LU85835A1 - Polypeptide physiologiquement actif humain,acide desoxyribonucleique comprenant une sequence de base codant ce polypeptide,procede de production de ce polypeptide,et composition pharmaceutique le contenant - Google Patents
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Description
* » , xr ïf
La présente invention se rapporte à un acide désoxyribonucléique (appelé ci-après "ADN") codant un nouveau polypetide physiologiquement actif pour les êtres humains. L'invention se rapporte également à un ADN re-5 combinant replicable contenant 1'ADN, un micro-organisme ou cellule transformé par l'ADN reco.mbinant replicable un nouveau polypetide physiologiquement actif humain obtenu en exprimant l'ADN , un polypeptide physiologiquement actif sensiblement pur humain 10 ayant la séquence d'acides aminés décrite ici, des composi-t tions pharmaceutiques contenant le polypeptide physiologi quement actif en tant qu'ingrédient efficace, et un procédé r de production du polypeptide physiologiquement actif humain . Plus particulièrement, la présente 15 invention concerne un ADN codant FNT humain (Factum de Nécrose de la Tumeur), FNT humain ayant une séquence d'acides aminés déduite de la séquence de base de l'ADN, un procédé de production de FNT humain à partir de l'ADN en utilisant la technologie de l'ADN recombinant et 20 l'utilisation du produit obtenu par le procédé.
Dans la présente description, les acides aminés et les peptides sont représentés en utilisant des abréviations, comme indiquées ci-dessous, approuvées par la Commission IUPAC-IUB sur la Nomenclature Biochimique (CBN). Par * 25 ailleurs, pour les acides aminés et analogues ayant des isomères, ceux représentés par les abréviations qui suivent sont de la configuration L à moins que cela ne soit spécifié , autrement.
U i / il l,; 2 k * j Λ Gin : résidu de glutamine i Asp : résidu d'acide aspartique I" f Φ Pro’: résidu de proline m 9»
Fi Tyr : résidu de tyrosine i ï ^ 5 _ Val : résidu de valine j] Lys: résidu de lysine $ Glu : résidu de l'acide glutamique IAla î résidu d'alanine
Asn : résidu d'asparagine 10 Leu : résidu de leucine
Phe : résidu de phénylalanine Gly : résidu de glycine j His : résidu d'histidine ! Ser : résidu de sérine i 15 Thr : résidu de thréonine
Ile : résidu d'isoleucine ; i '.j Trp : résidu de tryptophane ; r Arg : résidu d'argmine
Il Met : résidu de méthionine j| ' 20 Cys : résidu de cystéine, j Les polydésoxyribonucléotides et oligodésoxyribo- i nucléotides sont représentés par les séquences des résidus de désoxynucléotide qui ont les abréviations qui suivent : , '1 j A : résidu d'acide 21-désoxyadénylique 25 C : résidu d'acide 2'-désoxycytidylique G trésidu d'acide 2 '-désoxyguanylique îj T : résidu d'acide thymidylique
N
Il A moins que cela ne soit spécifié autrement, l'extré- j; mité gauche de la séquence des désoxvnucléotides est l'ex- I ' I j 30 trémité 5'.
Lj On connaît diverses substances ayant la capacité de ; \ j| _ stimuler le système réticulo-endothélial, par exemple, les substances physiologiquement actives ayant une activité 1 . anti-tumeur qui sont induites par diverses bactéries Gram 35 positif et endotoxines. Plus particulièrement, Carswell et 3
* autres ont découvert que le sérum de la souris suisse CD-I
infectée du bacilles de Calmette-guérin (BCG) et au bout I, de deux semaines, avec ensuite injection intraveineuse d'endotoxine, avait une activité cytotoxique contre les % - 5 - cellules L en culture et ont également découvert un phénomène selon lequel il induisait la nécrose hémorragique du sarcome Meth A transplanté chez la souris (BALB/c x C57BL/6)F^ . Ils ont donné le nom de FNT (facteur de nécrose de tumeur) à la substance active dans le sérum £ Proc. Nat. Acad. Sci.EUA , 10 Vol. 72 (N° 9), pages 3666-3670 (1975)]. Ensuite, Ruff et autres ont rapporté que le FNT du lapin préparé selon la ; méthode ci-dessus mentionnée proposée par Carswell et autres était purifié environ 2.000 fois par rapport au sérum (J. Immunol. , Vol. 125 (N° 4), pages 1671-1677 (1980)).
15 Par ailleurs, Matthews et autres ont rapporté que le FNT du lapin était purifié à environ 1.000 fois par rapport au sérum ]ßr. J. Cancer, Vol. 42, pages 416-422 (1980)3 · ~ Cependant, dans les ouvrages de Ruff et autres et de Matthews et autres, l'effet de nécrose de la tumeur par rapport à FNT Z 20 purifié n'est pas confirmé dans des expériences sur animaux.
La divulgation du brevet japonais N° 57-140725 (1982) i j révèle un procédé pour isoler et purifier une substance I physiologiquement active protéinée ayant une activité anti- I tumeur, qui est induite en administrant à un mammifère tel 25 qu'une souris, un lapin ou un cobaye, au moins une substance ayant la capacité de stimuler le système réticulo-endothélial I puis en injectant l'endotoxine d'une bactérie Gram négatif S au mammifère, ou en ajoutant l'endotoxine d'une bactérie | Gram négatif à une culture de tissus contenant les macrophages ! 30 activés d'un mammifère. Dans cette description de brevet j japonais, sont également révélés le poids moléculaire et le | ; point isoélectrique de la substance physiologiquement active protéinée purifiée (poids moléculaire, 39000+ 5000 en mesurant par filtration sur gel et électrophorèse au gel de poly-35 acrylamide-SDS; point isoélectrique, pH 3,9+0,3 en mesurant /
-.J
* 4 par focalisation isoélectrique) mais aucune structure détaillée de la substance physiologiquement active protéinée.
_ Par ailleurs-, Matthews a rapporté que l'on obtenait une substance ayant ‘une activité cytotoxique contreles 5 cellules L par un procédé où l'on injecte BCG à un lapin et des phagocytes mononucléaires de divers tissus du lapin sont obtenus deux semaines après l'injection, avec ensuite addition d'endotoxine à la culture des cellules des phagocytes mononucléaires £ Br. J. Cancer, Vol. 44 (3), pages 10 418-424 (1981) . Cependant, dans son rapport, la structure détaillée de la substance obtenue n'est pas révélée et par ailleurs, il n'y a aucune évidence montrant que la substance obtenue est identique à FNT que l'on trouve dans le sérum.
Par ailleurs, il y a un certain nombre de publica-15 tions imprimées rapportant des facteurs ayant une bioactivité ressemblant à FNT, ou une bio-activité semblable a celle de FNT. Par exemple, Reed et autres ont trouvé un tel facteur dans des macrophages et analogues présents dans le sang périphérique humain £ J. Immunology, Vol. 115, 20 page 395 (1975) , Matthews et autres dans des cellules de leucémie dérivées des monocytes du sang périphérique humain ou d'un patient souffrant de leucémie monocytique myélogène \_Immunology, Vol. 44, page 135 (1981) , D. Barbara dans les cellules humaines B transformées par le virus de 25 Epstein-barr [ Proc. Nat. Acad. Sci.EUA ,
Vol. 80 , page 5397 (1983/"],’ et B. Bharat dans la ligne de cellules de lymphoblastoïdes 1788 . Les facteurs ci-dessus mentionnés sont également 30 révélés dans les descriptions de brevets japonais N°s 58-15921 (1983), 58-21621 (1983), 58-107197 (1983) et 58-225024 (1983) et les descriptions de brevets britanniques N°s 2 106 117 et 2 117 385. Cependant, les cellules ou lignes de cellules pouvant efficacement produire 35 de tels facteurs n'ont pas encore été trouvées. Par ailleurs, / / *· 5 en ce qui concerne ces facteurs, il y a de nombreux points à élucider, comme leur structure et leurs propriétés.
- Ito ([ Brevet japonais N° 58-251817 (1983) 3 a effectué des études sur les propriétés et la structure de ^ - 5 -FNT du lapin et des cellules produisant FNT du lapin. Par suite, il a obtenu des cellules capables de produire une substance ayant une activité cytotoxique contre les cellules L en administrant une substance ayant la capacité de stimuler le système réticulo-endothélial à un lapin, avec ensuite 10 injection d'endotoxine dérivée d'une bactérie dans le lapin, et a obtenu ensuite une telle substance en utilisant les cellules L . Il a également affirmé que le poids moléculaire et les propriétés immunologiques de la substance ayant une activité cytotoxique contre les cellules L obtenue en 15 utilisant les cellules obtenues ci-dessus étaient en accord avec ceux de FNT obtenu du sérum du lapin. Par ailleurs, avec la progression des techniques de manipulation génétique , il est devenu possible de déterminer la structure d'une protéine tant qu'un ADN codant la protéine est - 20 obtenu sous forme isolée. Cela est ainsi parce que la structure de l'ADN isolé peut être déterminée et alors, la structure de la protéine peut être déduite de la structure de l'ADN. Par ailleurs, il est devenu possible de produire une protéine à partir d'un ADN codant la protéine 25 en utilisant une culture de micro-organismes ou de cellules. Ito a appliqué les techniques de manipulation génétique ci-dessus mentionnées aux cellules capables de produire une substance ayant une activité cytotoxique contre les cellules L. Par suite, il a réussi à isoler un AD‘\ 30 codant le FNT du lapin, à déterminer les structures de l'ADN et du FNT du lapin et à produire le FNT du lapin en utilisant l'ADN.
Comme cela est apparent par ce qui précède, Ito a bien réussi dans la production de FNT du lapin. Cependant, 35 il faut noter que l'administration de FNT à un animal qui L·.
* 6 n'est pas l'origine de FNT présente un danger de provoquer un choc anaphylactique. Cela est ainsi parce que FNT est un polypeptide et par conséquent lorsque l'on administre FNT à un animal qui n'est pas l'origine de FNT, FNT fonctionne v - 5 · en tant qu*antigène pour produire un anticorps. Pour cette raison, lorsque FNT est destiné à être administré à un corps humain , l'utilisation de FNT dérivé d’êtres humains est tout à fait préférable. Cependant, même la structure de FNT humain n'a pas encore été élucidée avec succès. Par consé-10 quent, la détermination de la structure de l'ADN codantFNT humain est fortement nécessaire.
Les présents inventeurs ont effectué des études intensives sur la structure de l'ADN codant FNT humain. Par suite, les présents inventeurs ont trouvé de 15 manière surprenante qu'un gène de polypeptide humain et un gène de FNT de lapin peuvent être clonés en utilisant ADNc du lapin comme échantillon, que l'ADN brut codant le i polypeptide humain peut être isolé avec soin et que sa structure peut être déterminée par comparaison entre le gène l 20 de FNT du lapin, le gène de polypeptide humain et l'ADNc du lapin par rapport à l'homologie de leurs séquences de base , que la structure de l'ADN pur codant' le polypeptide humain peut être déterminée soigneusement et un tel ADN pur peut être obtenu et -qu'un polypeptide humain produit 25 en utilisant . l'ADN codant le polypeptide humain aune activité cytotoxique contre les cellules L.
La présente invention est basée sur ces nouvelles découvertes.
Par conséquent, la présente invention a pour objet 30 un polypeptide humain physiologiquement actif.
La présente invention a pour autre objet un ADN codant FNT humain.
La présente invention a pour autre objet un ADN recombinant réplicable comprenant un ADN codant 35 FNT humain et un véhicule d'expression replicable.
/ i 7 λ
La présente invention a pour autre objet un micro-organisme ou une cellule transformé par un ADN recombinant î» du type ci-dessus mentionné.
La présente invention a pour autre objet un procédé v - 5 .de production d'un polypeptide physiologiquement actif du type ci-dessus décrit.
L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative 10 qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention et dans lesquels :
- la figure 1 illustre les cartes de res-15 triction de plasmides,contenant chacune un ADN
codant un polypeptide physiologiquement actif conventionnel du lapin; v - la figure 2 illustre l'organigramme du procédé de préparation d'un ADN recombinant (pFNT-lac-1) i 20 codant le polypeptide physiologiquement actif du lapin conventionnel; - la figure 3 montre l'organigramme du procédé de préparation d'un autre ADN recombinant (pFNT-l_acU\/5-l ) codant le polypeptide physiologiquement actif 25 conventionnel du lapin; - la figure 4 montre la carte de restriction de la portion d'un plasmide contenant un gène pour un polypeptide physiologiquement actif humain de la présente invention; - la figure 5 illustre la carte de restriction de la 30 portion d'un plasmide contenant un gène pour un polypeptide physiologiquement actif de lapin conventionnel; - la figure 6 montre l'organigramme du procédé de préparation d'un ADN recombinant CpHFNT-lacUV5-i __ codantun polypeptide physiologiquement actif humain de la 35 présente invention; et / ' 8 - la figure 7 montre l'organigramme du procédé de préparation d'un autre ADN recombinant (pHFNT- > lacUV5-2 ) codant le polypeptide physiologiquement actif humain de la présente invention.
> 5 - - Essentiellement, selon la présente invention, on prévoit un polypeptide physiologiquement actif humain ayant une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) qui suit; 10 5er 5er Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val
Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr 15 His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tvr Gin Thr Lys Val Asn
Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cvs Gin Arg Glu Thr Pro Glu
Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly ς Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn
Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe : 20 Gly Ile Ile Ala Leu où Gin indique un résidu de glutamine, Asp un résidu d'acide aspartique, Pro un résidu de proline, Tyr un résidu de tyrosine, Val un 25 résidu de valine, Lys un résidu de lysine, Glu un résidu d'acide glutamique, Ala un résidu d'alanine, Asn un résidu d'asparagine, Leu un résidu de leucine, Phe un résidu de phénylalanine, Gly un résidu de glycine, His 30 un résidu d'histidine, Ser un résidu de sérine,
Thr un résidu de thréonine, Ile un résidu d'iso-„ leucine, Trp un résidu de tryptophane, Arg un résidu d'arginine, Met un résidu de méthionine / f :-. 9 ) et Cys un résidu de cystéine.
. Le polypeptide physiologiquement actif humain v de la présente invention comprend également un polypeptide ayant un acide aminé méthionine attaché au ^ 5 terminus N de la séquence ci-dessus mentionnée d'acides aminés et un intermédiaire ayant un signal partiel ou entier de peptide pour FNT humain attaché au terminus N de la séquence ci-dessus mentionnée d'acides aminés.
Il est possible de changer une partie de la structure 10 d'un ADN codant un polypeptide par mutation naturelle ou artificielle sans changement significatif de l'activité du polypeptide . Le polypeptide physiologiquement actif humain de la présente invention comprend un polypeptide ayant une structure correspondant à la ou aux variantes 15 homologues du polypeptide ayant la séquence ci-dessus mentionnée des anses aminés. Tous ces polypeptides physiologiquement actifs seront appelés ci-après "FNT humain".
Selon un autre aspect de la présente invention, 20 on prévoit un acide désoxyribonucléique comprenant une séquence de bases codant un polypeptide physiologiquement actif humain.
10
Ledit polypeptide physiologiquement actif humain ayant une séquence d'acides aminés représentée par la z formule (I) qui suit :
Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val -e .. 5. Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg
Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin
Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val
Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr
His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn 10 Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu
Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly
Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn
Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe
Gly Ile Ile Ala Leu 15 où Gin indique un résidu de glutamine, Asp un résidu d'acide aspartique, Pro un résidu de proline, Tyr un résidu ae tyrosine, Val un résidu de valine, Lys un résidu de lysine, Glu un résidu d'acide glutamique, Ala un résider d'a-lanine, Asn un résidu d'asparagine, 20 Leu tin résidu de leucine, Phe un résidu de phényl- alanine, Gly un résidu de glycine, His un résidu d'histidine, 5er un résidu de sérine, thr un résidu de thréonine, Ile un résidu d1isoleucine, Trp un résidu de tryptophane , Arg un résidu d'arginine, 25 Met un résidu de méthionine et Cys un résidu de cystéine.
Selon un autre aspect de la présente invention, on prévoit un acide désoxyribonucléique comprenant au moins une séquence de base choisie dans le groupe consistant en 30 une séquence de base représentée par la formule (II) qui suit et une séquence de base complémentaire de ladite séquence de base : ! »t 11
TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA
GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG
£ GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC
-ç . 5 CTC TIC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC
CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC
CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG
GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG
GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT
10 CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT
GGG ATC ATT GCC CTG
où A indique un résidu d'acide désoxyadénylique, G un résidu d'acide désoxyguanylique, C un résidu d'acide désoxycytidylique et T un résidu d'acide 15 thymidylique et où l'extrémité gauche et l'extrémité droite de la formule (II Représentent le côté du groupe 5'-hydroxyle et le côté du groupe 3'-hydroxyle respectivement.
L'ADN de la présente invention comprend un ADN î. 20 comprenant une séquence de base ayant ATG (A, T et G sont tels que mentionnés ci-dessus) attaché à l'extrémité 5' de la séquence de base ci-dessus mentionnée afin de produire du FNT humain mûr au moyen d'une culture d'un micro-organisme ou d'une cellule. L'ADN de la présente, invention comprend égale-25 ment un ADN ayant un ADN à côté de la position 5' codant un signal partiel ou entier de peptide de FNT humain.
La structure d’un ADN et la structure du polypeptide qui en est déduite peuvent être partiellement changées par mutation naturelle ou artificielle sans provoquer un change-30 ment de l'activité principale du polypeptide. Par conséquent, 1'ADN de la présente invention peut alternativement avoir une séquence de base qui code un polypeptide ayant une structure correspondant à celle d'une variante homologue de l'un des polypeptides ci-dessus.
35 Selon la dégénération du code génétique, il est
H
12 I possible de substituer au moins une base de la séquence de base d'un gène par une autre sorte de base sans forcer la ^ séquence des acides aminés du polypeptide produit à partir du gène à changer. Par conséquent, 1'ADN de la présente ^ ' 5 invention peut également avoir toute séquence de base qui a été changée par substitution selon la dégénération du code génétique. Dans ce cas, la séquence des acides aminés déduite I de la séquence de base obtenue par la substitution ci-dessus mentionnée est identique à la séquence des acides aminés de 10 formule (i )telle que définie précédemment.
Selon un autre aspect de la présente invention, on prévoit un ADN recombinant replicable qui comprend l'acide désoxyribonucléique ci-dessus mentionné selon la présente »
| invention et un véhicule d'expression replicable . L1 ADN
15 recombinant est capable, dans une culture de cellule ou de | micro-organisme transformée, d'exprimer un polypeptide comprenant la séquence des acides aminés de FNT humain.
* Comme véhicule approprié, on peut mentionner, par exemple, les véhicules d'expression pHF\T-lacU\/5-l et pHFNT-i - 20 lacUV5-2.
Par ailleurs, la présente invention est dirigée vers une culture d'un micro-organisme ou d'une cellule transformée par un ADN recombinant capable d'exprimer un polypeptide i comprenant-la séquence des acides aminés de FNT humain. Des 25 exemples d'une telle culture de micro-organisme ou de cellule comprend Esche richia coli, Bacillus subtilis, des levures et des cellules animales supérieures.
; Selon un autre aspect de l'invention , on prévoit un : procédé de production du polypeptide physiologiquement actif j 30 humain de la présente invention qui comprend : ' (a) la liaison de l'acide désoxyribonucléique de la formule (II) ci-dessus définie à un véhicule d'expression replicable pour obtenir un ADN recombinant réplicable - comprenant ledit acide désoxyribonucléique et ledit véhicule • 35 d'expression replicable ; /> / * 13 (b) la transformation de cellules d'une culture de micro-organisme ou de cellule par ledit ADN recombinant „ replicable pour former des transformants; (c) le choix desdits transformants de cellules 5 parentes de la culture de micro-organisme ou de cellule; (d) l'incubation desdits transformants, forçant lesdits transformants à exprimer ledit acide désoxyribonucléique et à produire un polypeptide physiologiquemerït actif humain; et 10 (e) l'isolement dudit polypeptide physiologiquement actif humain des transformants incubés.
Selon le procédé de la présente invention, l'acide polydésoxyribonucléique ci-dessus décrit de la présente invention est lié à un véhicule d'expression réplica-15 cable en tant que vecteur pour obtenir un ADN recombinant réplicable contenant l'acide polydésoxyribonucléique ci-dessus mentionné. Une culture de micro-organisme ou de cellule est transformée par 1'ADN recombinant réplicabie ainsi obtenu pour obtenir une culture de micro-organisme ou 20 de cellule transformée contenant l'ADN recombinant. Le transformant ainsi obtenu est isolé de la culture de micro-organisme ou de cellule parente au moyen d'un trait phéno- -typique imparti avec l'ADN. On fait croître la culture transformée ainsi obtenue de micro-organisme ou de cellule 25 pour effectuer l'expression de l'information génétique qui est codée sur l'acide désoxyribonucléique ci-dessus mentionné, pour ainsi produire un polypeptide physiologiquement actif selon la présente invention.
Par ailleurs, la présente invention est dirigée vers 30 un FNT humain sous forme mûre, sécrété de cellules hôtes en tant que produit d'expression directe. Comme procédé pour obtenir un tel FNT humain mûr, on peut mentionner par exemple un procédé consistant à construire une séquence d'ADN afin de lier une séquence d'acides aminés connue comme un peptide 35 signal, composée de 15 à AO acides aminés qui est dérivée / i i i l i i.
1·+* * 14 d'un micro-organisme ou animal supérieur au terminus de la séquence d'acides aminés du FNT mûr.
5 Le FNT humain peut être obtenu comme suit : l.On a utilisé une génothèque bactériophage X/lapin V „ 5. et une génothèque bactériophage A. /humain préparées par le
Professeur T. Maniatis, Département de Biochimie et Biologie Moléculaires,Université de Harvard, 7 Divinity Avenue, Cambridge, Massachusetts 02138, E.U.A. . Ces matériaux i peuvent être préparés selon les processus qui suivent [.voir | 10 Cell, 13, page 687 (1978)"}: j 1. des tissus de lapin ou humains, par i exemple du tissu de pancréas de lapin ou humain, sont
] réduits en poudre gelée et traités pour digérer l'ARN
| et des matériaux de protéine et donnent, à la préci- || 15 pitation, de 1 ' ADN de lapin ou humain de fort poids moléculaire ; 2. l'ADN de fort poids moléculaire est partiellement digéré pour une coupe statistique par rapport au lieu du gène; 20 '3. les fragments résultants d'ADN sont frac- ! tionnés pour donner des fragments de 15 à 20 kilo i; paires de bases (kb) ; i ij 4. Les fragments résultants de l'étape 3 sont clonés en utilisant un vecteur phagique^ Charon 4A ; et 25 5. les vecteurs résultants sont conditionnés in vitro en particules phagiques infectieuses contenant i; ADNr pour obtenir la génothèque de lapin ou humaine i! ci-dessus mentionnée.
" 2. L'ADNc de FNT du lapin que l'on obtient à l'exemple 32 ;i 30 de référence 3 est marqué p par la méthode de translation il de P.W.J. Rigby et autres|yoir J. Mol. Biol.113, page 237 (1977)].
I; _ 3- Chacune des génothèques bactériophage AVlapin et bactériophage Λ/humain est plaquée à une confluence virtuelle sur un tamis de bactéries et l'hybridation est 32 i 35 examinée avec 1'ADNc de FNT du lapin marqué p.
S
h /7 * 15 4. A partir des clones appropriés, l'ADN correspondant est isolé, mis en carte de restriction et analysé par ; hybridation de Southern [_voir E.M. Southern , J. Mol. Biol.
98, page 503 (1975)].
^ - 5 . - Des fragments de restriction contenant des gènes de FNT de lapin ou humains sont sous-clonés en vecteurs plas-midiques puis séquencés.
5. La séquence de base de 1'ADNc de FNT du lapin est comparée à celle du gène de FNT du lapin pour déterminer les 10 exons (certaines séquences de bases qui codent la séquence d'acides aminés du FNT du lapin) et introns (certaines séquences de basesqui ne codent pas la séquence d'acides aminés du FNT du lapin ) du gène de FNT du lapin.
6. Ensuite, la séquence de basesdu gène de FNT humain 15 est comparée à celle du gène de FNT du lapin pour déterminer les exons et les introns du gène de FNT humain.
7. La séquence des acides aminés d FNT du lapin qui - a été déduite de la séquence de basesobtenue en laissant les introns du gène du FNT du lapin et en combinant ses
20 exons est affirmée comme étant en accord avec celle déduite de la séquence de base de l'ADNc de FNT du lapin. Ensuite, la séquence des acides aminés de FNT humain est déduite de la séquence de bases de l'ADN codant FNT humain obtenue en laissant les introns du gène de FNT „humain et en 25 combinant ses exons. La séquence des acides aminés de FNT
humain est affirmée comme étant partiellement en accord avec celle du FNT du lapin.
9. Alors, l'ADN codant le FNT humain est déterminé in vitro pour insertion dans un véhicule d'ex-30 pression approprié pour reformer l'ADN recombinant contenant l'ADN de codage. L'ADN recombinant est utilisé pour transformer une cellule hôte appropriée qu'à son tour, on laisse croître dans une culture et pour exprimer 2e FNT humain - souhaité.
35 10. Le FNT humain ainsi produit a 155 résidus /7
II
16 I d'acide aminé sous sa forme mûre, commençant par la sérine.
Lorsqu'il a un signal peptide dans sa préséquence , le 5 signal peptide est de caractère très hydrophobe.
Ce qui précède révèle les processus pour obtenir le * , 5 gène jje FNT humain, la séquence de base de l'ADN
codant le FNT humain et le procédé de production du FNT humain en utilisant l'ADN. Cependant, on comprendra que ce qui . précède n'est pas destiné à limiter l'invention et que des ! changements évidents peuvent être apportés par ceux qui ; 10 sont compétents en la matière sans changer les caractéris tiques essentielles et le concept de base de l'invention.
' Du fait de la fréquence variable d'utilisation d'un ; codon (code génétique) correspondant à chaque acide aminé ; et pour d'autres raisons, une partie partielle ou totale 15 de la séquence de base de l'ADN codant le FNT humain peut être substituée par un ADN artificiel organique chimiquement synthétisé sans forcer la séquence des acides aminés Cu polypeptide qui en est obtenu à changer.
On suppose que le FNT humain peut être produit intra-^ 20 cellulairement sous forme immature en tant que prépeptide ou prépropept.ide, que l'on peut faire croître par une forme intermédiaire en un FNT mûr au stade de traitement. La forme immature du FNT humain peut être déduite de la séquence de base du gène de FNT humain. L'ADN de FNT compre-25 nant un ADN codant le FNT sous forme immature ou intermédiaire peut également être recombiné à un ADN naturel ou artificiellement synthétisé.
Une application de cette technique peut être atteinte en insérant le codon méthionine 'ATGj dans l'extrémité 5' 30 et en insérant au moins un codon d'arrêt choisi parmi TAA, TAG et TGA à l'extrémité 3' de l'ADN de FNT mûr ou intermédiaire ou immature. Du fait de la présence du codon de méthionine, le FNT mûr ou intermédiaire ou immature peut être produit sur le ARNm synthétisé à l'aide d'un promoteur 35 approprié. Cependant, le résidu de méthionine attaché au / 17 ' Λ tri terminus N du ΓΝΤ est scindé ou non scindé selon la sorte de la cellule hôte employée. L'insertion du codon d'arrêt a c pour but d'arrêter la translation de l'ARNm transcrit de 1 ' ADN du FNT en une position appr-opriée (terminus C du ; - 5 - polypeptide de formule I).
Une autre application de cette technique peut être atteinte en ajoutant , à l'ADN, une séquence de base très hydrophobe connue par "séquence du signal". Par cette addition, il peut devenir possible de sécréter le FNT vers 10 l’extérieur de la cellule hôte, ou dans le cas d'une bactérie Gram-négatif, dans l'espace connu par "périplasme".
Lorsqu'un vecteur où un codon de départ est incorporé est employé , un peptide fondu peut être produit qui comprend le FNT humain et un peptide attribué au vecteur.
15 Dans ce cas, le peptide fondu peut être scindé chimiquement ou enzymatiquement. Alternativement, le peptide fondu, si l'activité principaledu FNT humain n'est pas affectée de manière néfaste, peut être utilisé tel qu'il est.
L'ADN de FNT humain peut être connecté, à sa région „ 20 en amont de l'extrémité 5', à la séquence génétique d'un promoteur pour ainsi obtenir une séquence promoteur-ADN de FNT qui ne gêne pas sa réplication et n'affecte pas de manière néfaste la translation de l'ARN résultant. La séquence promoteur-ADN de FNT ainsi obtenue peut être 25 combinée à un vecteur qui est réplicable dans une bactérie ou une cellule d'organisme supérieur pour obtenir un gène recombinant. Le gène recombinant ainsi obtenu peut être utilisé pour transformer une bactérie ou une cellule d'organisme supérieur utilisée comme hôte. Le transformant 30 ainsi obtenu peut être mis en culture pour effectuer l'expression du gène de FNT afin de produire le FNT humain.
Lorsque l'on utilise Escherichia coli comme hôte ci-dessus mentionné, on peut mentionner, comme hôte approprié, diverses souches mutantes de E. coli K-12 comme HB101 (ATCC 35 33694), C600K(ATCC33955 ), D1210, RRI(ATCC31343), MC1061, / r •·ν .1 i 18 j. LE392 (ATCC33572), JM101 (ATCC33876), et χ 1776 (ATCC31244) . Lorsque l’on emploie E. coli comme hôte, on peut mentionner, -comme vecteur approprié, des plasmides comme pBR322, pBR325, pBR327 , pUC8 > pUC9, 1 ” 5 pMB9 * (ATCC37019) , pJB8 (ATCC37074 ) et pKC7 (ATCC37084), I des A. phages comme Agt , AB et Charon 4A, et M13 phage. Pour que FNT soit produit dans la cellule de E. coli , un promoteur choisi parmi les promoteurs des gènes de E. coli et phagiques peut être employé. Des 10 exemples d'un promoteur approprié comprennent les gènes pour l'enzyme de la dégradation du lactose (LAC) , son mutant UV5 , la pénicillinase (BLA) et la tryptophane
Isynthétase (TRP), le promoteur de A phage P^ et le promoteur tac qui est un promoteur fondu de tryptophane 15 synthétase et de l'enzyme de dégradation du lactose.
* Lorsque l'on utilise Bacillus subtilis comme hôte, j on peut mentionner, comme hôte approprié, la souche | ’ BD170 ( ATCC33608 )y = la souche BR151 (ATCC33677) et la j souche MI112 (ATCC33712) . Lorsque l'on emploie l'hôte !20 Bacillus subtilis , on peut mentionner, comme vecteur approprié, les plasmides pC194 (ATCC37034 ), pUBllO | (ATCC37015), p5A2100 (ATCC37014) et pE194 . Par ailleurs, lorsque l'on emploie l'hôte Bacillus susbtilis , , i1! on peut mentionner, comme promoteur approprié, les 25 gènes pour l'enzyme de l'acétylation du chloramphénicol ;! (CAT), la pénicillinase et 1 1 anti-éry thromycine.
$ | Lorsqu'une levure est utilisée comme l'hôte, 13 on peut mentionner, comme hôte approprié, des souches
H
Ü de Saccharomyces cerevisiae comme RH218 (ATCC44076J, 3 30 SHY1 (ATCC44769), 5HY3 (ATCC44771), D131A, 4B3 et 830.
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Lorsque la levure hôte est employée, on peut mentionner, comme vecteur approprié, des plasmides comme YEpl3 (ATCC37115), YEp6 , YRp7 et YIp5 . Par ailleurs, lorsque la levure hôte est employée on peut mentionner, 5 comme' promoteur approprié, les gènes pour la phosphatase acide, l'alcool déshydrogénase (ADHI), la tryptophane synthétase (TRP) , la phosphoglycérate kinase (PGK) , le cytochrome B (COB) et l'actine.
Lorsqu'une culture de cellule d'un organisme 10 supérieur est utilisée pour l'hôte, on peut mentionner, comme hôte approprié, les cultures de cellule du rein du singe, COS et la souris C127 (ATCC 1616). Lorsque l'hôte de culture de cellule d'organisme supérieur est employé, on peut mentionner, comme vecteur approprié, 13 SV40 et le virus du polyome du bovin.
Le nouveau polypeptide physiologiquement actif humain selon la présente invention induit la nécrose des tumeurs sans effet toxique sur les tissus normaux du corps vivant. Le polypeptide actif de la présente 20 invention peut être formulé selon des méthodes connues pour préparer des compositions pharmaceutiques qui sont utiles pour l'inhibition de la prolifération des cellules, comme la prolifération des cellules de tumeur maligne.
Le polypeptide actif peut être combiné en mélange avec 23 un véhicule de support acceptable en pharmacie. Une quantité efficace du polypeptide actif de la présente invention eput être mélangée à une quantité appropriée d'un véhicule afin de préparer des compositions pharma-ceutiquement acceptables appropriées à une administration 30 effective au destinataire.
Le polypeptide physiologiquement actif de la présente invention peut être administré, à des sujets
L
20- nécessitant un traitement anti-tumeur ou antiviral, sous la forme d'une injection, de goutte oculaires, de goutte nasales î d'un agent d'inhalation, d'une préparation externe, d'une administration orale, d'une administration rectale ou d'un î. - 5 comprimé vaginal. La dose quotidienne du polypeptide de la présente invention par adulte peut généralement être comprise entre 50 et 100.000.000 d'unités. Elle peut être préférable entre 50 et 500.000 unités dans le cas d'une administration locale, entre 1.000 et 1.000.000 d'unités 10 dans le cas d'une injection générale comme une injection intraveineuse et une injection intramusculaire, et entre 10.000 et 100.000.000 d'unités dans le cas d'une administration orale. La dose quotidienne peut être accrue ou diminuée selon la direction d'utilisation et les symptômes 15 du destinataire.
La terminologie " 1 unité" utilisée ci-dessus signifie une quantité du polypeptide physiologiquement ; actif de la présente invention par laquelle 50¾ de 1 x 10^ cellules/ml de cellules L-M (American Type Culture 20 Collection CCL 1,2) sont tuées. La quantité ci-dessus mentionnée est mesurée comme suit. Comme récipients de culture, on emploie des plaques de microtitrage à 96 puits, produites par Flow Laboratories, Inc.(E.U.A.) et des cellules L-M sont mises en culture dans un milieu essentiel minimum de Eagle 25 contenant 1 v/v % de sérum foetal bovin £ la composition de ce milieu est décrite par exemple dans Tissue Culture, édité par Junnosuke Nakai et autres, Asakura Shoten, Japon (1967 )^ . Un échantillon (0,1 ml) dilué en série avec le milieu et la suspension de cellules L-M (0,1 ml, 1 x 105 cellules/ml) sont 30 mélangés dans chaque puits des plaques et les plaques sont incubées à 37°C pendant 48 heures dans de l'air contenant 5¾ de gaz carbonique. A la fin de la période de culture, on ajoute 20 yju-1 de glutaraldéhyde pour fixer les cellules.
Après fixation, les plaques sont lavées avec de l'eau 35 distillée et on les laisse sécher,et l'on ajoute 0,05¾ de / / _ " · 2! bleu de méthylène (0,1 ml)pour teinter les cellules viables. Les plaques sont totalement lavées avec de l'eau distillée „ pour retirer le colorant en excès et on les laisse sécher.
On ajoute de l'acide chlorhydrique à 0,36 N, à chaque puits, 5 pour extraire le colorant des cellules teintées. L'absor-bance de chaque puits à 665 nm est mesurée avec Titertek Multiskan produit par Flow Laboratories, Inc. L'absorbance est proportionnelle au nombre de cellules viables. La quantité ci-dessus mentionnée du polypeptide physiologique-10 ment actif de la présente invention par laquelle 50¾ de 1 x 10^ cellules /ml de L-M sont tuées est obtenue en ! représentant la dilution en fonction de l'absorbance sur f j un graphique.
f
Le polypeptide physiologiquement actif de la 15 présente invention peut être avantageusement administré par voie parentérale. Dans la préparation parentérale, on peut incorporer, comme additif, un agent épaississant comme du saccharose, de la glycérine, de la méthylcellulose, de la carboxyméthylcellulose ou analogue et/ou un agent d'ajuste-20 ment du pH comme divers sels inorganiques. Le polypeptide peut également être administré de manière appropriée sous la forme d'un comprimé. Dans le comprimé, on peut incorporer, comme additif, un véhicule comme de l'amidon, du lactose ou analogue.
25 Par suite d'expériences sur animaux, on a trouvé | qu'une tumeur de souris était totalement guérie par une ou deux injections seulement, dans la plupart des cas. En particulier, une portion des cellules néoplastiques 1 artificielles (cellules Meth-A a été i 30 transplantée à la peau de chaque souris. Lorsque la tumeur a cru pour avoir un diamètre de 6 à 7 mm, on a injecté une | quantité aussi faible que 0,6 g du polypeptide de la présente invention. Une semaine plus tard, il est apparu une ; croûte. Deux semaines plus tard, des poils ont commencé à ? 35 pousser, ce qui signifie une guérison complète de la tumeur.
ρ * f i 4 ! t "i 22
Ultérieurement, une gestation et une naissance réussie j sont observées pour les souris.
La présente invention sera décrite en plus de détail en se référant aux exemples de référence et exemples d'utili-| 5 sation qui suivent, qui ne doivent pas être considérés \ comme limitant le cadre de la présente invention.
Dans la mise en pratique de la présente invention, la construction d’un ADN recombinant et l'insertion d'un | ADN recombinant à un micro-organisme ont été effectuées selon 10 le processus décrit dans les rapports expérimentaux qui suivent £ Littératures (1) à (4)J , à moins que cela ne soit indiqué autrement.
(1) Yasutaka Takagi, Manual For Genetic Engineering, Kodan-sha, Tokyo.
15 (2) Yasutaka Takagi, Experimental Method In Genetic j. Engineering, Kodan-sha, Tokyo.
(3) T. Maniatis , E. F. Fritsch, J. Sam Brook, j Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory,
New York.
20 (4) Ray Wu et autres, Method in Enzymology, Volume 101, Academie Press, New York.
Abréviations utilisées dans les exemples de référence et les exemples : MOPS : acide morpholinopropanesulfonique 25 milieu LB : milieu de Luria-Bertani DMSO : diméthylsulfoxyde PFU : unité formant une plaque ! ' EDTA : acide éthylènediaminetétraacétique SDS : dodécyl sulfate de sodium 50 BRL : Bethesda Research Laboratories Inc.
DMT : diméthoxytrityle lac : lactose
Tris : tris(hydroxvméthyl)aminométhane XAR-5: film aux rayons X fabriqué et vendu par I 35 Eastman Kodak Company, E .U .A.
: f,
, i J
; t
V
-1 ' 23 1 x SSC : 0,15 M NaCl + 0,015 citrate de sodium, pH7 2 x SSC : 0,30 M NaCl + 0,030 M citrate de sodium, - pH7 3 x SSC : 0,45 M NaCl + 0,045 M citrate de sodium, 5 . . pH7 5 x SSC : 0,75 M NaCl + 0,075 M citrate de sodium, pH7 6 x SSC : 0,9 M NaCl + 0,09 M citrate de sodium, pH7 FDSS : 10 50¾ de formamide désionisé + 5 x Denhardt + 5 x SSPE + 0,1 % SDS + 100/cg/ml d'ADN de thymus de veau dénaturé.
(SSPE : 0,18 M NaCl + 10 mM NaH2P04 + |
1 mH EDTA, pH7,4 J
15 SM : milieu de stockage de phages qui contient 5,8 g de NaCl, 2g de MgS04.7H20 , 50 ml de IM Tris.Cl(pH7,5) et 5 ml de 2¾ de gélatine par litre bouillon NZ: milieu qui contient 10 g d'amine NZ, 20 5 g de NaCl et 2 g de MgS04.7H20 (l'amine NZ est un hydrolysat du type A de caséine fabriqué et vendu par Humko Sheffield Chemical Division de Kraft,
Inc, E.U.A.) 25 IPTG : isopropyl thiogalactoside
x-gal: 5-dibromo-4-chloro-3-indolylgalactoside TAE : 0,04 M tris-acétate (p H 8,0 ) - 0,002 M EDTA
solution de 5 X Denhardt : une solution aqueuse contenant Ficoll, 1.000 mg, 30 polyvinylpyrrolidone 1.000 mg et BSA 1.000 mg par litre bp : paire de bases.
{_ ή φ, 24 EXEMPLE REFERENTIEL 1 (Evaluation de l'activité cytotoxique contre les cellules L) L'évaluation de l'activité cytotoxique de la 5 substance physiologiquement active préparée dans les exemples référentiels et exemples qui suivent contre les cellules L est effectuée en mesurant son effet cytotoxique sur les cellules L929 (American Type Culture Collection CCL1 ) , selon la méthode de Ruff et autres Lvoir 10 Lymphokines, volume 2, édité par E. Pick, Academie Press,
New York, page 235 (1980)3 ou la méthode décrite dans 0. Immunol. , 126 , page 235 (1981) .La méthode d'évaluation de l'activité cytotoxique de la substance physiologiquement active préparée dans les exemples sera expliquée 15 ci-après.
Comme récipients de culture, on emploie des plaques de microtitrage à 96 puits, produites par Flow Laboratories, Inc. (E.U.A.) et des cellules L929 sont mises en culture dans le milieu essentiel minimum de Eagle contenant 1 v/v?i 20 et 5 yUg /ml (concentration finale) d ' actinomycine D j[ la composition de ce milieu est décrite par exemple dans Tissue Culture édité par Junnosuke Nakai et autres,
Asakura Shoten, Japon (1967)3* Un échantillon (0,1 ml) dilué en série avec le milieu et la suspension de cellules 25 L — 929 (0,1 ml, 1 x 10^ cellules) sont mélangés dans chaque puits des plaques et les plaques sont incubées à 37°C pendant 21 heures dans de l'air contenant 5% de gaz carbonique. A la fin de la durée de culture, on ajoute 20 jjJL d'une solution aqueuse à 20¾ de 30 glutaraldéhyde pour fixer les cellules. Après fixation, les plaques sont lavées avec de l'eau distillée et on les / —~ 25 laisse sécher, et on ajoute 0,05¾ de bleu de méthylène (0,1 ml) pour colorer, les cellules viables. Les plaques sont totalement lavées avec de l'eau distillée pour retirer le colorant en excès et on les laisse sécher.
5 On ajoute 0,36 N d'acide chlorhydrique, à chaque puits pour extraire le colorant des cellules teintées. L'absorbance de chaque puits à 665 nm est mesurée avec Titertek Multiskan produit par Flow Laboratories , Inc., E.U.A. L'absorbance est proportionnelle au nombre de cellules 10 viables. L'activité cytotoxique de la substance physiologiquement active, unité/ml, est définie comme la dilution réciproque de la substance physiologiquement active qui provoque 50¾ de cytotoxicité, et on peut l'obtenir en représentant la dilution en fonction de l'absorbance sur 15 un graphique. L'"unité 1" utilisée dans les exemples référentiels signifie une quantité du FNT du lapin par laquelle 50¾ de 10^ cellules/ml de cellules L929 sont tuées.
Par ailleurs, la quantité de protéine est déterminée par une méthode dans laquelle du bleu brillant de 20 coomassie G250 est lié à la protéine, selon l'enseignement de Bradford et autres £_voir Anal. Biochem. Volume 72, pages 248-254 (1976) .
EXEMPLE REFERENTIEL 2 Etape 1 25 (Préparation de FNT du sérum du lapin)
Des lapins femelles, pesant 2,5 à 3 kg , reçoivent une injection de 50 mg de Propionibacterium acnes tué à la formaline (Corynebacterium parvum , Wellcome Research Laboratories, Angleterre) par la veine auriculaire. Huit 30 jours plus tard, on injecte de nouveau 100 d'endotoxine (lipopolysaccharide de Escherichia coli 026:B6, produit par Λ / * 26
Difco Laboratories, E.U.A.), à travers la veine auriculaire et 2 heures après le sang entier est recueilli du coeur.
* Ausang recueilli, on .ajoute de l'héparine sodium en une quantité de 100 unités pour 100 ml. Le sang est alors * '5 centri'fugé tout en le refroidissant à 5.000 t/mn pendant 30 minutes pour retirer les cellules du sang et les solides insolubles. Par suite, on obtient un plasma (2,4 litres) ayant une activité cytotoxique de FNT du sérum de 3 x 10H unités/ml, des 40 lapins.
10 Etape 2 (Purification partielle de FNT du sérum du lapin)
Au plasma (2,4 litres) obtenu à l'étape 1, on ajoute 24 g de cellite. Le résultat est agité pendant 1 heure puis est soumis à une filtration. Le filtrat est mélangé à 1,2 litres de 0,94 M de tampon tris-HCl (pH 7,8) puis est appliqué à une colonne de DEAE-Sepharose CL-6B (fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals, Inc, Suède) suffisamment c équilibrée avec 0,04 M de tampon tris-HCl (pH 7,8).
la colonne est lavée avec 0,04 M de tampon 5 20 tris-HCl contenant 0,1 M de NaCl, et le FNT adsorbé est élué avec 0,04 M de tampon tris-HCl (pH 7,2) contenant 0,18 M de NaCl. Les fractions présentant des activités cytotoxiques contre les cellules L sont concentrées par ultrafiltration. Le concentré ainsi obtenu est appliqué à une 25 colonne de Sephacryl S-2000(fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals, Inc, Suède) suffisamment équilibrée avec . 5 M de tampons de phosphate et filtré sur gel en utilisant le même tampon. Les fractions actives sont concentrées par ultrafiltration, et on obtient g 30 ainsi un FNT purifié ayant une activité de 3,5 x 10 unités et une activité spécifique de 18 x 10^ unités/mg.
- Etape 3 (Anticorps anti-FNT) - Le FNT du sérum du lapin partiellement purifié à l'étape 2 est méla-ngé à l'adjuvant complet de Freund (1:1!·, ( 27 puis est injecté par voie sous-cutanée au dos d'une souris mâle BALB/c de 12 semaines. L'opération ci-dessus est - répétée 2 et 4 semaines après l'injection initiale. Une semaine après la dernière injection, le sang entier est - - 5 recueilli. Du sang recueilli, un sérum est obtenu.
Le sérum ainsi obtenu est ajouté au milieu de culture pour évaluation de l'activité cytotoxique de FNT contre les cellules L en une quantité telle qu'il soit dilué 500 fois à la concentration finale. L'activité cytotoxique 10 du FNT du sérum du lapin contre les cellules L est évaluée de la même façon qu'on l'a décrit à l'exemple référentiel 1.
On trouve que le FNT du sérum du lapin ne présente aucune cytotoxicité contre les cellules L. Par le résultat ci-dessus, on peut en conclure que le sérum de la souris obtenu dans 15 cette étape contient un anticorps au FNT du sérum du lapin (que l'on appellera ci-après "anticorps anti-FNT").
EXEMPLE REFERENTIEL 3 - Etape 1 (Préparation de cellules produisant FNT) - 20 Un lapin femelle reçoit une injection intraveineuse de cellules tuées à la formaline de Propionibacterium acnes (Corynebacterium parvum; Wellcome Research Laboratories, Angleterre). Sept jours plus tard, le lapin est soumis à une trachéotomie , et le poumon est lavé avec une solution saline 25 physiologique, et on obtient ainsi des cellules flottantes.
Les cellules ainsi obtenues sont lavées avec une solution saline physiologique. En utilisant, comme milieu de culture, RPMI 1640 (Flow Laboratories Inc, E.U.A.) contenant 10 v/vüS de sérum foetal de veau, les cellules sont incubées à 37°C 30 dans de l'air contenant 5% de gaz carbonique. La culture de cellules est divisée en deux groupes, et à l'un d'entre eux on ajoute, à une concentration de 10 g/ml, l'endotoxine dérivée de Escherichia coli (lipopolysaccharide de s, Escherichia coli 026:B6 produit par Difco Laboratories , E . U. A.).
/ 35 La même quantité ,d ' eau stérile est ajoutée à l'autre. Le fi t / l___ ' 28 liquide surnageant de la culture de cellules où l'endotoxine est ajoutée présente une activité cytotoxique contre les - cellules L et l'activité atteint la valeur maximum en 7 heures. Cette activité est dissipée par l'anticorps anti-„ „ 5 .FNT, mais n'est pas dissipée par le sérum normal de souris.
Par ailleurs, le liquide surnageant de la culture de cellules où aucune endotoxine n'est ajoutée ne présente pas de cytotoxicité contre les cellules L.
Etape 2 10 (Poids moléculaire de FNT) A la culture de cellules préparée à l'étape 1 où l'on a ajouté l'endotoxine, on ajoute encore de la méthionine radioactive (1300 Ci/mmole, produite par Amersham Industries pic, Angleterre) (1 mCi/ml).
15 Selon la méthode de Laemmli £voir Laemmli, U.K. (1970),
Nature (Londres), volume 227, pages 680-685"]^, le liquide surnageant est analysé par électrophorèse sur gel de poly-acrvlamide-SDS. La concentration du gel est ajustée à 12,5% en poids. Après l'électrophorèse, le gel est traité avec 20 ENHANCE ® (dénomination commerciale d'un produit de New England Nuclear Inc, E.U.A.), et après séchage, il est exposé à un filmaux rayons X (Fuji RX, fabriqué et vendu par Fuji Photo Film Co., Ltd, Japon). Dans le liquide surnageant de la culture de cellules en présence d'endotoxine, on 25 observe qu'une substance ayant un poids moléculaire d'environ 17500 se forme.
Par ailleurs, le liquide surnageant de chaque culture de cellules préparée à l'étape 1 est soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-5DS de la même façon qu'on 30 l'a décrit ci-dessus. Ensuite, l'on agite le gel dans 2,5% de NP 40® (agent tensio-actif vendu par Calbiochem, E.U.A.) pendant 1 heure puis ensuite dans l'eau pendant 2 heures. Après agitation, chaque voie de migration est séparée en coupant, et on coupe en bandes de 2 mm de large dans une 35 direction perpendiculaire à la direction de migration.
/ / i . 29
Chaque bande est mise en culture avec des cellules L, et on évalue l'activité cytotoxique contre les cellules L.
ς Dans la voie sur laquelle le liquide surnageant de la culture de cellulescontenant l'endotoxine se développe, la î - 5 -cytotaxicité contre les cellules L est observée en une position correspondant au poids moléculaire de 17500. Aucune cytotoxicité n'est observée aux autres positions.
Etape 3 ( Construction de ARNm) 10 La culture de cellules préparée à l'étape 1 est incubée pendant 2 heures après addition d'endotoxine, avec ensuite centrifugation pour recueillir les cellules. L'extraction de l'ARN cytoplasmique des cellules recueillies et l'extraction de ARNm de l'ARN cytoplasmique sont effectuées 15 selon la méthode de Chirgwin et autres £voir Chirgwin, J. M. et autres , Biochemistry, volume 18, page 5294 (1979)^ .
On ajoute 4 ml d'une solution à 4 M de thiocyanate de g : guanidine à 3 x 10 cellules, et le mélange est pulvérisé au moyen d'un homogénéiseur (modèle : AM-7, fabriqué et 20 vendu par Nihon Seiki Seisakusho, Japon). Les résidus sont retirés par centrifugation et on y dissout 2,4 g de chlorure de césium. Le mélange est versé avec soin dans un tube en polyallomère où l'on avait introduit à l'avance 2,5 ml d'une solution à 5,7 M-de chlorure de césium et 0,1 M de EDTA 25 (phi 7,5), et ensuite on soumet à une ultracentrifugation à 30.000 t/mn pendant 12 heures à 20°C en utilisant un rotor Beckman 5W41 (fabriqué et vendu par Beckman Instrument,E.U.A.). Après enlèvement du liquide surnageant, la boulette est dissoute dans 1 ml d’un tampon tris-HCl à 10 mM 50 (contenant 5 mM de EDTA et 1 poids/volume % de SDS). La solution résultante est extraite avec un mélange à 4:1 en » volume de chloroforme et de 1-butanol. Dans la phase aqueuse, on ajoute 0,05 volume d'acétate de sodium à 2 M et 2,5 volumes d'éthanol, et on laisse au repos à -20°C pendant 2 heures ou 55 plus pour ainsi précipiter l'ARN. Le précipité est recueilli / 30 Λ , f par centrifugation, séché, puis dissous dans 500 yi d'eau stérile. Par suite, on obtient une solution d'ARN cyto-. plasmique.
La solution d'ARN ci-dessus obtenue est chauffée 5 à 68°C pendant 2 minutes et ensuite est rapidement refroidie. On ajoute, dans la solution, 500yul d'une concentration à 2 fois d'un tampon tris-EDTA à 10 mM (pH 7,4) (contenant 1 mM d'EDTA , 0,1 poids/volume % de SDS et 0,5¾ de chlorure de lithium), et le mélange est appliqué à une colonne de 10 200 mg d'oligo dT-cellulose (fabriquée et vendue par
Bethesda Research Laboratories, Inc, E.U.A ) et lavé avec 10 ml du même tampon (concentration une fois) que ci-dessus décrit. Le matériau retenu par la colonne est élué avec 2 ml d'un tampon d'élution contenant 10 mM d'un tampon tris-HCl 15 pH 7,4, 1 mM de EDTA et 0,1 poids/volume % SDS. A l'éluat, on ajoute 0,05 volume d'acétate de sodium et 2,5 volu mes d'éthanol, et on refroidit le mélange à -20°C pour précipiter. Le précipité est recueilli par filtration et appliqué à la colonne d'oligo dT-cellulose, et les fractions 20 adsorbées sur l'oligo dT-cellulose sont recueillies. On récupère 85 g d'ARNm en déterminant par analyse du spectre ultraviolet.
Etape 4 (Fractionnement deARNm ) 25 On dissout 880 de ARNm préparé par la même méthode qu'à l'étape 3, dans 250 d'eau et la solution résultante est disposée en couche sur un gradient de densité linéaire de saccharose de 10 ml à 5-25¾. Le gradient de densité de saccharose est préparé au moyen de l'appareil 30 ISC0 570 (fabriqué et vendu par ISC0 Inc., E.U.A) en utilisant des solutions de tampons tris ^contenant 25 mM de tris-HCl (pH 7,2), 2 mM de EDTA et 1 poids/volume % de SDS^j respectivement contenant 5¾ de saccharose et 25¾ de saccharose.
En utilisant un rotor Beckman SW41, une ultra-35 centrifugation est effectuée à 40.000 t/mn pendant 12 heures / /’ 31 à 4°C et des fractions, chacune de 400 yj, sont récupérées par un dispositif de récupération de fractions (fabriqué . * et vendu par Beckman Instrument, E.U.A.) puis précipitées dans l'éthanol. Les fractions précipitées sont centrifugées c - 5 et dissoutes dans l'eau stérile.
Etape 3 (Expérience sur la translation de ARNm )
La translation de ARNm en utilisant des oocytes de Xenopus laevis (matériau d'enseignement biologique de 10 Hamamatsu) est entreprise selon le processus décrit dans les rapports expérimentaux (par exemple Hiroshi Teraoka, Mikio Itsuki et Kentaro Tanaka "Protein , Nucleic acid, Enzyme", Genetic Engineering , extra édition., 1981, page 602). Xenopus laevis provient des matériaux d'enseignement biolo-15 gique de Hamamatsu. Le ARNm fractionné obtenu à l'étape 4 est dissous dans 1'eau stérile pour avoir une concentration de 1 yvg/jjl et la solution est injectée à des oocytes en ς une quantité si faible que 50 ni par cellule. Les cellules sont alors mises en culture pendant 24 heures dans une 20 solution de Barth contenant 7,5 mM de tris-HCl (pH 7,6), 88 mM de NaCl, 1 mM de chlorure de potassium, 0,33 mM de nitrate de calcium, 0,41 mM de chlorure de calcium, 0,82 mM de sulfate de magnésium, 2,4 mM de bicarbonate de soude, 18 U/ml de pénicilline G et 18 ^tL-g/ml de streptomycine^ qui 25 contient 1 mg/ml d'albumine de sérum bovin. Les oocytes sont écrasés , dans le liquide de culture, au moyen d'une barre en verre. Le liquide de culture est alors centrifugé et le liquide surnageant est évalué pour l'activité cytotoxique contre les cellules L. ARNm qui sera translaté pour donner 30 un polypeptide ayant une activité maximum se sédimente sous forme de 16 S en dimension. Cette activité est éliminée par l'anticorps anti-FNT obtenu à l'étape 3 de l'exemple référentiel 2 , mais n'est pas éliminée par le sérum normal de la souris.
' ( ; ‘ 32 ; i I Etape 6 1' (Préparation des transformants) j * En utilisant 5 j^q de ARNm fractionné obtenu à i l'étape 4, on prépare un ADN à deux brins selon le j c 5 processus décrit dans la littérature (1), à partir de la j 1 page 96. Pour la transcriptase inverse, on utilise un produit I de Life Science, Inc, E.U.A. . L'ADN à deux brins est fractionné sur un gel de polyacrylamide à 3,5& et on obtient i des fractions de 330 ng d'environ 1.000 à 2.000 bp. Selon j 10 le processus décrit dans la littérature (1), on étend 7 ng
•I
j de cette fraction avec des résidus désoxyC en utilisant la ; désoxynucléotidyl transférase terminale (fabriquée et vendue
par Bethesda Research Laboratories, Inc, E.U.A.) et on recuit ; avec 56 ng de plasmide pBR322 ayant été digéré avec PstI
; 15 et étendu avec les résidus de désoxyG. Le mélange ainsi
H
5 recuit est inséré dans la souche E. coli K-12 (HB101, || ATCC 33694) pour transformer la souche. Par suite, on obtient j; i 12.000 transformants, j Etape 7 I α 20 (Séquence d'acides aminés partiels du FNT du lapin)
Du FNT de lapin partiellement purifié à l'exemple ! 7 référentiel 2 (activité : 5 x 10 unités) est soumis à un i j; électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS pour une purifi- j cation comme à l'étape 2. Une partie du gel est teintée avec 25 le bleu brillant de Coomassie. Une bande à la position cor-i respondant au poids moléculaire de 17.000 est découpée du j: gel, et est extraite avec 1¾ de bicarbonate d'ammonium. On j récupère, sous forme de protéine, environ 180 jj*q de FNT.
i ’ ] On dissout 150 y~g du FNT récupéré dans 75jxq de il 30 1?ί de bicarbonate d'ammonium, avec ensuite addition de 3jJ g |i de trypsine TPCK (fabriquée et vendue par Worthington F ^ Biochemical, E.U.A.). Le mélange est incubé à 37DC pendant 4 heures . Le mélange est alors fractionné au moyen d'une < colonne de chromatographie liquide très rapide compre- 35 nant Cosmosil 5C8 (fabriqué et vendu par Nakarai Chemical Ltd, a s 33
Japon) en tant que matériau de garniture, pour ainsi obtenir , les fragments digérés avec la trypsine.
„ Le FNT très purifié et ses fragments digérés à la trypsine sont alors soumis à un dessalage au moyen d'une , 5 colonne de Sephadex G-25 puis lyophilisés. Selon la méthode de R.M. Hewick et autres (voir J. Biol. Chem., volume 256, pages 7990-7997, 1981), le FNT purifié et les fragments digérés à la trypsine sont soumis à une dégradation de Edman à partir du terminal N. L'acide aminé-PTH libéré à 10 chaque étape est analysé par la méthode habituelle au moyen d'une chromatographie . très rapide modèle SP8100 (fabriqué et vendu par Spectra physics, E.U.A.) en utilisant Solpacks 0DS(fabriqué et vendu par E.I. Du Pont, E.U.A.), comme colonne. Par suite, on trouve que le FNT a la séquence 15 d'acides aminés suivante au terminal N : Ser-Ala-Ser-Arg-Ala-Leu-Ser-Asp-Lys-Pro-Leu-Ala-His-Val-Val-Ala-Asn-Pro-Gin-Val-Glu- Gly-Gln-Leu-Gln- c L'un des fragments digérés à la trypsine a la i séquence N terminât d'acides aminés qui suit.
20 Glu Thr Pro Glu Glu Ala Glu Pro Met Ala Etape -8
Synthèse d'échantillon d ' oligodésoxynucléotide )
Des oligodésoxynucléotides complémentaires de la séquence desbases de ARNm que l'on déduit de la séquence des 25 acides aminés du FNT du lapin obtenue à l'étape 7 de l'exemple référentiel 3 sont synthétisés selon la méthode perfectionnée du phosphotriester qui a déjà été rapportée par le présent inventeur dans H. Ito et autres "Nucleic Acid Res." 3JD , 1755-1769 (1982;. Pour préparer les oligodésoxy-30 nucléotides, 128 oligodésoxynucléotides estimés à partir de la séquence des acides aminés du FNT du lapin sont répartis en cinq groupes, c ' est-à-'dire des groupes de 16, 16, 32, 32 et 32 et sont synthétisés sous forme de mélanges d'oligo-désoxynucléotides des groupes respectifs. Les oligodésoxy-35 nucléotides obtenus des groupes respectifs sont déprotégés 34 selon la méthode habituelle et purifiés par chromatographie en colonne en utilisant G-5Û ( fabriqué et vendu par Pharmacia Fine Chemicals Inc, Suède), électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 20¾ en poids contenant 7 M 5 d'urée et chromatographie en colonne en utilisant DE52 (fabriqué et vendu par Whatman Ltd, E.U.A.). Les oligodésoxy-nucléotides des groupes respectifs ainsi obtenus sont dialysés par rapport à une solution tampon à 0,1 mM de tris-EDTA.
10 Chacun des oligodésoxynucléotides purifiés des groupes respectifs est marqué en utilisant la polynucléotide kinase T. (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, Inc, E.U.A.) et le -P-adénosine triphosphate selon la méthode habituelle et ensuite on purifie par 15 chromatographie en colonne en utilisant DE52 (fabriqué et vendu par Whatman Ltd, E.U.A.). La matière radioactive est incorporée dans chacun des oligodésoxynucléotides des g c groupes respectifs en une quantité d'environ 3 x 10 cpm/
Les oligodésoxynucléotides échantillons obtenus sous la forme 20 d'un mélange du groupe respectif sont désignés comme cela est montré au tableau 1.
Une partie de la séquence des aminoacides du FNT du lapin , de la séquence de base de ARNm estimée à partir de la séquence des aminoacides du FNT du lapin et des 25 séquences ds bases des oligodésoxynucléotides synthétiques échantillons des groupes respect! f s sont montrées au tableau 1.
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35 TABLEAU 1 Séquence Carboxyle Amino d'acides terminalAla Met Pro Glu Ala Glu Glu., terminal i- aminés___ . ARNm 3' .... XCG GTA XCC YAG XCG YAG YAG.. 5' MH échantillon 5' GC CAT MGG MTC GGC MTC MTC 3' MI échantilJon 5' GC CAT NGG MTC GGC MTC MTC 3' 10 MJ échantillon 5' GC CAT ZGG MTC AGC MTC MTC 3' MK échantillon 5' GC CAT ZGG MTC CGC MTC MTC 3' ML échantillon 5' GC CAT ZGG MTC TGC MTC MTC 3' 25 Note : X représente un résidu d'acide ribonucléique de A, C, G ou U.
Y représente un résidu d'acide ribonucléique de A ou G.
M représente un résidu d'acide désoxyribonucléique 2Q de T ou C.
N représente un résidu d'acide désoxyribonucléique de A ou G.
Z représente un résidu d'acide désoxyribonucléique de A, C, G ou T.
25 ARNm des cellules produisant FNT que l'on obtient selon l'étape 3 de l'exemple référentiel 3 est traité avec une solution contenant 1 mole de glyoxal, 10 millimoles de NaH2P0^ et 50¾ en volume de diméthyl sulfoxyde à 50°C pendant 60 minutes 30 puis est soumis à un fractionnement en uti1isantuneélectro-phorèse sur un gel agarose à 1/1¾ en poids . Le ARNm fractionné est transféré sur un filtre d'un dispositif de transfert du type électrophorèse ( fabriqué et vendu par Bio Rad, E.U.A.) selon le manuel du fabricant. Alors, le ARNm sur le filtre ’ 35 du dispositif est traité avec une solution à 5 x Denhardt 36 f »*.
contenant une solution de 5 x SSC et 150 ,A*-g/ml d'ADN de spermatozoïdes de saumon dénaturé à 65°C pendant 2 heures et ensuite on traite avec une solution à 5 x Denhardt 7 contenant 1 x 10 cpm/ml des oligodésoxynucléotides marqués 5 et une solution à 5 x SSC à 50°C pendant 2 heures. Le filtre obtenu ci-dessus est lavé avec une solution à 6 x SSC en succession quatre fois à la température ambiante } 40°C, 50°C et 60°C. Un film aux rayons X XAR-5 (fabriqué et vendu par Eastman Kodak Company, E.U.A.) est exposé au rayonnement 10 du filtre. Par suite, on trouve que les oligodésonucléotides désignés par MJ échantillon sont plus fortement hybridés avec le ARNm ? montrant que 1'oligodésoxynucléotide ayant une séquence de base qui est totalement complémentaire de ARNm est contenu dans les oligodésoxynucléotides désignés par 15 MJ échantillon.
Etape 9 (Clonage du gène de FNT du laDin) 5elon le processus décrit dans la littérature (2) , page 162, les transformants obtenus à l'étape 6 de l'exemple 20 référentiel 3 sont transférés à un filtre de cellulose et l'ADN des transformants est hybridé avec 1'oligodésoxynucléotide marqué ( MJ échantillon) choisi à l'étape B de l'exemple référentiel 3 dans les mêmes conditions qu'à l'étape 8 de l'exemple référentiel 3 (hybridation des 25 colonies. Dans le processus ci-dessus, 49 colonies qui sont fortement hybridées avec les oligodésoxynucléotides marqués (MJ échantillon)sont choisies et encore fixées sur un autre filtre de nitrocel1ulose. Alors, en utilisant 49 colonies, une plus ample hybridation est effectuée pour choisir 30 9 colonies qui sont plus fortement hybridées par les oligo désoxynucléotides marqués (MJ échantillon).
Selon le processus rapide de séparation des plasmides décrit dans la littérature (1), page 6 , on obtient environ g de plasmide de chacune des 9 colonies. Chacun des 35 plasmides obtenus est scindé en utilisant des enzymes de ! 37 restriction, PstI., Taql, Rsal et PvuII (chacun étant fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, Inc, * E.U.A.) selon le processus décrit dans le manuel du fabricant, avec ensuite électrophorèse effectuée sur un gel > - 5 agarose à 1« en poids. Alors, les fragments obtenus par scission par les enzymes de restriction respectifs sont comparés par rapport à leur longueur.
Les résultats suggèrent que les 9 souches correspondant aux 9 colonies ont la séquence desbasesdu fragment 10 obtenu par scission par PvuII et Rsal et consistant en environ 50 bp et que la plus grande partie des 9 souches ont la séquence desbasesdu fragment obtenu par scission par Rsal et consistant en environ 200 bp. En d'autres termes, les résultats suggèrent que les 9 souches ont des 15 séquences desbasespartiellement communes. Les résultats d’analyse par les enzymes de restriction sont montrés à la figure 1.
i Sept souches contenant des plasmides désignés au tableau 2 ci-dessous sont mises séparément en culture dans „ 20 2 ml d'un milieu LB contenant 10 ^/u-g/ml de tétracycline jusqu'à ce que la densité optique des solutions montre les valeurs indiquées au tableau 2 ci-dessous, avec ensuite centrifugation pour obtenir les souches respectives.
Chacune des souches obtenues est séparément ajoutée dans 25 2 ml d'une solution saline physiologique et rompue par sonication. Les solutions obtenues sont soumises à une centrifugation et l'activité cytotoxique contre les cellules L des liquides surnageants obtenus et déterminée. Les résultats sont montrés au tableau 2 ci-dessous. Comme 30 essai blanc, les mêmes processus que ceux mentionnés ci-dessus sont répétés en utilisant une souche contenant le plasmide pBR322. Les résultats sont également montrés au tableau 2 ci-dessous.
/ 38 i i ! ! 1 1 * * i TABLEAU 2
Nombre de Activité i paires de cytotoxique i c m -j bases OD contre les
J * 5 Plasmide recuites 600 cellules L
j (unité/ml) pB 2-2 1400 1,369 35 j pB 2-3 800 1,605 < 10 j 10 pB 2-7 1060 1,364 <£ 10 ! pR 9 1550 1,618 <10 | pR 12 1400 1,458 15 pR 18 1850 1,438 <10 pR 25 1350 1,514 < 10 i 15 pBR322 0 1,677 <10 - L'activité cytotoxique contre les cellules L est | éliminée par l'anticorps anti-FNT mais n'est pas éliminée 20 par le sérum normal de souris. Cela montre que toutes les i neuf colonies ci-dessus mentionnées ont des plasmides qui contiennent des oligodésoxynucléotides codant FNT.
;; Etape 10
j (Détermination de la séquence des bases de l'ADN
?5 codant ie FNT' du lapin)
Des souches de E. coli contenant les plasmides ij pB2-7 et pR 18 sont mises en culture dans 1 litre du milieu M9 décrit dans la littérature (3), page 440 et contenant ;; 10 g/ml de tétracycline. Alors, selon le processus décrit y 30 dans la littérature (3), page 90, chacun des plasmides est
ÎI
jj isolé en une quantité d'environ 50^^.
;! La séquence dsbasesde l'insertion de chaque plasmide est déterminée selon le processus chimique de Maxam-Gilbert décrit dans Maxam et autres "Méthod in :] 35 tnzymology", 5^, page 490 (1980), Academie Press. La séquence
A
/ /; / \ 39 desbasesainsi déterminée se révèle être en accord avec les ' séquences partielles d'acides aminés déterminées à l'étape 7 v de l'exemple référentiel 3. Ainsi, la séquence complète du FNT du lapin est considérée comme étant élucidée, s - 5 - Etape 11
Dans cette étape, la construction d'un plasmide est effectuée en utilisant le plasmide recombinant pR12 pour obtenir l'expression directe de FNT dans E. coli en utilisant lac comme promoteur. Les processus sont montrés 10 à titre d'exemple sur la figure 2. D'abord, 10 pjq du plasmide pR12 sont digérés avec 10 unités de Apal (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, Inc, E.U.A.) à 37°C pendant 2 heures et on électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 4% en poids pour isoler des fragments de 15 610 bp. On isole environ 1 yuug du fragment, du gel,par électroélution . De la même façon qu'à l'étape 8 de l'exemple référentiel 3,deux oligodésoxynucléotides montrés ^ sur la figure 2, c'est-à-dire 5'-GATCCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3' et 5'-CGAGAAGCTGACATG-3' sont synthétisés. Alors, chaque > 20 extrémité 5' des oligodésoxynucléotides (environ 100 pmoles) est phosphorylée en utilisant la polynucléotide kinase selon la méthode décrite dans la littérature (3), page 122. Après accomplissement de la réaction, le mélange réactionnel est extrait avec du phénol puis avec du chloroforme. Alors,
25 les oligomères de synthèse obtenus sont mélangés à 0,5 du fragment de 630 bp de Apal et Drécipité* à l'éthanol. Le fragment est lié avec les oligomères synthétiques à 4°C
pendant une nuit en utilisant 10 unités d'ADN ligase selon le processus décrit dans la littérature (1) page 37. Après 30 accomplissement de la réaction, le mélange réactionnel est précipité dans l'éthanol et digéré avec 20 unités de BamHI „ à 37°C pendant 3 heures avec ensuite électrophorèse effectuée sur un gel de polyacrylamide à 4¾ en poids pour récupérer un fragment de 670 bp par électroélution 1 yuq d'un 35 plasmide commercialisé pUC-8 (catalogue N° 4916, fabriqué / 40 et vendu par P-L Biochemicals, Inc, E.U.A ) et digéré avec BamHI et extrait avec du phénol puis avec du chloroforme, ^ avec ensuite précipitation dans l'éthanol pour obtenir un vecteur · On lie 0,5 g du vecteur ainsi obtenu au ώ , 5. fragment ci-dessus obtenu ayant des sites de BamHI à ses deux extrémités et contenant environ 170 bp . codant FNT en utilisant l'ADN ligase T^. Selon le processus décrit dans la littérature (4), page 20, E. coli JM101 est transformé en utilisant le vecteur ci-dessus obtenu et mis en 10 culture sur un milieu d'agar contenant 1 mM de IPTG et 0,004% (poids/volume ) de X-gal pour obtenir environ 200 plaques claires . L'ADN plasmidique est préparé à partir de ces transformants et est digéré avec BamHI. Par suite, on trouve que 15 plasmides contiennent le fragment BamHI 15 voulu (environ 670 bp). Afin d'examiner la direction d'insertion, les 15 plasmides ci-dessus sont digérés avec EcoRI n'ayant qu'un site de reconnaissance sur son pUC-8 ^ et PvulI n'ayant qu'un site de reconnaissance sur sa partie de fragment d'environ 670 paires de bases et on électro-20 phorèse sur un gel à 6% en poids de polyacrylamide. Par suite, on détermine que 7 plasmides ont le fragment voulu consistant en environ 140 bp et que la direction de transcription du promoteur lac sur pUC-8 est en accord avec celle des oligodésoxynucléotides codant FNT.
25 L'analyse de la séquence de l'ADN montre que ces sept plasmides ont la même séquence et ont la séquence souhaitée des nucléotides aux jonctions entre le promoteur lac, l'ADN de synthèse et ADNc.
> La construction d'autres plasmides est effectuée 30 en utilisant le plasmide recombinant pR17 afin d'obtenir l'expression directe de FNT dans E. coli en utilisant lac UV5 comme promoteur . Les processus sont montrés à titre f I d'exemple sur la figure 3. D'abord, 10 j^q du plasmide pR17 j i sont digérés avec 10 unités de ApaI (fabriqué et vendu par
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35 Bethesda Research Laboratories, Inc,E.U.A.) à 37°C pendant
A
i ‘ » - î i i ' ' 41 2 heures et on électrophorèse sur un gel de polyacrylamide à 4¾ en poids pour isoler un fragment consistant en environ 630 bp. On isole environ 1 yn-g du fragment, du gel, par électroélution . De la même façon qu'à l'étape 8, on fait 5 la synthèse des oligodésoxynucléotides montrés sur la figure 3, c'est-à-dire 5'-AATTCATGTCAGCTTCTCGGGCC-3' et 5 '-CGAGAAGCTGACATG-3'. Alors, chaque extrémité 5' des deux oligodésoxynucléotides (environ 100 pmoles) est phosphorylée en utilisant la polynucléotide kinase selon la méthode 10 décrite dans la littérature (3), page 122. Après accomplissement de la réaction, le mélange réactionnel est extrait avec du phénol puis avec du chloroforme . Alors, les oligomères de synthèse sont mélangés à 0,5^/Ug du fragment Apal précédemment obtenu (environ 630 bp) préparé à partir du 15 plasmide pR17 et précipités à l'éthanol. Le fragment
est lié avec les oligomères de synthèse à 4°C pendant une nuit en utilisant 10 unités de ligase selon le processus décrit dans la littérature (1) page 37. Après accomplissement de la réaction, le mélange réactionnel est précipité 20 dans l'éthanol et digéré avec 20 unités de EcoRI à 37°C
y pendant 3 heures, avec ensuite électrophorèse effectuée sur un gel de polyacrylamide à 4?ô en poids pour récupérer un fragment (environ 670 bp) par électroélution.
Selon le processus décrit par F. Füller "Gene", 19, 25 pages 42-54 (1982), on prépare le plasmide p0P95-15.
1 yCcg de pOP95-15 est digéré avec EcoRI et extrait avec du phénol puis avec du chloroforme, avec ensuite précipitation dans l'éthanol pour obtenir un vecteur. En utilisant l'ADN ligase , on lie 0,5 jlkjq du vecteur 30 obtenu avec le fragment (environ 670 bp) obtenu par liaison de l'oligonucleotide de synthèse avec l'oligonucléotide codant F NT ' . Selon le processus décrit dans la littéra ture (4), page 20, E. coli JM101 (ATCC 33876) est transformé en utilisant le vecteur obtenu ci-dessus et mis en culture 35 sur un milieu contenant 1 mM de IPTG et 0,004 % ( poids/volume) / / ' * 42 i de X-gal pour obtenir environ 150 colonies blanches.L'ADN plasmidique est préparé à partir de 100 de ces colonies et . ^ digéré avec EcoRI. Par suite, on trouve que 12 plasmides contiennent le fragment voulu de EcoRI (670 bp). Afin 5 d’examiner la direction d'insertion , les 12 plasmides ci-dessus sont digérés avec PvulI et PstI et on électrophorèse sur un gel agarose à 1,5¾ en poids. Par suite, on détermine que quatre plasmides ont les fragments souhaités (environ 1280 bp et environ 2600 bp) et que la direction de transcription 10 du promoteur lac UV5 est en accord avec celle des oligo-désoxynucléotides codant FNT.
L'analyse des séquences des bases montre que ces 4 plasmides ont la même séquence et que le promoteur lac UV5 , 1'oligodésoxynucléotide de synthèse etADNc sont bien combinés 15 les uns aux autres. Les plasmides obtenus sont désignés par pFNT-lacUV5-l.
Etape 12 (Purification du FNT produit par E. coli)
Des souches de E. coli contenant des plasmides 20 obtenus à l'étape 11 sont mises en culture sur 50 ml du milieu LB contenant 100g/ml d’ampicilline à 37°C pendant une nuit. Alors, les souches sont transférées à 5 litres de milieu LB contenant 100 juug/ml d'ampicilline et de plus mises en culture à 37°C pendant 3 heures. On ajoute de 1 ' isopropyl~yB< -25 D-thiogalactopyranoside (fabriqué et vendu par Sigma
Chemical Company, Inc, E.U.A.), jusqu'à une concentration finale de ImM. Une plus ample mise en culture est effectuée pendant 6 heures, avec ensuite refroidissement. Les souches sont recueillies par centrifugation. De la même façon qu'on 30 l'a décrit à l'étape 11, les souches sont ajoutées à 5 litres d'une solution à 0,04 M de tampon tris-HCl (pH 7,8} et brisées par sonication pour obtenir une solution de v protéine des souches. La solution obtenue a une activité cytotoxique contre les cellules L de 5 x 10^ unités/ml.
35 La solution obtenue est purifiée de la même façon
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qu'à l'étape 2 de l'exemple référentiel 2 pour obtenir 1,2 x 10^ unités de FNT. L'activité spécifique de FNT est 7 43 de 6,8 x 10 unités/mg.
Etape 13 5. . (Evaluation en utilisant le sarcome Meth A transplanté à la souris).
2 x 10^ cellules de sarcome Meth A sont transplantées intradermiquement dans la zone abdominale d'une souris BALB/c et, 7 jours plus tard, des souris ayant des tumeurs 10 de 7 à 8 mm de diamètre et sans nécrose centrale spontanée sont choisies pour une évaluation. Un échantillon (0,2 ml) du FNT obtenu à l'étape 12 de l'exemple référentiel 3 et dilué avec une solution saline physiologique est injecté à travers la veine de la queue. L'activité de l'échantillon 13 est évaluée au bout de 24 heures selon les critères suivants.
(-) : pas de changement - (+) : légère nécrose hémorragique (++): nécrose hémorragique modérée (nécrose 20 centrale s'étendant sur environ 50?ô de la £ surface de la tumeur^ (+++): nécrose hémorragique marquée (nécrose massive laissant un petit bourrelet viable sur le pourtour de la tumeur).
25 20 jours après l'injection de l'échantillon, des observations sont faites concernant la dégénération des tumeurs et le taux de rétablissement est déterminé selon l'expression qui suit.
Nombre de souris qui se sont 30 totalement rétablies de
Taux de rétablissement = ... ^a ^umeur----
Nombre de souris utilisées y pour 1'essai * 35 Les résultats sont montrés au tableau 3.
44 TABLEAU 3
Quantité Nombre de Evaluation de Taux de injectée souris l'activité rétablisse- ^ de FNT du utilisées des échantillons ment (au lapin produit pour (au bout d'un bout de par E. coli l'essai jour) 20 jour) unités/souris___- + ++ +++__ 2x 105 5 0014 5/5 Référence 5 5000 0/5 (saline physiologique ) 15 EXEMPLE 1
Etape 1(Transformation de la souche MC1061 de E. coli K12 par les plasmides pR18, pB2-7 et pB2-2)
Des colonies de la souche MC1061 de E. coli K12 20 sont transformées avec chacun des plasmides pR18, pB2-7 et pB2-2 , que l'on obtient à l'exemple référentiel 3, selon les processus habituels. Plus particulièrement, .des colonies de la souche MC1061 de E.coli K12 sont mises en culture dans le milieu LB jusqu'à ce que la densité optique du bouillon 25 de culture devienne de 0,3 à 550 nm. On recueille 50 ml de la culture de E. coli, on lave avec un mélange de 25 ml contenant 10 mM de MOPS (pH 7,0) et 10 mM de RbCl, et on remet en suspension dans 25 ml d'un mélange contenant 0,1 M de MOPS (pH 6,5), 50 mM de CaCl2 et 10 mM de RbCl. La 30 suspension résultante est refroidie sur de la glace pendant 30 minutes, centrifugée et mise en suspension dans un mélange de 2 ml du mélange ci-dessus mentionné contenant 0,1 M de MOPS (pH 6,5), 50 mM de CaCl2 et 10 mM de RbCl et 30 - de DMS0. A une portion de 200 de la suspension résul- 35 tante, on ajoute-séparément 10 ^ü. de chacune des solutions / h \ 45 * d'ADN plasmidique. Chacun des mélanges résultants est refroidi sur de la glace pendant 30 minutes puis subit un choc v thermique à 44°C pendant 60 secondes. Immédiatement après, 5 ml du milieu LB préchauffé à 37°C sont ajoutés à chacun - 5 des mélanges chauffés avec ensuite incubation à 37°C pendant 1 heure. Chacun des bouillons de culture obtenus est soumis à une centrifugation pour former des boulettes de cellules. Le liquide surnageant est évacué et le milieu LB est ajouté et agité pour remettre chacune des boulettes de 10 cellules en suspension. Chacune des suspensions résultantes est inoculée à une plaque d'agar LB contenant 30 jjg/ml de tétracycline, avec ensuite incubation à 37°C pendant une nuit. Par suite, on obtient des colonies de transformants résistant à la tétracycline, chacun étant transformé par 15 les plasmides pRIB, pB2-7 et pB2-2.
Etape 2 (Préparation d'ADN plasmidiques pB2-7 et pR18) Chacun des transformants respectivement transformés avec les plasmides pB2-7 et pR18 que l'on obtient à l'étape 1 est soumis à (1) une croissance du transformant 20 et une amplification du plasmide ; (2) une récolte et une lyse du transformant et (3) une purification de 1'ADN plasmidique, selon les processus décrits aux pages 88-96 de T. Maniatis, E.F. Fritsch et J. Sambrook, "Molecular cloning", publié par Cold Spring Harbor Laboratory, E.U.A. . _ 25 A titre d'exemple, chacun des transformants est . inoculé dans le milieu LB et incubé à 37°C sous agitation vigoureuse. Cette étape est répétée pour atteindre une croissance du transformant une amplification du plasmide. La culture de transformant est 30 recueillie par centrifugation à 4.000g pendant 10 minutes V à 4°C. Le liquide surnageant est rejeté. La boulette résul- r~ tante est lavée dans 100 ml de STE froid-glace ίθ,1 M de NaCl, 10 mM de T ris. Cl (pH 7,8) et 1 mM de EDTAJ.et est soumise à une lyse par ébullition en utilisant 20 mg/ml de lysozyme dans 10 mM de Tris-Ci^ 35 pH 8,0. Le produit visqueux est transféré à un tube d'ultracentrifugeuse / / /; 46 [ * et on centrifuge à 25.000 t/mn pendant 30 minutes à 4°C pour obtenir une solution d'ADN. Le volume de la solution x d'ADN est mesuré. Pour chaque millilitre, on ajoute exacte ment 1 g de chlorure de césium et on mélange doucement ^ - 5- jusqu'à ce que tout le sel soit dissous. On ajoute 0,8 ml d'une solution de bromure d'éthidium (10 mg/ml dans 1^0), pour 10 ml de la solution de chlorure de césium. La densité finale de la solution est de 1,55 g/ml et la concentration du bromure d'éthidium est d'environ 600 ^g/ml. La solution 10 de chlorure de césium est transférée à un tube approprié à la centrifugation, et le restant du tube est rempli d'huile de paraffine légère. La centrifugation est entreprise à 45.000 t/mn pendant 36 heures à 20°C pour obtenir deux bandes d'ADN, sa bande supérieure consistant en ADN 15 bactérien linéaire et ADN plasmidique circulaire entaillé et sa bande inférieure consistant en ADN plasmidique circulaire fermé. La bande inférieure d'ADN est recueillie dans un tube en verre par une aiguille hypodermique insérée dans le côté du tube. Le bromure d'éthidium est retiré, et la phase 20 aqueuse est dialysée par rapport à TAE. La solution d'ADN plasmidique est-traitée avec RNase, et extraite avec un volume égal de phénol équilibré. La phase aqueuse est mise en couche sur une colonne de Bio-Gel A-150 équilibrée dans TAE (pH 8,0) et Q-,l?i de SDS. L'ADN dans la colonne est 25 lavé et un réservoir de TE avec 0,1 .% de SDS est appliqué pour recueillir les fractions. Les fractions sont précipitées avec l'éthanol pour obtenir un ADN plasmidique pur.
En entreprenant les processus ci-dessus, on obtient 250 g d'ADN plasmidique pB2-7 pur et 134 jj. g d'ADN 30 plasmidique pR18 pur.
Etape 3 ^ (Translation de l'entaille des ADN plasmidiques pB2-7 et pR18 purs)
De l'ADN plasmidique pB2-7 pur obtenu à l'étape 2, 35 on prend 40^u-g que l'on digère avec l'enzyme de restriction /
, I
47 s ' PstI et on soumet à une électrophorèse à travers 4¾ de ! gel d1acrylamide. Après l’électrophorèse, l’ADN est teinté i j t et la bande souhaitée est découpée pour isoler une inser-
| tion de PstI
.. 5. .En utilisant 500 ng de l’insertion isolée de PstI, la translation d’entaille est effectuée à la façon décrite ; dans Maniatis, T. et autres, proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A., j 72^, 1184 (1975). Pour la translation d’entaille, l’appareil î · de translation d’entaille produit et vendu par Bethesda I 10 Research Laboratories, Inc, E.U.A., est employé, et on applique 80 pmoles de dCTP radioactif dans un système réactionnel de 25yul (à 400 Ci/mmoles). A un mélange consistant en : 2.5 ^1 de la solution A (solutions de dNTP) 15 2,5 y.1 de la solution B (500 ng d’ADN d’essai par rapport à l’insertion de PstI) 5 )de dCTP chaud (3200 Ci/mmole ) 1,3 yi>9de CTP froid (65 pmoles, 50 pmolesy^g de dCTP ) 20 11,2 yl de la solution E (l^O) 22.5 yj. (total) on ajoute 2,5/^1 de la solution C (DNasel, ADN | Polymérase I), et on fait réagir à 15°C pendant 60 minutes.
i ! Alors, la solution D (tampon d’arrêt ) est ajoutée au 1 25 mélange résultant pour arrêter la réaction. D'autre part ; ARNt de support est ajouté, on soumet deux fois à une t précipitation dans l'éthanol et on dissout dans 500^11 d'eau. L'activité spécifique par y-g d'ADN est de 9,3 x 10 cpm.
Pour 1'ADN plasmidique pR18 pur obtenu à l'étape 2, | 30 les processus ci-dessus décrits sont également mis en | oeuvre pour effectuer la translation de l'entaille. L'acti- i _ vité spécifique par y-g d'ADN était de 7 x 10^ cpm.
t "
: L
Etape 4 ψ 48 (Préparation du fragment d'insertion Rsal de ^ l'ADN plasmidique pR18 ) 80^cg de l'ADN plasmidique pR18 sont digérés avec 5. l'enzyme de restriction Rsal , et on soumet à une électrophorèse à travers 4¾ de gel de polyacrylamide. Les bandes souhaitées d'insertions qui suivent sont découpées et purifiées au moyen de la colonne BND : environ 640 bp 3,77(récupération 52¾) 10 environ 175 bp 1,77^ (récupération 50¾) L'insertion ci-dessus d'environ 640 bp est désignée par le fragment 3' de pR18 (ce qui signifie la région 3' non translatée de pR18), et l'insertion ci-dessus d'environ 175 bp est désignée par pR18-cfr (ce qui signifie la région 15 de codage de pR18).
Par ailleurs, les processus ci-dessus sont répétés en utilisant les enzymes de restriction PstI et MstlI au lieu de l'enzyme de restriction Rsal pour obtenir la t j bande qui suit : j 20 environ 450 bp 3,65 jjjg (récupération 60¾) L'insertion ci-dessus est désignée comme le fragment 5'de pR18.
Etape 5 (Isolement du gène de FNT génomique humain) 32 25 L'insertion de plasmide pB2-7 marqué p que l'on obtient à l'étape 3 de l'exemple 1 est utilisée comme échantillon ; 6 . d'hybridation pour sélectionner 10 plaques de génothèque j de bactériophage Charon 4A/humain préparées par insertion dans le site de liaison de Eco RI de Charon 4A £. Blattner et ^ autres "Science" 196, 161 (1977)J de fragments dimensionnés , à partir d'ADN humain partiellement digéré [_ Maniatis et autres "Cell" 15, 687 (1978)3 · La méthode d'hybridation des plaques de Benton et Davis Benton et Davis "Science", 196 : 180 (1977)J est utilisée. Comme tout le bactériophage de la 35 culture de départ ne contient pas la matière génétique <· / /; r * 49 nécessaire pour la préparation du FNT humain, un échantillon qui a une séquence de bases complémentaire du gène de FNT ΐ du lapin est utilisée. L'ADN des plaques de phage ayant la matière génétique souhaitée incorpore l'échantillon radioactif et on les ' 5 identifie par leur radioactivité. Neuf plaques hybridantes sont isolées de la génothèque.
Les processus et conditions utilisés sont comme suit : 1) Nombre de plaques :
Ig environ 1 x 10^ plaques (environ 4 xlO^ plaques/ plaque 0 150 mm x 25) 2) Transfert à des filtres de nitrocellulose : jvoir Benton et Davis, Science, 196, 186 ( 1977)] 15 3.) Hybridation : addition de 1,25 x 10^ cpm/ml d'échantillon d'insertion p B2-7 préparé à l'étape 3 de l'exemple 1, 42°C 19,5 heures 4) Lavage : 2 x SSC - 0,1% SDS à la température ambiante 20 Immersion 10 minutes x 4 1 x SSC -^0,1% SDS à 50°C Immersion 30 minutes x 2 5) Exposition: XAR-5 (Eastman Kodak Company E.U.A.) 25 -80°C, 2 écrans d'intensification, 39 heures.
Dans la sélection ci-dessus, on obtient 12 souches candidates. De la même façon qu'on l'a mentionné ci-dessus, une seconde sélection est effectuée pour obtenir 9 souches contenant le fragment voulu. En utilisant ces souches, une 5Q troisième sélection est effectuée de la même façon qu'on l'a mentionné ci-dessus pour obtenir 9 souches contenant v le fragment voulu. En utilisant les souches obtenues, une quatrième sélection est effectuée pour confirmer que les 9 souches contiennent le fragment voulu. Les 9 bactériophages 55 obtenus contenant le fragment voulu sont désignés par
A
50 HG-1 à HG-9, respectivement.
Etape 6 (Isolement du gène FNT génomique du lapin)
On répète sensiblement le même processus que décrit „ 5. à l'étape 5 de l'exemple 1 à l’exception que l’on utilise " 5 6,7 x 10 plaques de génothèque de bactériophage Charon 4A/lapin , que l'on prépare en utilisant 1'ADN du lapin digéré L Maniatis et autres , Cell, _15^ 687 (1978)]] au lieu d'ADN humain digéré, au lieu des 10^ plaques de la génothèque 10 bactériophage Charon 4A/humaine.Ainsi, on obtient deux souches de bactériophage (RG-1 et RG-2) contenant le gène FNT génomique du lapin.
Etape 7 (Analyse de maculage de Southern de clones humains) 15 En utilisant les bactériophages HG-3, HG-6 et HG-7 obtenus à l'étape 5 de l'exemple 1, on obtient 1'ADN de chaque bactériophage selon les processus qui suivent.
1 n
On met 6 x ÎO-1 cellules de E. coli LE392 (cellule 9
hôte) en suspension dans 18 ml de SM et on ajoute 3 x 10 PFU
20 de bactériophage HG-3,permettant ainsi à E. coli d'être infecté à 37°-C pendant 20 minutes. Alors, le mélange obtenu est ajouté à 3 litres de bouillon NZ et est soumis à une culture sous agitation à 37°C pendant 23 heures. On ajoute 60 ml de CHCl^ au mélange et on soumet encore 25 à une culture sous agitation pendant 30 minutes.
D'autre NaCl est ajouté au mélange jusqu'à une concen- i tration finale de 1 M, on laisse le mélange au repos pendant 15 minutes avec ensuite centrifugation pour obtenir le liquide surnageant. Alors, on ajoute du polyéthylène glycol 30 (poids moléculaire : environ 6.000) au mélange de façon que la concentration de polyéthylène glycol soit de 10¾ (poids/volume) et on laisse au repos pendant 22 heures à 4°C.
Les bactériophages sont recueillis par centrifugation. Les bactériophages obtenus sont mis en suspension dans 28 ml de 35 SM et on ajoute un volume égal de CHCl^. Après agitation e h j j a Λ 51 t i i au moyen d'un appareil Vortex pendant 30 secondes, le mélange est soumis à une centrifugation pour obtenir une phase aqueuse. On ajoute SM à la phase aqueuse de façon que la quantité totale soit de 30 ml. On ajoute 26,4 g de 5 CsCl au mélange obtenu et on dissout doucement, avec ensuite ultracentrifugation (45.000 t/mn, 20 heures) pour obtenir les bactériophages sous la forme d'une bande. Le mélange obtenu contenant les bactériophages est par rapport à 10 mM de NaCl-50 mM de trisipH 8)-10 mM de 10 MgC^· Alors, on ajoute EDTA, la protéinase K et 5D5 au mélange de façon que leurs concentrations soient de 20 mM, 50,^-g/ml et0,5?é (poids/volume), respectivement. Alors le mélange est traité à 65°C pendant 1 heure et est extrait avec du phénol, un mélange de phénol et de CHCl^ (1:1 en 15 volume) puis avec CHCl^. La phase aqueuse ainsi obtenue est dialysée par rapport à 10 mM de Tris(pH 8)-l mM EDTA.
La mesure d'absorption ultraviolette de la phase aqueuse obtenue montre que l'on obtient ADN pur du bactériophage HG-3.
20 On répète sensiblement les mêmes processus que décrits par rapport à la préparation d'ADN du bactériophage HG-3 pour obtenir les ADN des bactériophages HG-6 et HG-7.
Ainsi, on obtient 2.920yu<-g de HG-3, 1.100 j^q de HG-6 et 819/Lg de HG-7.
125 Selon la méthode de Southern E . M. Southern, J.Mol.
Biol., £8, 503 (1975) , l'analyse de maculage de Southern des ADN obtenus est accomplie. Les processus et conditions sont comme suit.
1) ADN : 30 HG-3 825 ng chacun HG-6 935 ng chacun HG-7 685 ng chacun 2) Digestion avec divers enzymes de restriction :
10 unités BamHI, 10 unités EcoRI 35 10 unités BamHI + 10 unités EcoRI
I ,f * 52 10 unités HindlII, 10 unités HindiII + 10 unités EcoRI 10 unités PvuII 37°C, 3 heures 5 - 3) Electrophorèse :
0,8?ô gel agarose TAE
28 V, 15,5 heures 4) Transfert à des filtres de nitrocellulose 10 [voir E. M. Southern, J.Mol.Biol., 98, 503 (1975)] 5) Pré-hybridation : 30 ml de FDSS 42°C, 6 heures 15 6) Hybridation fragment 5'(1 x 10^ cpm/ml) de pR18 (préparé à l'étape 4 de l'exemple 1) 42°C, 14 heures 7) Lavage : 20 2 x SSC - 0,1¾ SDS à la température ambiante *·
Immersion 10 minutes x 4 l
1 x SSC - 0,1¾ SDS à 50°C
: Immersion 30 minutes x 2 25 8) Exposition : XAR-5 (Eastman Kodak Company, E.U.A.) -80°C,2 écrans d'intensification, 14 heures Les résultats de l'hybridation sont montrés au tableau 4.
y / i a 53 TABLEAU 4
Enzyme Clone Dimension du fragment d'hybridation „ - * bactério- avec échantillon (PR18) _
Extrémité 5' Extrémité 3' HG-3 6,7 kb ’ «-
BamHI -6 11,2 kb ^_ -7 9,2 kb 4-
BamHI HG-3 2,9 kb «- + -6 " 4-
EcoRI -7 " «- HG-3 " *-
EcoRI -6 " +- -7 " 4-
HindiII HG-3 " 4- + _ -6 " 4-
EcoRI -7 " *- HG-3 9,7 kb *-
Hind III -6 4,1 kb ^_ -7 9,7 kb «- HG-3 2,2 kb 0,9 kb
PvuII -6 1,9 kb 0,9 kb _ -7_ 2,2 kb_[ 0,9 kb_
Note: Le symbole - " signifie que le même fragment s'hybride.
.4 / 54
Etape 8 (Analyse de maculage· de Southern des clones du lapin)
On répète sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 7 de l'exemple 1 à l'exception que chacun des bacté-„ 5 .riophages RG-1 et RG-2 est utilisé au lieu de chacun des bactériophages HG-3, HG-6 et HG-7. Ainsi, on accomplit l'analyse de maculage de Southern. Par suite, on trouve que le fragment 5' de pR18 est hybridé avec un seul fragment d'une bande de fragments que l'on obtient par scission de RG-1 et 10 RG-2 avec chacun de BamHI, EcoRI, BqlII, HindiII et
BamHI + EcoRI. Cela suggère que chacun des fragments hybridés avec le fragment J' de pR18 contient la totalité de la séquence des bases codant FNT.
Etape 9 (Construction des clones bactériens * 15 contenant le gène FNT génomique humain)
La méthode de Landy et autres \_ Biochemistry, volume 13, 2134 ( 1974) ^ est utilisée pour obtenir l'ADN de HG-3 comme on l’obtient à l’étape 5 ci-dessus. 33^M g de l'ADN HG-3 résultant sont digérés avec 80 unités de EcoRI à 37°C pendant 20 3 heures. Le condensé subit une électrophorèse sur 1% de gel agarose à faible point de fusion (conditions : 1 xTAE, 20 V, 14,5 heures). La bande de 2,9 kb est isolée du gel agarose ~ comme décrit par T. Maniatis [.Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, page 377 (1982)J . Plus particulièrement, 25 le gel découpé de la partie de bande de 2,9 kb est chauffé à 65°C pendant 15 minutes. Le fragment de HG-3 scindé par EcoRI ayant une longueur de 2,9 kb (souvent appelé ci-après "fragment de.2,9 kb de HG-3/EcoRI") est récupéré du gel fondu par extraction trois fois avec du phénol puis trois 30 fois avec de l'éthanol, avec ensuite précipitation avec de l'éthanol contenant de l'acétate d'ammonium. Ainsi, on obtient 637 ng (rendement :environ 30¾) de fragment de 2,9 kb de HG-3/EcoRI.
On lie 255 ng du fragment ci-dessus obtenu à 56,5 ng 35 de dUC 13 scindé par EcoRI [j. Messing, Methods in / 55 t ί
Enzymology, volume 101, 20 (1983)^ en utilisant 2,5 unités de ligase à 4DC pendant 20 heures.
La souche JM83 'de E. coli K12 est transformée en utilisant le produit de liaison ci-dessus obtenu. Plus 5 particulièrement, la souche JM83 de E. coli K12 est mise en culture dans le milieu LB jusqu'à ce que la densité optique du bouillon de culture soit de 0,3 à 550 nm. On recueille 50 ml de la culture de la souche JM83 de E. coli K12 , on lave avec 25 ml mM de MOPS (pH 7,0)l0 mM de 10 RbCl et on remet en suspension dans 25 ml de 0,1 M de MOPS (pH 6,5)-5 mM CaC^-lO mM RbCl. La suspension est refroidie sur de la glace pendant 30 minutes, centrifugée et remise en suspension dans un mélange de 2 ml de 0,1 M MOPS (pH 6,5)-50 mM CaCl2-10 mM RbCl et 30 de DMS0.
15 A 203 ,jl de la suspension, on ajoute lO^ul d'une solution aqueuse d'un produit de liaison contenant 10 ng du produit de liaison. Le mélange est refroidi sur de la glace pendant 30 minutes puis est chauffé à 4o°C pendant 60 secondes. Immédiatement après, on ajoute , au mélange chauffé, 5 ml 20 de bouillon LB préchauffé à 37°C , avec ensuite incubation à 37DC pendant 1 heure. Le bouillon de culture obtenu est soumis à une centrifugation et le liquide surnageant est retiré. Un milieu LB est ajouté à la boulette résultante de cellules, puis on inocule sur une plaque de LB contenant 25 30yu_g/ml d'ampicilline et 40jug/ml de X-gal. Des colonies contenant la souche JM83 de E. coli K12, qui ont été transformées avec les plasmides ayant l'insertion sont blanches, tandis que celles contenant la souche JM 83 de E. coli K12 qui ont été transformées avec le plasmide seul sont bleues. 30 Les colonies blanches obtenues sont inoculées de nouveau une plaque LB contenant 30^u_g/ml d'ampicilline et 40 μ-q/ml de X-gal dans le but d'une confirmation.
Des colonies blanches ci-dessus obtenues, on choisit 10 colonies (clones bactériens) et on sélectionne en 35 utilisant une technique "mini-prep" de Holmes and Quigley / 1 ' 56 » â j^Anal. Biochem., Volume 114, 193 (1981)3·
Plus particulièrement, chaque colonie est mise en culture pendant une nuit sur le milieu LB contenant 30yyg/ml d'ampicilline. Les cellules en croissance sont 5 recueillies et mises en suspension dans 2 mg/ml de V· lysozyme-50 mM de glucose-10 mM de EDTA-25 mM de tris HCl (pH 8,0). On laisse la suspension au repos à la température ambiante pendant 5 minutes, avec ensuite addition de 200 juJ. de 0,2 N NaOH-l^ SDS. Après lente agitation, on laisse la 10 suspension au repos à la température ambiante pendant 2 minutes. Ensuite, on ajoute 150jjJ. d'acétate de sodium à 3 M (pH 5,2), et on laisse au repos à -20°C pendant 10 minutes avec ensuite centrifugation pendant 15 minutes pour récupérer le liquide surnageant résultant. Au liquide 15 surnageant, on ajoute 900ml d'éthanol froid avec ensuite centrifugation pendant 5 minutes pour obtenir le précipité résultant . Le précipité obtenu est lavé avec 70¾ d'éthanol et séché pour obtenir un ADN plasmidique . Dans la méthode ci-dessus mentionnée, 10 ADN plasmidique sont obtenus.
20 Chaque ADN plasmidique est dissous dans 10 mM de Tris-0,1 mM de EDTA (pH 8,0), digéré avec EcoRI et est soumis à une électrophorèse pour une analyse par restriction. Les conditions de digestion et d'électrophorèse sont comme suit. Digestion : solution d'ADN plasmidique,un 2^ cinquième de la quantité préparée ci-dessus;
EcoRI, 3 unités, 37°C, 1,5 heures Electrophorèse : 1¾ de gel agarose; 1 x TAE; 120 V; 2 heures L'analyse par restriction ci-dessus montre que huit 50 des dix clones sont positifs. En effet, les huit clones ont un fragment de 2,9 kb. Des huit clones positifs, un clone est choisi et est désiqné par souche JM83 (pHGE) de E. coli K12 (ATCC 39656).
On répète sensiblement les mêmes processus qu'à 55 l'étape 2 ci-dessus pour préparer 1,89 mg d'ADN de pHGE, ο 57 à l’exception que l'on utilise la souche JM83 (pHGE) de E. coli K12 au lieu de E. coli récoltant pB2-7 et pR18.
Etape 10 (Sous-clonage de RG-1 scindé par EcoRI) 5- -On digère 30 μ. g de RG-1 tel que préparé à l'étape 6 ci-dessus avec EcoRI. Du mélange de fragments résultant, le fragment ayant une longueur d'environ 3,5 kb est récupéré sensiblement de la même manière qu'à l'étape 9 ci-dessus, à l'exception que l'on utilise le mélange de fragments ci-dessus préparé et 0,8¾ de gel agarose à faible point de fusion. On obtient 1,0 jfg du fragment RG-1 scindé par EcoRI (environ 3,3 kb). le fragment de RG-1 scindé par EcoRI (3,5 kb) ci-dessus obtenu est lié à pUC13 digéré par EcoRI sensiblement de la même façon qu’à l'étape 9 ci-dessus 15 à l'exception que le fragment scindé par EcoRI (3,5 kb) ci-dessus obtenu est utilisé au lieu du fragment HG-3 scindé par EcoRI (2,9 kb).
La transformation de la souche JM83 de E. coli K12, la sélection des clones bactériens, la digestion des clones 20 et l'électrophorèse sont effectuées sensiblement de la même façon qu'à l'étape 9 ci-dessus à l'exception que le produit de liaison ci-dessus obtenu est utilisé. Le clone obtenu est désigné par souche JM83 (pRGE) de E. coli K12· (ATCC 39655).
25 On répète sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 2 ci-dessus pour préparer 1,70 mg d'ADN de pRGE, à l'exception que l'on utilise la souche JM83 (pRGE) de E. coli K12 au lieu de pB2-7 et PR-18.
Etape 11 30 (Analyse de l'enzyme de restriction de l'ADN du plasmidique pHGE) L'analyse de l'enzyme de restriction de l'ADN de pHGE obtenu à l'étape 9 ci-dessus est effectuée selon la méthode décrite dans Maniatis [Molecular Cloning, Cold Spring 35 Harbor Laboratory, 98 (1982)J .
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58
Les processus et conditions utilisés sont comme suit.
1) Digestion de 1 ' ADN de pHGE avec EcoRI :
'18,6 d'ADN de pHGE 64 unités de EcoRI
5 - - 37°C, 2 heures 2) Précipitation dans l’éthanol : précipite
3) Addition d'eau distillée au précipité { Préparation de 1 jjjq/ml d'une solution de pHGE scindé par EcoRI
10 4) Digestion avec divers enzymes de restriction :
1 jjL-g depHGE/EcoRI
Enzyme de restriction : 5 unités de PvulI, 5 unités de PvulI + 10 unités de Rsal, 10 unités de Rsal, 4 unités de Mst 11, 3 unités 15 de Aval, 9 unités de PstI, 37°C, 2 heures 5) Electrophorèse 2¾ gel agarose, 1 x TAE 28 V, 14,5 heures 20 6) Transfert au filtre de nitrocellulose : L voir E.M. Southern , J. Mol. Biol., S^8, 503 (1975)] 7) Première pré-hybridation :
30 ml de FDSS
25 42°C, 6 heures 8) Première hybridation fragment 5' (5 x 10^1 cpm/ml ) de pR18 (préparé à l'étape 4 ci-dessus) 42°C, 14 heures 30 9) Lavage : 2 x SSC - 0,1¾ SDS à la température ambiante ^ Immersion 10 minutes x 4 - i 1 x SSC - 0,1¾ SDC à 50°C ^5 Immersion 30 minutes x 2 /_ 59 jj '* , 10) Exposition : XAR-5(Eastman Kodak Company , E.U.A.) -80oC^ 2 écrans d'intensification, 17,5 heures 11) Rinçage : 5 0,5 M NaOH - 1,5 M NaCl (Immersion: 1 minute) 0,5 M Tris - 1,5 M NaCl (Immersion: 1 minute) 3 x SSC (Immersion : 1 minute) 12) Exposition : 10 Effectuée de la même façon qu'en 10) ci-dessus, à l'exception que le temps d'exposition est de 19 heures 13) Seconde pré-hybridation :
De la même façon qu'en 7) ci-dessus 15 14) Seconde hybridation :
Insertion pB2-7 (préparée à l’étape 3 ci-dessus) 42°C, 16,5 heures 15) Lauage :
De la même façon qu'en 9) ci-dessus 20 16) Exposition
De la même façon qu'en 10) ci-dessus à l'exception que la durée d'exposition est de 19,5 heures 17) Rinçage : 25 De la même façon qu'en 11) ci-dessus 18) Exposition :
De la même façon qu'en 10) ci-dessus à l'exception que la durée d'exposition est de 20 heures 50 19) Troisième pré-hybridation
De la même façon qu'en 7) ci-dessus 20) Troisième hybridation
Fragment 3' (4,5 x 10 cpm/ml)de pR18 (préparé à l'étape 4 ci-dessus), 42°C, 55 15 heures il <1 60 - 21) Lavage :
De la même manière qu'à l'étape 9) ci-dessus 22) Exposition
De la'même façon qu'à l'étape 10)ci-dessus 5 Les résultats de l'analyse de l'enzyme de restriction s * sont montrés sur la figure 4.
Etape 12 (Analyse de l'enzyme de restriction de l'ADN du plasmidique pRGE) 10 Sensiblement de la même façon qu'à l'étape 11 ci-dessus, l'analyse de l'enzyme de restriction de l'ADN plasmidique pRGE préparé à l'étape 10 ci-dessus est effectuée, à l'exception que l'on utilise l'ADN plasmidique pRGE au lieu de l'ADN plasmidique de pHGE. La carte de res-15 triction de l'insertion d'ADN de pRGE obtenue est montrée sur la figure 5.
Etape 13 (Détermination des séquences de base du gène de FNT du lapin et du gène de FNT humain) 20 On répète sensiblement les mêmes processus qu'à l'étape 2 ci-dessus à l’exception que l'on utilise la souche JM83 (pHGE) de E. coli K12 obtenue à l’étape 9 ci-dessus et la souche JM83 (pRGE) de E. coli K12 obtenue à l'étape 10 ci-dessus au lieu de la souche MC1061 de 25 E. coli K12 ayant pB2-7 et la souche MC1061 de E. coli K12 ayant pR18. Ainsi, on obtient 150 yüg de chacun des ADN plasmidique pRGE et plasmidique pHGE.
Les séquences de base de pRGE et pHGE sont déterminées selon la méthode de Maxam-Gilbert [ Maxam et autres, Methods in enzymology, volume 55, 490 (I960; publiée par Academie PressJ .
La séquence des bases de pR18 déterminée dans l'exemple référentiel 3 est comparée à celle de pRGE déterminée ci-dessus pour élucider la structure, comprenant l'exon 35 et l'intron, du gène de FNT du lapin. La structure de i
P
A
! » 61 l'insertion d'ADN de pRGE est montrée sur la figure 5. Subséqu emment, la séquence desbases de pRGE est comparée à celle de pHGE pour rechercher l'homologie et la séquence de consensus autour de la limite entre l'intron et l'exon.
5. Ains,i, la structure, comprenant l'exon et l'intron, du gène de FNT humain est élucidée. La structure du gène de FNT humain est montrée sur la figure 4.
La séquence des bases ci-dessus obtenue codant pour le FNT du lapin et le FNT humain sera montrée ci-après. Dans 10 les séquences des bases la rangée supérieure montre la séquence de bases codant pour le FNT du lapin (R) et la rangée inférieure la séquence de bases codant pour le FNT humain (H).
R TCA GCT TCT CGG GCC CTG AGT GAC AAG CCT CTA GCC CAC GTA GTA
H TCA TCT TCT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA
15
R GCA AAC CCG CAA GTG GAG GGC CAG CTC CAG TGG CTG AGC CAG CGT
H GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CT G AAC CGC CGG
R GCG AAC GCC CTG CTG CGC AAC GGC ATG AAG CTC ACG GAC AAC CAG
H GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG
R CTG GTG GTG CCG GCC GAC GGG CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTT
H CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC
20 R CTC TTC AGC GGT CAA GGC TGC CGC TCC ... TAC GTG CTC CTC ACT
H CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC
R CAC ACT GTC AGC CGC TTC GCC GTC TCC TAC CCG AAC AAG GTC AAC
H CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC
R CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAC CGG GAG ACC CCC GAG
H CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG
25 R GAG GCT GAG CCC ATG GCC TGG TAC GAG CCC ATC TAC CTG GGC GGC
H GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG
R GTC TTC CAG TTG GAG AAG GGT GAC CGG CTC AGC ACC GAG GTC AAC
H GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT
R CAG CCT GAG TAC CTG GAC CTT GCC GAG TCC GGG CAG GTC TAC T T T
H CGG CCC GAC TAT CTC GAC T TT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC T T T
30
R GGG ATC ATT GCC CTG H GGG ATC ATT GCC CTG
I:>
Note : le symbole "..." signifie que cette partie dans la séquence de bases de l'ADN codant le FNT du ! / 62 lapin est nulle et par conséquent deux codons adjacents à ce symbole de ses deux côtés sont directement connectés.
Etape 14 i ^ 5 „ (Synthèse des oligodésoxynucléotides) ; Dans un récipient réactionnel en acier inoxydable ! de 500 /λ_1 avec des filtres en acier inoxydable à chaque | extrémité, on ajoute 20 mg d'une résine de polystyrène à ; laquelle un nucléoside (2,0 ^u-M) est connecté par une liaison ; IQ succinate. La résine est traitée avec du bromure de zinc i (Jyj-M) dans le dichlorométhane isopropanol (85:15) pour retirer le groupe protecteur de diméthoxytrityle (DMT),est lavée avec | du diméthylformamide, de la pyridine et de 11acétonitrile et i - | est séchée avec un courant d'azote. A la résine séchée, on | · [ 15 ajoute une solution de DMT-nucléotide (20 et de mésitylènesulfonylnitrotriazole (60 jM) dans 200 ^laJL de pyridine. On laisse la réaction de couplage se passer à 45°C pendant 20 minutes. Ce cycle de suppression de la protection et de couplage est répété pour des nucléotides successifs 20 jusqu'à ce que 1'oligodésoxynucléotide souhaité soit assemblé sur .la résine. La résine est alors traitée pour retirer 1'oligodésoxynucléotide et est purifiée comme décrit par Ito, Ike, Ikuta, et Itakura (Nue. Ac. Res., 10:1755 i (1982)).
i, 25 Ainsi on obtient les oligodésoxynucléotides qui i suivent.
! 1) 5'— ATTCATGTCATCTTCTCGAACCCCGAGTGACAA-3' I 2) 3'-GTACAGTAGAAGAGCTTGGGGCTCACTGTTCGG-5' 3) 5'-GCCTGTAGCCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAG-3r 30 4) 3'-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5' I Etape 15 S (Construction de M13mp9-HGE contenant le minigène humain pour FNT)
Le plamide pHGE (10 j*.g) est digéré avec EcoRI (20 j. unités). Après électrophorèse sur un gel agarose à 1 ?ô à l J.
j' i 63 * faible point de fusion, le fragment de 2,9 kb est élué.
Ce fragment est inséré dans le fragment de EcoRI de la forme reproductive de M13mp9 phage. Le M13mp9 phage est choisi parce qu'il est particulièrement adapté à la récep- 5. tion.de sections de l'ADN. Le produit est transféré à E. coli JM103 [ BRL (Bethesda Research Laboratories, Inc., E.U.A.) Manuel de 1'utilisateur/M13mp7 Cloning/1Dideoxy ' sequencing, 1980 3· Le produit est désigné par M13mp9-HGE.
Etape 16 10 (Délétion d'Intron 3, en utilisant l'ADN à un seul brin de M13mp9-HGE et le délétère E3-4) L'ADN à un seul brin de M13mp9-HGE est préparé par la méthode de BRL Manuel de 1'utilisateur/M13mp7 cloning/ 'Dideoxy' sequencing, 1980.
15 On utilise 1'oligodésoxynucléotide 4) 3'-ACATCGGGTACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT-5' préparé à l'étape 14 , comme délétère de l'intron 3. Le délétère de l'intron 3 est désigné par "E3-4".
Le délétère E3-4 a une séquence de bases qui est 20 complémentaire de la séquence de bases des bases avant (Exon 3) et après (Exon 4) l'intron 3 qui doit être délaissé.
La délétion de l'intron 3 est effectuée', selon l'enseignement de Wallace et autres , Science 209:1396 (1980), comme suit.
25 E3-4 (104 ng, 15 pmoles) est phosphorylé en utilisant la kinase T4 (108 unités) et ATP (3 mM) et on ajoute à l'étalon M13mp9-HGE (l,65^g, 0,5 pmole). Le mélange réactionnel est chauffé à 65°C pendant 65 minutes, refroidi à la température ambiante pendant 5 minutes et enfin 30 refroidi dans de l'eau glacée. A dATP, dCTP, dGTP, dTTP et ATP (0,4 mM), on ajoute un fragment de Klenow (5 unités), la ligase T4 (10 unités) dans un tampon Hint Wallace et autres, Nue. Ac. Res. 9_; 3647 (1981 ) 3 , 10 mM de Tris HCl (pH 7,2), 2 mM de MgC^ et 1 mM de /3-mercaptoéthanol.
35 Le mélange réactionnel (volume final 50 yul) est incubé Λ î i 64 Ί pendant 30 minutes à 4°C puis pendant 30 minutes à la température ambiante. L'ADN de la réaction amorcée par l'oligonucléotide est utilisé pour transférer E. coli JM103 selon le processus de BRL Manuel de 1'utilisateur/M13mp7 cloning/ v 5 'Dicfeoxy' sequencing, 1980. Les plaques obtenues de cette façon sont piquées à des plaques YT ^J.H. Miller, page 433, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor
Laboratory (1972) 3 · Les colonies obtenues sont hybridées 32 à 35°C pendant 2 heures avec E3-4 marqué . Pour cette 10 étape, le délétère est utilisé comme échantillon pour identifier les séquences de 1'ADN ayant la séquence de bases complémentaire correspondante après avoir laissé l'intron. Les phages sont isolés de ces colonies qui s'hybrident avec le délétère. Les phages résultants sont mis en plaques et les 15 plaques sont piquées à des plaques de YT. On laisse les clones s'hybrider à 55°C pendant 2 heures avec E3-4 32 marqué P. Les clones positifs sont obtenus et l'ADN phage est mis en séquence pour choisir les phages où l'intron 3 est totalement laissé. Un tel phage est désigné par 20 mp9-HGE Δ3-1.
Etape 17 (Construction de pHFNT-lacUV5-2)
La forme réplicative de mp9- hgeA3-i est digérée avec EcoRI. Le fragment de EcoRI est isolé et cloné à 25 pBR327 scindé par EcoRI pour donner le plasmide pHGeA.3-1.
La construction d'un autre plasmide est effectuée en utilisant le plasmide pHGEA3-l afin d'obtenir un tel plasmide il 3-1 pouvant exprimer directement FNT dans E. coli en utilisant lac UV5 comme promoteur. Les processus 30 sont illustrés à titre d'exemple sur la figure 7. D'abord, lO^Üg du plasmide pHGEA3-l sont digérés avec 10 unités de Aval et EcoRI (fabriqués et vendus par Bethesda Research Laboratories, Inc, E.U.A.) à 37°C pendant 2 heures et subissent une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide 35 à 4¾ en poids pour isoler les fragments. On isole, du gel, / h t 65 environ 1 js.q du fragment , par électroélution . De la même façon qu'à l'étape 14, deux oligodésoxynucléotides montrés sur la figure 7, c'est-à-dire 5'-AATTCATGTCATCTTCTCGAACC-3' et 5'-TCGGGGTTCGAGAAGATGACATG-3' sont synthétisés. Alors, 5 chaque extrémité 5'des deux oligodésoxynucléotides (environ 100 pmoles) est phosphorylée en utilisant la polynucléotide kinase selon la méthode décrite dans la littérature (3), page 122. Après accomplissement de la réaction, le mélange réactionnel est extrait avec du 10 phénol puis avec du chloroforme. Alors, les oligomères de synthèse ainsi obtenus sont mélangés avec 0,5^u_g du fragment précédemment obtenu de Aval-EcoRI du plasmide pHGEA3-l et précipités dans l'éthanol. Ces fragments sont i liés à 4°C pendant une nuit en utilisant 10 unités de i 15 ligase T selon le processus décrit dans la littérature i (1), page 37. Après accomplissement de la réaction, le .
mélange est précipité dans l'éthanol, avec ensuite électrophorèse effectuée sur un gel de polyacrylamide à 4% en poids pour récupérer le fragment par électroélution .
20 Selon le processus décrit dans F. Füller, "Gene", 19, pages 42-54 (1982), on prépare le plasmide pOP95-15.
1 yU-g de p0P95-15 est digéré avec EcoRI et extrait avec du phénol puis avec du chloroforme, avec ensuite précipitation dans l'éthanol pour obtenir un vecteur. En ! 25 utilisant l'ADN T4 ligase , 0,5 μ.g du vecteur obtenu est lié au fragment ci-dessus obtenu. Selon le processus décrit dans la littérature (4), page 20, on transforme E. coli JM101 (ATCC 33876) en utilisant le vecteur ci-dessus obtenu puis on met en culture sur un milieu d'agar 30 contenant 1 mM de IPTG et 0,004 poids/volume Pô de x-gal pour obtenir environ 100 colonies blanches.
L'ADN plasmidique est préparé à partir de ces ! transformants et est digéré avec EcoRI pour identifier les ( I - plasmides contenant le fragment voulu de Eco-RI. Afin
I
| 35 d'examiner la direction de l'insertion, ces plasmides sont ! / : fi m 66 digérés avec PvuII et PstI et subissent une électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,5¾ en poids pour choisir les ï- plasmides donnant de.s fragments d'environ 1280 paires de bases et environ 2600 paires de bases indiquant que la 5 direction de transcription du promoteur lac UV5 est en accord avec celle des oligodésoxynucléotides codant FNT.
L'analyse de la séquence de bases montre que ces deux plasmides ont la même séquence et que le promoteur lac UV5 , 1'oligodésoxynucléotide synthétisé et l'ADNc 10 sont bien combinés les uns avec les autres. Les plasmides obtenus sont désignés par pHFNT-lacUV5-2.
On met E. coli contenant pHFNT-lacUV5-2 en culture dans un milieu nutritif conventionnel. La bio-détermination du produit pour l'activité de FNT indique presque la même 15 activité que l'on obtient avec un plasmide pFNT-lacUV5-l contenant le gène de FNT du lapin sous le contrôle du promoteur lac.
EXEMPLE 2
En utilisant le plasmide pHGE et les oligodésoxy-20 nucléotides 1 à 4) obtenus par le processus décrit aux étapes 1 à 14 de l'exemple 1, on prépare pHFNT-lacUV5-l selon le processus illustré sur la figure 6.
Les micro-organismes et les nouveaux plasmides ont été placés en dépôt à l'American Type Culture Collection 25 à Rockville, Maryland, E.U.A., le 6 Avril 1984 en déposant des échantillons des micro-organismes contenant les plasmides. La souche JM83 (pRGE) du micro-organisme E. coli K-12 a reçu le numéro d'accession ATCC 39655. La souche JM83 (pHGE) du micro-organisme E. coli K12 a reçu le 30 numéro d'accession ATCC 39656.
L'invention ayant été ainsi décrite, il sera évident qu'elle peut être modifiée de nombreuses façons. De % 67 telles variations ne doivent pas être considérées comme s'écartant du cadre et de l'esprit de l'invention et toutes les modifications évidentes à toute personne compétente en la matière sont incorporées dans le cadre 5 de celle-ci.
A
î
Claims (36)
1. Polypeptide physiologiquement actif humain, caractérisé en ce qu'il a une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) : Ser 5er Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val 5 Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn
10 Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 15 où Gin indique un résidu de glutamine, Asp un résidu d'acide aspartique, Pro un résidu de proline, Tyr un résidu de tyrosine, Val un résidu de valine, Lys un résidu de lysine, Glu un résidu d'acide glutamique, Ala un résidu d'alanine, Asn un résidu d'asparagine, 20 Leu un résidu de leucine, Phe un résidu de phényl- alanine, Gly un résidu de glycine, His un résidu d'histidine, Ser un résidu de sérine, Thr un résidu de thréonine, Ile un résidu d'isoleucine, Trp un résidu de tryptophane, Arg un résidu 25 d'arginine, Met un résidu de méthionine et Cys un résidu de cystéine. 2, - Acide désoxyribonucléique, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de bases codant pour un polypeptide physiologiquement actif humain , ledit 30 polypeptide physiologiquement actif humain ayant une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) qui suit : / / c 69 M Ser 5er Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg ç Ala Asn Ala Leu Leu.Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser· Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val
5 Leu Phe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn
10 Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu où Gin indique un résidu de glutamine, Asp un résidu » d'acide aspartique, Pro un résidu de proline, Tyr un résidu de tyrosine, Val un résidu de valine, Lys un 15 résidu de lysine, Glu un résidu d'acide glutamique, Ala un résidu d'alanine, Asn un résidu d'asparagine, Leu un résidu de leucine, Phe un résidu de phényl-alanine, Gly un résidu de glycine, His un résidu d'histidine, Ser un résidu de sérine, Thr un 20 résidu de thréonine, Ile un résidu d'isoleucine, Trp un résidu de tryptophane, Arg un résidu d'arginine, Met un résidu de méthionine et Cys urr résidu de cystéine.
3. Acide désoxyribonucléique caractérisé en ce 25 qu'il comprend au moins une séquence de bases choisie dans le groupe consistant en une séquence de bases représentée par la formule (II) qui suit et une séquence de base complémentaire de ladite séquence de bases: TCA T CT T CT CGA ACC CCG AGT GAC AAG CCT GT A GCC CAT GTT GT A
30 GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CT G AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CT G AGA GAT AAC CAG CT G GTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC AT C AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC
35 CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG 69 Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val - 5 Leu P-he Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn
10 Arg Pro Asp Tyr Leu Asp.Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu où Gin indique un résidu de glutamine, Asp un résidu d'acide aspartique, Pro un résidu de proline, Tyr un résidu de tyrosine, Val un résidu de valine, Lys un 15 résidu de lysine, Glu un résidu d'acide glutamique, Ala un résidu d'alanine, Asn un résidu d'asparagine, Leu un résidu de leucine, Phe un résidu de phényl-alanine, Gly un résidu de glycine, His un résidu d'histidine, Ser un résidu de sérine, Thr un 20 résidu de thréonine, Ile un résidu d'isoleucine, Trp un résidu de tryptophane, Arg un résidu d'arginine, Met un résidu de"méthionine et Cys un résidu de cystéine.
3.- Acide désoxyribonucléique caractérisé en ce 25 qu'il comprend au moins une séquence de bases choisie dans le groupe consistant en une séquence de bases représentée par la formule (II) qui suit et une séquence de base complémentaire de ladite séquence de bases: TAC TCT TCT CGA ACC CCG AT G GAC AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA 3Q GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG T GG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGC GT G GAG CTG AGA GAT AAC CAG CT G GT G GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC
35 CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG / 70 GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC CTG 5- - où A indique un résidu d'acide désoxyadénylique, G un résidu d'acide désoxyguanylique, C un résidu d'acide désoxycytidylique, et T un résidu d'acide thymidylique et en ce que l'extrémité gauche et l'extrémité droite de la formule (II) représentent 10 le côté du groupe 5'-hydroxyle et le côté du groupe 3'-hydroxyle , respectivement.
4. Acide désoxyribonucléique caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de bases qui est obtenue par substitution d'au moins une base de ladite séquence de 15 bases de l'acide désoxyribonucléique selon la revendication 3 selon la dégénération du code génétique.
5. ADN recombinant réplicable,caractérisé en ce qu'il comprend un acide désoxyribonucléique selon la revendication 2 et un véhicule d'expression réplicable. 20 6.- Micro-organisme ou culture de cellule , caractérisé en ce qu'il est transformé par un ADN recombinant réplicable selon la revendication 5.
7,- Procédé de production d'un polypeptide physiologiquement actif humain ayant une activité de FNT,-25 caractérisé en ce qu'il comprend : (a; la liaison à un véhicule d'expression répii-cable d'un acide désoxyribonucléique comprenant une séquence de bases codant un polypeptide physiologiquement actif humain, ledit polypeptide physiologiquement 30 actif humain ayant une séquence d'acides aminés représentée par la formule (I) qui suit : ’ A « 71 Ser Ser Ser Arg Thr Pro 5er Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gin Ala Glu Gly Gin Leu Gin Trp Leu Asn^Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gin Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gin Val
5 Leu Fhe Lys Gly Gin Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gin Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gin Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gin Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn
10 Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gin Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu où Gin indique un résidu de glutamine, Asp un résidu d'acide aspartique, Pro un résidu de proline, Tyr un un résidu de tyrosine, Val un résidu de valine,
15 Lys un résidu de lysine, Glu un résidu d'acide glutamique, Ala un résidu d'alanine, Asn un résidu d'asparagine, Leu un résidu de leucine, Phe un résidu de phénylalanine, Gly un résidu de glycine, His un résidu d'histidine, Ser un résidu de sérine, Thr un 20 résidu de thréonine, Ile un résidu d'isoleucine, Trp un-résidu de tryptophane, Arg un résidu d'arginine, Met un résidu de méthionine et Cys un résidu de cystéine pour obtenir un ADN recombinant ré-plicable comprenant ledit 25 acide désoxyribonucléique et ledit véhicule d'expression réplicable; (b) la transformation des cellules d'un micro-organisme ou d'une culture de cellule avec ledit ADN recombinant réplicable pour former des transformants; 30 (c) le choix desdits transformants à partir de cellules parentes du micro-organisme ou de la culture de cellule . (d) l'incubation desdits transformants, forçant lesdits transformants à exprimer ledit acide désoxyribo-35 nucléique et à produire un polypeptide physiologiquement y 72 actif humain; et (e) l'isolement dudit polypeptide physiologiquement actif humain des transformants incubés.
8. Polypeptide physiologiquement actif sensiblement 5 pur,.caractérisé en ce qu'il a la séquence d'acides aminés définie à la revendication 1.
9. Polypeptide physiologiquement actif sensiblement pur, caractérisé en ce qu'il a l'activité de FNT humain.
10. Acide désoxyribonucléique sensiblement pur, 10 caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de bases codant un polypeptide ayant une activité de FNT humain.
11. Acide désoxyribonucléique sensiblement pur, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence définie à la revendication 3. 15 12.- Vecteur de transfert de plasmide ou de bactériophage, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de bases codant un polypeptide ayant une activité de FNT humain.
13. Vecteur de transfert de plasmide ou de 20 bactériophage, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence de bases codant un polypeptide défini à la revendication 1.
14. Culture de micro-organisme ou de cellule, caractérisée en ce qu'elle est transformée par le vecteur de transfert de la revendication 12 et ses mutants ou 25 variantes.
15. Culture de micro-organisme ou de cellule, caractérisée en ce qu’elle est transformée par le vecteur de transfert selon la revendication 13 , et ses mutants ou variantes. 30 16.- Nouveau micro-organisme E. coli, caractérisé en ce qu'il s'agit du E. coli K-12 souche JM83 (pRGE).
17. Nouveau micro-organisme E. coli, caractérisé en ce qu'il s'agit de E. coli K-12 souche JM83 (pHGE).
18. Nouveau plasmide caractérisé en ce qu'il s'agit 33 du plasmide pRGE. / /, 73 'l
19. Nouveau plasmide caractérisé en ce qu’il s'agit du plasmide pHGE'.
20. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficade anti-tumeur ou antivirale d'un polypeptide selon la revendication 9 et 3 au moins un véhicule, diluant ou excipient acceptable en pharmacie.
21. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité efficace anti-tumeur ou antivirale d'un ooiypeptide selon la revendication 1 10 et au moins un véhicule, ciluant ou excipient acceptable en pharmacie.
22. Polypeptide en substance tel que décrit.
23. Acide désoxyribonucléique en substance tel que décrit.
24. Micro-organisme ou culture de cellule en substance tel que décrit.
25. Procédé de production d'un polypeptide en substance tel que décrit.
26. Vecteur de transfert en substance tel que 20 décrit.
27. Nouveau micro-organisme en substance tel que décrit.
28. Nouveau plasmide en substance tel que décrit.
29. Composition pharmaceutique en substance telle 25 que décrite. ta
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|---|---|---|---|
| US06/597,372 US4879226A (en) | 1984-04-06 | 1984-04-06 | Novel human physiologically active polypeptide |
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