PL180765B1

PL180765B1 - Polipeptyd ligandu mpl, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd ligandu mpl, wektor ekspresyjny, transformowana komórka gospodarza, sposób otrzymywania przeciwciał, sposób otrzymywania polipeptydu ligandu mpl, sposób biosyntezy ludzkiego polipeptydu ligandu mpl, sposób określania obecności genu polipeptydu ligandu mpl oraz kompozycja

Info

Publication number: PL180765B1
Application number: PL94315289A
Authority: PL
Inventors: Dan L. Eaton; Sauvage Frederic J. De
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-01-03
Filing date: 1994-12-28
Publication date: 2001-04-30
Also published as: LT96118A; BR9408487A; US6660256B1; ZA9410355B; LT4120B

Abstract

1 Zasadniczo homogeniczny polipeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmujacej ( a) fragment polipeptydowy o wzorze X-hTPO(7-151)-Y gdzie hTPO(7-151) oznacza sekwencje aminokwasów ludzkiej TPO (hML) od Cys7 do Cys 151 wlacznie, X oznacza grupy aminowa Cys7 lub jedna albo wiecej aminokoncowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmujacej M, MA, MPA, MPPA, (SEQ ID NO 117) MAPPA, (SEQ ID NO 118) MPAPPA, (SEQ ID NO 119) MSPAPPA, (SEQ ID NO 120) A, PA, PPA, APPA, (SEQ ID NO 121) PAPPA, (SEQ ID NO 122) SP APPA, (SEQ ID NO 123) Y oznacza grupy karboksylowa Cys151 lub jedna albo wiecej karboksy-koncowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmujacej V, VR, VRR, VRRA, (SEQ ID NO 124) VRRAP, (SEQ ID NO 125) VRRAPP, (SEQ ID NO 126) VRRAPPT, (SEQ ID NO 127) VRRAPPTT, (SEQ ID NO 128) VRRAPPTTA, (SEQ ID NO 129) VRRAPPTTAV, (SEQ ID NO 130) VRRAPPTTAVP, (SEQ ID NO 131) VRRAPPTTAVPS, (SEQ ID NO 132) VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO 133) PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest zasadniczo homogeniczny polipeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmującej:

(a) fragment polipeptydowy o wzorze X-hTPO(7-151)-Y gdzie hTPO(7-151) oznacza sekwencję aminokwasów ludzkiej TPO(hML) od Cys7 do Cysl51 włącznie;

X oznacza grupy aminową Cys7 lub jedną albo więcej aminokońcowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmującej M, MA, MPA, MPPA, (SEQIDNO: 117) MAPPA, (SEQ ID NO: 118) MPAPPA, (SEQ ID NO: 119) MSPAPPA, (SEQ ID NO: 120) A, PA, PPA, APPA, (SEQ ID NO: 121) PAPPA, (SEQIDNO: 122) PAPPA, (SEQ ID NO: 123)

Y oznacza grupy karboksylową Cysl 51 lub jedną albo więcej karboksy-końcowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmującej: V, VR, VRR, VRRA, (SEQ ID NO: 124) VRRAP, (SEQ ID NO: 125) VRRAPP, (SEQ ID NO: 126) VRRAPPT, (SEQ ID NO: 127) VRRAPPTT, (SEQ ID NO: 128) VRRAPPTTA, (SEQ ID NO: 129) VRRAPPTTAV, (SEQ ID NO: 130) VRRAPPTTAVP, (SEQ ID NO. 131) VRRAPPTTAVPS, (SEQ ID NO: 132) VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO: 133) VRRAPPTTAVPSRT, (SEQ ID NO: 134) VRRAPPTTAVPSRTS, (SEQ ID NO: 135) VRRAPPTTAVPSRTSL, (SEQ ID NO: 136) VRRAPPTTAVPSRTSLV, (SEQ ID NO: 137) VRRAPPTTAVPSRTSLVL, (SEQ ID NO: 138) VRRAPPTTAVPSRTSLVLT, (SEQ ID NO: 139) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTL, (SEQ ID NO: 140) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN, (SEQ ID NO: 141) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE, (SEQ ID NO: 142) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL, (SEQ ID NO: 143) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP, (SEQ ID NO: 144), a amino-końcowe przedłużenia łańcucha aminokwasów obejmują jedną lub więcej reszt 176-332 ludzkiego ML, przedstawionych na fig. (SEQ ID NO: 1) i ich formy polioksyalkilenowane, (b) chimeryczny polipeptyd zawierający hgand mlp, który został przyłączony do pohpeptydu heterologicznego, przy czym sekwencja aminokwasów polipeptydu zawiera reszty aminok

180 765 wasów od 1 do X fig.l (SEQ ID NO: 1), gdzie X wybrany jest z grupy obejmującej reszty 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 211, 229, 245 i 332; i ' (c) warianty tych polipeptydów; przy czym polipeptyd ten korzystnie, stymuluje wbudowywanie znaczonych nukleotydów (3H-tymidyny) do DNA IL-3-zależnych komórek Ba/F3 transfekowanych ludzkim mpl P; lub stymuluje wbudowywanie 35S do krążących płytek w teście nawrotu płytek

Korzystnie polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, ze jego fragment został wybrany z grupy obejmującej TPO(1-153) i TPO(l-245).

Korzystnie polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, ze sekwencja aminokwasów fragmentu polipeptydu obejmuje:

SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL, (SEQ ID NO: 110) HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF, (SEQ ID NO: 111) SLGEWKTOMEETKAQDILGAVTL, (SEQ ID NO: 112) LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL, (SEQ ID NO: 113) GQLSGQVRLLLGALQS, (SEQ ID NO: 114) LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF, (SEQ ID NO: 115) LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR, (SEQ ID NO: 116) oraz ich kombinacje.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że stanowi polipeptyd pozbawiony reszt ohgosacharydów.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, ze jest wybrany z grupy obejmującej hML (SEQ ID NO:6), hML153 (SEQ ID NO:1 reszty 1-153), hML (R153A, R154A), (SEQ IDNO:1 R153A, R154A), hML2 (SEQ ID NO:8), hML3 (SEQ ID NO:9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO: 15), mML3 (SEQ ID NO: 16), pML (SEQ ID NO: 18) i pML2 (SEQ ID NO:21).

Korzystnie polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że posiada 80% identyczności sekwencji z pohpeptydem, którego sekwencja aminokwasów zawiera reszty aminokwasów od 1 do X według fig. 1 (SEQ ID NO:1), gdzie X wybrany jest z grupy obejmującej reszty 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 i 332. Korzystniej Xjest 153.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że w tym chimerycznym polipeptydzie heterologiczny polipeptyd stanowi polipeptyd immunoglobulmy.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że w tym chimerycznym polipeptydzie heterologiczny polipeptyd stanowi polipeptyd interleukmy.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera N-końcowe reszty od 1 do około 153-157 hML podstawionego resztą lub resztami ludzkiego EPO dodanymi lub podstawionymi w N-końcowych resztach hML w pozycjach wybranych z grupy zawierającej pozycje 1, 3-6, 9, 13-15, 17-28, 30, 32-34, 36-41, 43-50, 53-59, 61-68, 71, 73, 75-80, 82-88, 90-96, 98-99, 102-103, 105-107, 110, 112-113, 115-119, 121-130, 132-133, 135, 137-140, 143-150 oraz 152-156, zgodnie z zestawieniem pokazanym na fig. 10.

Korzystnie polipeptyd według wynalazku charakteryzuje się tym, ze jest kodowany przez kwas nukleinowy, którego sekwencja posiada co najmniej 70% zgodności z sekwencjąkwasu nukleinowego pokazanąna fig. 1 (SEQ ID NO:2) lub sekwencjądo niej komplementarną.

Przedmiotem wynalazku jest także cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmującej:

(a) fragment polipeptydowy o wzorze

X-hTPO(7-151)-y gdzie hTPO(7-151) oznacza sekwencję aminokwasów ludzkiej TPO (hML) od Cys7 do Cysl51 włącznie;

180 765

X oznacza grupy aminową Cys7 lub jedną albo więcej aminokońcowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmującej

M,

MA,

MPA,

MPPA, (SEQIDNO: 117)

MAPPA, (SEQ ID NO: 118)

MPAPPA, (SEQ ID NO: 119)

MSPAPPA, (SEQ ID NO: 120)

A,

PA,

PPA,

APPA, (SEQ ID NO: 121)

PAPPA, (SEQ ID NO· 122)

SPAPPA, (SEQ ID NO: 123)

Y oznacza grupy karboksylową Cysl 51 lub jedną albo więcej karboksy-końcowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmującej:

V,

VR,

VRR,

VRRA, (SEQ ID NO: 124)

VRRAP, (SEQ ID NO: 125)

VRRAPP, (SEQ ID NO: 126)

VRRAPPT, (SEQ ID NO: 127)

VRRAPPTT, (SEO ID NO: 128)

VRRAPPTTA, (SEQ ID NO: 129)

VRRAPPTTAV, (SEQ ID NO: 130)

VRRAPPTTAVP, (SEQ ID NO: 131)

VRRAPPTTAVPS, (SEQ ID NO: 132)

VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO: 133)

VRRAPPTTAVPSRT, (SEQ ID NO: 134)

VRRAPPTTAVPSRTS, (SEQ ID NO: 135)

VRRAPPTTAVPSRTSL, (SEQ ID NO: 136)

VRRAPPTTAVPSRTSLV, (SEQ ID NO: 137)

VRRAPPTTAVPSRTSLVL, (SEQ ID NO: 138)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLT, (SEQ ID NO: 139)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTL, (SEQ ID NO: 140)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN, (SEQ ID NO: 141)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE, (SEQ ID NO: 142)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL, (SEQ ID NO: 143) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP, (SEQ ID NO: 144), a amino-końcowe przedłużenia łańcucha aminokwasów obejmują jedną lub więcej reszt 176-332 ludzkiego ML, przedstawionych na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) i ich formy pohoksyalkilenowane;

(b) chimeryczny pohpeptyd zawierający ligand mlp, który został przyłączony do pohpeptydu heterologicznego, przy czym sekwencja aminokwasów polipeptydu zawiera reszty aminokwasów od 1 do X według fig. 1 (SEQ ID NO: 1), gdzie X wybrany jest z grupy obejmującej reszty 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 i 332; i (c) warianty tych pohpeptydów.

Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku charakteryzuje się tym, ze koduje polipeptyd ligandu mpl posiadający przynajmniej 80% identyczności sekwencji z pohpeptydem, którego sekwencja aminokwasów zawiera reszty aminokwasów od 1 do X według fig. 1

180 765 (SEQ ID NO:1), gdzie X wybrany jest grupy obejmującej reszty 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207,217, 229, 245 1 332.

Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku charakteryzuje się tym, ze zawiera otwartą ramkę odczytu sekwencji kwasu nukleinowego pokazanego na fig,. 1 (SEQ ID NO:2).

Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku charakteryzuje się tym, że koduje polipeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmującej hML (SEQ ID NO:6), hML153 (SEQ ID NO:1) reszty 1-153), hML (R153A, R154A) (SEQ ID NO:1 R153A, R154A), hML2 (SEQ ID NO:8), hML3 (SEQ ID NO:9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO: 15), mML3 (SEQ ID NO 16), pML (SEQ ID NO:18) i pML2 (SEQ ID NO:21),

Korzystnie cząsteczka kwasu nukleinowego według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję wykazującą przynajmniej 70% zgodności z sekwencją kwasu nukleinowego przedstawioną na fig. 1 (SEC ID NO:2) lub sekwencją do niej komplementarną.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmującej hML (SEQ ID NO:6), hML153 (SEQIDNO:1 reszty 1-153), hML (R153A, R154A), (SEQIDNO1 R153A, R154A), hML2 (SEQ ID NO:8), hML3 (SEQ ID NO:9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO:15), mML3 (SEQ ID NO:16), pML (SEQ ID NO:18) i pML2 (SEQ ID NO:21), korzystnie połączoną operacyjnie z sekwencjami kontrolnymi rozpoznawanymi przez komórkę gospodarza transformowaną wektorem.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest komórka gospodarza transformowana wektorem zawierającym cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującąpolipeptyd ligandu mlp wybrany z grupy obejmującej hML (SEQ ID NO:6), hML153 (SEQ ID NO:1 reszty 1-153), hML (R153A, R154A), (SEQ ID NO: 1 R153 A, R154A), hML2 (SEQ ID NO:8), hML3 (SEQ ID NO:9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO: 15), mML3 (SEQ ID NO: 16), pML (SEQ ID NO: 18) i pML2 (SEQ ID NO:21), korzystnie połączoną operacyjnie z sekwencjami kontrolnymi rozpoznawanymi przez tą komórkę.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania przeciwciał obejmujący immunizację ssaka i odzyskiwanie przeciwciał charakteryzujący się tym, że do immumzacji stosuje się polipeptyd lub jego fragment posiadający 80% identyczności sekwencji z polipeptydem, którego sekwencja aminokwasów zawiera reszty aminokwasów od 1 do X według fig. 1 (SEQ ID NO:1), gdzie Xwybranyjest z grupy obejmującej reszty 153,155,164,174,191,205,207,217, 229, 245 i 332.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania pohpeptydu hgandu mpl obejmujący hodowanie komórki gospodarza i odzyskiwanie polipeptydu hgandu mpl charakteryzujący się tym, że hoduje się komórkę gospodarza transformowaną wektorem zawierającym cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującąpolipeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmującej hML (SEQ ID NO:6), hML153 (SEQ ID NO:1 reszty 1-153), hML (R153A, R154A), (SEQ ID NO: 1 R153A, R154A), hML2 (SEQ ID NO.8), hML3 (SEQ ID NO:9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO’15), mML3 (SEQ ID NO: 16), pML (SEQ ID NO: 18) i pML2 (SEQ ID NO:21), operacyjnie połączoną z sekwencją kontrolną rozpoznawaną przez tą komórkę, przy czym korzystnie odzyskiwany polipeptyd jest pozbawiony reszt ohgosacharydów.

Korzystnie polipeptyd ligandu mpl jest odzyskiwany z komórki gospodarza.

Równie korzystnie polipeptyd hgandu mpl jest odzyskiwany z płynu hodowlanego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób biosyntezy ludzkiego pohpeptydu ligandu mpl obejmujący: (a) hodowanie komórki gospodarza, (b) odzyskiwanie ludzkiego polipeptydu hgandu mpl z hodowli, i (c) oczyszczanie polipeptydu ligandu mpl do zasadniczo homogenicznego, biologicznie czynnego ludzkiego polipeptyd ligandu mpl, charakteryzujący się tym, ze hoduje się komórkę gospodarza zawierającą cząsteczkę DNA kodującą sekwencję ammokwasową ludzkiego pohpeptydu ligandu mpl przedstawioną na fig. 1 (SEQ ID NO:1).

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób określania obecności genu polipeptydu hgandu mpl w testowanej próbie zawierającej kwas nukleinowy, obejmujący hybrydyzowanie

180 765 sondy DNA z testowaną próbą kwasu nukleinowego, charakteryzujący się tym, że jako sondę DNA stosuje się cząsteczkę DNA wykazującą przynajmniej 80% homologii do sekwencji SEQ ID NO:2 lub jej fragment.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja zawierająca czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzująca się tym, że jako czynnik aktywny zawiera polipeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmującej:

(a) fragment pohpeptydowy o wzorze

X-hTPO(7-151)-Y gdzie hTPO(7-151) oznacza sekwencję aminokwasów ludzkiej TPO (łiML) od Cys7 do Cysl51 włącznie;

M,

MA,

MPA,

MPPA, (SEQIDNO: 117)

MAPPA, (SEQIDNO: 118)

MPAPPA, (SEQ ID NO: 119)

MSPAPPA, (SEQ ID NO: 120)

A,

PA,

PPA,

APPA, (SEQIDNO: 121)

PAPPA, (SEQ ID NO: 122)

SPAPPA, (SEQ ID NO: 123)

Y oznacza grupy karboksylowąCysl51 lub jedną albo więcej karboksy-końcowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmującej:

V,

VR,

VRR,

VRRA, (SEQ ID NO: 124)

VRRAP, (SEQ ID NO: 125)

VRRAPP, (SEQ ID NO: 126)

VRRAPPT, (SEQ ID NO: 127)

VRRAPPTT, (SEQ ID NO: 128)

VRRAPPTTA, (SEQ ID NO: 129)

VRRAPPTTAV, (SEQ ID NO: 130)

VRRAPPTTAVP, (SEQ ID NO: 131)

VRRAPPTTAVPS, (SEQ ID NO: 132)

VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO: 133)

VRRAPPTTAVPSRT, (SEQ ID NO: 134)

VRRAPPTTAVPSRTS, (SEQ ID NO' 135)

VRRAPPTTAVPSRTSL, (SEQ ID NO: 136)

VRRAPPTTAVPSRTSLV, (SEQ ID NO: 137)

VRRAPPTTAVPSRTSLVL, (SEQ ID NO: 138)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLT, (SEQ ID NO: 139)

VRRAPPTTAVPSRTSEVLTL, (SEQ ID NO: 140)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN, (SEQ ID NO: 141)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE, (SEQ ID NO' 142)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL, (SEQ ID NO: 143)

180 765

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP, (SEQ ID NO: 144), a amino-końcowe przedłużenia łańcucha aminokwasów obejmują jedną lub więcej reszt 176-332 ludzkiego ML, przedstawionych na fig. (SEQ ID NO:1) i ich formy pohoksyalkilonowane;

(b) chimeryczny polipeptyd zawierający hgand mlp, który został przyłączony do pohpeptydu heterologicznego, przy czym sekwencja aminokwasów pohpeptydu zawiera reszty aminokwasów od 1 do X według fig. 1 (SEQ ID NO: 1), gdzie X wybranyjest z grupy obejmującej reszty 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 i 332; i (c) warianty tych pohpeptydów.

Korzystnie kompozycja według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera ponadto terapeutycznie skuteczną ilość środka wybranego z grupy obejmującej: cytokinę, czynnik stymulujący kolonie i interleukinę.

Korzystnie kompozycja według wynalazku charakteryzuje się tym, ze zawiera środek wybrany z grupy obejmującej KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, MCSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, 15 IL-9 i IL-11.

Wynalazek ujawnia wydzielone białko ssaka pobudzające megakanocytopoetycznąproliferację i dojrzewanie, określone jako „hgand mpl” (ML) lub „trombopoetyna” (TPO), zdolne do pobudzania proliferacji, dojrzewania i/lub różnicowana megakariocytów do dojrzałej formy wytwarzającej płytki.

Takie zasadniczo jednorodne białko wydzielić można w stanie oczyszczonym z naturalnego źródła sposobem obejmującym (1) kontaktowanie plazmy ze źródła zawierającej cząsteczki hgandu mpl, które mają zostać oczyszczone, z unieruchomionym polipeptydem receptora, w szczególności z mpl lub fuzyjnym polipeptydem mpl unieruchomionym na nośniku, w takich warunkach, że cząsteczki ligandumpl, które mają zostać oczyszczone, ulegają selektywnej adsorpcji na unieruchomionym polipeptydzie receptora, (2) przemywanie unieruchomionego pohpeptydu receptora i jego nośnika w celu usunięcia nie zaadsorbowanego materiału oraz (3) eluowanie cząsteczek hgandu mpl z unieruchomionego polipeptydu receptora, przez który zostały zaadsorbowane, za pomocąbuforu elucyjnego. Korzystnie naturalnym źródłem jest plazma lub mocz ssaka, zawierające hgand mpl. Ewentualnie ssak jest aplastyczny, a unieruchomionym receptorem jest fuzja mpl-IgG.

Ujawnionym ewentualnie korzystnym białkiem pobudzającym megakariocytopoetyczną proliferację i dojrzewanie jest wydzielony zasadniczo jednorodny polipeptyd hgandu mpl wytworzony syntetycznie lub technikami rekombinacji.

Polipeptyd „hgandu mpl’ lub „TPO” ujawnionej w wynalazku korzystnie wykazuje co najmniej w 70% ogólną identyczność sekwencji z sekwencją aminokwasów wysoce oczyszczonego, zasadniczo jednorodnego świńskiego polipeptydu hgandu mpl i co najmniej w 80% identyczność sekwencji z „EPO-domeną” świńskiego polipeptydu ligandu mpl. Dodatkowo ligand mpl ujawniony w wynalazku jest dojrzałym ludzkim hgandem mpl (hML), zawierającym dojrzałą sekwencję aminokwasów pokazanąna fig. 1 (SEQIDNO: 1) lub jego wariantową albo potranskrypcyjnie zmodyfikowaną formą lub białkiem wykazującym w 80% z dojrzałym ludzkim hgandem mpl. Ewentualnie wariant hgandu mpl stanowi fragment, zwłaszcza ammo-końcowy lub „EPOdomenowy” fragment dojrzałego ludzkiego ligandu mpl (hML). Korzystnie ammo-końcowy fragment zachowuje zasadniczo całość ludzkiej sekwencji ML między pierwsząi czwartą resztą cysteiny, ale może zawierać znaczące addycje, delecje i podstawienia poza tym obszarem. Ujawniony fragment pohpeptydowy może być określony wzorem X-hML(7-151)-Y.

We wzorze hML(7-151) oznacza sekwencję aminokwasów ludzkiego TPO(hML) od Cys⁷aż do Cys¹⁵¹ włącznie; X oznacza grupę aminową Cys⁷ lub jedną albo więcej amino-końcowych reszt aminokwasów dojrzałego hML, bądź też wydłużenia reszt aminokwasów takie jak Met, Tyr lub sekwencje liderujące zawierające, np. miejsca rozszczepiania proteolitycznego (np. czynnik Xa lub trombinę); a Y oznacza karboksylową grupę końcową Cys¹⁵¹ lub jedną albo więcej karboksy-końcowych reszt aminokwasów dojrzałego hML, albo ich wydłużenia

180 765

Ewentualnie ligandu mpl lub jego fragment może być połączony z hetero logicznym pohpetydem (chimerą). Korzystny hetero logiczny polipeptyd stanowi cytokma, czynnik pobudzający kolonie lub interleukma lub jej fragment, zwłaszcza kit-hgand (KL), IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, EPO, GM-CSF lub LIF. Dodatkowym korzystnym heterologicznym pohpeptydem jest łańcuch immunoglobiny, zwłaszcza ludzkiej IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD, IgM lub jego fragment, zwłaszcza obejmujący stałą domenę ciężkiego łańcucha IgG

W innym wykonaniu wynalazek ujawnia kompozycję obejmującą wydzielonego agomstę mpl, który jest biologicznie czynny i jest korzystnie zdolny do pobudzania wbudowywania znaczonych nukleotydów (np. ³H-tymidyny) do DNA IL-3-zależnych komórek Ba/F3 transfekowanych ludzkim mpl. Ewentualnie agonista mpl jest biologicznie czynnym hgendem mpl i jest korzystnie zdolny do pobudzania wbudowywania ³⁵S do krążących płytek krwi w teście nawrotu mysich płytek. Do odpowiednich agonistów mpl należą hML₁₅₃, hML(R153A, R154A), hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML i pML2 lub ich fragmenty.

W innym wykonaniu wynalazek ujawnia wydzielone przeciwciało zdolne do wiązania z ligandem mpl. Wydzielone przeciwciało zdolne do wiązania z ligandem mpl może być ewentualnie połączone z drugim pohpeptydem i jego przeciwciało lub jego fuzję można zastosować do wydzielania i oczyszczania ligandu mpl ze źródła jak to opisano powyżej dla unieruchomionego mpl. W kolejnym aspekcie tego wykonania wynalazek ujawnia sposób wykrywania ligandu mpl in vitro lub in vivo obejmujący kontaktowanie przeciwciała z próbką, zwłaszcza z próbką surowicy, podejrzanej o to, że zawiera hgand wykrycie czy wiązanie wystąpiło.

W jeszcze innych wykonaniach wynalazek ujawnia wydzieloną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą hgand mpl lub jego fragmenty, która to cząsteczka kwasu nukleinowego może być ewentualnie znaczona wykrywalną grupą, a ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję komplementarną lub hybrydyzujących w umiarkowanie lub silnie napiętych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję kodującą ligand mpl. Korzystne cząsteczki kwasu nukleinowego kodująludzki, świński i mysi hgand mpl, oraz obejmująRNA i DNA, zarówno genowy jak i cDNA. W innym aspekcie tego wykonania cząsteczkę kwasu nukleinowego stanowi DNA kodujący ligand mpl obejmujący ponadto wektory ulegające replikacji, w którym DNA jest operacyjnie połączony z sekwencjami kontrolnymi rozpoznawanymi przez gospodarza transformowanego wektorem. Ewentualnie DNA stanowi cDNA zawierający sekwencję pokazaną na fig. 1 5'-3' (SEQ ID NO: 2), 3'-5' lub jego fragment. Aspekt ten obejmuje także komórkę gospodarza, korzystnie komórkę CHO, transformowaną wektorem oraz sposób zastosowania DNA do wytwarzania ligand mpl, korzystnie obejmujący ekspresję cDNA kodującego ligand mpl w hodowli transformowanych komórek gospodarza oraz wydzielanie hgandu mpl z komórek gospodarza lub z hodowli komórek gospodarza. Ligand mpl wytworzony w taki sposób jest korzystnie ludzkim ligandem mpl.

Wynalazek ujawnia także sposób leczenia ssaka z zaburzeniem hematopoetycznym, zwłaszcza małopłytkowością obejmujący podawanie terapeutycznie skutecznej ilości ligandu mpl ssakowi. Ewentualnie hgand mpl podaje się w kombinacji z cytokmą, zwłaszcza czynnikiem pobudzającym kolonię łub interleukmą. Do korzystnych czynników pobudzających kolonię lub mterleukin należy kit-hgand (KL), LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-3, IL-6 oraz IL-11.

Wynalazek ujawnia także sposób wydzielania i oczyszczania TPO (ML) z drobnoustroju wytwarzającego TPO, obejmują:

(1) rozbijanie lub lizę komórek zawierających TPO, (2) ewentualnie oddzielenie rozpuszczalnego materiału nierozpuszczalnego materiału zawierającego TPO, (3) rozpuszczanie TPO z nierozpuszczalnego materiału buforem rozpuszczającym, (4) oddzielanie rozpuszczonego TPO od innych rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych materiałów, (5) ponowne fałdowanie TPO w buforze redoksy oraz (6) oddzielanie właściwie złożonego TPO od błędnie złożonego TPO.

180 765

Proces obejmuje rozpuszczanie nierozpuszczalnego materiału zawierającego TPO środkiem chaotropowym, przy czym środek chaotropowy jest wybrany z grupy obejmującej sól guanidyny, tiocyjanian sodu i mocznik. Ponadto w procesie rozpuszczony TPO oddziela się od innych rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych materiałów w jednym lub więcej etapach wybranych z grupy obejmującej wirowanie, filtrację żelową i chromatografię z odwróceniem faz. W etapie ponownego fałdowania procesu stosuje się bufor redoksy zawierający zarówno środek utleniający jak i redukujący. Zazwyczaj środkiem utleniającym jest tlen zawierający co najmniej jedno wiązanie disulfidowe, a środkiem redukującym związek zawierający co najmniej jeden wolny sulfydryl. Korzystnie środek utleniający jest wybrany z grupy obejmującej utleniony glutation (GSSG) oraz cystyna, a środek redukujący jest wybrany z grupy obejmującej zredukowany glutation (GSH) cysteinę. Najkorzystniejszym środkiem utleniającym utleniony glutation (GSSG), a środkiem redukującym zredukowany glutation (GSH). Korzystne jest również jeśli ilość moli środka utleniającego jest równa lub wyższa od ilości moli środka redukującego. Bufor redoksy dodatkowo zawiera detergent, korzystnie wybrany z grupy obejmującej CHAPS i CHAPSO, stosowany w ilości co najmniej 1%. Bufor redoksy dodatkowo zawiera NaCl, korzystnie w zakresie stężeń około 0,1 -0,5 M oraz glicerynę, korzystnie w stężeniu ponad 15%. pH buforu redoksy korzystnie wynosi około 7,5-9,0. Etap ponownego fałdowania prowadzi się w 4°C przez 12-48 godzin. W etapie ponownego fałdowania uzyskuje się biologicznie czynny TPO, w którym wiązanie disulfidowe powstaje pomiędzy Cys najbliższąkońca aminowego i Cys najbliższą końca karboksylowego w domenie EPO.

Wynalazek ujawnia także sposób oczyszczania biologicznie czynnego TPO z drobnoustrojów, obejmujący:

(1) hzę co najmniej zawnątrzkomórkowej błony drobnoustroju, (2) obróbkę lizatu zawierającego TPO środkiem chaotropowym, (3) powtórne fałdowanie TPO oraz (4) oddzielania zanieczyszczeń i błędnie złożonego TPO od właściwie złożonego TPO. Krótki opis rysunków

Na figurze 1 pokazano wydedukowanąsekwencję aminokwasów (SEQ ID NO: 1) ludzkiego ligandu mpl (hML), cDNA oraz kodującą sekwencję nukleotydów (SEQ ID NO: 2). Nukleotydy ponumerowano na początku każdego wiersza. Obszary 5' i 3', które nie uległy translacji, zaznaczono małymi literami, ponad sekwencją zaczynającą się od Ser 1 sekwencji białka dojrzałego hgandu mpl (ML). Granice założonego egzonu 3 zaznaczono strzałkami, a potencjalne miejsca N-glikozylowania ramkami. Reszty cysteiny zaznaczono kropkąponad sekwencją. Sekwencja podkreślona odpowiada N-końcowej sekwencji ustalonej z hgandu mpl oczyszczonego ze świńskiej plazmy.

Na figurze 2 pokazano procedurę wykorzystaną w teście wbudowywania ³H-tymidyny do ligandu mpl. W celu stwierdzenia obecności ligandu mpl w różnych źródłach mpl P komórki Ba/F3 hadowano bez IL-3 przez 24 godziny w inkubatorze z nawilżaniem w 37°C, w powietrzu z 5% CO₂. Po hodowaniu bez IL-3 komórki posiano na płytkach do hodowli z 96 studzienkami, z zastosowaniem lub bez rozcieńczania próbek i hodowano przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórek.

Dodano 20 μΐ ośrodka RMPI pozbawionego surowicy, zawierającego 1 pCi ³H-tymidyny do każdej studzienki na ostatnie 6-8 godzin. Komórki zebrano następnie na płytkach filtracyjnych o 96 studienkach i przemyto wodą. Następnie oznaczono radioaktywność filtrów.

Na figurze 3 pokazano wpływ pronazy, DTT i ciepła na zdolność APP do pobudzania proliferacji komórek Ba/F3-mpl. W celu stwierdzenia APP przez pronazę, enzym (Boehnnger Mannheim) lub albuminę z surowicy bydlęcej sprzężono z AffigellO (Biorad) i inkubowano pojedynczo z APP przez 18 godzin w 37°C. Następnie żywice odwirowano i supematanty poddano analizie APP ogrzano także do 80°C na 4 minuty lub dodawano 100 μΜ DTT, a następnie wykonywano dializę względem PBS.

180 765

Na figurze 4 pokazano elucję aktywnego ligandu mpl z kolumn Phenyl-Toyopearl, BlueSepharose i Ultralink-mpl. Frakcje 4-8 z kolumny z powinowactwem względem mpl były frakcjami eluowanymi z kolumny, wykazującymi najwyższą aktywność.

Na figurze 5 pokazano SDS-PAGE eluowanych frakcji Ultralink-mpl. Do 200 μΐ każdej z frakcji 2-8 dodano 1 ml acetonu zawierającego 1 mM HC1 w -20°C. Po 3 godzinach w -20°C próbki odwirowano, a pozostałości przemyto 2 x acetonem w -20°C. Osady acetonowe rozpuszczono w 30 μΐ buforu solubilizacyjnego do SDS, dodano 100 μΜ DTT ogrzewano w 90°Ć przez 5 minut. Próbki naniesiono na 4-20% żel SDS-pohakrylamidowy i białka wizualizowano przez barwienie srebrem.

Na figurze 6 pokazano eluowanie aktywności ligandu mpl z SDS-PAGE. Frakcję 6 z kolumny z powinowactwem względem mpl rozdzielono na 4-20% żel u SDS-poliakrylamidowym w nieredukujących warunkach. Po elektroforezie żel pocięto na 12 równych obszarów i elektroeluowano w sposób opisany w przykładach. Elektroeluowane próbki dializowano do PBS analizowano w rozcieńczeniu 1/20. Jako wzorce Mr stosowane do kalibracji żelu użyto wzorce Novex Mark 12.

Figura 7 pokazano wpływ APP pozbawionego ligandu mpl na megakariocytopoezę ludzką. APP zubożony w ligand mpl otrzymano przepuszczając 1 ml przez 1 -ml kolumnę z powinowactwem względem mpl (700 pg mpl-IgG/ml NHS-superose, Pharmacia), Hodowle ludzkich obwodowych komórek pierwotnych doprowadzono do 10% APP lub 10% APP pozbawionego ligandu mpl i hodowano przez 12 dni. Megakariocytopoezę oznaczano ilościowo w sposób opisany w przykładach.

Figura 8 pokazano wpływ mpl-IgG na pobudzanie megakariocytopoezy ludzkiej przez APP Hodowle ludzkich obwodowych komórek pierwotnych doprowadzono do 10% APP i hodowano przez 12 dni. W dniach 0,2 i 4 dodano mpl-IgG (0,5 pg) lub ANP-R-IgG (0,5 pg). Po 12 dniach megakariocytopoezę oznaczano ilościowo w sposób opisany w przykładach. Przedstawiono wykres dla wielkości średnich z dwóch oznaczeń podając rzeczywiste wielkości w nawiasach.

Na figurze 9 pokazano obydwie nici fragmentu 390 bp fragment ludzkiego genomowego DNA kodującego ligand mpl. Pokazano wydedukowaną sekwencję aminokwasów „egzonu 3” (SEQ ID NO: 3), sekwencję kodującą (SEQ ID NO: 4) i jej dopełnienie (SEQ ID NO 5).

Na figurze 10 pokazano wydedukowanąsekwencję aminokwasów dojrzałego ludzkiego ligandu mpl (hML) (SEQ ID NO: 6) i dojrzałej ludzkiej erytropoetyny (hEPO) (SEQ ID NO 7). Przewidywaną sekwencję aminokwasów dla ludzkiego ligandu mpl zestawiono z sekwencją ludzkiej erytropoetyny. Identyczne aminokwasy zaznaczono ramkami, a przerwy wprowadzone w celu osiągnięcia optymalnego zestawienia zaznaczono myślnikami. Potencjalne miejsca N-glikozylowama podkreślono ciągłą limą dla hML i linią przerywaną dla hEPO. Dwie cysteiny istotne dla aktywności erytropoetyny zaznaczono dużymi kropkami.

Na figurze 11 pokazano wydedukowanąsekwencję aminokwasów izoform dojrzałego ludzkiego ligandu mpl: hML (SEQ ID NO: 6), hML2 (SEQ ID NO: 8), hML3 (SEQ ID NO: 9) i hML4 (SEQ ID NO: 10). Identyczne aminokwasy zaznaczono ramkami a przerwy wprowadzone w celu osiągnięcia optymalnego zestawienia zaznaczono myślnikami.

Na figurach 12A, 12B112C pokazano wpływ ludzkiego ligandu mpl na proliferację komórek Ba/F3-mpl (A), in vitro megakariocytopoezę ludzką oznaczoną ilościowo z wykorzystaniem radioznaczonego mysiego monoklonalnego przeciwciała IgG specyficznego względem megakanocytowej glikoproteiny GPII_bIII_A (B), oraz mysiątrombopoezę oznaczonąw teście nawrotu płytek (C).

Komórki 293 transfekowano metodąCaPO₄ (Gorman C. w DNA Cłomng: A New Approach 2:143-190 [1985]) z samym wektorem pRK5, z pRK5-hML lub z pRK5-ML₁₅₃ przez noc (pRK5-ML₁₅₃ wytworzono wprowadzając kodon stopu po reszcie 153 hML metodą PCR). Ośrodki kondycjonowano następnie 36 godzin i oznaczono pobudzanie proliferacji komórek Ba/F3-mpl w sposób opisany w przykładzie 1 (A) lub in vitro megakariocytopoezy ludzkiej (B). Megakanocytopoezę oznaczano stosując ¹²⁵I radioznaczone mysie monoklonalne przeciwciało IgG (HP1-1D) dla specyficznej względem megakariocytu glikoproteiny GPn_bIII_a w sposób opisany (Grant i

180 765 inni, Blood 69T334-1339[1987]). Wpływ częściowo oczyszczonego zrekombinowanego ML (rML) na wytwarzanie in vivo płytek krwi (C) określano stosując test nawrotu trombocytozy opisany przez McDonalda T.P. Proc. Soc. Exp Biol. Med. 144:1006-10012 (1973). Częściowo oczyszczony rML otrzymano z 200 ml kondycjonowanego ośrodka zawierającego zrekombinowany ML. Ośrodki przepuszczono przez kolumnę 2 ml BlueSepharose doprowadzoną do równowagi w PBS i kolumnę przemyto PBS eluowano PBS zawierającym po 2M mocznika i NaCl. Aktywną frakcję dializowano do PBS i doprowadzono do 1 mg/ml BSA wolnym od endotoksyn BSA. Próbka zawierała poniżej 1 jednostki endotoksyny/ml. Myszom wstrzyknięto 64 000, 32 000 lub 16 000 jednostek rML lub samązaróbkę Każda grupa składa się z 6 myszy. Pokazano wielkość średnią i odchylenie standardowe dla każdej grupy. Wielkości p wyznaczono w 2-ogonowym teście T porównywania median.

Na figurze 13 porównano wpływ izoform ludzkiego ligandu mpl i wariantów w teście proliferacji komórek Ba/F3-mpl. hML, mock, hML2, hML3, hML(R153A, R154A) i hML₁₅₃ testowano w różnych rozcieńczeniach w sposób opisany w przykładzie 1.

Na figurze 14A, 14B i 14C pokazano wydedukowaną sekwencję aminokwasów (SEQ ID NO^-1) ludzkiego ligandu mpl (hML) lub ludzkiego TPO (hTPO) sekwencję kodującą ludzkiego genomowego DNA (SEQ ID NO: 11). Nukleotydy i reszty aminokwasów ponumerowano na początku każdego wiersza.

Na figurze 15 pokazano SDS-PAGE oczyszczonego 293-rhML3₃₂1 oczyszczonego 293-rhML₁₅₃.

Na figurze 16 pokazano sekwencję nukleotydów: kodującącDNA (SEQ ID NO. 12) i wydedukowaną sekwencję aminokwasów (SEQ ID NO: 13) otwartej ramki odczytu mysiej izoformy. Ta izoforma dojrzałego mysiego ligandu mpl zawiera 331 reszt aminokwasów, o 4 mniej niż przypuszczalny mML i pełnej długości i w związku z tym oznaczona jest jako mML2. Nukleotydy popnumerowano na początku każdego wiersza. Reszty aminokwasów ponumerowano ponad sekwencjąpoczynając od Ser 1. Potencjalne miejsca N-glikozylowania podkreślono. Reszty cysteiny zaznaczono kropkami ponad sekwencją.

Na figurze 17 pokazano sekwencję cDNA (SEQ ID NO: 14) i przewidzianą sekwencję białka (SEQ ID NO: 15) izoformy mysiego ML (mML). Nukleotydy ponumerowano na początku każdego wiersza. Reszty aminokwasów ponumerowano ponad sekwencjąpoczynając od Ser 1. Ta izoforma dojrzałego mysiego ligandu mpl zawiera 335 reszt aminokwasów, tak że uważana jest za ligand mpl o pełnej długości, oznaczony jako mML. Sekwencję sygnałową podkreślono linią przerywaną a punkt rozszczepienia zaznaczono strzałką. Obszary 5' i 3', które me uległy translacji, zaznaczono małymi literami. Podkreślono dwie delecje powstałe w wyniku wariantowego rozszczepienia (mML2 i mML3). 4 reszty cysteiny zaznaczono kropkami. 7 potencjalnych miejsc N-ghkozylowania zaznaczono ramkami.

Na figurze 18 porównano wydedukowaną sekwencję aminowkasów ludzkiej izoformy ML, hML3 (SEQ ID NO: 9) i mysiej izoformy ML oznaczonej jako mML3 (SEQ ID NO: 16). Przewidywaną sekwencję aminokwasów dla ludzkiego ligandu mpl zestawiono z sekwencjąmysiego ligandu mpl. Identyczne aminokwasy zaznaczono ramkami, a przerwy wprowadzone w celu zoptymalizowania zestawienia zaznaczono myślinikami. Aminokwasy ponumerowano na początku każdego wiersza.

Figura 19 porównuje przewidywaną sekwencję aminokwasów izoform dojrzałego ML mysiego ML (SEQ ID NO: 17), świńskiego ML (SEQ ID NO: 18) i ludzkiego ML (SEQ ID NO· 6) Sekwencje aminokwasów zestawiono wprowadzając przerwy, zaznaczone myślnikami, w celu uzyskania optymalnej zgodności. Aminokwasy ponumerowano na początku każdego wiersza, a identyczne reszty zaznaczono ramkami. Potencjalne miejsca N-glikozylowania zaznaczono zaciemowanąramką a reszty cysteiny zaznaczono kropkami. Podkreślono zachowany motyw z dwóch zasadowych aminokwasów stanowiący potencjalne miejsce rozszczepienia przez proteazę 4 delecje aminokwasów znalezione we wszystkich trzech rodzajach (ML2) zaznaczono pustą ramką.

Na figurze 20 pokazano sekwencję cDNA (SEQ ID NO: 19) przewidywaną dojrzałą sekwencjąbiałka (SEQ ID NO: 18) świńskiej izoformy ML (pML) Ta izoforma świńskiego ligandu mpl zawiera 332 reszty aminokwasów i, jak się uważa, stanowi świński ligand mpl o pełnej

180 765 długości, oznaczony jako pML. Nukleotydy ponumerowano na początku każdego wiersza Reszty aminokwasów ponumerowano nad sekwencją rozpoczynając od Ser 1.

Na figurze 21 pokazano sekwencję cDNA (SEQ ID NO: 20) i przewidywaną sekwencję dojrzałego białka (SEQ ID NO: 21) świńskiej izoformy (pML2). Tąizoformę świńskiego ligandu mpl zawierającą 328 reszt aminokwasów i stanowiącą formę pełnej długości świńskiego ligandu mpl z delecją4 reszt, oznaczono jako pML2. Nukleotydy ponumerowano na początku każdego wiersza. Reszty aminokwasów ponumerowano nad sekwencją rozpoczynając od Ser 1.

Na figurze 22 porównano wydedukowanąsekwencję aminokwasów pełnej długości świńskiego ML, pML (SEQ ID NO: 18) i świńskiej izoformy ML oznaczonej jako pML2 (SEQ ID NO: 21). Przewidywaną sekwencję aminokwasów dla pML zestawiono z sekwencją pML2. Identyczne aminokwasy zaznaczono w ramkach a przerwy wprowadzone w celu zoptymalizowania ułożenia zaznaczono myślnikami. Aminokwasy ponumerowano na początku każdego wiersza.

Na figurze 23 pokazano istotne cechy plazmidu pSVI5.ID.LL.MLORF („pełnej długości” lub TPO₃₃₂) stosowanego do transfekowana komórek gospodarza CHO-DP12 przy wytwarzaniu CHO-rhTPO₃₃₂.

Na figurze 24 pokazano istotne cechy plazmidu pSVI5.ID.LL.MLEPO-D („skróconego” lub TPO₁₅₃) stosowanego do transfekowania komórek gospodarza CHO-DP 12 przy wytwarzaniu CHO-rhTPO₁₅₃.

Na figurze 25A, 25B i 25C pokazano wpływ E. coli-rhTPO(Mef^!153) na płytki krwi (A), czerwone krwinki (B) i (C) białe krwinki u normalnej myszy. Dwóm grupom po 6 samic myszy C57 B 6 wstrzykiwano raz dziennie bufor PB S lub0,3 pgE. coli-rhTPO(Met‘^l153) (100 μΐ podskórnie). W dniu 0 oraz w dniach 3-7 pobierano po 40 μΐ łowi zzatoki oczodołu. Krew tąnatychmiast rozcieńczano 10 ml handlowego rozcieńczalnika i wykonano pełną analizę krwi w analizatorze Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Wyniki przedstawiono jako wielkość średnia ± błąd standardowy śedniej.

Na figurze 26 A, 26B126CV pokazano wpływ E coh-rhTPO (Met'¹,153) na płytki krwi (A), czerwone krwinki (B) i (C) białe krwinki myszy napromieniowanych dawką mniejszą od śmiertelnej. Dwóm grupom po 10 samic myszy C57 B6 napromieniowano dawką 750 cGy promieniowania γ ze źródła 137Cs (mniejszą od śmiertelnej) i wstrzykiwano raz dziennie bufor PBS lub 0,3 pg E. coh-rhTPO (Met^_1,153) (100 μΐ podskórnie). W dniu 0 oraz w określonych odstępach czasu pobierano po 40 μΙ krwi z zatoki oczodołu. Krew tąnatychmiast rozcieńczano 10 ml handlowego rozcieńczalnika i wykonano pełną analizę krwi w analizatorze Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Wyniki przedstawiono jako wielkość średnia ± błąd standardowy średniej.

Na figurze 27 A, 27B127C przedstawiono wpływ CHO-rhTPO₃₃₂ na (A) płytki krwi (trombocyty), (B) czerwone krwinki (erytrocyty) i (C) białe krwinki (leukocyty) u normalnej myszy. Dwóm grupom po 6 samic myszy C57 B6 wstrzykiwano raz dziennie bufor PBS lub 0,3 pg CHO-rhTPO₃₃₂ (100 pl z podskórnie). W dniu 0 oraz w dniach 3-7 pobierano po 40 pl krwi z zatoki oczodołu. Krew tąnatychmiast rozcieńczano 10 ml handlowego rozcieńczalnika i wykonano pełną analizę krwi w analizatorze Serrono Baker Hematology Analyzer 9018. Wyniki przedstawiono jako wielkość średnica ± błąd standardowy średniej.

Na figurze 28 pokazano krzywe reakcji na dawkę dla różnych form rhTPO otrzymanych z różnych linii komórek. Krzywe reakcji na dawkę wykonano dla rhTPO z następujących linii komórek: hTPO₃₃₂ z CHO pełnej długości z komórek jajowych chomika chińskiego); hTPO_Mel (pochodząca z E. coli skrócona forma z N-końcową metioniną); hTPO₃₃₂ (pełnej długości TPO z ludzkich komórek 293); Met-less 155 E-Coli (skrócona forma rhTPO₁₅₅] bez końcowej metioniny z E. Coli). Grupom po 6 samic myszy C57B6 wstrzykiwano raz dziennie przez 7 dni rhTPO, zależnie od grupy. Codziennie pobierano po 40pl krwi z zatoki oczodołu w celu wykonania pełnej analizy. Wyniki przedstawione powyżej oznaczają maksymalny wpływ zaobserwowany dla różnych sposobów obróbki, które z wyjątkiem (met 153 E-Coli) wystąpiły w 7 dniu obróbki W grupie „met 153 E-Coli” maksymalny efekt zaobserwowano w dniu 5. Wyniki przedstawiono jako wielkość średnia ± błąd standardowy średniej.

180 765

Na figurze 29 pokazano krzywe reakcji na dawkę porównujące aktywność form rhTPO o pełnej gługości i „okrojonej” uzyskanych w komórkach CHO ze skróconą formą z E. coli. Gupom po 6 samic myszy C57B6 wstrzykiwano raz dziennie 0,3 μ g rhTPO różnych typów. W dniach 2-7 pobierano po 40 μΐ krwi z zatoki oczodołu w celu wykonania pełnej analizy. Grupom podawano TPO₁₅₃, skrócona forma TPO z E. colt, TPO₃₃₂ (frakcja mieszana) pełnej długości TPO zawierający około 80-90% pełnej długości i 10-20% form okrojonych; TPO₃₃₂ (frakcja 30K) = oczyszczona okrojona frakcja z wyjściowego preparatu ‘mix”, TPO₃₃₂ (frakcja 70K) = oczyszczona frakcja TPO pełnej długości z wyjściowego preparatu „mix”. Wyniki przedstawiono jako wielkość średnia ± błąd standardowy średniej.

Na figurze 30 przedstawiono test KIRA ELISA do pomiaru TPO. Pokazano chimerę MPL/Rse.gD i odpowiednie części macierzystych receptorów, a także ostateczny konstrukt (prawa część rysunku) oraz schemat (lewa część rysunku) przedstawiający kolejne etapy testu.

Na figurze 31 pokazano schemat testu KIRA ELISA przedstawiający każdy etap procedury.

Na figurze 32A-32L pokazano sekwencję nukelotydów (SEQ ID NO: 22) pSVI17.ID.LL wektora ekspresji wykorzystywanego w ekspresji Rse.gD w przykładzie 17.

Na figurze 33 przedstawiono schematycznie wytwarzanie plazmidu pMPl.

Na figurze 34 przedstawiono schematycznie wytwarzanie plazmidu pMP21.

Na figurze 35 przedstawiono schematycznie wytwarzanie plazmidu pMP151.

Na figurze 36 przedstawiono schematycznie wytwarzanie plazmidu pMP202.

Na figurze 37 przedstawiono schematycznie wytwarzanie plazmidu pMP172.

Na figurze 38 przedstawiono schematycznie wytwarzanie plazmidu pMP210.

Na figurze 39 przedstawiono tablicę 5 klonów wytwarzających TPO w wyniku ekspresji z banku plazmidów pMP210 (SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 i 28).

Na figurze 40 przedstawiono schematycznie wytwarzanie plazmidu pMP41.

Na figurze 41 przedstawiono schematycznie wytwarzanie plazmidu pMP57 Na figurze 42 przedstawiono schematycznie wytwarzanie plazmidu pMP251. Szczegółowy opis wynalazku

I. Definicje

Ogólnie następujące słowa i wyrażenia użyte w opisie, przykładach i zastrzeżeniach mają podane znaczenie.

„Środek chaotropowy” oznacza związek, który w roztworze wodnym i w odpowiednich stężeniach może powodować zmiany w konfiguracji lub konformacji przestrzennej białka poprzez co najmniej częściowo zniszczenie sił odpowiedzialnych za utrzymywanie normalnej drugo- i trzeciorzędowej struktury białka. Do związków takich należy np. mocznik, chlorowodorek guanidyny i tiocyjanian sodu. Wysokie stężenia, np. 4-9M takich związków wymagane są zazwyczaj, aby wywołać zmiany konformacyjne w białkach.

„Cytokma” jest określeniem rodzajowym odnoszącym się do białek uwalnianych przez jedną populację komórek, które działają na inne komórki jako międzykomórkowi mediatorzy. Do przykładowych cytokin należą limfokiny, monokmy i tradycyjne hormony polipeptydowe. Do cytokin należy hormon wzrostu, insulino-podobny czynnik wzrostu, ludzki hormon wzrostu, N-metionylylowy ludzki hormon wzrostu, bydlęcy hormon wzrostu, hormon paratyroidowy, tyroksyna, insulina, promsulina, relaksyna, prorelaksyna, hormon glikopro terno wy taki jak hormon folikulotropowy (FSH), hormon pobudzający tarczycę (TSH) i hormon luteinizujący (LH), hematopoetyczny czynnik wzrostu, hepatyczny czynnik wzrostu, fibroblastowy czynnik wzrostu, prolaktyna, laktogen łożyskowy, czynnik martwicy nowotworowej-a (TNF-a i TNF-β) substancja inhibitująca mulerian, peptyd związany z mysią gonadotropmą, inhibina, aktywina, naczyniowo-nabłonkowy czynnik wzrostu, integryna, nerwowy czynnik wzrostu taki jak NGF-β, płytkowy czynnik wzrostu, transformujące czynniki wzrostu (TGF) takie jak TGF-α i TGF-β, insulino-podobny czynnik wzrostu-I i -II,erytropoetyna (EPO), czynnik osteomdukcyjny, nterferony takie jak interferon-α, i -β i -γ, czynniki pobudzające kolonie (CSF) takie jak makrofagowy CSF (M-CSF), granulocytomakrofagowy CSF (GM-CSF) i granulocytowy CSF (G-CSF), interleukmy(IL) takie jak IL-1, IL-Ια, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9,

180 765

IL-11, IL-121 inne czynniki polipeptydowe takie jak LIF, SCF i kit-hgand. W użytym znaczeniu powyższe terminy obejmująbiałka ze źródeł naturalnych lub z hodowli zrekombinowanych komórek. Podobnie terminy te obejmująbiologicznie czynne odpowiedniki, np. różniące się w sekwencji aminokwasów jednym lub więcej aminokwasami, albo typem i stopniem glikozylowania.

Określenia, „ligand mpl”, „polipeptyd hgandu mpl”, „ML”, „trombopoetyna” lub „TPO” są stosowane wymiennie i oznaczająpolipeptyd wykazujący zdolność wiązania mpl, członka superrodziny receptorów cytokiny o właściwościach biologicznych ML, określonych poniżej Przykładową właściwość biologiczną stanowi zdolność pobudzania wbudowywania znaczonych nukleotydów (np. ³H-tymidyny) do DNA IL-3-zależnych komórek Ba/F3 transfekowanych ludzkim mpl P. Inną przykładową właściwość biologiczną stanowi zdolność pobudzania wbudowywania ³⁵S do krążących płytek krwi w teście nawrotu mysich płytek. Definicja ta obejmuje pohpeptyd wydzielony ze źródła ligandu mpl, taki jak aplastyczna świńska plazma lub z innego źródła, np. pochodzącego z innych gatunków zwierząt, w tym do ludzi, albo wytworzony metodami rekombinacji lub syntetycznie, w tym formy wariantowe obejmujące ich pochodne funkcyjne, fragmenty, allele, izoformy i analogi.

„Fragment ligandu mpl” lub „fragment TPO” stanowi część występującego w naturze pełnej długości hgandu mpl lub sekwencji TPO z wyciętą jedną lub więcej resztami aminokwasów lub merów węglowodanowych. Wycięte reszty aminokwasów mogą znajdować się w dowolnym miejscu w peptydzie, w tym na jego końcu N-końcowym lub C-końcowym albo wewnątrz Fragment będzie dzielić co najmniej jedną właściwość biologiczną z ligandem mpl. Fragmenty hgandu mpl zawierają zazwyczaj kolejną sekwencję co najmniej 10, 15, 20, 25, 30 lub 40 reszt ammokwasów, identyczną z sekwencjami ligandu mpl wydzielonego ze ssaka, obejmującego hgand wydzielony z aplastycznej plazmy świńskiej albo ligand ludzki lub mysi, zwłaszcza z jego domenąEPO. Do reprezentatywnych przykładów N-końcowych fragmentów należy łiML₁₅3 lub TPOiMet'¹ 1-153) „Warianty hgandu mpl” lub „warianty sekwencji ligandu mpl” oznaczają biologicznie czynny ligand mpl, określony poniżej, o identyczności sekwencji poniżej 100% z ligandem mpl wydzielonym z hodowli zrekombinowanych komórek lub z aplastycznej plazmy świńskiej albo z ludzkim ligandem o wydedukowanej sekwencji przedstawionej na fig. 1 (SEQ ID NO: 1). Zazwyczaj biologicznie czynny wariant ligandu mpl będzie zawierać sekwencj ę aminokwasów wykazującej w co najmniej 70% identyczności z ligandem mpl wydzielonym z aplastycznej świńskiej plazmy lub z dojrzałym mysim albo ludzkim ligandem lub jego fragmentem (patrz fig. 1 [SEQ ID NO: 1]), korzystnie w co najmniej około 75%, jeszcze korzystniej w co najmniej około 80%, szczególnie korzystnie co najmniej około 85%, wyjątkowo korzystnie co najmniej około 90%, a najkorzystniej co najmniej około 95%.

„Chimeryczny ligand mpl” stanowi polipeptyd obejmujący pełnej długości mpl lub jeden albo więcej z jego fragmentów, połączony lub związany z drugim heterologicznym pohpeptydem lub jednym albo więcej jego fragmentami. Chimera będzie dzielić co najmniej jedną właściwość biologiczną z ligandem mpl. Drugim polipeptydem jest zazwyczaj cytokina, immunoglobulina lub ich fragment.

Określenia „wydzielony ligand mpl”, „znacznie oczyszczony ligand mpl” i „zasadniczo jednorodny hgand mpl” są używane wymiennie i oznaczają ligand mpl, który został wydzielony ze źródła i oczyszczony lub został wytworzony metodami rekombinacj i lub syntetycznie i j est zasadniczo wolny od ich peptydów lub białek (1), tak że uzyskuje się co najmniej 15, a korzystnie 20 reszt aminokwasów N-końcowej lub wewnętrznej sekwencji aminowkasów przy stosowaniu aparatu do sekwencjonowania z wirującym kubkiem albo najlepszego dostępnego na rynku aparatu do sekwencjonowania aminokwasów, produkowanego lub zmodyfikowanego opublikowanymi metodami przed datą wniesienia niniejszego zgłoszenia, albo (2) do homogemczności w SDS-PAGE w meredukujących lub redukujących warunkach przy zastosowaniu barwienia błękitem Coomassię lub, korzystnie, srebrem. W opisie jednorodność oznacza zanieczyszczenie innymi źródłami białkami poniżej około 5%.

180 765

Określenie „właściwość biologiczna” użyte w połączeniu z „ligandem mpl” lub „wydzielonym ligandem mpl” oznacza, ze wykazuje aktywność trombopoetyczną lub in vivo działanie efektorowe lub antygenowe albo aktywność, która jest bezpośrednio lub pośrednio spowodowana lub realizowana przez hgand mpl (zarówno w natywnej jak i w zdenaturowanej konfiguracji) lub jego fragment. Działania efektorowe obejmują aktywność wiązania mpl i wiązania dowolnego nośnika, agonizm lub antagonizm mpl, zwłaszcza transdukcję replikacji obejmującej sygnał proliferacyjny, regulowanie DNA, modulowanie aktywności biologicznej innych cytokin, uaktywnianie receptora (zwłaszcza cytokiny), dezaktywowanie regulacja w górę lub w dół, wzrost lub różnicowanie komórek ltp. Działanie antygenowe oznacza posiadanie epitopu lub miejsca antygenowego zdolnego do reakcji krzyżowej z przeciwciałami przeciw natywnemu ligandowi mpl. Podstawowe działanie antygenowe polipeptydu ligandu mpl polega na tym, że wiąże się on z powinowactwem co najmniej około 10⁶ litra/mol z przeciwciałem przeciw ligandowi mpl wydzielonemu z aplastycznej świńskiej plazmy. Zwykle polipeptyd wiąże się z powinowactwem co najmniej około 10⁷ litra/mol. Najkorzystniej antygenowo aktywny polipeptyd ligandu mpl jest polipeptydem, który wiąże się z przeciwciałem przeciw ligandowi mpl wykazującemu działanie efektorowe opisane powyżej. Przeciwciałami stosowanymi do określania „aktywności biologicznej” są poliklonalne przeciwciała królika wyhodowane przez przyrządzenie ligandu mpl wydzielonego z hodowli zrekombinowanych komórek lub z aplastycznej świńskiej plazmy w pełnym ośrodku Freunda podskórne wstrzyknięcie preparatu i wzmocnienie reakcji odpornościowej przez dootrzewnową infekcję preparatu aż do osiągnięcia plateau miana przeciwciała hgandu mpl.

Określenie „biologicznie czynny” użyte w połączeniu z „ligandem mpl” lub „wydzielonym ligandem mpl” oznacza ligand mpl lub polipeptyd, który wykazuje działanie trombopoetyczne lub dzieli działanie efektorowe ligandu mpl wydzielonego z aplastycznej świńskiej plazmy lub wytworzonego w wyniku ekspresji w hodowli zrekombinowanych komórek, w opisany sposób. Podstawowym znanym działaniem efektorowym ligandu mpl lub polipeptydu jest wiązanie z mpl i pobudzanie wbudowywania znaczonych nukleotydów (³H-tymidyny) do DNA IL-3-zaleznych komórek BaJF3 transfekowanych ludzkim mpl P. Innym znanym działaniem efektorowym ligandu mpl lub polipeptyd jest zdolność do pobudzania wbudowywania ³⁵S do krążących płytek krwi w teście nawrotu mysich płytek. Jeszcze innym znanym działaniem efektorowym ligandu mpl jest zdolność do pobudzania in vitro megakariocytopoezy ludzkiej, co można oznaczyć ilościowo stosując radio-znaczone monoklonalne przeciwciała specyficzne względem megakariocytowej glikoproteiny GPII_bIII_A

Procent identyczności sekwencji aminokwasów” w odniesieniu do sekwencji ligandu mpl określa się jako procent reszt aminokwasów w określonej sekwencji identycznych z resztami w sekwencji ligandu mpl wydzielonego z aplastycznej świńskiej plazmy lub mysiego albo ludzkiego ligandu o wydedukowanej sekwencji aminokwasów pokazanej na fig. 1 (SEQ ID NO 1), po zestawieniu sekwencji i wprowadzeniu przerw, gdy jest to niezbędne, aby osiągnąć maksymalny procent identyczności sekwencji, bez uwzględniania ewentualnych konserwatywnych podstawień jako części identyczności sekwencji. Żadnego z N-końcowych, C-końcowych, lub wewnętrznych wydłużeń, delecji lub insercji w sekwencji ligandu mpl nie można uważać za wpływające na identyczność lub homologię sekwencji. I tak do przykładowych biologicznie czynnych pohpeptydów ligandu mpl, jak się uważa, zawierają identyczne sekwencje, należą ligand prepro-mpl, ligand pro-mpl i dojrzały ligand mpl.

„Mikrosekwencjonowame ligandu mpl” można przeprowadzić dowolnym standardowym sposobem, pod warunkiem, że sposób ten jest wystarczająco czuły. W jednym z takich sposobów wysoce oczyszczony polipeptyd otrzymany z żeli SDS lub z ostatecznego etapu HPLC sekwencjonuje się bezpośrednio przeprowadzając zautomatyzowaną degradację Edmana (izotiocyjanian fenylu) stosując aparat do sekwencjonowania w fazie gazowej model 470A Applied Biosystems wyposażony w fenylotiohydantoinowy (PTH) analizator aminokwasów 120 A Dodatkowo fragmenty ligandu mpl otrzymane przez trawienie chemiczne (np. CNBR, hydroksyloaminą, 2-nitro-5-tiocyjanobenzoesanem) lub enzymatycznie (np. trypsyną, klostrypainą

180 765 streptoproteazą), a następnie oczyszczanie fragmentu (np. metodą HPLC) można podobnie sekwencjonować. Aminokwasy PTH analizuje się stosując układ danych ChromPerfect (Justice Innovations, Pało Alto, CA). Interpretację sekwencji przeprowadza się stosując komputer VAX 11/785 Digital Eąuipment Co., jak to opisali Henzel i inni, J. Chromatography, 404:41-52 [1987], Ewentualnie próbki frakcji HPLC można poddawać elektroforezie na 5-20% SDS-PAGE, przenosić elektrycznie na membranę PVDF (ProBlott, AIB, Foster City, CA) i barwić Coomassię Brilhant Blue (Matsurdiara, J. Biol. Chem., 262:10035-10038 [1987], Określone białko zidentyfikowane przez barwienie wycina się z biotu i przeprowadza się N-końcowe sekwencjonowanie stosując aparat do sekwencjonowania w fazie gazowej opisany powyżej. W przypadku wewnętrznych sekwencji białek, frakcje HPLC suszy się pod zmniejszonym ciśnieniem (SpeedVac), ponownie zawiesza w odpowiednich buforach i trawi się bromkiem cyjanogenu, Lys-specyficznym enzymem Lys-C (Wako Chemicals, Richmond, VA), lub Asp-N (Boehnnger Mannheim, Indianapolis, IN). Po strawieniu uzyskane peptydy sekwencjonuje się w postaci mieszaniny lub po rozdzielaniu metodą HPLC w kolumnie C4 rozwijanej z gradientem propanolu w 0,1% TFA przed sekwencjonowaniem w fazie gazowej.

„Małopłytkowość” określa się jako liczbę płytek poniżej 150 x 10⁹/htr krwi.

„Aktywność trombopoetyczną” określa się jako aktywność biologiczną obejmującą przyspieszanie proliferacji, różnicowania i/lub dojrzewania megakanocytów lub prekursorów megakanocytów do formy tych komórek wytwarzającej płytki. Aktywność tą można mierzyć w różnych testach obejmujących test in vivo powrotnej syntezy mysich płytek, test indukcji antygenu powierzchni komórek płytkowych określanej w immunologicznym teście przeciwpłytkowym (anty-GPII_bIII_a) dla linii ludzkich megakarioblastycznych komórek białaczki (CMK) oraz indukowanie poliploidyzacji w linii komórek megakarioblastycznych (DAMI).

„Trombopoetynę” (TPO) określa się jako związek o aktywności trombopoetycznej lub zdolny do zwiększania liczby płytek krwi u ssaka. TPO jest korzystnie zdolny do zwiększania liczby endogennych płytek o co najmniej 10%, jeszcze korzystniej o 50%, a najkorzystniej jest zdolny do podwyższania liczby płytek u człowieka do wielkości ponad 150 x 10⁹/litr krwi „Wydzielony kwas nukleinowy hgandu mpl” stanowi RNA lub DNA zawierający ponad 16, a korzystnie 20 lub więcej kolejnych zasad nukleinowych, które kodują biologicznie czynny ligand mpl lub jego fragment, jest komplementarny z RNA lub DNA, albo hybrydyzuje z RNA lub DNA i pozostaje trwale związany w umiarkowanych - napiętych warunkach. Taki RNA lub DNA jest wolny od co najmniej jednego zanieczyszczającego źródła kwasu nukleinowego, z którym jest on normalnie związany w naturalnym źródle, a korzystnie zasadniczo wolny od jakiegokolwiek innego RNA lub DNA ssaka. Określenie „wolny od co najmniej jednego zanieczyszczającego źródła kwasu nukleinowego, z którym jest on normalnie związany” obejmuje przypadek, gdy kwas nukleinowy występuje w źródle lub w naturalnej komórce, ale jest zlokalizowany w innym chromosomie lub jest inaczej flankowany przez sekwencje kwasu nukleinowego nie występujące zazwyczaj w komórce źródłowej. Przykład wydzielonego kwasu nukleinowego hgandu mpl stanowi RNA lub DNA kodujący biologicznie czynny ligand mpl wykazujący co najmniej 75% identyczności sekwencji, korzystnie co najmniej 80%, jeszcze korzystniej co najmniej 85%, szczególnie korzystnie 90%, a najkorzystniej 95% identyczności sekwencji ludzkim, mysim lub świńskim hgandem mpl.

„Sekwencje kontrolne” w odmesimu do ekspresji oznaczają sekwencje DNA niezbędne do ekspresji operacyjnie połączonej sekwencji kodującej w konkretnym organizmie gospodarza. Sekwencje kontrolne przydatne w przypadku prokariotów, zawierająnp. promotor, ewentualnie sekwencję operatora, miejsce wiązania rybosomu i ewentualnie inne, dotychczas me do końca zidentyfikowane, sekwencje. Komórki eukariotyczne wykorzystują promotory, sygnały poliadenylowania i enhancery.

„Operacyjnie połączony” w odniesieniu do kwasów nukleinowych oznacza, że kwasy nukleinowe znajdują się w funkcyjnej zależności w stosunku do mnej sekwencji kwasu nukleinowego. Tak np. DNA sekwencji wstępnej lub lidera wydzielania jest operacyjnie połączony z DNA dla polipeptydu, jeśli został wytworzony w wyniku ekspresji jako prebiałko, które uczest

180 765 mczy w wydzielaniu polipeptydu; promotor lub enhancer jest operacyjnie połączony z sekwencją kodującą gdy wpływa na transkrypcję sekwencji; albo też miejsce wiązania rybosomu jest operacyjnie połączone z sekwencja kodującąjeśli jest usytuowane tak, aby ułatwiać translację. Ogólnie „operacyjnie połączony” oznacza, że połączone sekwencje DNA sąsiadują a w przypadku lidera wydzielania, sąsiadują i są w fazie odczytu. Jednakże enhancer nie musi być w sąsiedztwie. Połączenie osiąga się przez ligowanie w dogodnych miejscach restrykcyjnych. Gdy takie miejsca nie występują stosuje się syntetyczne oligonukleotydowe adaptery lub ligandy, zgodnie z przyjętą praktyką.

„Egzogenny” w odniesieniu do elementu oznacza sekwencję kwasu nukleinowego obcą dla komórki, lub homologiczną dla komórki, ale w takim miejscu w kwasie nukleinowym w komórce gospodarza, w którym element ten zazwyczaj nie występuje.

Określenia „komórka”, „linia komórek” i „hodowla komórek” stosuje się wymiennie, przy czym obejmująone wszelkie potomstwo komórki lub linii komórek. Tak np. określenia „transformanty” i „transformowane komórki” obejmują komórkę pierwotną oraz pochodzące z niej hodowle, bez względu na liczbę transferów. Zrozumiałe jest również, że całe potomstwo może nie być dokładnie identyczne w odniesieniu do zawartego DNA z uwagi na rozmyślne lub nieumyślne mutacje. Dotyczy to także mutantowego potomstwa wykazującego to samo działanie lub aktywność biologiczną wyselekcjonowaną dla wyjściowych transformowanych komórek. Gdy różnice w określeniach są zamierzone, wynikać to będzie z kontekstu.

„Plazmidy” są kolistymi cząsteczkami ulegającymi automatycznej replikacji o niezależnym pochodzeniu, które w opisie zaznacza się małąliterą„p” umieszczonąprzed i/lub za literami dużymi i/lub liczbami. Zastosowane wyjściowe plazmidy sądostępne w handlu, dostępne publicznie na nieograniczonych zasadach lub mogą być wytworzone w takich dostępnych plazmidów z wykorzystaniem opublikowanych procedur. Ponadto inne równoważne plazmidy są znane specjalistom.

„Trawienie enzymem restrykcyjnym” w odniesieniu do DNA oznacza katalityczne rozszczepianie wewnętrznych wiązań fosfodiestrowych w DNA enzymem, który działa tylko w pewnych lokalizacjach lub miejscach w sekwencji DNA. Enzymy takie określa się jako „endonukleazy restrykcyjne”. Każda endonukleaza restrykcyjna rozpoznaje konkretną sekwencję DNA określanąjako „miejsce restrykcji” wykazujące symetrię dwustronną. Różne zastosowane enzymy restrykcyjne są dostępne w handlu, przy czym zastosowano podane przez producentów warunki reakcji, kofaktory i inne wymagania. Enzymy restrykcyjne określa się zazwyczaj skrótami, w skład których wchodzi duża litera, po której następują małe litery oznaczające dronbnoustrój, z którego każdy enzym restrykcyjny został pierwotnie, oraz liczba określająca konkretny enzym. Zazwyczaj stosuje się około 1 pg plazmidu lub fragmentu DNA z około 1-2 jednostkami enzymu w około 20 μΐ roztworu buforowego. Odpowiednie bufory i ilości substratów dla konkretnego enzymu restrykcyjnego podane sąprzez producenta. Zazwyczaj prowadzi się inkubacje przez około 1 godzinę w 37°C, z tym że warunki mogąbyć inne, w zależności od zaleceń dostawcy. Po inkubacji białko lub polipeptyd usuwa się przez ekstrakcję fenolem i chloroformem, po czym strawiony kwas nukelinowy odzyskuje się z frakcji wodnej przez strącanie etanolem. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym można przeprowadzić hydrolizę bakteryjną fosfatazą alkaliczną końcowych 5'-fosforanów, aby zapobiec „cyrkularyzacji” łub utworzenia zamkniętej pętli przez dwa restrykcyjnie rozszczepione końce fragmentu DNA, gdyż mogłoby to zakłócić insercję innego fragmentu DNA w miejscu restrykcji. O ile nie zaznaczono tego, po trawieniu plazmidów nie prowadzono 5'-końcowego odfosforylowama. Procedury i odczynniki do fosforylowania są znane i opisane w sekcjach 1,56-1,61 pracy Sambrook i mm, Molecular Clonmg: A Laboratofy Manuał [New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989].

„Odzysk” lub „wydzielanie” danego fragmentu DNA z trawienia restrykcyjnego oznacza rozdzielanie produktu trawienia na żelu pohakrylamidowym lub agarozowym na drodze elektroforezy, identyfikację wybranego fragmentu przez porównanie jego ruchliwości z ruchliwością fragmentów merkera DNA o znanym ciężarze cząsteczkowym, usunięciu sekcji żelu zawie

180 765 rającego fragment i oddzielenie żelu od DNA. Jest to procedura ogólnie znana. Patrz np Lawn i mm,Nucleic AcidsRes., 9:6103-6114 [1981] i Goeddelinni,NucleicAcidsR.es., 8:4057 [1980] „Analiza Southema” lub „blottmg Southema’ stanowi metodę, zgodnie z którą obecność sekwencji DNA w produkcie trawienia endonukleaząrestrykcyjną DNA lub kompozycji zawierającej DNA potwierdza się na drodze hybrydyzacji ze znanym, znaczonym ohgonukleotydem lub fragmentem DNA. Analiza Southema obejmuje zazwyczaj rozdzielanie elektroforetyczne produktów trawienia DNA na żelach agarozowych, denaturacja DNA po rozdzielaniu elektroforetycznym i przeniesienie DNA na nitrocelulozę, nylon lub innąodpowiedmąmembranę nośną w celu wykonania analizy radioznaczoną biotynylowaną lub enzymatycznie znaczoną sondą, jak to opisano w sekcjach 9,37-9,62 pracy Sambrook i mni, supra.

„Analiza Northema” lub blotting Northema” jest metodą wykorzystywaną do identyfikacji sekwencji DNA, które hybrydyzują ze znaną sondą taką jak oligonukleotyd, fragment DNA, cDNA lub jego fragment, albo fragment RNA. Sonda jest znaczona radioizotopem takim jak ³²P, lub przez biotynylowanie albo enzymem. Analizowany RNA zwykle rozdziela się elektroforetyczme na żelu agarozowym lub poliakrylamidowym, przenosi na membranę z nitrocelulozy, nylonu lub innego odpowiedniego materiału i hybrydyzuje się z sondą stosując dobrze znane standardowe techniki, takie jak opisane w sekcjach 7,39-7,52 pracy Sombrook i mm, supra.

„Ligowanie” jest procesem wytwarzania wiązań fosfodiestrowych między dwoma fragmentami kwasu nukleinowego. Aby mogło zajść ligowanie dwóch fragmentów, końce fragmentów muszą sobie odpowiadać. W pewnych przypadkach końce będą bezpośrednio kompatybilne po trawieniu endonukleazą. Jednakże może okazać się, że najpierw trzeba przekształcić lepkie końce zazwyczaj powstałe po trawieniu endonukleazą w tępe końce, tak aby nadać im przydatność do ligowania. W celu stępienia końców DNA poddaje się obróbce w odpowiednim buforze prze co najmniej 15 minut w 15°C w około 10 jednostkami fragmentu Klenowa pohmerazy I DNA lub polimerazy T4 DNA w obecności 4 trifosforanów dezoksyrybonukleotydu. DNA oczyszcza się następnie przez ekstrakcję fenolem-chloroformem i wytrącanie etanolem, Fragmenty DNA przeznaczone do ligowania umieszcza się w roztworze w około równomolowych ilościach. Roztwór zawiera również ATP, bufor hgazy i hgazę taką ligaza T4 DNA w ilości około 10 j ednostek/0,5 pg DNA. Gdy DNA ma być ligowany z wektorem, wektor najpierw linearyzuje się przez trawienie odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi. Linearyzowany fragment poddaje się następnie obróbce bakteryjną fosfatazą alkaliczną lub fosfataząz jelita bydlęcego, aby zapobiec samohgowamu w etapie ligowania.

„Preparowanie” DNA z komórek oznacza wydzielanie plazmidowego DNA z hodowli komórek gospodarza. Do znanych sposobów preparowania DNA należy preparowanie plazmidów w dużej i małej skali, opisane w sekcjach 1,25-1,33 pracy Sambrook i inni, supra. Po preparowaniu DNA można oczyszczać znanymi sposobami, takimi jak opisane w sekcji 1,40 pracy Sambrook i mm, supra.

„Oligonukleotydy” stanowią krótkołańcuchowe, jedno- lub dwuniciowe polidezoksynukleotydy zsyntetyzowane chemicznie znanymi sposobami (takimi jak chemia fosfotriestrowa, fosforanowa lub fosforamidyniowa, stosując techniki w fazie stałej, takie jak sposób opisany w EP 266 032 opublikowanym 4 maja 1988, poprzez półprodukty typu H-fosfoniany dezoksynukleozydu, jak to opisali Froehler i mm, Nuci. Acids Res., 14:5399-5407 [1986]). Inne sposoby obejmuj ąpohmerazową reakcję łańcuchową opisaną poniżej oraz mne sposoby z autosondami i syntezy ohgonukleotydów na stałych nośnikach. Wszystkie takie sposoby opisali Engels i inni, Agnew Chem. Int. Ed. Engl., 28:716-734 (1989). Metody takie stosuje się gdy cała sekwencja kwasu nukleinowego genu jest znana lub, gdy dostępna jest sekwencja kwasu nukleinowego komplementarna z nicią kodującą. Natomiast jeśli znana jest docelowa sekwencja aminokwasów, można założyć potencjalne sekwencje kwasów nukleinowych stosując znane i korzystne reszty kodujące każdą resztę aminokwasu. Oligonukleotydy oczyszcza się następnie na żelach pohakrylamidowych.

„Pohmerazowa reakcja łańcuchowa” lub „PCR” oznacza procedurę lub technikę, zgodnie z którą niewielkie ilości określonego kawałka kwasu nukleinowego, RNA i/lub DNA, amphfiku

180 765 je się w sposób opisany w patencie USAnr 4 683 195, z 28 lipca 1987. Zasadniczo niezbędne są informacje odnośnie sekwencji od końców określonego obszaru lub poza nim, tak aby można było zaprojektować oligonukleotydowe startery; startery te będą zawierać sekwencję identyczną lub podobną do sekwencji przeciwnej nici amplifikowanej matrycy. 5'-końcowe nukleotydy dwóch starterów mogą zgadzać się z końcami amplifikowanego materiału. PCR wykorzystać można do amphfikacji określonych sekwencji RNA, określonych sekwencji DNA z pełnego genomowego DNA oraz cDNA transkrybowanego z pełnego komórkowego RNA, sekwencje bakteriofagowe, plazmidowe itp. Patrz ogólnie Mulhs i inni, Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol., 51:263 [1987]; Erlich,red.,PCRTechnology, (StocktonPress,NY, 1989). Wużytymznaczeniu PCR należy uważać za jeden, ale nie jedyny przykład metody polimerazowej reakcji kwasu nukleinowego do amplifikacji badanej próbki kwasu nukleinowego, obejmującej zastosowanie znanego kwasu nukleinowego jako startera i połimerazy kwasu nukleinowego do amphfikacji lub wytworzenia określonego kawałka kwasu nukleinowego.

„Ostrymi warunkami” sątakie warunki, że (1) stosuje się do przemywania środek o niskiej sile jonowej w wysokiej temperaturze, np. 0,015 M NaCl/0,0015 M cytrynian sodowy/0,1 %NaDodSO₄ (SDS) w 50°C, lub (2) stosuje się w czasie hybrydyzacji środek denaturacyjny taki jak formamid, np. 50%(objęt.) formamid z 0,1% albuminy z surowicy bydlęcej/0,1% Ficoll/0,1 % pohwinylopirohdonu/50 mM bufor z fosforanu sodowego o pH 6,5 z 750 mM NaCl, 75 mM cytrynianu sodowego w 42°C. Inny przykład stanowi użycie 50% formamidu, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M cytrynianu sodowego), 50 mM fosforan sodowy (pH 6,8), 0,1% pirofosforan sodowy, 5 x roztwór Denhardta, DNA nasienia łososia poddane obróbce ultradźwiękami (50 μg/ml), 0,1 % SDS 110% siarczanu dekstranu w 42°C z przemywaniem w 42°C 0,2 x SSC i 0,1 % SDS „Umiarkowanie ostre warunki” są opisane w pracy Sambrook i inni, supra i obejmują zastosowanie roztworu przemywającego i warunki hybrydyzacji (np. temperatura, siła jonowa i % SDS.) mniej ostre od opisanych powyżej. Przykład umiarkowanie ostrych warunków stanowią warunki takie jak inkubacja przez noc w 37°C w roztworze zawierającym 20% formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM tricytrynian sodowy), 50 mM fosforan sodowy (pH 7,6), 5 x roztwór Denhardta, 10% siarczan dekstranu i 20 μΐ/ml denaturowanego DNA z ucieranego nasienia łososia, a następnie przemywanie filtrów 1 x SSC w około 37-50°C. Specjalista łatwo ustali, jak dobrać temperaturę, siłę jonowąi inne warunki niezbędne do dopasowania się do czynników takich jak długość sondy itp.

,,Przeciwciała”(Ab) i „immunoglobuliny” (Ig) są ghkoproteinami o tej samej charakterystyce strukuralnej. Podczas gdy przeciwciała wykazują specyficzność wiązania względem określonego antygenu, immunoglobuliny obejmują zarówno przeciwciała jak i inne przeciwciało-podobne cząsteczki nie wykazujące specyficzności względem antygenu. Polipeptydy tego ostatniego typu sąnp. w niewielkich ilościach przez układ limfatyczny oraz w zwiększonych ilościach przez szpiczak.

„Natywne przeciwciała i immunoglobuliny” są zazwyczaj heterotetramerycznymi ghkoprotemami o około 150 000 daltonach, złożone z dwóch identycznych lekkich (L) łańcuchów i dwóch identycznych ciężkich (H) łańcuchów. Każdy lekki łańcuch jest połączony z ciężkim łańcuchem jednym kowalencyjnym wiązaniem disulfidowym, przy czym hczba wiązań disulfidowych jest różna dla ciężkich łańcuchów immmunoglobulin różnych izotypów. Każdy ciężki i lekki łańcuch zawiera również regularnie rozmieszczone wewnątrz łańcucha mostki disulfidowe. Każdy ciężki łańcuch ma najednym końcu zmienną domenę (VH), po której następuje szereg stałych domen. Każdy lekki łańcuch ma zmienną domenę najednym końcu (VL) stałą domenę na drugim końcu; stała domena lekkiego łańcucha zorientowana z pierwszą stałą domeną ciężkiego łańcucha, a zmienna domena lekkiego łańcucha jest zorientowana ze zmienną domeną ciężkiego łańcucha. Uważa się, że konkretne reszty aminokwasów tworzą między fazę pomiędzy zmiennymi domenami lekkiego i ciężkiego łańcucha (Clothia i inni, J. Mol. Biol., 186:651-663 [1985]; Novotny i Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596 [1985]).

Określenie „zmienny” dotyczy faktu, że między przeciwciałami występują znaczące różnice w sekwencjach pewnych części zmiennych domen, które wykorzystywane są w wiązaniu i

180 765 specyficzności każdego określonego przeciwciała względem jego określonego antygenu. Jednakże zmienność ta nie jest równomiernie rozmieszczona w zmiennych domenach przeciwciał Jest ona skoncentrowana w trzech segmentach określanych jako obszary determinujące komplementamość (CDR) lub obszary hiperzmienne w zmiennych domenach zarówno w lekkim łańcuchu jak i w ciężkim łańcuchu. Bardziej zachowane części zmiennych domen określane są jako szkielet (FR) Każda ze zmiennych domen natywnych ciężkich lekkich łańcuchów zawiera 4 obszary FR, w znacznym stopniu przyjmujące konfigurację β-arkusza, połączone przez 3 CDR, które tworząpętle łączące, a w pewnych przypadkach tworzące część struktury β-arkusza. CDR w każdym łańcuchu sąutrzymywane w bliskim sąsiedztwie przez obszary FR oraz, wraz z CDR z innego łańcucha uczestniczą w tworzeniu na przeciwciele miejsca wiązania antygenu (patrz Kabat i mm, Seąuences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD [1987]). Stałe domeny nie uczestniczą bezpośrednio w wiązaniu przeciwciała z antygenem, ale wykazują różne funkcje efektorowe, np. w udziale przeciwciała w zależnej od przeciwciała toksyczności komórkowej.

W wyniku trawienia papainą przeciwciał uzyskuje się dwa identyczne fragmenty wiążące antygen, określane jako fragmenty „Fab”, przy czym każdy z nich zawiera pojedyncze miejsce wiązania antygenu i resztkowy fragment „Fc”, którego nazwa odzwierciedla jego łatwość do krystalizacji. Przy obróbce pepsyną uzyskuje się fargment F(ab')₂ zawierający dwa miejsca łączące antygen, w dalszym ciągu zdolny do sieciowania antygenu.

„Fv” jest minimalnym fragmentem przeciwciała, który zawiera pełne miejsce rozpoznawania i wiązania antygenu. Obszar ten obejmuje dimer zmiennych domen jednego ciężkiego i jednego lekkiego łańcucha w ścisłym, non-kowalencyjnym połączeniu. To dzięki takiej konfiguracji trzy CDR każdej zmiennej domeny oddziaływująokreślając miejsce wiązania antygenu na powierzchni dimeru VH-VL. Łącznie 6 CDR nadaje specyficzność wiązania antygen z przeciwciałem. Jednak nawet pojedyncza zmienna domena (lub połówka Fv obejmująca tylko 3 CDR specyficzne względem antygenu) wykazuje zdolność rozpoznawania wiązania antygenu, choć z mniejszym powinowactwem niż całe miejsce wiązania.

Fragmenty Fab zawierają również stałą domenę lekkiego łańcucha i pierwszą stałą domenę (CHI) ciężkiego łańcucha. Fragmenty Fab' różnią się od fragmentów Fab dodaniem kilku reszt przy karboksylowym końcu domeny CHI ciężkiego łańcucha, obejmujących jedną lub więcej cystein z obszaru zawiasy przeciwciała. Fab'-SH stanowi w opisie określenie dla Fab', w którym jedna lub więcej reszt cysteiny w stałych domenach zawiera wolną grupę tiolową. Fragmenty przeciwciała F(ab')₂ początkowo otrzymano jako pary fragmentów Fab' zawiasowymi cysternami między nimi. Znane są również inne, chemiczne sprzężenia fragmentów przeciwciał.

„Lekkie łańcuchy” przeciwciał (immunoglobulin) pochodzącym z dowolnego gatunku kręgowca można przypisać do jednego z dwóch wyraźnie różniących się typów określanych jako kappa i lambda (λ), na podstawie sekwencji aminokwasów ich stałych domen

W zależności do sekwencji aminokwasów stałe domeny ich ciężkich łańcuchów immunoglobulmy można przypisać do różnych klas. Istnieje 5 głównych klas immunoglobulin· IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, przy czym szereg z nich można dodatkowo podzielić na podklasy (izotypy), np IgG-1, IgG-2, IgG-3 i IgG-4; IgA-li IgA-2. Stałe domeny ciężkiego łańcucha, które odpowiadają różnym klasom immunoglobulin określa się odpowiednio jako a, delta, epsilon, γ i μ. Struktury podjednostek i trójwymiarowe konfiguracje różnych klas immunoglobulin są dobrze znane

Określenie „przeciwciało” użyte jest w najszerszym znaczeniu i w szczególności obejmuje pojedyncze monoklonalne przeciwciała (obejmujące przeciwciała agonisty i antagonisty), kompozycje przeciwciał o specyficzności poliepitopowej, a także fragmenty przeciwciał (np. Fab, Fiab^ i Fv), o ile wykazują one pożądaną aktywność biologiczną.

Określenie „monoklonalne przeciwciało” w użytym znaczeniu odnosi się do przeciwciała uzyskanego z populacji zasadniczo jednorodnych przeciwciał; Tak np. poszczególne przeciwciała wchodzące w skład populacji są identyczne, z wyjątkiem ewentualnych naturalnych,mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. Monoklonalne przeciwciała wysoce specyficzne i ukierunkowane są przeciw jednemu miejscu antygenowemu. Ponadto w przeciwień

180 765 stwie do preparatów zwykłych (połiklonalnych) przeciwciał, które zazwyczaj zawierają różne przeciwciała ukierunkowane przeciw różnym determinantom (epitopom), każde monoklonalne przeciwciało jest ukierunkowane przeciw pojedynczej determinancie na antygenie. Oprócz specyficzności zaletą monoklonalnych przeciwciał jest to, że są one syntetyzowane przez hodowlę hybrydomy i me są zanieczyszczone innymi immunoglobulinami. Przymiotnik „monoklonalny” określa charakter przeciwciała uzyskanego z zasadniczo jednorodnej populacji przeciwciał, przy czym nie należy uważać że wymaga to wytwarzania przeciwciał określonym sposobem. Tak np. monoklonalne przeciwciało do stosowania zgodnie z wynalazkiem może być wytworzone sposobem hybrydomowym, który jako pierwsi opisali Kohler i Milstein, Naturę. 256:495 (1975), albo technikami rekombinacji DNA (patrz np. patent USA nr 4 815 567 [Cabilly i inni]).

Określenie monoklonalne przeciwciało w szczególności obejmuje „chimeryczne” przeciwciała (immunoglobulin), w których część ciężkiego i/lub lekkiego łańcucha jest identyczna lub homologiczna z odpowiednimi sekwencjami w przeciwciele pochodzącym z określonych gatunków lub należących do określonej klasy lub podklasy przeciwciał, podczas gdy reszta łańcucha (łańcuchów) jest identyczna lub homologiczna odpowiednimi sekwencjami w przeciwciałach pochodzących z innych gatunków lub należących do innej klasy lub pod klasy przeciwciał, a także fragmenty takich przeciwciał, o ile wykazują one pożądaną aktywność biologiczną (patent USA nr 4 816 567 (Cabilly i inni,); iMorrison inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 [1984]).

„Humanizowane” formy me-ludzkich (np. mysich) przeciwciał stanowią chimeryczne immunoglobuliny, łańcuchy immunoglobulin lub ich fragmenty (takie jak Fv, Fab, Fab', F(ab')₂lub inne wiążące antygen subsekwencje przeciwciał), które zawierają minimalną sekwencję pochodzącą z nieludzkiej immunoglobuliny. W większości humanizowane przeciwciała są ludzkimi immunoglobulinami (przeciwciałami biorcy), w których reszty z obszaru determinującego komplementamość (CDR) biorcy są zastąpione resztami z CDR nieludzkich gatunków (donorowe przeciwciała), takich jak mysz, szczur lub królik, o wymaganej specyficzności, powinowactwie i pojemności. W pewnych przypadkach reszty szkieletu Fv ludzkiej immunoglobuliny są zastąpione odpowiednimi nie-ludzkimi resztami. Ponadto humanizowane przeciwciało może zawierać reszty, które nie występują ani w przeciwciele biorcy ani w importowanym CDR lub w sekwencjach szkieletu. Takie modyfikacje wykonuje się aby jeszcze bardziej udoskonalić i zoptymalizować właściwości przeciwciała. Zazwyczaj humanizowane przeciwciało będzie zawierać zasadniczo całość co najmniej jednej, a zwykle dwóch zmiennych domen, w których całość lub zasadniczo całość obszarów CDR odpowiada obszarom nie-ludzkiej immunoglobuhny, a ponadto całość lub zasadniczo całość obszarów FR pochodzi z sekwencji konsensusu ludzkiej immunoglobuliny. Optymalnie humanizowane przeciwciało będzie również zawierać co najmniej część stałego obszaru immunoglobuliny (Fc), zazwyczaj ludzkiej immunoglobuliny. Szczegóły - patrz Jones i inni, Naturę, 321:522-525 [1986]; Reichmann i inni, Naturę, 332:323-329 [1988]; oraz Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 p[1992]).

„Nieimmunogeniczny u człowieka” oznacza, że w wyniku kontaktowania pohpeptydu w farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku i w temperaturze skutecznej ilości z odpowiednią tkanką ludzką nie obserwuje się stanu wrażliwości lub odporności na polipeptyd po drugim podaniu pohpeptydu, po określonym okresie utajonym (np. 8 do 14 dni).

II. Korzystne rozwiązania według wynalazku

Korzystne polipeptydy według wynalazku stanowią zasadniczo jednorodne pohpeptydy, określane jako ligand(y) mpl lub trombopoetyna (TPO), wykazujące właściwość wiązania się z mpl, członem superrodziny receptorów cytokmy, wykazujących właściwość biologiczną pobudzania wbudowywania się znaczonych nukleotydów (³H-tymidyny) do DNA IL-3-zależnych komórek Ba/F3 transfekowanych ludzkim mpl P. Jeszcze korzystniej ligand(y) mpl stanowią wydzielone białka ssaka, wykazujące aktywność hematopoetyczną zwłaszcza megakariocytopoetyczną lub trombocytopoetyczną czyli zdolne do pobudzania proliferacji, dojrzewania i/lub różnicowania niedojrzałych megakariocytów lub ich przodków do dojrzałej formy wytwarzającej płytki. Najkorzystniej polipeptydami według wynalazku są ludzkie ligandy mpl obej

180 765 mujące ich fragmenty wykazujące aktywność hematopoetyczną, megakanocytopoetyczną lub trombopoetyczną. Optymalnie takie ludzkie ligandy mpl nie sąglikozylowane. Innymi korzystnymi ludzkimi ligandami mpl są „domeny EPO” hML określane jako hML₁₅₃, skrócona forma hML określanych jako hML₂₄₅ lub hTPO₂₄₅ i dojrzałe pełnej długości polipeptydy zawierające sekwencję aminokwasów pokazaną na fig. 1 (SEQ ID NO: 1), określane jako hML, hML₃₃₂ lub hTPO₃₃₂, oraz biologicznie czynny wariant podstawienia hML(R153A, R154A).

Do dodatkowych korzystnych polipeptydów według wynalazku należą biologicznie lub immunologicznie czynne warianty hgandu mpl wybrane z grupy obejmującej hML2, hML3, hML4, mML, mML2, mML3, pML i pML2.

Do dodatkowych korzystnych polipeptydów według wynalazku należą biologicznie czynne warianty ligandu mpl zawierające sekwencję aminokwasów wykazujące w co najmniej 70% identyczność sekwencji aminokwasów z ludzkim hgandem mpl (patrz fig 1 [SEQ ID NO: 1]), mysim ligandem mpl (patrz fig. 16 [SEQ ID NO: 1 2113]), zrekombinowanym świńskim ligandem mpl (patrz fig. 19 [SEQ ID NO: 18]) lub świńskim ligandem mpl wydzielonym z aplastycznej świńskiej plazmy, korzystnie co najmniej w 75%, jeszcze korzystniej co najmniej w 80%, szczególnie korzystnie w co najmniej 85%, wyjątkowo korzystnie w co najmniej 90%, a najkorzystniej w co najmniej 95%.

Ligand mpl wydzielony z aplastycznej świńskiej plazmy wykazuje następującą charakterystykę:

(1) częściowo oczyszczony ligand eliminuje się z kolumny do filtracji żelowej w PBS, PBS zawierającym 0,1% SDS lub PBS zawierającym 4M MgCl₂ z Mr 60 000-70 000;

(2) Aktywność hgandu niszczona jest przez pronazę;

(3) Ligand jest stabilny w niskim pH (2,5), w SDS do 0,1% i w 2M moczniku;

(4) Ligand jest glikoproteiną na podstawie jego wiązania się z szeregiem kolumn lektynowych, (5) Silnie oczyszczony hgand elluje się z niezredukowanej SDS-PAGE z Mr 25 000-35 000 Mniejsze ilości aktywności eluują się także z Mr ~ 18 000-22 000 i 60 000;

(6) Silnie oczyszczony ligand rozdziela się w zredukowanej SDS-PAGE jako dublet z Mr 28 000 i 31 000;

(7) Końcowe aminowe sekwencje pasm 18 000-22 000, 28 000 i 31 000 są takie same SPAPPACDPRLLNKLLRDDHVLHGR (SEQ ID NO; 29); oraz (8) Ligand wiąże się i eluuje z następujących kolumn powinowactwa:

Blue-Sepharose,

CM Blue-Sepharose,

MONO-Q,

MONO-S,

Lentil Lecytyno-Sepharose,

WGA-Sepharose,

Con A-Sepharose,

Ether 650m Toyopearl,

Butyl 650 m Toyopearl,

Phenyl 650m Toyopearl oraz

Pheny 1- Sepharose.

Jeszcze korzystniej pohpeptydy ligandu mpl są kodowane przez ludzki genomowy lub cDNA zawierający sekwencję aminokwasów pokazaną na fig. 1 (SEQ ID NO. 1).

Do innych korzystnych występujących w przyrodzie biologicznie czynnych polipeptydów hgandu mpl według wynalazku należą: prepro-mplligand, pro-mplligand, dojrzały hgand mpl, fragmenty ligandu mpl i jego warianty glikozylowane.

Do jeszcze innych korzystnych polipeptydów według wynalazku należą warianty i chimery sekwencji ligandu mpl. Zazwyczaj do korzystnych wariantu i chimery sekwencji ligandu mpl należą biologicznie czynne warianty hgandu mpl, które zawierają sekwencję aminokwasów z co najmniej 70% identycznością sekwencji aminokwasów z ludzkim hgandem mpl lub ligandem

180 765 mpl wydzielonym z aplastycznej świńskiej plazmy, korzystnie z co najmniej 75%, jeszcze korzystniej z co najmniej 80%, szczególnie korzystnie z co najmniej 85%, wyjątkowo korzystnie z co najmniej 90%, a najkorzystniej z co najmniej 95%. Przykładowym korzystnym wariantem ligandu mpl jest wariant N-końcowej domeny hML (określany jako „domena EPO” z uwagi na jego homologię sekwencji z erytropoetyną). Korzystna EPO-domena hML zawiera około 153 pierwszych reszt aminokwasów dojrzałego hML i jest określana jako hML] ₅₃. Dodatkowym korzystny wariantem sekwencji hML jest wariant, w którym jedna lub więcej reszt zasadowych lub dwuzasadowych aminokwasów w C-końcowej domenie jest zastąpiona resztami niezasadowych aminokwasów (np. hydrofobowych, obojętnych, kwaśnych, aramatycznych, Gly, Pro itp.). Korzystny jest taki wariant C-sekwencji końcowe domeny hML, w których reszty Arg 153 1 154 są zastąpione resztami Ala. Wariant ten określa się jako hML₃₃₂ (R153A, R154A). Alternatywny korzystny wariant hML stanowi hML₃₃₂ lub hML₁₅₃, w których reszty aminowe 111-114 (OLPP lub LPPO) są wycięte lub zastąpione innąsekwencjątetrapeptydową(np. AGAG itp). Powyższe mutanty delecyjne określa się jako A4hML₃₃₂ lub A4hML₁₅₃.

Korzystną chimerę stanowi fuzja ligandu mpl lub jego fragmentu (określonego poniżej) z heterologicznym pohpeptydem lub jego fragmentem. Tak np. hML₁₅₃ może być połączony z fragmentem IgG w celu zwiększenia okresu półtrwania w surowicy lub z IL-3, GCSF albo EPO, aby uzyskać cząsteczkę o zwiększonej aktywności trombopoetycznej lub himerycznej hematopoetycznej.

Alternatywną korzystną chimerę ludzkiego ligandu mpl stanowi „chimera ML-domeny EPO”, która zawiera N-koncowe reszty 153-157 hML podstawione w jednym lub więcej miejscach, ale nie we wszystkich, resztami ludzkiego EPO, w przybliżeniu zgodnymi, jak to pokazano na fig. 10(SEQ ID NO: 7). W takim wykonaniu chimera hML powinna zawierać około 153-166 reszt w sekwencji, do której dodano poszczególne reszty lub ich bloki z ludzkiej sekwencji EPO lub podstawiono nimi reszty sekwencji hML w pozycjach odpowiednich do uzyskania zgodności pokazanej na fig. 10 (SEQIDNO: 6). Przykładowe inserty blokowych sekwencji do N-końcowej części hML mogą obejmować jedno lub więcej miejsc N-glikozylowania w pozycjach (EPO) 24-27, 38-40 i 83-85; jedno lub więcej z 4 przewidywanych amfipatycznych wiązeka-helikalnych w pozycjach (EPO) 9-22, 59-76, 90-107 i 132-152; oraz inne wysoce zachowane obszary obejmujące N-końcowe i C-końcowe obszary i reszty w pozycjach (epo) 44-52 (patrz np. Wen i inni, Blood, 82.1507-1516 [1993] i Boissel i inni, J. Biol. Chem., 268(21): 15983-15993 [1993]). Uważa się, że taka ”chimera ML-domeny EPO” będzie wykazywać mieszaną trombopoetyczno-erytropoetyczną (TĘPO) aktywność biologiczną.

Do innych korzystnych polipeptydów według wynalazku należą fragmenty ligandu mpl zawierające kolejną sekwencję co najmniej 10,15,20,25,30 lub 40 reszt aminokwasów identycznych z sekwencjami ligandu mpl wydzielonego z aplastycznej świńskiej plazmy lub ludzkiego ligandu mpl (patrz np. tabela 14, przykład 24). Korzystnym fragmentem, ligandu mpl jest ludzki ML[1-X] gdzie X oznacza 153,164,191,205,207,217,2291ub245(patrzfig. 1 [SEQIDNO 1] dla sekwencji 1-Χ). Do innych korzystnych fragmentów ligand mpl należą fragmenty uzyskane w wyniku chemicznej lub enzymatycznej hydrolizy lub trawienia oczyszczonego ligandu.

W mnym korzystnym aspekcie przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania cząsteczki ligand mpl obejmujący kontaktowanie źródła ligandu mpl zawierającego cząsteczki ligandu mpl z unieruchomionym pohpeptydem receptora, w szczególności mpl lub fuzyjnym pohpeptydem mpl, w takich warunkach, że oczyszczane cząsteczki ligandu mpl są selektywnie adsorbowane na unieruchomionym polipeptydzie recptora, przemywanie unieruchomionego nośnika w celu usunięcia nie zaadsorbowanego materiału i eluowanie oczyszczanych cząsteczek z unieruchomionego polipeptydu receptora buforem eleucyjnym. Źródłem zawierającym ligand mpl może być plazma, gdy unieruchomionym receptorem jest korzystnie fuzja mpl-IgG.

Alternatywnie źródło zawierające ligand mpl stanowi hodowla zrekombinowanych komórek, gdzie stężenie ligandu mpl w ośrodku hodowli lub w lizatach komórek jest zasadniczo wyższe niż w plaźmie lub w innym naturalnym źródle. W takim przypadku opisana powyżej metoda immunopowinowactwa mpl-IgG metod, jakkolwiek w dalszym ciągu przydatna, zwykle nie jest konieczna, tak że zastosować można bardziej tradycyjne metody oczyszczania białka znane spe

180 765 cjalistom. W skrócie korzystny sposób oczyszczania w celu uzyskania zasadniczo jednorodnego ligandu mpl obejmuje: usuwanie stałych resztek komórek gospodarza lub lizowanych fragmentów np. przez wirowanie lub ultrafiltrację; ewentualnie białko można zatężyć na dostępnym w handlu filtrze do zatężania białek; następnie oddziela się ligand od innych zanieczyszczeń w jednym lub więcej etapów wybranych z grupy obejmującej immunopowinowactwo, wymiana jonowa (np. na DEAE lub matrycach zawierających grupy karboksymetylowe lub sulfopropylowe), Blue-Sepharose, CM Blue-Sepharose, MONO-Q, MONO-S, lentil lectyno-Sepharose, WGASepharose, Con A-Sepharose, Ether Toypearl, Butyl Toypearl, Phenyl Toypearl, protein A Sepharose, SDS-PAGE, HPLC z odwróceniem faz (np. na żelu krzemionkowym z dołączonymi grupami alifatycznymi), lub sita molekularne Sephadex lub chromatografia z wykluczeniem wymiarów oraz wytrącanie etanolem lub siarczanem amonu. Inhibitor proteazy taki jak fluorek mety losul fony lu (PMSF) można wprowadzić w dowolnym z powyższych etapów, aby zapobiec proteohzie

W innym korzystnym wykonaniu wynalazek dostarcza wydzielonego przeciwciała zdolnego do wiązania z ligandem mpl. Korzystnie wydzielone przeciwciało ligandu mpl monoklonaIne (Kohler i Milstein, Naturę, 256:495-497 [1975]; Campbell, Laboratory Techniąues in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon i inni, Eds, Vblume 13, Elsevier Science Pubhshers, Amsterdam [1985]; orazHuse i innim Science, 246:1275-1281 [1989]). Korzystnie jest takie wydzielone przeciwciało ligandu mpl, które wiąże się z ligandem mpl z powinowactwem co najmniej około 10⁶ litra/mol. Jeszcze korzystniej przeciwciało wiąże się z powinowactwem co najmniej około 10⁷ htra/mol. Najkorzystniej przeciwciało jest wyhodowane przeciw hgandowi mpl o jednej z wyżej opisanych funkcji efektorowych. Wydzielone przeciwciało zdolne do wiązania z ligandem mpl może być ewentualnie połączone z drugim polipeptydem, a przeciwciało lub jego fuzję można zastosować do wydzielania i oczyszczania ligandu mpl ze źródła, jak to opisano powyżej dla unieruchomionego polipeptydu mpl. W kolejnym korzystnym wykonaniu tego wariantu wynalazek dostarcza sposobu wykrywania ligandu mpl in vitro lub in vivo, obejmującego kontaktowanie przeciwciała próbką zwłaszcza próbką surowicy, podejrzewaną o to, że zawiera hgand i wykrywanie, czy zaszło wiązanie.

W jeszcze korzystniejszych wykonaniach, wynalazek dostarcza wydzielonej cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej ligandy mpl lub ich fragmenty, która to cząsteczka kwasu nukleinowego może być znaczona lub nieznaczona wykrywalną grupą oraz cząsteczki kwasu nukleinowego, która zawiera sekwencję komplementarną lub hybrydyzuje w ostrych lub umiarkowanie ostrych warunkach z cząsteczką kwasu nukleinowego zawierającą sekwencję kodującą hgand mpl. Korzystnym kwasem nukleinowym ligandu mpl jest RNA lub DNA, który koduje biologicznie czynny ligand mpl wykazujący w co najmniej 75% identyczności sekwencji, jeszcze korzystniej w co najmniej 80%, szczególnie korzystnie w co najmniej 85%, wyjątkowo korzystnie 90%, a najkorzystniej w 95% identyczności sekwencji z ligandem mpl. Jeszcze korzystniej wydzielone cząsteczki kwasów nukleinowych stanowią sekwencje DNA kodujące biologicznie czynny ligand mpl, wybrane z grupy obejmującej: (a) DNA oparty na obszarze kodowania genu ligandu mpl ssaka (np. DNA obejmujący sekwencje nukleotydów pokazane na fig. 1 (SEQ ID NO: 2) lub ich fragmenty); (b) DNA zdolny do hybrydyzacji z DNA (a) w co najmniej umiarkowanie ostrych warunkach; i (c) DNA zdegenerowany w stosunku do DNA określonego w (a) lub (b), co wynika z degeneracji kodu genetycznego. Uważa się, że nowe ligandy mpl ujawnione w opisie mogą należeć do rodziny hgandów lub cytokin zawierających sekwencje o takiej identyczności, że ich DNA może hybrydyzować z DNA na fig. 1 (SEQ ID NO: 2) (lub jego komplementem albo fragmentami) w nisko- umiarkowanie ostrych warunkach. W związku z tym w kolejnym aspekcie wynalazek obejmuje DNA, który hybrydyzuje w nisko- umiarkowanie ostrych warunkach z DNA kodującym polipeptyd ligandu mpl.

W kolejnym korzystnym wykonaniu według wynalazku, cząsteczkę kwasu nukleinowego stanowi cDNA kodujący ligand mpl, który ponadto zawiera wektor ulegający replikacji, w którym cDNA jest operacyjnie połączony z sekwencjami kontrolnymi rozpoznawanymi przez gospodarza transformowanego wektorem. Ten wariant ponadto obej40

180 765 muje komórkę gospodarza transformowaną wektorem i sposób stosowania cDNA wytwarzania ligandu mpl, obejmujący ekspresję cDNA kodującego ligand mpl w hodowli transformowanych komórek gospodarza i odzyskiwanie hgandu mpl z hodowli komórek gospodarza. Ligand mpl wytworzony w taki sposób jest korzystnie zasadniczo jednorodnym ludzkim ligandem mpl. Korzystną komórkę gospodarza do wytwarzania ligandu mpl komórkajajowa chomika chińskiego (CHO).

Wynalazek ponadto obejmuje korzystny sposób leczenia ssaka z zaburzeniem immunologicznym lub hematopoetycznym, zwłaszcza małopłytkowości, polegający na podawaniu ssakowi terapeutycznie skutecznej ilości hgandu mpl. Ligand mpl podaj e się ewentualnie w kombinacj i z cytokiną zwłaszcza czynnikiem pobudzającym kolonię lub interleukiną. Do korzystnych czynników pobudzających kolonie lub interleukin należą: kit-ligand, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9 oraz IL-11.

III. Sposoby wytwarzania

Pewni autorzy od dawna uważali, że wytwarzanie płytek krwi jest kontrolowane przez wieloszeregowe specyficzne czynniki humoralne. Postulowano, że dwie różne aktywności cytokiny, określane jako megakanocytowy czynnik pobudzający kolonię (megCSF) i trombopoetyna, regulująmegakanocytopoezę i trombopoezę (Williams i inni, J. CellPhysiol., 110:101-104 [1982]; Williams i inni, BloodCells, 15:123-133 [1989]; oraz Gordon i inni, Blood, 80:302-307 [1992]). Według tej hipotezy, meg-CSF stymuluje proliferację megakariocytów pierwotnych, natomiast trombopoetyna przede wszystkim wpływa na dojrzewanie bardziej zróżnicowanych komórek i ostatecznie na uwalnianie płytek. Od lat 1960 indukcja i występowanie aktywności meg-CSF i trombopoetyny w plazmie, surowicy i moczu zwierząt i ludzi z małopłytkowością obszernie udokumentowano (Odęli i inni, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 108:428-431 [1961]; Nakeff i inni, Acta Haematol., 54:340-344[1975]; Specter, Proc. Soc. Exp. Biol., 108:146149 [1961]; Schreiner i inni, J.Chn.Invest., 49:1709-1713 [1970]; Ebbe, Blodd, 44:605-608 [1974]; Hoffman i mm, N. EngL J. Med., 305:533 [1981]; Straneva i inni, Exp. Hematol., 17'1122-1127 [1988]; Mazur i inni, Exp. Hematol., 13:1164 [1985]; Mazur i inni, J. Clin. Invest., 68:733-741 [1981]; Sheiner i inni, Blood, 56:183-188 [1980]; Hill i inni, Exp. Hematol, 20:354-360 [1992]; Hegyi i inni, Int. I. CellClonmg, 8:236-244 [1990], Ponadto, że aktywności te sąlmiowo-specyficzneiróżniąsięod znanych cytokin (Hill R.J. i inni, Blood 80:346 (1992); Enckson-Miller C.L. i inni. Bnt. J.Haematol., 84:197-203 (1993); Straneva J.E. i inni, Exp. Hematol. 20:4750 (1992); oraz Tsukada J. i inni, Blood 81:866-867 [1993]). Dotychczas próby oczyszczaniameg-CSF lub trombopoetyny z trombocytopenicznej plazmy lub moczu kończyły się niepowodzeniem.

W zgodzie z powyższymi obserwacjami opisującymi trombocytopenicznąplazmę stwierdzono, że aplastyczna świńska plazma (APP) otrzymana z napromieniowanych świń stymuluje ludzką megakariocytopoezę in vitro. Stwierdzono, że to działanie stymulujące jest znoszone przez rozpuszczalną pozakomórkową domenę c-mpl, co potwierdza, że APP jest potencjalnym źródłem przypuszczalnego hgandu mpl (ML). Z powodzeniem oczyszczono ligand mpl z APP i informację odnośnie sekwencji aminokwasów zastosowano do wydzielania mysiego, świńskiego i ludzkiego ML cDNA. Te ML wykazująhomologię sekwencji z erytropoetynąi objawiajązarówno aktywność meg-CSF i trombopoetyno-podobną.

1. Oczyszczanie i identyfikacja ligandu mpl Ligand z plazmy

Jak to zaznaczono powyżej, podano, iż aplastyczna plazma z wielu gatunków wykazuje aktywności, które stymulująhematopoezę in vitro, z tym że dotychczas nie doniesiono o wydzieleniu żadnego hematopoetycznego czynnika stymulującego z plazmy. Jednym źródłem aplastycznej plazmy jest plazma otrzymana z napromieniowanych świń. Ta aplastyczna świńska plazma (APP) stymuluje ludzką hematopoezę in vitro. W celu zbadania, czy APP zawiera hgand mpl, jego wpływ oceniono mierząc wbudowywanie ³H-tymidyny do komórek Ba/F3 transfekowanych ludzkim mpl P (BaIF3-mpl) w sposób pokazany na fig. 2. APP stymulował wbudowywanie ³H-tymidyny do komórek Ba/F3-mpl, ale nie do komórek kontrolnych Ba/F3 (czyli nie transfekowanych ludzkim mpl P). Ponadto aktywności takiej nie zaobserwowano w przypadku normalnej świńskiej plazmy. Wyniki te wykazują że APP zawiera czynnik lub czynniki, które przenoszą

180 765 sygnał proliferacyjny przez receptor mpl i z tego względu może być naturalnym hgandem tego receptora. Podparto to odkryciem, że obróbka APP rozpuszczalnym mpl-IgG blokuje stymulując działanie APP na komórki Ba/F3-mpl.

Okazało się, ze aktywność APP stanowi białko, gdyż pronaza, DTT, i ciepło niszczą aktywność w APP (fig. 3). Aktywność me ulegała ponadto dializie. Aktywność była jedna odporna na niskie pH (2,5 przez 2 godziny), oraz jak wykazano, wiąże się eluuje z szeregu kolumn z powinowactwem lektyny, co oznacza, że jest to glikoproteina. W celu dokładniejszego zbadania struktury i identyczności tej aktywności oczyszczono ją na drodze powinowactwa z APP stosując chimerę mpl-Igg.

APP poddano obróbce w sposób opisany poniżej w przykładach 1 i 2. W skrócie ligand mpl oczyszczano stosując hydrofobową chromatografię interakcyjną (HIC), chromatografię z unieruchomionym barwnikiem i chromatografię z powinowactwem mpl. Odzysk aktywności z każdego etapu pokazano na fig. 4, a krotność oczyszczania pokazano a tabeli 1. Ogólny odzysk aktywności z kolumny z powinowactwem mpl wyniósł około 10%. Oceniono, ze aktywność właściwa frakcji o największej aktywności (F6) z kolumny z powinowactwem mpl wynosi 9,8 x 10⁶ jednostek/mg. Ogólny stopień oczyszczenia z 5 litrów APP był około 4 x 10⁶-krotny (od 0,8 jednostek/mg do 3,3 x 10⁶ jednostek/mg) przy 83x10⁶-krotnym zmniejszeniu ilości białka (z 250 g do 3 pg). Oszacowano, że aktywność właściwa hgandu eluowanego z kolumny z powinowactwem mpl wynosi ~3 x 10⁶ jednostek/mg.

Tabela 1 Oczyszczanie hgandu mpl

Próbka	Objętość ml	Białko mg/ml	Jednostki/ml	Jednostki	Aktywność właściwa jednostki/ml	Wydajność	Krotność oczyszczania
APP	5000	50	40	200000	0,8	-	1
Phenyl	4700	0,8	40	200000	50	94	62
Blue-Sep.	640	0,93	400	256000	430	128	538
mpl (μΐ) (Fxns 5-7)	12	5x1 θ'⁴	1666	20000	3,300,000	10	4100000

Białko oznaczano w teście Bradforda. Stężenie białka we frakcjach eluowano mpl 5-7 oceniano na podstawie intensywności zabarwienia żeli SDS barwionych srebrem. 1 jednostkę zdefiniowano jako ilość zapewniającą50% maksymalnej stymulacji proliferacji komórek Ba/F3-mpl

Analiza eluowanych frakcji z kolumny z powinowactwem mpl metodą SDS-PAGE (4-20%, żel Novex) prowadzoną w redukujących warunkach, potwierdziła obecność szeregu białek (fig. 5). Białka, które srebro barwi najintensywniej, rozdzielono na frakcje o względnym Mr 66 000,55 000,30 000,28 000 i 18 000-22 000. W celu zbadania,, które z tych białek stymuluje proliferację hodowli komórek Ba/F3-mpl, białka eluowano w żelu w sposób opisany w przykładzie 2

Wyniki tego eksperymentu wykazały, że największą aktywność eluowano plastra żelu zawierającego białko o Mr 28 000-32 000, a mniejszą aktywność eluowano z obszaru żelu 18 000-22 000 (fig. 6). Jedyne białka zaobserwowane w tych obszarach wykazywały Mr 30 000, 28 000 i 18 000-22 000. W celu przeprowadzenia identyfikacji i wyznaczenia sekwencji białek przypadających w tym obszarze żelu (czyli pasm o 30, 28 i 18-22 kDa), 3 białka poddano elektroblottingowi do PVDF przeprowadzono sekwencjonowanie w sposób opisany w przykładzie 3. Uzyskane sekwencje amino-końcowe zestawiono w tabeli 2.

180 765

Tabela 2

Sekwencje amino-końcowe ligandu mpl

30 kDa 1 5 10 15 20 25 (S) PAPPA (C) DPRLLNKLLRDD (H/S) VLH (G) RL	(SEQ ID NO 30)
28 kDa 1 5 10 15 20 25 (S) PAPPAXDPRLLNKLLRDD (H) VL (H) GR	(SEQ1DNO 31)
18-22 kDa 1 5 10 XPAPPAXDPRLX (N) (K)	(SEQIDNO 32)

Analiza z wykorzystaniem komputera potwierdziła, że te sekwencje aminokwasów są nowe. Ponieważ wszystkie 3 sekwencje były takie same, uważa się, że białka o 30 kDa, 28 kDa i 18-22 kDa są spokrewnione mogą stanowić różne formy tego samego białka. Ponadto białka te są prawdopodobnymi kandydatami naturalnego ligandu mpl, gdyż aktywność wyodrębniona w SDS-PAGE jest w tym samym obszarze (28 000-32 000) żelu 4-20%. Na dodatek częściowo oczyszczony hgand migrował z Mr 17 000-30 000 w chromatografu żelowej przy zastosowaniu kolumny Superose 12 (Pharmacia). Uważa się, że formy ligandu o różnych Mr spowodowane sąróznicami w proteohzie lub glikozylowaniu albo innymi modyfikacjami po-lub przedtranslacyjnymi.

Jak to wcześniej zaznaczono, antysensowny RNA ludzkiego mpl znosi megakanocytopoezę w hodowlach ludzkiego szpiku kostnego wzbogaconych w komórki pierwotne CD 34+ nie wpływając na różnicowanie innych linii komórek hematopoetycznych (Methia i inni, supra). Wynik ten sugeruje, że receptor mpl może odgrywać rolę w różnicowaniu i proliferacji megakanocytów in vitro. Aby dokładniej wyjaśnić rolę ligandu mpl w magakanocytopoezie, porównano wpływy APP i APP pozbawionego ligandu mpl na in vitro ludzką megakariocytopoezę Wpływ APP na ludzką megakariocytopoezę ludzkiej oznaczano stosując modyfikację testu megakanocytopoezy w ciekłej zawiesinie opisanego w przykładzie 4. W teście tym ludzkie pierwotne komórki obwodowe (PSC) zadano APP przed i po chromatografu powinowactwa mpl-IgG. Stymulację przez GPII_bIII_amegakariocytopoezy oznaczano ilościowo przeciwciałem 125_f-anty-II_bIII_a (fig. 7). Jak to pokazano na fig. 7,10% APP powoduje około 3-krotnąstymulację, podczas gry APP bez ligandu mpl me wywiera wpływu. Należy podkreślić, że APP bez ligandu mpl nie inicjuje proliferacji Ba/F3-mpl.

W innym doświadczeniu rozpuszczalny ludzki mpl-IgG dodawany w dniach 0,214 do hodowli zawierających 10% APP neutralizował stymulujące działanie APP na ludzką megakariocytopoezę (fig. 8). Wyniki te wykazują że ligand mpl odgrywa rolę w regulowaniu megakanocytopoezy ludzkiej i z tego względu może być przydatny do leczenia małopłytkowości.

Klonowanie ligandu mpl

W oparciu a amino-końcową sekwencję aminokwasów uzyskaną z białek 30 kDa, 28 kDa i 18-22 kDa (patrz tabela 2 powyżej), skonstruowano dwie pule zdegenerowanych starterów ohgonukleotydowych i zastosowano je do amplifikacji świńskiego genomowego DNA metodą PCR. Zakładano, że gdyby amino-końcowa sekwencja aminokwasów była kodowana przez pojedynczy egzon, to prawidłowy produkt PCR powinien zawierać 69 bp. Fragment DNA o tej wielkości znaleziono i subklonowano w PGEMT. Sekwencje ohgonukleotydowego startera PCR 3 uzyskanych klonów pokazano w przykładzie 5. Sekwencje aminokwasów (PRLLNKLLR [SEQ ID NO' 33]) peptydu kodowanego między starterami PCR były identyczne z sekwencjami uzyskanymi przez sekwencjonowanie amino-końcowego białka świńskiego ligandu (patrz reszty 9-17 dla świńskich sekwencji białek 28 i 30 kDa, powyżej).

Syntetyczny ohgonukleotyd oparty na sekwencji fragmentu PCR zastosowano do selekcjonowania biblioteki ludzkiego genomowego DNA. 45-merowy oligonukłeotyd, oznaczony

180 765 jako pR45, zaprojektowano i zsyntetyzowano w oparciu o sekwencję fragmentu PCR. Oligonukleotyd ten zawierał następującą sekwencję: 5'GCC-GTG-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-M-ATT-TAG-GAG-TCG3' (SEQ ID NO: 34)

Ten dezoksyoligonukleotyd zastosowano do selekcjonowania biblioteki ludzkiego genomowego DNA z Zgem 12 w warunkach hybrydyzacji o niskiej ostrości i przemywania podanych w przykładzie 6. Dodatnie klony wybrano, łysmki oczyszczono i zanalizowano przez mapowanie restrykcyjne i blotting Southema. Fragment 390 bp EcoRI-Xbal, hybrydyzował z 45-mer, subklonowano w pBluescript SK-. Sekwencjonowanie DNA tego klonu potwierdziło, że wydzielono DNA kodujący ludzki homolog świńskiego ligandu mpl. Sekwencję ludzkiego DNA i wydedukowanąsekwencję aminokwasów pokazano na fig. 9 (SEQ ID NO: 314). Przewidywane pozycje intronów w sekwencji genomowej zaznaczono strzałkami oraz określono przypuszczalny egzon („egzon 3”).

W oparciu o sekwencję ludzkiego „egzonu 3” (przykład 6) zsyntetyzowano ohgonukleotydy odpowiadające końcom 3' i 5' sekwencji egzonu. Te 2 starter zastosowano w reakcjach PCR stosując jako matrycę cDNA wytworzony z różnych tkanek ludzkich. Przewidywana wielkość prawidłowego produktu PCR wynosiła 140 bp. Po analizie produktów PCR na 12% żelu poliakrylamidowym fragment DNA oczekiwanej wielkości wykryto w bibliotekach cDNA wytworzonych z nerki dorosłego człowieka, płodowych komórek nerki (293) i cDNA uzyskanego z ludzkiej płodowej wątroby.

Bibliotekę cDNA płodowej wątroby (7x10⁶ klonów) w lambda DR2 po selekcjonowano tym samym oligonukleotydem 45-mer, który stosowano do selekcjonowania ludzkiej genomowej biblioteki i biblioteki cDNA płodowej wątroby w warunkach hybrydyzacji o małej ostrości Dodatnie klony wybrano, łysinkę oczyszczono i wielkość insertu oznaczano metodąPCR. Jeden klon z insertem 1,8 kb wybrano do dalszej analizy. Wykorzystując procedury opisane w przykładzie 7 otrzymano nukleotyd i wydedukowanąsekwencję aminokwasów ludzkiego ligandu mpl (hML). Sekwencje te pokazano na fig. 1 (SEQ ID NO: 1 i 2).

Budowa ludzkiego ligandu mpl (hML)

Sekwencja DNA ludzkiego ligandu mpl (hML) (fig. 1 [SEQ ID NO: 2]) obejmuje 1774 nukleotydów, po których następuje ogon poli(A). Zawiera on 215 nukleotydów 5'-nietranslatowaną sekwencję i 3'-metranslatowany obszar 498 nukleotydów. Założony kodon inicjacji w pozycji nukleotydów (216-218) znajduje się w sekwencji największej zgodności korzystnej dla zainicjowania translacji eukariotycznej. Otwarta ramka odczytu zawiera 1059 nukleotydów i koduje pohpeptyd o 353 resztach aminokwasów, rozpoczynając od pozycji mikleotydu 220. N-komec przewidywanej sekwencji aminokwasów jest wysoce hydrofobowy i prawdopodobnie odpowiada peptydowi sygnałowemu. Analiza komputerowa przewidywanej sekwencji aminokwasów (von Heijne u mm, Eur. J. Blochem., 133:17-21 [1983]) wskazuje potencjalne miejsce rozszczepiania dla peptydazy sygnałowej między resztami 21122. Roszczepienie w tej pozycji powinno wygenerować dojrzały polipeptyd o 332 resztach aminokwasów zaczynający się atnmo-końcową sekwencją otrzymaną z ligandu mpl oczyszczono ze świńskiej plazmy. Przewidywany ciężar cząsteczkowy nieglikolizowanego ligandu o 332 resztach aminokwasów wynosi około 38 kDa. Znajduje się w nim 6 potencjalnych miejsc N-glikozylowania 14 reszty cysteiny.

Porównanie sekwencji ligandu mpl z bazą danych sekwencji Ganbank potwierdziło 23% identyczności pomiędzy aminokońcowymi 153 resztami dojrzałego ludzkiego ligandu mpl i ludzkiej erytropoetyny (fig. 10 [SEQ ID NO^- 6 i 7]) Gdy uwzględni się konserwatywne podstawienia, ten obszar hML wykazuje 50% podobieństwa do ludzkiej erytropoetyny (hEPO) Zarówno hEPO jak i hML zawierają 4 cysteiny. 3 z 4 cystern zachowane są w hML, w tym pierwsza i ostatnia cysteina. Eksperymenty umiejscowionej mutagenezy wykazują, że 2 cysteiny, pierwsza i ostatnia, w erytropoetyme tworzą wiązanie disulfidowe niezbędne do działania (Wang, F.F. i inni, Endocnnology 116;2286-2292 [1983]). Przez analogię pierwsza i ostatnia cysteiny w hML mogą także tworzyć istotne wiązanie disulfidowe. Żadne z miejsc glikozylowania nie zachowało się w

180 765 hML. Wszystkie potencjalne N-połączone miejsca glikozylowama w hML znajdują się karboksykońcowej połówce polipeptydu hML.

Podobnie jak w przypadku hEPO, hML mRNA nie zawiera sekwencji największej zgodności poliadenylowania AAUAAA ani elementu regulującego AUUUA obecnego z 3'-nietranslatowanych obszarach wielu cytokm, który, jak się uważam wpływa na stabilność mRNA (Shaw i mm, Celi, 46 659-667 [1986]). Błotting Northema potwierdza niskie poziomy pojedynczego transkryptu 1,8 kb hML RNA zarówno w płodowej jak i dorosłej wątrobie. Po dłuższej ekspozycji słabsze pasmo o tej samej wielkości można wykryć w dorosłej nerce. Dla porównania ludzka erytropoetyna wytwarzana jest w wyniku ekspresji w wątrobie płodu oraz, w reakcji na niedotlenienie, w dorosłej nerce i wątrobie (Jacobs i inni, Naturę, 313:804-809 [1985] oraz Bondurant i inni, Molec. Celi. Biol., 6:2731-2733 [1986]).

Znaczenie C-końcowego obszaru hML oczekuje na wyjaśnienie. Biorąc pod uwagę obecność 6 potencjalnych miejsc N-połączonego glikozylowania i zdolność hgandu do wiązania się w kolumnach z powinowactwem względem lektyny, ten obszar hML jest prawdopodobnie glikozylowany. W pewnych eksperymentach eluowania żelu zaobserwowano rozwinięcie aktywności o Mr około 60 000 co może odpowiadać glikozylowanej cząsteczce o pełnej długości. C-końcowy obszar może z tego względu działać stabilizująco i zwiększać okres półtrwama krążącego hML. W przypadku erytropoetyny nieglikolizowana forma wykazuje in vitro pełną aktywność biologiczną ale znacząco skrócony okres półtrwania w plazmie w porównaniu z ghkozylowaną erytropoetyną (Takeuchi i inni, J. Biol. Chem., 265:12127-12130 [1990]; Narhi i inni, J. Biol. Chem., 266:23022-23026 [1991] oraz Spivack i inni, Blood, 7:90-99 [1989]) C-końcowa domena hML zawiera 2 dwuzasadowe sekwencje aminokwasów [motyw Arg-Arg w pozycjach 153-1541245-246], które mogą służyć jako potencjalne miejsca obróbki. Rozszczepienie w tych miejscach może być odpowiedzialne za generowanie form 30,28 i 18-22 kDa ML wydzielonego z APP. Należy zaznaczyć, że sekwencja Arg₎₅₃-Argi₅₄ występuje bezpośrednio za erytropoetyno-podobną domeną ML. Obserwacje te wykazują pełnej długości ML może reprezentować prekursorowe białko, które ulega ograniczonej preteolizie tworząc dojrzały ligand.

4. Izoformy i warianty ludzkiego ligandu mpl

Izoformy łub alternatywnie rozszczepione formy ludzkiego ligandu mpl wykryto metodą PCR w wątrobie dorosłego człowieka. W skrócie zsyntetyzowano odpowiednie startery dla każdego z końców, a ponadto wybrano obszary wewnętrzne sekwencji kodującej hML. Startery te zastosowano w RT-PCR do amplifikacji RNA wątroby dorosłego człowieka w sposób opisany w przykładzie 10. Oprócz formy o pełnej długości, oznaczonej jako hML, 3 inne formy, oznaczone jako hML3 i hML4, zaobserwowano lub wydedukowano. Dojrzałą wydedukowaną sekwencję aminokwasów wszystkich 4 izoform przedstawiono na fig. 11 (SEQ ID NO: 6, 8, 9110). hML3 zawiera 116-nukleotydowądelecję w pozycji 700, co powoduje zarówno delecję aminokwasów jak i przesunięcie szkieletu. cDNA koduje obecnie dojrzały polipeptyd zawierający 265 aminokwasów i różniący się do sekwencji hML resztą aminokwasu 139. Natomiast hML4 zawiera zarówno 12-nukleotydową delecję za pozycją nukleotydu 618 (stwierdzoną również w mysiej i świńskiej sekwencji [patrz poniżej]) 1116 bp delecję występującą w hML3. Mimo iż me wydzielono żadnego klonu zawierającego tylko delecję 12 bp (za nukleotydem 619) w przypadku człowieka (oznaczonego jako hML2), forma taka prawdopodobnie istnieje, gdyż izoformę zidentyfikowano zarówno u myszy jak i u świni (patrz niżej), a także z uwagi na to, że zidentyfikowano ją w połączeniu z delecją 116 nukelotydów w hML4.

Zarówno podstawiony wariant hML, w którym dwuzasadową sekwencję Arg₁₅₃-Arg₁₅₄zastąpiono dwoma resztami alaniny, jak i skróconą formę „EPO-domeny” hML skonstruowano, aby zbadać czy ML pełnej długości jest niezbędny do osiągnięcia aktywności biologicznej. Wariant z podstawieniem dwuzasadowej sekwencji Arg₁₅₃-Arg₁₅₄ oznaczony jako hML(Rl 53 A, R154A), skonstruowano stosując PCR w sposób opisany w przykładzie 10. Wykonano także skróconą formę „EPO-domeny”, hML₁₅₃, stosując PCR, przez wprowadzenie kodon stopu za Arg.

180 765

5. Ekspresja zrekombinowanego ludzkiego ligandu mpl (rhML) w przejściowo transfekowanych ludzkich embrionalnych komórkach nerki (293)

W celu potwierdzenia, że klonowany ludzki cDNA koduje ligand mpl, hgand wytworzono w wyniku ekspresji w komórkach 293 ssaka pod kontrolą natychmiastowego wczesnego promotora wirusa cytomegalii stosując wektory ekspresji pRK5-hML lub pRK5-hML₁₅₃. Stwierdzono, że supematanty z przejściowo transfekowanych ludzkich embrionalnych komórek nerki 293 pobudzająwbudowywame ³H-tymidyny w komórkach Ba/F3-mpl, ale me w macierzystych komórkach Ba/F3 (fig. 12A). Ośrodki z komórek 293 transfekowanych samym wektorem pRK nie zawierajątej aktywności. Dodanie mpl-IgG do ośrodków zlikwidowało stymulacji (wyników me pokazano). Wyniki te wskazują że klonowany cDNA koduje funkcyjny ludzki ML (hML).

W celu ustalenia czy sama „EPO-domena” może wiązać i uaktywniać mpl, uciętą formę hML, rhML₁₅₃, wytworzono w wyniku ekspresji w komórkach 293. Stwierdzono, że supematanty z transfekowanych komórek wykazują aktywność zbliżoną do występującej w supematantach z komórek, w których zachodzi ekspresja pełnej długości hML (fig. 12A), co świadczy o tym, ze C-końcowa domena ML nie jest konieczna do wiązania i uaktywniania c-mpl.

6. Ligand mpl stymuluje megakariocytopoezę i trombopoezę

Formy zrekombinowanego hML, zarówno pełnej długości rhMLjak i skrócony rhML₁₅₃, stymulowały megakariocytopoezę ludzką/» vitro (fig. 12B). Działanie takie zaobserwowano bez innego dodanego z zewnątrz hematopoetycznego czynnika wzrostu. Z wyjątkiem IL-3 ML był jednym zbadanym hematopoetycznym czynnikiem wzrostu, który wykazywał taką aktywność IL-11, IL-6, IL-1, erytropoetyna, G-CSF, IL-9, LIF, kit ligand (KL), M-CSF, OSM i GM-CSF me wywierały wpływu na megakariocytopoezę przy badaniu pojedynczo w teście (wyników nie pokazano). Wynik ten wykazuje, ze ML ma stymulującąmegakanocyty aktywność i wskazuje na rolę ML w regulowaniu megakariocytopoezy.

Wykazano, że aktywności trombopoetyczne obecne w plazmie zwierząt trombocytopenicznych pobudzają wytwarzanie płytek krwi w teście nawrotu mysiej trombocytozy (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14:1006-1001 [1973] oraz McDonald i mni, Scand. J. Haematol., 16:326-334 [1976]). W teście u myszy wywołano ostrą małopłytkowość stosując specyficzną przeciwpłytkową surowicę, co spowodowało przewidywany nawrót trombocytozy. Takie immuno-trombocytemiczne myszy silniej reagująna trombopoetyno-podobne aktywności niż myszy normalne (McDonald, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 14'1006-1001 [ 1973]), podobnie jak myszy z przebytym niedotlenieniem są bardziej wrażliwe na erytropoetynę niż myszy normalne (McDonald i inni, J. Lab. Clin. Med., 77:134143 [1971]). W celu sprawdzenia czy rML stymuluje wytwarzanie płytek krwi in vitro, myszom z nawrotem trombocytozy wstrzyknięto częściowo oczyszczony rhML. Następnie oznaczono ilościowo liczbę płytek krwi i wbudowywanie ³⁵S do płytek krwi. Wstrzykiwanie myszom 64 000 łub 32 000 jednostek rML znacząco zwiększa wytwarzanie płytek krwi, o czym świadczy -20% wzrost liczby płytek (p=0,0005 i 0,0001, odpowiednio) i -40% wzrost wbudowywania ³⁵S do płytek krwi (p=0,003) w przypadku badanych myszy w stosunku do myszy kontrolnych, którym wstrzyknięto samązaróbkę (fig. 12C). Ten poziom stymulacji jest porównywalny z poziomem zaobserwowanym w przypadku IL-6 w tym modelu (wyników nie pokazano). Podawanie 16 000jednostek rML me stymuluje znacząco wytwarzania płytek krwi. Wyniki te wskazują że ML stymuluje wytwarzanie płytek krwi w sposób zależny od dawki i z tego względu wykazuje działanie trombopoetyno-podobne.

Komórki 293 transfekowano również innymi konstruktami izoformy ML opisanymi powyżej i supematanty oceniono przeprowadzając test proliferacji myszy Ba/F3-mpl (patrz fig. 13). hML2 i hML3 me wykazały wykrywalnej aktywności w tym teście, natomiast aktywność hML (R153 A, R154A) był podobna do hML i hML₁₅₃, co obróbka przy dwuzasadowym miejscu Arg₁₅₃-Arg₁₅₄ nie jest wymagana, ale me wywiera niekorzystnego wpływu na aktywność 7. Megakariocytopoeza i ligand mpl

Założono, że megakariocytopoeza jest regulowana na wielu poziomach komórkowych (Williams i inni, J.Celł Physiol., 110:101-104 [1982] oraz Williams i inni, Blood Cells, 15:123-133 [1989]). Oparto się głównie na obserwacji, że pewne hematopoetyczne czynniki wzrostu stymu

180 765 lująproliferację przodków megakariocytów, a inne przede wszystkim wpływająna dojrzewanie. Przedstawione wyniki sugerują, że ML działa jako czynnik zarówno proliferacyjny jak i dojrzewający. To, ze ML stymuluje proliferację przodków megakariocytów poparte jest szeregiem szereg dowodów. Po pierwsze APP stymuluje zarówno proliferację jak i dojrzewanie ludzkich megaknocytów in vitro, a stymulacja taka jest całkowicie inhibitowana przez mpl-IgG (fig. 718) Ponadto inhibitowame tworzenia kolonii megakariocytów przez antysensowne ohgonukleotydy c-mpl (Methia i inni, Blood, 82:1395-1401 [1993]) oraz stwierdzenie, że c-mpl może przenosić sygnał proliferacyjny w komórkach, w których został transfekowany (Skoda i inni, EMBO, 12 2645-2653 [1993] i Vigon i inni, Oncogene, 8:2607-2615 [1993]) również świadcząo tym, że ML stymuluje proliferację. Rzeczywista ekspresja c-mpl na wszystkich stadiach różnicowania megakariocytów (Methia i inni, Blood, 82:1395-1401 [ 1993]) oraz zdolność zrekombinowanego ML to szybkiego stymulowania wytwarzania płytek krwi in vivo świadczą o tym, że ML także wpływa na dojrzewanie Dostępność zrekombinowanego ML stwarza możliwość dokładnej oceny jego roli w regulowaniu megakariocytopoezy i trombopoezy, a także jego zdolności we wpływaniu na inne szeregi hematopoetyczne.

8. Wydzielanie genu ludzkiego ligandu mpl (TPO)

Klony ludzkiego genomowego DNA z genu TPO wydzielono przez selekcjonowanie biblioteki ludzkich genomów w X-Geml 2 za pomocąpR45, w warunkach o małej ostrości lub w warunkach o dużej ostrości, z fragmentem odpowiednim do 3'-połowy ludzkiego cDNA kodującego hgand mpl. Wydzielono dwie nakładające się klony lambda o odstępie 35 kb. Dwa nakładające się fragmenty (BamHI i EcoRI) zawierające cały gen TPO subklonowano i sekwencjonowano (patrz fig. 14A, 14B i 14C).

Struktura ludzkiego genu obejmuje 6 egzonów z 7 kb genomowego DNA. Granice wszystkich połączeń egzon/intron są zgodne z motywem konsensusu ustalonym dla genów ssaków (Shapiro,M. B.i inni,Nuci. AcidsRes. 15:7155 [1987]). Egzon 1i egzon 2 zawierają 5'-metranslatowanąsekwencję i początkowe 4 aminokwasy peptydu sygnałowego. Reszta sygnału wydzielania i pierwszych 26 aminokwasów dojrzałego białka kodowanych jest w egzonie 3. Cała domena karboksylowa i 3'-nietranslatowany fragment oraz ~50 aminokwasów domeny erytropoetyno-podobnej kodowanych jest w egzonie 6. 4 aminokwasy biorące udział w delecji zaobserwowanej w hML-2 (hTPO-2) są kodowane na końcu 5' egzonu 6

Analiza ludzkiego genomowego DNA metodąblottingu Southema wskazuje, że gen TPO występuje w pojedynczej kopii. Chromosomowa lokalizacja gen oznaczano przez fluorescencyjną in situ hybrydyzację (FISH), którą zmapowano z chromosomem 3q27-28.

9. Ekspresja i oczyszczanie TPO z komórek 293

Wytwarzanie komórek i oczyszczanie ML lub TPO komórek 293 opisano szczegółowo w przykładzie 19 W skrócie cDNA odpowiadający pełnej otwartej ramce odczytu TPO otrzymano metodąPCR stosując pRK5-hmpl 1. Produkt PCR oczyszczano i klonowano pomiędzy miejsca restrykcji Clal i Xbal plazmidu plazmid pRK5tkneo (wektora pochodzącego od pRK5, tak zmodyfikowanego, aby wytwarzał w wyniku ekspresji gen odporności na neomycynę pod kontrolą promotora kinazy tymidynowej) uzyskując wektor pRK5tkneo.ORF (wektor kodujący całą otwartą ramkę odczytu).

Drugi wektor kodujący homologiczną domenę EPO uzyskano tak samo, ale stosując różne startery PCR, ostatecznie konstrukt określony jako pRK5-tkneoEPOD. Te 2 konstrukty transfekowano w ludzkich embrionalnych komórkach nerki metodą CaPO₄, po czym wyselekcjonowano i klony odporne na neomycynę i hodowano do zlania. Ekspresję ML₁₅₃ lub ML₃₃₂ w kondycjonowanych ośrodkach z tych klonów oceniono przeprowadzając test proliferacji Ba/F3-mpl.

Oczyszczanie rhML₃₃₂ przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 19. W skrócie kondycjonowane ośrodki 293-rhML₃₃₂ wprowadzono do kolumny Blue-Sepharose (Pharmacia), którą następnie przemywano buforem zawierającym 2 M mocznik. Kolumnę eluowano buforem zawierającym 2M mocznik i IMNaCl. Odciek eluowama BlueSepharose bezpośrednio wprowadzono do kolumny WGA-Sepharose, przemyto (10 objętości kolumny) buforu zawierającego 2M mocznik i IM NaCl, a następnie eluowano tym samym buforem zawierającym 0,5M N-ace

180 765 tylo-D-glucozammę. Eluat z WGA-Sepharose wprowadzono do kolumny C4-HPLC (Synchrom, Inc.) i eluowano z nieciągłym gradientem propanolu. Na SDS-PAGE oczyszczony 293-rhML₃₃₂ migruje jako szerokie pasmo w obszarze żelu 68-80 kDa (patrz fig. 15).

Oczyszczanie rhML₁₅₃ również przeprowadzono w sposób opisany w przykładzie 19. W skrócie kondycjonowane ośrodki 293-rhML₁₅₃ rozdzielono na Blue-Sepharose w sposób opisany dla rhML₃₃₂. Eluat Blue Sepharose wprowadzono bezpośrednio do kolumny z powinowactwem mpl, jak to opisano powyżej. RhML₁₅₃ eluowany z kolumn z powinowactwem względem mpl oczyszczano do jednorodności stosując kolumnę C4-HPLC w takich samych warunkach jak w przypadku rhML₃₃₂. Na SDS-PAGE oczyszczony rhML₁₅₃ rozdziela się na 2 główne i 2 mniejsze pasma o Mr ~18 000-22 000 (patrz fig. 15).

Mysi ligand mpl

Fragment DNA odpowiadający obszarowi kodowania ludzkiego hgandu mpl otrzymano metodą PCR, oczyszczoną na żelu i znaczono w obecności ³²P-dATP i ³²P-dCTP. Sondę tą zastosowano do selekcjonowania 10⁶ klonów biblioteki cDNA mysiej wątroby w XGT10. Mysi klon (fig. 16 [SEQ ID NO^- 12113]) zawierający insert o 1443 parach zasad wydzielono i sekwencjonowano. Przewidywany kodon inicjacyjny przy nukleotydach w pozycjach 138-141 znajdował się w sekwencji największej zgodności korzystnej dla zainicjowania translacji eukariotycznej (Kozak,M. J.CellBiol., 108:229-241 [1989]). Sekwencja ta określa otwartą ramkę odczytu 1056 nukleotydów, odpowiadającą produktowi pierwotnej translacji z 352 aminokwasów. Na brzegach tej otwartej ramki odczytu znajduje się 137 nukleotydów 5'- i 247 nukleotydów 3'-nietranslatowanej sekwencji. Nie ma ogona poh(A) za 3'- nietranslatowanym obszarem, co oznacza, że klon ten jest prawdopodobnie niekompletny. N-komec przewidywanej sekwencji aminokwasów jest wysoce hydrofobowy i prawdopodobnie reprezentuje peptyd sygnałowy. Analiza komputerowa (vonHeijne, G. Eur. J. Blochem. 133'17-21 [1983] wskazała potencjalne miejsce rozszczepiania dla peptydazy sygnałowej między resztami 21122. Rozszczepianie w tej pozycji powinno wygenerować dojrzały polipeptyd o 331 aminokwasach (35 kDa) zidentyfikowany jako mML₃₃, (mML2 ze względów opisanych poniżej). Sekwencja zawiera 4 cysteiny, wszystkie zachowane w sekwencji ludzkiej i 7 potencjalnych miejsc N-glikozylowama, spośród których 5 jest zachowanych w sekwencji ludzkiej. Podobnie jak w przypadku hML wszystkie 7 potencjalnych miejsc N-glikozylowania znajduje się w C-końcowej połowie białka.

Przy porównywaniu z ludzkim ML zaobserwowano znaczące identyczności dla obydwu nukleotydów i wydedukowanych sekwencji aminokwasów w „EPO-domenach” tych ML. Jednak jeśli wydedukowane sekwencje aminokwasów ludzkiego i mysiego ML nałożono, okazało się, że mysia sekwencja zawiera tetrapeptydową delecję między resztami 111-114 odpowiadającą 12-nukleotydowej delecji po pozycji nukleotydu 618, zaobserwowaną zarówno w ludzkim (patrz powyżej) i świńskim (patrz poniżej) cDNA. W związku z tym zbadano dodatkowy klon w celu wykrycia ewentualnych mysich izoform ML. Jeden klon kodował wydedukowaną sekwencję polipeptydową o 335 aminokwasach, zawierającą „opuszczony” tetrapeptyd LPLQ. Uważa się, że forma ta jest pełnej długości mysim ML; oznaczono jąjako mML lub mML₃₃₅. Sekwencję nukleotydów i wydedukowaną sekwencję aminokwasów mML pokazano na fig. 17 (SEQ ID NO: 14 i 15). Ten klon cDNA obejmuje 1443 par zasad, a następnie ogon poli(A). Zawiera on otwartą ramkę odczytu o 1068 bp flankowaną przez 134 zasady 5'- i 241 zasad 3'- nietranslatowanej sekwencji. Przewidywany kodon inicjacyjny znajduje się w pozycjach nukleotydów 138-140. Otwarta ramka odczytu koduje przewidywane białko 356 aminokwasów, spośród których pierwszych 21 stanowią aminokwasy silnie hydrofobowe i prawdopodobnie działają jako sygnał wydalania.

Ponadto trzeci mysi klon wydzielono i posekwencjonowano stwierdzają że zawiera on delecję 116 nukleotydów odpowiadającąhML3. Z tego względu tą mysią izoformę oznaczono jako mML3 Porównanie wydedukowanych sekwencji aminokwasów tych dwóch lozoform pokazano na fig. 18 (SEQ ID NO: 9 i 16).'

Ogólna identyczność sekwencji aminokwasów ludzkiego i mysiego ML (fig. 19 [SEQ ID NO: 61 17]) wynosi 72% z tym że homologia ta nie jest równomiernie rozmieszczona. Obszar

180 765 określony jako „EPO-domena” (ammokwasy 1-153 ludzkiej sekwencji i 1-149 dla mysiej) jest lepiej zachowany (86% homologii) niż obszar białka od końca karboksylowego (62% homologuj . Może to ponadto oznaczać, że tylko „EPO-domena” odgrywa istotną rolę w dla aktywności biologicznej białka. Należy zaznaczyć, że spośród dwóch motywów dwuzasadowych aminokwasów stwierdzonych w hML, tylko dwuzasadowy motyw bezpośrednio za „EPO-domeną” (pozycje reszt 153-154) w sekwencji ludzkiej występuje mysiej sekwencji. Jest to zgodne z założeniem, że pełnej długości ML może stanowić prekursorowe białko, które ulega ograniczonej proteolizie tworząc dojrzały ligand. Alternatywnie proteoliza pomiędzy Arg₁₅₃-Arg₁₅₄ może ułatwić klirens hML.

Wektor ekspresji zawierający całą sekwencję kodującą mML przejściowo transfekowano do komórek 293 w sposób opisany w przykładzie 1. Kondycjonowany ośrodek z tych komórek stymulował wbudowywanie ³H-tymidyny do komórek BadF3 wytwarzających w wyniku ekspresji mysi lub ludzki mpl, ale nie wywierał wpływu na macierzystą linię komórek (mpl-less). Wskazuje to, cDNA klonowanego mysiego ML koduje funkcyjny ligand, któryjest zdolny od uaktywniania zarówno mysiego jak i ludzkiego receptora ML (mpl).

11. Świński ligand mpl cDNA świńskiego ML (pML) wydzielono metodą RACE PCR w sposób opisany w przykładzie 13. Produkt PCR w postaci cDNA o 1342 bp znaleziono m nerce i subklonowano. Szereg klonów posekwencjonowano stwierdzając, że kodują one świński ligand mpl o 332 reszt aminokwasów, określany jako pML (lub pML₃₃₂). Sekwencję nukleotydów i wydedukowanąsekwencję aminokwasów pokazano na fig. 20 (SEQ ID NO: 18 i 19).

Zidentyfikowano również drugą formę, oznaczonąjako pML2, kodującąbiałko z delecją4 reszt aminokwasów (228 reszt aminokwasów) (patrz fig. 21 [SEQ ID NO: 21 ]). Porównanie sekwencji aminokwasów pML i pML2 wykazuje, że ta ostatnia forma jest odentyczna z wyjątkiem tetrapeptydu QLPP odpowiadającego wyciętym resztom 111-114 (patrz fig. 22 [SEQ ID NO: 181 21]). Delecje 4 aminokwasów zaobserwowano w cDNA zarówno mysiego jak i świńskiego ML występują w dokładnie tych samych miejscach w przewidywanych białkach.

Porównanie przewidywanych sekwencji aminokwasów dojrzałego ML człowieka, myszy i śwmi (fig. 19 [SEQ ID NO: 6, 17 i 18]) wykazuje, że ogólna identyczność sekwencji wynosi 72% dla myszy i człowieka, 68% dla myszy i świni oraz 73% dla świni i człowieka. Homologia jest zasadniczo wyższa w ammo-końcowej połowie ML (EPO-homologiczna domena). Domena ta wykazuje identyczność w 80-84% dla dowolnych dwóch gatunków, podczas gdy połowa Karboksy-końcowa (domena węglowodanowa) wykazuje identyczność jedynie w 57-67%. Motyw dwóch zasadowych aminokwasów, który może reprezentować miejsce rozszczepiania proteazą, znajduje się na karboksylowym końcu domeny homologii erytropoetynowej. Motyw ten zachowanyjest w trzech gatunkach w tej pozycji (fig. 19 [SEQIDNO: 6,17118]). Drugie miejsce dwuzasadowe obecne w sekwencji ludzkiej w pozycjach 245 i 246 nie występuje w sekwencji mysiej i świńskiej. Mysia i świńska sekwencja ML zawierają4 cysteiny, wszystkie zachowane w sekwencji ludzkiej. Występuje 7 potencjalnych miejsc N-glikozylowania w hgandzie mysim 16 w świńskim ML, spośród których 5 zachowanychjest w sekwencji ludzkiej. Wszystkie potencjalne miejsca N-glikozylowania znajdują się również w C-końcowej połowie białka.

Ekspresja i oczyszczanie TPO z komórek jajowych chomika chińskiego (CHO)

Wektory ekspresji stosowane do transfekowania komórek CHO oznaczono jako: pSVI5.ID.LL.MLORF (pełnej długości lub TPO₃₃₂) i pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (skrócony lub TPO₁₅₃). Odpowiednie cechy tych plazmidów pokazano na fig. 23 i 24.

Procedury transfekcji są opisane w przykładzie 20. W skrócie cDNA odpowiadający całkowitej otwartej ramce odczytu TPO otrzymano metodą PCR. Produkt PCR oczyszczano i klonowano pomiędzy 2 miejsca restrykcji (Ciał i Sali) plazmidu pSVI5.ID.LL uzyskując wektor pSVI5.ID.MLORF. Drugi konstrukt odpowiadający homologicznej domenie wytworzono w taki sam sposób, ale stosując odmienny starter odwrotny (EPOD.Sal). Ostateczny konstrukt wektora kodującego homologiczną domenę EPO w TPO nazwano pSVI5.ID.LL.MLEPO-D.

180 765

Te 2 konstrukty zlinearyzowano Notl i zastosowano do transfeko wania komórek jakowych chińskiego chomika (komórek CHO-DP12, EP 307 247 opublikowany 15 marca 1989) na drodze elektroporacji. 10⁷ komórek poddawano elektroporacji w aparacie do elektroporacji BRL (350 V, 330 mF, niska pojemność) w obecności 10, 25 lub 50 mg DNA w opisany sposób (Andreason GL.,J. Tissue Cult. Meth. 15,56 [1993]). W dzień po transfekcji komórki rozszczepiono selektywnym ośrodku DHFR (wysokoglukozowy DMEM-F12 50:50 bez glicyny, 2mM glutamina, 2-5% dializowana płodowa surowica bydlęca) 10-15 dni później pojedyncze kolonie przeniesiono na płytki z 96 studzienkami i hodowano do zlania. Ekspresję ML₁₅₃ lub ML₃₃₂ w kondycjonowanych ośrodkach z tych klonów oceniono stosując test proliferacji Ba/F3-mpl (opisane w przykładzie 1).

Sposób oczyszczania i wydzielania TPO z zebranego płynu z hodowli komórek CHO opisano w przykładzie 20. W skrócie zebrany płyn z hodowli komórek (HCCF) wprowadzono do kolumny Blue Sepharose (Phamacia)w ilości około 100 litrów HCCF/htr żywicy. Kolumnę przemyto następnie (3-5 objętości kolumny) buforu, a następnie (3-5 objętości kolumny) buforu zawierającego 2,0 M mocznik. TPO eluowano następnie (3-5 objętości kolumny) buforu zawierającego 2,0 M mocznik i 1,0 M NaCl.

Zebrany eluat z Blue Sepharose, zawierający TPO wprowadza się następnie do kolumny Wheat Germ Lectin Sepharose (Pharmacia) doprowadzonej do stanu równowagi z buforem elucyjnym Blue Sepharose, stosując 8-16 ml eluatuBlue Sepharose/ml żywicy. Kolumnę przemywa się następnie (2-3 objętości kolumny) buforu do ekwilibracji. TPO eluuje się następnie (2-5 objętości kolumny) buforem zawierającym 2,0 M mocznik i 0,5 M N-acetylo-D-glucosaminę.

Eluat z Wheat Germ Lectin zawierający TPO zakwasza się C₁₂E₈ do uzyskania ostatecznego stężenia 0,04%. Uzyskany eluat wprowadza się do kolumny C4 z odwróceniem faz doprowadzonej do równowagi w 0,1 % TFA, 0,04% C₁₂E₈, stosując obciążenie około 0,2-0,5 mg białka/ml żywicy.

Białko eluuje się z dwufazowym liniowym gradientem stosując acetonitryl zawierający 0,1% TFA i 0,04% C_]2E₈ łącząc frakcje w oparciu o SDS-PAGE.

Zebrany eluat C4 rozcieńcza się i poddaje diafiltracji względem około 6 objętości buforu stosując membranę do ultrafiltracji Amicon YM lub inną podobną odcinającą ciężary cząsteczkowe 10 000 - 30 000 daltonów. Uzyskany diafiltrat można następnie bezpośrednio poddać obróbce lub dalej zatężać na drodze ultrafiltracji. Diafiltrat/koncentrat zwykle nastawia się środkiem Tween-80 do stężenia 0,01%.

Całość lub część diafiltratu/koncentratu odpowiadająca 2-5% wyliczonej objętości kolumny wprowadza się do kolumny Sephacryl S-300 HR (Pharmacia) doprowadzonej do stanu równowagi w buforze zawierającym 0,01% Tween-80 i prowadzi się chromatografię. Frakcje zawierające TPO, wolne od agregatu i produktów degradacji proteolitycznej łączy się w oparciu o SDS-PAGE. Uzyskany zebrany eluat sączy się i przechowuje w 2-8°C.

. Sposoby transformowania i indukowania syntezy TPO w drobnoustroju oraz wydzielanie, oczyszczanie i składania (renaturacja) wytworzonego TPO

Konstrukcję wektorów ekspresji E. coli TPO opisano szczegółowo w przykładzie 21 W skrócie plazmidy pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 i pMP202 zaprojektowano tak, aby osiągnąć ekspresj ę pierwszych 155 aminokwasów TPO w dół od małego lidera, różnego dla różnych konstruktów. Lidery zapewniają przede wszystkim wysoki poziom inicjowania translacji i szybkie oczyszczanie. Plazmidy pMP210-l, -T8, -21, -22, -24, -25 są zaprojektowane tak, aby osiągnąć ekspresję pierwszych 153 aminokwasów TPO w dół od inicjacyjnej metioniny i różnią się tylko wykorzystaniem kodonów dla pierwszych 6 aminokwasów TPO, podczas gdy plazmid pMP251 stanowi pochodna pMP210-1, w której karboksy-końcowy koniec TPO jest wydłużony o 2 aminokwasy. Wszystkie powyższe plazmidy będą zapewniać wysokie poziomy wewnątrzkomórkowej ekspresji TPO w E. coli po indukcji promotorem tryptofanowym (Yansura, D G. i mm, Methods in Enzymology (Goeddel, D. V., Ed.) 185:54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Plazmidy pMPl i pMP172 są półproduktami do konstrukcji powyższych wewnątrzkomórkowych plazmidów ekspresji.

180 765

Powyższe plazmidy ekspresji TPO zastosowano do transformowania E. coli stosując metodę szoku termicznego w CaCl₂ (Mandel M. i inni, J. Mol. Biol., 53:159-162, [1970]) oraz inne procedury opisane w przykładzie 21 W skrócie transformowane komórki hodowano najpierw w 37°C do uzyskania (600 nm) hodowli około 2-3. Hodowlę rozcieńczono następnie i po hodowaniu z napowietrzaniem dodano kwas. Następnie kontynuowano hodowlę z napowietrzaniem przez kolejne 15 godzin, po czym komórki zebrano przez odwirowanie.

Procedury wydzielania, oczyszczania i składania podane poniżej w podniesieniu do wytwarzania biologicznie czynnego, złożonego ludzkiego TPO lub jego fragmentów, opisane w przykładach 22 i 23, wykorzystać można do wydzielania dowolnego wariantu TPO obejmującego N- i C-końcowe wydłużone formy. Inne procedury przydatne do składania zrekombmowanego lub syntetycznego TPO znaleźć można w następujących patentach: Builder i mm, patent USA 4 511 502; Jones i inni, patent USA 4 512 922; Olson, patent USA 4 518 526 oraz Builder i inni, patent USA 4 620 948, w odniesieniu do ogólnego opisu procesu wydzielania i składania różnych zrekombmowanych białek wytworzonych w wyniku ekspresji w nierozpuszczalnej formie w E. coli.

A. Wydzielanie nierozpuszczalnego TPO

Drobnoustrój taki jak E. coli wytwarzający w wyniku ekspresji TPO kodowany przez dowolny odpowiedni plazmid poddaje się fermentacji w warunkach, w których TPO osadza się w postaci nierozpuszczalnych „załamujących światło ciał”. Komórki można także najpierw przemyć w buforze rozbijającym komórki. Zazwyczaj około 100 g komórek zawiesza się w około 10 objętościach buforu rozbijającego komórki (np. 10 mM Tris, 5 mM EDTA, pH 8) np. w homogemzatorze Polytron i komórki odwirowuje się przy 5000 x g przez 30 minut. Następnie komórki poddaje się hzie stosując dowolną znaną technikę takąjak szok toniczny, obróbkę ultardźwiękami, cykliczne zmiany ciśnienia oraz metody chemiczne lub enzymatyczne. Tak np powyższą przemytąpozostałość komórkową można zawiesić w kolejnych 10 objętościach buforu do rozbijania komórek w homogenizatorze i zawiesinę komórek przepuszcza się przez aparat LH Celi Disrupter (LH Inceltech, Inc.) lub przez Microfluidizer (Microfluidics International), zgodnie z instrukcjami producentów. Osad zawierający TPO oddziela się następnie od fazy ciekłej i ewentualnie przemywa się dowolną odpowiednią cieczą. Tak np. zawiesinę lizatu komórek można odwirować przy 5 000 x g przez 30 minut, ponownie zawiesić i ewentualnie odwirować po raz drugi uzyskując przemyty osad załamujących światło ciał. Przemyty osad można wykorzystać od razu lub ewentualnie przechowywać w stanie zamrożonym (np. -70°C).

B Rozpuszczanie i oczyszczanie monomerycznego TPO

Nierozpuszczalny TPO w postaci osadu 106 przeprowadza się następnie w stan rozpuszczony stosując bufor rozpuszczający Bufor rozpuszczający zawiera środek chaotropowy i jest zwykle buforowany przy zasadowym pH i zawiera środek redukujący w celu zwiększenia wydajności monomerycznego TPO. Do reprezentatywnych środków chaotropowych należy mocznik, chlorowodorek gaunidyny i tiocyjanian sodowy. Korzystnym środkiem chaotropowym jest chlorowodorek guanidyny. Stężenie środka chaotropowego jest zwykle 4-9M, korzystnie 6-8M. pH buforu rozpuszczającego utrzymywane jest za pomocą dowolnego odpowiedniego buforu w zakresie około 7,5-9,5, korzystnie 8,0-9,0, a najkorzystniej 8,0. Korzystnie bufor rozpuszczający zawiera także środek redukujący aby ułatwić powstawanie monomerycznej formy TPO. Do odpowiednich środków redukujących należą związki organiczne zawierające wolną grupę tiolową (RSH). Do reprezentatywnych środków redukujących należy ditiotreitol (DTT), ditioerytrytol (DTE), merkaptoetanol, glutation (GSH), cysteamma i cysteina. Korzystnym środkiem redukującym jest ditiotreitol (DTT). Bufor rozpuszczający może ewentualnie zawierać łagodny środek utleniający (np. cząsteczkowy) i a sól siarczkową aby uzyskać monomeryczny TPO na drodze siarczkohzy. W takim wykonaniu uzyskany S-sulfoman TPO składa się następnie w obecności buforu redoksy (np. GSH/GSSG) uzyskując właściwie złożony TPO.

Białko TPO zwykle dodatkowo oczyszcza się stosując, np. wirowanie, chromatografię żelową i chromatografię kolumnową z odwróceniem faz.

180 765

Przykładowo monomeryczny TPO wytwarza się w następujący sposób. Osad załamujących światło ciał zawiesza się w około 5 objętościach wagowo buforu rozpuszczającego (20 mM Tns, pH 8, z 6-8 M guanidyną i 25 mM DTT) i miesza się przez 1-3 godziny lub przez noc w 4°C doprowadzając do rozpuszczenia białko TPO. Przydatne są również wysokie stężenia mocznika (6-8 M), z tym że zazwyczaj usykuje się wówczas nieco niższe wydajności w porównaniu z guanidyną. Po rozpuszczeniu roztwór odwirowuje się przy 30 000 x g przez 30 minut uzyskując klarowny supematant zawierający zdenaturowane, monomeryczne białko TPO. Supematant poddaje się następnie chromatografii w kolumnie do filtracji żelowej Superdex 200 (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) przy szybkości przepływu 2 ml/minutę i białko eluuje się 20 mM fosforanem Na, pH 6,0, z 10 mM DTT. Frakcje zawierające monomeryczne, zdenaturowane białko TPO eluowane pomiędzy 1601 200 ml łączy się. Białko TPO oczyszcza się dokładniej w półpreparatywnej kolumnie C4 z odwróceniem faz (2 x 20 cm VYDAC). Próbkę wprowadza się z szybkością 5 ml/minutę do kolumny doprowadzonej do stanu równowagi w 0,l%TFA (kwas trifluorooctowy) w 30% acetomtrylu Białko eluuje się z liniowym gradientem acetonitrylu (30-60% przez 60 minut). Oczyszczone zredukowane białko eluuje się przy około 50% acetonitrylu. Materiał ten stosuje się do składania w celu uzyskania biologicznie czynnego wariantu TPO.

C Składanie TPO w celu wytworzenia formy biologicznie czynnej

Po rozpuszczeniu i dodatkowym oczyszczaniu TPO, biologicznie czynną formę otrzymuje się przez składanie zdenaturowanego monomerycznego TPO w buforze redoksy. Z uwagi na wysoką siłę działania TPO (połowę wielkości maksymalnej stymulacji w teście z Ba/F3 uzyskuje się przy około 3 pg/ml), uzyskać można biologicznie czynny materiał stosując wiele różnych buforów, detergentów i warunków redoksy. Jednakże najczęściej uzyskuje się jedynie niewielką ilość właściwie złożonego materiału (<10%). W procesach produkcyjnych pożądane jest, aby wydajności składania wynosiły co najmniej 10%, jeszcze korzystniej 30-50%, a najkorzystniej >50% Stwierdzono, że wiele różnych detergentów takich jak Triton Χ-100, dodecylo-P-maltozyd, CHAPSO, SDS, sarkozyl, Tween 20 i Tween 80, Zwittergent 3-14 i inne, nadaje się do wytwarzania co najmniej pewnej ilości właściwie złożonego materiału. Stwierdzono, ze spośród tych środków do najkorzystniejszych detergentów należą środki z rodziny CHAPS (CHAPS i CHAPSO), które jak stwierdzono, działają najskuteczniej w reakcji składania i ograniczają agregację białka i tworzenie niewłaściwych disulfidów. Najkorzystniej CHAPS stosuje się w ilości ponad około 1%. Aby uzyskać jak największe wydajności, należy zastosować chlorek sodowy, którego optimum stężenia przypada w zakresie pomiędzy 0,1 M i 0,5 M. Obecność EDTA (1-5 mM) w buforze redoksy wywiera korzystny wpływ na ograniczenie katalizowanego przez metal utleniania (i agregacji), co zaobserwowano w przypadku pewnych preparatów. Przy stężeniach gliceryny ponad 15% uzyskuje się optymalne warunki składania. Aby uzyskać maksymalne wydajności, należy zastosować parę redoksy w buforze redoksy obejmującym zarówno utleniony jak i zredukowany tiol organiczny (RSH). Do odpowiednich par redoksy należą: merkaptoetanol, glutation (GSH), cysteamina, cysteina i ich odpowiednie utlenione formy. Korzystne pary redoksy tworząc glutation (GSH):utleniony glutation (GSSG) lub cysteina:cystyna. Najkorzystniejszą parę redoksy tworzą glutation (GSH):utleniony glatation (GSSG). Zazwyczaj wyższe wydajności obserwowano, gdy ilość moli składnika utlenionego w parze redoksy była równa lub wyzsza od ilości składnika zredukowanego w parze redoksy. Wielkości pH pomiędzy 7,5 i około 9 są optymalne do składania takich wariantów TPO. Rozpuszczalniki organiczne (np. etanol, acetonitryl, metanol) sątolerowane w stężeniach 10-15% lub niższych. Przy większych ilościach rozpuszczalników organicznych wzrasta ilość niewłaściwie złożonych form. Zazwyczaj przydatny jest bufor Tns i fosforanowy. Wyższe poziomy właściwie złożonego TPO uzyskuje się prowadząc indukcję w 4°C

Wydajności składania rzędu 40-60% (w stosunku do ilości zredukowanego i zdenaturowanego TPO stosowanego w reakcji składania) są typowe dla preparatów TPO oczyszczonych w pierwszym etapie C4 Matenał aktywny można także otrzymać przy stosowaniu mniej czystych preparatów (np. bezpośrednio po kolumnie Superdex 200 lub po wyjściowej ekstrakcji załamujących światło ciał), z tym że wydajności są niższe z uwagi na obfite wytrącanie się i zakłócenia białek nie-TPO podczas procesu składania TPO.

180 765

W związku z tym, że TPO zawiera 4 reszty cysteiny, można uzyskać 3 różne disulfidowe tego białka:

wersja 1: disulfidy między resztami cysteiny 1-4 i 2-3 wersja 2: disulfidy między resztami cysteiny 1-2 i 3-4 wersja 3: disulfidy między resztami cysteiny 1-3 i 2-4.

W czasie wyjściowych badań przy ustalaniu warunków składania szereg różnych pików zawierając białko TPO rozdzielono metodą chromatografii C4 z odwróceniem faz. Tylko jeden z tych pików wykazywał znaczącą aktywność biologiczną oznaczaną w teście z BadF3. Następnie warunki składania zoptymalizowano aby osiągnąć wybiórczo taką wersję. W takich warunkach błędnie złożone wersje stanowiły mniej niż 10-20% całości monomerycznego TPO otrzymanego z etapu rozpuszczania.

Na podstawie spektrometru masowej i sekwencjonowania ustalono, że układ wiązań disulfidowych w biologicznie czynnym TPO jest 1-4 i 2-3, przy czym cysteiny ponumerowano kolejno od końca aminowego. Taki układ wiązań sieciujących cysteiny odpowiada znanemu układowi wiązań disulfidowych w pokrewnej cząsteczce erytropoetyny.

D. Aktywność biologiczna zrekombinowanego, złożonego TPO

Złożony i oczyszczony TPO wykazuje aktywność zarówno w testach in vitro]ak i in νινο. Tak np. w teście z Ba/F3 ilość TPO (Met’¹ 1-153) zapewniająca 50% maksymalnej stymulacji wbudowywania tymidyny do komórki Ba/F3 wynosi 3,3 pg/ml (0,3 pM). W teście ELISA opartym na receptorze mpl połówkowa maksymalna aktywność wystąpiła przy 1,9 ng/ml (120 pM). W przypadku zwierząt normalnych i takich, u których osłabiono działanie szpiku prawie śmiertelną dawką promieniowania rentgenowskiego działanie złożonego TPO (Met’¹ 1-153) było bardzo silne (aktywność zaobserwowano przy dawkach wynoszących zaledwie 30 ng/mysz) w pobudzaniu wytwarzania nowych płytek krwi. Podobną aktywność biologiczną zaobserwowano dla innych form TPO składanych opisanymi powyżej sposobami (patrz fig. 25,26 i 28). 14. Metody pomiaru aktywności trombopoetycznej

Aktywność trombopoetyczną można oznaczać w różnych testach obejmujących test wiązania ligandu mpl Ba/F3 opisany w przykładzie 1, test nawrotu syntezy in vivo płytek u myszy, test indukowania antygenu powierzchni komórek płytkowych oznaczanego w przeciwpłytkowym teście immunologicznym (anty-GPIIbliy dla linii komórek megakarioblastycznych ludzkiej białaczki (CMK) (patrz Sato i inni, Brit. J. Heamatol., 72 : 184-190 [1989]) (patrz także test megakariocytopoezy w zawiesinie w cieczy, opisane w przykładzie 4) oraz indukowanie poliploidyzacji w linii komórek megakarioblastycznych (DAMI) (patrz Ogura i mm, Blood, 72(1): 49-60 [1988]). Dojrzewanie megakriocytów z niedojrzałych, w znaczym stopniu me syntetyzujących DNA komórek do morfologicznie dających się zidentyfikować megakariocytów obejmuje proces, w którym pojawiająsię cytoplazmatyczne organelle, przyjmowanie antygenów błony (GPIIblllg), endorephkacja i uwalnianie płytek krwi, jak to opisano we wstępie. Należałoby oczekiwać, że liniowo-specyficzny promotor (np. ligand mpl) dojrzewania megakariocytów będzie indukować co najmniej część tych zmian w niedojrzałych megakanocytach prowadzących do uwalniania płytek i łagodzenia małopłytkowości. W związku z tym testy zaprojektowano tak, aby zmierzyć pojawianie się tych parametrów w liniach niedojrzałych komórek megakrocytowych, np komórek CMK i DAMI. W teście CMK (przykład 4) oznacza się pojawianie specyficznego markera płytek, GPII_bIII_a i uwalnianie płytek. W teście DAMI (przykład 15) oznacza się endoreplikację, gdyż wzrost ploii jest oznaką dojrzałych megakariocytów. Rozpoznawalne megakariocyty wykazująploidię 2N, 4N, 8N, 16N, 32N itp. Test in vivo nawrotu mysich płytek (przykład 16) jest przydatny do wykazania, że podawanie badanego związku (w danym przypadku ligandu mpl) powoduje wzrost liczby płytek.

Dwa dodatkowe testy in vitro opracowano w celu wykonania pomiarów aktywności TPO. Pierwszym jest ELISA z uaktywnianiem receptora kinazy (KIRA) ELISA, w którym komórki CHO transfekuje się chimerą mpl-Rse fosforylowanie tyrozyny w Rse oznacza się w teście ELISA po ekspozycji części mpl chimery na działanie ligandu mpl (patrz przykład 17). Drugim jest test ELISA oparty na receptorze, w którym płytka ELISA pokryta przeciwludzki IgG królika

180 765 wychwytuje ludzki chimeryczny receptor mpl-IgG, który wiąże badany ligand mpl. Biotynylowane poligonalne przeciwciało królika przeciw ligandowi mpl (TPO₁₅₅) stosuje się do wykrycia związanego ligandu mpl, który oznacza się stosując streptawidynę-peroksydazę w sposób opisany w przykładzie 18.

15. Odpowiedź biologiczna in vivo normalnych i subletalnie napromieniowanych myszy traktowanych TPO

Normalne i subletalnie napromieniowane myszy potraktowano skróconym i pełnej długości TPO wydzielonym z komórek jajowych chińskiego chomika, E. coli i ludzkich embrionalnych komórek nerkowych (293). Obydwie formy TPO wytworzone w tych 3 gospodarzach stymulowały wytwarzanie płytek krwi u myszy, z tym że okazało się iż pełnej długości TPO wydzielony z CHO wytwarza najsilniejszą reakcję in vivo. Wyniki te wskazują że właściwe glikozylowanie karboksykońcowej domery może być niezbędne do uzyskania optymalnej aktywności in vivo.

(a) E. coli-rhTPO (Met-1, 153)

Formę „Met” domeny EPO (Met w pozycji -1 + pierwsze 153 reszty ludzkiego TPO) wytworzoną w E. coh (patrz przykład 23) wstrzykiwano raz dziennie normalnym samicom myszy C57 B6 w sposób podany w legendzie przy fig. 25A, 25B i 25C. Z rysunków tych wynika, że nieghkolizowana skrócona forma TPO wytworzona w E. coli i zwinięta, jak to opisano powyżej, jest zdolna do stymulowania około dwukrotnego wzrostu wytwarzania płytek krwi u normalnych myszy bez wpływu na populację na czerwone lub białe komórki krwi.

Te same cząsteczki wstrzykiwane raz dziennie subletalnie napromieniowanym (137Cs) samicom myszy C57 B6 w sposób podany w legendzie przy fig. 26A, 26B i 26C stymulowały odzysk płytek i obniżenie nadiru, ale nie wywierały wpływu na erytrocyty i leukocyty (b) CHO-rhTPO₃₃₂

Pełnej długości forma TPO wytworzona w CHO i wstrzyknięta raz dziennie normalnym samicom myszy C57 B6 w sposób podany w legendzie przy fig. 27A, 27B i 27C powodowała około a pięciokrotny wzrost wytwarzania płytek krwi u normalnych myszy bez wpływu na populację erytrocytów lub leukocytów.

(c) CHO-rhTPO₃₃₂; E. coli-rhTPO (Met’¹, 153); 293-rhTPO₃₃₂ i E. coli-rhTPOi₅₅

Wykreślono krzywe reakcji na dawkę w przypadku traktowania normalnych myszy rhTPO z różnych linii komórek (CHO-rhTPO₃₃₂; E. coli-rhTPO (Met'¹, 153); 293-rhTPO₃₃₂ i E. cohrhTPO₁₅₅) w sposób podany w legendzie przy fig. 28. Wykres ten wykazuje, że wszystkie zbadane formy cząsteczek stymulująwytwarzanie płytek krwi, z tym że formy o pełnej długości wytworzone w CHO wykazują najwyższą aktywność in vivo.

(d) CHO-rhTPO₁₅₃, CHO-rhTPO „obcięty” i CHO-rhTPO₃₃₂

Wykreślono krzywe reakcji na dawkę w przypadku traktowania normalnych myszy rhTPO wytworzonym w CHO (CHO-rhTPO ₁₅₃, CHO-rhTPO, „obcięty” i CHO-rhTPO₃₃₂) w sposób podany w legendzie przy fig. 29. Wykres ten wykazuje, że wszystkie zbadane formy cząsteczki CHO stymulują wytwarzanie płytek krwi, z tym że forma 70 kDa o pełnej długości wykazuje najwyższą aktywność in vivo.

16. Ogólny sposób rekombinacyjnego wytwarzania ligandu mpl i jego wariantów

Korzystnie ligand mpl wytwarza się standardowymi sposobami rekombinacji obejmuj ącymi wytwarzanie polipeptydu hgandu mpl przez hodowlę komórek transfekowanych wytwarzających w wyniku ekspresji kwas nukleinowy ligandu mpl (zazwyczaj przez transferowanie komórki wektorem ekspresji) i odzyskiwanie polipeptydu z komórki. Jednakże dopuszcza się również możliwość wytwarzania ligandu mpl na drodze homologicznej rekombinacji, lub technikami rekombinacji stosując elementy kontrolne wprowadzone do komórek już zawierających DNA kodujący ligand mpl. Tak np. a silny element promotor/enhancer element, supresor lub egzogenny element modulujący transkrypcję można wstawić do genomu przewidywanej komórki gospodarza w takim sąsiedztwie i w takiej orientacji, aby wpływać na transkrypcję DNA kodującego pożądany polipeptyd hgandu mpl. Element kontrolny me koduje ligandu mpl, to raczej DNA jest rodzimy dla genomu komórki gospodarza. Następnie przeprowadza się selekcjonowanie komórek

180 765 wytwarzających polipeptyd receptora według wynalazku, lub zwiększa się albo obniża poziom ekspresji, zależnie od potrzeb.

I tak wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania ligandu mpl, obejmującego insercję, do genomu komórki zawierającego cząsteczkę kwasu nukleinowego ligandu mpla, transkrypcyjnego elementu modulującego na tyle blisko i w takiej orientacji w stosunku do cząsteczki kwasu nukleinowego, aby wpłynąć na jego transkrypcję, a ponadto ewentualnie dodatkowy etap obejmujący hodowlę komórki zawierającej transkrypcyjny element modulujący i cząsteczkę kwasu nukleinowego. Wynalazek dotyczy także komórki gospodarza zawierającej rodzimą cząsteczkę kwasu nukleinowego ligandu mpl operacyjnie połączoną z egzogennymi sekwencjami kontrolnymi rozpoznawanymi przez komórkę gospodarza.

A. Wydzielanie DNA kodującego polipeptyd ligandu mpl

DNA kodujący polipeptyd ligandu mpl można otrzymać z dowolnej biblioteki cDNA wytworzonej z tkanki, która, jak się sądzi, zawiera mRNA ligandu mpl i wytwarza go w wyniku ekspresji w wykrywalnym poziomie. Gen hgandu mpl można także otrzymać z genomowej biblioteki DNA lub na drodze in vitro syntezy oligonukleotydów pełnego nukleotydu lub sekwencji aminokwasów.

Biblioteki selekcjonuje się sondami zaprojektowanymi tak, że identyfikują one określony gen lub kodowane przezeń białko. W przypadku bibliotek ekspresji cDNA, do odpowiednich sond należąmonoklonalne lub pohklonałne przeciwciała, które rozpoznają ligand mpl i specyficznie wiążą się z nim. W przypadku bibliotek cDNA do odpowiednich sond należą ohgonukleotydy o około 20-80 zasadach, które kodująznane lub podejrzewane części cDNA ligandumpl z tego samego lub innego gatunku; ι/lub komplementarne albo homologiczne cDNA lub ich fragmenty które kodująten sam lub podobny gen. Do odpowiednich sond do selekcjonowania bibliotek genomowego DNA należą ale nie wyłącznie, ohgonukleotydy, cDNA lub ich fragmenty, które kodują ten sam lub podobny gen i/łub homologicznie genomowe DNA lub ich fragmenty. Selekcjonowanie cDNA lub genomowej biblioteki wybraną sondą przeprowadzić można stosując standardowe procedury opisane w rozdziałach 10-12 pracy Sambrook i inni, supra.

Wariantowy sposób wydzielania u kodującego ligand mpl stanowi wykorzystanie techniki PCR opisanej w sekcji 14 pracy Sambrook i inni, supra. Sposób ten wymaga użycia sond ohgonukleotydowych, które będąhybrydyzować z DNA kodującym ligand mpl. Strategie selekcji ohgonukleotydów opisano poniżej.

Korzystny sposób realizacji wynalazku obejmuje stosowanie dokładnie wybranej sekwencji oligonukleotydów do selekcjonowania bibliotek cDNA z różnych tkanej, korzystnie z ludzkiej lub świńskiej nerki (dorosłego osobnika lub płodowej) albo linii komórek wątroby. Tak np. bibliotekę cDNA z linii ludzkich płodowych komórek wątroby selekcjonuje się sondami ohgonukleotydowymi. Alternatywnie ludzkie genomowe biblioteki można selekcjonować sondami ohgonukleotydowymi.

Sekwencje oligonukleotydów wybrane jako sondy powinny być na tyle długie i niedwuznaczne, aby zminimalizować fałszywe wyniki pozytywne. Rzeczywiste sekwencje nukleotydów zwykle projektuje się tak, aby oparte były na obszarach ligandu mpl o najmniejszej ilości zbędnych kodonów. Ohgonukleotydy mogą być zdegenerowane w jednej lub więcej pozycjach. Zastosowanie zdegenerowanych oligonukleotydów jest szczególnie istotne wtedy, gdy selekcjonuje się bibliotekę z gatunków, w których preferencyjny użyty kodon nie jest znany.

Ohgonukleotyd musi być znaczony, tak aby można go było wykryć w wyniku hybrydyzacji z DNA w selekcjonowanej bibliotece. Korzystnym sposobem znakowania jest użycie ATP (np. γ³²Ρ) i kinazy polinukleotydowej do radioznaczenia końca 5' ohgonukleotydu. Można jednak zastosować również inne sposoby do znaczenia ohgonukleotydu, obejmujące, ale nie wyłącznie, biotynylowanie lub znaczenie enzymem.

Szczególnie interesujący jest kwas nukleinowy hgandu mpl, który koduje pełnej długości polipeptyd hgandu mpl. W pewnych korzystnych wariantach sekwencję kwasu nukleinowego stanowi sekwencja sygnałowa natywnego hgandu. Kwas nukleinowy zawierający sekwencję ko

180 765 dującą białko otrzymuje się przez selekcjonowanie wybranych bibliotek cDNA lub genomowych stosując wydedukowaną sekwencję aminokwasów.

B. Warianty sekwencji aminokwasów natywnego Uganda mpl

Warianty sekwencji aminokwasów wytwarza się wprowadzając odpowiednie zmiany nukleotydowe do DNA hgandu mpl lub na drodze syntezy in vitro pożądanego pohpeptydu hgandu mpl. Do takich wariantów należą np. delecje lub insercje albo podstawienia reszt w sekwencji aminokwasów świńskiego hgandu mpl. Tak np. części karboksylowego końca dojrzałego pełnej długości hgandu mpl można usunąć przez by rozszczepienie proteolityczne, in vivo lub in vitro, albo przez klonowanie i ekspresję fragmentu lub DNA kodującego pełnej długości ligand mpl, uzyskując biologicznie czynny wariant. Dowolną kombinację delecji, insercji i podstawienia wykonuje się w celu doprowadzenia do ostatecznego konstruktu, pod warunkiem, że ostateczny konstrukt wykazuje pożądaną aktywność biologiczną. Zmiany aminokwasów mogą także wpływać na potranslacyjne procesy w ligandzie mpl, takie jak zmiana liczby lub pozycji miejsc ghkozylowama. Przy projektowaniu sekwencji aminokwasów wariantu ligandu mpl, położenie miejsca mutacji i charakter mutacji będzie zależeć od charakterystyki modyfikowanego hgandu mpl. Miejsca mutacji można zmodyfikować pojedynczo lub seryjnie, np. przez (1) podstawienie najpierw wybranych zachowanych aminokwasów, a następnie bardziej radykalną selekcję, w zależności od uzyskanych wyników, (2) delecję docelowej reszty lub (3) wstawienie reszt tej samej klasy lub różnych klas, w sąsiedztwie ustalonego miejsca, albo stosując kombinacje wariantów 1-3.

Przydatną metodą identyfikacji pewnych reszt lub obszarów polipeptydu ligandu mpl będących korzystnymi miejscami dla mutagenezy, „mutageneza ze skaningiem alahny” opisali Cunningham i Wells, Science, 244 : 1081-1085 [1989]. Resztę lub grupę docelowych reszt identyfikuje się (np. reszty obdarzone ładunkiem takie jak arg, asp, his, lys i glu) i zastępuje się dowolnym, ale korzystnie obojętnym lub ujemnie naładowanym, aminokwasem (najkorzystniej alaniną lub polialamną), aby wpłynąć na oddziaływanie aminokwasu z otaczając wodnym środowiskiem wewnątrz lub na zewnątrz komórki. Domeny wykazujące funkcyjną wrażliwość na podstawienia uwidocznia się następnie wprowadzając dodatkowy lub inny wariant w miejscu podstawienia lub zamiast mego. W związku z tym, mimo iż miejsce wprowadzenia wariantu sekwencji aminokwasów jest ustalone, charakter mutacji jako taki nie musi być wstępnie określony. Tak np. w celu zoptymalizowania skuteczności mutacji w danym miejscu przeprowadza się skaning ala lub przypadkową mutagenezę w docelowym kodonie lub obszarze i wytworzony w wyniku ekspresji wariant ligandu mpl selekcjonuje się względem optymalnej kombinacji pożądanej aktywności.

Dwie podstawowe zmienne występują w konstrukcji wariantu sekwencji aminokwasów: położenie miejsca mutacji i charakter mutacji. Tak np. warianty pohpeptydu ligandu mpl obejmują warianty sekwencji ligandu mpl, przy czym mogą one reprezentować allele występujące w naturze (które nie wymagają manipulacji DNA hgandu mpl) lub wstępnie ustalone formy mutantowe wytworzone przez mutowanie DNA, co prowadzi do allelu lub wariantu me występującego w przyrodzie. Zazwyczaj dobór miejsca i charakteru mutacji będzie zależeć od charakterystyki modyfikowanego ligandu mpl.

Delecje sekwencji aminokwasów zazwyczaj obejmują od około 1 do 30 reszt, jeszcze korzystniej około 1-10 reszt i zazwyczaj sąsiadują. Alternatywnie delecje sekwencji aminokwasów ligand mpl mogą obejmować część lub całość karboksy-końcowej domeny glikoprotemowej. Delecje sekwencji aminokwasów mogą także obejmować jedną lub więcej spośród pierwszych 6 ammo-końcowych reszt dojrzałego białka. Delecje sekwencji aminokwasów ewentualnie obejmująjednąlub więcej reszt wjednym lub więcej obszarach pętli występujących między pomiędzy „wiązkami hehsowymi”. Sąsiednie delecje zazwyczaj wykonuje się na parzystej liczbie reszt, z tym że pojedyncze lub nieparzyste delecje są również objęte zakresem wynalazku. Delecje wprowadzać można do obszarów o niskiej homologii wśród ligandów mpl dzielących najwyższą identyczność sekwencji, tak aby zmodyfikować aktywność hgandu mpl. Można także wprowadzić delecje do obszarów o niskiej homologii w ludzkim ligandzie mpl i

180 765 pohpeptydzie ligandumpl innych ssaków, które dzieląnajwyższąidentyczność sekwencji z ludzkim ligandem mpl. Delecje polipeptyd ligandu mpl ssaka w obszarach o znaczącej homologn ligandem mpl innego ssaka najprawdopodobniej zmodyfikują aktywność biologiczną ligandu mpl w sposób bardziej znaczący. Liczbę kolejnych delecji dobiera się tak, aby zachować trzeciorzędową strukturę ligandu mpl modyfikowanej domenie, np. β-płytkowy arkusz lub a-hehsę.

Insercje sekwencji aminokwasów obejmują amino- i/lub karboksy-końcowe fuzje o wielkości w zakresie od jednej reszty polipeptydu zawierającego 100 lub więcej reszt, a także wewnątrzsekwencyjne insercje jednej lub więcej reszt aminokwasów. Insercje wewnątrzsekwencyjne (np. insercje w sekwencji dojrzałego ligandu mpl) mogą obejmować od około 1 do 10 reszt, jeszcze korzystniej 1 - 5, a najkorzystniej 1-3. Przykładową korzystną fuzję stanowi fuzja ligandu mpl lub jego fragment z inną cytokiną lub jej fragmentem. Do przykładowych insercji końcowych należy dojrzały ligand mpl z N-końcową resztą metionylową, świadczący o bezpośredniej ekspresji dojrzałego ligandu mpl w hodowli zrekombinowanych komórek, oraz fuzja heterologicznej N-końcowej sekwencji sygnałowej z N-końcem cząsteczki dojrzałego ligandu mpl, co ułatwia wydzielanie dojrzałego ligandu mpl ze zrekombinowanych gospodarzy. Takie sekwencje sygnałowe zazwyczaj otrzymuje się z komórek przewidzianego gatunku gospodarza, co zapewnia homologiczność. Do odpowiednich sekwencji należą STII lub Ipp w przypadku E. coli, czynnik a w przypadku drożdży i sygnały wirusowe takie jak herpes gD w przypadku komórek ssaków.

Inne warianty insercyjne cząsteczki ligandu mpl obejmują fuzję z N- lub C-końcem ligandu mpl immunogenicznego polipeptydu (czyli nie endogennego względem gospodarza, do którego wprowadza się fuzję), np. z bakteryjnym polipeptydem takim jak betp-laktamaza lub enzym kodowany przez locus trp E. coli albo białko drożdżowe i C-końcowe fuzje białkami wykazującymi długi okres półtrwama, takimi jak stałe obszary immunoglobulin (lub inne obszary immunoglobuliny), albuminy, lub ferrytyny, jak to opisano w WO 89/02922 opublikowanym 6 kwietnia 1989.

Trzecią grupę wariantów stanowią warianty podstawienia aminokwasów. Warianty te obejmują cząsteczkę ligandu mpl, z których co najmniej jedną resztę aminokwasu została usunięta i najej miejsce wstawiono inną resztę. Do najbardziej interesujących miejsc dla mutagenezy podstawienia należą miejsca zidentyfikowane jako aktywne miejsca ligandu mpl i miejsca, w których aminokwasy znalezione w innych analogach zasadniczo różnią się objętościąłańcuchów bocznych, ładunkiem lub hydrofobowością, ale w których występuje również wysoki stopień identyczności sekwencji w wybranym miejscu między Ugandami mpl w różnych gatunkach i/lub między różnymi zwierzęcymi analogami jednego ligandu mpl.

Do innych interesujących miejsc należą te, w których konkretne reszty w ligandzie mpl otrzymana z różnych elementów rodziny i/lub gatunków zwierząt w jednej grupie są identyczne. Miejsca takie, zwłaszcza przypadające w sekwencji co najmniej trzech innych identycznie zachowanych miejsc, są podstawiane w stosunkowo zachowawczy sposób. Takie zachowawcze podstawienia podano w tabeli 3 w kolumnie korzystnych podstawień. Gdy podstawienia takie spowodują zmianę aktywności biologicznej, bardziej zasadnicze zmiany określone jako podstawienia przykładowe w tabeli 3, a ponadto opisane poniżej w odniesieniu do klas ammokwasów, wprowadza się, po czym produkty selekcjonuje się.

Tabela 3

Reszta wyjściowa	Podstawienia przykładowe	Podstawienia korzystne
1	2	3
Ala (A)	Val, Leu, Ile	Val
Arg(R)	Lys, Gin; Asn	Lys
Asn (N)	Gin; His, Lys; Arg	Gin

180 765

c.d. tabeli 3

1	2	3
Asp (D)	Glu	Glu
Cys(C)	Ser	Ser
Gin (Q)	Asn	Asn
Glu (E)	Asp	Asp
Gly (G)	Pro	Pro
His (H)	Asn; Gin; Lys, Arg	Arg
Ile(I)	Leu; Val; Met; Ala; Phe, norleucyna	Leu
Leu (L)	norleucyna, Ile; Val; Met; Ala; Phe	Ile
Lys(K)	Arg; Gin; Asn	Arg
Met (M)	Leu; Phe; Ile	Leu
Phe (F)	Leu; Val; Ile; Ala	Leu
Pro (P)	Gly	Gly
Ser (S)	Thr	Thr
Thr(T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr	Tyr
Tyr(Y)	Trp, Phe, Thr, Ser	Phe
Val (V)	Ile, Leu; Met; Phe; Ala, norleucyna	Leu

Znaczące modyfikacje w działaniu lub identyczności immunologicznej ligandu mpl uzyskuje się dobierając podstawniki, które różnią się znacząco wpływem na utrzymanie (a) struktury szkieletu polipeptydu w obszarze podstawienia, np. konformacji arkuszowej lub helisowej, (b) ładunku lub hydrofobowości cząsteczek w docelowym miejscu, lub (c) objętości bocznego łańcucha. Występujące w przyrodzie reszty dzieli się na grupy w oparciu o wspólne właściwości bocznych łańcuchów:

(1) hydrofobowe: norleucyna, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) obojętne hydrofilowe. Cys, Ser, Thr;

(3) kwaśne: Asp, Glu;

(4) zasadowe: Asn, Gin, His, Lys, Arg;

(5) reszty wpływające na orientację łańcucha: Gly, Pro; oraz (6) aromatyczne: Trp, Tyr, Phe.

Podstawienia niezachowawcze będą powodowane przez zmiany elementu jednej grupy na element mnej grupy. Takie podstawione reszty można także wprowadzać do miejsc podstawienia zachowawczego lub, jeszcze korzystniej, do pozostałych (nie zachowawczych) miejsc.

Zgodnie z jednym z rozwiązań według wynalazku pożądane jest zdezaktywowanie jednego lub więcej miej sc rozszczepiania przez proteazę, obecnych w cząsteczce. Miej sca te identyfikuje się przeszukując kodowaną sekwencję aminokwasów, np. w przypadku trypsyny na obecność argmmy lub lizyny. Gdy miejsca rozszczepiania przez proteazę zidentyfikuje się, dezaktywuje się rozszczepianie proteolityczne podstawiając docelową resztę inną resztą korzystnie zasadową np. glutaminy albo resztą hydrofobową np. seryny; wycinając resztę; lub wstawiając resztę prolilową bezpośrednio za tą resztą.

W innym wykonaniu, jakiekolwiek reszty metionylowe inne niż początkowa reszta metionylowa w sekwencji sygnałowej, lub jakakolwiek inna reszta zlokalizowana w obrębie około 3 reszt po stronie N lub C każdej z tych reszt metionylowych, podstawia się innymi resz

180 765 tami (korzystnie w oparciu o tabelę 3) lub wycina się. Można także w sąsiedztwie takich miejsc wstawić 1-3 reszty.

Jakąkolwiek resztę cysteiny nie biorącą udziału w utrzymaniu właściwej konformacji ligandu mpl można również podstawić, zazwyczaj seryną aby zwiększyć odporność cząsteczki na utlenianie i zapobiec niewłaściwemu sieciowaniu. Stwierdzono, ze cysteiny pierwsza i czwarta w domenie epo, licząc od końca aminowego, są niezbędne dla utrzymania właściwej konformacji, natomiast trzecia i czwarta nie sąniezbędne. W związku z tym drugą i trzecią cysteinę w domenie epo można podstawić.

Cząsteczki kwasu nukleinowego kodujące sekwencję wanantów aminokwasów ligandu mpl wytwarza się różnymi sposobami znanymi specjalistom. Do sposobów takich należą, ale me wyłącznie, wydzielanie ze źródeł naturalnych (w przypadku występujących w przyrodzie wanantów sekwencji aminokwasów) lub wytwarzanie na drodze mutagenezy z udziałem oligonukleotydów (lub umiejscowionej), mutagenezy PCR i mutagenezy kasetowej wcześniej wytworzonego wanantu lub niewanantowej wersji polipeptydu ligandu mpl.

Mutageneza z udziałem oligonukleotydu stanowi korzystny sposób wytwarzania wariantów podstawienia, delecji i insercji DNA ligandu mpl. Technika ta jest dobrze znana specjalistom i opisana przez Adelmana i innych, DNA, 2: 183 [1983]. W skrócie DNA hgand mpl zmienia się na drodze hybrydyzacji oligonukleotydu kodującego pożądaną mutację z matrycą DNA, przy czym matrycę stanowi jednoniciowa forma plazmidu lub bakteriofagu zawierająca nie zmienioną lub natywnąsekwencję DNA ligandu mpl. Po hybrydyzacji stosuje się polimerazę DNA do zsyntetyzowama pełnej drugiej komplementarnej nici matrycy, która zawierać będzie dzięki temu ohgonukleotydowy starter i będzie kodować wybraną zmianę DNA hgand mpl.

Zazwyczaj stosuje się oligonukleotydy zawierające najmniej 25 nukleotydów. Optymalny oligonukleotyd będzie zawierać 12-15 nukleotydów, które są w pełni komplementarne z matrycą po obydwu stronach jednego lub więcej nukleotydów kodujących mutację. Powoduje to, że oligonukleotyd będzie prawidłowo hybrydyzować z matrycową cząsteczką jednoniciowego DNA. Oligonukleotydy łatwo wytwarza się stosując techniki znane specjalistom, takie jak opisana przez Crea'ę i innych, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 : 5765 [1978]

Matryca DNA może być wytwarzana przez te wektory, które albo pochodzą z wektorów bakteriofagu Ml3 (odpowiednie są dostępne w handlu wektory M13mpl8 i M13mpl9) lub zawierające jednoniciowy fagowy początek replikacji, które opisali Viera i inni, Meth. Enzymol., 153 : 3 [1987]. I tak DNA, który ma być zmutowany, można wstawić do jednego z takich wektorów jednomciową matrycę. Wytwarzanie jednoniciowej matrycy opisano w sekcjach 4.21-4.41 pracy Sambrook i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manuał (Cold Spring Harbor Laboratory Press, ΝΎ 1989).

Alternatywnie jednoniciową matrycę DNA otrzymać można przez denaturację dwuniciowego plazmidowego (lub innego) DNA stosując standardowe techniki.

Aby zmienić natywnąsekwencję DNA (np. w celu wytwarzania wanantów sekwencji aminokwasów) oligonukleotyd hydrydyzuje się z jednoniciową matrycą w odpowiednich warunkach hybrydyzacji. A enzym polimeryzujący DNA, zazwyczaj fragment Klenowapohmerazy DNA 1, następnie dodaje się w celu zsyntetyzowama nici komplementarnej względem matrycy stosując oligonukleotyd jako starter w syntezie. Powstaje w ten sposób cząsteczka heterodupleksowa, w której jedna nić DNA koduje zmutowaną formę ligandu mpl, a druga nić (wyjściowa matryca) koduje natywną nie zmienioną sekwencję ligandu mpl. Taką heterodupleksową cząsteczką transformuje się następnie odpowiednią komórkę gospodarza, zazwyczaj a prokanotu takiego jakE. coli JM101. Po wyhodowaniu komórki nanosi się na płytki agarozowe i selekcjonuje stosując ohgonukleotydowy starter radioznaczony 32-fosforanem w celu zidentyfikowania kolonu bakteryjnych, które zawierają zmutowany DNA. Zmutowany obszar usuwa się następnie i umieszcza w odpowiednim wektorze do wytwarzania białka, zazwyczaj w wektorze ekspresji typu najczęściej stosowanego do transformowania odpowiedniego gospodarza.

Powyższy sposób można zmodyfikować tak, że wytwarza się homodupleksowe cząsteczki, w których obydwie mci plazmidu zawierają mutację (mutacje). Modyfikację wykonuje się w

180 765 sposób następujący: Jednoniciowy ohgonukleotydhybrydyzuje się z jednoniciowąmatrycą jak to opisano powyżej. Mieszanmę 3 dezoksyrybonukleotydów, dezoksyryboadenozyny (dATP), dezoksyryboguanozyny (dGTP) i dezoksyrybotymidyny (dTTP), łączy się z modyfikowaną tiodezoksyrybocytozyną określaną jako dCTP-(aS) (którą można otrzymać Amersham Corporation). Mieszaninę tą dodaje się do kompleksu matryca-ohgonukleotyd. W wyniku dodania polimerazy DNA do tej mieszaniny powstaje nić DNA identyczna z matrycą z wyjątkiem zmutowanych zasad. Ponadto taka nowa nić DNA będzie zawierać dCTP-(aS) zamiast DCTP, co chroni ją przed trawieniem endonukleazami restrykcyjnymi.

Po nacięciu nici matrycy dwuniciowego heterodupleksu odpowiednim enzymem restrykcyjnym, nić matrycy można strawić nukleaząExoin inną odpowiednią nukleazą poza obszarem zawierającym miejsce (miejsca) przeznaczone do mutowania. Następnie reakcję przerywa się uzyskując cząsteczkę, która jest tylko w części jednoniciową. Następnie wytwarza się pełny dwuniciowy homodupleks DNA stosując polimerazę DNA w obecności wszystkich 4 trifosforanów dezoksyrybonukleotydów, ATP i ligazy DNA. Takąhomodupleksową cząsteczką można następnie transformować odpowiednią komórkę gospodarza taką jak E. coli JM 1 01, jak to opisano powyżej.

DNA kodujący mutanty ligandu mpl z podstawieniem więcej niż jednego aminokwasu wytworzyć można jednym z szeregu sposobów. Gdy aminokwasy znajdują się blisko siebie w łańcuchu pohpeptydowym, można je zmutować równocześnie stosując jeden ohgonukleotyd, który koduje wszystkie pożądane podstawienia aminokwasowe. Jeśli jedne aminokwasy znajdują się w pewnej odległości jeden od drugiego (rozdzielone więcej niż około 10 aminokwasami), trudno jest uzyskać pojedynczy oligonukleotyd, który koduje wszystkie pożądane zmiany Można wówczas zastosować jeden z dwóch wariantowych sposobów.

Zgodnie z pierwszym sposobem odrębny ohgonukleotyd wytwarza się dla każdego z podstawianych aminokwasów. Następnie ohgonukleotydy hybrydyzuje się równocześnie z jednomciowym matrycowym DNA i drugą nić DNA zsyntetyzowaną z matrycy, koduje wszystkie pożądane podstawienia aminokwasowe.

Wariantowy sposób obejmuje dwie lub więcej rund mutagenezy w celu wytworzenia pożądanego mutanta. Pierwsza runda jest taka sama jak w przypadku pojedynczych mutantów· DNA dzikiego typu stosuje się jako matrycę, oligonukleotyd kodujący pierwszy pożądane podstawienie (podstawienia) aminokwasowe hybrydyzuje się z tą matrycą i wytwarza się heterodupleksową cząsteczkę DNA. W drugiej rundzie mutagenezy stosuje się zmutowany DNA wytworzony w pierwszej rundzie mutagenezy jako matrycę. W związku z tym matryca ta już zawierajednąlub więcej mutacji. Następnie ohgonukleotyd kodujący dodatkowe pożądane podstawienie (podstawienia) aminokwasowe hybrydyzuje się następnie z tą matrycą uzyskując nić DNA, która koduje mutacje zarówno z pierwszej jak i drugiej rundy mutagenezy. Uzyskany DNA można zastosować jako matrycę w trzeciej rundzie mutagenezy itd.

Mutageneza PCR jest również przydatna do wytwarzania aminokwasowego wariantu pohpeptydu ligandu mpl. Choć poniższy opis odnosi się do DNA, należy zdawać sobie sprawę, że technika ta znajduje zastosowanie również w odniesieniu do RNA. Technika PCR zazwyczaj dotyczy zazwyczaj następującej procedury (patrz Erhch, supra, rozdział napisany przez R. Higuchfego, str. 61-70)· Gdy małe ilości matrycowego DNA stosuje się jako materiał wyjściowy w PCR, startery różniące się nieznacznie sekwencją od odpowiedniego obszaru w matrycy DNA można zastosować do wytwarzania stosunkowo dużych ilości określonego fragmentu DNA różniącego się od sekwencji matrycy tylko w pozycjach, w których starter różni się od matrycy. W celu wprowadzenia mutacji do plazmidowego DNA jeden ze starterów konstruuje się tak, aby pokrywać miejsce mutacji i zawierał mutację; sekwencja innego startera musi być identyczna z odcinkiem sekwencji przeciwnej mci plazmidu, ale sekwencja ta może być zlokalizowana w dowolnym miejscu wzdłuż plazmidowego DNA. Korzystna jednak sekwencja drugiego startera znajduje się w obszarze 200 nukleotydów pierwszego, na końcu cały zamphfikowany obszar DNA związany przez starter można łatwo poddać sekwencjonowaniu. W amphfikacji PCR z zastosowaniem pary starterów, podobnie jak w opisanym przypadku jednego startera, uzyskuje

180 765 się populację fragmentów DNA różniących się w pozycji mutacji określonej przez starter i ewentualnie w innych pozycj ach, gdyż kopiowanie matrycy j est w pewnym stopniu podatne na błędy.

Gdy stosunek matrycy do wytwarzanego materiału wyjątkowo niski, większość fragmentów wytwarzanego DNA zawiera pożądane mutacje. Taki materiał stosuje się do zastępowania odpowiedniego obszaru in plazmidzie, który służy jako matryca PCR przy stosowaniu standardowej technologii DNA. Mutacje w odrębnych pozycjach można wprowadzić równocześnie stosując drugi starter metantowy, lub przeprowadzając drugą PCR z innym starterem mutantowym i logowanie równoczesne dwóch uzyskanych fragmentów PCR fragment u wektora w trój- (lub więcej) częściowym ligowaniu.

• W specyficznym przykładzie mutagenezy PCR matrycowy DNA plazmidu (1 pg) hnearyzuje się przez trawienie endonukleazą restrykcyjną dla której unikatowe miejsce rozpoznawania występuje w plazmidowym DNA poza obszarem, który ma być amplifikowany. 100 ng tego materiału dodaje się do mieszaniny PCR zawierającej bufor PCR, który zawiera 4 trifosforany dezoksynukleotydów i znajduje się w zestawach GeneAmps (otrzymanych z Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT i Emeryville, CA), oraz po 25 pmoli każdego ze starterów oligonukleotydowych, w ostatecznej objętości 50 μΐ. Mieszaninę reakcyjną zalewa się 35 μΐ oleju mineralnego. Mieszaninę reakcyjnąpoddaje się denaturacji przez 5 minut w 100°C, wstawia na krótko do lodu i dodaje się 1 μΐ DNA polimerazy Thermus aąuaticus (Tag) (5 jednostek/μΐ, dostępna z PerkmElmer Cetus) dodaje się pod warstwę oleju mineralnego. Mieszaninę reakcyjną wstawia się następnie do aparatu DNA Thermal Cycler (dostępnego z Perkin-Elmer Cetus), zaprogramowanego następująco:

minuty 55°C s 72°C, potem 19 następujących cykli:

s 94°C

30s55°Ci s 72°C.

Po zakończeniu programu fiolkę reakcyjną wyjmuje się z aparatu i fazę wodnąprzenosi się do nowej fiolki, ekstrahuje mieszaniną fenol/chloroform (50:50 objętościowo), wytrąca się etanolem i DNA odzyskuje się w zwykły sposób. Materiał ten poddaje się następnie odpowiednim obróbkom w celu wykonania insercji w wektorze.

Inny sposób wytwarzania wariantów, mutageneza kasetowa, oparty jest na technice, którą opisali Wells i inni, Gene, 34: 315 [1985], Wyjściowym materiałem jest plazmid (lub inny wektor) obejmując DNA imitowanego ligandu mpl. Kodon(y) w DNA imitowanego ligandu mpl zidentyfikowane. Musi istnieć unikatowe miejsce dla endonukleazy restrykcyjnej po każdej stronie zidentyfikowanego miejsca (miejsc) mutacji. Gdy nie ma takich miejsc restrykcji, można je wytworzyć przeprowadzając powyżej opisaną metodę mutagenezy z udziałem oligonukleotydu do wprowadzenia ich w odpowiednie miejsca w DNA ligandu mpl. Po wprowadzeniu miejsc restrykcji do plazmidu, plazmid rozcina się w tych miejscach w celu zlinearyzowania. Dwuniciowy ohgonukleotyd kodujący sekwencję DNA pomiędzy miejscami restrykcji, ale zawierający pożądane mutacje, syntetyzuje się stosując standardowe procedury. Dwie nici syntetyzuje się osobno, po czym hybrydyzuje się je razem stosując standardowe techniki. Taki dwuniciowy ohgonukleotyd określany jest jako kaseta. Kaseta ta jest zaprojektowana tak, że zawiera końce 3' i 5' kompatybilne z końcami linearyzowanego plazmidu, tak że można ją bezpośrednio zligować z plazmidem. Plazmid taki zawiera wówczas zmutowaną sekwencję DNA ligandu mpl.

C. Insercja kwasu nukleinowego w wektorze replikacji

Kwas nukleinowy (np. cDNA lub genomowy DNA) kodujący natywny lub wariantowy polipeptyd ligandu mpl wstawia się do wektora ulegającego replikacji do przeprowadzenia następnie klonowania (amplifikacji DNA) lub do ekspresji. Dostępnych jest wiele wektorów, a selekcja odpowiedniego wektora będzie zależeć od (1) czy ma być on zastosowany do amphfikacji DNA, czy też do ekspresji DNA, (2) wielkości kwasu nukleinowego wstawianego do wektora i (3) komórki gospodarza, która ma być transformowana wektorem. Każdy wektor zawiera różne składniki, zależnie od przeznaczenia (amplifikacji DNA lub ekspresji DNA) i od

180 765 komórki gospodarza, z którym jest kompatybilny. Składniki wektora zazwyczaj obejmują, ale nie wyłącznie, jeden łub więcej z następujących elementów: sekwencję sygnałową, źródło replikacji, jeden lub więcej genów markerowych, element enhancera, promotor i sekwencję terminacji transkrypcji.

(i) Składnik sekwencji sygnałowej

Ligand mpl według wynalazku może być wytworzony w wyniku ekspresji nie tylko bezpośrednio, ale także jako fuzja z heterologicznym polipeptydem, korzystnie z sekwencją sygnałową lub innym polipeptydem zawierającym specyficzne miejsce rozszczepianie na końcu N dojrzałego białka lub polipeptydu. Zazwyczaj sekwencja sygnałowa może stanowić składnik wektora, lub może być częścią DNA ligandu mpl wstawianą do wektora. Należy wybrać taką heterologiczną sekwencję sygnałową, która jest rozpoznawana i przetwarzana (np. rozszczepiana przez peptydazę sygnałową w komórce gospodarza. W przypadku prokanotycznych komórek gospodarza, które nie rozpoznają i nie przetwarzają sekwencji sygnałowej natywnego hgandu mpl, sekwencję sygnałową zastępuje się prokariotyczną sekwencją sygnałową wybraną np. z grupy fosfataz alkalicznych, penicylinazy, i liderów termostabilnej enterotoksyny II. Do wydzielania w drożdżach natywną sekwencją sygnałową można zastąpić np. inwertazą drożdżową, czynnikiem a lub liderami fosfatazy kwasowej, liderem glukoamylazy C. albicans (EP 362 179, opublikowany 4 kwietnia 1990) lub sygnałem opisanym w WO 90/13646, opublikowanym 15 listopada 1990. W przypadku komórek ssaków zadowalające wyniki daje ekspresja natywnej sekwencji sygnałowej (czyli presekwencji ligandu mpl, która zwykle kieruje wydzielaniem hgandu mpl z jego natywnych komórek in vivo), choć odpowiednie mogąbyć także inne sekwencje sygnałowe ssaków, takie jak sekwencje sygnałowe z innego polipeptydu hgandu mpl lub z tego samego ligandu mpl z innego gatunku zwierząt, sekwencje sygnałowe z hgandu mpl i sekwencje sygnałowe z wydzielonego polipeptydu z tego samego lub spokrewnionego gatunku, a także wirusowe hdery wydzielania, np. z sygnału gD herpes simplex (ii) Początek składnika replikacji

Wektory zarówno ekspresji jak i klonowania zawierają sekwencję kwasu nuklemowego, która umożliwia replikację wektora w jednej lub więcej wybranych komórkach gospodarza. Zazwyczaj w wektorach klonowania jest to taka sekwencja, która umożliwia replikację wektora niezależnie od chromosomowego DNA gospodarza i obejmuje źródła replikacji łub sekwencje ulegające autonomicznej replikacji. Takie sekwencje są dobrze znane dla różnych bakterii, drożdży i wirusów. Początek replikacji z plazmidu pBR322 jest odpowiedni dla większości gramo-ujemnych bakterii, plazmidowy początek 2 μ jest odpowiedni dla drożdży, a różne początki wirusowe (SV40, pohoma, adenowirus, VSV lub BPV) są przydatne do klonowania wektorów komórkach ssaków. Zazwyczaj początek składnika replikacji nie jest konieczny w przypadku wektorów ekspresji ssaków (początek SV40 może być zazwyczaj stosowany tylko dlatego, że zawiera wczesny promotor).

Większość wektorów ekspresji stanowią „bifunkcjonalne” wektory, czyli takie które są zdolne do replikacji w co najmniej jednej klasie organizmów, ale mogąbyć transfekowane do innego organizmu w celu doprowadzenia do ekspresji. Tak np. wektor klonowany jest w E. coli, a następnie ten sam wektor jest transfekowany do komórek drożdży lub ssaka w celu doprowadzenia do ekspresji, nawet jeśli nie jest on zdolny do replikacji niezależnie chromosomu komórki gospodarza.

Amplifikację DNA osiągnąć można także na drodze insercji do genom gospodarza. Uzyskuje się to łatwo stosując gatunki Bacillus jako gospodarzy, np. wprowadzając do wektora sekwencję DNA komplementarną z sekwencją występującą w genomowym DNA Bacillus. W wyniku transfekcji Bacillus tym wektorem uzyskuje się homologiczną rekombinację z genomem i insercję DNA mpl. Jednakże odzyskiwanie genomowego DNA kodującego ligand mpl jest bardziej skomplikowane niż wektora zreplikowanego egzogennie, gdyż trawienie enzymem restrykcyjnym jest niezbędne do wycięcia DNA ligandu mpl.

180 765 (iii) Dobór składnika genowego

Wektory ekspresji i klonowania powinny zawierać gen selekcji, określany również jako selekcyjny marker. Gen ten koduje białko niezbędne do przeżycia lub wzrostu transformowanych komórek gospodarza hodowanych na selektywnej pożywce. Komórka gospodarza me transformowana wektorem zawierającym gen selekcji nie przeżyje w ośrodku hodowli. Typowe geny selekcji kodująbiałka, które (a) nadają odporność na antybiotyki lub inne toksyny, np. ampicylinę, neomycynę, metotreksan lub tetracyklinę, (b) uzupełniają deficyty autotroficzne lub (c) dostarczają istotnych składników odżywczych niedostępnych w złożonym ośrodki, np. gen kodujący racemazę D-alaniny dla Bacilh.

W jednym z przykładowych schematów selekcji wykorzystuje się lek do zatrzymania wzrostu komórek gospodarza. Te komórki, które z powodzeniem transformowano heterologicznym genem, który w wyniku ekspresji wytwarza białko nadające odporność na lek, przeżywająprocedurę selekcji. Przykładowo w takiej dominantowej selekcji stosuje się jako leki neomycynę (Southern i inni, J. Molec Appl. Genet., 1:327 [1982]) kwas mikofenolowy (Mulligan i inni, Science, 209 : 1422 [1980]) lub higromycynę (Sugden i inni, Mol. Celi. Biol., 5: 410-413 [1985]). W 3 podanych wyżej przykładach stosuje się bakteryjne geny pod kontrolą eukariotyczną w celu nadania odporności na odpowiedni lek, G418 lub neomycynę (genetycynę), xgpt (kwas mikofenolowy) lub higromycynę.

Do przykładowych innych odpowiednich selekcyjnych markerów dla komórek ssaków należą te, które umożliwiają identyfikację komórek konkurujących w przechwytywaniu kwasu nukleinowego, np. reduktaza dihydrofolanu (DHFR) lub kmaza tymidynowa. Transformanty komórek ssaków umieszcza się pod ciśnieniem selekcyjnym, tak że tylko transformanty są absolutnie przystosowane do przeżycia z uwagi na przejęty marker. Ciśnienie selekcyjne wytwarza się hodując transformanty w warunkach, w których kolejno zmienia się stężenie wybranego środka, co prowadzi do amphfikacji zarówno genu selekcyjnego jak i DNA kodującego pohpeptyd ligandu mpl. Amplifikacja jest procesem, w którym geny o większym zapotrzebowaniu na wytwarzanie białka o decydującym znaczeniu dla wzrostu powtarzające łączą się w tandemy z chromosomami kolejnych generacji zrekombinowanych komórek. Zwiększone ilości hgandu mpa syntetyzowane są na amplifikowanym DNA.

Tak np. komórki transformowane genem selekcji DHFR najpierw identyfikuje się hodując wszystkie transformanty na pożywce zawierającej metotreksan (Mtx), konkurencyjnego antagonistę DHFR. Odpowiednią komórką gospodarza przy stosowaniu DHFR dzikiego typu są linie komórekjajowych chomika chińskiego (CHO) nie wykazujące aktywności DHFR, wytworzone i hodowane w sposób opisany przez Urlauba i Chasina, Proc. NatL Acad. Sci. USA, 77: 4216 [1980], Transformowane komórki wystawia się następnie na działanie zwiększonych poziomów Mtx. Prowadzi to do syntezy wielu kopii genu DHFR oraz, równocześnie, wielu kopii innego DNA zawierającego wektory ekspresji, takiego jak DNA kodujący hgand mpl. Taką technikę amplifikacji zastosować można w odniesieniu do jakiegokolwiek innego odpowiedniego gospodarza, np. ATCC nr CCL61 CHO-KL, pomimo obecności endogennego DHFRjest stosuje się np. mutant genu DHFR wysoce odporny na Mtx (EP 117 060). Alternatywnie komórki gospodarza [zwłaszcza gospodarza dzikiego typu, zawierające endogenny DHFR] transformowane lub współ-transformowane sekwencjąDNA kodującąligand mpl, dzikiego typu białko DHFR i inny selekcyjny marker taki jak 3'-fosfotransferaza (APH) można wyselekcjonować hodując komórki na pożywce zawierającej środek selekcyjny dla selekcyjnego markera, taki jak antybiotyk aminoglikozydowy, np. kanamycynę, neomycynę lub G418. Patrz patent USA nr 4 965 199

Odpowiednim genem selekcyjnym do stosowania w drożdżach jest gen trpl obecny w plazmidzie drozdżowym YRp7 (Stinchcomb i inni, Naturę, 282: 39 [1979]; Kingsman i inni, Gene, 7: 141 [1979]; lub Tschemperi inni, Gene, 10: 157 [1980]). Gen trpl stanowi marker selekcyjny dla szczepu mutantowego drożdży nie wykazującego zdolności do wzrostu w tryptofanie, np. ATCC nr 44076 lub PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 [1977]). Obecność uszkodzenia trpl w genomie drozdżowej komórki gospodarza genomu zapewnia odpowiednie środowisko wykrywania transformacji poprzez wzrost w nieobecności tryptofanu. Podobnie szczepy drożdży nie

180 765 zawierające Leu2 (ATCC No. 20,622 lub 38,626) są uzupełniane przez znane plazmidy przenoszące gen Leu2.

(iv) Składnik promotora

Wektory ekspresji i klonowania zazwyczaj zawierają promotor, który jest rozpoznawany przez organizm gospodarza i jest operacyjnie połączony z kwasem nukleinowym hgandu mpl Promotor stanowią nietranslatowane sekwencje zlokalizowane (5') względem kodonu startu genu strukturalnego (zazwyczaj o około 100 to 1000 bp), które kontrolują transkrypcję i translację określonej sekwencji kwasu nukleinowego, takiej jak sekwencja kwasu nukleinowego hgandu mpl, z którą są operacyjnie połączone. Promotory zazwyczaj należą do dwóch klas, indukcyjnych i konstytutywnych. Promotory indukcyjne są promotorami, które inicjują wzrost transkrypcji z DNA pod ich kontrolą w reakcji na pewne zmiany w warunkach hodowli, np. w obecności lub nieobecności składnika odżywczego lub przy zmianie temperatury. Obecnie znanych jest wiele promotorów rozpoznawanych przez wiele potencjalnych komórek gospodarza. Promotory te są operacyjnie połączone z DNA kodującym ligand mpl poprzez usunięcie promotora ze źródła DNA przez trawienie enzymem restrykcyjnym i wstawienie sekwencji wydzielonego promotora do wektora. Zarówno sekwencję promotora ligandu mpl jak i wiele heterologicznych promotorów można zastosować do kierowania amplifikacji i/lub ekspresji DNA hgandu mpl. Jednakże heterologiczne promotory są korzystne, gdyż zazwyczaj umożliwiająone większą transkrypcję i wyższe wydajności wytworzonego w wyniku ekspresji hgandu mpl w porównaniu z natywnym promotorem hgandu mpl.

Do promotorów odpowiednich do stosowania z prokariotycznymi gospodarzami należą układy promotorów β-laktamazy i laktozy (Chang i inni, Naturę, 275: 615 [1978]; oraz Goeddeli inni, Naturę, 281: 544 [1979]), fosfataza alkaliczna, układ promotora tryptofanu (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 [1980] i EP 36,776) i hybrydowe promotory takie jak promotor tac (deBoer i mni, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 [1983]). Odpowiednie sąjednak również inne znane promotory bakteryjne. Ich sekwencje nukleotydów zostały opublikowane, co umożliwia specjaliście operacyjnie zhgować je z DNA kodującym ligand mpl (Siebenlist i inni, Celi, 20: 269 [1980]) stosując linkery lub adaptory w celu dostarczenia dowolnych odpowiednich miejsc restrykcji. Promotory do stosowania w układach bakteryjnych zawierają również sekwencję Shine-Daigamo (S.D.) operacyjnie połączoną z DNA kodującym polipeptyd hgandu mpl.

Znane są sekwencje promotorów dla eukariotów. Praktycznie wszystkie eukariotyczne geny zawierają wzbogacony w AT obszar zlokalizowany około 25 - 30 zasad w górę od miejsca, w którym inicjowana jest transkrypcja. Inną sekwencję znajdującą się 70 - 80 zasad w górę od startu transkrypcji w wielu genach jest obszar CXCAAT, w którym X może stanowić dowolny nukleotyd. Na końcu 3' większości genów eukariotycznych znajduje się sekwencja AATAAA, która może stanowić sygnał dla dodawania ogona poh A do końca 3' sekwencji kodującej. Wszystkie te sekwencje nadają się do wstawiania do eukariotycznych wektorów ekspresji.

Do przykładowych odpowiednich sekwencji promotorowych do stosowania w drożdżowych gospodarzach należą promotory kinazy 3-fosfogliceranu (Hitzeman i inni, J. Biol. Chem., 255' 2073 [1980]) lub inne enzymy ghkolityczne (Hess i inni, J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 [1968]; oraz Holland, Biochemistry, 17: 4900 [1978]), takie jak enolaza, dehydrogenaza 3-fosforanu aldehydu ghcerylowego, heksokinaza, dekarboksylaza pirogronianowa, fosfofruktokinaza, izomeraza 6-fosforanu glukozy, mutaza 3-fosfoghceranu, kinaza pirogronianu, izomeraza tnozofosforanu, izomeraza fosfoglukozowa i glukokinaza.

Innymi drożdżowymi promotorami, które są indukowanymi promotorami wykazującymi dodatkową zaletę transkrypcji kontrolowanej przez warunki wzrostu są obszary promotorowe dehydrogenazy alkoholowej 2, izocytochrom C, fosfataza kwasowa, enzymy degradacyjne związane z metabolizmem azotu, metalotioneina, dehydrogenaza 3-fosforanu aldehydu ghcerylowego i enzymy odpowiedzialne za wykorzystanie maltozy i galaktozy. Odpowiednie wektory i promotory do stosowania w ekspresji w drożdżach sąponadto opisane przez Hitzemana i innych, EP 73 657A. Dogodnie z drożdżowymi promotorami stosuje się również drożdzowe enhancery.

180 765

Transkrypcja ligandu mpl z wektorów w komórkach ssaków jako gospodarzu kontrolowana jest np. przez promotory otrzymane z genomów wirusów takich jak wirus poliom, wirus ospy drobiu (UK 2 211 504 opublikowany 5 lipca 1989), adenowirus (taki jak adenowirus 2), wirus motyhcy bydlęcej, wnuś mięsaka ptasiego, cytomegalowirus, retrowirus, wirus zapalenia wątroby B, a najkorzystniej wirus małpi 40 (SV40), przez heterologiczne promotory ssaków, np. promotor aktynowy lub promotor immunoglobuliny, przez promotory szoku termicznego i promotor zwykle związany z sekwencją ligandu mpl, pod warunkiem, że takie promotory są kompatybilne z układami komórek gospodarza.

Wczesne i późne promotory wirusa SV40 dogodnie otrzymuje się jako fragment restrykcji SV40, który zawiera również początek replikacji z wirusa SV40. Fiers i inni, Naturę, 273. 113 [178]; Mulhgan i Berg, Science, 209: 1 4221427 [1980]; Pavlakis i inni, proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 7398-7402 [1981]. Natychmiastowy wczesny promotor ludzkiego cytomegalowirusa dogodnie otrzymuje sięjako fragment restrykcyjny HindlllE. Greenaway i inni, Gene, 18:355-360 [1982], Układ do ekspresji DNA w ssakach-gospodarzach z zastosowaniem wirusa motyhcy bydlęcej jako wektora ujawniony jest w patencie USA nr 4 419 446. Modyfikację tego układu opisano w patencie USA nr 4 601 978. Patrz także Gray i inni, Naturę, 295: 503-508 [1982] odnośnie ekspresji cDNA kodującego interferon odpornościowy w komórkach małpy; Reyes i inni, Naturę, 297: 598-601 [1982] odnośnie ekspresji cDNA ludzkiego β-interferonu cDNA w komórkach myszy pod kontrolą promotora kinazy tymidynowej z wirusa herpes simplex; Canaani i Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 5166-5170 [1982] odnośnie ekspresji ludzkiego genu interferonu βΐ w hodowanych komórkach myszy i królika; i Gorman i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 6777-6781 [1982] odnośnie ekspresji bakteryjnych sekwencji CAT w komórkach CV-1 nerki małpy, fibroblastach zarodka kurzego, komórkach jajowych chińskiego chomika, komórkach HeLa i mysich komórkach NIH-3T3 z zastosowaniem długiej końcowej powtórki wirusa mięsaka Rous jako promotora.

(v) Składnik w postaci enhancera

Transkrypcję DNA kodującego ligand mpl według wynalazku przez wyższe eukanoty często zwiększa się przez wstawienie sekwencji enhancera do wektora. Enhancery są cisdziałającymi elementami DNA, zazwyczaj o około 10 - 300 bp, które działają na promotor zwiększając jego transkrypcję. Enhancery względnie niezależne od orientacji i położenia znaleziono w położeniu 5' (Laimins i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 [ 1981 ]) i 3' względem jednostki transkrypcji (Lusky i inni, Mol. Celi Bio., 3:1108 [1983]), w intronie (Baneiji i inni, Celi, 33: 729 [1983]), a także w samej sekwencji kodującej (Osbome i inni, Mol. Celi Bio., 4: 1293 [1984]) Obecnie znanych jest wiele sekwencji enhancerowych pochodzących z różnych genów ssaka (globiny, elastazy, albuminy, białka płodowego i insuliny). Zazwyczaj jednak stosuje się enhacer wirusów komórek eukariotycznych. Przykładowo wymienić można enhancer SV40 po późnej stronie początku replikacji (bp 100-270), enhancer wczesnego promotora cytomegalowirusa, enhancer poliomy po późnej stronie początku replikacji i enhancer adenowirusowy. Patrz także Yaniv, Naturę, 297: 17-18 [1982] odnośnie elementów wzmacniających promotory eukariotyczne. Enhancer może zostać rozszczepiony na wektor w pozycji 5' lub 3' względem sekwencji kodującej ligand mpl, ale korzystnie zlokalizowany jest w miejscu 5' od promotora.

(vi) Składnik w postaci terminatora transkrypcji

Wektory ekspresji stosowane w eukariotycznych komórkach gospodarza (drożdży, grzybów, owadów roślin, zwierząt, ludzi lub komórek zawierających jądra innych organizmów wielokomórkowych) zawierają ponadto sekwencje niezbędne terminacji transkrypcji i stabilizacji mRNA. Sekwencje takie stanowią zazwyczaj metranslatowane obszary 5' i ewentualnie 3' eukariotycznych lub wirusowych DNA lub cDNA. Obszary te zawierają segmenty nukleotydów transkrybowane jako poliadenylowane fragmenty w nietranslatowanej części mRNA kodującego ligand mpl.

(vii) Konstrukcja i analiza wektorów

Przy konstruowaniu odpowiednich wektorów zawierających jeden lub więcej z wyżej wymienionych składników wykorzystuje się standardowe techniki ligowania. Wydzielone plaż

180 765 midy lub fragmenty DNA rozszczepia się, dopasowuje i ponownie liguje w postaci wymaganej w celu wytworzenia pożądanych plazmidów.

W analizie w celu potwierdzenia prawidłowości sekwencji w uzyskanych plazmidach mieszaniny ligacyjne stosuje się do transformowania szczepu E. coli KI2 294 (ATCC No. 31 446) wybierając korzystne transformanty na podstawie odporności na ampicylinę lub tetracyklinę, zależnie od sytuacji. Plazmidy z transformantów wytwarza się, analizuje przez trawienie endonukleazami restrykcyjnymi i/lub sekwencjonuje metodąMessinga i innych, Nucleic Acids Res., 9:309 [1981] lub metodąMaxama i innych, Methods m Enzymology, 65: 499 [1980].

(viii) Przejściowe wektory ekspresji

Szczególnie przydatne w realizacji wynalazku są wektory ekspresji zapewniające przejściową ekspresję w komórkach ssaka DNA kodującego polipeptyd ligandu mpl. Zazwyczaj przejściowa ekspresja obejmuje zastosowanie wektora ekspresji zdolnego do wydajnej replikacji w komórce gospodarza, tak że komórka gospodarza nagromadza wiele kopii wektora ekspresji i z kolei syntetyzuje w dużych ilościach pożądany polipeptyd kodowany przez wektor ekspresji. Sambrook i inni, supra, str. 16.17-16.22. Układy przejściowej ekspresji obejmujące odpowiedni wektor ekspresji i komórkę gospodarza, umożliwiają dogodną dodatnią identyfikację polipeptydu kodowanego przez klonowane DNA, a także szybkie selekcjonowanie takiego polipeptydu pod względem pożądanych właściwości biologicznych lub fizjologicznych. W związku z tym przejściowe układy ekspresji są szczególnie przydatne według wynalazku w celu identyfikacji tych analogów i wariantów polipeptydu hgandu mpl, które wykazują aktywność biologiczną polipeptydu hgandu mpl.

(ix) Odpowiednie przykładowe wektory komórek kręgowców

Inne sposoby, wektory i komórki gospodarza nadające się do wykorzystania w syntezie hgandu mpl w hodowli zrekombinowanych komórek kręgowców opisali Gethmg i inni, Naturę, 293: 620-625 [1981]; Mantel i inni, Naturę, 281 : 40-46 [1979]; Levinson i inni; EP 117 060; i EP 117 058. Szczególnie przydatny plazmid do ekspresji hgandu mpl w hodowli komórek ssaka stanowi pRK5 (EP 307 247 patent USA nr 5 258 287) łub pSV16B (publikacja PCT nr WO 91/08291).

D. Dobór i transformowanie komórek gospodarza

Odpowiednie komórki gospodarza do klonowania lub ekspresji wektorów stanowią prokanoty, drożdże lub wyższe eukariotyczne komórki opisane powyżej. Do odpowiednich prokanotów należą eubakterie takie jak gramo-ujemne lub gramo-dodatme organizmy, np. E. coli, Bacilli takie jak B. subtilis, gatunki Pseudomonas takie jak P. aeruginosa, Salmonella typhimunum lub Serratia marcescans. Jednym z korzystnych gospodarzy klonowania E. coli jest E. coli 294 (ATCC nr 31 446), choć można także zastosować inne szczepy takie jak E. coli B, E. coli XI776 (ATCC nr 31 537) i E. coli W3110 (ATCC nr 27 325). Przykłady te podano w celu zilustrowania, a nie ograniczenia wynalazku. Korzystnie komórka gospodarza powinna wydzielać minimalne ilości enzymów proteolitycznych. Przydatne są także metody in vitro klonowania, np. PCR lub inne reakcje polimerazowe kwasów nukleinowych.

Oprócz prokariotów także eukariotyczne drobnoustroje, takie jak włókmakowe grzyby lub drożdże są odpowiednimi gospodarzami dla wektorów kodujących ligand mpl. Saccharomyces cerevisiae lub zwykłe drożdże piekarskie są najczęściej stosowanymi niższymi eukariotycznymi gospodarzami drobnoustrojowymi. Dostępnych jest jednak i przydatnych szereg innych rodzajów, gatunków i szczepów, takich jak Schizosaccharomyces pombe (Beach i Nurse, Naturę, 290: 140 [1981]; EP 139 383 opublikowany 2 maja 1985), gospodarze Kluyveromyces (patentUSA nr 4 943 529) takie jak np. K. lactis (Louvencourt i mni, J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragihs, K. bulgaricus, K. thermotolerans i K. marxianus, yarrowia [EP 402 226], Pichia pastons (EP 183 070; Sreekrishna i mm, J. Basic Microbiol., 28 : 265-278 [1988]), Candida, Trichoderma reesia (EP 244 234), Neurospora crassa (Case i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979] i grzyby włókniakowe takie jak np. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 opublikowany 10 stycznia 1991) i gospodarze Aspergillus tacy jak A. nidulans (Ballance i mni, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112' 284-289 [1983]; Tilbum i inni, Gene, 26: 205-221

180 765

[1983]; Yelton i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) i A. mger (Kelly i Hynes, EMBO L, 4 475-479 [1985]).

Odpowiednie komórki gospodarza do ekspresji glikozylowanego ligandu mpl pochodzą od wielokomórkowych organizmów. Takie komórki gospodarza są zdolne do złożonego przetwarzania i ghkozylowania. Zasadniczo przydatna jest dowolna hodowla wyższych komórek eukariotycznych, zarówno hodowla komórek kręgowców jak i bezkręgowców. Do przykładowych komórek bezkręgowców należą komórki roślin i owadów. Zidentyfikowano liczne szczepy bakulowirusowe i warianty odpowiadające dozwolonym owadzim komórkom gospodarza z gospodarzy takich jak Spodoptera frugiperda (gąsienica), Aedes aegypti (komar), Aedes albopictus (komar), Drosophila melanogaster (owocówka) i Bombyx mon. Patrz np. Lucków i inni, Bio/Technology, 6:47-55 [1988]; Miller i inni, Genetic Engineering, Setlow i inni, red., Vol. 8(Plenum Pubhshmg, 1986), str. 277-279; oraz Maeda i inni, Naturę, 31 5: 592-594 [1985], Ogólnie dostępnych jest szereg szczepów wirusowych do transfekcji, np. wariant L-l Autographa NPV i szczep Bm-5 Bombyx mon NPV, przy czym wirusy takie można zastosować jako wirusa zgodnie z wynalazkiem, zwłaszcza do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda.

Jako gospodarzy zastosować można hodowle komórek roślin, np. bawełny, kukurydzy, ziemniaka, soi, petunii, pomidora i tytoniu. Zazwyczaj komórki roślinne transfekuje się na drodze inkubacji z pewnymi szczepami bakterii Agrobacterium tumefaciens, które zostały uprzednio poddane manipulacji tak, że zawierająDNA ligandu mpl. W czasie inkubacji komórek roślinnych z A. tumefaciens DNA kodujący ligand mpl zostaje przeniesiony do roślinnej komórki gospodarza tak że ulega ona transfekcji i w odpowiednich warunkach wytwarza w wyniku ekspresji DNA ligandu mpl. Dostępne są także sekwencje regulujące i sygnałowe kompatybilne z komórkami roślinnymi, takie jak promotor syntazy nopalmowej i sekwencje sygnału pohadenylowania. Depicker i inni, J. Mol. Appl. Gen., 1: 561 [1982], Ponadto segmenty DNA wydzielone z obszaru genu T-DNA 780 sązdolne uaktywniania lub zwiększania poziomów transkrypcji genów ulegających ekspresji w roślinach, w tkance roślinnej zawierającej zrekombinowany DNA. EP 321 196 opublikowany 21 czerwca 1989.

Jednakże najbardziej obiecujące sąkomórki kręgowców, także hodowla komórek kręgowców (hodowla tkankowa) stała się w ostatnich latach rutynową procedurę (Tissue Culture, Academic Press, Kruse i Patterson, red. [1973]). Do przykładowych użytecznych linii komórek ssaków jako gospodarzy należy kinia nerki małpy CV1 transformowana SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linia ludzkich embrionalnych komórek nerki (komórki 293 lub 293 subklonowane do hodowli w zawiesinie, Graham i inni, J. Gen Virol., 36 : 59 [1977]); komórki nerki młodych chomików (BHK, ATCC CCL 10); komórki jajowe chomika chmskiego/-DHFR (CHO, Urlaub i Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 : 4216 [1980]); komórki mysiej sertoli (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 [1980]); komórki nerki małpy (CV1 ATCC CCL 70); komórki nerki zielonej małpy afrykańskiej (VERO-76, ATCC CRL-1587); komórki ludzkiego raka szyjki (HELA, ATCC CCL 2); komórki nerki psa (MDCK, ATCC CCL 34); komórki wątroby szczura bawolego (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ludzkie komórki płuc (W138, ATCC CCL 75); ludzkie komórki wątroby (Hep G2, HB 8065); mysi rak sutka (MMT 060562, ATCC CCL51); komórki TRI (Mather i inni, Annals N.Y. Acad. Sci., 383: 44-68 [1982]); komórki MRC 5; komórki FS4; oraz lima ludzkich komórek wątrobiaka (Hep G2).

Komórki gospodarza transfekuje się i korzystnie transformuje powyżej-opisanymi wektorami ekspresji lub klonowania według wynalazku i hoduje na zwykłych pożywkach zmodyfikowanych odpowiednio w celu indukowania promotorów, selekcji transformantów lub amphfikacji genów kodujących pożądane sekwencje.

Transfekcja odnosi się do przejmowania wektora ekspresji przez komórkę gospodarza bez względu na to czy w rzeczywistości zajdzie ekspresja sekwencji kodujących. Specjalistom znane są liczne metody transfekcji, np. z CaPO₄ i elektroporacja. O powodzeniu transfekcji świadczą zazwyczaj jakiekolwiek oznaki działania tego wektora w komórce gospodarza.

Transformacja oznacza wprowadzanie DNA do organizmu, tak że DNA może ulec replikacji jako element pozachromosomowy lub po zintegrowaniu w chromosomie. W zależności od

180 765 stosowanej komórki gospodarza transformowanie przeprowadza się stosując standardowe techniki odpowiednie dla takiej komórki. Obróbkę wapniową z zastosowaniem chlorku wapnia, opisanąw części 1.82 pracy Sambrook i inni, supra, jest zasadniczo wykorzystywana w odniesieniu do prokariotów lub innych komórek, które zawierają znaczące bariery w postaci ścianek komórkowych. Infekcję Agrobactenum tumefaciens stosuje się do transformowania pewnych komórek roślinnych, jak to opisali Shaw i inni, Gene, 23: 315 [1983] i WO 89/05859 opublikowany 29 czerwca 1989. Ponadto rośliny można transfekować stosując obróbkę ultradźwiękami w sposób opisany w WO 91/00358 opublikowanym 10 stycznia 1991. W przypadku komórek ssaka bez takich ścianek komórkowych korzystnie stosuje się strącanie fosforanem wapnia. Graham i vander Eb, Virology, 52:456-457 [1978], Ogólne problemy transformowania układów komórek ssaków jako gospodarzy opisał Axel w patencie USA nr 4 399 216 z 16 sierpnia 1983. Transformowanie drożdży zazwyczaj przeprowadza się metodą Van Solingena i innych, J. Bact., 130:946 [1977] oraz Hsiao i innych, Proc. Natl. Acad. Sci., (USA), 76:3829 [1979]. Możnajednak zastosować inne metody wprowadzania DNA do komórek, takie jak wtrysk jąder, elektroporacja lub fuzja protoplastów.

E. Hodowla komórek gospodarza

Komórki prokariotyczne stosowane do wytwarzania pohpeptydu ligandu mpl według wynalazku hoduje się na odpowiednich pożywkach, w sposób ogólnie opisany w pracy Sambrook i inni, supra.

Komórki ssaków jako gospodarzy stosowane do wytwarzania ligandu mpl według wynalazku można hodować na różnych pożywkach. Dostępne w handlu pożywki takie j ak Ham’s F10 (Sigma), Mimmal Essential Medium ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbecco's Modified Eagie's Medium ([DMEM], Sigma) nadają się do hodowli komórek gospodarza. Ponadto dowolnąz pożywek opisanych w: Ham i Wallace, Meth. Enz., 58:44 [1979], Bames i Sato. Anal. Biochem., 102: 255 [1980], patenty USA nr 4 767 704; 4 657 866; 4 927 762 lub 4 560 655; WO 90/03430; WO 87/00195; patentUSARe. 30 985; lub zgłoszenia patentowe USA 07/592 107 albo 07/592 141, obydwa z 3 października 1990, który wprowadza się jako źródła literaturowe, można zastosować pożywki dla komórek gospodarza. Dowolnąz tych pożywek w zależności od potrzeb można uzupełnić hormonami i/lub innymi czynnikami wzrostu (takimi jak insulina, transferyna łub naskórkowy czynnik wzrostu), solami (takimi jak chlorek sodowy, wapń, magnez i fosforan), buforami (takimi jak HEPES), nukleozydami (takimi jak adenozyna i tymidyna), antybiotykami (takimi jak Gentamycyna™), pierwiastkami śladowymi (określanymi jako związki nieorganiczne zazwyczaj obecne w ostatecznych stężeniach w zakresie mikromolowym) oraz glukoza lub równoważne źródło energii. Dowolne inne niezbędne środki uzupełniające można także dodawać w odpowiednich stężeniach znanych specjalistom. Warunki hodowli takie jak temperatura, pH itp. są takie same jak stosowane dotychczas w przypadku komórek gospodarzy wybranych do ekspresji; są one dobrze znane specjalistom.

Komórki gospodarza, o których mowa w opisie, obejmująkomórki w hodowli in vitro oraz komórki znajdujące się w zwierzęciu gospodarzu.

F Wykrywanie amplifikacji/ekspresji genu

Amplifikację i/lub ekspresję genu można oznaczać bezpośrednio w próbce, np. metodą blottmgu Southema, blottmgu Northema w celu ilościowego oznaczenia transkrypcji mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 [1980]), blottingu kropkowego (analiza DNA) lub in situ hybrydyzacji, stosując odpowiednio znaczoną sondę, w oparciu o określone sekwencje. Stosować można różne znaczniki, najczęściej radioizotopy, zwłaszcza ³²P. Można jednak wykorzystywać inne techniki takie jak zastosowanie nukleotydów modyfikowanych biotyną wprowadzanych do polinukleotydu. Biotyna służy następnie jako miejsce wiązania awidyny lub przeciwciał, które mogą być znaczone wieloma różnymi znacznikami takimi jak radionuklidy, środki fluorescencyjne, enzymy itp. Można także stosować przeciwciała, które rozpoznają określone dupleksy takie jak dupleksy DNA, dupleksy RNA i hybrydowe dupleksy DNA-RNA lub dupleksy DNA-białko. Przeciwciała mogą z kolei być znaczone; test można

180 765 przeprowadzić gdy dupleks jest związany z powierzchnią tak że po utworzeniu dupleksu na powierzchni wykryć można obecność przeciwciała związanego z dupleksem.

Ekspresję genu można także mierzyć metodami immunologicznymi, takimi jak barwienie immunohistochemiczne sekcji tkanki i analizowanie hodowli komórek lub płynów ustrojowych bezpośrednio oznaczając ilościowo ekspresję produktu genowego. W technikach barwienia immunohistochemicznego wytwarza się próbkę komórek, zazwyczaj przez odwodnienie i utrwalanie, po czym przeprowadza się reakcję ze znaczonymi specyficznymi przeciwciałami w celu sprzężenia produktu genowego, przy czym są to zazwyczaj znaczniki wykrywalne wzrokowo, takie jak znaczniki enzymatyczne, znaczniki fluorescencyjne, znaczniki luminescencyjne itp. Szczególnie czułą technikę barwienia nadającą się do stosowania w sposobach według wynalazku opisali Hsu i inni, Am. J. Clin. Path., 75: 734-738 [1980].

Przeciwciała przydatne w barwieniu immunohistochemicznym i/lub w oznaczaniu płynów próbki mogą być monoklonalne lub pohklonalne oraz mogą być wytworzone przez ssaka. Dogodnie wytworzyć można przeciwciała przeciw natywnemu polipeptydowi ligandu mpl lub przeciw syntetycznemu peptydowi opartemu na sekwencjach DNA według wynalazku, jak to dokładniej opisano poniżej.

G. Oczyszczanie polipeptydu ligandu mpl

Ligand mpl korzystnie odzyskuje się z ośrodka hodowli w postaci wydzielonego pohpeptydu, choć można go odzyskać również z hzatów komórek gospodarza, gdy został on bezpośrednio wytworzony w wyniku ekspresji bez sygnału wydzielania.

Gdy ligand mpl zostaje wytworzony w wyniku ekspresji w zrekombinowanych komórkach innych komórki pochodzenia ludzkiego, hgand mpl jest całkowicie wolny od białek lub pohpeptydów pochodzenia ludzkiego. Jednakże zazwyczaj w dalszym ciągu niezbędne jest oczyszczenie ligandu mpl od innych białek lub pohpeptydów zrekombinowanej komórki, tak aby uzyskać preparaty zasadniczo tak jednorodne jak sam ligand mpl. W pierwszym etapie pożywkę lub lizat odwirowuje się w celu usunięcia szczątek komórek. Następnie oddziela się błoną i rozpuszczalne frakcje białek. Można także zastosować dostępny w handlu filtr zatężający (np. układy do ultrafiltracji Amicon lub Millipore Pelhcon). Ligand mpl można następnie oczyszczać od frakcji rozpuszczalnego białka i od frakcji błony lizatu hodowli, w zależności od tego czy ligand mpl jest związany z błoną. Ligand mpl oczyszcza się następnie od zanieczyszczających rozpuszczalnych białek i polipeptydów na drodze wysalania i wymiany lub chromatograficznie z zastosowaniem różnych matryc żelowych. Zastosować można akrylamidowe, agarozowe, dekstranowe, celulozowe i inne matryce powszechnie stosowane do oczyszczania białek. Do przykładowych procedur chromatograficznych przydatnych do oczyszczania białek należą: immunopowinowactwo (np. anty-hmpl ligand Mab), powinowactwo recepturowe (np. mpl-IgG lub białko A Sepharose), hydrofobowa chromatografia interakcyjna (HIC) (np. ether, butyl lub phenyl Toyopearl), chromatografia lektynowa (np. Con A-Sepharose, lentil-lectin-Sepharose), wykluczenie wymiarowe (np. Sephadex G-75), kolumny kationo- i aniono-wymienne (np. DEAE lub karboksymetylo- i sulfopropyl-celuloza)oraz wysokosprawna chromatografia cieczowa z odwróceniem faz (RP-HPLC) (patrz np. Urdal i inni, J. Chromatog., 296: 171 [1984] gdzie dwa kolejne etapy RP-HPLC zastosowano do oczyszczania zrekombinowanego ludzkiego IL-2). Inne etapy oczyszczania ewentualnie obejmują wytrącanie etanolem, wytrącanie siarczanem amonu, ogniskowanie chromatograficzne; preparatywna SDS-PAGE itp.

Warianty ligandu mpl, w których reszty zostały wycięte, wstawione łub podstawione, odzyskuje się w taki sam sposób jak natywny ligand mpl przy uwzględnieniu znaczących zmian właściwości na skutek modyfikacji. Tak np. wytwarzanie fuzji ligandu mpl z innym białkiem lub pohpeptydem, np. z bakteryjnym lub wirusowym antygenem, ułatwia oczyszczanie; Kolumnę immunopowinowactwa zawierającą przeciwciało względem antygenu można zastosować do zaadsorbowania polipeptydu fuzyjnego. Kolumny immunopowinowactwa takie jak kolumny z poliklonalnym anty-mpl ligandem królika zastosować można do absorpcji wariantu ligandu mpl na drodze wiązania z co najmniej jednym pozostającym epitopem odporności. Ligand mpl można także oczyścić metodąchromatografn kolumnowej powinowactwa stosując oczyszczony

180 765 mpl-IgG sprzężony (korzystnie) z unieruchomioną żywicą taką jak Affi-Gel 10 (Bio-Rad, Richmond, CA) itp., w sposób znany specjalistom. Inhibitor proteazy taki jak fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) może być także przydatny do inhibitowania proteolitycznej degradacji w czasie oczyszczania; antybiotyki można dodać, aby powstrzymać wzrost przypadkowych zanieczyszczeń. Dla specjalistów zrozumiałe jest, że sposoby oczyszczania odpowiednie w przypadku natywnego hgandu mpl mogą wymagać zmodyfikowania w związku ze zmianami w charakterze ligandu mpl lub jego wariantów w wyniku ekspresji w hodowli zrekombinowanych komórek.

H. Kowalencyjne modyfikacje polipeptydów ligandu mpl

Kowalencyjne modyfikacje polipeptydów ligandu mpl objęte są zakresem wynalazku. Zarówno natywny ligand mpl jak i sekwencje aminokwasów wariantu ligandu mpl można modyfikować kowalencyjnie. Jednym z typów kowalencyjnej modyfikacji objętej zakresem wynalazku jest fragment ligandu mpl. Fragmenty wariantu ligandu mpl zawierające do około 40 reszt aminokwasów można dogodnie wytworzyć na drodze syntezy chemicznej lub przez enzymatyczne albo chemiczne rozszczepianie pełnej długości lub wariantu pohpeptydu ligandu mpl. Inne typy kowalencyjnej modyfikacji ligandu mpl lub jego fragmentów wprowadza się do cząsteczki poddając reakcji docelowe reszty aminokwasów ligandu mpl łub jego fragmentów z organicznym środkiem derywatyzującym zdolnym do przereagowania z wybranymi bocznymi łańcuchami reszt Nlub C-końcowych.

Reszty cysteinylowe najczęściej poddaje się reakcji z α-chlorowcooctanami (i odpowiednimi ammami), takimi jak kwas chlorooctowy lub chloroacetamid, uzyskując pochodne karboksymetylowe lub karboksyamidometylowe. Reszty cysteinylowe przekształca się również w pochodne w reakcji z bromotrifluoroacetonem, kwasem a-bromo-p-(5-imidozoi!o)propionowym, fosforanem chloroacetylu, N-alkilomaleimidami, disulfidem 3-mtro-2-pyridylu, disułfidem metylo-2-pyridylu, p-chloromercuribenzoesanem, 2-chloromercuri-4-nitrofenolem lub chloro7-nitrobenzo-2-oksa-l,3-diazolem.

Reszty histidylowe przekształca się w pochodne w reakcji z piwowęglanem di etylu przy pH 5,5-7,0 gdyż środek ten jest stosunkowo specyficzny względem bocznego łańcucha histydylowego. Przydatny jest także bromek p-bromofenacylu; reakcję korzystnie przeprowadza się w Ο,ΙΜ M kakodylame sodowym przy pH 6,0.

Lizynylowe i końcowe aminowe reszty poddaje się reakcji z bezwodnikiem kwasu bursztynowego lub innego organicznego kwasu karboksylowego. Derywatyzacja takimi środkami wpływa na odwrócenie ładunku reszt lizynylowych. Do innych odpowiednich reagentów do derywatyzacji reszt zawierających aminę należą imidoesty takie jak pikolinoimidan metylu, fosforan pirydoksylu, pirydoksal, chloroborowodorek, kwas trinitrobenzenosulfonowy; O-metyloizomoczmk, 2,4-pentanodion oraz katalizowana transaminaząreakcja z ghoksylanem.

Reszty argmyłowe modyfikuje się w reakcji z jednym lub kilkoma zwykłymi reagentami takimi jak fenyloglioksal, 2,3-butanodion, 1,2-cykloheksanodion i ninhydryna. Derywatyzacja reszt argininowych wymaga prowadzenia reakcji w warunkach alkalicznych z uwagi na wysokie pKa funkcyjnej grupy guamdynowej. Ponadto reagenty te mogą reagować z grupami lizyny oraz z grupą ε-ammową argininy.

Specyficzną modyfikację reszt tyrozylowych można przeprowadzić, zwłaszcza wprowadzając określone znaczniki spektralne do reszt tyrozynowych, przez reakcję z aromatycznymi związkami diazoniowymi lub z tetranitrometanem. Najczęściej stosuje się N-acetyloimidazol i tetramtrometan uzyskując odpowiednio grupę O-acetyltyrozylowąi 3-nitrową. Reszty tyrozylowe joduje się stosując ¹²⁵I lub ¹³¹I w celu wytworzenia znaczonych białek do zastosowania w testach radioimmunologicznych, przy czym odpowiedni jest sposób z chloraminę T opisany powyżej.

Boczne grupy karboksylowe (asparaginianowe lub glutamylowe) selektywnie modyfikuje się w reakcji z karbodiimidami (R-N=C=N-R'), w których R i R' stanowią różne grupy alkilowe, takimi jak l-cykloheksylo-3-(2-morfolinylo-4-etylo)karbodiimid lub l-etylo-3-(4-azonia-4,4dimetylopentylo)karbodiimid. Reszty asparaginianowe i glutamylowe przekształca się również w reszty asparaginylowe i glutaminylowe w reakcji z jonami amonowymi.

180 765

Derywatyzacja dwufunkcyjnymi środkami jest przydatna w sieciowaniu ligandu mpl z nierozpuszczalną w wodzie matrycą lub powierzchnią wykorzystywanym w metodzie oczyszczania przeciwciał anty-ligand mpl i odwrotnie. Do zazwyczaj stosowanych środków sieciujących należy np. 1,1 -bis(diazoacetylo)-2-fenyloetan, aldehyd glutarowy, estry N-hydroksysukcynimidu, np. estry z kwasem 4-azydosahcylowym, homodwufunkcyjne imidoestry, np. estry disukcymmidylowe takie jak 3,3'-ditiobis(sukcynimidylopropionian) i dwufunkcyjne maleimidy takie jak bis-N-maleimido-l,8-oktan. Przy stosowaniu środków derywatyzujących takich jak metylo3-[(p-azydofenylo)ditio]propioimidan uzyskuje się fotoaktywne półprodukty zdolne do sieciowania w obecności światła. Do unieruchomiania białek zastosować można także reaktywne, nierozpuszczalne w wodzie matryce takie jak węglowodany uaktywnione bromkiem cyjanogenu i reaktywne substraty opisane w patentach USA nr 3 969 287,3 691 016,4 195 128,4 247 642, 4 229 537 i 4 330 440.

Reszty glutaminylowe i asparaginylowe często odaminowuje się uzyskując odpowiednio reszty glutamylowe i asparagimanowe. Reszty te odaminowuje się w warunkach obojętnych lub zasadowych. Odaminowana forma takich reszt objęta jest zakresem wynalazku.

Do innych modyfikacji należy hydroksylowanie proliny i lizyny, fosforylowanie grup hydroksylowych reszty serylowej lub teonylowej, metylowanie grup α-aminowych w bocznych łańcuchach lizyny, arginmy i histydyny (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular properties, W.H. Freeman i Co., San Francisco, str. 79-86 [1983]), acylowanie N-końcowej aminy i amidowanie C-końcowych grup karboksylowych.

Do innego typu kowalencyjnej modyfikacji polipeptydu ligandu mpl objętego zakresem wynalazku należy zmiana natywnego układu glikozylowania polipeptydu. Zmiana obejmuje delecję jednej lub więcej grup węglowodanowych występujących w natywnym ligandzie mpl i/lub dodanie jednego lub więcej miejsc glikozylowania nie występujących w natywnym ligandzie mpl.

Glikozylowanie polipeptydów jest zazwyczaj N- lub O-połączone. N-połączenie dotyczy przyłączania grupy węglowodanowej do bocznego łańcucha reszty asparaginy. Sekwencje tripeptydowe asparagina-X-serina i asparagma-X-treonma, gdzie X oznacza dowolny aminokwas z wyjątkiem proliny, stanowią sekwencje rozpoznawane przy enzymatycznym przyłączaniu grupy węglowodanowej do bocznego łańcucha asparaginy. W związku z tym obecność którejkolwiek z tych sekwencji tripeptydowych w pohpeptydzie stwarza potencjalne miejsce glikozylowania. O-połączone glikozylowanie odnosi się do przyłączania jednego lub więcej cukrów, N-acetyloglaktozaminy, galaktozy lub ksylozy do hydroksyaminokwasu, najczęściej do seryny lub treoniny, choć wykorzystać można także 5-hydroksyprohnę lub 5-hydroksylizynę.

Dodawanie miejsc glikozylowania polipeptydu ligandu mpl dogodnie przeprowadza się zmieniając sekwencję aminokwasów tak, aby zawierała ona jedno lub więcej wyżej podanych sekwencji tripeptydowych (w przypadku N-połączonego miejsca glikozylowania). Zmianę można przeprowadzić dodając lub podstawiając jedną lub więcej reszt seryny lub treoniny do sekwencji natywnego ligandu mpl (w przypadku O-połączonego miejsca glikozylowania). Dla ułatwienia sekwencję aminokwasów ligand mpl korzystnie zmienia się wprowadzając zmiany na poziomie DNA, zwłaszcza poprzez mutację DNA kodującego polipeptyd ligandu mpl w wybranych zasadach, tak że powstają kodony, które będą zapewniać translację pożądanych aminokwasów. Mutację (mutacje) DNA można przeprowadzić stosując metody opisane powyżej w rozdziale „warianty sekwencji aminokwasów ligandu mpl”.

Jeszcze innym sposobem zwiększania liczby grup węglowodanowych w ligandzie mpl jest chemiczne lub enzymatyczne sprzęganie glikozydów z polipeptydem. Procedury takie są korzystne, gdyż nie wymagają one wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza wykazującej zdolność glikozylowania w odniesieniu do N- lub O-połączonego glikozylowania. W zależności od zastosowanego sposobu sprzęgania cukier (cukry) można przyłączyć do (a) argininy i histydyny, (b) wolnych grup karboksylowych, (c) wolnych grup sulfhydrylowych takich jak grupy cysteiny, (d) wolnych grup hydroksylowych takich jak grupy seryny, treoniny lub hydroksyprohny, (e) reszt aromatycznych takich reszty fenyloalaniny, tyrozyny lub tryptofanu albo

180 765 (f) grupy amidowej glutaminy. Metody takie opisano w WO 87/05330 opublikowanym 11 września 1987 i w pracy Aplin i Wriston, CRC Cnt. Rev. Biochem., str. 259-306 [1981],

Grupy węglowodanowe obecnie w polipeptydzie ligandu mpl usunąć można chemicznie lub enzymatycznie. Chemiczne odglikozylowanie wymaga obróbki polipeptydu kwasem tnfluorometanosulfonowym lub równoważnym związkiem. W wyniku takiej obróbki uzyskuje się rozszczepienie większości lub wszystkich cukrów z wyjątkiem cukrów łączących (N-acetylglukosammy lub N-acetylgalaktozaminy), pozostawiając polipeptyd w stanie nienaruszonym. Chemiczne odglikozylowanie opisali Hakimuddin i inni, Arch. Biochem. Biophys., 259' 52 [1987] oraz Edge i inni, Anal. Biochem., 118:131 [1981], Enzymatyczne odszczepianie grup węglowodanowych przy polipeptydzie przeprowadzić można z zastosowaniem różnych endo- i egzo-glikozydaz, jak to opisali Thotakura i inni, Met. Enzymol., 138' 350 [1987]

Glikozylowaniu w potencjalnych miejscach glikozylowania można zapobiec stosując tunikamycynę, jak to opisali Duskin i inni, J. Biol. Chem., 257' 3105 [1982], Tunikamycyna blokuje tworzenie połączeń białko-N-glikozyd.

Innego typu kowalencyjna modyfikacja ligandu mpl obejmuje łączenie polipeptydu hgandu mpl z różnymi niebiałkowymi polimerami, np. glikolem polietylenowym, glikolem polipropylenowym lub polioksyalkilenami, w sposób podany w patentach USA nr 4 640 835,4 496 689, 4301 144,4670417,4791 1921ub4 179337. Polipeptydy ligandu mpl kowalencyjnie połączone z powyższymi polimerami określa się w opisie jako pegilowane polipeptydy ligandu mpl.

Zrozumiałe jest, że pewne selekcjonowanie odzyskanego wariantu ligandu mpl niezbędne będzie do wyselekcjonowania optymalnego wariantu wiązania z mpl, wykazującego immunologiczną i/lub biologiczną aktywność określoną powyżej. Selekcjonowanie dotyczyć może stabilności w hodowli zrekombinowanych komórek lub w plazmie (np. odporności na rozszczepianie proteolityczne), wysokiego powinowactwa względem członu mpl, odporności na utlenianie, zdolności do wydzielania w dużych ilościach itp. Tak np. zmianę w immunologicznym charakterze polipeptydu ligandu mpl, takąjak powinowactwo względem danego przeciwciała, oznacza się w teście immunologicznym typu konkurencyjnego. Inne potencjalne modyfikacje właściwości białka lub polipeptydu takie jak stabilność redoksy lub termiczna, hydrofobowość lub podatność na degradację proteolityczną ocenia się metodami dobrze znanymi specjalistom.

Ogólne sposoby wytwarzania przeciwciał dla ligandu mpl

Wytwarzanie przeciwciała (i) Pohklonalne przeciwciała

Poliklonalne przeciwciała względem polipeptydu hgandu mpl lub jego fragmentów zazwyczaj wytwarzane w zwierzętach poprzez wielokrotne podskórne (sc) lub dootrzewnowe (ip) iniekcje ligandu mpl i środka pomocniczego. Przydatne może być koniugowanie hgandu mpl lub fragmentu zawierającego docelową sekwencję aminokwasów z białkiem immunogemcznym w stosunku do immunizowanych gatunków, np. hemocyjaniną pijawki, albuminą surowicy, tyroglobuliną bydlęcą lub sojowym inhibitorem trypsyny, stosując środek dwufunkcyjny lub derywatyzujący, np. ester maleimidobenzoilo-sulfosukcymmidy ester (skoniugowany przez resztę cysteiny), N-hydroksysukcynimid (przez resztę lizyny), aldehyd glutarowy, bezwodnik bursztynowy, SOC1₂ lub R^-C^NR, gdzie R i R¹ stanowią różne grupy alkilowe.

Zwierzęta immumzuje się przeciw polipeptydowi ligandu mpl lub jego fragmentowi, immunogenicznym koniugatom lub pochodnym przez połączenie 1 mg albo 1 pg peptydu lub koniugatu (odpowiednio w przypadku królików lub myszy) 3 objętościami pełnego dodatku Freunda i iniekcję roztworu dootrzewnowo w wielu miejscach. Po miesiącu zwierzętom podaje się 1/5 -1/10 wyjściowej ilości peptydu lub koniugatu w pełnym dodatku Freunda przez wielomiejscowąmiekcję podskórną. Po 7-14 dniach zwierzętom upuszcza się krew i w surowicy oznacza się miano przeciwciała ligandu mpl. Podawanie powtarza się aż do uzyskania ustalonego miana. Korzystnie zwierzętom podaje się koniugat tego samego ligandu mpl, ale skoniugowanym z innym białkiem i/lub poprzez inny reagent sieciujący. Koniugaty można także uzyskać w hodowli zrekombinowanych komórek białka fuzyjne. W celu zwiększenia odpowiedzi immunologicznej stosuje się także środki wywołujące agregację, takie jak ałun.

180 765 (u) Monoklonalne przeciwciała

Monoklonalne przeciwciała otrzymuje się z populacji zasadniczo jednorodnych przeciwciał, tak że poszczególne przeciwciała wchodzące w skład populacji są identyczne z wyjątkiem ewentualnych naturalnie zachodzących mutacji, które mogą występować w niewielkich ilościach. W związku z tym określenie „monoklonalny” wskazuje na charakter przeciwciała jako nie stanowiącego mieszaniny odrębnych przeciwciał.

Tak np. monoklonalne przeciwciała ligandu mpl według wynalazku można uzyskać stosując metodą hybrydomy, którą po raz pierwszy opisali Kohler i Milstein, Naturę, 256: 495 [1975], albo technikami rekombinacji DNA (patent USA nr 4 816 567 [Cabilly i inni]).

W metodzie hybrydomowej mysz lub inne odpowiednie zwierzę-gospodarz, takie jak chomik, immunizuje się w sposób opisany powyżej w celu uzyskania limfocytów, które wytwarzają lub są zdolne do wytwarzania przeciwciał będą specyficznie wiązać się z białkiem stosowanym do immunizacji. Alternatywnie limfocyty można immunizować in vitro. Następnie wykonuje się fuzję limfocytów z komórkami szpiczaka stosując a odpowiedni środek sprzęgający, taki jak glikol polietylenowy, uzyskując komórki hybrydomowe (Goding, Monoclonal Antibodies: Prmciples i Practice, str. 59-103 [Academic Press, 1986]).

Uzyskane w ten sposób komórki hybrydomowe zaszczepia się i hoduje na odpowiedniej pożywce, która korzystnie zawiera jedną lub więcej substancji inhibitujących wzrost lub przetrwanie niesprzężonych, macierzystych komórek szpiczaka. Tak np. jeśli macierzyste komórki szpiczaka nie zawierają enzymu transferazy hipoksantyno-guanino-fosforybozylowej (HGPRT lub HPRT), pożywka dla hybrydom zazwyczaj zawierać będzie hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę (pożywka HAT), gdyż substancje te zapobiegająwzrostowi komórek nie zawierających HGPRT.

Do korzystnych komórek szpiczaka które wydajnie ulegają fuzji, trwale podtrzymują wysoki poziom ekspresji przeciwciał przez wyselekcjonowane komórki wytwarzające przeciwciała oraz są wrażliwe na pożywkę takąjak pożywka HAT. Spośród nich do korzystnych linii komórek szpiczaka należą mysie linie szpiczaka, np. pochodzące z nowotworów myszy MOPC-21 i MPC-11, dostępne z Salk Institute Celi Distribution Center, San Diego, Califomia USA oraz komórki SP-2 dostępne z American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Opisano także zastosowanie linii komórek ludzkiego szpiczaka mysio-ludzkiego heteroszpiczaka do wytwarzania ludzkich monoklonalnych przeciwciał (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 [1984]; Brodeur i inni, Monoclonal Antibody Production Techniąues i Applications, str. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, 1987). Pożywkę, w której rosną komórki hybrydomy, analizuje się pod względem wytwarzania monoklonalnych przeciwciał skierowanych przeciw ligandowi mpl. Korzystnie specyficzność wiązania monoklonalnych przeciwciał wytworzonych przez komórki hybrydomy określa się na drodze immunostrącania lub w teście wiązania in vitro, takim jak test radioimmunologiczny (RIA) lub enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA).

Powinowactwo wiązania monoklonalnych przeciwciał można np. określić w analizie Scatchard, Munson i Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 [1980].

Po zidentyfikowaniu tych komórek hybrydomy, które wytwarzają przeciwciała o pożądanej specyficzności, powinowactwie, i/lub aktywności klony można subklonować metodami ograniczonego rozcieńczania i hodować w zwykły sposób (Goding, supra). W tym celu jako odpowiednie pożywki zastosować można np. Dulbecco's Modified Eagie's Medium pożywkę RPMI-1640. Komórki hybrydomy można także hodować in vivo jako puchliny nowotworowe w organizmie zwierzęcia.

Monoklonalne przeciwciała wydzielone przez subklony według wynalazku dogodnie oddziela się od pożywki, płynu puchlinowego lub surowicy znanymi sposobami oczyszczania immunoglobuliny, takimi jak np. A-Sepharose z białkiem, chromatografia na hydroksyloapatycie, elektroforeza żelowa, dializa lub chromatografia powinowactwa.

DNA kodujący monoklonalne przeciwciała według wynalazku łatwo wydziela się i sekwencjonuje stosując znane procedury (np. stosując sondy oligonukleotydowe zdolne do specyficznego wiązania z genami kodującymi ciężkie i lekkie łańcuchy mysiego przeciwciała).

180 765

Komórki hybrydomy według wynalazku służąjako korzystne źródło takiego DNA. Po wydzieleniu DNA można umieścić w wektorach ekspresji, które następnie transfekuje się do komórek gospodarza takich jak małpie komórki COS, komórki jajowe chomika chińskiego (CHO) lub komórki szpiczaka, które w mny sposób nie wytwarzają białka immunoglobuhnowego, doprowadzając do syntezy monoklonalnych przeciwciał w zrekombinowanych komórkach gospodarza. DNA można także zmodyfikować, np. zastępując sekwencją kodującą stałe domeny ludzkiego ciężkiego i lekkiego łańcucha homologiczne mysie sekwencje (Cabilly i inni, supra, Morrison i inni, Proc. Nat. Acad. Sci., 81: 6851 [1984]), lub kowalencyjnie łącząc z sekwencją kodującą immunoglobulinę całość lub część sekwencji kodującej polipeptyd nie— immunoglobuhnowy.

Zazwyczaj takie me-immunoglobulinowe polipeptydy zastępują stałe domeny przeciwciała według wynalazku lub zastępują zmienne domeny wiążącego jeden antygen miejsca przeciwciała według wynalazku, tworząc chimeryczne dwufunkcyjne przeciwciało zawierające miejsce wiążące jeden antygen o specyficzności względem ligandu mpl oraz miejsce wiążące mny antygen o specyficzności względem innego antygenu.

Chimeryczne lub hybrydowe przeciwciała można także wytworzyć in vitro stosując znane metody chemicznej syntezy białek, w tym obejmujące stosowanie środków sieciujących. Tak np. skonstruować można immunotoksyny stosując disulfidową reakcję wymiany lub wytwarzając wiązanie tioeterowe. W tym celu zastosować można przykładowo takie reagenty jak iminotiolan i 4-merkaptobutyroimidan metylu.

Do zastosowań diagnostycznych przeciwciała według wynalazku zazwyczaj znaczy się wykrywalną grupą. Wykrywalną grupę może stanowić dowolna grupa zdolna do wytwarzania, bezpośrednio lub pośrednio, wyrywalnego sygnału. Tak np. wykrywalną grupę może stanowić radioizotop taki jak ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S lub ¹²⁵I, związek fluorescencyjny lub chemiluminescencyjny taki jak izotiocyjaman fluorescemy, rodamina lub lucyferyna; radioaktywne znaczniki izotopowe takiej jak np. ¹²⁵1, ³²P, ^I4C lub ³H albo enzym taki jak fosfataza alkaliczna, β-galaktozydaza lub peroksydaza chrzanowa.

Zastosować można dowolny znany sposób odrębnego koniugowania przeciwciała z wykrywalną grupą w tym sposoby, które opisali Hunter i inni, Naturę, 144: 945 [1962]; David i mni, Biochemistry, 13:1014 [1974]; Paini inni, J. Immunol.,Met., 40:219 [1981]; orazNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407 [1982],

Przeciwciała według wynalazku można stosować w dowolnym znanym teście takim jak testy wiązania konkurencyjnego, bezpośrednie i pośrednie testy sandwiczowe oraz testy immunoprecypitacji. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manuał of Techniques, str. 147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

Testy wiązania konkurencyjnego oparte są na zdolności znaczonego wzorca (którym może być hgand mpl ligand mpl lub jego immunologicznie reaktywna część) do konkurowania z analitem badanej próbki (ligandem mpl) w wiązaniu z ograniczoną ilością przeciwciała. Ilość hgandu mpl w badanej próbce jest odwrotnie proporcjonalna do ilości wzorca związanego z przeciwciałem Aby ułatwić oznaczenie ilości związanego wzorca przeciwciała zazwyczaj przeprowadza się w stan nierozpuszczalny przed lub po teście konkurencyjnym, tak że wzorzec i analit, które związały się z przeciwciałem można dogodnie oddzielić od wzorca i analitu, które me zostały związane.

Testy sandwiczowe obejmują stosowanie dwóch przeciwciał, z których każde zdolne jest do wiązania się z inną częścią immunogeniczną lub z epitopem wykrywanego białka (ligandem mpl). W teście sandwiczowym badaną próbkę anahtu wiąże się z pierwszym przeciwciałem, które jest unieruchomione na stałym nośniku, po czym drugie przeciwciało wiąże się z analitem, tak ze tworzy się nierozpuszczalny trzyczęściowy kompleks. David i Greene, patent USA nr 4 376 110. Drugie przeciwciało może być znaczone wykrywalną grupą (bezpośrednie testy sandwiczowe) albo też można wykonać pomiar stosując antyimmunoglobuhnowe przeciwciało, które jest znaczone wykrywalną grupą (pośredni test sandwiczowy). Tak np. jeden typ testu sandwiczowego stanowi test ELISA; w takim przypadku wykrywalną grupę stanowi enzym (np peroksydaza chrzanowa).

180 765 (in) Humanizowane i ludzkie przeciwciała

Sposoby humanizowania nieludzkich przeciwciał są dobrze znane. Zazwyczaj humanizowane przeciwciało zawiera jedną lub więcej reszt aminokwasów wprowadzonych do niego ze źródła nie pochodzącego od człowieka. Takie nie-ludzkie reszty aminokwasów często określa się jako reszty „importowane” które zazwyczaj pochodzą z „importowanej” zmiennej domery. Humanizację można zasadniczo przeprowadzić metodą Winter i współpracowników (Jones i mni, Naturę, 321: 522-525 [1986];

Riechmann i inni, Naturę, 332: 323-327 [1988]; Verhoeyen i inni, Science, 239: 1 534-1 536 [1988]), zastępując CDR lub sekwencjami CDR z gryzoni odpowiednie sekwencje ludzkiego przeciwciała. W związku z tym takie „humanizowane” przeciwciała są chimerycznymi przeciwciałami (Cabilly i inni, supra), w których zasadniczo mniej niż nienaruszona ludzka zmienna domena została zastąpione odpowiednią sekwencją z nie-ludzkich gatunków. W praktyce humanizowane przeciwciała stanowią zazwyczaj ludzkie przeciwciała, w których część reszt CDR i ewentualnie część reszt FR zastąpiono resztami z analogicznych miejsc przeciwciał gryzonia.

Dobór ludzkich zmiennych domen, zarówno lekkich jak i ciężkich, do stosowania przy wytwarzaniu humanizowanych przeciwciał, ma bardzo istotne znaczenie ze względu na zmniejszenie antygeniczności. Zgodnie z tak zwaną metodą „najlepszego dopasowania”, sekwencję zmiennej domeny przeciwciała gryzonia selekcjonuje się przeciw pełnej bibliotece znanych sekwencji ludzkich zmiennych domen. Ludzką sekwencję najbardziej zbliżoną do sekwencji gryzonia przyjmuje się następnie jako ludzki szkielet (FR) humanizowanego przeciwciała (Sims i inni, J.Immunol., 151:2296 [1993]; Chothiai Lesk, J. Mol.Biol., 196:901 [1987]). W innym sposobie stosuje się określony szkielet pochodzący z sekwencji zgodności wszystkich ludzkich przeciwciał z określonej podgrupy lekkich lub ciężkich łańcuchów. Ten sam szkielet można zastosować dla szeregu różnych humanizowanych przeciwciał (Carter i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 [1992]; Presta i inni, J. Immnol., 151: 2623 [1993]).

Ważne jest ponadto, aby przeciwciała humanizowano przy zachowaniu wysokiego powinowactwa względem antygenu i innych korzystnych właściwości biologicznych. Aby osiągnąć ten cel zgodnie z korzystnym sposobem humanizowane przeciwciała wytwarza się przeprowadzając analizę macierzystych sekwencji i różnych wymyślonych humanizowanych produktów stosując trójwymiarowe modele macierzystych i humanizowanych sekwencji. Trójwymiarowe modele immunoglobulin sąpowszechnie dostępne i znane specjalistom. Dostępne są także programy komputerowe ilustrujące i wyświetlające prawdopodobne trójwymiarowe struktury konformacyjne wybranych potencjalnych sekwencji immunoglobulmowych. Analiza tych obrazów umożliwia zbadanie prawdopodobnej roli reszt w funkcjonowaniu wybranej sekwencji immunoglobulinowej, np. analizę reszt wpływaj ących na zdolność wybranej immunoglobuliny do wiązania się z jej antygenem. W ten sposób reszty FR można wybrać i połączyć na podstawie zgodności i ważnych sekwencji, osiągając w ten sposób zwiększone powinowactwo względem docelowych antygenów. Zazwyczaj reszty CDR bezpośrednio i zdecydowanie zasadniczo wpływają na wiązanie antygen. Więcej szczegółów znaleźć można w zgłoszeniu patentowym USA nr 07/934 373 z 21 sierpnia 1992, stanowiącego częściową kontynuację zgłoszenia nr 07/715,272 z 14 czerwca 1991.

Obecnie istnieje również możliwość wytwarzania transgenicznych zwierząt (np. myszy), które są zdolne, po immunizacji, do wytwarzania pełnego zakresu ludzkich przeciwciał bez wytwarzania endogennej immunoglobuliny. Tak np. podano, że w wyniku homozygotowej delecji ciężkiego łańcucha przeciwciała łączącego obszar (JH) genu w chimerycznej i zarodkowej linii mutantowej myszy występuje całkowite zahamowanie wytwarzania endogennych przeciwciał Przeniesienie układu genu immunoglobuliny ludzkiej linii zarodkowej do takiej linii zarodkowej mutanta myszy spowoduje wytwarzanie ludzkich przeciwciał w wyniku prowokacji antygenowej. Patrz np. Jakobovits i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 [1993]; Jakobovits i inni, Naturę, 362: 255-258 [1993]; Bruggermann i inni, Year in Immuno, 7: 33 [1993], Ludzkie przeciwciała można także wytwarzać w bibliotekach fagowych (Hoogenboom i Winter, J. Mol. Bioł. 227, 381 [1991]; Marks i inni, J. Mol. Biol. 222, 581 [1991]).

180 765 (iv) Przeciwciała o podwójnej specyficzności

Bispecyficzne przeciwciała stanowią monoklonalne, korzystnie ludzkie lub humanizowane, przeciwciała, które wykazują specyficzność wiązania się z co najmniej dwoma różnymi antygenami. Sposoby wytwarzania bispecyficznych przeciwciał są znane specjalistom.

Tradycyjnie rekombinantowe wytwarzanie bispecyficznych przeciwciał oparte jest na współekspresji dwóch par ciężki łańcuch-lekki łańcuch immunoglobuliny, w których dwa ciężkie łańcuchy różnią się specyficznością (Millstein i Cuello, Naturę, 305: 537-539 [1983]). Z uwagi na przypadkowy asortyment ciężkich i lekkich łańcuchów immunoglobuliny takie hybrydomy (kwadromy) potencjalnie wytwarzają mieszaninę 10 różnych cząsteczek przeciwciał, spośród których tylko jedno wykazuje właściwą strukturę bispecyficzną. Oczyszczanie prawidłowej cząsteczki, które zazwyczaj wykonuje się metodą chromatografii powinowactwa, jest raczej pracochłonne, a wydajności produktu są niewielkie. Podobne procedury ujawniono w publikacji PCT nr WO 93/08829 (opublikowanej 13 maja 1993) i wpracy Trauneckera i innych, EMBO, 10· 3655-3659 [1991],

Zgodnie z odmiennymi korzystniejszym rozwiązaniem przeprowadza się fuzję zmiennych domen przeciwciała o pożądanej specyficzności wiązania (miejsca połączenia przeciwciał-antygen) z sekwencjami stałych domen immunoglobuliny. Fuzję korzystnie przeprowadza się ze stałą domeną ciężkiego łańcucha obejmującą co najmniej część zawiasowych obszarów CH2 i CH3. Korzystnie co najmniej jedna z fuzji zawiera pierwszy stały obszar ciężkiego łańcucha (CHI) zawierający miejsce niezbędne do wiązania lekkiego łańcucha. DNA kodujące fuzje ciężkich łańcuchów immunoglobuliny oraz, korzystnie, lekkich łańcuchów immunoglobuliny, wstawia się do odrębnych wektorów ekspresji i współtransfekuje się mmi odpowiedni organizm gospodarza. Zapewnia to większą elastyczność w nastawianiu wzajemnych proporcji 3 fragmentów pohpeptydowych w tych rozwiązaniach, w których niejednakowe stosunki 3 łańcuchów polipeptydowych stosowanych w konstrukcji zapewniają optymalne wydajności. Można jednak wstawić sekwencje kodujące 3 lub wszystkie 3 łańcuchy pohpeptydowe do jednego gdy ekspresja co najmniej dwóch łańcuchów polipeptydowych w równych proporcjach zapewni wysokie wydajności lub gdy stosunki me mająwiększego znaczenia. W korzystnym wariancie tego rozwiązania bispecyficzne przeciwciała są utworzone przez hybrydę ciężkiego łańcucha immunoglobuhny o pierwszej specyficzności wiązania w jednym ramieniu oraz przez hybrydę pary ciężki łańcuch-lekki łańcuch immuloglobuliny (zawierającą drugie specyficzne wiązanie) w drugim ramieniu. Stwierdzono, że taka asymetryczna struktura ułatwia rozdzielenie pożądanego bispecyficznego związku od niepożądanych kombinacji łańcuchów immunoglobulinowych, gdyż obecność lekkiego łańcucha immunoglobuliny tylko w jednej połówce bispecyficzne] cząsteczki ułatwia rozdzielanie. Takie rozwiązanie ujawniono w zgłoszeniu patentowym USA nr 07/931 811 z 17 sierpnia 1992.

Więcej szczegółów odnośnie wytwarzania bispecyficznych przeciwciał znaleźć można np. w pracy Suresha i innych, Methods in Enzymology, 121: 210 [1986], (v) Heterokoniugatowe przeciwciała

Heterokoniugatowe przeciwciała są również objęte zakresem wynalazku. Heterokoniugatowe przeciwciała składają się z dwóch kowalencyjnie połączonych przeciwciał. Zaproponowano np. zastosowanie takich przeciwciał do kierowania komórek układu odpornościowego do niepożądanych komórek (patent USA nr 4 676 980) i do leczenia infekcji HIV (publikacje PCT nr WO 91/003601 WO 92/00373; EP 03089). Heterokoniugatowe przeciwciała wytwarzać można stosując dowolne odpowiednie metody sieciowania. Odpowiednie środki sieciujące są dobrze znane i są ujawnione w patencie USA nr 4 676 980 wraz z różnymi technikami sieciowania.

IV. Terapeutyczne zastosowanie ligandu mpl białka megakariocytopoetycznego

Biologicznie czynny ligand mpl o działaniu hematopoetycznego efektora, określany w opisie jako białko megakariocytopoetyczne lub tromocytopoetyczne (TPO) można zastosować w sterylnym preparacji lub kompozycji farmaceutycznej do pobudzania aktywności megakancytopoetycznej lub trombopoetycznej u pacjentów z małopłytkowościąna skutek zahamowania wytwarzania, sekwestracji lub zwiększonego rozkładu płytek krwi. Związkami według wyna

180 765 lazku można skutecznie leczyć niedorozwój szpiku kostnego związany z małopłytkowością(np. a-plastyczną anemię po chemioterapii lub przeszczepie szpiku kostnego), a także zaburzenia takie jak krzepnięcie wewnątrznaczyniowe rozsiane (DIC), małopłytkowość samoistną(obejmującą ITP wywołaną przez HIV i ITP nie związaną z HIV), przewlekła samoistna małopłytkowość, małopłytkowość wrodzona, mielodysplazja i małopłytkowość zakrzepowa. Takie białka megakariocytopoetyczne mogą być również przydatne w leczeniu mieloproliferacyjnych chorób trombocytowych oraz trombocytozy wynikającej ze stanów zapalnych lub niedoboru żelaza

Do korzystnych zastosowań białka megakariocytopoetycznego lub trombocytopoetycznego (TPO) według wynalazku należą: toksyczna dla szpiku chemioterapia w leczeniu białaczki lub stałych nowotworów, chemioterapii wyłączającej szpik przy autologicznym lub allogenicznym przeszczepie szpiku kostnego, mielodysplazja, samoistna aplastyczna anemia, małopłytkowość wrodzona i małopłytkowość samoistna.

Do jeszcze innych zaburzeń zazwyczaj leczonych białkami megakanocytopoetycznymi według wynalazku należą defekty lub uszkodzenia płytek krwi związane ze stosowaniem leków, zatruciami lub uaktywnianiem na sztucznych powierzchniach. W takich przypadkach związki według wynalazku można stosować w celu pobudzenia „zrzucania” nowych „nie uszkodzonych” płytek krwi. Pełniejsze zestawienie odpowiednich zastosowań podano w rozdziale „stan techniki”, a zwłaszcza w częściach (a) - (f) i cytowanych tam odsyłaczach.

Białka megakanocytopoetyczne według wynalazku stosować można same lub w kombinacji z innymi cytokinami, hematopoetynami, interleukinami, czynnikami wzrostu lub przeciwciałami w leczeniu wyżej wymienionych zaburzeń i stanów. I tak związki według wynalazku stosować można w kombinacji z innym białkiem lub peptydem o aktywności trombopoetycznej, takim jak G-CSF, GM-CSF, LIF, M-CSF, EL-1, IL-3, erytropoetyna (EPO), kit ligand, IL-6 i IL-11.

Białka megakanocytopoetyczne według wynalazku przyrządza się w mieszaninie z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem. Kompozycję terapeutycznąpodawać można dożylnie lub przez nos do płuc. W razie potrzeby kompozycję można także podawać pozajehtowo lub podskórnie. Przy podawaniu doukładowym kompozycja terapeutyczna powinna być wolna od pirogenów i znajdować się w roztworze dopuszczalnym do stosowania pozajelitowego, o odpowiednim pH, izotoniczności i stabilności. Kompozycje takie są dobrze znane. W skrócie preparaty związków według wynalazku w postaci dawek przyrządza się do przechowywania lub podawania przez wymieszanie związku o pożądanym stopniu czystości z fizjologicznie tolerowanymi nośnikami, zarobkami lub stabilizatorami. Do materiałów takich, nietoksycznych dla biorcy w stosowanych dawkach i stężeniach, należą bufory takie jak fosforan, cytrynian, octan i sole innych kwasów organicznych; antyutleniacze takie jak kwas askorbinowy; peptydy o niskim ciężarze cząsteczkowym (zawierające poniżej około 10 reszt), takie jak poliargmina, białka takie jak albumina surowicza, żelatyna lub immunoglobuliny; hydrofitowe polimery takie jak poliwmylopirohdon; aminokwasy takie jak glicyna, kwas glutaminowy, kwas asparaginowy lub arginina; monocukry, dwucukry i inne węglowodany, w tym celuloza i jej pochodne, glukoza, mannoza i dekstrany; środki chelatujące takie jak EDTA; alkohole cukrowe takie jak mannitol lub sorbitol; przeciwjony takie jak sód i/lub niejonowe środki powierzchniowo czynne takie jak Tween, Pluronics lub glikol polietylenowy.

Około 0,5 - 500 mg związku lub mieszaniny białka megakariocytopoetycznego w postaci wolnego kwasu lub zasady albo w postaci farmaceutycznie dopuszczalnej soli, miesza się z fizjologicznie tolerowanym rozczynnikiem, nośnikiem, zaróbką, środkiem wiążącym, środkiem konserwującym, stabilizatorem, środkiem smakowo-zapachowym itp., zgodnie z przyjętą praktyką farmaceutyczną. Kompozycje takie zawierają substancję czynną w ilości zapewniającej uzyskanie odpowiedniej dawki w podanym zakresie.

Sterylne kompozycje do iniekcji przyrządzać można zgodnie z przyjętą praktyką farmaceutyczną. Tak np. odpowiedni może być roztwór lub zawiesina substancji czynnej w nośniku takimjak woda lub naturalne oleje roślinne takie jak olej sezamowy, arachidowy lub bawełniany, albo syntetyczne nośniki tłuszczowe takie jak oleinian etylu itp. Bufory, środki konserwujące, antyutleniacze itp. zastosować można zgodnie z przyjętą praktyką farmaceutyczną.

180 765

Do odpowiednich przykładowych preparatów o przedłużonym uwalnianiu należą półprzepuszczalne matryce ze stałych hydrofobowych polimerów, zawierające polipeptyd, przy czym matryce te sąw postaci kształtowanych wyrobów takich jak folie lub mikrokapsułki. Do przykładowych matryc o przedłużonym uwalnianiu należą poliestry, hydrożele [np. polimetakrylan 2-hydroksyetylu), patrz Langer i inni, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 [1981] i Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 [1982] lub połi(alkohol winylowy), polilaktydy (patent USA nr 3 773 919, EP 58 481), kopolimery kwasu L-glutaminowego i γ-L-glutaminianu etylu (Sidman i inni, Biopolymers, 22: 547-556 [1993]), nie ulegający degradacji kopolimer etylen-octan winylu (Langer i inni, supra), ulegające degradacji kopolimery kwasu mlekowego z kwasem glikolowym takie jak Lupron Depot™ (mikrokulki do iniekcji złożone z kopolimeru kwasu mlekowego z kwasem glikolowym i octanu leuprolidu) oraz polikwas D(-)-3-hydroksymasłowy (EP 133 988).

Podczas gdy polimery takie jak etylen-octan winylu i kwas mlekowy-kwas glikolowy zapewniają uwalnianie cząsteczek przez ponad 100 dni, pewne hydrożele uwalniają białka w krótszych okresach czasu. Gdy kapsułkowane białko pozostaje dłużej w organizmie, może ono ulec denaturacji lub agregacji w wyniku działania wilgoci w 37°C, co spowoduje utratę aktywności biologicznej i ewentualnie zmiany immunogeniczności. Zastosować można odpowiednią strategię stabilizacji białek, w zależności od mechanizmu zachodzących procesów. Tak np. jeśli stwierdzi się, że mechanizm agregacji obejmuje tworzenie międzycząsteczkowych wiązań S-S na drodze wymiany disulfidowej, stabilizacje można osiągnąć poprzez modyfikację reszt sulfhydrylowych, liofilizacje z roztworów wodnych, regulowanie zawartości wilgoci, stosowanie odpowiednich dodatków oraz opracowanie pośrednich kompozycji matryc polimerowych.

Do kompozycji białek megakariocytopoetycznych o przedłużonym uwalnianiu należą również białka megakariocytopoetyczne uwięzione w liposomach. Liposomy zawierające białka megakariocytopoetyczne wytwarza się znanymi sposobami: DE 3 218 121; Epstein i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688-3692 [1985]; Hwang i inn, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77. 4030-4034 [1980]; EP 52 322; EP 36 676; EP 88 046; EP 143 949; EP 142 641; zgłoszenie patentowe japońskie 83-118008; patenty USA nr 4 485 045 i 4 544 545 oraz EP 102 324. Zazwyczaj stosuje się małe liposomy (około 200-800 A) typu jednowarstwowego, w których jako lipid stosuje się cholesterol w ilości ponad około 30% molowych, przy czym proporcje dobiera się tak, aby uzyskać optymalne działanie terapeutyczne białka megakariocytopoetycznego.

Dawka będzie ustalana przez nadzorującego lekarza przy uwzględnieniu różnych czynników modyfikujących działanie leku, takich jak ostrość i rodzaj choroby, waga ciała, wieku, sposób odżywania, czas i sposób podawania, inne stosowane leki oraz inne związane czynniki kliniczne. Zazwyczaj dzienna dawka wynosi 0,1-100 pg/kg wagi ciała. Korzystnie dawka wynosić będzie 0,150 pg/kg wagi ciała. Jeszcze korzystniej wyjściowa dawka wynosić będzie 1-5 pg/kg/dzień. Ewentualnie zakres dawek może być taki sam jak w przypadku innych cytokin, zwłaszcza G-CSF, GM-CSF i EPO. Terapeutycznie skuteczne dawki określić można w testach in vitro lub in νινο.

Przykłady

Uważa się, że bez dodatkowego opisu specjalista na podstawie powyższego opisu i ilustrujących przykładów będzie mógł wykorzystać wynalazek w całej rozciągłości. W związku z tym poniższe przykłady robocze konkretnie przedstawiaj ąkorzystne rozwiązania wynalazku, ale w żaden sposób nie ograniczają jego istoty.

Przykład 1. Częściowe oczyszczanie świńskiego ligandu mpl

Zubożoną w płytki plazmę zebrano z normalnych lub aplastycznych anemicznych świń. U świń wywołano aplastyczność przez napromieniowanie całego ciała dawką 900 cGy liniowy akcelerator 4mEV. Napromieniowane świnie utrzymywano przy życiu przez 6-8 dni wstrzykując im domięśniowo cefazolinę. Następnie całą krew usunięto w warunkach ogólnego znieczulenia, heparynizowano i odwirowano przy 1800 x g przez 30 minut uzyskując plazmę zubożoną w płytki krwi. Stwierdzono, że szczyt aktywności pobudzającej megakanocyty osiąga się w 6 dni po napromieniowaniu.

180 765

Do aplastycznej świńskiej plazmy otrzymanej z napromieniowanych świń dodano NaCl do stężenia4 M i mieszano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Wytrącony osad odwirowano przy 3800 obrotów/minutę w wirówce Sorvall RC3B, a supematant wprowadzono do kolumny Fenylo-Toyopearl (220 ml) doprowadzonej do stanu równowagi w 10 mM NaPO₄ zawierającym 4 M NaCl. Kolumnę przemyto tym samym buforem aż do uzyskania A_2g0 <0,05 i eluowano dejonizowaną H₂O. Szczytową frakcję eluowanego białka rozcieńczono dejomzowaną H₂O do przewodnictwa 15 mS i wprowadzono do kolumny Blue-Sepharose doprowadzonej do stanu równowagi (240 ml) w PBS. Następnie kolumnę przemyto (po 5 objętości kolumny) PBS110 mM NaPO₄ (pH 7,4) zawierającym 2M mocznik. Białka eluowano z kolumny 10 mM NaPO₄ (pH 7,4) zawierającym 2 M mocznik 11M NaCl. Szczytową frakcję eluowanego białka doprowadzono do stężenia 0,01% oktyloglukozydem (n-oktylo-p-D-glukopiranozydem) i po 1 mM EDTA i Pefabloc (Boehinger Mannheim), po czym wprowadzono bezpośrednio do równolegle połączonych kolumn CD4-IgG (Capon, D.J. i inni, Naturę 337: 525-531 [1989]) i mpl-IgG Ultralink (Pierce) (patrz poniżej). Kolumnę CD4-IgG (2 ml) usunięto po wprowadzeniu próbki, a kolumnę mpl-IgG (4 ml) przemyto (po 10 objętości kolumny) PBS i PBS zawierającym 2 M NaCl i eluowano 0,1 M chlorowodorkiem glicyny przy pH 2,25. Frakcje zbierano w do 1/10 objętości 1 M Tns-HCl (pH 8,0).

Analiza eluowanych frakcji z kolumny powinowactwa mpl metodą SDS-PAGE (4-20%, żel Novex) w redukujących warunkach potwierdziła obecność szeregu białek (fig. 5). Białka największej intensywności zabarwienia srebrem wydzielają się przy pozornym Mr 66 000, 55 000,30 000,28 000 i 14 000. W celu ustalenia, które z tych białek stymulują proliferację hodowli komórek Ba/F3-mpl, białka te eluowano z żelu w sposób opisany w przykładzie 2 poniżej.

Kolumny powinowactwa Ultralink

- 20 mg mpl-IgG lub CD4-IgG w PBS sprzęgnięto z 0,5 g żywicy Ultralink (Piercew sposób podany w instrukcjach producenta).

Konstrukcja i ekspresja mpl-IgG

Chimeryczną cząsteczkę obejmującą całą pozakomórkową domenę ludzkiego mpl (aminokwasy 1-491) i obszar Fc ludzkiej cząsteczki IgGl wytworzono w wyniku ekspresji w komórkach 293. Fragment cDNA kodujący aminokwasy 1-491 ludzkiego mpl otrzymano metodą PCR z biblioteki cDNA ludzkiej megakariocytowej komórki, a następnie sekwencjonowanie. Miejsce Ciał wstawiono na końcu 5', a miejsce BstEII na końcu 3'. Fragment ten klonowano w górę od obszaru kodowania IgGi Fc w wektorze Bluescript pomiędzy miejscami Ciał i BstEII po częściowym strawieniu produktu PCR BstEII z uwagi na dwa inne miejsca BstEII obecne w DNA kodującym pozakomórkową domenę mpl. Miejsce BstEII wprowadzone na końcu 3' mpl produktu PCR zaprojektowano tak, aby obszar Fc znajdował się w szkielecie wraz z pozakomórkową domeną mpl. Konstrukt subklonowano w wektorze pRK5-tkneo pomiędzy miejscami Ciał i Xbał i zastosowano do transfekowania ludzkich embrionalnych komórek nerkowych 293 metodą fosforanu wapnia. Komórki poselekcjonowano w 0,4 mg/ml G4181 wydzielono poszczególne klony. Ekspresję Mp/-IgG z wydzielonych klonów oznaczono metodą ELISA specyficzną względem ludzkiego Fc. Klon o najwyższej ekspresji wykazywał poziom ekspresji 1-2 mg/ml mpl-IgG.

Komórki wytwarzające w wyniku ekspresji Ba/F3 mpl P cDNA odpowiadający całemu obszarowi kodowania ludzkiego mpl P klonowano w pRK5-tkneo, który następnie zhneralizowano Notl i transfekowano do IL-3-zależnej linii komórek Ba/F3 na drodze elektroporacji (1 χ 10⁷ komórek, 9605 F, 250 V). Po 3 dniach rozpoczęto selekcję w obecności 2 mg/ml G418. Komórki zebrane jako zbiory lub poszczególne klony otrzymano metodą ograniczonego rozcieńczania na płytkach z 96 studzienkami. Wyselekcjonowane komórki utrzymywano w RPMI zawierającym 15% FBS, 1 mg/ml G418,20 mM glutaminy, 10 mM HEPES i 100 pg/ml Pen-Strep. Ekspresję mpl P w wyselekcjonowanych klonach oznaczano na podstawie analizy FACS stosując anty-mpl P poliklonalne przeciwciało królika.

180 765

Test ligandu mpl Ba/F3

Test ligandu mpl przeprowadzono w sposób pokazany na fig. 2. W celu określenia obecności ligandu mpl z różnych źródeł komórki mpl P Ba/F3 przetrzymywano bez IL-3 przez 24 godziny przy gęstości komórek 5 χ 10⁵ komórek/ml nawilżonym inkubatorze w 37°C w powietrzu z 5% CO₂. Po okresie hodowli bez IL-3 komórki wysiano na płytkach do hodowli z 96 studzienkami w gęstości 50 000 komórek w 200 pl pożywki z rozcieńczaniem lub bez rozcieńczania próbek i hodowano przez 24 godziny w inkubatorze do hodowli komórek. 20 μΐ pożywki RPMI bez surowicy, zawierającej 1 pCi ³H-tymidyny dodano do każdej studzienki na ostatnie 6-8 godzin. Komórki zebrano na 96-studzienkowych płytkach filtracyjnych GF/C i przemyto 5 razy wodą. Radioaktywność filtrów zliczono w obecności 40 μΐ płynu scyntylacyjnego (Microscint 20) w liczniku Packard Top Count counter.

Przykład 2. Świński hgand mpl o wysokim stopniu oczyszczania

Procedura eluowania żelu

Jednakowe ilości hgandu mpl oczyszczonego na drodze powinowactwa (frakcja 6 eluowana z kolumny mpl/IgG) i próbki buforu 2X Laemmli wymieszano w temperaturze pokojowej bez środka redukującego i wprowadzono na żel poliakryloamidowy Novex4-20% możliwie jak najszybciej. Próbki nie ogrzewano. Jako próbkę kontrolną zastosowano bufor bez ligandu przepuszczany na sąsiedniej ścieżce. Proces na żelu prowadzono w 4-6°C przy 135 V przez około 2 1/4 godziny. Bufor znajdował się początkowo w temperaturze pokojowej. Zel usunięto następnie z pojemnika żelu i usunięto płytkę z jednej strony żelu.

Replikę żelu wykonano na nitrocelulozie w sposób następujący: Kawałek nitrocelulozy zwilżono wodą destylowaną i ostrożnie nałożono na wierzch odsłoniętej płaszczyzny żelu, tak aby uniknąć powstania pęcherzy powietrza. Punkty odniesienia naniesiono na nitrocelulozę i płytkę żelu, tak aby po barwieniu replikę można było umieścić dokładnie w tym samym miejscu. Po około 2 minutach nitrocelulozę ostrożnie zdjęto i żel zawinięto w plastikowe opakowanie i włożono do lodówki. Nitrocelulozę zabarwiono złotym środkiem do barwienia pełnego białka (Biorad) najpierw mieszając go w 3 x 10 ml 0,1% Tween 20 + 0,5 M NaCl + 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, przez około 45 minut a następnie 3 x 10 ml oczyszczonej wody przez 5 minut. Następnie dodano złoty środek barwiący i całość pozostawiono do wywołania, aż pasma na wzorcu staną się widoczne. Replikę przepłukano wodą, umieszczono na plastikowym opakowaniu na żelu i dokładnie ustawiono z uwzględnieniem punktów odniesienia. Pozycje wzorców Novex zaznaczono na płytce żelowej i nakreślono linie, aby zaznaczyć linie cięcia. Następnie celulozę i plastikowe opakowanie usunięto, a żel przecięto wzdłuż zaznaczonych linii za pomocą ostrej żyletki. Cięcia przedłużono poza ścieżki próbki, tak aby możnaje było wykorzystać do ustalenia pozycji płatów po zabarwieniu żelu. Po usunięciu płatów resztę żelu zabarwiono srebrem i oznaczono pozycje wzorców i miejsc przecięcia. Na podstawie wzorców Novex określono ciężary cząsteczkowe odpowiadające miejscom przecięcia.

płatów żelu umieszczono w komórkach dwóch aparatów do elektroeluowania Biorad model 422. Na komórkach umieszczono zamknięcia membranowe odcinające ciężar cząsteczkowy 12-14K. Jako bufor do eluowania zastosowano 50 mM wodorowęglan amonu + 0,05% SDS (pH około 7,8). 1 litr buforu schłodzono przed użyciem przez około 1 godzinę w chłodziarce w 4-6°C. Plastry żelu eluowano przy 10 mA/komórkę (wstępne napięcie 40 V) w chłodnym pomieszczeniu w 4-6°C. Eluowanie prowadzono przez około 4 godziny. Następnie komórki ostrożnie wyjęto i ciecz znad spieku usunięto pipetą. Komorę elucyjną usunięto i jakąkolwiek ciecz znajdującą się powyżej zamknięcia membranowego usunięto pipetą. Ciecz w zamknięciu membranowym usunięto aparatem Pipetman i zachowano. Następnie w zamknięciu umieszczano próbki 50 μΐ oczyszczonej wody, mieszano i usuwano, aż do rozpuszczenia kryształów SDS. Wody z płukania połączono ze wspomnianą powyżej zachowaną cieczą. Całkowita objętość próbki elucyjnej wynosiła 300-500 μΐ/płat żelu. Próbki umieszczono w 10 mm rurce na dializy Spectrapor 4 odcinającej 12-14K, którąmoczono przez szereg godzin w oczyszczonej wodzie. Próbki dializowano przez noc w 4-6°C względem 60,0 ml roztworu soli buforowanego fosforanem (PB S j est około 4 mM względem potasu) dla 6 próbek. Bufor zastąpiono następnego ranka i dializę kontynuowano

180 765 przez 2,5 godziny. Próbki wyjęto z torebek do dializy i umieszczono w probówkach mikrowirówki. Probówki umieszczono w lodzie na 1 godzinę, odwirowano przy 14 000 obrotów/minutę przez 3 minuty i supematanty ostrożnie usunięto znad wytrącono SDS. Supematanty umieszczono w lodzie na około 1 godzinę i odwirowano ponownie przez 4 minuty. Supematanty rozcieńczono roztworem soli buforowanym fosforanem i oznaczono aktywność. Resztę próbek przechowywano w stanie zamrożonym w -70°C.

Przykład 3. Mikrosekwencjonowanie świńskiego ligandu mpl

Frakcję 6 (2,6 ml) z kolumny powinowactwa mpl-IgG zatężono w Microcon-10 (Amicon). Aby zapobiec absorpcji ligandu mpl na Microconie membranę przepłukano 1% SDS 15 μΐ 10% SDS dodano do frakcji 6. Bufor (20 μΐ) 2X dodano do frakcji nr 6 po zatężeniu na Microconie (20 μΐ) i całkowitą objętość (40 μΐ) wprowadzono na pojedynczą ścieżkę 4-20% gradientowego żelu akrylamidowego (Novex). Żel poddawano obróbce zgodnie z procedurąNovex. Żel doprowadzono następnie do stanu równowagi przez 5 minut przed wykonaniem elektroblottingu w 10 mM kwasie 3-(cykloheksyloamino)-l-propanosulfonowym (CAPS) jako buforze, pH 11,0, zawierającym 10% metanolu. Elektroblotting na membranach Immobilon-PSO (Millipore) prowadzono przez 45 minut przy stałym prądzie 250 mA w transferowej komórce BioRad Trans-Blot (32). Membranę PVDF zabarwiono 0,1 % Coomassie Blue R-250 w 40% metanolu, 0,1 % kwasem octowym przez 1 minutę i odbarwiano przez 2-3 minuty 10% kwasem octowym w 50% metanolu. Jedyne białka widoczne w obszarze Mr 18 000 - 35 000 biotu wykazywały Mr 30 000, 28 000 i 22 000.

Pasma przy 30, 28 i 22 kDa poddano sekwencj ono waniu białek. Automatyczne sekwencjonowanie białek przeprowadzono w aparacie do sekwencjonowama model 470A Applied Biosystem wyposażonym w bezpośredni analizator PTH Analyzer. Aparat do sekwencj onowama zmodyfikowano tak, aby wstrzykiwać 80-90% próbki (Rodriguez, J. Chromatogr., 350:217-225 [1985]). Aceton (~ 12 μΐ/litr) dodano do rozpuszczalnika A aby zrównoważyć absorbancję UV. Białka z elektroblottingu sekwencjonowano w zestawie Blott. Piki scałkowano za pomocą oprogramowania Justice Innovation stosując interfejsy Nelson Analytical 970. Interpretację sekwencjowania przeprowadzono na VAX 5900 (Henzel i inni, J. Chromatogr., 404: 41-45 [1987]). N-końcowe sekwencje (stosując jednoliterowy kod oraz zaznaczając niepewne reszty w nawiasach) i oraz ilość otrzymanego materiału (w nawiasach kwadratowych) podano w tabeli 2'

Tabela 2'

Sekwencja aminowego końca hgandu mpl

30 kDa [l,8pmol]
1 5 10 15 20 25
(S) PAPPA (C) DPRLLNKLLRDD (H/S) VLH (G) RL	(SEQIDNO 30)
28 kDa [0,5 pmol]
1 5 10 15 20 25
(S) PAPPAXDPRLLNKLLRDD (H) VL (H) GR	(SEQIDNO 31)
18-22 kDa [0,5 pmol]
1 5 10
XPAPPAXDPRLX (N) (K)	(SEQ ID NO: 32)

Przykład 4. Test megakanocytopoezy w ciekłej zawiesinie

Ludzkie obwodowe komórki pierwotne (PSC) (otrzymane od wyrażających zgodę pacjentów) rozcieńczono pięciokrotnie ośrodkiem IMDM (Gibco) i odwirowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej przy 800 x g. Osad komórek zawieszono ponownie w IMDM i naniesiono w warstwie na 60% Percoll (gęstość 1,077 g/ml) (Pharmacia) i odwirowano przy 800 x g przez 30

180 765 minut. Jednojądrowe komórki o małej gęstości odessano z granicy faz, przemyto 2x IMDM i naniesiono w ilości 1 -2 χ 10⁶ komórek/ml w IMDM zawierającym 30% FBS (ostateczna objętość 1 ml) w gniazda do hodowli tkanki o 24 studzienkach (Costar) APP lub APP pozbawiony ligandu mpl dodano w ilości 10% i hodowle prowadzono przez 12-14 dni wilgotnym inkubatorze w 3 7°C w powietrzu zawierającym 5% CO₂. Hodowle prowadzono także w obecności 10% APP z 0,5 pg mpl-IgG dodawanego w dniach 0, 2 i 4. Z APP usuwano ligand mpl przepuszczając go przez kolumnę z powinowactwem mpl-IgG.

W celu ilościowego oznaczenia megakariocytopoezy w hodowlach w ciekłej zawiesinie wykorzystano modyfikację Solberga i innych stosując radioznaczone mysie monoklonalne przeciwciała IgG (HP1-1D) względem GPII_bIII_a (dostarczonego przez dr Nicholsa, Mayo Climc). 100 pg HP1-1D (patrz Grant, B. i inni, Blood 69:1334-1339 [1987]) znaczono radiologicznie 1 mCi Na¹²⁵I stosując Enzymobeads (Biorad, Richmond, CA) w sposób podany w instrukcjach producenta. Radioznaczony HP1-1D przechowywano w -70°C w PBS zawierającym 0,01% oktyloglukozydu. Typowe aktywności właściwe wynosiły 1-2 χ 10⁶ cpm) pg (> 95% wytrącenia 12,5% kwasem trichlorooctowym).

Hodowle w ciekłych zawiesinach prowadzono potrójnie dla każdego punktu pomiarowego. Po 12-14 dniach hodowli po 1 ml zawiesiny przeniesiono do 1,5 ml probówek Eppendorfa i odwirowano przy 800 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i uzyskane osadu komórkowe ponownie zawieszono w 100 pl PBS zawierającego 0,02% EDTA i 20% surowicy cielęcej. 10 ng ¹²⁵I-HP1 -1D w 5 0 pl buforu testowego dodano do zawiesin hodowli i inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej (RT) z okresowym wytrząsaniem. Następnie komórki odwirowano przy 800 x g przez 10 minut w RT i przemyto 2x buforem testowym. Osady zliczano przez 1 minutę w liczniku γ (Packard). Niespecyficzne wiązanie oznaczano dodając 1 pg nieznaczonego HP1-1D przez 60 minut przed dodaniem znaczonego HP1-1D. Wiązanie specyficzne oznaczano jako całkowity ¹²⁵I-HP1-1D związany minus związany w obecności nadmiaru nieznaczonego HP1-1D.

Przykład 5. Oligonukleotydowe sondy PCR

Napodstawie amino-końcowych sekwencji aminokwasów otrzymanych z białek o 30 kDa, 28 kDa i 18-22 kDa, zdegenerowane oligonukleotydy zaprojektowano do wykorzystania jako startery w polimerazowej reakcji łańcuchowej (PCR) (patrz tabela 4). /syntetyzowano dwie pule starterów sensowną 20-merową pulę kodującą reszty aminokwasów 2-8 (mpl 1) i antysensowną 21-merowąpulę komplementarną z sekwencjami kodującymi aminokwasy 18-24 (mpl 2).

Tabela 4

Pule zdegradowanych starterów ohgonukleotydowych

mpl 1 5'CCN GCN CCN CCN GCN TGY GA3' (2,048-krotny degenerat)	(SEQIDNO 35)
mpl2 5'NCC RTG NAR NAC RTG RTC RTC3’ (2,048-krotny degenerat)	(SEQ ID NO. 36)

Świński genomowy DNA, wydzielony ze świńskich limfocytów krwi obwodowej zastosowano jako matrycę dla PCR. 50 pl mieszaniny reakcyjnej zawierało: 0,8 pg świńskiego genomowego DNA w 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KC1,3 mM MgCl₂,100 pg/ml BSA, 400 gM dNTPs, po 1 pM każdej puli starterów i 2,5 jednostek polimerazy Taq. Wstępną denaturację matrycy prowadzono w 94°C przez 8 minut, po czym przeprowadzano 35:45 sw94°C, 1 minutaw55°Ci 1 minuta w 72°C. W ostatnim cyklu obróbkę w 72°C wydłużono do 10 minut. Produkty PCR rozdzielono na drodze elektroforezy na 12% żelu poliakrylamidowym, dokonując wizualizację przez barwienie bromkiem etydiowym. Zakładano, że jeśli amino-końcowa sekwencja aminokwasów była kodowana przez pojedynczy egzon, to prawidłowego produktu PCR należało oczekiwać przy 69 bp. Fragment DNA o tej wielkości eluowano z żelu i subklonowano w PGEMT (Promega). Sekwencje 3 klonów przedstawiono poniżej w tabeli 5.

180 765

Tabela 5

Fragmenty świńskiego genomowego DNA o 69 bp gemT3

5' CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA

3' GGTCGCGGCG GTCGGACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACGGAGCACI TGACCACGTT CAGCACGGC (69 bp] (SEQIDNO 37) ACTGGTGCAA GTCGTGCCG(SEQ IN NO 38) gemT7

5' CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA

3' GGTCGTGGAG GCCGTACACT GGGGGCTGAG GATTTATTTG ACG AAGCACI

CGACCACGTC CATCACGGC [69 bp] (SEQ ID NO: 39)

GCTGGTGCAG GTAGTGCCG(SEQ ID NO: 40) gemT9

P R L L N K L LR (SEQ ID 140: 32)

5' CCAGCACCGCCGGCATGTGACCCCCGACTCCTAAATAAACTGCTTCGTGACG

3' GGTCGTGGCGGCCGTACACTGGGGGCTGAGGATTTATTTGACGAAGCAdGC

NTCATGTCTATCACGGT 3' (SEQ ID NO: 41)

TAGTACAGATAGTGCCA 5' (SEQ ID NO: 42)

Pozycję startera PCR zaznaczono podkreślonymi zasadami. Wyniki te weryfikują Nkońcową sekwencję otrzymaną dla aminokwasów 9-17 w białkach 30 kDa, 28 kDa 118-22 kDa, wskazując, że sekwencja ta kodowana jest przez pojedynczy egzon świńskiego DNA.

Przykład 6. Ludzki gen ligandu mpl

W oparciu o wyniki uzyskane w przykładzie 5 a 45-merowy dezoksyoligonukleotyd, określany jako pR45, zaprojektowano i zsyntetyzowano do selekcjonowania genomowej biblioteki. Sekwencja 45-merowego nukleotydu była następująca:

5'GCC-GTb-AAG-GAC-GTG-GTC-GTC-ACG-AAG-CAG-TTT-ATT-TAG-GAG-TCG 3' (SEQ ID NO: 28)

Oligonukleotyd ten ³²P-znaczono (γ³²Ρ)-ΑΤΡ i T4 kinazą po czym zastosowano go do selekcjonowania ludzkiej genomowej biblioteki DNA w Xgeml2 w warunkach hybrydyzacji i przemywania o małej ostrości (patrz przykład 7). Dodatnie klony wybrano, łysinkę oczyszczono i zanalizowano przez mapowanie restrykcyjne i blotting Southema. Klon nr 4 wybrano do dodatkowej analizy.

Fragment 2,8kb BamHI-Xbal, który hybrydyzowano z 45-merem subklonowano w pBluescnpt SK-. Częściowe sekwencjonowanie DNA tego klonu przeprowadzono stosując jako startery ohgonukleotydy specyficzne względem sekwencji DNA świńskiego ligandu mpl. Otrzymana sekwencja potwierdziła, że wydzielono DNA kodujący ludzki homolog świńskiego hgandu mpl. Miejsce restrykcji EcoRI wykryto w sekwencji, co umożliwiło wydzielenie fragmentu 390 bp EcoRI-XbaI z 2,8 kb BamHI-XbalIi do subklonowania w pBluescnpt SK-.

Obydwie mci tego fragmentu poddano sekwencjonowamu. Sekwencję ludzkiego DNA i wydedukowanąsekwencję aminokwasów pokazano na fig. 9 (SEQ ID NO: 3 i 4). Przewidywane pozycje mtronów w sekwencji genomowej są również zaznaczone strzałkami i określają przypuszczalny egzon („egzon 3”).

Badanie przewidywanej sekwencji aminokwasów potwierdza, że reszta seryny jest pierwszym aminokwasem dojrzałego ligandu mpl, co wynika z bezpośredniej analizy sekwencji aminokwasów. Bezpośrednio w górę od tego kodonu przewidywana sekwencja aminokwasów stanowi bardzo prawdopodobnie sekwencję sygnałową odgrywającą rolę w wydzielaniu dojrzałego hgandu mpl. Ten obszar kodujący sekwencję sygnałową jest prawdopodobnie przerwany w pozycji nukleotydu 68 przez intron.

180 765

W kierunku 3' egzon kończy się na nukleotydzie 196. Z tego względu egzon ten koduje sekwencję 42 aminokwasów, spośród których 16 stanowi prawdopodobnie sekwencję sygnałową, a 26 stanowi część dojrzałego ludzkiego ligandu mpl.

Przykład 7. Pełnej długości cDNA ludzkiego hgandu mpl

W oparciu o sekwencję ludzkiego „egzonu 3” (przykład 6) zsyntetyzowano sekwencje dwóch niezdegenerowanych oligonukleotydów, odpowiednio dla końców 3' i 5' „egzonu 3” (tabela 6).

Tabela 6

Ludzkie niezdegenerowane ohgonukleotydowe startery cDNA dla PCR

Starter Fwd' 5' GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTrCT3'	(SEQIDNO 43)
Starter Rvs: 5' CAG TCT GCC GTG AAG GAC ATG G 3'	(SEQ ID NO: 44)

Dwa startery zastosowano w reakcjach PCR stosując jako matrycę DNA z różnych ludzkich bibliotek cDNA lub 1 ng Quick Clone cDNA (Clonetech) z różnych tkanek, stosując warunki opisane w_przykładzie S. Przewidywana wielkość prawidłowego produktu PCR wynosiła 140 bp. Po analizie produktów PCR na 12% żelu pohakrylamidowym, fragment DNA oczekiwanej wielkości wykryto w bibliotekach cDNA wytworzonych nerki dorosłego człowieka, z płodowych komórek nerkowych 293 i w cDNA wytworzonym z ludzkiej płodowej wątroby (Clonetech katalog #7171-1).

Bibliotekę cDNA z płodowej nerki w λ DR2 (Clonetech katalog # HL1151 x) selekcj onowano tym samym 45-merowym ohgonukleotydem, który zastosowano do selekcjonowania ludzkiej genomowej biblioteki. Przeprowadzono znakowanie ohgonukleotydu (γ³²Ρ)-ΑΤΡ stosując pohnukleotydowąkinazę T4. Bibliotekę selekcjonowano w warunkach hybrydyzacji o małej ostrości. Przesącze wstępnie hybrydyzowano przez 2 godziny, a następnie hybrydyzowano z sondą przez noc w 42°C w 20% formamidzie, 5xSSC, 10 x Denhardts, 0,05 M fosforan sodowy (pH 6,5), 0,1% pirofosforan sodowy, 50 pg/ml poddanego obróbce ultradźwiękami DNA nasienia łososia przez 16 godzin. Filtry przemyto 2xSSC, a następnie raz przemyto 0,5xSSC, 0,1% SDS w 42°C. Filtry eksponowano przez noc na błonę rentegenowskąKodak. Dodatnie klony wybrano, łysinkę oczyszczono i wielkość insertu oznaczano metodą PCR stosując oligonukleotydy flankujące BamHI-XbaI klonowane w λ DR2 (Clonetech katalog #6475-1). 5 μΐ bazy fagowej zastosowano jako źródło matrycy. Wstępną denaturację prowadzono przez 7 minut w 94°C, po czym wykonywano 30 cykh amplifikacji (1 minuta w 94°C, 1 minuta w 52°C i 1,5 minuty w 72°Ć). Końcowe wydłużanie prowadzono przez 15 mmut w 72°C. Klon # FL2b z insertem 1,8 kb wybrano do dalszej analizy

Plazmid pDR2 (Clonetech, XDR2 i pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, str. 42) zawarty w ramieniu fagaXDR2, uwolniono w sposób opisany w instrukcjach producenta (Clonetech, XDR2 i pDR2 Cloning and Expression System Library Protocol Handbook, str. 29-30). Analiza restrykcyjna plazmidu pDR2-FL2b za pomocą BamHI i Xbal wykazała obecność wewnętrznego miejsca restrykcji BamHI w insercie w przybliżeniu w pozycji 650. Trawienie plazmidu BamHI-Xbal przecina insert na 2 fragmenty, jeden o 0,65 kb i jeden o 1,15 kb. Sekwencję DNA oznaczano stosując 3 różne klasy matryc pochodzących z plazmidu pDR2-FL2b. Sekwencjonowanie DNA dwuniciowego plazmidowego DNA przeprowadzono z ABI373 (Apphed Biosystems, Foster City, Califomia), zautomatyzowanym fluorescencyjnym aparatem do sekwencjonowama DNA stosując standardowe procedury dla znaczonych barwnikiem didezoksynukleozydowych terminatorów tnfosforanowych (terminatorów barwnikowych) i zwykłego zsyntetyzowanego startera kroczącego (Sanger i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 [1977]; Smith i inni, Naturę, 321 · 674-679 [1986]). Bez

180 765 pośrednie sekwencjonowanie fragmentów zamplifikowanych w polimerazowej reakcji łańcuchowej z plazmidu przeprowadzono stosując aparat do sekwencjonowania ABI373 sequencer z wykorzystaniem zwykłego startera i reakcji z terminatorem barwnikowym. Jednoniciową matrycę wytworzono stosując wektor Ml 3 Janus (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin) (Burland i inni, Nuci. Acids Res., 21: 3385-3390 [1993]). Fragmenty BamHI-XbaI (1,15 kb) i BamHI (0,65 kb) wydzielono z plazmidu pDR2-FL2b, końce wypełniono w pohmerazie DNA T4 w obecności dezoksynukleotydu, a następnie subklonowano w miejscu Smal w Ml3 Janus. Sekwencjonowanie przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami dla znaczonych barwnikiem uniwersalnych i odwrotnych starterów Ml3, lub dla starterów kroczących i terminatorów barwnikowych. Ręczne reakcje sekwencjonowania przeprowadzono na jednoniciowym M13 DNA stosując starter kroczący i standardowy chemizm didezoksy-terminatora (Sanger i mm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 [1977]), ³³P-znaczony α-dATP i Sequenase (United States Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Zestawianie sekwencji DNA przeprowadzono z Sequencher V2.1bl2 (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan). Nukleotyd i wydedukowano sekwencję hML podano na fig. 1 (SEQ ID NO: 1).

Przykład 8. Wydzielanie genu ludzkiego ligandu mpl (TPO)

Ludzkie genomowe klony DNA genu TPO wydzielono przez selekcjonowanie ludzkiej genomowej biblioteki w X-Geml2 z pR45, uprzednio opisaną sondą oligonukleotydową w warunkach o małej ostrości (patrz przykład 7) lub w warunkach o dużej ostrości z fragmentem odpowiadającym połówce 3' ludzkiego cDNA kodującego hgand mpl (od miejsca BamHI do końca 39. Wydzielono dwa zachodzące klony λ o odstępie 35 kb. 2 zachodzące fragmenty (BamHI 1 EcoRI) zawierające pełny gen TPO subklonowano 1 sekwencjonowano. Ludzki gen składa się z 6 egzonów w genomowym DNA o 7 kb (fig. 14A, B i C). Granice wszystkich połączeń egzon/intron odpowiadająmotywowi zgodności ustalonemu dla genów ssaków (Shapiro, Μ. B. i inni, Nuci. Acids Res. 15: 7155 [1987]). Egzon 1 i egzon 2 zawierają5'-nietranslatowaną sekwencję i początkowe 4 aminokwasy peptydu sygnałowego. Resztę sygnału wydzielania 1 pierwsze 26 aminokwasów dojrzałego białka są kodowane w egzonie 3. Pełną karboksylową domenę 13'-nietranslatowaną a także ~50 aminokwasów erytropoetyno-podobnej domeny kodowanych jest w egzonie 6. 4 aminokwasy uwzględniane w delecji zaobserwowanej dla hML-2 (hTPO-2) są kodowane przy końcu 5' egzonu 6.

Przykład 9. Przejściowa ekspresja ludzkiego ligandu mpl (hML)

W celu subklonowania pełnej długości insertu zawartego w pDR2-FL2b plazmid strawiono do końca Xbal, po czym częściowo strawiono BamHI. Fragment DNA odpowiadający insertowi 1,8 kb oczyszczono na żelu i subklonowano w pRK5 (pRK5-hmpl I) (patrz patent USA nr 5 258 287 odnośnie konstrukcji pRK5) pod kontrolą bezpośrednio wczesnego promotora cytomegalowirusa. DNA z konstruktu pRK5-hmpl I otrzymano metodą PEG i transfekowano w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych 293 otrzymywanych w modyfikowanej według Dulbecco pożywce Eagie medium (DMEM) uzupełnionej mieszanką odżywkowąF-12, 20 mM Hepes (pH 7,4) 1 10% płodowej surowicy bydlęcej. Komórki transfekowano metodą z fosforanem wapnia w opisany sposób (Gorman, C. [1985] w DNA Cloning: A Practical Approach (Glover, D. M., red.) Vol. ll,str. 143-190, IRL Press, Washington, D.C.) 36 godzin po transfekcjisupernatant transfekowanych komórek oceniono pod względem aktywności w teście proliferacji (patrz przykład 1). Supematant z komórek 293 transfekowanych samym wektorem pRK nie powodował stymulacji komórek Ba/F3 lub Ba/F3-mpl (fig. 12A). Supematant komórek transfekowanych pRK5-hmpl I nie wywierał wpływu na komórki Ba/F3, ale zdecydowanie stymulował proliferację komórek Ba/F3-mpl (fig. 12A), co wskazuje, że ten cDNA koduje funkcjonalnie aktywny ludzki hgand mpl.

Przykład 10. Izoformy ludzkiego ligandu mpl, hML2, hML3 i hML4

W celu zidentyfikowania alternatywnie rozszczepionych form hML zsyntetyzowano startery odpowiadające każdemu końcowi sekwencji kodującej hML. Startery te zastosowano w RT-PCR do amplifikacji RNA ludzkiej dorosłej wątroby. Dodatkowo skonstruowano i podobnie zastosowano wewnętrzne startery flankujące wybrane określone obszary (patrz poniżej). Bez180 765 pośrednie sekwencjonowanie końców produktu PCR potwierdziło występowanie pojedynczej sekwencji odpowiadającej dokładnie sekwencji cDNA wydzielonego z biblioteki ludzkiej płodowej wątroby (patrz fig. 1 [SEQ ID NO: 1]). Jednakże obszar w sąsiedztwie C-końca EPOdomeny (w środku produktu PCR) wykazywał sekwencję o złożonym układzie, co sugeruje ewentualne występowanie rozszczepionych wariantów w tym obszarze. W celu wydzielenia tych rozszczepionych wariantów startery wymienione w tabeli 7, flankujące określony obszar zastosowano w PCR jako matryce dla cDNA ludzkiej dorosłej wątroby.

Tabela 7

Ludzka izoforma ML starterów PCR

phmpllcdna.3el 5' TGTGGACTTTAGCTTGGGAGAATG3'	(SEQ ID NO: 45)
pbx4.f2. 5' GGTCCAGGGACCTGGAGGTTTG3'	(SEQ ID NO: 46)

Produkty PCR subklonowano tępymi końcami wM13. Sekwencjonowanie poszczególnych subklonów potwierdziło obecność co najmniej 3 izoform ML. Jedna z nich, hML (oznaczana także jako hML₃₃₂), jest formą najdłuższą i odpowiada dokładnie sekwencji wydzielonej z biblioteki płodowej wątroby. Sekwencje 4 izoform ludzkiego ligandu mpl, wymienione od najdłuższej (hML) do najkrótszej (hML-4) przedstawiono na fig. 11 [SEQ ID NO: 6, 8, 9 i 10]).

Przykład 11. Konstrukcja i przejściowa ekspresja izoform ludzkiego ligandu mpl i wariantów podstawienia hML2, hML3 i hML(RI53A, R154A)

Izoformy hML2 i hML3 oraz wariant podstawienia hML(R153A, R154A) odtworzono z hML stosując technikę zrekombinowanej PCR, którą opisał Russell Higuchi, w PCR Protocols, a guide to Methods and Applications, Acad. Press, M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Snisky i T.J. White red.

We wszystkich konstruktach zastosowano „zewnętrzne” startery pokazane w tabeli 8, a „zachodzące” startery pokazano w tabeli 9.

Tabela 8 Startery zewnętrzne

Cla.FL.F2. 5' ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G3'	(SEQ ID NO. 47)
HMPLL-R: 5' GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATGAGA 3'	(SEQ ID NO· 48)

Tabela 9 Startery zachodzące

hML-2 MLA4.F. 5' CTC CTT GGA ACC CAG GGC AGG ACC 3' ILA4.R. 5' GGT CCT GCC CTG GGT TCC AAG GAG 3'	(SEQIDNO 49) (SEQ ID NO. 50)
hML-3. hMLAl 16+. 5' CTG CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT 3' hMLAlló-: 5ΆΑΤ CCA GAA GTC CTT TCC TCG GAG CAG 3'	(SEQ ID NO· 51) (SEQ ID NO. 52)
hML(R153A R154A) RR-KO-F· 5' CCC TCT GCG TCG CGG CGG CCC CAC CCA C 3' RR-KO-R 5' GTG GGT GGG GCC GCC GCG ACG CAG AGG G 3'	(SEQ ID NO: 53) (SEQ ID NO: 54)

180 765

Wszystkie amplifikacje PCR przeprowadzano z klonowanym DNA polimerazy Pfu (Stratagene) w następujących warunkach: Wyjściowa denaturacja matrycy w 94°C przez 7 minut, a następnie 30 cykli 1 minuta w 94°C, 1 minuta w 55°C i 1,5 minuty w 72°C. Ostatni cykl wydłużono do 10 minut w 72°C. Produkt końcowy PCR strawiono Clal-Xbal, oczyszczono na żelu i klonowano w pRK5tkneo. Komórki 293 transfekowano różnymi konstruktami, jak to opisano powyżej i supematant oceniono stosując test proliferacji Ba/F3-mpl. hML-2 i hML-3 nie wykazały wykrywalnej aktywności w tym teście, podczas gdy aktywność hML(Rl 53 A, R154A) była podobna do hML co wskazuje, że obróbka w tym dwuzasadowym miejscu nie jest istotna do osiągnięcia aktywności (patrz fig. 13).

Przykład 12. Mycie cDNA ligandu mpl; mML, mML-2 i mML-3

Wydzielanie mML cDNA.

Fragment DNA odpowiadający całemu obszarowi kodowania ludzkiego ligandu mpl otrzymano metodą PCR, oczyszczono na żelu i znaczono przez przypadkowe sondowanie w obecności ³²P-dATP 1³²P-dCTP. Sondę tą zastosowano do selekcjonowania 10⁶ klonów biblioteki cDNA mysiej wątroby w XGT10 (Cłontech katalog # ML3001a). Podwójne filtry hybrydyzowano w 35% formamidzie, 5xSSC, 10 x Denhardfs, 0,1% SDS, 0,05 M fosforan sodowy (pH 6,5), 0,1 % pirofosforan sodowy, 100 ,ug/ml poddanego obróbce ultradźwiękami DNA nasienia łososia przez noc w obecności sondy. Filtry przemyto 2xSSC, a następnie przemyto raz n 0,5xSSC, 0,1% SDS w 42°C. Hybrydyzujące fagi oczyszczono na łysmkach i inserty cDNA subklonowano w miejscu EcoRI plazmidu Bluescript SK-. Klon „LD” z insertem 1,5 kb wybrano do dalszej analizy i obydwie nici posekwencjonowano w sposób opisany powyżej dla ludzkiego ML cDNA. Nukleotyd i wydedukowanąsekwencję aminokwasów z klonu LD pokazano na fig. 14 (SEQ ID NO: liii). Wydedukowana sekwencja dojrzałego ML z tego klonu zawierała 331 reszt aminokwasów; zidentyfikowano jąjako mML331 (lub mML-2 ze względów podanych poniżej). Zaobserwowano znaczącą identyczność zarówno dla nukleotydu jak i wydedukowanej sekwencji aminokwasów EPO-podobnych domenach tych ML. Jednakże jeśli nałoży się wydedukowaną sekwencję aminokwasów ludzkiego i mysiego ML, okazuje się, że mysia sekwencja zawiera tetrapeptydowądelecję pomiędzy ludzkimi resztami 111-114, co odpowiada delecji 12 nukleotydów po pozycji nukleotydu 618 występujących zarówno w ludzkim (patrz powyżej) jak i świńskim (patrz poniżej) cDNA. W związku z tym zbadano dodatkowe klony w celu wykrycia ewentualnych mysich izoform Ml. Jeden klon, „L7”, zawierał insert 1,4 kb z wydedukowaną sekwencją335 aminokwasów zawierającą „opuszczony” tetrapeptyd LPLQ. Uważa się, że forma ta stanowi pełnej długości mysi ML; oznaczono jąjako mML lub mML335. Nukleotyd i wydedukowaną sekwencję aminokwasów mML pokazano na fig. 16 (SEQ ID NO: 12 113). Klon „L2” wydzielono i posekwencjonowano. Klon ten zawiera delecje 116 nukleotydów w stosunku do hML3 i jest z tego względu określany jako mML-3. Porównanie wydedukowanych sekwencji aminokwasów tych dwóch izoform pokazano na fig. 16.

Ekspresja zrekombinowanego mML.

Wektory ekspresji mysiego ML wytworzono zasadniczo w sposób opisany w przykładzie 8. Klony kodujące mML i mML-2 subklonowano w pRK5tkneo, wektorze ekspresji ssaka, który zapewnia ekspresję pod kontrolą promotora CMV i sygnału poliadenylowania SV40. Uzyskane wektory ekspresji, mMLpRKtkneo i mML2pRKtkneo przejściowo transfekowano do komórek 293 stosując metodę fosforanu wapnia. Po przejściowej transfekcji hodowlę kontynuowano przez 5 dni. Komórki utrzymywano w wysokoglukozowej pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodowej surowicy cielęcej.

Ekspresja mysiego-mpl (mmpl) w komórkach Ba/F3

Stabilne linie komórek wytwarzających w wyniku ekspresji c-mpl otrzymano przez transfekcję mmpl pRKtkneo, zasadniczo w sposób opisany dla ludzkiego mpl w przykładzie 1. W skrócie wektor ekspresji (20 pg; linearyzowany) zawierający pełną sekwencję kodującą mysi mpl (Skoda, R. C. i inni, EMBO J. 1 2^- 2645-2653 [1993]) transfekowano do komórek Ba/F3 na drodze elektroporacji (5 X 10⁶ komórek, 250 V, 960 pF), po czym wykonano selekcję pod względem odporności na neomycynę z 2 mg/1 G418. Ekspresję mpl oceniano na podstawie cy

180 765 tometrycznej analizy przepływowej stosując królicze, przeciwmysie przeciwsurowice mpl-IgG. Komórki Ba/F3 utrzymywano w pożywce RPMI 1640 z komórek WEHI-3B jako źródle IL-3. Supematanty z komórek 293 przejściowo transfekowane mML i mML-2 oceniano w komórkach BaF3 transfekowanych mmpl i hmpl w sposób opisany w przykładzie 1.

Przykład 13. cDNA świńskiego ligandu mpl; pML i pML-2

Świński ML (pML) cDNA wydzielono metodę RACE PCR. W skrócie oligo dT starter i 2 specyficzne startery skonstruowano w oparciu o sekwencję egzonu świńskiego genu ML kodującego aminowy koniec ML oczyszczono z surowicy aplastycznej świni. Otrzymano cDNA wytworzony z różnych tkanek aplastycznej świni, a następnie poddano je amphfikacji. Produkt cDNA z PCR o 1342 bp znaleziono nerce i subklonowano. Szereg klonów posekwencjonowano stwierdzając, że kodują one dojrzały świński ligand mpl (me obejmujący pełnego sygnału wydalania). Stwierdzono, że cDNA koduje dojrzałe białko o 332 aminokwasach (pML₃₃₂) zawierające sekwencję pokazaną na fig. 18 (SEQ ID NO: 9 i 16).

Metoda

Wydzielanie genu pML i cDNA. Genomowe klony świńskiego genu ML wydzielono przez selekcjonowanie świńskiej geonomowej biblioteki w EMBL3 (ClontechInc.)zpR45. Bibliotekę selekcjonowano zasadniczo w sposób opisany w przykładzie 7. Wydzielono szereg klonów i egzon kodujący sekwencję aminokwasów identycznąz sekwencją otrzymaną z oczyszczonego ML poddano sekwencjonowaniu. Świński ML cDNA otrzymano stosując modyfikację procedury RACE PCR. Skonstruowano dwa startery ML oparte na sekwencji świńskiego genu ML. Pohadenylowany mRNA wydzielono z nerek aplastycznych świń zasadniczo w sposób opisany powyżej cDNA otrzymano metodą odwrotnej transkrypcji ze starterem BamdT (BamdT: 5' GACTCGAGGATCCATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT3') (SEQ ID NO: 55) ukierunkowanym przeciw ogonowi pohadenozynowemu w mRNA. Wstępnąrundę amphfikacji PCR (28 cykli w 95°C, 60 s, 58°C przez 60 s i 72°C przez 90 s) przeprowadzono stosując ML-specyficzny h-forward-1 starter (h-forward-1 · 5' GCTAGCTCTAGAAATTGCTCCTCGTGGTCATGCTTCT3') (SEQ ID NO: 43) oraz starter BAMAD (BAMAD: 5' GACTCGAGGATCCATCG 39 (SEQ ID NO: 56) w 100 ml mieszaninie reakcyjnej (50 mM KC1, 1,5 mM MgCl, 10 mM Tris pH 8,0, 0,2 mM dNTPs, z 0,05 U/ml polimerazy Amplitaą [Perkin Elmer Inc.]). Produkt PCR strawiono następnie Ciał, wyekstrahowano fenolem-chloroformem (1:1), wytrącono etanolem i zhgowano z 0,1 mg wektora Bluescnpt SK- (Stratagene Inc.) przeciętnym Ciał i Kpn 1. Po inkubowaniu przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, 1/4 mieszaniny hgacyjnej dodano bezpośrednio to drugiej rundy PCR (22 cykli, powyżej) stosując drugi ML-specyficzny starter forward-1 (forward-1· 5' GCTAGCTCTAGAAGCCCGGCTCCTCCTGCCTG 3') (SEQ ID NO: 57) oraz T3-21 (oligonukleotyd, który wiąże się z sekwencją sąsiadującą z obszarem wielokrotnego klonowania w wektorze Bluescnpt SK-):

(5- CGAAATTAACCCTCACTAAAG 39 (SEQ ID NO: 58).

Uzyskany produkt PCR strawiono Xbal i Clal, a następnie subklonowano w Bluescript SK-. Szereg klonów z niezależnych reakcji PCR poddano sekwencjonowaniu.

180 765

Zidentyfikowano również drugą formę oznaczonąjako pML-2, kodującąbiałko z delecją4 reszt aminokwasów (328 reszt aminokwasów) (patrz fig. 21 [SEQ ID NO: 21]). Porównanie sekwencji aminokwasów pML i pML-2 wykazuje że ta ostatnia forma jest identyczna z tym wyjątkiem delecji tetrapeptydu OLPP odpowiadającego resztom 111-114 (patrz fig. 22 [SEQ ID NO: 18 i 21]). Delecje 4 aminokwasów zaobserwowane mysim, ludzkim i świńskim ML cDNA występują w dokładnie tych samych miejscach w przewidywanych białkach.

Przykład 14. Test CMK indukowania przez trombopoetynę (TPO) ekspresji antygenu płytkowego GP_bIII_a

Komórki CMK utrzymywano w pożywce RMPI1640 (Sigma) uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej 110 mM glutaminy. Przy przygotowywaniu do testu, komórki zbiera się, przemywa i ponownie zawiesza w stężeniu 5 χ 10⁵ komórek/ml w wolnej od surowicy pożywce GIF uzupełnionej 5 mg/litr insuliny bydlęcej, lOmg/litr apo-transferyny, 1 X pierwiastki śladowe. Na płytce z 96 studzienkami z płaskim dnem do każdej studzienki dodawano wzorzec TPO lub próbki w odpowiednich rozcieńczeniach, w ilości po 100 μΐ. 100 μΐ zawiesiny komórek CMK dodaje się do każdej studzienki i płytki inkubuje się w 37°C w inkubatorze z 5% CO₂ przez 48 godzin. Po inkubacji płytki odwirowuje się przy 1000 obrotach/minutę w 4°C przez 5 minut. Supematanty odrzuca się i 100 μΐ FITC-skoniugowanego GPII_bHI_a monoklonalnego przeciwciała 2D2 dodaje się do każdej studzienki. Po inkubacji w 4°C przez 1 godzinę płytki ponownie odwirowuje się przy 1000 obrotach/minutę przez 5 minut. Supematanty zawierające niezwiązane przeciwciało odrzuca się i 200 μΐ 0,1% BSA-PBS dodaje się do każdej studzienki. Etap przemywania 0,1% BSA-PBS powtarza się 3 razy. Komórki analizuje się następnie w aparacie FASCAN przeprowadzając standardową jednoparametrową analizę przy pomiarze względnej intensywności fluorescencji.

Przykład 15. Test D AMI dla trombopoetyny (TPO) przez pomiar endomitotycznej aktywności komórek DAMI na płytkach microtiter z 96 studzienkami.

Komórki DAMI utrzymuje się w IMDM + 10% surowicy końskiej (Gibco), uzupełnionym 10 mM glutaminą, 100 ng/ml penicyliny G150 pg/ml streptomycyny. Przy przygotowywaniu do testu, komórki zbiera się, przemywa i ponownie zawiesza w stężeniu 1 χ 10⁶ komórek/ml w IMDM +1% surowicy końskiej. Na płytce z 96 studzienkami z płaskim dnem wzorzec TPO lub próbki dodawano do zawiesiny komórek DAMI. Komórki inkubuje się przez 48 godzin w 37°C w inkubatorze z 5% CO₂. Po inkubacji płytki odwirowuje się w wirówce Sorvall 6000B przy 1000 obrotów/minutę przez 5 minut w 4°C. Supematant odrzuca się dwukrotnie przemywa się 200 μΐ PBS-0,1 % BSA. Komórki utrwala się dodając 200μ1 schłodzonego w lodzie 70% etanoluPBS i zawiesza się przez zasysanie. Po inkubacji w 4°C przez 15 minut płytki odwirowuje się przy 2000 obrotów/minutę przez 5 minut i do każdej studzienki dodaje się 150 μΐ Img/ml RNAzy zawierającej 0,1 mg/ml jodku propidiowego i 0,05% Tween-20. Po inkubacji przez 1 godzinę w 37°C zmiany w zawartości DNA oznacza się metodą cytometrii przepływowej. Oznacza się poliploidowość wyliczając ją ilościowo w sposób następujący:

Znormalizowany stosunek poliploidów (% komórek w komórkach> G2 + M / % w< G2 + M) z TPO

NPR ~ ^v______________________________________________ % komórek w komórkach> G2 + M / % w< G2+M) w kontrolnej

Przykład 16. Test trombopoetynowy (TPO) m vivo (test nawrotu mysich płytek) Test in vivo oznaczania wytwarzania płytek krwi z wykorzystaniem ³⁵S

Myszom C57BL6 (otrzymany z Charles River) wstrzyknięto dootrzewnowe (IP) 1 ml kociej przeciw-mysiej surowicy płytkowej (6 amps) w dniu 1 wywołując małopłytkowość. W dniach 5 i 6 myszom dwukrotnie wstrzyknięto IP czynnik lub kontrolnie PBS. W dniu 7 wstrzyknięto dożylnie 30 pCi Na₂ ³⁵SO₄ w 0,1 ml roztworu soli i % wbudowania wstrzykniętej dawki ³⁵S wbudowywania do krążących płytek krwi oznaczono w próbkach krwi z myszy traktowanych i kontrolnych. Równocześnie oznaczano liczbę płytek i leukocytów w krwi pobranej z zatoki tylno-ocznej.

180 765

Przykład 17. KIRA ELIS A dla trombopoetyny (TPO) przez pomiar fosforylowania chimerycznego receptora mpl-Rse.gD

Ludzki receptor mpl został ujawniony przez Vigona i innych, PNAS, USA 89: 5640-5644 (1992). Chimeryczny receptor obejmujący pozakomórkową domenę (ECD) receptora mpl oraz transmembranową (TM) i wewnątrzkomórkową domenę (ICD) Rse (Mark i inni, J. of Biol. Chem. 269(14): 10720-10728 [1994]) z karboksylowym-końcowym polipeptydem flagowym (Le. Rse.gD) wykonano do stosowania w opisanym teście KIRA ELISA. Test schematycznie przedstawiono na fig. 30 i 31.

(a) Wytwarzanie czynnika wychwytującego

Wytworzono monoklonalny anty-gd (klon 5B6) przeciw peptydowi glikoproteiny D z wirusa Herpes simplex (Paborsky i inni, Protein Engineering 3(6): 547-553 [1990]). Oczyszczony preparat bazowy doprowadzono do stężenia 3,0 mg/ml w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS), pH 7,4 i porcje po 1,0 ml przechowywano w -20°C.

(b) Wytwarzanie przeciwciała anty-fosfotyrozynowego

Monoklonalnąanty-fosfotyrozynę, klon 4G10, otrzymano z UBI (Lakę Placid, NY) i biotynylowano stosując biotyno-N-hydroksysukcynamid o długim ramieniu (Biotin-X-NHS, Research Organics, Cleveland, OH).

(c) Ligand

Ligand mpl otrzymano technikami rekombinacji przedstawionymi w opisie. Oczyszczony ligand mpl przechowywano w 4°C jako roztwór bazowy.

(d) Wytwarzanie kwasu nukleinowego Rse.gD

Syntetyczne dwumciowe oligonukleotydy zastosowano do odtwarzania sekwencji kodującej C-końcowych 10 aminokwasów (880 - 890) ludzkiego Rse i dodano 21 dodatkowych aminokwasów zawierających epitop dla przeciwciała 5B6 i kodon stopu. W tabeli 10 przedstawiono końcową sekwencję syntetycznej części genu fuzyjnego.

Tabela 10

Syntetyczna dwumciowa część ludzkiego genu fuzyjnego Rse

Nić kodująca 5'-TGCAGCAAGGGCTACTGCCACACTCGAGCTGCGCAGATGCTAGCCTCAAGA TGGCTG ATCCAAATCGATTCCGCGGCAAAGATCTTCCGGTCCTGTAGAAGCT3'	(SEQIDNO 59)
Nić nie kodująca (nonsensowna) 5'-AGCTTCTACAGGACCGGAAGATCTTTGCCGCGGAATCGATTTGGATCAGCCA TCTTG AGGCTAGCATCTGCGCAGCTCGAGTGTGGCAGTAGCCCTTGCTGCA-3'	(SEQIDNO 60)

Syntetyczny DNA zligowano z cDNA kodującym aminokwasy 1-880 ludzkiego Rse w miejscu Pstl poczynając od nukleotydu 2644 opublikowanej sekwencji DNA ludzkiego Rse (Mark i inni, Journal ofBiological Chemistry 269(14): 10720-10728 [1994]) i miejscami Hindlll w pohlinkerze wektora ekspresji pSVI7.ID.LL (patrz fig. 32 A-L; SEQ ID NO: 22) w celu uzyskania plazmidu ekspresji pSV.ID.Rse.gD. W skrócie plazmid ekspresji obejmuje a dicistronowy pierwotny transkrypt, który zawiera sekwencję kodującą DHFR związaną przez 5' donor składania i 3' akceptor składania miejsc składania intronu, a następnie sekwencję kodującą Rse.gD. Pełnej długości (nie rozszczepień) informacja zawiera DHFR jako pierwszą otwartą ramkę odczytu i z tego względu wytwarza białko DHFR, co umożliwia wybranie trwałych transformantów.

(e) Wytwarzanie kwasu nukleinowego mpl-Rse.gD

Plazmid ekspresji pSV.ID.Rse.gD wytworzony w sposób opisany powyżej zmodyfikowano uzyskując plazmid pSV.ID.M.tmRd6, który zawierał sekwencje kodujące ECD ludzkiego mpl (aminokwasy 1-491) złączone z transmembranową domeną i wewnątrzkomórkową domeną Rse.gD (aminokwasy 429-911). Syntetyczne oligonukleotydy zastosowano do połączenia sek

180 765 wencji kodujących część pozakomórkowej domeny ludzkiego mpl z częściąsekwencji kodującej Rse w dwóch etapach reakcji klonowania opisane przez Marka i innych, J. Biol. Chem. 267: 26166-26171 (1992). W pierwszej reakcji PCR zastosowano startery Ml (5'-TCTCGCTACCGTTTACAG-3') (SEQ ID NO: 61)

1M2 (5'-CAGGTACCCACCAGGCGGTCTCGGT-3') (SEQ ID NO: 62) z matrycą cDNA mpl oraz R1 (5'-GGGCCATGACACTGTCAA-3') (SEQ ID NO: 63)

1R2 (5'-GACCGCCACCGAGACCGCCTGGTGGGTACCTGTGGTCCTT-3') (SEQ ID NO: 64) z matrycącDNA Rse. Część PvuII-SmaI tego połączenia fuzyjnego zastosowano do konstrukcji pełnej długości chimerycznego receptora.

(f) Transferowanie komórek

Komórki DP12.CHO (EP 307 247 opublikowany 15 marca 1989) poddawano elektroporacji z pSV.ID.M.tmRd6, który zlinearyzowano w unikatowym miejscu Notl w szkielecie plazmidu. DNA wytrącono etanolem po ekstrakcji fenolem/chloroformem extraction i zawieszono w 20 μΐ 1/10 TrisEDTA. Następnie 10 pg DNA inkubowano z 10⁷komórekCHO DP12w 1 ml PBS w lodzie przez 10 minut przed elektroporacjąprzy 400 V1330 pF. Komórki ponownie wstawiono do lodu na 10 minut przed naniesieniem na nieselektywny ośrodek. Po 24 godzinach komórki zasilono pożywką bez nukleozydów w celu wyselekcjonowania stabilnych klonów DHFR+.

(g) Selekcja transformowanych komórek do stosowania w KIRA ELISA

Klony wytwarzające w wyniku ekspresji MPL/Rse.gD zidentyfikowano metodąblottingu Westema pełnych lizatów komórek po frakcjonowaniu metodą SDS-PAGE stosując przeciwciało 5B6, który wykrywa gD epitop tag.

(h) Pożywki

Komórki hodowano w F12/DMEM 50:50 (Gibco/BRL, Life Technologies, Grandlsland, NY). Pożywki uzupełniono 10% FBS poddanym diafiltracji (HyClone, Logan, Utah), 25 mM HEPES i 2 mM L-glutaminy.

(i) KIRA ELISA

Komórki DP12.CHO transformowane Mp/-Rse.gD zaszczepiono (3 χ 10⁴ na studzienkę) na płytce do hodowli z 96 studzienkami z płaskim dnem w 100 pl pożywki i hodowano przez noc w 37°C w 5% CO₂. Następnego ranka supematanty ze studzienek zdekantowano, płytki łagodnie przetarto papierowym ręcznikiem. 50 pl pożywki zawierające próbki lub 200, 50, 12,5, 3,12, 0,78,0,19,0,048 albo 0 ng/ml ligandu mpl dodano do każdej studzienki. Komórki stymulowano w 37°C przez 30 minut, po czym supematanty ze studzienek zdekantowano i płytki ponownie łagodnie przetarto papierowym ręcznikiem. W celu przeprowadzenia lizy komórek i rozpuszczenia chimerycznego receptora do każdej studzienki dodano 100 pl buforu łizującego. Bufor hzujący stanowił 150 mM NaCl zawierający 50 mM HEPES (Gibco), 0,5% Triton-X 100 (Gibco), 0,01 % timerosal, 30 KlU/ml aprotyniny (ICN Biochemicals, Aurora, OH), 1 pM chlorowodorku fluorku 4-(2-aminoetylo)-benzenosulfonylu (AEBSF; ICN Biochemicals), 50 mM leupeptyny (ICN Biochemicals) 12 mM ortoaanadanu sodowego (Na₃VO₄; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), pH 7,5. Płytkę łagodnie mieszano na wytrząsarce do płytek (Bellco Instruments, Vmeland, NJ) przez 60 minut w temperaturze pokojowej.

180 765

W czasie rozpuszczania komórek płytką mocrotiter do ELISA (Nunc Maxisorp, Inter Med, Dania) powlekane przez noc w 4°C monoklonalnymi anty-gD przeciwciałami 5B6 (5,0 pg/ml w 50 mM buforze węglanowym, pH 9,6, 100 μΙ/studzienkę) zdekantowano, wytarto papierowym ręcznikiem i zablokowano dodając 150 μΐ/studzienkę buforu Błock Buffer [PBS zawierający 0,5% B S A (Intergen Company, Purchase, NY) i 0,01 % timerosalu] przez 60 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem. Po 60 minutach tę płytkę powleczoną anty-gd 5B6 przemyto 6 razy buforem przemywającym (PBS zawierający 0,05% Tween-20 i 0,01 % timerosalu) stosując zautomatyzowaną płuczkę do płytek (ScanWasher 300, Skatron Instruments, Inc, Sterłmg, VA).

Lizat zawierający rozpuszczony MPURse.gD ze studzienki microtiter do hodowli komórek przeniesiono (85 μΐ/studzienkę) do anty-gd 5B6-powleczonej i zablokowanej studzienki ELISA, po czym prowadzono inkubację przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem. Nie związany mplRse.gD usunięto przez przemywanie buforem przemywającym i 100 μΐ biotynylowanego 4G10 (anty-fosfotyrozyny) rozcieńczonego 1:18000 buforem rozcieńczającym (PBS zawierający 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, 5 mM EDTA i 0,01% timerosalu), 56 ng/ml dodano do każdej studzienki. Po mkubowaniu przez 2 godziny w temperaturze pokojowej płytkę przemyto i 100 μΐ peroksydazy chrzanowej (HRPO)-skoniugowanej ze streptawidyną (Zymed Laboratories, S San Francisco, CA) rozcieńczonej 1:60000 w buforze rozcieńczającym dodano do każdej studzienki. Płytkę inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem. Wolny komugat awidyny odmyto away i 100 pl świeżo przygotowanego roztworu substratu (tetrametylobenzydyny [TMB]; 2-składnikowy zestaw substratu; Kirkegaard i Perry, Gaithersburg, MD) dodano do każdej studzienki. Reakcję prowadzono przez 10 minut, po czym wywoływanie barwy przerwano dodając 100 μΐ/studzienkę 1,0 M H₃PO₄. Absorbancję przy 450 nm zmierzono w odniesieniu do długości fali 650 nm (ABS450/650), stosując a czytnik płytek vmax (Molecular Devices, Pało Alto, CA) sterowany przez Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertmo, CA) i oprogramowanie DeltaSoft (BioMetallics, Inc, Princeton, NJ)

Krzywą wzorcową wyznaczono przez stymulowanie komórek dpl2.trkA,B lub C/gD 200, 50, 12,5,3,12,0,78,0,19,0,048 lub 0 ng/ml ligandu mpl i przedstawiono jako ng/ml TPO w funkcji średniej ABS450/650 ± odchylenie standardowe, stosując program DeltaSoft. Stężenia próbek otrzymano na drodze interpolacji absorbancji na krzywej wzorcowej wyrażając je w ng/ml aktywności TPO.

Stwierdzono, że ligand mpl jest zdolny do uaktywniania chimerycznego receptora mpl-Rse gD w sposób zależny od stężenia i specyficzny dla ligandu. Ponadto stwierdzono, że mplRse.gD KIRA-ELISA toleruje do 100% ludzkiej surowicy (pokazano) lub 100% plazm (me pokazano), co powoduje, że test jest przydatny do selekcjonowania pacjentów i próbek pK.

Krzywa wzorcowa TPQ₃₂ wytworzonych w 293

Stężenie TPO (ng/ml)

180 765

Zestawienie EC50 TPO

Forma TPO (komórka)	EC50 (wag./objęt.)	EC_S0 (molowość)
Hu TPO 332 (293)	2,56 ng/ml	67,4 PM
Mu TPO 332 (293)	3,69 ng/ml	97,1 pM
Hu TPO 153 (293)	~41 ng/ml	-1,08 nM
Hu TPO 155 (E. coli)	0,44 ng/ml	11,6 pM
Hu TPO 153met (E. coli)	0,829 ng/ml	21,8 pM

Przykład 18. ELISA oparta na receptorach dla trombopoetyny (TPO)

Płytki ELISA powleczono króliczym Ftyb^ anty-ludzkim IgG (Fc) buforze węglanowym o pH 9,6 w 4°C przez noc. Płytki zablokowano 0,5% albuminąz surowicy bydlęcej w PBS w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Zbiór z fermentatora zawierający chimeryczny receptor, mpl-IgG, dodano na płytki i inkubowano przez 2 godziny. Dwukrotne kolejne rozcieńczenia (0,39-25 ng/ml) wzorca (TPO₃₃₂ wytworzonego w komórkach 293 w stężeniach oznaczonych na podstawie ilościowej analizy aminokwasów) i kolejno rozcieńczone próbki w 0,5% albuminie z surowicy bydlęcej, 0,05% Tween 20, dodano na płytki i inkubowano przez 2 godziny. Związany TPO wykryto białkiem A oczyszczonym, biotynyłowanymi króliczymi przeciwciałami przeciw TPO₁₅₅, wytworzonymi w E. coh (1 godzina inkubowania), a następnie streptawidynę-peroksydazę (inkubowanie 30 minut) i 3,3',5,5'-tetrametylobenzydynę jako substrat. Absorbancję oznaczano przy 450 nm. Płytki przemyto pomiędzy etapami. W celu zanalizowania danych wykonano krzywą wzorcową stosując czteroparametrowy program Kaleidagraph dopasowywania krzywej. Stężenia próbek wyliczano z krzywej wzorcowej.

Przykład 19. Ekspresja i oczyszczanie TPO z komórek 293

1. Wytwarzanie wektorów eksopresji komórek 293 cDNA odpowiadający pełnej otwartej ramce odczytu TPO otrzymano metodą PCR stosując następujące ohgonukleotydy jako startery:

Tabela 11

Startery 293 PCR

Cla.FL.F 5' ATC GAT ATC GAT CAG CCA GAC ACC CCG GCC AG 3'	(SEQ ID NO: 65)
hmpII-R 5' GCT AGC TCT AGA CAG GGA AGG GAG CTG TAC ATG AGA 3'	(SEQ ID NO- 48)

PRK5-hmpl I (opisany w przykładzie 9) zastosowano jako matrycę w reakcji w obecności polimerazy pfu DNA (Stratagene). Wyjściową denaturację prowadzono przez 7 mmut w 94°C, po czym wykonano 25 cykli amphfikacji (1 minuta w 94°C, 1 minuta w 55°C 11 minuta w 72°C). Ostateczne wydłużanie prowadzono przez 15 minut w 72°C. Produkt PCR oczyszczono 1 klonowano pomiędzy miejsca restrykcji Ciał 1 Zbal plazmidu pRK5tkneo, wektora pochodnego pRK5, zmodyfikowanego tak, aby osiągnąć ekspresję genu odporności na neomycynę pod kontrolą promotora kinazy tymidynowej, uzyskując wektor pRK5tkneo.ORF. Drugi konstrukt odpowiadający homologicznej domenie epo wytworzono w taki sam sposób, ale stosując Cla.FL.F starter przedni i następujący starter odwrotny:

Arg.STOP.Xba: 5' TCT AGA TCT AGA TCA CCT GAC GCA GAG GGT GGA CC 3' (SEQ ID NO: 66)

Ostateczny konstrukt nazwano pRK5-tkneoEPO-D. Sekwencje obydwu konstruktów zweryfikowano w sposób opisany w przykładzie 7.

180 765

2. Transfekcja ludzkich embrionalnych komórek nerkowych

Przeprowadzono transfekcję 2 powyższych konstruktów do ludzkich embrionalnych komórek nerkowych metodą CaPO₄ w sposób opisany w przykładzie 9. W 24 godziny po transfekcji rozpoczęto selekcjonowanie klonów odpornych na neomycynę w obecności 0,4 mg/ml G418. 10-15 dni później poszczególne kolonie przeniesiono na płytki z 96 studzienkami i hodowano do zlania. Ekspresję ML₁₅₃ lub ML₃₃₂ w kondycjonowanych ośrodkach z tych klonów oceniono stosując test proliferacji Ba/F3-mpl (opisany w przykładzie 1).

3. Oczyszczanie rhML₃₃₂

Kondycjonowane ośrodki 293-rhML₃₃₂ wprowadzono do kolumny Blue-Sepharose (Pharmacia) doprowadzonej do stanu równowagi w 10 mM fosforanie sodowym pH 7,4 (bufor A) Kolumnę przemyto następnie (po 10 objętości kolumny) buforu A i buforu A zawierającego 2 M mocznik. Z kolei kolumnę eluowano buforem A zawierającym 2 M mocznik i IM NaCl. Pulę z eluowama The-Blue-Sepharose bezpośrednio naniesiono do kolumny WGA-Sepharose doprowadzonej do stanu równowagi w buforze A. Kolumnę WGA-Sepharose przemyto (10 objętości kolumny) buforu A zawierającego 2 M mocznik i 1 M NaCl i eluowano tym samym buforem zawierającym 0,5M N-acetylo-D-glukozaminy. Eluat z WGA-Sepharose wprowadzono do kolumny C4-HPLC (Synchrom, Inc.) doprowadzonej do stanu równowagi w 0,1% TFA. Kolumnę C4-HPLC eluowano z nieciągłym gradientem propanolu (0-25%, 25-35%, 35-70%). Stwierdzono, że rhML₃₃₂ eluuje się w zakresie gradientu propanolu 28-30%. W SDS-PAGE oczyszczony rhML₃₃₂ migruje jako szerokie pasmo w obszarze żelu o 68-80 kDa (patrz fig. 15).

4. Oczyszczanie rhML₁₅₃

Kondycjonowane ośrodki 293-rhML₁₅₃ rozdzielono na Blue-Sepharose w sposób opisany dla rhML₃₃₂. Eluat z Blue-Sepharose wprowadzono bezpośrednio do kolumny z powinowactwem mpl, jak to opisano powyżej. RhML₁₅₃ eluowano z kolumny z powinowactwem mpl oczyszczano do homogeniczności stosując kolumnę C4-HPLC w takich samych warunkach jak dla rhML₃₃₂. W SDS-PAGE oczyszczono rhML_!53 rozdziela się na 2 główne i 2 uboczne pasma z Mr ~18 00021 000 (patrz fig. 15).

Przykład 20. Ekspresja i oczyszczanie TPO z CHO

1. Opis wektorów ekspresji CHO

Wektory ekspresji stosowane w procedurach elektroporacji protocols opisanych poniżej oznaczono jako pSVI5.ID.LL.MLORF (pełnej długości lub hTPO₃₃₂) i pSVI5.ID.LL.MLEPO-D (skrócony lub hTPO₁₅₃).

Odpowiednie cechy tych plazmidów pokazano na fig. 23 124.

2. Wytwarzanie wektorów ekspresji CHO cDNA odpowiadający pełnej otwartej ramce odczytu hTPO otrzymano metodą PCR stosując startery oligonukleotydowe przedstawione w tabeli 12.

Tabela 12

Startery PCR wektorów ekspresji CHO

Cla.FL F2 5' ATC GAT ATC GAT AGC CAG ACA CCC CGG CCA G 3'	(SEQ ID NO. 47)
ORF. Sal 5' AGT CGA CGT CGA CGT CGG CAG TGT CTG AGA ACC 3'	(SEQ ID NO: 67)

PRK5-hmpl I (opisany w przykładach 7 i 9) zastosowano jako matrycę w reakcji w obecności polimerazy pfu DNA (Stratagene). Wstępną denaturację prowadzono przez 7 minut w 94°C, po czym wykonano 25 cykli amphfikacji (1 minuta w 94°C, 1 minuta w 55°C 11 minuta w 72°C). Ostateczne wydłużanie prowadzono przez 15 minut w 72°C). Produkt PCR oczyszczono i klonowano pomiędzy miejsca restrykcji Ciał i Sali plazmidu pSVI5.ID.LL uzyskując wektor

180 765 pSVI5.ID LL.MLORF. Drugi konstrukt odpowiadający homologicznej domenie EPO otrzymano w taki sam sposób, ale stosując Cla.FL.F2 jako starter przedni i następujący starter odwrotny:

EPOD.Sal 5' AGT CGA CGT CGA CTC ACC TGA CGC AGA GGG TGG ACC 3' (SEQ ID NO: 68)

Ostateczny konstrukt nazwano pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. Sekwencje obydwu konstruktów zweryfikowano w sposób opisany w przykładach 7 i 9.

Zasadniczo sekwencje kodujące pełnej długości i skrócony hgand wprowadzono do miejsca wielokrotnego klonowania wektora ekspresji CHO, pSVI5.ID.LL. Wektor ten zawiera obszar wczesnego promotora/enhancera SV40, zmodyfikowanąjednostkę składającą zawierającą mysi DHFR cDNA, miejsce wielokrotnego klonowania do wprowadzania odpowiedniego genu (w danym przypadku opisanej sekwencji TPO) i sygnału poliadenylowama SV40 oraz początek replikacji i gen β-laktamazy gene do selekcji plazmidów i amplifikacji w bakteriach.

3. Metodologia ustalania stabilnych linii komórek CHO, w których następuje ekspresja zrekombinowanego ludzkiego TPO₃₃₂ 1 TPO₁₅₃

a. Opis macierzystej hnii komórek CHO

Linia komórek gospodarza CHO (komórekj aj owych chińskiego chomika) zastosowana do ekspresji cząsteczek TPO według wynalazku jest znana jako CHO-DP12 (patrz EP 307 247 opublikowany 15 marca 1989). Tą linię komórek ssaka wyselekcjonowano pod względem klonowania z transfekcji linii macierzystej (CHO-KL DUX-B11 (DHFR-) otrzymano od dr Franka Lee ze Stanford University za pozwoleniem dr L. Chasina) za wektorem wytwarzającym w wyniku ekspresji prepromsulinę, uzyskując klon ze zredukowanym wymaganiem odnośnie insuliny. Komórki te sąponadto DHFR-minus, tak że klon można wyselekcjonować pod względem obecności sekwencji cDNA wektora przez hodowanie na pożywce nie zawierającej uzupełnień nukleozydowych (glicyna, hipoksantyna i tymidyna). Taki układ selekcji dla linii CHO ze stabilną ekspresją jest powszechnie używany.

b. Metoda transfekcji (elektroporacja)

Lmie komórek wytwarzające w wyniku ekspresji TPO₃₃₂ i TPO_]53 wytworzono przez transfekcję komórek DP12 na drodze elektroporacji (patrz np. Andreason, G.L. J. Tiss. Cult. Met., 15,56 [1993]) odpowiednio z linearyzowanym plazmidem pSVI5.ID.LL.MLORF lub pSVI5.ID.LL.MLEPO-D. 3 mieszaniny reakcyjne enzymów restrykcyjnych przygotowano dla cięcia każdego plazmidu: 10 pg, 25 pg i 50 pg wektora z enzymem NOTI, z wykorzystaniem standardowych metod biologii molekularnej. Takie miejsce restrykcji występuje tylko raz w wektorze w obszarze linearyzacji 3' i poza jednostkami transkrypcji hgandu TPO (patrz fig. 23). 100 pl mieszanin reakcyjnych pozostawiano do inkubacji na noc w 37°C. Mieszanki wyekstrahowano raz układem fenol-chlorofonn-alkohol izoamylowy (50:49:1) extracted i wytrącono etanolem w suchym lodzie przez około 1 godzinę. Osad oddzielono przez 15-minutowe wirowanie, a następnie wysuszono. Lmearyzowany DNA zawieszono w 50 pl pożywki Ham's DMEM-F12 1.1 uzupełnionej standardowymi antybiotykami i 2 mM glutaminą.

Zawieśmy hodowli komórek zebrano, przemyto raz ośrodkiem stosowanym do zawieszania DNA i na koniec ponownie zawieszono w tym samym ośrodku w stężeniu 10⁷ komórek w 750 pl Porcje komórek (750 pl) i każdej z Imearyzowanych mieszanek DNA mkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, po czym przeniesiono do komory BRL do elektroporacji Każdą mieszaninę reakcyjną poddawano następnie elektroporacji w standardowym aparacie BRL elektroporacji przy 350 V z nastawą330 pF i niskąpojemnością. Po elektroporacji komórki pozostawiono do opadnięcia w aparacie na 5 minut, a następnie inkubowano je w lodzie przez kolejne 10 minut. Komórki po elektroporacji przeniesiono na 60 mm szalki do hodowli komórek zawierające 5 ml standardowej, pełnej pożywki dla komórek CHO (wysokoglukozowy DMEMF12 50:50 uzupełniania glicyną z 1 X GHT, 2 mM glutaminąi 5% płodowsurowicy cielęcej) i hodowano przez noc w 5% CO₂ w inkubatorze do hodowli komórek.

180 765

c. Metoda wyboru i selekcjonowania

Następnego dnia komórki usunięto z płytek przez trypsynizowanie znanymi sposobami i przeniesiono na 150 mm szalki do hodowli komórek, zawierające selektywną pożywkę DHFR (Ham's DMEM-FL 2, 1:1 pożywka opisana powyżej uzupełniona 2% lub 5% dializowaną płodową surowicę cielęcą, ale pozbawiona glicyny, hipoksantyny i tymidyny - jest to standardowa stosowana selekcyjna pożywka DHFR). Komórki z każdej z 60 mm szalek rozmieszczono na 5 150 mm szalkach. Komórki inkubowano przez 10-15 dni (z jedną zmianą pożywki) w 37°C/5% CO₂, aż do uwidocznienia się klonu i osiągnięcia wielkości umożliwiającej przeniesienie na szalki z 956 szalki z 956 studzienkami W ciągu 4-5 dni linie komórek przeniesiono na szalki z 96 studzienkami stosując sterylna żółte końcówki na pipecie nastawionej na 50 ml. Komórki hodowano do zlania (zazwyczaj 3-5 dni), po czym szalki trypsynizowano i wykonano 2 kopie oryginalnej tacki. 2 spośród 3 kopii wstawiono na krótko do zamrażarki, przy czym komórki w każdej studzience rozcieńczono do 50 μΐ 10% FCS w DMSO. Kondycjonowane przez 5 dni próbki ośrodka bez surowicy z trzeciej tacki po zlaniu poddano ocenie w celu określenia ekspresji TPO w teście aktywności opartym na komórkach Ba/F. Klony wykazujące największą aktywność w tym teście ożywiono z przechowywanych hodowli i przeniesiono do 2 150 ml kolb T w celu powiększenia skali hodowli, aby przystosować je do hodowli w zawiesinie, ponownie zbadać i założyć bank.

d Procedura amphfikacji

Szereg hnn komórek o najwyższym mianie z opisanej powyżej selekcji poddano standardowej procedurze amplifikacji metotreksanem w celu wyodrębnienia klonów o wyższym mianie. Kolonie komórek CHO powiększono i naniesiono na 10 cm szalki z metotreksanem w 4 stężeniach (50 nM, 100 nM, 200 nM i 400 nM) przy dwóch lub 3 liczbach komórek (10⁵, 5xl0⁵1 10⁶komórek/szalkę). Hodowle te inkubowano następnie w 37°C/5% CO₂ aż do ustabilizowania się klonów umożliwiającego ich przeniesienie na szalki z 96 studzienkami w celu dokonania dalszych badań. Szereg klonów o podwyższonym mianie uzyskanych z tej selekcji ponownie wystawiono na działanie metotreksanu o wyższym stężeniu (600 nM, 800 nM, 1000 nM 11200 nM) i, podobnie jak poprzednio, odporne klony pozostawiono do ustabilizowania się, a następnie przeniesiono na szalki z 96 studzienkami i poddano badaniom.

4. Hodowla stabilnych linii komórek CHO wytwarzających w wyniku ekspresji zrekombinowany ludzki TPO₃₃₂ i TPO₁₅₃

Komórki z banku odmrożono i populację komórek powiększono prowadząc standardową hodowlę w pożywce zawierającej lub nie zawierającej surowicy. Po rozszerzeniu do uzyskania odpowiedniej gęstości komórki przemyto w celu usunięcia wyczerpanej pożywki. Komórki hodowano następnie dowolnym znanym sposobem, np. periodycznie, periordycznie z zasilaniem lub w sposób ciągły, w 25-40°C, przy obojętnym pH, z rozpuszczonym O₂ w ilości co najmniej 5%, aż do nagromadzenia znaczących ilości wydzielonego TPO. Płyn z hodowli oddzielono od komórek na drodze mechanicznej, np. przez odwirowanie.

5. Oczyszczanie zrekombinowanego ludzkiego TPO z płynów z hodowli CHO

Zebrany płyn z hodowli komórek (HCCF) wprowadzono bezpośrednio do kolumny Blue Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia) doprowadzonej do stanu równowagi in 0,01 M fosforanie Na, pH 7,4, 0,15 M NaCl, w ilości około 100 litrów HCCF/litr żywicy, przy liniowej szybkości przepływu około 300 ml/godzinę/cm². Kolumnę przemyto następnie (3 - 5 objętości kolumny) buforem eksilibracyjnym, a następnie (3-5 objętości kolumny) 0,01 M fosforanem Na, pH 7,4, 2,0 M mocznik. TPO eluowano (3-5 objętości kolumny) 0,01 M fosforan Na o pH 7,4, 2,0 M mocznik, 1,0 M NaCl.

Pulę z Blue Sepharose Pool zawierającą TPO wprowadzono do kolumny Wheat Germ Lectm Sepharose 6MB (Pharmacia) doprowadzonej do stanu równowagi 0,01 M fosforanie Na, pH 7,4,2,0 M mocznika i 1,0 M NaCl w ilości 8 -16 ml puli Blue Sepharose Pool na ml żywicy, przy szybkości przepływu około 50 ml/godzinę/cm². Kolumnę przemyto następnie (2-3 objętości kolumny) buforu ekwilibracyjnego. TPO eluowano (2-5 obj ętości kolumn) 0,01 M fosforanem Na o pH 7,4, 2,0 M mocznik, 0,5 M N-acetylo-D-glukozamina.

180 765

Pulę z Wheat Germ Lectin Pool doprowadzono do stężenia 0,04% C₁₂E₈ i 0,1% kwasu tnfluorooctowego (TFA). Uzyskanąpulę wprowadzono do kolumny C4 z odwróceniem faz (Vydac 214TP1022) doprowadzonej do stanu równowagi w 0,1% TFA, 0,04% C₁₂E₈, przy obciążeniu około 0,2 - 0,5 mg białka/ml żywicy i szybkości przepływu 157 m/godzinę/cm².

Białko eluowano z dwufazowym liniowym gradientem acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA, 0,04% C₁₂E₈. Pierwszą fazę stanowił liniowy gradient od 0 do 30% acetonitrylu w ciągu 15 minut, a drugą stanowił liniowy gradient od 30 do 60% acetonitrylu w ciągu 60 minut. Eluaty TPO uzyskano przy około 50% acetonitrylu. Pulę zabrano na podstawie SDS-PAGE.

Pulę C4 rozcieńczono 2 objętościami 0,01 M fosforanu Na o pH 7,4, 0,15 M NaCl i poddano diafiltracji względem około 6 objętości 0,01 M fosforanu Na o pH 7,4,0,15 M NaCl przez Amicon YM lub podobną membranę do ultrafiltracji odcinającąciężar cząsteczkowy 10 000 - 30 000 Daltonów. Uzyskany diafiltrat można bezpośrednio przerobić lub bardziej zatężyć na drodze ultrafiltracji. Diafiltrat/koncentrat nastawia się na ostateczne stężenie 0,01% Tween-80.

Całość lub część diafiltratu/koncentratu odpowiadającą 2 - 5% wyliczonej objętości kolumny wprowadza się do kolumny Sephacryl S-300 HR (Pharmacia) doprowadzonej do stanu równowagi w 0,01 M fosforanie Na, pH 7,4,0,15 M NaCl, 0,01% Tween-801 prowadzi się chromatografię przy szybkości przepływu około 17 ml/godzinę/cm². Frakcje zawierające TPO, wolne od agregatów i produktów dergaracji proteolitycznej łączy się na podstawie SDS-PAGE. Uzyskanąpulę sączy się przez filtr 0,22 μ, Millex-GV lub inny podobny i przechowuje się w 2-8°C.

Przykład 21. Tranformowanie i indukcja syntezy białka TPO w E. coli

1. Konstrukcja wektorów ekspresji TPO E. coli

Plazmidy pMP21, pMP151, pMP41, pMP57 i pMP202 zapewniają ekspresję pierwszych 155 aminokwasów TPO w dół od małego lidera, różnego dla różnych konstruktów. Lidery zapewniająprzede wszystkim wysoki poziom inicjowania translacji mitiation i szybkie oczyszczanie. Plazmidy pMP210-1, -T8, -21, -22, -24, -25 zapewniają ekspresję pierwszych 153 aminokwasów TPO w dół od wspomnianej inicjacji i różnią się tylko zastosowaniem kodonu dla pierwszych 6 aminokwasów TPO, podczas gdy plazmid pMP251 stanowi pochodną pMP210-1 w której karboksylowy koniec TPO jest wydłużony o 2 aminokwasy. Wszystkie powyższe plazmidy będą zapewniać wysokie poziomy wewnątrzkomórkowej ekspresji TPO w E. coli po indukcji promotora tryptofanu (Yansura, D. G. i inni, Methods in Enzymology (Goeddel, D. V., Ed.) 185: 54-60, Academic Press, San Diego [1990]). Plazmidy pMPl i pMP172 stanowią półprodukty w konstrukcji powyższych plazmidów wewnątrzkomórkowej ekspresji TPO.

(a) Plazmid pMP 1

Plazmid pMPl jest wektorem wydzielania dla pierwszych 155 aminokwasów TPO, uzyskanym przez zligowanie 5 fragmentów DNA, jak to pokazano na fig. 33. Pierwszym z nich był wektor pPho21, z którego usunięto mały fragment Mlul-Baml. pPho21 stanowi pochodną phGHl (Chang, C. N. i inni, Gene 55: 189-196 [1987]) w którym gen ludzkiego hormonu wzrostu zastąpiono genem E. coli phoA, a miejsce restrykcji Mlul zostało wstawione do sekwencji kodującej sekwencję sygnałową STII przy aminokwasach 20-21.

Następne dwa fragmenty, fragment DNA Hinfl-Pstl o 258 parach zasad z pRK5-hmpl I (przykład 9) kodujący aminokwasy TPO 19-103 i następujący syntetyczny DNA kodujący aminokwasy 1-18.

5'-CGCGTATGCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTGACCTCCGAGTCCTCAGTAA ACTGCTTCGTG (SEQ ID NO: 69)

ATACGGTCGGGCCGAGGAGGACGAACACTGGAGGCTCAGGAGTCATTTGAC GAAGCACTGA-5' (SEQ ID NO: 70) wstępnie zligowano z łigazę T4-DNA, a następnie przecięto Pstl. Czwartym fragmentem był fragment Pstl-Haelll o 152 parach zasad z pRK5hmpll kodującego aminokwasy TPO 104-155. Ostatnim fragmentem był fragment StuI-BamHI o 412 parach zasad z pdhlO8 zawierającego lambda względem transkrypcyjnego terminatora, jak to opisano uprzednio (Scholtissek, S. i inni, NAR 15. 3185 [1987]).

180 765 (b) Plazmid pMP21

Plazmid pMP21 przeznaczony jest do ekspresji pierwszych 155 aminokwasów TPO z pomocą lidera 13 aminokwasów obejmującego część sekwencji sygnałowej STII. Skonstruowano go przez hgowanie 3 fragmentów DNA, jak to pokazano na fig. 34, przy czym pierwszym z nich był wektor pVEG31, z którego usunięto mały fragment Xbal-Sphl. Wektor pVEG31 stanowi pochodnąpHGH207-l (de Boer, H. A. i inni, w Promoter Structure and Function (Rodnguez, R. L. i Chamberlain, M. J. red.), 462, Praeger, New York [1982]) w którym gen ludzkiego hormonu wzrostu zastąpiono genem naczyniowego śródbłonkowego czynnika wzrostu (ten identyczny fragment wektora można otrzymać z tego ostatniego plazmidu).

Drugą część w ligowaniu stanowił syntetyczny dupleks DNA o następującej sekwencji:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAA

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGAAGAATTGCGC-5' (SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 72)

Ostatni fragment stanowił fragment MluI-SphI o 1072 parach zasad z pMPl kodującego 155 aminokwasów TPO.

(c) Plazmid pMP 151

Plazmid pMP151 przeznaczony jest do ekspresji pierwszych 155 aminokwasów TPO w dół od lidera obejmującego 7 aminokwasów sekwencji sygnałowej STII, 8 histydyn i miejsce rozszczepienia czynnika Xa. Jak to pokazano na fig. 35, pMP 151 skonstruowano przez zligowanie 3 fragmentów DNA, z których pierwszy stanowił opisany uprzednio wektor pVEG31, z którego usunięto mały fragment Xbal-Sphl. Drugi fragment stanowił syntetyczny dupleks DNA o następującej sekwencji:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCA CATCGAAGGTCGTAGCC

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGT GTAGCTTCCAGCAT-5' (SEQ ID NO: 73) (SEQ ID NO· 74)

Ostatnim był fragment Bgll-SphI o 1064 parach zasad z pMPH kodującego 154 aminokwasy TPO. Plazmid pMPl 1 jest identyczny z pMPl z tym wyjątkiem zmian kilku kodonów w sekwencji sygnałowej STII (fragment ten można otrzymać pMPl).

(d) Plazmid pMP202

Plazmid pMP202 jest bardzo podobny do wektora ekspresji pMP 151, z tym wyjątkiem, że miejsce rozszczepiania czynnika Xa w liderze zastąpiono miejscem rozszczepiania trombiny. Jak to pokazano na fig. 36, pMP202 skonstruowano przez ligowanie 3 fragmentów DNA. Pierwszym z nich był uprzednio opisany pVEG31, z którego usunięto mały fragment Xbal-Sphl. Drugi stanowił syntetyczny dupleks DNA o następującej sekwencji:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCATCACCATCACCATCACCATCA CATCGAACCACGTAGCC

TTAATACTTTTTCTrATAGCGTAAAGTAGTGGTAGTGGTAGTGGTAGT GTAGCTTGGTGCAT-5' (SEQ ID NO: 75) (EQ ID NO: 76)

Ostatni fragment stanowił fragment Bgll-SphI o 1064 parach zasad z uprzednio opisanego plazmidu pMPll.

180 765 (e) Plazmid pMP172

Plazmid pMP172 stanowi wektor wydzielania dla pierwszych 153 aminokwasów TPO i jest półproduktem do konstrukcji pMP210. Jak to pokazano na fig. 37,pMP172 otrzymano przez ligowanie 3 fragmentów DNA, z których pierwszy stanowił wektor pLS321 amB, z którego usunięto mały fragment EcoRI-HindllL Drugim był fragment EcoRI-Hgal o 946 parach zasad fragment z uprzednio opisanego plazmidu pMPll. Ostatni kawałek stanowił syntetyczny dupleks DNA o następującej sekwencji:

5'-TCCACCCTCTGCGTCAGGT (SEQ ID NO:77)

GGAGACGCAGTCCATCGA-5' (SEQ ID NO: 78) (f) Plazmid pMP210

Plazmid pMP210 przeznaczony jest do ekspresji pierwszych 153 aminokwasów TPO po wspomnianej inicjacji translacyjnej. Plazmid ten w rzeczywistości wykonano jako bank plazmidów tcy pierwszych 6 kodonów TPO uśredniono w trzeciej pozycji każdego kodonu i skonstruowano w sposób pokazany na fig. 38 przez ligowanie 3 fragmentów DNA. Pierwszym z nich był uprzednio opisany wektor pVEG31, z którego usunięto mały fragment Xbal-Sphl. Drugim był syntetyczny dupleks DNA pokazany poniżej, poddany najpierw obróbce polimeraząDNA I (Klenowa), a następnie przez trawienie Xbal i Hinfl, kodujący inicjacyjną metioninę i uśrednione pierwszych 6 kodonów TPO.

5'-GCAGCAGTTCTAGAATTATGTCNCCNGCNCCNCCNGCNTGTGACCTCCGA

ACACTGGAGGCT

GTRCTCAGTAAA (SEQ ID NO: 79)

CAAGAGTCATTTGACGAAGCACTGAGGGTACAGGAAG-5 ' (SEQ ID NO· 80)

Trzecim był fragment Hinfl-SphI fragment o 890 parach zasad from pMP172 kodującego aminokwasy 19-153 TPO.

Bank plazmidów pMP210 bank o około 3700 klonów zretransformowano na wysokotetracyklinowych (50 pg/ml) płytkach LB w celu wyselekcjonowania klonów o wysokiej inicjacji translacyjnej (Yansura, D. G. i inni, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 4:151-158(1992]). Spośród 8 kolonii, które przetrwały na wysoko-tetracyklmowych płytkach, 5 najlepszych pod względem ekspresji TPO poddano sekwencjonowamu DNA, którego wyniki pokazano na fig. 39 (SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 i 28).

(g) Plazmid pMP41

Plazmid pMP41 skonstruowano do ekspresji pierwszych 155 aminokwasów TPO złączonych z liderem obejmującym 7 aminokwasów sekwencji sygnałowej STII, po której następuje czynnik rozszczepiania miejsca Xa. Plazmid skonstruowano w sposób pokazany na fig. 40 przez hgowanie tree kawałków DNA, z których pierwszy stanowił uprzednio opisany wektor pVEG31, z którego usunięto mały fragment Xbal-Sphl. Drugim był następujący syntetyczny dupleks DNA:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTATCGAAGGTCGTAGCC (SEQ ID NO: 81)

TTAATACTTTTTCTTATAGCGTAAATAGCTTCCAGCAT-5 (SEQ ID NO: 82)

Ostatni element w ligowaniu stanowił fragment BgU-Sphl o 1064 parach zasad, z uprzednio opisanego plazmidu pMPll.

(h) Plazmid pMP57

Plazmid pMP57 wytwarza w wyniku ekspresji pierwsze 155 aminokwasów TPO w dół od lidera obejmującego 9 aminokwasów sekwencji sygnałowej STII dwuzasadowe miejsce LysArg. Takie miejsce dwuzasadowe umożliwia usunięcie lidera przez proteazę ArgC. Plazmid ten skonstruowano w sposób pokazany na fig. 41 przez ligowanie 3 kawałków Pierwszym z nich był

180 765 uprzednio opisany wektor pVEG31 z którego usunięto mały fragment Xbal-Sphl. Drugim był następujący syntetyczny dupleks DNA:

5'-CTAGAATTATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTAAACGTAGCC (SEQ ID NO· 83)

TTAATACTTMCTTATAGCGTAAAGAAGAATTTGCAT-5' (SEQ ID NO: 84)

Ostatni element w ligowamu stanowił fragment Bgll-SphI o 1064 zasad, z uprzednio opisanego plazmidu pMP 11.

(i) Plazmid pMP251

Plazmid pMP251 stanowi pochodnąpMP210-1 w którym 2 dodatkowe aminokwasy TPO wprowadzono na końcu karboksylowym. Jak to pokazano na fig. 42, plazmid ten skonstruowano przez ligowanie 2 kawałków DNA, z których pierwszy stanowi uprzednio opisany pMP21, z którego usunięto mały fragment Xbal-Apal. element w ligowaniu stanowił fragment Xbal-Apal o 316 parach zasad z pMP210-1.

2. Transformowanie i indukcja E. coli wektorami ekspresji TPO

Powyższe plazmidy ekspresji TPO zastosowano do transformowania szczepu E. coli 44C6 (w3110 tonA_ń ψοΗ_β 1οη_Δ ορΡ_Δ galE) stosując metodę szoku termicznego z CaCl₂ (Mandel, M. i inni, J. Mol. Biol., 53: 159-162, [1970]). Transformowane komórki hodowano najpierw w 37°C w pożywce LB zawierającej 50 pg/ml karbenicyliny aż do uzyskania gęstości optycznej (600 nm) hodowli około 2-3. Hodowle LB rozcieńczono następnie 20x pożywką M9 zawierającą 0,49% (wagowo/objętościowych) kwasów kazaminowych i 50 pg/ml karbenicylmy. Po hodowaniu z napowietrzaniem w 30°C przez 1 godzinę, dodano kwas indolo-3-akrylowy od uzyskania stężenia 50 pg/ml. Następnie hodowlę kontynuowano w 30°C z napowietrzaniem przez kolejne 15 godzin, po czym komórki zebrano przez odwirowanie.

Przykład 22. Wytwarzanie biologicznie czynnego TPO (Met^-1 1-153) w E. coli

Procedury podane poniżej odnośnie wytwarzania biologicznie czynnego, złożonego TPO (met^-11-153) zastosować można w analogiczny sposób do odzyskiwania innych wariantów TPO obejmujących N i C-końcowe wydłużone formy (patrz przykład 23).

A. Odzysk nierozpuszczalnego TPO (Met^-1 1-153)

Komórki E. coli wytwarzające w wyniku ekspresji TPO (Met'¹ 1-153) kodowany przez plazmid pMP2101 poddaje się fermentacji jak to opisano powyżej. Zazwyczaj około 100 g komórek zawiesza się w 1 litrze (10 objętości) buforu do rozbijania komórek (10 mM Tns, 5 mM EDTA, pH 8) w homogemzatorze Polytron i komórki odwirowuje się przy 5000 x g przez 30 minut. Przemyty osad komórkowy ponownie zawiesza się w 1 litrze buforu do rozbijania komórek w homogenizatorze Polytron i zawiesinę komórek przepuszcza się przez urządzenie LH Celi Disrupter (LH Inceltech, Inc.) lub przez Microfluidizer (Microfluidics International) zgonie z instrukcjami producentów. Zawiesmę odwirowuje się przy 5 000 g przez 30 minut, po czym zawiesza się i odwirowuje drugi raz uzyskując błyszczącą masę komórkową. Przemytą masę zużywa się natychmiast lub przechowuje w stanie zamrożonym w -70°C.

B. Rozpuszczanie i oczyszczanie monomerycznego TPO (Met^-1 1-153)

Powyższą masę zawiesza się w 5objętościach Wagowych 20 mM Tns, pH 8, z 6-8 M guanidyny i 25 mM DTT (ditiotreitolu) i miesza się przez 1-3 godziny lub przez noc w 4°C, aby doprowadzić do rozpuszczenia białka TPO. Wysokie stężenia mocznika (6-8 M) są również przydatne, ale zazwyczaj powoduje to obniżenie wydajności w porównaniu z guanidyną. Po rozpuszczeniu roztwór odwirowuje się przy 30 000 x g przez 30 minut uzyskując klarowny supematant zawierający zdenturowane, monomeryczne białko TPO. Supernatant poddaje się następnie chromatografii w kolumnie do filtracji żelowej Superdex 200 (Pharmacia, 2,6 x 60 cm) przy szybkości przepływu 2 ml/minutę i białko eluuje się 20 mM Na fosforanem, pH 6,0, z 10 mM DTT. Zbiera się frakcje zawierające monomeryczne, zdenaturowane białko TPO eluowane pomiędzy 1601200 ml. Białko TPO ponadto oczyszcza się w półpreparatywnej kolumnie C4 z odwróceniem faz (2 x 20 cm VYDAC). Próbkę wprowadza się z ob

100

180 765 jętością 5 ml/mmutę do kolumny doprowadzonej do stanu równowagi w 0,1% TFA (kwas trifluorooctowy) z 30% acetonitrylu. Białko eluuje się z liniowym gradientem acetonitrylu (30-60% w ciągu 60 minut). Oczyszczone, zredukowane białko eluuje się przy około 50% acetonitrylu. Materiał ten stosuje się do składania w celu uzyskania biologicznie czynnego wariantu TPO.

c. Wytwarzanie biologicznie czynnego TPO (Met^-1 1-153)

Około 20 mg monomerycznego, zredukowanego i zdenaturowanego białka TPO in 40 ml 0,1% TFA/50% acetonitrylu rozcieńcza się do 360 ml buforem do składania zawierającym ewentualnie następujące odczynniki:

mM Tns

0,3 M NaCl mM EDTA

2% detergent CHAPS

25% gliceryny mM utlenionego glutationu mM zredukowanego glutationu pH nastawione na 8,3

Po wymieszaniu bufor do składania łagodnie miesza się w 4°C przez 12-48 godzin dla zapewnienia maksymalnej wydajności składania formy TPO z prawidłowymi połączeniami disulfidowymi (patrz poniżej). Roztwór zakwasza się następnie TFA do ostatecznego stężenia 0,2%, sączy przez 0,45 lub 0,22 μ filtr i dodaje się 1/10 objętości acetonitrylu. Roztwór pompuje się bezpośrednio do kolumny C4 z odwróceniem faz i oczyszczony, złożony TPO (Met'¹ 1-153) eluuje się z takim samym programem gradientu jak powyżej. Złożony, biologicznie czynny TPO eluuje się przy około 45% acetonitrylu w takich warunkach. Wersje TPO z nieprawidłowymi wiązaniami disulfidowymi TPO eluująsię wcześniej. Ostatecznie oczyszczony TPO (Met’¹ 1-153) wykazuje ponad 95% czystości na podstawie analizy na żelach SDS i analitycznej chromatografu C4 z odwróceniem faz. Do badań na zwierzętach materiał oczyszczony na C4 dializowano do fizjologicznie kompatybilnych buforów. Przydatne są izotomczne bufory (10 mM octan Na,pH5,5,10mMbursztynianNa,pH5,5 lub 1 OmM fosforan Na, pH 7,4) zawierające 150mM NaCl i 0,01% Tween 80.

Z uwagi na wysoką aktywność TPO w teście Ba/F3 (połowę maksymalnej stymulacji uzyskuje się przy około 3 pg/ml), uzyskać można biologicznie czynny materiał stosując wiele różnych buforów, detergentów i układów redoksy. Jednakże w większości przypadków uzyskuje się jedynie niewielką ilość właściwie złożonego materiału (<10%). W procesach produkcyjnych pożądanejest, aby wydajności składania wynosiły co najmniej 10%, jeszcze korzystniej 30-50%, a najkorzystniej >50%. Wiele różnych detergentów (Triton Χ-100, dodecylo-P-maltozyd, CHAPS, CHAPSO, SDS, sarkozyl, Tween 20 i Tween 80, Zwittergent 3-141 inne) zbadano pod względem skuteczności zapewniania wysokich wydajności składania. Stwierdzono, że spośród tych środków tylko środki z rodziny CHAPS (CHAPS i CHAPSO) działająnajskuteczniej w reakcji składania i ograniczają agregację białka i tworzenie niewłaściwych disulfidów. Najkorzystniej CHAPS stosuje się w ilości ponad około 1%. Aby uzyskać jak największe wydajności, należy zastosować chlorek sodowy, którego optimum stężenia przypada w zakresie pomiędzy 0,1 M i 0,5 M. Obecność EDTA (1-5 mM) w buforze redoksy wywiera korzystny wpływ na ograniczenie katalizowanego przez metal utleniania (i agregacji), co zaobserwowano w przypadku pewnych preparatów. Przy stężeniach gliceryny ponad 15% uzyskuje się optymalne warunki składania. Aby uzyskać maksymalne wydajności, należy zastosować zarówno glutation utleniony jak i zredukowany glutation lub utlenioną i zredukowaną cysteinę. Zazwyczaj wyższe wydajności obserwowano gdy ilość moli składnika utlenionego w parze redoksy była równa lub wyższa od ilości składnika zredukowanego w parze redoksy. Wielkości pH pomiędzy 7,5 i około 9 są optymalne do składania takich wariantów TPO. Rozpuszczalniki organiczne (np. etanol, acetonitryl, metanol) są tolerowane w stężeniach 10-15% lub niższych. Przy większych ilościach rozpuszczalników organicznych wzrasta ilość niewłaściwie złożo

180 765

101 nych form. Zazwyczaj przydatny jest bufor Tris i fosforanowy. Wyższe poziomy właściwie złożonego TPO uzyskuje się prowadząc inkubację w 4°C.

Wydajność składania rzędu 40-60% (w stosunku do ilości zredukowanego i zdenaturowanego TPO stosowanego w reakcji składania) są typowe dla preparatów TPO oczyszczonych w pierwszym etapie C4. Materiał aktywny można także otrzymać przy stosowaniu mniej czystych preparatów (np. bezpośrednio po kolumnie Superdex 200 lub po wyjściowej ekstrakcji załamujących światło ciał), z tym że wydajności są niższe z uwagi na obfite wytrącanie się i zakłócenia białek nie-TPO podczas procesu składania TPO.

W związku z tym, że TPO (Met^-1 1-153) zawiera 4 reszty cysteiny, można uzyskać 3 różne disulfidowe wersje tego białka:

W czasie wyjściowych badań przy ustalaniu warunków składania szereg różnych pików zawierając białko TPO rozdzielono metodą chromatografii C4 z odwróceniem faz. Tylko jeden z tych pików wykazywał znaczącą aktywność biologiczną oznaczaną w teście z Ba/F3. Następnie warunki składania zoptymalizowano aby osiągnąć wybiórczo taką wersję. W takich warunkach błędnie złożone wersje stanowiły mniej niż 10-20% całości monometrycznego TPO.

Na podstawie spektrometrii masowej i sekwencjonowama ustalono, że układ wiązań disulfidowych w biologicznie czynnym TPO jest 1-4 i 2-3 (czyli odpowiada wersji 1). Próbki różnych pików rozdzielonych w C-4 (5-10 nmoli) strawiono trypsyną (stosunek molowy trypsyny do białka 1 25). Mieszaniny po trawieniu analizowano metodą spektrometrii masowej z desorpcją laserową, z udziałem matrycy, przed i redukcji DTT. Po redukcji określono masy odpowiadające większości większych trypsynowych peptydów w TPO. W przypadku próbek nieredukowanych część mas znikła, a zaobserwowano nowe masy. Masy nowych pików odpowiadały zasadniczo sumom poszczególnych trypsynowych peptydów z par disulfidowych. W związku z tym można bezwzględnie przyjąć, że układ disułfidowy złożonego, zrekombinowanego, biologicznie czynnego TPO jest 1-4 i 2-3. Odpowiada to znanemu układowi disulfidowemu spokrewnionej cząsteczki erytropoetyny.

D. Aktywność biologiczna zrekombinowanego, złożonego TPO (met 1-153)

Złożony i oczyszczony TPO (Met’¹1-153) wykazuje aktywność zarówno w testach in vitro jak i in vivo. W teście z komórkami Ba/F3 ilość zapewniająca 50% maksymalnej stymulacji wbudowywania tymidyny do komórki Ba/F3 wynosi 3,3 pg/ml (0,3 pM). W teście ELISA opartym na receptorze mpl połówkowa maksymalna aktywność wystąpiła przy 1,9 ng/ml (120 pM). W przypadku zwierząt normalnych i takich, u których osłabiono działanie szpiku prawie śmiertelną dawką promieniowania rentgenowskiego działanie TPO (Met^-1 1-153) było bardzo silne (aktywność zaobserwowano przy dawkach wynoszących zaledwie 30 ng/mysz) w pobudzaniu wytwarzania nowych płytek krwi.

Przykład 23. Wytwarzanie innych biologicznie czynnych wariantów TPO w E. coli różne warianty TPO wytworzone w E. coli oczyszczono i złożono uzyskując biologicznie czynne formy przedstawiono poniżej.

(l)MLF -13 reszt z sekwencji sygnałowej STII pochodzenia bakteryjnego połączono z Nkońcową domeną TPO (reszty 1-155).

Uzyskano sekwencję

MKKNIAFLLNAYASPAPPAC... CVRRA (SEQ ID NO: 85)

1 S1 gdzie sekwencję lidera podkreślono, a C...C reprezentuje Cys do Cys . Wariant ten skonstruowano w celu uzyskania tyrozyny radio-jonizacji TPO do badań receptorowych i biologicznych.

102

180 765 (2) H8MLF - 7 reszt z sekwencji STII, 8 reszt histydyny i czynnik Xa, sekwencję enzymatycznego rozszczepiania IEGR połączono z N-końcową domeną (reszty 1-55) TPO. Uzyskano sekwencję

MKKNIAFHHHHHHHHIEGRSPAPPAC....CVRRA (SEQ ID NO: 86) gdzie sekwencję lidera podkreślono, a C...C reprezentuje Cys⁷ do Cys¹⁵¹. Wariant ten po oczyszczeniu i złożeniu można poddać obróbce enzymatycznym czynnikiem Xa, który spowoduje rozszczepienie za resztąarginmy sekwencji IEGR, tak że powstanie wariant TPO ze 155 resztami, z naturalną seryną jako N-końcowym aminokwasem.

(3) T-H8MLF - wytwarza się w sposób opisany powyżej w przypadku wariantu (2), z tym wyjątkiem, że wrażliwą na trombinę sekwencję IEPR łączy się z N-końcową domeną TPO. Uzyskano następując sekwencję

MKKNIAFHHHHHHHHIEPRSPAPPAC....CVRRA (SEQ ID NO: 87) gdzie sekwencję lidera podkreślono, a C...C reprezentuje Cys⁷ do Cys¹⁵¹. Wariant ten po oczyszczeniu i złożeniu można poddać obróbce enzymatycznej trombinąuzyskuj ąc naturalny N-końcowy wariant TPO zawierający 155 reszt.

A. Odzyskiwanie, rozpuszczenie i oczyszczanie monometrycznego, biologicznie czynnego TPO, warianty (1), (2) i (3).

Ekspresja wszystkich wariantów zachodzi w E. coli. Większość wariantów stwierdzono w odbijających światło ciałach, co zaobserwowano w przykładzie 22 w odniesieniu do TPO (Met'¹1-153). Zastosowano identyczne procedury odzysku, rozpuszczenia i oczyszczania monomerycznych wariantów TPO jak w sposobie opisanym w przykładzie 22. Zastosowano identyczne warunki składania jak w przypadku TPO (Met’¹ 1-153) uzyskując ogólne wydajności 30-50%. Po składaniu warianty TPO oczyszczono metodą chromatografii C4 z odwróceniem faz w 0,1% TFA stosując gradient acetonitrylu gradient jak poprzednio. Wszystkie warianty TPO (w formach meproteohzowanych) wykazywały aktywność biologiczną ocenianą w treści Ba/F3, odpowiadającą połówkowej maksymalnej aktywności przy 2-5 pM.

B. Proteolityczna obróbka wariantów (2) i (3) prowadząca do autentycznego authentic Nkońcowego TPO (1-155).

Warianty TPO (2) i (3) strawiono peptydem enzymatycznie odszczepiającym lidera przed normalnąN-końcową resztą aminokwasu TPO. Po składaniu i oczyszczaniu wariantu (2) i (3), jak to opisano powyżej, każdy z nich poddano trawieniu odpowiednim enzymem. W przypadku każdego z wariantów acetonitryl z etapu C4 z odwróceniem faz usunięto przedmuchując łagodny strumień azotu przez roztwór. Następnie do wariantów dodano czynnik Xa lub trombinę w sposób opisany poniżej.

W przypadku wariantu (2) TPO 1 M bufor Tris, pH 8, dodano do wolnego od acetonitrylu roztworu do uzyskania stężenia 50 mM i pH nastawiono na 8, gdy było to niezbędne. NaCl i CaCl₂dodano do uzyskania stężeń odpowiednio 0,1 M i 2 mM. Czynnik Xa (New England Biolabs) dodano do uzyskania stosunku molowego enzymu do wariantu około 1:25 - 1:100. Próbkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny w celu zapewnienia maksymalnego rozszczepianie ocenianego na podstawie zmian w migracji na żelach SDS, świadczących o utracie sekwencji lidera. Następnie mieszaninę reakcyjną oczyszczano metodą chromatografu C4 z odwróceniem faz stosując te same gradienty i warunki jak przy oczyszczaniu właściwie złożonego wariantu. Nierozszczepiony wariant B oddziela się od rozszczepionego wariantu (2) w tych warunkach. Stwierdzono, że N-końcowe aminokwasy stanowiąSPAPP, co wskazuje, że usuwanie N-końcowej sekwencji lidera zakończyło się powodzeniem. Czynnik Xa powodował również w zmiennych ilościach wewnętrzne rozszczepianie w domenie TPO; rozszczepianie zaobserwowano za resztą arginmy w pozycji numer 118 z utworzeniem dodatkowej N-końcowej sekwencji TTAHKDP-(SEQ ID NO: 88). Na nieredukujących żelach SDS zaobserwowano pojedyncze pasmo przy około 17000 daltonów dla wariantu rozszczepionego czynnikiem Xa; na żelach redukujących zaobserwowano dwa pasma o ciężarze

180 765

103 cząsteczkowym około 12000 i 5000 daltonów, potwierdzające rozszczepienie przy argminie 118. Obserwacje te potwierdziły również, że 2 części cząsteczki utrzymywane są poprzez wiązanie disulfidowe pomiędzy 1 i 4 resztami cysteiny, co wydedukowano z doświadczeń trypsynowego trawienia opisanych powyżej. W teście biologicznym Ba/F3 oczyszczony wariant TPO (1-155) po usunięciu N-końcowej sekwencji lidera i po wewnętrznym rozszczepieniu wykazuje połówkową maksymalną aktywność 0,2 - 0,3 pM. Nienaruszony wariant z sekwencją lidera wykazuje połówkową maksymalną aktywność 2-4 pM.

W przypadku wariantu (3) jako bufor trawiący zastosowano 50 mM Tns, pH 8, 2% CHAPS, 0,3 M NaCl, 5 mM EDTA i ludzką lub bydlęcą trombinę (Calbiochem) przy stosunku wagowym enzymu do wariantu białka TPO 1:25 - 1:50. Trawienie prowadzono w temperaturze pokojowej przez 2-6 godzin. Postęp trawienia oceniono na żelach SDS, jak powyżej dla reakcji rozszczepiania czynnikiem Xa. Zazwyczaj ponad 90% rozszczepienia sekwencji lidera uzyskiwano po takim czasie. Uzyskany TPO oczyszczano w kolumnach C4 z odwróceniem faz, jak to opisano powyżej; na podstawie sekwencjonowania aminokwasów stwierdzono, że zawiera on pożądany N-komec. Uzyskano jedynie niewielkie (< 5%) ilości wewnętrznego rozszczepiania przy tym samym wiązaniu arginma-treonina, zaobserwowano powyżej w przypadku czynnika Xa Uzyskane białko TPO wykazywało wysoką aktywność biologiczną z połówkową maksymalną aktywnością w teście Ba/F3 0,2-0,4 pM. W teście ELISA opartym na receptorze mpl białko to wykazywało połówkową maksymalną reakcję przy 2-4 ng/ml oczyszczonego białka (120-240 pM), podczas gdy nienaruszony wariant zawierający sekwencję lidera działał w obydwu testach 5-10 razy słabiej Do badań na zwierzętach HPLC-oczyszczone, rozszczepione białko dializowano do fizjologicznie dopuszczalnych buforów, stosując 150 mM NaCl, 0,01% Tween 80 i 10 mM bursztyman sodowy, pH 5,5, lub 10 mM octan sodowy, pH 5,5, albo 10 mM fosforan sodowy, pH 7,4 Analiza HPLC i na żelach SDS potwierdziły, że oczyszczone białko zachowuje stabilność przez szereg tygodni przy przechowywaniu w 4°C. W przypadku myszy normalnych i z osłabionym działaniem szpiku oczyszczono TPO z autentyczną N-końcową sekwencją był bardzo aktywny stymulując wytwarzanie płytek krwi w dawkach zaledwie 30 ng/mysz.

Przykład 24. Syntetyczny ligand mpl

Jakkolwiek ludzki ligand mpl (hML) zwykle wytwarza się stosując techniki rekombinacji, można go także syntetyzować na drodze enzymatycznego ligowama fragmentów syntetycznego peptydu stosując metody opisane poniżej. Syntetyczne wytwarzanie hML umożliwia wbudowywanie nienaturalnych aminokwasów lub syntetycznych grup funkcyjnych takich jak glikol polietylenowy. Poprzednio wykonano mutant serynowej proteazy, subtilizyny BPN, subtiligazę (S221C/P225A) skonstruowano, aby skutecznie hgować estry peptydów w wodnym roztworze (Abrahmsen i inni, Blochem., 30:4151-4159 [1991]). Obecnie wykazano, że syntetyczne peptydy można enzymatycznie ligować sekwencyjnie uzyskując enzymatycznie aktywne długie peptydy i białka takie jak rybonucleaza A (Jackson i inni, Science, [1994]). Technika ta, opisana BARDZIEJ SZCZEGÓŁOWO poniżej, umożliwia chemiczne syntetyzowanie długich białek, które uprzednio można było uzyskać tylko w technologii rekombinacji DNA.

Ogólną strategię syntezy hML₁₅₃ z zastosowaniem subtiligazy przedstawiono poniżej (schemat 1). Rozpoczynając od całkowicie odblokowanego peptydu odpowiadającego C-końcowemu fragmentowi białka, N-końcowo chroniony, C-końcowo uaktywniony peptyd estrowy dodaje się wraz z subtiligazą. Po zakończeniu reakcji produkt wydziela się metodą HPLC z odwróceniem faz i grupę chroniącą usuwa się z N-końca. Przeprowadza się ligowame następnego fragmentu peptydu, odblokowuje się i proces powtarza się stosując kolejne peptydy aż do uzyskania białka pełnej długości. Proces ten jest zbliżony do techniki w fazie stałej w tym, że N-końcowo chroniony, C-końcowo uaktywniony peptyd hguje się z N-końcem poprzedniego peptydu, a białko syntetyzuje się w kierunku C—>N. Jednakże z uwagi na to, że w wyniku sprzęgania osiąga się dodanie 50 reszt, a produkty wydziela się po każdym hgowamu, syntetyzować można o wiele dłuższe czyste białka z rozsądnymi wydajnościami.

104

180 765

Schemat 1

Strategia syntezy hML z zastosowaniem subtiligazy

R-NH-Peptyd ₂-co-R' + H₂N-Pept yd _rCO₂ | 1) Subtiligaza

R-NH-Peptyd 2-CO-NH-Peptyd _rCO₂ | 2) Zn/CH₃CO₂H

H₂N-Peptyd ₂-CO-NH-Peptyd _rCO₂

3) powtórzyć 1+2

H₂N-Peptyd 3-CO-NH-Pept ₂-CO-NH-Peptyd _rCO₂

Na podstawie zdobytej wiedzy odnośnie specyficzności sekwencji subtiligazy, a także sekwencji aminokwasów z biologicznie czynną „epo-domeną” hML, podzielono hML₁₅₃ na 7 fragmentów zawierających po 18-25 reszt. Zsyntetyzowano testowe tetrapeptydy ligowania w celu ustalenia odpowiednich połączeń ligowania dla 18-25 merów. W tabeli 13 przedstawiono wyniki takich testowych hgowań.

Tabela 13

Testowe ligowania hML Donor i peptydy nukleofilowe rozpuszczono w stężeniu 10 mM w 100 mM tncyme (pH 7,8) w 22°C Dodano ligazę do osiągnięcia stężenia 10 μΜ, stosując wyjściowy roztwór 1,6 mg/ml (~70 μΜ) i hgowanie prowadzono przez noc.

Wydajności oznaczają % ligowania w stosunku do hydrolizy peptydów donorowych

Miejsce	Donor (gic-K-NH₂)	Nukleo-fil-NH₂	% Hydrolizy	% ligowania
1	2	3	4	5
1 (23/24)	HVLH (SEQ ID NO. 89)	SRLS (SEQ ID NO. 90)	92	08
(22/23)	SHVL (SEQIDNO 91)	HSRL (SEQIDNO 92)	48	52
2 (46/47)	AVDF (SEQ ID NO. 93)	SLGE (SEQ ID NO. 94)	22	78
3 (69/70)	AVTL (SEQIDNO 95)	LLEG (SEQIDNO 96)	53	47

180 765

105

c.d. tabeli 13

1	2	3	4	5
4 (89/90)	LSSL (SEQ ID NO. 97)	LGQL (SEQ ID NO. 98)	95	05
(88/89)	C(acm)LSS (SEQ ID NO· 99)	LLGQ (SEQIDNO· 100)	00	00
(90/91)	SSLL (SEQ ID NO. 101)	GQLS (SEQIDNO. 102)	45	55
(88/89)	CLSS (SEQIDNO 103)	LLGQ (SEQIDNO· 104)	90	10
(107/108)	LQSL (SEQIDNO 104)	LGTQ (SEQIDNO: 105)	99	01
(106/107)	ALQS (SEQ ID NO· 106)	LLGT (SEQIDNO: 107)	70	40
(128/129)	NAIF (SEQIDNO: 108)	LSFQ (SEQIDNO: 109)	60	40

Na podstawie tych doświadczeń można stwierdzić, że peptydy ligacyjne wymienione w tabeli 14 można wydajnie ligować za pomocą subtiligazy. Odpowiednia grupa chroniąca N-koniec każdego donorowego peptydu estrowego jest niezbędna, aby zapobiec samohgowaniu. Wybrano izonikotynylową(iNOC) grupę chroniącą(Veber i inni, J. Org. Chem., 42’ 3286-3289 [1977]) z uwagi najej rozpuszczalność w wodzie, to, że można ją wprowadzać w ostatnim etapie syntezy peptydów w fazie stałej, a także z tego względu, że jest ona odporna na bezwodny HF stosowany do odblokowania i odszczepiania peptydów od stałej fazy żywicy. Na dodatek można jąusunąć z peptydu po każdym hgowaniu w łagodnych warunkach redukujących (Zn/CH₃CO₂H) uzyskując wolny N-koniec do przeprowadzania kolejnego ligowania. Ester glikolan lizyloamidu (gic-K-NH₂) zastosowano do C-końcowego uaktywniania, w oparciu o wcześniejsze doświadczenia, które wykazały, że jest on wydajnie acylowany przez subtiligazę (Abrahmsen i inni, Biochem., 30: 4151-4159 [1991]). iNOC-chronione, glc-K-amido-uaktywnione peptydy można syntetyzować stosując standardowe techniki reakcji w fazie stałej, przedstawione na schemacie 2. Peptydy następnie kolejno hguje się aż do uzyskania pełnego białka, po czym produkt finalny składa się in vitro. W oparciu o homologię z EPO uważa się, że pary disulfidowe tworzą się między resztami 7 i 151 oraz pomiędzy 28 i 85. Utlenianie disulfidu można łatwo przeprowadzić przez proste mieszanie zredukowanego materiału w atmosferze tlenowej przez szereg godzin Złożony materiał omóxa następnie oczyścić metodąHPLC, a frakcje zawierające aktywne białko połączyć i liofilizować. Wariantowo disulfidy można różnie chronić, tak aby kontrolować kolejność utleniania określonych par disulfidowych. Chronienie cysteiny 7 1151 grupami acetamidometylowymi (acm) powinno doprowadzić do utlenienia 28 i 85. Grupy acm można następnie usunąć i reszty 7 oraz 151 utlenić. I odwrotnie reszty 28 i 85 można chronić za pomocą acm i utlenianiem, w przypadku, gdy kolejne utlenianie utlenione jest konieczne dla prawidłowego złożenia. Cysteiny 28 i 85 można także podstawić innymi naturalnymi lub nienaturalnymi resztami innymi niż Cys, aby zapewnić właściwe utlenienie cystern 7 i 151.

106

180 765

Tabela 14.

Fragmenty peptydów stosowane w totalnej syntezie h-ML z zastosowaniem subhhgazy

Fragment/sekwencj a (SEQIDNO: 110) iN0C-HN-SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL-gic-K-NH41 -22)

2(SEQIDNO: 111) ' iNOC-HN-HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF-gic-K-NH₂ (23-46) (SEQIDNO: 112) iNOC-HN-SLGEWKTOMEETKAODILGAVTL-glc-K-NH₂ (47-69) 4(SEQIDNO: 113) iNOC-HN-LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL-glc-K-NH₂ (70-90) (SEQIDNO: 114) iNOC-HN-GQLSGQVRLLLGALOS-gic-K-NH₂ (90-106) (SEQ ID NO: 115) iNOC-HN-LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF-gic-K-NH₂ (107-128) (SEQ ID NO: 116)

H₂N-LSFOHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR-CO₂ (129-153)

Ligowanie peptydu przeprowadza się w 25°C 100 mM tncynie, pH 8 (świeżo otrzymanej i odgazowanej przez sączenie pod próżnią przez filtr 5 pm). Zazwyczaj C-końcowy fragment rozpuszcza się w buforze (2-5 mM peptydu) i a 10 x roztwór podstawowy subtihgazy (1 mg/ml in 100 mM tncyniee, pH 8) dodaje się, tak aby uzyskać ostateczne stężenie enzymu ~5 μΜ. 3-5 krotny molowy nadmiar glc-K-NH₂-uaktywnionego peptydu donorowego dodaje się w postaci stałej, rozpuszcza się i mieszaninę odstawia się w 25°C. Ligowanie śledzi się metodą analitycznej Cl8 HPLC z odwróceniem faz (CH₃CN/H₂O gradient z 0,1% TFA). Produkty ligowama oczyszcza się metodą preparatywnej HPLC i liofilizuje. Odblokowanie grupy izonikotynylowej (1NOC) przeprowadza się przez mieszanie pyłu cynkowego uaktywnionego HC1 z chronionym peptydem w kwasie octowym. Pył cynkowy usuwa się przez sączenie, a kwas octowy odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskany peptyd można zastosować bezpośrednio w następnym ligowaniu i proces powtórzyć. Syntetyczny hML₁₅₃ można ligować metodami analogicznymi do opisanych powyżej, dla syntetycznego lub zrekombinowanego hMLl54-332 uzyskując syntetyczny lub półsyntetyczny hML pełnej długości.

Syntetyczny hML wykazuje wiele zalet w porównaniu z rekombinantowym Wprowadzić można nienaturalne łańcuchy boczne w celu zwiększenia aktywności lub specyficzności. Pohmeryczne grupy funkcyjne, takie jak ghkol polietylenowy, wprowadzać można w celu zwiększenia czasu działania. Tak np. ghkol polietylenowy można przyłączyć do reszt lizyny poszczególnych fragmentów (tabela 14) przed lub po przeprowadzeniu jednego lub więcej etapów ligowania. Wiązania peptydowe wrażliwe na proteazę można usunąć lub zmienić poprawiając stabilność in vivo. Na dodatek syntetyzować można pochodne ciężkich atomów, co ułatwi badanie struktury.

180 765

107

Schemat 2.

Synteza w fazie stałej fragmentów peptydu do ligowania segmentów

Izonikotynyl (iNOC)

O

O^NH'^(PeP‘^yd)

glikolan-lizyloamid (glc-K-NH₂)

a) Żywicę hzylo-p-metylobenzhydryloaminową (MBHA) 1 (0,63 meq./g., Advanced ChemTech) mieszano z kwasem bromooctowym (5 eq.) i diizopropylokarbodiimidem (5 eq.) przez 1 godzinę w 25°C w dimetyloacetamidzie (DMA) uzyskując pochodnąbromoacetylową2. b) Żywicę dokładnie przemywa się DMA i poszczególne Boc-chronione aminokwasy (3 eq , Bachem) estryfikuje się przez mieszanie z wodorowęglanem sodowym (6 eq.) w dimetyloformamidzie (DMF) przez 24 godziny 50°C uzyskując odpowiednią żywicę glikolano-fenyloalanyloamidową- 3. Aminoacetylowanążywicę 3 przemywa się DMF (3x) i dichlorometanem (CH₂C1₂) (3x), po czym można ją przechowywać w temperaturze pokojowej przez szereg miesięcy Żywicę 3 można następnie wprowadzić do automatycznego syntetyzatora peptydów (Applied biosystems 430A) wydłużając peptydy zgodnie ze standardową procedurą syntezy w fazie stałej (5). c) Grupę Ν-α-Boc usuwa się w 45% roztworze kwasu trifluorooctowego w CH₂C1₂. d) Po wstępnym uaktywnieniu Boc-chronionego aminokwasu (5 eq.) za pomocąheksafluorofosforanu benzotnazol-l-iloksy-tris(dimetyloammo)fosfoniowego (BOP, 4 eq.) i N-metylomarfohny (NMM, 10 eq.) w DMA prowadzi się sprzęganie przez 1-2 godziny, e) Na koniec grupę N-a-Boc usuwa się (TFA/CH₂C1₂) uzyskując 4 i wprowadza się chroniącą grupę izonikotynylową(iNOC) w sposób opisany uprzednio (4) przez mieszanie z węglanem 4-izonikotynylo-2-4-dimtrofenylu (3 eq) i NMM (6 eq.) w DMA w 25°C przez 24 godziny, f) W wyniku odszczepienia i odblokowania peptydu na drodze obróbki bezwodnym HF (5% anizolu/5% sulfidu etylometylu) w 0°C przez 1 godzinę uzyskuje się iNOC-chroniony, ghkolanoe-lys-amidem uaktywniony peptyd 5, który oczyszcza się metodąC18 HPLC z odwróceniem faz (gradient CH₃CN/H₂O, 0,1% TFA). Identyczności wszystkich substratów potwierdza się metodą spektrometru masowej.

108

180 765

Uzupełniające możliwości

Zastrzeżony wynalazek realizuje się na podstawie powyższego opisu i łatwo dostępnych odnośników i materiałów wyjściowych. Tym niemniej zgłaszający zdeponował w American Type Culture Cołlection, Rockville, Md., USA (ATCC) poniższe linie komórek:

Escherichia coli, Dhl OB-pBSK-hmpl 11.8, nr ATCC CRL 69575, zdeponowany 24 lutego 1994.

Plazmid, pSVI5.ID.LL.MLORF, nr ATCC CRL 75958, zdeponowany 2 grudnia 1994; oraz komórki CHO DP-12, ML 1/50 MCB (oznaczone #1594), nr ATCC CRL 11770, zdeponowane 6 grudnia 1994.

Depozytu dokonano zgodnie z Budapest Treaty on the International Recognition the Deposit of Microorganisms for the Purposes of patent Procedurę odpowiednich uregulowań (Budapest Treaty). Zapewniają one utrzymywanie żywej hodowli przez 30 lat od daty zdeponowania Organizmy mogąbyć udostępniane przez ATCC zgodnie z zasadami Budapest Treat i uzgodnieniami pomiędzy zgłaszającymi i ATCC, które zapewniają nieograniczony dostęp po wydaniu stosownego patentu w USA. Dostępności zdeponowanego szczepu nie należy uważać za licencję na realizację wynalazku naruszającąprawa przyznane przez władze jakiegokolwiek rządu, zgodnie z prawami patentowymi.

Jakkolwiek z konieczności wynalazek został opisany w odniesieniu do konkretnych rozwiązań i określonych przykładów roboczych, specjalista po zapoznaniu się z powyższym opisem będzie mógł dokonać różnych zmian, równoważnych zastąpień lub modyfikacji podanej treści bez wychodzenia poza zakres i istotę wynalazku. W związku z tym wynalazek można realizować sposobami innymi niż konkretnie opisane. W związku z tym ochrona wynikająca z udzielenia patentu ograniczona jest jedynie do załączonych zastrzeżeń i ich równoważników.

Wszystkie odsyłacze wprowadza się w całości jako źródło literaturowe.

180 765

109

Wykaz sekwencji (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) TWÓRCY: Eaton, Dan L. de Sauvage, Frederic J.

(ii) TYTUŁ WYNALAZKU: TROMBOPOETYNA (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 144 (iv) ADRES KORESPONDENCYJNY:

(A) ADRESAT: Genentech, Inc.

(B) ULICA: 1 DNA Way (C) MIASTO: South San Francisco (D) STAN: California (E) PAŃSTWO: USA (F) KOD: 94080 (v) POSTAĆ DO ODCZYTU KOMPUTEROWEGO:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: 3.5 cali, 1.44 Mb dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: WinPatin (Genentech) (vi) DANE DOTYCZĄCE ZGŁOSZENIA:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/374540 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 18-Styczeń-1995 (C) KLASYFIKACJA:

(vii) PIERWSZEŃSTWO:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: PCT/US94/14553 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 28-Grudnia-1994 (vii) PIERWSZEŃSTWO:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/249376 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 25-Maja-1994 (vii) PIERWSZEŃSTWO:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/223263 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 04-Kwietnia-1994 (vii) PIERWSZEŃSTWO:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/196689 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 15-Lutego-1994 (vii) PIERWSZEŃSTWO:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/348658 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 02-Grudnia-1994 (vii) PIERWSZEŃSTWO:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/185607 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 21-Stycznia-1994

110

180 765 (vii) PIERWSZEŃSTWO:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/348657 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 02-Grudnia-1994 (vii) PIERWSZEŃSTWO:

(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/176553 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 03-Stycznia-1994 (viii) Pełnomocnik:

(A) Nazwisko: Winter, Daryl B.

(B) Numer w rejestrze: 32,637 (C) numer referencyjny: P0871P5 (ix) dane telekomunikacyjne:

(A) TELEFON: 650/225-1249 (B) TELEFAX: 650/952-9881 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 353 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:1:

Met -21

Glu -20

Leu Thr

Glu Leu Leu -15

Leu

Val

Val Met

Leu -10

Leu

Thr

Ala

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Pro

Ala

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

-5

1

5

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

10

15

20

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

25

30

35

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

40

45

50

Met

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

55

60

65

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

70

75

80

Cys

Leu

Ser

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

85

90

95

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

100

105

110

180 765

111

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Met

Leu

Val 145

Gly

Ser

Thr

Leu 150

Cys

Val

Arg

Ala 155

Pro

Thr

Ala 160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr 165

Ser

Leu

Val

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

Thr

Gly

Ser 195

Gly

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Asn

Gin

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

Ile

His 230

Glu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg 245

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro 275

Thr

Hi,s

Pro

Thr 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Val

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Pro

Asp 305

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr 310

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser 315

Pro

Leu

Asn

Thr 320

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

325 330 332 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1795 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa

112

180 765 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:2:

TCTTCCTACC CATCTGCTCC CCAGAGGGCT GCCTGCTGTG CACTTGGGTC 50

CTGGAGCCCT TCTCCACCCG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG 100

CCCCACCCTA CTCTGCCCAG AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC 150

CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA 200

GACACCCCGG CCAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC239

Met Glu Leu Thr Glu Leu LeuLeu

-21 -20-15

GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC278

Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr LeuSer

-10-5

AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT317

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val LeuSer

1510

AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG356

Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser ArgLeu

2025

AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC395

Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr ProVal

3035

CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA434

Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu TrpLys

4550

ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA473

Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp Ile LeuGly

6065

GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG512

Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala AlaArg

7075

GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG551

Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu LeuGly

8590

CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG590

Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly AlaLeu

95100

CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG629

Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg

180 765

113

105 110115

ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC668

Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe LeuSer

120 125130

TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG707

Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe LeuMet

135140

CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA746

Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg AlaPro

145 150155

CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC785

Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu ValLeu

160165

ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG824

Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly LeuLeu

170 175180

GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT863

Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr GlySer

185 190195

GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT902

Gly Leu Leu Lys Trp Gin Gin Gly Phe Arg Ala LysIle

200205

CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA941

Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin

210 215220

ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT980

Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn

225230

GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC1019

Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr

235 240245

CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA1058

Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr

250 255260

GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT1097

Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tyr SerPro

265270

TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC1136

Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr LeuPhe

275 280285

114

180 765

CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC1175

Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val GinLeu

290295

CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC1214

His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr ProThr

300 305310

CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC1253

Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr HisSer

315 320325

CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG T AAGGT TCTCAGACAC 1290

Gin Asn Leu Ser Gin Glu Gly 330332

TGCCGACATC AGCATTGTCT CATGTACAGC TCCCTTCCCT GCAGGGCGCC 1340

CCTGGGAGAC AACTGGACAA GATTTCCTAC TTTCTCCTGA AACCCAAAGC 1390

CCTGGTAAAA GGGATACACA GGACTGAAAA GGGAATCATT TTTCACTGTA 1440

CATTATAAAC CTTCAGAAGC TATTTTTTTA AGCTATCAGC AATACTCATC 1490

AGAGCAGCTA GCTCTTTGGT CTATTTTCTG CAGAAATTTG CAACTCACTG 1540

ATTCTCTACA TGCTCTTTTT CTGTGATAAC TCTGCAAAGG CCTGGGCTGG 1590

CCTGGCAGTT GAACAGAGGG AGAGACTAAC CTTGAGTCAG AAAACAGAGA 1640

AAGGGTAATT TCCTTTGCTT CAAATTCAAG GCCTTCCAAC GCCCCCATCC 1690

CCTTTACTAT CATTCTCAGT GGGACTCTGA TCCCATATTC TTAACAGATC 1740

TTTACTCTTG AGAAATGAAT AAGCTTTCTC TCAGAAAAAA AAAAAAAAAA 1790

AAAAA 1795 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 42 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:3:

Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu

-16 -15 -10 -5

Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys 15 10

180 765

115

Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu

20 25 26 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 390 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:4:

GAATTCCTGG AATACCAGCT GACAATGATT TCCTCCTCAT CTTTCAACCT 50

CACCTCTCCT CATCTAAGAA

TTG CTC Leu Leu

CTC Leu

GTG GTC ATG CTT

91

Val Val

Met

Leu -10

-16

-15

CTC

CTA

ACT

GCA AGG

CTA

ACG

CTG

TCC

AGC

CCG

GCT

CCT

130

Leu

Thr

Ala Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Pro

Ala

P-ro

-5

1

CCT

GCT

TGT

GAC CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

169

Pro

Ala

Cys

Asp Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

5

10

15

GAC

TCC

CAT

GTC CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

GTGA GAACTCCCAA

210

Asp

Ser

His

Val Leu

His

Ser

Arg

Leu

20

25

26

CATTATCCCC TTTATCCGCG TAACTGGTAA GACACCCATA CTCCCAGGAA 260

GACACCATCA CTTCCTCTAA CTCCTTGACC CAATGACTAT TCTTCCCATA 310

TTGTCCCCAC CTACTGATCA CACTCTCTGA CAAGAATTAT TCTTCACAAT 360

ACAGCCCGCA TTTAAAAGCT CTCGTCTAGA 390 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 390 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:5:

TCTAGACGAG AGCTTTTAAA TGCGGGCTGT ATTGTGAAGA ATAATTCTTG 50

116

180 765

TCAGAGAGTG TGATCAGTAG GTGGGGACAA TATGGGAAGA ATAGTCATTG 100

GGTCAAGGAG TTAGAGGAAG TGATGGTGTC TTCCTGGGAG TATGGGTGTC 150

TTACCAGTTA CGCGGATAAA GGGGATAATG TTGGGAGTTC TCACCAGTCT 200

GCTGTGAAGG ACATGGGAGT CACGAAGCAG TTTACTGAGG ACTCGGAGGT 250

CACAAGCAGG AGGAGCCGGG CTGGACAGCG TTAGCCTTGC AGTTAGGAGA 300

AGCATGACCA CGAGGAGCAA TTCTTAGATG AGGAGAGGTG AGGTTGAAAG 350

ATGAGGAGGA AATCATTGTC AGCTGGTATT CCAGGAATTC 390 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 332 aminokwasów (B) RODZAJ: Ammokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:6:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 15 1015

Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro 20 2530

Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 4045

Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala 50 5560

Gin Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 65 7075

Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 8590

Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin 95 100105

Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala 110 115120

His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gin His Leu Leu 125 130135

Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu 140 145150

180 765

117

Cys

Val

Arg

Ala 155

Pro

Thr Thr

Ala 160

Val

Pro Ser

Arg

Thr 165

Ser

Leu

Val

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

Thr

Gly

Ser 195

Gly

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Asn

Gin

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

Ile

His 230

Glu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg 245

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro 275

Thr

His

Pro

Thr 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Val

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Pro

Asp 305

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr 310

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser 315

Pro

Leu

Asn

Thr 320

Ser

Tyr

Thr

His

Ser 325

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin 330

Glu Gly

332 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 166 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:7:

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr 15 10 15

Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala

118

180 765

2530

Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys 35 4045

Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 50 5560

Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu 65 7075

Arg Gly Gin Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro 80 8590

Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu 95 100105

Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gin Lys Glu Ala Ile Ser 110 115120

Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala 125 130135

Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 140 145150

Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp 155 160165

Arg 166 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 328 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:8:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 15 1015

Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro 20 2530

Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 4045

Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala

5560

180 765

119

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

Leu

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Ser

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr 115

Ala

His

Lys

Asp

Pro 120

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu 125

Ser

Phe

Gin

His

Leu 130

Leu

Arg

Gly

Lys

Val 135

Arg

Phe

Leu

Met

Leu 140

Val

Gly

Ser

Thr 145

Leu

Cys

Val

Arg

Arg 150

Ala

Pro

Thr

Thr 155

Ala

Val

Pro

Ser

Arg 160

Thr

Ser

Leu

Val

Leu 165

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu170

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser 175

Gly

Leu

Glu

Thr 180

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser 185

Ala

Arg

Thr

Gly 190

Ser

Gly

Leu

Lys 195

Trp

Gin

Gly

Phe 200

Arg

Ala

Lys

Ile

Pro 205

Gly

Leu

Asn

Gin 210

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu 215

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly 220

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile 225

His

Glu

Leu

Asn 230

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu 235

Phe

Pro

Gly

Pro

Ser 240

Arg

Thr

Leu

Gly 245

Ala

Pro

Asp

Ile

Ser 250

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp 255

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro 260

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro 265

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser 270

Pro

Thr

His

Pro

Pro 275

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr 280

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro 285

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr 290

Pro

Val

Gin

Leu 295

His

Pro

Leu

Pro 300

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro 305

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr 310

Ser

Pro

Leu

Asn 315

Thr

Ser

Tyr

Thr

His 320

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser 325

Gin

Glu

Gly 328

120

180 765 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 265 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:9:

Ser Pro Ala 1

Pro

Pro Ala Cys 5

Asp Leu

Arg 10

Val

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Val

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro

Thr

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

Met 55

Glu

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

Leu

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Ser

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Asp

Phe 140

Trp

Ile

Val

Gly

Asp 145

Lys

Leu

His

Cys

Leu 150

Ser

Gin

Asn

Tyr

Trp 155

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu 160

Val

Ala

Gly

Ile 165

Gin

Ser

Gin

Asp

Ser 170

Trp

Ser

Ala

Glu

Pro 175

Asn

Leu

Gin

Val

Pro 180

Gly

Pro

Asn

Pro

Arg 185

Ile

Pro

Glu

Gin

Asp 190

Thr

Arg

Thr

Leu

Glu 195

Trp

Asn

Ser

Trp

Thr 200

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu 205

Thr

Gin

Asp

Pro

Arg 210

Ser

Pro

Gly

His

Phe

Leu

Arg

Asn

Ile

Arg

His

Arg

Leu

Pro

Ala

180 765

121

215

Thr Gin Pro Pro Ala Trp Ile Phe 230

Tyr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro 245

Pro Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro 260 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:10:

220225

Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser

235240

Ser Ser Thr His Leu Ala His

250255

Ala Ser

265 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 261 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:10:

Ser 1

Pro Ala

Pro

Pro Ala Cys 5

Asp

Leu

Arg 10

Val

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

20

25

30

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

35

40

45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Thr

Lys

Ala

50

55

60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Glu

Gly

Val

Met

65

70

75

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Leu

80

85

90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

95

100

105

Ser

Leu

Gly

Thr

Gin

Gly

Arg

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

110

115

120

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Arg

Gly

Lys

Asp

125

130

135

Phe

Trp

Ile

Val

Gly

Asp

Lys

Leu

His

Cys

Leu

Ser

Gin

Asn

Tyr

140

145

150

Trp

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu

Val

Ala

Gly

Ile

Gin

Ser

Gin

Asp

155

160

165

122

180 765

Ser Trp Ser Arg Ile Pro Thr Leu Ser Phe Leu Arg Ala Trp Ile Tyr Ala Leu Ala Pro Pro

Ala Glu Pro 170

Glu Gin Asp 185

Trp Thr Leu 200

Asn Ile Arg 215

Phe Ser Phe 230

Pro Ser Ser 245

Pro Ala Ser

260 261

Asn Leu Gin Thr Arg Thr Thr Gin Asp His Arg Leu Pro Asn Pro Thr His Leu

Val Pro Gly 175

Leu Glu Trp 190

Pro Arg Ser 205

Pro Ala Thr 220

Ser Ser Tyr 235

Ala His Pro 250

Pro Asn Pro

180

Asn Ser Trp

195

Pro Gly His 210

Gin Pro Pro

225

Trp Thr Val 240

Cys Gly Pro 255 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7849 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:11:

CCCAGCCTCC TTTCTCTTGT TCCCTGGTCA TGCCTGCCTC CCTGTCTCCT GTCTCTCCCT CCCACACACA CCCACTATCC TCCCAGCTAT CCCTACACCC TCCTTCCTAA TCTTGGGAGA CATCTCGTCT GGCTGGACGG GAAAATTCCA GGATCTAGGC CACACTTCTC AGCAGACATG CCCATCCTTG GGGAGGAGGA ACAGGAGAGA GCCTGAGGAA GTTCTGGGGG ACAGGGGGAT GATGGGATCA AGGTCAGGCC AGGAAGCCCC TGAGGACAGA GACTGTGGGG AGACTGGGAC TGGGAAGAAA GCAAAGGAGC TAGAGCCAGG GCCAAAGGAA AAGGGGGGCC AGCAGGGAGG TATTTGCGGG GGAGGTCCAG CAGCTGTCTT TCCTAAGACA GGGACACATG GGCCTGGTTA TTCCTCTTGT CACATGTGGA ACGGTAGGAG ATGGAAGACG GAGACAGAAC AAGCAAAGGA GGGCCCTGGG CACAGAGGTC

100

150

200

250

300

350

400

450

500

TGTGTGTGTA GCCATCCAAG CCACTGGACC CCAGCAGACG AGCACCTAAG 550

180 765

123

CTCAGGCTTA ACCCAGTGCA CGTGTGCGCA CATACATGTG CCCCGCACCT 600

GACAGTCCAC TCAACCCGTC CAAACCCTTT CCCCATAACA CCAACCCATA 650

ACAGGAGATT TCTCTCATGT GGGCAATATC CGTGTTCCCA CTTCGAAAGG 700

GGGAATGACA AGATAGGACT CCCTAGGGGA TTACAGAAAG AAAAGCAGGA 750

AAGCAAGCAT CCTGTTGGAT TTCAGCAGCA GGTATGATGT CCAGGGAAAA 800

GAAATTTGGA TAGCCAGGGA GTGAAAACCC CACCAATCTT AAACAAGACC 850

TCTGTGCTTC TTCCCCAGCA ACACAAATGT CCTGCCAGAT TCCTCCTGGA 900

AAAAAACTTC TGCTCCTGTC CCCCTCCAGG TCCCAGGTTG CCCATGTCCA 950

GGAAAAGATG GATCCCCCTA TCCAAATCTT CTCCGTGGTG TGTGTGGGTG 1000

GAGGAGTGGA CCCTGGTCCA GGCAGGGGCT CCAGGGAAGA GAAGGCGTCA 1050

CTTCCGGGGG CCTTCACCAG TGTCTGGTGG GAAGTGGCCC AGGCAGGCGT ATGACCTGCT CACCGCCACA TGTCTTCCTA CCCATCTGCT TGCACTTGGG TCCTGGAGCC CTTCTCCACC GTGGGGTTAT GTGAGGGTAG AAAGGACAGC CTGGGGGAGG GGCAGGCAAA CTGGAACCTA GAAGAGTGTA GCCTTCCCAG AATGGGAGGA GGGGTGGGGT GCTGGTTTCT GAGGGACTGA AGCACAGCCC TGGCTGGCCC TAAGGAAAGG AATAAGAGAG GGAGCTGCAC TTAGGGCTTA GACACAGCCC CAATCCCCAT TCTTAGCTGG GTTCTGAATC TGGTGCTGGG GAAGCTGGGC GAGAGGGTAA TGGGAGGAGG GCCCACTCAT TCCCAATATT GAATCAGGTG CAAGCCTCTT GAGGAAGCCA TGTGGGGGGT CCTGTGAAGG

CTCCCTTCTC TGATTGGGCA 1100

GCTGTGGAGG GGCTGTGCCC 1150

CCCCAGAGGG CTGCCTGCTG 1200

CGGTGAGTGG CCAGCAGGGT 1250

AAAGAGAAAT GGGCTCCCAG 1300

CAGGCACTGA CCTTTGTCGA 1350

GCAGGGCAGA GCAGGGGTAG 1400

TCACTTACTT GGTGGAATAC 1450

GGACATGAGC CCAGGGAGAA 1500

GCAAACACAG TAGTAAGATG 1550

TCATTCCTCG TTAGCTTAAG 1600

CAGGCAAGCC AGGGCGCAAG 1650

GTTGACAGAC CTACAGGAAA 1700

TGCACAACTT GTGAAAGGAG 1750

AACCGGAAGG GGTTCTGCCA 1800

AGGGGGCAGG GAGGCAGGTG TGAGCTATGA GACAGATATG TTAGTGGGCG 1850

124

180 765

CCTAAGACAA GGTAAGCCCC TAAGGTGGGC ATCACCCAGC AGGTGCCCGT TCCTGGGCAG CTGGTCTCAG GAAGGAAGTC CCAGAACTGT TAGCCCATCT CTTGGCCTCA GATAATGGAG TATTTCAGGA CTTGGAGTCC AAAGAAAAGC TCCAGTGGCT TTATGTGTGG GGGTAGATAG GGAAAGAATA GAGGTTAATT TCTCCCATAC CGCCTTTTAA TCCTGACCTC TAGTGGTCCC AGTTACAGCT TTGTGCAGTT CCCCTCCCCA GCCCCACTCC CCACCGCAGA AGTTACCCCT CAACATATTG CGCCCGTTTG CCAGTTCCTC ACCCAGGCCC TGCATCCCAT TTTCCACTCT CTTCTCCAGG CTGAAGCCAC AATACTTTCC TTCTCTATCC CCATCCCAGA TTTTCTCTGA CCTAACAACC AAGGTTGCTC AGAATTTAAG GCTAATTAAG ATATGTGTGT ATACATATCA TGTCCTGCTG CTCTCAGCAG GGGTAGGTGG CACCAAATCC GTGTCCGATT CACTGAGGAG TCCTGACAAA AAGGAGACAC CATATGCTTT CTTGCTTTCT TTCTTTCTTT CTTTCTTTTT TTTTTTTTGA GACGGAGTTT CACTCTTATT GCCCAGGCTG GAGTGCAATG GTGCGATCTC GGCTCACCAC AAACCTCCGC CTCCCAGGTA CAAGCGATTC TCCTGTCTCA GCCTCCCAAG TAGCTTGGAT TACAGGCATG AGCCACCACA CCCTGCTAGT TTTTTTGTAT TTCGTAGAGC CGGGGTTTCA CCATGTTAGT GAGGCTGGTG GCGAACTCCT GACCTCAGGT GATCCACCCG CCTTGGACTC CCAAAGTGCT GGGATTACAG GCATGAGCCA CTGCACCCGG CACACCATAT GCTTTCATCA CAAGAAAATG TGAGAGAATT CAGGGCTTTG GCAGTTCCAG GCTGGTCAGC ATCTCAAGCC CTCCCCAGCA TCTGTTCACC CTGCCAGGCA GTCTCTTCCT AGAAACTTGG TTAAATGTTC ACTCTTCTTG CTACTTTCAG GATAGATTCC TCACCCTTGG CCCGCCTTTG CCCCACCCTA CTCTGCCCAG AAGTGCAAGA GCCTAAGCCG CCTCCATGGC CCCAGGAAGG ATTCAGGGGA GAGGCCCCAA ACAGGGAGCC ACGCCAGCCA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGGT GAGAACACAC CTGAGGGGCT AGGGCCATAT GGAAACATGA CAGAAGGGGA GAGAGAAAGG AGACACGCTG CAGGGGGCAG GAAGCTGGGG

1900

1950

2000

2050

2100

2150

2200

2250

2300

2350

2400

2450

2500

2550

2600

2650

2700

2750

2800

2850

2900

2950

3000

3050

3100

3150

GAACCCATTC TCCCAAAAAT AAGGGGTCTG AGGGGTGGAT TCCCTGGGTT 3200

180 765

125

TCAGGTCTGG GTCCTGAATG GGAATTCCTG GAATACCAGC TGACAATGAT 3250

TTCCTCCTCA TCTTTCAACC TCACCTCTCC TCATCTAAGA ATTGCTCCTC 3300

GTGGTCATGC TTCTCCTAAC TGCAAGGCTA ACGCTGTCCA GCCCGGCTCC 3350

TCCTGCTTGT GACCTCCGAG TCCTCAGTAA ACTGCTTCGT GACTCCCATG 3400

TCCTTCACAG CAGACTGGTG AGAACTCCCA ACATTATCCC CTTTATCCGC 3450

GTAACTGGTA AGACACCCAT ACTCCCAGGA AGACACCATC ACTTCCTCTA 3500

ACTCCTTGAC CCAATGACTA TTCTTCCCAT ATTGTCCCCA CCTACTGATC 3550

ACACTCTCTG ACAAGAATTA TTCTTCACAA TACAGCCCGC ATTTAAAAGC 3600

TCTCGTCTAG AGATAGTACT CATGGAGGAC TAGCCTGCTT ATTAGGCTAC 3650

CATAGCTCTC TCTATTTCAG CTCCCTTCTC CCCCCACCAA TCTTTTTCAA 3700

CAGAGCCAGT GCCCAGAGGT TCACCCTTTG CCTACACCTG TCCTGCTGCC 3750

TGCTGTGGAC TTTAGCTTGG GAGAATGGAA AACCCAGATG GTAAGAAAGC 3800

CATCCCTAAC CTTGGCTTCC CTAAGTCCTG TCTTCAGTTT CCCACTGCTT 3850

CCCATGGATT CTCCAACATT CTTGAGCTTT TTAAAAATAT CTCACCTTCA 3900

GCTTGGCCAC CCTAACCCAA TCTACATTCA CCTATGATGA TAGCCTGTGG 3950

ATAAGATGAT GGCTTGCAGG TCCAATATGT GAATAGATTT GAAGCTGAAC 4000

ACCATGAAAA GCTGGAGAGA AATCGCTCAT GGCCATGCCT TTGACCTATT 4050

CCYGTTCAGT CTTCTTAAAT TGGCATGAAG AAGCAAGACT CATATGTCAT 4100

CCACAGATGA CACAAAGCTG GGAAGTACCA CTAAAATAAC AAAAGACTGA 4150

ATCAAGATTC AAATCACTGA AAGACTAGGT CAAAAACAAG GTGAAACAAC 4200

AGAGATATAA ACTTCTACAT GTGGGCCGGG GGCTCACGCC TGTAATCCCA 4250

GCACTTTGGG AGGCCGAGGC AGGCAGATCA CCTGAGGGCA GGAGTTTGAG 4300

AGCAGCCTGG CCAACATGGC GAAACCCCGT CTCTACTAAG AATACAAAAT 4350

TAGCCGGGCA TGGTAGTGCA TGCCTGTAAT CCCAGCTACT TGGAAGGCTG 4400

AAGCAGGAGA ATCCCTTGAA CCCAGGAGGT GGAGGTTGTA GTGAGCTGAG 4450

ATCATGCCAA TGCACTCCAG CCTGGGTGAC AAGAGCAAAA CTCCGTCTCA 4500

126

180 765

AAAAGAAAAA CAGCTTTCAG AGCACTTCCT CCATGTAACA GTTTGATGTT CCGAGTGGAC GAAGACATAT CTAGAAAGCA CAATAGTTTA TTCCTTCAGG TAGTCCTTTC CATTTAGTTT CCAGGCTGGA CCGGATTCAA AGGTGCCCAC GGTTTCACCA CCACCTGCCT CACCCAGCCT CAGAAAGAGT GGGCAGATTT AGTGTAAGAC CTGATGACCA ACCTTGGTCC TCCTAAGGCT CTCTCTTCCA GAGCAGTGAC GGACCCACTT

AAAATTCTAC ATGTGTAAAT TAATGAGTAA AGTCCTATTC 4550

GCCACAATGC CCTGCTTCCA TCATTTAAGC CTCTGGCCCT 4600

ACGAAAAGGA TCTGAGAGAA TTAAATTGCC CCCAAACTTA 4650

TTACTGAAGC TGCTATTCTT AAAGCTAGTA ATTCTTGTCT 4700

TAGCATCCCC ATTGTGGAAA TGCTCGTACA GAACTCTATT 4750

TACACTTAAA TATACTGGCC TGAACACCGG ACATCCCCCT 4800

GCTAATTTAT TAAGAGGGAC CATATTAAAC TAACATGTGT 4850

GCAGCCTGAA CAGAAAGAGA CTAGAAGCAT GTTTTATGGG 4900

AAAAACTAAA ATCTATCCTC AAGAACCCTA GCGTCCCTTC 4950

ACTGAGTCAG GGAAGAAGGG CAGTTCCTAT GGGTCCCTTC 5000

TTTTCATCCT TATGATCATT ATGGTAGAGT CTCATACCTA 5050

ATTTATTATT ATTATTTGAG ACGGAGTCTC ACTCTATCCC 5100

GTGCAGTGGC ATGATCTCAA CTCACTGCAA CCTCAGCCTC 5150

GCGATTCTCC TGCCTCAGTC TCCCAAGTAG CTGGGATTAC 5200

CACCATGCCC AGCTAATTTT TGTATTTTTG GTAGAGATGG 5250

TGTTGGCCAG GCTGATCTTG AACTCCTGAC CTCAGGTGAT 5300

CAGCCTCCCA AAGTGCTGGG ATTACAGGCG TGAGCCACTG 5350

TCATTCAGTT TAAAAATCAA ATGATCCTAA GGTTTTGCAG 5400

AAATTTGCAG CACTAGAACC AAGAGGTAAA AGCTGTAACA 5450

CAGCAACGTA AGAAAAAAGG AGCTCTTCTC ACTGAAACCA 5500

CAGGCTGGAC TAGAGGACAC GGGAGTTTTT GAAGCAGAGG 5550

GCTGTCGGGA GACTGTGAAG GAATTCCTGC CCTGGGTGGG 5600

TGTCCAGTTC TCAGCCTGTA TGATTCACTC TGCTGGCTAC 5650

CCCCACCCGC TTTTAGTGTG CCCTTTGAGG CAGTGCGCTT 5700

TCTCTTTCTC AGGAGGAGAC CAAGGCACAG GACATTCTGG 5750

CCTTCTGCTG GAGGGAGTGA TGGCAGCACG GGGACAACTG 5800

GCCTCTCATC CCTCCTGGGG CAGCTTTCTG GACAGGTCCG 5850

180 765

127

TCTCCTCCTT GGGGCCCTGC AGAGCCTCCT AGTCAAGGGA TCTGTAGAAA CTGTTCTTTT GACCTGAGGG AAGAAGGGCT CTTCCAGGGA ATCTACTAAG AGTGCTCCCT GCCAGCCACA TGTCTTTCCT ACTTAGACAA GGGAGGCCTG GCCTCAGGAC CATCCTCTGC CCTCAGCTTC GCTCACAAGG ATCCCAATGC CATCTTCCTG AGGAAAGGTG CGTTTCCTGA TGCTTGTAGG GGCGGGCCCC ACCCACCACA GCTGTCCCCA ACACTGAACG AGCTCCCAAA CAGGACTTCT CACTGCCTCA GCCAGAACTA CTGGCTCTGG GATTCAGAGC CAAGATTCCT GGTCTGCTGA GACCAAATCC CCGGATACCT GAACAGGATA TCGTGGACTC TTTCCTGGAC CCTCACGCAG TTTCCTCAGG AACATCAGAC ACAGGCTCCC GGATATTCTC CTTCCCCAAC CCATCCTCCT CCCTCTTCCA CCCACCTTGC CCACCCCTGT TTCCTGACCC TTCTGCTCCA ACGCCCACCC ACATCCTACA CCCACTCCCA GAATCTGTCT GACACTGCCG ACATCAGCAT TGTCTCATGT GCGCCCCTGG GAGACAACTG GACAAGATTT AAAGCCCTGG TAAAAGGGAT ACACAGGACT CTGTACATTA TAAACCTTCA GAAGCTATTT TCATCAGAGC AGCTAGCTCT TTGGTCTATT CACTGATTCT CTACATGCTC TTTTTCTGTG

TGGAACCCAG GTAAGTCCCC 5900

CTGACTCAGT CCCACTAGAA 5950

GCTCAAGGGC AGAAGAGCTG 6000

ATGCCTGGGT ACTGGCATCC 6050

AGATCTGGCC CTGGTGTTTG 6100

CTCCACAGGG CAGGACCACA 6150

AGTTTCCAAC ACCTGCTCCG 6200

AGGGTCCACC CTCTGCGTCA 6250

GCAGAACCTC TCTAGTCCTC 6300

GGATTGTTGG AGACAAACTT 6350

GCTTCTGAAG TGGCAGCAGG 6400

ACCAAACCTC CAGGTCCCTG 6450

CACGAACTCT TGAATGGAAC 6500

GACCCTAGGA GCCCCGGACA 6550

TGCCACCCAA CCTCCAGCCT 6600

ACTGGACAGT ATACGCTCTT 6650

GGTCCAGCTC CACCCCCTGC 6700

CTACCAGCCC TCTTCTAAAC 6750

CAGGAAGGGT AAGGTTCTCA 6800

ACAGCTCCCT TCCCTGCAGG 6850

CCTACTTTCT CCTGAAACCC 6900

GAAAAGGGAA TCATTTTTCA 6950

TTTTAAGCTA TCAGCAATAC 7000

TTCTGCAGAA ATTTGCAACT 7050

ATAACTCTGC AAAGGCCTGG 7100

GCTGGCCTGG CAGTTGAACA GAGGGAGAGA CTAACCTTGA GTCAGAAAAC 7150

128

180 765

AGAGAAAGGG TAATTTCCTT TGCTTCAAAT TCAAGGCCTT CCAACGCCCC 7200

CATCCCCTTT ACTATCATTC TCAGTGGGAC TCTGATCCCA TATTCTTAAC 7250

AGATCTTTAC TCTTGAGAAA TGAATAAGCT TTCTCTCAGA AATGCTGTCC 7300

CTATACACTA GACAAAACTG AGCCTGTATA AGGAATAAAT GGGAGCGCCG 7350

AAAAGCTCCC TAAAAAGCAA GGGAAAGATG TTCTTCGAGG GTGGCAATAG 7400

ATCCCCCTCA CCCTGCCACC CCAAACAAAA AAGCTAACAG GAAGCCTTGG 7450

AGAGCCTCAC ACCCCAGGTA AGGCTGTGTA GACAGTTCAG TAAAGACAGG 7500

ACCTGGATGT GACAGCTGAG CAAACAGCTA GAGCTTTGGC AGCTCAGCAG 7550

GAGGCTTTGC CAGGCATGGA CGCCTGCCTC CCTCCTGTGG AGGTCAGGAG 7600

GAAGTGCAGG AAGTGGCATG AGTCAGGCTC CTTGAGCTCA CACAGCAGGA 7650

GAACAAGTAC AAGTCAAGTA CAAGTTGAAG GCTCATTTCC CAGTTCCCGC 7700

AAATGCATCT AAAAAGCAGC TCTGTGTGAC CACCATAAAC TCTGCTAGGG 7750

GATCTCTAAA AAGGAGTCAG GCTTATGGGG CTTTGCAAAT AAGTGCTGCC 7800

TTGGTGCTCA GGAAAAGGTT TGTGTTGCAC AAAACACAAA TTCCACTGC 7849 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:12:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1443 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:12:

GAGTCCTTGG CCCACCTCTC TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50

AAGCTCAAGC CGCCTCCATG GCCCCAGGAA AGATTCAGGG GAGAGGCCCC 100

ATACAGGGAG CCACTTCAGT TAGACACCCT GGCCAGA ATG GAG 143

Met Glu

-21 -20

CTG ACT GAT TTG CTC CTG GCG GCC ATG CTT CTT GCA GTG182

Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu AlaVal

-15-10

GCA AGA CTA ACT CTG TCC AGC CCC GTA GCT CCT GCC TGT221

Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala Pro AlaCys

180 765

129

GAC CCC AGA CTC CTA AAT AAA CTGCTG

Asp Pro Arg.Leu Leu Asn Lys LeuLeu

1015

CTC CTT CAC AGC CGA CTG AGT CAGTGT

Leu Leu His Ser Arg Leu Ser GinCys

CCT TTG TCT ATC CCT GTT CTG CTGCCT

Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu LeuPro

3540

AGC CTG GGA GAA TGG AAA ACC CAGACG

Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr GinThr

5055

GCA CAG GAC ATT CTA GGG GCA GTGTCC

Ala Gin Asp Ile Leu Gly Ala ValSer

6065

GGA GTG ATG GCA GCA CGA GGA CAGTTG

Gly Val Met Ala Ala Arg Gly GinLeu

7580

CTC TCA TCC CTC CTG GGA CAG CTTTCT

Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin LeuSer

CTC CTC TTG GGG GCC CTG CAG GGCCTC

Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin GlyLeu

100105

GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GACCCC

Gly Arg Thr Thr Ala His Lys AspPro

115120

TTG AGC TTG CAA CAA CTG CTT CGGGGA

Leu Ser Leu Gin Gin Leu Leu ArgGly

125130

CTG CTT CTG GTA GAA GGT CCC ACCCTC

Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro ThrLeu

140145

ACC CTG CCA ACC ACA GCT GTC CCA AGC

Thr Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser

155

GAC TCC CAC 260

Asp Ser His

GAC GTC GAC 299

Asp Val Asp

GTG GAC TTT 338

Val Asp Phe 45

CAG AGC AAG 377

Gin Ser Lys

CTA CTG GAG 416

Leu Leu Glu 70

CCC TCC TGC 455

Pro Ser Cys 85

CAG GTT CGC 494

Gin Val Arg

GGA ACC CAG 533

Gly Thr Gin

110

GCC CTC TTC 572

Ala Leu Phe

GTG CGC TTC 611

Val Arg Phe

135

GTC AGA CGG 650

Val Arg Arg

150

ACT TCT CAA 689

Thr Ser Gin

CTC CTC ACA CTA AAC AAG TTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA 728

Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly

165 170 175

130

180 765

TTG TTG GAG ACG AAC TTC AGT GTC ACA GCC AGA ACT GCT767

Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg ThrAla

180185

GGC CCT GGA CTT CTG AGC AGG CTT CAG GGA TTC AGA GTC806

Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg Leu Gin Gly Phe ArgVal

190 195200

AAG ATT ACT CCT GGT CAG CTA AAT CAA ACC TCC AGG TCC845

Lys Ile Thr Pro Gly Gin Leu Asn Gin Thr Ser ArgSer

205 210215

CCA GTC CAA ATC TCT GGA TAC CTG AAC AGG ACA CAC GGA884

Pro Val Gin Ile Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr HisGly

220225

CCT GTG AAT GGA ACT CAT GGG CTC TTT GCT GGA ACC TCA923

Pro Val Asn Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly ThrSer

230 235240

CTT CAG ACC CTG GAA GCC TCA GAC ATC TCG CCC GGA GCT962

Leu Gin Thr Leu Glu Ala Ser Asp Ile Ser Pro GlyAla

245250

TTC AAC AAA GGC TCC CTG GCA TTC AAC CTC CAG GGT GGA1001

Phe Asn Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu Gin GlyGly

255 260265

CTT CCT CCT TCT CCA AGC CTT GCT CCT GAT GGA CAC ACA1040

Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro Asp Gly HisThr

270 275280

CCC TTC CCT CCT TCA CCT GCC TTG CCC ACC ACC CAT GGA1079

Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr HisGly

285290

TCT CCA CCC CAG CTC CAC CCC CTG TTT CCT GAC CCT TCC1118

Ser Pro Pro Gin Leu His Pro Leu Phe Pro Asp ProSer

295 300305

ACC ACC ATG CCT AAC TCT ACC GCC CCT CAT CCA GTC ACA1157

Thr Thr Met Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro ValThr

310315

ATG TAC CCT CAT CCC AGG AAT TTG TCT CAG GAA ACA TAGCGC 1199

Met Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu Ser Gin Glu Thr

320 325 330 331

G GGCACTGGCC CAGTGAGCGT CTGCAGCTTC TCTCGGGGAC 1240

AAGCTTCCCC AGGAAGGCTG AGAGGCAGCT GCATCTGCTC CAGATGTTCT 1290

180 765

131

GCTTTCACCT AAAAGGCCCT GGGGAAGGGA TACACAGCAC TGGAGATTGT 1340

AAAATTTTAG GAGCTATTTT TTTTTAACCT ATCAGCAATA TTCATCAGAG 1390

CAGCTAGCGA TCTTTGGTCT ATTTTCGGTA TAAATTTGAA AATCACTAAT 1440 TCT 1443 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 352 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (DJ TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:13:

Met -21

Glu -20

Leu Thr Asp Leu

Leu -15

Leu Ala

Ala

Met

Leu Leu -10

Ala

Val

Ala

Arg -5

Leu

Thr

Leu

Ser

Ser 1

Pro

Val

Ala

Pro 5

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg 10

Leu

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Asp

Val

Asp

Pro

Leu 35

Ser

Ile

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr 55

Glu

Gin

Ser

Lys

Ala 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Ser

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys 85

Leu

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Gly

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr 115

Ala

His

Lys

Asp

Pro 120

Asn

Ala

Leu

Phe

Leu 125

Ser

Leu

Gin

Leu 130

Leu

Arg

Gly

Lys

Val 135

Arg

Phe

Leu

Leu 140

Val

Glu

Gly

Pro

Thr 145

Leu

Cys

Val

Arg

Arg 150

Thr

Leu

Pro

Thr

Thr 155

Ala

Val

Pro

Ser

132

180 765

Ser Thr Ser Gin Leu Leu Thr Leu Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr

160 165170

Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser Val Thr Ala Arg ThrAla

175 180185

Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg Leu Gin Gly Phe Arg Val LysIle

190 195200

Thr Pro Gly Gin Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Pro Val GinIle

205 210215

Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly Pro Val Asn Gly ThrHis

220 225230

Gly Leu Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gin Thr Leu Glu Ala SerAsp

235 240245

Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu Ala Phe AsnLeu

250 255260

Gin Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro Asp GlyHis

265 270275

Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His GlySer

280 285290

Pro Pro Gin Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr ThrMet

295 300305

Pro Asn Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro HisPro

310 315320

Arg Asn Leu Ser Gin GluThr

325 330331 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1536 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:14:

GAGTCCTTGG CCCACCTCTC TCCCACCCGA CTCTGCCGAA AGAAGCACAG 50

AAGCTCAAGC CGCCTCCATG GCCCCAGGAA AGATTCAGGG GAGAGGCCCC 100

ATACAGGGAG CCACTTCAGT TAGACACCCT GGCCAGA ATG GAG 143

Met Glu

180 765

133

-21 -20

CTG ACT

GAT Asp

TTG CTC CTG

GCG GCC

ATG Met

CTT Leu -10

CTT GCA GTG

182

Leu

Thr

Leu

Leu -15

Leu

Ala

Leu

Ala

Val

GCA Ala

AGA Arg -5

CTA Leu

ACT Thr

CTG Leu

TCC Ser

AGC Ser 1

CCC Pro

GTA Val

GCT Ala

CCT Pro 5

GCC Ala

TGT Cys

221

GAC Asp

CCC Pro

AGA Arg 10

CTC Leu

CTA Leu

AAT Asn

AAA Lys

CTG Leu 15

CTG Leu

CGT Arg

GAC Asp

TCC Ser

CAC His 20

260

CTC Leu

CTT Leu

CAC His

AGC Ser

CGA Arg 25

CTG Leu

AGT Ser

CAG Gin

TGT Cys

CCC Pro 30

GAC Asp

GTC Val

GAC Asp

299

CCT Pro

TTG Leu 35

TCT Ser

ATC Ile

CCT Pro

GTT Val

CTG Leu 40

CTG Leu

CCT Pro

GCT Ala

GTG Val

GAC Asp 45

TTT Phe

338

AGC Ser

CTG Leu

GGA Gly

GAA Glu 50

TGG Trp

AAA Lys

ACC Thr

CAG Gin

ACG Thr 55

GAA Glu

CAG Gin

AGC Ser

AAG Lys

377

GCA Ala 60

CAG Gin

GAC Asp

ATT Ile

CTA Leu

GGG Gly 65

GCA Ala

GTG Val

TCC Ser

CTT Leu

CTA Leu 70

CTG Leu

GAG Glu

416

GGA Gly

GTG Val

ATG Met 75

GCA Ala

CGA Arg

GGA Gly

CAG Gin 80

TTG Leu

GAA Glu

CCC Pro

TCC Ser

TGC Cys 85

455

CTC Leu

TCA Ser

TCC Ser

CTC Leu

CTG Leu 90

GGA Gly

CAG Gin

CTT Leu

TCT Ser

GGG Gly 95

CAG Gin

GTT Val

CGC Arg

494

CTC Leu

CTC Leu 100

TTG Leu

GGG Gly

GCC Ala

CTG Leu

CAG Gin 105

GGC Gly

CTC Leu

CTA Leu

GGA Gly

ACC Thr 110

CAG Gin

533

CTT Leu

CCT Pro

CTA Leu

CAG Gin 115

GGC Gly

AGG Arg

ACC Thr

ACA Thr

GCT Ala 120

CAC His

AAG Lys

GAC Asp

CCC Pro

572

AAT Asn 125

GCC Ala

CTC Leu

TTC Phe

TTG Leu

AGC Ser 130

TTG Leu

CAA Gin

CTG Leu

CTT Leu 135

CGG Arg

GGA Gly

611

AAG Lys

GTG Val

CGC Arg 140

TTC Phe

CTG Leu

CTT Leu

CTG Leu

GTA Val 145

GAA Glu

GGT Gly

CCC Pro

ACC Thr

CTC Leu 150

650

134

180 765

TGT GTC AGA CGG ACC CTG CCA Cys Val Arg Arg Thr Leu Pro 155

AGT ACT TCT CAA CTC CTC ACA Ser Thr Ser Gin Leu Leu Thr 165 170

AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu 180

GCC AGA ACT GCT GGC CCT GGA Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly 190 195

GGA TTC AGA GTC AAG ATT ACT

Gly Phe Arg Val Lys Ile Thr 205

ACC TCC AGG TCC CCA GTC CAA Thr Ser Arg Ser Pro Val Gin 220

AGG ACA CAC GGA CCT GTG AAT Arg Thr His Gly Pro Val Asn 230 235

GCT GGA ACC TCA CTT CAG ACC Ala Gly Thr Ser Leu Gin Thr 245

TCG CCC GGA GCT TTC AAC ΑΆΑ Ser Pro Gly Ala Phe Asn Lys 255 260

CTC CAG GGT GGA CTT CCT CCT

Leu Gin Gly Gly Leu Pro Pro 270

GAT GGA CAC ACA CCC TTC CCT Asp Gly His Thr Pro Phe Pro 285

ACC ACC CAT GGA TCT CCA CCC Thr Thr His Gly Ser Pro Pro

295300

CCT GAC CCT TCC ACC ACC ATG Pro Asp Pro Ser Thr Thr Met 310

ACA GCT GTC CCA AGC689

Thr Ala Val ProSer

160

AAC AAG TTC CCA AAC728

Asn Lys Phe ProAsn

175

AAC TTC AGT GTC ACA767

Asn Phe Ser ValThr

185

CTG AGC AGG CTT CAG806

Leu Ser Arg LeuGin

200

GGT CAG CTA AAT CAA845

Gly Gin Leu AsnGin

215

TCT GGA TAC CTG AAC884

Ser Gly Tyr LeuAsn

225

ACT CAT GGG CTC TTT923

Thr His Gly LeuPhe

240

GAA GCC TCA GAC ATC962

Glu Ala Ser AspIle

250

TCC CTG GCA TTC AAC1001

Ser Leu Ala PheAsn

265

CCA AGC CTT GCT CCT1040

Pro Ser Leu AlaPro

280

TCA CCT GCC TTG CCC1079

Ser Pro Ala LeuPro

290

CTC CAC CCC CTG TTT1118

Leu His Pro LeuPhe

305

AAC TCT ACC GCC CCT1157

Asn Ser Thr Ala Pro

315

180 765

135

CAT CCA GTC ACA ATG TAC CCT CAT CCC AGG AAT TTG TCT 1196

His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu Ser

320 325 330

CAG GAA ACA TAGCG CGGGCACTGG CCCAGTGAGC GTCTGCAGCT 1240

Gin Glu Thr

335

TCTCTCGGGG ACAAGCTTCC CCAGGAAGGC TGAGAGGCAG CTGCATCTGC 1290

TCCAGATGTT CTGCTTTCAC CTAAAAGGCC CTGGGGAAGG GATACACAGC 1340

ACTGGAGATT GTAAAATTTT AGGAGCTATT TTTTTTTAAC CTATCAGCAA 1390

TATTCATCAG AGCAGCTAGC GATCTTTGGT CTATTTTCGG TATAAATTTG 1440

AAAATCACTA AAAAAAAAAA ΑΆΆΆΆΆΆΆΑΑ ΑΑΆΑΆΆΑΆΑΑ AAAAAAAAAA 14 90

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAA 1536 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 356 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:15:

Met -21

Glu -20

Leu

Thr

Asp Leu

Leu -15

Leu Ala

Ala

Met

Leu -10

Leu

Ala

Val

Ala

Arg

Leu

Thr

Leu

Ser

Pro

Val

Ala

Pro

Ala

Cys

Asp

Pro

-5

1

5

Arg

Leu

Asn

Lys

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Leu

His

Ser

10

15

20

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Asp

Val

Asp

Pro

Leu

Ser

Ile

Pro

Val

25

30

35

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

40

45

50

Thr

Glu

Gin

Ser

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Ser

Leu

55

60

65

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Glu

Pro

Ser

70

75

80

Cys

Leu

Ser

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

85

90

95

136

180 765

Leu 100

Leu

Gly Ala Leu

Gin 105

Gly Leu Leu Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Leu

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Leu

Phe

Leu

Ser 130

Leu

Gin

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Val 145

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu 150

Cys

Val

Arg

Thr 155

Leu

Pro

Thr

Ala 160

Val

Pro

Ser

Thr 165

Ser

Gin

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Lys

Phe

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Ser

Val

Thr

Ala 190

Arg

Thr

Ala

Gly

Pro 195

Gly

Leu

Ser

Arg 200

Leu

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Val

Lys

Ile

Thr

Pro 210

Gly

Gin

Leu

Asn

Gin 215

Thr

Ser

Arg

Ser

Pro 220

Val

Gin

Ile

Ser

Gly 225

Tyr

Leu

Asn

Arg

Thr 230

His

Gly

Pro

Val

Asn 235

Gly

Thr

His

Gly

Leu 240

Phe

Ala

Gly

Thr

Ser 245

Leu

Gin

Thr

Leu

Glu 250

Ala

Ser

Asp

Ile

Ser 255

Pro

Gly

Ala

Phe

Asn 260

Lys

Gly

Ser

Leu

Ala 265

Phe

Asn

Leu

Gin

Gly 270

Gly

Leu

Pro

Ser 275

Pro

Ser

Leu

Ala

Pro 280

Asp

Gly

His

Thr

Pro 285

Phe

Pro

Ser

Pro 290

Ala

Leu

Pro

Thr

Thr 295

His

Gly

Ser

Pro

Pro 300

Gin

Leu

His

Pro

Leu 305

Phe

Pro

Asp

Pro

Ser 310 Tyr 325

Thr Pro

Thr His

Met Pro

Pro Arg

Asn 315 Asn 330

Ser Leu

Thr Ser

Ala Gin

Pro Glu

His 320 Thr 335

Pro

Val

Thr

Met

(2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 241 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa

180 765

137 (D) TOPOLOGIA: Liniowa

(XI) OPIS 1

SEKWENCJI: SEQ ID NO

: 16:

Ser 1

Pro

Val

Ala

Pro 5

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg 10

Leu

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Asp

Val

Asp

Pro

Leu 35

Ser

Ile

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr 55

Glu

Gin

Ser

Lys

Ala 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Ser

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys 85

Leu

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Gly

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Leu

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Leu

Phe

Leu

Ser 130

Leu

Gin

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Asp

Phe 140

Trp

Ile

Val

Gly

Asp 145

Glu

Leu

Gin

Cys

His 150

Ser

Gin

Asn

Cys

Trp 155

Pro

Trp

Thr

Ser

Glu 160

Gin

Ala

Ser

Gly

Ile 165

Gin

Ser

Gin

Asp

Tyr 170

Ser

Trp

Ser

Ala

Lys 175

Ser

Asn

Leu

Gin

Val 180

Pro

Ser

Pro

Asn

Leu 185

Trp

Ile

Pro

Glu

Gin 190

Asp

Thr

Arg

Thr

Cys 195

Glu

Trp

Asn

Ser

Trp 200

Ala

Leu

Cys

Trp

Asn 205

Leu

Thr

Ser

Asp

Pro 210

Gly

Ser

Leu

Arg

His 215

Leu

Ala

Arg

Ser

Phe 220

Gin

Arg

Leu

Pro 225

Gly

Ile

Gin

Pro

Pro 230

Gly

Trp

Thr

Ser

Ser 235

Phe

Ser

Lys

Pro

Cys 240

Ser

138

180 765

241 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:17:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 335 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:17:

Ser 1

Pro

Val

Ala

Pro 5

Ala

Cys

Asp

Pro

Arg 10

Leu

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Asp

Val

Asp

Pro

Leu 35

Ser

Ile

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

Thr 55

Glu

Gin

Ser

Lys

Ala 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Ser

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Glu

Pro

Ser

Cys 85

Leu

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Gly

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Leu

Gin 115

Gly

Arg

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Leu

Phe

Leu

Ser 130

Leu

Gin

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Val 145

Glu

Gly

Pro

Thr

Leu 150

Cys

Val

Arg

Thr 155

Leu

Pro

Thr

Ala 160

Val

Pro

Ser

Thr 165

Ser

Gin

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Lys

Phe

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Ser

Val

Thr

Ala 190

Arg

Thr

Ala

Gly

Pro 195

Gly

Leu

Ser

Arg 200

Leu

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Val

Lys

Ile

Thr

Pro 210

180 765

139

Gly Gin Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Pro Val Gin Ile Ser Gly 215 220225

Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly Pro Val Asn Gly Thr His Gly Leu 230 235240

Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gin Thr Leu Glu Ala Ser Asp Ile Ser 245 250255

Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn Leu Gin Gly 260 265270

Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro Asp Gly His Thr Pro 275 280285

Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His Gly Ser Pro Pro 290 295300

Gin Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr Met Pro Asn 305 310315

Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro Arg Asn 320 325330

Leu Ser Gin Glu Thr 335 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 332 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:18:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu 15 1015

Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Gly Arg Leu Ser Gin Cys Pro 20 2530

Asp Ile Asn Pro Leu Ser Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp 35 4045

Phe Thr Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Thr Glu Gin Thr Lys Ala 50 5560

Gin Asp Val Leu Gly Ala Thr Thr Leu Leu Leu Glu Ala Val Met 65 7075

Thr Ala Arg Gly Gin Val Gly Pro Pro Cys Leu Ser Ser Leu Leu 80 8590

140

180 765

Val	Gin Leu	Ser Gly 95	Gin Val	Arg	Leu Leu Leu 100	Gly	Ala	Leu	Gin 105
Asp	Leu Leu	Gly Met 110	Gin Leu	Pro	Pro Gin Gly 115	Arg	Thr	Thr	Ala 120
His	Lys Asp	Pro Ser 125	Ala Ile	Phe	Leu Asn Phe 130	Gin	Gin	Leu	Leu 135
Arg	Gly Lys	Val Arg 140	Phe Leu	Leu	Leu Val Val 145	Gly	Pro	Ser	Leu 150
Cys	Ala Lys	Arg Ala 155	Pro Pro	Ala	Ile Ala Val 160	Pro	Ser	Ser	Thr 165
Ser	Pro Phe	His Thr 170	Leu Asn	Lys	Leu Pro Asn 175	Arg	Thr	Ser	Gly 180
Leu	Leu Glu	Thr Asn 185	Ser Ser	Ile	Ser Ala Arg 190	Thr	Thr	Gly	Ser 195
Gly	Phe Leu	Lys Arg 200	Leu Gin	Ala	Phe Arg Ala 205	Lys	Ile	Pro	Gly 210
Leu	Leu Asn	Gin Thr 215	Ser Arg	Ser	Leu Asp Gin 220	Ile	Pro	Gly	His 225
Gin	Asn Gly	Thr His 230	Gly Pro	Leu	Ser Gly Ile 235	His	Gly	Leu	Phe 240
Pro	Gly Pro	Gin Pro 245	Gly Ala	Leu	Gly Ala Pro 250	Asp	Ile	Pro	Pro 255
Ala	Thr Ser	Gly Met 260	Gly Ser	Arg	Pro Thr Tyr 265	Leu	Gin	Pro	Gly 270
Glu	Ser Pro	Ser Pro 275	Ala His	Pro	Ser Pro Gly 280	Arg	Tyr	Thr	Leu 285
Phe	Ser Pro	Ser Pro 290	Thr Ser	Pro	Ser Pro Thr 295	Val	Gin	Leu	Gin 300
Pro	Leu Leu	Pro Asp 305	Pro Ser	Ala	Ile Thr Pro 310	Asn	Ser	Thr	Ser 315
Pro	Leu Leu	Phe Ala 320	Ala His	Pro	His Phe Gin 325	Asn	Leu	Ser	Gin 330

Glu Glu

332 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:19:

180 765

141 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1026 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:19:

AGC Ser 1

CCG GCT

CCT Pro

CCT Pro 5

GCC Ala

TGT Cys

GAC CCC CGA CTC

CTA Leu

36

Pro

Ala

Asp

Pro

Arg 10

Leu

AAT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

GTC

CTT

CAC

GGC

AGA

75

Asn

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Val

Leu

His

Gly

Arg 25

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAC

ATT

AAC

CCT

TTG

TCC

ACA

CCT

114

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Asp

Ile

Asn

Pro

Leu 35

Ser

Thr

Pro

GTC

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTC

ACC

TTG

GGA

GAA

TGG

153

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Thr

Leu

Gly

Glu 50

Trp

AAA

ACC

CAG

ACG

GAG

CAG

ACA

AAG

GCA

CAG

GAT

GTC

CTG

192

Lys

Thr

Gin

Thr 55

Glu

Gin

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp

Val

Leu

GGA

GCC

ACA

ACC

CTT

CTG

GAG

GCA

GTG

ATG

ACA

GCA

231

Gly 65

Ala

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Ala

Val

Met 75

Thr

Ala

CGG

GGA

CAA

GTG

GGA

CCC

CCT

TGC

CTC

TCA

TCC

CTG

270

Arg

Gly

Gin 80

Val

Gly

Pro

Cys 85

Leu

Ser

Leu

Leu 90

GTG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTT

CGC

CTC

GGG

GCC

309

Val

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

CTG

CAG

GAC

CTC

CTT

GGA

ATG

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGA

348

Leu

Gin 105

Asp

Leu

Gly

Met 110

Gin

Leu

Pro

Gin 115

Gly

AGG

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AGT

GCC

ATC

TTC

CTG

387

Arg

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Ser 125

Ala

Ile

Phe

Leu

AAC

TTC

CAA

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

426

Asn 130

Phe

Gin

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

142

180 765

CTC CTT GTA GTG GGG CCC TCC Leu Leu Val Val Gly Pro Ser 145

CCA CCC GCC ATA GCT GTC CCG Pro Pro Ala Ile Ala Val Pro 160

CAC ACA CTG AAC AAG CTC CCA His Thr Leu Asn Lys Leu Pro 170 175

TTG GAG ACA AAC TCC AGT ATC Leu Glu Thr Asn Ser Ser Ile 185

TCT GGA TTT CTC AAG AGG CTG Ser Gly Phe Leu Lys Arg Leu 195 200

ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gin 210

CAA ATC CCT GGA CAC CAG AAT Gin Ile Pro Gly His Gin Asn 225

AGT GGA ATT CAT GGA CTC TTT Ser Gly Ile His Gly Leu Phe

235 240

GCC CTC GGA GCT CCA GAC ATT Ala Leu Gly Ala Pro Asp Ile 250

ATG GGC TCC CGG CCA ACC TAC Met Gly Ser Arg Pro Thr Tyr 260 265

CCT TCC CCA GCT CAC CCT TCT

Pro Ser Pro Ala His Pro Ser 275

TTC TCT CCT TCA CCC ACC TCG

Phe Ser Pro Ser Pro Thr Ser 290

CTC CAG CCT CTG CTT CCT GAC Leu Gin Pro Leu Leu Pro Asp

300 305

CTC TGT GCC AAG AGG GCC 465

Leu Cys Ala Lys Arg Ala 150 155

AGC AGC ACC TCT CCA TTC 504

Ser Ser Thr Ser Pro Phe 165

AAC AGG ACC TCT GGA TTG 543

Asn Arg Thr Ser Gly Leu 180

TCA GCC AGA ACT ACT GGC 582

Ser Ala Arg Thr Thr Gly 190

CAG GCA TTC AGA GCC AAG 621

Gin Ala Phe Arg Ala Lys 205

ACC TCC AGG TCC CTA GAC 660

Thr Ser Arg Ser Leu Asp 215 220

GGG ACA CAC GGA CCC TTG 699

Gly Thr His Gly Pro Leu 230

CCT GGA CCC CAA CCC GGG 738

Pro Gly Pro Gin Pro Gly 245

CCT CCA GCA ACT TCA GGC 777

Pro Pro Ala Thr Ser Gly 255

CTC CAG CCT GGA GAG TCT 816

Leu Gin Pro Gly Glu Ser 270

CCT GGA CGA TAC ACT CTC 855

Pro Gly Arg Tyr Thr Leu 280 285

CCC TCC CCC ACA GTC CAG 894

Pro Ser Pro Thr Val Gin 295

CCC TCT GCG ATC ACA CCC 933

Pro Ser Ala Ile Thr Pro

310

180 765

143

AAC TCT ACC AGT CCT CTT CTA Asn Ser Thr Ser Pro Leu Leu 315

TTT GCA GCT CAC CCT CAT 972

Phe Ala Ala His Pro His

320

TTC CAG AAC CTG Phe Gin Asn Leu 325

TCT CAG GAA GAG TAAG GTGCTCAGAC 1010 Ser Gin Glu Glu

330 332

CCTGCCAACT TCAGCA 1026 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1014 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID N0:20:

AGC CCG GCT CCT CCT GCC TGT GAC CCC CGA CTC CTA 36

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu 1510

AAT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC GGC AGA75

Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His GlyArg

2025

CTG AGC CAG TGC CCA GAC ATT AAC CCT TTG TCC ACA CCT114

Leu Ser Gin Cys Pro Asp Ile Asn Pro Leu Ser ThrPro

3035

GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTC ACC TTG GGA GAA TGG153

Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Thr Leu Gly GluTrp

4550

AAA ACC CAG ACG GAG CAG ACA AAG GCA CAG GAT GTC CTG192

Lys Thr Gin Thr Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp ValLeu

5560

GGA GCC ACA ACC CTT CTG CTG GAG GCA GTG ATG ACA GCA231

Gly Ala Thr Thr Leu Leu Leu Glu Ala Val Met ThrAla

7075

CGG GGA CAA GTG GGA CCC CCT TGC CTC TCA TCC CTG CTG270

Arg Gly Gin Val Gly Pro Pro Cys Leu Ser Ser LeuLeu

8590

GTG CAG CTT TCT GGA CAG GTT CGC CTC CTC CTC GGG GCC309

Val Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu GlyAla

95100

144

180 765

CTG CAG GAC CTC CTT GGA ATG Leu Gin Asp Leu Leu Gly Met 105 110

CAC AAG GAT CCC AGT GCC ATC His Lys Asp Pro Ser Ala Ile 120

CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg 130 135

GGG CCC TCC CTC TGT GCC AAG Gly Pro Ser Leu Cys Ala Lys 145

GCT GTC CCG AGC AGC ACC TCT

Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser 160

AAG CTC CCA AAC AGG ACC TCT Lys Leu Pro Asn Arg Thr Ser 170 175

TCC AGT ATC TCA GCC AGA ACT Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr 185

AAG AGG CTG CAG GCA TTC AGA Lys Arg Leu Gin Ala Phe Arg 195 200

CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser 210

CAC CAG AAT GGG ACA CAC GGA

His Gin Asn Gly Thr His Gly 225

GGA CTC TTT CCT GGA CCC CAA

Gly Leu Phe Pro Gly Pro Gin 235 240

CCA GAC ATT CCT CCA GCA ACT Pro Asp Ile Pro Pro Ala Thr 250

CCA ACC TAC CTC CAG CCT GGA Pro Thr Tyr Leu Gin Pro Gly 260 265

CAC CCT TCT CCT GGA CGA TAC

CAG GGA AGG ACC ACA GCT 348

Gin Gly Arg Thr Thr Ala

115

TTC CTG AAC TTC CAA CAA 387

Phe Leu Asn Phe Gin Gin

125

TTC CTG CTC CTT GTA GTG 426

Phe Leu Leu Leu Val Val

140

AGG GCC CCA CCC GCC ATA 465

Arg Ala Pro Pro Ala Ile 150 155

CCA TTC CAC ACA CTG AAC 504

Pro Phe His Thr Leu Asn

165

GGA TTG TTG GAG ACA AAC 543

Gly Leu Leu Glu Thr Asn

180

ACT GGC TCT GGA TTT CTC 582

Thr Gly Ser Gly Phe Leu

190

GCC AAG ATT CCT GGT CTG 621

Ala Lys Ile Pro Gly Leu

205

CTA GAC CAA ATC CCT GGA 660

Leu Asp Gin Ile Pro Gly

215 220

CCC TTG AGT GGA ATT CAT 699

Pro Leu Ser Gly Ile His 230

CCC GGG GCC CTC GGA GCT 738

Pro Gly Ala Leu Gly Ala

245

TCA GGC ATG GGC TCC CGG 777

Ser Gly Met Gly Ser Arg

255

GAG TCT CCT TCC CCA GCT 816

Glu Ser Pro Ser Pro Ala

270

ACT CTC TTC TCT CCT TCA 855

180 765

145

His

Pro

Ser 275

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr 280

Leu

Phe

Ser

Pro

Ser 285

CCC

ACC

TCG

CCC

TCC

CCC

ACA

GTC

CAG

CTC

CAG

CCT

CTG

894

Pro

Thr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

Val

Gin

Leu

Gin

Pro

Leu

290

295

CTT

CCT

GAC

CCC

TCT

GCG

ATC

ACA

CCC

AAC

TCT

ACC

AGT

933

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Ile

Thr

Pro

Asn

Ser

Thr

Ser

300

305

310

CCT

CTT

CTA

TTT

GCA

GCT

CAC

CCT

CAT

TTC

CAG

AAC

CTG

972

Pro

Leu

Phe

Ala

His

Pro

His

Phe

Gin

Asn

Leu

315

320

TCT CAG GAA GAG TAAGGT GCTCAGACCC TGCCAACTTC 1010

Ser Gin Glu Glu

325 328

AGCA 1014 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 328 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:21:

Ser 1	Pro	Ala	Pro	Pro Ala 5	Cys Asp	Pro Arg 10	Leu Leu Asn	Lys	Leu 15
Leu	Arg	Asp	Ser	His Val 20	Leu His	Gly Arg 25	Leu Ser Gin	Cys	Pro 30
Asp	Ile	Asn	Pro	Leu Ser 35	Thr Pro	Val Leu 40	Leu Pro Ala	Val	Asp 45
Phe	Thr	Leu	Gly	Glu Trp 50	Lys Thr	Gin Thr 55	Glu Gin Thr	Lys	Ala 60
Gin	Asp	Val	Leu	Gly Ala 65	Thr Thr	Leu Leu 70	Leu Glu Ala	Val	Met 75
Thr	Ala	Arg	Gly	Gin Val 80	Gly Pro	Pro Cys 85	Leu Ser Ser	Leu	Leu 90
Val	Gin	Leu	Ser	Gly Gin 95	Val Arg	Leu Leu 100	Leu Gly Ala	Leu	Gin 105
Asp	Leu	Leu	Gly	Met Gin 110	Gly Arg	Thr Thr 115	Ala His Lys	Asp	Pro 120

146

180 765

Ser

Ala

Ile

Phe

Leu 125

Asn

Phe

Gin

Leu 130

Leu

Arg

Gly

Lys

Val 135

Arg

Phe

Leu

Leu 140

Val

Gly

Pro

Ser 145

Leu

Cys

Ala

Lys

Arg 150

Ala

Pro

Ala

Ile 155

Ala

Val

Pro

Ser

Ser 160

Thr

Ser

Pro

Phe

His 165

Thr

Leu

Asn

Lys

Leu 170

Pro

Asn

Arg

Thr

Ser 175

Gly

Leu

Glu

Thr 180

Asn

Ser

Ile

Ser 185

Ala

Arg

Thr

Gly 190

Ser

Gly

Phe

Leu

Lys 195

Arg

Leu

Gin

Ala

Phe 200

Arg

Ala

Lys

Ile

Pro 205

Gly

Leu

Asn

Gin 210

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu 215

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly 220

His

Gin

Asn

Gly

Thr 225

His

Gly

Pro

Leu

Ser 230

Gly

Ile

His

Gly

Leu 235

Phe

Pro

Gly

Pro

Gin 240

Pro

Gly

Ala

Leu

Gly 245

Ala

Pro

Asp

Ile

Pro 250

Pro

Ala

Thr

Ser

Gly 255

Met

Gly

Ser

Arg

Pro 260

Thr

Tyr

Leu

Gin

Pro 265

Gly

Glu

Ser

Pro

Ser 270

Pro

Ala

His

Pro

Ser 275

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr 280

Leu

Phe

Ser

Pro

Ser 285

Pro

Thr

Ser

Pro

Ser 290

Pro

Thr

Val

Gin

Leu 295

Gin

Pro

Leu

Pro 300

Asp

Pro

Ser

Ala

Ile 305

Thr

Pro

Asn

Ser

Thr 310

Ser

Pro

Leu

Phe 315

Ala

His

Pro

His 320

Phe

Gin

Asn

Leu

Ser 325

Gin

Glu

Glu 328

(2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5141 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Podwójny (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:22:

180 765

147

TTCGAGCTCG CCCGACATTG ATTATTGACT AGAGTCGATC GACAGCTGTG 50

GAATGTGTGT CAGTTAGGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA 100

GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAG GTGTGGAAAG 150

TCCCCAGGCT CCCCAGCAGG CAGAAGTATG CAAAGCATGC ATCTCAATTA 200

GTCAGCAACC ATAGTCCCGC CCCTAACTCC GCCCATCCCG CCCCTAACTC 250

CGCCCAGTTC CGCCCATTCT CCGCCCCATG GCTGACTAAT TTTTTTTATT 300

TATGCAGAGG CCGAGGCCGC CTCGGCCTCT GAGCTATTCC AGAAGTAGTG 350

AGGAGGCTTT TTTGGAGGCC TAGGCTTTTG CAAAAAGCTA GCTTATCCGG 400

CCGGGAACGG TGCATTGGAA CGCGGATTCC CCGTGCCAAG AGTGACGTAA 450

GTACCGCCTA TAGAGCGATA AGAGGATTTT ATCCCCGCTG CCATCATGGT 500

TCGACCATTG AACTGCATCG TCGCCGTGTC CCAAAATATG GGGATTGGCA 550

AGAACGGAGA CCTACCCTGG CCTCCGCTCA GGAACGAGTT CAAGTACTTC 600

CAAAGAATGA CCACAACCTC TTCAGTGGAA TATGGGTAGG AAAACCTGGT TCTCCATTCC AGGACAGAAT TAATATAGTT CTCAGTAGAG GGAGCTCATT TTCTTGCCAA AAGTTTGGAT ACAACCGGAA TTGGCAAGTA AAGTAGACAT GTTCTGTTTA CCAGGAAGCC ATGAATCAAC GTGACAAGGA TCATGCAGGA ATTTGAAAGT TGATTTGGGG AAATATAAAC CTCTCCCAGA AGGTCCAGGA GGAAAAAGGC ATCAAGTATA AAAGACTAAC AGGAAGATGC TTTCAAGTTC ATGCATTTTT ATAAGACCAT GGGACTTTTG CTTCGTTAGA ACGCGGCTAC AATTAATACA ATACGATTTA GGTGACACTA TAGATAACAT

GGTAAACAGA ATCTGGTGAT 650

TGAGAAGAAT CGACCTTTAA 700

AACTCAAAGA ACCACCACGA 750

GATGCCTTAA GACTTATTGA 800

GGTTTGGATA GTCGGAGGCA 850

CAGGCCACCT TAGACTCTTT 900

GACACGTTTT TCCCAGAAAT 950

ATACCCAGGC GTCCTCTCTG 1000

AGTTTGAAGT CTACGAGAAG 1050

TCTGCTCCCC TCCTAAAGCT 1100

CTGGCTTTAG ATCCCCTTGG 1150

TAACCTTATG TATCATACAC 1200

CCACTTTGCC TTTCTCTCCA 1250

CAGGTGTCCA CTCCCAGGTC CAACTGCACC TCGGTTCTAA GCTTCTGCAG 1300

148

180 765

GTCGACTCTA GAGGATCCCC GGGGAATTCA AACTTGTTTA TTGCAGCTTA TAATGGTTAC AAATTTCACA AATAAAGCAT TTTTTTCACT CCAAACTCAT CAATGTATCT TATCATGTCT CGGCGCAGCA CCATGGCCTG AAATAACCTC GTACCTTCTG AGGCGGAAAG AACCAGCTGT TGTGGAAAGT CCCCAGGCTC CCCAGCAGGC TCTCAATTAG TCAGCAACCA GGTGTGGAAA GCAGAAGTAT GCAAAGCATG CATCTCAATT CCCCTAACTC CGCCCATCCC GCCCCTAACT TCCGCCCCAT GGCTGACTAA TTTTTTTTAT CCTCGGCCTC TGAGCTATTC CAGAAGTAGT CTAGGCTTTT GCAAAAAGCT GTTACCTCGA CGCCATTTAA ATCCTGCAGG TAACAGCTTG ACGTCGTGAC TGGGAAAACC CTGGCGTTAC CACATCCCCC CTTCGCCAGC TGGCGTAATA CGCCCTTCCC AACAGTTGCG TAGCCTGAAT GTATTTTCTC CTTACGCATC TGTGCGGTAT GCAACCATAG TACGCGCCCT GTAGCGGCGC TGGTTACGCG CAGCGTGACC GCTACACTTG CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC CTTTCTCGCC TCAAGCTCTA AATCGGGGGC TCCCTTTAGG GGCACCTCGA CCCCAAAAAA CTTGATTTGG CCATCGCCCT GATAGACGGT TTTTCGCCCT CTTTAATAGT GGACTCTTGT TCCAAACTGG CGGGCTATTC TTTTGATTTA TAAGGGATTT TTAAAAAATG AGCTGATTTA ACAAAAATTT

ATCGATGGCC GCCATGGCCC 1350

AAATAAAGCA ATAGCATCAC 1400

GCATTCTAGT TGTGGTTTGT 1450

GGATCGATCG GGAATTAATT 1500

TGAAAGAGGA ACTTGGTTAG 1550

GGAATGTGTG TCAGTTAGGG 1600

AGAAGTATGC AAAGCATGCA 1650

GTCCCCAGGC TCCCCAGCAG 1700

AGTCAGCAAC CATAGTCCCG 1750

CCGCCCAGTT CCGCCCATTC 1800

TTATGCAGAG GCCGAGGCCG 1850

GAGGAGGCTT TTTTGGAGGC 1900

GCGGCCGCTT AATTAAGGCG 1950

GCACTGGCCG TCGTTTTACA 2000

CCAACTTAAT CGCCTTGCAG 2050

GCGAAGAGGC CCGCACCGAT 2100

GGCGAATGGC GCCTGATGCG 2150

TTCACACCGC ATACGTCAAA 2200

ATTAAGCGCG GCGGGTGTGG 2250

CCAGCGCCCT AGCGCCCGCT 2300

ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG 2350

GTTCCGATTT AGTGCTTTAC 2400

GTGATGGTTC ACGTAGTGGG 2450

TTGACGTTGG AGTCCACGTT 2500

AACAACACTC AACCCTATCT 2550

TGCCGATTTC GGCCTATTGG 2600

AACGCGAATT TTAACAAAAT 2650

180 765

149

ATTAACGTTT ACAATTTTAT GGTGCACTCT CAGTACAATC TGCTCTGATG 2700

CCGCATAGTT AAGCCAACTC CGCTATCGCT ACGTGACTGG GTCATGGCTG 2750

CGCCCCGACA CCCGCCAACA CCCGCTGACG CGCCCTGACG GGCTTGTCTG 2800

CTCCCGGCAT CCGCTTACAG ACAAGCTGTG ACCGTCTCCG GGAGCTGCAT 2850

GTGTCAGAGG TTTTCACCGT CATCACCGAA ACGCGCGAGG CAGTATTCTT 2900

GAAGACGAAA GGGCCTCGTG ATACGCCTAT TTTTATAGGT TAATGTCATG 2950

ATAATAATGG TTTCTTAGAC GTCAGGTGGC ACTTTTCGGG GAAATGTGCG 3000

CGGAACCCCT ATTTGTTTAT TTTTCTAAAT ACATTCAAAT ATGTATCCGC 3050

TCATGAGACA ATAACCCTGA TAAATGCTTC AATAATATTG AAAAAGGAAG 3100

AGTATGAGTA TTCAACATTT CCGTGTCGCC CTTATTCCCT TTTTTGCGGC 3150

ATTTTGCCTT CCTGTTTTTG CTCACCCAGA AACGCTGGTG AAAGTAAAAG 3200

ATGCTGAAGA TCAGTTGGGT GCACGAGTGG GTTACATCGA ACTGGATCTC 3250

AACAGCGGTA AGATCCTTGA GAGTTTTCGC CCCGAAGAAC GTTTTCCAAT 3300

GATGAGCACT TTTAAAGTTC TGCTATGTGG CGCGGTATTA TCCCGTGATG 3350

ACGCCGGGCA AGAGCAACTC GGTCGCCGCA TACACTATTC TCAGAATGAC 3400

TTGGTTGAGT ACTCACCAGT CACAGAAAAG CATCTTACGG ATGGCATGAC 3450

AGTAAGAGAA TTATGCAGTG CTGCCATAAC CATGAGTGAT AACACTGCGG 3500

CCAACTTACT TCTGACAACG ATCGGAGGAC CGAAGGAGCT AACCGCTTTT 3550

TTGCACAACA TGGGGGATCA TGTAACTCGC CTTGATCGTT GGGAACCGGA 3600

GCTGAATGAA GCCATACCAA ACGACGAGCG TGACACCACG ATGCCAGCAG 3650

CAATGGCAAC AACGTTGCGC AAACTATTAA CTGGCGAACT ACTTACTCTA 3700

GCTTCCCGGC AACAATTAAT AGACTGGATG GAGGCGGATA AAGTTGCAGG 3750

ACCACTTCTG CGCTCGGCCC TTCCGGCTGG CTGGTTTATT GCTGATAAAT 3800

CTGGAGCCGG TGAGCGTGGG TCTCGCGGTA TCATTGCAGC ACTGGGGCCA 3850

GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG GGAGTCAGGC 3900

AACTATGGAT GAACGAAATA GACAGATCGC TGAGATAGGT GCCTCACTGA 3950

150

180 765

TTAAGCATTG GTAACTGTCA GACCAAGTTT ACTCATATAT ACTTTAGATT 4000

GATTTAAAAC TTCATTTTTA ATTTAAAAGG ATCTAGGTGA AGATCCTTTT 4050

TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACG TGAGTTTTCG TTCCACTGAG 4100

CGTCAGACCC CGTAGAAAAG ATCAAAGGAT CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT 4150

CTGCGCGTAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA AAACCACCGC TACCAGCGGT 4200

GGTTTGTTTG CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG 4250

GCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTG TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG 4300

TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA CCGCCTACAT ACCTCGCTCT 4350

GCTAATCCTG TTACCAGTGG CTGCTGCCAG TGGCGATAAG TCGTGTCTTA 4400

CCGGGTTGGA CTCAAGACGA TAGTTACCGG ATAAGGCGCA GCGGTCGGGC 4450

TGAACGGGGG GTTCGTGCAC ACAGCCCAGC TTGGAGCGAA CGACCTACAC 4500

CGAACTGAGA TACCTACAGC GTGAGCATTG AGAAAGCGCC ACGCTTCCCG 4550

AAGGGAGAAA GGCGGACAGG TATCCGGTAA GCGGCAGGGT CGGAACAGGA 4600

GAGCGCACGA GGGAGCTTCC AGGGGGAAAC GCCTGGTATC TTTATAGTCC 4650

TGTCGGGTTT CGCCACCTCT GACTTGAGCG TCGATTTTTG TGATGCTCGT 4700

CAGGGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA GCAACGCGGC CTTTTTACGG 4750

TTCCTGGCCT TTTGCTGGCC TTTTGCTCAC ATGTTCTTTC CTGCGTTATC 4800

CCCTGATTCT GTGGATAACC GTATTACCGC CTTTGAGTGA GCTGATACCG 4850

CTCGCCGCAG CCGAACGACC GAGCGCAGCG AGTCAGTGAG CGAGGAAGCG 4900

GAAGAGCGCC CAATACGCAA ACCGCCTCTC CCCGCGCGTT GGCCGATTCA 4950

TTAATCCAGC TGGCACGACA GGTTTCCCGA CTGGAAAGCG GGCAGTGAGC 5000

GCAACGCAAT TAATGTGAGT TACCTCACTC ATTAGGCACC CCAGGCTTTA 5050

CACTTTATGC TTCCGGCTCG TATGTTGTGT GGAATTGTGA GCGGATAACA 5100

ATTTCACACA GGAAACAGCT ATGACCATGA TTACGAATTA A 5141 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:23:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy

180 765

151 (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:23:

ATGTCNCCNG CNCCNCCNGC N 21 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:24:

ATGTCTCCAG CGCCGCCAGC G 21 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:25:

ATGTCGCCTG CTCCACCTGC T 21 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:26:

ATGTCGCCAG CGCCACCAGC C 21 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy

152

180 765 (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:27:

ATGTCCCCAG CCCCACCCGC A 21 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:28:

ATGTCGCCAG CGCCGCCAGC G 21 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:29:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu

10 15

Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg

25 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 26 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:30:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu

10 15

Leu Arg Asp Asp Xaa Val Leu His Gly Arg Leu

25 26 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:31:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

180 765

153 (A) DŁUGOŚĆ: 25 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:31:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu

10 15

Leu Arg Asp Asp His Val Leu His Gly Arg

25 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:32:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:32:

Xaa Pro Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Xaa Asn Lys

10 14 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:33:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:33:

Pro Arg Leu Leu Asn Lys Leu Leu Arg

9 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:34:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:34:

GCCGTGAAGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCG 45 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:35:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 par zasad

154

180 765 (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:35:

CCNGCNCCNC CNGCNTGYGA 20 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:36:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:36:

NCCRTGNARN ACRTGRTCRT C 21 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:37:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:37:

CCAGCGCCGC CAGCCTGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCCTCGTGA 50

TGACCACGTT CAGCACGGC 69 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:38:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:38:

GCCGTGCTGA ACGTGGTCAT CACGAGGCAG TTTATTTAGG AGTCGGGGGT 50

CACAGGCTGG CGGCGCTGG 69 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:39:

180 765

155 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedynczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:39:

CCAGCACCTC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50

CGACCACGTC CATCACGGC 69 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:40:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:40:

GCCGTGATGG ACGTGGTCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCGGGGGT 50

CACATGCCGG AGGTGCTGG 69 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:41:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:41:

CCAGCACCGC CGGCATGTGA CCCCCGACTC CTAAATAAAC TGCTTCGTGA 50

CGATCATGTC TATCACGGT 69 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:42:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:42:

156

180 765

ACCGTGATAG ACATGATCGT CACGAAGCAG TTTATTTAGG AGTCGGGGGT 50

CACATGCCGG CGGTGCTGG 69 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:43:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:43:

GCTAGCTCTA GAAATTGCTC CTCGTGGTCA TGCTTCT 37 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:44:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:44:

CAGTCTGCCG TGAAGGACAT GG 22 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:45:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:45:

TGTGGACTTT AGCTTGGGAG AATG 24 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:46:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa

180 765

157 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:46:

GGTCCAGGGA CCTGGAGGTT TG 22 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:47:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 31 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi ) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:47:

ATCGATATCG ATAGCCAGAC ACCCCGGCCA G 31 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:48:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:48:

GCTAGCTCTA GACAGGGAAG GGAGCTGTAC ATGAGA 36 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:49:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:49:

CTCCTTGGAA CCCAGGGCAG GACC 24 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:50:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:50:

158

180 765

GGTCCTGCCC TGGGTTCCAA GGAG 24 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:51:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:51:

CTGCTCCGAG GAAAGGACTT CTGGATT 27 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:52:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 27 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:52:

AATCCAGAAG TCCTTTCCTC GGAGCAG 27 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:53:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:53:

CCCTCTGCGT CGCGGCGGCC CCACCCAC 28 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:54:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 28 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:54:

180 765

159

GTGGGTGGGG CCGCCGCGAC GCAGAGGG 28 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:55:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:55:

GACTCGAGGA TCCATCGATT _TTTTTTTTTT TTTTT 35 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:56:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:56:

GACTCGAGGA TCCATCG 17 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:57:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:57:

GCTAGCTCTA GAAGCCCGGC TCCTCCTGCC TG 32 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:58:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:58:

160

180 765

CGAAATTAAC CCTCACTAAA G 21 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:59:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 103 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:59:

TGCAGCAAGG GCTACTGCCA CACTCGAGCT GCGCAGATGC TAGCCTCAAG 50

ATGGCTGATC CAAATCGATT CCGCGGCAAA GATCTTCCGG TCCTGTAGAA 100

GCT 103 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:60:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 103 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:60:

AGCTTCTACA GGACCGGAAG ATCTTTGCCG CGGAATCGAT TTGGATCAGC 50

CATCTTGAGG CTAGCATCTG CGCAGCTCGA GTGTGGCAGT AGCCCTTGCT 100

GCA 103 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:61:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:61:

TCTCGCTACC GTTTACAG 18 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:62:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad

180 765

161 (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:62:

CAGGTACCCA CCAGGCGGTC TCGGT 25 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:63:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:63:

GGGCCATGAC ACTGTCAA 18 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:64:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 40 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (Xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:64:

GACCGCCACC GAGACCGCCT GGTGGGTACC TGTGGTCCTT 40 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:65:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 32 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:65:

ATCGATATCG ATCAGCCAGA CACCCCGGCC AG 32 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:66:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy

162

180 765 (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:66:

TCTAGATCTA GATCACCTGA CGCAGAGGGT GGACC 35 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:67:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 33 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:67:

AGTCGACGTC GACGTCGGCA GTGTCTGAGA ACC 33 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:68:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 36 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy

CC) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:68:

AGTCGACGTC GACTCACCTG ACGCAGAGGG TGGACC 36 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:69:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 62 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:69:

CGCGTATGCC AGCCCGGCTC CTCCTGCTTG TGACCTCCGA GTCCTCAGTA 50

AACTGCTTCG TG 62 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:70:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 61 par zasad

180 765

163 (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedynczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:70:

AGTCACGAAG CAGTTTACTG AGGACTCGGA GGTCACAAGC AGGAGGAGCC 50

GGGCTGGCAT A 61 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:71:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:71:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAA 37 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:72:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 37 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:72:

CGCGTTAAGA AGAAATGCGA TATTCTTTTT CATAATT 37 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:73:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:73:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50

CACATCGAAG GTCGTAGCC 69 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:74:

164

180 765 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 62 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedynczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:74:

TACGACCTTC GATGTGATGG TGATGGTGAT GGTGATGAAA TGCGATATTC 50

TTTTTCATAA TT 62 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:75:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 69 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:75:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC ATCACCATCA CCATCACCAT 50

CACATCGAAC CACGTAGCC 69 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:76:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 62 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:76:

TACGTGGTTC GATGTGATGG TGATGGTGAT GGTGATGAAA TGCGATATTC 50

TTTTTCATAA TT 62 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:77:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:77:

180 765

165

TCCACCCTCT GCGTCAGGT 19 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:78:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:78:

AGCTACCTGA CGCAGAGG 18 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:79:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 62 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:79:

GCAGCAGTTC TAGAATTATG TCNCCNGCNC CNCCNGCNTG TGACCTCCGA 50

GTTCTCAGTA AA 62 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:80:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 49 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:80:

GAAGGACATG GGAGTCACGA AGCAGTTTAC TGAGAACTCG GAGGTCACA 49 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:81:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa

166

180 765 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:81:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTA TCGAAGGTCG TAGCC 45 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:82:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:82:

TACGACCTTC GATAAATGCG ATATTCTTTT TCATAATT 38 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:83:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 45 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:83:

CTAGAATTAT GAAAAAGAAT ATCGCATTTC TTCTTAAACG TAGCC 45 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:84:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 38 par zasad (B) RODZAJ: Kwas Nukleinowy (C) RODZAJ ŁAŃCUCHA: Pojedyńczy (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:84:

TACGTTTAAG AAGAAATGCG ATATTCTTTT TCATAATT 38 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:85:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 168 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (Xl) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:85:

180 765

167

Met 1

Lys

Asn

Ile 5

Ala

Phe

Leu

Asn 10

Ala

Tyr

Ala

Ser

Pro 15

Ala

Pro

Ala

Cys 20

Asp

Leu

Arg

Val

Leu 25

Ser

Lys

Leu

Arg 30

Asp

Ser

His

Val

Leu 35

His

Ser

Arg

Leu

Ser 40

Gin

Cys

Pro

Glu

Val 45

His

Pro

Leu

Pro

Thr 50

Pro

Val

Leu

Pro 55

Ala

Val

Asp

Phe

Ser 60

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys 65

Thr

Gin

Met

Glu

Glu 70

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp 75

Ile

Leu

Gly

Ala

Val 80

Thr

Leu

Glu 85

Gly

Val

Met

Ala

Ala 90

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly 95

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser 100

Ser

Leu

Gly

Gin 105

Leu

Ser

Gly

Gin

Val 110

Arg

Leu

Gly 115

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu 120

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu 125

Pro

Gin

Gly

Arg 130

Thr

Ala

His

Lys 135

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile 140

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin 145

His

Leu

Arg

Gly 150

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

Val

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

155 160 165

Arg Arg Ala

168 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:86:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 174 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (DJ TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:86:

Met 1

Lys

Asn

Ile 5

Ala

Phe

His

His 10

His

His 15

Ile

Glu

Gly

Arg

Ser

Pro

Ala

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

20

25

30

Leu

Ser

Lys

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

35

40

45

168

180 765

Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro 50

Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly 65

Glu Thr Lys Ala Gin Asp Ile Leu 80

Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly 95

Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser 110

Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly 125

Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro 140

Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val 155

Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg 170 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:87:

Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu 5560

Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu 7075

Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu 8590

Gin Leu Gly Pro Thr Cys Leu

100105

Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu 115120

Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly

130135

Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe

145150

Arg Phe Leu Met Leu Val Gly 160165

Ala

174 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 174 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO

Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe His 1 5

Ile Glu Pro Arg Ser Pro Ala Pro 20

Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser 35

Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro 50

Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly 65

Glu Thr Lys Ala Gin Asp Ile Leu

87:

His His His His His His His 1015

Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val 2530

His Val Leu His Ser Arg Leu 4045

Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu 5560

Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu 7075

Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu

180 765

169

8085

Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr Cys 95100

Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu 110115

Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin 125130

Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser 140145

Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val 155160

Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala 170174 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:88:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:88:

Thr Thr Ala His Lys Asp Pro 1 5 7 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:89:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:89:

His Val Leu His

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:90:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa

Leu 105

Leu 120

Gly 135

Phe 150

Gly 165 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:90:

170

180 765

Ser Arg Leu Ser

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:91:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:91:

Ser His Val Leu

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:92:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:92:

His Ser Arg Leu

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:93:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:93:

Ala Val Asp Phe

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:94:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:94:

Ser Leu Gly Glu

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:95:

180 765

171 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:95:

Ala Val Thr Leu

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:96:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:96:

Leu Leu Glu Gly

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:97:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:97:

Leu Ser Ser Leu

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:98:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:98:

Leu Gly Gin Leu

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:99:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa

172

180 765 (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:99:

Cys Xaa Leu Ser Ser 1 5 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:100:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:100:

Leu Leu Gly Gin

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:101:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:101:

Ser Ser Leu Leu

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:102:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:102:

Gly Gin Leu Ser

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:103:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:103:

Cys Leu Ser Ser

4

180 765

173 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:104:

(1) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:104:

Leu Gin Ser Leu

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:105:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:105:

Leu Gly Thr Gin

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:106:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:106:

Ala Leu Gin Ser

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:107:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:107:

Leu Leu Gly Thr

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:108:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa

174

180 765 (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:108:

Asn Ala Ile Phe 1 4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:109:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:109:

Leu Ser Phe Gin 1 4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:110:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:110:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu 15 10 15

Leu Arg Asp Ser His Val Leu 20 22 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:111:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:111:

His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr 15 10 15

Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe 20 24 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:112:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI: (A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasów

180 765

175 (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:112:

Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin 15 10 15

Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu 20 23 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:113:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:113:

Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu Gly Pro Thr 15 10 15

Cys Leu Ser Ser Leu Leu 20 21 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:114:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:114:

Gly Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin 1 5 10 ’ 15

Ser 16 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:115:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:115:

Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His 15 10 15

176

180 765

Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe 20 22 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:116:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 25 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:116:

Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met 15 10 15

Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg 20 25 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:117:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:117:

Met Pro Pro Ala 1 4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:118:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:118:

Met Ala Pro Pro Ala 1 5 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:119:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:119:

Met Pro Ala Pro Pro Ala 1 5 6

177

180 765 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:120:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:120:

Met Ser Pro Ala Pro Pro Ala

5 7 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:121:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:121:

Ala Pro Pro Ala

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:122:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:122:

Pro Ala Pro Pro Ala

5 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:123:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:123:

Ser Pro Ala Pro Pro Ala

5 6 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:124:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 4 aminokwasów

178

180 765 (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:124:

Val Arg Arg Ala

4 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:125:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 5 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:125:

Val Arg Arg Ala Pro

5 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:126:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 6 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:126:

Val Arg Arg Ala Pro Pro 1 5 6 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:127:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 7 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:127:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr 1 5 7 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:128:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:128:

180 765

179

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr

5 8 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 12 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 129:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala

9 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 130:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 10 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO: 130:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val

10 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 131:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 11 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:131:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro

5 10 11 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 132:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:132:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser

5 10 12 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO: 133:

180

180 765 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 13 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:133:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg 1 5 10 13 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:134:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 14 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:134:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr 15 10 14 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:135:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 15 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:135:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:136:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 16 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:136:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:137:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 aminokwasów

180 765

181 (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi ) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:137:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val 17 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:138:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 18 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:138:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu 18 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:139:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 19 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:139:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr 19 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:140:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 20 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:140:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

182

180 765

Leu Val Leu Thr Leu 20 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:141:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 21 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:141:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn 20 21 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:142:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 22 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:142:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu 20 22 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:143:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:143:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 20 23 (2) DANE DOTYCZĄCE SEQ ID NO:144:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 24 aminokwasów (B) RODZAJ: Aminokwasowa

180 765 183 (D) TOPOLOGIA: Liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:144:

Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser 15 10 15

Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro

24

180 765 uc-ccacccacccgcDccccagagggccgccEgccgcgcactcgggtcctggagcccttctccacccggatagattcctcacccttggcccgcctttg λ u u n> Λ U u σ> u <o u u cn Φ Dl D> Dl Φ U «J <0 β u u u u Dl O IC D> Φ θ' Di Dl Dl <0 U <Λ < V) > υ <α ο Μ Ł Ο Μ Ο, <0

Ο Μ Ł Μ Φ

Φ ω 3 Φ

Ρ £ φ υ σι Μ < <ο

U Ευ υ υ Ευ υ υ υ υ υ υ υ υ Ευ Ευ υ υ φ u 5 υ c ω φ

υ Ευ υ υ υ <

<=*» a

Ο

Lu <σ > 3 Φ σι υ Ευ < u < υ υ Ευ <0 D> Dl <0 <0 CT D> Φ U U U U Di Di

Ifl υ u Xl υ u D> U· U Dl <0 <0

U υ σι φ Di Φ <0 U D> XI Dl Φ <0 Di <9 U υ υ Di XI u u <0 XI o υ u «1 υ u o

Φ U □ Φ

Φ S <0 >

φ

Φ

Φ UI 3 Φ

Φ U 3 υ φ X

U υ Ευ υ Ευ υ Ευ υ Ευ υ Ευ υ £ υ Ευ υ Ευ υ < υ υ w (0 υ u σι □> υ υ u υ u 10 Dl ο σι —η υ < υ χι υ φ ΕΣ <

ο ιη ο 10 φ ω ο Μ a.

>

U α. ο Ρ α Λ υ < υ υ < υ υ υ υ Ευ Ευ υ < υ < υ υ < υ υ υ < υ υ υ υ υ σι υ «c σι <0 > w υ υ υ υ < υ Ευ υ

Φ Ευ υ υ

180 765

210 _________ 220 230 _________ 240

ProGlvLeuLetjAsnGlnThr]serArqSerLeuAspGlnIleProGlvTYrLeuAsnArqIleHisGluLeuLeŁ&3nGlYThr|ArqGlvLeuPhePro 901 TTCCTGGTCTGCTGAACCAAACCTCCAGGTCCCTGG ACCAAATCCCCGGATACCTGAACAGGATACACGAACTCTTGAATGGAACTCGTGGACTCTTTCC o

o KO 04

O m oj

U Φ ω o M O. 0. ω A o Ul CU 5 a> 0 5 4) J o M o. tn •rH X □ 41

C 0 <0 >

(0 > o M

M & 5 OJ

O u o. O Ul CU 5 4) U o Ul a« 4) £ CU 5 4» eo u H 0 δ 0 0 0 0 < 0 b 0 0 < 0 0

O υ u u o u < o 0 u u u u

0 U

3

O C

4) W

Φ U c u

u <0 © u u o u to u <0 © <0 u 4-1 u

O Ol

0 < 0

o Cl 4) cn w

0

4> u 3 4J ►J O M CU Ul 4) W Ul

O Ut CU

O Ul fδ δ 0 0 0 < 0 0

0 0 < 0 0 0 0

CM to <o ra to © © u U u © to <o <o u u u to <0 <0 © u u u

u <9

U U AJ u ©

AJ AJ 10

U © «J 10 © 10 u u u <0 10 to AJ <0 AJ o u to © AJ υ to u

AJ u

to <0 © © © to to rc <0 o AJ υ 10 © © to υ ιθ O to

CT © © © to u © a u u © © u © © a u u a © <o <o ffl u © AJ u AJ υ to to <0 a AJ © AJ u

AJ

U u © « u a u

u fl © AJ U <0 υ u <0 to u ©

AJ <0 <0 10 © <0 o © AJ u

AJ

AJ u a © AJ o

υ a o in ra u

AJ

U U u u <0 u u u u u © u 3 10 u u u u a o to to υ AJ to <o <o u u a aj to (0 © a a (0 <0 © 10 © Λ U <0 <0 <0 <0 a υ

a <o ©

AJ υ u 10 fl u to © to © to © © a to a <o u <o to a <o ιο 10 <o <o <o <0 <0 <0 <0 <0 to to <0 <0 10 <0 <0 <0 to to © to u u

u u © to to to a (0 <0 © to ©

AJ u AJ υ <0

AJ

U AJ to © to u to 10 AJ u

,to u u υ to © u u to © © © © to u u AJ AJ 10 u m

ΟΠΗ·»

O O Lu

180 765

Komórki BaF3

MPLP3

Usunąć IL-3 — II— I i I I (24 godziny głodzenia)

Połączyć badane komórki + + IL-3-głodzone komórki inkubować 18 godzin (przez noc)

O ooooooo ooo 000 0 000 oooo ooooooooooo ooooooooooo o o o o o o o o o o o

Dodać 3H-tymidynę do studzienek inkubować 6 godzin / OOOOOOOOOOO /OOOOOOOOOOO) /ooooooooooo/ ooooooooooo ooooooooooo

Zebrać zawartość na płytce do filtracji ooooooooooo ooooooooooo ooooooooooo ooooooooooo ooooooooooo

ooooooooooo ooooooooooo ooooooooooo ooooooooooo ooooooooooo

Analiza wbudowania 3H-tymidyny/ studzienkę;

oznaka mitogeniczn reakcj i na badany czynnik

FIG.2

180 765

120 η stosunku do kontrolnego

FIG.3

180 765

15000 Wbudowanie 4H-tymidyny

10000 H i/ioo ϋ 1/200 □ 1/400 0 1/800 □ 1/1600 ϋ 1/3200 g 1/6400

Λ Φ N Μ (i (i β

FIG. 4

180 765

MW χ 10’³

3 4 5 6 7 8 nr frakcji

FIG. 5

180 765

Wbudowanie 3H-tymidyny

Płat żelu

FIG.6

180 765

Związany 125-1 HPD-ID

FIG,7

180 765

Związany 125I-HP1-1D

FIG_e8

180 765

s >

> j u J δ o 82

U <

U u δ u < ίο < o o < □ o u 0

X o o 0 o 0 O δ

Q o

u □

o 0 < o

u < o o u

0

a>

u <c o o

Ol,

U □ «t u (5 u H U tn u u 0 o < u u e0 u 0 u o •t o 0 u o u

U 0

O 0 o o

δ s δ 22

o o o o < 0 •t 0 <

Ο) ο ω

Lu

O 0 O O H

0 ο u 0 Η Ο Η 0 < 0 < 0 δ «< 2 ο

u ο

U 0 u Ευ o o

0

Ο (Ν e 0 ο < ο ο ο 0

Λ 0

Ο ί180 765

UJ	os co	> OS	«C LU
o >-	>\|	—J «U	co _J
-J uu	o «ε	Lu Lk.	«C UD
Z	CD	cg z	1—
u. >-	CO Q	>· ŁO	U. H—
ca	—1 >·	ac >-	2S CD
> ►—	O X	UD >	I— z
c o	UD —J	1°⁶ «i	UJ —J
	-J CJ		—J *
—I >>	I«J —i]	\| u \|	—1 UJ
^—i	CO O.	z ag	UD Z
>· >-1 !	i UJ	a cg	CO HM
o- z :	> X	\|u_ u_j	ł— OS
ł— UJ	CO CU	CO H-	X z
O. 2	—1 o	—J a	z —:
1—J —>\|	ο co :	u- «ε	□- >-
o. CO	u- us i	HM h-	_J ld
3= UJ	a zj	«ε «-<	uj o.
> Z	UD >	2 1—	z <-<
\|uj uj\|	[_□ —j\|	o- os	—J O
o- <C	O -J	a —i	i— a
L^-^l	CD <C	ag a	-J «J
a ud	Cg o	x ><	> <Λ
CO ł—	< UD	(«ε «ε\|	—1 Z
«u h— :	-C cg	H- CO	co co
as i—»:	X -J	μ- «ε	l·—
z i	1» _>l	Cg <<	z o
X UJ	UD <	ud a	UD Z
_J <C	Fuj uj]	O O-	Ο» -J
> UJ	—j co	\|o. 0-1	> <_l
3=	_J —j	O. CO	< o
co <c	«J —J	HM	►— o.
ca uj	·— «ε	¹ «ε	HM
CC -J	> —I	• UJ	o- ag
1—J Jj)	·< UD	<	O. OS <<
	UD O	(o o\|	<ε a tu
bC os	-J X	H- «	Cg UD u.
CO UJ	-< >	LD LD	OS ►— CD
—i —J	a uj	•J .J	>· X o
> >	o >	—> c	»\|uj uj\| o
tg cg	\|c <1	co os	—J «ε x
-J co	ag o	O —J	t— uu ag
a a	ł— o	\|«j J»i\|	U0 UD —1
® UJ UJ	UJ UD	< h-	UD ł— —1
c »->	UJ >	UD 1—	UD X- UD
O.	X UJ	l-u «u\|	> -J Vł
O- os	α z	' CO	-J LD
< a	U- os	> os	X —1 1—
[Ol. cl.]		L=i_=LJ	> ^s >—
u> ·<	Z X	—1 (J3	> CD OS
•M	Ul Ul	σ> «μ σι o	η —( «μ in σι

Ο e Ο Lu σ\

Ci

180 765

SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSHLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGE SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVLHSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDFSLGE

UJ O

G E

L ^LL ^LL ^L

l l

TL

T L

L H

id

•

4

«4

X

K

X

OT

id

4

σ

co

CO

>

CD

a

4

4 1

LU

U»

o

σ

CD

z

Q

o

a

CD

>

OT

CO

a.

X

>

CD

CO

-4

4

—

CD

UJ

<

4

2

h»

1—

<

O.

x

σ

o

σ

o

•4

4

W·

co

OT

.J

4

o

CD

o

CD

LL

U*

LL

tu

X

5

3

4

«4

u

4

X

o

a

<

OT

>

«4

4

«4

>

t

OT

Q

O

cl

CL

OT

CD

OT

id

<

«<

σ

h-

►—

OT

CD

H

OT

CO

CL

x

4

X

U.

u.

o

σ

4

o

CD

o

4

-4

4

z

—

X

£=·

«4

4

h“

CD

X

CL

0-

X

UJ

Ul

<

>

O

CD

σ

o

4

—1

<

Ul

-4

4

«4

U.

X

LL

4

>

cl

x

o

σ

a

σ

OT

co

OT

CD

Ul

o

u

o

CD

4

OT

co

_ OT |

σ

X

U.

LL

LU

I-

<

CO

OT

<

<4^

—

X

K

3:

£

«4

o4

<

z

•

«

X

2

S

2

z

X

1

a

OT

>

X

4

•

«

X

a

CD

a

Q

a

o

Ul

•

«

4

—i

UJ

Ul

id

ϋ

id

z

0

4

>

4

•4

4

X

4

•

X

4

«4

4

<

<<

<

k·

a

•

OT

4

•=4

=J

1—

I·»

ctJ

«J

9

•

Q

O

ł—

φ·—

f—

>

•

«

X

>

X

4

4 I

_1

4

<

CD

OT

£

4

CD

O

σ

O

σ

I-o

H-

>

id

«4

4

X

•

X

a

X

z

OT

—

X

•

X

•

OT

•

«4

a

Q

o

4

•

4

X

•

»

>

o

σ

I

o

•

>

•

ł

X

<

><

<

I-

H

h-

<

a

0

«4

4

id

co

CD

C3

1-

H

•

a

o

a

H

H-

►·

4

1-

*

a

o

UJ

Ul

U)

UJ

-4

4

CL

X

•

a

<

Ul

OT

CO

X

t

a

O-

X

2

O

σ

O

σ

<<

•

X

a

O

o

σ

«4

4

X

σ

<

h-

H

t-*

<

X

co

OT

x

X

id

CD

>

4

co

5

s

5

4

. 1

4

_ 1

o

CD

o

oj

4

fH

Λ

in

cH m

in

o

rH O

3

O ϊΗ

3

5

σ\ S

IH s

cm m ’Φ cm m CMcn·^ cm m iiii liii liii iiii

180 765

PGYLNRIHELLNGTRGLFPGPSRRTLGA P G Y L NR IHELLNGTRGL F PGPSRRTL G A	S WT L S WT L TGDPRSPGHfIlRN 1 R H R LlPjA S WT L S WT L TQDPRSPGHf\|l RN 1 RjH R L!p\|a		PSPTHPPTGQYTLFPLPPTLPTPVVQLH PSPTHPPTGQYTLFPLPPTLPTPVVQLH 11 ¹ i i i a	.....NPSS Y WT V Y A L PIS S......... .....NPRSYWTVYAI PS S.........	J J	THSONL SQEG THSONLSOEG			«εη>
hML 201 QQGFRAKIPGLLNQTSRSLDQI hML2 197 Q Q G FRAK 1 P GLIN Q T S R S L D Q 1	hML3 179 V P G Ρ N P R 1 P - - - E Q D T R T L E W N hML4 175 V P G P N P R IP - - · E Q 0 T R T L E W N		hML 251 POISSGTSDTGSLPPNLOPGYS hML2 247 POISSGTSDTGSLPPNLOPGYS j . . .	hML3 226 T Q...........PPAWIFSFP hMTJ τη...........PPAWIFSFP	J 1 1« 3	hML 301 PLLPDPSAPTPTPTSPLLNTSY hML2 297 PLL P D PSA Ρ Τ Ρ Τ P T SP L L NT S Y	σ a ° a a c Ł a 3 * 3 U C r	5 tf C « . O . a . a c * . o > c ) Ł . a : 3 C «a : 3 - H 1 ζ < e	O u, d c J c J ) > J c J • 1 3

180 765

Wbudowana

Związany i25|._antj ||bl||a (cpm) [³H]- tymidyna (cpm) φ pRK5

O PRK5-ML pRK5-MLi53

60000

50000;

4000030000 20000·

10000-

10⁴

10⁵

Krotność rozcieńczenia

FIGo! 2A

30000*

kontrolna Mock APP rhML FhML₁₅₃

FIG. I 2B

180 765

Ν Ο Λ >4 C

Ο C

01- X

PBS

Mock

16,000 U

32,000 U

64,000 U

OJ

CD

O OJ o o Lu _P0LX c ^egA^d op SSE Bxu«MopnqM %

180 765

00009

Krotność rozcieńczenia

AuAp-ęmAą- [H£ ]

STueMopnqM

180 765 ο u u ΙΟ u <o o υ o <o xi o σ> to u υ o υ υ to u <ο ο υ υ « υ η υ <ο u <3 ϋ υ u ο υ u χΐ u χι Ο χι ο χι υ υ χ> ο σ> υ u υ χΙ υ υ σι υ u σι <ο u σ> ο ο u υ σ> χ)

U υ 4J XI X) υ υ χΐ u υ σι η u υ u υ <ο σ> σι σ>

υ <ο οι ιο σι σι σ σι χ> 01

U <0 σι <ο ο <ο υ (0 σι σι α σι XI u υ υ υ Οι <0 ιθ σ> σι ιο υ u σι σι η υ σ> σι 10 ιο υ <ο σι σι σ> XI ιο σι XI ο σι σι σι σ σ> <ο υ ο σι σ> σ> σι σι υ

σι <0 σι σι ιο σι χ> υ υ 01 <0 σι ιο Ο) <ο σι σι <ο υ <ο σι σι οι σι οι οι σι σι u υ u χΙ XI u <σ to ra υ ο «

υ υ u υ ο χι ιο 01 σι to 01 «3 ιο <0 10 w σ> <0 υ υ σ χι ιο u υ υ σ>

XI w σ <ο υ υ υ σ>

σ> <ο υ u u u σι ο σι to <ο σι <ο ο> <ο <ο υ σ ιο u <ο 01 σ> ιο ιο ιο Οι ιο σι σ> σ> <ο σ σι χ> (0 <ο σι 01 σι σι <ο ο w ο σι <ο ο σ σι σι <ο ο σι ο σ & ιο σ οι Ο) to η σι <ο ο ο ο u

υ υ u υ u σ

ο υ XI υ σ υ

υ <ο ιο 10 <ο ιο ο σι

Οι σι οι σι σι XI Οι σι σι <ο υ οι β υ υ σι σ οι (Ο σι XI σ> ο u ο ο u u

Ευ εευ υ ο ο < υ υ Ευ U ΕΟ υ υ

U < U U υ ο σι σ σι

Οι ιο σι σ 10 σι <ο σι ο σι α ο <ο οι υ ο ο σι σι 10 ο η χΙ 0 ο 10 <0 σι οι XI υ ο 10 κ> u σ εη <ο υ σ σ> σ σι <ο 01 01 σι σ σι u

to m en ιο σι σι σι <0 υ ο υ ΟΙ 10 Οι to ϋ Λ 01 01 σι οι ιο <0 <0 01 σι to <ο XI υ υ υ οι σι ο σ> 01 ο u ο σι <ο υ η υ σι ιο υ <ο <ο ιο σι σι σι σι υ

<0 <ο □ <ο en χι Ο ια οι σι σι <ο σι υ

σι 01 σ σι σι σι Οι 01 & σι σ σ

180 765

to u

U σι

O Ol

U

σι tu

<0 <0

Oi AJ

f0 U

U

σι tQ

o ta

u

(0 cn

ł

υ

tu

O)

U

10

tu

to

u

0

Dl

cn

υ

to

(U

O

AJ

y

10

u

tu

u

1 >

10

cn

Aj

u

<u

u

υ

AJ

10

υ

u

Ol

O

u

cn

u

σι

tu

AJ

aj

D>

σι

to

Ol

aj

AJ

|Q

AJ

Ol

AJ

tu

<0

aj

υ

σ>

U

o

<0

o

σι

to

AJ

u

10

u

Dl

υ

11

<0

tu

IG

y

σ>

Λ5

σι

Ol

Dl

y

Π3

σι

u

U

aj

ί*

tn

u

σι

to

10

<a

10

Ol

10

u

σι

y

<

Dl

σι

υ

u

Dl

Ol

σι

Dl

0

Aj

σι

□

u

AJ

<0

U

u

0

IG

to

10

<0

AJ

υ

u

Dl

y

05

U

aj

AJ

<

XI

Dl

<0

υ

σι

AJ

Oi

o

Dl

υ

U

u

2

10

cn

Ol

υ

<u

Ol

0>

aj

<0

Dl

σ>

to

u

0

u

0)

υ

0)

Ol

«5

aj

Dl

to

σι

U

Cl

AJ

0

u

cn

υ

tu

Ot

^J

O

Dl

AJ

u

m

υ

Cl

o

tn

cn

u

AJ

Ol

0

Dl

u

y

ο

Ol

u

Ol

cn

<0

tU

0

<0

to

y

10

«5

<0

O

u

Ol

cn

<0

4

u

aJ

<0

10

O

o>

AJ

Di

0

to

u

«

io

σι

υ

(U

υ

U

XI

o

u

Dl

σι

AJ

U

At

AJ

«

Dl

A>

0

u

(0

σι

Ol

υ

U

<0

05

m

Dl

<0

XI

y

Ol

O

to

σι

to

u

10

Oi

Dl

to

<0

Ol

E-

tn

σι

aj

u

«3

U

aj

| 1

U

Ol

XI

<

&

cn

aj

σι

aJ

σι

AJ

io

U

u

χι

io

10

U

Di

Dl

σι

aJ

AJ

σι

<0

aj

y

U

oi

to

Cl

a

cn

<0

AJ

U

«3

AJ

Dl

y

Οι

O

io

Ε-

Dl

cn

υ

10

tu

U

υ

u

AJ

io

<0

0>

2

υ

10

υ

xj

AJ

aj

u

0)

u

x>

Dl

xl

^J

U

0

to

u

Dl

fO

Ol

10

u

aj

Cl

Ol

Dl

O

0

σ»

υ

<0

(U

aJ

Di

y

AJ

IG

O

cn

U

IG

to

οι

υ

Dl

aJ

aj

aJ

AJ

10

U

(0

aj

O

U

IG

0)

υ

Dl

aJ

AJ

u

(0

Di

U

u

10

AJ

0

a

IG

ΟΙ

Οι

Xl

aj

Ol

^J

<0

10

y

U

lO

y

<C

u

IG

σι

ra

<0

AJ

u

<0

Ol

y

<0

|Q

<0

2

10

<0

σι

<0

fl

U

υ

AJ

u

Dl

10

Dl

IG

O

AJ

aj

O

0

AJ

y

W

10

<0

0

cn

O

σι

tU

Ol

^J

10

u

a

<0

Dl

U

IG

U

σι

Ol

υ

u

AJ

u

Dl

Cl

Dl

U

10

O

Ol

10

<Q

u

σι

10

Ol

10

IG

Dl

IG

U

□

<u

O

tU

aJ

Ol

w

Dl

y

O

u

0

tn

XI

ϋ

υ

AJ

^j

<0

^J

AJ

il

Dl

o

<

0 0

σι

«J

u

10

<0

O

D>

aJ

U

Di

<0

2

>< H

to

m

σι

υ

y

XI

y

D>

aj

XI

X)

u

X)

U

Λ u

u

to

<0

Dl

u

<0

u

<0

AJ

Dl

U

o

0

E- A

u

σι

10

Ol

o

U

^J

AJ

^J

Dl

£ i

XI

Et

□ 0

o

σι

u

^J

aJ

IG

<0

Ol

I 1

u

Dl

aj

o

0

41 E-

<0

m

0

aJ

0

<0

y

Dl

y

O

y

>4 U

n>

cn

U

O

aJ

O

u

Dl

aj

Dl

Ol

Dl

2

3 0

tn

σι

Ol

AJ

aj

AJ

o

Ol

^J

o

10

3

<-t <

Dl

(0

u

υ

^J

U

o

iG

AJ

Dl

IG

O

0 O

cn

σ>

0)

AJ

<0

u

Aj

O

AJ

10

Dl

u

xi u

tn

σι

Ol

to

<0

u

«3

Ol

AJ

10

<0

cn

υ

Φ E-

cn

(0

Ol

u

^j

to

aJ

Dl

XI

u

to

u

£

AJ

U

Aj

tu

y

O

υ

U

Ol

y

u

o

2

u

<0

Ol

u

01

AJ

xi

XI

AJ

ο

<0

u

H

□

Cn

σι

io

Ol

0>

aJ

O

y

AJ

IG

10

u

cn

0

A

a

u

AJ

<0

Ol

u

<0

O

(0

XI

Ε-

U

to

σι

AJ

aj

01

10

aj

o

u

y

υ

U

CT

AJ

Ol

(0

io

U

Ol

aJ

10

io

o>

y

0

a

aJ

AJ

oi

aJ

Dl

U

AJ

u

Oi

o

Ε-

0

«

υ

m

AJ

10

aJ

O

aJ

Di

AJ

0

<0

υ

u

«

jj

u

<0

u

AJ

Ol

y

Dl

AJ

y

u

O

u

Dl

<0

Ol

X>

AJ

aJ

fO

o

u

U

u

0

υ

01

<0

0

u

jj

U

Di

ra

u

cn

η

<0

Ol

<0

u

to

y

AJ

U

Ol

y

Oi

U

A

0

υ

u

<0

^J

aJ

u

U

Di

oi

XI

u

υ

&

01

(0

u

O>

u

10

Dl

AJ

Dl

y

u

A

10

*.)

Ol

υ

01

u

<0

AJ

aJ

u

U

u

0

u

<0

u

Ol

u

10

AJ

u

U

10

<0

A

Di

XI

Ol

AJ

10

u

«0

y

υ

Dl

0

y

U

XI

U

AJ

Dl

AJ

u

AJ

U

10

0

cn

U

u

10

<0

u

y

to

y

Dl

01

n>

0

cn

u

^J

10

Ol

to

O)

xi

X)

aJ

10

IG

u

A

o

u

Ol

<0

u

<0

10

y

u

XI

Dl

y

u

U

10

tn

σ>

Dl

xi

u

IG

u

oi

y

01

u

o

U

u

<0

Ol

u

Ol

to

A,

<0

O

10

u

0

IG

o

<0

ci

u

Ał

AJ

to

xl

y

u

U

a

u

AJ

Dl

a

y

co

u

<0

ąI

01

u

A

10

oi

Ol

01

<0

Dl

AJ

y

aj

Dl

u

U

cn

AJ

<0

Dl

u

Dl

AJ

10

CO

<0

u

0

U

a

01

Ol

υ

u

IG

AJ

u

AJ

y

Dl

f-

0

to

oi

Dl

AJ

Ol

u

O

Ol

U

u

cn

Λ

IG

Ε-

A

<a

<0

υ

aj

u

U

AJ

σι

<0

AJ

10

υ

0

IG

υ

U

AJ

O!

x>

aj

Di

AJ

u

AJ

x>

U

u

0

Dl

AJ

Ol

Oi

AJ

u

O

10

aj

AJ

10

u

0

IG

10

Dl

Di

<0

υ

Aj

to

aj

u

AJ

Ol

y

A

Dl

OJ

<0

AJ

y

AJ

10

Dl

D>

ll

u

U

IG

Ol

Dl

υ

xj

o

O

IG

u

Dl

aj

Ol

to

e-

A

Dl

AJ

Dl

01

^J

Dl

0

U

AJ

u

Λ U

2

10

XI

Dl

10

0

AJ

u

nj

<0

aj

O)

O

cn

U

2

cn

<0

fl

υ

Dl

01

AJ

to

u

10

Ol

10

ot E-

u

Dl

x>

U

01

Dl

10

u

AJ

IG

AJ

X)

u

£

u

0

Dl

Di

AJ

o

<0

Dl

10

y

Dl

C A

u

Dl

<0

Dl

Ol

01

Dl

o

m

10

Dl

Di

«

Dl

O 0

u

10

U

Dl

AJ

io

jj

u

10

Dl

U

AJ

10

tn

X <

0

<G

U

a

υ

u

Dl

AJ

01

D

u

10

AJ

U E-

0

U

Dl

υ

u

AJ

aJ

u

10

AJ

u

y

A

to

X1

io

u

AJ

aJ

Ol

io

Dl

u

y

Dl

V 0

0

O

^*4

^4

r*4

fH

i*H

f*4 rH

O

o

O

o

O

o

©

as

O

CN

O*

in

\o

p·»

CO

as

o

i-4

r-4

r4

(N

CN

(N

CN

(N

CN

m

< Εχοη 3 >

luLeuLeuLeu

3201 tcaggtctgggtcctgaatgggaattcctggaataccagctgacaatgatttcctcctcatctttcaacctcacctctcctcatctaagAATTGCTCCTC

FIG. I 4B

180 765

ValValMetLeuLeuLeuTlirAlaArgLeuThrLeuSerSerProAlaProProAlaCysAspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHisVal 3 301 GTGGTC ATGCTTCTCCT AACTGCAAGGCT AACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGTG ACCTCCGAGTCCTC AGTAAACTGCTTCGTGACTCCCATG

End of signal peptide io o o o u

o to u o a u <o 0 to □i 01 <0 o υ u u tO u -o u o υ u ra o ra «1 o o o 10 <0 w o 01 O υ <o υ 01 <ο <ο <ο <ο 4J (0 υ 01 ο u u οι ιο 0 ιο

-ο ο <ο 0 to to o

Ifl to 0 u to 0 0 0 0 0 0 u υ o υ to

Li <0 <0 σι -ο η ο <0 01 U 0 Li 0 Li u ιο u « o β Ol <0 o o <0 o o u o o to 0 <0 o

<0

-o 0 0 to ίο

0

-o to to o to to o o 3 0 ® β J β <0 βίο β< o 2δ a 0 3 0 O β β > o O β M 0 <o υ <o <0 υ u υ υ 10 <o o <o οι ο

4) β

U Ο < < u υ ® ο ω < w 0 •Η < X ο 3 βίο β u υ υ <0 to o 0 0 u u

u <0 to 01 <0 ra o o 0 <0 01

LI 0 o <0

0 to o o

<0 0 o to <0 β < O β M U a u 3 O φ p o β M U Ł (J (A U β > 0 3 0 to a a 0 0 W 0

U β 10 C C 0

ΟΧ00 u ω u 0 0 V 0 O V w <

<0 u o in m

180 765 cn Di Di m

u u

Dl IB u D> cn D> <3 10 □1 «3 a Dl o Ol <ΰ u

Dl «3 Dl

U 3 Ol Dl O U JJ u u xl U jJ XI D υ u u

Di i8 U Dl xi XI x> XI Dl Dl 13 <3

U υ <3 Dl XI <3 15 <3 U XI <3 cO <8 <3 <3

U W O Dl x> Dl <8 U Dl Dl <8 Dl

U U U Dl x> Dl

Dl 13

Dl M <0 «3 <8 £

<6

U

O O 0 O U

Cn

U D>

<0 σ> io tu c o u

tu > □ 41

Dl <3 U

XI i3 υ u υ

Di u u υ (3 υ Dl

U <8 U U Di

Cn

OJ υ o υ <11 III Ol «1 <3 O

U O XI rt υ

nj <0 3 nj x> u «1 «1 <3 <3 <3 13 x> XI x> Di <8 <3 13 U

Dl U Di Dl <3 U <3

x) IB D> Ol Dl x> U Dl XI Dl <0 (3 fl U υ u x> u υ w <3 υ υ u w u u <3 u u υ & υ o u <3 υ u u υ u Dl Cn <3 <3 XI υ u u <3 XI υ cn Dl XI U Dl

O

D <3 U «3 Dl u 13

XI U U W 13 U x) U

VI a o X ω v

υ u X) Dl

U U XI & Dl υ u <8

O 31 <?

ui ui o n in oo 'tm uicn

O Ό Ul

O 3

O 3 4) 0 5 <U >4 5 V 0 *3 u o o s o E0 «3 O c 0 rt 0 0 ίο 0 EU Eh 0

U >

<3

5 4) J 0) s

o o 0 o e0 ίO <3 cn

O □

O ο 0 < 0 <3 u o o u u < o o 0 «3 O Dl (8 O XI u

U

D <3 O O

U XI U xl □ cn D> cn <3 <3 u u Dl <5 D> cn D> <0 u D υ

u w Cn cn <3 (3 Ol <0 18 Dl cn DI <0 Dl xl U U <8 Cn <3 10 Dl <8

O <0 O U U

Dl to o u <0 Dl x> υ

XI XI XI

D

XI Dl

U <0 <0 <0 Ol <3 XI cn XI U

IB Dl Ol oi IB <8 LI

Dl 10 u w

ΙDl ot o Ul CU >

•3

U CU ο Ul a <o

Dl

U3 o σι Ul o o KO

KO

E2 E0 E0 E0 0 υ *3 0 0 < 0 0 0 0 Ευ Ευ υ «3 0

O < 0 0 0 < 0 0 0 0 0 0 0 0

ΟΙ 0 <<

•10 > cn >1

3 41 < 0 E0 0 0 E* 0 w

o > 5 0*

O

0 EO 0 0 < 0 O o c

O c rH o a in

U x3 □ 4)

ΙΟ w

0 Ευ o Ευ EEυ e c o Ευ Ευ 0 o

Ω Φ

O o Lu o £ 3 4> J 4) £ a. & Η

Ο EEυ υ E< 0 Ευ υ <o > «

U 0 0 ίο 0 co

Ul

KO c

<8 E ΙΟ Ό

O Cu 01 < Ευ

Dl M -3 <0

Ul a> V) (8

Ι41 £ & C cn

E5

3 41 0 5 41

Ul Φ W Ul σι Μ cn «3

O u CU 3 41 0 5 υ c cn

0 «3 0 Ευ υ o o Ευ EEυ < u 0 o o Ευ o < o

KO

180 765 c <n

OJ £ 3 41 £ 3

Ul

X 4) o> o «1 X 3 4) £ Ul

Ευ U

0 U CU 41 o 0 u u u u (Λ X 5 41 U) Ul 41 ca eD> 0

Ui X u 4> CA Ul £ EC

C W X 3 O £ 3 4)

X u u Ευ u Cl o o u Cu 01 u EO o Ευ U

ΙΛ

X

Ul X 41 £ CU

X υ ΕΕX 0

1Λ Cl <N

V0

O Ul CU c rM 0 5 41 £ 3 CA X O Ul tu O

01 w

Ul £ E& <A X Ui 4) CA

EO U 41 W U 41 CA 4) w

£ <0

X

3 4) £ Ui υ 0 X υ u

Ευ υ υ Ε0 0 x u X 0 X u o o X u Ευ u EEΕ0 0 υ u υ υ υ χ 0 ο χ Ευ u υ

Dl 0 Ui 0 X X 01 U c X Ui Φ CA 0 Ui

0 Ια, οι

Λ CU 3 4)

01 u co m <N u X u

U u X 0 0 Ευ U

U Ευ

O E0 in UJ

41

Φ £ O Ut CU W

X

U U U U X U

CU c ο 10 a > o U a.

O M Cu 5 41 J Ul ία, o Ul a. 3 4) £ O Ul a. 4> £ CU 5 4)

Ui

X Εο Μ CU ο Μ tu w

O Ui

CU M 4) CA 0 >4 <u w u u u u o u dl υ 0 Ευ Ευ u υ u χ

U ευ 0 υ χ

E0 X U X O 0 ευ x

U Ευ u EX υ u u

Cl u Ευ

UJ ua υ Ut 4) CA 5 41 £ C Μ ί o o i 0 o X u Ευ E0 Ευ

Ευ 0

Cl

ΕΟ ευ u 4) CA m •H X Ui x u u u Ευ X U u u

Cl u EX U X u υ χ 0 X 0 0 0 Ευ U

Cl

EU Ευ 0 x u < Ευ Ευ ci ci c

£ 3 4) £ O Ui CU Ul 41 W Ui £ EO Ul tU Ul

E* o o u 0 0

X υ u Ευ υ υ

X u X u

Ui

O Ul CU <0

X Ul 41 CA O Ui CU u u u 0 X u υ X υ Ε0 u Cl

Dl

O Dl <8 fO t0 0

Cl o c>

δ

Ul o cu

Ol io <8 (0 u OI Ol

Dl Dl Dl (0 O U

Ευ u u u X u u u 0 υ c> u a u Μ X śg Ui U (N σι <0 u <0 Ol «3 10 <0

Dl 18 υ

X υ x E0 EX υ ευ EO

X U ο Ευ

Ευ u u E0

X O X O X o 0 o X o

X o o o u 0 X u EX 0 υ u 0 Ευ χ υ χ υ

UJ

0 Ευ U U 0

UJ

U Ευ χ Ευ 0 X u 0 X 0 X υ ΕX υ s υ u u Ευ υ 0 0 ευ υ u u u EX U

Dl fl Dl tO « <0 Dl Dl Dl t0 O Dl nJ fl to to to Li U u υ Li O Di to to <0 <8 01 U U Ol u 01 10 01 Dl Ol Li to to io to 10 Ol Ot to to (0

Ol u o Di t0 01 JJ u 10 to <0 o u o Ol <0 o D υ 10 Li <0 Li υ

Οι ιο u ιο & ιο Li Dl Li Ol o 01 Dl 10 10

Ol Dl <0 U O u o Ifl O <0 υ Li o υ Ol 10 Dl 10 o 01 u υ σ> 10 Ιΰ 01 σι <0 υ <ο <ο U) υ σι <ο <8 18 •8 <0 10 u <0 <0 10 υ υ u u ΙΟ υ υ σι u υ υ υ <ο υ u υ υ υ υ u σι to 01 01 to u

Ol cn to W Ol

W u u u υ υ υ o Ol u υ o u to & 01 <0 U Di Di 10 U O Dl u ο & 18 0> Ci <8 U W <0 U

U 01 <8 U W Ol ο Οι <0 οι <0 υ οι η u ιο <0 <6 U σι <ο Οι

Li Ο σ> <ο υ <ο ο σι <ο σ> σι υ υ 10 in u 0> u u u σι <0 u o o <8 o u O Ol 01 i8 <8 <0 10 u <0 Li Ol <0 10 u

Ol (0 <0 u 10 Li 01 a <8 U 10 10 D> <0 Ol Ol <0 O Ol (0 u 10 υ <0 u Li U Ol <0 Cl u ο u ο 01 01 18 U

10 01

U Ol Ol

Dl <0 <0 Dl 01 10 u Dl JJ Dl O <0 01 u υ o>

u Dl

Ol <0 <0 <8 te io u Dl y Dl Dl 01 Dł υ Cl Ol to υ en 18 01 Ol t0 18 <0 <0

Li U Li U 4J <0 Ci Dl Ol Ol to u Dl υ

u to 10 to u u <0 u u Ifl Ol

Ol

Ol u a O) to u Di to to to <0 to u Li (0 O Ol to to «J

UJ

O Dl u u co u u <8 18 U <8 O <8 tO « tfl 0 <6 U d

Ol Li Cl

O 01 <8 10 <0 <6 Ol Ol 10 u U) ϋ Ol XJ cn Ol co

180 765

200

---66.3 —55.4

---36.5 •----31.1

---21.5 __

FIG. I 5

180 765 ο

ο < ο

οι

V) £·* ·&8 c ο Μ

V 01 9 V

V u

Ο § ϋ δ δ δ 8 ο <

3δ

« Ο -Η C4 X h

Ο < 8 υ w Η αο Μ < S8

ki ϋ

C

Φ J η

υ

J Ο 38 J υ

Φ u □ 41

O

4> 0} h 4) oi ki V 01 o

Eo < u C5 o

k U £ U E« <

tn « M O <3

Φ U h

EO h

CJ u u u u ο δ υ υ

ο δ υ υ u υ ο Μ α a υ η <

ϋ ο

<υ οι ο υ υ υ υ <

o 3 »—I O «5 u u

Ο o o P

o ΓΊ σι >

< <D

WED e o Lu o

in

180 765

Ο ο ΓΊ

Ο ο 8 ο σ> ο <-ι Ο C

Ο Μ « W c C5 <ϋ ϋ) 9 Φ

C οι < cn u ο

Μ

X ο Μ & Μ ϋ ο < ο ο υ κ < υ ο ο ο f->

> ο

Μ η

X ο Μ 0« β

Ο C0

X Μ X €*» Η

Η Μ V « Ο ki

Ο α 4) ο C0

Ο σ\ υ ο Ρ υ υ << υ υ δ υ δ ο ο

180 765 gagtccttggcccacctctctcccacccgactctgccgaaagaagcacagaagctcaagccgcctccatggccccaggaaagattcaggggagaggcccc

CM «'e□Ιο sa a>!fmi o <0l< —<!U <ie -1'0

OiH >'O «|<

□ι A ωΐεjIu □;e<v!eO|O xj}O OlltΣ!< ΦιΟ -H|U <lo 10'0 r-i|o <!O 3 0 <ul^> J|U 3iU ulu 3IO < o Mi fi jsjo 3'0

JiU 38 e»o u! o <V|EXi<

O σ> ιο u u 01 01 •Ul u u u m u (0 Ol Ό

0> Ό u u (0 u u o Ό 01 01 Ol (0 u Ό

Ό

O m co o

O IT

O 10 < N= e

Ll.

180 765 o

Ul ο u CU □ 0) J φ o U CU M o w o ο σι u o u < u u Eu E< u o u u υ Λ u u υ u u u u u u Ευ u φ ω 3 Φ •J C <Λ υ Ευ cno u ο ο u cu w u ρ υ

Φ > 0 Ρ α. ο ω ο Ρ α<

υ

-< υ

CU u U 0 Φ EΣ < u υ χ υ Ε- < ρ υ cu υ ο>υ Ul <4

α. υ Φ ΕCU 3 Φ U ο m

χ 3 Φ U C υ Ευ υ υ υ cn Φ U u <0 υ

X) φ

φ φ u θ' φ υ φ

u u φ φ u 4J

Φ

U Cn φ σι ο> φ φ φ φ φ σι φ σ> φ σ> Οι u φ υ cn φ u φ u φ φ cn cn cn φ φ οι cn cn cn u u υ υ cn cn φ φ φ φ 4-1 U u Φ υ u u u cn u

φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ Φ φ Φ φ φ Φ φ Φ φ Φ Φ Φ Φ φ Φ Φ Φ φ φ Φ φ φ Φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ Φ Φ Φ φ φ φ φ XI U Φ U u Φ Φ Φ Φ O

XI Φ Φ Φ

Φ

0> Ol U

XI XI

Φ υ

cn 0>

XI u

φ o υ cn φ u cn φ u cn φ

CD Γ*· o u.

Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ Φ o

in

180 765

9 1 S J 0 Λ V d Ί Ud Id 1 d Η Λ 3 Id 9 O S Ί U S Η ΊΛΗ S O Η Ί Ί X S Ί Λ Η Ί O O V d d V d S ΐ ΕΊΠΜ

LU ω w

WKTQMEETKAQDILGAVTLLLEGVMAARGQLGPTCLSSLLGQLSGQVRLL WK T Q T E Q S K A Q D 1 L G A V S L L L E G V M A A R G Q L EPS C L S S L L G Q L S G 0 V R L L

LGALQSLLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIFLSFQHLLRGKDFWIVGDKLHCL LGALOGLLGTOLPL QGRT T A HK DP N A L F L S L Q 0 ί L R GK D F Wl VGD E L_ Q C H

m m

E W N S W E W N S W

-J o

1 P E Q D T R T 1 P E Q D T R T

a: S

z z a-a.

CD tn

N L Q V P N L Q V P

E P K S

S W S A S WS A

» >-

G 1 Q S Q D G 1 Q S Q 0

< «

! < < i

> σ

S E S E

< u

3 3

-J o.

I 5

>- CD

NOS NOS

m in

CD tn tn

co « a Lu hML3 250 STHLAHPCGPAPPPAS

180 765

m-ML i iŚ~p]V A|P A C O P R L L N K L LR DS H[lJL H S R L S O C P D V]DlP L SjjJP V L L P A V D F S L G E p-ML 1 S P A P P A C D P R L L NK L L R O S Η V L h[g]r L S O C P l)fl N P L S ϊ P V L L P A V D fQ^l G E h-ML i [lJLLL2JLLIJWvkfs]!LLldL·lLJLJlJLLJLŁILJJL·^QJLBE0”

1«. co	i	3: i<C
—i	u.
UD	UD	UD
CU	je	CO
	o	UD
«c	h	i—.
	U-	H-
ee	«	ec
	-<	<<
i—	UO	CD
		«c

US		US
Ζ&2&Χ
L E Ti	L E T	UJ
UD	UD	UD
CO	CO	CO
		(fe

cu	a·	a.
IF	χΓ	UJ
2	2	2
t—	H·
	2
	ŁU	D*
0	ł	•J
	vo	wl
k°
co	c/η	OC
co	co
CU	o.	O-
	>	>
<c	·<
u-	c-m
¢-	««	»»·
O.	a.	CU
	]*·	CU
		«:
	OC	cc
C£		DC
>*	«c	>
UJ	UJ	UJ

Ul	Ul	Ul
	M

CD

O o Lu j -j —j

S S S s s

E ό. .έ E o. x

-1 _i

S S o. jz

ł--	UJ	LD
UJ	UJ	UJ
CS	0	a

as	0	0
Q_	u-	co
SC	s	2I
O-	aJ
?*!	s	z
B	<c <<	i
>-	u.
		«J
	i	a.
<	co	V3
a.	a.	d i\|T
X	u-
	»—*	a.

co	UH	co
a.	a.	cu
Q	0	a
CU	CU	CU
u-		—i
_J	—j	«J
CU	CU	CU
2I	0	12
-J	>□
0	0	O
eu	D*·	>-
0		fKte
0	Cl	01
	«	c<
	u	-J
Σ έ	2	s
O.	£

180 765

V) w < ο Ο Μ m cu <η

U C ο Μ Φ W 3 Φ J σ> ρ ο u χ □ φ j <0 > η ο ·Η Μ χ

Μ

V «

ο Μ CU « > υ <0 ο Μ & ο Μ CU <0 υ ο Ευ υ Ευ ο ο υ υ u ο

Φ ΕJ U & U η <

r-4 ><

Ο Ο

U

Φ Ε-> 4 U ο ο» η ο

<Ν < Ο CJ α

Ο U.

180 765 ο ο CM

Φ W 3 Φ a ο ρ α<

ν>

CQ Ο 0J Ó U.

0 ρ ο Φ ΕX <

Ο 01 ο ΓΜ CM

CM (Λ

X υ u < υ

Ρ U α· υ ρ

Ρ φ 0 Ρ X ΕΚ

C u φ j □ φ φ

< en Ρ < φ £ & <0 < υ υ Ευ υ υ ο Ε0

0 Ευ U υ ο < υ υ υ υ < υ υ ο ιβ

ΓΜ

Ρ φ 0 Ρ φ

α. ο Ρ α< ο ρ Ł φ £ Ευ υ υ Ευ U η < ο ρ ο, <ο <

< 0 < U υ Ευ Ο ο 00 ο 01 υ u υ <

υ Ευ

180 765 ί-

ο ΓΝ

Φ jC a Ο Μ a Μ V w Μ Λ β Μ Φ W Μ Φ W 0 Μ a « > η <0 < 0 u α ο Μ & <3

Ο ΓΊ <

CJ

G

Ο Lu u 0 £

s δ □ ο ο u ο < < w 0 σ β

180 765 ο ο (Ν m α^» 0J ο ο ΗΟ ιη ο 03

180 765


SPAPPACDPRLL NKL L RDSHVLHGRLSQCPD 1 N P L S Τ Ρ V L L P A V D F T L G E S P A Ρ P A CD P R L l N K L L R 0 S Η VI H G RL S QC P D 1 N P L S Τ Ρ V L L P A V DF T L GE		wktqteqtkaqdvlgattllleavmtargqvgppclssllvqlsgqvrl l WKTQTEQTKAQDVLGATTLL LEAVMTARGQVGPPCL5SLLVQLSGQVRL L		LGALQDLLGMQLPPQGRTTAHKDPSAIFLNFQQLLRGKVRFLLLVVGPSL L GALOP L L GM - - · - Q G R Τ Τ A Η K D P S A IFLNFQQLLRGKVRFLLLVVGPSL	CAKRAPPA 1 A V P S ST S P FHT L NK L PNRT S GL L ET NS S 1 S A R Τ T G S G F L K R CAKRAPPA 1 A V P S ST S PF HT L NKL PNRT SGL L ETNS S ISARTTGSGFLKR
^W ί In	o_o		151 147

LQAFRAKIPGLLNQTSRSLOQIPGHQNGTHGPLSGIHGLFPGPQPGALGA L 0 A F R A K > P GL L N 0T S RSŁDOIPGHONGTHGPLSGIHGLFPGPOPGALGA		PDIPPATSGMGSRPTYLQPGESPSPAHPSPGRYTLFSPSPTSPSPTVQLQ PDIPPATSGMGSRPTYLQPGESPSPAHPSPGRYTLFSPSPTSPSPTVQLQ
pML 201 pML2 197		pML 251 pML2 247

OJ OJ o o u.

tu UJ a w z o i

Q<

pML2 297 P L L P D P S A ITPNSTSPLLFAAHPHFQNISQEE

180 765

StUl(366)

Nhel(387)

Donor rozszczepienia

Xbal(4B7)

ΜΙυΙ(6ΐη Sstl(785)

PVU 11(6065)

Mstl(4774)

Sspl(4W2)

Sstl(4)

Pvull(43)

Akceptor rozszczepienia

Clal(!3i9)

Ssp 1(3756)

Pvull(3175)

Pstl(1717) BamHI(i773) Pvull(1883)

Sstl(1924)

StUl(3005) Xhol(3034) N0tl(3039) Pacl(3047)

ASCl(305S)

Nael(3445)

Narl(3246)

Pstl(3072)

SV40 PotyA

SV40Ori

Sal1(2427) Pstl(2433) Hindlil(2439) Clal(2591)

PVUII(2682)

FIG.23

180 765

Stul (366)

Nhel(387)

Donor rozszczepienia

Pvull(5508)

MStl(4237)

Sstl(4)

Pvull(43)

Akceptor rozszczepienia

Clal(1319)

SV40 PoiyA

Sv400ri

Nael(2088)

StU 1(2448) Xhol(2477) Notl(2482) PaCl(2490) ASCl(2498)

PStl(2515) Pvull(2018) Narl(2689)

Xbal(487)

Mlul(617)

Sstl(785)

TPO 153

Sspl(3635)

Aatll(35i9)

Sspl(3199)

Pstl(1717) BamHld773)

Sal 1(1070) pstl(1876) Hlndlll(i882)

Clal(2034)

Kpnl(2Wi) Pvull(2125)

FIG.24

180 765

ΜΗΙ / Cu mm Płytki (Thsn / Cu mm)

Dni po obróbce

FIG.25A

Dni po obróbce

F1G.25B

180 765

Thsn Z Cu mm Thsn / Cu mm

4'

Bufor

TPO-153

Dni po obróbce

FIG.25C

Dni po obróbce

FIG.26A

180 765

Dni po obróbce

FIG.26C

180 765

5000 Ί Płytki

Thsn ! Cu mm

Dni po obróbce

FK3.27A

Dni po obróbce

FIG_e27B

180 765

o+ o

Dni po obróbce

6000 η

5000*

4000* c u .C

3000*

2000*

Met 153 E-Coii

332 z 293

MeMess 155 E-Coli

1000 I^-1 ......... ..............

.0001 .001 .01

100

Dawka (gg/>dzień)

FIG.28

180 765

6000 η

£ 5000E :

□ :

O 4000 *e :

ω .

13ooo;

s 2000+>

rM

A.

1000--Φ— Bufor PBS

TPO153

-I-----------------------^---------1-------i--------!--------i--------1-----------------ϊ---------1

2 3 4 5 67

Dni po obróbce

FIG.29

180 765

CHO transfekowany

Biotynylowany

4G10

S treptawidyna

FIG.30A

Wlywoływanie TBM

Odczyt przy 450/600 nm

180 765

MPL/Rse.gD

FIG.30B

180 765

5x1 komórek MPL/Rse.g/studzienkę na płytkach do hodowli z 96 studzienkami (płaskie dno) stymulowanie w/ligandu x 30 minut stymulowanie można wykonać w 50 lub 100

Ψ

Rozpuszczanie w:

150 mM Naci

0,5% Triton Χ-100 rnM HEPES, PH 7,5

N^yty (inhibitor fosfatazy)

Leupeptyna, Aprotynina i aebsf (inhibitory proteazy

Przenieść 85 μΙ lizato komórek do studzienki ELISA pokrytej wychwytującym przeciwciałem 5B6 (anty-gD peptyd mAb) inkubować w wytrząsarce x 2 godziny

I przemyć płytkę i dodać biotynylowany 4G10

400 pg/ml, 100 μΙ/studzienkę inkubować w wytrząsarce x 2 godziny

Przemyć płytkę i dodać streptawidynę zymed/HRP 1:10 K, 100 μΙ/studzienkę

l.

Inkubować w wytrząsarce x 30 minut

Przemyć płytkę i dodać substrat

Kierkgaard & perryTMB ΐθθμΙ/studzienke wywoływać x 10 minut

Przerwać 1M ypcf i odczytać przy 450/650 nm

Fig. 31

180 765

OT □ ra ot ro ra n u ra ot

E ra m ra

E ra \o

U ra ot kO co ot w

E ra ra ta ra E to £ ra ra φ ra E

L)

CD ra U u OT ra > E

CE > Z o ra -u υ OT OT Φ Oh

ra φ OT

z ra

U-A OT

I-I ι-t cd > Z ra o ra 4-> t> u OT OT E Φ Ό XI

CL OT

O. C

OT C

M I-I

o. ra ra ot < CM ΓΟ o Lu

180 765 co c co

CO co u 05 nlaIV scrFI sfaNI mval ppulOI ecoRII nsil/avalll

0 0 0

CO

Π5 ω co co co co ro co c ca 05

0 0 0 u <0

O) co

Φ 05

0 <

o 05 co co

X> «Μ 05 o 05 co o CO o ca □ as o 0

0

CN

0 0 0

0 0 0 0

Φ 05

CGACTGATTA AAAAAAATAA ATACGTCTCC GGCTCCGGCG GAGCCGGAGA CTCGATAAGG TCTTCATCAC

FIG,32B

CO CX)

180 765

180 765 haelll/pall hael scrFI mval bsrBI

FIG.32D

180 765 ł—I I—I M O (U 3 ot o ra £ £ OT

X) iw 03

0) OT e

IW Z ra IW

OT sacl hgiJII

X O OT tw

OT iw \ CD IW cn <

σ> υ .c 0)

CD IW 00 < CM łW X d-w OT OT £) -O >1 C ε ro .Q JO

ra < h o o

^Ηθί>ΖΗ0υ u ra o ro -w >< Eu > u OT OT 0,0 o ot ε <d tj jo ra o o

M

OT

C iw U υ ra

CM co

Łd GJ ro o

CD Lu

180 765 (0 Μ

Ε ro υ < ο <

αο

(0 Η Η σ c φ r ·η χ: η χ: φ ίχ >—।

Μ φ υ > ω Ε οί > Ο Φ U <η φ Ό

C Ε

κο σι

Lu CM to •

CD Lu

180 765

HH Z ra 4-1 OT

(0 c

>1 o

Ul o OT C t-f (0 (0 OT OT •o n o

□ CL CL tO > (0

M •-4 OT C scrFI mval h4 £X > O «3 O OT (1) Ό

t0

I—ł □ (0 □ E-<<

to > OT OO

CO (0 tO UJO

CD OJ PO

O CD U.

180 765 <Tl l-« 0 (U U OT u E

C > e

styl bsa JI sau3AI fnu4HI —I t-t Q 0) U OT 0 4J <0 JZ C OT u Ή JQ

OT n

CJ εο

Eω

I E nj Ό

O J2

E

C C 3 > α a-i Ό Ό ro OT Ό

EE0 O EECD

O 0 EEU O O ω E-<

o

Eω C9 o Ευ u u < o <D 0! E

< EE-

X CM ro o o b_

180 765 ser FI nci I mspl

I—(

<0 <0 l-ł t-i Cłi ł—ł > CL en <ϋ ίϋ Κι .H OJ X Ό E E U U <n X CD CO C Ό ε co Ό i—i ·— I hh t—i i—i m i-i i-h + E *-· ι-ι — I i-1 m ra e <o □ o ra i ε m c ra ra OratrartnEdiDUU ra en t» >-< co — u x n ra τ> ra o u u £ ra < x — hh Ό - w u u raHMH>HH-Hj2UU 30CCi-i><Zi-(3 H <

raj2Q.Łro4JE5^ <6mEOO-imra-erai-iou c η n ra —ι ο ω

M c < Eh e3u m n Ό ra <υ c >-i < η

E ra —i ra hc

I-I Ui Ert Ό UO i-< u-ι \ X H<

CL.C er i—« u h 0u ra —i c o oo u ra ή o E-<

nc rau u

X ou

CL <Eh co h CJ0

4J ΟΌU co W Ei<

CL UUU m H<

M Eh<

l-ł I—I I-I UU u-1 3 -o OU

O —l C en ra -η m ae->

.c ra ιίEFIG.32I

m e> ε-· < m ro c en u 0 ε -Q u O

r*

CM

180 765

UD σι □ to co

M ra Cu m M I-I Φ ro sz

CO ra

M nj i—i i—i *—i > O c 4-> υ co c

U <ϋ

X TT 3 C <4-1 r-ł M ch-h m ,Q M-C Φ co to Φ

Φ ra E

X «o· <0 3 C «Μ

1—4 i—i

E co XJ

O O c o o CJ

ro

Ll.

180 765

GL ot >

n to ra o.> m m m O O (0 c

I-I M o I-I C -H C cl σ> nj 44 £1 X2

I—< rH Ul

CL U OT O (D KJ

sauJAI mbol/ndell[damdpnl[dam+J dpnlI[dam-]

c OT E-¹M <0El —- m \<

□ ι Φ m o<

U E OT — Φ OEaj ra e i ·-< ot r—E-i

Ό E c (0CL<

— ra e ot<

— to -o X mU i o —— U

E t—i —i co CL ł-t + E —U

Ό OT φ E <ϋ IO — 42 Ό nj Ό E6»-< >-1 C Ό — ro«£

CTh <\-hOĆ ra ro π h *-< t—· —·o

AJ^iOOCCi-iEU UJ d 0.0.3 <

OT E ΌΌ H O ra u

I-I ra

«5 CL

M M φ ł-ł Φ Φ JZ Φ Λ l-H M >1 O jj υ OT C ro

OT •σ

X ΊΤ □ c > x> XI

FIG.32K u o o

M U O

I-H u u h-ł M u U Ό m H < ro -< < E-i OT c u u XI o o

M o < H «w U O

U U O w \ < H Cu w O U C ro O O •h J= o u .C .C U O

O o U O o

ID

180 765

RG.32L scrFi mval ecoRII dsaV

nspHI acil acil foki

1711 GCAAAGCATG CATCTCAATT AGTCAGCAAC CATAGTCCCG CCCCTAACTC CGCCCATCCC GCCCCTAACT CGTTTCGTAC GTAGAGTTAA TCAGTCGTTG GTATCAGGGC GGGGATTGAG GCGGGTAGGG CGGGGATTGA

180 765 ra

OT ra .OT > ra

Φ ra

OT

Φ ra nlalll

	U 0 0 0 0 0 0	< £h 0 0
I-I I-I	11 Eh <	0 0
> O	ra ra < Eh	Eh «£
X U	OT OT 0 0
OT C	Ό X 0 0	< Eh
	0 0	H Eh <
	n n 0 0	□ 0 0
	-H -1 0 0	Ί H 0 0
	OT U 0 0	ra i <
	x ra 0 0	n ra 0 0
	H <	Φ CL Eh <
		Ό \
	0 0	Π n n 0 0
	h $	Ί n E- <
		C n 0 0
	< Eh	E Φ 0 0
	0 0	ra 0 0
	0 0	Μ Μ X 0 0
	M 0 0	1 Hh 0 0
	-4 0 0	ra hh ra En <
	U 0 0	CL C OT 0 0
	ra 0 0	n \ E X 0 0
		X M H
		TT H H -10 0
		□ n Μ M U 0 0
	n 0 0	c σ>ι φ ri ra 0 0
	M < Eh	1 X 1 ID H ra 00
	OT 0 0	OT X -4 CLM 0 0
	X 0 0	C »O < Eh
	M 0 0	E m ra 0 0
	-10 0	H OT 0 0
	OT 0 0	Μ X 0 0
	ra 0 0	Φ 0 0
		ra
	7*4	_df*^
	CD	TT

Cd rO

180 765 a co co σι <W υ OT cnoo to a> co CO

Φ to

E σι φ

OT acil hinPI haelll/pall hhal/cfol mcrl thal

OT

Ou c ra ra φ CO E ra ε ra Φ φ ra ω ra o

O <u O

UJ

CM ra u OT ra co σι ra

OT w

OT

Φ OT

E σι □ u o ra

Φ OT ε υ ra to

Φ ra ra > ra ra ε U| ra o.

s

Φ ra E

Φ ra ε ra

Φ ra E

Ul ra 4J

OT <

•o Φ 4-1 Ui Φ OT C ♦H υ

OT ra > E od O υ φ ra co

OT ra to

Ul

Φ c

Φ ra E co φ ra ε ro

Φ ra a> ra φ

OT

FIG.32N

ΕE-i 0 0 0 < Ε0 ra o σι φ ra E σι

180 765 sau3AI sau96I mbol/ndell[dam-

Z aj u-i m

u a OJ .O > u 3 a e u u < w o Ή ł-l o

U CM CJ id m o

w □ aj

OOJ

Ł H > n ΜM

M

O

U-i as

M □ > C 12 M-l Ώ

o o o o u u

U o o u 0 u (J 0

180 765

OT u (0 hinPI thal fnuDII/mvnI bstUI scfl hinPI

O 0

0 to E

0) (0

0) to E to

0) to kO ΓΠ CM

JZ OT

-Q i-1 to OT ki u to o Ψ4 u

0) (0 Ξ to < 0 0 kD

CM w

Φ tD e

EO 0 tO

OT

0) to Ξ •H

U <0 o 0 o β

U to kD

CM

-H O to <

0 0 0 E0 to (0

U to

OT σι

0) w E m

CM CM

U

CL <0 ·—· OT CL 0) E£ !0 C

O 12

E

0 0 0 H 0 EH

GGAAAGCGAA AGAAGGGAAG GAAAGAGCGG TGCAAGCGGC CGAAAGGGGC AGTTCGAGAT TTAGCCCCCG

FIG.32P

180 765 ω (0 E nlaIV hgiCI

iw >w

0) C αχ:

Φ iw nj -o E U Ό

ra

IW 10 OJ cn ra □

JZ Π3 OT

IW

Hi IW 0) iw ro iw E ro

Ul 75

OJ

O OJ ΓΟ o

180 765 ra ra to co 0 nj to u

Φ ra E ro < 0 hgiAI/aspHI thal bspl286 fnuDII/mvnI maell bsiHKAI o c to co ra u ro ra c 0 0

CD co ra to

CD ra ε ra ra ra σ\ co

0) ro E < ro to u ra co E

U

CO ra to ra u

FIG.32R

Φ CO

E to co (U co

E co

CN to

CD σι

CD

CO

E

Cb c ra ra

CM to to

0 0 0 u ra ro < E0 0 0 0 ro 0 σ' <

w o c ra

CJ ra n

CD CM o CD CN co

CM < U 0 0 0

180 765 rnuuii/mvnl scrFI bstUI ncil bshl236l

O M M M

U C m \ e CU M c ro m •h jz ra χ: -c xz c > ε

M

Cl 0 c >4-1

Μ X CL CL w co OT X C C

C U_i

o u H 0 0 W < h n 0 u h oj U O 0 H 0 U aj JZ U o W (0 0 u Ό Ό U 0 < E-

c E

Φ (0 o β σι

Μ

AJ

υ <α

ιο m OJ

XX co £>

I-I CL C

JZ

Μ I—I >I-I cl ra ro0 ot cl otφ

Ε Λ ΌMU n CL com

OT £1-ł

ΦOT £

(Π

Μ 1-4 I-I C Μ Ό Ε Φ σι φ 0 XX Φ OT

I—I

Ο £ ε

X «5 CO £

ΜΙ-II-I Μ Μ M C CO AJ •H JZ Φ JZ CO Φ

O Cl OJ ddel maell hhal/cfol rig 32S

2951 ATAATAATGG TTTCTTAGAC GTCAGGTGGC ACTTTTCGGG GiAATGTGCG °

TATTATTACC AAAGAATCTG CAGTCCACCG TGAAAAGCCC CTTTACACGC

180 765 bsrBI nlalll acil bsoHI

ro m cn

TACGACTTCT AGTCAACCCA CGTGCTCACC CAATGTAGCT TGACCTAGAG TTGTCGCCAT

FIG,32T

180 765 sau3AI mbol/ndelI(dam-J maell dpnl[dam+) pspl4O6I hgiAI/aspHI σ» □ <D m oj to

E to

CJ

CO

Φ co E co <o to co to

E to co (Π

KD OJ cn u o co c

U no co E

CO <0 <0 O, co co υ (0 <0 U <0 <o co

OJ rtJ < 6-, 0 (U co <u <o E co to U O co ίί

FIG.32U w cn OJ co

Cb c co

0

OJ

CD

180 765 eael cf rl fnu4HI fnu4HI

H <		0 0	i—i
0 0	1	0 0	3 >
< E-	E	0 0	C X2
	t-ι oj	E- <	U-ι X)
E- <	I-I TJ	0 0
0 0	1—1 —	— < E-
< E-	0) I-I	— I <
3 E-	I-I (U I-I	-t- E — E-ι <	ΗH
0 0	i—i E Φ	E ro i 0 0	z
0 0	i-η τ>	ra T5 E E- <	tu
	ro i-i c	•Ό — ro	M-l
I-I 0 0	<—i <	— i—i T5 < El	ω
-10 0	emu	i—ł w — 0 C>
O 0 0	3 O	C C I-I H <
ro 0 0	ro X1	Cb a 3 < E-
E- <	w E	Ό ΌΗ o 0
0 0		(U 0 0
< E->		0 0	M
0 0		I-I 0 0
< E-		1-10 0	hH
< E-		I-I E- <	Φ
		ro	ro
E-* <		-· < E-	E
< E-		C 0 0

o o

(0 ro <Cl u? cn

E ro (0 w ro ro ro tu tu

E (U

E (U ro ro u fU ro < 0 0 <

Cl ro «3 i E ro

0) tu ro <o

E ro ra ro

E ro co m m

FIG.32V

180 765 hinPI mspl hhal/cfol hpall stl scrFI

I—I υ c to

M > M ra 3 w ra 13 o

—ł <31 01 O ii (o

Ul CO I—<

X) σ> □ u jj

o <0 to ra >

MD cn

CL W

E

u a?

u Ε0

O UJ

M σι 3 U

JJ

X U U

jO OT 0 U -Q U O O O E- < U O U U U U δ u i-i E- <

·—· l—< XX i- ho a uu a <u r-< χ: m uu

OT CL Ul E UU

E X MJ > CL OU

U M JQ UU

Φ \ <EM 0 U C 3 00

OT E- < σ'u 0 <

E-I s e1 U

HG.32W

U

180 765 asul piel nlaIV hinfl bsrl haelll/pall mnll eamllO5l FIG»32X

3841 ACTGGGGCCA GATGGTAAGC CCTCCCGTAT CGTAGTTATC TACACGACGG GGAGTCAGGC ’ < e< o

Φ OT E ra

E ro ro ot ro

E ro

E— 0 l <

E ro o

<

CD u

o u

o

O o

Φ ro E

co σ» ro

Φ ro E ro i E ro Ό

I-I — i— iw + Ei

Φ EroE •Ό ra Όro mc Ό —Ό m m I—I I—II—I □ O C C3 ra X) — CL CL—i OT E I Ό Ό Φ

E ro TJ x: M —, |M

M EM h £ (V E (ϋO ro Ό ra Όx:

EM C Ό —X

O < X. —> M\ m M M MM o c c>

ra n cl cl4_>

OT E Ό Ό OT

X!

σι 3 Ul msel alwl(dam-] bstYI/xhoII rcal tru9l ahalll/dral mael mboll(dam-) bspHI msel

4021 ATTTAAAAGG ATCTAGGTGA AGATCCTTTT TGATAATCTC ATGACCAAAA TCCCTTAACG TGAGTTTTCG TAAATTTTCC TAGATCCACT TCTAGGAAAA ACTATTAGAG TACTGGTTTT AGGGAATTGC ACTCAAAAGC

180 765

η 3 Φ W	1 Ε Φ Ό <υ Ο C ο XI Ε	η 3 Φ η + Ε Φ •σ C a •σ	Ε Φ Ό te.*» Φ σ ο η Ε 1 Ε Φ η C CU Ό	bstYI/xhoII dpnl[dam+]	sau3Al alwlldam-j dpnll[dam-)	mbol/ndell[dam-] alwl[dam-]	dpnl[dam+) mboll[dam-]	dpnll(dam-) bstYI/xhoII	\G ATCAAAGGAT CTTCTTGAGA TCCTTTTTTT	fC TAGTTTCCTA GAAGAACTCT AGGAAAAAAA
										H
									δ 0 u	Ε0 δ 0

	0 U Ε- 0 U
	II/mvnI		m CM	o Φ M X •3· 3 C	cfol bbvl acil nspBII	TAA TCTGCTGCTT GCAAACAAAA AAACCACCGC TACCAGCGGT GGTT	ATT AGACGACGAA CGTTTGTTTT TTTGGTGGCG ATGGTCGCCA CCAA
Μ	Q		,*4	)-<		0	u
(0	3	U	JZ	Oj		U	0
χ:	C	W	co	C	Φ	0	u
XJ	U-(	Λ X2	Ή JZ	JZ JZ	U 0 Ε0	0 u s

Ο M-l υ Μ \ Cu ι-( C φ •Η JC χ: jz ιΧ) ο υ υ

Μ Μ Μ CO Μ

Χ> Μ Φ Π} Ε ι Ε Φ Ό Μ — —« 3

Μ | r-f ^Μ + Ε — Φ Φ Ε φ ι Ό Φ Ό Ε Η C Ό — φ < \ — w Ό ΠΗΗΗ·-3 Ο C C μ

Φ Ώ Q> Ο, 5μ

W Ε Ό Ό ή ι—ιμ

Φ Ο< Φ WCU

Ε JC

211 CCGGATCAAG AGCTACCAAC TCTTTTTCCG AAGGTAACTG GCTTCAGCAG AGCGCAGATA CCAAATACTG GGCCTAGTTC TCGATGGTTG AGAAAAAGGC TTCCATTGAC CGAAGTCGTC TCGCGTCTAT GGTTTATGAC

180 765 rmal haelll/pall mael bsll hael scfl acil mnll

4281 TCCTTCTAGT GTAGCCGTAG TTAGGCCACC ACTTCAAGAA CTCTGTAGCA CCGCCTACAT ACCTCGCTCT AGGAAGATCA CATCGGCATC AATCCGGTGG TGAAGTTCTT GAGACATCGT GGCGGATGTA TGGAGCGAGA

OT

Ui U OT a ot ot a

E Λ

OJ OT ot υ

OT (0 iw

OT

Φ OT E

OT OT co ot σ'

OT

Ul υ

E aj

OT o ot

OT

OT 3

CU c ω ot

0 0 u a OT

E (0 (0

0 0 0

U OT

OT

Φ OT

E <

0

0 u u 0 0

GCTGGATGTG GCTTGACTCT ATGGATGTCG CACTCGTAAC TCTTTCGCGG TGCGAAGGGC TTCCCTCTTT

FIG.32Z- i

180 765 scrFI mval ecoRII mval

I—I s O U Φ > Z fD X co co Ό X t-t — 0 U

000

ra

Μ M Φ X ra

X 3 c

X

I-<

OT X

X M □ ra ra x

X < u u u

o. ra ot cl

OT

U ra u u 0 0 ra

OT < u u 0 u ra

U rt

U	+ 00
u Eh 0	E O < Eh Ό Eh < I-· — 0 0
U £łi	> Z M 0 0
U 1	ro x > h <
0 U	OT OT CL 0 0
U OT	Ό X ro 0 0
U	0 0

CM I iM CM ΓΟ o

Lł_ m 04

X co X ra

C —4 U ra

4701 CAGGGGGGCG GAGCCTATGG AAAAACGCCA GCAACGCGGC GTCCCCCCGC CTCGGATACC TTTTTGCGGT CGTTGCGCCG

180 765 ra

UH X l-H CL CLrH cn w ui cera

1-4 φ n ra φ x: ra x:

haelll/pall scrFI mval bsll s > o ra o cn φ u

Ό »-< t—। —> φ z i—। ra 4-> >-C en CL X3 ro >

ra c

ω 0

m

Li en

u ra

H

E0

					0	0
					E->
					0	0
			^4			<
			c		0	0
			£	44	0	0
				•^4	0	0
				u	0	0
				ra	0	0
					<	E-
					<	El
					<	Eh
					0	0
					0	0
					0	0
					<	Eh
						<
		f-4			<	Eh
		0			<	Eh
		U-4		H4	0	0
		u		CM
^4				en	0	0
Oi	1-4	^~4		UJ	0	0
c	UH	ra		0.0	0
«^4	Φ	x:		en	0	0
	ra	X			0	0
	JZ		44			Eh
		4	44	44	0	0
		cx	o	Ul
		ra	X)	ra	<
		en	E	φ	0	0

o ra x

C <L4 roj

FIG.32Z

180 765 thal fnuDII/mvnl bstUI bshl236l

180 765

O ra

w m kl co ιο

N OJ ro •

CD

Ll.

cl OT >

u U 0 H < w U 0 ι-ι m 0 0 cl ra 0 0 ω CL 0 0 ε x: 0 0 c OT i-i ra < H στ i-i \ □ (D m o < H ki OT CDO H <

k E <n h r- h < ra C CLsC EE OT < E-<·-<

x ra 0 0τη

0r-S < E-UD £2 ..

£ tnσ' <c

UDΦ

180 765

Hlnfl

Μ o

180 765

Syntetyczny DNA

Η I

Xbal Mlui

Iphl

Xbal Sphl

Wektor izolatu

Mluf

Sphl

Izolat1072bp

Fragment

Xbal

MM

Ligowanie

FIG.34

180 765

Syntetyczny DNA

B=l

Xbal Bgll

ihl

Xbal Sphl Wektor izolatu

Xbal

π....... -- ¹ 1

Xbal Bgll

Bgll

Sphl

IzolatlOWbP Fragment

FIG.35

180 765

Syntetyczny DNA h Xbal Bgll

Xbal Sphl

Wektor izolatu

Bgll

Xbal

Xbal ’1 Ligowanie

Bgll

Sphl , _rIzolat1064 bp Fragment

FIG.36

180 765

Syntetyczny DNA

I — -....... Ί

Hgal Hindlll ndlll

EcoRI

Hindlll Wektor izolatu

EcoRI

Hgal

Izolatg46 bp

V Fragment

EcoRI

EcoRI Hgal f—H

Hgal Hindlll

TPO

FIG.37

180 765

Syntetyczny DNA

Hinfl

TPO

Xbal Sphl

Wektor izolatu

Polimeraza DNA I (Klenowa)

Xbal

Hinfl

Sphl

Izolat890 bp ’' Fragment hl

Ligowanie

HG.38

180 765

MP210Bank

MP210-1

MP210-T8

MP210-21

MP210-24

MP210-25

Met Ser Pro Ala Pro Pro Ala

ATG TCN CCN GCN CCN CCN GCN ATG TCT CCA GCG CCG CCA GCG ATG TCG CCT GCT CCA CCT GCT ATG TCG CCA GCG CCA CCA GCC ATG TCC CCA GCC CCA CCC GCA ATG TCG CCA GCG CCG CCA GCG

FIG.39

180 765

Syntetyczny DNA

Η·· =1

Xbal Bgll

Xbal Sohl

Wektor iźolatu

Ligowanie

FIG.40

180 765

Syntetyczny DNA b—-— Xba! Bgll

hi

FIG_e41

180 765

ι I

Xbal Apai

FIG.42

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zasadniczo homogeniczny polipeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmującej:

(a) fragment polipeptydowy o wzorze X-hTPO(7-151)-Y gdzie hTPO(7-151) oznacza sekwencję aminokwasów ludzkiej TPO (hML) od Cys7 do Cysl51 włącznie;

X oznacza grupy aminową Cys7 lub jedną albo więcej aminokońcowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmującej

M,

MA,

MPA,

MPPA, (SEQEDNO: 117)

MAPPA, (SEQIDNO: 118)

MPAPPA, (SEQ ID NO: 119)

MSPAPPA, (SEQ ID NO: 120)

A,

PA,

PPA,

APPA, (SEQ ID NO: 121)

PAPPA, (SEQ ID NO: 122)

SPAPPA, (SEQ ID NO: 123)

Y oznacza grupy karboksylową Cysl51 lub jedną albo więcej karboksy-końcowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmującej:

V,

VR,

VRR,

VRRA, (SEQIDNO: 124)

VRRAP, (SEQ ID NO: 125)

VRRAPP, (SEQ ID NO: 126)

VRRAPPT, (SEQ ID NO: 127)

VRRAPPTT, (SEQ ID NO: 128)

VRRAPPTTA, (SEQ ID NO: 129)

VRRAPPTTAV, (SEQ ID NO: 130)

VRRAPPTTAVP, (SEQ ID NO: 131)

VRRAPPTTAVPS, (SEQ ID NO: 132)

VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO: 133)

VRRAPPTTAVPSRT, (SEQ ID NO: 134)

VRRAPPTTAVPSRTS, (SEQ ID NO: 135)

VRRAPPTTAVPSRTSL, (SEQ ID NO: 136)

VRRAPPTTAVPSRTSLV, (SEQ ID NO: 137)

VRRAPPTTAVPSRTSLVL, (SEQ ID NO: 138)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLT, (SEQ ID NO: 139)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTL, (SEQ ID NO: 140)

180 765

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN, (SEQ ID NO: 141) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE, (SEQ ID NO: 142) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL, (SEQ ID NO: 143) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP, (SEQ ID NO: 144), a amino-końcowe przedłużenia łańcucha aminokwasów obejmują jedną lub więcej reszt 176-332 ludzkiego ML, przedstawionych na fig. 1 (SEQ ID NO:1) i ich formy polioksyalkilenowane;

(b) chimeryczny polipeptyd zawierający ligand mlp, który został przyłączony do polipeptydu heterologicznego, przy czym sekwencja aminokwasów polipeptydu zawiera reszty aminokwasów od 1 do X według fig. 1 (SEQ ID NO: 1), gdzie X wybrany jest z grupy obejmującej reszty 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 211, 229, 245 i 332; i (c) warianty tych polipeptydów; przy czym polipeptyd ten korzystnie; stymuluje wbudowywanie znaczonych nukleotydów (3H-tymidyny) do DNA IL-3-zależnych komórek Ba/F3 transfekowanych ludzkim mpl P; lub stymuluje wbudowywanie 35S do krążących płytek w teście nawrotu płytek.
2. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jego fragment został wybrany z grupy obejmującej TPO(1-153) i TPO(l-245).
3. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja aminokwasów fragmentu polipeptydu obejmuje: SPAPPACDLRVLSKLLRDSHVL, (SEQ ID NO: 110) HSRLSQCPEVHPLPTPVLLPAVDF, (SEQ ID NO: 111) SLGEWKTOMEETKAQDILGAVTL, (SEQ ID NO: 112) LLEGVMAARGQLGPTCLSSLL, (SEQ ID NO: 113) GQLSGQVRLLLGALQS, (SEQ ID NO: 114) LLGTQLPPQGRTTAHKDPNAIF, (SEQ ID NO: 115) LSFQHLLRGKVRFLMLVGGSTLCVR, (SEQ ID NO: 116) oraz ich kombinacje
4. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że stanowi polipeptyd pozbawiony reszt oligosacharydów.
5. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej hML (SEQ ID NO:6), hML153 (SEQ ID NO:1 reszty 1-153), hML (R153A, R154A) (SEQ ID NO: 1 R153A, R154A), hML2 (SEQ ID NO:8), hML3 (SEQ ID NO:9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO: 15), mML3 (SEQ ID NO: 16), pML (SEQ ID NO: 18) i pML2 (SEQ ID NO:21).
6. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada 80% identyczności sekwencji z pohpeptydem, którego sekwencja aminokwasów zawiera reszty aminokwasów od 1 do X według fig. 1 (SEQ ID NO:1), gdzie X wybrany jest z grupy obejmującej reszty 153, 155,164, 174, 191, 205, 207,217, 229, 245 i 332.
7. Polipeptyd według zastrz. 6, znamienny tym, że X jest 153.
8. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że w tym chimerycznym polipeptydzie heterologiczny polipeptyd stanowi polipeptyd immunoglobuliny.
9. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że w tym chimerycznym polipeptydzie heterologiczny polipeptyd stanowi polipeptyd interleukmy.
10. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera N-końcowe reszty od 1 do około 153-157 hML podstawionego resztą lub resztami ludzkiego EPO dodanymi lub podstawionymi w N-końcowych resztach hML w pozycjach wybranych z grupy zawierającej pozycje 1,3-6,9,13-15,17-28,30,32-34,36-41,43-50,53-59,61-68,71,73,75-80,82-88,90-96,98-99, 102-103, 105-107, 110, 112-113, 115-119, 121-130, 132-133, 135, 137-140, 143-150 oraz 152-156, zgodnie z zestawieniem pokazanym na fig. 10.
11. Polipeptyd według zastrz. 1, znamienny tym, że jest kodowany przez kwas nukleinowy, którego sekwencja posiada co najmniej 70% zgodności z sekwencją kwasu nukleinowego pokazaną na fig. 1 (SEQ ID NO:2) lub sekwencją do niej komplementarną.

180 765
12. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca polipeptyd hgandu mpl wybrany z grupy obejmującej:

(a) fragment polipeptydowy o wzorze

X-hTPO(7-151)-y gdzie hTPO(7-151) oznacza sekwencję aminokwasów ludzkiej TPO (hML) od Cys7 do Cysl51 włącznie;

X oznacza grupy aminową Cys7 lub jedną albo więcej ammokońcowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmującej M, MA, MPA, MPPA, (SEQIDNO: 117) MAPPA, (SEQIDNO: 118) MPAPPA, (SEQ ID NO: 119) MSPAPPA, (SEQ ID NO: 120) A, PA, PPA, APPA, (SEQIDNO: 121) PAPPA, (SEQIDNO: 122) SPAPPA, (SEQ ID NO: 123)

Y oznacza grupy karboksylową Cysl51 lub jedną albo więcej karboksy-końcowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmującej: V, VR, VRR,

VRRA, (SEQ ID NO: 124)

VRRAP, (SEQ ID NO: 125)

VRRAPP, (SEQ ID NO: 126)

VRRAPPT, (SEQ ID NO: 127)

VRRAPPTT, (SEQ ID NO: 128)

VRRAPPTTA, (SEQ ID NO: 129)

VRRAPPTTAV, (SEQ ID NO: 130)

VRRAPPTTAVP, (SEQ ID NO: 131)

VRRAPPTTAVPS, (SEQ ID NO: 132)

VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO: 133)

VRRAPPTTAVPSRT, (SEQ ID NO: 134)

VRRAPPTTAVPSRTS, (SEQ ID NO: 135)

VRRAPPTTAVPSRTSL, (SEQ ID NO: 136)

VRRAPPTTAVPSRTSLV, (SEQ ID NO: 137)

VRRAPPTTAVPSRTSLVL, (SEQ ID NO: 138)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLT, (SEQ ID NO: 139)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTL, (SEQ ID NO: 140)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN, (SEQ ID NO: 141)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE, (SEQ ID NO: 142)

VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL, (SEQ ID NO: 143) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP, (SEQ ID NO: 144), a amino-końcowe przedłużenia łańcucha aminokwasów obejmująjedną lub więcej reszt 176-332 ludzkiego ML, przedstawionych na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) i ich formy pohoksyalkilenowane;

180 765 (b) chimeryczny pohpeptyd zawierający Ugand mlp, który został przyłączony do pohpeptydu heterologicznego, przy czym sekwencja aminokwasów polipeptydu zawiera reszty aminokwasów od 1 do X według fig. 1 (SEQ ID NO: 1), gdzie X wybranyjest z grupy obejmującej reszty 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 i 332; i (c) warianty tych polipeptydów.
13. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 12, znamienna tym, że koduje pohpeptyd hgandu mpl posiadający przynajmniej 80% identyczności sekwencji z polipeptydem, którego sekwencja aminokwasów zawiera reszty aminokwasów od 1 do X według fig. 1 (SEQ ID NO:1), gdzie X wybranyjest grupy obejmującej reszty 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 i 332.
14. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera otwartą ramkę odczytu sekwencji kwasu nukleinowego pokazanego na fig,. 1 (SEQIDNO:2).
15. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 12, znamienna tym, że koduje polipeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmującej hML (SEQ ID NO:6), hML153 (SEQ ID NO. 1) reszty 1-153), hML (R153A, R154A) (SEQ IDNO:1 R153A, R154A),hML2 (SEQ ID NO.8), hML3 (SEQ ID NO:9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO: 15), mML3 (SEQ ID NO: 16), pML (SEQ ID NO: 18) i pML2 (SEQ ID NO:21),
16. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 12, znamienna tym, że zawiera sekwencję wykazującą przynajmniej 70% zgodności z sekwencją kwasu nukleinowego przedstawioną na fig. 1 (SEQ ID NO 2) lub sekwencją do mej komplementarną.
17. Wektor ekspresyjny zawierający cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującąpohpeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmującej hML (SEQ ID NO:6), hMLl 53 (SEQ ID NO: 1 reszty 1-153), hML (R153A, R154A), (SEQ ID NO:1 R153A, R154A), hML2 (SEQ ID NO:8), hML3 (SEQ ID NO.9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO: 15), mML3 (SEQ ID NO: 16), pML (SEQ ID NO: 18) i pML2 (SEQ ID NO:21), korzystnie połączoną operacyjnie z sekwehcjami kontrolnymi rozpoznawanymi przez komórkę gospodarza transformowaną wektorem. ¹
18 Komórka gospodarza transformowana wektorem zawierającym cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą polipeptyd ligandu mlp wybrany z grupy obejmującej hML (SEQ ID NO:6),hML153 (SEQIDNO:1 reszty 1-153), hML (R153A, R154A), (SEQIDNO.l R153A, R154A), hML2 (SEQ ID NO:8), hML3 (SEQ IDNO:9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO: 15), mML3 (SEQ ID NO: 16), pML (SEQ ID NO: 18) i pML2 ((SEQ ID NO:21), korzystnie połączoną operacyjnie z sekwencjami kontrolnymi rozpoznawanymi przez tą komórkę.
19. Sposób otrzymywania przeciwciał obejmujący immunizację ssaka i odzyskiwanie przeciwciał, znamienny tym, że do immunizacji stosuje się polipeptyd lub jego fragment posiadający 80% identyczności sekwencji z polipeptydem, którego sekwencja aminokwasów zawiera reszty aminokwasów od 1 do X według fig. 1 (SEQ ID NO: 1), gdzie X wybranyjest z grupy obejmującej reszty 153, 155, 164, 174, 191, 205, 207, 217, 229, 245 i 332.
20. Sposób otrzymywania polipeptydu ligandu mpl obejmujący hodowanie komórki gospodarza i odzyskiwanie polipeptydu ligandu mpl, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza transformowaną wektorem zawierającym cząsteczkę kwasu nukeinowego kodującą polipeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmującej hML (SEQ ID NO:6), hMLl53 (SEQ ID NO:1 reszty 1-153), hML (R153A, R154A), (SEQ ID NO:1 R153A, R154A), hML2 (SEQ ID NO-8), hML3 (SEQ ID NO:9), hML4 (SEQ ID NO: 10), mML (SEQ ID NO: 15), mML3 (SEQ ID NO:16), pML (SEQ ID NO:18) i pML2 (SEQ ID NO:21), operacyjnie połączonąz sekwencją kontrolną rozpoznawaną przez tą komórkę, przy czym korzystnie odzyskiwany polipeptyd jest pozbawiony reszt oligosacharydów.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że pohpeptyd ligandu mpl jest odzyskiwany z komórki gospodarza.
22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, ze polipeptyd hgandu mpl jest odzyskiwany z płynu hodowlanego.
23. Sposób biosyntezy ludzkiego polipeptydu hgandu mpl obejmujący· (a) hodowanie komórki gospodarza, (b) odzyskiwanie ludzkiego polipeptydu ligandu mpl z hodowli, i (c) oczysz

180 765 czarne polipeptydu ligandu mpl do zasadniczo homogenicznego, biologicznie czynnego ludzkiego polipeptyd ligandu mpl, znamienny tym, że hoduje się komórkę gospodarza zawierającą cząsteczkę DNA kodującą sekwencję aminokwasową ludzkiego polipeptydu ligandu mpl przedstawioną na fig. 1 (SEQ ID NO:1).
24. Sposób określania obecności genu polipeptydu ligandu mpl w testowanej próbie zawierającej kwas nukleinowy, obejmujący hybrydyzowanie sondy DNA z testowaną próbą kwasu nukleinowego, znamienny tym, że jako sondę DNA stosuje się cząsteczkę DNA wykazującą przynajmniej 80% homologii do sekwencji SEQ ID NO:2 lub jej fragment.
25. Kompozycja zawierająca czynnik aktywny i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienna tym, że jako czynnik aktywny zawiera polipeptyd ligandu mpl wybrany z grupy obejmującej:

(a) fragment pohpeptydowy o wzorze

X-hTPO(7-151)-Y gdzie hTPO(7-151) oznacza sekwencję aminokwasów ludzkiej TPO (hML) od Cys7 do Cysl51 włącznie;

X oznacza grupy aminową Cys7 lub jedną albo więcej aminokońcowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmującej

M,

MA,

MPA,

MPPA, (SEQIDNO: 117)

MAPPA, (SEQIDNO: 118)

MPAPPA, (SEQ ID NO: 119)

MSPAPPA, (SEQ ID NO: 120)

A,

PA,

PPA,

APPA, (SEQIDNO: 121)

PAPPA, (SEQIDNO: 122)

SPAPPA, (SEQ ID NO: 123)

Y oznacza grupy karboksylową Cysl51 lub jedną albo więcej karboksy-końcowych reszt aminokwasów wybranych z grupy obejmującej:

V,

VR,

VRR,

VRRA, (SEQIDNO: 124)

VRRAP, (SEQ ID NO: 125)

VRRAPP, (SEQ ID NO: 126)

VRRAPPT, (SEQ ID NO: 127)

VRRAPPTT, (SEQ ID NO: 128)

VRRAPPTTA, (SEQ ID NO: 129)

VRRAPPTTAV, (SEQ ID NO· 130)

VRRAPPTTAVP, (SEQ ID NO· 131)

VRRAPPTTAVPS, (SEQ ID NO: 132)

VRRAPPTTAVPSR, (SEQ ID NO: 133)

VRRAPPTTAVPSRT, (SEQ ID NO: 134)

VRRAPPTTAVPSRTS, (SEQ ID NO: 135)

VRRAPPTTAVPSRTSL, (SEQ ID NO: 136)

VRRAPPTTAVPSRTSLV, (SEQ ID NO: 137)

VRRAPPTTAVPSRTSLVL, (SEQ ID NO: 138)

180 765

VRRAPPTTAVPSRTSLVLT, (SEQ ID NO: 139) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTL, (SEQ ID NO: 140) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLN, (SEQ ID NO: 141) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNE, (SEQ ID NO: 142) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNEL, (SEQ ID NO: 143) VRRAPPTTAVPSRTSLVLTLNELP, (SEQ ID NO: 144), a amino-końcowe przedłużenia łańcucha aminokwasów obejmują jedną lub więcej reszt 176-332 ludzkiego ML, przedstawionych na fig. 1 (SEQ ID NO: 1) i ich formy polioksyalkilenowane;

(b) chimeryczny pohpeptyd zawierający ligand mlp, który został przyłączony do pohpeptydu heterologicznego, przy czym sekwencj a aminokwasów polipeptydu zawiera reszty aminokwasów od 1 do X według fig. 1 (SEQ ID NO: 1), gdzie X wybrany jest z grupy obejmującej reszty 153, 155, 164, 174, 191,205, 207, 217, 229, 245 i 332; i (c) warianty tych pohpeptydów.
26. Kompozycja według zastrz. 25. znamienna tym, że zawiera ponadto terapeutycznie skuteczną ilość środka wybranego z grupy obejmującej: cytokmę, czynnik stymulujący kolonie i interleukinę.
27. Kompozycja według zastrz. 26, znamienna tym, że zawiera środek wybrany z grupy obejmującej KL, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, IL-1, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8,15 IL-9 i IL-11.

* * *

Wynalazek dotyczy wydzielania, oczyszczania i oraz rekombinantowej lub chemicznej syntezy białek, które wpływają na przetrwanie, rozwój, różnicowanie lub dojrzewanie komórek hematopoetycznych, zwłaszcza komórek będących prekursorami płytek krwi. Wynalazek w szczególności dotyczy klonowania i ekspresji kwasów nukleinowych kodujących ligand białko zdolny do wiązania się i uaktywniania mpl, członka superrodzmy receptorów cytokmy. Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania tych białek, samych w kombinacji z innymi cytokinami do leczenia zaburzeń immunologicznych lub hematopoetycznych, takich jak małopłytkowość.

Stan techniki wynalazku

I. Układ hematopoetyczny

Układ hematopoetyczny wytwarza dojrzałe, wysoce wyspecjalizowane komórki krwi niezbędne dla życia wszystkich ssaków. Do tych dojrzałych komórek należą: erytrocyty, wyspecjalizowane w transporcie tlenu i ditlenku węgla, T- i B-hmfocyty, odpowiedzialne za odpowiedzi immunologiczne z udziałem komórek i przeciwciał, płytki krwi lub trombocyty, wyspecjalizowane w tworzeniu skrzephn krwi oraz granulocyty i makrofagi, wyspecjalizowane jako komórki oczyszczające oraz jako komórki pomocnicze w zwalczaniu infekcji. Granulocyty dzielą się ponadto na neutrofile, eozynofile, komórki zasadochłonne i komórki tuczne, wyspecjalizowane typy komórek o określonych funkcjach. Wyraźnie widać, że wyspecjalizowane dojrzałe komórki krwi pochodzą od jednego wspólnego typu komórek, określanego jako komórki macierzyste o wielorakich (lub wielokierunkowych) możliwościach różnicowania się, występujące głównie w szpiku kostnym (Dexter i inni, Ann. Rev. Celi. Biol., 3:423-441 [1987]).

Dojrzałe, wysoce wyspecjalizowane komórki krwi muszą być stale wytwarzane w wielkich ilościach przez całe życie ssaka. Przeznaczeniem zdecydowanej większości tych wyspecjalizowanych komórek krwi jest to, że wykazują one aktywność jedynie przez okres od kilku godzin do tygodni (Cronkite i inni, Blood Cells, 2:263-284 [1976]). W związku z tym konieczne jest ciągłe odnawianie dojrzałych komórek krwi, samych pierwotnych komórek macierzystych, a także jakichkolwiek linii pośrednich lub pośredniczących komórek prekursorowych, występujących między komórkami pierwotnymi i dojrzałymi, tak aby utrzymać normalny stały poziom komórek krwi niezbędnych dla ssaka.

180 765

U podstaw układu hemetopoetycznego leży jedna lub więcej komórek pierwotnych o wielorakich możliwościach różnicowania się. Komórki te są stosunkowo nieliczne i samorzutnie odnawiają się na drodze proliferacji z wytworzeniem potomnych komórek pierwotnych, albo ulegają przekształceniu w szeregu etapach różnicowania w coraz bardziej dojrzałe komórki o ograniczonej zdolności tworzenia linii komórkowych, tworząc ostatecznie wysoce wyspecjalizowane dojrzałe komórki krwi.

Tak np. pewne wielofunkcyjne komórki prekursorowe, określane jako CFC-Μιχ, pochodzące z komórek pierwotnych, ulegająproliferacji (samoodnawianiu) i rozwijająsię tworząc kolonie zawierające całość różnych komórek szpikowych: erytrocyty, neutrofile, magakariocyty (będące przodkami płytek krwi), makrofagi, komórki zasadochłonne, eozynofile oraz komórki tuczne. Inne komórki prekursorowe z linii limfoidalnej ulegają proliferacji i rozwijają się tworząc komórki T i komórki B.

Na dodatek między komórkami prekursorowymi CFC-Mix i komórkami szpiku znajduje się inna grupa komórek prekursorowych o pośrednim związku z potomstwem Takie komórki prekursorowe o ograniczonej zdolności tworzenia linii komórkowych klasyfikuje się w oparciu o tworzone przez nie potomstwo. I tak do znanych bezpośrednich prekursorów komórek szpiku należą: jednostki tworzące kolonię erytroidów (CFU-E) dla erytrocytów, komórki tworzące kolonię granulocytów/makrofagów (GM-CFC) dla neutrofih i makrofagów, komórki tworzące kolonię megakariocytów (Meg-CFC) dla megakariocytów, komórki tworzące kolonię eozynofili (EosCFC) dla eozynofili oraz komórki tworzące kolonię komórek zasadochłonnych (Bas-CFC) komórek tucznych. Znane (patrz poniżej) lub zostaną prawdopodobnie odkryte inne pośrednie komórki prekursorowe pomiędzy komórkami pierwotnymi o wielorakiej możliwości różnicowania się i dojrzałymi komórkami krwi, o zmiennej zdolności do ograniczania tworzenia linii komórkowych i samoodnawiania.

U podstaw normalnego układu komórek hemetopoetycznych leży zasada zmniejszania się zdolności do samoodnawiania się w miarę jak spada wielofunkcyjność i dochodzi się do ograniczania tworzenia linii komórkowych i stanu dojrzałego. I tak na jednym końcu układu komórek hemetopoetycznych znajdują się komórki pierwotne o wielorakiej możliwości różnicowania się, wykazujące zdolność samoodnawiania się, różnicowania na rozliczne pośrednie komórki potomne o określonym charakterze. Zdolność ta leży u podstaw terapii obejmującej przeszczep szpiku kostnego, gdyż pierwotne komórki macierzyste stanowią źródło całego układu komórek hemetopoetycznych. Na drugim końcu układu znajdują się komórki potomne o organiczonej zdolności tworzenia linii komórkowych oraz ich potomstwo, które utraciło zdolność do samoodnawiania się, ale osiągnęło aktywność funkcyjną komórki dojrzałej.

Proliferacja i rozwój komórek macierzystych i komórek potomnych o ograniczonej zdolności tworzenia linii komórkowych jest dokładnie regulowana przez różne hemetopoetyczne czynniki wzrostu lub cytokiny. Rola tych czynników wzrostu in vivo jest złożona i nie do końca zrozumiała. Pewne czynniki wzrostu, takiej jak mterleukina-3 (IL-3), są zdolne do pobudzania zarówno wielofunkcyjnych komórek macierzystych i jak pośredniczących komórek prekursorowych różnych szeregów, obejmujących np. megakariocyty. Początkowo uważano, że inne czynniki takie jak czynnik pobudzający kolonię granulocytów/makrofagów (GM-CSF) ograniczają się do działania na GM-CFC. Później jednak stwierdzono, że GM-CSF wpływa również na proliferację i rozwój m.in. megakariocytów. W zawiązku z tym okazało się, że działania biologiczne IL-31 GM-CSF częściowo pokrywająsię,jakkolwiek różniąsię one siłą oddziaływania. Ostatnio okazało się, że zarówno mterleukina-6 (IL-6) jak i mterleukina-11 (IL-11), osobno nie wywierają wyraźnego wpływu na powstawanie kolonii i meg, działają synergistycznie z IL-3 pobudzając dojrzewanie megakariocytów (Yonemura i inni, Exp. Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

W zawiązku z tym hematopoetyczne czynniki wzrostu mogą wpływać na wzrost i różnicowanie jednego lub więcej szeregów, mogą nakładać się z innymi czynnikami wzrostu w oddziaływaniu na określoną linię komórek prekursorowych lub mogą działać synergistycznie z innym czynnikiem.

180 765

Okazuje się ponadto, że hematopoetyczne czynniki wzrostu mogą wywierać wpływ na różnych stadiach rozwoju komórek od pierwotnych komórek o wielorakich możliwościach różnicowania się poprzez różne pośrednie komórki prekursorowe o ograniczonej zdolności tworzenia linii komórkowych aż do dojrzałych komórek krwi. Ta np. okazało się, że erytropoetyna (epo) wpływa na proliferację tylko dojrzałych erytroidowych komórek prekursorowych. Natomiast IL-3 wywiera wpływ na wcześniejsze komórki pierwotne oraz na pośrednie komórki prekursorowe o ograniczonej zdolności tworzenia linii komórkowych. Inne czynniki wzrostu takie jak czynnik komórek pierwotnych (SCF), mogą wpływać na rozwój jeszcze wcześniejszych komórek.

Można oczekiwać na podstawie powyższego, że nowe hematopoetyczne czynniki wzrostu, które wpływają na przetrwanie, proliferację, różnicowanie i dojrzewanie dowolnych komórek krwi lub ich prekursorów, mogą być przydatne, zwłaszcza do ułatwiania odtwarzania układu hematopoetycznego osłabionego przez chorobę lub radio- albo chemioterapię.

II Megakanocytopoeza - wytwarzanie płytek krwi

Przegląd regulacji megakariocytopoezy i wytwarzania płytek krwi opublikowali· Mazur, Exp. Hematol., 15.248 [1987] oraz Hoffman, Blood, 74:1196-1212 [1989]. W skrócie pierwotne komórki szpiku kostnego o wielorakich możliwościach różnicowania się tworzą linie komórek megakariocytowych, erytrocytowych i mielocytowych. Uważa się, ze występuje hierarchia pośrednich megakariocytowych komórek prekursorowych między komórkami pierwotnymi i megakanocytami. Zidentyfikowano co najmniej 3 klasy megakariocytowych komórek prekursorowych, a konkretnie: megakariocyty jednostkowe tworzące rozerwanie (BFU-MK), megakariocyty jednostkowe tworzące kolonie (CFU-MK) megakariocytowe komórki prekursorowe o małej gęstości (LD-CFU-MK). Samo dojrzewanie megakanocytów stanowi ciągły proces rozwoju, który podzielono na stadia w oparciu o standardowe kryteria morfologiczne. Najwcześniejszymi rozpoznanymi członkami rodziny megakanocytów (MK lub meg) sąmegakanoblasty. Komórki te, o początkowej średnicy 20-30 pm, zawierają zasadochłonną cytoplazmę, oraz nieznacznie nieregularne jądro z luźną, nieznacznie siatkowatą chromatyną oraz z szeregiem jąderek. Późne megakanoblasty mogą zawierać do 32 jąder (pohploidy), z tym że cytoplazma pozostaje rzadka i niedojrzała. W miarę dojrzewania jądro staje się bardziej zrazikowate i piknotyczne, ilość cytoplazmy zwiększa się, a ponadto staje się ona bardziej kwasochłonna i ziarnista Najdojrzalsze komórki z tej rodziny mogą uwalniać płytki krwi na swoim obwodzie. Zazwyczaj mniej niż 10% megakanocytów jest w stadiumblastów, a ponad 50% w stanie dojrzałym. Według zaakceptowanej, przyjętej klasyfikacji morfologicznej w odniesieniu do szeregu megakariocytów megakarioblasty zalicza się do formy najwcześniejszej, promegakanocyty lub megakanocyty zasadochłonne do formy pośredniej, a megakanocyty dojrzałe (kwasochłonne, ziarniste lub wytwarzające płytki) do form późniejszych. Dojrzały megakariocyt wypuszcza włókienka z cytoplazmy do zatokowych przestrzeni, gdzie odrywająsię one i dzieląna poszczególne płytki krwi (Williams i mm, Hematology, 1972).

Uważa się, że megakanocytopoeza obejmuje szereg czynników regulujących (Williams i inni, Br. J. Haematol., 52'173 [1982] oraz Willims i inni, J. CellPhysiol, 110:101 [1982]). Postuluje się, że wczesne stadium megakariocytopoezy jest mitotyczne, związane z proliferacją komórek inicjowaniem kolonii przez CFU-MK, ale nie zależy od liczby płytek krwi (Burstem i inni, J. Celi Physiol., 109:333 [1981] oraz Kimura i mm, Exp. Hematol., 13:1048 [1985]). Późne stadium dojrzewania jest niemitotyczne, związane z poliploidyzacją jądra i cytoplazmatycznym dojrzewaniem oraz jest prawdopodobnie regulowane według mechanizmu sprzężenia zwrotnego przez liczbę płytek krwi (Odęli i inni, Blood, 48:765 [1976] oraz Ebbe i inni, Blood, 32,787 [1968]).

Rozważano możliwość występowania odrębnego i specyficznego czynnika pobudzającego kolonie megakariocytowe (MK-CSF) (Mazur, Esp. Hematol., 15:340-350 [1987]). Jednakże większość autorów uważa, że proces tak istotny dla przeżycia jak wytwarzanie płytek krwi powinien być regulowany przez jedną lub więcej cytokin wyłącznie odpowiedzialnych za ten proces. Hipoteza odnośnie występowania jednej lub więcej cytokin specyficznych względem megakanocytów/płytek krwi została potwierdzona trwającymi ponad 30 lat badaniami, ale jak dotych

180 765 czas nie przeprowadzono oczyszczania i sekwencjonowania żadnej takiej cytokiny oraz nie ustalono na podstawie testów jej unikalności jako MK-CSF (TPO).

Jakkolwiek doniesiono, że MK-CSF zostały wstępnie oczyszczone w przypadku doświadczalnie wywołanej małopłytkowości (Hill, i inni, Exp.Hematol, 14 752 [1986]), w kondycjonowanym ośrodku embrionalnej ludzkiej nerki [CM] (McDonald i inni, J. Lab. Clin. Med., 85 59 [1975]), a także z ekstraktów moczowych ludzi z niedokrwistościąpooperacyjną i chorobą WerIhofa (Kawakita i inni, Blood, 6:556 [1983]) oraz w osoczu (Hoffman i inni, J. Clin. Invest, 75:1174 [1985]), ich działanie fizjologiczne jest dotychczas w większości przypadków nieznane

Kondycjonowany ośrodek komórek śledziony pobudzanych wyciągiem szkarłatki (PWM-SpCM) oraz mysich linii komórek monocytów szpiczakowych WEHI-3 (WEHI-3CM) zastosowano jako środki intensyfikujące megakariocyty. PWM-SpCM zawiera czynniki intensyfikujące wzrost CFU-MK (Metcalf i inni, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 72:1744-1748 [1975]; Quesenberry i inni, Blood, 65:214 [1985]; orazIscoveN.N., w Hamatopoietic Celi Differenticition, ICN-UCLA Symposia on Molecular i Cellular Biology, Vol. 10, Golde i inni, red. [New York, Academy Press] str. 37-52 [978]), z których jeden stanowi interleukina-3 (IL-3), czynnik pobudzający kolonię wieloszergową (multi-CSF [Burstein, Blood Celłs, 11:469 [1986]). Inne czynniki w tym ośrodku nie zostały jak dotychczas zidentyfikowane i wydzielone. WEHI-3 stanowi linię mysich komórekmonocytów szpiczakowych, wydzielających stosunkowo duże ilości IL-3 mniejsze ilości GM-CSF. Stwierdzono, że IL-3 intensyfikuje wzrost wielu różnych komórek hematopoetycznych (Ihle i inni, J. Immunol., 13:282 [1983]). Stwierdzono także, że IL-3 działa synergistycznie z wieloma znanymi hematopoetycznymi hormonami lub czynnikami wzrostu (Bartelmez i inni, J Celi Physiol, 122:362-369 [1985] oraz Warren i inni, Celi, 46:667-674 [1988]), w tym z erytropoetyną (EPO) i interleukiną-1 (EL-1), w indukowaniu bardzo wczesnych prekursorów wielofunkcyjnych i tworzeniu bardzo dużych mieszanych kolonii hematopoetycznych.

Inne źródła środków intensyfikujących megakariocyty znaleziono w kondycjonowanych ośrodkach mysich płuc, kości, liniach komórek makrofagowych, komórek wydzieliny otrzewnowej i ludzkich embrionalnych komórek nerki. Pomimo pewnej sprzeczności danych (Mazur, Exp. Hematol., 15:340-350 [1985]), istnieje pewne potwierdzenie (Geissler i inni, Br J. Haematol., 60.233-238 [1951]), że to raczej uaktywnione limfocyty T, anie monocyty odgrywają intensyfikującą rolę w megakariocytopoezie. Wyniki te sugerują że wydzielmy uaktywnionych limfocytów T, takie jak interleukiny mogą być czynnikami regulującymi rozwój MK (Geissler i inni, Exp. Hematol, 15:845-853 [1987]). Szereg badań nad megakariocytopoezą z oczyszczoną erytropoetynąEPO (Vainchenker i inni, Blood, 54:940 [1979]; McLeod i inni, Naturę, 261:492-4 [1976]; oraz Williams i inni, Exp. Hematol, 12:734 [1984]) wskazują że hormon ten wywiera działanie intensyfikujące na powstawania kolonii MK. Wykazano to także w przypadku hodowli zarówno me zawierających jak i zawierających surowicę, a także w nieobecności komórek biorczych (Williams i inni, Exp. Hematol, 12:734 [1984]). Postulowano, ze EPO odgrywa rolę bardziej w jedno- i dwukomórkowych stadiach megakariocytopoezy, w przeciwieństwie do wpływu na PWM-SpCM, który występuje w czeterokomórkowym stadium rozwoju megakanocytów. Oddziaływanie wszystkich tych czynników zarówno we wczesnych jak i późnych fazach rozwoju megakanocytów pozostaje do wyjaśnienia.

Wyniki uzyskane w szeregu laboratoriach sugerują że jednymi czynnikami wieloszeregowymi, które pojedynczo wykazują działanie pobudzające linię komórek MK, są GM-CSF i IL-3 oraz, w mniejszym stopniu, czynnik pobudzający komórki B, IL-6 (Ikebuchi i inni, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84:9035 [1987]). Ostatnio szereg autorów doniosło, że IL-11 i czynnik hamujący białaczkę (LIF) działają synergistycznie z IL-3 zwiększając wielkość i ploidię megakanocytów (Yonemura i inni, British Journal of Hematology, 84:16-23 [1993]; Burstein i inni, J. Celi. Physiol, 153:305-312 [1992];Metcalf i inni, Blood, 76:50-56 [1990]; Metcalf i inni, Blood, 77:2150-2153 [1991]; Bruno i inni, Exp. Hematol., 19:378-381 [1991]; oraz Yonemura i inni, Exp, Hematol., 20:1011-1016 [1992]).

Do innych istotnych dokumentów należą: Eppstein i inni, patent USA nr 4 962 091; Chong, patent USA nr 4 879 111; Femandes i inni, patent USA nr 4 604 377; Wissier i mm, patent USA nr

180 765

4 512 971; Gottlieb, patent USA nr 4 468 379; Bennett i inni, patent USA nr 5 215 895; Kagan i inni, patent USA nr 5 250 732; Kimura i inni, Eur. J. Immunol, 20(9): 1927-1931 [1990]; Secor i inni, J. of Immunol, 144(4):1484-1489 [1990]; Warren i inni, J. of Immunol, 140(1):94-99 [1988], Warren i inni, Exp. Hematol., 17(11):1095-1099 [1989]; Bruno i inni, Exp. Hematol., 17(10):1038-1043 [1989]; Tanikawa i inni, Exp. Hematol., 17(8):883-888 [1989]; Koike i inni, Blood, 75( 12):2286-2291 [ 1990]; Lotem, Blood, 75(5): 1545-1551 [ 1989]; Rennick i inni, Blood, 73(7)· 1828-1835; oraz Clutterbuck i inni, Blood, 73(6).1 504-1 51 2 [1989],

III. Małopłytkowość

Płytki krwi stanowią podstawowe elementy odgrywające rolę w mechanizmie krzepliwości krwi. Zubożenie poziomu płytek krwi w obiegu, określane jako małopłytkowość, występuje w różnych stanach klinicznych i zaburzeniach. Zazwyczaj określa się, że małopłytkowość występuje gdy liczba płytek wynosi poniżej 150x10⁹/litr. Główne przyczyny małopłytkowości można z grubsza podzielić na 3 kategorie w zależności od przedziału czasu życia płytek, a mianowicie^ 1) zakończenie wytwarzania płytek krwi przez szpik kostny, (2) sekwencja płytek przez śledzionę (splenomegaha) lub (3) zwiększony rozpad płytek krwi krążeniu obwodowym (np. małopłytkowość autoimmunologiczna albo chemio- i radioterapia). Ponadto u pacjentów, którym szybko podaje się duże objętości produktów krwi zubożonych w płytki, małopłytkowość może wystąpić na skutek rozcieńczenia.

Krwawienie jako kliniczny objaw małopłytkowości zależy od ostrości małopłytkowości, jej przyczyn oraz od ewentualnych związanych defektów koagulacyjnych. Zazwyczaj u pacjentów z ilościąpłytek od 20 do 100 x 10⁹/htr występuje ryzyko nadmiernego krwawienia pourazowego, a u pacjentów z liczbą płytek poniżej 20 x 10⁹/litr mogą wystąpić krwawienia spontaniczne. Ci ostatni pacjenci sąpotencjalnymi kandydatami do wykonania transfuzji płytek z ryzykiem konfliktu odpornościowego lub zakażeniu wirusowemu. Dla danego stopnia małopłytkowości krwawienie jest silniejsze, gdy przyczynę stanowi zmniejszenie wytwarzania płytek niż zwiększony ich rozpad. W tym ostatnim przypadku przyspieszony obieg płytek powoduje, że krążyć zaczynają młodsze, większe i hemostatycznie bardziej skuteczne płytki krwi. Małopłytkowość może wynikać z wielu zaburzeń skrótowo opisanych poniżej. Bardziej szczegółowy opis znaleźć można w pracy Schafher A.L, „Thrombocytopenia and Disorders of Platelet Function”, Intemal Medicine, 3 Ed , Jon J. Hutton i inni, red., Little Brown i Co., Boston/Toronto/ London [1990].

(a) Małopłytkowość spowodowana zakłóceniami w wytwarzaniu płytek krwi

Do przyczyn wrodzonej małopłytkowości należy wrodzona niedokrwistość aplastyczna (zespół Fanconiego) oraz wrodzona amegakariocytowa małopłytkowość, która może być związana z wadliwie wykształconym szkieletem. Do nabytych zaburzeń w wytwarzaniu płytek krwi należy niedorozwój megakanocytów lub nieskuteczna trombopoeza. Niedorozwój megakariocytów może wynikać z różnych stanów takich jak aplazja szpiku (obejmująca formy samoistne lub zahamowania funkcjonowania szpiku przez środki chemioterapeutyczne lub radioterapię), zwłókienie szpiku, białaczka zaatakowanie szpiku kostnego przez przerzutowe nowotwory lub ziaminiaki. W pewnych sytuacjach toksyny, czynniki infekcyjne lub leki mogą stosunkowo selektywnie zakłócać trombopoezę; przykładowo wymienić można przejściowe małopłytkowości wywołane przez alkohol i pewne infekcje wirusowe oraz łagodną małopłytkowość związaną z podawaniem tiazydowych środków moczopędnych. Także niewydajna trombopoeza wtórna w stosunku do procesów megaloblastycznych (zubożenie w folian lub B₁₂) może spowodować małopłytkowość, zazwyczaj z równoczesną niedokrwistością i leukopenią.

Obecne leczenie małopłytkowości spowodowanej zmniejszeniem wytwarzania płytek krwi zależy od identyfikacji przyczyny leżącej u podstaw niewydolności szpiku kostnego i sposobu jej odwracania. Transfuzje płytek zarezerwowane sązazwyczaj dla pacjentów z poważnymi komplikacjami krwawień lub do przypadków w czasie operacji chirurgicznych, gdyż immunizacja może doprowadzić do oporności na dalsze transfuzje płytek. Krwawienie błon śluzowych występujące w przypadku ostrej małopłytkowości można złagodzić podając doustnie lub dożylnie środki przeciwfibrynolityczne. Komplikacje trombotyczne mogą się jednak pojawić w przy

180 765 padku podawania środków przeciwfibrynolitycznych pacjentom z rozsianym wykrzepiamem wewnątrznaczyniowym (DIC).

(b) Małopłytkowość spowodowana przez sekwestrację w śledzionie

Splenomegalia spowodowana różnymi przyczynami może być związana z umiarkowaną małopłytkowością. Jest to w znacznym stopniu proces pasywny (hiperspienizm) sekwestracji płytek w śledzionie, w przeciwieństwie do aktywnego niszczenia płytek krwi przez śledzionę w przypadku małopłytkowości związanej z odpornością opisanej poniżej. Jakkolwiek większość naj częstszych przyczyn hiperspienizmu stanowi nabyta splenomegalia spowodowana nadciśnieniem wrotnym na skutek alkoholowej marskości wątroby, innej formy nabytej, naciekowej lub hmfoproliferacyjnej splenomegahi są także związane z małopłytkowością. Przy występowaniu samego hiperspienizmu liczba płytek zazwyczaj nie spada poniżej 50 x 10⁹/litr.

(c) Małopłytkowość spowodowana niszczeniem płytek, nie związanym z odpornością

Małopłytkowość może być spowodowana przyspieszonym niszczeniem płytek krwi w różnych procesach meimmunologicznych. Do zaburzeń tego typu należy rozsiane wykrzepianie wewnątrznaczyniowe, protetyczne elementy wewnątrznaczyniowe, pozaustrojowe krążenie krwi oraz zakrzepowe mikroangiopatie takie jak choroba Moschowitza. We wszystkich tych sutuacjach krążenie płytki krwi, narażone na zetknięcie z obcymi powierzchniami lub z nienormalnymi błonami wewnętrznymi naczyń, zużywająsię w tych miejscach lub zostająuszkodzone tak, że są przedwcześnie usuwane przez układ siateczkowo-śródbłonkowy. Stany chorobowe lub zaburzenia, które mogą doprowadzić do rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego (DIC) opisane są dokładniej w pracy Braunwald i inni, (red.), Harrison’s Principles of Intemal Medicine, 11 Ed., p. 1478, McGraw Hill [1978]. Wewnątrznaczyniowe elementy protetyczne takie jak zastawki sercowe i balony wewnątrztętnicze, mogą spowodować łagodnie lub umiarkowanie destrukcyjną małopłytkowość, a małopłytkowość przemijająca u pacjentów z krążeniem pozaustrojowym i hemodializą może być spowodowana zużyciem lub uszkodzeniem płytek krwi w obwodzie pozaustrojowym.

(d) Małopłytkowość odpornościowa wywołana przez leki

Ponad 100 leków posądzanych jest o wywoływanie małopłytkowości związanej z odpornością. Jednakże dobrze udokumentowane jest jedynie działania chinidyny, chinmy, złota, sulfonamidów, cefalotyny i heparyny. Małopłytkowość wywołana prze lek jest często bardzo ostra i zazwyczaj postępuje lawinowo w ciągu dni podczas przyjmowania przez pacjentów uczulającego leku.

(e) Immunologiczna (autoimmunologiczna) plamica małopłytkowa (ITP)

ITP u osób dorosłych jest chorobą przewlekłą charakteryzującą się autoimmonologicznym niszczeniem płytek. Auto-przeciwciałem jest zazwyczaj IgG, choć doniesiono także o innych immunoglobulinach. Jakkolwiek stwierdzono, że autoprzeciwciało w ITP jest związane z błoną płytkową GPII_bin_a, w większości przypadków nie została ustalona specyficzność antygenu. Pozanaczyniowe niszczenie uczulonych płytek krwi zachodzi w układzie siateczkowo-śródbłonkowym śledziony i wątroby. Jakkolwiek ponad połowę wszystkich przypadków stanowią samoistne ITP, w przypadku wielu pacjentów u podstaw leżą choroby reamatyczne lub autoimmunologiczne (np. liszaj rumieniowaty układowy) lub zaburzenia profileracyjne limfy (np. białaczka hmfatyczna przewlekła).

(f) ITP wywołana przez HIV

ITP stanowi coraz częściej występujące powikłanie infekcji HIV (Morris i inni, Ann. Intern. Med., 96:714-717 [1982]), przy czym może ona pojawić sięupacjentów z zepołem nabytego niedoboru odporności (AIDS), z kompleksem związanych z AIDS oraz z infekcją HIV. ale bez objawów AIDS. Infekcja HIV jest chorobą przenoszoną ostatecznie charakteryzującą się znaczącym niedoborem odpornościowego działania komórek, a także występowaniem oportunistycznych infekcji i złośliwością. Podstawową nienormalność immunologiczną wynikającą z infekcji HIV stanowi postępujące wyczerpywanie i zakłócanie działam limfocytów T wytwarzających w wyniku ekspresji powierzchniową glikoproteiną komórkową CD4 (Lane i inni, Ann. Rev. Immunol., 3:477 [1985]. Utrata działania czynnika pomocmczego/wywołującego CD4 ko

180 765 morek T leży prawdopodobnie u podstaw znaczących defektów w odporności komórkowej i humoralnej, co prowadzi do oportunistycznych infekcji i złośliwości charakterystycznych dla AIDS (H. Lane, supra).

Jakkolwiek mechanizm ITP związanej z HIV nie jest znany, uważa się, ze jest on odmienny od mechanizmu ITP nie związanej z infekcją HIV. (Walsh i inni, N. Eng. J. Med., 311:635-639 [1984]; oraz Ratner, Am. J. Med., 86:194-198 [1989]).

IV. Obecna terapia małopłytkowości

Terapeutyczne podejście do leczenia pacjentów z małopłytkowością podyktowane jest ostrością i powagą sytuacji klinicznej. Leczenie w przypadku małopłytkowości związanej i nie związanej z HIV jest podobne i jakkolwiek zastosowano różne rozwiązania terapeutyczne, to terapia pozostaje bardzo kontrowersyjna.

Liczbę płytek u pacjentów z diagnoząmałopłytkowości z powodzeniem zwiększa się stosując terapię glukokortykoidem (np. prednisolonem), z tym że u większości pacjentów reakcja jest niepełna lub następuje ponowny spadek, gdy dawkę glukokortikoidu zmniejszy się lub przerwie się jego podawanie. Na podstawie studiów nad pacjentami z ITP związanąz HIV pewni badacze zasugerowali, że terapia glukokortykoidem może spowodować podatność na wystąpienie AIDS. Glukokortykoidy zazwyczaj podaje się gdy hczba płytek spadnie poniżej 20x 10⁹/htr lub gdy wystąpi samoistne krwawienie.

W przypadku pacjentów odpornych na glukokortykoidy z powodzeniem zastosowano 4-(2-chlorfenylo)-9-metylo-2-[3-(4-morfolinylo)-3-propanon-l-ylo]-6H-tieno[3,2,f][l,2,4-tnazolo[4,3,a][l,4]diazepinę (WEB 2086) do leczenia ostrych przypadków ITP nie związanej z HIV. Pacjentowi z ilościąpłytek 37 000-58 000/μΙ podawano WEB 2086 i po 1-2 tygodniach leczenia liczba płytek wzrosła do 140 000-190 000/μ1. (EP 361 077 oraz Lohman i inni, Lancet, 1147 [1988]).

Jakkolwiek optymalne leczenie w przypadku nabytej amegakanocytowej plamicy małopłytkowej (AATP) nie jest pewne, wykazano, że globulina tomocytowa (ATG), końska przeciwsurowica przeciw ludzkiej tkance grasiczej zapewnia w dłuższym okresie całkowite cofnięcie choroby (Trimble i inni, Am. J. Hematol, 37:126-127 [1991]). Jednakże najnowsze badania wykazują że działanie hematopoetyczne ATG jest przypisywane timerosalowi, gdy prawdopodobnie białko działa jako nośnik rtęci (Panella i inni, Cancer Research, 50:4429-4435 [1990]).

Doniesiono o dobrych wynikach splenektomii. Splenektomia usuwa główne miejsce niszczenia płytek oraz główne źródło wytwarzania autoprzeciwciał u wielu pacjentów. Taki sposób zapewnia w dłuższym okresie czasu bez stosowania leków cofnięcie się choroby u wielkiej liczby pacjentów Jednakże w związku z tym, że operacji chirurgicznych należy raczej unikać w przypadku pacjentów z upośledzoną odpornością splenektomię zaleca się jedynie w ciężkich przypadkach małopłytkowości (np. przy ciężkiej ITP związanej z HIV), u pacjentów, którzy nie reagują na 2-3 tygodniową terapię glukokortykoidem lub u tych, u których nie występuje przedłużona reakcja po przerwaniu podawania glukokortykoidu. Na podstawie obecnej wiedzy nie jest pewne, czy splenektomia stwarza predyspozycje pacjentów względem AIDS.

Oprócz terapii prednisolonem i splenektomii obiecujące wyniki uzyskano przy zastosowaniu pewnych środków cytotoksycznych, np. winkrystyny i azydotymidyny (AZT, zidowudyna) do leczenia ITP wywołanej przez HIV; są to jednak wyniki wstępne.

Z powyższego przeglądu wynika, że jednym ze sposobów leczenia małopłytkowości mogłoby być zastosowanie środka, który może przyspieszać różnicowanie i dojrzewanie megakariocytów lub ich prekursorów do formy wytwarzającej płytki. Przedsięwzięto znaczne wysiłki w celu zidentyfikowania tego środka, zwykle określanego jako „trombopoetyna” (TPO) Do innych określeń TPO zwykle spotykanych w literaturze należy czynnik pobudzający trombocytopoezę (TSF), czynnik pobudzający kolonię megakanocytów (MK-CSF), czynnik pobudzający megakanocyty oraz intensyfikator megakariocytów. Aktywność TPO zaobserwowano juz w 1959 roku (Rak i inni, Med. Εχρ., 1 · 125) a próby jego scharakteryzowania i oczyszczania tego środka kontynuowane są do dzisiaj. Jakkolwiek istnieją doniesienia o częściowym oczyszczaniu TPO-aktywnych polipeptydów (patrz np. Tayrien i innim J. Biol. Chem., 262:3262 [1987] oraz

180 765

Hoffman i inni, J. Clin. Invest. 75:1174 [1985]), inni postulują, że TPO me stanowi odrębnej jednostki, ale raczej stanowi po prostu wielofunkcyjny objaw znanego hormonu (IL-3, Sparrow i inni, Próg. Clin. Biol. Res., 215:123 [1986]). Bez względu na postać lub pochodzenie cząsteczka wykazująca działanie trombopoetyczne powinna mieć duże znaczenie terapeutyczne. Jakkolwiek jednoznacznie nie zidentifikowano żadnego białka jako TPO, znaczne zainteresowanie wzbudza ostatnie odkrycie, że mpl, a przypuszczalny receptor cytokiny, może przenosić sygnał trombopoetyczny.

V Mpljest megakariocytopoetycznym receptorem cytokiny

Sądzi się, że proliferacja i dojrzewanie komórek hematopoetycznych jest dokładnie regulowane przez czynnik, który dodatnio lub ujemnie moduluje proliferację komórek pierwotnych o wielorakich możliwościach różnicowania się i wieloszeregowe różnicowanie. Zjawiska te przebiegaj ąz udziałem wiązania z wysokim powinowactwem pozakomórkowych czynników białkowych ze specyficznymi receptorami na powierzchni komórki. Takie receptory powierzchni komórki wykazują znaczącą homologię i sązazwyczaj klasyfikowane jako człony superrodzmy receptorów cytokiny. Do członów tej superrodziny należą receptory w stosunku do IL-2 (łańcuchy βγ) (Hatakeyma i inni, Science, 244:551-556 [1989]; Takeshita i inni, Science 257'379-382 [1991]); IL-3 (Itoh i inni, Science, 247:324-328 [1990]; Gorman i inni, Proc, Natl. Acad Sci. USA, 7:5459-5463 [1990]; Kitamura i inni, Celi, 66:1165-1174 [199la]; Kitamura i mm, Proc, Natl, Acad. Sci, USA, 88:5082-5086 [ 199Ib], IL-4 (Mosley i inni, Celi, 59:335-348 [1989], IL-5 (Takaki i inni, EMBO J., 9:4367-4374 [1990]; Tavemier i inni, Celi, 66:1175-1184 [1991]), IL-6 (Yamasaki i inni, Science, 241:825-828 [1988]; Hibi i inni, Celi, 63.1149-1157 [1990], IL-7 (Goodwiniinni, Celi, 60:941-951 [1990]), IL-9 (Renault i inni, Proc, Natl. Sci. USA, 89:5690-5694 [1992]), czynnika pobudzającego kolonię granulocytów-makrofagów (GMCSF) (Geanng i inni, EMBO J., 8'3667-3676 [1991]; Hayashida i inni, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 244'9655-9659 [ 1990]), czynnika pobudzającego kolonię granulocytów (G-CSF) (Fukunaga i inni, Celi, 61'341-350 [ 1990a]; Fukunaga i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8702-8706 [1990b]; Larsen i inni, J. Exp. Med., 172:15591570 [1990]), EPO (D’Andrea i inni, Celi, 57:277-285 [1989]; Jones i inni, Blood, 76:31-35 [1990]), czynnika hamującego białaczkę LIF) (Geanng i inni, EMBO J., 10:2839-2848 [1991]), onkostatyny M (OSM) (Rosę i inni, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 88 8641-8645 [1991], a także receptorów prolaktyny (Boutin i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7744-7748 [1988]; Edery i inni, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:2112-2116 [1989]), hormonu wzrostu (GH) (Leung i inni, Naturę, 330:537543 [1987] oraz neuropatycznego czynnika rzęskowego (CNTF) (Davis i inni, Science, 253:59-63 [1991].

Członków superrodziny receptorów cytokiny pogrupować można w 3 funkcjonalne kategorie (przegląd patrz Nicola i inni, Celi, 67:1-4 [1991]). Pierwszą klasę stanowiąjednołańcuchowe receptory takie jak receptor erytropoetyny (EPO-R) lub czynnik pobudzający kolonię granulocytów (G-CSF-R), który wiąże się z wysokim powinowactwem poprzez domenę pozakomórkową, a także generuje sygnał wewnątrzkomórkowy. Druga klasa receptorów, tak zwane podjednostki o, obejmuje receptor interleukiny-6 (IL6-R), receptor czynnika pobudzającego kolonię granulocytów/makrofagów (GM-CSF-R), receptor interleukiny-3 (IL3-Ra) oraz inni członkowie superrodzmy receptorów cytokiny. Te podjednostki a wiążą ligand z niskim powinowactwem, ale nie mogą przenosić sygnału wewnątrzkomórkowego. Receptor z wysokim powinowactwem, zdolny do sygnalizacji, wytwarzany jest przez heterodimer między podjednostką a i członkiem trzeciej klasy receptorów cytokiny, określanych jako podjednostki β, np. β_ε, wspólna β-podjednostka dla trzech podjednostek a IL3-Ra i GM-CSF-R.

Dowód na to, że mpl należy do superrodziny receptorów cytokiny, pochodzi z homologii sekwencji (Gearing, EMBO J., 8:3667-3676 [1988]; Bazan, Proc, Natl. Acad. Sci USA, 87:6834-6938 [ 1990]; Davis i inni, Science, 253:59-63 [1991] oraz Vigon i mm, Proc, Natl. Acad Sci. USA, 89:5640-5644 [1992]) i jego zdolności do przenoszenia sygnałów proliferacyjnych.

Wydedukowana sekwencja białka z klonowania molekularnego mysiego c-mpl potwierdza, że białko to jest homologiczne z innymi receptorami cytokin. Pozakomórkowa domena zawiera 465 reszt aminokwasów i składa się z dwóch subdomen, każda z czterech wysoce

180 765 zachowanymi cysteinami i określonym motywem w N-końcowej subdomenie i w C-końcowej subdomenie. Przewiduje się, że pozakomórkowe domeny wiążące ligand będą wykazywać podobną strukturalną geometrię podwójnej β-baryłkowej fałdy. Ta zdublowana pozakomórkowa domena jest wysoce homologiczna z przenoszącym sygnał łańcuchem wspólnym dla receptorów IL-3, IL-51GM-CSF, a także z domenąLIF wiążącąz niskim powinowactwem (Vigon i inni, Oncogene, 8;2607-2615 [1993]).Tak więc mpl może należeć do klasy receptorów cytokiny o niskim powinowactwie wiązania ligandu.

Porównanie mysiego mpl dojrzałego ludzkiego mpl potwierdza, ze te dwa białka wykazują 81 % identyczności sekwencji. W szczególności N-koniec i C-koniec pozakomórkowych subdomen wykazują odpowiednio 75% i 80% identyczności sekwencji. Najbardziej zachowanym obszarem mpl jest cytoplazmatyczna domena wykazująca 91% identyczności aminokwasów, przy czym sekwencja 37 reszt w pobliżu transmembranowej domeny jest identyczna w obydwu mpl. W związku z tym uważa się, że mpl stanowi jeden z najbardziej zachowanych członków superrodzmy receptorów cytokiny (Vigon, supra).

Potwierdzenie, że mpl jest funkcyjnym receptorem zdolnym do przenoszenia sygnału prohferacyjnego pochodzi z konstrukcji chimerycznych receptorów zawierających pozakomórkową domenę z receptora cytokiny o wysokim powinowactwie cytokiny z cytoplazmatyczną domeną mpl W związku z tym, że me doniesiono o żadnym Ugandzie mpl, konieczne było skonstruowanie chimerycznej pozakomórkowej domeny o wysokim powinowactwie wiązania ligandu z klasy receptorów cytokiny, takiego jak IL-4R lub G-CSFR. Vigon i mm, supra wykonali fuzję pozakomórkowej domeny G-CSFR z transmembranową i cytoplazmatyczną domeną c-mpl. IL-3-zależną linię komórek, BAF/BO3 (Ba/F3) transfekowano chimerą G-CSFR/mpl wraz z fragmentem kontrolnym G-CSFR o pełnej długości. Komórki transfekowane chimerą rosną równie dobrze w obecności cytokiny IL-3 lub G-CSF. Podobnie komórki transfekowane G-CSFR także dobrze rosną w obecności IL-3 lub G-CSF. Wszystkie komórki umierają w nieobecności czynnika wzrostu. Podobne doświadczenie przeprowadzili Skoda i inni, EMBO J , 12(7):2645-2653 [1993], w którym wykonano fuzję zarówno pozakomórkowych jak i transmembranowych domen ludzkiego receptora IL-4 (hlL-4-R) z cytoplazmatyczną domeną ludzkiego mpl, a następnie transfekcję w linii komórek Ba/F3 zależnych od mysiego IL-3. Komórki BaIF3 transfekowane dzikim hIL-4-R ulegają normalnej proliferacji w obecności fragmentów specyficznychIL-4 lub IL-3. Komórki Ba/F3 transfekowanehIL-4R7mplulegająnormalnej proliferacji w obecności hIL-4 (w obecności lub bez IL-3), co wykazuje że w komórkach Ba/F3 domena cytoplazmatyczna mpl zawiera wszystkie elementy niezbędne do przenoszenia sygnału prohferacyjnego.

Te chimeryczne eksperymenty wykazuj ązdolność domeny cytoplazmatycznej mpl do sygnalizowania proliferacji, ale mc nie mówią o możliwości wiązania ligandu przez pozakomórkową domenę mpl. Wyniki te odpowiadają co najmniej dwóm możliwościom, a mianowicie takim, że mpl jest receptorem o pojedynczym łańcuchu (klasy 1) podobnie jak EPO-R lub G-CSFR lub też jest podjednostką β przenoszącą sygnał (klasy 3) wymagającym podjednostki a takiej jak IL-3 (Skoda i inni, supra).

VI. Ligand mpl jest trombopoetyną (TPO)

Jak to wspomniano powyżej, sugeruje się, że surowica zawiera unikatowy czynnik, czasami określany jako trombopoetyną (TPO), który działa synergistyczme różnymi innymi cytokmami przyspieszając wzrost i dojrzewanie megakariocytów. Dotychczas nie wydzielono żadnego naturalnego czynnika tego typu z surowicy ani też z jakiegokolwiek innego źródła pomimo znacznych wysiłków w badaniach różnych grup. Mimo iż me wiadomo, czy mpl jest zdolny do bezpośredniego wiązania czynnika pobudzającego megakariocyty, ostatnie badania wykazują że mpl odgrywa rolę sygnału proliferacyjnego od czynnika lub czynników występujących w surowicy pacjentów z aplastycznym szpikiem kostynym (Methia i inni, Blood, 82(5): 1395-1401 [1993]).

Potwierdzenie, ze unikatowy pochodzący z surowicy czynnik tworzący kolonię, różniący się odIL- lot, IL3, IL-4, IL-6, IL-11, SCF, EPO, G-CSF i GM-CSF, przenosi sygnałprohferacyjny

180 765 poprzez mpl pochodzi z badania rozkładu ekspresji c-mpl w pierwotnych i pośrednich liniach komórek hematopoetycznych oraz z badań anty sensowności mpl w jednej z tych linii komórek.

Wykorzystując odwrotną transkryptazę (RT)-PCR immunologicznie oczyszczonych ludzkich komórkach hematopoetycznych Methia i inni, supra, wykazali, ze silne przekazy mpl mRNA znaleziono jedynie w oczyszczonych komórkach CD34+, magakariocytach i płytkach krwi. Oczyszczone komórki CD34+ ze szpiku kostnego (BM) stanowią około 1 % wszystkich komórek BM oraz występują w większych ilościach we wszystkich pierwotnych i pośrednich przodkach wszystkich szeregów (np. erytroidów granulomakrofagów i megakanocytów).

Wykazano, że antysensowne ohgodezoksynukleotydy tłumią tworzenie kolonu megakanocytowych z komórek CD34+ o wielorakich możliwościach różnicowania się, hodowanych w surowicy od pacjentów z aplastycznym szpikiem (bogatym źródłem aktywności pobudzającej kolonię megakariocytów [MK-CSA]). Te same antysensowne ohgodezoksynukleotydy nie wywierają wpływu na tworzenie się koloni erytroidów łub granulomakrofagów.

Nie wiadomo w dalszym ciągu, czy mpl bezpośrednio wiąże hgand oraz czy czynnik surowicy, który jak to wykazano, powoduje megakariocytopoezę, działa poprzez mpl. Zasugerowano jednak, że gdyby mpl bezpośrednio wiązał hgand, to jego sekwencja aminokwasów byłaby prawdopodobnie wysoce zachowana i zawierała elementy krzyżowo reagujące z uwagi na znaczną identyczność sekwencji między ludzkimi i mysimi pozakomórkowymi domenami mpl (Vigon i inni, supra [1993]).

VII Cele

W świetle powyższego zrozumiałe jest, że istnieje aktualne i stałe zapotrzebowanie na wydzielenie i identyfikację cząsteczek zdolnych do pobudzania proliferacji, różnicowania I dojrzewania komórek hematopoetycznych, zwłaszcza megakanocytów lub ich przodków, do zastosowań terapeutycznych w leczeniu małopłytkowości. Uważa się, że taka cząsteczka jest hgandem mpl; w związku z tym istnieje również zapotrzebowanie na wydzielenie takiego ligandu (hgandów) oraz określenie jego (ich) roli we wzroście i różnicowaniu komórek.

W związku z tym celem wynalazku jest uzyskanie farmaceutycznie czystej cząsteczki zdolnej do pobudzania proliferacji, różnicowania i/lub dojrzewania megakariocytów do dojrzałej formy wytwarzającej płytki

Innym celem jest dostarczenie cząsteczki w postaci umożliwiającej jej terapeutyczne zastosowanie w leczeniu zaburzenia hematopoetycznego, a zwłaszcza małopłytkowości. Kolejnym celem wynalazku jest wydzielenie, oczyszczenie i specyficzne zidentyfikowanie białkowych ligandów zdolnych do wiązania in vivo receptorów z superrodziny cytokin znanych jako mpl i do przenoszenia sygnału prohferacyjnego.

Kolejnym celem jest dostarczenie cząstek kwasów nukleinowych kodujących takie ligandy białkowe zastosowanie tych cząsteczek kwasów nukleinowych do wytwarzania hgandów wiążących mpl w hodowli zrekombinowanych komórek w celach diagnostycznych i terapeutycznych.

Innym celem jest dostarczenie pochodnych lub zmodyfikowanych form hgandów białkowych obejmujących warianty sekwencji aminokwasów, wariantowe formy ghkoprotein i ich kowalencyjne pochodne.

Dodatkowym celem jest dostarczenie form fuzyjnego polipeptydu łączących hgand mpl i heterologiczne białko oraz jego kowalencyjne pochodne.

Dodatkowym celem jest również dostarczenie wariantowych form polipeptydu łączących hgand mpl z addycjami i podstawieniami aminokwasów z sekwencji EPO, tak aby uzyskać białko zdolne do regulowania proliferacji i wzrostu zarówno płytek krwi jak i przodków czerwonych ciałek krwi. Innym dodatkowym celem jest wytworzenie immunogenów do hodowania przeciwciał przeciw ligandom mpl lub ich form fuzyjnych, a także wytworzenie przeciwciał zdolnych do wiązania takich hgandów.

Te i inne cele wynalazku staną się oczywiste dla specjalisty po zapoznaniu się z całością opisu.

180 765