės inhibicijos metodo pagalba. Šis apibrėžimas apima polipeptidą, išskirtą iš mpl ligando šaltinio, tokio kaip aplastinių kiaulių plazma, kaip aprašyta šiame išradime, arba iš kitų šaltinių, pvz., kitų gyvūnų rūšių, tarp jų ir žmogaus, arba paruošta genoinžinieriniu ar sintetiniu būdu, o taip pat šių formų variantus, tarp jų ir funkcionalius darinius, fragmentus, alelinius variantus, izoformas ir analogus.

Mpl ligando fragmentas arba TPO fragmentas yra natyvaus pilno ilgio subrendusio mpl ligando ar TPO amino rūgščių liekanų sekos dalis, kurioje trūksta vienos ar daugiau amino rūgščių liekanų ar angliavandenių. Trūkstamos amino rūgščių liekanos gali būti molekulės N gale, C gale arba viduryje. Fragmentas turi bet kur: turėti bent vieną mpl ligando savybių. Mpl ligando fragmentas paprastai turi 10, 15, 20, 30 ar 40 amino rūgščių liekanų, identiškų mpl ligando, išskirto iš žinduolių, tarp jų ir iš aplastinės kiaulių plazmos, taip pat žmogaus ar pelės ligando, ypač jo EPO domenų, sekai . Charakteringi N galinio fragmento pavyzdžiai yra hMLi.53 arba TPO(Met^_1 1-153).

Mpl ligando variantas arba mpl ligando sekos variantas čia apibrėžiamas kaip biologiškai aktyvus mpl ligandas, kurio amino rūgščių liekanų seka identiška mažiau nei 100 % mpl ligando, išskirto iš rekombinantinių ląstelių kultūros arba aplastinės kiaulių plazmos, sekai, arba žmogaus ligando išvestinei amino rūgščių liekanų sekai, pateiktai Fig. 1 (SEQ ID Nr. 1) . Paprastai biologiškai aktyvaus mpl ligando varianto amino rūgščių liekanų seka turi būti ne mažiau kaip 70 % identiška mpl ligando, išskirto iš aplastinės kiaulių plazmos arba subrendusio žmogaus ar pelės mpl ligando ar jų fragmentų, amino rūgščių liekanų sekai (žiūr. Fig. 1 [SEQ ID Nr. 1]); geriau, jei sekų identiškumas siekia bent 75 %, dar geriau - bent 80 %, dar geriau - bent 85 %, dar geriau - bent 90 % ir geriausias variantas - kai yra ne mažesnis kaip 95 % sekų sutapimas.

Chimerinis mpl ligandas yra polipeptidas, kuris sudarytas iš pilno ilgio mpl ligando ar vieno arba kelių ligando fragmentų, kurie sulieti arba sujungti su kitu heterologiniu peptidu arba jo fragmentu (vienu ar keliais). Chimerinis junginys turi turėti bent vieną mpl ligando biologinę savybę. Antras polipeptidas turi būti citokinas, imunoglobulinas arba jų fragmentai.

Išskirtas mpl ligandas, išgrynintas mpl ligandas ar homogeniškas mpl ligandas yra sinonimai. Šiais terminais vadinamas mpl ligandas, išgrynintas iš mpl ligando šaltinio, arba pagamintas genoinžinieriniu ar sintetiniu būdais ir praktiškai neturintis kitų baltymų ar peptidų priemaišų. Švarumas nustatomas dviem metodais: (1) sekvenuojant 15, geriau 20 iš N baltymo galo ar molekulės vidurinės dalies amino rūgščių liekanų seką, naudojantis geriausiu komerciniu sekvenatoriumi ir geriausiu žinomu šiai datai būdu; (2) homogeniškumas nustatomas SDS PAGE elektroforeze redukuojan43 čiomis ir neredukuojančiomis sąlygomis, baltymo dažymui naudojamas Coomasie Blue arba, geriau, kai dažoma sidabru. Homogeniškumas reiškia, kad kitų baltymų priemaišos neviršija 5 %.

Biologinė savybė, kai naudojama kartu su mpl ligandas ar išskirtas mpl ligandas, reiškia turėti trombopoetinį aktyvumą, ar turėti in vivo efektorinę arba antigeninę funkcijas, arba aktyvumą, kuris tiesiogiai ar netiesiogiai sąlygojamas mpl ligando (nesvarbu, natyvaus ar denatūruoto) ar jo fragmento. Efektorinės funkcijos apima mpl surišimą, ar kito nešiklio surišimą, agonizmą ar antagonizmą mpl, ypač proliferacijos signalo perdavimą, o taip pat replikaciją, DNR reguliatorinę funkciją, citokinų biologinio aktyvumo moduliaciją, receptorių (ypač citokinų receptorių) aktyvaciją, inaktyvaciją, kiekio sumažėjimą ar padidėjimą, ląstelių augimą ir diferenciaciją ir panašiai. Antigeninė funkcija reiškia epitopo ar antigeninės determinantės, kuri gali kryžmiškai reaguoti su antikūnais prieš natyvų mpl ligandą, buvimas. Principinė antigeninė mpl ligando polipeptido funkcija yra tai, kad jis jungiasi su antikūnais, pagamintais prieš mpl ligandą, išskirtą iš aplastinių kiaulių plazmos; šios sąveikos konstanta turi būti ne mažesnė, nei 10⁶ 1/M. Paprastai šios sąveikos surišimo konstanta ne mažesnė, nei 10⁷ 1/M. Antigeniškai aktyvus mpl ligando polipeptidas, geriausiai, yra tas polipeptidas, kuris sąveikauja su antikūnais, pagamintais prieš mpl ligandą, pasižymintį viena iš aukščiau aprašytų efektorinių funkcijų. Antikūnai, taikomi biologinio aktyvumo nustatymui, yra triušio poliklonaliniai antikūnai. Šiems antikūnams pagaminti triušiai imunizuojami, suleidžiant po oda mpl ligandą (išskirtą iš rekombinantinių ląstelių kultūros ar aplastinės kiaulių plazmos) su pilnu Freund'o adjuvantu. Pakartotinės imunizacijos tuo pačiu preparatu į pilvo ertmę vykdomos tol, kol pasiekiamas reikalingas antikūnų titras.

Terminas biologiškai aktyvus, vartojamas kartu su terminu mpl ligandas ar išskirtas mpl ligandas, reiškia mpl ligandą ar polipeptidų, kuris pasižymi trombopoetiniu aktyvumu, ar turi tokią pat efektorinę funkciją, kaip mpl ligandas, išskirtas iš aplastinės kiaulių plazmos arba ekspresuotas rekombinantinių ląstelių kultūroje. Svarbiausia žinoma mpl ligando ar polipeptido efektorinė funkcija yra mpl surišimas ir žymėtų nukleotidų (³H-timidino) įsijungimo į IL-3 priklausomų BA/F3 ląstelių, transfekuotų žmogaus mpl P DNR, stimuliacija. Kita žinoma efektorinė mpl ligando ar polipeptido funkcija yra sugebėjimas stimuliuoti ³⁵S įsijungimą į cirkuliuojančius trombocitus, įvertinamas pelių trombocitų inhibicijos metodu. Dar viena žinoma mpl ligando efektorinė funkcija yra jo sugebėjimas stimuliuoti in vitro žmogaus megakariocitopoezę, kurią galima įvertinti, naudojant žymėtus radioaktyvia žyme monokloninius antikūnus prieš megakariociotų glikoproteiną GPII_bIII_a·

Sąvoka amino rūgščių liekanų sekos identiškumo procentas taikoma, lyginant sekas su mpl ligando seka, pateikta Fig. 1 (SEQ ID Nr. 1) .Ši seka atitinka mpl ligandą, išskirtą iš aplastinės kiaulių plazmos, arba pelių ar žmogaus mpl ligandą. Identiškos amino rūgščių liekanos yra apibėžtos; tam, kad būtų geriau parodyta amino rūgščių sekų homologija, amino rūgščių sekose palikti tarpai, kurie pažymėti punktyru. Identiškumo procentas yra sutampančių amino rūgščių liekanų procentas nuo visų amino rūgščių liekanų sekoje. Konservatyvių amino rūgščių liekanų pasikeitimai nelaikomi sekos identiškumo dalimi. N ir C baltymo galuose papildomos amino rūgščių liekanos, intarpai ir delecijos mpl ligando amino rūgščių liekanų sekoje nelaikomi identiš45 kurną mažinančiais faktoriais. Tokiu būdu, biologiškai aktyvūs mpl ligandai, kurių sekos laikomos identiškomis, apima: prepro-mpl ligandą, pro-mpl ligandą ir subrendusį mpl ligandą.

Mpl ligando mikrosekvenavimas gali būti atliktas bet kokiu tinkamu standartiniu metodu, jei šis metodas yra pakankamai jautrus. Vienas būdas yra, kai išgrynintas polipeptidas išskiriamas iš SDS PAGE gelio, ar analizuojama paskutinėje HPLC stadijoje baltymo frakcija ir tiesiogiai sekvenuojama automatizuotu Edmano būdu (fenilizocianatiniu), naudojant Applied Biosystems dujinį sekvenatorių kartu su 120A feniltiohidantioniniu (PTH) amino rūgščių analizatoriumi. Papildomai mpl ligando fragmentai buvo gaunami cheminiu (pvz., skaldant baltymą CNBr, hidroksilaminu, 2-nitro-5-tiocianbenzoatu) ar fermentiniu (pvz., skaldant tripsinu, klostripainu, stafilokokine proteinaze) būdais, po skaldymo fragmentai yra frakcionuojami (pvz. HPLC) ir panašiu būdu sekvenuojami. PTH amino rūgščių dariniai yra analizuojami naudojant ChromPerfect duomenų apdorojimo sistemą (Justice Innovation, Palo Alto, CA). Sekų analizė atliekama kompiuteriu VAX 11/785 Digital Eąuipment Co. kaip aprašyta Henzel et ai., J. Chomatography, 404:41-52 [1987]. Papildomai HPLC frakcijos gali būti elektroforezuojamos 5-20 % SDS PAGE, pernešamos i PVDF memraną (ProBlott, AIB, Foster City, CA) ir dažomos Coomassie Brilliant Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 [1987]). Specifiškai identifikuotos dažu baltymų zonos išpjaunamos ir baltymų N galo seka nustatoma dujiniu sekvenatoriumi, kaip aprašyta aukščiau. Nustatant vidines baltymų sritis, HPLC frakcijos liofilizuojamos (SpeedVac), suspenduojamos tinkamame buferiniame tirpale, skaldoma cianbromidu, Lys-specifine proteinaze Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA) , ar Asp-N (Boehringer Mannheim, Indianapolis,

IN) . Po skaldymo gauti peptidai sekvenuojami mišinyje ar po frakcionavimo HPLC C4 chromatografinėj e kolonėlėje, naudojant propanolio gradientą su 0,1 % TFA.

Trombocitopenija apibrėžiama kaip trombocitų kiekio sumažėjimas iki ar žemiau 150xl0⁹ trombocitų litre kraujo.

Trombopoetinis aktyvumas yra biologinis aktyvumas, pasireiškiantis kaip megakariocitų ar megakariocitų pirmtakų proliferacijos, diferenciacijos ir/arba brendimo skatinimas. Šioms ląstelėms tampant trombocitus produkuojančia forma šis aktyvumas gali būti įvertintas Įvairiais metodais, tarp jų in vivo pelių cirkuliuojančių trombocitų inhibicijos metodu, trombocitų paviršinio antigeno indukcijos metodu, kuris yra antitrombocitų imuninis metodas (anti-GPII_bIII_a) t taikomas žmogaus leukemijos megakariocitų linijai (CMK), o taip pat megakarioblastų ląstelių linijos (DAMI) poliploidizacijos proceso indukcijos metodu.

Trombopoetinas (TPO) apibrėžiamas kaip junginys, turintis trombopoetinį aktyvumą arba sugebantis padidinti trombocitų kiekį žinduolių kraujyje. TPO gali padidinti endogeninį trombocitų kiekį 10%, geriau 50 %, geriausiai - pakelti trombocitų skaičių žmogaus kraujyje iki 150xl0⁹ trombocitų litre ar daugiau.

Išskirta mpl ligando nukleino rūgštis yra RNR arba DNR, turinti ne mažiau 16, o geriau 20 arba daugiau nukleotidų seką, koduojančią biologiškai aktyvų mpl Ugandą ar jo fragmentą; yra komplementari tokiai RNR ar DNR, arba hibridizuo j asi su ja ir išlieka stabiliai prisijungusi esant vidutinėms arba griežtom hibridizacijos sąlygom. Šie RNR ir DNR preparatai neturi nei vieno iš šaltinio nukleino rūgščių priemaišų, su kuriomis jie paprastai yra asocijuoti gamtiniuose šaltiniuose, o taip pat šie preparatai praktiškai neturi kitų žinduolių DNR ar RNR. Frazė neturi nei vieno iš šaltinio nukleino rūgščių priemaišų, su kuriais jie yra paprastai asocijuoti apima atvejus, kai nukleino rūgštis yra šaltinyje ar ląstelėje, bet yra kitos chromosominės lokalizacijos ar flankuojama tokiomis sekomis, kurios paprastai šaltinio ląstelėse neaptinkamos. Išskirtos mpl ligando nukleinio rūgšties pavyzdys yra RNR arba DNR, koduojanti biologiškai aktyvų mpl ligandą, kurio amino rūgščių liekanų seka yra identiška žmogaus, pelių ar kiaulės mpl ligando sekai bent 75 %, geriau - 80 %, dar geriau - 85 %, dar geriau - 90 % ir geriausiai - 95 %.

Terminas kontrolinės sekos, kai jis susijęs su ekspresija, reiškia DNR sekas, būtinas funkcionaliai prijungtos koduojančios sekos ekspresijai tam tikrame šeimininko organizme. Kontrolonės sekos, tinkančios prokariotams, pvz., apima promotoriaus ir operatoriaus sekas, ribosomų prisijungimo vietą ir, gal būt, kitas sekas, kurių vaidmuo nėra išaiškintas. Žinoma, kad eukariotinės ląstelės naudoja promotorius, poliadenilinimo signalus ir stiprintojus.

Terminas funkcionaliai prijungta, kai jis naudojamas nukleino rūgštims, reiškia, kad nukleino rūgštis sujungta su kita nukleino rūgšties seka, su kuria ją sieja funkcionalūs ryšiai. Pavyzdžiui, sekretorinio lyderio DNR funkcionaliai sujungta su polipeptido DNR; tokiu atveju šis polipeptidas ekspresuoj amas kaip prebaltymas, kuris dalyvauja polipeptido sekrecijoje; promotorius ir sustiprintojas funkcionaliai prijungti prie koduojančios sekos ir reguliuoja šios sekos transkripciją; ribosomų prisijungimo vieta, funkcionaliai prijungta prie koduojančios sekos, palengvina transliaciją. Paprastai funkcionalus prijungimas įgyvendinamas tiesiogiai sujungiant kontrolinę ir koduojančią sekas, o lyderinės sekos atveju šis prijungimas neturi pažeisti atviro skaitymo rėmelio. Tai nebūtina sustiprintojams. Prijungimas įvykdomas ligavimu tam tikrose restriktazių skėlimo vietose. Jei tokių vietų nėra, naudojami sintetiniai oligonukleotidinai adapteriai arba jungikliai (linkeriai), kaip Įprasta klonavimo praktikoje.

Egzogeninis elementas yra nukleino rūgšties seka, svetima ląstelei arba homologiška ląstelei, bet esanti tokioje pozicijoje, kokioje šis elementas ląstelės-šeimininkės nukleino rūgštyje paprastai neaptinkamas .

Terminai ląstelė, ląstelių linija ir ląstelių kultūra naudojami kaip sinonimai ir apima visas ląsteles arba ląstelių linijos palikuonys. Pvz., toks termiminas kaip transformantai arba transformuotos ląstelės apima pirminę transformuotą ląstelę ir iš jos išaugintą kultūrą, nepriklausomai nuo peršėjimų skaičiaus. Suprantama, kad ne visų palikuonių DNR griežtai identiška, nes ląstelėse vyksta tikslinės arba atsitiktinės mutacijos. Tie palikuonys, kuriuose mutacijos nepažeidė norimos funkcijos bei biologinio aktyvumo, ir toliau priskiriami prie transformantų. Iš konteksto paaiškės atvejai, kai tokie mutantai specialiai vadinami kitaip, nei pradinis transformantas.

Plazmidės - autonomiškai besireplikuojančios žiedinės DNR molekulės, turinčios nepriklausomą replikacijos iniciacijos vietą; tekste žymimos arba mažąja p raide prieš pavadinimą, arba didžiosiomis raidėmis ir/arba numeriais po pavadinimo. Pradinės plazmidės, naudojamos šiame išradime, yra arba perkamos, arba laisvai prieinamos, arba gali būti sukonstruotos minėtų plazmidžių pagrindu, naudojant publikuotus metodus. Kitos ekvivalentiškos plazmidės gerai žinomos ir prieinamos eiliniam šios srities specialistui.

Skaldymas restrikcijos fermentais - kai kalbama apie DNR, reiškia katalitinį vidinių DNR fosfodiesterinių jungčių skaldymą, naudojant fermentą, kuris veikia tik tam tikrose DNR sekos vietose. Tokie fermentai vadinami restrikcijos endonukleazėmis. Kiekviena restrikcijos endonukleazė atpažįsta specifinę DNR seką, vadinama restrikcijos vieta, kuri pasižymi antrine simetrija. Skirtingi restrikcijos fermentai, naudojami šiame išradime, yra komerciniai reagentai;reakcijos sąlygos bei kofaktoriai visiškai atitinka fermentų gamintojų rekomendacijas. Viešai priimta, kad restrikcijos fermentų pavadinimus sudaro sutrumpintas mikroorganizmo, iš kurio šis fermentas buvo pirmą kartą išskirtas, pavadinimas ir skaičius , žymintis patį fermentą. Paprastai lųg plazmidės arba DNR fragmento suskaldymui naudojami 1-2 vienetai fermento ir apie 20 μΐ buferinio tirpalo. Optimalius buferių ir substrato kiekius kiekvienam restrikcijos fermentui nurodo gamintojas. Dažniausiai reakcija vyksta apie 1 valandą 37°C temperatūroje, tačiau šitos sąlygos gali skirtis, jeigu tai nurodyta gamintojo specifikacijoje. Po inkubacijos baltymas arba polipeptidas pašalinamas ekstrahuojant fenoliu ir chloroformu, o suskaldyta DNR išskiriama iš vandens fazės išsodinant etilo alkoholiu. Po skaldymo gali būti atliekama 5' galo fosfatinių grupių hidrolizė, naudojant bakterinę šarminę fosfatazę; tai daroma, kad būtų išvengta DNR fragmentų galų susijungimo, t.y. žiedinės struktūros formavimosi, nes į tokios struktūros restrikcijos vietą nebus galima įterpti kito DNR fragmento. Jeigu tai nėra specialiai pažymėta, 5' galų defosforilinimas po plazmidės suskaldymo nebuvo taikomas. Defosforilinimo procedūra ir jai reikalingi reagentai aprašyti Sambrook, et ai. knygos Molecular cloning [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989] 1.56-1.61 skyriuose.

Tam tikro DNR fragmento išskyrimas ar izoliacija iš restrikcijos produktų apima: fragmentų mišinio frakcionavimą elektroforezės būdu poliakrilamidiniame ar agaroziniame gelyje; reikiamo fragmento identifikavimą pagal jo judrumą elektrof orezė j e (palyginama su žinomo molekulinio svorio markerinių DNR fragmentų judrumu); gelio gabaliuko, kuriame yra norimas fragmentas, išpjovimą; gelio ir DNR atskirimą. Ši procedūra yra gerai žinoma(žiūr. Lawn et ai., Nucleic Acids Res., 9:6103-6114 [1981], ir Goeddel et ai., Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980]).

Southern analizė arba Southern blotingas metodas, kurio pagalba nustatomas vienos ar kitos DNR sekos buvimas tiek mišinyje, kuriame yra DNR, tiek ir restrikcijos endonukleazėmis suskaldytoje DNR, hibridizuojant su žinomu žymėtu oligonukleotidu arba DNR fragmentu. Southern analizė paprastai apima elektroforetinų DNR frakcionavimą agaroziniame gelyje, frakcionuotos DNR denatūraciją ir pernešimą ant nitroceliuliozinės, nailoninės ar kitos tinkamos membranos ir tolesnę analizę su DNR pavyzdžiu, žymėtu radioaktyvia žyme, biotinu ar fermentu (žiūr. Sambrook et ai., supra, skirsniai 9.37-9.52).

Northern analizė arba Northern blotingas metodas, kurio pagalba identifikuojamos RNR sekos, besihibridizuojančios su žinomu pavyzdžiu, tokiu kaip oligonukleotidas, DNR fragmentas, kDNR ar jos fragmentas, arba RNR fragmentas. Tokie pavyzdžiai žymimi radioaktyviu izotopu (³²P), arba biotinu, arba fermentu. Analizuojama RNR paprastai elektroforetiškai frakcionuojama agaroziniame arba poliakrilamidiniame gelyje, pernešama ant nitroceliuliozinės, nailoninės ar kitos tinkamos membranos ir hibridizuojama su pavyzdžiu, naudojant standartines procedūras, gerai žinomas šios srities specialistams (žiūr. Sambrook et ai., supra, skirsniai 7.39-7.52).

Ligavimas - procesas, kuris formuoja fosfodiesterinius ryšius tarp dviejų nukleino rūgšties fragmentų. Tam, kad ligavimas galėtų Įvykti, fragmentų galai turi vienas kitą atitikti. Kai kuriais atvejais tinkami galai susidaro iš karto po skaldymo endonuklea51 zėmis. Tačiau dažnai po restrikcijos pirmiausia reikia bukus galus paversti lipniais - tinkamais ligavimui. Tam tikslui, DNR mažiausiai 15 min. inkubuojama 15°C temperatūroje tinkamame buferyje, turinčiame apie 10 vienetų DNR polimerazės I Klenow fragmento arba fago T4 DNR polimerazės ir visus keturis dezoksiribonukleotidtrifosfatus. Po šitos procedūros DNR išgryninama, ekstrahuojant fenolio-chloroformo mišiniu ir išsodinant etilo alkoholiu. DNR fragmentai, kurie turi būti susiūti, sumaišomi tam tikrame tirpale ekvimoliariniu santykiu. Į šio tirpalo sudėtį įeina ATP, ligazės buferinis tipalas ir ligazė, pvz.: T4 DNR ligazė, apie 10 vienetų/0,5 ųg DNR. Jeigu DNR turi būti Įsiūta į vektorių, tai pastarasis pirmiausia suskaldomas tinkama restrikcijos endonukleaze, tam kad vektorius būtų pervestas iš žiedinės į linijinę formą. Linearizuotas fragmentas toliau veikiamas bakterine ar kitos kilmės šarmine fosfataze, tam, kad ligavimo metu vektoriaus galai vėl nesusijungtų, sudarydami žiedinę molekulę.

DNR išskyrimas iš ląstelių reiškia plazmidės DNR išskyrimą iš ląstelių-šeimininkų kultūros. Dažniausiai taikomi didelių ir mažų DNR kiekių išskyrimo metodai aprašyti (žiūr. Sambrook et ai., supra, skirsniai 1.251.33). Po DNR išskyrimo ji gali būti toliau išgryninta, naudojant gerai žinomus metodus (žiūr. Sambrook et ai., supra, skirsnis 1.40).

Oligonukleotidai - trumpi, viengrandžiai ar dvigrandžiai poiidezoksinukleotidai, susintetinti cheminės sintezės būdu per dezoksinukleozid-H-fosfonatinius tarpinius junginius (Froehler et ai., Nucl. Acids Res., 14: 5399-5407 [1986]), arba naudojant tokius žinomus metodus kaip fosfotriesterinis, fosfitinis ar fosforamiditinis metodas kietoje fazėje (aprašyti EP 266032 publikuotame 1988.05.04). Kiti metodai apima polimerazinę grandininę reakciją, apibrėžtą žemiau, ir kitus autopradmeninius metodus, o taip pat oligonukleotidų sintezę ant kieto nešiklio. Visi šie metodai aprašyti (Engels et ai., Agnew. Chem. Int. Ed. Engi., 28:716-734 [1989]). Šie metodai taikomi tais atvejais , kai žinoma visa geno nukleino rūgšties seka arba seka, komplementari koduojančiai grandinei. Kita vertus, jeigu žinoma taikinio amino rūgščių liekanų seka, nukleino rūgšties seka gali būti išvesta žinant dažniausiai pasitaikančius amino rūgštis koduojančius trinukeotidus. Po sintezės oligonukleotidai išgryninami elektroforetiškai poliakrilamidiniame gelyje.

Polimerazinė grandininė reakcija arba PCR metodas, kurio pagalba padauginami labai maži specifinių nukleino rūgšties, RNR ir/arba DNR fragmentų kiekiai (žiūr.JAV patentas Nr.4,683,195, išleistas 1987.07.28). Taikant šį metodą, reikia žinoti norimo padauginti fragmento galines sekas tam, kad būtų galima susintetinti pradmenis; šie pradmenys turi būti identiški arba labai panašūs i sekas komplementarias dauginamai matricai. 5'galiniai pradmenų nukleotidai gali sutapti su dauginamo fragmento galais. PCR galima panaudoti dauginant specifines RNR sekas, specifines DNR sekas iš totalinės genominės DNR, kDNR, transkribuotos nuo totalinės ląstelės RNR, taip pat bakteriofago bei plazmidžių sekas ir 1.1, (žiūr. Mullis et ai., Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol., 51:263 [1987]; Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)). PCR yra vienas, bet ne vienintelis nukleino rūgščių polimerazinės reakcijos metodas, pritaikytas nukleino rūgšties pavyzdžio dauginimui, naudojant žinomas nukleino rūgštis kaip pradmenis ir polimerazinę reakciją kaip būdą padauginti arba sukurti specifinį nukleininės rūgšties fragmentą.

Griežtos sąlygos - tokios sąlygos, kurioms esant (1) plovimams taikomi mažos joninės jėgos ir aukštos temperatūros tirpalai, pvz.: 0,015M NaCl/0', 0015M natrio citratas/0,1% NaDodS0₄ (SDS) ir 50°C temperatūra; (2) hibridizacijos metu naudojami denatūruojantis agentai, tokie kaip formamidas, pvz.: 50 % (tūris/tūryje) formamidas su 0,1% galvijų serumo albuminu/O,1% fikolis/0,1% polivinilpirolidonas/50 mM natrio fosfatinis buferis tirpalas (pH 6,5) su 750 mM NaCl, 75 mM natrio citrato ir 42°C temperatūra. Kitame pavyzdyje hibridizacija vykdoma tokiame tirpale: 50 % formamido, 5xSSC (0,75mM NaCl, 0,075M natrio citratas), 50 mM natrio fosfatas (pH 6,8), 0,1% natrio pirofosfatas, 5xDenhardto tirpalas, ultragarsu apdorota lašišos spermos DNR (50 ųg/ml) , 0,1 % SDS ir 10 % dekstransulfatas; hibridizacija vyksta 42°C temperatūroje, praplovimus atliekant 42°C temperatūroje 0,2xSSC su 0,1% SDS.

Vidutiniškai griežtos sąlygos aprašytos Sambrook et ai., supra, kuriose praplovimo bei hibridizacijos sąlygos (temperatūra, joninė jėga ir SDS koncentracija) ne tokios griežtos, kaip aprašyta aukščiau. Vidutiniškai griežtų sąlygų pavyzdys pateikiamas žemiau: inkubacija pernakt 37°C temperatūroje; į hibridizacijos tirpalo sudėtį įeina 20 % formamidas, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM trinatrio citratas), 50 mM natrio fosfatas (pH 7,6), 5x Denharto tirpalas, 10 % dekstransulfatas ir 20 μΐ/ml denatūruotos fragmentuotos lašišos spermos DNR; membrana atplaunama lxSSC tirpalu esant 37-50°C temperatūrai. Patyręs specialistas mokės parinkti tinkamas sąlygas kiekvienam konkrečiam atvejui.

Antikūnai (Abs) ir imunoglobulinai (Igs) glikoproteinai, turintys vienodas struktūrines charakteristikas. Antikūnams būdinga specifinė sąveika su tam tikru antigenu, o imunoglobulinai apima ir antikūnus, ir panašios struktūros molekules, nepasižyminčias tokia specifine sąveika. Pastarojo tipo polipeptidus produkuoja mažais kiekiais limfoidinė sistema, o dideliais mielomos.

Natyvūs antikūnai ir imunoglobulinai - apie 150 kD molekulinės masės heterotetrameriniai glikoproteinai, susidedantys iš dviejų identiškų lengvųjų (L) ir dviejų identiškų sunkiųjų (H) grandinių. Lengvoji ir sunkioji grandinės tarpusavy sujungtos viena kovalentine disulfidine jungtimi, tuo tarpu disulfidinių jungčių kiekis tarp sunkiųjų grandinių skiriasi, priklausomai nuo imunoglobulino izotipo. Kiekvienoje sunkiojoje bei lengvojoje grandinėje yra taip pat reguliariai išdėstyti vidugrandininiai disulfidiniai tiltai. Viename sunkiosios grandinės gale yra variabilus domenas (V_H) , po kurio seka keli pastovieji domenai. Kiekviena lengvoji grandinė viename gale turi variabilų domeną (V_L), o kitame - pastovųjį (C_L) domeną; pastovusis lengvosios grandinės domenas yra ties pirmuoju pastovaus sunkiosios grandinės domenu, o variabilus lengvosios grandinės domenas yra asocijuotas su variabiliu sunkiosios grandinės domenu. Žinoma, kad tam tikrose pozicijose esančios amino rūgščių liekanos formuoja lengvosios ir sunkiosios grandinių variabilių domenų tarpą (Clothia et ai., J. Mol. Biol186:651-663 [1985]; Novotny and Haber, Proc. Natl. Sci. USA, 82:4592-4596 [1985].

Terminas variabilus atspindi tą faktą, kad tam tikrų variabilių domenų dalinių amino rūgščių liekanų sekos yra labai skirtingos ir, būtent, šios dalys dalyvauja formuojant sąveikos su antigenu centrą ir apsprendžia specifinę antigeno ir antikūno sąveiką. Tačiau sekos variabilumas netolygiai paskirstytas variabiliame domene. Tiek lengvosios, tiek sunkiosios grandinių variabilių domenų skirtumai sukoncentruoti trijuose segmentuose, vadinamuose komplementarumą apsprendžiančiais regionais (CDR_S) arba hipervariabiliais regionais. Labiausiai konservatyvios variabilių domenų dalys vadinamos karkasais (Framework, FR) . Natyvių lengvųjų ir sunkiųjų grandinių variabilus domenai turi keturis

FR, turinčius β-klosčių struktūrą, ir sujungtus į kilpą trimis CDR_S, kai kuriais atvejais sudarančiais β-klosčių struktūrų dalį. Kiekvienoje grandinėje CDR_S išsilaiko šalia vienas kito erdvinėje struktūroje FR regionų dėka ir kartu su kitos grandinės CDR_S regionais sudaro antikūno sąveikos su antigenu centrą (žiūr. Kabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD [1987]). Pastovieji domenai tiesiogiai nedalyvauja sąveikoje su antigenu, tačiau jie atlieka įvairias efektorines funkcijas, pvz.: apsprendžia antikūnų dalyvavimą nuo antikūnų priklausančioje ląstelių toksiškumo reakcijoje.

Antikūną suskaldžius papainu, susidaro du identiški antigeną rišantys fragmentai, vadinami Fab fragmentais, kurie turi po vieną sąveikos su antigenu centrą, ir Fc fragmentas, kurio pavadinimas kilo iš jo savybės lengvai kristalizuotis. Suskaldžius antikūną pepsinu susidaro F(ab')₂ fragmentas, kuris turi 2 sąveikos su antigenu centrus ir todėl gali sujungti dvi antigeno molekules.

Fv yra pats mažiausias antikūno fragmentas, turintis pilną antigeno atpažinimo ir surišimo vietą. Šis fragmentas yra sunkiosios ir lengvosios grandinių variabilių domenų dimeras, išlaikomas stipria nekovalentine sąveika. Būtent šioje konfigūracijoje , kurioje sąveikauja po tris kiekvieno variabilaus domeno CDR_Sregionus, susidaro antigeną rišanti vieta V_H-V_L dimero paviršiuje. 6 CDR_S kolektyviai apsprendžia antikūno specifiškumą. Tačiau net ir vienas variabilus domenas (arba pusė F_v, kuris sudarytas tik iš trijų CDR_S) gali atpažinti ir surišti antigeną, nors ir su mažesniu afiniškumu, nei pilnas surišimo centras.

Į Fab fragmento sudėtį įeina lengvosios grandinės pastovusis domenas ir pirmasis pastovusis (CH1) sunkiosios grandinės domenas. Fab' fragmentas skiriasi nuo

Fab fragmento tuo, kad prie sunkiosios grandinės CH1 domeno karboksilinio galo yra keletas papildomų amino rūgščių liekanų, tarp jų viena ar daugiau cisteino liekanų iš antikūno talijos regiono. Fab', turintys cisteino liekanų su laisva tioline grupe, vadinami Fab'-SH. Antikūnų F(ab')2 fragmentai gaminami kaip Fab' fragmentų poros, sujungtos talijos regiono cisteinais. Taip pat žinomi ir kiti cheminiai antikūnų fragmentų sujungimo būdai.

Pagal pastovaus domeno amino rūgščių liekanų seką visų stuburinių gyvūnų antikūnų (imunoglobulinų) lengvosios grandinės skirstomos į du aiškiai skirtingus tipus, vadinamus kapa (k) ir lambda (λ) .

Priklausomai nuo sunkiosios grandinės pastoviųjų domenų amino rūgščių liekanų sekos, imunoglobulinai skirstomi į kelias klases. Yra 5 pagrindinės imunoglobulinų klasės: IgA, IgD, IgE, IgG ir IgM, ir kai kurios iš jų toliau skirstomos į poklasius (izotipus), pvz.: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4; IgAl ir IgA2. Sunkiųjų grandinių pastoviuosius domenus, atitinkančius šias pagrindines klases, žymime α, δ, ε, γ ir μ, atitinkamai. Įvairių klasių imunoglobulinų subvienetų struktūra ir erdvinė konfigūracija gerai žinomos.

Terminas antikūnas labai plačiai naudojamas ir taikomas tiek monokloniniams antikūnams (tarp jų agonistiniams ir antagonistiniams), tiek ir antikūnų mišiniams su poliepitopiniu specifiškumu bei antikūnų fragmentams (pvz.: Fab, F(ab')2 ir Fv) , jei pastarieji išlaiko norimą biologinį aktyvumą.

Terminas monokloniniai antikūnai čia naudojamas aprašant antikūnus, gautus iš praktiškai homogeniškos antikūnų populiacijos, kurioje individualios antikūnų molekulės yra visiškai identiškos, išskyrus nedidelius kiekius natūraliu būdu atsirandančias mutantines molekules. Monokloniniai antikūnai yra labai specifiški ir reaguoja tik su viena antigenine determinante. Skirtin57 gai nuo tradicinių (polikloninių) antikūnų preparatų, kuriuos sudaro skirtingi antikūnai prieš skirtingas antigenines determinantes (epitopus) , kiekvienas monokloninis antikūnas reaguoja tik su viena antigeno determinante. Be didelio specifiškumo kitas monokloninių antikūnų privalumas yra tas, kad jie gaminami hibridominių ląstelių kultūroje ir todėl neužteršti kitais imunoglobulinais. Būdvardis monokloninis nurodo, kad antikūnas išskirtas iš praktiškai homogeninės antikūnų populiacijos ir neapsiriboja vienu konkrečiu antikūnų gavimo būdų. Pvz.: monokloniniai antikūnai , naudojami šiame išradime, gali būti pagaminti tiek hibridominių metodu pagal Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975), tiek genoinžinieriniu metodu (žiūr. pvz., JAV patentą Nr. 4816567 [Cabilly et ai.]).

Šiame išradime minimi monokloniniai antikūnai apima chimerinius antikūnus (imunoglobulinus), kuriuose dalis sunkiosios ir /arba lengvosios grandinės identiška ar homologiška atitinkamoms sekoms tų antikūnų, kurie išskirti iš vienos gyvūnų rūšies arba priklausantys vienai antikūnų klasei ar poklasiui, tuo tarpu kita grandinės (grandinių) dalis identiška ar homologiška sekoms tų antikūnų, kurie išskirti iš kitos gyvūnų rūšies arba priklausantys kitai antikūnų klasei ar poklasiui; čia taip pat įeina ir tokių chimerinių molekulių fragmentai, jeigu jie turi norimą biologinį aktyvumą (JAV patentas Nr. 4816567 (Cabilly et ai.); Morrison et ai., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 81:68516855 [1984]).

Humanizuoti ne žmogaus kilmės antikūnai (pvz.: pelių) tai yra chimeriniai imunoglobulinai, arba jų grandinės, arba jų fragmentai (tokie kaip Fv, Fab, Fab' , F(ab')2 arba kitokios antigeną rišančios sekos, gautos iš antikūnų), kuriuose ne žmogaus kilmės sekų kiekis yra sumažintas iki minimumo. Daugeliu atvejų humanizuoti antikūnai yra žmogaus imunoglobulinai (recipientinis antikūnas), kuriuose komplementarumą apsprendžiančių regionų (CDR) liekanos yra pakeistos CDR liekanomis iš ne žmogaus kilmės, pvz.:pelės, triušio ar žiurkės, turinčių norimą specifiškumą ir afiniškumą, donorinių antikūnų. Kai kuriais atvejais žmogaus imunoglobulino Fv karkasinės amino rūgščių liekanos gali būti pakeistos atitinkamomis ne žmogaus kilmės sekų liekanomis. Dar daugiau, humanizuotuose antikūnuose gali būti amino rūgščių liekanų, kurių nėra nei recipientinėse, nei donorinėse CDR ar karkasinėse sekose. Tai daroma tam, kad būtų pagerintas ir optimizuotas antikūnių aktyvumas. Humanizuoti antikūnai susidaro mažiausiai iš vieno ar, dažniausiai, iš dviejų variabilių domenų, kuriuose visos arba beveik visos CDR liekanos yra ne žmogaus kilmės, o visos ar beveik visos FR liekanos yra žmogaus. Humanizuotuose antikūnuose taip pat yra bent dalis pastovaus regiono (Fc), paprastai tai žmogaus imunoglobulino regiono dalis. Smulkesnius aprašymus galima rasti (Jonės et ai., Nature, 321:522525 [1986]; Reichmann et ai., Nature, 332:323-329 [1988]; Presta, Curr. Op. Biol., 2:593-596 [1992]).

Neimunogeniškas žmogui reiškia, kad vaistinė polipeptido forma, esant jos atitinkamai terapinei dozei, kontaktuodama su atitinkamais žmogaus audiniais, nesukelia jokios jautrumo ar atsparumo polipeptidui būklės, kuri pasireikštų vartojant polipeptidą antrą kartą, praėjus atitinkamam latentiniam periodui (pvz.: po 8-14 dienų).

II. Geriausi išradimo variantai

Šiame išradime aprašyti polipeptidai yra praktiškai homogeniškas polipeptidas(polipeptidai) , vadinamas mpl ligandu(ligandais) arba trombopoetinu’ (TPO), kuris gali jungtis su mpl, citokinų receptorių superšeimos nariu, ir turi biologinę savybę stimuliuoti žymėtų nukleotidų (³H-timidino) isijungimą į IL-3 priklausomų Ba/F3 ląstelių, transformuotų žmogaus mpl P genu, DNR. Šiame išradime aprašytas mpl ligandas(Ugandai) - tai išskirtas žinduolių baltymas(baltymai), turintis hemopoetinį, ypač megakariocitopoetini ar trombopoetinį, aktyvumą - būtent, sugebantis stimuliuoti nesubrendusių megakariocitų ar jų pirmtakų proliferaciją, brendimą ir/arba diferenciaciją į subrendusius trombocitus produkuojančią formą. Konkrečiai šiame išradime aprašyti polipeptidaitai žmogaus mpl ligandas(Ugandai), arba jo fragmentai, turintys hemopoetinų, megakariocitopoetinį ar trombopoetinį aktyvumą. Šie žmogaus mpl ligandai nebūtinai glikozilinti. Kiti pateikiami žmogaus mpl ligandai yra hML EPO-domenas, vadinamas hMLi53 arba hTPOis₃ , sutrumpinta hML forma, vadinama hML₂₄₅ arba hTPO₂4₅ , ir pilno ilgio subrendęs polipeptidas, turintis Fig. 1 (SEQ ID Nr.: 1) parodytą amino rūgščių liekanų seką, vadinamas hML, hML₃₃₂ arba TPO₃₃₂, o taip pat biologiškai aktyvus šio polipeptido variantas su pakeistomis amino rūgščių liekanomis hML(R153A, R154A).

Taip pat šiame išradime aprašyti polipeptidai biologiškai arba imunologiškai aktyvūs mpl ligando variantai, atrinkti iš hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML ir pML2.

Taip pat pateikiami šiame išradime polipeptidai biologiškai aktyvūs mpl ligando variantai, kurių amino rūgščių liekanų sekos mažiausiai 70% identiškos žmogaus mpl ligando sekai (žiūr. Fig. 1 [SEQ ID Nr.:l]), pelės mpl ligando sekai (žiūr. Fig. 16 [SEQ ID Nr.:12 ir 13]), kiaulės rekombinantinio mpl ligando sekai (žiūr. Fig. 19 [SEQ ID Nr.:18]) arba kiaulės mpl ligando, išskirto iš aplastinės kiaulės plazmos, sekai.

Pateikiamas identiškumas siekia mažiausiai 75%, o geriausia, jeigu jis siekia 95 % ir daugiau.

mpl ligandas, išskirtas iš aplastinių kiaulių plazmos, charakterizuojamas taip:

(1) Dalinai išgrynintas gelfiltracinės kolonėlės, ligandas eliujuojamas iš atliekant chromatografiją

PBS, PBS su 0,1 % SDS ar PBS su 4 M MgCl₂, 60-70 kD molekulinių masių srityje.

(2) Ligandas aktyvumą praranda paveikus pronaze (3) Ligandas yra stabilus esant žemam pH (2,5), esant

0,1 % SDS ir 2 M karbamido;

(4) Ligandas yra glikoproteinas, nes jis yra sorbuojamas įvairiais lecitino sorbentais;

(5) Išgryninto ligando eliuatai iš SDS PAGE gelio, analizę atlikus neredukuojančiomis sąlygomis, yra 2525 kD molekulinių masių zonoje. Mažesni jo kiekiai aptinkami -18-22 ir 60 kD zonose;

(6) Išgrynintas ligandas SDS PAGE analizėje redukuojančiomis sąlygomis išsiskiria į dvi juostas - 28 ir 31 kD;

(7) Ligando formų, išskirtų iš 18-22, 28 ir 31 KD zonų, N galo amino rūgščių liekanų sekos yra tos pačios SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID Nr.:29); ir (8) Ligandas yra sorbuojamas ir desorbuoj amas nuo šių sorbentų:

Blue-Sepharose,

CM Blue-Sepharose MONO-Q,

MONO-S,

Lentil lectin-Sepharose,

WGA-Sepharose,

Con A-Sepharose,

Ether 650m Toyopearl,

Butyl 650m Toyopearl,

Phenyl 650m Toyopearl ir

Phenyl-Sepharose.

Labiau tinkami mpl ligando polipeptidai yra tie, kurie koduojami žmogaus genomine ar kDNR, kurių amino rūgščių liekanų seka yra pateikta Fig. 1 (SEQ ID

Nr . : 1) .

Kiti gamtiniai biologiškai aktyvūs mpl ligando polipeptidai - šio išradimo objektai - yra prepro-mpl ligandas, pzo-mpl ligandas, subrendęs mpl ligandas, mpl ligando fragmentai ir glikozilinti variantai.

Kiti šiame išradime aprašyti polipeptidai apima mpl ligando amino rūgščių liekanų sekos variantus ir chimeras. Kaip Įprasta, priimtinais laikomi tie biologiškai aktyvūs mpl ligando variantai ir chimeros, kurių amino rūgščių liekanų sekų homologiškumas žmogaus mpl ligandui ar mpl ligandui, išskirtam iš aplastinių kiaulių, yra ne mažesnis nei 70 %, geriau, kai homologija yra bent 75 %, dar geriau, kai - bent 80 %, dar geriau, kai - bent 85 %, dar geriau, kai - bent 90 % ir geriausia, kai nemažiau 95 %. Vienas pavyzdinių mpl ligando variantų yra hML N galo domenas (vadinamas EPO-domenu dėl amino rūgščių liekanų sekos homologijos su eritropoetinu) . Geriausią hML EPO domeną sudaro apie 153 pirmųjų amino rūgščių liekanų iš subrendusio hML ir todėl jis vadinamas hMLis₃. Dar geresnis hML amino rūgš25 čių liekanų sekos variantas yra tas, kuriame viena ar kelios bazinės arba dviejų bazinių amino rūgščių liekanų poros, esančios C galo domene, pakeistos i nebazines amino rūgščių liekanas (pvz., į hidrofobines, neutralias, rūgščias, aromatines, Gly, Pro ar panašias).

Geriausia hML C galo domeno seka yra tokia, kur 153 ir 154 Arg liekanos pakeistos Ala liekanomis. Šis variantas vadinamas hML₃₃2 (R153A, R154A) . Kiti geriausi hML variantai yra arba hML₃32 , arba hMLis₃, kuriuose amino rūgščių liekanos nuo 111 iki 114 (QLPP arba LPPQ) yra pašalintos arba pakeistos kitais tetrapeptidais (pvz.,

AGAG ar panašiais). Šie deleciniai mutantai vadinami A4hML₃32 ir A4hMLi₅₃.

Geriausia chimera yra baltymas, kur mpl ligandas arba jo fragmentas (apibrėžtas žemiau) sulietas su heterologiniu polipeptidų arba jo fragmentu. Pavyzdžiui, hMLi_S3 gali būti suliejamas su IgG fragmentu, siekiant prailginti preparato cirkuliacijos kraujyje laiką, arba su IL-3, G-CSF ar EPO, siekiant gauti molekulę su didesniu trombopoetiniu aktyvumu ar su chimerinių komponentų aktyvumu.

Kita geriausia žmogaus mpl ligando chimera yra ML-EPO domeno chimera, kuri sudaryta iš 153-157 N gale esančių hML amino rūgščių liekanų, kur viena ar kelios, bet ne visos, liekanos pakeistos žmogaus EPO liekanomis, kaip parodyta Fig. 10 (SEQ ID Nr.:7). Šiame išradime hML chimera turi būti apie 153-166 amino rūgščių liekanų ilgio ir atskiros amino rūgščių liekanos ar individualūs liekanų blokai yra paimti iš žmogaus EPO sekos ir įterpti į hML baltymo seką, arba pakeista dalis hML sekos, vietose, kurios nurodytos Fig. 10 (SEQ ID Nr.:6) . Tokių intarpinių sekų pavyzdžiai apima: vieną ar kelias N-glikozilinimo vietas, esančias EPO amino rūgščių liekanų sekoje pozicijose 24-27, 38-40 ir 83-85; vieną ar kelias iš keturių spėjamų amfipatinių α-spiralių sričių, esančių EPO amino rūgščių liekanų sekoje pozicijose 9-22, 59-76, 90-107 ir 132-152; taip pat kitas konservatyvias sritis, tarp jų EPO molekulės N ir C galų amino rūgščių liekanų sekas, bei liekanas, esančias pozicijoje (epo) 44-52 (žiūr., pvz., Wen et ai., Blood, 82:1507-1516 [1993] ir Boissel et ai., J. Biol. Chem., 268(21): 15983-15993 [1993]). Tikimasi, kad ši ML-EPO domenų chimera turės mišrų trombopoetinį-eritropoetinį (TEPO) biologinį aktyvumą.

Kiti šio išradimo polipeptidai apima mpl ligando fragmentus, turinčius nepertraukiamas bent 10, 15, 20,

25, 30 ar 40 amino rūgščių liekanų sekas, identiškas mpl ligando, išskirto iš aplastinių kiaulių plazmos arba čia aprašyto žmogaus mpl ligando (žiūr. Lentelę 14, Pavyzdį 24) amino rūgščių liekanų sekoms. Geriausias mpl ligando fragmentas yra žmogaus ML[1-X], kur X yra 153, 164, 191, 205, 207, 217, 229 ar 245 (žiūr. Fig. 1 [SEQ ID Nr.:l]). Kiti geriausi mpl ligando fragmentai yra tie fragmentai, kurie gauti cheminės ar fermentinės hidrolizės būdu iš išgryninto ligando.

Kitas išradimo aspektas yra mpl ligando molekulių išgryninimo būdas, kuris apima: mpl ligando šaltinio, turinčio mpl ligando molekulių, sąveiką su imobilizuotu receptoriaus polipeptidu, konkrečiai su mpl ar mpl hibridiniu polipeptidu, tokiomis sąlygomis, kai gryninamos mpl ligando molekulės selektyviai sorbuojasi ant imobilizuoto receptoriaus polipeptido, sorbento praplovimą, pašalinant nesisorbavusius pašalinius baltymus, ir gryninamų molekulių eliuciją nuo imobilizuoto receptoriaus polipeptido eliucijos buferiniu tirpalu, mpl ligando šaltinis gali būti plazma, o geriausias imobilizuotas receptorius yra mpl-IgG sulietas polipeptidas.

Taip pat mpl ligando šaltinis gali būti rekombinantinė kultūra, kur mpl ligando koncentracija kultūriniame skystyje arba ląstelių lizatuose yra žymiai didesnė, nei plazmoje ar kituose gamtiniuose šaltiniuose. Todėl aukščiau aprašytas mpl-IgG imunoafininis būdas nebūtinai gali būti taikomas, nes gali būti pritaikomi kiti žinomi tradiciniai baltymų gryninimo metodai. Trumpai, geriausias gryninimo būdas, kurio metu gaunamas homogeniškas mpl ligandas, apima šeiminko ląstelių nuolaužų ar ūžavimo fragmentų pašalinimą, pavyzdžiui, centifūguojant ar ultrafiltruoj ant; po to baltymai gali būti sukoncentruojami komerciniais baltymų koncentravimui skirtais filtrais; toliau seka ligando atskyrimas nuo kitų pašalinių medžiagų viena ar keliomis stadijomis, pasirenkamomis iš: imunoafininės chromatografijos, jonų mainų chromatografijos (pvz., DEAE ar sorbentai su karboksimetil- ar sulfopropil- grupėmis) , chromatografijos su Blue-Sepharose, CM BlueSepharose, MONO-Q, MONO-S, lentil lectin-Sepharose, WGA-Sepharose, Con A-Sepharose, Ether-Toyopearl, Butyl Toyopearl, Phenyl Toyopearl, protein-A Sepharose, preparatyvinės SDS-PAGE, atvirkščių fazių HPLC (pvz., silikagelis su alifatinėmis grupėmis) ar gelfiltracijos su Sephadex sorbentais, ir išsodinimo etanoliu ar išsodinimo amonio sulfatu. Proteinazių inhibitorius - metilsulfonilfluoridas (PMSE) gali būti naudojamas bet kokioje gryninimo stadijoje, siekiant sumažinti proteolizę.

Kitas šio išradimo objektas yra išskirti antikūnai, sugebantys jungtis su mpl ligandu. Geriausi antikūnai mpl ligandui išskirti yra monokloniniai (Kohler ir Milstein, Nature, 256:495-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon et ai., Eds, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam [1985]; ir Huse et ai., Science, 246:1275-1281 [1989]). Geriausi mpl ligando išskyrimui antikūnai yra tie, kurie jungiasi su mpl ligandu ne mažesniu afiniškumu, nei 10⁶ 1/moliui. Dar geresni antikūnai, kurių afiniškumas didesnis, nei 10⁷ 1/moliui. Geriausia, kai atikūnai yra gaunami prieš mpl Ugandą, turintį vieną iš aukščiau aprašytų efektorinių funkcijų. Antikūnai, sugebantys jungtis su mpl ligandu, gali būti sulieti su kitu polipeptidu, ir antikūnas ar sulietas baltymas gali būti naudojamas mpl ligando išskyrimui iš šaltinių, kaip aprašyta aukščiau, bei gryninimui. Kitas išradimo objektas yra būdas, kurio pagalba galima nustatyti mpl Ugandą in vitro ir in vivo, apimantis antikūnų sąveiką su mėginiu, ypatin65 gai su serumo pavyzdžiais, kuriuose tikimasi rasti ligandą ir susidariusio junginio detekciją, jei toks susidaro.

Kitas išradimo objektas yra išskirta nukleino rūgšties molekulė, koduojanti mpl ligandą ar jo fragmentą. Ši nukleino rūgšties molekulė gali būti pažymėta arba nežymėta, ir nukleino rūgšties molekulės seka yra komplementari, galinti hibridizuotis, esant griežtoms arba vidutiniškai griežtoms sąlygomis, su nukleino rūgšties molekule, koduojančia mpl ligandą. Geriausia mpl ligando nukleino rūgštis yra RNR ar DNR, kuri turi bent 75 % homologijos su molekule, koduojančia biologiškai aktyvų mpl ligandą, dar geriau, kai homologiją yra bent 80 %, dar geriau - 85 %, dar geriau - 90 % ir pats geriausias atvejis, kai homologiją žmogaus mpl ligandui yra 95 %. Geriausia išskirta nukleino rūgšties molekulė yra DNR seka, koduojanti biologiškai aktyvų mpl ligandą, atrinkta iš: (a) DNR iš žinduolių mpl ligando geno regiono (pvz., DNR, kurioje yra nukleotidų seka, pateikta Fig. 1 (SEQ ID Nr.:2) ar jos fragmentai) ; (b) DNR, sugebančios hibridizuotis su (a) DNR, esant bent vidutiniškai griežtoms sąlygoms; ir (c) DNR, kuri yra išsigimusi lyginant su DNR apibrėžta (a) ar (b) . Manoma, kad nauji mpl Ugandai, aprašyti šiame išradime, gali būti ligandų šeimos nariai ar citokinų šeimos nariai, turintys pakankamai identiškas sekas, kad jų DNR galėtų hibridizuotis su DNR, pateikta Fig. 1 (SEQ ID Nr.:2) (būtų komplementari ji pati arba jos fragmentai), esant nuo silpnų iki vidutiniškai griežtų, sąlygoms. Taigi, kitas šio išradimo aspektas yra, DNR, kuri hibridizuojasi esant nuo silpnų iki vidutiniškai griežtų, sąlygoms su DNR, koduojančia mpl ligandų polipeptidus.

Kitas šio išradimo objektas yra nukleino rūgšties molekulė - kDNR, koduojanti mpl ligandą, ir joje esantis replikacijos vektorius, kuris kDNR funkcionaliai sujungia su kontroliuojančiomis sekomis, atpažįstamomis transformuoto vektoriumi šeimininko. Šis aspektas apima ląsteles-šeimininkus, transformuotus vektoriumi ir būdą, kurio pagalba kDNR apsprendžia mpl ligando produkciją transformuotų ląstelių kultūroje, o taip pat mpl ligando išskyrimą iš ląstelių kultūros, mpl ligandas, paruoštas tokiu būdu, yra praktiškai homogeninis žmogaus mpl ligandas. Geriausios ląstelės-šeimininkės mpl ligando produkcijai yra Kinietiškų žiurkėnių kiaušidžių (CHO) ląstelės.

Išradimas taip pat apima terapiškai efektyvaus mpl ligando kiekio pasirinkimą ir panaudojimą, žinduolių su imunologiniais ar hematopoetiniais susirgimais, ypač trombocitopenija, terapijoje. Mpl ligandas gali būti vartojamas kartu su kitais citokinais, ypač su kolonijas stimuliuojančiu faktoriumi ar interleukinu. Geriausi kolonijas stimuliuojantys faktoriai ar interleukinas yra: kit-ligandas, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 ar IL-11.

III. Išskyrimo principai

Daugelis autorių ilgą laiką manė, kad trombocitų produkcija kontroliuojama keliais, įvairioms hemopoetinių ląstelių atšakoms specifiniais humoraliniais faktoriais. Buvo teigiama, kad magakariocitopoezė ir trombopoezė reguliuojama dviem skirtingais citokinų aktyvumais, priskiriamais magakariocitų kolonijų stimuliuojančiam faktoriui (meg-CSF) ir trombopoetinui (Williams et ai., J. Cell Physiol., 110:101-104 [1982]; (Williams et ai., Blood Cells, 15:123-133 [1989]; ir Gordon et ai., Blood, 80:302-307 [1992]). Pagal šią hipotezę, meg-CSF stimuliuoja megakariocitų pirmtakų proliferaciją, o trombopoetinas pirmiausia įtakoja labiau diferencijuotų ląstelių brendimą ir galų gale trombocitų produkciją. Iki 1960 metų tiek meg-CSF, tiek ir trombopoetino indukcija bei aktyvumų pasirodymas gyvūnų ir žmogaus plazmoje, serume ir šlapime,esant trombocitopenijos epizodams, buvo pakankamai gerai aprašyti (Odeli et ai., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108:428-431 [1961]; Nakeff et ai., Actą Haematol., 54:340-344 [1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108:146149 [1961]; Schreiner et ai., J. Clin. Invest., 49:1709-1713 [1970]; Ebbe, Blood, 44:605-608 [1974]; Hoffman et ai., N. Engi. J. Med., 305:533 [1981]; Straneva et ai., Exp. Hematol., 17:1122-1127 [1988]; Mazur et ai., Exp. Hematol., 13:1164 [1985]; Mazur et ai., J. Clin. Invest., 68:733-741 [1981]; Sheiner et ai., Blood, 56:183-188 [1980]; Hill et ai., Exp. Hematol., 20:354-360 [1992] ir Hegyi et ai., Int. J. Cell Cloning, 8:236-244 [1990]). Buvo aprašyta, kad šie aktyvumai yra specifiniai tam tikrai hemopoetinių ląstelių atšakai ir skyrėsi nuo žinomų citokinų aktyvumų (Hill R. J. et ai., Blood, 80:346 [1992]; Erickson-Miller C.L. et ai., Brit. J. Haematol., 84:197-203 [1993]; Straneva J. E. et ai., Exp. Hematol. 20:4750 [1992] ir Tsukada J. et ai., Blood 81:866-867 [1993]). Bet pastangos išgryninti meg-CSF ar trombopoetiną iš trombocitopeninės plazmos ar šlapimo buvo nesėkmingos.

Remiantis aukščiau minėtais trombocitopeninės plazmos tyrimais, mes nustatėme, kad aplastinių kiaulių plazma (APP), gauta iš apšvitintų kiaulių, stimuliuoja žmogaus megakariocitopoezę in vitro. Mes nustatėme, kad šis stimuliuojantis aktyvumas panaikinamas tirpiu ekstraląsteliniu c-mpl domenu, o tai patvirtina, kad APP yra potencialus ieškomo mpl ligando (ML) šaltinis. Mes sėkmingai išgryninome mpl Ugandą iš APP, ir nustačius mpl ligando amino rūgščių liekanų seką, buvo galima išskirti pelės, kiaulės ir žmogaus ML baltymo kDNR.

Šie ML baltymai pasižymi sekų homologija su eritropoetinu ir turi kaip meg-CSF aktyvumą, taip ir i trombocitopoetiną panašų aktyvumą.

1. inpl ligando gryninimas iš plazmos ir identifikavimas

Kaip buvo pažymėta aukščiau, iš įvairių šaltinių gautoje aplastinėje plazmoje buvo aptiktas aktyvumas, stimuliuojantis hematopoezę in vitro, bet nebuvo išskirtas iš plazmos joks hemotopoezę stimuliuojantis faktorius. Vienas iš aplastinės plazmos šaltinių yra apšvitintų kiaulių plazma. Ši aplastinių kiaulių plazma (APP) stimuliuoja žmogaus hemopoezę in vitro. Siekiant nustatyti, ar APP yra mpl ligandas, buvo matuojamas ³H-timidino įsijungimas į Ba/F3 ląsteles, transfekuotas žmogaus mpl P (Ba/F3-mpl). Šio metodo eiga pateikta Fig. 2. APP stimuliuoja ³H-timidino Įsijungimą i Ba/F3-mpi ląsteles, bet ne į kontrolines Ba/F3 ląsteles (t.y., netransfekuotas žmogaus mpl P). Papildant, jokio aktyvumo nebuvo pastebėta, tyrimus atliekant su normalių kiaulių plazma. Šie rezultatai parodo, kad APP yra faktorius arba faktoriai, kurie perduoda proliferacijos signalą per mpl receptorių ir tai gali būti natūralus ligandas šiam receptoriui. Tai buvo patvirtinta apdorojus APP tirpiu mpl-IgG, kuris blokuodavo stimuliuojantį APP efektą ląstelėms Ba/F3-mpl.

Šis APP faktorius yra baltymas, nes paveikus APP pronaze, DTT ar pakaitinus, buvo prarandamas APP stimuliuojantis aktyvumas (Fig. 3). Aktyvumas nebuvo prarandamas, dializuojant APP. Šis faktorius stabilus, esant žemoms pH reikšmėms (2 valandas pH 2,5), buvo parodyta, kad šis faktorius yra sorbuojamas keliais lectin-afininiais sorbentais, o tai reiškia, kad šis baltymas yra glikozilintas. Sekantis etapas, nustatant šio fakto69 riaus struktūrą ir identiškumą, buvo afininis šio faktoriaus išgryninimas iš APP, naudojant mpl-IgG chimerą.

APP buvo apdorojama taip, kaip aprašyta Pavyzdžiuose 1 ir 2. Trumpai, mpl ligandas buvo gryninamas naudojant hidrofobinės sąveikos chromatografiją (HIC), chromatografija su imobilizuotais dažais ir mpl-afininę chromatografiją. Aktyvumo išeiga kiekvienoje chromatografijos stadijoje pateikta Fig. 4, o kiekvienos stadijos išgryninimo faktoriai (kartais) pateikti Lentelėje 1. Bendra faktoriaus išeiga po mpi-afininės chromatografijos buvo apie 10 %. Aktyvumo pikas (F6) po mplafininės chromatografijos turėjo 9,8xl0⁶ V/mg specifini aktyvumą. Gryninant 5 litrus APP, gryninimo faktorius buvo 4xl0⁶ kartai (nuo 0,8 V/mg iki 3,3xl0⁶ V/mg), baltymų kiekis sumažėjo 83xl0⁶ kartų (nuo 250 g iki 3 ųg). Mūsų nustatytas ligando specifinis aktyvumas po mplafininės chromatografijos buvo ~3xl0⁶ V/mg.

LENTELĖ 1 mpl ligando gryninimas

Mėginys	Turis, ml	Baltymo koncentra- cija, mg/ml	V/ml	Vienetai	Specifinis aktyvunas, V/mg	Išeiga, %	Išgryninimo faktorius, kartai
APP	5000	50	40	200000	0,8	-	1
Phenyl	4700	0,8	40	200000	50	94	62
Blue-Seph.	640	0,93	400	256000	430	128	538
npl (μΐ) (Fr. 5-7)	12	5x10’’	1666	20000	3300000	10	4100000

Baltymo koncentracija buvo nustatoma Bradford metodu. Baltymo koncentracijos frakcijose (5-7) nuo mpl-kolonėlės buvo nustatoma pagal dėmių intensyvumą, dažant SDS PAGE gelį sidabru. Vienas aktyvumo vienetas lygus koncentracijai, kuriai esant pasiekiama 50 % maksimalaus Ba/F3-mpl ląstelių proliferacijos stimuliavimo.

Eliujuotos nuo mpl afininės kolonėlės frakcijos buvo analizuojamos SDS PAGE (4-20 %, Novex gel) redukuojančiomis sąlygomis. Buvo nustatyta, kad mėginiuose yra keletas baltymų (Fig. 5) . Intensyvesnės baltymų juostos dažytuose sidabru SDS PAGE geliuose buvo ties molekulinėmis masėmis 66000, 55000, 30000, 28000 ir

18000-22000D. Siekiant nustatyti, kuris iš šių baltymų stimuliuoja Ba/F3-mpI ląstelių proliferaciją, baltymai buvo eliujuojami iš gelio, kaip aprašyta Pavyzdyje 2.

Šiuo eksperimentu buvo nustatyta, kad didesniu aktyvumu pasižymėjo eliujuoti iš gelio baltymai iš molekulinių masių juostos 28 - 32 kD, mažesniu aktyvumu pasižymėjo baltymai iš molekulinių masių juostos 18 22 kD (Fig. 6) . Vieninteliai šiuose molekulinių masių intervaluose matomi baltymai turėjo 30, 28, ir 18-22 kD molekulines mases. Siekiant nustatyti šių baltymų (t.y., juostos 30, 28, ir 18-22 kD) amino rūgščių liekanų seką, šie baltymai buvo pernešami blotuojant ant PVDF membranos ir sekvenuojami, kaip aprašyta Pavyzdyje 3. Baltymų N galo amino rūgščių liekanų seka pateikta Lentelėje 2.

LENTELĖ 2 znpl ligando N galo amino rūgščių liekanų seka

30 kD 15 10 15 20 25 (S) PAPPA(C)DPRLLNKLLRDD (H/S) VLH (G) RL	(SEQ ID Nr.:30)
28 kD 1 5 10 15 20 25 (S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H)VL(H)GR	(SEQ ID Nr.:31)
18-22 kD 1 5 10 XPAPPAXDPRLX(N)(K)	(SEQ ID Nr.: 32)

Kompiuterine analize buvo nustatyta, kad tokių N galo baltymo sekų neturi jokie žinomi baltymai. Kadangi visos trys N galų sekos yra tos pačios, tai tikėtina, kad 30 kD, 28 kD ir 18-22 kD molekulinių masių baltymai gali būti vieno naujo baltymo skirtingos formos. Šis baltymas (baltymai) kaip tik gali būti natūralus mpl ligandas, nes aktyvumas buvo nustatytas toje pačioje SDS PAGE gelio (4-20 %) srityje (28-32 kD) . Be to, dalinai išgrynintas ligandas eliujuojamas 17-30 kD srityje nuo gelfiltracinės Superose 12 (Pharmacia) kolonėlės. Tikėtina, kad skirtingų molekulinių masių ligando formos gali būti proteinolizės, skirtingo glikozilinimo ar kitų post- arba prieštransliacinių modifikacijų rezultatas.

Kaip buvo aprašyta ankščiau, antisensinė žmogaus mpl RNR panaikina megakariocitopoezę žmogaus kaulų čiulpų kultūroje, praturtintoje CD 34⁺ ląstelėmis-pirmtakais, ir neturi jokios įtakos kitų hemopoetinių ląstelių linijų diferenciacijai (Methia et ai., supra). Šie rezultatai leidžia daryti prielaidą, kad mpl receptorius gali įtakoti megakariocitų diferenciaciją ir proliferaciją in vitro. Tolesniam išsiaiškinimui apie mpl ligando įtaką megakariocitopoezei buvo sulyginama APP ir APP be mpl ligando įtaka žmogaus megakariocitopoezei in vitro. APP įtaka žmogaus megakariocitopoezei buvo įvertinama, naudojant modifikuotus suspensinius megakariocitopoezės tyrimus, aprašytus Pavyzdyje 4. Šiuose tyrimuose žmogaus periferinės kamieninės ląstelės (PSC) buvo paveikiamos APP prieš ir po gryninimo mpl-IgG afinine chromatografija. GPIIbIIIa megakariocitopoezės stimuliacija buvo kiekybiškai įvertinama su ¹²⁵J-anti-II_bIII_a antikūnais (Fig. 7) . Kaip parodyta Fig. 7, 10 % APP sukelia apie tris kartus didesnę stimuliaciją, tuo metu, kai APP be mpl ligando neturi jokios įtakos. Svarbu, kad APP be mpl ligando neindukuoja ląstelių Ba/F3-mpl proliferacijos.

Kitame tyrime tirpus žmogaus mpl-IgG buvo pridedamas 0, 2 ir 4 dieną į kultūras, kuriose buvo 10 % APP, kad neutralizuotų APP stimuliacijos efektą žmogaus megakariocitopoezei (Fig. 8). Šie rezultatai įrodo, kad mpl ligandas dalyvauja žmogaus megakariocitopoezės reguliavime, todėl mpl ligandas gali būti naudingas, gydant trombocitopeniją.

2. mpl ligando molekulinis klonavimas

Remiantis galine amino rūgščių seka, gauta iš 30 kD, 28 kD ir 18-22 kD baltymų (žr. Lentelę 2), du išsigimę oligonukleotidai buvo panaudoti kiaulių genominės DNR amplifikuoti PCR būdu. Tai buvo atlikta remiantis tuo, jog, jeigu galinė amino rūgščių seka yra koduojama vienintelio egzono, tada teisingas PCR produktas turėtų būti 69 bp ilgio. Tokio ilgio DNR fragmentas buvo gautas ir klonuotas į pGEMT. Oligonukleotidinės PCR pradmenų sekos ir trys gauti klonai yra parodyti Pvz. 5. Peptido amino rūgščių seka (PRLLNKLLR [SEQ ID Nr.: 33]), koduojama tarp PCR pradmenų, buvo identiška galinei baltymo amino sekai gautai, sekvenuojant kiaulių Ugandą (žiūrėti 9-17 amino rūgščių liekanas 28 ir 30 kD kiaulių baltymo sekas, pateiktas aukščiau).

Sintetinis oligonukleotidas, paremtas PCR fragmento seka, buvo panaudotas žmogaus genominės DNR bibliotekos skryningui. 45 bazių oligonukleotidas, pavadintas pR45, buvo susintetintas, remiantis PCR fragmento seka. Šis oligonukleotidas turi tokią seką:

5' GCC GTG AAG GAC GTG GTC GTC ACG AAG CAG

TTT ATT TAG GAG TCG 3' (SEQ ID Nr.: 34)

Šis dezoksioligonukleotidas buvo panaudotas žmogaus genominės DNR bibliotekos skryningui Igem 12, esant negriežtoms hibridizacijos ir atplovimo sąlygoms, pagal Pavyzdį.6. Buvo atrinkti teigiami klonai, jie išgryninti ir analizuoti restriktuoj ant bei naudojant Southern blotingą. 390 bp EcoRI-XbaI fragmentas, kuris hibridizuojasi su 45 bazių porų ilgio fragmentu, buvo klonuotas i pBluescript SK-. Šio klono DNR sekos nustatymas patvirtino, jog buvo išskirta DNR seka, koduojanti žmogaus homologą kiaulių mpl ligando dalį. Žmogaus DNR seka ir ją atitinkanti amino rūgšių seka yra parodyta Pieš.9 (SEQ ID Nr.: 3 ir 4). Numatomos intronų po73 zicijos genominėje sekoje taip pat yra pažymėtos rodyklėmis, ir nustatytas numanomas egzonas (egzonas 3).

Remiantis žmogaus egzono 3 seka (Pavyzdys.6) buvo susintetinti oligonukleotidai, atitinkantys 3' ir 5' egzono sekos galus. Šie du pradmenys buvo naudojami PCR reakcijose, kaip matricą naudojant kDNR, gautą iš ivairių žmogaus audinių. Teisingo PCR produkto laukiamas ilgis buvo 140 bp. Išanalizavus PCR produktus 12% poliakrilamidiniame gelyje, laukiamo dydžio DNR fragmentas buvo nustatytas kDNR bibliotekose, paruoštose iš suaugusio žmogaus inkstų, embriono inkstų 293 ląstelių ir kDNR paruoštose iš žmogaus embriono kepenų.

Embriono kepenų kDNR biblioteka (7xl0^{3 * * 6} klonų) XDR2 toliau buvo analizuojama su tuo pačiu 45 bazių oligonukleotidu, kuris buvo naudotas žmogaus genominės bibliotekos ir embriono kepenų kDNR bibliotekos skryninge, esant negriežtoms hibridizacijos sąlygoms. Buvo atrinkti teigiami klonai, trombocitai išgryninti ir įterptos sekos dydis buvo analizuojamas PCR būdu.Vienas klonas su 1.8 kbp intarpu buvo atrinktas tolesnei analizei. Naudojant procedūras, aprašytas Pavyzdyje.7, buvo gauta žmogaus mpl ligando (hML) nukleotidų seka bei iš jos išvestinė amino rūgščių liekanų seka. Šios sekos yra pateiktos Fig. 1 (SEQ ID Nr.: 1 ir 2).

3. Žmogaus mp2 ligando (hML) struktūra

Žmogaus mpl ligando (hML) kDNR seka (Fig. l.[SEQ

ID Nr.: 2]) turi 1774 nukleotidus ir poli(A)uodegą. Tai sudaro 215 nukleotidų nuo netransliuojamos sekos 5' galo ir 498 nukleotidus nuo 3' ne transliuo j amos srities. Tikėtinas iniciacijos kodonas, esantis 216-218 nukleotidų srityje yra konsensinė seka, tinkama eukariotinei transliacijos iniciacijai. Atviras skaitymo rėmelis yra 1059 nukleotidų ilgio ir koduoja 353 amino rūgščių polipeptidą, pradedant 220-tu nukleotidų. Išvestinės amino rūgščių sekos N-galas yra labai hidroLT 4120 B fobinis ir turbūt atitinka signalinį, peptidą. Kompiuterinė amino rūgščių sekos analizė (von Heijne et.ai., Eur.J.Biochem., 133:17-21[1983]) nurodo potencialią skėlimo vietą signalinei peptidazei tarp 21 ir 22 amino rūgščių liekanų. Perskėlus šioje pozicijoje, susidarytų subrendęs 332 amino rūgščių liekanų polipeptidas, prasidedantis N galine seka, kurią turi mpl ligandas, išgrynintas iš kiaulių plazmos. Išvestinis neglikozilinto 332 amino rūgščių liekanų ligando molekulinis svoris yra apie 38 kD. Yra 6 potencialios N-glikozilinimo vietos ir 4 cisteino liekanos.

mpl ligando sekos palyginimas su Genų banko sekų duomenų baze parodė 23% identiškumą tarp subrendusio žmogaus mpl ligando 153 amino galinių liekanų ir žmogaus eritropoetino (Fig. 10 [SEQ ID Nr.: 6 ir 7]). Turint galvoje konservatyvius pakeitimus, šis hML regionas parodo 50% panašumą su žmogaus eritropoetinu (hEPO). Ir hEPO, ir hML turi keturis cisteinus. Trys iš keturių cisteinų yra konservatyvūs hML, įskaitant pirmąjį ir paskutinįjį cisteinus. Kryptingosios mutagenezės eksperimentai parodė, kad pirmas ir paskutinis eritropoetino cisteinai formuoja disulfidinę jungtį, kuri yra funkciškai reikalinga (Wang, F.F., et.ai., Endocrinology 116: 2286-2292[1983]). Analogiškai pirmas ir paskutinis hML cisteinai taip pat gali formuoti kritinį disulfidinį ryšį. hML neturi konservuatyvių glikozilinimo vietų. Visos potencialios hML N- susijusios glikozilinimo vietos yra lokalizuotos hML polipeptido C galo pusėje.

Kaip ir hEPO, hML iRNR neturi konsensinės poliadenilinimo sekos AAUAAA, nei reguliatorinio elemento AUUUA, kuris yra daugelio citokinų 3'netransliuojamoje srityje ir kuris, manoma, turi įtakos mRNR stabilumui (Shawet ai., Cell, 46:659-667 [1986]). Northern blotavimo analizė rodo nedidelį kiekį vienintelio 1.8 kbp hML RNR transkripto tiek embriono, tiek suaugusių žmonių kepenyse. Po ilgo ekspozicijos laiko silpna tokio pat dydžio juostelė gali būti nustatyta suaugusių žmonių kepenyse. Analogiškai žmogaus eritropoetinas yra ekspresuojamas embriono kepenyse, o taip pat suaugusio žmogaus inkstuose ir kepenyse, atsakant i hipoksiją (Jacobs et. ai., Nature, 313: 804-809 [1985] and Bondurant et. ai., Molec.Cell.Biol., 6:2731-2733 [1986]).

HML C-galinio rajono svarba tebėra aiškinama. Remiantis šešių potencialių N-susieto glikozilinimo vietų buvimu ir ligando sugebėjimu rištis prie lectinafininių kolonų, panašu, jog šis hML rajonas yra glikozilintas. Kai kuriuose eliucijos iš gelio eksperimentuose mes pastebėjome, jog aktyvumas yra aptinkamas ties molekuline mase 60000 D, o tai gali būti pilna glikozilinta molekulė. Tuo būdu C-galinė sritis gali stabilizuoti ir padidinti cirkuliuojančio hML gyvavimo pusperiodį. Eritropoetino atveju neglikozilinta forma turi pilną biologinį aktyvumą in vitro, bet turi žymiai sumažintą plazmos gyvavimo pusperiodį, lyginant su glikozilintu eritropoetinu (Takeuchi et.ai., J. Biol. Chem., 265: 12127-12130 [1990]; Narhi et.ai., J. Biol. Chem., 266: 23022-23026 [1991] ir Spivack et ai., Blood, 7:90-99 [1989]). hML C-galinis domenas turi dvi bazines amino rūgščių liekanų sekas [Arg-Arg motyvai 153-154 ir 245-246 pozicijose], kurios gali tarnauti kaip potencialios procesingo vietos. Skeliant šiose vietose gali susidaryti 30, 28,ir 18-22kD ML, išskirto iš APP, formos. Arg₁₅₃~Arg₁₅₄ sekos yra iš karto po domeno, panašaus i eritropoetiną, kuris yra ML. Remiantis šiais pastebėjimais, galima pasakyti, kad pilnas ML gali būti signalinis peptidas, kuris patiria ribotą proteolizę, tam kad susidarytų subrendęs ligandas.

4. Žmogaus mpl ligando izoformos ir variantai

Izoformos arba alternatyviai sujungtos žmogaus mpl ligando formos buvo nustatytos PCR būdu suaugusio žmogaus kepenyse. Trumpai tariant, pradmenys buvo susintetinti atitinkamai kiekvienam galui, taip pat ir pasirinktiems vidiniams hML koduojančios sekos regionams. Šie pradmenys buvo naudojami RT-PCR, norint padauginti suaugusio žmogaus kepenų RNR, kaip aprašyta Pavyzdyje 10, Be pilno ilgio formos, priskiriamos hML, trys kitos formos, hML2, hML3 ir hML4 buvo pastebėtos arba išvestos. Išvestinės visų keturių subrendusių izoformų amino rūgščių sekos yra parodytos Fig. 11 (SEQ ID Nr.: 6,8,9 ir 10) . hML3 turi 116 nukleotidų deleciją 700-toje pozicijoje, o tai duoda amino rūgščių deleciją ir rėmelio poslinkį. kDNR dabar koduoja subrendusį polipeptidą, kuris turi 265 amino rūgštis ir skiriasi nuo hML sekos ties 139 amino rūgšties liekana. Galiausiai, hML4 turi 12 nukleotidų deleciją po 618-tos nukleotido pozicijos (taip pat randama pelės ir kiaulės sekose [žiūr. žemiau]) ir 116 bazių porų deleciją, randamą hML3. Nors nebuvo išskirtų iš žmogaus klonų tik su 12 bazių porų deleciją (po 619 nukleotido) (priskiriama hML2), panašu, jog ši -forma egzistuoja, kadangi tokia izoforma buvo identifikuota pelėje ir kiaulėje (žr.žemiau), ir kadangi tai buvo identifikuota kartu su 116 nukleotidų deleciją hML4 .

Kartu ir pakaitinis hML variantas, kuriame dviejų bazinių amino rūgščių liekanų Arg₁₅₃~Arg₁₅₄ seka buvo pakeista i dvi alanino liekanas, ir EPO-domenas, sutrumpinta hML forma, buvo sukonstruotos, norint nustatyti, ar pilno ilgio ML yra būtinas biologiniam' aktyvumui. Arg₁₅₃-Arg₁₅₄ dviejų bazinių amino rūgščių liekanų sekos pakaitinis variantas, vadinamas hML(R153A, R154A), buvo sukonstruotas PCR būdu, kaip aprašyta

Pvz. 10. EPO-domeno sutrumpinta forma, hMLi₅₃, taip pat buvo gauta PCR būdu, įvedant stop kodoną po Argi₅₃.

5. Žmogaus rekombinantinio mpl ligando (rhML) ekspresija laikinai transfekuotuose žmogaus embriono inkstų (293) ląstelėse

Norint patvirtinti, kad klonuota žmogaus kDNR 5 koduoja mpl Ugandą, ligandas buvo ekspresuotas žinduolių 293 ląstelėse, naudojant ekspresijos vektorius pRK5-hML ar pRK5-hMLis₃, kuriuose mpl ligando kDNR ekspresiją kontroliuoja ankstyviausias citomegalo viruso promotorius. Buvo parodyta, kad supernatantai, kuriuose augo laikinai transfekuotos žmogaus embriono

293 ląstelės, stimuliuoja ³H-timidino įsijungimą į Ba/F3-mpl ląsteles, bet ne į motinines Ba/F3 ląsteles (Fig. 12A) . Terpė, kondicionuota 293 ląstelėmis, transfekuotomis vien pRK vektoriumi, tokiu aktyvumu nepasižymėjo. Pridėjus į terpę mpl-IgG, ląstelių stimuliacija inhibuojama (duomenys nepateikti). Šie rezultai įrodo, kad klonuota kDNR koduoja funkcionalų žmogaus ML (hML).

Siekiant išaiškinti, ar EPO-domenas vienas gali sąveikauti su mpl ir jį aktyvuoti, sutrumpinta hML forma - rhML₁₅₃ - buvo ekspresuota 293 linijos ląstelėse. Transfekuotų ląstelių kondicionuota terpė pasižymėjo tokiu pat aktyvumu, kaip ir terpė nuo ląstelių, transfekuotų pilno ilgio hML genu (Fig. 12A) . Tai parodo, kad ML domenas, esantis baltymo C gale, nereikalingas sąveikai su c-mpl bei jo aktyvacijai.

6. mpl ligandas stimuliuoja megakariocitopoezė ir trombopoezę.

Abi - pilno ilgio rhML ir sutrumpinta rhMLis₃ - rekombinantinio hML baltymo formos stimuliuoja megakario30 citopoezę in vitro (Fig. 12B) . Šis efektas stebimas nesant jokių kitų egzogeninių hemopoetinių augimo faktorių. Išskyrus IL-3, ML buvo vienintelis hemopoetinis augimo faktorius, pasižymintis tokiu aktyvumu. Testuojant atskirai IL-11, IL-6, IL-1, eritropoetinas, G-CSF, IL-9, LIF, kit-ligandas (KL), M-CSF, OSM ir GM-CSF neturėjo įtakos megakariocitopoezei (duomenys nepateikti) . Šie rezultatai rodo, kad ML pasižymi megakariocitus stimuliuojančiu aktyvumu ir pabrėžia jo vaidmenį megakariocitopoezės reguliacijoj e.

Pelių atsakomosios trombocitozės metodu parodyta, kad trombocitopeniškų gyvūnų plazmoje esantys trornbopoetiškai aktyvūs faktoriai stimuliuoja trombocitų produkciją (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:10061001 [1973] ir McDonald, et ai., Scand. J. Haematol., 16:326-334 [1976]). Šiame modelyje pelėms suleidus specifinį antitrombocitinį antiserumą, sukeliama ūmi trombocitopenija, kuri savo ruožtu iššaukia nuspėjamą atsakomąją trombocitozę. Tokios pelės daug geriau, nei nomalios reaguoja į egzogeninį trombopoetinį aktyvumą (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001 [1973]), lygiai taip, kaip pelės po hipoksijos daug geriau reaguoja į eritropoetiną, nei sveikos (McDonald, et ai., J. Lab. Clin. Med., 77:134-143 [1971]). Norint išaiškinti ar rML gali stimuliuoti trombocitų produkciją in vivo, pelėms, kurioms buvo sukelta atsakomoji trombocitozė, buvo suleistas nevisiškai išgrynintas rhML. Po to buvo įvertintas trombocitų skaičius ir ³⁵S įsijungimas į trombocitus. Suleidus pelėms 64000 arba 32000 vienetų rML, pasiektas žymus trombocitų produkcijos padidėjimas, kuris pasireiškia trombocitų skaičiaus padidėjimu ~20 %, lyginant su kontroline' grupe (p = 0, 0005 ir 0,0001, atitinkamai) ir ³⁵S įsijungimo į trombocitus padidėjimu ~40 % (p = 0,003); kontrolinėms pelėms buvo suleidžiamas vien tirpiklis (Fig. 12C) . Gautas stimuliacijos lygis panašus į stimuliacijos lygį, kurį šioje sistemoje rodo IL-6 (duomenys nepateikti) . Leidžiant 16000 vienetų rML, žymios trombocitų stimuliacijos nebuvo. Šie rezultatai rodo, kad ML stimuliuoja trombocitų produkciją ir preparato efektas priklauso nuo jo dozės. Tokiu būdu, ML aktyvumas atitinka trombopoetino aktyvumą.

293 linijos ląsteles buvo taip pat transfekuotos kitų hML izoformų konstruktais, aprašytais aukščiau, ir transformantų kondicionuotų terpių aktyvumas buvo analizuotas Ba/F3-mp2 proliferacijos metodu (žiūr. Fig. 13) . hML2 ir hML3, tiriant šiuo metodu, buvo neaktyvus, tačiau hML(R153A, R154A) aktyvumas buvo panašus i hML ir hMLi53 aktyvumus. Tai rodo, kad Argi₅₃-Argi₅4 dviejų bazinių amino rūgščių liekanų vieta neturi nei teigiamos, nei neigiamos įtakos ML aktyvumui.

7. Megakariocitopoezė ir mpl ligandas

Manoma, kad megakariocitopoezė reguliuojama įvairiose ląstelių vystymosi stadijose (Williams et ai., J. Cell Physiol., 110:101-104 [1982] ir Williams et ai., Blood Cells, 15:123-133 [1989]). Šis požiūris remiasi žinomu faktu, kad vieni hemopoetiniai faktoriai stimuliuoja megakariocitų pirmtakų proliferaciją, tuo tarpu kiti, matyt, įtakoja jų brendimą. Išradime pateikti rezultatai rodo, kad ML veikia ir proliferaciją, ir brendimą. Yra eksperimentinių duomenų, kad ML stimuliuoja megakariocitų pirmtakų proliferaciją. Pirma, APP gali stimuliuoti megakariocitų proliferaciją ir brendimą in vitro, ir abu efektai visiškai inhibuojami pridėjus mpl-IgG (Fig. 7 ir 8). Antra, c-mpl antisensiniai oligonukleotidai inhibuoja megakariocitų kolonijų formavimąsi (Methia et ai., Blood, 82:1395-1401 [1993]). Tas efektas, kad c-mpl gali perduoti proliferacijos signalą į ląsteles, kurias jis transfekavo, taip pat įrodo, kad ML stimuliuoja proliferaciją (Skoda et ai.,

EMBO, 12:2645-2653 [1993] ir Vigon et ai., Oncogene, 8:2607-2615 [1993]). Akyvaizdi c-mpl ekspresija visose megakariocitų diferencijacijos stadijose (Methia et ai., Blood, 82:1395-1401 [1993]) ir rekombinantinio ML sugebėjimas greitai stimuliuoti trombocitų produkciją in vivo nurodo, kad ML taip pat įtakoja megakariocitų brendimą. Rekombinantinis ML atveria galimybę tiksliai įvertinti jo vaidmenį megakariocitopoezės ir trombocitopoezės reguliacijoje, o taip pat galimą jo įtaką kitų atšakų hemopoetinėms ląstelėms.

8. Žmogaus mpl ligando (TPO) geno išskyrimas

TPO geno žmogaus genominės DNR klonai buvo išskirti, atliekant žmogaus genominės bibliotekos, esančios XGeml2 su pR45, skryningą, kai yra negriežtos sąlygos arba, esant griežtoms sąlygoms su fragmentu, atitinkančiu žmogaus kDNR 3'dalį, koduojančią mpl ligandą. Buvo išskirti du persidengiantys lambda klonai, turintys 35kb. Du persidengiatys fragmentai (BamHI ir EcoRI), turintys pilną TPO geną, buvo klonuoti ir sekvenuoti (žr. Fig. 14A, 14B ir 14C) .

Žmogaus genas turi 6 egzonus 7 kbp ilgio genominėje DNR. Jungtys visose egzono/introno susijungimo vietose atitinka konsensinį motyvą, nustatytą žinduolių genams (Shapiro, M.B., et.ai., Nucl.Acids Res. 15:7155 [1987]). Egzonas 1 ir egzonas 2 turi 5' netransliuojamą seką ir signalinio peptido pirmas keturias amino rūgštis. Sekrecinio signalo liekana ir pirmos 26 subrendusio baltymo amino rūgštys yra koduojamos egzone 3. Pilnas C-galinis domenas, 3'netransliuoj amas domenas, o taip pat ir apie 50 amino rūgščių iš domeno, panašaus į eritropoetiną, yra koduojami egzone 6. Keturios amino rūgštys, dalyvaujančios delecijoje, stebimoje hML-2 (hTPO-2), yra koduojamos 6 egzono 5'gale.

Žmogaus genominės DNR analizė, naudojant Sautherno blotavimą, nurodo, jog TPO genas yra vienintelėje kopijoje. Geno chromosominė lokalizacija yra nustatoma fluorescentine in situ hibridizacija (FISH), naudojama 3q27-28 chromosomai.

9. TPO ekspresija ir gryninimas iš 293 ląstelių

ML arba TPO paruošimas ir gryninimas iš 293 ląstelių yra detaliai aprašytas Pavyzdyje 19. Trumpai tariant, kDNR, atitinkanti TPO pilną atvirą skaitymo rėmelį, buvo gauta PCR būdu, naudojant pRK5-hmpl I. PCR produktas buvo išvalytas ir klonuotas į plazmidę pRK5tkneo, kuri suskaldyta restrikazėmis Clal ir Xbal (pRK5 vektorius yra modifikuotas ekspresuoti atsparumo neomicinui geną, esant timidin-kinazės promotoriaus kontrolei), norint gauti vektorių pRK5tkneo.ORF (vektorių, koduojantį pilną atvirą skaitymo rėmelį).

Antrasis vektorius EPO homologiniam domenui buvo gautas tokiu pat būdu, bet naudojant skirtingus PCR pradmenis, norint gauti galutinę konstrukciją, vadinamą pRK5-tkneoEPO-D.

Šios dvi konstrukcijos buvo transfekuotos į žmogaus embrionines inkstų ląsteles kalcio fosfatiniu metodu ir buvo atrinkti neomicinui atsparūs klonai, kurie buvo auginami. ML₁₅₃ arba ML₃₃₂ ekspresija kondicionuotoje terpėje nuo šių klonų buvo nustatyta, naudojant Ba/F3-mpl proliferacijos bandymą. rhML332 gryninimas buvo atliekamas, kaip aprašyta Pavyzdyje 19. Trumpai tariant, terpė su 239-rhML3₂₂ buvo naudojama Blue-Sepharose (Pharmacia) kolonoje, kuri buvo vėliau plaunama buferiniu tirpalu, turinčiu 2M karbamido. Baltymai buvo eliujuoti buferiniu tirpalu, turinčiu 2M karbamido ir 1M NaCl. Po Blue-Sepharose apjungtos eliujuotos frakcijos buvo tiesiogiai užnešamos ant WGASepharose kolonos, praplautos su 10 kolonos tūrių bufe82 rinio tirpalo, turinčio 2M karbamido ir 1 M NaCl ir eliujuota su tuo pačiu buferiniu tirpalu, turinčiu 0,5 M N-acetil-D-glukozamino. WGA-Sepharose eliuatas buvo užneštas ant C4-HPLC kolonos (Synchrom, Ine.) ir eliujuotas propanolio gradientu. Išvalytas 293-rhML₃₃₂SDS-PAGE juda kaip plati juosta 68-80 kD srityje (žr. Fig. 15) .

rhMLi53 gryninimas gali taip pat būti atliktas kaip aprašyta Pavyzdyje 19. Trumpai tariant, terpė su 293rhML₁₅₃ buvo chromatografuojama ant Blue-Sepharose, kaip aprašyta rhML₃₃₂ . Blue Sepharose eliuatas iškart buvo perneštas ant mpl afininės kolonėlės, kaip aprašyta aukščiau. RhML₁₅₃ , eliujuotas nuo mpl afininės kolonėlės buvo išgrynintas iki homogeniškumo, naudojant C4HPLC koloną tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir buvo naudota rhML₃₃₂ valyme. Išgrynintas rhML₁₅₃ SDS-PAGE išsiskiria i dvi pagrindines ir dvi minorines juostas, kurių molekulinė masė 18 -22 kD (žr. Fig. 15).

10. Pelės mpl ligandas

DNR fragmentas, atitinkantis žmogaus mpl ligando koduojančią sritį, buvo gautas PCR būdu, išgrynintas iš gelio ir pažymėtas radioaktyvia žyme, naudojant 32 32

P-dATP ir P-dCTP. Sis mėginys buvo panaudotas atrinkti 10⁶ klonų -iš pelės kepenų kDNR bibliotekos, esančių ZGTIO. Buvo išskirtas ir sekvenuotas pelės klonas (Fig. 16 [SEQ ID Nr: 12 ir 13]), turintis 1443 bazių porų intarpą. Numanomas iniciacijos kodonas, esantis 138-141 nukleotidų srityje, buvo konsensinėje sekoje, tinkamoje eukariotinei transliacijos iniciacijai (Kozak, M. J.Cell Biol., 108:229-241 [1989]). Ši seka sudaro atvirą skaitymo rėmelį iš 1056 nukleotidų, kuris apsprendžia pirminį transliacijos produktą iš 352 amino rūgščių. Šį atvirą skaitymo rėmelį supa 137 nukleotidai nuo netransliuojamos sekos 5'galo ir 247 nukleotidai nuo netransliuojamos sekos 3' galo. Nėra poli(A) uodegos, einančios po 3' netransliuojamos srities, o tai reiškia, jog klonas tikriausiai nėra pilnas. Numanomos amino rūgščių sekos N galas yra ypač hidrofobinis ir tai, turbūt, yra signalinis peptidas. Kompiuterine analize (von Heijne, G. Eur. J. Biochem. 133:17-21[1983]) buvo nustatyta potenciali skėlimo signalinei peptidazei vieta tarp 21 ir 22 liekanų. Perskėlus šioje vietoje, susidaro 331 amino rūgšties subrendęs polipeptidas (35kD) , žymimas kaip mML₃₃₁ (arba mML2, dėl priežasčių aprašytų žemiau) . Seka turi keturis cisteinus, visus konservatyvius žmogaus baltymo sekoje, ir septynias potencialias N-glikozilinimo vietas, 5 iš kurių yra konservatyvios žmogaus baltymo sekoje. Vėl, kaip su hML, visos septynios potencialios N-glikozilinimo vietos yra baltymo C galo pusėje.

- Lyginant su žmogaus ML, buvo stebimas abiejų ML nukleotidų sekų ir išvestinių amino rūgščių sekų žymus panašumas EPO-domenuose. Tačiau palyginus žmogaus ir pelės ML išvestines amino rūgščių sekas, pasirodė, jog pelės ML seka turi tetrapeptidinę deleciją tarp 111-114 liekanos, atitinkančią 12 nukleotidų deleciją po 618 nukleotido, kuri yra matoma žmogaus (žr.aukščiau) ir kiaulės (žr.žemiau) kDNR. Atitinkamai, buvo išanalizuoti papildomi klonai galimų pelės ML izoformų nustatymui. Vienas klonas, koduojantis 335 amino rūgščių polipeptidą turi praleistą tetrapeptidą LPLQ. Tikimasi, jog ši forma yra pilnas pelės ML ir jis vadinamas mML arba mML₃₃₅ . mML nukleotidinė ir išvestinė amino rūgščių sekos yra pateiktos Fig. 17 (SEQ ID Nr.:· 14 ir 15) . Šis kDNR klonas turi 1443 bazių poras, kurios yra iki poli(A) uodegos. Tai apima atvirą skaitymo rėmelį iš 1068 bp, apsuptą 134 bazių nuo netransliuojamos sekos 5'galo ir 241 bazės nuo netransliuojamos sekos 3' galo. Numanomas iniciacijos kodonas yra tarp 138-140 nukleotidų. Atviras skaitymo rėmelis koduoja išvestinį 356 amino rūgščių liekanų baltymą, kurio pirmosios 21 amino rūgščių liekanos yra ypač hidrofobinės ir, panašu, jog jos yra sekrecijos signalas.

Galų gale, buvo išskirtas trečias pelės baltymo klonas, nustatyta seka ir parodyta, kad jis turi 116 nukleotidų deleciją, atitinkančią hML3. Ši pelės baltymo izoforma pavadinta mML3. Šių dviejų izoformų išvestinių amino rūgščių sekų palyginimas yra pateiktas Fig. 18 (SEQ ID Nr.: 9 ir 16).

Žmogaus ir pelės ML amino rūgščių sekos panašumas (Fig. 19 [SEQ ID Nr.: 6 ir 17]) yra 72%, bet ši homologija nėra vienodai paskirstyta. Sritis, vadinama EPOdomenu (žmogaus sekos amino rūgštys 1-153 ir 1-149 pelės sekos) yra labiau konservatyvi (86% homologijos), negu baltymo C-galo sritis (62% homologijos). Tai gali reikšti, kad tiktai EPO-domenas yra svarbus baltymo biologiniam aktyvumui. Įdomu, kad iš dviejų bazinių amino rūgščių liekanų motyvų, randamų hML, tiktai dviejų bazinių amino rūgščių liekanų motyvas, esantis iškart po EPO-domeno (153-154 liekanos) žmogaus ML sekoje, yra pelės ML sekoje. Tai atitinka prielaidą, kad pilno ilgio ML gali turėti signalinę seką, kuri atskeliama ir susidaro subrendęs ligandas. Proteolizė tarp Argi5₃-Arg₁₅₄ gali palengvinti hML išskyrimą.

Ekspresijos vektorius, turintis pilną mML koduojančią seką, buvo laikinai transfekuotas į 293 ląstelių liniją, kaip aprašyta Pavyzdyje 1. Šių ląstelių kondicionuota terpė stimuliuoja ³H-timidino Įsijungimą į Ba/F3 lątesles, ekspresuojančias arba pelės arba žmogaus mpl, bet neturi įtakos motininei (be mpl) ląstelių linijai. Tai rodo, jog klonuota pelės ML kDNR koduoja funkcionuojantį Ugandą, kuris gali aktyvuoti ir pelės, ir žmogaus ML receptorių (mpl).

11. Kiaulės mpl ligandas

Kiaulės ML (pML) kDNR buvo išskirta RAČE PCR būdu, kaip aprašyta Pvz. 13.PCR produktas, 1342 bp kDNR, buvo rastas inkstuose ir klonuotas. Buvo nustatyta kelių klonų seka ir rastas 332 amino rūgščių liekanų kiaulės mpl ligandas, pavadintas pML (arba pML₃₃₂), kurio nukleotidų ir išvestinė amino rūgščių seka yra parodyta Fig. 20 (SEQ ID Nr.: 18 ir 19).

Po to, buvo nustatyta antra forma, pavadinta pML2 (žr. Fig. 21 [SEQ ID Nr.: 21]), koduojanti baltymą su 4 amino rūgščių liekanų delecija (228 amino rūgščių liekanos) . pML ir pML2 amino rūgščių sekų palyginimas parodė, kad pastaroji forma yra identiška, išskyrus tai, kad tetrapeptido QLPP, atitinkančio 111-114 liekanas trūksta (žr. Fig. 22 [SEQ ID Nr.: 18 ir 21]). Keturios amino rūgščių liekanų delecijos, esančios pelės ir kiaulės ML kDNR, yra toje pačioje išvestinių baltymų sekų vietoje.

Palyginus žmogaus, pelės ir kiaulės (Fig. 19 [SEQ ID Nr.: 6, 17 ir 18]) subrendusio ML išvestines amino rūgščių liekanų sekas, pasirodo, jog tarp pelės ir žmogaus ML visos sekos identiškumas yra 72 %, 68 % tarp pelės ir kiaulės ir 73 % - tarp kiaulės ir žmogaus ML. Homologija yra žymiai didesnė ML N-galo pusėje (EPO homologinis domenas) . Šis domenas yra nuo 80 iki 84 % identiškas tarp bet kurių rūšių, tuo tarpu kai baltymo C-galas (karbohidratinis domenas) yra identiškas tiktai nuo 57 iki 67 %. Dviejų bazinių amino rūgščių liekanų motyvas, kuris gali būti proteazės skėlimo vieta, yra eritropoetino homologo domeno C-gale. Šis motyvas yra konservatyvus šioje pozicijoje trijose rūšyse (Fig. 19 [SEQ ID Nr.: 6, 17 ir 18]). Antros vietos, kur yra dvi bazinės amino rūgščių liekanos, žmogaus ML sekoje tarp 245 ir 246 nuk-leotidų, nėra pelės ir kiaulės ML sekose. Pelės ir kiaulės ML seka turi 4 cisteinuš, visus konservatyvius žmogaus ML sekoje. Yra septynios potencia86 lios glikozilinimo vietos pelės ligande ir šešios kiaulės ML, 5 iš kurių yra konservatyvios žmogaus ML sekoje. Vėl, visos potencialios N-glikozilinimo vietos yra baltymo C-gale.

12. TPO ekspresija ir gryninimas iš Kinietiškų žiurkėnių kiaušdžių (CHO) ląstelių

CHO ląstelių transfekcij ai panaudoti vektoriai buvo pažymėti: pSVI5.ID.LL.MLORF (pilno ilgio arba TPO332) ir pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (sutrumpintas arba TPO153) . Šių plazmidžių savybės yra pateiktos Fig. 23 ir 24 .

Transfekcijos procesas yra aprašytas Pavyzdyje 20. Trumpai, kDNR, atitinkanti pilną TPO skaitymo rėmelį, buvo gauta PCR pagalba. PCR produktas buvo išgrynintas ir klonuotas i restrikcijos (Olai ir Salį) sritį plazmidėje pSVI5.ID.LL, taip buvo gautas vektorius pSVI5.ID.LL.MLORF. Kitas konstruktas, atitinkantis EPO homologo domeną, buvo gautas tuo pačiu būdu, bet naudojant skirtingą atvirkštinį pradmenį (EPOD.Sal). Galutinis konstruktas, atitinkantis TPO baltymo EPO homologini domeną, buvo pavadintas pSVI5.ID.LL.MLEPO-D.

Šie konstruktai buvo linearizuoj ami su NotI ir transfekuoti elektroporacij a i Kinietiškų Žiurkėnių Kiaušidžių Ląsteles (CHO-DP12 ląstelės, EP 307247, publikuotas 1989.03.15). 10⁷ ląstelių buvo elektroporuojamos BRL elektroporacijos aparate (350 V, 330 mF, esant mažai talpuminei varžai), pridėjus 10, 25 arba 50 mg DNR, kaip aprašyta (Anderson, G. L. J. Tissue Cult. Meth., 15,56 [1993]). Praėjus dienai po transfekcijos, ląstelės buvo perkeltos į DHFR selektyvią terpę (DMEM-F12 su didele koncentracija gliukozės 50:50 be glicino, su 2 mM glutamino, 2 - 5 % dializuoto embrioninio galvijų serumo). Po 10 - 15 dienų atskiri klonai buvvo perkeliami į 96 šulinėlių plokšteles arba paliekami augti iki monosluoksnio susidarymo. Šių klonų ML3.53 arba ML332 ekspresija kondicionuotoje terpėje buvo įvertinama Ba/F3-mpI proliferacijos analize (aprašyta Pavyzdyje 1) .

TPO išskyrimas ir gryninimas iš CHO ląstelių auginimo terpės aprašytas Pavyzdyje 20. Trumpai, surinkta ląstelių auginimo terpė (HCCF) buvo sorbuojama BueSepharose kolonoje (Pharmacia) (100 1 HCCF 1 litrui sorbento) . Kolona po to buvo praplaunama nuo 3 iki 5 kolonos tūrių buferinio tirpalo, po to praplaunama nuo 3 iki 5 kolonos tūrių to paties buferinio tirpalo su 2,0 M karbamido. TPO baltymas buvo eliujuojamas 3 - 5 kolonos tūriais buferinio tirpalo su 2,0 M karbamido ir 1,0 m NaCl.

Surinktos po Blue Sepharose kolonos frakcijos, kuriose buvo TPO, buvo sorbuotos ant Wheat Germ Lectin Sepharose kolonos (Pharmacia), nulygsvarintos Blue Sepharose kolonėlės eliucijos buferiniu tirpalu, parinkus tokį santykį: nuo 8 iki 16 ml eliuato 1 ml sorbento. TPO buvo eliujuojamas 2-5 kolonos tūriais buferinio tirpalo su 2,0 M karbamido ir 0,5 M N-acetil-Dgliukozamino.

Eliuatas iš Wheat Germ Lectin, kuriame buvo TPO, buvo parūgštinamas ir pridedama Ci₂E₈ iki galutinės jo koncentracijos 0,04 %. Toks tirpalas buvo sorbuojamas ant atvirkščių fazių kolonėlės C4, nulygsvarintos 0,1 % TFA, 0,04 % Ci₂E₈, sorbuojant nuo 0,2 iki 0,5 mg baltymo vienam ml sorbento.

Baltymas buvo eliujuojamas dvifaziu linijiniu acetonitrilo gradientu su 0,1 % TFA ir 0,04 % Ci₂E₈; eliujuotos frakcijos buvo apjungiamos po SDS PAGE analizės.

Po C4 kolonėlės apjungtos frakcijos buvo praskiedžiamos ir diafiltruojamos prieš apytikriai 6 tūrius buferinio tirpalo Amicon YM aparatu arba naudojant kitas panašias ultrafiltracines membranas, kurių pralaidumo riba yra molekulinės masės nuo 10 iki 30 kD.

Gautas diafiltratas gali būti tiesiogiai naudojamas arba toliau sukoncentruojamas ultrafiltruojant. Į diafiltratą/koncentratą buvo pridedama Tween-80 iki galutinės jo koncentracijos 0,01 %.

Visas diafiltratas/koncentratas arba jo dalis, atitinkanti 2 - 5 % apskaičiuoto kolonos tūrio, buvo chromatografuojama Sephacryl S-300 HR kolonėlėje (Pharmacia) , nulysvarintoje buferiniu tirpalu, kuriame buvo 0,01 % Tween-80. Frakcijos, kuriose buvo, SDS PAGE analizės duomenimis, neagregavęs ir proteoliškai nedegradavęs, TPO baltymas, buvo apjungiamos. Šios apjungtos frakcijos buvo perfiltruotos ir saugomos 2 - 8°C temperatūroje.

13. Transformavimo, TPO sintezės indukcijos mikroorganizmuose, išskyrimo, gryninimo ir TPO struktūros atstatymo būdai

E.coli TPO ekspresijos vektorių konstrukcija yra detaliai aprašyta Pvz. 21. Plazmidės pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 ir pMP202 buvo sukonstruotos ekspresuoti pirmąsias 155 TPO amino rūgštis po trumpos lyderinės sekos, kuri yra skirtinga skirtingose konstrukcijose. Lyderinė seka pirmiausia reikalinga efektyviai transliacijos iniciacijai ir greitam išvalymui. Plazmidės pMP210-l, -T8, -21, -22, -24, -25 yra sukurtos ekspresuoti pirmąsias 153 TPO amino rūgštis po iniciacijos metionino ir skiriasi tiktai kodonų panaudojime pirmoms šešioms TPO amino rūgštims, nors pMP251 plazmidė yra sukonstruota iš pMP210-l plazmidės, kur TPO C-galas yra prailgintas dviem amino rūgštimis. Visos aukščiau pateiktos plazmidės užtikrina didelį TPO viduląstęlinės ekspresijos lygį E.coli, indukuojant triptofaninį promotorių. (Yansura, D.G.et.ai., Methods in Enzymology (Goeddel,‘ D.V.Ed.) 185:54-60, Academic Press, San Diego [1990]) . Plazmidės pMPl ir pMP172 yra tarpinės, konst89 ruojant aukščiau aprašytas viduląstelinės ekspresijos plazmides.

Aukščiau aprašytos TPO. ekspresijos plazmidės buvo naudotos E.coli transformacijoje, atliekant ją CaCl2 temperatūrinio šoko metodu (Mandel, M. et.ai. J. Mol. Biol., 53:159-162, [1970]) ir kitas procedūras, aprašytas Pavyzdyje 21. Transformuotos ląstelės buvo augio narnos pirmiausia 37 C, kol kultūros optinis tankis (600 nm) pasiekia apie 2-3. Kultūra buvo skiedžiama ir, po auginimo aeruojant, buvo pridėta rūgšties. Tada kultūra vėl buvo auginama aeruojant dar 15 valandų, po to ląstelės buvo surenkamos centrifuguojant.

Pateiktos žemiau biologiškai aktyvaus, atstatytos struktūros žmogaus TPO ar jo fragmentų išskyrimo, gryninimo ir struktūros atstatymo procedūros yra aprašytos Pavyzdžiuose 22 ir 23 ir gali būti panaudotos bet kokio TPO varianto gavimui, įskaitant praplėstas N ir C galines formas. Kitos procedūros, tinkamos rekombinantinio ar sintetinio TPO struktūros atstatymui, gali būti randamos šiuose patentuose; Builder et ai., JAV patentas 4511502 ; Jonės et. ai., JAV patentas 4512922; Olson JAV patentas 4518526 ir Builder et.ai., JAV patentas 4620948; aprašančiuose įvairių rekombinantinių baltymų, ekspresuojamų E.coli netirpioje formoje, gavimo ir struktūros atstatymo procesą.

A. Netirpaus TPO baltymo išskyrimas

Mikroorganizmas, toks kaip E. coli, ekspresuojantis TPO, koduojamą bet kokia tinkama plazmide, kultivuojamas sąlygomis, kai TPO produkuojamas netirpus intarpiniuose kūneliuose. Ląstelės iš pradžių praplaunamos ląstelių ardymo buferiniu tirpalu. Paprastai apie 100 g ląstelių suspenduojama 10 kartų didesniame, nei ląstelių tūris, ardymo buferiniame tirpale (pvz., mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) su, pavyzdžiui, Polytron homogenizatoriumi, ir ląstelės nucentrifūguojamos esant 5000xg 30 min. Po to ląstelės ardomos, naudojant įprastą tam techniką: osmotinis šokas, apdorojimas ultragarsu, ciklinis slėgio sudarymas ar fermentiniais ir cheminiais būdais. Pavyzdžiui, praplautos, kaip aprašyta aukščiau, ląstelės gali būti suspenduojamos su homogenizatoriumi 10 tūriuose ląstelių ardymo buferiniame tirpale, ląstelių suspensija praleidžiama per LH Cell Disrupter (LH Inceltech, Ine) ląstelių ardymo aparatą ar per Microfluidizer (Microfluidics International) aparatą, pagal gamintojų pateikiamas rekomendacijas. Nuosėdos, kuriose yra TPO, atskiriamos nuo skysčio ir praplaunamos tam tinkamu tirpalu. Pavyzdžiui, ląstelių lizato suspensija centrifūguojma 5000xg 30 min., suspenduojama ir vėl centrifūguojama, taip gaunamos atplautų intarpinių kūnelių.nuosėdos. Taip atplautos nuosėdos gali būti panauddotos nebedelsiant arba laikomos užšaldytos (pvz., -70°C).

B. Monomerinio TPO tirpinimas ir gryninimas

Netirpūs TPO intarpinai kūneliai soliubilizuojami buferiniame tirpale. Šio tirpalo sudėtyje yra chaotropinis agentas, paprastai šio tirpalo sudėtyje yra buferinis tirpalas, palaikantis šarminį pH, ir redukuojantis agentas padidinti monomerinio TPO išeigą. Chaotropiniai agentai gali būti karbamidas, guanidino HC1, natrio tiocianatas. Geriausias chaotrotropinis agentas yra guanidino HC1. Chaotropinio agento koncentracija paprastai gali būti nuo 4 iki 9 M, geriausia, kai 6 8 M. Tirpalo, naudojamo soliubilizavimui, pH palaikomas nuo 7,5 iki 9,5, geriau, kai pH yra 8,0-9,0 ir geriausia, kai pH 8,0. Geriau, kai buferiniame tirpale yra redukuojantis agentas, kuris padeda formuotis mononteriniam TPO. Tinkamas redukuojantis agentas yra organinė medžiaga, kurioje yra laisvos tiolinės grupės (RSH). Tokie redukuojantys agentai gali būti: ditiotreitolis (DTT), ditioeritritolis (DTE), merkaptoetanolis, gliutationas (GSH), cisteaminas ir cisteinas. Geriausiai tinkamas redukuojantis agentas yra ditiotreitolis (DDT) . Papildomai soliubilizacijos buferiniame tirpale gali būti silpnas oksiduojantis agentas (pvz., molekulinis deguonis) ir sulfito druska, kad susidarytų sulfitolizės metu monomerinis TPO. Šiame aprašyme gauto TPO-S-sulfonato struktūra vėliau atstatoma redoks buferiniame tirpale (pvz., GSH/GSSG), ir susidaro taisyklingos struktūros TPO.

TPO baltymas toliau gryninamas, naudojant, pavyzdžiui, centrifugavimą, gelfiltracinę chromatografiją ir atvirkščių fazių chromatografiją.

Iliustracijai pateikiamas pakankamos išeigos monomerinio TPO gryninimo pavyzdys. Intarpinių kūnelių nuosėdos suspenduojamos penkis kartus didesniame, nei e

nuosėdos, soliubilizacijos buferiniame tirpale (20 mM Tris, pH 8, 'su 6-8 M guanidino ir 25 mM DTT) ir maišoma 1-3 valandas ar per naktį 4°C temperatūroje; taip gaunamas ištirpęs TPO baltymas. Galima naudoti ir dideles karbamido koncentracijas (6-8 M), bet šiuo atveju gaunamos mažesnės išeigos, lyginant su guanidinu. Po soliubilizacijos tirpalas nuskaidrinamas centrifuguojant 30000xg 30 min., surenkamas supernatantas, kuriame yra denatūruotas monomerinis TPO baltymas. Supernatantas chromatografuoj amas (pratekėjimo greitis 2 ml/min.) Superdex 200 gelfiltracinėj e kolonėlėje (Pharmacia, 2,6x60 cm), baltymai eliujuojami su 20 mM Na fosfatiniu buferiniu tirpalu, pH 6,0, su 10 mM DTT. Surenkamos frakcijos, tarp 160 ir 200 ml, kuriose yra monomerinis denatūruotas TPO baltymas. Toliau TPO baltymas chromatograf uoj amas pusiau preparatyvinėj e C4 atvirkščių fazių kolonėlėje (2x20 cm, VYDAC). Baltymų tirpalas užnešamas 5 ml/min greičiu ant nulygsvarintos 0,1 % TFA (trifluoracto rūgštimi) 30 % acetonitrile. Baltymai eliujuojami linijiniu acetonitrilo gradientu (30-60 % per 60 min.). Išgrynintas redukuotas baltymas eliujuojamas, esant acetonitrilo koncentracijai ~50 %. Po to vykdomas taip išgryninto baltymo struktūros atstatymas ir gaunamas biologiškai aktyvus TPO baltymo variantas.

C. TPO baltymo struktūros atstatymas, gaunant biologiškai aktyvią formą.

Po soliubilizacijos ir gryninimo biologiškai aktyvi TPO baltymo forma gaunama atstatant denatūruoto monomerinio TPO baltymo struktūrą redoks buferiniame tirpale. Didelio biologinio aktyvumo (pusė maksimalios Ba/F3 ląstelių stimuliacijos analizėje koncentracijos pasiekiama, esant koncentracijai iki ~3 pg/ml) TPO baltymą galima gauti, naudojant daug įvairių buferinių tirpalų, detergentų ir redoks sistemų. Bet daugeliu atvejų taisyklingos struktūros baltymo išeiga yra maža (<10 %) . Gamybiniam procesui reikalinga, kad struktūros atstatymo išeiga būtų nemažesnė 10 %, geriau kad būtų 30-50 %, dar geriau - daugiau 50 %. Gali būti naudojama daugelis paviršiaus aktyvių medžiagų: Triton Χ-100, dodecil-p-maltozidas, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkozilas, Tween 20 ir Tween 80, Zwitergent 3-14 ir kiti. Naudojant šias paviršiaus aktyvias medžiagas, gaunamas bent mažas kiekis taisyklingai atstatytos struktūros TPO baltymo. Iš šių paviršiaus aktyvių medžiagų geriausios yra CHAPS grupės (CHAPS ir CHAPSO). Jos yra geriausios struktūros atstatymo procesui, kadangi naudojant jas išvengiama baltymų agregacijos ir· netaisyklingų disulfidinių tiltelių susidarymo. Geriausia naudoti didesnes, . nei 1 % CHAPS koncentracijas. Norint gauti didesnes proceso išeigas, reikalingas natrio chloridas, jo optimali koncentracija yr tarp 0,1 ir 0,5 M. EDTA (1-5 mM) reikalingas struktūros atstatymo buferiniame tirpale metalų jonais katalizuojamų oksidacijos procesų pašalinimui (ir baltymų agregacijos išvengimui), šie procesai stebimi kai kuriems preparatams. Didesnės, nei % glicerino koncentracijos sudaro optimalias struktūros atstatymo sąlygas. Norint pasiekti didesnes proceso išeigas, labai svarbu, kad tirpale būtų ir oksiduotas ir redukuoti organiniai tioliniai junginiai (RSH). Tinkamos redoks poros yra: merkaptoetanolis, gliutationas (GSH), cisteamidas, cisteinas ir šiuos junginius atitinkačios oksiduotos formos. Geriausios redoks poros yra gliutationas (GSH) - oksiduotas gliutationas (GSSG) arba cisteinas - cistinas. Pati geriausia pora yra gliutationas (GSH) - oksiduotas gliutationas (GSSG). Paprastai gaunamos didesnės proceso išeigos, kai oksiduotos ir redukuotos formos molinis santykis yra lygus ar didesnis, nei vienetas. TPO preparatų struktūros atstatymui optimalus tirpalo pH yra nuo 7,5 iki ~9. Organinių tirpiklių (pvz., etanolio, acetonitrilo, metanolio) toleruojama koncentracija yra 10-15 %, arba mažesnė. Didinant organinių tirpiklių koncentraciją, didėja baltymo formų su netaisyklingais disulfidiniais tilteliais. Geriausia naudoti TRIS arba fosfatinius buferinius tirpalus. Struktūros atstatymo procesą atliekant 4°C temperatūroje, gaunama didesnė taisyklingos struktūros baltymo išeiga.

TPO preparatams, grynintiems per pirmąją C4 kolonėlę, struktūros atstatymo proceso tipiška išeiga yra 40-60 % (skaičiuojant nuo redukuoto ir denatūruoto TPO baltymo kiekio). Biologiškai aktyvūs preparatai gali būti gaunami, kai struktūros atstatymo procese naudojami mažiau išgryninti preparatai (pvz., po Superdex 200 gelfiltracijos ar po intarpinių kūnelių ekstrakcijos), nors šiais atvejais šio proceso išeiga būna mažesnė dėl didelio baltymo išsėdimo į nuosėdas ir dėl priemaišinių baltymų trukdymo.

Kadangi TPO baltymo sudėtyje yra keturios cisteino liekanos, tai galimi trys skirtingi disulfidinių tilte94 lių susidarymo variantai šiame baltyme:

1	variantas:	disulfidinis ryšys cisteino liekanos	tarp	1-4	ir	2-3
2	variantas:	disulfidinis ryšys cisteino liekanos	tarp	1-2	ir	3-4
3	variantas:	disulfidinis ryšys	tarp	1-3	ir	2-4

cisteino liekanos

Pradinių struktūros atstatymo sąlygų tyrimuose buvo naudojama keletas frakcijų TPO baltymo po chromatografijos atvirkštinių fazių kolonėlėje C4 . Tik viena frakcija pasižymėjo žymesniu biologiniu aktyvumu, tiriant su BA/F3 ląstelėmis. Vėliau struktūros atstatymo sąlygos buvo optimizuojamos. Šiomis sąlygomis neteisingos struktūros baltymo kiekis buvo mažesnis, nei 10-20 % nuo bendro gauto monomerinio TPO kiekio.

Biologiškai aktyvaus TPO baltymo disulfidinių tiltelių vietos yra tarp 1-4 ir 2-3 cisteino liekanos (liekanų numeravimas pateiktas pradedant nuo baltymo N galo), tai buvo nustatyta remiantis biologiniu aktyvumu, masspektroskopij a ir analizuojant baltymo amino rūgščių liekanų seką baltymo N gale. Tai sutampa su žinomomis disulfidinių jungčių vietomis eritropoetino molekulėje.

D. Rekombinantinio atstatytos struktūros TPO biologinis aktyvumas

Atstatytos struktūros išgrynintas TPO pasižymėjo aktyvumu kaip in vitro, taip ir in vivo tyrimuose. Pavyzdžiui, tiriant BA/F3 ląstelėse buvo nustatyta, kad pusė maksimalios timidino Įsijungimo į BA/F3 ląsteles stimuliacijos buvo pasiekiama su 3,3 pg/ml(0,3 pM) TPO (Met^-1 1-153). Mėginius tiriant ELISA, pagrįsta sąveika su mpl receptoriumi, pusė maksimalaus aktyvumo pasiekiama esant 1,9 ng/ml (120 pM) TPO koncentracijai. Normaliuose ir mielosupresuotuose gyvūnuose, apšvitintuose beveik letalia Rentgeno spindulių doze, TPO(Met^-1

1-153) labai efektyviai stimuliavo naujų trombocitų susidarymą (aktyvumas buvo pastebimas net esant dozei 30 ng/pelei) . Panašūs biologiniai aktyvumai buvo nustatyti ir kitiems, atstatytos struktūros pagal aprašytas procedūras (žiūr. Fig. 25, 26 ir 28), TPO variantams.

14. Trombopoetino aktyvumo matavimo metodai

Trombopoetinis aktyvumas gali būti išmatuotas įvairiais metodais, tarp jų: Ba/F3 mpl ligando metodu, aprašytu Pavyzdyje 1, in vivo pelių atsakomosios trom10 , bocitozės metodu, trombocitų paviršiaus antigeno indukcijos metodu, kuriame šis antigenas imunologinės analizės būdu (anti-GPIIblUa) matuojamas žmogaus leukemijos megakarioblastinės linijos (CMK) ląstelių paviršiuje (žiūr. Šato et ai., Brit. J. Heamatol., 72:18415 190 [1989])(taip pat žiūr. suspensinės megakariopoezės metodą, aprašytą Pavyzdyje 4) ir poliploidizacijos indukcijos metodu, naudojant megakarioblastų ląstelių liniją (DAMI) (žiūr. Ogura et ai., Blood, 72(1):49-60 [1988]). Megakariocitų brendimas iš nesubrendusių ląstelių, kurių dauguma nesintetina DNR, į morfologiškai identifikuojamus megakariocitus yra procesas, apimantis citoplazminių organelių ir membraninių antigenų (GPIIbIIIa) atsiradimą, endoreplikaciją ir trombocitų formavimąsi, kaip aprašyta išradimo pagrin25 dime. Faktorius, specifiškai skatinantis megakariocitų atšakos ląstelių brendimą (pvz., mpl ligandas), turėtų sukelti nesubrendusiuose megakariocituose bent keletą iš paminėtų pasikeitimų, kurių pasekmė yra trombocitų formavimasis ir trombocitopenijos palengvėjimas. Tokiu būdu, buvo paruošti metodai, įgalinantys matuoti šių parametrų pasirodymą nesubrendusių megakariocitų ląstelių linijose, pvz., CMK ir DAMI ląstelėse. CMK analizės metodas (Pavyzdys 4) nustato specifinio trombocitų markerio GPIIbIIIa atsiradimą ir trombocitų atskilimą.

DAMI analizės metodas (Pavyzdys 15) matuoja endorepli96 kaciją, kadangi padidėjęs ploidiškumas yra būdingas subrendusių megakariocitų bruožas. Atpažįstamų megakariocitų ploidiškumo skaičiai yra 2N, 4N, 8N, 16N, 32N etc. In vivo pelių atsakomosios trombocitozės metodu (Pavyzdys 16) galima parodyti, kad testuojamojo junginio (čia mpl ligando) vartojimas sukelia trombocitų skaičiaus padidėjimą.

TPO aktyvumui matuoti buvo paruošti dar du in vitro metodai. Pirmasis metodas yra kinazės receptoriaus aktyvacijos (KIRĄ) ELISA. Šiame metode CHO ląstelės transfekuojamos mpl-Rse chimera ir ELISA pagalba matuojamas Rse tirozino liekanų fosforilinimas po mpl ligando sąveikos su chimerinės molekulės mpl dalimi (žiūr. Pavyzdį 17). Antrasis metodas yra ELISA, pagrįsta mpl ligando sąveika su receptoriumi. ELISA plokštelėje imobilizuoti triušio antikūnai prieš žmogaus IgG sąveikauja su žmogaus chimeriniu receptoriumi mpl-IgG, kuris savo ruožtu prijungia mpl ligandą, esantį analizuojamame mėginyje. Prisijungusiam mpl ligandui nustatyti naudojami triušio polikloniniai antikūnai prieš mpl ligandą (TPOi₅₅) , žymėti biotinu ir streptavidin-peroksidazė, kaip aprašyta Pavyzdyje 18.

15. Normalių ir subletaliai apšvitintų pelių in vivo biologinis atsakas į gydymą TPO

Normalioms ir subletaliai apšvitintoms pelėms buvo leidžiamas sutrumpintas ir pilno ilgio TPO, išskirtas iš kinietiškų žiurkėnių kiaušidžių ląstelių (CHO), E. coli ir žmogaus embrioninių inkstų ląstelių (293) . Abi TPO formos, produkuotos visuose trijose šeimininkuose, stimuliavo trombocitų produkciją pelėse, tačiau geriausią in vitro atsaką sukelia pilno ilgio TPO, išskirtas iš CHO ląstelių. Šie rezultatai rodo, kad teisingas C galo domeno glikozilinimas gali būti svarbus veiksnys, siekiant optimalaus aktyvumo in vivo.

(a) E. coli-ihT:SO_(Mt~^l,is3)

EPO domeno Met forma (Met -1 padėtyje ir pirmosios 153 žmogaus TPO amino rūgščių liekanos), produkuojama E. coli (žiūr. Pavyzdį 23), buvo leidžiama kasdien normalioms C57 B6 pelių patelėms, kaip pateikta Fig. 25A, 25B ir 25C aprašymuose. Šie piešinėliai rodo, kad neglikozilinta sutrumpinta TPO forma, pagaminta E. coli ir turinti atstatytą, kaip aprašyta aukščiau, baltymo struktūrą, stimuliuoja trombocitų produkciją normaliose pelėse apie du kartus ir neturi įtakos raudonųjų bei baltųjų kraujo ląstelių populiacijoms.

Ta pati TPO forma, kasdien leista subletaliai apšvitintoms (¹³⁷Cs) C57 B6 pelių linijos patelėms, kaip pateikta Fig. 26A, 26B ir 26C aprašymuose, stimuliavo trombocitų kiekio atstatymą ir sumažindavo kritinį lygį, bet neturėjo jokio efekto eritrocitų ir leukocitų populiacijoms.

(b) CHO-rhTPO₃₃2

Pilno ilgio TPO forma, pagaminta CHO ląstelėse ir leista normalioms C57 B6 pelių linijos patelėms, kaip pateikta Fig. 27A, 27B ir 27C aprašymuose, sukėlė normaliose pelėse trombocitų produkcijos padidėjimą penkis kartus,neveikiant eritrocitų ir leukocitų populiacijas.

(c) CHO—rhTPO₃₃₂! E . coli—rhTPOjMet \i53>/ 293—rhTPO₃₃₂ir E. coli-rhTPOi55

Buvo sudarytos priklausomybės nuo dozės kreivės, leidžiant normalioms pelėms rhTPO, pagamintą skirtingose CHO ląstelių linijose (CHO-rhTPO₃₃₂; E.colirhTPO_(Met ^_1,i53); 293-rhTPO₃₃₂ ir E. coli-rhTPOi₅₅) , kaip pateikta Fig. 28 aprašyme. Šis piešinėlis rodo, kad visos analizuotos molekulių formos stimuliavo trombocitų produkciją, tačiau pilno ilgio forma, pagaminta CHO ląstelėse, turėjo dižiausią aktyvumą in vivo.

(d) CHO-rhTPOi53, CHO-rhTPD._sutrumpintas ir CHO-rhTPO^

Priklausomybės nuo dozės kreivės buvo taip pat sudarytos, leidžiant normalioms pelėms įvairias rhTPO formas, pagamintas CHO ląstelėse (CHO-rhTPOi₅3, CHOrhTPO-sutrumpintas ir CHO-rhTPO₃₃₂) , kaip pateikta Fig. 29 aprašyme. Šis piešinėlis rodo, kad visos analizuotos molekulės formos stimuliuoja trombocitų produkciją, bet pilno ilgio 70 kD forma pasižymi didžiausiu aktyvumu in vivo.

16. mpl ligando ir jo variantų rekombinantinės gamybos pagrindai

Geriausia, kai mpl ligandas yra gaminamas standartinėmis rekombinantinėmis procedūromis, kurios apima mpl ligando polipeptido produkciją, kultivuojant ląsteles, transfekuotas taip,' kad galėtų ekspresuoti mpl ligandą, koduojamą nukleino rūgštimi (paprastai ląstelės transformuojamos ekspresijos vektoriumi), ir polipeptido išskyrimą iš ląstelių. Tačiau, galima įsivaizduoti kitus mpl ligando gamybos būdus, naudojant homologinės rekombinacijos metodą arba įterpiant kontroliuojančius elementus į ląsteles, turinčias mpl ligandą koduojančią DNR. Pavyzdžiui, stiprus promotorius/sustiprintojas arba supresorius, arba egzogeninis transkripciją moduliuojantis elementas gali būti įterpti į norimos ląstelės-šeimininkės genomą tokiame atstume nuo DNR, koduojančios mpl ligando polipeptidą, sekos ir tokioje orientacijoje, kad galėtų įtakoti šios DNR transkripciją. Kontroliuojantis elementas nekoduoja mpl ligando; šį polipeptidą koduoja DNR, priklausanti ląstelei-šeimininkei. Toliau ląstelės tikrinamos, siekiant atrinkti, priklausomai nuo tikslo, ląsteles, gaminančias receptorini polipeptidą, aprašomą šiame išradime, arba ląsteles, kuriose ekspresijos lygis yra padidintas arba sumažintas.

Taigi, šiame išradime pateikiamas mpl ligando gamybos būdas, kuriame: i ląstelių, turinčių mpl ligandą koduojančią nukleino rūgšties molekulę, genomą, įterpia transkripciją moduliuojantį elementą, tokiu atstumu ir tokioje orientacijoje, kad galėtų įtakoti transkripciją; toliau ląsteles, turinčias transkripcijos moduliuojanti elementą ir nukleino rūgšties molekulę, kultivuoja. Išradime taip pat aprašoma ląstelė-šeimininkė, turinti endogeninę, mpl ligandą koduojančią nukleino rūgšties molekulę, funkcionaliai sujungtą su egzogeninėmis reguliuojančiomis sekomis, kurias gali atpažinti ląstelė-šeimininkė.

A. mpl ligando polipeptidą koduojančios DNR išskyrimas

DNR, koduojančią mpl ligando polipeptidą, galima išskirti iš bet kurios kDNR bibliotekos, paruoštos iš audinių, kuriuose, kaip tikimasi, vyksta pakankama mpl ligando iRNR ekspresija, mpl ligando geną galima išskirti iš genominės DNR bibliotekos, o taip pat sintetinant in vitro oligonukleotidų seką, pagal pilną nukleotidų ar amino rūgščių liekanų seką.

Bibliotekos tikrinamos naudojant pavyzdžius, sugebančius identifikuoti norimą geną ar to geno koduojamą baltymą. Tikrinant kDNR ekspresijos bibliotekas, tinkami pavyzdžiai yra monokloniniai ar polikloniniai antikūnai, kurie atpažįsta ir specifiškai sąveikauja su mpl ligandu. Tikrinant kDNR bibliotekas, tinkami pavyzdžiai yra 20-80 bazių ilgio oligonukleotidai, koduojantys žinomas ar spėjamas mpl ligando kDNR dalis, priklausančias tai pačiai ar skirtingoms rūšims; ir/arba komplementarios arba homologinės kDNR arba jų fragmentai, koduojantys tą patį arba panašų geną. Tinkami pavyzdžiai genominės DNR bibliotekos tikrinimui apima, bet tuo neapsiriboja: oligonukleotidus, kDNR ar jų fragmentus, kurie koduoja tą patį ar panašų geną,

100 ir/arba homologines genomines DNR ar jų fragmentus. kDNR ar genomines bibliotekos tikrinamos, naudojant pasirinktą pavyzdį pagal standartines procedūras, aprašytas Sambrook et ai., supra, skyriuose 10-12.

Kitas būdas išskirti mpl ligandą koduojantį geną yra PCR metodas, aprašytas Sambrook et ai., supra, skyriuje 14. Šis metodas reikalauja, kad būtų naudojami oligonukleotidiniai pavyzdžiai, kurie hibridizuojasi su DNR, koduojančia mpl ligandą. Oligonukleotidų pasirin10 kimo strategijos aprašytos žemiau.

Geriausias šio išradimo įgyvendinimo būdas yra panaudoti kruopščiai pasirinktas oligonukleotidines sekas kDNR bibliotekų, pagamintų iš įvairių audinių, geriau žmogaus ar kiaulės inkstų (embrionų ar suau15 gūsių) ar kepenų ląstelių, tikrinimui. Pavyzdžiui, žmogaus embriono kepenų ląstelių linijos kDNR bibliotekos tikrinamos, naudojant oligonukleotidini pavyzdį. Taip pat ir žmogaus genomines bibliotekos gali būti tikrinamos oligonukleotidiniu pavyzdžiu.

Oligonukleotidų sekos, pasirinktos kaip pavyzdžiai, turi būti pakankamo ilgio ir pakankamai specifinės, siekiant sumažinti iki minimumo tariamai teigiamų signalų atsiradimą.

seka (sekos) yra parenkamos koduojačios sekos regionų, kur kodonų įvairovė yra mažiausia. Oligonukleotidai gali skirtis nuo pradinės sekos vienoje ar keliose pozicijose. Naudoti išsigimusius oligonukleotidus yra labai svarbu, kai tikrinamos kitų rūšių bibliotekos, kur kodonų naudojimas nežinomas.

Oligonukleotidai turi būti pažymimi, kad. būtų galima po DNR hibridizacijos, tikrinant bibliotekas, juos detektuoti. Geriausias žymėjimo būdas yra panaudoti ATP (pvz., γ³²Ρ) ir polinukleotidkinazę oligo35 nukleotido 5' galo žymėjimui. Tačiau oligonukleotidų

Paprastai nukleotidinė iš tokių mpl ligandą

101 žymėjimui galima naudoti ir kitus metodus, tarp jų ir žymėjimą biotinu ar fermentu ir kitus.

Svarbiausia mpl ligandą koduojanti nukleino rūgštis yra ta, kuri koduoja pilno ilgio mpl ligando poli5 peptidą. Keliuose šio išradimo palankiausiuose variantuose naudojama nukleino rūgšties seka, apimanti ir natyvaus mpl ligando signalinę seką. Nukleino rūgštis, turinti visą baltymą koduojančią seką, yra gaunama tikrinant pasirinktą kDNR genominę biblioteką, naudojant išvestines amino rūgščių liekanų sekas.

B. Natyvaus mpl ligando amino rūgščių liekanų sekų variantai mpl ligando variantai su skirtingomis amino rūgš15 čių liekanų sekomis buvo gaunami, įterpiant reikalingus nukleotidus i mpl ligandą koduojančią DNR arba sintetinant in vitro norimą mpl ligando polipeptidą. Tokie variantai, pavyzdžiui, yra formos su delecijomis ar intarpais kiaulės mpl ligando amino rūgščių liekanų sekoje. Pavyzdžiui, N gale subrendusio viso ilgio mpl ligando dalis yra pašalinama proteolize, kaip in vivo, taip ir in vitro arba klonuojant ir ekspresuojant fragmentą DNR, koduojančios viso ilgio mpl ligandą, siekiant gauti biologiškai aktyvų variantą. Bet kokios delecijų, intarpų ar pakeitimų kombinacijos yra padaromos tam, kad būtų galima gauti galutinę konstrukciją, kuri pasižymėtų norimu biologiniu aktyvumu. Amino rūgščių liekanų pakeitimai gali būti padaromi mpl ligando postransliacijos procese, kaip antai, pakei30 čiant glikozilinimo skaičių ir vietą. Konstruojant mpl ligando amino rūgščių liekanų sekos variantus, taškinės mutacijos vieta ir mutacijos pobūdis priklauso nuo norimų pakeisti mpl ligando charakteristikų (charakteristikos). Taškinės mutacijos gali būti daromos atski35 rai arba kelios kartu, pavyzdžiui, (1) pirmiausia pa102 keičiant konservatyvia amino rūgščių liekana, o po to padaromas radikalesnis pakeitimas, kuris priklauso nuo pasirinkto tikslo, (2) pašalinant proteinazės skėlimo vietą ar (3) įterpiant panašias amino rūgščių liekanas ar skirtingas intarpo kaimyninėms liekanoms arba atliekant 1-3 punkto kombinacijas.

Metodas identifikuoti tam tikrų mpl ligando polipeptido amino rūgščių liekanų ar jų regionų geriausioms mutagenezės vietoms yra vadinamas alanino skanavimo mutageneze, aprašyta Cunningham ir Wells, Science, 244:1081-1085 [1989]. Šiame metode taikinio amino rūgščių liekana ar jų grupė yra identifikuojama (t.y., amino rūgščių liekana, kuri turi krūvį: Arg, Asp, His, Lys ir Glu) ir pakeičiama bet kokia, bet geriau neturinčia krūvio arba turinčia neigiamą krūvį amino rūgščių liekana (geriausiai alaninu ar polialaninu), siekiant pakeisti sąveiką tarp amino rūgščių liekanų ir vandens molekulių, esančių aplink baltymą, ląstelės viduje ar ląstelės išorėje. Domenai, kurie pasižymi funkcionaliu jautrumu pakeitimams, yra tobulinami, įterpiant papildomus ar kitus variantus prie pakeitimo vietos arba pakeitimo vietoje. Taigi, kai amino rūgščių liekanų variantų intarpų vieta nustatyta, mutacijos pobūdis iš esmės gali būti neapibrėžtas. Pavyzdžiui, siekiant optimizuoti mutaciją pasirinktoje vietoje, alanino skanavimas ar atsitiktinė mutageneze vykdoma pasirinktame kodone ar regione ir atliekamas ekspresuotų mpl ligando variantų tikrinimas, atrenkant optimalias kombinacijas su norimu aktyvumu.

Yra du pagrindiniai kintamieji, konstruojant amino rūgščių liekanų sekų variantus: mutacijos vieta sekoje ir mutacijos prigimtis. Pavyzdžiui, mpl ligando polipeptido variantai apima amino rūgščių liekanų sekos mpl ligando variantus, kurie gali būti gamtinio mpl ligando aleliniai variantai (jiems nereikalingi pakeitimai DNR, koduojančiai mpl ligandą) arba mutantinės formos, pada103 rytos mutuojant DNR. Šie variantai gali būti aleliniais ar variantais, kurie neaptinkami gamtoje. Paprastai mutagenezės vieta ir pobūdis priklauso nuo mpl ligando norimų modifikuoti charakteristikų.

Amino rūgščių liekanų sekoje delecijos paprastai atliekamos nuo 1 iki 30 liekanos, geriausia, kai jos atliekamos nuo 1 iki 10 amino rūgščių liekanos, ir paprastai atliekamos šalia esančių liekanų delecijos. Be to, amino rūgščių liekanų sekos delecijos mpl ligande gali būti dalis ar visas glikoproteino C galo domenas. Amino rūgščių liekanų sekos delecijos gali apimti vieną ar kelias pirmųjų 6 amino rūgščių liekanas iš subrendusio baltymo C galo. Amino rūgščių liekanų delecijos gali apimti vieną ar kelias amino rūgščių liekanas, esančias viename ar keliuose kilpos regione, kuris yra tarp spiralinių klosčių. Gretimos delecijos paprastai daromos su lyginiu amino rūgščių liekanų skaičiumi, bet, priklausomai nuo tikslo, galimos ir vienos ar nelyginio skaičiaus amino rūgščių liekanų skaičiaus delecijos. Delecijos gali būti padaromos tose mažai homologiškų mpl ligandų vietose, kurios pasižymi didžiausiu sekos identiškumu, tokiu būdu modifikuojant žmogaus mpl ligando aktyvumą. Labiau tikėtina, kad delecijos žinduolių mpl ligando polipeptide, padarytos tose srityse, kurios yra homologiškos kitoms žinduolių mpl ligandų sekoms, žymiau pakeis mpl ligando biologinį aktyvumą. Nuoseklių delecijų skaičius gali būti pasirenkamas taip, kad nebūtų suardyta mpl ligando baltymo tretinė struktūra, pvz., β-klostė ar a-spiralės.

Amino rūgščių liekanų intarpai, įskaitant prijungimą prie N ir/arba C baltymo galo, gali būti nuo vienos amino rūgščių liekanos iki kelių šimtų amino rūgščių liekanų. Intarpų dydis sekos viduje (t.y., intarpai subrendusio mpl ligando amino rūgščių liekanų sekoje); gali būti apie 1-10 amino rūgščių liekanų, geriau,

104 kai 1-5, geriausiai - nuo 1 iki 3 liekanų. Geriausias pavyzdinis mpl ligando ar jo fragmento suliejimas yra su kitu citokinu ar jo fragmentu. Intarpų prie N baltymo galo pavyzdžiai apima subrendusi mpl ligandą su N gale esančia metionino liekana, tiesioginės subrendusio mpl ligando ekspresijos rekombinantinėse kultūrose artefaktus, baltymus, kai prie subrendusio mpl ligando N galo prijungiamos baltymo N gale esančios heterologinės signalinės sekos, kurios Įgalina rekombinantinius producentus sekretuoti subrendusi mpl ligandą. Šios signalinės sekos gali būti gaunamos iš ląstelių-šeimininkų, taigi, naudojamos signalinės sekos yra horrtologiškos ląstelės-šeimininko sekoms. Tinkamos signalinės sekos yra STII ar lpp iš E. coli, alfa faktorius iš mielių ir virusiniai signalai, tokie kaip žinduolių ląstelių herpes gD.

Kiti intarpų variantai, kai prie mpl ligando N arba C galo prijungiami imunogeniški polipeptidai (t.y., svetimi ląstelei-šeimininkui) yra šie: bakteriniai polipeptidai, tokie kaip beta-laktamazė arba fermentas, koduojamas E. coli trp lokuse, ar mielių baltymai; suliejant su mpl ligando C galu baltymus, turinčius ilgą gyvavimo pusperiodį, tokius kaip imunoglobulinų pastovūs regionai (arba kiti imunoglobulinų regionai), albuminas ar feritinas, kaip aprašyta patente WO 89/02922, publikuotame 1989.04.06.

Trečia variantų grupė yra amino rūgščių liekanų pakeitimo variantai. Šiuose variantuose bent viena amino rūgščių liekanų mpl ligando molekulėje yra pakeičiama skirtinga amino rūgščių liekana. Įdomiausios mutagenezės vietos yra mpl ligando aktyvusis centras (centrai) ir vietos, kur amino rūgščių liekanos, kurios aptinkamos ir kituose analoguose, yra labai skirtingos pagal šoninės grandinės tūri, krūvį ar hidrofobiškumą, bet tose srityse yra didelė homologija tarp įvairių mpl

105 ligandų ir/arba tarp įvairių gyvūnų rūšių mpl ligandų analogų.

Kitos įdomios vietos yra tos, kuriose randamos identiškos tam tikros ypatingos mpl ligando amino rūgščių liekanos įvairiuose mpl ligando šeimos atstovuose ir/arba viename ligande įvairiose gyvūnų rūšyse. Šios vietos, ypatingai tos, kurios pakliūva mažiausiai į trijų kitų identiškų konservatyvių vietų sekas, yra pakeičiamos santykinai konservatyviomis amino rūgščių liekanomis. Tokie konservatyvūs pakeitimai yra pateikti Lentelėje 3. Jei šie pakeitimai turi įtakos biologiniam aktyvumui, tai padaromi dar žymesni pakeitimai, pavadinti pavyzdiniais pakeitimais Lentelėje 3, arba padaromi pakeitimai, aprašyti žemiau, nurodant amino rūgš15 čių klases, ir gauti produktai patikrinami.

LENTELĖ 3

Pradinė amino	Pavyzdiniai pakeitimai	Geriausi
rūgšties		pakeiti-
liekana		mai
Ala (A)	Vai; Leu; Ile	Vai
Arg (R)	Lys; Gln; Asn	Lys
Asn (N)	Gln; His; Lys;Arg	Gln
Asp (D)	Glu	Glu
Cys (C)	Ser	Ser
Gln (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro	Pro
His (H)	Asn; Gln; Lys; Arg	Arg
Ile (I)	Leu; Vai; Met; Ala; Phe; norleucinas	Leu
Leu (L)	norleucinas; Ile; Vai; Met; Ala; Phe	Ile
Lys (K)	Arg; Gln; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Leu; Vai; Ile; Ala	Leu
Pro (P)	Gly	Gly
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr	Tyr
Tyr (Y)	Trp; Phe; Thr; Ser	Phe
Vai (V)	Ile; Leu; Met; Phe; Ala; norleucinas	Leu

Žymios mpl ligando funkcijos ar imunogeniškumo modifikacijos atliekamos, atrenkant pakeitimus, kurie turi didžiausią įtaką (a) polipetido grandinės struk106 turai pakeitimo vietoje, pavyzdžiui, β-klosčių ar aspiralių konformacij ai, (b) krūviui ar hidrofobiškumui pakeitimo vietoje ar (c) šoninės grandinės užimamam tūriui. Gamtinės amino rūgščių liekanos yra suskirstomos į grupes pagal bendras šoninių radikalų savybes:

(1) hidrofobinės: norleucinas, Met, Ala, Vai, Leu, Ile;

(2) neutralios hidrofilinės: Cys, Ser, Thr;

(3) rūgštinės: Asp, Glu;

(4) bazinės: Asn, Gln, His, Lys, Arg;

(5) liekanos, turinčios įtakos grandinės orientacijai: Gly, Pro; ir (6) aromatinės: Trp, Tyr, Phe.

Atlikus pakeitimą nekonservatyvoje sekos vietoje, gali prireikti pakeisti vienos klasės narų kitos klasės nariu. Tokios pakeistos liekanos gali būti įterptos konservatyviose sekos pakeitimo vietose arba, dar geriau, nekonservatyviose vietose.

Viename išradimo variante siekiama inaktyvuoti vieną ar kelias proteinazių skėlimo vietas, esanačias molekulėje. Šios vietos nustatomos, peržiūrint baltymo amino rūgščių liekanų seką, pvz., nustatant tripsino skėlimo vietas, ieškoma arginino ar lizino liekanų. Kai proteinazių skėlimo vietos yra nustatomos, jos padaromos nejautriomis proteolitiniam skėlimui, pakeičiant atitinkamą amino rūgščių liekaną i kitą, geriausiai į bazinę, pvz., glutaminą arba į hidrofobinę, pvz., seriną; taip amino rūgščių liekana gali būti pašalinta iš sekos arba greta skėlimo vietos gali būti įterpiama prolino liekana.

Kitame išradimo variante visos metionino liekanos, išskyrus pirmąją metionino lekaną signalinėje sekoje, arba bet kuri iš trijų amino rūgščių liekanų, esančių prieš arba po tokios metionino liekanos, pakeičiamos į kitas liekanas (pagal Lentelę 3) arba pašali107 narnos. Taip pat į tokias vietas gali būti įterpiama 1 3 papildomos amino rūgščių liekanos.

Bet kokia cisteino liekana, kuri neturi įtakos taisyklingai mpl ligando konformacij ai, gali būti pakeičiama, dažniausiai serinu, tam, kad būtų pagerintas molekulės atsparumas oksidacijai ir taip pat išvengta netaisyklingų disulfidinių tiltelių susidarymo. Buvo nustatyta, kad 1 ir 4 EPO domeno cisteino liekanos, skaičiuojant nuo N baltymo galo, būtinos taisyklingos konf ormaci j os susidarymui, o 2 ir 3 - šiam procesui neturi įtakos. Taigi 2 ir 3 EPO domeno cisteino liekanos gali būti pakeistos.

Nukleino rūgščių molekulės, koduojančios mpl ligando amino rūgščių liekanų sekos variantus, gali būti pagamintos įvairiais žinomais metodais. Šie metodai apima, bet tuo neapsiriboja, nukleino rūgšties išskyrimą iš gamtinių šaltinių (natūralių amino rūgščių liekanų sekos varianto atvejais) arba nukleotidų sąlygojamos (arba kryptingos) mutagenezės, PCR mutagenezės ir kasečių mutagenezės būdais gautus mutantinius variantus, paruoštus iš anksčiau pagamintų variantinių arba laukinio tipo mpl ligando polipeptidų.

Oligonukleotidų sąlygojama mutagenezė yra geriausias būdas gauti mpl ligando DNR variantus su amino rūgščių liekanų pakeitimais, delecijomis ar intarpais. Šis metodas plačiai žinomas ir aprašytas (Adelman et ai., DNR, 2:183 [1983]. Reziumuojant, mpl ligando DNR pakeičiama, hibridinant oligonukleotidus, koduojančius norimą mutaciją, su matrica, kuri yra plazmidės arba bakteriofago, turinčio nepakeistą ar natyvią mpl ligando DNR seką, viengrandė forma. Po hibridizacijos DNR polimerazės pagalba sintetinama visa antroji komplementari grandinė, kurioje yra ir oligonukleotinis pradmuo, koduojantis norimus mpl ligando DNR pakeitimus.

Paprastai naudojami ne trumpesni nei 25 bazių ilgio oligonukleotidai. Optimaliame nukleotide abiejuose

108 galuose turi būti 12 - 15 nukleotidų, visiškai komplementarių matricai, o mutaciją koduojantys nukleotidai lieka sekos vidury. Tai užtikrina teisingą oligonukleotido hibridizaciją su viengrande DNR matrica. Oligonukleotidai sintetinami žinomais būdais, kurie aprašyti Crea et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:5765 [1978].

DNR matricos gali būti pagamintos iš vektorių, sukonstruotų bakteriofago M13 pagrindu, (tinkami komerciniai vektoriai yra M13mpl8, M13mpl9) arba tokių vektorių, kurie turi viengrandžio fago replikacijos iniciacijos vietą, kaip aprašyta Viera et ai., Meth. Enzymol., 153:3 [1987]. DNR, kurioje norima padaryti mutaciją, įterpiama į vieną tokį vektorių ir tokiu būdu pagaminama viengrande matrica. Viengrandžių matricų paruošimas aprašytas Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Sring Harbor Laboratory Press, NY, 1989) skyriai 4.21 -4.41.

Kitas būdas pagaminti viengrandę DNR matricą yra dvigrandės plazmidės ar kitos dvigrandės DNR denatūracija standartiniais metodais.

Siekiant pakeisti natyvią DNR seką (pvz., tam, kad pagaminti amino rūgščių liekanų sekos variantus), oligonukleotidas hibridinamas su viengrande matrica, esant tinkamoms hibridizacijos sąlygoms. Po to pridedamas DNR polimerizaciją katalizuojantis fermentas, paprastai DNR polimerazė I, Klenow fragmentas, siekiant susintetinti matricai komplementarią grandinę, naudojant oligonukleotidą, kaip pradmenį. Tokiu būdu susidaro heterodupleksas, kuriame viena grandinė koduoja mutantinę mpl ligando formą, o kita (matrica) koduoja natyvią nepažeistą mpl ligando seką. Šis heterodupleksas toliau transformuojamas į tinkamą šeimininką, dažniausiai i prokariotinę ląstelę, pvz., E coli JM101. Kai ląstelės paauga, jos išsėjamos į Petri lėkšteles su agarizuota terpe ir išaugusios kolonijos tikrinamos, naudojant

32,

109 žymėtą oligonukleotidinį pradmenį, siekiant identifikuoti bakterijų kolonijas, turinčias mutuotą DNR. Mutuota sritis toliau išskiriama ir įterpiama į vektorių, tinkamą baltymo produkcijai, paprastai tai būna ekspresijos vektorius, dažniausiai naudojamas pasirinkto šeimininko transformacijai.

Aukščiau aprašytas metodas gali būti modifikuojamas taip, kad susidarytų homodupleksinė molekulė, kurioje abi grandinės turi mutaciją (mutacijas). Šios metodo modifikacijos tokios: Viengrandis oligonukleotidas hibridinamas su viengrande matrica, kaip aprašyta aukščiau. Į trijų dezoksiribonukleotidtrifosfatų: dezoksiriboadenozintrifosfato (dATP), dezoksiriboguanozintrifosfato (dGTP) ir dezoksiribotimidintrifosfato (dTTP) mišinį įdedamas modifikuotas tiodezoksiribocitozintrifosfatas (dCTP-[aS]) (Amersham Corparation). Šis mišinys pridedamas prie matricos ir oligonukleotido komplekso. Įdėjus į tokį mišinį DNR polimerazę, sintetinama antroji DNR grandinė, komplementari matricai, išskyrus mutuotus nukleotidus. Be to naujai susintetintoje grandinėje vietoj dCTP bus dCTP-(aS), kuris apsaugo nuo skėlimo restrikcijos endonukleazėmis.

Po to matrica, esanti dvigrandžio heteroduplekso sudėtyje, skeliama tinkamu restrikcijos fermentu ir matricos dalis, atitinkanti norimos mutacijos vietą, yra suskaldoma £xoIII nukleaze arba kita tinkama nukleaze. Reakcija sustabdoma ir tokiu būdu susidaro dalinai viengrandė molekulė.

polimerazę, visus keturis fosfatus, ATP ir DNR ligazę, formuojamas dvigrandis DNR homodupleksas. Šis homodupleksas toliau transformuojamas į tinkamą šeimininką, pvz., E. coli JM101, kaip aprašyta aukščiau.

DNR, koduojanti mpl ligando mutantus su vienos ar kelių amino rūgščių liekanų pakeitimais, gali būti sukonstruota vienu iš keleto būdu. Jei norimos pakeisti

Toliau, pridėjus DNR dezoksiribonukleotidtri110 amino rūgščių liekanos yra greta polipeptidinėj e grandinėje, tai jas galima pakeisti kartu, naudojant vieną oligonukleotidą, koduojantį visus amino rūgščių liekanų pakeitimus. Tačiau, jei tarp šių amino rūgščių liekanų yra didesnis nei 10 amino rūgščių liekanų tarpas, tai pagaminti vieną oligonukleotidą, koduojantį visus pakeitimus, tampa labai sudėtingu uždaviniu. Tokiais atvejais reikia pasirinkti vieną iš dviejų galimų būdų.

Pirmuoju būdu pagaminami keli oligonukleotidai, koduojantys po vieną amino rūgščių liekanų pakeitimą. Šių oligonukleotidų mišinys hibridinamas su matrica ir sintetinama antroji grandinė, kurioje bus užkoduoti visi norimi pakeitimai.

Antras būdas apima du ar kelis mutagenezės ciklus, jei norima pagaminti norimą mutantą. Pirmame cikle, naudojant laukinio tipo DNR matricą ir oligonukleotidą, koduojantį pirmą iš norimų pakeitimų, pagaminamas heterodupleksas. Antrame mutagenezės cikle kaip matrica naudojama mutantinė DNR, pagaminta pirmame cikle. Taigi, ši matrica jau turi vieną ar kelias mutacijas. Oligonukleotidas, koduojantis papildomų norimų amino rūgščių liekanų pakeitimus, hibridinamas su minėta matrica ir vykdoma DNR polimerizacijos reakcija. Susintetinta antroji grandinė koduoja mutacijas, įvestas į DNR pirmame ir antrame mutagenezės cikluose. Ši DNR gali būti panaudojama kaip matrica trečiam mutagenezės ciklui ir taip toliau.

PCR mutageneze taip pat yra tinkamas būdas pagaminti mpl ligando polipeptido mutantinius variantus su amino rūgščių liekanų pakeitimais. Nors žemiau aptariamas metodas taikomas DNR, reikia turėti omeny, kad jis gali būti taikomas ir RNR molekulėms. PCR metodas apima šias procedūras (žiūr. Erlich, supra, skyrius, parašytas R. Higuchi, p. 61-70): Naudojant nedidelius DNR matricos kiekius ir pradmenis, kurių sekos truputį skiriasi nuo matricos DNR sekos, galima pagaminti

111 palyginti didelius kiekius DNR fragmentų, kurie skiriasi nuo matricos sekos tik tose vietose, kuriose skyrėsi pradmenys. Norint įterpti mutaciją į plazmidės DNR, vienas iš pradmenų turi persidengti su vieta, kurioje norima padaryti mutaciją ir turi šią mutaciją koduoti; kito pradmens seka turi būti identiška sekai, esančiai bet kurioje komplementarios DNR grandinės vietoje. Geriau, kad antrąjį pradmenį atitinkanti seka būtų ne toliau, kaip 200 bazių atstumu nuo mutuojamos vietos, tam kad amplifikuotą fragmentą būtų lengva sekvenuoti. Naudojant tokias poras pradmenų, PCR pagalba pagaminama DNR fragmentų populiacija, kuri skiriasi nuo pradinės DNR mutacijomis, įvestomis pirmuoju pradmenim!. Amplifikuotas fragmentas gali turėti ir kitų mutacijų, nes kopijuojant matricą, gali įsivelti klaidos .

Jei matricos ir reakcijos produktų santykis yra ypatingai mažas, tai didžioji dauguma pagamintų fragmentų turės norimą mutaciją (mutacijas). Ši medžiaga toliau naudojama pakeisti atitinkamą plazmidės vietą, taikant standartinius DNR konstravimo metodus. Mutacijas skirtingose pozicijose galima padaryti, naudojant antrą mutantinį pradmenį arba padarant antrą PCR su kitais pradmenimis; abiejų PCR produktai lygiagrečiai įsiuvami į vektorių, naudojant tris (ar kelis) ligavimo etapus.

Konkrečiame PCR mutagenezės pavyzdyje plazmidinė DNR matrica (1 ųg) linearizuojama, naudojant restrikcijos endonukleazę, turinčią tik vieną atpažinimo vietą plazmidėje. Ši atpažinama vieta neturi būti amplifikuojamoje DNR dalyje. 100 ng tokios medžiagos įdedama į PCR mišinį, susidedantį iš PCR buferinio tirpalo, keturių dezoksiribonukleotidtrifosfatų (GeneAMP® rinkinys, Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT and Emeryville, CA) ir 25 pM kiekvieno oligonukleotidinio prad112 mens; galutinis reakcijos mišinio tūris yra 50 μΐ. Reakcijos mišinio viršuje užsluoksniuojama 35 μΐ mineralinės alyvos. Reakcijos mišinys denatūruojamas 5 minutes 100°C temperatūroje, atšaldomas, trumpam padėjus pavyzdžius į ledą, ir į mišinius po alyvą įdedama po 1 μΐ Thermus aąuaticus (Taq) DNR polimerazės (5 V/μΙ, Perkin-Elmer Cetus) . Reakcijos mišinys perkeliamas į DNA Thermal Cycler aparatą (Perkin-Elmer Cetus). Aparatas programuos amas lokiu režimu:

min. 55°C sek. 72°C, po to seka 19 ciklų:

30	sek.	94°C
30	sek.	55°C ir
30	sek.	72°C
Pasibaigus programai,	mėgintuvėliai išimami iš

aparato, vandeninė fazė pernešama į naujus mėgintuvėlius, ekstrahuojama fenolio/chloroformo mišiniu (50:50, t/t) , DNR išsodinama etanoliu ir išskiriama standartiniais metodais. Ši medžiaga toliau apdorojama taip, kad būtų galima įterpti į vektorių.

Kitas mutagenezės variantas - kasečių mutagenezė pagrįstas metodu, aprašytu Wells et ai., Gene, 34:315 [1985]. Pradinė medžiaga yra plazmidė (ar kiti vektoriai) , turinti norimą pakeisti mpl ligando DNR. Mpl ligando DNR kodonas (kodonai), kurį norima pakeisti, identifikuojamas. Abejose būsimos mutacijos vietos galuose turi būti unikalios restrikcijos vietos. Jei tokių vietų nėra, tai jos turi būti įterptos į mpl ligando DNR, naudojant aukščiau aprašytą oligonukleotidų sąlygojamą mutagenezę. Įvedus restrikcijos vietas, plazmidė linearizuojama, skaldant atitinkama restrikcijos endonukleaze. Standartiniais metodais sintetinamas avigrandis oligonukleotidas, koduojantis seką, esančią tarp restrikcijos vietų ir turintis norimas mutacijas. Oligonukleotidų grandinės sintetinamos atskirai ir

113 hibridinamos pagal standartinius metodus. Toks dvigrandis oligonukleotidas vadinamas kasete. Kasetės sudarytos taip, kad jų 3' ir 5' galai atitiktų linearizuotos plazmidės galus ir kad būtų galima juos sujungti liguojant. Po ligavimo plazmidė turės mutantinę mpl ligando DNR seką.

C. Nukleino rūgšties įterpimas į replikuojama, vektorių

Nukleino rūgštis (pvz., kDNR ar genominė DNR), koduojanti natyvų ar mutantinį mpl ligando polipeptidą, įterpiama į replikuojamą vektorių tolesniam klonavimui (DNR amplifikacijai) arba ekspresijai. Yra daug vektorių, todėl tinkamo vektoriaus pasirinkimas priklauso nuo: (1) ar jis bus panaudotas DNR amplifikacijai ar DNR ekspresijai; (2) įterpiamos nukleino rūgšties dydžio; (3) ląstelės-šeimininkės, i kurią vektorius bus įvedamas. Kiekviename vektoriuje yra Įvairūs komponentai, kurie priklauso nuo jo funkcijos (DNR amplifikacija ar DNR ekspresija) ir nuo ląstelės-šeimininkės, kurioje jis bus pavartotas. Vektoriaus komponentai paprastai apima, bet tuo neapsiribojama, vieną ar kelis iš šių elementų: signalinę seką, replikacijos iniciacijos vietą, vieną ar kelis markerinius genus, sustiprintoją, promotorių ir transkripcijos terminacijos seką.

(i) Signalinės sekos

Šiame išradime aprašomas mpl ligandas gali būti ekspresuojamas ne tik tiesiogiai, bet ir kaip hibridinis polipeptidas, kuriame mpl ligandas yra sulietas su heterologiniu polipeptidu, geriau su signaline seka arba su kitu polipeptidu, turinčiu specifinę skėlimo vietą subrendusio baltymo ar polipeptido N gale. Signalinė seka gali būti vektoriaus komponentu arba mpl ligando DNR - dalimi ir kartu su šia DNR įterpiama į vektorių. Reikia pasirinkti tokią signalinę seką, kurią

114 ląstelė-šeimininkas gali atpažinti ir paveikti (pvz., nuskelti signaline peptidaze) . Prokariotinėse ląstelėse-šeimininkuose, kurie negali atpažinti ir nuskelti natyvios mpl ligando signalinės sekos, pastaroji pakeičiama į kokią nors prokariotinę signalinę seką, pvz., i šarminės fosfatazės, penicilinazės, lpp arba aukštai temperatūrai atsparaus endotoksino II signalinę seką. Siekiant sekrecijos mielėse, natyvią signalinę seką galima pakeisti, pvz., invertazės, alfa faktoriaus arba rūgštinės fosfatazės lyderinėmis sekomis, C. albicans gliukoamilazės lyderine seka (EP 362179, publikuotas 1990.04.04) arba siganaline seka, aprašyta WO 90/13646, publikuotame 1990.11.15. Žinduolių ląstelėse gerai veikia natyvi signalinė seka (pvz., mpl ligando prebaltymas, Įvykdantis mpl ligando sekreciją natyviose žinduolių ląstelėse in vivo), galima naudotis ir kitomis žinduolių signalinėmis sekomis, pvz., kitų mpl ligando polipeptidų signalinėmis sekomis ar kitų rūšių gyvūnų mpl ligando signalinėmis sekomis, tos pačios ar kitos rūšies gyvūnų sekretuojamų polipeptidų signalinėmis sekomis, o taip pat virusinių baltymų sekretoriniais lyderiais, pvz., Herpes siplex viruso gD baltymo signaline seka.

(ii) Replikacijos iniciacijos vietos Abu, ekspresijos ir klonavimo, vektoriai turi nukleino rūgšties sekas, kurios įgalina vektoriaus replikaciją vienoje ar keliose ląstelėse-šeimininkuose. Paprastai klonavimo vektoriuose ši seka leidžia vektoriui replikuotis nepriklausomai nuo šeimininko chromosominės DNR ir turi replikacijos iniciacijos vietą arba autonomiškai bes ireplikuojančias sekas. Tokios sekos gerai žinomos daugelyje bakterijų, mielių bei virusų. Plazmidės pBR322 replikacijos iniciacijos vieta tinkama daugumai Gram-neigiamų bakterijų, 2 μ plazmidės repli115 kacijos iniciacijos vieta tinkama mielėms, o įvairios virusinės kilmės (SV40, poliomos, adenovirusų, VSV ar BPV) replikacijos iniciacijos vietos naudojamos žinduolių ląstelių klonavimo vektoriuose. Paprastai žinduolių ekspresijos vektoriams replikacijos iniciacijos vieta nereikalinga (SV40 replikacijos iniciacijos vieta dažnai naudojama ekspresijos vektoriuose tik todėl, kad joje yra ankstyvasis promotorius) .

Dauguma ekspresijos vektorių yra šaudyklės tipo vektoriai, tai yra tie, kurie gali replikuotis bent vienos organizmų klasės ląstelėse ir gali būti transfekuojami į kitas ląsteles, kuriose gali ekspresuotis. Pavyzdžiui, vektorius klonuojamas E. coli ląstelėse, o po to tuo pačiu vektoriumi transfekuoj amas mielių arba žinduolių ląstelės, kuriose šis vektorius ekspresuojasi, nors ir negali replikuotis nepriklausomai nuo ląstelės-šeimininko chromosomos.

DNR galima taip pat amplifikuoti, įterpiant ją į šeimininko genomą. Tai nesunku padaryti, panaudojant, pvz., Bacillus genties bakteriją kaip šeimininką ir įterpiant į vektorių DNR seką, komplementarią Bacillus genominės DNR sekai. Įvedus tokį vektorių į Bacillus bakteriją, vyksta homologinė rekombinacija ir mpl ligando DNR įsiterpia į Bacillus genomą. Tačiau išskirti mpl ligando DNR iš genominės DNR sudėtingiau, nei iš automiškai besireplikuojančio vektoriaus, nes pirmuoju atveju mpl ligando DNR reikia pirma iškirpti iš genominės DNR restrikcijos fermentu.

(iii) Selekcijos genai

Ekspresijos ir klonavimo vektoriai sūri turėti selekcijos geną, kitaip vadinamą selekcijos markeriu, toks genas koduoja baltymą, reikalingą transformuotų ląstelių išgyvenimui ar augimui selektyvioje augimo terpėje. Ląstelės-šeimininkai, netransformuotos vektoriumi, kuriame yra selekcijos genas, tokioje terpėje

116 neišgyvena. Tipiški selekcijos genai koduoja baltymus, kurie: (a) suteikia atsparumą antibiotikams arba kitiems toksinams, pvz., ampicilinui, neomicinui, metoatstato autotrofinį būtinus mitybinius treksatui ar tetraciklinui; (b) fenotipą; arba (c) produkuoja komponentus, kurių terpėje nėra, pvz., genas, koduojantis D-alaninracemazę Bacillus genties bakterijose.

Viename selekcijos pavyzdyje naudojamas reagentas., sustabdantis ląstelių-šeimininkų augimą. Ląstel., kurios buvo sėkmingai transformuotos heterologiniu genu, ekspresuoja baltymą, suteikiantį atsparumą šiam reagentui ir tokiu būdu išgyvena selektyviomis sąlygomis. Tokios teigiamos selekcijos pavyzdžiuose naudojami reagentai yra neomicinas (Southern et ai., J. Molec. Appl. Genet., 1:327 [1982]), mikofenolio rūgštis (Mulligan et ai., Science, 209:1422 [1980]) arba higromicinas (Sugden et ai., Mol. Cell. Biol., 5:410-413 [1985]) . Trijuose aukščiau pateiktuose pavyzdžiuose naudojami bakteriniai genai, kontroliuojami eukariotiniais elementais ir suteikiantys atsparumą atitinkamai G418 ar neomicinui (geneticinui), xgpt (mikofenolio rūgščiai), arba higromicinui.

Kitų žinduolių ląstelėms tinkamų selekcijos markerių, įgalinančių identifikuoti transformuotas ląsteles, pavyzdžiai yra: dihidrofolatreduktazė (DHFR) ir timidinkinazė. Žinduolių ląstelių transformantai auginami tokiomis selektyviomis sąlygomis, kai adaptuotis ir išgyventi gali tik markeri turinčios ląstelės. Palaipsniui didinant selektyvaus agento koncentraciją, transformantai verčiami amplifikuoti selekcijos geną, o kartu ir DNR, koduojančią mpl ligando polipeptidą. Amplifikacij a yra procesas, kai per keletą rekombinantinių ląstelių generacijų chromosomoje padidėja geno kopijų skaičius, ir tos kopijos išdėstomos viena paskui kitą. Atitinkamai padidėja ligando sintezė.

117

Pavyzdžiui, ląstelės, transformuotos DHFR selekcijos genu, identifikuojamos auginant visus transformantus su metotreksatu (Mtx), kuris yra konkurentinis DHFR antagonistas. Tinkamos ląstelės-šeimininkai yra Kinietiškų žiurkėnų kiaušidžių (CHO) ląstelių linija, neturinti DHFR aktyvumo. Ši ląstelių linija paruošiama ir auginama kaip aprašyta (Urlaub ir Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]). Trasformantai auginami terpėje su vis o:.desne i?itx koncentracija. Tai verčia ląstelę sintetinti vis daugiau DHFR geno kopijų ir lygiagrečiai daugiau visų kitų ekspresijos vektoriaus elementų, tarp jų ir DNR, koduojančios mpl ligandą, kopijų. Šį amplifikacijos metodą galima taikyti ir kitiems tinkamiems šeimininkams, pvz., ATCC Nr. CCL61 CHO-ΚΙ, kuris neperneša egzogeninio DHFR, ypač, jei naudojamas mutantinis DHFR genas, atsparus dideliems Mtx kiekiams (EP 117060). Kitas būdas yra ląstelesšeimininkus (ypač laukinio tipo ląsteles, turinčias endogeninę DHFR) transformuoti ar kotransformuoti DNR sekomis, koduojančiomis mpl ligandą, laukinio tipo DHFR baltymą ir kitą selekcijos markeri, pvz., aminogliukozid-3'-fosfotransferazę (APH), ir po to atrinkti transformantus terpėje su selektyviu agentu tokiu, kaip aminogliukozidinis antibiotikas, kanomicinas, neomicinas ar G418. (Žiūr. JAV patentą Nr.: 4965199).

Mielėse naudojamas selekcijos genas trpl, koduojamas mielių plazmidės YRp7 (Stinchcomb et ai., Nature, 282:39 [1979]; Kingsman et ai., Gene, 7:141 [1979]; ir Tschemper et ai., Gene, 10:157 [1980]). trpl genas suteikia selekcijos markerį mielių mutantams, nesugebantiems augti terpėje be triptofano, pvz., ATCC Nr. 44076 arba PEP4-1 (Jonės, Genetics, 85:12 [1977]). Trpl geno defektas mielių ląstelėse-šeimininkuose suteikia galimybę atrinkti transformantus, kurie skirtingai nei šeiminkai gali augti terpėje be triptofano. Analogiš118 kai, Leu2 defektyvius mielių ląstelių kamienus (ATCC Nr. 20622 arba 38626) galima transformuoti žinomomis plazmidėmis, turinčiomis Leu2 geną.

(iv) Promotoriai

Ekspresijos ir klonavimo vektoriai paprastai turi promotorių, kurį gali atpažinti šeimininko organizmas, ir kuris funkcionaliai sujungtas su mpl ligando nukleino rūgštimi. Promotoriai yra netransliuojamos sekos, lokalizuotos prieš struktūrinio geno pirmąjį kodoną (iš 5' galo, 100 - 1000 bp atstumu) ir funkcionaliai sujungtos su tam tikra nukleino rūgšties seka, pvz., mpl ligando nukleino rūgšties seka, ir reguliuoja jos transkripciją ir transliaciją. Promotoriai suskirstomi į dvi pagrindines klases: indukuojami promotoriai ir konstitutyvūs promotoriai. Indukuojami promotoriai yra tokie promotoriai, kurie inicijuoja kontroliuojamos DNR transkripciją, kai tam tikru būdu pasikeičia augimo sąlygos, pvz., kai terpėje atsiranda ar išnyksta koks nors mitybinis komponentas, ar pasikeičia temperatūra. Žinoma daug promotorių, kuriuos atpažįsta įvairūs potencialūs šeimininkai. Šie promotoriai funkcionaliai sujungiami su mpl ligandą koduojančia DNR, pašalinant restrikcijos fermentais natūralų šaltinio promotorių ir įterpiant į vektorių norimą išskirtą promotorinę seką. Kaip natūralius mpl ligando promotorius, taip ir daugumą heterologinių promotorių galima panaudoti mpl ligando DNR amplifikacijai ir/arba ekspresijai. Geriau naudoti heterologinius promotorius, nes jie paprastai suteikia galimybę pasiekti didesnį transkripcijos lygį ir didesnes ekspresuojamo mpl ligando išeigas, lyginant su natūraliu mpl ligando promotoriumi.

Promotoriai, tinkami naudoti prokariotinėse ląstelėse apima β-laktamazės ir laktozės promotorines sistemas (Chang et ai., Nature, 275:615 [1978]; Goeddel et

119 ai., Nature, 281:544 [1979]), šarminės fosfatazės ir triptofano (trp) promotorines sistemas (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 [1980] ir EP 36776) ir hibridinius promotorius, pvz., tac promotorių (deBoer et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 [1983]). Tinka ir kiti žinomi bakterijų promotoriai. Jų nukleotidinės sekos publikuotos ir patyręs specialistas gali juos funkcionaliai sujungti su mpl Ugandą koduojančia DNR (Siebenlist et ai., Cell, 20:269 [1980]), naudodamasis linkeriais ir adapteriais norimoms restrikcijos vietoms sukonstruoti. Promotoriai, naudojami bakterijose, turi turėti Shine-Dalgarno (S.D.) seką, funkcionaliai sujungtą su DNR, koduojančią mpl ligandą.

Žinomi ir eukariotams tinkami promotoriai. Praktiškai visi eukariotų genai turi AT-turtingas sritis, lokalizuotas 25 - 30 bazių atstumu į 5' galą nuo transkripcijos iniciacijos vietos. Kita seka, randama 70 80 bazių atstumu į 5' galą nuo daugumos genų transkripcijos iniciacijos vietos, yra CXCAAT seka, kur X gali būti bet koks nukleotidas. Daugumos eukariotų genų 3' gale yra seka AATAAA, kuri, matyt, gali būti signalu, reguliuojančiu poli-A uodegos prijungimą prie koduojančios sekos 3' galo. Visos šios sekos įterpiamos į tinkamas eukariotų ekspresijos vektorių vietas.

Promotoriai, tinkami naudoti mielėse, apima promotorius 3-fosfogliceratkinazei (Hitzeman et ai., J. Biol., Chem., 255:2073 [1980]) ar kitiems glikolitiniams fermentams (Hess et ai., J. Adv. , Enzyme Reg., 7:149 [1968] ir Holland, Biochemistry, 17:4900 [1978]), tokiems kaip enolazė, gliceraldehid-3-fosfatdehidrogenazė, heksokinazė, piruvatdekarboksilazė, fosfofruktokinazė, gliukoz-6-fosfatizomerazė, 3-fosfogliceratmutazė, piruvatkinazė, triozfosfatizomerazė, fosfogliukozizomerazė ir gliukokinazė.

120

Kiti mielių promotoriai yra indukuojami promotoriai, turintys papildomą pranašumą, kad transkripcija reguliuojama augimo sąlygomis. Tokie promotoriai: alkoholdehidrogenazės 2, izocitochromo C, rūgštinės fosfatazės, degradacijos fermentų, susijusių su azoto metabolizmu, metaltioneino, gliceraldehid-3-fosfatdehidrogenazės ir fermentų, atsakingų už maltozės ir galaktozės įsisavinimą, promotorinės sekos. Vektoriai ir promotoriai, naudojami ekspresijai mielėse, detaliai aprašyti Hitzeman et ai., EP 73657(A). Mielių sustiprintojai sėkmingai naudojami kartu su mielių promotoriais .

Mpl ligando transkripcija nuo vektoriaus žinduolių ląstelėse-šeimininkuose kontroliuojama promotoriais, išskirtais iš virusų genomų, pvz., iš poliomos viruso, paukščių raupų viruso (UK 2211504, publikuotas 1989.07.05), adenovirusų (pvz., Adenoviruso 2), galvijų papiliomos viruso, paukščių sarkomos viruso, citomegalo viruso, retrovirusų, hepatito B viruso ir geriausiai iš Beždžionių Viruso 40 (SV40), o taip pat heterologiniais žinduolių promotoriais, pvz., aktino promotoriumi, imunoglobulino promotoriumi, temperatūrinio šoko promotoriais arba promotoriais, normaliai susijusiais su mpl ligando seka, jei šie natūralūs promotoriai suderinami su kitomis ląstelės-šeimininko sistemomis.

Ankstyvasis ir vėlyvasis SV 40 viruso promotoriai paprastai gaunami kaip SV40 restrikcijos fragmentas, turintis taip pat SV40 viruso replikacijos iniciacijos vietą (Fiers et ai., Nature, 273: 113 [1978]; Mulligan ir Berg, Science, 209:1422-1427 [1980]; Pavlakis et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 [1981]). Ankstyviausias žmogaus citomegalo viruso promotorius išskiriamas kaip Hinc/III E restrikcijos fragmentas (Greenaway et ai., Gene, 18:355-360 [1982]). Sistema, rinkama DNR ekspresijai žinduolių ląstelėse-šeiminin121 kuose, naudojant galvijų papilomos virusą, aprašyta JAV patente Nr. 4419446. Šios sistemos modifikacija aprašyta JAV patente Nr. 4601978. Taip pat žiūr. Gray et ai., Nature, 295:503-508 [1982] apie imuninio interferono kDNR ekspresiją beždžionių ląstelėse; (Reyes et ai., Nature, 297:598-601 [1982] apie žmogaus β-interferono kDNR ekspresiją pelių ląstelėse, naudojant timidinkinazės promotorių iš Herpes simplex viruso; (Canaani ir Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:51665170 [1982]; apie žmogaus interferono βΐ geno ekspresiją kultivuojamose pelių bei triušių ląstelėse; ir Gorman et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 [1982] apie bakterijų CAT sekų ekspresiją beždžionių inkstų ląstelių linijoje CV-1, viščiukų embrionų fibroblastuose, Kinietiškų žiurkėnių kiaušidžių ląstelių linijoje, HeLa ląstelėse ir pelių NIH-3T3 ląstelėse, naudojant promotoriumi Rous'o sarkomos viruso ilgąją galinę pasikartojančią seką.

(v) Sustiprinantys elementai DNR, koduojančios šiame išradime pateiktą mpl

Ugandą, transkripcija aukštesniuose eukariotuose dažnai padidėja, kai į vektorių įterpiama sustiprintojo seka. Sustiprintojai yra cis-padėtyje veikiantys DNR elementai, paprastai nuo 10 iki 300 bp ilgio, kurie veikia promotorių, taip padidindami transkripciją. Sustiprintojai yra sąlyginai nepriklausomi nuo padėties ir orientacijos DNR sekoje, jie buvo rasti kiek 5' (Laimins et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 [1981]), tiek ir 3¹transkripcijos vieneto galuose (Lusky et ai., Mol. Cell Bio., 3:1108 [1983]), taip pat viduryje introno (Banerji et ai., Cell, 33:729 [1983]), ir pačioje koduojančioje sekoje (Osborne et ai., Mol. Cell Bio., 4:1293 [1984]). Žinoma daug sustiprintojų sekų iš žinduolių genų (globino, elastazės, albumino,

122 α-fetoproteino ir insulino). Paprastai dažniau naudojami eukariotinių ląstelių virusų sustiprintojai, pastarieji apima: SV40 sustiprintoją, esantį vėlyvojoje replikacijos iniciacijos vietos pusėje (100-270 bp) , citomegalo viruso ankstyvojo promotoriaus sustiprintoją, poliomos viruso sustiprintoją, esantį vėlyvojoje replikacijos iniciacijos vietos pusėje ir adenovirusų sustiprintojus. Žiūrėk taip pat(Yaniv, Nature, 297:1718 [1982]) apie sustiprinančius elementus, taikomus eukariotų promotorių aktyvacijai. Sustiprintoją galima įterpti į 5' arba 3' mpl Ugandą koduojančios sekos galą, bet geriau jį įterpti į vietą, esančią prie promotoriaus 5' galo.

(vi) Transkripcijos terminacijos elementai Ekspresijos vektoriai, naudojami eukariotinėse ląstelėse-šeimininkuose (mielėse, grybuose, vabzdžių, augalų, gyvūnų, žmogaus ląstelėse arba kitų daugialąsčių organizmų branduolį turinčiose ląstelėse) turi turėti sekas, reikalingas transkripcijos terminacijai ir iRNR molekulių stabilizavimui. Tokios sekos paprastai būna eukariotų arba virusų DNR arba kDNR 5' arba, rečiau, 3' netransliuojamose dalyse. Šios dalys turi nukleotidų segmentus, kurie transkribuojami kaip poliadenilinti fragmentai netransliuojamoje mpl Ugandą koduojančios iDNR dalyje.

(vii) Vektorių konstravimas ir analizė Tinkamų vektorių, turinčių vieną ar kelis aukščiau išvardintus elementus, konstravimas remiasi standartiniais ligavimo metodais. Išskirtos plazmidės arba DNR fragmentai skaldomi, prie gautų fragmentų padaromi lipnūs galai ir jie liguojami tokia tvarka, kad būtų gaunamos norimos plazmidės.

123

Norint įsitikinti,kad sukonstruotos plazmidės seka yra teisinga, ligavimo mišiniu transformuojamas E. coli K12 kamienas 294 (ATCC Nr. 31446), ir transformantai atrenkami pagal atsparumą ampicilinui ar tetraciklinui. Iš transformantų išskiriamos plazmidės ir analizuojamos restrikcine analize ir/arba sekvenuojamos pagal Messing et ai., Nucleic Acids Res. , 9:309 [1981] arba pagal Maxam et ai., Methods in Enzymology, 65:499 [1980].

(viii) Vektoriai laikinajai ekspresijai

Šio išradimo Įgyvendinimui labai naudingi ekspresijos vektoriai, kurie taikomi, siekiant mpl ligando polipeptidą koduojančios DNR laikinosios ekspresijos žinduolių ląstelėse. Paprastai laikinąjai ekspresijai taikomi ekspresijos vektoriai, sugebantys efektyviai replikuotis ląstelėse-šeimininkuose. Tuo būdu ląstelėje susikaupia daug ekspresijos vektoriaus kopijų ir atitinkamai sintetinami dideli norimo polipeptido, koduojamo ekspresijos vektoriumi, kiekiai (Sambrook et ai., supra, pp. 16.17 - 16.22). Laikinosios ekspresijos sistemos, susidedančios iš tinkamo ekspresijos vektoriaus ir ląstelės-šeimininko, įgalina identifikuoti polipeptidus, koduojamus klonuotomis DNR, o taip pat greitai analizuoti tokių polipeptidų biologines ir fiziologines savybes. Taigi, laikinosios ekspresijos sistemos ypatingai naudingos šiame išradime identifikuojant mpl ligando polipeptido analogus ir variantus, kurie pasižymi mpl ligando polipeptido biologiniu aktyvumu.

(ix) Tinkami pavyzdiniai stuburinių gyvūnų ląstelių vektoriai

Kiti metodai, vektoriai ir ląstelės-šeimininkai, tinkamos mpl ligando sintezei rekombinantinėse stuburinių gyvūnų ląstelių kultūros, yra aprašyti Gething et ai., Nature, 293:620-625 [1981]; Mantei et ai., Nature,

124

281:40-46 [1979]; Levinson et al.;EP 117060 ir EP 117058. Geriausiai tinkama mpl ligando ekspresijai žinduolių ląstelėse plazmidė yra pRK5 (EP 307247; JAV patentas Nr. 5258287) arba pSVl6B (PCT publikacija Nr. W0 91/08291).

D. Ląstelių-šeimininkių atranka ir transformavimas

Tinkamos ląlstelės-šeimininkai vektorių klonavimui ar ekspresijai yra prokariotų ląstelės, mielės ar aukštesniųjų eukariotų ląstelės, aprašytos aukščiau. Tinkami prokariotai apima Eubacteria, Gram-neigiamas ar Gram-teigiamas, pavyzdžiui, E. coli, Bacilli rūšys, pvz., B. subtilis, Pseudomonas rūšis, pvz., P. aeruginosa, Salmonella typhimurium ar Serratia marcescans. Geriausias klonavimui E. coli kamienas yra E. coli 294 (ATCC Nr. 31446), nors ir kiti kamienai yra tinkami klonavimui: E. coli B, E. coli Χ177 6 (ATCC Nr. 31537) ir E. coli W3110 (ATCC Nr. 27325). Šie pavyzdžiai pateikti iliustracijai, o ne apribojimui. Palankiausia, kai ląstelės-šeiminJnkai sekretuoja minimalius kiekius proteinazių. Taip pat atliekami klonavimo darbai in vitro, pvz., PCR ar kitos nukleino rūgščių polimerazinės reakcijos.

Be prokariotinių ląstelių, gali būti naudojami šeimininkais mpl ligandą koduojantiems vektoriams eukariotiniai mikroorganizmai, pvz., siūliniai grybai ar mielės. Saccharomyces cerevisiae ar paprastos kepimo mielės dažniausiai naudojamos iš žemesniųjų eukariotinių mikroorganizmų. Daugelis mikroorganizmų iš kirų genčių, rūšių ir kiti mikroorganizmų kamienai yra paprastai prieinami ir gali būti naudojami šiame išradime. Pavyzdžiui, Schizosaccharomyces pombe (Beach ir Nurse, Nature, 290:140 [1981]; EP 139383, publikuotas 1985.05.02), Kluyveromyces (JAV patentas Nr. 4943529?, pvz., K. lactis (Louvencourt et ai., J. Bacteriol., 737

125 [1983]), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans ir K. marxianus, yarrouia [EP 402226], Pichia pastoris (EP183070; Sreekrishna et ai., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP

244234), Neurospora crassa (Case et ai., Proc. Natl. acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); siūliniai grybai, pvz., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, publikuotas 1991.01.10), Aspergillus, pvz., A. niddulans (Ballance et ai., Biochem. Biophys. Bes. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et ai., Gene,

26:205-221 [1983];. Yelton et ai., Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 81:1470-1474 [1984 ]) ir A. niger (Kelly ir

Hynes, EMBO J., 4:415-419 [1985]).

kompleksiniu Iš principo aukštesniųjų eukariotų

Ekspresuoti glikozilintam mpl ligandui tinkamos ląstelės-šeimininkės yra kilusios iš daugialąsčių organizmų. Tokios ląstelės pasižymi procesingu ir glikozilinimo aktyvumu, galima naudoti bet kokias ląsteles kaip iš stuburinių, taip ir iš bestuburių gyvūnų. Bestuburių gyvūnų ląstelių pavyzdžiai yra augalų ir vabzdžių ląstelės. Gali būti naudojamos daugelio bakulovirusų kamienų ir variantų ir atitinkamų vabzdžių ląstelės iš Spodoptera frugiperda (vikšras), Aedes aegypti (moskitas), Aedes albopictus (moskitas), Drosophila melanogaster (vaisinė muselė) ir Bombyx mori. Žiūrėk, pavyzdžiui, Luckow

Bio/Technology, 6:47-55 [1988]; Miller et ai.

Engineering, Setlow et ai.eds., Vol.8 Publishing, 1986), pp. 277-279; ir Maeda

Nature, 315:592-594 [1985] . Daugelis virusų kamienų yra prieinami transfekcij ai, pvz., Autographa californica NPV L-l variantas ir Bm-5 kamienas Bombyx mori NPV ir kiti virusai, ir tokie virusai, kaip ir šiame išradime naudojamas virusas, gali būti naudojami čia aprašytais et ai. , Genetic (Plenum et ai. ,

126 būdais, ypač transfekuojant Spodoptera frugiperda ląsteles.

Augalų audinių kultūros iš medvilnės, kukurūzų, bulvių, sojos pupelių, petunijų, pomidorų ir tabako gali būti naudojamos kaip šeimininkai. Augalų kultūros ląstelės paprastai transfekuojamos inkubuojant su tam tikrais bakterijų Agrobacterium tumefaciens kamienais, kuriose prieš tai buvo įterpta mpl ligando DNR. Augalų ląstelių kultūros inkubacijos su A. tumefaciens metu, DNR, koduojanti mpl ligandą, pernešama į augalo ląsteles; ląstelės tampa transfekuotos ir tam tikromis sąlygimis ekspresuoja mpl ligando DNR. Yra reguliatorinės ir signalinės sekos, tinkamos augalų kultūros ląstelėms, pvz., nopalinsintetazės promotorius ir poliadenilinimo signalinės sekos (Depicker et ai., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 [1982]). Taip pat yra išskirtas DNR segmentas, esantis T-DNR prieš geną 780, kuris sugeba aktyvuoti arba padidinti augalų ekspresuoj amų genų transkripcijos lygi rekombinantinę DNR turinčiose augalų kultūros ląstelėse. EP 321196, publikuotas 1989.06.21.

Bet labiausiai įdomios yra stuburinių gyvūnų ląstelės, ir stuburinių gyvūnų ląstelių dauginimas kultūroje (audinių kultūros) dabar jau yra rutininė procedūra (Tissure Culture, Academic Press, Kruse ir Patterson, redaktoriai [1973]). Žinduolių ląsteliųšeimininkų linijų pavyzdžiai yra: beždžionės inkstų CV1 linijos ląstelės, transformuotos SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); žmogaus embriono inkstų ląstelių linija (293 ar 293 linijos ląstelės, subklonuotos, kad galėtų augti suspensinėje kultūroje, Graham et ai., J. Gen Virol . , 36:59 [1977]); jauniklių žiurkėnų inkstų ląstelės (BHK, ATCC CCL 10); Kinietiškų žiurkėnių kiaušidžių ląstelės (DHFR) (CHO, Urlaub ir Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980] ) ; pelių sertoli ląstelės (TM4,

127

Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 [1980]); beždžionių inkstų ląstelės (CV1 ATCC CCL 70) ; Afrikos žaliųjų beždžionių inkstų ląstelės (VERO-76, ATCC CRL-1578); žmogaus gimdos kaklelio karcinomos ląstelės (HELA, ATCC CCL 2); šuns inkstų ląstelės (MDCK, ATCC CCL 34); buffalo žiurkių kepenų ląstelės (BRL 3A, ATCC CRL 1442); žmogaus plaučių ląstelės (W138, ATCC CCL 75); žmogaus kepenų ląstelės (Hep G2, RB °065); pelių pieno liaukų auglio ląstelės (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI ląstelės (Mather et ai., Annals N. Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]); MRC 5 ląstelės; FS4 ląstelės ir žmogaus hepatomos linija (Hep G2) .

Ląstelės-šeimininkai transfekuojamos ir transformuojamos šiame išradime aukščiau aprašytais ekspresijos ar klonavimo vektoriais; ląstelės kultivuojamos bendrai priimtinose maitinimo terpėse, papildant jas, kad būtų indukuojami promotoriai; atrenkami transformantai ar amplifikuojami genai, koduojantys tikslines sekas.

Transfekcija vadinamas procesas,, kai į ląstelę įvedamas vektorius, nepriklausomai nuo to, ar vyksta kokios nors koduojančios sekos ekspresija. Specialistams yra žinoma daug transfekcijos metodų, pvz., kalcio fosfatinis metodas, elektroporacij a. Pasisekusi transfekcija paprastai įvertinama pagal bet koki vektoriaus veikimo pasireiškimą ląstelėje-šeimininke .

Transformacija vadinamas procesas, kai į organizmą įvedama DNR taip, kad vyktų jos replikacija arba kaip ekstrachromosominio elemento, arba integruojantis i ląstelės-šeimininko chromosomą. Priklausomai nuo pasirinkto šeimininko, transformacija atliekama standartiniais metodais, tinkančiais šiam konkrečiam šeimininkui. Ląstelių paveikimas kalcio chloridu (žiūr. skyrių 1.82, Sambrood et ai., supra) paprastai taikomas prokariotinėms ląstelėms arba kitoms, turinčioms ląstelės sienelės barjierą. Transformuojant augalų ląsteles, naudojamas užkrėtimas Agroba eteriui?, tumefaciens, tai

128 aprašyta Shaw et ai., Gene, 23:315 [1983] ir WO 89/05859, publikuotame 1989.06.29. Be to, augalų ląstelės gali būti transfekuojamos paveikiant ultragarsu, kaip aprašyta patente WO 91/00358, publikuotame 1991.01.10. Žinduolių ląstelėms, kurios neturi ląstelių sienelės, geriau taikyti kalcio fosfatinį metodą, aprašytą Graham ir van der Eb, Virology, 52:456-457 [1978]. Bendri žinduolių ląstelių-šeimininkų transformacijos aspektai aprašyti Axel JAV patente Nr. 4399216, publikuotame 1983.08.16. Mielių ląstelių transformacija paprastai vykdoma pagal metodus, aprašytus Van Solingen et ai., J. Bact., 130:946 [1977] ir Hsiao et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 [1979]. Taip pat galima naudoti ir kitus DNR įvedimo metodus, pvz., injekciją į branduolį, elektroporaciją arba protoplastų suliejimą.

E. Ląstelių-šeimininkų kultivavimas

Prokariotų ląstelės, naudojamos šiame išradime mpl ligando polipeptido produkcijai, kultivuojamos tam tinkamoje terpėje, kaip aprašyta Sambrook et ai., supra.

Šiame išradime žinduolių ląstelės-šeimininkai, naudojamos mpl ligando produkcijai, gali būti kultivuojamos įvairiose terpėse. Ląstelių-šeimininkų kultivavimui gali būti naudojamos komercinės terpės: Ham F10 (Sigma), minimali pagrindinė terpė ( [MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) ir Dulbecco modifikuota Eagle terpė (DMEM, Sigma). Taip pat ląstelių-šeimininkų auginimui gali būti naudojama bet kuri terpė, aprašyta šiuose šaltiniuose: Ham ir Wallace, Meth. Enz., 58:44 [1979], Barnes ir Šato Anai. Biochem., 102:255 [1980], JAV patentuose: 4767704 ; 4 6 57866; 4927762 arba 4560655; WO 90/03430; WO 87/00195; JAV patento Re. 30985;ir paraiškose USSN 07/592107 ar 07/592141, abi pateiktos 1990.10.03. Visų išvardintų terpių panaudojimas laikomas atitinkančiu ši išradimą. Bet kuri čia aprašyta

129 terpė gali būti papildoma, jei tai būtina, hormonais ir/arba kitais augimo faktoriais (pvz., insulinu, transferinu ar epiderminiu augimo faktoriumi), druskomis (pvz., natrio chloridu, kalcio, magnio druskomis ir fosfatais), buferinėm medžiagomis (pvz., HEPES) , nukleozidais (pvz., adenozinu ir timidinu), antibiotikais (pvz., Gentamicinu™), mikroelementais (pvz., neorganiniais junginiais, paprastai jų koncentracija būna keli μΜ) ir gliukoze ar ekvivalentišku energijos šaltiniu. Kiti terpės priedai, žinomi šios srities specialistams, taip pat gali būti naudojami tinkamomis tam koncentracijomis. Ląstelių-šeimininkų, pasirinktų baltymų ekspresijai, kultivavimo sąlygos: temperatūra, pH ir kt., parenkamos specialistams žinomais būdais.

Šiame išradime ląstelės-šeimininkai apima ląsteles, kultivuojamas in vitro ir ląsteles, kurios yra pačiuose gyvūnuose.

F. Geno amplifikacijos/ekspresijos nustatymas

Geno amplifikacij a ir/arba ekspresija gali būti įvertinama tiesiogiai mėginyje, pavyzdžiui, įprastais Southern blotavimu, northern blotavimu įvertinant iRNR transkripciją (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]), dot hibridizacija (DNR analize), arba hibridizacija in situ, naudojant tinkamai pažymėtus zondus, pasirenkamus pagal pateiktas šiame išradime sekas. Galima naudoti įvairius žymėjimo būdus, labiausiai įprastas yra žymėjimas radioizotopais, ypač ³²P. Bet galima naudoti ir kitokius metodus, pvz., biotinu modifikuotus nukleotidus įterpti į polinukleotidą. Prie biotino gali jungtis avidinas ar antikūnai, kurie gali būti pažymimi įvairiomis žymėmis, pvz., radioizotopais, f 1uorescentinėmis žymėmis, fermentais ar kitais būdais. Tarp pat gali būti naudojami antikūnai, atpažįstantys specifinius dupleksus, pvz., DNR dupleksus, RNR duplek130 sus ir DNR-RNR hibridinius dupleksus ar DNR-baltymo dupleksus. Naudojami antikūnai gali būti pažymėti ir matavimas gali būti atliekamas, kai dupleksas sorbuojamas ant paviršiaus, kad, formuojantis ant paviršiaus dupleksams, būtų galima nustatyti prisijungusius prie duplekso antikūnus.

Taip pat geno ekspresija gali būti įvertinama imunologiniais metodais, pvz., atliekant imunohistocheminį audinių pjūvių dažymą, o taip pat analizuojant audinių kultūrų terpes arba organizmo skysčius, tokiu būdu tiesiogiai įvertinant geno ekspresijos produktą. Atliekant imunohistocheminio dažymo analizę, ląstelių mėginiai paprastai paruošiami dehidratuoj ant ir užfiksuojant ląsteles, po to seka reakcija su žymėtais antikūnais, specifiniais imobilizuotam geno produktui. Paprastai šios žymės yra matomos, pvz., fermentinės žymės, fluorescuojančios žymės, liuminescuojančios žymės ir kitos. Tinkamiausias šiam išradimui ypač jautrus dažymo metodas yra pateiktas Hsu, et ai., Am. J. Clin. Path., 75:734-738 [1980].

Imunocheminiam dažymui ir/arba mėginių tirpalų tyrimui naudojami kaip monokloniniai, taip ir polikloniniai antikūnai. Jie gali būti gaunami iš bet kurių žinduolių. Antikūnai gali būti pagaminti prieš natyvų mpl ligando polipeptidą ar prieš sintetinį polipeptidą, kuris yra susintetintas pagal DNR sekas, pateikiamas žemiau.

G. mpl ligando pol ipetido gryninimas

Patogiausia, kai mpl ligandas yra išskiriamas iš kultūrinės terpės, į kurią jis yra sekretuoj amas, nors taip pat gali būsi išskirtas iš ląstelių-šeimininkų lizato, kai baltymas yra ekspresuojamas be signalinės sekos .

Kai mpl ligandas yra ekspresuojamas rekombin.autiriėse ląstelėse, skirtingose nuo žmogaus ląstelių,

131 mpl ligando preparatuose nebūna kitų žmogaus polipeptidų ar baltymų. Bet šiuo atveju yra būtina mpl Ugandą išgryninti nuo rekombinantinių ląstelių baltymų ar polipeptidų, norint gauti išgrynintą, homogenišką mpl ligando preparatą. Pirmoje gryninimo stadijoje kultūrinė terpė ar ląstelių lizatas yra centrifūguojami, siekiant pašalinti ląstelių nuolaužas. Ląstelių membranos ir tirpūs baltymai yra atskiriami. Taip pat gali būti naudojami ir komerciniai, skirti baltymams koncentruoti, filtrai (pvz., Amicon ar Millipore ultrafiltacinė įranga). mpl ligandas gali būti gryninamas iš tirpių baltymo frakcijos ir iš ląstelių lizato membraninės frakcijos, priklausomai nuo to, ar mpl ligandas yra įsijungęs į membraną, mpl ligandas toliau gryninamas nuo pašalinių tirpių baltymų ar polipeptidų išsodinant jį druskomis ar jonų mainų chromatografija, ar chromatografuoj ant kitais sorbentais. Naudojamos matricos gali būti: akrilamidas, agarozė, dekstranas, celiuliozė ir kitos matricos, paprastai naudojamos baltymų gryninimui. Chromatografinės procedūros, tinkamos baltymų gryninimui, yra: imunoafininė chromatografija (pav., anti-hmp2 ligando Mab), receptorinė chromatografija (pvz., mpl-IgG, ar protein A Sepharose), hidrofobinės sąveikos chromatografija (HIC) (pvz., esterio, butilo ar fenilo Toyopearl) , lėktino chromatografija (pvz., Con A-Sepharose, lentil-lectinSepharose), gelfiltracij a (pvz., Sephadex G-75), katijonų ir anijonų mainų chromatografija (pvz., DEAE ar karboksimetil- ir sulfopropil-celiuliozė), ir atvirkščių fazių didelio efektyvumo skystinė chromatografija (RP-HPLC) (žiūr. Chromatog., 296:171 [1984], einančios RP-HPLC stadijos nantinio IL-2 gryninimui).

pvz., Urdal et ai., J. kur dvi viena po kitos yra naudojamos rekombiKitos gryninimo stadijos paprastai būna: išsodinimas etanoliu, išsodinimas

132 amonio sulfatu, chromatofokusavimas, preparatyvinė SDS PAGE ir kitos.

mpl ligando variantai, kuriuose amino rūgščių liekanos yra pašalintos, įterptos ar pakeistos, yra išskiriami taip pat, kaip ir natyvus mpl ligandas, turint omeny savybių pokyčius mpl ligando variantuose. Pavyzdžiui, gryninant mpl ligando junginį su kitu baltymu ar polipeptidų, pvz., bakteriniu virusiniu antigenu, galima atlikti imunoafininę chromatografiją, naudojant sorbentą su antikūnais prieš antigeną, kadangi šis sorbentas sugeba sorbuoti sulietą polipeptidą. Taip pat mpl ligandas gali būti išgryninamas afinine chrimatografij a, naudojant išgrynintus mpl-IgG, imobilizuotus gerai žinomais būdais (geriausiai) prie sorbento, tokio kaip Affi-Gel 10 (Bio-Rad, Richmond, CA) ar panašaus. Proteinazių inhibitorius, toks kaip fenilmetilsulfonilfluoridas (PMSF), turi būti naudojamas, norint išvengti proteolitinės degradacijos valymo metu, antibiotikai turi būti naudojami, norint išvengti atsitiktinio užkrato augimo. Šios srities specialistas gali įvertinti, kaip gryninimo metodai, tinkami natyviam mpl ligandui, turi būti modifikuojami, kai gryninamas mpl ligandas ar jo variantai iš kitų rekombinantinių ląstelių kultūros.

H. mpl ligando polipeptido kovalentinės modifikacijos mpl ligando polipeptidų kovalentinės modifikacijos yra šio išradimo sudėtinė dalis. Kaip natyvus mpl ligandas, taip ir mpl ligando amino rūgščių liekanų sekos variantai gali būti kovalentiškai modifikuoti. Vienas kovalentiškai modifikuoto mpl ligando tipas, aprašytas šiame išradime, yra mpl ligando fragmentas. Mpl ligando fragmentų variantai, kurių sudėtyje yra apie 40 amino rūgščių liekanų, gali būsi paruošti

133 chemiškai sintetinant ar fermeniniu ar cheminiu būdu skaldant pilno ilgio mpl ligando polipeptidą ar jo variantą. Kiti mpl ligando ar jo fragmentų kovalentinės modifikacijos variantai yra molekulė įterpiama i taikinio mpl ligando ar jo fragmento amino rūgščių liekaną organiniu modifikuojančių agentu, kuris sugeba reaguoti su pasirinkta vieta grandinėje ar su N ar C galinėmis amino rūgščių liekanomis.

Cisteinilo liekanos paprastai modifikuojamos a-halogenacetatais (ir atitinkamais aminais), tokiais, kaip choracto rūgštis ar chloracetamidas, susidarant karboksimetil- ar karboksiamidometilo dariniams. Cistenilo liekanos taip pat gali būti paveiktos bromtrifluoracetonu, a-brom-β-(5-imidozoil)propiono rūgštimi, chloracetilfosfatu, N-alkilmaleinimidais, 3-nitro-2piridildisulf idu, metil-2-piridildisulfidu, p-chlormercuribenzoatu, 2-chlormercuri-4-nitrofenoliu ar chlor-7-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazolu.

Histidilo liekanos modifikuojamos dietilpirokarbonatu, kai pH 5,5-7,0, nes šis reagentas yra santykinai selektyvus šoninei histidilo grandinei. Taip pat gali būti naudojamas bromofenilacetilbromidas, reakcija vykdoma 0,1 M natrio kokodilato tirpale, esant pH 6.0.

Lizinilo ir N galinės amino rūgščių liekanos modifikuojamos gintaro rūgšties ar kitais karboksiliniais anhidridais. Modifikuoj ant šiais agentais, pakeičiamas liekanos krūvis į priešingą lizinilui krūvį. Kiti amino grupes turinčių liekanų modifikavimui tinkamu reagentai apima imidoesterius, tokius, kaip metilpikolinimidatas; piridoksalfosfatas; pirodoksalis, chlorborhidridas, trinitrobenzensulfo rūgštis, O-metilizokarbamidas, 2,4pentandioiis ir transaminaze katalizuojaraa reakcija su glioksilatu .

Arginilo liekanos modifikuojamos vieni: ar keliais įprastais reagentais, tarp jų: fenilglioksaL i s , 2,3-bu134 tandionas, 1,2-cikloheksandionas ir ninhidrinas. Modifikuojant arginilo liekanas, reakcija turi būti atliekama šarminėje terpėje dėl aukštos guanidino grupės pK_a. Šie reagentai taip pat gali reaguoti ir su lizino grupe, taip kaip ir su arginino liekanos ε-amino grupe.

Specifinė tirozilo liekanos modifikacija gali būti atliekama, norint įvesti spektrometrines žymes, vykdant reakciją su aromatiniais diazonio junginiais arba su tetranitrometanu. Paprastai naudojami N-acetilimidizolas ir tetranitrometanas, reakcijos metu susidaro O-acetiltirozilo junginiai ir 3-nitro dariniai, atitinkamai. Per tirozilo liekanas įvedamas radioaktyvus jodas chloramino T metodu, aprašytu aukščiau, tam naudo• 125 131 jamas J ar J, ir tokie dariniai yra naudojami radioimunoanalizėj e.

Šoninės karboksilinės grupės (aspartilo ar glutamilo) selektyviai modifikuojamos reakcijomis su karbodiimidais (R-N=C=N-R'), kur R ir R' yra skirtingos alkilo liekanos. Tokie karbodiimidai gali būti 1-cikloheksil-3-(2-morfonilinil-4-etil)karbodiimidas arba 1etil-3-(4-azonio-4,4-dimetilpentil)karbodiimidas . Asparagino ir glutamino rūgščių liekanos gali būti pakeistos su amonio jonais į asparaginilo ir glutaminilo liekanas.

Modifikavimas su difunkcinais agentais yra tinkamas mpl ligando prisiuvimui prie vandenyje netirpios matricos arba paviršiaus, kad gryninant būtų galima naudoti anti-mpl ligando antikūnus ir atvirkščiai . Įprastai naudojami susiuvantys agentai yra šie: pvz., 1,l-di(diazoacetil)-2-fenlietanas, glutaraldehidas, N-hidroksisukcinimido esteris, pavyzdžiui 4-azidosalicilo rūgšties esteris, homodifunkcionalus imidoesteris, įskaitant disukcinimidilesterį tokį, kaip 3,3'diticbis ( sukcinimidilpropionatas) , ir difunkcionalūs maleir imidai, tokie, kaip bis-N-maleinimido-1,8-oktanas . Modifikuojantys agentai, tokie, kaip met i 1-3-[(p-azid 135 fenil)ditio]propioimidatas, sudaro fotoaktyvius tarpinius produktus, kuriuos galima susiūti (prijungti) paveikus šviesa. Taip pat baltymų imobilizacij ai gali būti naudojamos reakcingos, vandenyje netirpios matricos tokios, kaip cianbromidu aktyvuoti angliavandeniai, ir reakcingos matricos, aprašytos JAV patentuose: 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537; ir 4330440.

Glutaminilo ir asparagilo liekanos yra dažnai deamidinamos iki atitinkamų glutamilo ir aspartilo liekanų. Šios liekanos deamidinamos neutralioje arba šarminėje terpėje. Deamidintos šių liekanų formos taip pat yra šio išradimo dalis.

Kitos modifikacijos apima prolino ir lizino hidroksilinimą, serino ar treonino hidroksilinių grupių fosforilinimą, lizino, arginino ir histidino šoninių grandinių α-amino grupių metilinimą (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983]), N galo amino grupės acetilinimą ir bet kokios C galinės karboksilinės grupės amidinimą.

Kiti mpl ligando polipeptido kovalentinės modifikacijos tipai, esantys šio išradimo sferoje, apima natyvaus polipeptido glikozilinimo pakeitimus. Tai reiškia vieno ar kelių angliavandenių komponentų, sutinkamų natyviame mpl ligande, pašalinimą ir/arba vieno ar kelių angliavandenių, nesutinkamų natyviame mpl ligande, pridėjimą.

Paprastai polipeptidų glikoziiinimas būna per N atomą arba per O atomą. N glikoziiinimas vyksta, prijungiant angliavandenio grandinę prie asparagino liekanos. Tripeptidinės sekos: asoaraginas-X-sermas ir asparaginas-X-treoninas, kur X yra bet kokia amino rūgščių liekana, išskyrus prolino liekaną, yra fermentiniu būdu atliekamo angliavandenio grandinės prijungimo prie asparagino liekanos vieta. Taigi, ka r yra šių

136 trijų amino rūgščių liekanų tokios sekos, tai polipeptidas turi potencialią glikozilinimo vietą. O glikozilinimas vyksta prijungiant vieną kuri nors angliavandenį - N-acetilgalaktozaminą, galaktozę ar ksilozę prie hidroksiamino rūgšties liekanos, paprastai prie serino ar treonino liekanos; bet gali jungtis ir prie 5-hidroksiprolino ar 5-hidroksilizino liekanų.

Papildomos glikozilinimo vietos mpl ligando polipeptide yra padaromos, pakeičiant amino rūgščių liekanas taip, kad būtų vienas ar keli aukščiau aprašyti tripeptidai (N glikozilinimas) . Glikozilintų polipeptidų variantai gali būti padaromi, papildant ar pakeičiant vieną arba kelias serino ar treonino liekanas natyvaus mpl ligando sekoje (O glikozilinimas). Mpl ligando amino rūgščių liekanų seka yra pakeičiama, padarant pakeitimus DNR lygyje, dažniausiai atliekant mutagenezę DNR, koduojančios mpl ligando polipeptidą, pakeičiant kodonus taip, kad jie transliuotų norimas amino rūgščių liekanas. DNR mutacija (mutacijos) gali būti atliktos, naudojant metodus, aprašytus aukščiau, skyriuje mpl ligando amino rūgščių liekanų sekos variantai.

Angliavandenių liekanų skaičiaus padidinimą mpl ligando polipeptide galima atlikti taip pat ir fermentiniu ar cheminiu būdais. Šie metodai patogūs tuo, kad tada nereikia polipeptido ekspresiją atlikti sudėtingesnėse ląstelėse, kuriose vyksta N ir O glikozilinimas. Priklausomai nuo naudojamo metodo, angliavandenis (angliavandeniai) gali būti prijungti prie (a) arginino ir histidino, (b) prie laisvų karboksilinių grupių, (c) prie laisvų sulfhidrilo grupių tokių, kaip cisteino, (d) laisvų hidroksilo grupių tokių, kaip serino, treonino ar hidroksiprolino, (e) prie aromatinių liekanų tokių, kaip fenilalanino, tirožino ar tnptofano ar (f) prie amidinių glutamino grupių. Šie metodai aprašyti V.'C 37/05330, publikuotame 1987.0S.il·.

137 ir Aplin ir Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259306 [1981].

Angliavandenių, esančių mpl ligando polipeptido grandinėje, pašalinimą galima atlikti cheminiu ar fermentiniu būdais. Deglikozilinant cheminiu būdu, polipeptidas paveikiamas trifluormetansulfo rūgštimi ar ekvivalenčių junginiu. Šiuo būdu yra pašalinamos dauguma ar visos angliavandenių liekanos, išskyrus jungiančius angliavandenius (N-acetilgliukozaminą ar N10 acetilgalaktozaminą), išlaikant nepažeistą polipeptidą. Cheminis deglikozilinimas aprašytas Hakimuddin, et ai., Arch. Biochem. Biophys. , 259:52 [1987] ir Edge et ai.,

Anai. Biochem., 118:131 [1981], Fermentinis angliavandenių pašalinimas nuo polipeptidų grandinių gali būti atliekamas įvairiomis endo- ir egzoglikozidazėmis, kaip aprašyta Thotakura et ai., Meth. Enzymol., 138:350 [1987] .

Glikozilinimas potencialiose glikozilinimo vietose gali būti blokuojamas, naudojant tunikamiciną, kaip aprašyta Duskin et ai., J. Biol. Chem., 257:3105 [1982]. Tunikamicinas blokuoja baltymo ir N-glikozido ryšio susidarymą.

Kitas mpl ligando modifikavimo tipas apima prijungimą prie mpl ligando kurį nors iš daugelio nebaltymi25 nių polimerų, pvz., polietilenglikolį, polipropilenglikolį ar polioksialkileną, būdu, pateiktu JAV patentuose: Nr. 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 ir 4179337 . Kovalentiš kai modifikuoti šiais polimerais mpl ligando polipeptidai šiame išradime vadinami sukabintais (pegylated) mpl ligando polipeptidais.

Suprantama, kad turi būti atliekamas išskirto mpl ligando varianto atrinkimas paoal jo sąveiką su mpl, o atrinktas mpl ligando varianta- turi pasižymėti imunobiologiniu ir/arba biologiniu aktyvumu, kaip aprašyta ^ς aukščiau, mpl ligando variam us gali būti atrenkamas

138 pagal stabilumą rekombinantinėj e ląstelų kultūroje ar plazmoje (pvz., atsparumas proteolizei), pagal afiniškumą mpl nariui, pagal atsparumą oksidacijai, pagal produkcijos lygi ir kitas sąvybes. Pavyzdžiui, imunologinių mpl ligando polipeptido savybių, tokių kaip afiniškumas pasirinktiems antikūnams, pakeitimai gali būti įvertinami konkurentine imunoanalize. Kitos baltymų ar polipeptidų savybių modifikacijos, tokios, kaip atsparumas redukcijos-oksidacijos procesams, terminis atsparumas, hidrofobiškumas ar atsparumas proteolizei, gali būti įvertinamos gerai žinomais metodais.

17. Antikūnų prieš mpl ligandą gavimas: bendrieji metodai

Antikūnų gavimas (i) Polikloniniai antikūnai

Polikloniniai antikūnai prieš mpl ligandą arba jo fragmentus paprastai yra gaunami, gyvūnams po oda (sc) arba į pilvo ertmę (ip) keletą kartų suleidžiant mpl ligandą kartu su adjuvantu. Geriausia konjuguoti mpl ligandą arba jo fragmentą, kuriame yra reikalinga amino rūgščių seka (seka-taikinys) , su tokiu baltymu, kuris yra imunogeniškas imunizuojamam gyvūnui, pvz., moliuskų hemocianinu, serumo albuminu, jaučio tiroglobulinu arba sojos pupelių tripsino inhibitoriumi, naudojant difunkcinį arba modifikuojantį agentą, pavyzdžiui, maleinimidobenzoil-sulfosukcinimido esterį (prijungimas per cisteino liekaną), N-hidroksisukcinimidą (per lizino liekaną), glutaro aldehidą, sukcino anhidridą, SOCI2, arba R¹N=C=NR, kur R ir R¹ yra skirtingos alkilo grupės.

Imunizuojant mpl ligandu ar jo fragmentais, gyvūnams keliose vietose po odą suleidžiama nuo 1 mg iki 1 ųg (triušiams arba pelėms, atitinkamai) peptido arba konjugato, suspenduoto 3 tūriuose pilno Freund'o adju139 vanto. Po mėnesio gyvūnams keliose vietose po oda suleidžiama nuo 1/5 iki 1/10 peptido arba konjugato pradinio kiekio, suspenduoto pilname Freund'o adjuvante. Po 7-14 dienų iš gyvūnų paimamas kraujas ir serume nustatomas antikūnų prieš mpl ligandą titras. Gyvūnai pakartotinai imunizuojami tol, kol pasiekiamas pakankamai aukštas titras. Tikslinga pakartotinai imunizuoti gyvūnus to paties ligando konjugatu, bet konjugavimui naudoti kitą baltymą arba kitą konjugavimo agentą. Agreguoj antys agentai, tokie kaip aliuminis, naudojami imuninio atsako sustiprinimui.

(ii) Monokloniniai antikūnai

Monokloniniai antikūnai yra išskiriami iš homogeniškų antikūnų populiacijos, t.y., individualūs antikūnai yra visiškai identiški visai populiacijai, išskyrus retai pasitaikančias mutantinės molekules, kurios gali atsirasti dėl natūraliai vykstančių mutacijų. Taigi, terminas monokloniniai rodo, kad antikūnai nėra skirtingų antikūnų mišinys.

Pavyzdžiui, šiame išradime aprašyti monokloniniai antikūnai prieš mpl ligandą gali būti gauti hibridominės technologijos būdu pagal Kohler'io ir Milstein'o metodą (Nature, 256:495, 1975), arba rekombinantinės DNR metodais (JAV patentas Nr.4816567, Cabilly ir kt.).

Naudojant hibridominės technologijos metodą, pelė arba kitas tinkamas gyvūnas, pavyzdžiui, žiurkėnas, yra imunizuojamas aukščiau aprašytu būdu, kad limfocitai pradėtų produkuoti specifinius antikūnus prieš imunizacijai naudotą baltymą. Yra ir alternatyvus limfocitų in vitro imunizacijos būdas. Po to limfocicai suliejami su mielomos ląstelėmis, naudojant tinkama suliejimo agentą, pavyzdžiui, polietiienglikolį, kad susiformuotų hibridominė ląstelė (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103, Academic Press, 1986) .

140

Tokiu būdu gautos hibridominės ląstelės išsėjamos ir auginamos tinkamoje terpėje, kurioje yra viena arba keletas medžiagų, inhibuojančių nehibridinių, tėvinių mielomos ląstelių augimą. Pavyzdžiui, jeigu tėvinės mielomos ląstelės neturi fermento hipoksantin-guaninfosforiboziltransferazės (HGPRT arba HPRT), hibridomų auginimo terpėje paprastai turi būti hipoksantino, aminopterino ir timidino (HAT terpė), kurie sustabdo HGPRT neturinčių ląstelių augimą.

Paprastai pasirenkamos tokios mielomos ląstelės, kurios efektyviai hibridizuojasi, užtikrina stabilią antikūnų ekspresiją po suliejimo su atitinkama antikūnus produkuojančia ląstele, o taip pat yra jautrios tam tikrai terpei, pavyzdžiui, HAT terpei. Iš tokių mielomos ląstelių linijų dažniausiai pasirenkamos pelės mielomos ląstelių linijos, tokios kaip MOPC-21 ir MPC11 (Salk Institute Distribution Center (Salk'o ląstelių centras),San Diego, Kalifornija, JAV) bei SP-2 ląstelės (American Type Culture Collection, Rockville, Merilendas, JAV). Taip pat yra aprašytos žmogaus mielomos bei pelės-žmogaus heteromielomos ląstelių linijos, kurios gali būti panaudotos žmogaus monokloninių antikūnų gavimui (Kozbor, J.Immunol., 133:3001 [1984]; Brodeur ir kt. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63, Markei Dekker, Ine., New York, 1987) .

Terpėje, kurioje auga hibridomos, yra tikrinama monokloninių antikūnų prieš mpl ligandą produkcija. Paprastai monokloniniu antikūnų specifiškumas tikrinamas imuniprecipitaci-os būdu arba in vitro metodais, tokiais kaip radioimun. n.is metodas (RIA) arba imunofermentinis metodas (ELToA¹ .

Monokloninių ant:. -ūnų afiniškumas (sąveikos tvirtumas) gali būti : artintas Scatchard'o analizės pagalba pagal Munscr. :: Polard, Anai. Biochem., 107:220 [1980].

141 • Nustačius, kad hibridominės ląstelės produkuoja norimo specifiškumo ir afiniškumo antikūnus, pradiniai klonai yra subklonuojami didėjančių praskiedimų metodu ir auginami kaip įprasta (Goding, žr aukščiau). Šiam tikslui tinka tokios terpės, kaip DMEM arba RPMI-1640. Be to, hibridomos gali būti auginamos in vivo, kaip gyvūno ascitinis auglys.

Subklonų produkuojami monokloniniai antikūnai paprastai išskiriami iš terpės, ascitinio skysčio arba serumo, naudojant įprastas imunoglobulinų gryninimo procedūras, pavyzdžiui, chromatografiją ant baltymo A-Sefarozės arba hidroksilapatito, elektroforezę gelyje, dializę arba afininę chromatografiją.

Šiame išradime aprašytus monokloninius antikūnus koduojanti DNR yra išskirta ir sekvenuota, naudojant Įprastas procedūras (t.y., naudojant oligonukleotidų sekas, kurios specifiškai sąveikauja su genų, koduojančių pelės antikūnų lengvąsias ir sunkiąsias grandines, sekomis). Ši DNR paprastai išskiriama iš hibridominių ląstelių. Išskirta DNR gali būti perkelta Į ekspresijos vektorius, kurie po to tranfekuojami į ląstelę-šeimininką, pavyzdžiui, į beždžionių COS ląteles, žiurkėnių kiaušidžių ląsteles (CHO) arba i neprodukuojančias imunoglobulinų mielomos ląsteles, tokiu būdu užtikrinant monokloninių antikūnų sintezę rekombinantinėj e ląstelėje-šeimininke. DNR taip pat gali būti modifikuojama, pavyzdžiui, žmogaus sunkiųjų ir lengvųjų grandinių pastoviuosius domenus koduojančiomis DNR sekomis pakeičiamos homologiškos pelės DNR sekos (Cabilly ir kt, žr. aukščiau, Morrison ir kt . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 81:6851 [1984 ]), arba prie imunoglobulinus koduojančios DNR sekos kovalentiškai prijungiama kitokį polipeptidą koduojanti seka arba jcs dalis.

Pakeitus tokį ne imunoglobu1 ininės kilmės baltymą šiame išradime aprašytų antikūnų pastoviuoju domenu, arba šių antikūnų antigeną jungiančiosios vietos

142 kintamuoju domenu, sukuriami bivalentiniai chimeriniai antikūnai, kuriuose yra dvi antigeną jungiančiosios vietos - viena specifiška mpl ligandui, kita specifiška kitam antigenui.

Chimeriniai arba hibridiniai antikūnai taip pat gali būti gaunami in vitro, naudojant gerai žinomus baltymų cheminės sintezės metodus arba prijungimo agentus. Pavyzdžiui, galima sukonstruoti imunotoksinus, naudojant dizulfidų mainų reakciją arba įvedant tioeterini ryši. Šiam tikslui tinka tokie reagentai, kaip iminotiolatas ir metil-4-merkaptobutirimidatas.

Norint pritaikyti aprašytus antikūnus diagnostiniams tikslams, reikia pažymėti vieną iš komponentų. Šis komponentas turi tiesiogiai ar netiesiogiai sukelti signalą, kurį galima išmatuoti. Pavyzdžiui, tokia žymė gali būti radioizotopas, toks kaip ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S arba ¹²⁵I, fluorescuojantis arba chemiliuminescuoj antis junginys, toks kaip fluoresceino izotiocianatas, rodaminas arba liuciferinas, o taip pat fermentai, tokie kaip šarminė fosfatazė, beta-galaktozidazė arba krienų peroksidazė.

Šiam tikslui gali būti panaudotas bet kuris žinomas antikūnų žymėjimo metodas, pavyzdžiui, metodai, aprašyti Hunter ir kt., Nature, 144:945 [1962], David ir kt., Biochemistry, 13:1014 [1974]; Pain ir kt., J. Immun. Meth., 40:219 [1981], Nygren, J. Hystochem. and Cytochem., 30:407 [1982],

Šiame išradime aprašyti antikūnai gali būti panaudoti bet kokiam žinomam analizės metodui, pavyzdžiui, konkurenciniam analizės metodui, tiesioginei ir netiesioginei dviepitopinei analizei, o taip pat imunoprecipitacijai (Zola, Monocloral Antibodies: A Manual of Techniąues, ρρ. 147-158, CPl’ Press, Ine., 1987).

Konkurentiniai analizes metodai remiasi tuo, kad žymėtas standartas (tai sali būti mpl ligandas arba

143 imunologiškai aktyvus jo fragmentas) konkuruoja su testuojamajame pavyzdyje esančiu mpl ligandu dėl sąveikos su antikūnais, mpl ligando kiekis testuojamajame pavyzdyje yra atvirkščiai proporcingas standarto, prisijungusio prie antikūnų, kiekiui. Kad būtų galima nustatyti, kiek standarto prisijungė prie antikūnų, paprastai antikūnai yra imobilizuojami arba išsodinami - tokiu būdu yra atskiriami prisijungę ir neprisijungę prie antikūnų standartas bei analizuojamasis ligandas.

Dviepitopinėj e analizėje yra naudojami dveji antikūnai, kurių kiekvienas atpažįsta skirtingas analizuojamojo baltymo (mpl ligando) imunogeniškas sekas, arba epitopus. Dviepitopinėj e analizėje antigenas sąveikauja su pirmaisiais antikūnais, imobilizuotais kietoje fazėje, o po to antrieji antikūnai prisijungia prie antigeno, tokiu būdu sudarydami netirpų trijų komponentų kompleksą (David ir Green, JAV patentas Nr. 4376110). Antrieji antikūnai gali būti žymėti (tiesioginė dviepitopinė analizė), arba jų kiekis išmatuojamas, naudojant žymėtus anti-imunoglobulininius antikūnus (netiesioginė dviepitopinė analizė) . Pavyzdžiui, viena iš dviepitopinės analizės modifikacijų yra imunofermentinė analizė, kai naudojama fermentinė žymė (pvz., krienų peroksidazė) .

(iii} Humanizuoti ir žmogaus antikūnai.

Garai žinomi metodai, kurių pagalba ne žmogaus kilmės antikūnai gali būti humanizuojami. Paprastai humanizuotuose antikūnuose yra įterpta viena arba daugiau ne žmogaus kilmės amino rūgščių liekanų. Šios ne žmogaus kilmės amino rūgščių liekanos dažnai vadinamos pernešimo liekanomis ir paprastai yra paimamos iš pernešamo kintamojo domeno. Humanizaciją galima atlikti metodais, pasiūlytais Minter ir kt. (Jonės ir kt., Nature, 321:522:525 [1986]; Riechmann ir kt. , Nature, 332:323-327 [1988]; Verhoeyen ir kt., Science,

144

239:1534-1536 [1988]), pakeičiant graužikų CDR sekas atitinkamomis žmogaus antikūnų sekomis. Atitinkamai, tokie humanizuoti antikūnai vadinami chimeriniais (Cagilly et ai., supra), jeigu juose žymiai mažiau nei intaktinis kintamasis domenas (t.y., ne visas domenas) yra pakeičiamas atitinkama ne žmogaus kilmės amino rūgščių seka. Praktiškai, humanizuoti antikūnai yra tipiški žmogaus antikūnai, kuriuose kai kurios CDR, o kartais ir kai kurios FR amino rūgščių liekanos pakeistos analogiškomis graužikų antikūnų sekomis.

Siekiant sumažinti imunogeniškumą, labai svarbu pasirinkti žmogaus imunoglobulinų sunkiųjų ir lengvųjų grandinių kintamuosius domenus, tinkamus humanizuotų antikūnų gavimui. Tam gali būti naudojamas geriausio atitikimo metodas, kai graužikų antikūnų kintamojo domeno seka yra palyginama su visų žinomų žmogaus imunoglobulinų kintamųjų domenų sekų biblioteka. Ta žmogaus imunoglobulinų seka, kuri labiausiai panaši i graužikų imunoglobulinų seką, pasirenkama kaip karkasas (framework, FR) humanizuotiems antikūnams gauti (Sims ir kt. , J. Immunol., 151:2296 [1993]; Chothia ir Lesk, J. Mol. Biol., 196:901 [1987]). Naudojant kitą metodą, pasirenkamas tam tikras karkasas, gautas iš bendros (konsensinės) visiems žmogaus antikūnams amino rūgščių sekos, kuri sudaro tam tikrą lengvųjų ir sunkiųjų grandinių pogrupi. Tas pats karkasas gali būti naudojamas keliems skirtingiems humanizuotiems antikūnams gauti (Carter ir kt., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 [1992]; Presta ir kt. , J. Immunol., 151:2623 [1993]) .

Taip pat labai svarbu, kad atlikus antikūnų humanizaciją būtų išsaugotas jų aukštas afiniškumas ir kitos svarbios biologinės savybės. Siekiant šio tikslo, pasirenkamas toks metodas, kai humanizuotų antikūnų ruošimo metu yra analizuojamos pradinės sekos ir

145 įvairūs humanizuoti produktai, naudojant pradinių ir humanizuotų sekų erdvinės struktūros modelius. Imunoglobulinų erdvinės struktūros modeliai yra visiems prieinami ir gerai žinomi šios srities specialistams. Sukurtos kompiuterinės programos, kurios iliustruoja ir pademonstruoja tam tikros pasirinktos imunoglobulinų sekos galimas erdvinės konformacijos struktūras. Analizuojant šiuos modelius, galima įvertinti tam tikrų amino rūgščių liekanų reikšmę tiriamos imunoglobulinų sekos funkcijoms, t.y., galima analizuoti amino rūgščių liekanas, kurios yra svarbios tiriamos imunoglobulinų sekos sąveikai su antigenu. Tokiu būdu, galima pasirinkti tokias FR sekas ir tokias pernešimo sekas, kad antikūnams būtų suteiktos tam tikros reikalingos savybės, pavyzdžiui, didelis afiniškumas antigenui. Apskritai, CDR sekos turi tiesioginę įtaką sąveikai su antigenu (JAV paraiška išradimui Nr.07/934373, pateikta 1992.08.21., kuri yra paraiškos Nr. 07/715272, pateiktos 1991.06.14., tęsinys).

Kita vertus, šiuo metu galima gauti transgeninius gyvūnus (pvz., peles), kuriuose po imunizacijos susidaro vien tik žmogaus antikūnai ir visai nevyksta endogeninių imunoglobulinų sintezė. Pavyzdžiui, buvo aprašyta, kad homozigotinė delecija antikūnų sunkiosios grandinės sujungimo srities genų (J_H) srityje visiškai inhibuoja endogeninių antikūnų produkciją chimerinėse ir mutantinėse pelėse, turinčiose mutaciją nepertvarkytame imunoglobulinų gene (germ-line mutant). Kai į tokią mutantinę pelę perkeliamas nepertvarkytas žmogaus imunoglobulinų genas, po stimuliacijos antigenu prasideda žmogaus imunoglobulinų sintezė (Jakobovits ir kt,

Proc. Natl

Jakobovits

Acad. Sci. USA, 90:2551-255 [1993];

ir kt., Nature, 362:255-258 [1993];

Bruggermann ir kt. , Year in Immuno., 7:33 [1953]).

Žmogaus antikūnai taip pat gal·: būti gaunami ragų bibliotekų pagalba (Hoogenboom :r Winter, J. Mol.

146

Biol., 227, 381, [1991] ; Marks ir kt., J. Mol. Biol., 222, 581 [1991]).

(iv) Bispecifiniai antikūnai

Bispecifiniai antikūnai yra monokloniniai antikūnai, paprastai žmogaus arba humanizuoti antikūnai, kurie yra specifiški mažiausiai dviems skirtingiems antigenams. Yra žinomi bispecifinių antikūnų gavimo metodai.

Tradiciškai, rekombinantiniai bispecifiniai antikūnai gaunami, atliekant dviejų imunoglobulinų lengvųjų grandinių-sunkiųjų grandinių porų ko-ekpresiją, kai abi sunkiosios grandinės turi skirtingą specifiškumą (Milstein ir Cuello, Nature, 305:537-539 [1983]). Dėl imunoglobulinų lengvųjų ir sunkiųjų grandinių įvairovės tokios hibridomos (kvadromos) produkuoja 10 skirtingų antikūnų molekulių mišinį, kurių tik viena turi teisingą bispecifinę struktūrą. Šių teisingos struktūros antikūnų išvalymas (tam paprastai naudojama afininė chromatografija), yra gana sudėtingas, o išeigos mažos. Panašios procedūros aprašytos PCT publikacijoje WO 93/08829 (publikuota 1993.05.13.), o taip pat Trauhecker ir kt., EMBO, 10:3655-3659 [1991],

Yra ir kitas, tinkamesnis būdas, kai reikiamo specifiškumo kintamieji domenai (antikūno-antigeno sąveikos sritys) yra sujungiami su imunoglobulinų pastoviųjų domenų sekomis. Paprastai tokiam junginiui naudojamas sunkiosios grandinės pastovusis domenas, kuriame turi būti bent dalys šarnyrinės (hinge), CH2 ir CH3 sričių. Be to, bent viename iš junginių turėtų būti ir pirmojo sunkiosios grandinės domeno (CH1) dalis, kurioje yra sritis, būtina lengvosios grandinės prisijungimui. DNR, koduojanti imunoglobulinų sunkiosios grandinės junginius ir, jeigu reikia, imunoglobulinų lengvąja grandinę, yra įterpiama į skirtingus ekspresijos vektorius ir vienu metu transfekuojama į tinkamą ląstelę-š-imininką.

147

Transfekuotose ląstelėse stebima didelė galimų kombinacijų įvairovė, skirtingomis tarpusavio proporcijomis susirenkant šiems trims polipeptidiniams fragmentams, kadangi esant šių trijų polipeptidinių grandinių tam tikram nevienodam santykiui užtikrinama optimali išeiga. Tačiau įmanoma dvi ar visas tris polipeptidinių grandinių koduojančias DNR sekas įterpti į vieną ekspresijos vektorių, kai siekiama didelės bent dviejų polipeptidinių grandinių ekspresijos, esant vienodam jų santykiui, arba kai šios proporcijos neturi didelės reikšmės. Pasirenkant šį būdą, bispecifiniai antikūnai yra sukonstruojami iš hibridinės imunoglobulinų sunkiosios grandinės, turinčios vienokį specifiškumą, ir iš hibridinės imunoglobulinų sunkiosios grandinės - lengvosios grandinės poros, turinčios kitokį specifiškumą. Buvo nustatyta, kad tokią .asimetrinę struktūrą, turinčią bispecifinį komponentą, lengviau atskirti nuo kitų nereikalingų imunoglobulinų grandinių kombinacijų, kadangi imunoglobulinų lengvąsias grandines turi tik pusė bispecifinių molekulių. Šis būdas aprašytas paraiškoje išradimui Nr.07/931811, pateiktoje 1992.08.17.

Detaliau bispecifinių antikūnų gavimo metodai aprašyti Suresh ir kt. , Methods in Enzymol., 121:210 [1986] .

(v) Heterokonjuguoti antikūnai

Heterokonjuguoti antikūnai taip pat yra šio išradimo dalis. Heterokonjuguoti antikūnai yra sukomponuojami iš dviejų kovalentiškai sujungtų antikūnų. Tokie antikūnai buvo sukurti tam, kad, pavyzažiui, būtų galima nukreipti imuninės sistemos ląsteles atakuoti nepageidautinas ląsteles (JAV patentas Nr. 4676980), arba kad būtų galima gydyti ŽIV infekciją (PST publikacija WO 91/00360 ir WO 92/00373, EP 0308S;. Heterokon juguotus antikūnus galima sukonstruoti, naudojant uet kokį įprastą konjugavimo metodą. Tinkami pri'ungimo

148 agentai yra gerai žinomi ir aprašyti JAV patente Nr. 4676980, kartu pateikiant ir keletą konjugavimo metodų.

IV. Megakariocitopoetinio baltymo - mpl ligando panaudojimas terapijoje.

Biologiškai aktyvus mpl ligandas, atliekantis hematopoetinio efektoriaus funkciją ir aprašytas čia kaip megakariocitopoetinis arba trombocitopoetinis baltymas (TPO), steriliai paruošus jo vaistinę formą, gali būti naudojamas megakariocitopoetinės arba trombocitopoetinės funkcijos stimuliavimui, gydant trombocitopeniją, atsiradusią dėl susilpnėjusios trombocitų produkcijos arba jų destrukcijos. Kaulų čiulpų hipoplazija, susijusi su trombocitopenija (pvz., aplastinė anemija po chemoterapijos arba kaulų čiulpų persodinimo), o taip pat ir kiti susirgimai, tokie kaip išsėtinė intravaskulinė koaguliacija (DIC), imuninė trombocitopenija (tarp jų ŽIV sukelta ITP arba ne ŽIV sukelta ITP), chroniška idiopatinė trombocitopenija, kongenitalinė trombocitopenija, mielodisplazij a ir trombotinė trombocitopenija, gali būti efektyviai gydomi šiame išradime aprašytais komponentais. Be to, šie megakariocitopoetiniai baltymai gali būti panaudojami, gydant mieloproliferacines ligas, o taip pat trombocitozes, atsiradusias dėl uždegimų arba geležies trūkumo.

Tikslingiausia šiame išradime aprašytą megakariocitopoetini arba trombocitopoetini baltymą (TPO) naudoti mielotoksinei chemoterapijai, gydant leukemiją arba kietus auglius, mieloabliatyvinei terapijai autologinės arba alogeninės kaulų čiulpų tranplantacijos atveju, o taip pat mielodisplazijos, idiopatinės aplastinės anemijos, kongenitalinės trombocitopenijos bei imuninės trombocitopenijos atvejais.

149

Kiti susirgimai, kurie gali būti sėkmingai gydomi šiame išradime aprašytu megakariocitopoetiniu baltymu, yra trombocitų defektai arba pažeidimai, atsiradę dėl vaistų ar nuodų poveikio arba aktyvacijos, vykstant sąveikai su dirbtiniu paviršiumi. Šiais atvejais minėtas baltymas gali būti naudojamas stimuliuoti naujų, nepažeistų trombocitų atsparumą. Visas galimų pritaikymo variantų sąrašas pateiktas Šio išradimo esmės aprašyme, o ypač jo (a)-(f) dalyse ir ten cituojamuose šaltiniuose.

Megakariocitopoetiniai baltymai, aprašyti šiame išradime, gali būti naudojami vieni arba kombinuojant juos su kitais citokinais, hemopoetinais, interleukinais, augimo faktoriais arba antikūnais, gydant minėtus susirgimus. Taigi, šie aprašyti komponentai gali būti naudojami kartu su kitais trombopoetini aktyvumą turinčiais baltymais arba peptidais, tarp jų G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, IL-1, IL-3, eritropoetinu (EPO), kit-ligandu, IL-6 ir IL-11.

Megakariocitopoetiniai baltymai, aprašyti šiame išradime, sumaišomi su nešikliais, tinkančiais vaistinių preparatų gamybai. Tokia vaistinė forma gali būti naudojama intraveninėms injekcijoms arba inhaliacijoms per nosį arba plaučius. Ši vaistinė forma taip pat gali būti suleidžiama po oda arba parenteraliniu būdu. Paruoštas nuolatiniam vartojimui, šis preparatas turi būti nepirogeniškas, ištirpintas tinkamame injekcijoms tirpale su atitinkamu pH, tam tikro izotoniškumo bei stabilumo. Šios sąlygos gerai žinomos šios srities specialistams. Trumpai tariant, šiame išradime aprašytų komponentų vaistinės formos yra paruošiamos vartojimui arba saugojimui, i atitinkamai išgrynintus komponentus pridedant fiziologiškai priimtinų nešiklių arba stabilizatorių. Šios medžiagos yra netoksiškos, vartojant jas reikiamomis dozėmis, o į jų sudėtį įeina buferinių tirpalų komponentai, tokie kaip fosfatai, citratai,

150 acetatai arba kitokios organinių rūgščių druskos; antioksidantai, tokie kaip askorbino rūgštis; mažo molekulinio svorio (mažiau nei 10 amino rūgščių liekanų) peptidai, tokie kaip poliargininas; baltymai, tokie kaip serumo albuminas, želatina arba imunoglobulinai; hidrofiliniai polimerai, tokie kaip polivinilpirolidinonas; amino rūgštys, tokios kaip glicinas, gliutamatas, aspartatas, argininas; monosacharidai, disacharidai ir kiti angliavandeniai, tarp jų celiuliozė arba jos dariniai, gliukozė, manozė arba dekstrinai; chelatiniai agentai, tokie kaip EDTA; sacharidai, tokie kaip manitas arba sorbitas, jonai, tokie kaip natrio jonai, ir/arba nejoninės paviršiaus aktyvios medžiagos, tokios kaip Tween, Puronics arba polietilenglikolis.

Apie 0,5-500 mg megakariocitopoetinio baltymo arba šių baltymų mišinio (tai gali būti jų rūgštinė, šarminė forma arba vaistinei formai tinkama druska) sumaišoma su fiziologiškai priimtinu nešikliu, užpildu, stabilizatoriumi, konservantu ir t.t., kaip įprasta vaistų gamybos praktikoje. Aktyvaus komponento kiekis turi atitikti reikiamą dozę.

Sterilūs tirpalai injekcijoms paruošiami taip, kaip įprasta farmacijos praktikoje. Pavyzdžiui, aktyvusis komponentas ištirpinamas arba suspenduojamas vandenyje arba natūraliame augaliniame aliejuje, pavyzdžiui, sezamo, riešutų arba medvilnės sėklų aliejuje arba sintetinėse riebiosiose rūgštyse, tokiose, kaip etilo oleatas ar panašiose. Buferinės medžiagos, konservantai, antioksidantai ir kt., gali būti irgi pridedami, kaip įprasta farmacinėje praktikoje.

Kad būtų palaikoma pastovi preparato koncentracija, naudojamos pusiau pralaidžios matricos iš kietų hidrofobinių polimerų, kurie suformuoja mikrokapsules su ten esančiu polipeptidu. Tokių pusiau pralaidžių membranų pavyzdžiai gali būti poliesteriai, hidrogeliai (pvz., poli(2-hidroksietimetakrilatas), kaip aprašyta

151

Langer ir kt., J. Biomed. Mater. Res. , 15:167-277 [1981] ir Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982] arba polivinilalkoholis) , o taip pat poliaktidai (JAV patentas Nr. 3773919, EP 58481), L-gliutamino rūgšties ir gama-etil-L-gliutamato kopolimerai (Sidman ir kt., Biopolymers, 22:547-556 [1983]), nesuyrantis etilenvinilacetatas (Langer ir kt. , supra), suyrantys pieno rūgšties-glikolio rūgšties kopolimerai, tokie kaip Lupron Depot™ (mikro-rutuliukai iš pieno rūgšties10 glikolio rūgšties kopolimero ir leuprolido acetato) , ir poli-D-(-)-3-hidroksibutiro rūgšties (EP 133988).

Jeigu polimerai, tokie kaip etilenvinilacetatas ir pieno rūgšties-glikolio rūgšties kopolimerai, gali atpalaiduoti baltymo molekules daugiau kaip 100 dienų, kai kurie hidrogeliai atpalaiduoja baltymus trumpesnį laiką. Kai baltymas, uždarytas į kapsulę, išbūna organizme ilgą laiką, jis gali denatūruoti arba agreguoti, veikiamas drėgmės 37°C temperatūroje, ir dėl to gali netekti biologinio aktyvumo arba gali pasikeisti jo imunogeninės savybės. Priklausomai nuo šių pokyčių mechanizmo turi būti pasirenkama baltymo stabilizavimo strategija. Pavyzdžiui, jeigu vyksta agregacija dėl tarpmolekulinio S-S-ryšio susiformavimo, stabilizaciją galima atlikti, modifikuojant sulfhidrilines liekanas, liofilizuojant preparatą iš rūgštaus tirpalo, kontroliuojant drėgmę, naudojant tam tikrus priedus ir kuriant specifines polimerinių matricų kompozicijas .

Norint palaikyti pastovią megakariocitopoetinio baltymo koncentraciją, taip pat galima naudoti liposo30 mose uždarytą megakariocitopoetini baltymą. Liposomos su jose uždarytu megakariocitopoetiniu baltymu paruošiamos šiais metodais: DE 3218121; Epstei ir kt., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 82:3688-3692 [19851; Hwang ir kt . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 [1980];

EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; EP 142641;

152 paraiška Japonijos patentui 83-118008; JAV patentai Nr. 4485045 ir 4544545 ir EP 102324. Paprastai liposomos yra mažos (apie 200-800 A) , vienasluoksnės, ir jų sudėtyje būna daugiau nei 30 mol. procentų cholesterolio - tikslesnės proporcijos pasirenkamos taip, kad būtų optimalus megakariocitopoetinio baltymo terapinis efektas.

Dozę turi nustatyti gydantis gydytojas, atsižvelgdamas i įvairius faktorius, galinčius turėti įtakos vaistų veikimui - ligos ūmumą ir tipą, kūno svorį, lyti, dietos laikymąsi, injekcijų laiką ir dažnų, kitų medikamentų vartojimą, o taip pat ir kitus klinikinius faktorius. Paprastai dienos norma yra 0,1-100 ųg/kg kūno svorio. Optimali dozė yra 0,1-50 ųg/kg kūno svorio. Optimaliausia pradinė dozė yra 1-5 ųg/kg per dieną. Dozės yra panašios kaip ir kitiems citokinams, ypač G-CSF, GM-CSF, ir EPO. Terapiškai efektyvios dozės gali būti nustatomos in vitro arba in vivo metodais.

PAVYZDŽIAI

Tikimasi, kad šio aprašymo ir iliustracijų pakankama tam, kad bet kuris specialistas išsamiai atkartotų šį išradimą. Pateikiami darbiniai pavyzdžiai atskleidžia optimalius išradimo variantus, bet neapriboja išradimo.

PAVYZDYS 1

Dalinai išgrynintas kiaulės mpl ligandas

Surenkama normalių ar kiaulių su aplastine anemija trombocitais neturtinga plazma. Kiaulių plazma padaroma aplastine, kiaules apšvitinant 900 cGy visam svoriui, spindulisvimo šaltiniu naudojamas 4 mEV linijinis greitintuvas. Apšvitintoms kiaulėms atliekamas cerazolino injekcijos i raumenis 6-8 dienas. Po to visas jų kraujas surenkamas, esant pinai anestezijai, [ridėdama

153 heparino ir centrifuguojama, esant 1800g, 30 minučių; taip gaunama plazma be trombocitų. Megakariocitus stimuliuojančio aktyvumo maksimumas būna po 6 dienų po apšvitinimo.

Į aplastinę kiaulių plazmą, gautą iš apšvitintų kiaulių, pridedama iki 4M NaCl ir maišoma 30 min. kambario temperatūroje. Gautos nuosėdos pašalinamos centrifuguojant (3800 aps/min) centrifūgoje Sorvall RC3B, supematantas užnešamas ant kolonos su PhenylToyopearl (220 ml), nulygsvarintos lOmM Na fosfatiniu buferiniu tirpalu, i kurį pridėta iki 4M NaCl. Kolona praplaunama tuo pačiu buferiniu tirpalu, kol A₂₈₀ tampa mažesnis, nei 0,05, baltymai eliujuojami dH₂O. Eliujuotų baltymų piko frakcija praskiedžiama dH₂O iki 15 mS laidumo ir užnešamas ant Blue-Sepharose kolonėlės (240 ml) , nulygsvarintos PBS. Kolonėlė praplaunama penkiais kolonos tūriais PBS ir penkiais kolonos tūriais lOmM (pH 7,4) Na fosfatiniu buferiniu tirpalu, i kurį pridėta 2 M karbamido. Baltymai eliujuojami 10 mM (pH 7.4) natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu, į kurį pridėta 2M urėjos ir 1M NaCl. Į apjungtas eliuoto baltymo frakcijas pridedama 0,01% oktilglukozido (n-oktilβ-D-gliukopiranozido) ir po ImM EDTA ir Pefabloc (Boehinger Mannheim) ir sorbuojama ant tandemiškai sujugto CD4-IgG (Capton, D. J. et ai., Nature, 337:525-531 [1989]) ir mpl-IgG Ultralink (Pierce) kolonėlių (žiūr. žemiau). CD4-IgG (2 ml) kolonėlė pašalinama, kai mėginys užnešamas ir mpl-IgG (4 ml) kolonėlė praplaunama po 10 kolonėlės tūrių PBS ir PBS su 2 M NaCl, ir sorbuoti baltymai eliujuojami su 0,1 M glicino-HCl tirpalu, pH 2,25. Frakcijos surenkamos į 1/10 frakcijos tūrio 1 M Tris-HCl buferinį tirpalą (pH 8,0) .

Eliujuotos frakcijos analizuojamos SDS PAGE (420%, Novex gel) redukuojančiose sąlygose (Fig. 5). Išryškintų sidabru baltymų intensyvios juostos atitinka

154

66000, 55000, 30000, 28000 ir 14000 molekulines mases. Tam, kad būtų galima nustatyti, kurie baltymai stimuliuoja Ba/F3-mpl ląstelių kultūrą, šie baltymai buvo eliujuoti iš SDS PAGE gelio, kaip aprašyta Pavyzdyje 2.

Ultralink afininė kolonėlė 10-20 mg mpl-IgG ar CD4-IgG PBS tirpale buvo prisiuvama prie 0,5 g Ultralink sorbento (Pierce) pagal gamintojo aprašymą.

mpl-IgG konstravimas ir ekspresija Chimerinė molekulė, kurioje yra visas ekstraląstelinis žmogaus mpl domenas (amino rūgščių liekanos 1491) ir žmogaus IgGl molekulės F_c regionas, ekspresuojama 293 ląstelių linijoje. kDNR fragmentas, koduojantis žmogaus mpl amino rūgščių liekanas nuo 1 iki 491, gaunamas iš žmogaus megakariocitų CMK ląstelių kDNR bibliotekos panaudojus PCR, ir po to sekvenuoj amas. Clal skėlimo sritis buvo prijungiama 5' gale, BstEII skėlimo sritis - 3' gale. Šis fragmentas buvo klonuojamas prieš IgGI F_c koduojantį regioną Į Bluescript vektorių tarp Clal ir BstEII skėlimo sričių po dalinio PCR produkto suskaldymo su BstEII, nes dvi kitos BstEII skėlimo vietos yra koduojančioje ekstraląstelini mpl domeną DNR. BstEII skėlimo vieta buvo įvedama į mpl PCR produkto 3' galą, tam, kad F_c sritis būtų tame pačiame rėmelyje kartu su mpl ekstraląsteliniu domenu. Ši konstrukcija buvo subklonuota į pRK5-tkneo vektorių tarp Clal ir Xbal skėlimo sričių ir transfekuota į žmogaus embrioninių inkstų ląstelių 293 liniją kalcio fosfatiniu metodu. Ląstelės buvo auginamos selektyvioje terpėje su 0,4 mg/ml G418 ir išaugę individualūs klonai buvo atskiriami. mpl-IgG ekspresija atskirtuose kiemuose buvo nustatyta naudojant žmogaus F_c specifinę ELISA. Geriausiai besiekspresuoj antis klonas produkavo 1 2 mg/ml mpl-IgG.

155

Ba/F3 mpl P ekspresuoj ančios ląstelės kDNR, atitinkanti visą žmogaus mpl P koduojančią sritį, buvo klonuota į pRK5-tkneo vektorių, kuris buvo vėliau linearizuotas NotI ir transfekuotas į IL-3 priklausomų Ba/F3 ląstelių liniją elektroporacijos būdu (lxl0⁷ ląstelių, 9605F, 250 V) . Po trijų dienų buvo pradėta transfekantų atranka, naudojant 2 mg/ml G418. Ląstelės buvo atrinktos bendrai arba klonuotos limituojančių skiedimų metodu 96 šulinėlių plokštelėse. Atrinktos ląstelės auginamos RPMI terpėje su 15 % FBS, 1 mg/ml G418, 20 mM glutamino, 10 mM HEPES ir 100 gg/ml Pen-Strep. mpl P ekspresija atrinktuose klonuose buvo nustatyta FACS analize, naudojant polikloninius triušio anti-mpl P antikūnus .

Ba/F3 mpl ligando nustatymas mpl ligando nustatymas pavaizduotas Fig. 2. mpl ligando nustatymui iš įvairių šaltinių mpl P Ba/F3 ląstelės buvo augintos be IL-3 24 valandas, esant 5xl0⁵ląstelių viename ml inkubatoriuje, prisotintame vandens garais, 37°C temperatūroje, paduodant orą su 5% CO2. Po auginimo be IL-3 ląstelės buvo perkeliamos į 96 šulinėlių plokšteles, esant 50000 ląstelių 200 μΐ terpės, pridedama arba nepridedama praskiestų mėginių ir kultivuojama 24 valandas CO2^_inkubatoriuj e. 20 μΐ beseruminės RPMI terpės, kurioje yra 1 ųCi ³H-timidino, buvo pridedama į kiekvieną šulinėlį ir laikoma 6-8 valandas. Ląstelės buvo surenkamos ant 96 šulinėlių GF/C filtro plokštelių ir praplaunamos 5 kartus vandeniu. Radioaktyvumas buvo įvertintas pridėjus 40 μΐ scinciliacinio skysčio (Microscint 20) Packard Top Count skaitikliu.

156

PAVYZDYS 2

Išgrynintas kiaulės opi ligandas

Gel- filtracija

Vienodi afiniškai išgryninto mpl ligando (6 frakcija eliujuota nuo mpl-IgG kolonėlės) ir 2 kartus sukoncentruoto Laemmli pavyzdžio buferinio tirpalo tūriai buvo sumaišomi kambario temperatūroje be redukuojančio agento ir nedelsiant užnešami ant Novex 4-20 % poliakrilamidinio gelio. Mėginys nebuvo kaitinamas. Kontrole buvo naudojamas pavyzdžio buferinis tirpalas be ligando. Elektroforezė buvo vykdoma 4-6°C temperatūroje, esant 135 V Įtampai, maždaug 2¼ valandas. Elektroforetinis buferinis tirpalas elektroforezės pradžioje buvo kambario temperatūros. Gelis buvo išimamas iš elektroforezės aparato ir nuo gelio nuimama viena plokštelė.

Gelio replika buvo padaroma ant nitroceliuliozės tokiu būdu: gabalėlis nitroceliuliozės membranos buvo sudrėkinamas distiliuotu vandeniu ir atsargiai uždedamas ant gelio viršaus taip, kad po membrana neliktų oro burbulėlių. Nitoceliuliozinė membrana ir gelis pažymimi kad nudažytą membraną būtų galima vėl tiksliai uždėti ant gelio. Maždaug po 2 minučių nitroceliuozinė membrana buvo atsargiai nuimama, gelis įdedamas į plastikini maišelį ir padedamas į šaldytuvą. Nitroceliuliozinė membrana buvo ryškinama Bio-Rad baltymų dažymo auksu reagentų rinkiniu, pirmiausia purtant membraną tris kartus po 10 ml 0,1 % Tween 20 +0,5 M

NaCl +0,1 M Tris-HCl buferiniame tirpale (pH 7,5) apytikriai po 45 minutes, po te tris kartus praplaunama 10 ml distiliuoto vandens po 5 minutes. Dažymo auksu mišinys buvo užpilamas ir paliekama ryškintis, kol standartinių baltymų juostos tampa matomos. Gelio replika po to- praplaunama vandeniu, uždedama, sutapatinus žymes, ant maišelyje suvynioto poliakrilamidinio

157 gelio. Novex standartinių baltymų juostų pozicijos buvo pažymėtos ant gelio ir nubrėžiamos gelio pjaustymo linijos. Nitroceliuoliozinė membrana ir plastikinis maišelis nuo gelio nuimami, gelis supjaustomas pagal pažymėtas linijas aštriu peiliuku. Pjūviai padaromi kiek ilgesni nei mėginių takelių plotis, kad nudažius likusiąją gelio dalų, būtų galima tiksliai nustatyti išpjautos juostelės poziciją. Kai supjaustyto gelio gabaliukai nuimami, likusi gelio dalis nudažoma sidabru, ir pamatuojamos supjaustymo linijų ir standartinių baltymų atstumai nuo starto pozicijos. Pagal Novex standartus nustatomos išpjautų gelio juostelių pozicijas atitinkančios molekulinės masės.

Dvylika gelio gabalėlių buvo įdedama į dviejų BioRad 422 modelio elektroeliutorio kiuvetes. Kiuvetėse buvo naudojami membraniniai kamštukai su 12-14 kD pralaidumu. Elektroeliucij ai buvo naudojamas eliucijos buferinis tirpalas: 50mM amonio bikarbonato + 0,05 % SDS (pH apie 7,8). Prieš naudojimą vienas litras šio buferinio tirpalo buvo vieną valandą išlaikomas 4-6°C temperatūroje. Eliucija buvo vykdoma šaltame kambaryje, esant 10 mA srovei vienai kiuvetei (pradinė įtampa 40 V) ir palaikant 4-6°C temperatūrą. Elektroeliucij a trukdavo apie 4 valandas. Kiuvetės atsargiai buvo išimamos ir viršuje esantis tirpalas buvo nusiurbiamas pipete. Eliucijos kamera buvo išimama ir tirpalas, esantis membranos dangtelyje buvo nusiurbiamas Pipetmanu ir saugomas. Po 50 μΐ išgryninto vandens buvo įpilama į membranų dangtelius, supurtoma, kol visi SDS kristalai ištirps. Šie tirpalai buvo prijungiami prie pirmųjų tirpalų. Bendri eliucijos tirpalų tūriai buvo po 300 - 500μ1 vienam gelio gabalėliui. Mėginiai buvo dializuojami supylus į lOmm Spectrapor 4 dializės žarneles, kurių pralaidumas - 12 - 14 kD, prieš išgrynintą vandeni kelias valandas. Po to mėginiai buvo dializuojami per naktį 4-6°C temperatūroje prieš 6:·η ml (6 mė158 giniams) fosfatinio buferinio fiziologinio tirpalo (PBS yra apytikriai 4 mM kalio). Buferinis tirpalas buvo pakeičiamas kitą rytą ir dar dializuojama 2,5 valandos. Mėginiai buvo išimami iš dializės maišelių ir supilami į mikrocentrifūginius mėgintuvėlius. Mėginiai buvo išlaikomi vieną valandą lede, po to centrifūguojami, esant 14000 aps/min, 4 minutes. Supernatantai buvo praskiedžiami PBS ir juose buvo nustatomas mpl ligando aktyvumas. Likę mėginiai buvo užšaldomi -70°C temperatūroje .

PAVYZDYS 3

Kiaulės mpl ligando mikrosekvenavimas Šešta nuo mpl-IgG afininės kolonėlės frakcija (2,6 ml) buvo koncentruojama Microcon-10 kiuvetėje (Amicon). Tam, kad būtų išvengta mpl ligando sorbcijos Microcon kiuvetėje, membrana buvo praplaunama 1 % SDS tirpalu ir pridedama 5μ1 10% SDS tirpalo į 6 frakcijos mėginį. Pavyzdžio buferinis tirpalas, du kartus sukoncentruotas (20 μΐ) , buvo įpilamas į 6 frakcijos Microcon koncentratą (20 μΐ) ir bendras (40 μΐ) mišinys buvo užnešamas į vieną 4-20 % gradientinio poliakrilamidinio gelio (Novex) takelį. Elektroforeze buvo atliekama pagal Novex aprašymą. Prieš elektroblotingą gelis buvo nulygsvarinamas 5 minutes 10 mM 3-(cikloheksilamino)-1propansulfo rūgšties (CAPS) buferiniame tirpale, pH 11,0, kuriame buvo 10% metanolio. Elektroblotingas buvo vykdomas 45 minutes su Immobilon-PSQ membranomis (Millipore), esant 250mA pastoviai srovei Bio-Rad TransBlot pernešimo kiuvetėje (32). PVDF membrana buvo ryškinama su 0,1% Coomassie Blue 40% metanolio, 0,1% acco rūgšties tirpale 1 minutę, blukinamas 2-3 minutes 10% acto rūgšties ir 50% metanolio tirpale. Vieninteliai matomi baltymai 18000 - 35000 D molekulinės masės srityje buvo 30000, 28000 ir 22000 D molekulinės masės.

159

30, 28 ir 22 kD molekulinės masės juostos buvo naudojamos baltymų sekvenavimui. Automatinis baltymų sekvenavimas buvo atliekamas 470A modelio Applied Biosystem sekvenatoriumi su sujungtu PTH analizatoriumi.

Sekvenatorius buvo modifikuotas taip, kad būtų galima naudoti 80-90% mėginio (Rodriguez, J. Chomatogr., 350: 217-225 [1985]). Į tirpiklį A buvo pridedama acetono (~12 μΐ/ΐ) UV detekcijos subalansavimui. Baltymai po elektroblotavimo buvo sekvenuojami Blott strypuose.

Eliucijos pikai buvo integruojami naudojant Justice Innovation duomenų apdorojimo programą ir Nelson Analytical 970 keitiklį. Sekų analizė buvo atliekama naudojant VAX 5900 (Henzel et ai., J. Chromatogr., 404:4152 [1987]). Baltymų N galo amino rūgščių liekanų sekos (naudojant vienos raidės kodus, abejotinas amino rūgščių liekanas pažymint skliausteliuose) ir gautos medžiagos kiekiai (laužtiniuose skliausteliuose) pateikti Lentelėj e 2'.

Lentelė 2’ mpl ligando N galo amino rūgščių liekanų sekos

30 kD [1.8 pmol]
15 10 15	20	25
(S)PAPPA(C)DPRLLNKLLRDD	(H/S)VLH(G)RL	(SEQ	ID	Nr.	30)
28 kD [0,5 pmol]
1 5 10 15 20	25
(S)PAPPAXDPRLLNKLLRDD(H	) VL (H) GR		(SEQ	ID	Nr.	31)
18-22 kD [0,5 pmol]
1 5 10
XPAPPAXDPRLX(N)(K)			(SEQ	ID	Nr.	32)

PAVYZDYS 4

Megakariocitopoezės suspensinėje ląstelių kultū25 roję tyrimas

Žmogaus · periferinės kamieninės ląstelės (PSC) (išskirtos iš savanorių pacientų) buvo atskiestos 5 kartus IMDM terpėje (Gibco) ir centrifuguotos 15 min. kambario temperatūroje 800xg. Ląstelės buvo suspen160 duotos IMDM, užneštos ant 60% Percoll'o (1,077 g/ml tankio) (Pharmacia) ir centrifuguotos 800xg 30 min. Mažo tankio mononuklearinės ląstelės, sukoncentruotos tarp skirtingo tankio sluoksnių, buvo nusiurbtos, praplautos 2x IMDM terpe, suspenduotos(l-2xl0⁶ ląstelių/ml) IMDM terpėje su 30% FBS ir išpilstytos po 1 ml į 24 šulinėlių plokštelę audinių kultūrai (Costar) . APP arba APP be mpl ligando buvo pridėta iki 10% ir kultūros buvo auginamos 12-14 dienų 37°C temperatūroje inkubatoriuje, prisotintame vandens garų ir 5% CO₂. Kultūros taip pat buvo auginamos su 10% APP ir 0,5 ųg mpl-lgG, kurie buvo pridėti 0, 2 ir 4 dieną. APP buvo.atskirta nuo mpl ligando, praleidžiant per mpl-lgG afininę kolonėlę.

Megakariocitopoezės įvertinimui šiose suspensinėse kultūrose buvo naudojama Solberg et ai. metodo modifikacija, panaudojant radioaktyviu izotopu žymėtus pelės IgG monokloninius antikūnus (HP1-1D) prieš GPIIbIII_a(gautus iš Dr.Nichols'o, Mayo klinika). ΙΟΟμς HP1-1D (žiūr. Grant, B. et ai., Blood 69:1334-1339 [1987]) buvo žymėta lmCi Na¹²⁵J naudojant Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) pagal gamintojo instrukcijas. Žymėtas HP1-1D buvo laikomas PBS su 0,01% oktil-gliukozido. Tipiškas specifinis radioaktyvumas buvo l-2xl0⁶cpm/ųg (>95% po precipitacijos 12,5% trichloracto rūgštimi).

Kiekvienas eksperimento taškas suspensinėje kultūroje buvo nustatinėjamas trimis pakartojimais. Po 12-14 dienų kultivavimo po 1 ml ląstelių suspensijos buvo pernešama į 1,5 ml Ependorf mėgintuvėlius ir centrifūguojama 10 min. 800xg kambario temperatūroje. Gautos ląstelių nuosėdos buvo suspenduojamos 100 μΐ PBS su 0,02% EDTA ir 20% veršiuko serumo. 10 ng ¹²⁵I-HP1-1D, ištirpinto 50 μΐ analizės buferinio tirpalo, buvo pridedama prie suspenduotų ląstelių ir inkubuojama

161 min. kambario temperatūroje (KT), retkarčiais supurtant. Po to ląstelės buvo nusodinamos, centrifuguojant 10 min. 800xg KT ir praplaunamos 2x analizės buferiniu tirpalu. Ląstelių nuosėdų radioaktyvumas buvo matuojamas 1 min. gama skaitiklyje (Pacard). Nespecifinė sąveika buvo nustatoma, pridedant 1 ųg nežymėto HP1-1D, 60 min. prieš įdedant žymėto HP1-1D. Specifinė sąveika buvo nustatoma kaip skirtumas tarp viso prisijungusio ¹²⁵J-HP1-1D radioaktyvumo ir radioaktyvumo, esant nežymėto HP1-1D pertekliui.

Pavyzdys 5

Oligonukleotidiniai PCR pradmenys

Pagal 30 kD, 28 kD ir 18-22 kD baltymų N galo amino rūgščių liekanų sekas buvo susintetinti išsigimę oligonukleotidų pradmenys polimerazinei grandininei reakcijai (PCR) (žiūr. Lentelę 4). Buvo susintetinti dviejų tipų išsigimę pradmenys: teigiamas 20 nukleotidų pradmuo, koduojantis 2-8 amino rūgščių liekanas (mpl 1) ir antisensinis 21 nukleotido pradmuo, komplementarus 18-24 amino rūgščių liekanas koduojančiai sekai (mpl 2).

Lentelė 4

Išsigimusių oligonukleotidų pradmenys mpl 1: 5' CNN GCN CCN CCN GCN TGY GA 3 ' (2048 - išsigimimo laipsnis) mpl 2: 5' NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC 3 ’ (2048 - išsigimimo laipsnis) (SEQ ID Nr.: 35) (SEQ ID Nr.: 36)

Kiaulės genominė DNR, išskirta iš periferinio kraujo limfocitų, buvo naudojama kaip matrica PCR. 50 μΐ reakcijos mišinyje buvo: 0,8ųg kiaulės genominės DNR 10 mM Tris-HCl (pH 8,3) tirpale, 50 mM KC1, 3 mM MgCl2, 100 ųg/ml BSA, 400 μΜ dNTP, po 1 μΜ kiekvieno išsigimusio pradmens ir 2,5 vieneto Tag polimerazės. Pradinis matricos denatūravimas buvo atliekamas 94°C

162 temperatūroje 8 minutes, po to sekė 35 ciklai išlaikymo po 45 sekundes 94°C, 1 min. 55°C ir 1 min. 72°C temperatūrose. Paskutinis ciklas buvo iki 10 min. 72°C temperatūroje PCR produktai buvo atskiriami elektoforeze 12% poliakrilamidiniame gelyje ir vizualizuojami su etidžio bromidu. Buvo tikimasi, kad, jei amino rūgščių liekanų seka baltymo N gale koduojama vienu egzonu, tai taisyklingas PCR produktas turi būti 69 bazių porų (bp) ilgio. Tokio dydžio DNR fragmentas buvo eliujuotas iš ge10 lio ir subklonuotas i vektorių pGEMT (Promega) . Trijų klonų sekos yra pateiktos žemiau Lentelėje 5.

Lentelė 5.

69bp kiaulės genominės DNR fragmentai gemT3

5'CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 3'GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACT

TGACCACGTT CAGCACGGC [69bp] (SEQ ID Nr.: 37)

ACTGGTGCAA GTCGTGCCG (SEQ ID Nr.: 38) gemT7

5'CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 3'GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGAAGCACT

CGACCACGTC CATCACGGC [69bp] (SEQ ID Nr.: 39)

GCTGGTGCAG GTAGTGCCG (SEQ ID Nr.: 40) gemT9

PRLLNKLL R (SEQ ID

Nr.: 32) ' CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG ' GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCACTGC

ATCATGTCTATCACGGT 3' (SEQ ID Nr.: 41)

TAGTACAGATAGTGCCA 5' (SEQ ID Nr.: 42)

PCR pradmenų pozicijos pavaizduotos pabraukiant bazes. Gauti rezultatai atitinka 30 kD, 28 kD ir 1822 kD baltymų N gale esančia amino rūgščių liekanų seka nuo 9 iki 17 amino rūgščių liekanos, ir tai patvirtina, kad šios sekos yar koduojamos vienu kiaulės DNR egzonu.

163

PAVYZDYS 6

Žmogaus mpl ligando genas

Remiantis duomenimis, pateiktais Pavyzdyje 5, genominės bibliotekos analizei buvo sukonstruotas ir susintetintas 45 monomerų dezoksioligonukleotidas, pavadintas pR45. Jo seka:

5'GCC GTG AAG GAC GTG GTC GTC ACG AAG CAG TTT ATT TAG GAG TCG 3' (SEQ ID Nr. : 28)

Šis oligonukleotidas, pažymėtas ³²P naudojant (γ³²Ρ)—ATP ir T4 kinazę, buvo naudojamas žmogaus genominės DNR bibliotekos, esančios Zgeml2, analizei negriežtose hibridizacijos ir atplovimo sąlygose (žiūr. Pavyzdį 7). Teigiami klonai buvo surenkami, išgryninami ir analizuojami restikcijos ir Southern blotingo pagalba. Klonas Nr. 4 buvo atrinktas tolesnei analizei.

2,8 kb BamHI-XbaI fragmentas, kuris hibridizavosi su pR45, buvo subklonuotas į pBluescript SK- vektorių. Dalinis šio klono DNR sekvenavimas buvo atliktas naudojant pradmenis, specifinius kiaulės mpl ligando DNR sekai. Nustatyta seka patvirtino, kad išskirta DNR koduoja žmogaus mpl Ugandą, homologišką kiaulės mpl ligandui. Nustatyta Ecol restriktazės skėlimo vieta sekoje leido išskirti 390 bp EcoRI-XbaI fragmentą iš

2,8 kbp BamHI-XbaI fragmento ir subklonuoti šį fragmentą į pBluescript SK-.

Abi šio fragmento grandinės buvo sekvenuotos. Žmogaus DNR seka ir išvestinė amino rūgščių liekanų seka yra pateiktos Fig. 9 (SEQ ID Nr: 3 ir 4), galimos intronų vietos genominėje sekoje taip pat pažymėtos rodyklėmis ir nurodytas spėjamas egzonas (egzonas 3) .

Analizuojant išvestinę amino rūgščių liekanų seką, buvo patvirtinta, kad serinas yra pirma amino rūgščių liekana subrendusio mpl ligando sekoje, tai taip pat buvo nustatyta sekvenuojant amino rūgščių liekanų seką. Labai tikėtina, kad prieš pat šį kodoną (Ser) yra sig164 nalinė seka,dalyvaujanti subrendusio mpl ligando sekrecijoje. Ši signalinė seka, matyt, yra pertraukta ties 68 nukleotidų intronu.

Panašu, kad 3' kryptimi egzonas baigiasi ties 196 nukleotidų. šis egzonas koduoja 42 amino rūgščių liekanų seką, 16 iš kurių, matyt, yra dalis signalinės sekos, o 26 - subrendusio žmogaus mpl ligando.

PAVYZDYS 7

Visa. žmogaus mpl ligando kDNR

Remiantis žmogaus egzono 3 seka (Pavyzdys 6) buvo susintetinti du neišsigimę oligonukleotidai, atitinkantys 3' ir 5' egzono 3 galams (Lentelė 6)

LENTELĖ 6

Žmogaus kDNR neišsigimę PCR oligonukleotidų pradmenys

Tiesioginis pradmuo 5'GCT AGC TCT AGA AAT TGC TCC TCG TGG TCA TGC TTG T 3'	(SEQ	ID Nr.	43)
Atvirkštinis pradmuo 5' CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G 3'	(SEQ	ID Nr.	44)

Šie du pradmenys buvo naudojami PCR reakcijoje, naudojant kaip matricą DNR iš įvairių žmogaus kDNR bibliotekų arba 1 ng Qiuck Clone kDNR (Clonetech) iš įvairių audinių. Reakcijos sąlygos aprašytos Pavyzdyje 5. Laukiamas taisyklingo PCR produkto dydis turėjo būti 140 bp. Po PCR produktų analizės 12 % poliakrilamidiniame gelyje tokio dydžio fragmentas buvo aptiktas kDNR bibliotekose, išskirtose iš suaugusiųjų inkstų ir iš embrioninių inkstų ląstelių linijos 293, o taip pat kDNR, paruoštoje iš žmogaus embrioninių kepenų (Clonetech cat. Nr. 7171-1).

Embrioninių kepenų kDNR biblioteka, klonuota ZDR2 (Clonetech cat. Nr. HL1151x) , buvo analizuojama su ta pačia 45 oligonukleotidų seka, kuri buvo naudojama

165 analizuojant žmogaus genominę biblioteką. Olikonukleotidas buvo pažymėtas su (γ³²Ρ)-ΑΤΡ, naudojant T4 polinukleotidkinazę. Biblioteka buvo analizuojama švelniomis hibridizacijos sąlygomis. Filtrai buvo prehibridizuojami 2 valandas, po to hibridizuoj ami su mėginiais per naktį (16 vai.) 42°C temperatūroje 20% formamide, 5xSSC, 10x Denhardto buferiniame tirpale, 0,05M natrio fosfatiniame tirpale (pH 6,5), 0,1% natrio pirofosfato curpaie, prioejus ųg/mi ultragarsu paveiKtos lašišų spermos DNR. Filtrai buvo pamerkiami i 2xSCC ir vieną kartą praplaunami 0,5xSCC, 0,1% SDS 42°C temperatūroje. Filtrai buvo laikomi per naktį ant Kodak X-Ray fotojuostos. Teigiami klonai buvo surenkami, gryninami, ir įterptos sekos dydis buvo nustatomas PCR, klonuojant BamHI-XbaI flankuojančius oligonukleotidus i ZDR2 (Clonetech Cat. Nr. 6475-1). 5 μΐ fago suspensijos buvo naudojama kaip matricos šaltinis. Pradinė denatūracija buvo atliekama 94°C temperatūroje 7 minutes, po kurios sekė 30 amplifikaci jos ciklų (1 min. 94°C, 1 min 52°C ir 1,5 min. 52°C) Pabaigoje buvo išlaikoma 15 min. 72^cC temperatūroje. Klonas Nr. FL2b turėjo 1,8 kbp intarpą ir buvo atrinktas tolesnei analizei.

Plazmidė pDR2 (Clonetech, ZDR2 & pDR2 Cloning and Expresion system Library Protocol Handbook, p. 42), kurioje yra 1DR2 fago rankos, buvo sukarpoma, kaip aprašyta gamintojo instrukcijose (Clonetech, 1DR2 & pDR2 Cloning and Expresion system Library Protocol Handbook, p. 29-30) . Plazmidės pDR2-FL2b restrikcinė analizė su BamHI ir Xbal parodė, kad yra intarpe vidinė BamHI skėlimo vieta, apytikriai 650 pozicijoje. Skaldant plazmidę BamHI-XbaI, intarpas sukarpomas į du fragmentus, vienas yra 0,65 kbp, kitas - 1,15 kgp. DNR seka buvo nustatoma su trimis skirtingų klasių matricomis, 'gautomis iš plazmidės pDR2-FL2b. Dvigrandės plazmidinės DNR sekos analizė buvo atliekama ABI373

166 modelio automatiniu fluorescentiniu DNR sekvenatoriumi (Applied Biosystems, Foster City, California) pagal standartini analizės protokolą dažu žymėtiems didezoksinukleozidtrifosfatų terminatoriams (spalviniai terminatoriai) ir įprastus šokinėjančius pradmenis (Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:54635467 [1977]; Smith et ai., Nature, 321:674-679 [1986]). Polimerazinės grandininės reakcijos ampifikacijos būdu gautų plazmidės fragmentų tiesioginis sekvenavimas buvo atliekamas ABI373 sekvenatoriumi, naudojant Įprastinius pradmenis ir spalvinius terminatorius. Viengrandė matrica buvo gauta naudojant M13 Janus vektorių (DNASTAR, Ine., Madison, Wisconsin) (Burland et ai., Nucl. Acids Res., 21:3385-3390 [1993]). BamHI-XbaI (1,15 kbp) ir

BamHI (0,65 kbp) fragmentai buvo išskirti iš plzmidės pDR2-FL2b, galai buvo užpildomi su T4 DNR polimeraze, esant reakcijos mišinyje dezoksinukleotidams, ir subklonuojami į SmaI skėlimo vietą vektoriuje M13 Janus. Sekvenavimas buvo atliekamas pagal standartinį protokolą, naudojant dažu žymėtus M13 universalius ir atvirkštinius pradmenis, arba šokinėjančius pradmenis ir spalvinius terminatorius. Neautomatinis sekvenavimas buvo atliekamas su viengrande M13 DNR, naudojant šokinėjančius pradmenis ir standartini didezoksiterminavimo metodą (Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 [1977]), naudojant ³³P žymėtus α-dATP ir

Sekvenazę (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio) . DNR sekvenatorius buvo valdomas Seąuencher V2 . Ibl2 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan) . Žmogaus ML nukleotidų ir išvestinės amino rūgščių liekanų sekos pateiktos Fig. 1 (SEQ ID Nr.:l).

167

PAVYZDYS 8

Žmogaus mpl ligando (TPO) geno išskyrimas

Žmogaus genominės DNR TPO geno klonai buvo išskirti atliekant žmogaus genominės bibliotekos, esančios X-Geml2, analizę, panaudojant anksčiau aprašytą oligonukleotidu pR45 švelniom sąlygoms (žiūr. Pavyzdį 7) arba labai griežtomis sąlygomis, naudojant fragmentą, atitinkanti kDNR, koduojančio žmogaus mpl ligandą, 3' dalų (nuo BamHI skėlimo vietos iki 3' galo) . Buvo išskirti du persidengiantys 35 kbp lambda klonai. Buvo subklonuoti ir sekvenuoti du persidengiantys fragmentai (BamHI ir EcoRI), kuriuose yra pilnas TPO genas. Žmogaus geno 7 kbp ilgio genominėje DNR yra 6 egzonai (Fig. 14A, B ir C) . Prie visų egzonų/intronų ribų yra konsensinis motyvas, būdingas žinduolių genams (Shapiro, M. B., et ai., Nucl. Acids Res., 15:7155 [1987]). Egzone 1 ir egzone 2 yra 5' netransliuojamos sekos ir pirmąsias 4 signalinio polipeptido amino rūgščių liekanas koduojantys nukleotidai. Likusi sekretorinio signalo dalis ir pirmosios subrendusio baltymo 26 amino rūgščių liekanos koduojamos egzono 3 viduje. Visas C galo domenas ir 3' netransliuojamas galas, o taip pat į eritropoetiną panašaus domeno apie 50 amino rūgščių liekanų yra koduojama egzono 6 viduje. Keturios amino rūgščių liekanos, kurios pašalinamos, kaip pastebėta hML-2 (hTPO-2) baltymui, yra koduojamos 6 egzono 5' gale.

PAVYZDYS 9

Žmogaus mpl ligando (hML) laikinoji ekspresija

Siekiant subklonuoti pilno ilgio intarpą, esantį pDR2-FL2b plazmidėje, pastaroji buvo visiškai suskaldyta restriktaze Xbal, o po to ne visiškai suskaldyta restrikcijos endonukleaze BamHI. DNR fragmentas, ati168 tinkantis 1,8 kbp ilgio intarpą, buvo išgrynintas elektroforetiškai agaroziniame gelyje ir subklonuotas pRK5 plazmidėje (pRK5-hmp2 I) (pRK5 konstravimas pateiktas JAV patente Nr. 5258287) funkcionaliai sujungiant intarpą su akstyviausiuoj u citomegalo viruso promotoriumi. DNR iš konstrukto pRK5-hmp2 I buvo išskirta PEG metodu ir transfekuota į žmogaus embriono inkstų ląstelių liniją 293, auginamą Dulbecco modifikuotuoje Eagle terpėje (DMEM) su šiais priedais: mitybinis mišinys F-12, 20 mM HEPES (pH 7,4) ir 10 % embrioninio galvijų serumu. Ląstelės buvo transfekuotos kalcio fosfatiniu metodu, kaip aprašyta (Gorman, C. [1985] in DNR Cloning: A Practical Approach (Glover, D. M., ed.) Vol. II, pp. 143-190, IRL Press, Washington, D.C.). Po 36 valandų transfekuotų ląstelių supernatantų aktyvumai buvo analizuojami proliferacijos metodu (žiūr. Pavyzdį 1) . 293 linijos ląstelių, transfekuotų vien pRK vektoriumi, supernatantai nestimuliuodavo nei Ba/F3, nei Ba/F3-mp2 ląstelių proliferacijos (Fig. 12A) . Ląstelių, transfekuotų pRK5-hmp2l plazmidę, supernatantai neveikė Ba/F3 ląstelių, bet stipriai stimuliuodavo Ba/F3-mp2 ląstelių proliferaciją (Fig. 12A) . Tai Įrodo,kad ši kDNR koduoja fukcionaliai aktyvų žmogaus mpl ligandą.

PAVYZDYS 10

Žmogaus mpl ligando izoformos hML2, hML3 ir ŪML4

Siekiant nustatyti alternatyvias hML formas, buvo susintetinti pradmenys, atitinkantys kiekvieną sekos, koduojančios hML, galą. Šie pradmenys buvo panaudoti RT-PCR amplifikuoj ant suaugusio žmogaus kepenų RNR. Papildomai buvo sukonstruoti ir panaudoti vidiniai pradmenys, flankuoj antys pasirinktus regionus (žiūr. žemiau). Tiesioginis PCR produkto galų sekvenavimas parodė, kad yra viena seka, atitinkanti kDNR, išskirtos

169 iš žmogaus embrioninių kepenų bibliotekos, seką (žiūr. Fig. 1 [SEQ ID Nr.:l]). Tačiau pagal sekų, esančių prie EPO domeno C galo (PCR produkto viduryje), struktūrą buvo galima spręsti apie galimus spaisingo variantus, esančius šioje srityje. Kad būtų galima išskirti šiuos spaisingo variantus, suaugusio žmogaus kepenų kDNR buvo analizuojama PCR, naudojant minėtą sritį flankuojančius pradmenis, kurių sekos pateiktos Lentelėje 7.

LEKTELĖ 7

Žmogaus ML izoformų PCR pradmenys phmpllcdna.3el:

' TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG 3' (SEQ ID Nr.:45) pbx4.f2:

5'GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG 3' (SEQ ID Nr.:4 6)

PCR produktai buvo subklonuoti į M13. Individualių subklonų sekvenavimas parodė, kad egzistuoja mažiausiai trys ML izoformos. Viena iš jų, hML (taip pat žymima kaip hML₃₃₂) , yra ilgiausia forma ir atitinka seką, išskirtą iš embrioninių kepenų bibliotekos. Keturios žmogaus mpl ligando izoformų sekos, pradedant nuo ilgiausios (hML) ir baigiant trumpiausia (hML-4), yra pateiktos Fig. 11 (SEQ ID Nr.: 6, 8, 9, ir 10) .

PAVYZDYS 11

Žmogaus Mpl ligando izoformų ir pakeistų variantų hML2,hML3 ir hML(R153A, R154A) konstravimas ir tarpinė ekspresija

Izoformos hML2, hML3 ir pakeisti variantai hML(Rl53A, R154A) buvo konstruojami iš hML, naudojant rekombinantinę PCR techniką, aprašytą Russell Higuchi, in PCR Protocols, A guide to Methods and Applications, Acad. Press, M.A.Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky & T.J. White Editors.

Visų konstrukcijų išoriniai pradmenys yra pateikti Lentelėje 8, persidengiantys pradmenys pateikt i Lentelėj e 9.

170

LENTELĖ 8

Išoriniai pradmenys

Cla.FL.F2:

5'ATC GATATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G3' HMPLL-R:

5'GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3' (SEQ ID Nr.: 47) (SEQ ID Nr.:48)

LENTELĖ 9

Persidengiantys pradmenys

hML-2 : MLA4F: 5'CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC 3' MLA4R: 5'GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG 3'	(SEQ ID Nr.:49) (SEQ ID Nr.:50)
hML-3: MLA116+: 5'CTG CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT 3' MLA116-: 5'AAT CCA GAA GTC CTT TCC TCG GAG CAG 3'	(SEQ ID Nr.:51J (SEQ ID Nr.:52)
hML (R153A, R154A) : RR-KO-F: 5'CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC CCA C 3' RR-KO-R: 5'GTG GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG AGG G 3'	(SEQ ID Nr.:53) (SEQ ID Nr.:54)

Visos PCR amplifikacijos buvo atliktos su klonuota Pfu DNR polimeraze (Stratagene), šiomis sąlygomis: pradinė matricos denatūracija buvo atlikta 94°C tempe10 ratūroje 7 min., po to sekė 30 ciklų po 1 min. 94°C, 1 min. 55°C ir 1,5 min. 55°C. Paskutinis ciklas buvo pabaigiamas išlaikant 10 min. 72°C temperatūroje. Galutinis PCR produktas buvo suskaldytas Clal-Xbal, išrgynintas gelyje ir klonuotas į pRK5tkneo. 293 linijos ląstelės buvo transfekuotos įvairiais konsruktais, kaip aprašyta aukščiau, šių ląstelių supernatantas buvo tiriamas Ba/F3-mp_Z proliferacijos metodu. hML-2 ir hML-3 šiame tyrime neturėjo aktyvumo, hML(R153A, R154A) pasižymėjo panašiu aktyvumu kaip ir hML, tai parodo, kad skėlimas šioje dviejų bazinių amino rūgščių liekanų vietoje neturi įtakos aktyvumui (žiūr. Fig. 13).

171

PAVYZDYS 12

Pelės mpl ligando kDNR mML, mML-2 ir mML-3 mML kDNR išskyrimas

DNR fragmentas, atitinkantis visą žmogaus mpl ligando koduojamą regioną buvo gautas panaudojant PCR, išgrynintas gelyje ir pažymėtas atsitiktiniais pradmenimis, esant ³²P-dATP ir ³²P-dCTP. Šis mėginys buvo panaudotas analizuojant 10⁶ klonų iš pelės kepenų kDNR bibliotekos, klonuotos XGT10 (Clontech Cat Nr. ML3001a) . Replikos ant filtrų buvo gautos per naktį mėginius hibridizuojant 35 % formamide, 5xSSC, 10xDenharto buferiniame tirpale, 0,1 % SDS, 0,05 M natrio fosfatiniame buferiniame tirpale (pH 6.5), 0,1% natrio pirofosfato tirpale, esant 100 μg/ml apdorotos ultragarsu lašišos spermos DNR. Filtrai buvo praplaunami 2xSSC, po to praplaunami vieną kartą 0,5xSCC, 0,1% SDS 42°C temperatūroje. Hibridizacijai naudotas fagas buvo išgrynintas ir kDNR intarpai buvo subklonuoti į Eco R1 skėlimo vietą Bluescript SK- plazmidėje. LD klonas su

1,5 kbp intarpu buvo pasirinktas tolesnei analizei, abi grandinės buvo analizuojamos, kaip aprašyta aukščiau žmogaus ML kDNR atveju. Klono LD nukleotidų ir išvestinės amino rūgščių liekanų sekos yra pateiktos Fig. 14 (SEQ ID Nr.: 1 ir 11). Išvestinė subrendusio ML baltymo amino rūgščių liekanų seka iš šio klono yra iš 331 amino rūgščių liekanų ir žymima mML33i (ar mML-2 dėl nurodytų žemiau priežasčių). Žymus tiek nukleotidų, tiek ir amino rūgščių liekanų sekų identiškumas buvo nustatytas šių ML į EPO-panašiuose domenuose. Tačiau, kai buvo palygintos žmogaus ir pelių ML išvestines amino rūgščių liekanų sekos, buvo pastebėta keturių amino rūgščių liekanų (tarp 111 ir 114) delecija, kuri atitiko 12 nukleotidų deleciją (nuo 618 nukleotido), nustatytą tiek žmogaus (žiūr. aukščiau), tiek ir kiau172 lės (žiūr. žemiau) kDNR. Todėl buvo ištirti ir kiti klonai, siekiant nustatyti galimas pelių ML baltymo izoformas. Viename klone L7, turinčiame 1,4 kbp intarpą su išvestine 335 amino rūgščių liekanų seka, buvo prarastas tetrapeptidas LPLQ. Ši forma, matyt, yra visas pelės ML baltymas, ir pažymėtas mML arba mML₃₃5 . mML nukleotidų ir išvestinė amino rūgščių liekanų sekos pateiktos Fig. 16 (SEQ ID Nr.: 12 ir 13). L2 klonas taip pat buvo išskirtas ir sekvenuotas. Šiame klone buvo 116 nukleotidų delecija taip pat kaip ir hML3 sekoje, todėl buvo pažymėtas mML-3. Šių dviejų izoformų amino rūgščių liekanų sekų palyginimas yra Fig. 16.

Rekombinantinio mML ekspresija

Pelės ML ekspresijos vektorius buvo sukonstruotas taip pat kaip ir Pavyzdyje 8. Klonai, pažymėti mML ir mML-2, buvo subklonuoti į pRK5tkneo, žinduolių ekspresijos vektorių, kuris leidžia ekspresuoti baltymus kontruoliuojant ekspresiją CMV promotoriui ir SV40 poliadenilacijos signalui. Galutiniai ekspresijos vektoriai, mMLpRKtkneo ir mML2pRKtkneo, buvo laikinai transfekuoti į 293 linijos ląsteles kalcio fosfatiniu metodu. Po transfekcijos terpė buvo kondicionuojama penkias dienas. Ląstelės buvo palaikomos DMEM terpėje su didele gliukozės koncentracij a su 10 % embrioninio veršiukų serumo.

Pelės mpl (mmpl) ekspresija Ba/F3 ląstelėse.

Stabili ląstelių linija, ekspresuojanti c-mpl buvo gauta transfekuoj ant mmpl pRKtkneo vektoriumi taip pat, kaip ir žmogaus mpl atveju, aprašytu Pavyzdyje 1. Trumpai: ekspresijos vektoriumi (20 ųg, linijinis), kuriame yra pilna pelės mpl koduojanti seka, (Skoda, R. C., et ai., EMBO J., 12:2645-2653 [1993]) buvo transfekuojamos ląstelės Ba/F3 elektroporacijos būdu (5xl0⁶ląstelių, 250 V, 960 pF) , po to sekė selekcija pagal

173 atsparumą neomicinui su 2mg/ml G418. mpl ekspresija buvo įvertinama tėkmės citometriją, naudojant triušio antiserumą prieš pelės mpl-IgG. Ba/F3 ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpėje, kondicionuotoje WEHI-3B ląstelių (kaip IL-3 šaltinio). 293 ląstelių linijos, transfekuotos su mML ir mMl-2, supernatantas buvo analizuojamas su BA/F3 ląstelėmis, transfekuotomis su Tampi ir hmpl, aprašytu Pavyzdyje 1 būdu.

PAVYZDYS 13

Kiaulės mpl ligando kDNR pML ir pML-2

Kiaulės ML (pML) kDNR buvo išskirta naudojant RAČE PCR. Trumpai aprašant: oligodT pradmuo ir du specifiniai pradmenys buvo sukonstruoti remiantis kiaulės ML geno egzono seka, koduojančia baltymo, išskirto iš kiaulių aplastinio serumo, N galą. Buvo paruoštos kDNR iš aplastinių kiaulių Įvairių audinių. 1342 bp kDNR PCR produktas buvo aptiktas inkstuose ir subklonuotas. Keletas klonų buvo sekvenuoti ir surasta seka, koduojanti subrendusi kiaulės mpl ligandą (be pilnos signalinės sekos) . Buvo nustatyta, kad kDNR koduoja 332 amino rūgščių liekanų subrendusi baltymą, (pML₃₃₂) , jo seka pateikta Fig. 18 (SEQ ID Nr.: 9 ir 16).

Medodas:

pML ir kDNR išskyrimas.

Genominiai kiaulės ML geno klonai buvo išskirti tikrinant kiaulės genominę biblioteką, esančią EMBL3 (Clontech Ine.) su pR45. Biblioteka buvo tikrinama kaip aprašyta Pavyzdyje 7. Buvo atrinkta keletas klonų ir sekvenuotas egzonas, koduojantis amino rūgščių liekanų seką, identišką ML sekai. Kiaulės kDNR buvo gauta, naudojant modifikuotą RAČE PCR metodą. Buvo susintetinti du specifiniai ML pradmenys, remiantis kiaulės ML geno seka. Poliadenilinta iRNR buvo išskirta iš aplastinių kiaulių inkstų iš esmės taip, kaip aprašyta

174 aukščiau. kDNR buvo susintetinta atvirkštinės transkripcijos būdu su BamdT pradmeniu,

BamdT:

5'GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT3' (SEQ ID Nr.:55) nukreiptu į poliadenosino seką iRNR sekoje. Pirma PCR amplif ikaci j a (28 ciklai po 60 sek. 95°C, 60 sek. 58°C ir 90 sek. 72°C) buvo atliekama naudojant ML specifini h-tiesiogini-1 pradmenį h-tiesioginis-1:

5'GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT3' (SEQ ID Nr.:43) ir BAMAD pradmenį

BAMAD:

5'GACTCGAGGATCCATCG3' (SEQ ID Nr.:56)

100 ml reakcijos mišinio (50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 10 mM Tris pH 8.0, 0,2 mM dNTP su 0,05 V/ml Amplitaq polimeraze [Perkin Elmer Ine.]). PCR produktas buvo suskaldomas su Clal, ekstrahuoj amas fenolio-chloroformo mišiniu (1:1), išsodinamas etanoliu ir liguotjamas į 0.1 mg Bluescript SK- vektorių (Stratagene Ine.), kuris buvo suskaldomas su Clal ir Kpnl. Po 2 valandų inkubacijos kambario temperatūroje, vienas ketvirtadalis ligavimo mišinio buvo pridedamas i kitą PCR ciklą (22 ciklai aprašyti aukščiau), naudojant kitą specifini tiesioginį pradmenį tiesioginis-1 tiesioginis-1:

5'GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG3' (SEQ ID Nr.:57) ir T3-21 (oligonukleotidas , kuris jungiasi šalia poliklonavimo regiono Bluescript SK- vektoriuje):

5'CGAAATTAACCCTCACTAAAG3' (SEQ ID Nr.:58).

Gautas PCR produktas buvo suskaldytas Xbal ir Clal ir subklonuotas į Bluescript SK- vektorių. Buvo sekvenuota keletas nepriklausomų PCR reakcijų klonų.

Buvo identifikuota kita forma, pažymėta pML-2, koduojanti baltymą be keturių amino rūgščių liekanų (328 amino rūgščių liekanos) (žiūr. Eig. 21 [SEQ ID Nr.:21]). Lyginant pML ir pML-2 amino rūgščių liekanų

175 sekas, matome, kad šios sekos yra identiškos, iškyrus tai, kad paskutiniojoje nėra QLPP tetrapeptido, atitinkančio 111-114 liekanas (žiūr. SEQ ID Nr.:18 ir 21). Keturių amino rūgščių liekanų delecija aptinkama pelės, žmogaus ir kiaulės ML kDNR tose pačiose baltymų išvestinių amino rūgščių liekanų sekų vietose.

PAVYZDYS 14

Trombopoetino (TPO) poveikio trombocitų antigeno GPIIfrlIIa ekspresijos indukcijai CMK ląstelėse tyrimas

CMK ląstelės yra auginamos RPMI 1640 terpėje su 10% embrioninio veršiuko serumo ir lOmM gliutamino. Ląstelės prieš bandymą praplaunamos ir suspenduojamos (5xl0⁵ ląstelių/ml), beseruminėje GIF terpėje su 5mg/l jaučio insulino, 10mg/l apo-transferino ir įprastu mikroelementų kiekiu. Atitinkamai atskiestas TPO standartas arba tiriami pavyzdžiai po 100 μΐ įnešami į kiekvieną 96-šulinėlių plokščiadugnės plokštelės šulinėlį. Tada įnešama po 100 μΐ CMK ląstelių suspensijos, ir plokštelės inkubuojamos 48 valandas inkubatoriuje su 5% CO2 37°C temperatūroje. Po inkubacijos plokštelės centrifuguojamos penkias minutes 1000 aps./min. 4°C temperatūroje. Supernatantai išpilami ir į kiekvieną šulinėlį pridedama po 100 μΐ konjuguotų su FITC'u GPIIt,III_a monokloninių 2D2 antikūnų. Po vienos valandos inkubacijos 4°C temperatūroje, plokštelės vėl centrifuguojamos penkias minutes 1000 aps./min. Supernatantai su neprisijungusiais antikūnais išpilami ir šulinėliai praplaunami 200 μΐ 0,1% BSA-PBS tirpalo. Plovimas 0,1% BSA-PBS kartojamas tris kartus. Po to ląstelės analizuojamos naudojant standartinę vienparametrinę analizę, t.y. FASCAN aparatu matuojant santykini fluorescensijos intensyvumą.

176

PAVYZDYS 15

Trombopoetino (TPO) poveikio DAMI ląstelių endomitotiniam aktyvumui tyrimas 96-šulinėlių plokštelėse

DAMI ląstelės yra auginamos IMDM terpėje su 10% arklio serumo (Gibco), lOmM glutamino, lOOng/ml penicilino G ir 50 ųg/ml streptomicino. Prieš bandymą ląstelės yra praplaunamos, suspenduojamos (lxl0⁵ ląstelių/ml) , IMDM terpėje su 1 % arklio ir išpilstomos į 96-šulinėlių apvaliadugnes plokšreies.

Į DAMI ląstelių suspensiją plokštelėse pridedama po 100 μΐ TPO standarto arba tiriamų pavyzdžių ir inkubuojama 48 valandas inkubatoriuje su 5% C0₂ 37°C temperatūroje. Po inkubacijos plokštelės centrifūguojamos Sorvall 6000B centrifūgoje penkias minutes 1000 aps./min. 4°C temperatūroje. Supematantas išpilamas, o plokštelės du kartus praplaunamos 200 μΐ PBS su 0,1% BSA tirpalo. Ląstelės fiksuojamos, pridedant 200 μΐ atšaldyto 70 % etanolio-PBS, o po to resuspenduojama. Po 15 min. inkubacijos 4°C temperatūroje, plokštelės yra centrifuguojamos penkias minutes 2000 aps./min., supematantas išpilamas, o i šulinėlius Įnešama po 150 μΐ lmg/ml RNR'zės su 0,1 mg/ml propidžio jodido ir 0,05 % Tween-20. Po vienos valandos inkubacijos 37°C temperatūroje, tėkmėscitometrijos metodu matuojami DNR kiekio pakitimai. Poliploidija yra įvertinama pagal formulę:

(%ląst. esančių>G2+M/%ląst. esančių<G2+M) su TPO NPR = (%ląst. esančių >G2 + M/%ląst. esančių<G2+M) kontrolėj e

NPR - normalinis poliploidų santykis.

177

PAVYZDYS 16

Trombopoetino (TPO) in vivo nustatymas (Pelės trombocitų prisijungimo analizė)

Trombocitų produkcijos in vivo nustatymas, naudojant ³⁵S

Siekiant sukelti trombocitopeniją, C57BL6 linijos pelėms (gautos iš Charles River) į pilvo ertmę (IP) (diena 1) buvo suleidžiama 1 ml ožkos serumo prieš pelių trombocitus (6 ampulės) . 5 ir 6 dieną pelėms buvo suleidžiamos dvi injekcijos (IP) faktoriaus ar PBS, naudojamo, kaip kontrolė. 7 dieną buvo suleidžiama į veną 30pCi Na₂ ³⁵SO4 0,1 ml druskos tirpale, ³⁵S įsijungimo i cirkuliuojančius trombocitus procentas nuo suleistos dozės buvo nustatomas kraujo mėginiuose, paimtuose iš bandomųjų ir kontrolinių pelių. Trombocitų ir leukocitų radioaktyvumai buvo matuojami po to tiek pat laiko, paėmus kraują iš retro-orbitalinio sinuso.

PAVYZDYS 17

Trombopoetino (TPO) KIRĄ ELISA, įvertinant mpl-Rse.gD chimerinio receptoriaus fosforilinimą

Žmogaus mpl receptorius buvo atrastas Vigon et ai., PNAS USA, 89:5640-5644 (1992). Chimerinis receptorius, kurio sudėtyje yra ekstraląstelinis mpl receptoriaus domenas (ECD), transmembraninis (TM) ir viduląstelinis (ICD) Rse domenai (Mark et ai., J. of Biol. Chem., 269(14):10720-10728 [1994]) ir C galinis flag polipeptidas (pvz., Rse.gD), buvo naudojamas KIRĄ ELISA analizėje, aprašomoje šiame pavyzdyje. Schematinis analizės aprašymas pateiktas Pieš.30 ir 31.

(a) Sujungiančio agento paruošimas

Monoklonaliniai anti-gD (klonas 5B6) buvo pagaminti prieš peptidą iš Herpes simplex viruso glikoproteino D (Paborsky et ai., Protein Engineering 3(6):547178

553 [1990]). Išgrynintas preparatas buvo praskiedžiamas iki 3,0 mg/ml koncentracijos fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), pH 7,4 ir išpilstytas po 1,0 ml buvo saugomas -20°C temperatūroje.

(b) Antikūnių prieš fosfotiroziną paruošimas

Monokloniniai antikūnai prieš fosfotiroziną (klonas 4G10) buvo gautas iš ŪBI (Lake Placid,NY) ir biotinilinti, naudojant ilgos grandinės biotin-N-hidroksisukcinamidą (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH).

(c) Ligandas mpl ligandas buvo gautas rekombinantinių būdu, kaip aprašyta šiame išradime. Išgrynintas mpl ligandas buvo saugomas 4°C temperatūroje.

(d) Rse.gD nukleino rūgščių paruošimas

Sintetiniai dvigrandžiai oligonukleotidai buvo panaudoti atstatyti žmogaus Rse C galo 10 amino rūgščių liekanų (880-890) seką, kuri buvo prijungta prie papildomų 21 amino rūgščių liekanų, kuriose yra 5B6 epitopas ir stop kodonas. Lentelėje 10 pateikta sintetinė sulieto geno dalis.

Lentelė 10

Sintetinė dvigrandė žmogaus Rse sulieto geno dalis.

koduojanti grandinė: 5'-TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCC TCAAGATGGCTGATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCC TGTAGAAGCT-3'	(SEQ ID Nr.:59)
Nekoduojanti (anti-sense) grandinė 5'-AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTTGGA TCAGCCATCTTGAGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGC CCTTGCTGCA-3'	(SEQ ID Nr.:60)

Sintetinė DNR buvo liguojama su kDNR, koduojančia žmogaus Rse amino rūgščių liekanas nuo 1 iki 880 nukleotido, pradedant nukleotidų 2644 prie PstI skėlimo vietos publikuotoje žmogaus Rse kDNR sekoje (Mark et

179 ai., Journal of Biological Chemistry 269 (14):1072010728 [1984]) ir su ekspresijos vektoriaus pSV17.XD.LL polilinkerio HindlII skėlimo vieta (žiūr. Fig. 32 A-L; SEQ ID Nr.:22). Taip buvo sukonstruota ekspresinė plazmidė pSV.ID.Rse.gD. Trumpai charakterizuojant, ekspresijos plazmidėje yra dicistroninis pirminis transkriptas, kuriame yra seka, koduojanti DHFR, ribojama 5' splaisingo donoro ir 3' splaisingo akceptoriaus introno splaisingo srities, kurios eina po sekos, koduojančios Rse.gD. Visa (be splaisingo) informacinė seka turi DHFR, kaip pirmą atviro skaitymo rėmeli, todėl generuoja DHFR baltymą, o tai leidžia selekcijuonuoti stabilius transformantus.

(e) mpl-Rse.gD nukleino rūgščių paruošimas Ekspresijos plazmidė pSV.ID.Rse.gD, sukonstruota, kaip aprašyta aukščiau, buvo modifikuota i plazmidę pSV.ID.M.tmRd6, kurioje yra sekos, koduojančios žmogaus mpl ECD (amino rūgščių liekanos 1-491) sulietą su transmembraniniu domenu ir viduląsteliniu domenu Rse.gD (amino rūgščių liekanos 429-911). Buvo naudojami sintetiniai oligonukleotidai dalies žmogaus mpl ekstraląstelinio domeno sujungimui su dalimi sekos, koduojančios Rse, atliekant dviejų etapų PCR klonavimo reakciją, kaip aprašyta Mark et ai., J. Biol. Chem., 267:2616626171 (1992). Pirmame PCR reakcijos etape buvo naudojamas pradmuo Ml

5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3' (SEQ ID Nr ir pradmuo M2

5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3' (SEQ ID Nr su mpl kDNR matrica ir R1

5'-GGGCCATGACACTGTCAA-3 ' (SEQ ID Nr ir R2

5’-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGG TCCTT -3' (SEQ ID Nr .:61) .:62) .:63) .:64)

180 su Rse kDNR matrica. Šios suliejimo vietos PvuII-SmaI fragmentas buvo panaudotas konstruojant pilno ilgio chimerinį receptorių.

(f) Ląstelių transformavimas

DP12.CHO ląstelės (EP 307,247, publikuotas 1989.03.15) buvo elektroporuojamos su pSV.ID.M.tmRd6 plazmide, kuri buvo linerizuota per unikalią NotI skėlimo vietą. DNR buvo išsodinama etanoliu po ekstrakcijos fenolio/chloroformo mišiniu ir suspenduojama 20 μΐ 1/10 Tris EDTA. Po to prieš elektroporaci j ą (400 V, 330 ųF) , 10 μg DNR buvo inkubuojama su 10⁷ CHO DP12 ląstelėmis 1 ml PBS tirpalo lede 10 min. Ląstelės po elektroporaci j os buvo išlaikomos 10 min. lede prieš perkeliant jas į neselektyvią terpę. Po 24 valandų ląstelės buvo maitinamos terpe be nukleotidų tam, kad būtų galima atrinkti DHFR+ stabilius klonus.

(g) Transformuotų ląstelių selekcija KIRĄ ELISA analizei

Ekspresijos klonai MPL/Rse.gD buvo identifikuojami vesternblotavimu,atlikus visų ląstelių lizato frakcionavimą SDS PAGE, naudojant 5B6 antikūnus, kurie detektuoja gD tag epitopą.

(h) Terpė

Ląstelės buvo auginamos F12/DMEM 50:50 terpėje (Gibco/BRL, Life Technologies, Grand Island, NY). Terpė buvo papildyta 10 % diafiltruotu FBS (HyClone, Logan, Utah), 25mM HEPES ir 2mM L-gliutaminu.

(i) KIRĄ ELISA analizė

Vektoriumi MpI-Rse.gD transformuotos DP12.CHO buvo perkeltos (po 3xl0⁴ viename šulinėlyje) į plokščiadugnes 96 šulinėlių plokšteles kartu su 100 μΐ terpės ir kultivuojamos per naktį 37°C temperatūroje, esant 5% CO2. Sekantį rytą šulinėliuose esantis supernetantas buvo dekantuoj amas, plokštelės atsargiai nusausinamos ant popierinio rankšluosčio. Į kiekvieną šulinėlį buvo

181 įpilama po 50 μΐ terpės su tiriamasiais mėginiais arba 200, 50, 12,5, 3.12, 0,78, 0,19, 0,048 ar 0 ng/ml mpl ligando. Ląstelės buvo stimuliuojamos 30 minučių 37°C temperatūroje, šulinėliuose esantis supematantas buvo dekantuojamas ir plokštelės vėl atsargiai nusausinamos ant popierinio rankšluoščio. Siekiant sulizuoti ląsteles ir ištirpinti chimerinį receptorių, buvo pridedama po 100 μΐ lizatinio buferinio tirpalo į kiekvieną šulinėlį. Lizatinio buferinio tirpalo sudėtis: 150mM NaCl tirpalas su 50mM HEPES (Gibco), 0,5% Triton-X 100 (Gibco), 0,01% mertiolato, 30 kTV/ml aprotino (ICN Biochemicals, Aurora, OH), lmM

4-(2-aminoetil)-benzen(AEBSF, ICN Biochemisulfonilflorido hidrochlorido cals), 50 μΜ leupeptino (ICN Biochemicals) ir 2 mM natrio ortovanadato (Na₃VO₄, Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) , pH 7,5. Plokštelė buvo atsargiai purtoma kratytuve (Bellco Instruments, Vineland, NJ) 60 minučių kambario temperatūroje.

Kol ląstelės buvo tirpinamos, ELISA mikrotitravimo plokštelės (Nunc Maxisorp, Inter Med, Denmark) su sorbuotais per naktį 4°C temperatūroje 5B6 monokloniniais antikūnais (5,0 ųg/ml 50 mM karbonatiniame buferiniame tirpale, pH 9,6, po 100 μΐ į vieną šulinėlį) buvo nudekantuojamos ir atsargiai nusausinamos ant popierinio rankšluoščio, po to blokuojamos, įpilant 150 μΐ vienam šulinėliui blokavimo buferinio tirpalo [PBS, kuriame yra 0,5 % BSA (Intergen Company, Purchase, NY) ir

0,01 % mertiolato] panaudojant automatinį plokštelių plovimo įrenginį (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Ine., Sterling, VA).

Lizatas su ištirpintu MRL/Rse.gD iš audinių kultūros plokštelės šulinėlių buvo perkeliamas (po 85 μΐ į šulinėlį) į anti-gD 5B6 padengtus ir blokuotus ELISA plokštelės šulinėlius ir inkubuojama 2 valandas kambario temperatūroje, atsargiai purtant. Neprisijungęs

182 mpl-Rse.gD buvo pašalinamas praplaunant praplovimo buferiniu tirpalu, ir pridedama po 100 μΐ biotinilintų 4G10 (antikūnų prieš fosfotiroziną), praskiestų 1:18000 praskiedimo buferiniu tirpalu (PBS, kuriame yra 0,5 % BSA, 0,05 % Tween-20, 5 mM EDTA ir 0,01 % mertiolato) , tai yra 56 ng/ml buvo įdedami į kiekvieną šulinėlį. Po 2 vai. inkubacijos kambario temperatūroje plokštelė buvo praplaunama, ir į kiekvieną šulinėlį buvo pridedama po 100 μΐ streptovidino konjugato su krienų peroksidaze (HRPO) (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA) , praskiesto 1:60000 praskiedimo buferiniu tirpalu. Plokštelės buvo inkubuojamos 30 min. kambario temperatūroje, švelniai purtant. Neprisijungęs avidino konjugatas buvo išplaunamas, ir į kiekvieną šulinėlį buvo pridedama po 100 μΐ šviežiai paruošto substrato tirpalo (tetrametilbenzidinas [TMB]; dvikomponentis substrato rinkinys (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD) buvo pridėtas į kiekvieną šulinėlį. Reakcijai įvykti plokštelės buvo laikomos 10 min., po to spalvos susidarymas buvo stabdomas, pridedant į kiekvieną šulinėlį po 100 μΐ 1,0 M H3PO4 tirpalo. Sugertis 450 nm bangoje buvo matuojama, lyginant su sugertimi 650 nm bangoje (ABS450/650) < naudojant vmax plokštelių daugiakanalį spektrofotometrą (Molecular Devices, Polo Alto, CA) , kontroliuojant Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) , duomenys apdorojami DeltaSoft programa (BioMetallics, Ine, Princeton, NJ) .

Kalibracinė kreivė buvo sudaroma pagal dpl2.trkA,B ar C.gD ląstelių stimuliaciją, esant 200, 50, 12.5, 3.12, 0,78, 0,19, 0,048 ar 0 ng/ml mpl ligando arba išreiškiama kaip ng/ml TPO ir ABS450/650 ± sd priklausomybė, naudojant DeltaSoft programą. Pavyzdžių koncentracijos buvo nustatomos pagal sugerti ir iš kalibracinės kreivės išreiškiamos kaip TPO aktyvumas ng/ml.

183

Nustatyta, kad mpl ligandas sugeba aktyvuoti mplligand-specifiniu nuo Toliau mpl-Rse.gD KIRĄ kad analizei netrukdo

Rse.gD chimerinų receptorių koncentracijos priklausomu būdu ELISA analize buvo nustatyta,

100 % žmogaus serumas (parodyta piešinėlyje) ar 100 % plazma (neparodyta piešinėlyje), tai leidžia naudoti metodą tiriant pacientus ir atliekant pK mėginių analizę.

TPO₃₃₂ produkcija 293 ląstelėse

TPO koncentracija (ng/ml)

TPO EC50 apibendrinimas

TPO formos (ląstelės)	EC50 (m/v)	EC50 (moliaringumas)
Hu TPO 332 (293)	2.56 ng/ml	67.4 pM
Mu TPO 332 (293)	3.69 ng/ml	97.1 pM
Hu TPO 153 (293)	~41 ng/ml	-1.08 nM
Hu TPO 155 (E.coli]	0,44 ng/ml	11.6 pM
Hu TPO 153met (E.coli]	0,829 ng/ml	21.8 pM

184

PAVYZDYS 18

Trombopoetino nustatymas ELISA metodu, pagrįstas sąveika su receptoriumi

ELISA plokštelės buvo padengiamos triušio antikūnų prieš žmogaus IgG (Fc) F(ab'>2 fragmentais karbonatiniame buferiniame tirpale pH 9,6 per nakti 4°C temperatūroje. Plokštelės buvo blokuojamos 0,5 % jaučio serumo albuminu PBS kambario temperatūroje 1 valandą. Kultūrinė terpė iš fermentatoriaus, turintį chimerini receptorių mpl-IgG, buvo Įpilama į šulinėlius ir inkubuojama 2 valandas. Toliau i šulinėlius buvo įpilami standartinio pavyzdžio (TPO332, produkuotas 293 linijos ląstelėse, kurio koncentracija buvo nustatyta pagal amino rūgščių liekanų analizę) praskiedimų serija (nuo 25 iki 0,38 ng/ml, praskiedimo žingsnis 2) ir mėginių praskiedimo serijos. Standartas ir mėginiai skiedžiami PBS su 0,5 % jaučio serumo albumino ir 0,05 % Tween 20. Inkubuojama buvo 2 valandas. Susirišęs TPO buvo detektuojamas, naudojant išgrynintus proteinu-A ir biotinilintus triušio antikūnus prieš TPO155, kuris buvo ekspresuotas E. coli ląstelėse. Po 1 valandos inkubacijos į šulinėlius buvo įnešama steptavidin-peroksidazė ir inkubuojama 30 min. Prisijungusi peroksidazė buvo nustatoma, naudojant substratą - 3,3 ' ,5,5 '-tetrametilbenzidiną. Sugertis buvo įvertinama 450 nm bangoje. Plokštelės buvo praplaunamos po kiekvienos stadijos. Duomenų analizei buvo naudojama kalibracinė kreivė, apdorota, naudojant 4 parametrų kreivių aprašymo Kaleidagraph programa. TPO koncentracijos mėginiuose buvo apskaičiuojamos pagal kalibracinę kreivę.

PAVYZDYS 19

TPO ekspresija ir išgryninimas iš ląstelių 293 linijos

185

1. Ląstelių 293 linijos ekspresijos vektorių paruošimas kDNR, atitinkanti visą TPO baltymą ir esanti atvirame skaitymo rėmelyje, buvo gauta PCR metodo pagalba, naudojant šiuos oligonukleotidinius pradmenis:

LENTELĖ 11

PCR pradmenys

Cla.Fl.F: 5' ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC CCG GCC AG 3'	(SEQ ID Nr.:65)
hmplIR: 5' GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3'	(SEQ ID Nr.:48)

DNR fragmentas buvo amplifikuoj amas nuo pRK5-hmplI matricos (aprašyta Pavyzdyje 9), naudojant pfu DNR polimerazę (Stratagene). Pradinė denatūracija buvo altiekama 94°C temperatūroje 7 minutes, po to sekė 25 amplif ikaci j os ciklai (1 min. 94°C, 1 min. 55°C ir 1 min. 72°C). Pabaigoje buvo išlaikoma 72°C temperatūroje 15 minučių. PCR produktas buvo išgrynintas ir klonuotas tarp Clal ir Xbal skėlimo vietų pRK5tkneo plazmidėje, kuri yra sukonstruota modifikuojant pRK5 vektorių. Vektorius pRK5tkneo.ORF ekspresuoja geną, apsprendžiantį atsparumą neomicinui ir kontroliuojamą timidinkinazės promotoriumi. Antras konstruktas, atitinkantis EPO homologišką domeną, buvo sukonstruotas tokiu pat būdu, tik naudojant kiek skirtingą pradmenų porą. Tiesioginis pradmuo buvo Cla.FL.F (žiūr. Lentelę 11), o atvirkštinio pradmens seka buvo tokia:

Arg.STOP.Xba:

5' TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT (^SEQ ^ID Nr.:66) GGA CC 3'

Galutinis konstruktas buvo pavadinatas pRK5-tkneoEPO-D. Abiejų konstruktų sekos buvo patvirtintos aprašytu Pavyzdyje 7 būdu.

186

2. Žmogaus embriono inkstų ląstelių transfekcija

Aukščiau aprašyti konstruktai buvo transfekuoti i žmogaus embriono inkstų ląsteles, naudojant kalcio fosfatinį metodą, aprašyta Pavyzdyje 9. Praėjus 24 vai. po transfekcijos, buvo pradedama neomicinui atsparių klonų atranka selektyvioje terpėje su 0,4 mg/ml G418. Po 10 - 15 dienų neomicinui atsparūs klonai buvo individualiai perkeliami į 96 šulinėlių plokšteles, toliau auginama iki ląstelių monosluoksnio susidarymo. ML153 ir ML332 ekspresija buvo įvertinama, tikrinant transfektantų kondicionuotos terpės aktyvumą Ba/F3-mpl ląstelių proliferacijos metodu (žiūr. Pavyzdį 1).

3. rhML,332 gryninimas

293-rhML332 kondicionuota terpė buvo užnešama ant Blue-Sepharose (Pharmacia) kolonėlės, kuri buvo nulygsvarinta 10 mM natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 7,4 (buferis A). Kolonėlė paeiliui buvo praplaunama 10 kolonėlės tūrių buferiu A ir buferio A su 2 M karbamido. Baltymai buvo eliujuojami buferiniu tirpalu A su 2 M karbamido ir 1 M NaCl. Eliujuotos nuo Blue-Sepharose kolonėlės apjungtos frakcijos buvo užnešamos ant WGA-Sepharose kolonėlės, nulygsvarintos buferiniu tirpalu A. Kolonėlė paeiliui buvo praplaunama su 10 kolonėlės tūrių buferio A su 2 M karbamido ir 1 M NaCl, baltymai buvo eliujuojami tuo pačiu buferiniu tirpalu, į kurį pridėta 0,5 M N-acetil-D-glukozamino. Eliuatas nuo WGA-Sepharose kolonėlės buvo chromatografuoj amas C4-HPLC kolonėlėje (Synchrom, Ine.) nulygsvarintoj e 0,1 % TEA. Nuo C4-HPLC kolonėlės baltymai buvo eliujuojami propanolio gradientu (0-25 %, 25-35%, 35-70%).

rhML.332 buvo aptiktas 28-30% propanolio gradiento srityje. SDS-PAGE analizėje išgrynintas rhML₃₃₂ migruoja plačia juosta 68-80 kD srityje (žiūr. Fig. 15).

4. rhML].s3 gryninimas

293-rhML₁₅₃ kodicionuota terpė buvo gryninama su Blue-Sepharose, kaip aprašyta rhML₃₃2 atveju. Eliuatas

187 iš Blue-Sepharose kolonėlės buvo užneštas, kaip aprašyta aukščiau. rhMLis₃ eliuatas iš mpl-afininės kolonėlės buvo chromatografuojamas C4-HPLC kolonėlėje, kaip aprašyta rhML₃₃₂ atveju. Išgrynintas rhML₁₅₃ SDS-PAGE analizėje išskiriamas kaip dvi dominuojančios juostos ir dvi minorinės juostos, kurių molekulinės masės yra -18000 - 21000 kD (žiūr. Fig. 15).

PAVYZDYS 20

TPO ekspresija CHO ir gryninimas . CHO ekspresijos vektoriaus aprašymas

Ekspresijos vektoriai, panaudoti elektroporacijoje, aprašytoje žemiau, buvo pažymėti:

pSVI5 . ID. LL. MLORF (pilnas arba hTPO₃₃₂) , ir pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (nukirptas arba hTPOis₃) .

Šių plazmidžių konstrukcijos yra pateiktos Fig. 23 ir 24.

2. CHO ekspresijos vektoriaus paruošimas kDNR, kurioje yra pilnas hTPO atviras skaitymo rėmelis, buvo gauta PCR, naudojant oligonukleotidinius pradmenis, pateiktus Lentelėje 12.

LENTELĖ 12

CHO ekspresijos vektoriaus PCR pradmenys Cla.FL.F2:

5' ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA (^S02 IDNr.: 47)

G 3'

ORF.Sal:

5' AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA (SEQ ID Nr.: 67) ACC 3 '

PRK5-hmplI (aprašytas Pavyzdžiuose 7 ir 9) buvo naudojamas kaip matrica, esant pfu DNR polimerazei (Stratagene). Pradinė denatūracija buvo atliekama 94^:C temperatūroje 7 minutes, po to sekė 25 amplifikacijos ciklai (1 min. 94°C, 1 min. 55°C ir 1 min. 72°C). Pabaigoje buvo išlaikoma 72°C temperatūroje 15 minučių. PCR

188 produktas buvo gryninamas ir klonuojamas į Clal ir Salį skėlimo vietą plazmidėje pSVI5.ID.LL, tokiu būdu buvo sukonstruotas vektorius pSVI5.ID.LL.MLORF. Sekantis konstruktas, kuriame yra EPO homologinis domenas, buvo sukonstruotas tuo pačiu keliu, naudojant Cla.FL.F2 kaip tiesioginį pradmenį ir sekantį atvirkštini pradmenį: EPOD.Sal:

5'ATG CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG (^SEQ ID.Nr.:68) TGG ACC 3'

Galutinis konstruktas buvo pažymėtas pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. Abiejų konstruktų sekos buvo patikrintos aprašytu Pavyzdžiuose 7 ir 9 būdu.

Trumpai, pilno ilgio ir nukirptą Ugandą koduojančios sekos buvo įterptos i poliklonavimo sritį CHO ekspresijos vektoriuje pSVI5.ID.LL. Šiame vektoriuje yra ankstyvas promotoriaus/sustiprintoj o regionas, modifikuotas splaisingo elementas, kuriame yra pelės DHFR kDNR, poliklonavimo sritis tikslinio geno įterpimui (šiuo atveju TPO sekos), SV40 poliadenilinimo signalas, replikacijos iniciavimo vieta ir betalaktamazės genas plazmidės selekcijai ir amplifikacij ai bakterijose.

3. Stabilios CHO ląstelių linijos, ekspresuoj ančios rekombinantinius TPO332 ir TPO153, sukūrimo metodologija

a. CHO tėvinių ląstelių linijos aprašymas

CHO (Kinijos žiurkėnių kiaušidžių) ląstelių-šeimininkų linija, naudojama TPO molekulių ekspresijai, yra žinoma kaip CHO-DP12 (žiūr. EP 307247, publikuotą 1989.03.15). Ši žinduolių ląstelių linija buvo atrinkta iš transfekuotų tėvinių ląstelių linijos (CHO-ΚΙ DUXBll(DHFR-)- gautos iš Dr. Frank Lee, Stanford University su Dr. L. Chasin sutikimu) su preproinsulino ekspresijos vektoriumi, tam kad būtų gauti klonai su sumažintu insulino poreikiu. Šios ląteles taip pat yra DHFR-, todėl klonai gali būti atrenkami esant DHFR kDNR

189 vektoriaus sekoms, auginant terpėje be nukleozidų priedų (glicino, hipoksantino ir timidino). Ši atrankos sistema paprastai naudojama stabilioms ekspresuojančioms CHO ląstelių linijoms atrinkti.

b. Transfekcij os metodas (elektroporacij a)

Ląstelių, ekspresuo j ančių TPO₃₃₂ ir TPOis₃, linijos buvo gaunamos transfekuoj ant DP12 ląsteles elektroporacija (žiūr. Anderson, G.L. J.Tiss.Cult. Meth., 15,56 [1993]) atitinkamai su linearizuotomis pSVI5.ID.LL.MLORF ar su pSVI5.ID.LL.MLEPO-D plazmidėmis. Trys (3) restrikcijos fermentų reakcijos mišiniai buvo naudojami kiekvienos plazmidės skėlimui; buvo naudojama 10 pg, 25 pg ir 50 pg vektoriaus, skaldant su NOTI fermentu pagal standartinius molekulinės biologijos metodus. Ši restrikcijos vieta, vienintelė vektoriuje, yra linearizacijos regione 3' gale ir už TPO ligando transkripcijos elementų (žiūr. Fig. 23) . 100 pg reakcijos mišinio buvo inkubuojamas per naktį 37°C temperatūroje. Kitą dieną mišinys buvo vieną kartą išekstrahuoj amas fenolio-chloroformo-izoamilo alkoholio mišiniu (50:49:1) ir ekstraktas išsodinamas etanoliu, išlaikant sausame lede vieną valandą. Nuosėdos buvo surenkamos centrifuguoj ant 15 min. ir po to išdžiovinamos. Linearizuota DNR buvo suspenduota į 50 pi Ham DMEM-F12 1:1 terpę, papildant ją standartiniais antibiotikais ir 2 mM gliutamino.

Auginamų DP12 ląstelių suspensija buvo surenkama, praplaunama vieną kartą terpe, naudojama DNR suspendavimui, ir pabaigai suspenduojamos toje pačioje terpėje, esant ląstelių koncentracijai 10⁷ ląstelių 750 pi. Ląstelių suspensijos alikvotos (po 750 pi) ir kiekvienas linearizuotos DNR mišinys buvo inkubuojami kartu kambario temperatūroje vieną valandą ir pernešami į BRL elektroporacijos kamerą. Kiekvienas reakcijos mišinys buvo elektroporuoj amas standartiniame elektroporacijos

190 aparate, esant 350V ir 330 pF, esant mažai talpuminei varžai. Po elektroporacijos ląstelės buvo paliekamos aparate 5 min. ir po to buvo papildomai išlaikomos 10 min. lede. Elektroporuotos ląstelės buvo perkeliamos i 60 mm audinių kultūros lėkšteles, kuriose buvo po 5 ml pilnos standartinės CHO augimo terpės (didelės glukozės koncentracijos DMEM-F12 50:50, be glicino su lx GHT, 2 mM glutamino ir 5% embrioninio veršiukų serumo) ir auginamos audinių kultūros inkubatoriuje per nakti, esant 5 % CO2.

c. Tikrinimo ir atrankos metodas

Kitą dieną ląstelės buvo tripsinizuojamos nuo plokštelių pagal standartinę metodiką ir perkeltos i 150 mm audinių kultūros lėkšteles su DHFR selektyvia terpe (Ham DMEM-F12, 1:1 terpe, aprašyta aukščiau, papildyta 2 % arba 5 % dializuoto embrioninio veršiukų serumo, bet be glicino, hipoksantino ir timidino - tai yra standartinė DHFR selekcijos terpė). Ląstelės iš kiekvienos 60 mm lėkštelės buvo padauginamos į penkias 150 mm lėkšteles. Ląstelės buvo inkubuojamos nuo 10 iki 15 dienų (su vienu terpės pakeitimu) 37°C temperatūroje, esant 5 % CO2, kol buvo pastebimas klonų augimas ir kol klonų dydis pasiekė dydį, tinkamą pernešti į 96 šulinėlių plokšteles. Po 4-5 dienų ląstelės buvo perkeliamos į 96 šulinėlių plokšteles, naudojant sterilius geltonus pipetmano antgalius (po 50 μΐ). Ląstelės buvo paliekamos augti, kol susidarydavo ląstelių monosluoksnis (paprastai 3-5 dienas), ir tripsinizuojamos, kiekvieną kloną išsėjant 2 pakartojimais. Trumpą laiką šios dvi kopijos buvo laikomos šaldiklyje, pridėjus į kiekvieną šulinėlį po 50 μΐ 10 % DMSO. Likusi klonų dalis buvo auginama iki monosluoksnio susidarymo, augimo terpė buvo išsiurbiama ir užpilama beserumine terpe, po penkių dienų tokiuose kondicionuotos terpės mėginiuose buvo nustatoma TPO ekspresija, naudojant analizę su

191

Ba/F ląstelėmis. Klonai, atrinkti pagal šią analizę ir turintys didžiausią ekspresijos lygi, buvo paimami iš šaldiklio ir pagausinti dviejuose 150 mm T-induose. Paaugintos ląstelės buvo naudojamos adaptacijai suspensinei kultūrai, pakartotinei analizei ir saugojimui.

d. Amplifikacijos protokolas

Keletas ląstelių linijų, turinčių didžiausią titrą po selekcijos, kuri aprašyta aukščiau, buvo amplifikuojamos metotreksato metodu, siekiant gauti dar didesnio titro klonus. CHO ląstelių klonai buvo padidinti ir pernešti į 10 cm lėkšteles, esant 4 metotreksato koncentracijoms (t. y., 50 nM, 100 nM, 200 nM ir 400 nM) ir dviems ar trims skirtingoms ląstelių koncentracijoms (10⁵, 5xl0⁵ ir 10⁶ ląstelių lėkštelėje). Šios ląstelės buvo inkubuojamos 37°C temperatūroje, esant 5 % C0₂, kol klonai bus pastebimi ir galima bus perkelti i 96 šulinėlių plokšteles tolesnei analizei. Keletas aukšto titro klonų po šios selekcijos buvo paveikti didesnės koncentracijos metotreksato (t. y., 600 nM 800 nM, 1000 nm ir 1200 nM) , atsparūs klonai buvo perkeliami Į 96 šulinėlių plokšteles ir tiriami.

4. Stabiliai ekspresuojančių rekombinantinį žmogaus TPO332 ir TPO₁₅₃ CHO ląstelių linijos kultivavimas

Saugomos ląstelės buvo atšildomos ir ląstelės pagausinamos standartiniais ląstelių auginimo būdais terpėje kaip su serumu, taip ir be serumo. Pasiekus reikiamą ląstelių tankumą, ląstelės buvo praplaunamos, siekiant pašalinti ląstelių kultūrinę terpę. Ląstelės po to buvo kultivuojamos bet kokiu standartiniu būdu: induose ar nepertraukiamoje kultūroje 25 - 40°C temperatūroje, esant neutraliam pH ir ištirpusio O₂ kiekiui ne mažiau 5 %, kol susidaro reikiamas sekretuojamo TPO kiekis. Ląstelių kultūros skystis buvo atskiriamas nuo ląstelių mechaniniu būdu, pvz., centrifuguojant.

192

5. Rekombinantinio žmogaus TPO gryninimas iš CHO auginimo terpės.

Ląstelių auginimo terpė (HCCF) buvo užnešama ant Blue Sepharose 6 fast Flow kolonėlės (Pharmacia), nulygsvarintos su 0,01 M natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 7.4 su 0,15 M NaCl, apytikriai 100 1 HCCF vienam litrui sorbento; linijinis pratekėjimo greitis apie 300 ml/(val*cm²) . Kolona buvo praplaunama 3-5 kolonos tūriais nulygsvarinimo buferiniu tirpalu, po to 3 - 5 kolonos tūriais 0,01 M natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 7,4 su 2,0 M karbamido. TPO buvo eliujuojamas

3-5 kolonos tūriais natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu su 2,0 M karbamido ir 1,0 M NaCl.

Apjungtos po Blue Sepharose frakcijos su TPO buvo užnešamos ant Wheat Germ Lectin Sepharose 6MB kolonos (Pharmacia), nulygsvarintos 0,01 M natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 7,4 su 2,0 M urėjos ir 1,0 M NaCl, apytikriai nuo 8 iki 16 ml apjungtų frakcijų nuo Blue Sepharose vienam mililitrui sorbento; linijinis pratekėjimo greitis apie 50 ml/(val*cm²) . Kolona buvo praplaunama 2-3 kolonos tūriais nulygsvarinimo buferiniu tirpalu. TPO buvo eliujuojamas 2-5 kolonos tūriais 0,01 M natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 7.4 su 2.0 M karbamido ir 0,5 M N-acetil-D-glukozamino.

Į apjungtas Wheat Germ Lectin frakcijas buvo pridėta iki 0,04 % Ci2E_g ir 0,1 % trifloracto rūgšties (TFA) . Gautas tirpalas buvo chromatografuoj amas C4 atvirkščių fazių kolonėlėje (Vydac 214TP1022), nulysvarinus 0,1 % TFA, 0,04 % Ci₂E₈; užnešama apytikriai 0,2 0,5 mg baltymo 1 ml sorbento, pratekėjimo greitis 157 ml/ (val*cm²) .

Baltymai buvo eliujuojami dviem linijiniais acetonitrilo gradientais su 0,1 % TFA ir 0,04 % Ci₂Eg. Pirmas linijinis gradientas buvo nuo 0 iki 30 % acetonitrilo per 15 min., sekantis - nuo 30 iki 60 % acetonitrilo

193 per 60 minutes. TPO buvo eliu j uo j amas, esant apie 50 % acetonitrilo. Surinktos frakcijos buvo analizuojamos SDS PAGE.

Apjungtos po C4 kolonėlės frakcijos buvo praskiestos dvigubu 0,01 M natrio fosfatinio buferinio tirpalo pH 7.4 su 0,15 M NaCL tūriu ir diafiitruojama prieš apytikriai šešis tūrius 0,01 M natrio fosfatinio buferinio tirpalo pH 7,4 su 0,15 M NaCl Anicon YM aparatu ar kitais ultrafiltracijos aparatais, naudojant 10000 30000 D pralaidžias membranas. Gautas diafiltratas buvo sukoncentruojamas ultrafiltruoj ant. Į diafiltracijos koncentratą buvo pridedama Tween-80 iki 0,01 % koncentracijos .

Visas ar dalis koncentrato (nuo 2 iki 5 % kolonos tūrio) buvo užnešama ant Sephacryl S-300 HR kolonos (Pharmacia), nulygsvarintos 0,01 M natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu, pH 7.4 su 0,15 M NaCl ir 0,01 % Tween-80 ir gelfiltruojama, esant pratekėjimo greičiui 17 ml/(val*cm²) . Frakcijos, kuriose po SDS PAGE analizės buvo nustatytas neagregavęs ir be proteinazinės degradacijos produktų TPO, buvo apjungiamos. Apjungtos frakcijos buvo perfiltruotos per 0,22 ųm filtrą MillexGV ar panašų ir saugomos 2-8°C temperatūroje.

PAVYZDYS 21

Transformavimas ir TPO sintezės indukcija E. coli

1. TPO ekspresijos vektoriaus E. coli konstravimas

Plazmidės pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 ir pMP202 buvo sukonstruotos taip, kad ekspresuotų pirmąsias 155 TPO amino rūgščių liekanas už trumpos lyderinės sekos, kuri buvo skirtinga kiekvienai konstrukcijai. Lyderinė seka leidžia padidinti transliacijos iniciavimo lygį ir palengvina baltymo gryninimą. Plazmidės pMP210-l, -T8, -21,-22, -24, -25 buvo sukonstruotos taip, kad ekspresuotų pirmąsias 153 TPO amino rūgščių liekanas po ini194 ciacijos vietos (metionino liekanos), ir kad skirtųsi naudojamais pirmųjų TPO šešių amino rūgščių liekanų kodonais. Plazmidė pMP251 yra išvestinė iš pMP210-l plazmidės, joje TPO baltymo C gale yra papildomos dvi amino rūgščių liekanos. Visos aukščiau paminėtos plazmidės pasižymi didele TPO ekspresija E. coli ląstelėse, indukuojant triptofano promotorių (Yansura, D. G. et ai., Methods in Enzymology (Goeddel, D.V., Ed.) 185:5460, Academic Press, San Diego [1990]). Plazmidės pMPl ir pMP172 yra tarpinės, konstruojant aukščiau nurodytas plazmidės, kurių pagalba ekspresuoj amas viduląstelinis TPO.

(a) Plazmidė pMPl

Plazmidė pPMl yra TPO fragmento, i kurį įeina pirmosios 155 amino rūgščių liekanos, ekspresijos vektorius, ir jis buvo gautas liguojant penkis DNR fragmentus, kaip parodyta Fig. 33. Pirmasis fragmentas - tai vektorius pPho21, kuriame yra pašalintas MluI-BamHI fragmentas. pPho21 yra išvestinis iš phGHl (Chang, C.N., et ai., Gene 55:189-196 [1987]), šiame vektoriuje žmogaus augimo hormono genas buvo pakeistas E. coli phoA genu ir buvo sukonstruota MluI skėlimo vieta STII signalinės sekos vietoje, koduojančioje 20 - 21 amino rūgšties liekaną.

Sekantys du fragmentai - DNR iš pRK5-hmplI (Pavyzdys 9) 258 bazių porų Hinfl-PstI fragmentas, koduojantis TPO baltymo seką nuo 19 iki 103 amino rūgščių liekanos ir sintetinis DNR fragmentas, koduojantis TPO baltymo seką nuo 1 iki 18 amino rūgščių liekanos:

5'CGC GTA TGC CAG CCC GGC TCC TCC TGC TTG

TGA CCT CCG AGT CCT CAG TAA ACT GCT TCG TG (SEQ ID Nr.: 69) ATA CGG TCG GGC CGA GGA GGA CGA

ACA CTG GAG GCT CAG GAG TCA TTT GAC GAA (SEQ ID Nr.: 70)

GCA CTG A-5' buvo pirmiausia liguojami su T4-DNR ligaze, o po to perkerpami su Pstl. Ketvirtas yra Pstl-HaelII frag195 mentas iš pRK5hmplI, sudarytas iš 152 bp, koduojantis TPO amino rūgščių liekanų seką nuo 104 iki 155 amino rūgščių liekanos. Paskutinis buvo 412 bp ilgio StuIBamHI fragmentas iš pdhl08, turintis λ iki transkripcijos terminatoriaus, kaip ankščiau aprašyta (Scholtissek,

S. et ai., NAR 15:3185 [1987]).

(b) Plazmidė pMP21

Plazmidė pMP21 sukonstruota taip, kad ekspresuotų TPO baltymo pirmąsias 155 amino rūgščių liekanas, naudojant STII signalinės sekos dalį iš 13 amino rūgščių liekanų. Ši plazmidė buvo sukonstruota, liguojant tris (3) DNR fragmentus, pateiktus Fig. 34. Pirmas fragmentas buvo padarytas iš vektoriaus pVEG31, iškirpus mažą Xbal-Sphl fragmentą. Vektorius pVEG31 yra sukonstruotas iš vektoriaus pHGH207-l (deBoer, H.A. et ai., in Promoter Structure and Funktion (Rodriguez, R.L. and Chamberlain, M.J., Ed.) 462, Prager, New York [1982]).

Šiame vektoriuje žmogaus augimo hormono genas buvo pakeistas vaskuliarinio endotelio augimo faktoriaus genu (identiškas vektoriaus fragmentas gali būti gautas iš paskutiniosios plazmidės).

Kita ligavimo dalis buvo sintetinė dvigrandė DNR:

' -CTA GAA TTA TGA AAA AGA ATA TCG CAT TTC

TT AAT ACT TTT TCT TAT AGC GTA AAG TCC TTA A (SEQ ID Nr.:71)

AAG AAT TGC GC-5' (SEQ ID Nr.:72)

Paskutinioji 1072 bp dalis buvo Mlul-Sphl fragmentas iš pMPl, koduojantis 155 TPO baltymo amino rūgščių liekanas .

(c) Plazmidė pMP151

Plazmidė pMP151 sukonstruota taip, kad ekspresuotų TPO baltymo pirmąsias 155 amino rūgščių liekanas už lyderinės seka, į kurią įeina 7 amino rūgščių liekanų STII signalinės sekos, astuonios histidino liekanos ir faktoriaus Xa skėlimo vieta. Kaip parodyta Fig. 35, pMP151 buvo konstruojama liguojant tris DNR fragmentus.

196

Pirmasis fragmentas buvo gautas iš anksčiau aprašytos plazmidės pVEG31 iškirpus mažą Xbal-Sphl fragmentą ir jį pašalinus. Sekantis fragmentas buvo sintetinė dvigrandė DNR:

5’CTA

GAA

TTA

TGA

AAA

AGA

ATA

TCG

CAT

TTC

TT

AAT

ACT

TTT

TCT

TAT

AGC

GTA

AAG

ATC

ACC

ATC

ACC

ATC

ACC

ATC

ACA

TCG

AAG

TAG

TGG

TAG

TGG

TAG

TGG

TAG

TGT

AGC

TTC

GTC

GTA

GCC

(SEQ

ID

Nr.

:73

GAG

C AT-

5’

(SEQ

ID

Nr.

:74

Paskutinysis buvo 1064 bp ilgio Bgll-Sphl fragmentas iš plazmidės pMPll, koduojantis TPO baltymo 154 amino rūgščių liekanas. Plazmidė pMPll identišką plazmidei pMPl, skiriasi tik keliais kodonais STII signalinėje sekoje (šis fragmentas gali būti gaunamas iš pMPl plazmidės).

(d) Plazmidė pMP202

Plazmidė pMP202 labai panaši į ekspresijos vektorių pMP151, skiriasi tik tuo, kad Xa faktoriaus skėlimo vieta pakeista i trombino skėlimo vietą. Kaip parodyta Fig. 36, pMP202 buvo konstruojama liguojant tris DNR fragmentus. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš ankščiau aprašytos plazmidės pVEG31 iškirpus mažą Xbal-Sphl fragmentą ir jį pašalinus. Sekantis fragmentas buvo sintetinė dvigrandė DNR:

5’CTA	GAA	TTA	TGA	AAA	AGA	ATA	TCG	CAT	TTC
	TT	AAT	ACT	TTT	TCT	TAT	AGC	GTA	AAG
ATC	ACC	ATC	ACC	ATC	ACC	ATC	ACA	TCG	AAC
TAG	TGG	TAG	TGG	TAG	TGG	TAG	TGT	AGC	TTG

CAC GTA GCC (SEQ ID Nr.:75)

GTG CAT-5' (SEQ ID Nr.:76)

Paskutinysis buvo 1064 bp ilgio Bgll-Sphl fragmentas iš aukščiau aprašytos plazmidės pMPll.

(e) Plazmidė pMP172

Plazmidė pMP172 yra TPO fragmento, į kurį įeina pirmosios 153 amino rūgščių liekanos, sekrecijos vek197 torius, ir yra tarpinė konstrukcija sudarant plazmidę pMP210. Kaip parodyta Fig. 37, pMP172 plazmidė buvo konstruojama, liguojant tris DNR fragmentus. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš vektoriaus pLS321amB pasali5 nūs mažą EcoRI-HindlII fragmentą. Sekantis 946 bp ilgio EcoRI-Hgal fragmentas buvo gautas iš aukščiau aprašytos plazmidės pMPll. Paskutinysis fragmentas buvo sintetinė dvigrandė DNR:

5'TCC ACC CTC TGC GTC AGG T (SEQ ID Nr.:77)

GG AGA CGC AGT CCA TCG A-5’ (SEQ ID Nr.:78) (f) Plazmidė pMP210

Plazmidė pMP210 buvo sukonstruota, kad ekspresuotų pirmąsias TPO baltymo 153 amino rūgščių liekanas po transliacijos iniciavimo vietos - metionino liekanos. Ši plazmidė buvo sukonstruota kaip plazmidžių bankas, atsiktinai pakeičiant pirmuosiuose TPO 6 kodonuose trečioje pozicijoje kiekvieno kodono nukleotidą. Šios plazmidės konstravimas atliktas liguojant tris DNR fragmentus pavaizduotas Fig. 38. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš vektoriaus pVEG31 pašalinus mažą XbalSphl fragmentą. Sekantis fragmentas buvo sintetinė dvigrandė DNR, pateikta žemiau. Šis fragmentas buvo pirmiausia paveikiamas DNR polimeraze I (Klenow), po to sekė skaldymas Xbal ir Hinfl. Fragmentas koduoja iniciacijos metioniną ir atsitiktinai pakeistus 6 TPO baltymo kodonus.

5'GCA GCA GTT CTA GAA TTA TGT CNC CNG CNC

CNC CNG CNT GTG ACC TCC GAG TTC TCA GTA A CAC TGG AGG CTC AAG AGT CAT

AA (SEQ ID Nr.:79)

TTC- ACG AAG CAC TGA GGG TAC AGG AGG-5' (SEQ ID Nr.:80)

Trečiasis 890 bp ilgio Hinfl-Sphl fragmentas buvo gautas iš plazmidės pMP172, koduojantis TPO baltymo 19-153 amino rūgščių liekanas.

198

Su plazmidžių pMP210 banku (apie 3700 klonų) buvo pakartotinai atlikta transformacija, esant didelei tetraciklino koncentracijai (50 ųg/ml) LB plokštelėse, tam kad būtų galima atrinkti klonus su dideliu transliacijos iniciacijos lygiu (Yansura, D.G. et ai., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4:151-158 [1982]). Iš aštuonių klonų augančių, esant didelei tetraciklino koncentracijai, buvo atrinkti penki, kurie ekspresavo daugiausiai TPO baltymo, DNR sekos nustatymui. Rezultatai pateikti Pieš. 39 (SEQ ID Nr.: 23, 24, 25, 26, 27 ir 28).

(g) Plazmidė pMP41

Plazmidė pMP41 buvo konstruojama, kad ekspresuotų pirmąsias TPO baltymo 155 amino rūgščių liekanas sulietas su lyderine seka, sudaryta iš 7 STII signalinės sekos amino rūgščių liekanų, sekančių po Xa faktoriaus skėlimo vietos. Plazmidės konstravimas pavaizduotas Fig. 40. Buvo liguojami trys DNR fragmentai. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš plazmidės pVEG31 iškerpant mažą Xbal-Sphl segmentą. Sekantis fragmentas buvo sintetinė dvigrandė DNR:

5'-CTA GAA TTA TGA AAA AGA ATA TCG CAT TTA

TT AAT ACT TTT TCT TAT AGC GTA AAT

TCG AAG GTC GTA GCC (SEQ ID Nr.:81)

AGC TTC CAG CAT-5¹ (SEQ ID Nr.:82)

Paskutinysis ligavimo 1064 bp ilgio Bgll-Sphl fragmentas buvo gautas iš anksčiau aprašytos pMPll plazmidės.

(h) Plazmidė pMP5 7

Plazmidė pMP57 ekspresuoja TPO baltymo pirmąsias 155 amino rūgščių liekanas po lyderinės sekos, sudarytos iš 9 STII signalinės sekos amino rūgščių liekanų ir dviejų bazinių amino rūgščių liekanų - Lys-Arg. Šis dviejų bazinių amino rūgščių liekanų fragmentas leidžia pašalinti signalinę seka proteinąse ArgC. Šios plazmidės konstravimas pavaizduotas Fi.i. 41. Buvo liguojami

199 trys DNR fragmentai. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš ankščiau aprašytos pVEG31 plazmidės pašalinus mažą Xbal-Sphl fragmentą. Sekantis fragmentas buvo sintetinė dvigrandė DNR:

5 ' -CTA

GAA

TTA

TGA

AAA

AGA

ATA

TCG

CAT

TTC

TT

AAT

ACT

TTT

TCT

TAT

AGC

GTA

AAG

TTC

TTA

AAC

GTA

GCC

(SEQ

ID

Nr.

: 83)

AAG

AAT

TTG

C AT-

•5'

(SEQ

ID

Nr.

: 84)

Paskutinysis ligavimo 1064 bp ilgio Bgll-Sphl fragmentas buvo gautas iš ankščiau aprašytos pMPll plazmidės.

(i) Plazmidė pMP251

Plazmidė pMP251 yra plazmidės pMP210-l darinys, į kurią buvo įterptos dvi papildomos amino rūgščių liekanos TPO baltymo C gale. Šios plazmidės konstravimas pavaizduotas Fig. 42. Plazmidė buvo konstruojama, liguojant du DNR fragmentus. Pirmasis fragmentas buvo gautas, iš plzmidės pMP21 iškerpant mažą Xbal-Apal segmentą. Antrasis buvo 316 bp ilgio Xbal-Apal fragmentas iš plazmidės pMP210-l.

2. E. coli transformacija ir indukcija TPO ekspresijos vektoriumi

Aukščiau aprašyti TPO ekspresijos vektoriai buvo naudojami E. coli kamieno 44C6 (w3110 tonA_A rpoH_ts 1οη_Δ ο1ρΡ_Δ galE) transformacijai CaCl₂ temperatūriniu šoku (Mendel, M. et ai., J. Mol. Biol., 53:159-162 [1970]).

Transformuotos ląstelės pirmiausia buvo auginamos LB terpėje esant 50 ųg/ml karbenicilino 37°C temperatūroje, kol sugertis 600 nm bangoje padidėja iki 2-3. LB terpė po auginimo buvo praskiedžiama 20 kartų M9 terpe, kurioje buvo 0,49 % kazamino rūgščių (m/v) ir 50 ųg/ml karbenicilino. Po 15 valandų auginimo aeruojant 30°C temperatūroje ląstelės buvo surenkamos centrifuguojant.

200

PAVYZDYS 22

Biologiškai aktyvaus TPO (Met^-1l-153) produkcija E. coli

Pateikti žemiau biologiškai aktyvaus, su atstatyta struktūra TPO (Met^-1 1-153) produkcijos metodai gali būti pritaikyti TPO analogams, tarp jų ir formoms su papildomomis sekomis C ir N baltymo galuose (žiūr. Pavyzdį 23).

A. Netirpaus TPO (Met¹ 1-153) išskyrimas

E. coli ląstelės, ekspresuo j ančios TPO (Met^-1 1153), kuris koduojamas plazmide pMP210-l, yra auginamos aukščiau aprašytu būdu. Paprastai apie 100 g ląstelių suspenduojama Polytron homogenizatoriumi viename litre (10 ląstelių kiekio tūrių) ardymo buferinio tirpalo (10 mM tris, 5 mM EDTA, pH 8), ląstelės centrifūguojamos esant 5000 g, 30 min. Praplautos ląstelės vėl suspenduojamos Polytron homogenizatoriumi 1 1 ardymo buferinio tirpalo ir ląstelės ardomos LH Cell Disrupter (LH Inceltech, Ine) ląstelių ardymo aparatu ar Microfluidizer (Microfluidies International) aparatu pagal gamintojų instrukcijas. Gauta suspensija centrifūguoj ama esant 5000 g, 30 min. Nuosėdos suspenduojamos ir centrifuguojama antrą kartą. Praplautos nuosėdos naudojamos iš karto arba užšaldomos -70°C temperatūroje.

B. Monomerinio TPO (Met'¹ 1-153) soliubilizavimas ir gryninimas.

Atplautos nuosėdos buvo suspenduojamos 5 tūriuose (pagal nuosėdų svori) 20 mM Tris, pH 8 su 6 M guanidino ir 25 mM DTT (ditiotreitolio) ir maišomos 1-3 vai., ar per naktį 4°C temperatūroje, kad ištirptų TPO baltymas. Galima naudoti ir dideles (6-8 M) karbamido koncentracijas, bet gaunama mažesnė TPO baltymo išeiga, lyginant su guanidinu. Po soliubilizacijos tirpalas nuskaidrinimas centrifūguoj ant esant 30000 g 30 min.,

201 tirpale lieka denatūruotas, monomerinis TPO baltymas. Supematantas chromatografuojamas kolonėlėje su Superdex 200 gelfiltracijos sorbentu (Pharmacia, 2,6x60 cm), tirpalo pratekėjimo greitis - 2 ml/min. Baltymas eliujuojamas 20 mM natrio fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 6.0 su 10 mM DTT. Frakcijos eliujuotos nuo 160 iki 200 ml surenkamos, jose buvo monomerinis, denatūruotas TPO baltymas. Toliau TPO baltymas buvo chromatografuojamas pusiau preparatyvinėj e atvirkščių fazių 04 kolonėlėje (2x20 VYDAC). Mėginiai buvo užnešami 5 ml/min greičiu ant kolonėlės, nulygsvarintos 0,1 % TFA (trifluoracto rūgštimi) su 30 % acetonitrilo. Baltymai buvo eliujuojami linijiniu acetonitrilo gradientu (30-60 % per 60 min.) . Išgrynintas redukuotas baltymas buvo eliujuojamas esant 50 % acetonitrilo. Toks preparatas buvo naudojamas natyvios struktūros atstatymui, kad būtų gautas biologiškai aktyvus TPO variantas.

C. TPO (Met'¹ 1-153) biologinio aktyvumo atstatymas

Apie 20 mg monomerinio, redukuoto ir denatūruoto TPO baltymo, esančio 40 ml 0,1 % TFA ir 50 % acetonitrilo tirpale, buvo praskiedžiama 360 ml struktūros atstatymo buferinio tirpalo, turinčio:

mM Tris 0, 3 M NaCl 5 mM EDTA % CHAPS, paviršiaus aktyvios medžiagos 25 % glicerino 5 mM oksiduoto gliutationo 1 mM redukuoto gliutationo tirpalo pH koreguoj amas iki 8,3.

Po sumaišymo, struktūros atstatymo buferinis tirpalas atsargiai maišomas 4 C temperatūroje 12-48 valandas, tam kad būtų pasiekta didžiausia TPO struktūros su teisingais disulfidiniai s tilteliais atstatymo išeiga (žiūr. žemiau). Tirpalas po to buvo parūgština202 mas TFA iki galutinės jos koncentracijos 0,2 %, perfiltruotas per 0,45 ar 0,22 ųm filtrą, pridedama 1/10 tūrio acetonitrilo. Šis tirpalas buvo chromatografuojamas ant atvirkščių fazių C4 kolonėlės, atstatytos struktūros TPO (Met^-1 1-153) baltymas buvo eliujuojamas ta pačia gradiento programa. Šiomis sąlygomis atstatytos struktūros, biologiškai aktyvus TPO baltymas buvo eliujuojamas, esant apie 45 % acetonitrilo koncentracijai. TPO baltymas su netaisyklingais disulfidiniais tilteliais buvo eliujuojamas anksčiau. Galutinis išgrynintas TPO (Met^-1 1-153) preparatas turėjo mažiau nei 5 % priemaišų, analizuojant SDS PAGE ir analitine atvirkščių fazių C4 kolonėle. Tyrimams su gyvuliukais išgrynintas po C4 chromatografijos preparatas buvo dializuojams tinkamame fiziologiniame buferiniame tirpale. Buvo naudojami izotoniniai buferiniai tirpalai (10 mM natrio acetato, pH 5,5; natrio sukcinate, pH 5.5; ar 10 mM natrio fosfato, pH 7,4) su 150 mM NaCl ir 0,01 % Tween 80.

Kadangi TPO pasižymi dideliu aktyvumu testuojant su BA/F3 ląstelėmis (pusė maksimalios stimuliacijos pasiekiama su maždaug 3 pg/ml), todėl galima gauti biologiškai aktyvius preparatus, naudojant daugelį buferinių tirpalų, paviršiaus aktyvių medžiagų ir naudojant įvairias red-oks sistemas. Vis dėlto, dažniausiai kitomis sąlygomis gaunama labai maža dalis teisigai atstatytos struktūros preparato (<10 %) . Gamybiniams procesams reikalinga, kad struktūros atstatymo proceso išeiga būtų ne mažesė kaip 10 %, geriau 30-50 % ir geriausia, kad išeiga būtų didesnė nei 50 %. Struktūros atstatymo stadijoje buvo išbandyta daug paviršiaus aktyvių medžiagų (Triton Χ-100, dodecil-beta-maltozidas, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkosilas, Tween 20 ir Tween 80, Zwitergent 3-14 ir kiti). Iš šių paviršiaus aktyvių medžiagų buvo nustatyta, kad tik CHAPS grupės (CHAPS ir CHAPSO) pav:;siaus aktyvios

203 medžiagos tinka struktūros atstatymui, sumažinant baltymų agregaciją ir netaisyklingų disulfidinių tiltelių susidarymą. Patartina naudoti didesnes nei 1 % CHAPS koncentracijas. Natrio chloridas reikalingas didesnei proceso išeigai pasiekti, optimali jo koncentracija yra nuo 0,1 M iki 0,5 M. EDTA (1-5 mM) reikalingas metalų jonais katalizuoj amų oksidacijos procesų pašalinimui (ir išvengti baltymų agregacijos) , šie procesai pastebimi kai kuriems preparatams. Didesnės nei 15 % glicerino koncentracijos sudaro optimalias struktūros atstatymui sąlygas. Tam ,kad būtų didesnės proceso išeigos, labai svarbu, kad tirpale būtų red-oks reaktyvų pora: oksiduotas ir redukuotas gliutationas ar oksiduotas ir redukuotas cisteinas. Paprastai gaunamos didesnės proceso išeigos, kai oksiduotos ir redukuotos formos molinis santykis yra lygus ar didesnis nei vienetas. TPO preparatų struktūros atstatymui optimalus tirpalo pH yra nuo 7,5 iki 9. Organinių tirpiklių (pvz., etanolis, acetonitrilas, metanolis) toleruojama koncentracija yra 10-15 % arba žemesnė. Didinant organinių tirpiklių koncentraciją, didėja baltymo formų su netaisyklingais disulfidiniais tilteliais. Geriausia naudoti TRIS ir fosfatinius buferinius tirpalus. Atstatant baltymo struktūra 4°C temperatūroje, gaunama didesnė teisingai atstatytos struktūros TPO baltymo išeiga.

TPO preparatams, grynintiems pirmą kartą per C4 kolonėlę, struktūros atstatymo proceso tipiška išeiga sudaro 40-60 % (skaičiuojant nuo redukuoto ir denatūruoto TPO kiekio). Biologiškai aktyvūs preparatai gali būti gaunami, kai struktūros atstatymo procese naudojami mažiau išgryninti TPO preparatai (pvz., po Superdex 200 gelfiltracijos ar po intarpinių kūnelių ekstrakcijos ), bet šiais atvejais šio proceso išeiga būna mažesnė dėl didelio baltymo išsėdimo į nuosėdas ir dėl priemaišinių baltymų trukdymo.

204

Kadangi TPO (Met^-1 1-153) baltymo sudėtyje yra keturios cisteino liekanos, tai galimi trys skirtingi disulfidinių tiltelių susidarymo variantai šiame baltyme:

variantas: disulfidinis ryšys tarp 1-4 ir 2-3 cisteino liekanos variantas: disulfidinis ryšys tarp 1-2 ir 3-4 cisteino liekanos variantas: disulfidinis ryšys tarp 1-3 ir 2-4 cisteino liekanos

Pradinių struktūros atstatymo sąlygų tyrimuose buvo naudojama keletas frakcijų TPO baltymo po chromatografijos atvirkštinių fazių kolonėlėje C4 . Tik viena frakcija pasižymėjo žymesniu biologiniu aktyvumu, tiriant su BA/F3 ląstelėmis. Vėliau struktūros atstatymo sąlygos buvo optimizuojamos, naudojant šiuos preparatus. Šiomis sąlygomis neteisingos struktūros baltymo kiekis buvo mažesnis nei 10-20 % nuo bendro gauto monomerinio TPO kiekio.

Biologiškai aktyvaus TPO disulfidinių tiltelių išsidėstymas buvo nustatytas remiantis masės spektroskopija ir analizuojant baltymo amino rūgščių liekanų seką. Biologiškai aktyvaus TPO baltymo disulfidinių tiltelių vietos yra tarp 1-4 ir 2-3 cisteino liekanos (t.y., 1 variantas). Baltymo frakcijų po C4 chromatografijos mėginiai (5-10 nM) (tripsino ir baltymo molinis santykis 1:25 mišinys buvo analizuojamas matricine lazerine aesorbcine masės spektroskopija prieš ir po redukcijos DDT. Po redukcijos buvo nustatomi baltymo fragmentai, atitinkantys didžiausius tripsininius TPO fragmentus. Neredukuotucse pavyzdžiuose keletas iš šių fragmentų nebuvo nustatyti, bet atsirasdavo kitos molekulinės masės fragmentai. Naujai atsiradusiųjų fragmentu molekulinė masė daugeliu atvejų sutapo su atskirų tripsininių peptidų, da1 yvauj ančių disulfidinių tilteliu susibuvo skaldomi tripsinu

Skaldymo

205 daryme, molekulinių masių suma. Taigi, galima neabejotinai teigti, kad teisingos disulfidinių jungčių vietos atstatytos struktūros rekombinantiniame biologiškai aktyviame TPO baltyme yra tarp 1-4 ir 2-3 cisteino liekanų. Tai sutampa su žinomomis disulfidinių jungčių vietomis eritropoetino molekulėje.

D. Rekombinantinio atstatytos struktūros TPO (Met 1-153) biologinis aktyvumas

Atstatytos struktūros išgrynintas TPO(Met^-1 1-153) pasižymėjo aktyvumu kaip in vitro, taip ir in vivo tyrimuose. Tiriant BA/F3 ląstelėse, buvo nustatyta, kad pusė maksimalios timidino įsijungimo į BA/F3 ląsteles stimuliacijos buvo pasiekiama su 3,3 pg/ml(0,3 pM) TPO. Mėginius tiriant ELISA, pagrista sąveika su mpl receptoriumi, pusė maksimalaus aktyvumo pasiekiama esant

1.9 ng/ml (120 pM) TPO koncentracijai. Normaliuose ir mielosupresuotuose gyvūnuose, apšvitintuose beveik letalia Rentgeno spindulių doze, TPO(Met^_1 1-153) labai efektyviai stimuliavo naujų trombocitų susidarymą (aktyvumas buvo pastebimas net esant 30 ng/pelei dozei).

PAVYZDYS 23

Kitų biologiškai aktyvių TPO variantų produkcija

E. coli

Trys skirtingi TPO variantai, produkuojami E. coli, buvo išgryninti ir atstatyta baltymų struktūra iki biologiškai aktyvių preparatų. Šie variantai buvo tokie:

(1) MFL - 13 amino rūgščių liekanų iš bakterinės STII signalinės sekos buvo sulieta su TPO domeno(1-155 amino rūgščių liekanos) N galu. Gauta galutinė seka: MKKNIAFLLNAYASPAPPAC—CVRRA (SEQ ID Nr.:85), kur lyderinė seka yra pabraukta, C----C pažymėta seka nuo Cys7 iki Cysl51. Šis variantas buvo sukonstruotas, kad būtų galima pažymėti tirozino liekanas radioaktyviu

206 jodu - toks TPO baltymas buvo naudojamas tiriant receptorius ir įvertinant biologinį aktyvumą.

(2) H8MFL - 7 amino rūgščių liekanos iš STII sekos, 8 histidino liekanos ir Xa faktoriaus fermentinio skėlimo vieta IEGR buvo sulieta su TPO baltymo domeno (1-155 amino rūgščių liekana) N galu. Galutinė seka: MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC--CVRRA (SEQ ID Nr.:86), kur lyderinė seka yra pabraukta, C—·C pažymėta seka nuo Cys7 iki Cysl51. Šis TPO baltymo variantas po išgryninimo ir struktūros atstatymo gali būti paveiktas fermentu - Faktoriumi Xa, kuris skelia grandinę po arginino liekanos sekoje IEGR. Po skaldymo gaunamas TPO baltymo variantas su 155 amino rūgščių liekanų seka, kuriame kaip ir gamtiniame baltyme yra serino liekana baltymo N gale.

(3) T-H8MFL - buvo sukonstruotas kaip variante (2) , iškyrus tai, kad trombino skaldoma seka IEPR buvo sulieta su TPO domeno N galu. Galutinė seka: MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC—-CVRRA (SEQ ID Nr.:87), kur lyderinė seka yra pabraukta, C·—C pažymėta seka nuo Cys7 iki Cysl51. Šis TPO baltymo variantas po išgryninimo ir struktūros atstatymo gali būti paveiktas trombinu. Po skaldymo gaunamas gamtinis N galo TPO baltymo variantas su 155 amino rūgščių liekanų seka.

A. Biologiškai aktyvaus TPO variantų (1) , (2) ir (3) išskyrimas, soliubilizavimas ir monomerinių formų išgryninimas.

Visi šie TPO baltymo variantai buvo ekspresuoti E. coli. Šių variantų baltymų pagrindinis kiekis buvo produkuojams intarpiniuose kūneliuose, tai buvo nustatyta TPO (Met^-1 1-153) atveju Pavyzdyje 22. Buvo naudojami identiški baltymų išskyrimo, soliubilizavimo ir monomerinių TPO variantų gryninimo metodai, kaip ir aprašyti Pavyzdyje 22. Buvo naudojamos identiškos struktūros atstatymo sąlygos, kaip ir TPO (Met’¹ 1-153)

207 atveju , bendra šios stadijos išeiga sudarė 30-50 %. Po struktūros atstatymo TPO variantai buvo chromatografuojami C4 atvirkščių fazių kolonėlėje, esant 0,1 % TFA, naudojant aprašytą aukščiau acetonitrilo gradientą. Visi TPO variantai (proteolitiškai nesuskaldyti) pasižymėjo biologiniu aktyvumu, vertinant Ba/F3 analizėje, jų pusiau maksimalus aktyvumas buvo nuo 2 iki 5 pM.

B. Variantų (2) ir (3) proteolitinis skaldymas, gaunant TPO su gamtiniu N baltymo galu (1-155)

Aprašyti aukščiau TPO variantai (2) ir (3) buvo sukonstruoti su papildoma fermetais nuskeliama lyderine seka prieš normalaus TPO baltymo N galinę amino rūgščių liekaną. Po struktūros atstatymo ir išgryninimo aprašyti aukščiau (2) ir (3) TPO variantai buvo skaldomi jiems tinkamais proteolitiniais fermentais. Iš kiekvieno varianto eliuatų nuo C4 kolonėlės acetonitrilas buvo pašalinamas prapučiant tirpalus nestipria azoto srove. Po to variantai buvo paveikti arba Faktoriumi Xa, arba trombinu.

TPO varianto (2) atveju buvo pridedama į tirpalą, iš kurio buvo pašalintas acetonitrilas, 1 M Tris buferinio tirpalo, pH 8,0 iki galutinės jo koncentracijos 50 mM ir tirpalo pH buvo koreguojamas, kad būtų lygus 8. NaCl ir CaCl₂ buvo atitinkamai įdedama iki 0,1 M ir 2 mM. Faktoriaus Xa (New England Bioiabs) buvo įdedama, kad molinis fermento ir TPO baltymo varianto santykis būtų nuo 1:25 iki 1:100. Mėginys buvo inkubuojamas 1-2 valandas kambario temperatūroje, siekiant maksimalaus nuskėlimo, šis procesas buvo kontroliuojamas SDS PAGE analize pagal baltymo migraciją gelyje. Po to reakcijos mišinys buvo gryninamas C4 atvirkščių fazių chromatografija, naudojant tokį pat gradientą ir chromatografijos sąlygas, kaip aprašyta aukščiau gryninant taisyklingos struktūros baltymus. Nesuskaldytas variantas B buvo atskiriamas nuo skaldyto varianto (2) šiomis sąlygomis. Po skaldymo buvo nustatyta

208 baltymo N galo seka - SPAPP, tai įrodo, kad sėkmingai buvo pašalinta lyderinė baltymo seka. Faktorius Xa taip pat gali skelti ir kitoje TPO baltymo sekos vietoje; gali nuskelti ties 118 arginino liekana, tuo atveju baltymo N gale seka yra TTAHKD- (SEQ ID Nr.:88). Atiekant skaldyto Faktoriumi Xa varianto SDS PAGE analizę neredukuojančiomis sąlygomis, stebima viena baltymo juosta, atitinkanti 17000 D molekulinę masę; atliekant SDS PAGE analizę redukuojančiomis sąlygomis, stebimos dvi baltymo juostos, atitinkančios 12000 ir 5000 D molekulinę masę, jei baltymas buvo suskaldytas ties 118 arginino liekana. Šis rezultatas paaiškinamas tuo, kad dvi molekulės dalys yra sujungtos tarpusavyje disulfidiniu tilteliu tarp 1 ir 4 cisteino liekanos, tai buvo nustatyta analizuojant baltymo tripsinini žemėlapį, kaip aprašyta ankščiau. Matuojant biologini aktyvumą su Ba/F3 ląstelėmis, buvo nustatyta, kad išgrynintam TPO (1-155) variantui, pašalinus N gale lyderinę seką ir perskėlus baltymą viduryje, pusė maksimalaus aktyvumo sudarė nuo 0,2 iki 0,3 pM.

TPO varianto (3) atveju skaldymo buferinis tirpalas buvo 50 mM Tris, pH 8, 2 % CHAPS, 0,3 M NaCl, 5 mM EDTA ir žmogaus ar jaučio trombinas (Calbiochem) santykiu nuo 1:25 iki 1:50 (fermento masė su TPO varianto baltymo kiekiu). Baltymo skaldymas buvo vykdomas 2-6 valandas kambario temperatūroje. Skaldymo eiga buvo įvertinama SDS PAGE analize, kaip aprašyta skaldant baltymą Faktoriumi Xa. Šiuo atveju buvo pasiekiama didesnė nei 90 % skaldymo išeiga. Gautas TPO baltymas buvo chromatografuoj amas C4 atvirkščių fazių kolonėlėje, kaip aprašyta aukščiau, po chromatografijos buvo nustatyta, kad baltymas turi N galo baltymo seką. Tik nedidelė (<5 %) baltymo dalis buvo suskaldyta vidinėje baltymo sekos dalyje ties ta pačia arginino ir treonino jungties vieta, kaip ir skaldant faktoriumi Xa. Galutinis T?O baltymas pasižymėjo dideliu biologiniu aktyvu209 mu, jo 0,2 - 0,4 pM sukėlė pusę maksimalaus atsako Ba/F3 ląstelėse. Analizuojant ELISA metodu, kuris paremtas sąveika su mpl receptoriumi,šis baltymas sukėlė pusę maksimalaus atsako, esant jo koncentracijai 2 4 ng/ml (120-240 pM išgryninto baltymo). Tuo tarpu neskaidyto baltymo, turinčio lyderinę seką, aktyvumas abiejose analizėse buvo 5-10 kartų mažesnis. Atliekant tyrimus su gyvulėliais, HPLC išgrynintas suskaldytas baltymas buvo dializuojamas fiziologiniame buferiniame tirpale su 150 mM NaCl, 0,01 % Tween 80 ir 10 mM natrio sukcinato, pH 5.5 arba 10 mM natrio acetato, pH 5,5, arba 10 mM natrio fosfato, pH 7,4. Analizuojant HPLC ir SDS PAGE analize, buvo nustatyta, kad išgrynintas baltymas stabilus keletą savaičių, kai saugomas 4°C temperatūroje. Normaliuose ir mielosupresuotuose pelėse šis išgrynintas TPO baltymas su natyviu N galu labai efektyviai stimuliavo naujų trombocitų susidarymą, aktyvumas buvo pastebimas net esant jo dozei 30 ng/pelei.

PAVYZDYS 24

Sintetinis mpl ligandas

Nors žmogaus mpl ligandas (hML) paprastai gaunamas naudojant rekombinantinius metodus, šis baltymas taip pat gali būti gaunamas, fermentais liguojant sintetinius baltymo fragmentus aprašytais žemiau metodais. Sintetinat hML galima įvesti nenatūralias amino rūgščių liekanas ar sintetinius elementus, tokius, kaip polietilenglikolis. Anksčiau buvo nustatyta, kad mutantinė serininė proteinazė subtilizinas BPN, subtiligazė (S221C/P225A), efektyvi liguojant peptidų esterius vandeniniuose tirpaluose (Abrahmsen et ai., Biochem., 30:4151-4159 [1991]). Buvo parodyta, kad sintetiniai peptidai gali būti fermentiniu būdu nuosekliai liguojami, ir gaunami ilgi polipeptidai, pasižymintys fermentiniu aktyvumu, ar baltymai, tokie kaip ribonukleazė A (Jackson et ai., Science, [1994]). Šis

210 metodas, žemiau aprašytas detaliau, įgalina mus cheminiu būdu sintetinti baltymus, kurie ankščiau buvo gaunami tik rekombinantinės technologijos būdu.

hML153 sintezės, naudojant subtiligazę, strategija pateikta Schemoje 1. Pradedant nuo pilnai deblokuoto peptido, atitinkančio baltymo C galą, subtiligazę prijungiamas N gale apsaugoto ir C gale aktyvuoto sekančio peptido esteris. Kai reakcija pasibaigia, produktas išskiriamas chromatografuoj ant HPLC atvirkščiose fazėse, pašalinama apsauginė grupė N gale. Sekantis peptido fragmentas liguojamas, pašalinamos apsauginės grupės ir procesas kartojamas, naudojant taisyklingus peptidus, kol susintetinamas norimo ilgio baltymas. Procesas panašus i kietafazini metodą, bet šiuo atveju peptido N galas yra apsaugomas, C galas aktyvuojamas, peptidas liguojamas prie N galo, baltymas sintetinamas C—»N kryptimi. Kadangi kiekvienoje prijungimo stadijoje peptidą galima pailginti iki 50 amino rūgščių liekanų, šie tarpiniai produktai yra išskiriami po kiekvieno ligavimo ir todėl ilgesni išgryninti baltymai gali būti sintetinami priimtinomis išeigomis.

211

SCEMA 1 hML sintezės, naudojant subtiligazę, strategija

R-NH-Peptide₂-CO-R‘ + H₂N-Peptide-j-CO₂

1) Subtiligazė

R-NH-Peptide₂-CO-NH-Peptide₁-CO₂| 2) Zn/CH₃CO₂H

H₂N-Peptide₂-CO-NH-Peptide₁-CO₂ | 3) Pakartoti 1+2

H₂N-Peptide₃-CO-NH-Peptide₂-CO-NH-Peptide_rCO₂

Remiantis žiniomis apie subtiligazės specifiškumą, o taip pat biologiškai aktyvaus hML epo-domeno amino rūgščių liekanų seka, mes padalijom hML153 i septynis 18 -15 amino rūgščių liekanų ilgio fragmentus. 18 - 15 amino rūgščių liekanų ligavimo efektyvumas buvo patik30 rintas, naudojant sintetinius tetrapeptidus. Lentelėje' 13 pateikti bandomojo ligavimo rezultatai.

212

LENTELĖ 13 hML bandomasis ligavimas. Donoras ir nukleofiliniai peptidai (10 mM) buvo ištirpinti 100 mM

Tricine (pH 7,8) 22°C temperatūroje. Ligazės buvo pridedama iki galutinės jos koncentracijos 10 μΜ (naudojamas buvo 1,6 mg/ml tirpalas [apie 70 μΜ]), ligavimas buvo vykdomas per naktį. Išeigos nurodytos ligavimo % nuo peptidų donorų hidrolizės.

Vieta	Donoras (glc-K-NH2)	Nukleofilas-NH2	Hidro- lizė, %	Liga- vimas, %
1 (23/24)	HVLH (SEQ ID Nr.:89)	SRLS (SEQ ID Nr.:90)	92	08
(22/23)	SHVL (SEQ ID Nr.:91)	HSRL (SEQ ID Nr.:92)	48	52
2 (46/47)	AVDF (SEQ ID Nr.:93)	SLGE (SEQ ID Nr.:94)	22	78
3 (69/70)	AVTL (SEQ ID Nr.:95)	LLEG (SEQ ID Nr.:96)	53	47
4 (89/90)	LSSL (SEQ ID Nr.:97)	LGQL (SEQ ID Nr.:98)	95	05
(88/89)	C(acm)LSS (SEQ ID Nr.:99)	LLGQ (SEQ ID Nr.:100)	00	00
(90/91)	SSLL (SEQ ID Nr.:101)	GQLS (SEQ ID Nr.:102)	45	55
(88/89)	CLSS (SEQ ID Nr.:103)	LLGQ (SEQ ID Nr.:100)	90	10
5 (107/108)	LQSL (SEQ ID Nr.:104)	LGTQ (SEQ ID Nr.:105)	99	01
(106/107)	ALQS (SEQ ID Nr.:106)	LLGT (SEQ ID Nr.:107)	70	30
6 (128/129)	NAIF (SEQ ID Nr.:108)	LSFQ (SEQ ID Nr.:109)	60	40

Remiantis šiais eksperimentais, lentelėje 14 išvardinti peptidai turi efektyviai liguotis su subtiligaze. Tinkamos apsauginės grupės kiekvieno donorinio 15 peptidinio esterio N gale reikalingos, norint išvengti peptidų tarpusavio ligavimosi. Mes pasirinkome izonikotinilo (iNOC) apsauginę grupę (Veber et ai., J. Org. Chem., 42:3286-3289 [1977]), nes ji tirpi vandenyje, ir gali būti naudojama paskutinėje ketafazinėje peptidų sintezės stadijoje, taip pat ji atspari HF, kai ši rūgštis naudojama apsauginių grupių nuėmimui ir atske20

213 liant peptidus nuo sintezės matricos. Papildomai ji gali būti pašalinta nuo peptidų po kiekvienos ligavimo stadijos švelniomis redukcinėmis sąlygomis (Zn/CH₃CO2H) ir taip gaunamas neblokuotas peptido N galas sekančiam ligavimo žingsniui. Esteris glikolat-lizil-amidas (glcK-NH2) buvo naudojamas aktyvuoti peptidų C galą. Šis pasirinkimas buvo paremtas parengtiniais eksperimentais, kuriuose buvo parodyta, kad jis yra efektyvus liguojant subtiligaze (Abrahmsen et ai., Biochem., 30: 4151-4159 [1991]). Peptidai, apsaugoti iNOC grupe ir aktyvuoti glc-K-amidine grupe, gali būti sintetinami standartiniais kietafaziniais metodais, kurie yra pateikti Schemoje 2. Peptidai nuosekliai buvo liguojami, kol buvo susintetinamas pilno ilgio baltymas, galutinio produkto struktūra buvo atstatoma in vitro. Pagal homologiją su EPO, disulfidiniai tilteliai turi būti sudaryti tarp 7 - 151 ir 18 - 85 cisteino liekanų. Disulfidinių jungčių oksidavimas gali būti atliktas tiesiog maišant tirpalą deguonies atmosferoje keletą valandų. Atstatytos struktūros produktas gali būti išgryninamas, naudojant HPLC, o frakcijos, kuriose yra aktyvus baltymas, surenkamos ir liofilizuotos. Alternatyviu būdu disulfidinės jungtys gali būti skirtingais būdais apsaugotos, siekiant kontroliuoti disulfidinių tiltelių oksidaciją tarp specifinių disulfidinių porų. Apsaugant 7 ir 151 cisteino liekanas acetamidometilo grupe (acm) , galima oksiduoti 28 ir 85 cisteino liekanas atskirai. Nuo blokuotų liekanų acm grupės pašalinamos, o 7 ir 151 cisteino liekanos oksiduojamos. Ir atvirkščiai - 28 ir 85 cisteino liekanos gali būti blokuojamos acm, jeigu oksidacija reikalinga tam, kad susidarytų taisyklingos struktūros baltymas. Papildomai 28 ir 85 cisteino liekanos gali būti pakeistos kitomis natūraliomis arba sintetinėmis liekanomis, ne cisteinu, tam kad būtų galima atlikti taisyklingą oksidaciją tarp 7 ir 151 cisteino liekanų.

214

LENTELĖ 14

Peptidai, naudojami viso h-ML baltymo sintezei su subtiligazę.

Seka	Fragmentas
1	(SEQ ID Nr.:110)	iNOC-NH-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-glc-k-NH₂ (1-22)
2	(SEQ ID Nr.:111)	iNOC-NH-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-glc-k-NH₂ (23-46)
3	(S£Q ID Nr.:112)	iNOC-NH-SLGEWKTQMEETKAQDILGAVTL-glc-k-NH₂ (47-69)
4	(SEQ ID Nr.:113)	iNOC-NH-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-k-NH₂ (70-90)
5	(SEQ ID Nr.:114)	iNOC-NH-GQLSGQVRLLLGALQS-glc-k-NH₂ (91-106)
6	(SEQ ID Nr.:115)	iNOC-NH-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-glc-k-NH₂ (107-128)
7	(SEQ ID Nr.:116)	iNOC-NH-LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO₂

Peptidų ligavimas buvo atliekamas 25°C temperatūroje 10 mM tricino buferiniame tirpale, pH 8 (šviežiai paruoštas ir degazuotas filtruojant vakuume per 5 ųm filtrą). Paprastai C galo peptidinis fragmentas buvo ištirpinamas buferiniame tirpale (2-5 mM peptido) ir buvo pridedamas 10x subtiligazės pradinis (1 mg/ml subtiligazės 100 mM tricino buferiniame tirpale, pH 8) tirpalas iki galutinės fermento koncentracijos apie 5 μΜ. 3-5 kartų molinis perteklius glc-K-NH2 aktyvuoto donorinio peptido buvo pridedama arba kaip sausa medžiaga, arba kaip tirpias, ir reakcijos mišinys buvo paliekamas 25°C temperatūroje. Ligavimo eiga buvo Įvertinama C18 atvirkščių fazių HPLC chromatografija (CH3CN/H2O gradientas su 0,1 % TFA) . Ligavimo produktai buvo gryninami preparatyvine HPLC ir liofilizuojami. Izonicotinilo (INOC) apsauginės grupės buvo pašalinamos maišant su HC1 aktyvuotomis Zn dulkėmis, apsaugant peptidą acto rūgštimi. Nesureagavusios cinko dulkės buvo pašalinamos filtruojant, o acto rūgštis - garinant vakuume. Gautas polipeptidas gali būti iš karto naudojamas ligavimui ir procesas vėl kartojamas. Sintetinis hMLi53 gali būti gautas, liguojant aukščiau aprašytu būdu, su sintetiniu a s rekombinantiniu hMLi54-332 bal215 tymu, ir taip gaunamas sintetinis arba pusiau sintetinis viso ilgio hML.

Sintetinis hML baltymas yra pranašesnis už rekombinantinį. Sintetinio baltymo sudėtyje gali būti pada5 romi įvairūs pakeitimai, siekiant padidinti aktyvumą ar specifiškumą. Polimerinai dariniai, pvz., polietilenglikolis gali būti įjungti į baltymą, kad prolonguotų baltymo veikimą. Pavyzdžiui, polietilenglikolis gali būti prijungtas prie lizino liekanos kuriame nors individualiame fragmente (Lentelė 14) prieš arba po vieno ar kelių ligavimo žingsnių. Proteinazėms jautrios peptidinės jungtys gali būti pašalinamos arba pakeičiamos tam, kad būtų padidintas baltymo stabilumas in vivo. Papildomai gali būti įvedami sunkiųjų metalų atomai, kad būtų galima palengvinti baltymo struktūros nustatymą.

216

SCHEMA 2

Kietafazinė peptidų fragmentų, skirų segmentų ligavimui, sintezė

Izonikotinilas (iNOC) glikolat-lizil-amidas (glc-K-NH₂)

a) Lysil-parametylbenzhidrilamino (MBHA) matrica 1 (0,63 mekv/g, Chemtech) buvo maišoma su bromacto rūgštimi (5 ekv.) ir diizopropilkarbodiimidu (5 ekv.) vieną valandą 25°C temperatūroje dimetilacetamido (DMA) tirpale; gaunamas bromacetilo darinys 2.

b) Matrica buvo gerai atplaunama DMA ir individualios Boc-blokuotos (3 ekv., Bachem) amino rūgštys buvo esterifikuojamos, maišant su natrio hidrokarbonatu (6 ekv.) dimetilformamide (DMF) 24 valandas 50°C temperatūroje, kad būtų galima jas prijungti prie glikolatfenilalanilamidinės matricos 3. Aminoaceti217 linta matrica 3 buvo po 3 kartus praplaunama DMF ir dichlormetanu (CH2CI2)· Taip paruoštą matricą galima saugoti kambario temperatūroje keletą mėnesių. Matrica 3 gali būti naudojama automatiniame peptidų sintezatoriuje (Applied Biosystems 430A), peptidai gali būti prijungiami pagal standartinius kietafazės peptidų sintezės metodus (5) .

c) Ν-α-Boc grupės pašalinamos 45 % trifluoracto rūgšties tirpalu dichlormetane.

d) Po to Boc-apsaugotos amino rūgštys (5 ekv.) yra preaktyvuojamos su benzotriazol-l-il-oksi-tris-(dimetilamino)fosfonio heksafluorfosfatu (BOP, 4 ekv.) ir N-metilmorfolinu (NMM, 10 ekv.) DMA tirpale ir prijungimas vykdomas 1-2 valandas.

e) Ν-α-Boc grupės visiškai pašalinamos (TFA/CH₂C1₂), gaunamas 4 darinys, įvedama izonikotinilo (iNOC) apsauginė grupė, kaip aprašyta aukščiau (4), maišant su

4-isonikotinil-2-4-dinitrofenilkarbonatu (3 ekv.) ir

NMM (6 ekv.) DMA tirpale 25°C temperatūroje 24 valandas.

f) Peptidas atskeliamas nuo matricos ir nuimamos blokavimo grupės, paveikiant bevandeniu HF zolo/5 % etilmetilsulfido) dą. Gaunamas iNOC-apsaugotas, aktyvuotas peptidas 5, kuris atvirkščių fazių HPLC (CH₃CN/H₂O

TFA) . Visų gautų fragmentų tapatumas buvo tikrinamas masės spektrometrij a.

]5 % ani0°C temperatūroje 1 valanglikolat-lys-amid išgryninamas C18 gradientas, 0,1%

Pateiktas išradimas gali būti atkartotas, remiantis aukščiau pateiktu aprašymu ir prieinamomis publikacijomis ir pradinėmis medžiagomisa. Be to pareiškėjo atidavė saugoti American Type Culture Collection (ATCC) muziejui, esančiam Rockville, Md., USA ,ląstelių linijas, išvardytas žemiau:

218

Escherichia coli, DHlOB-pBSK-hmplI 1.8, ATCC saugojimo Nr. CRL 69575, priimtas saugojimui 1994 m. vasario mėn. 24 d.

Plazmidė pSVI.ID.LL.MLORF, ATCC saugojimo Nr. CRL 75958, priimta saugojimui 1994 m. gruodžio mėn. 2 d. ir

CHO DP-12 ląstelės, ML 1/50 MCB (pažymėtos Nr. 1594), ATCC saugojimo Nr. CRL 11770, priimtos saugojimui 1994 m. gruodžio mėn. 6 d.

Šis muziejus buvo sudarytas pagal Budapešto Sutartį, reguliuojančią Tarptautines Mikroorganizmų Muziejų Sudarymo taisykles patentavimo tikslams, ir atitinkamus poįstatyminius aktus. Tai užtikrina gyvybingų kultūrų palaikymą 30 metų nuo priėmimo saugojimui datos. Mikroorganizmai gali būti paimami iš ATCC pagal tvarką, nurodytą Budapešto Sutartyje, ir yra susitarimo objektas tarp pateikėjo ir ATCC, kuris garantuoja neribotą galimybę naudotis kultūromis, nepažeidžiant JAV patento. Galimybė naudotis saugomomis kultūromis nereiškia teisės naudoti šį išradimą, pažeidžiant patento savininko teises, kurios yra garantuojamos kiekvienos Vyriausybės pagal jos Patentų įstatymus.

*******

Kadangi aprašant išradimą būtina pateikti geriausius išradimo įgyvendinimo būdus ir konkrečius darbinius pavyzdžius, tai kiekvienas eilinis specialistas, perskaitęs šį aprašymą, galės padaryti įvairius pakeitimus, naudoti medžiagų analogus, ir kitaip pakeisti išradimą, nepakeičiant esmės. Tai yra, šis išradimas gali būti panaudojamas kitaip, nei čia aprašyta. Todėl laikoma, kad patentu suteikiama apsauga ribojama išradimo apibrėžtimi, taikant ekvivalentus.

219

SEKOS (1) PAGRINDINĖ INFORMACIJA:

(i) PATEIKĖJAS: Eaton, Dan L.

de Sauvage, Federic J.

(ii) IŠRADIMO PAVADINIMAS: TROMBOPOETINAS (iii) Sekų skaičius: 144 (iv) ADRESAS SUSIRAŠINĖJIMUI:

(A) ADRESAS: Genentech, Ine.

(B) GATVĖ: 460 Point San Bruno Blvd (C) MIESTAS: South San Francisco (D) VALSTIJA: Kalifornija (E) ŠALIS: JAV (F) KODAS: 94080 (v) KOMPIUTERINĖ VERSIJA:

(A) NEŠIKLIS: 3,5 colio, 1.44Mb lankstūs laikmenys.

(B) KOMPIUTERIS: IBM PC suderinamas (C) OPERACINĖ SISTEMA: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: WinPatin (Genentech) (vi) PASKUTINIO PATEIKIMO DUOMENYS:

(A) PATEIKIMO Nr.: 08/374540 (B) UŽPILDYMO DATA: 1995.01.18 (C) KLASIFIKACIJA:

(vii) ANKSTESNIOJO PATEIKIMO DUOMENYS:

(A) PATEIKIMO Nr.:PCT/US94/14553 (B) UŽPILDYMO DATA: 1994.12.28 (vii) ANKSTESNIOJO PATEIKIMO DUOMENYS:

(A) PATEIKIMO Nr.:08/249376 (B) UŽPILDYMO DATA: 1994.05.25 (vii) ANKSTESNIOJO PATEIKIMO DUOMENYS:

(A) PATEIKIMO Nr.:08/223263 (B) UŽPILDYMO DATA: 1994.04.04 (vii) ANKSTESNIOJO PATEIKIMO DUOMENYS:

(A) PATEIKIMO Nr.:08/196689 (B) UŽPILDYMO DATA: 1994.02.15 (vii) ANKSTESNIOJO PATEIKIMO DUOMENYS:

(A) PATEIKIMO Nr.:08/348658 (B) UŽPILDYMO DATA: 1994.12.02 (vii) ANKSTESNIOJO PATEIKIMO DUOMENYS:

(A) PATEIKIMO Nr.:08/185607 (B) UŽPILDYMO DATA: 1994.01.21 (vii) ANKSTESNIOJO PATEIKIMO DUOMENYS:

(A) PATEIKIMO Nr.:08/348657 (B) UŽPILDYMO DATA: 1994.12.02 (vii) ANKSTESNIOJO PATEIKIMO DUOMENYS:

(A) PATEIKIMO Nr.:08/176553

220 (B) UŽPILDYMO DATA: 1994.01.03 (viii) INFORMACIJA APIE PATIKĖTINĮ/AGENTĄ:

(A) PAVARDĖ: Winter, Daryl B.

(B) REGISTRACIJOS Nr.: 32,637 (C) NUORODOS/APRAŠO Nr.: P0871P5 (ix) TELEKOMUNIKACINĖ INFORMACIJA:

(A) TELEFONAS: 415/225-1249 (B) TELEFAKSAS: 415/952-9881 (C) TELEKSAS: 910/371-7168 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 1:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 353 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė

(xi)

SEKA

SEQ

ID Nr.:

1:

Met

Glu

Leu

Thr

Glu

Leu

Vai

Met

Leu

Thr

-21

-20

-15

-10

Ala

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

.Ser

Pro

Ala

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

-5

1

5

Arg

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

10

15

20

Arg

Leu

Ser

Gln

Cys

Pro

Glu

Vai

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

25

30

35

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gln

40

45

50

Met

Glu

Thr

Lys

Ala

Gln

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

55

60

65

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

Ala

Arg

Gly

Gln

Leu

Gly

Pro

Thr

70

75

80

Cys

Leu

Ser

Leu

Gly

Gln

Leu

Ser

Gly

Gln

Vai

Arg

Leu

85

90

95

Leu

Gly

Ala

Leu

Gln

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Leu

Pro

100

105

110

Gln

Gly

Arg

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

115

120

125

221

Ser 130

Phe

Gln

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg 140

Phe

Leu

Met

Leu

Vai

Gly

Ser

Thr

Lėu

Cys

Vai

Arg

Ala

Pro

Thr

145

150

155

Ala

Vai

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Vai

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

160

165

170

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

175

180

185

Ala

Arg

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Lys

Trp

Gln

Gly

Phe

190

195

200

Arg

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Asn

Gln

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

205

210

215

Asp

Gln

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Asn

220

225

230

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

* Thr

Leu

Gly

235

240

245

Ala

Pro

Asp

Ile

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

250

255

260

Pro

Asn

Leu

Gln

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

265

270

275

Thr

Gly

Gln

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

280

285

290

Pro

Vai

Gln

Leu

His

Pro

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

295

300

305

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

310

315

320

Ser

Gln

Asn

Leu

Ser

Gln

Glu

Gly

325

330

332

(2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 2:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 1795 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 2:

TCTTCCTACC CATCTGCTCC CCAGAGGGCT GCCTGCTGTG CACTTGGGTC 50

222

CTGGAGCCCT TCTCCACCCG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG 100

CCCCACCCTA CTCTGCCCAG AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC 150

CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA 200

GACACCCCGG	CCAGA	ATG Met -21	GAG Glu -20	CTG Leu	ACT Thr	GAA Glu	TTG Leu	CTC Leu -15	CTC Leu	239
GTG GTC ATG	CTT CTC	CTA	ACT	GCA	AGG	CTA	ACG	CTG	TCC	278
Vai Vai Met	Leu Leu -10	Leu	Thr	Ala	Arg -5	Leu	Thr	Leu	Ser
AGC CCG GCT	CCT CCT	GCT	TGT	GAC	CTC	CGA	GTC	CTC	AGT	317
Ser Pro Ala 1	Pro Pro 5	Ala	Cys	Asp	Leu	Arg 10	Vai	Leu	Ser
AAA CTG CTT	CGT GAC	TCC	CAT	GTC	CTT	CAC	AGC	AGA	CTG	356
Lys Leu Leu 15	Arg Asp	Ser	His 20	Vai	Leu	His	Ser	Arg 25	Leu 1
AGC CAG TGC	CCA GAG	GTT	CAC	CCT	TTG	CCT	ACA	CCT	GTC	395
Ser Gln Cys	Pro Glu 30	Vai	His	Pro	Leu 35	Pro	Thr	Pro	Vai	-
CTG CTG CCT	GCT GTG	GAC	TTT	AGC	TTG	GGA	GAA	TGG	AAA	434
Leu Leu Pro 40	Ala Vai	Asp 45	Phe	Ser	Leu	Gly	Glu 50	Trp	Lys
ACC CAG ATG	GAG GAG	ACC	AAG	GCA	CAG	GAC	ATT	CTG	GGA	473
Thr Gln Met 55	Glu Glu	Thr	Lys	Ala 60	Gln	Asp	Ile	Leu	Gly 65
GCA GTG ACC	CTT CTG	CTG	GAG	GGA	GTG	ATG	GCA	GCA	CGG	512
Ala Vai Thr	Leu Leu 70	Leu	Glu	Gly	Vai	Met 75	Ala	Ala	Arg
GGA CAA CTG	GGA CCC	ACT	TGC	CTC	TCA	TCC	CTC	CTG	GGG	551
Gly Gln Leu 80	Gly Pro	Thr	Cys 85	Leu	Ser	Ser	Leu	Leu 90	Gly
CAG CTT TCT	GGA CAG	GTC	CGT	CTC	CTC	CTT	GGG	GCC	CTG	590
Gln Leu Ser	Gly Gln 95	Vai	Arg	Leu	Leu 100	Leu	Gly	Ala	Leu
CAG AGC CTC	CTT GGA	ACC	CAG	CTT	CCT	CCA	CAG	GGC	AGG	629
Gln Ser Leu 105	Leu Gly	Thr 110	Gln	Leu	Pro	Pro	Gln 115	Gly	Arg
ACC ACA GCT	CAC AAG	GAT	CCC	AAT	GCC	ATC	TTC	CTG	AGC	668
Thr Thr Ala 120	His Lys	Asp	Pro	Asn 125	Ala	Ile	Phe	Leu	Ser 130

TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG 707

223

Phe

Gln

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg 140

Phe

Leu

Met

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

746

Leu

Vai 145

Gly

Ser

Thr

Leu 150

Cys

Vai

Arg

Ala 155

Pro

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

TCT

CTA

GTC

CTC

785

Pro

Thr

Ala 160

Vai

Pro

Ser

Arg

Thr 165

Ser

Leu

Vai

Leu

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

TTG

824

Thr 170

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

ACT

GGC

TCT

863.

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

Thr

Gly

Ser 195

GGG

CTT

CTG

AAG

TGG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

902

Gly

Leu

Lys

Trp 200

Gln

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

nė·

CCT

GGT

CTG

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

941

Pro

Gly 210

Leu

Asn

Gln

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gln

ATC

CCC

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ATA

CAC

GAA

CTC

TTG

AAT

980

Ile

Pro

Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

Ile

His 230

Glu

Leu

Asn

GGA

ACT

CGT

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

TCA

CGC

AGG

ACC

1019

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg 245

Arg

Thr

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

1058

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

GGC

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

1097

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gln

Pro

Gly 270

Tyr

Ser

Pro

TCC

CCA

ACC

CAT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

1136

Ser

Pro 275

Thr

His

Pro

Thr 280

Gly

Gln

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

CCC

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

1175

Pro

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Vai

Gln

Leu

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

ACG

CCC

ACC

1214

His

Pro

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

300 305 310

224

CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC 1253 Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser
315	320	325
CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG T AAGGT TCTCAGĄCAC 1290 Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly 330 332
TGCCGACATC AGCATTGTCT	CATGTACAGC TCCCTTCCCT	GCAGGGCGCC 1340
CCTGGGAGAC AACTGGACAA	GATTTCCTAC TTTCTCCTGA	AACCCAAAGC 1390
CCTGGTAAAA GGGATACACA	GGACTGAAAA GGGAATCATT	TTTCACTGTA 1440
CATTATAAAC CTTCAGAAGC	TATTTTTTTA AGCTATCAGC	AATACTCATC 1490
AGAGCAGCTA GCTCTTTGGT	CTATTTTCTG CAGAAATTTG	CAACTCACTG *1540
ATTCTCTACA TGCTCTTTTT	CTGTGATAAC TCTGCAAAGG	CCTGGGCTGG 1590
CCTGGCAGTT GAACAGAGGG	AGAGACTAAC CTTGAGTCAG	AAAACAGAGA 1640
AAGGGTAATT TCCTTTGCTT	CAAATTCAAG GCCTTCCAAC	GCCCCCATCC 1690
CCTTTACTAT CATTCTCAGT	GGGACTCTGA TCCCATATTC	TTAACAGATC 1740
TTTACTCTTG AGAAATGAAT	AAGCTTTCTC TCAGAAAAAA	AAAAAAAAAA 1790

AAAAA 1795 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 3:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 42 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr. : 3 :

Leu -16

Leu -15

Leu Vai

Vai

Met

Leu -10

Leu

Thr Ala Arg -5

Leu Thr

Leu

Ser

Pro

Ala

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Vai

Leu

Ser

Lys

1

5

10

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu

15

20

25

26

(2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 4:

(l) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 390 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė

225 (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 4 :

GAATTCCTGG AATACCAGCT GACAATGATT TCCTCCTCAT CTTTCAACCT 50

CACCTCTCCT CATCTAAGAA	TTG Leu -16	CTC Leu -15	CTC Leu	GTG Vai	GTC ATG CTT	91
Vai	Met	Leu -10
CTC CTA ACT GCA AGG CTA	ACG	ČTG	TCC	AGC	CCG	GCT	CCT	130
Leu Leu Thr Ala Arg Leu	Thr	Leu	Ser	Ser	Pro	Ala	Pro
-5				1
CCT GCT TGT GAC CTC CGA	GTC	CTC	AGT	AAA	CTG	CTT	CGT	169
Pro Ala Cys Asp Leu Arg	Vai	Leu	Ser	Lys	Leu	Leu	Arg
5 10					15			-
GAC TCC CAT GTC CTT CAC	AGC	AGA	CTG	GTGA GAACTCCCAA	210
Asp Ser His Vai Leu His	Ser	Arg	Leu
20		25	26

CATTATCCCC	TTTATCCGCG	TAACTGGTAA	GACACCCATA	* CTCCCAGGAA	260
GACACCATCA	CTTCCTCTAA	CTCCTTGACC	CAATGACTAT	TCTTCCCATA	310
TTGTCCCCAC	CTACTGATCA	CACTCTCTGA	CAAGAATTAT	TCTTCACAAT	360
ACAGCCCGCA	TTTAAAAGCT	CTCGTCTAGA	390
(2)	INFORMACIJA APIE SEKĄ	SEQ ID Nr.	: 5:
(i)	SEKOS CHARAKTERISTIKA
	(A) ILGIS:	390 bazių ;	Porų

(B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė

(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 5:
TCTAGACGAG	AGCTTTTAAA	TGCGGGCTGT	ATTGTGAAGA	ATAATTCTTG	50
TCAGAGAGTG	TGATCAGTAG	GTGGGGACAA	TATGGGAAGA	ATAGTCATTG	100
GGTCAAGGAG	TTAGAGGAAG	TGATGGTGTC	TTCCTGGGAG	TATGGGTGTC	150
TTACCAGTTA	CGCGGATAAA	GGGGATAATG	TTGGGAGTTC	TCACCAGTCT	200
GCTGTGAAGG	ACATGGGAGT	CACGAAGCAG	TTTACTGAGG	ACTCGGAGGT	250
CACAAGCAGG	AGGAGCCGGG	CTGGACAGCG	TTAGCCTTGC	AGTTAGGAGA	300
AGCATGACCA	CGAGGAGCAA	TTCTTAGATG	AGGAGAGGTG	AGGTTGAAAG	350

ATGAGGAGGA AATCATTGTC AGCTGGTATT CCAGGAATTC 390

226 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 6:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 332 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka

(xi)

(C) GRADIŠKUMAS SEKA SEQ ID Nr.

: linijinė : 6:

Ser 1

Pro

Ala

Pro

Pro 5

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg 10

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Vai

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gln

Cys

Pro 30

Glu

Vai

His

Pro

Leu 35

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Vai

.Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gln

Met 55

Glu

Thr

Lys t

Ala 60

Gln

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Vai

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Vai

Met 75

Ala

Arg

Gly

Gln 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

Leu

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gln

Leu

Ser

Gly 95

Gln

Vai

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gln 105

Ser

Leu

Gly

Thr 110

Gln

Leu

Pro

Gln 115

Gly

Arg

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gln

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg 140

Phe

Leu

Met

Leu

Vai 145

Gly

Ser

Thr

Leu 150

Cys

Vai

Arg

Ala 155

Pro

Thr

Ala 160

Vai

Pro

Ser

Arg

Thr 165

Ser

Leu

Vai

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

Thr

Gly

Ser 195

Gly

Leu

Lys

Trp 200

Gln

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Asn

Gln

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gln

Ile

Pro

Gly

Tyr 225

Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe

227

230 235 240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg 245

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gln

Pro

Gly 270

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro 275

Thr

His

Pro

Thr 280

Gly

Gln

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Vai

Gln

Leu

His 300

Pro

Leu

Pro

Asp 305

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr 310

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser 315

Pro

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gln

Asn

Leu

Ser

Gln

320 325 330

Glu Gly 332 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 7:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 166 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 7:

Ala 1

Pro

Arg

Leu 5

Ile

Cys

Asp

Ser

Arg 10

Vai

Leu

Glu

Arg

Tyr 15

Leu

Glu

Ala

Lys 20

Glu

Ala

Glu

Asn

Ile 25

Thr

Gly

Cys

Ala 30

Glu

His

Cys

Ser

Leu 35

Asn

Glu

Asn

Ile

Thr 40

Vai

Pro

Asp

Thr

Lys 45

Vai

Asn

Phe

Tyr

Ala 50

Trp

Lys

Arg

Met

Glu 55

Vai

Gly

Gln

Ala 60

Vai

Glu

Vai

Trp

Gln 65

Gly

Leu

Ala

Leu

Leu 70

Ser

Glu

Ala

Vai

Leu 75

Arg

Gly

Gln

Ala

Leu 80

Leu

Vai

Asn

Ser

Ser 85

Gln

Pro

Trp

Glu

Pro 90

Leu

Gln

Leu

His

Vai 95

Asp

Lys

Ala

Vai

Ser 100

Gly

Leu

Arg

Ser

Leu 105

Thr

Leu

Arg 110

Ala

Leu

Gly

Ala

Gln 115

Lys

Glu

Ala

Ile

Ser 120

228

Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala 125 130 135

Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Vai Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 140 145 150

Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 155 160 165

Arg

166 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 8:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 328 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė

Ser 1	(xi) Pro Ala	SEKA SEQ ID Nr.:	8 : Asp	Leu Arg Vai 10	1 Leu Ser	Lys	Leu 15
Pro	Pro Ala 5	Cys
Leu	Arg Asp	Ser	His Vai 20	Leu	His	Ser Arg Leu 25	Ser Gln	Čys	Pro 30
Glu	Vai His	Pro	Leu Pro 35	Thr	Pro	Vai Leu Leu 40	Pro Ala	Vai	Asp 45
Phe	Ser Leu	Gly	Glu Trp 50	Lys	Thr	Gln Met Glu 55	Glu Thr	Lys	Ala 60
Gln	Asp Ile	Leu	Gly Ala 65	Vai	Thr	Leu Leu Leu 70	Glu Gly	Vai	Met 75
Ala	Ala Arg	Gly	Gln Leu 80	Gly	Pro	Thr Cys Leu 85	Ser Ser	Leu	Leu 90
Gly	Gln Leu	Ser	Gly Gln 95	Vai	Arg	Leu Leu Leu 100	Gly Ala	Leu	Gln 105
Ser	Leu Leu	Gly	Thr Gln 110	Gly	Arg	Thr Thr Ala 115	His Lys	Asp	Pro 120
Asn	Ala Ile	Phe	Leu Ser 125	Phe	Gln	His Leu Leu 130	Arg Gly	Lys	Vai 135
Arg	Phe Leu	Met	Leu Vai 140	Gly	Gly	Ser Thr Leu 145	Cys Vai	Arg	Arg 150
Ala	Pro Pro	Thr	Thr Ala 155	Vai	Pro	Ser Arg Thr 160	Ser Leu	Vai	Leu 165

Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr

229

170

175

180

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Lys

185

190

195

Trp

Gln

Gly

Phe

Arg

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Asn

Gln

200

205

210

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gln

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

215

220

225

His

Glu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser

230

235

240

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

Ile

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

245

250

-

255

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Asn

Leu

Gln

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

260

265

270

Pro

Thr

His

Pro

Thr

Gly

Gln

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

275

280

285

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Gln

Leu

His

Pro

Leu

Pro

290

295

300

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Asn

305

310

315

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gln

Asn

Leu

Ser

Gln

Glu

Gly

320

325

328

(2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 9:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 265 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 9:

Ser 1

Pro

Ala

Pro

Pro 5

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg 10

Vai

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Vai

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gln

Cys

Pro 30

Glu

Vai

His

Pro

Leu 35

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gln

Met 55

Glu

Thr

Lys

Ala 60

Gln

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Vai

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Vai

Met 75

230

Ala Ala

Arg

Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys

Leu

Ser Ser

Leu Leu 90

80

85

Gly

Gln

Leu

Ser

Gly

Gln

Vai

Arg

Leu

Gly

Ala

Leu

Gln

95

100

105

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Leu

Pro

Gln

Gly

Arg

Thr

Ala

110

115

120

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gln

His

Leu

125

130

135

Arg

Gly

Lys

Asp

Phe

Trp

Ile

Vai

Gly

Asp

Lys

Leu

His

Cys

Leu

140

145

150

Ser

Gln

Asn

Tyr

Trp

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu

Vai

Ala

Gly

-Ile

155

160

165

Gln

Ser

Gln

Asp

Ser

Trp

Ser

Ala

Glu

Pro

Asn

Leu

Gln

Vai

Pro

170

175

-

180

Gly

Pro

Asn

Pro

Arg

Ile

Pro

Glu

Gln

Asp

Thr

Arg

Thr

Leu

Glu

185

190

195

Trp

Asn

Ser

Trp

Thr

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Thr

Gln

Asp

Pro

Arg

200

205

210

Ser

Pro

Gly

His

Phe

Leu

Arg

Asn

Ile

Arg

His

Arg

Leu

Pro

Ala

215

220

225

Thr

Gln

Pro

Ala

Trp

Ile

Phe

Ser

Phe

Pro

Asn

Pro

Ser

230

235

240

Tyr

Trp

Thr

Vai

Tyr

Ala

Leu

Pro

Ser

Thr

His

Leu

Ala

His

245

250

255

Pro

Cys

Gly

Pro

Ala

Pro

Ala

Ser

260 265 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.:' 10:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 261 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė

	(xi)	SEKA SEQ ID	Nr.	: 10
Ser	Pro Ala	Pro Pro Ala	Cys	Asp	Leu	Arg	Vai	Leu	Ser	Lys	Leu
1		5				10					15
Leu	Arg Asp	Ser His Vai	Leu	His	Ser	Arg	Leu	Ser	Gln	Cys	Pro
		20				25					30

Glu Vai His Pro Leu Pro Thr Pro Vai Leu Leu Pro Ala Vai Asp

231

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gln

Met

Glu

Thr

Lys

Ala

50

55

60

Gln

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

65

70

75

Ala

Arg

Gly

Gln

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Leu

80

85

90

Gly

Gln

Leu

Ser

Gly

Gln

Vai

Arg

Leu

Gly

Ala

Leu

Gln

95

100

105

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Gly

Arg

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

110

115

-

120

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gln

His

Leu

Arg

Gly

Lys

Asp

125

130

135

Phe

Trp

Ile

Vai

Gly

Asp

Lys

Leu

His

Cys

Leu

Ser

Gln*

Asn

Tyr

140

145

150

Trp

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu

Vai

Ala

Gly

Ile

Gln

Ser

Qln

Asp

155

160

165

Ser

Trp

Ser

Ala

Glu

Pro

Asn

Leu

Gln

Vai

Pro

Gly

Pro

Asn

Pro

170

175

180

Arg

Ile

Pro

Glu

Gln

Asp

Thr

Arg

Thr

Leu

Glu

Trp

Asn

Ser

Trp

185

190

195

Thr

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Thr

Gln

Asp

Pro

Arg

Ser

Pro

Gly

His

200

205

210

Phe

Leu

Arg

Asn

Ile

Arg

His

Arg

Leu

Pro

Ala

Thr

Gln

Pro

215

220

225

Ala

Trp

Ile

Phe

Ser

Phe

Pro

Asn

Pro

Ser

Tyr

Trp

Thr

Vai

230

235

240

Tyr

Ala

Leu

Pro

Ser

Thr

His

Leu

Ala

His

Pro

Cys

Gly

Pro

245

250

255

Ala

Pro

Ala

Ser

260

261

(2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 11:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 7849 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė

232 (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 11:

CCCAGCCTCC	TTTCTCTTGT	TCCCTGGTCA	TGCCTGCCTC	CCTGTCTCCT	50
GTCTCTCCCT	CCCACACACA	CCCACTATCC	TCCCAGCTAT	CCCTACACCC	100
TCCTTCCTAA	TCTTGGGAGA	CATCTCGTCT	GGCTGGACGG	GAAAATTCCA	150
GGATCTAGGC	CACACTTCTC	AGCAGACATG	CCCATCCTTG	GGGAGGAGGA	200
ACAGGAGAGA	GCCTGAGGAA	GTTCTGGGGG	ACAGGGGGAT	GATGGGATCA	250
AGGTCAGGCC	AGGAAGCCCC	TGAGGACAGA	GACTGTGGGG	AGACTGGGAC	300
TGGGAAGAAA	GCAAAGGAGC	TAGAGCCAGG	GCCAAAGGAA	AAGGGGGGCC	350
AGCAGGGAGG	TATTTGCGGG	GGAGGTCCAG	CAGCTGTCTT	TCCTAAGACA	400
GGGACACATG	GGCCTGGTTA	TTCCTCTTGT	CACATGTGGA	ACGGTAGGAG	450
ATGGAAGACG	GAGACAGAAC	AAGCAAAGGA	GGGCCCTGGG	CACAGAGGTC	500
TGTGTGTGTA	GCCATCCAAG	CCACTGGACC	CCAGCAGACG	AGCACCTAĄG	550
CTCAGGCTTA	ACCCAGTGCA	CGTGTGCGCA	CATACATGTG	CCCCGCACCT	600
GACAGTCCAC	TCAACCCGTC	CAAACCCTTT	CCCCATAACA	CCAACCCATA	650
ACAGGAGATT	TCTCTCATGT	GGGCAATATC	CGTGTTCCCA	CTTCGAAAGG	700
GGGAATGACA	AGATAGGACT	CCCTAGGGGA	TTACAGAAAG	AAAAGCAGGA	750
AAGCAAGCAT	CCTGTTGGAT	TTCAGCAGCA	GGTATGATGT	CCAGGGAAAA	800
GAAATTTGGA	TAGCCAGGGA	GTGAAAACCC	CACCAATCTT	AAACAAGACC	850
TCTGTGCTTC	TTCCCCAGCA	ACACAAATGT	CCTGCCAGAT	TCCTCCTGGA	900
AAAAAACTTC	TGCTCCTGTC	CCCCTCCAGG	TCCCAGGTTG	CCCATGTCCA	950
GGAAAAGATG	GATCCCCCTA	TCCAAATCTT	CTCCGTGGTG	TGTGTGGGTG	1000
GAGGAGTGGA	CCCTGGTCCA	GGCAGGGGCT	CCAGGGAAGA	GAAGGCGTCA	1050
CTTCCGGGGG	CCTTCACCAG	TGTCTGGTGG	CTCCCTTCTC	TGATTGGGCA	1100
GAAGTGGCCC	AGGCAGGCGT	ATGACCTGCT	GCTGTGGAGG	GGCTGTGCCC	1150
CACCGCCACA	TGTCTTCCTA	CCCATCTGCT	CCCCAGAGGG	CTGCCTGCTG	1200
TGCACTTGGG	TCCTGGAGCC	CTTCTCCACC	CGGTGAGTGG	CCAGCAGGGT	1250

GTGGGGTTAT GTGAGGGTAG AAAGGACAGC AAAGAGAAAT GGGCTCCCAG 1300

233

CTGGGGGAGG	GGCAGGCAAA	CTGGAACCTA	CAGGCACTGA	CCTTTGTCGA	1350
GAAGAGTGTA	GCCTTCCCAG	AATGGGAGGA	GCAGGGCAGA	GCAGGGGTAG	1400
GGGGTGGGGT	GCTGGTTTCT	GAGGGACTGA	TCACTTACTT	GGTGGAATAC	1450
AGCACAGCCC	TGGCTGGCCC	TAAGGAAAGG	GGACATGAGC	CCAGGGAGAA	1500
AATAAGAGAG	GGAGCTGCAC	TTAGGGCTTA	GCAAACACAG	TAGTAAGATG	1550
GACACAGCCC	CAATCCCCAT	TCTTAGCTGG	TCATTCCTCG	TTAGCTTAAG	1600
GTTCTGAATC	TGGTGCTGGG	GAAGCTGGGC	CAGGCAAGCC	AGGGCGCAAG	1650
GAGAGGGTAA	TGGGAGGAGG	GCCCACTCAT	GTTGACAGAC	CTACAGGAAA	1700
TCCCAATATT	GAATCAGGTG	CAAGCCTCTT	TGCACAACTT	GTGAAAGGAG	1750
GAGGAAGCCA	TGTGGGGGGT	CCTGTGAAGG	AACCGGAAGG	GGTTCTGCCA	1800
AGGGGGCAGG	GAGGCAGGTG	TGAGCTATGA	GACAGATATG	TTAGTGGGCG	1850
CCTAAGACAA	GGTAAGCCCC	TAAGGTGGGC	ATCACCCAGC	AGGTGCCCGT	1900
TCCTGGGCAG	CTGGTCTCAG	GAAGGAAGTC	CCAGAACTGT	TAGCCCATCT	1950
CTTGGCCTCA	GATAATGGAG	TATTTCAGGA	CTTGGAGTCC	AAAGAAAAGC	2000
TCCAGTGGCT	TTATGTGTGG	GGGTAGATAG	GGAAAGAATA	GAGGTTAATT	2050
TCTCCCATAC	CGCCTTTTAA	TCCTGACCTC	TAGTGGTCCC	AGTTACAGCT	2100
TTGTGCAGTT	CCCCTCCCCA	GCCCCACTCC	CCACCGCAGA	AGTTACCCCT	2150
CAACATATTG	CGCCCGTTTG	CCAGTTCCTC	ACCCAGGCCC	TGCATCCCAT	2200
TTTCCACTCT	CTTCTCCAGG	CTGAAGCCAC	AATACTTTCC	TTCTCTATCC	2250
CCATCCCAGA	TTTTCTCTGA	CCTAACAACC	AAGGTTGCTC	AGAATTTAAG	2300
GCTAATTAAG	ATATGTGTGT	ATACATATCA	TGTCCTGCTG	CTCTCAGCAG	2350
GGGTAGGTGG	CACCAAATCC	GTGTCCGATT	CACTGAGGAG	TCCTGACAAA	2400
AAGGAGACAC	CATATGCTTT	CTTGCTTTCT	TTCTTTCTTT	CTTTCTTTTT	2450
TTTTTTTTGA	GACGGAGTTT	CACTCTTATT	GCCCAGGCTG	GAGTGCAATG	2500
GTGCGATCTC	GGCTCACCAC	AAACCTCCGC	CTCCCAGGTA	CAAGCGATTC	2550
TCCTGTCTCA	GCCTCCCAAG	TAGCTTGGAT	TACAGGCATG	AGCCACCACA	2600
CCCTGCTAGT	TTTTTTGTAT	TTCGTAGAGC	CGGGGTTTCA	CCATGTTAGT	2650

GAGGCTGGTG GCGAACTCCT GACCTCAGGT GATCCACCCG CCTTGGACTC 2700

234

CCAAAGTGCT	GGGATTACAG	GCATGAGCCA	CTGCACCCGG	CACACCATAT	2750
GCTTTCATCA	CAAGAAAATG	TGAGAGAATT	CAGGGCTTTG	GCAGTTCCAG	2800
GCTGGTCAGC	ATCTCAAGCC	CTCCCCAGCA	TCTGTTCACC	CTGCCAGGCA	2850
GTCTCTTCCT	AGAAACTTGG	TTAAATGTTC	ACTCTTCTTG	CTACTTTCAG	2900
GATAGATTCC	TCACCCTTGG	CCCGCCTTTG	CCCCACCCTA	CTCTGCCCAG	2950
AAGTGCAAGA	GCCTAAGCCG	CCTCCATGGC	CCCAGGAAGG	ATTCAGGGGA	3000
GAGGCCCCAA	ACAGGGAGCC	ACGCCAGCCA	GACACCCCGG	CCAGAATGGA	3050
GCTGACTGGT	GAGAACACAC	CTGAGGGGCT	AGGGCCATAT	GGAAACATGA	3100
CAGAAGGGGA	GAGAGAAAGG	AGACACGCTG	CAGGGGGCAG	GAAGCTGGGG	3150
GAACCCATTC	TCCCAAAAAT	AAGGGGTCTG	AGGGGTGGAT	TCCCTGGGTT	3200
TCAGGTCTGG	GTCCTGAATG	GGAATTCCTG	GAATACCAGC	TGACAATGAT	3250
TTCCTCCTCA	TCTTTCAACC	TCACCTCTCC	TCATCTAAGA	ATTGCTCCTC	3300
GTGGTCATGC	TTCTCCTAAC	TGCAAGGCTA	ACGCTGTCCA	GCCCGGCTČC	3350
TCCTGCTTGT	GACCTCCGAG	TCCTCAGTAA	ACTGCTTCGT	GACTCCCATG	3400
TCCTTCACAG	CAGACTGGTG	AGAACTCCCA	ACATTATCCC	CTTTATCCGC	34 50
GTAACTGGTA	AGACACCCAT	ACTCCCAGGA	AGACACCATC	ACTTCCTCTA	3500
ĄCTCCTTGAC	CCAATGACTA	TTCTTCCCAT	ATTGTCCCCA	CCTACTGATC	3550
ACACTCTCTG	ACAAGAATTA	TTCTTCACAA	TACAGCCCGC	ATTTAAAAGC	3600
TCTCGTCTAG	AGATAGTACT	CATGGAGGAC	TAGCCTGCTT	ATTAGGCTAC	3650
CATAGCTCTC	TCTATTTCAG	CTCCCTTCTC	CCCCCACCAA	TCTTTTTCAA	3700
CAGAGCCAGT	GCCCAGAGGT	TCACCCTTTG	CCTACACCTG	TCCTGCTGCC	3750
TGCTGTGGAC	TTTAGCTTGG	GAGAATGGAA	AACCCAGATG	GTAAGAAAGC	3800
CATCCCTAAC	CTTGGCTTCC	CTAAGTCCTG	TCTTCAGTTT	CCCACTGCTT	3850
CCCATGGATT	CTCCAACATT	CTTGAGCTTT	TTAAAAATAT	CTCACCTTCA	3900
GCTTGGCCAC	CCTAACCCAA	TCTACATTCA	CCTATGATGA	TAGCCTGTGG	3950
ATAAGATGAT	GGCTTGCAGG	TCCAATATGT	GAATAGATTT	GAAGCTGAAC	4000

ACCATGAAAA GCTGGAGAGA AATCGCTCAT GGCCATGCCT TTGACCTATT 4 050

CCYGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAG AAGCAAGACT CATATGTCAT 4100

235

CCACAGATGA	CACAAAGCTG	GGAAGTACCA	CTAAAATAAC	AAAAGACTGA	4150
ATCAAGATTC	AAATCACTGA	AAGACTAGGT	CAAAAACAAG	GTGAAACAAC	4200
AGAGATATAA	ACTTCTACAT	GTGGGCCGGG	GGCTCACGCC	TGTAATCCCA	4250
GCACTTTGGG	AGGCCGAGGC	AGGCAGATCA	CCTGAGGGCA	GGAGTTTGAG	4300
AGCAGCCTGG	CCAACATGGC	GAAACCCCGT	CTCTACTAAG	AATACAAAAT	4350
TAGCCGGGCA	TGGTAGTGCA	TGCCTGTAAT	CCCAGCTACT	TGGAAGGCTG	4400
AAGCAGGAGA	ATCCCTTGAA	CCCAGGAGGT	GGAGGTTGTA	GTGAGCTGAG	4450
ATCATGCCAA	TGCACTCCAG	CCTGGGTGAC	AAGAGCAAAA	CTCCGTCTCA	4500
AAAAGAAAAA	AAAATTCTAC	ATGTGTAAAT	TAATGAGTAA	AGTCCTATTC	4550
CAGCTTTCAG	GCCACAATGC	CCTGCTTCCA	TCATTTAAGC	CTCTGGCCCT	4600
AGCACTTCCT	ACGAAAAGGA	TCTGAGAGAA	TTAAATTGCC	CCCAAAC?TTA	4650
CCATGTAACA	TTACTGAAGC	TGCTATTCTT	AAAGCTAGTA	ATTCTTGTCT	4700
GTTTGATGTT	TAGCATCCCC	ATTGTGGAAA	TGCTCGTACA	GAACTCTATT	4750
CCGAGTGGAC	TACACTTAAA	TATACTGGCC	TGAACACCGG	ACATCCCCCT	4800
GAAGACATAT	GCTAATTTAT	TAAGAGGGAC	CATATTAAAC	TAACATGTGT	4850
CTAGAAAGCA	GCAGCCTGAA	CAGAAAGAGA	CTAGAAGCAT	GTTTTATGGG	4900
CAATAGTTTA	AAAAACTAAA	ATCTATCCTC	AAGAACCCTA	GCGTCCCTTC	4950
TTCCTTCAGG	ACTGAGTCAG	GGAAGAAGGG	CAGTTCCTAT	GGGTCCCTTC	5000
TAGTCCTTTC	TTTTCATCCT	TATGATCATT	ATGGTAGAGT	CTCATACCTA	5050
CATTTAGTTT	ATTTATTATT	ATTATTTGAG	ACGGAGTCTC	ACTCTATCCC	5100
CCAGGCTGGA	GTGCAGTGGC	ATGATCTCAA	CTCACTGCAA	CCTCAGCCTC	5150
CCGGATTCAA	GCGATTCTCC	TGCCTCAGTC	TCCCAAGTAG	CTGGGATTAC	5200
AGGTGCCCAC	CACCATGCCC	AGCTAATTTT	TGTATTTTTG	GTAGAGATGG	5250
GGTTTCACCA	TGTTGGCCAG	GCTGATCTTG	AACTCCTGAC	CTCAGGTGAT	5300
CCACCTGCCT	CAGCCTCCCA	AAGTGCTGGG	ATTACAGGCG	TGAGCCACTG	5350
CACCCAGCCT	TCATTCAGTT	TAAAAATCAA	ATGATCCTAA	GGTTTTGCAG	5400
CAGAAAGAGT	AAATTTGCAG	CACTAGAACC	AAGAGGTAAA	AGCTGTAACA	5450

GGGCAGATTT CAGCAACGTA AGAAAAAAGG AGCTCTTCTC ACTGAAACCA 5500

236

AGTGTAAGAC	CAGGCTGGAC	TAGAGGACAC	GGGAGTTTTT	GAAGCAGAGG	5550
CTGATGACCA	GCTGTCGGGA	GACTGTGAAG	GAATTCCTGC	CCTGGGTGGG	5600
ACCTTGGTCC	TGTCCAGTTC	TCAGCCTGTA	TGATTCACTC	TGCTGGCTAC	5650
TCCTAAGGCT	CCCCACCCGC	TTTTAGTGTG	CCCTTTGAGG	CAGTGCGCTT	5700
CTCTCTTCCA	TCTCTTTCTC	AGGAGGAGAC	CAAGGCACAG	GACATTCTGG	5750
GAGCAGTGAC	CCTTCTGCTG	GAGGGAGTGA	TGGCAGCACG	GGGACAACTG	5800
GGACCCACTT	GCCTCTCATC	CCTCCTGGGG	CAGCTTTCTG	GACAGGTCCG	5850
TCTCCTCCTT	GGGGCCCTGC	AGAGCCTCCT	TGGAACCCAG	GTAAGTCCCC	5900
AGTCAAGGGA	TCTGTAGAAA	CTGTTCTTTT	CTGACTCAGT	CCCACTAGAA	5950
GACCTGAGGG	AAGAAGGGCT	CTTCCAGGGA	GCTCAAGGGC	AGAAGAGCTG	6000
ATCTACTAAG	AGTGCTCCCT	GCCAGCCACA	ATGCCTGGGT	ACTGGCA,TCC	6050
TGTCTTTCCT	ACTTAGACAA	GGGAGGCCTG	AGATCTGGCC	CTGGTGTTTG	6100
GCCTCAGGAC	CATCCTCTGC	CCTCAGCTTC	CTCCACAGGG	CAGGACCAČA	6150
GCTCACAAGG	ATCCCAATGC	CATCTTCCTG	AGTTTCCAAC	ACCTGCTCCG	6200
AGGAAAGGTG	CGTTTCCTGA	TGCTTGTAGG	AGGGTCCACC	CTCTGCGTCA	6250
GGCGGGCCCC	ACCCACCACA	GCTGTCCCCA	GCAGAACCTC	TCTAGTCCTC	6300
ACACTGAACG	AGCTCCCAAA	CAGGACTTCT	GGATTGTTGG	AGACAAACTT	6350
CACTGCCTCA	GCCAGAACTA	CTGGCTCTGG	GCTTCTGAAG	TGGCAGCAGG	6400
GATTCAGAGC	CAAGATTCCT	GGTCTGCTGA	ACCAAACCTC	CAGGTCCCTG	6450
GACCAAATCC	CCGGATACCT	GAACAGGATA	CACGAACTCT	TGAATGGAAC	6500
TCGTGGACTC	TTTCCTGGAC	CCTCACGCAG	GACCCTAGGA	GCCCCGGACA	6550
TTTCCTCAGG	AACATCAGAC	ACAGGCTCCC	TGCCACCCAA	CCTCCAGCCT	6600
GGATATTCTC	CTTCCCCAAC	CCATCCTCCT	ACTGGACAGT	ATACGCTCTT	6650
CCCTCTTCCA	CCCACCTTGC	CCACCCCTGT	GGTCCAGCTC	CACCCCCTGC	6700
TTCCTGACCC	TTCTGCTCCA	ACGCCCACCC	CTACCAGCCC	TCTTCTAAAC	6750
ACATCCTACA	CCCACTCCCA	GAATCTGTCT	CAGGAAGGGT	AAGGTTCTCA	6800
GACACTGCCG	ACATCAGCAT	TGTCTCATGT	ACAGCTCCCT	TCCCTGCAGG	6850

GCGCCCCTGG GAGACAACTG GACAAGATTT CCTACTTTCT CCTGAAACCC 6900

237

AAAGCCCTGG	TAAAAGGGAT	ACACAGGACT	GAAAAGGGAA	TCATTTTTCA	6950
CTGTACATTA	TAAACCTTCA	GAAGCTATTT	TTTTAAGCTA	TCAGCAATAC	7000
TCATCAGAGC	AGCTAGCTCT	TTGGTCTATT	TTCTGCAGAA	ATTTGCAACT	7050
CACTGATTCT	CTACATGCTC	TTTTTCTGTG	ATAACTCTGC	AAAGGCCTGG	7100
GCTGGCCTGG	CAGTTGAACA	GAGGGAGAGA	CTAACCTTGA	GTCAGAAAAC	7150
AGAGAAAGGG	TAATTTCCTT	TGCTTCAAAT	TCAAGGCCTT	CCAACGCCCC	7200
CATCCCCTTT	ACTATCATTC	TCAGTGGGAC	TCTGATCCCA	TATTCTTAAC	7250
AGATCTTTAC	TCTTGAGAAA	TGAATAAGCT	TTCTCTCAGA	AATGCTGTCC	•7300
CTATACACTA	GACAAAACTG	AGCCTGTATA	AGGAATAAAT	GGGAGCGCCG	7350
AAAAGCTCCC	TAAAAAGCAA	GGGAAAGATG	TTCTTCGAGG	GTGGCAATAG *	7400
ATCCCCCTCA	CCCTGCCACC	CCAAACAAAA	AAGCTAACAG	GAAGCCTTGG	7450
AGAGCCTCAC	ACCCCAGGTA	AGGCTGTGTA	GACAGTTCAG	TAAAGACAGG	7500
ACCTGGATGT	GACAGCTGAG	CAAACAGCTA	GAGCTTTGGC	AGCTCAGCAG	7550
GAGGCTTTGC	CAGGCATGGA	CGCCTGCCTC	CCTCCTGTGG	AGGTCAGGAG	7600
GAAGTGCAGG	AAGTGGCATG	AGTCAGGCTC	CTTGAGCTCA	CACAGCAGGA	7650
GAACAAGTAC	AAGTCAAGTA	CAAGTTGAAG	GCTCATTTCC	CAGTTCCCGC	7700
AAATGCATCT	AAAAAGCAGC	TCTGTGTGAC	CACCATAAAC	TCTGCTAGGG	7750
GATCTCTAAA	AAGGAGTCAG	GCTTATGGGG	CTTTGCAAAT	AAGTGCTGCC	7800
TTGGTGCTCA	GGAAAAGGTT	TGTGTTGCAC	AAAACACAAA	TTCCACTGC 7849
(2)	INFORMACIJA APIE SEKĄ	SEQ ID Nr.	: 12:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 1443 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 12:

GAGTCCTTGG CCCACCTCTC TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50

AAGCTCAAGC CGCCTCCATG GCCCCAGGAA AGATTCAGGG GAGAGGCCCC 100

ATACAGGGAG CCACTTCAGT TAGACACCCT GGCCAGA ATG GAG 143 Met Glu

238

-21

-20

CTG

ACT

GAT

TTG

CTC

CTG

GCG

GCC

ATG

CTT

GCA

GTG

182

Leu

Thr

Asp

Leu

Ala

Met

Leu

Ala

Vai

-15

-10

GCA

AGA

CTA

ACT

CTG

TCC

AGC

CCC

GTA

GCT

CCT

GCC

TGT

221

Ala

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Pro

Vai

Ala

Pro

Ala

Cys

-5

1

5

GAC

CCC

AGA

CTC

CTA

AAT

AAA

CTG

CGT

GAC

TCC

CAC

260

Asp

Pro

Arg

Leu

Asn

Lys

Leu

Arg

Asp

Ser

His

10

15

20

CTC

CTT

CAC

AGC

CGA

CTG

AGT

CAG

TGT

CCC

GAC

GTC

GAC

299

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gln

Cys

Pro

Asp

Vai

Asp

25

30

CCT

TTG

TCT

ATC

CCT

GTT

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

338

Pro

Leu

Ser

Ile

Pro

Vai

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

35

40

45

«

AGC

CTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

ACG

GAA

CAG

AGC

AAG

377

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gln

Thr

Glu

Gln

Ser

Lys

50

55

GCA

CAG

GAC

ATT

CTA

GGG

GCA

GTG

TCC

CTT

CTA

CTG

GAG

416

Ala

Gln

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Vai

Ser

Leu

Glu

60

65

70

GGA

GTG

ATG

GCA

CGA

GGA

CAG

TTG

GAA

CCC

TCC

TGC

455

Gly

Vai

Met

Ala

Arg

Gly

Gln '

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys

75

80

85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGA

CAG

CTT

TCT

GGG

CAG

GTT

CGC

494

Leu

Ser

Leu

Gly

Gln

Leu

Ser

Gly

Gln

Vai

Arg

90

95

CTC

TTG

GGG

GCC

CTG

CAG

GGC

CTC

CTA

GGA

ACC

CAG

533

Leu

Gly

Ala

Leu

Gln

Gly

Leu

Gly

Thr

Gln

100 105 110

GGC AGG ACC ACA GCT

CAC AAG

GAC Asp

CCC Pro 120

AAT Asn

GCC Ala

CTC Leu

TTC Phe

572

Gly Arg

Thr

Thr 115

Ala

His

Lys

TTG

AGC

TTG

CAA

CTG

CTT

CGG

GGA

AAG

GTG

CGC

TTC

611

Leu

Ser

Leu

Gln

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg

Phe

125

130

135

CTG

CTT

CTG

GTA

GAA

GGT

CCC

ACC

CTC

TGT

GTC

AGA

CGG

650

Leu

Vai

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu

Cys

Vai

Arg

140

145

150

ACC CTG CCA ACC ACA GCT GTC CCA AGC AGT ACT TCT CAA 68 9

239

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr 155

Ala

Vai

Pro

Ser

Ser 160

Thr

Ser

Gln

CTC

ACA

CTA

AAC

AAG

TTC

CCA

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA 728

Leu

Thr

Leu

Asn

Lys

Phe

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

165

170

175

TTG

GAG

ACG

AAC

TTC

AGT

GTC

ACA

GCC

AGA

ACT

GCT 767

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Ser

Vai

Thr

Ala

Arg

Thr

Ala

180

185

GGC

CCT

GGA

CTT

CTG

AGC

AGG

CTT

CAG

GGA

TTC

AGA

GTC 806

Gly

Pro

Gly

Leu

Ser

Arg

Leu

Gln

Gly

Phe

Arg

Vai

190

195

200

AAG

ATT

ACT

CCT

GGT

CAG

CTA

AAT

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC 845

Lys

Ile

Thr

Pro

Gly

Gln

Leu

Asn

Gln

Thr

Ser

Arg

Ser

205

210

215

CCA

GTC

CAA

ATC

TCT

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ACA

CAC

GGA 884

Pro

Vai

Gln

Ile

Ser

Gly

Tyr

Leu

Asn

Arg

Thr

His

Gly.

220

225

CCT

GTG

AAT

GGA

ACT

CAT

GGG

CTC

TTT

GCT

GGA

ACC

TCA 923

Pro

Vai

Asn

Gly

Thr

His

Gly

Leu

Phe

Ala

Gly

Thr

Ser

230

235

240

CTT

CAG

ACC

CTG

GAA

GCC

TCA

GAC

ATC

TCG

CCC

GGA

GCT 962

Leu

Gln

Thr

Leu

Glu

Ala

Ser

Asp

Ile

Ser

Pro

Gly

Ala

245

250

TTC

AAC

AAA

GGC

TCC

CTG

GCA

TTC

AAC

CTC

CAG

GGT

GGA 1001

Phe

Asn

Lys

Gly

Ser

Leu

Ala

Phe

Asn

Leu

Gln

Gly

255

260

265

CTT

CCT

TCT

CCA

AGC

CTT

GCT

CCT

GAT

GGA

CAC

ACA 1040

Leu

Pro

Ser

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro

Asp

Gly

His

Thr

270

275

280

CCC

TTC

CCT

TCA

CCT

GCC

TTG

CCC

ACC

CAT

GGA 1079

Pro

Phe

Pro

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Thr

His

Gly

285

290

TCT

CCA

CCC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

TTT

CCT

GAC

CCT

TCC 1118

Ser

Pro

Gln

Leu

His

Pro

Leu

Phe

Pro

Asp

Pro

Ser

295

300

305

ACC

ATG

CCT

AAC

TCT

ACC

GCC

CCT

CAT

CCA

GTC

ACA 1157

Thr

Met

Pro

Asn

Ser

Thr

Ala

Pro

His

Pro

Vai

Thr

310

315

ATG

TAC

CCT

CAT

CCC

AGG

AAT

TTG

TCT .

CAG

GAA

ACA

TAGCGC 1199

Met

Tyr

Pro

His

Pro

Arg

Asn

Leu

Ser

Gln

Glu

Thr

320

325

330

331

240

G GGCACTGGCC CAGTGAGCGT CTGCAGCTTC TCTCGGGGAC 1240

AAGCTTCCCC AGGAAGGCTG AGAGGCAGCT GCATCTGCTC CAGATGTTCT 1290

GCTTTCACCT AAAAGGCCCT GGGGAAGGGA TACACAGCAC TGGAGATTGT 134 0

AAAATTTTAG GAGCTATTTT TTTTTAACCT ATCAGCAATA TTCATCAGAG 13 90

CAGCTAGCGA TCTTTGGTCT ATTTTCGGTA TAAATTTGAA AATCACTAAT 1440

TCT 1443 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 13:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 352 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka

	(C)	TOPOLOGIJA:	linij inė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.	: 13:
Met Glu Leu -21 -20	Thr	Asp Leu Leu -15	Leu Ala Ala Met Leu Leu Ala Vai -10
Ala Arg Leu -5	Thr	Leu Ser Ser 1	Pro Vai Ala Pro Ala Cys Asp Pro 5
Arg Leu Leu 10	Asn	Lys Leu Leu 15	Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser 20
Arg Leu Ser 25	Gln	Cys Pro Asp 30	Vai Asp Pro Leu Ser Ile Pro Vai 35
Leu Leu Pro 40	Ala	Vai Asp Phe 45	Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln 50
Thr Glu Gln 55	Ser	Lys Ala Gln 60	Asp Ile Leu Gly Ala Vai Ser Leu 65
Leu Leu Glu 70	Gly	Vai Met Ala 75	Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser 80
Cys Leu Ser 85	Ser	Leu Leu Gly 90	Gln Leu Ser Gly Gln Vai Arg Leu 95
Leu Leu Gly 100	Ala	Leu Gln Gly 105	Leu Leu Gly Thr Gln Gly Arg Thr 110
Thr Ala His 115	Lys	Asp Pro Asn 120	Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln 125
Leu Leu Arg 130	Gly	Lys Vai Arg 135	Phe Leu Leu Leu Vai Glu Gly Pro 140

Thr Leu Cys Vai Arg Arg Thr Leu Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser

241

145	150	155
Ser Thr Ser	Gln Leu Leu Thr Leu	Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr
160	165	170
Ser Gly Leu	Leu Glu Thr Asn Phe	Ser Vai Thr Ala Arg Thr Ala
175	180	185
Gly Pro Gly	Leu Leu Ser Arg Leu	Gln Gly Phe Arg Vai Lys Ile
190	195	200
Thr Pro Gly	Gln Leu Asn Gln Thr	Ser Arg Ser Pro Vai Gln Ile
205	210	215
Ser Gly Tyr	Leu Asn Arg Thr His	Gly Pro Vai Asn Gly Thr His
220	225	230
Gly Leu Phe	Ala Gly Thr Ser Leu	Gln Thr Leu Glu Ala Ser Asp
235	240	245
Ile Ser Pro	Gly Ala Phe Asn Lys	Gly Ser Leu Ala Phe·Asn Leu
250	255	260
Gln Gly Gly	Leu Pro Pro Ser Pro	Ser Leu Ala Pro Asp Gly His
265	270	275
Thr Pro Phe	Pro Pro Ser Pro Ala	Leu Pro Thr Thr His Gly Ser
280	285	290
Pro Pro Gln	Leu His Pro Leu Phe	Pro Asp Pro Ser Thr Thr Met
295	300	305
Pro Asn Ser	Thr Ala Pro His Pro	Vai Thr Met Tyr Pro His Pro
310	315	320
Arg Asn Leu	Ser Gln Glu Thr
325	330 331
(2)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 14:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 1536 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKŪMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 14:

GAGTCCTTGG

AAGCTCAAGC

CCCACCTCTC TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50

CGCCTCCATG GCCCCAGGAA AGATTCAGGG GAGAGGCCCC 100

ATACAGGGAG CCACTTCAGT TAGACACCCT GGCCAGA

ATG GAG 143 Met Glu

242

-21 -20

CTG

ACT

GAT

TTG

CTC

CTG

GCG

GCC

ATG

CTT

GCA

GTG

182

Leu

Thr

Asp

Leu

Leu -15

Leu

Ala

Met

Leu -10

Leu

Ala

Vai

GCA

AGA

CTA

ACT

CTG

TCC

AGC

CCC

GTA

GCT

CCT

GCC

TGT

221

Ala

Arg -5

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser 1

Pro

Vai

Ala

Pro 5

Ala

Cys

GAC

CCC

AGA

CTC

CTA

AAT

AAA

CTG

CGT

GAC

TCC

CAC

260

Asp

Pro

Arg 10

Leu

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

CTC

CTT

CAC

AGC

CGA

CTG

AGT

CAG

TGT

CCC

GAC

GTC

GAC

299

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gln

Cys

Pro 30

Asp

Vai

Asp

CCT

TTG

TCT

ATC

CCT

GTT

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

338

Pro

Leu 35

Ser

Ile

Pro

Vai

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp 45

Phe.

AGC

CTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

CAG

ACG

GAA

CAG

AGC

AAG

377

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gln

Thr 55

Glu

Gln

Ser

Lys

·

GCA

CAG

GAC

ATT

CTA

GGG

GCA

GTG

TCC

CTT

CTA

CTG

GAG

416

Ala 60

Gln

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Vai

Ser

Leu

Leu 70

Leu

Glu

GGA

GTG

ATG

GCA

CGA

GGA

CAG

TTG

GAA

CCC

TCC

TGC

455

Gly

Vai

Met 75

Ala

Arg

Gly

Gln 80

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys 85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGA

CAG

CTT

TCT

GGG

CAG

GTT

CGC

494

Leu

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gln

Leu

Ser

Gly 95

Gln

Vai

Arg

CTC

TTG

GGG

GCC

CTG

CAG

GGC

CTC

CTA

GGA

ACC

CAG

533

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gln 105

Gly

Leu

Gly

Thr 110

Gln

CTT

CCT

CTA

CAG

GGC

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAC

CCC

572

Leu

Pro

Leu

Gln 115

Gly

Arg

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

AAT

GCC

CTC

TTC

TTG

AGC

TTG

CAA

CTG

CTT

CGG

GGA

611

Asn 125

Ala

Leu

Phe

Leu

Ser 130

Leu

Gln

Leu

Leu 135

Arg

Gly

AAG

GTG

CGC

TTC

CTG

CTT

CTG

GTA

GAA

GGT

CCC

ACC

CTC

650

Lys

Vai

Arq 140

Phe

Leu

Vai 14 5

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu 150

TGT GTC AGA CGG ACC CTG CCA ACC ACA GCT GTC CCA AGC 689

243

Cys

Vai

Arg

Thr 155

Leu

Pro

Thr

Ala 160

Vai

Pro

Ser

AGT

ACT

TCT

CAA

CTC

ACA

CTA

AAC

AAG

TTC

CCA

AAC

728

Ser

Thr 165

Ser

Gln

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Lys

Phe

Pro 175

Asn

AGG

ACT

TCT

GGA

TTG

GAG

ACG

AAC

TTC

AGT

GTC

ACA

767

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Ser

Vai

Thr

GCC

AGA

ACT

GCT

GGC

CCT

GGA

CTT

CTG

AGC

AGG

CTT

CAG

806

Ala 190

Arg

Thr

Ala

Gly

Pro 195

Gly

Leu

Ser

Arg 200

Leu

Gln

GGA

TTC

AGA

GTC

AAG

ATT

ACT

CCT

GGT

CAG

CTA

AAT

CAA

845

Gly

Phe

Arg 205

Vai

Lys

Ile

Thr

Pro 210

Gly

Gln

Leu

Asn

Gln 215

ACC

TCC

AGG

TCC

CCA

GTC

CAA

ATC

TCT

GGA

TAC

CTG

AAC

884

Thr

Ser

Arg

Ser

Pro 220

Vai

Gln

Ile

Ser

Gly 225

Tyr

Leu

Asn.

AGG

ACA

CAC

GGA

CCT

GTG

AAT

GGA

ACT

CAT

GGG

CTC

TTT

923

Arg

Thr 230

His

Gly

Pro

Vai

Asn 235

Gly

Thr

His

Gly

Leu 240

Phe

GCT

GGA

ACC

TCA

CTT

CAG

ACC

CTG

GAA

GCC

TCA

GAC

ATC

962

Ala

Gly

Thr

Ser 245

Leu

Gln

Thr

Leu

Glu 250

Ala

Ser

Asp

Ile

TCG

CCC

GGA

GCT

TTC

AAC

AAA

GGC

TCC

CTG

GCA

TTC

AAC

1001

Ser 255

Pro

Gly

Ala

Phe

Asn 260

Lys

Gly

Ser

Leu

Ala 265

Phe

Asn

CTC

CAG

GGT

GGA

CTT

CCT

TCT

CCA

AGC

CTT

GCT

CCT

1040

Leu

Gln

Gly 270

Gly

Leu

Pro

Ser 275

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro 280

GAT

GGA

CAC

ACA

CCC

TTC

CCT

TCA

CCT

GCC

TTG

CCC

1079

Asp

Gly

His

Thr

Pro 285

Phe

Pro

Ser

Pro 290

Ala

Leu

Pro

ACC

CAT

GGA

TCT

CCA

CCC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

TTT

1118

Thr

Thr 295

His

Gly

Ser

Pro

Pro 300

Gln

Leu

His

Pro

Leu 305

Phe

CCT

GAC

CCT

TCC

ACC

ATG

CCT

AAC

TCT

ACC

GCC

CCT

1157

Pro

Asp

Pro

Ser 310

Thr

Met

Pro

Asn 315

Ser

Thr

Ala

Pro

CAT

CCA

GTC

ACA

ATG

TAC

CCT

CAT

CCC

AGG

AAT

TTG

TCT

1196

His 320

Pro

Vai

Thr

Met

Tyr 325

Pro

His

Pro

Arg

Asn 330

Leu

Ser

244

CAG GAA ACA TAGCG CGGGCACTGG CCCAGTGAGC GTCTGCAGCT 124 0 Gln Glu Thr

335

TCTCTCGGGG ACAAGCTTCC CCAGGAAGGC TGAGAGGCAG CTGCATCTGC 12 90
TCCAGATGTT	CTGCTTTCAC	CTAAAAGGCC	CTGGGGAAGG	GATACACAGC	1340
ACTGGAGATT	GTAAAATTTT	AGGAGCTATT	TTTTTTTAAC	CTATCAGCAA	1390
TATTCATCAG	AGCAGCTAGC	GATCTTTGGT	CTATTTTCGG	TATAAATTTG	1440
AAAATCACTA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	1490
AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA	AAAAAA 1536
(2)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.	: 15:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 356 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka

	(C)	TOPOLOGIJA:	linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.	: 15:
Met Glu Leu -21 -20	Thr	Asp Leu Leu -15	Leu Ala Ala Met Leu Leu Ala Vai -10
Ala Arg Leu -5	Thr	Leu Ser Ser 1	Pro Vai Ala Pro Ala Cys Asp Pro 5
Arg Leu Leu 10	Asn	Lys Leu Leu 15	Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser 20
Arg Leu Ser 25	Gln	Cys Pro Asp 30	Vai Asp Pro Leu Ser Ile Pro Vai 35
Leu Leu Pro 40	Ala	Vai Asp Phe 45	Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln 50
Thr Glu Gln 55	Ser	Lys Ala Gln 60	Asp Ile Leu Gly Ala Vai Ser Leu 65
Leu Leu Glu 70	Gly	Vai Met Ala 75	Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser 80
Cys Leu Ser 85	Ser	Leu Leu Gly 90	Gln Leu Ser Gly Gln Vai Arg Leu 95
Leu Leu Gly 100	Ala	Leu Gln Gly 105	Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu 110
Gln Gly Arg 115	Thr	Thr Ala His 120	Lys Asp Pro Asn Ala Leu Phe Leu 125

245

Ser Leu 130	Gln	Gln	Leu	Leu Arg Gly Lys 135	Vai	Arg 140	Phe	Leu Leu Leu
Vai Glu	Gly	Pro	Thr	Leu Cys Vai Arg	Arg	Thr	Leu	Pro Thr Thr
145				150		155
Ala Vai	Pro	Ser	Ser	Thr Ser Gln Leu	Leu	Thr	Leu	Asn Lys Phe
160				165		170
Pro Asn	Arg	Thr	Ser	Gly Leu Leu Glu	Thr	Asn	Phe	Ser Vai Thr
175				180		185
Ala Arg	Thr	Ala	Gly	Pro Gly Leu Leu	Ser	Arg	Leu	Gln Gly Phe
190				195		200
Arg Vai	Lys	Ilė	Thr	Pro Gly Gln Leu	Asn	Gln	Thr	Ser Arg Ser
205				210		215
Pro Vai	Gln	Ile	Ser	Gly Tyr Leu Asn	Arg	Thr	His	Gly Pro Vai
220				225		230		t
Asn Gly	Thr	His	Gly	Leu Phe Ala Gly	Thr	Ser	Leu	Gln Thr Leu
235				240		245
Glu Ala	Ser	Asp	Ile	Ser Pro Gly Ala	Phe	Asn	Lys	Gly Šer Leu
250				255		260
Ala Phe	Asn	Leu	Gln	Gly Gly Leu Pro	Pro	Ser	Pro	Ser Leu Ala
265				270		275
Pro Asp	Gly	His	Thr	Pro Phe Pro Pro	Ser	Pro	Ala	Leu Pro Thr
280				285		290
Thr His	Gly	Ser	Pro	Pro Gln Leu His	Pro	Leu	Phe	Pro Asp Pro
295				300		305
Ser Thr	Thr	Met	Pro	Asn Ser Thr Ala	Pro	His	Pro	Vai Thr Met
310				315		320
Tyr Pro	His	Pro	Arg	Asn Leu Ser Gln	Glu	Thr
325				330		335
(2)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID	Nr. :	16:
(i)	SEKOS CHARAKTERISTIKA:
		(A) ILGIS: 241 amino rūgščių	liekanos
		(B) TIPAS: amino rūgščių	liekanų	seka

(C) TOPOLOGIJA: linijinė

(xi

) SEKA

SEQ

ID

Nr. :

16 :

Ser 1

Pro

Vai

Ala

Pro 5

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg 10

Leu

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gln

Cys

Pro

246

25 30

Asp

Vai Asp

Pro

Leu 35

Ser

Ile

Pro

Vai

Leu 40

Leu

Pro Ala

Vai

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gln

Thr

Glu

Gln

Ser

Lys

Ala

50

55

60

Gln

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Vai

Ser

Leu

Glu

Gly

Vai

Met

65

70

75

Ala

Arg

Gly

Gln

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys

Leu

Ser

Leu

80

85

90

Gly

Gln

Leu

Ser

Gly

Gln

Vai

Arg

Leu

Gly

Ala

Leu

Gln

95

100

.105

Gly

Leu

Gly

Thr

Gln

Leu

Pro

Leu

Gln

Gly

Arg

Thr

Ala

110

115

120

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Leu

Phe

Leu

Ser

Leu

Gln

Giri

• Leu

Leu

125

130

135

Arg

Gly

Lys

Asp

Phe

Trp

Ile

Vai

Gly

Asp

Glu

Leu

Gln

Cys

His

140

145

150

Ser

Gln

Asn

Cys

Trp

Pro-

Trp

Thr

Ser

Glu

Gln

Ala

Ser

Gly

Ile

155

160

165

Gln

Ser

Gln

Asp

Tyr

Ser

Trp

Ser

Ala

Lys

Ser

Asn

Leu

Gln

Vai

170

175

180

Pro

Ser

Pro

Asn

Leu

Trp

Ile

Pro

Glu

Gln

Asp

Thr

Arg

Thr

Cys

185

190

195

Glu

Trp

Asn

Ser

Trp

Ala

Leu

Cys

Trp

Asn

Leu

Thr

Ser

Asp

Pro

200

205

210

Gly

Ser

Leu

Arg

His

Leu

Ala

Arg

Ser

Phe

Gln

Arg

Leu

Pro

215

220

225

Gly

Ile

Gln

Pro

Gly

Trp

Thr

Ser

Phe

Ser

Lys

Pro

Cys

230 235 240

Ser

241 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 17:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 335 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 17:

247

Ser 1

Pro

Vai

Ala

Pro 5

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg 10

Leu

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gln

Cys

Pro 30

Asp

Vai

Asp

Pro

Leu 35

Ser

Ile

Pro

Vai

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gln

Thr 55

Glu

Gln

Ser

Lys

Ala 60

Gln

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Vai

Ser

Leu

Leu ⁷⁰

Leu

Glu

Gly

Vai

Met 75

Ala

Arg

Gly

Gln 80

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys 85

Leu

Ser

Leu.

. Leu 90

Gly

Gln

Leu

Ser

Gly 95

Gln

Vai

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gln 105

Gly

Leu

Gly

Thr 110

Gln

Leu

Pro

Leu

Gln 115

Gly

Arg

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Leu

Phe

Leu

Ser 130

Leu

Gln

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg 140

Phe

Leu

Vai 145

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu 150

Cys

Vai

Arg

Thr 155

Leu

Pro

Thr

Ala 160

Vai

Pro

Ser

Thr 165

Ser

Gln

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Lys

Phe

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Ser

Vai

Thr

Ala 190

Arg

Thr

Ala

Gly

Pro 195

Gly

Leu

Ser

Arg 200

Leu

Gln

Gly

Phe

Arg 205

Vai

Lys

Ile

Thr

Pro 210

Gly

Gln

Leu

Asn

Gln 215

Thr

Ser

Arg

Ser

Pro 220

Vai

Gln

Ile

Ser

Gly 225

Tyr

Leu

Asn

Arg

Thr 230

His

Gly

Pro

Vai

Asn 235

Gly

Thr

His

Gly

Leu 240

Phe

Ala

Gly

Thr

Ser 245

Leu

Gln

Thr

Leu

Glu 250

Ala

Ser

Asp

Ile

Ser 255

Pro

Gly

Ala

Phe

Asn 260

Lys

Gly

Ser

Leu

Ala 265

Phe

Asn

Leu

Gln

Gly 270

Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro Asp Gly His Thr Pro

248

				275
Phe	Pro	Pro	Ser	Pro 290
Gln	Leu	His	Pro	Leu 305
Ser	Thr	Ala	Pro	His 320
Leu	Ser	Gln	Glu	Thr 335

Ala	Leu	Pro	Thr	Thr 295
Phe	Pro	Asp	Pro	Ser 310
Pro	Vai	Thr	Met	Tyr

325

280

				285
His	Gly	Ser	Pro	Pro 300
Thr	Thr	Met	Pro	Asn 315
Pro	His	Pro	Arg	Asn 330

(2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 18:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 332 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (XX) SEKA SEQ ID Nr.: 18:

Ser 1

Pro

Ala

Pro

Pro 5

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg 10

Leu

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Vai

Leu

His

Gly

Arg 25

Leu

Ser

Gln

Cys

Pro 30

Asp

Ile

Asn

Pro

Leu 35

Ser

Thr

Pro

Vai

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp 45

Phe

Thr

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gln

Thr 55

Glu

Gln

Thr

Lys

Ala 60

Gln

Asp

Vai

Leu

Gly 65

Ala

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Ala

Vai

Met 75

Thr

Ala

Arg

Gly

Gln 80

Vai

Gly

Pro

Cys 85

Leu

Ser

Leu

Leu 90

Vai

Gln

Leu

Ser

Gly 95

Gln

Vai

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gln 105

Asp

Leu

Gly

Met 110

Gln

Leu

Pro

Gln 115

Gly

Arg

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Ser 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Asn 130

Phe

Gln

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg 140

Phe

Leu

Vai 145

Vai

Gly

Pro

Ser

Leu 150

Cys

Ala

Lys

Arg

Ala 155

Pro

Ala

Ile

Ala 160

Vai

Pro

Ser

Thr 165

249

Ser	Pro	Phe	His	Thr Leu Asn Lys 170	Leu	Pro Asn Arg Thr Ser 175	Gly 180
Leu	Leu	Glu	Thr	Asn Ser Ser Ile	Ser	Ala Arg Thr Thr Gly	Ser
				185		190	195
Gly	Phe	Leu	Lys	Arg Leu Gln Ala	Phe	Arg Ala Lys Ile Pro	Gly
				200		205	210
Leu	Leu	Asn	Gln	Thr Ser Arg Ser	Leu	Asp Gln Ile Pro Gly	His
				215		220	225
Gln	Asn	Gly	Thr	His Gly Pro Leu	Ser	Gly Ile His Gly Leu	Phe
				230		235	240
Pro	Gly	Pro	Gln	Pro Gly Ala Leu	Gly	Ala Pro Asp Ile Pro	•Pro
				245		250	255
Ala	Thr	Ser	Gly	Met Gly Ser Arg	Pro	Thr Tyr Leu Gln Pro	Gly
				260		265 *	270
Glu	Ser	Pro	Ser	Pro Ala His Pro	Ser	Pro Gly Arg Tyr Thr	Leu
				275		280	285
Phe	Ser	Pro	Ser	Pro Thr Ser Pro	Ser	Pro Thr Vai Gln Leu	Gln
				290		295	300
Pro	Leu	Leu	Pro	Asp Pro Ser Ala	Ile	Thr Pro Asn Ser Thr	Ser
				305		310	315
Pro	Leu	Leu	Phe	Ala Ala His Pro	His	Phe Gln Asn Leu Ser	Gln
				320		325	330
Glu	Glu
	332
(2)		INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 19:
	(i)	SEKOS CHARAKTERISTIKA:
			(A)	ILGIS: 1026 bazių poros
			(B)	TIPAS: nukleino	rūgščių seka
			(C)	GRADISKUMAS: viengrandė
			(D)	TOPOLOGIJA: linijinė
	(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 19	•
	AGC	CCG	GCT	CCT CCT GCC TGT	GAC	CCC CGA CTC CTA 36
	Ser	Pro	Ala	Pro Pro Ala Cys	Asp	Pro Arg Leu Leu
	1			5		10
AAT	AAA	CTG	CTT	CGT GAC TCC-CAT	GTC	CTT CAC GGC AGA 75
Asn	Lys	Leu	Leu	Arg Asp Ser His	Vai	Leu His Gly Arg
		15		20		25

250

CTG Leu

AGC Ser

CAG Gln

TGC Cys

CCA Pro 30

GAC Asp

ATT Ile

AAC Asn

CCT Pro

TTG Leu 35

TCC Ser

ACA Thr

CCT Pro

114

GTC

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTC

ACC

TTG

GGA

GAA

TGG

153

Vai

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp 45

Phe

Thr

Leu

Gly

Glu 50

Trp

AAA

ACC

CAG

ACG

GAG

CAG

ACA

AAG

GCA

CAG

GAT

GTC

CTG

192

Lys

Thr

Gln

Thr 55

Glu

Gln

Thr

Lys

Ala 60

Gln

Asp

Vai

Leu

GGA

GCC

ACA

ACC

CTT

CTG

GAG

GCA

GTG

ATG

ACA

GCA

231

Gly 65

Ala

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Ala

Vai

Met 75

Thr

Ala

CGG

GGA

CAA

GTG

GGA

CCC

CCT

TGC

CTC

TCA

TCC

CTG

270

Arg

Gly

Gln 80

Vai

Gly

Pro

Cys 85

Leu

Ser

Leu

Leu 90 I

GTG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTT

CGC

CTC

GGG

GCC

309

Vai

Gln

Leu

Ser

Gly 95

Gln

Vai

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

CTG

CAG

GAC

CTC

CTT

GGA

ATG

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGA

348

Leu

Gln 105

Asp

Leu

Gly

Met 110

Gln

Leu

Pro

Gln 115

Gly

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AGT

GCC

ATC

TTC

CTG

387

Arg

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Ser 125

Ala

Ile

Phe

Leu

AAC

TTC

CAA

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

426

Asn 130

Phe

Gln

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg 140

Phe

Leu

CTC

CTT

GTA

GTG

GGG

CCC

TCC

CTC

TGT

GCC

AAG

AGG

GCC

465

Leu

Vai 145

Vai

Gly

Pro

Ser

Leu 150

Cys

Ala

Lys

Arg

Ala 155

CCA

CCC

GCC

ATA

GCT

GTC

CCG

AGC

ACC

TCT

CCA

TTC

504

Pro

Ala

Ile

Ala 160

Vai

Pro

Ser

Thr 165

Ser

Pro

Phe

CAC

ACA

CTG

AAC

AAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACC

TCT

GGA

TTG

543

His

Thr 170

Leu

Asn

Lys

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

TTG

GAG

ACA

AAC

TCC

AGT

ATC

TCA

GCC

AGA

ACT

GGC

582

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Ser

Ile

Ser

Ala 190

Arg

Thr

Gly

TCT

GGA

TTT

CTC

AAG

AGG

CTG

CAG

GCA

TTC

AGA

GCC

AAG

621

Ser

Gly

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Gln

Ala

Phe

Arg

Ala

Lys

195 200 205

251

ATT Ile

CCT GGT CTG CTG AAC

CAA ACC

TCC Ser

AGG TCC Arg Ser

CTA Leu

GAC Asp 220

660

Pro

Gly Leu Leu Asn 210

Gln

Thr 215

CAA

ATC

CCT

GGA

CAC

CAG

AAT

GGG

ACA

CAC

GGA

CCC

TTG

699

Gln

Ile

Pro

Gly

His

Gln

Asn

Gly

Thr

His

Gly

Pro

Leu

225

230

AGT

GGA

ATT

CAT

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

CAA

CCC

GGG

738

Ser

Gly

Ile

His

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Gln

Pro

Gly

235

240

245

GCC

CTC

GGA

GCT

CCA

GAC

ATT

CCT

CCA

GCA

ACT

TCA

GGC

777

Ala

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

Ile

Pro

Ala

Thr

Ser

Gly

250

255

•

ATG

GGC

TCC

CGG

CCA

ACC

TAC

CTC

CAG

CCT

GGA

GAG

TCT

816

Met

Gly

Ser

Arg

Pro

Thr

Tyr

Leu

Gln

Pro

Gly

Glu

Ser

260

265

270

«

CCT

TCC

CCA

GCT

CAC

CCT

TCT

CCT

GGA

CGA

TAC

ACT

CTC

855

Pro

Ser

Pro

Ala

His

Pro

Ser

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr

Leu

275

280

285

TTC

TCT

CCT

TCA

CCC

ACC

TCG

CCC

TCC

CCC

ACA

GTC

CAG

894

Phe

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

Vai

Gln

290

295

CTC

CAG

CCT

CTG

CTT

CCT

GAC

CCC

TCT

GCG

ATC

ACA

CCC

933

Leu

Gln

Pro

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Ile

Thr

Pro

300

305

310

AAC

TCT

ACC

AGT

CCT

CTT

CTA

TTT

GCA

GCT

CAC

CCT

CAT

972

Asn

Ser

Thr

Ser

Pro

Leu

Phe

Ala

His

Pro

His

315

320

TTC

CAG

AAC

CTG

TCT

CAG

GAA

GAG

TAAG

r GTGCTCAGAC

1010

Phe

Gln

Asn

Leu

Ser

Gln

Glu

325

330

332

CCTGCCAACT TCAGCA 1026 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 20:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 1014 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 20:

AGC CCG GCT CCT. CCT GCC TGT GAC CCC CGA CTC CTA 3 6 Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu

252

10

AAT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

GTC

CTT

CAC

GGC

AGA

75

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Vai

Leu

His

Gly

Arg 25

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAC

ATT

AAC

CCT

TTG

TCC

ACA

CCT

114

Leu

Ser

Gln

Cys

Pro 30

Asp

Ile

Asn

Pro

Leu 35

Ser

Thr

Pro

GTC

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTC

ACC

TTG

GGA

GAA

TGG

153

Vai

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp 45

Phe

Thr

Leu

Gly

Glu 50

Trp

AAA

ACC

CAG

ACG

GAG

CAG

ACA

AAG

GCA

CAG

GAT

GTC

CTG

192

Lys

Thr

Gln

Thr 55

Glu

Gln

Thr

Lys

Ala 60

Gln

Asp

Vai

Leu

GGA

GCC

ACA

ACC

CTT

CTG

GAG

GCA

GTG

ATG

ACA

GCA

231

Gly 65

Ala

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Ala

Vai

Met 75

Thr

Ala

CGG

GGA

CAA

GTG

GGA

CCC

CCT

TGC

CTC

TCA

TCC

CTG

270

Arg

Gly

Gln 80

Vai

Gly

Pro

Cys 85

Leu

Ser

Leu

Leu 90

-

GTG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTT

CGC

CTC

GGG

GCC

309

Vai

Gln

Leu

Ser

Gly 95

Gln

Vai

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

CTG

CAG

GAC

CTC

CTT

GGA

ATG

CAG

GGA

AGG

ACC

ACA

GCT

348

Leu

Gln 105

Asp

Leu

Gly

Met 110

Gln

Gly

Arg

Thr

Thr 115

Ala

CAC

AAG

GAT

CCC

AGT

GCC

ATC

TTC

CTG

AAC

TTC

CAA

387

His

Lys

Asp

Pro 120

Ser

Ala

Ile

Phe

Leu 125

Asn

Phe

Gln

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

CTC

CTT

GTA

GTG

426

Leu 130

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai 135

Arg

Phe

Leu

Leu 140

Vai

GGG

CCC

TCC

CTC

TGT

GCC

AAG

AGG

GCC

CCA

CCC

GCC

ATA

465

Gly

Pro

Ser 145

Leu

Cys

Ala

Lys

Arg 150

Ala

Pro

Ala

Ile 155

GCT

GTC

CCG

AGC

ACC

TCT

CCA

TTC

CAC

ACA

CTG

AAC

504

Ala

Vai

Pro

Ser

Ser 160

Thr

Ser

Pro

Phe

His 165

Thr

Leu

Asn

AAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACC

TCT

GGA

TTG

GAG

ACA

AAC

543

Lys

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

Asn

170 175 180

TCC AGT ATC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGA TTT CTC 582

253

Ser

Ile

Ser 185

Ala

Arg

Thr

Gly 190

Ser

Gly

Phe

Leu

AAG

AGG

CTG

CAG

GCA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

CCT

GGT

CTG

621

Lys 195

Arg

Leu

Gln

Ala

Phe 200

Arg

Ala

Lys

Ile

Pro 205

Gly

Leu

CTG

AAC

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTA

GAC

CAA

ATC

CCT

GGA

660

Leu

Asn

Gln 210

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu 215

Asp

Gln

Ile

Pro

Gly 220

CAC

CAG

AAT

GGG

ACA

CAC

GGA

CCC

TTG

AGT

GGA

ATT

CAT

699

His

Gln

Asn

Gly

Thr 225

His

Gly

Pro

Leu

Ser 230

Gly

Ile

His

GGA

CTC

TTT

CCT

GGA

CCC

CAA

CCC

GGG

GCC

CTC

GGA

GCT

738

Gly

Leu 235

Phe

Pro

Gly

Pro

Gln 240

Pro

Gly

Ala

Leu

Gly 245

Ala

CCA

GAC

ATT

CCT

CCA

GCA

ACT

TCA

GGC

ATG

GGC

TCC

CGG

777

Pro

Asp

Ile

Pro 250

Pro

Ala

Thr

Ser

Gly 255

Met

Gly

Ser

Arg·

CCA

ACC

TAC

CTC

CAG

CCT

GGA

GAG

TCT

CCT

TCC

CCA

GCT

816

Pro 260

Thr

Tyr

Leu

Gln

Pro 265

Gly

Glu

Ser

Pro

Ser 270

Pro

Ala

CAC

CCT

TCT

CCT

GGA

CGA

TAC

ACT

CTC

TTC

TCT

CCT

TCA

855

His

Pro

Ser 275

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr 280

Leu

Phe

Ser

Pro

Ser 285

CCC

ACC

TCG

CCC

TCC

CCC

ACA

GTC

CAG

CTC

CAG

CCT

CTG

894

Pro

Thr

Ser

Pro

Ser 290

Pro

Thr

Vai

Gln

Leu 295

Gln

Pro

Leu

CTT

CCT

GAC

CCC

TCT

GCG

ATC

ACA

CCC

AAC

TCT

ACC

AGT

933

Leu

Pro 300

Asp

Pro

Ser

Ala

Ile 305

Thr

Pro

Asn

Ser

Thr 310

Ser

CCT

CTT

CTA

TTT

GCA

GCT

CAC

CCT

CAT

TTC

CAG

AAC

CTG

972

Pro

Leu

Phe 315

Ala

His

Pro

His 320

Phe

Gln

Asn

Leu

TCT CAG GAA GAG TAAGGT GCTCAGACCC TGCCAACTTC 1010 Ser Gln Glu Glu 325 328

AGCA 1014 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 21:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

254

(xi)

SEKA SEQ ID Nr.: 21:

Ser

Pro

Ala

Pro

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg

Leu

Asn

Lys

Leu

1

5

10

15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Gly

Arg

Leu

Ser

Gln

Cys

Pro

20

25

30

Asp

Ile

Asn

Pro

Leu

Ser

Thr

Pro

Vai

Leu

Pro

Ala

Vai

Asp

35

40

45

Phe

Thr

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gln

Thr

Glu

Gln

Thr

Lys

Ala

50

55

60

Gln

Asp

Vai

Leu

Gly

Ala

Thr

Leu

Glu

Ala

Vai

Met

65

70

75

Thr

Ala

Arg

Gly

Gln

Vai

Gly

Pro

Cys

Leu

Ser

Leu

80

85

90

Vai

Gln

Leu

Ser

Gly

Gln

Vai

Arg

Leu

Gly

Ala

*Leu

Gln

95

100

105

Asp

Leu

Gly

Met

Gln

Gly

Arg

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

110

115

120

Ser

Ala

Ile

Phe

Leu

Asn

Phe

Gln

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

125

130

135

Arg

Phe

Leu

Vai

Gly

Pro

Ser

Leu

Cys

Ala

Lys

Arg

140

145

150

Ala

Pro

Ala

Ile

Ala

Vai

Pro

Ser

Thr

Ser

Pro

Phe

His

155

160

165

Thr

Leu

Asn

Lys

Leu

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Glu

Thr

170

175

180

Asn

Ser

Ile

Ser

Ala

Arg

Thr

Gly

Ser

Gly

Phe

Leu

Lys

185

190

195

Arg

Leu

Gln

Ala

Phe

Arg

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly

Leu

Asn

Gln

200

205

210

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gln

Ile

Pro

Gly

His

Gln

Asn

Gly

Thr

215

220

225

His

Gly

Pro

Leu

Ser

Gly

Ile

His

Gly

Leu

Phe

Pro

Gly

Pro

Gln

230

235

240

Pro

Gly

Ala

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

Ile

Pro

Ala

Thr

Ser

Gly

245

250

255

Met

Gly

Ser

Arg

Pro

Thr

Tyr

Leu

Gln

Pro

Gly

Glu

Ser

Pro

Ser

260

265

270

255

Pro Ala	His	Pro	Ser Pro Gly	Arg Tyr Thr	Leu	Phe	Ser	Pro	Ser
			275	280					285
Pro Thr	Ser	Pro	Ser Pro Thr	Vai Gln Leu	Gln	Pro	Leu	Leu	Pro
			290	295					300
Asp Pro	Ser	Ala	Ile Thr Pro	Asn Ser Thr	Ser	Pro	Leu	Leu	Phe
		305	310					315
Ala Ala	His	Pro	His Phe Gln	Asn Leu Ser	Gln	Glu	Glu
			320	325			328
(2)'		INFORMACIJA APIE	: SEKĄ SEQ ID	Nr.	: 22
(i)		SEKOS CHARAKTERISTIKA:
		(A)	ILGIS: 5141	bazių pora
		(B)	TIPAS: nukleino rūgščių	seka
		(č)	GRADISKUMAS:	dvigrandė
		(D)	TOPOLOGIJA:	linij inė

(xi) SEKA SEQ ID Nr.: 22:

TTCGAGCTCG CCCGACATTG ATTATTGACT AGAGTCGATC GACAGCTGTG 50

GAATGTGTGT CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA 100

GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAG GTGTGGAAAG 150 TCCąCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA 200 GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC 250

CGCCCAGTTC CGCCCATTCT CCGCCCCATG GCTGACTAAT TTTTTTTATT 3 00

TATGCAGAGG CCGAGGCCGC CTCGGCCTCT GAGCTATTCC AGAAGTAGTG 350

AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG CAAAAAGCTA GCTTATCCGG 400

CCGGGAACGG TGCATTGGAA CGCGGATTCC CCGTGCCAAG AGTGACGTAA 4 50

GTACCGCCTA TAGAGCGATA AGAGGATTTT ATCCCCGCTG CCATCATGGT 500

TCGACCATTG AACTGCATCG TCGCCGTGTC CCAAAATATG GGGATTGGCA 550

AGAACGGAGA CCTACCCTGG CCTCCGCTCA GGAACGAGTT CAAGTACTTC 600

CAAAGAATGA CCACAACCTC TTCAGTGGAA GGTAAACAGA ATCTGGTGAT 650

TATGGGTAGG AAAACCTGGT TCTCCATTCC TGAGAAGAAT CGACCTTTAA 700

AGGACAGAAT TAATATAGTT CTCAGTAGAG AACTCAAAGA ACCACCACGA 750

GGAGCTCATT TTCTTGCCAA AAGTTTGGAT GATGCCTTAA GACTTATTGA 800

256

ACAACCGGAA	TTGGCAAGTA	AAGTAGACAT	GGTTTGGATA	GTCGGAGGCA	850
GTTCTGTTTA	CCAGGAAGCC	ATGAATCAAC	CAGGCCACCT	TAGACTCTTT	900
GTGACAAGGA	TCATGCAGGA	ATTTGAAAGT	GACACGTTTT	TCCCAGAAAT	950
TGATTTGGGG	AAATATAAAC	CTCTCCCAGA	ATACCCAGGC	GTCCTCTCTG	1000
AGGTCCAGGA	GGAAAAAGGC	ATCAAGTATA	AGTTTGAAGT	CTACGAGAAG	1050
AAAGACTAAC	AGGAAGATGC	TTTCAAGTTC	TCTGCTCCCC	TCCTAAAGCT	1100
ATGCATTTTT	ATAAGACCAT	GGGACTTTTG	CTGGCTTTAG	ATCCCCTTGG	1150
CTTCGTTAGA	ACGCGGCTAC	AATTAATACA	TAACCTTATG	TATCATACAC	1200
ATACGATTTA	GGTGACACTA	TAGATAACAT	CCACTTTGCC	TTTCTCTCCA	1250
CAGGTGTCCA	CTCCCAGGTC	CAACTGCACC	TCGGTTCTAA	GCTTCTGCAG t	1300
GTCGACTCTA	GAGGATCCCC	GGGGAATTCA	ATCGATGGCC	GCCATGGCCC	1350
AACTTGTTTA	TTGCAGCTTA	TAATGGTTAC	AAATAAAGCA	ATAGCATCAC	1400
AAATTTCACA	AATAAAGCAT	TTTTTTCACT	GCATTCTAGT	TGTGGTTTGT	1450
CCAAACTCAT	CAATGTATCT	TATCATGTCT	GGATCGATCG	GGAATTAATT	1500
CGGCGCAGCA	CCATGGCCTG	AAATAACCTC	TGAAAGAGGA	ACTTGGTTAG	1550
GTACCTTCTG	AGGCGGAAAG	AACCAGCTGT	GGAATGTGTG	TCAGTTAGGG	1600
TGTGGAAAGT	CCCCAGGCTC	CCCAGCAGGC	AGAAGTATGC	AAAGCATGCA	1650
TCTCAATTAG	TCAGCAACCA	GGTGTGGAAA	GTCCCCAGGC	TCCCCAGCAG	1700
GCAGAAGTAT	GCAAAGCATG	CATCTCAATT	AGTCAGCAAC	CATAGTCCCG	1750
CCCCTAACTC	CGCCCATCCC	GCCCCTAACT	CCGCCCAGTT	CCGCCCATTC	1800
TCCGCCCCAT	GGCTGACTAA	TTTTTTTTAT	TTATGCAGAG	GCCGAGGCCG	1850
CCTCGGCCTC	TGAGCTATTC	CAGAAGTAGT	GAGGAGGCTT	TTTTGGAGGC	1900
CTAGGCTTTT	GCAAAAAGCT	GTTACCTCGA	GCGGCCGCTT	AATTAAGGCG	1950
CGCCATTTAA	ATCCTGCAGG	TAACAGCTTG	GCACTGGCCG	TCGTTTTACA	2000
ACGTCGTGAC	TGGGAAAACC	CTGGCGTTAC	CCAACTTAAT	CGCCTTGCAG	2050
CACATCCCCC	CTTCGCCAGC	TGGCGTAATA	GCGAAGAGGC	CCGCACCGAT	2100
CGCCCTTCCC	AACAGTTGCG	TAGCCTGAAT	GGCGAATGGC	GCCTGATGCG	2150
GTATTTTCTC	CTTACGCATC	TGTGCGGTAT	TTCACACCGC	ATACGTCAAA	2200

257

GCAACCATAG	TACGCGCCCT	GTAGCGGCGC	ATTAAGCGCG	GCGGGTGTGG	2250
TGGTTACGCG	CAGCGTGACC	GCTACACTTG	CCAGCGCCCT	AGCGCCCGCT	2300
CCTTTCGCTT	TCTTCCCTTC	CTTTCTCGCC	ACGTTCGCCG	GCTTTCCCCG	2350
TCAAGCTCTA	AATCGGGGGC	TCCCTTTAGG	GTTCCGATTT	AGTGCTTTAC	2400
GGCACCTCGA	CCCCAAAAAA	CTTGATTTGG	GTGATGGTTC	ACGTAGTGGG	2450
CCATCGCCCT	GATAGACGGT	TTTTCGCCCT	TTGACGTTGG	AGTCCACGTT	2500
CTTTAATAGT	GGACTCTTGT	TCCAAACTGG	AACAACACTC	AACCCTATCT	2550
CGGGCTATTC	TTTTGATTTA	TAAGGGATTT	TGCCGATTTC	GGCCTATTGG	2600
TTAAAAAATG	AGCTGATTTA	ACAAAAATTT	AACGCGAATT	TTAACAAAAT	2650
ATTAACGTTT	ACAATTTTAT	GGTGCACTCT	CAGTACAATC	TGCTCTGATG «	2700
CCGCATAGTT	AAGCCAACTC	CGCTATCGCT	ACGTGACTGG	GTCATGGCTG	2750
CGCCCCGACA	CCCGCCAACA	CCCGCTGACG	CGCCCTGACG	GGCTTGTCTG	2800
CTCCCGGCAT	CCGCTTACAG	ACAAGCTGTG	ACCGTCTCCG	GGAGCTGCAT	2850
GTGTCAGAGG	TTTTCACCGT	CATCACCGAA	ACGCGCGAGG	CAGTATTCTT	2900
GAAGACGAAA	GGGCCTCGTG	ATACGCCTAT	TTTTATAGGT	TAATGTCATG	2950
ATAATAATGG	TTTCTTAGAC	GTCAGGTGGC	ACTTTTCGGG	GAAATGTGCG	3000
CGGAACCCCT	ATTTGTTTAT	TTTTCTAAAT	ACATTCAAAT	ATGTATCCGC	3050
TCATGAGACA	ATAACCCTGA	TAAATGCTTC	AATAATATTG	AAAAAGGAAG	3100
AGTATGAGTA	TTCAACATTT	CCGTGTCGCC	CTTATTCCCT	TTTTTGCGGC	3150
ATTTTGCCTT	CCTGTTTTTG	CTCACCCAGA	AACGCTGGTG	AAAGTAAAAG	3200
ATGCTGAAGA	TCAGTTGGGT	GCACGAGTGG	GTTACATCGA	ACTGGATCTC	3250
AACAGCGGTA	AGATCCTTGA	GAGTTTTCGC	CCCGAAGAAC	GTTTTCCAAT	3300
GATGAGCACT	TTTAAAGTTC	TGCTATGTGG	CGCGGTATTA	TCCCGTGATG	3350
ACGCCGGGCA	AGAGCAACTC	GGTCGCCGCA	TACACTATTC	TCAGAATGAC	3400
TTGGTTGAGT	ACTCACCAGT	CACAGAAAAG	CATCTTACGG	ATGGCATGAC	3450
AGTAAGAGAA	TTATGCAGTG	CTGCCATAAC	CATGAGTGAT	AACACTGCGG	3500
CCAACTTACT	TCTGACAACG	ATCGGAGGAC	CGAAGGAGCT	AACCGCTTTT	3550

TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT GGGAACCGGA 3 600

258

GCTGAATGAA	GCCATACCAA	ACGACGAGCG	TGACACCACG	ATGCCAGCAG	3650
CAATGGCAAC	AACGTTGCGC	AAACTATTAA	CTGGCGAACT	ACTTACTCTA	3700
GCTTCCCGGC	AACAATTAAT	AGACTGGATG	GAGGCGGATA	AAGTTGCAGG	3750
ACCACTTCTG	CGCTCGGCCC	TTCCGGCTGG	CTGGTTTATT	GCTGATAAAT	3800
CTGGAGCCGG	TGAGCGTGGG	TCTCGCGGTA	TCATTGCAGC	ACTGGGGCCA	3850
GATGGTAAGC	CCTCCCGTAT	CGTAGTTATC	TACACGACGG	GGAGTCAGGC	3900
AACTATGGAT	GAACGAAATA	GACAGATCGC	TGAGATAGGT	GCCTCACTGA	3950
TTAAGCATTG	GTAACTGTCA	GACCAAGTTT	ACTCATATAT	ACTTTAGATT	4000
GATTTAAAAC	TTCATTTTTA	ATTTAAAAGG	ATCTAGGTGA	AGATCCTTTT	4050
TGATAATCTC	ATGACCAAAA	TCCCTTAACG	TGAGTTTTCG	TTCCACTGAG	4100
CGTCAGACCC	CGTAGAAAAG	ATCAAAGGAT	CTTCTTGAGA	TCCTTTTTTT	4150
CTGCGCGTAA	TCTGCTGCTT	GCAAACAAAA	AAACCACCGC	TACCAGCGGT	4200
GGTTTGTTTG	CCGGATCAAG	AGCTACCAAC	TCTTTTTCCG	AAGGTAACfG	4250
GCTTCAGCAG	AGCGCAGATA	CCAAATACTG	TCCTTCTAGT	GTAGCCGTAG	4300
TTAGGCCACC	ACTTCAAGAA	CTCTGTAGCA	CCGCCTACAT	ACCTCGCTCT	4350
GCTAATCCTG	TTACCAGTGG	CTGCTGCCAG	TGGCGATAAG	TCGTGTCTTA	4400
CCGGGTTGGA	CTCAAGACGA	TAGTTACCGG	ATAAGGCGCA	GCGGTCGGGC	4450
TGAACGGGGG	GTTCGTGCAC	ACAGCCCAGC	TTGGAGCGAA	CGACCTACAC	4500
CGAACTGAGA	TACCTACAGC	GTGAGCATTG	AGAAAGCGCC	ACGCTTCCCG	4550
AAGGGAGAAA	GGCGGACAGG	TATCCGGTAA	GCGGCAGGGT	CGGAACAGGA	4600
GAGCGCACGA	GGGAGCTTCC	AGGGGGAAAC	GCCTGGTATC	TTTATAGTCC	4650
TGTCGGGTTT	CGCCACCTCT	GACTTGAGCG	TCGATTTTTG	TGATGCTCGT	4700
CAGGGGGGCG	GAGCCTATGG	AAAAACGCCA	GCAACGCGGC	_CTTTTTACGG	4750
TTCCTGGCCT	TTTGCTGGCC	TTTTGCTCAC	ATGTTCTTTC	CTGCGTTATC	4800
CCCTGATTCT	GTGGATAACC	GTATTACCGC	CTTTGAGTGA	GCTGATACCG	4850
CTCGCCGCAG	CCGAACGACC	GAGCGCAGCG	AGTCAGTGAG	CGAGGAAGCG	4900
GAAGAGCGCC	CAATACGCAA	ACCGCCTCTC	CCCGCGCGTT	GGCCGATTCA	4950
TTAATCCAGC	TGGCACGACA	GGTTTCCCGA	CTGGAAAGCG	GGCAGTGAGC	5000

259

GCAACGCAAT TAATGTGAGT TACCTCACTC ATTAGGCACC CCAGGCTTTA 5050

CACTTTATGC TTCCGGCTCG TATGTTGTGT GGAATTGTGA GCGGATAACA 5100

ATTTCACACA GGAAACAGCT ATGACCATGA TTACGAATTA A 5141 .

(2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 23:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 21 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 23:

ATGTCNCCNG CNCCNCCNGC N 21 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 24:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 21 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 24:

ATGTCTCCAG CGCCGCCAGC G 21 (2) ' . INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 25: (i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 21 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 25:

ATGTCGCCTG CTCCACCTGC T 21 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 26:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 21 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 26:

260

ATGTCGCCAG CGCCACCAGC C 21 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 27:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 21 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 27:

ATGTCCCCAG CCCCACCCGC A 21 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 28:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 21 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 28:

ATGTCGCCAG CGCCGCCAGC G 21 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 29:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 25 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė

	(xi)	SEKA	SEQ	ID	Nr. :	29 :
Ser 1	Pro Ala	Pro	Pro 5	Ala	Cys	Asp	Pro	Arg Leu Leu Asn Lys 10	Leu 15
Leu	Arg Asp	Asp	His 20	Vai	Leu	His	Gly	Arg 25

(2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 30:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 26 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 30:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 1 5 10 15

261

Leu Arg Asp	Asp Xaa Vai	Leu His Gly Arg	Leu
	20		25	26
(2)	INFORMACIJA	APIE SEKĄ SEQ	ID	Nr.	: 31:
(i)	SEKOS CHARAKTERISTIKA:
	(A) ILGIS: 25 amino rūgščių	liekanos
	(B) TIPAS: amino rūgščių	liekanų	seka
	(C) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID	Nr.: 31:
Ser Pro Ala	Pro Pro Ala	Xaa Asp Pro Arg	Leu	Leu Asn
1	5		10
Leu Arg Asp	Asp His Vai	Leu His Gly Arg
	20		25
(2)	INFORMACIJA	APIE SEKĄ SEQ	ID	Nr. :	: 32:

Leu (i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 14 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 32:

Xaa Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Xaa Asn Lys 15 10 14 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 33:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 9 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 33:

Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg 15 9 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 34:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 45 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrande (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 34:

GCCGTGAAGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCG 4 5

262

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 35: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 20 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 35:

CCNGCNCCNC CNGCNTGYGA 20

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 36: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 21 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr. : 3 6:

NCCRTGNARN ACRTGRTCRT C 21

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 37: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 69 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 37:

CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 50

TGACCACGTT CAGCACGGC 69

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 36: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 69 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 38:

GCCGTGCTGA ACGTGGTCAT CACGAGGCAG TTTATTTAGG AGTCGGGGGT 50

CACAGGCTGG CGGCGCTGG 69

263 (2) . INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 33:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 69 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 39:

CCAGCACCTC

CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC

TGCTTCGTGA 50

CGACCACGTC

CATCACGGC 69 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 40:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 69 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 40:

GCCGTGATGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCGGGGGT 50

CACATGCCGG AGGTGCTGG 69 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 41:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 69 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (χί) SEKA SEQ ID Nr.: 41:

CCAGCACCGC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50

CGATCATGTC TATCACGGT 69 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 42:

(i) -SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 69 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 42:

264

ACCGTGATAG ACATGATCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCGGGGGT 50

CACATGCCGG CGGTGCTGG 69 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 43:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 37 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 43:

GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 37 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 44:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 22 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 44:

CAGTCTGCCG TGAAGGACAT. GG 22 (2) INFORMACIJA AFIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 45:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 24 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 45:

TGTGGACTTT AGCTTGGGAG AATG 24 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ i'D Kr.: 4o:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 22 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (ΧΪ) SEKA SEQ ID Nr.: 46:

GGTCCAGGGA CCTGGAGGTT TG 22

265

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 47 SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 31 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADISKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 47:

ATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G 31

(2)	INFORMACIJA APIE SEKA SEQ ID Nr.: 48
(i)	SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 36 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADISKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 48:

GCTAGCTCTA GACAGGGAAG GGAGCTGTAC ATGAGA 36

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 49: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 24 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADISKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 49:

CTCCTTGGAA CCCAGGGCAG GACC 24

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 50: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 24 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADISKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 50:

GGTCCTGCCC TGGGTTCGAA GGAG 24

(2) (i)

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 51: SEKOS CHARAKTERISTIKA:

266 (A) ILGIS: 27 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 51:

CTGCTCCGAG GAAAGGACTT CTGGATT 27 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 52:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 27 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 52:

AATCCAGAAG TCCTTTCCTC GGAGCAG 27 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 53:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 28 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 53:

CCCTCTGCGT CGCGGCGGCC CCACCCAC 28 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 54:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 28 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 54:

GTGGGTGGGG CCGCCGCGAC GCAGAGGG 28 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 55:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 35 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė

267 (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 55:

GACTCGAGGA TCCATCGATT _TTTTTTTTTT TTTTT 35 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 56:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 17 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 56:

GACTCGAGGA TCCATCG 17 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 57:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 32 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 57:

GCTAGCTCTA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCC TG 32 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 58:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 21 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 58:

CGAAATTAAC CCTCACTAAA G 21 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 59:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 103 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 59:

268

TGCAGCAAGG GCTACTGCCA CACTCGAGCT GCGCAGATGC TAGCCTCAAG 50

ATGGCTGATC CAAATCGATT CCGCGGCAAA GATCTTCCGG TCCTGTAGAA 100

GCT 103 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 60:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 103 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 60:

AGCTTCTACA GGACCGGAAG ATCTTTGCCG CGGAATCGAT TTGGATCAGC 50

CATCTTGAGG CTAGCATCTG CGCAGCTCGA GTGTGGCAGT AGCCCTTGCT 100

GCA 103 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 61:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 61:

TCTCGCTACC GTTTACAG 18 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 62:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 25 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 62:

CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT 25 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 63:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka

269 (XX) (C) GRADIŠKUMAS (D) TOPOLOGIJA:

viengrandė linij inė

SEKA SEQ ID Nr.: 63

GGGCCATGAC ACTGTCAA 18 (2) (i) (xi)

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 40 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė

SEKA SEQ ID Nr.: 64:

GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT 40 (2) (i) (xi)

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 32 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė

SEKA SEQ ID Nr.: 65:

65:

ATCGATATCG ATCAGCCAGA CACCCCGGCC AG 32 (2) (i)

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 35 bazių poros TIPAS: nukleino rūgščių (B) (C) (D) seka (xi)

GRADIŠKUMAS

TOPOLOGIJA:

SEKA SEQ ID Nr, viengrandė l ini j inė :

TCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC 35

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: (i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 33 bazių poros.

(B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (2\

270 (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 67:

AGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC 33

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 68: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 36 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 68:

AGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC 36

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 69: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 62 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 69:

CGCGTATGCC AGCCCGGCTC CTCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA 50

AACTGCTTCG TG 62

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 70: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 61 bazių pora (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 70:

AGTCACGAAG CAGTTTACTG AGGACTCGGA GGTCACAAGC AGGAGGAGCC 50

GGGCTGGCAT A 61

(2) (i)

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 71: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 37 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė

271 (χί) SEKA SEQ ID Nr.: 71:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAA 37 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 72:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 37 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 72:

CGCGTTAAGA AGAAATGCGA TATTCTTTTT CATAATT 37 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 73:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 69 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 73:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50

CACATCGAAG GTCGTAGCC 69 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 74:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 62 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 74:

TACGACCTTC GATGTGATGG TGATGGTGAT GGTGATGAAA TGCGATATTC 50

TTTTTCATAA TT 62 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 75:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 69 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė

272

(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 75:
CTAGAATTAT	GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50
CACATCGAAC	CACGTAGCC 69
(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 76: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 62 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 76:

TACGTGGTTC GATGTGATGG TGATGGTGAT GGTGATGAAA TGCGATATTC 50

TTTTTCATAA TT 62

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 77: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 19 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 77:

TCCACCCTCT GCGTCAGGT 19

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 78: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 18 bazių porų (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 78:

AGCTACCTGA CGCAGAGG 18

(2) (i)

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 79: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 62 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė

273 (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 79:

GCAGCAGTTC TAGAATTATG TCNCCNGCNC CNCCNGCNTG TGACCTCCGA 50

GTTCTCAGTA AA 62

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 80: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 49 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 80:

GAAGGACATG GGAGTCACGA AGCAGTTTAC TGAGAACT CG GAGGTCĄCA 4 9 *

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 81: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 45 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr. : 81:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC 45

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 82: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 38 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 82:

TACGACCTTC GATAAATGCG ATATTCTTTT TCATAATT 3 8

(2) (i)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 83: SEKOS CHARAKTERISTIKA: (A) ILGIS: 45 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė
(xi)	SEKA SEQ ID Nr.: 83:

274

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC 4 5 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 84:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 38 bazių poros (B) TIPAS: nukleino rūgščių seka (C) GRADIŠKUMAS: viengrandė (D) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 84:

TACGTTTAAG AAGAAATGCG ATATTCTTTT TCATAATT 3 8

(	2) (i	)	INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 85: SEKOS CHARAKTERISTIKA:
(A) (B) (C)	ILGIS: 168 amino rūgščių liekanos TIPAS: amino rūgščių liekanų seka
TOPOLOGIJA:	linij inė
	(xi)	SEKA SEQ ID Nr.	: 85:
Met 1	Lys	Lys	Asn	Ile Ala Phe 5	Leu Leu Asn Ala Tyr Ala 10	Ser	Pro 15
Ala	Pro	Pro	Ala	Cys Asp Leu 20	Arg Vai Leu Ser Lys Leu 25	Leu	Arg 30
Asp	Ser	His	Vai	Leu His Ser 35	Arg Leu Ser Gln Cys Pro 40	Glu	Vai 45
His	Pro	Leu	Pro	Thr Pro Vai 50	Leu Leu Pro Ala Vai Asp 55	Phe	Ser 60
Leu	Gly	Glu	Trp	Lys Thr Gln 65	Met Glu Glu Thr Lys Ala 70	Gln	Asp 75
Ile	Leu	Gly	Ala	Vai Thr Leu 80	Leu Leu Glu Gly Vai Met 85	Ala	Ala 90
Arg	Gly	Gln	Leu	Gly Pro Thr 95	Cys Leu Ser Ser Leu Leu 100	Gly	Gln 105
Leu	Ser	Gly	Gln	Vai Arg Leu 110	Leu Leu Gly Ala Leu Gln 115	Ser	Leu 120
Leu	Gly	Thr	Gln	Leu Pro Pro 125	Gln Gly Arg Thr Thr Ala 130	His	Lys 135
Asp	Pro	Asn	Ala	Ile Phe Leu 140	Ser Phe Gln His Leu Leu 145	Arg	Gly 150

275

Lys Vai Arg Phe Leu Met Leu Vai Gly Gly Ser Thr Leu Cys Vai 155 160 165

Arg Arg Ala 168 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 86:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:_ (A) ILGIS: 174 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 86:

Met 1

Lys

Asn

Ile Ala 5

Phe His His His His His His 10

His

His 15

Ile

Glu

Gly

Arg

Ser

Pro

Ala

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

' Arg

Vai

20

25

30

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Vai

Leu

His

Ser

Arg

Leu

35

40

45

Ser

Gln

Cys

Pro

Glu

Vai

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Vai

Leu

50

55

60

Pro

Ala

Vai

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gln

Met

Glu

65

70

-

75

Glu

Thr

Lys

Ala

Gln

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Vai

Thr

Leu

80

85

90

Glu

Gly

Vai

Met

Ala

Arg

Gly

Gln

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

95

100

105

Ser

Leu

Gly

Gln

Leu

Ser

Gly

Gln

Vai

Arg

Leu

110

115

120

Gly

Ala

Leu

Gln

Ser

Leu

Gly

Thr

Gln

Leu

Pro

Gln

Gly

125

130

135

Arg

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

140

145

150

Gln

His

Leu

Arg

Gly

Lys

Vai

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Vai

Gly

155

160

165

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Vai

Arg

Ala

170

174

(2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 87:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 174 amino rūgščių liekanos

276

(B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka
	(C)	TOPOLOGIJA:	linij inė
(xi) SEKA SEQ ID Nr.	: 87:
Met Lys	Lys Asn	Ile Ala Phe	His His His His His His His His
1		5	10 15
Ile Glu	Pro Arg	Ser Pro Ala	Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Vai
		20	25 30
Leu Ser	Lys Leu	Leu Arg Asp	Ser His Vai Leu His Ser Arg Leu
		35	40 45
Ser Gln	Cys Pro	Glu Vai His	Pro Leu Pro Thr Pro Vai Leu Leu
		50	55 60
Pro Ala	Vai Asp	Phe Ser Leu	Gly Glu Trp Lys Thr' Gln Met Glu
		65	70 * 75
Glu Thr	Lys Ala	Gln Asp Ile	Leu Gly Ala Vai Thr Leu Leu Leu
		80	85 90
Glu Gly	Vai Met	Ala Ala Arg	Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu
		95	100 105
Ser Ser	Leu Leu	Gly Gln Leu	Ser Gly Gln Vai Arg Leu Leu Leu
		110	115 120
Gly Ala	Leu Gln	Ser Leu Leu	Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly
		125	130 135
Arg Thr	Thr Ala	His Lys Asp	Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe
		140	145 150
Gln His	Leu Leu	Arg Gly Lys	Vai Arg Phe Leu Met Leu Vai Gly
		155	160 165
Gly Ser	Thr Leu	Cys Vai Arg	Arg Ala
		170	174
(2)	INFORMACIJA APIE	SEKĄ SEQ ID Nr. : 88 :

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 7 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 88:

Thr Thr Ala His Lys Asp Pro 1 5 7 (2)

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 89:

277 (i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (Xi) SEKA SEQ ID Nr.: 89:

His Vai Leu His 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 90:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 90:

Ser Arg Leu Ser 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 91:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 91:

Ser His Vai Leu l 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 92:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 92:

His Ser Arg Leu 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 93:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 93:

278

Ala Vai Asp Phe 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 94:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (χί) SEKA SEQ ID Nr.: 94:

Ser Leu Gly Glu 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 95:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA':

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) . SEKA SEQ ID Nr.: 95:

Ala Vai Thr Leu 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 96:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 96:

Leu Leu Glu Gly l 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 97:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 97:

Leu Ser Ser Leu 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 98:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos

279 (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 98:

Leu Gly Gln Leu 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 99:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 5 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 99:

Cys Xaa Leu Ser Ser 1 5 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 100:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 100:

Leu Lėu Gly Gln 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 101:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 101:

Ser Ser Leu Leu 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 102:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 102:

Gly Gln Leu Ser 1 4

280 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 103:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 103:

Cys Leu Ser Ser 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 104:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 104:

Leu Gln Ser Leu 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 105:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 105:

Leu Gly Thr Gln 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 106:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 106:

Ala Leu Gln Ser 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 107:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė

281 (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 107:

Leu Leu Gly Thr 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 108:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 108:

Asn Ala Ile Phe 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 109:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 109:

Leu Ser Phe Gln 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 110:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 22 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė

	(xi)	SEKA	SEQ	ID	Nr. :	110 :
Ser	Pro Ala	Pro	Pro	Ala	Cys	Asp Leu	Arg Vai	Leu Ser Lys Leu
1			5				10	15
Leu	Arg Asp	Ser	His	Vai	Leu
			20		22

(2). INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 111:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 24 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 111:

His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Vai His Pro Leu Pro Thr 1 5 TO 15

282

Pro Vai Leu Leu Pro Ala Vai Asp Phe 20 24 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ ŠEQ ID Nr.: 112:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 23 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 112:

Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln 15 10 15

Asp Ile Leu Gly Ala Vai Thr Leu 20 23 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 113:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 21 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 113:

Leu Leu Glu Gly Vai Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr 15 10 15

Cys Leu Ser Ser Leu Leu 20 21 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 114:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 16 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 114:

Gly Gln Leu Ser Gly Gln Vai Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln 1 5 10 15

Ser (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 115:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

S

283

I

	(xi)	SEKA	SEQ	ID	Nr. :	115:
Leu	Leu Gly	Thr	Gln	Leu	Pro	Pro Gln	Gly Arg Thr Thr Ala	His
1			5				10	15
Lys	Asp Pro	Asn	Ala	Ile	Phe
			20		22

(2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 116:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(xi)	SEKA SEQ ID	Nr. :	116 :
Leu Ser Phe 1	Gln His Leu 5	Leu	Arg Gly	Lys 10	Vai	Arg Phe	Leu Met 15
Leu Vai Gly	Gly Ser Thr 20	Leu	Cys Vai	Arg 25
(2)	INFORMACIJA	APIE	SEKĄ SEQ ID	Nr.	: 117 :

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (ΧΪ) SEKA SEQ ID Nr.: 117:

Met Pro Pro Ala 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 118:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 5 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (Xi) SEKA SEQ ID Nr.: 118:

Met Ala Pro Pro Ala 1 5 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 119:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 6 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 119:

284

Met Pro Ala 1 (2) (i)

Pro Pro Ala 5 6 (xi)

Met Ser Pro 1 (2) (i) (xi)

Ala Pro Pro 1 (2) (i)

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 120: SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 7 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė

SEKA SEQ ID Nr.: 120:

Ala Pro Pro Ala 5 7

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 121: SEKOS CHARAKTERISTIKA:

SEKA SEQ ID Nr.: 121:

Ala (xi)

Pro Ala Pro 1 (2) (i)

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 122: SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 5 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė

SEKA SEQ ID Nr.: 122:

Pro Ala 5 (xi)

Ser Pro Ala 1

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 123: SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 6 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė

SEKA SEQ ID Nr.: 123:

Pro Pro Ala 5 6 (2) (i)

INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 124: SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 4 amino rūgščių liekanos

285 (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (χί) SEKA SEQ ID Nr.: 124:

Vai Arg Arg Ala 1 4 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 125:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 5 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 125:

Vai Arg Arg Ala Pro 1 5 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 126:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 6 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 126:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro 1 5 6 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 127:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 7 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 127:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr 1 5 7 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 128:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 8 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 128:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr 1 5 8

286 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 129:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 9 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 129:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 15 9 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 130:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 10 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 130:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai 15 10 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 131:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 11 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 131:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro 1 5 10 11 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 132:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 12 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 132:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser 1 5 10 12 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 133:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 13 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė

287 (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 133:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg 1 5 10 13 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 134:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 14 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 134:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr 15 10 14' (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 135:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 15 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 135:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 136:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 16 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 136:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 137:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 17 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (Xl) SEKA SEQ ID Nr.: 137:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

288

Leu Vai 17 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 138:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 18 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 138:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Vai Leu · (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 139:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 19 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 139:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15

Leu Vai Leu Thr 19 (2) · INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 140:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 20 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 140:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15

Leu Vai Leu Thr Leu 20 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 141:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 21 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 141:

289

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser 1 5 10 15

Leu Vai Leu Thr Leu Asn 20 21 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 142:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA^ (A) ILGIS: 22 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 142:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15 t

Leu Vai Leu Thr Leu Asn Glu 20 22 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 143:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 23 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 143:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Vai Leu Thr Leu Asn Glu Leu 20 23 (2) INFORMACIJA APIE SEKĄ SEQ ID Nr.: 144:

(i) SEKOS CHARAKTERISTIKA:

(A) ILGIS: 24 amino rūgščių liekanos (B) TIPAS: amino rūgščių liekanų seka (C) TOPOLOGIJA: linijinė (xi) SEKA SEQ ID Nr.: 144:

Vai Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Vai Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Vai Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro 20 24

290

Claims

IŠRADIMO APIBRĖŽTIS

1. mpl ligando polipeptidas, gaunamas būdu, kuriame (i) žmogaus genominę biblioteką tikrina su oligonukleotidu, sudarytu pagal genominę seką, pateiktą Fig. 9, siekiant išskirti genominę DNR, kurioje būtų mpl ligando egzoną koduojanti seka, pateikta Fig. 9, ir likusieji geno egzonai;

(ii) DNR įterpia į ekspresijos vektorių;

(iii) žinduolių ląsteles transfekuoja šiuo vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir (iv) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.
2. mpl ligando polipeptidas, gaunamas būdu, kuriame:

(i) iš genominės bibliotekos išskiria genominę DNR, kuri hibridizuojasi, esant silpno griežtumo sąlygoms, su DNR seka

5' - GCC CTG AAG GAC GTG GTC GTC ACG AAG CAG TTT ATT TAG GAG TCG -3' ir kurios sudėtyje yra egzonai, koduojantys mpl ligando polipeptidą;

(ii) DNR įterpia į ekspresijos vektorių;

(iii) žinduolių ląsteles transfekuoja vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir (iv) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.
3. mpl ligando polipeptidas, gaunamas būdu, kuriame:

(i) tinkamas ląsteles - žmogaus mpl ligandą koduojančios RNR šaltinį - identifikuoja ir paruošia vieną ar kelias kDNR bibliotekas iš šios RNR;

(ii) siekiant identifikuoti ir išskirti kloną, kuriame būtų mpl ligandą koduojanti seka, vykdo bibliotekos ar bibliotekų atranką,hibridizacijai naudojant žymėtą oligonukleotidą, paruoštą pagal koduojančią seką, pateiktą Fig. 9;

291 (iii) koduojančią DNR įterpia į ekspresijos vektorių, tinkamą ekspresijai žinduolių ląstelėse;

(iv) žinduolių ląsteles transfekuoja vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir (v) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.
4. mpl ligando polipeptidas, gaunamas būdu, kuriame:

(i) iš iRNR, išskirtos iš žmogaus inkstų ląstelių, paruošia kDNR biblioteką ar bibliotekas;

(ii) siekiant identifikuoti ir išskirti kloną, kuriame būtų mpl ligandą koduojanti seka, vykdo bibliotekos ar bibliotekų atranką, hibridizacijai naudojant žymėtą oligonukleotidą, paruoštą pagal koduojančią seką, pateiktą Fig. 9;

(iii) koduojančią DNR įterpia į ekspresijos vektorių, tinkamą ekspresijai žinduolių ląstelėse;

(iv) žinduolių ląsteles transfekuoja vektoriumi ir ekspresuoja geną; ir (v) mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląstelių kultivavimo terpės.
5. Išskirtas, iš esmės homogeninis mpl ligandas, charakterizuojamas šiais požymiais:

(a) ligandas stimuliuoja žymėtų nukleotidų (²H-timidino) įsijungimą į Ba/F3 ląstelių, transfekuotų žmogaus mpl P ir priklausomų nuo IL-3, DNR;

(b) ligandas stimuliuoja 35g įsijungimą į cirkuliuojančius trombocitus, naudojant atsakomosios trombocitozės metodą;

(c) ligandas yra stabilus, esant pH iki 2,5, 0,1 % SDS, ir 2 M karbamido;

(d) ligandas yra glikoproteinas;

(e) polipeptido N galo amino rūgščių liekanų seka

J ₍ yra SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR arba SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRL.

292
6. mpl ligandas, gaunamas, išskiriant jį iš aplastinės plazmos hidrofobinės sąveikos chromatografija, imobilizuotų dažų chromatografija ir mpl-afinine chromatografija, turintis molekulinę masę, nustatytą SDS PAGE analize redukuojančiomis sąlygomis, 18-22 kD, 28 kD arba 30 kD srityje.
7. Išskirtas mpl ligando polipeptidas, koduojamas nukleino rūgštimi, kuri hibridizuojasi, esant vidutiniškai griežtom sąlygom, su nukleino rūgštimi, kurios seka prasideda 119 nukleotidų ir yra pateikta Fig. 9 (ID Nr.:4 ar ID Nr.:5)
8. Išskirtas mpl ligandas pagal bet kurį ankstesnį punktą, besiskiriantis tuo, kad jis pasižymi biologiniu aktyvumu.
9. mpl ligando polipeptidas, kurio sekos identiškumas yra bent 70 %, lyginant su polipeptidu pagal bet kurį iš 1-7 punktų.
10. mpl ligando polipeptidas, kuris yra alelinis arba kitoks polipeptido pagal 1-7 punktus variantas, pasižymintis mpl ligando biologiniu aktyvumu.
11. mpl ligando polipeptidas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad yra išskirtas iš žmogaus.
12. mpl ligando polipeptidas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų, besiskiriantis tuo, kad yra išskirtas ne iš žmogaus.
13. mpl ligando polipeptidas pagal bet kurį iš ankstesnių

punktų, besiskiria glikozilintas. n t i s tuo, kad yra ne 14. Sulietas baltymas, kurio sudėtyje yra mpl ligando polipeptidas pagal bet kurį iš ankstesnių punktų ir heterologinis polipeptidas.

293
15. Išskirta nukleino rūgšties molekulė, koduojanti polipeptidą pagal bet kurį iš ankstesnių punktų.
16. Išskirta nukleino rūgšties molekulė, pasirenkama iš:

(a) kDNR klono, gaunamo pagal 3 punkto (iii) dalį arba pagal 4 punkto (ii)dalį;

(b) DNR sekos, galinčios hibridizuotis, esant griežtoms sąlygoms, su klonu, gautu pagal šio punkto (a) dalį; ir (c) bet kurio genetinio DNR sekos, gautos pagal šio punkto (a) arba pagal šio punkto (b) dalis, varianto, kuris koduoja polipeptidą, turintį gamtoje aptinkamo mpl ligando biologines sąvybes.
17. Išskirta nukleino rūgšties molekulė, kuri hibridizuojasi, esant vidutiniškai griežtom sąlygom, su nukleino rūgštimi, kurios seka prasideda 119 nukleotidų ir yra pateikta Fig. 9 (ID Nr. :4 ar ID Nr.:5), ir koduoja mpl Ugandą.
18. Genominė DNR arba kDNR, atitinkanti bent dalį mpl ligando geno, ir kuri hibridizuojasi, esant sąlygoms nuo vidutiniškai griežtų iki labai griežtų, su gamtoje aptinkama nukleino rūgšties molekule, koduojančia mpl Ugandą pagal bet kurį iš 1-7 punktų.
19. Nukleino rūgštis pagal bet kurį iš 15-18 punktų, besiskirianti tuo, kad yra funkcionaliai sujungta su promotoriumi.
20. Ekspresijos vektorius, kurio sudėtyje yra nukleino rūgštis pagal bet kurį iš 15-18 punktų, funkcionaliai sujunta su kontroliuojančiomis sekomis, atpažįstamomis ląstelės - šeimininko.
21. Ląstelės-šeimininkai, transformuotos rūgštimi pagal bet kurį iš 15-20 punktų, ekspresuoti nurodytas nukleino rūgšties produkuoti mpl ligando polipeptidą.

nukleino sugebančios sekas ir

294
22. Nukleino rūgšties ekspresijos būdas, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad rekombinantinės nukleino rūgšties pagal bet kurį iš 15-20 punktų ekspresiją vykdo ląstelėje-šeimininke, kuri sugeba produkuoti mpl ligando polipeptidą
23. Būdas pagal 22 punktą, besiskiriantis tuo, kad mpl ligando polipeptidą išskiria iš ląsteliųšeimininkų arba iš ląstelių-šeimininkų kultivavimo terpės.
24. Ekspresijos būdas, besiskiriantis tuo, kad vykdo laukinio mpl ligando geno ekspresiją ląstelėje, ir ekspresija yra kontroliuojama promotoriumi/sustiprintoju, supresoriumi ar egzogeniniu transkripciją moduliuojančiu elementu, kurie buvo įterpti į ląstelės genomą tinkamu atstumu ir tinkama orientacija, kad galėtų įtakoti DNR, koduojančios mpl ligando polipeptidą, transkripciją.
25. Kompozicija, besiskirianti tuo, kad jos sudėtyje yra mpl ligandas pagal bet kurį iš 1-14 punktų, arba gautas būdu, pagal 22 arba 23 punktą, ir vaistų gamybai tinkamas nešiklis.
26. mpl ligando polipeptido pagal bet kurį iš 1-14 punktų, arba gauto būdu pagal 22 arba 23 punktą panaudojimas medikamentų gamybai.
27. Kompozicija pagal 25 punktą, arba gaunama pagal 26 punktą, besiskirianti tuo, kad jos sudėtyje yra terapiškai efektyvus agento, pasirinkto iš citokinų, kolonijas stimuliuojančių faktorių ir interleukinų, kiekis.
28. Kompozicija pagal 27 punktą, besiskirian t i tuo, kad agentas pasirinktas iš: LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8,

IL-9 ir IL-11.

295
29. Mėginio nukleino rūgšties amplifikacijos būdas, besiskiriantis tuo, kad nukleino rūgšties polimerazinę reakciją inicijuoja naudojant nukleino rūgštį, atitinkančią bent dalį genominės ar kDNR pagal 18 punktą.
30. mpl ligando polipeptido nustatymo būdas, besiskiriantis tuo, kad DNR pagal 18 punktą hibridizuoja su mėginių nukleino rūgštimi ir nustato mpl ligando polipeptido nukleino rūgštį.
31. mpl ligandui specifinių antikūnų gamybos būdas, besiskiriantis tuo, kad naudoja mpl ligando polipeptidą pagal bet kurį iš 1-14 punktų, arba gautą būdu pagal 22 arba 23 punktą.
32. Būdas pagal 31 punktą, besiskiriantis tuo, kad gaunami antikūnai yra monokloniniai.
33. Antikūnai, gaunami būdu pagal 31 arba 32 punktą.
34. Antikūnai, sugebantys jungtis su mpl ligando polipeptidu pagal bet kurį iš 1-14 punktų.
35. Antikūnai, pagal 34 punktą, besiskiriantys tuo, kad jie yra monokloniniai.
36. Hibridominė ląstelių linija, produkuojanti antikūnus pagal 33 punktą arba 35 punktą.