MC1019A1 - Nouveaux peptides et leurs procédés de préparation - Google Patents

Description

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L'objet de la présente invention est constitué par de nouveaux peptides à activité hypocalcémiante de formule I :

1 \ 2 3 4 5 6 7l 8 9 10 11 12 13 14 H~Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys- X -Leu-Gly-Thr-Tyr-ïhr-Gln

5

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 A sp-Phe-Asn-Lys-Phe-H i s-Thr~Ph e-P ro-Gln-ïhr - A1a-11e-Gly-

29 30 31 32 (I)

10 Val-Gly-Ala-Pro-NH^,

dans laquelle X représente un radical de L-méthionine, L-valine,

L-norvaline, L-leucine, L-isoleucine, L-norleucine ou d'acide

L— ^-aminobutyrique et surtout un radical de L-méthionine ou de

15 L-valine et dans laquelle la L-alanine est remplacée par la

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L-Asparagine et/ou la L-isoleucine par la L-thréonine et dans laquelle éventuellement un ou plusieurs des amino-acides dans les positions 11, 12, 16, 19, 22 et 24 sont échangés contre un autre

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amino acide, à savoir la L-thréonine contre la L-lysine,

20 la L-tyrosine"^ contre la L-leucine, la L-phénylalanine"^

iq contre la L-leucine, la L-phénylalanine ^ contre la L-leucine,

pô 24

la L-phénylalanine contre la L-tyrosine et la L-glutamine contre la L— arginine, leurs dérivés ainsi que leurs sels d'addition d'acides et leurs complexes et des procédés pour les prépa-25 rer.

Comme dérivés, il faut citor en premier lieu les dérivés N"1 -acylés ainsi que les désamino^-peptides.

Les groupes acyle pour l'acylation du groupe îM -amino sont les radicaux d'acides carboxyliques, comme des acides . 30 carboxyliques aliphatiques, aromatiques, araliphatiques, hétéro-cycliques et hétérocyclyl-aliphatiques, en particulier des acides alcane- ou alcènecarboxyliaues, mono- ou divalents,

surtout des acides alcanoïaues inférieurs contenant 1 à 4 atomes de.carbone, comme les acides formique, acétique, propioniaue, 35 butyrique, ainsi que les acides acrylique, succinique, des acides alicycliau.es comme les acides cycloalcoylcarboxyliques 'comme les acides benzoïque ou phtalique non substitués ou substitués, des acides aryl-alcoyle (inférieur) ou alcénylcarbo-

£

xyliques non substitués et à substituant aryle, comme l'acide phénylacétique, des acides hétérocycliaues non substitués ou substitués mono- ou divalents contenant 5 ou 6 membres avec l'azote, le soufre et/ou l'oxygène comme hétéroatomes, comme les 5 acides pyridinecarboxyliques, les acides thiophènecarboxyliques, ou des acides hétérocyclyl-alcanoïques inférieurs, comme l'acide pyridylacétique, l'acide imidazolylacétique, dans lesquels les substituants des cycles sont par exemple des atomes d'halogène, des groupes nitro, des groupes alcoyle inférieur ou alcoxy infé-10 rieur ou des groupes carbalcoxy inférieur. En outre, il faut nommer comme radicaux acyle les radicaux acyle d'aminoacides, en particulier d'^-aminoacides, comme par exemple les radicaux glycyle, L-leucyle, L-pyroglutamyle ou encore les radicaux acyle qui dérivent de l'acide carbonique ou thiocarbonique ou de leurs 15 esters ou amides, par exemple des groupes alcoyl(inférieur)

oxycarbonyle comme les groupes athoxycarbonyle, tert.-butyloxy-carbonyle, benzyloxycarbonyle, carbamoyle et thiocarbamoyle non substitués ou substitués comme indiqué ci-dessus ainsi que des • groupes carbamoyle et thiocarbamoyle N-substitués, par exemple 20 les groupes K-alcoyl(inférieur)carbamoyle, N.-phénylcarbamoyle, N-phényl-thiocarbamoyle.

Comme sels d'addition d'acides il faut citer surtout les sels d'acides thérapeutiquement utilisables comme les acides chlorhydriaus, acétique, sulfurique, phosphorique et sulfoniques, 25 comme les acides alcane(inférieur)sulfoniques, benzène- bu toluènesulfoniaue.

Par complexes il faut entendre des composés dont la structure n'est pas éclaircie qui -se forment par addition de certaines substances inorganiques ou organiques à des peptides à 30 longue chaîne et qui confèrent à ces derniers une durée d'action plus longue. De telles substances sont décrites par exemple pour l'ACTH et autres peptides à activité adrénocorticotropiaue. Il faut citer par exemple des composés inorganicues dérivés du calcium, du magnésium, de l'aluminium, du cobalt et en particulier 35 du zinc, surtout des sels difficilement solubles comme les phosphates, pyrophosphates et polyphosphates ainsi que les hydroxydes de ces métaux, des polyphosphates de métaux alcalins comme par exemple "Calgon K", "Calgon 322", "Calgon 188" ou

s

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"Polyron B 12". Des substances organiques qui provoquent une prolongation de l'action, sont par exemple la gélatine non antigène, par exemple la polyoxygélatine, la polyvinylpyrrolidone et la carboxyméthylcellulose, ainsi que les esters sulfoniques

5 ou phosphoriques de l'acide alginiaus, le dextrane, les poly-phénols et les polyslcools, surtout le phosphate de poly-phlorétine et l'acide phytique et les polymérisats et copolymé-risats d'aminoacides basiques ou surtout acides, par exemple la protamine ou l'acide polyglutamique.

10 'Les nouveaux composés présentent une activité hypocal-

cémiante- Ils abaissent la teneur du sang en plasma, calcium et phosphates chez les mammifères, comme on l'a déterminé par des essais sur rats. Ils peuvent être employés dans les hypocalcémies, 1'ostéoporose et l'ostéite déformante. La séparation d'électro-

*15 lytes dans l'urine est la même que pour la calcitonine de l'homme, au contraire de la Salmcalcitonine, qui provoque des fortes actions rénales.

Les nouveaux composés sont obtenus par des procédés en soi connus, en condensant dans un ordre quelconque les aminoacides "20 nécessaires pour leur construction avec formation de liaisons

COKH, les groupes fonctionnels ne prenant pas part à la réaction étant intermédiairement protégés et les radicaux de cystéine étant oxydés en le radical cystine à un moment quelconque. C'est ainsi qu'ils peuvent être obtenus.

25 1. en séparant le(s) groupe(s) protecteur(s) dans des composés de formule I.

l[ 2 " 3 4 . 5 6 7| . 8.9 10 11 12' 13 14 H-Cys~Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys- X -Leu-Gly~Thr-Tyr~Thr-Gln-15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

30 Asp-Phe-Asn-Lys-Phe~His~Thr-Phe-Pro~Gln--Thr~Ala-Ile~Gly-

29 30 31 32 (I)

Val-Gly-Ala-Pro-KHg,

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dans laquelle X a ia signification donnée et la L-alanine est

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35 remplacée par la L—asparagine et/ou. la L-isoleucine par la _ .

• L-thréonine et dans.lesquels éventuellement un ou plusieurs des aminoacides dans les positions 11, 12, 16, 19, 22 et 24 sont ^ . remplacés par les aminoacides cités' ci-dessus ou dans leurs

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dérivés, dans lesquels au moins un groupe amino ou un groupe carboxylique est protégé par un groupe protecteur séparable ou 2. en oxydant en disulfures des composés de formule II : 1 2 3 4 5 ' 6 7 8 9 10 11 12 13 5 H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys- X -Leu-Gly-îhr-ïyr~Thr-14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-28 29 30 31 32

Gly-Val~Gly-Ala-Pro-NH2 (II)

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pd*

dans laquelle X a la signification indiquée et la L-alanine est

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remplacée par la L— asparagine et/ou la L-isoleucine par la L-thréonine et dans lesquels éventuellement un ou plusieurs des aminoacides dans les positions 11, 12, 16, 19, 22 et 24 sont 15 remplacés par les aminoacides cités ci-dessus, ou dans leurs dérivés dans lesquels les groupes mercapto sont libres ou protégés par le groupe trityle ou par un groupe protecteur acylaminométhyle et, si on le désire, on transforme 'les peptidamides obtenus en . leurs sels d'addition d'acide ou leurs complexes. 20 Pour l'obtention des produits de dé.part pour la première variante du procédé .selon l'invention, comme aussi pour l'obtention de tous les produits intermédiaires, les groupes protecteurs entrant en ligne de compte sont surtout ceux qui sont connus par la synthèse de peptides à longue chaîne et qui peuvent être 25 séparés facilement, par exemple par hydrolyse, réduction, amino-lyse ou hydrazinolyse.

Comme groupes protecteurs d?aminé, on peut citer par exemple les groupes aryl-alcoyle inférieur éventuellement substitués par exemple par un halogène ou un groupe nitro, 30 alcoyle inférieur ou alcoxy inférieur comme des groupes diphényl-méthyle ou triphénylméthyle, par exemple des groupes benzhydryle, trityle, di-paraméthoxybenzhydryle, ou des groupes acyle, comme les groupes formyle, trifluoroacétyle, phtaloyle,_ p-toluène-sulfonyle, benzylsulfonyle, benzènesulfényle, o-nitrophényl-35 suifényle ou surtout des groupes dérivant de l'acide carbonique • ou thiocarbonique comme des groupes carbober.zoxy éventuellement substitués dans le radical aromatique par des atomes d'halogène, des groupes nitro ou des groupes alcoyle inférieur ou alcoxy

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inférieur ou carbalcoxy inférieur, par exemple des groupes carbobenzoxy,' p-bromo- ou p-chlorobenzoxy, p-nitrobobenzoxy, p-méthoxycarbobenzoxy, des groupes benzyloxycarbor.yle colorés comme les groupes p-phényl-azo-benzyloxycarbonyle et p-(p'-5 méthoxyphényl-azo)-benzyloxycarbonyle, tolyloxycarbonyle, 2-phényl-isopropyloxycarbonyle, 2-tolylisopropyloxycarbonyle et surtout • 2-(para-biphénylyl)-2-propyloxycarbonyle, ou encore des groupes oxycarbonyle aliphatiques comme par exemple les groupes allyloxy-carbonyle, cyclopentyloxycarbonyle, tert,-amyloxycarbonyle, adaman-10 tyloxycarbonyle, isobornyloxycarbonyle, 2,2,2-trichloroéthyloxycar-bonyle, 2-iodoethoxycarbonyle et en premier lieu tert.-butyloxycarbonyle, et des groupes carbamoyle, thiocarbamoyle, N--phényl-carbamoyle et -thio-carbamoyle.

Les groupes amino peuvent aussi être protégés par forma-15 tion d'énsmines, obtenues par réaction du groupe amino avec des 1-3-dicétones, par exemple la benzoylacétone, 11acétylacétone ou le dimédon.

Les groupes carboxyle sont protégés par exemple par formation d'amides ou d'hydrazides ou par estérification. Les groupes 20 amides et hydrazides peuvent éventuellement être substitués,

le groupe amide par exemple par le groupe 3,4-diméthoxybenzyle ou bis-(p-méthoxyphényl)-méthyle, le groupe hydrazide par exemple par le groupe carbobenzoxy, le groupe trichloroéthyloxycarbonyle, le groupe trifluoroacétyle, le groupe trityle, le groupe tert.-25 butyloxycarbonyle ou le groupe 2-(p-biphénylyl)~isopropyloxy~ carbonyle. Pour 2'estérification conviennent par exemple les alcanols inférieurs éventuellement substitués comme le méthahol, l'éthanol, l'alcool cyanométhyliaue, le 2,2,2-trichloroéthar.ol, le 2-iodoéthanol, l'alcool benzoylméthylique ou en particulier 30 le tert.-butanol, les aralcanols, comme les arylalcanols inférieurs, par exemple des alcools benzylique ou benzhydrylique comme l'alcool p-nitrobenzylique, l'alcool p-méthoxybenzylique ou 2,4,6-triméthylbenzylique, les phénols et thiophénols éventusllement substitués par des substituants capteurs d'électrons comme le 35 phénol, le thiôphénol, le thiocrésol, le p-nitrothiophér:ol, les 2,4,5- et 2,4,6-trichlorophsnols, le p-ntachlorophér.ol, le p-nitrophénol, le 2,4-dinitrophénol, le p-cyanophér.ol ou le p-■ méthanesulfonylphénol, ou encore par exemple le N-hydroxyphtalimide

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la N-hydroxypiperidine, la 8-hydroxyquinoléine.

Les groupes hydroxy des radicaux de serine, thréonine et tyrosine peuvent être protégés par exemple par estérification ou éthérification. Comme radicaux acyle pour 1 ' estérification, 5 conviennent des radicaux alcanoyle inférieur comme les radicaux acétyle, aroyle comme le radical ber.zoyle et surtout des radicaux dérivant de l'acide carbonique comme l'acide benzyloxycarbonyle ou éthyloxycarbonyle. Pour 1'éthérification des groupes appropriés sont par exemple des groupes bsnzyle, tétrahydropyrannyle ou tert. 10 -butyle. Conviennent aussi pour la protection des groupes hydroxjrle les groupes 2,2,2-trifluoro-l-tert.~butyloxycarbonyl~amino ou -1-benzyloxycarbonylaminoéthyle décrits dans Ber.100 (1967) 3838-3849 (Y/eygand). I.îais les groupes hydroxylc n'ont pas besoin d'être nécessairement protégés.

15 Les groupes mercapto des radicaux de cystéine sont proté

gés par acylation ou par alcoylation. Pour l'acylation un radical approprié est par exemple le radical acétyle ou benzoyle, le radical éthylcarbamoyle ou le radical carbobenzoxy éventuellement substitué. Pour 1'alcoylation sont appropriés par exemple les 20 radicaux tert.-butyl- ou benzylthiométhyle ou des radicaux aryl-méthyle éventuellement substitués comme les radicaux ber.zyle, p~ nitrobenzyle, diphénylméthyle, diméthoxybenzhydryle ou trityle, ou phénylcyclohexyle, thiényl(2)-cyclohexyle entre autres, cf. ber. 101 (1968), 681 ou encore par exemple un radical acylamidornéthyie, 25 cf.Tetrahedron Letters No. 26 (1968) page 3057 ou la LOS 2 060 969. Un radical acylamidométhyle est par exemple un groupe de formule -CHg-NH-CO-R, dans lequel CO-R est le radical œyle d'un acide carboxylique, comme un acide carboxylique aliphatique, aromatique, araliphatique ou hétérocyclique ou un dérivé de l'acide carbonique 30 comme un radical d'ester carbonique ou carbamique. En premier lieu R est un groupe alcoyle inférieur éventuellement substitué, • par exemple un radical méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, n-butyle, ou tert.-butyle, qui peut contenir comme substituants •par exemple du chlore ou un groupe trifluorométhyle ou nitro. Be 35 plus R est par exemple un radical cycloalcoyle éventuellement substitué avec 3 à. 8, de préférence 5 à 6 atomes cycliques comme le radical cyclopentyle ou cyclohexyle ou un radical aromatique ou ■araliphatique éventuellement substitué dans lequel le radical aromatique est de préférence le noyau benzène, surtout un radical phényle ou benzyle éventuellement substitué, par exemple un

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radical phényle ou benzyle non substitué ou substitué dans le radical phényle par des radicaux alcoyle inférieur, alcoxy inférieur, halo ou nitro, ou un radical hétérocyclyle de préférence monocyclique éventuellement substitué -comme indiqué, par exemple 5 un radical thiényle ou furyle. En' particulier un radical acylarnido-méthyle représente un radical acétylamidométhyle. Le groupe imino de l'histidine n'exige pas absolument d'être protégé, il peut pourtant être avantageux de le protéger, par exemple oar un groupe benzyle, trityle, carbobenzoxy, adamantyloxycarbonyle ou les 1B groupes de Weygand cités.

Ces groupes protecteurs peuvent être scindés de façon connue. C'est ainsi qu'on peut scinder le groupe carbobenzoxy par hydrogénolyse, le groupe IV-trityle avec des acides minéraux comme l'acide chlorhydrique ou un acide organique comme l'acide fornique, 15 l'acide acétique, l'acide chloroacétique ou l'acide trifluoro-acétique dans le trifluoroéthanol aqueux ou absolu comme solvant ou avec l'acide acétique aqueux, le groupe tert,-butyloxycarbonyle avec l'acide trifluoroacétique ou l'acide chlorhydrique, le groupe 2-(p-biphénylyl)-isopropyloxycarbonyle avec l'acide acétique 20 aqueux ou avec un mélange d'acide acétique, d'acide fornique

(à 82,8 fo) et d'eau (7:1:2). L'ester méthylique peut être transformé par l'hydrate d'hydrazine en l'hydrazide. Avec de la lessive de soude diluée le groupe ester méthylique ou éthylique est hydrolyse. L'ester tert.-butylique est scindé par exemple avec 25 l'acide trifluoroacétique, de même que l'éther tert.-butylique.

De préférence, on emploie dans la première variante du procédé selon l'invention pour protéger le groupe carboxyle de la chaîne latérale et éventuellement le groupe carboxyle terminal le groupe tert.-butylester, pour protéger le groupe amino de la 30 chaîne latérale le groupe tert.-butyloxycarbonyle, pour les groupes hydroxyle des radicaux de sérine, thréonine et tyrosine, pour autant que ces groupes sont surtout protégés, le groupe tert.-butyléther, et, si on le désire, pour protéger le groupe imino de l'histidine le groupe 2,2,2-trifluoro-l-tert.-butyloxy-35 carbonylaminoéthyle. Tous ces groupes protecteurs peuvent, si.on le désire, être scindés en une seule étape par hydrolyse acide, par exemple au moyen de l'acide trifluoroacétique, de l'acide chlorhydrique ou de l'acide fluorhydrique.

Dans la deuxième variante du procédé selon l'invention, le peptide à chaîne ouverte-utilisé comme produit de départ peut de même être préparé avec les groupes protecteurs cités pour la variante 1).

Les groupes mercapto sont protégés de préférence par des radicaux benzyle, trityle ou acylamidométhyle. Les groupes S-trityle peuvent être scindés sélectivement du peptide protégé en solution organique (en respectant les groupes scindables par l'acide trifluoroacétique) avec l'acétate mercurique et l'hydrogèn sulfuré. Les groupes S-benzyle peuvent être scindés du peptide protégé par le sodium dans l'arrmoniac liquide. Les groupes S-acylamidométhyle peuvent être scindés du peptide protégé par agitation du peptide de préférence à la température ambiante dans une solution aoueuse d'un" sel hydrosoluble de métal lourd comme un acétate ou un nitrate de mercure, d'argent, de cadmium, d'étain etc., ou un sel organométallique d'un métal lourd. T,n dehors de l'eau, on peut employer d'autres solvants comme le méthanol, le diméthylformamide ou des mélanges de ces solvants. Dans tous les cas on obtient le peptide protégé avec des groupes mercapto libres. Ce dernier peut être oxydé en disulfure protégé, par exemple avec l'iode dans l'acide acétique, avec le diiodoéthane dans les solvants organiques ou avec l'oxygène de l'air dans l'ammoniac liquide. Il est particulièrement avantageux de protéger les groupes mercapto par des groupes trityle ou acylamidométhyle et d'éliminer ces derniers du peptide protété en formant simultanément le pont disulfure avec l'iode par exemple dans le méthanol ou l'acide acétique. La formation, du cycle disulfure peut être réalisée dans l'étape d'une séquence partielle contenant l'un des deux radicaux cystéine, par exemple du aécapeptide 1-10 ou dans l'étape du dotriacontapeptidamide.

Dans la préparation des dérivés K-acylés, le groupe acyle peut être employé comme groupe protecteur d'aminé.

Les peptides obtenus peuvent être transformés ultérieurement de façon en soi connue en leurs sels d'addition d'acides et/ou en leurs complexes.

La formation des sels d'addition d'acides est réalisée 'de façon connue.

La formation des complexes est également effectuée par des procédés connus ou par des procédés équivalents à ces procédés c onnus..

Les complexes avec des substances inorganiques comme des composés métalliques difficilement solubles, par exemple des composés d'aluminium ou de zinc sont obtenus de façon analogue à ce qu'on connaît pour l'ACTH, par exemple par réaction avec un sel soluble du métal en cause, par exemple le chlorure ou le sulfate de z-inc et précipitation avec un phosphate et/ou un hydroxyde de métal alcalin. Les complexes avec des composés organiques comme la polyoxygélatine, la carboxyméthylcellulose, la polyvinylpyrrolidone le phosphate de polyphlorétine, l'acide polyglutamique etc., sont obtenus par mélange de ces substances avec le peptide en solution aqueuse. Le la même façon on obtient aussi des composés insolubles avec des polyphosphates de métaux alcalins.

L'invention concerne aussi les modes de réalisation du procédé dans lesquels on part d'un produit intermédiaire pouvant être obtenu en une étape quelconque du procédé et on effectue les opérations manquantes, ou dans lesquels on interrompt le procédé à une étape quelconque et/ou on forme un produit de départ in situ et/ou on l'emploie sous forme d'un sel.

Les peptides utilisés comme produits de départ sont obtenus en associant les aminoacides, si nécessaire ou désiré, en employant des groupes protecteurs facilement séparables, dans la séquence désirée individuellement ou après formation préalable de plus petites unités de peptides, le pont disulfure étant éventuellement formé dans une étape appropriée de la synthèse. On opère de façon appropriée selon les procédés convenant à l'obtention de peptides à longue chaîne en tenant compte du pont disulfure, comme'on les connaît d'après la littérature.

L'association des unités d*aminoacides et/ou de peptides est obtenue par exemple en faisant réagir un aminoacide ou un peptide contenant un groupe A -amino protégé et un groupe carboxyle terminal activé, avec un aminoacide ou un peptide contenant un groupe -amino libre et un groupe carboxyle terminal libre ou protégé, par exemple ostérifié ou arr.idifié ou en faisant réagir un aminoacide ou un peptide contenant un groupe ^-amino activé et un groupe carboxyle terminal protégé avec un aminoacide ou un

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peptide présentant un groupe carboxyle terminal libre et un groupe /.-amino protégé. Le groupe carboxyle peut être activé par exemple par transformation en un azidure, un anhydride, un imidazolide, un isoxazolide d'acide ou un ester activé, comme un ester de cyanoraéthyle, de carboxyméthyle, un thioester de p~ nitrophényle, un ester de p-nitrophényle, de 2,4 ,5-trichlorophényIb, de pentachlorophényle, de K-hydroxyphtalimide, de K-hydroxy-succinimide, de 8-hydroxyquinoléine, de N-hydroxypipéridine ou par réaction avec un carbodiimide (éventuellement en ajoutant du N-hydroxysuccinimide ou un 1-hydroxybenzotriazole non substitué ou substitué par un halogène ou un groupe méthyle ou méthoxy) ou avec un N,N'-carbonyl-diimidazole, le groupe amino par exemple par réaction avec un phosphitamide. Comme procédés les plus usuels, il faut citer le procédé aux carbodiimides, le procédé aux azidures, le procédé des esters activés et le procédé aux anhydrides,et encore le procédé de Lîerrifiela et le procédé des K-carboxyanhydrides ou des ÎT-thiocarboxyanhydrides.

Pour l'obtention des produits de départ, il est avantageux de partir d'une séquence qui contient les 10 premiers • aminoacides K-terminaux et de condenser avec ce N-terminal toute la séquence restante, de préférence selon Weygand-V>unsch.

Liais on peut aussi associer ladite séquence N-terminale par exemple avec le fragment allant jusqu'au 28ème aminoacide (glycine) contenant un groupe carboxyle terminal libre et condenser 1'octacosapeptide avec le tétrapeptide des aminoacides 29-32 par exemple selon ïïeygand-Wunsch.

Dans ce qui suit on .va exposer, comme exemple pour un mode de réalisation préférentiel, la préparation du peptide de formule I, dans laquelle X représente la L-méthionine.

Le décapeptide (1-10)N-terminal peut être préparé par exemple selon Helv. 53.» 556 (1970)..

La séquence contenant les llème à 32ème aminoacides à lier à la séquence N-terminale 1-10 est assemblée par exemple à partir des séquences 11-16, 17-20, 21-23» 24-28 et 29-32.

La séquence 24-28 peut être obtenue par exemple en combinant de préférence selon le procédé des esters activés, le 27ème aminoacide (Thr) avec le 28ème aminoacide (Gly), couplant cette séquence de 2 avec le 26ème aminoacide (Asn) et en combinant

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la séquence de 3 résultante avec le 25ème aminoacide (Thr) et finalement avec le 24ème aminoacide (Gin). Les groupes hydroxy des radicaux thréonine peuvent dans cette opération être protégés par exemple par le groupe tert.-butyl éther. 5 La séquence 24-28 contenant le groupe amiho du radical glutamine protégé et le groupe carboxyle du radical glycine libre est combinée avec la séquence 29-32 H-Val-Gly-ala-Pro-NH^

[Helv. 53, 2135 (1970)] de préférence selon le procédé au carbodiimide-N-hydroxysuccinimide.

10 Après séparation du groupe protecteur d'aminé du radical glutamine de la séquence 24-32, la séquence 21-23 Z-11hr(tBu)~Phe~ Pro-0H(}lelv. 5_3, 2135 (1970)J est couplée à la séquence 24-32, de préférence selon le procédé au carbodiimide en présence de N-hydroxysuccinimide.

15 La combinaison de la séquence 17-20 Z-Asn-Lys(Boc)-Phe-

His-KH-NHg [(Helv. 53., 2135 (1970)3 avec la séquence 21-32 débaras-■ sée du groupe protecteur d'aminé Z est réalisée par exemple au moyen du procédé aux azidures.

• Après séparation du groupe protecteur d'anine Z du radical 20 asparagine de la séquence 17-32, la séquence 11-16 Z-Thr(tBu)-

Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-AHKH2 [Helv. 53 , 2135 (1970)J .pour compléter le fragment nécessaire 11-32 est couplée, de "préférence selon le procédé aux azidures, à la séquence 17-32.

Le couplage de la séquence 11-32 qu'on vient de décrire 25 avec la séquence 1-10 Boc-Cys-Gly~Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(t3u)-Cys-Met-Leu-Gly-OH [Helv. 5_3, 556 (1970)] est réalisé de préférence selon le procédé'au carbodiimide-K-hydroxysuccinimide.

L'élimination de l'ensemble des groupes protecteurs encore présents est conduite de préférence dans l'acide trifluoro-

30 acétique ou l'acide chlorhydrique concentré et conduit à la

9f> 97 Asn -Thr -calcitonine-M.

Suivant les modes opératoires, on obtient les nouveaux composés sous forme de bases ou de leurs sels. A partir des sels

• on peut obtenir les bases de façon en soi connue. A partir de ces 35 dernières, on peut obtenir les sels par réaction avec des acides qui conviennent à la formation de sels thérapeutiquement utilisables, comme par exemple des sels avec des acides inorganiques,

• comme les acides halohydriques, par exemple l'acice chlorhydrique ou l'acide bromhydrique, les acides perchlorique, nitrique ou

I

thiocyanique, sul'furique ou phoophorique, ou des acides organiques comme les acides formique, acétique,.propionique, glycolique, lactique, pyruvique, oxalique, malonique, succinique, maléique, fumarique, malique, tartrique, citrique, ascorbique, hydroxy-maléique, dihydroxymaléique, benzoïque, phénylacétique, 4-amino-benzoïque, 4-hydroxyber.zoïque, anthranilique, cinnamique, mandé-liaue, salicylique, 4-aminosalicylique, 2-phénoxybenzoïque, 2-acétoxybenzoïque, méthanesulfonique, éthanesulfonique, hydroxy-éthanesulfonique, ber.zèr.esulfonique, p-toluènesulfonique, naphtalènesulfonique ou sulfaniliaue.

Les peptides obtenus selon l'invention peuvent trouver leur emploi sous forme de préparations pharmaceutiques. Ces dernières contiennent les peptides en mélange avec un support organique ou inorganique pharmaceutique convenant à l'application intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée ou intranasale.

Pour cet usage, entrent en ligne de compte les substances qui ne réagissent pas avec les polypeptides, comme par exemple la gélatine, l'agar-agar, la gomme adragante, la cellulose, par exemple "Avicel" (cellulose microcristalline) et les dérivés cellulosiques comme la carboxyméthylcellulose, des éthers cellulosiques comme la méthyl- ou 1'éthylcellulose, les polyalcoylène-glycols, comme les propylèneglycols, l'eau, les mono- ou polyalcools comme l'éthar.ol, 1'isopropanol, la glycérine, l'hexite, les huiles végétales et autres esters gras comme l'huile d'arachides, de graines de coton, d'amandes, d'olives, de ricin, l'oléaté d'éthyle, le myristate d'isopropyle, le "Cetion V" (esters oléiques d'alcools gras liquides), "Miglyol" ou "Labrafac" (mélanges de triglycérides d'acides gras contênant 8-12 atomes de carbone), "Labrafil IZ 2735" ou "Labrafac WL 1219" (mélanges de glycérine et d'esters polyoxyéthyléniques d'acides gras), "Arlacel" (esters de sorbitan d'acides gras), "Tween" (monooléate de polyoxyéthylène-sorbitan), les huiles de silicones comme l'huile de diméthyl-silicone ou autres supports pharmaceutiques connus. Les préparations peuvent exister par exemple sous forme de lyophilisats ou sous forme liquide sous forme de solutions, de suspensions, d'émulsions ou de pulvérisations, voir par exemple la publication allemande 2 212 315» Filles sont éventuellement stérilisées et/ou contiennent d'autres adjuvants comme des agents de conservation ou de stabilisation, des mouillants ou des émulsionnants. lilles peuvent aussi contenir d'autres substances de valeur thérapeutique.

1

L'invention est décrite dans les exemples qui suivent : Les températures sont données en degrés Celsius.

Dans la chromatographie en couche mince, on emploie les systèmes' suivants :

5 système 43C : alcool amylique tertiaire-isopropanol-eau

(51:21:28)

système 45 : sec.butanol-ammoniaque aqueuse à 3 f» (70:30)

système 52 : n-butanol-acide acétique-eau (75:7,5:21)

système 52A : n-butanol-acide acétique-eau (67:10:23)

10 système 70 : acétate d'éthyle-pyridine-eau (40:20:40), phase ■ , supérieure système 89 : acétate d'éthyle-acétone-eau (72:24:4)

système 96 • : sec.butanol-acide acétique-eau (67:10:23)

système 100 : acétate d'éthyle-pyridine-acide acétique-eau 15 (62:21:6:11)

système 101A : n-butanol-pyridine-acide acétique-eau (42:24:4:30) système 102A : ester acétique-méthyléthylcétone-acide fornique-eau

(50:30-10:10)

système 107 : acétate d'éthyle-pyridine-eau (49:24:27)

20 système 112E : n-butanol-pyridine-acide formique-eau (44:24:2:20) • système 121 : isopropanol-ammoniaque aqueuse à 25 i° eau

(70:10:20)

système 121A : isopropanol-ammoniaqus aqueuse à 25 ^ eau

(85:5:10)

25 Données de R^ pour la chromatographie en couche mince

DS : sur plaques de gel de silice préparées SI 254 de la firme Antec 'de Birsfelden.

DC : sur plaques de cellulose préparées de la firme 30 Merck de Larmstadt.

DA : sur plaque d'Alox (45 g AlgO^ de la firme Camag de ï.Iuttenz, + 3»5 g de gypse, épaisseur 0,3 mm)

Dans les exemples, on emploie les abréviations suivantes: 35 ' Boc tert.-butyloxycarbonyle, *

Z carbobenzoxy

OtBu ester de tert.-butyle ONp . ester de p-nitrophényl'e

14

OMe ester méthylique

OSu ester d'hydroxysuccinimide tBu tert.-butyl éther

3mp

(Z -percaptopropionyle

DMP

diméthylformamide

Exemple

1

H-Cys~Gly-Asn-Leu-S er-Thr-Cys-IvIe t-I eu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe~Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Asn--xhr~ Gly-Val-Gly-Ala-Pro-TvH^ (chlorhydrate) (Asn^-Thr^-calcitonine I,l) » .10 50 mg de Boc-Cys~Gly-Asn-Leu~Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-

Met-L eu-G1y-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(£Bu)-Gln-Asp(0 tBu)-Ph e-A sn-Lys(Boc)-Phe-His~Thr(t3u)~?he~Pro-Gln-ïhr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHg sont dissous à 0° dans 1,2 ml d'acide chlorhydrique 12 N très pur (durée environ 1-2 minutes), purgés 15 rapidement à l'azote et abandonnés au repos à la température de 0° pendant 10 minutes. On refroidit aussitôt à la glace sèche, évacue sous vide élevé et concentre en un sirop en élevant lentement la température. Le sirop est dissous dans 2 ml d'eau, lyophilisé, le résidu est encore lyophilisé à partir de 2 ml d'eau et finale-20 ment équilibré avec l'humidité de l'air. Le produit ainsi obtenu est une poudre amorphe soluble dans l'eau.

DC : Rf(45) = 0,45 ; Rf(l01A) = 0,53 ; Rf(112E) - 0,39. Le composé migre vers la cathode d'environ 3j7 cm en 1 1/2 heures dans 1'élactrophorèse en couche mince (sur plaque de cellulose) 25 à pH 1,9 et 16 volts/cm.

Le dotriacontapeptidamide protégé est préparé par exemple de la façon suivante : . .

a) Z-Thr( tBu)-Gly~0?v!e

22,3 g de Z-Thr(tBu)-OSu et 8,29 g de HC1. H-Gly-OMe 30 sont dissous ou mis en suspension dans 100 ml de diméthylformamide. 'additionnés de 7i^9 rai de N-méthylmorpholine, agités pendant un jour à 22° et concentrés à sec sous vide élevé. On reprend le résidu dans l'ester acétique, lave à l'acide citrique (5/0 KHCO^ (5 fi>) et à l'eau, sèche sur sulfate de sodium et concentre 35 à sec sous 'vide. Le résidu huileux cristallise après repos d'une, nuit, P.F. 48°. Le dipeptide est chromatographiquement unitaire et est employé tel quel..

V

1-5

BS : R^.(45) = 0,77 ;• R^(chloroforme méthanol = 9:1) =

0,70

b) H-Thr(t3u)-Gly-0?.:e HC1 '

•5', 0 g de Z-Thr(tBu)-Gly-0Ke sont dissous dans 200 ml de 5 méthanol et après addition de 13,2 ml d'acide chlorhydrique IN

e"t 0,5 g de palladium sur noir à 10 <£> hydrogénés en absorbant 00 ^ jusqu'à saturation. On sépare le catalyseur par -filtration et concentre à sec, on obtient ainsi une mousse blanche.

DS : -R^(45) = 0,64 ; R|.(chloroformeméthanol = 9:1) = 10 0,41 ; Rf(52) = 0,42

c) Z-Asn~Thr(t3u)Gly-0Me

"18,9 g de Z-Asn-ONp et 12,5 g âe H-Thr(tBu)-Gly-Oîde. HC1 sont dissous dans 95 ml de DM?, on ajoute 4,6 ml de N-méthyl~ morpholine et abandonne le mélange au repos à la température 15 ambiante pendant 15 heures; Le solvant est évaporé sous vide

élevé, le résidu est pulvérisé par trituration avec l'ester acétique et cristallisé dans le méthanol-chloroforme-éther de pétrole et dans 11éthanol-eau, P.P. 165°.

DS : R^.(45) = 0,68 ; R^chloroforme-méthanol = 9:1) = 20 0,38, Rf(52) =0,70

d) H-Asn-Thr(tBu)-Gly-OMe

8,5 g de Z-Asr.-Thr(tBu)Gly-OMe sont hydrogénés dans 210 ml de méthanol en présence dg'palladium sur noir à 10 fo, Le produit est une mousse amorphe fondant à 60° environ.. 25 DS : Rf(45) = 0,42 ; Rf(52) = 0,27.

e) Z~Thr(t3u)-Asn-?hr(tBu)-Gly-0He

Une solution de 7,51 g de Z-Thr(tBu)-0Su et 5,55 g de H-Asn-Thr( t3u)-Gly-0?<Ie dans 50 ihl de DMP est laissée au repos pendant une nuit à 22° puis concentrée à sec sous vide élevé. 30 On dissout le résidu dans l'ester acétique-n-outanol (1:1), lave avec de l'acide citrique (5 7°) KHCO^ (5 /°) et de l'eau, évapore à sec et cristallise le résidu solide dans le méthanol-éther ; P.P. 145-146°. *

DS : Rf(45) = 0,73 ; Rf(52) = 0,75 35 ' f) H~Thr( t3u)-Asn-Thr( t3u)-GIy-C?.le

2,0 g de Z-Thr( t3u)-Asn-Thr( t3u)Gly-0î.'Ie sont hydrogénés dans 20 ml de méthanol comme d'habitude jusqu'à saturation et on obtient un oro&uit amorphe (mousseux).

16

DS : Rf(45) =0,41 ; Rf(52) = 0,34

g) ?-GIn~Thr( tBu)-Asn-Thr( tBu)Gly-0I!e

Une solution de 5,33 g de H-?hr(tBu)~Asn~Thr(tBu)-Gly-OMe et 4,95 g de Z-Gln-ONp dans 80 ml de DMF est laissée au repos pendant une nuit à 22° et au bout de peu de temps, le pentapeptide qui se forme commence à se séparer en cristallisant. On ajoute à la fin 500 ml d'eau, filtre à 0°, sèche et purifie le résidu par mise-en suspension dans 1'acétone-acétonitrile 1:1. le produit 'cristallin présente un point de fusion de 220°.

DS : R^(lOO) = 0,65 : R^chloroforme-méthanol 8:2) = 0,35 ; Rf(52) = 0,58

h) Z-Gln-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-Gly-0H

6,42 g de l'ester méthylique du pentapeptide[de g 3 sont dissous par chauffage dans 58 ml de trifluoroéthanol, additionnés à la température ambiante de 25 ml de lessive de soude M et agités pendant 6 heures à 22°. Après addition de 25 ml d'acide chlorhydrique 1I\T, le pentapeptide saponifié commence à cristalliser. On concentre à 50 ml, filtre et lave à l'eau jusqu'à disparition du chlore. • .

DS : Rf(52) = 0,46 : Rf(100) = 0,29

i) Z-Gln-Thr(tBu)-Asn~Thr(tBu)-GIy-Yal~Gly-Ala-Pro~KH2

500 mg de Z-Gln-îhr(t3u)-Asn-Thr(tBu)-Gly-0H, 335 mg de de H-Yal-Gly-Àla-Pro~KH2 [Helv. 53, 2135 (1970Q et 105 mg de N-hydroxysuccinimide sont dissous par chauffage dans 4 ml de LÎ.IF, Après addition de 202 mg de dicyclohexyl-carbodiimide on agite pendant 4 heures à 40°, à la suite de quoi le produit de la réaction précipite sous forme d'une gelée par introduction dans un mélange de 100 ml d'éther et 100 ml d'éther de pétrole et est séparé par filtration. On purifie le produit brut en le dissolvant deux fois dans le méthanol-eau (85:15) et précipitant à l'éther. P.F. 198-199°.

DS : Rf(96) = 0,41 ; Rf(107) = 0,50 ; Rf(chlorofome-méthanol 7:3) = 0,35

j ) H~G ln-Th r ( tBu ) - As n- Th r ( tBu ) -G 1 y- Va I -G Iy-AI a-Pro-NH^.

17

3,1 g du dérivé Z mentionné ci-dessus sont hydrogénés dans 120 ml do trifluoroéthanol à 80 fi avec 310 mg de palladium sur noir à 10 fi en absorbant COg jusqu'à saturation. Le filtrat est concentré à 5 ml environ et, après addition de 40 rnl d'eau,

abandonné au repos à 0° pendant une nuit, après quoi le nonapep-

tide cristallise sous forme pure. P.F. environ 240° (déc).

DS : Rf(96) = 0,20 ; Rf(107) = 0,32 ; Rf(70 - 0,18

k) Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)~Asn~Thr( tBu)

G1y-Val-G1y-AIa-P ro-MI 2

517 mg de Z-Thr(tBu)-?he-Pro-OH QHelv. J53, 2135 (1970)J

410 mg du nonapeptide ci-dessus et 74 mg de K-hydroxysuccinimide sont dissous ou mis en suspension dans 4 ml de chlorofrme-

trifluoroéthanol (4:6) sous léger chauffage, additionnés à 22° de

177 mg de dicyclohexyl-carbodiimide et agités pendant 20 heures.

Le mélange réactionnel est concentré à sec et le résidu précipité

une fois du mélange chloroforme-éther de pétrole. On purifie le produit brut ainsi obtenu dans un partage de Craig dans le système de solvants méthanol-tarnpon-chloroforme-tétrachlorure de carbone

10:10:3:5:4 'tampon : 28,6 ml d'acide acétique + 19,25 g d'acétate d'ammonium + 960 ml d'eau) avec des volumes de phases de chacun 5 ml en procédant à 420 opérations. On obtient le dodécapeptide pur par concentration des éléments de partage

135-184 (r = 160 ; K = 0,61) à sec et élimination de l'acétate max d'ammonium par sublimation sous vide élevé à 45°, sous forme d'une poudre amorphe fondant à environ 195° (déc).

DS : Rf(96) = 0,44 ; Rf(70) = 0,51 ; Rf(52A) = 0,38 1) H-Thr(tBu)~Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-

Gly-Val-Gly-Ala-?ro-KH2 504 mg de Z-dodécapeptide ci-dessus sont dissous par chauffage dans 30 ml de méthanol et, après addition de 100 mg de palladium sur noir, hydrogénés comme d'habitude. Le produit obtenu par concentration du filtrat à sec est une poudre blanche amorphe.

DS : Rf(43C) = 0,25 5 Rf(70) ) 0,35 ; Rf(52A) = 0,20

m) Z-Asn-Lys (Boc )Phe-His-T'hr( t3u)-Phe-Pro-Gln~Thr ' tBu)~ Asn-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-KI^

18

A une solution de 479 mg de Z-Asn-Lys(Boc)-Phe-His-NHNH2 iHelv. 51, 2135 (1970)3 dans 4,5 rai de CTuF, on ajoute à -20°, 378 ^.1 d'acide chlorhydrique, 3»2 dans le dioxanne et 90 ^il de nitrile de tert.-butj'le. Après agitation pendant 15 5 minutes à -10° on ajoute 410 mg de H-Thr(tBu)-Phe-Gln-Thr(tBu)-Gly /Val-Gly-Ala-Pro-NHg, dissous dans 6 ml de DtîF, puis 260 jul d1 éthyl-diisopropylamine. On laisse reposer une-nuit à 0° et on précipite alors le produit brut en l'ajoutant goutte à goutte à 100 ml d'éther» Pour la purification on soumet le produit à un 10 partage de Craig dans le système méthanol-tampon-chloroforme-tétrachlorure de carbone 10:5:10:5 (tampon comme dans k) en procédant à 200 opérations avec des volumes de phases de chaque fois 3 ml. L'hexadécapeptide pur est obtenu à partir des éléments de partage 18-37 (r^^ = 27 ; K = 0,16) par concentration à sec

IiiaX

15 et élimination du tampon par sublimation à 40° sous vide élevé sous forme d'une poudre amorphe.

DS : Rf(43C) = 0,40 ; Rf(52) =0,20 ; Rf(70) = 0,58 n) H-Asn-Lys(3oc)-Phe-His-Thr(t3u)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Asr,-Thr(t3u)-Gly~VaI-Gly~Ala-Pro-:.H2 Acétate 20 ' 270 mg de Z-hexadécapeptide.ci-dessus sont hydrogénés

. . pendant 2 heures dans 27 ml d'acide acétique à 80 fo avec 50 mg de palladium sur noir, débarrassés du catalyseur par filtration, le -filtrat est concentré à 3 ml environ et lyophilisé.

DS : Rf(52) = 0,07 ; Rf(96) = 0,28 : Rf(107) = 0,65 25 0) Z-Thr( tBu) -Tyr-(t3u ) -Thr( t3u )-Gln-Asp-fOtBu ) -Phe-

Asn-Lys(Boc)-Pho-Hi s-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr-( t Bu ) - A s n-Th r ( tBu ) -C-1 y ~V a I -G I y- A1 a -Pr 0 - r.

A une solution de 165 mg'de Z-Thr(tBu)~Tyr(t3u)-Thr(tBu)-Gln-Asp(0t3u)-Phe-KHI^Hg [Helv. 53, 2135 (1970)J dans 2 ml de 30 DMF on ajoute à.-20° 117 pl d'acide chlorhydrique 3}24 H dans le dioxanne et 21 pi de ni tri .te de tert.-butyle. On agite pendant 15 minutes à -10°, ajoute une solution refroidie à 0° de 198 mg de H-Asn-Lys(3oc)-?he-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(t3u)-Asn-Thr (tBu)-Gly-Val-Gly-Ala-Pro~KH2 (acétate) dans 4 ml de IMF ainsi 35 que 80 jil 'd ' éthyle-diisopropylamine et on laisse le tout en repos pendant une nuit à 0°. le produit brut est précipité en faisant arriver goutte à goutte la solution réactionnelle dans un mélange de 40 ml d'éther et 20 ml d'éther de pétrole et soumet

.1$

tant ensuite lé. mélange à un partage de Graig dans le système méthanol-tampon-chloroforme-tétrachlorure de carbone 20:5:10:10

L tampon comme dans kjen 300 opération avec des volumes de phases de 3 ml chaque fois. A partir des éléments départagé 93-117

5 (rmov ) 107 ; K ) 0,55) on obtient, par concentration à sec et max

élimination du tampon par sublimation à 40° sous vide élevé, le docosapeptide chromatographiqu^ment pur sous forme d'une poudre amorphe. •

DS : Rf(43C) = 0,39 ; Rf(52) =0,30 ; Rf(96) = 0,48

10 p ) H-Thr(tBu)~Tyr(t3u)-Thr(tBu)-Gln-Asp(0t3u)~Phe-Asn-

Lys(Boc)-Phc-His-Thr^tBu)-Phe-Pro-GIn-ThrftBu)-Asn-

Thr(t Bu)-G1y- Va 1 ~G1 y- A1 a-P r o ~I\H 2

260 mg de Z-docosapeptide sont hydrogénés pendant 15

heures dans 26 ml d'acide acétique à 80 fo avec 50 mg de palladium

15 sur noir, le catalyseur est séparé par filtration, le filtrat est concentré à 5 ml environ et lyophilisé. Pour éliminer l'acide acétique, on reprécipite le résidu deux fois dans le méthanol additionné d'une solution de bicarbonate de sodium.

DS : Rf(43C) ='0,31 ; Rf(100) = 0,29

20 q) Boc-Cys-Gly-Asn-Ieu-Ser( t3u)~Thr( t3u)-Cys-I.!et-Ieu-

Gly-Thrf t3u)-Tyrf tBu)-Thr(tBu)-GIn-Asp-(0tBu)-

Phe-Asn-Iys(3oc)-Pho-Hir:-ThrftBu)-Phe-Pro-GIn-Thr

(tBu)-Asn-Thr(t3u)-GIy-7al~Gly-Ala-Pro-Hi2

170 mgde docosapeptide hydrogéné décrit sous p) et

25 101 mg de Boc-Cys-Gly-Asn-Leu~Ser( t3u)~Thr( tBu)-Cys-î,îet-Leu-Gly-OH

^Helv. 5_3, 55^ (1970)3 sont dissous par chauffage dans 1,2 ml de

DMF, additionnés de 15,8 mg de h-hydroxysuccinimide et 21,3 mg de dicyclohexyl-carbodiimide et agités sous azote pendant 3 1/2

heures à 45°. Le produit brut est alors précipité en envoyant

30 goutte à goutte le mélange réactionnël dans 20 ml d'éther exempt de peroxyde et en soumettant le tout à un partage de Craig dans le système méthanol-tampon-chloroforme-tétrachlorure de carbone

11:3:6:7 (tampon comme en k'J en effectuant 450 opérations avec des volumes de phases de chacune 3 ml. On isole le dérivé pur du

35 dotriacontapeptide protégé à partir des éléments 190-210

(r = 200 : K = 0,8) par concentration et élimination du tampon v max ' ' r par sublimation, sous'forma d'une poudre amorphe.

DS : Rf(70) = 0,53 ; Rf(l00) =.0,35 ; Rf(52A) = 0,29.

20

Exemple 2

Bmp-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cyc-îiIet-Leu-Gly-Thr-ïyr-Thr-Gln-Asp~Phe-Asn~Lys-Phe-His~Thr~Phe-Pro-Gln~Thr-Asn-Thr~Gly-Val-

o c on

Gly-Ala-Pro-NHp(~hydrochloride)-(désamino-Asn -Thr -calcitonine

5 M). ^

' 50 mg de Brnp-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Met-Ieu-Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(0tBu)-Pho-Asn-Lys(3oc)-Phe His~Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly~Ala-Pro-KHg sont transformés par acidolyse avec l'acide chlorhydrique 10 12 K à 0°, comme décrit dans l'exemple 1, en le peptide ci-dessus DC : Rf(45) = 0,50 ; Rf(101A) = 0,59 ; Rf(ll2Iî) = 0,43 Electrophorèse en couche mince : pH 1,9 16 volt/cm, 1 1/2 heure : migration d'environ 2,4 cm vers la cathode.

Le dotriacontapeptidamide protégé est obtenu par exemple 15 de la façon suivante :

61 mg de Bmp-Gly-Asn-Leu-5 er ( tBu ) -Thr ( tBu ) ~Cys~I,Ie t-Leu-Gly-OH (DOS 2 050 434), 113 mg de H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)~ Gln-Asp(0tBu)-Phe~Asn~Lys(Boc)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr (t3u)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Val-G.iy-Ala-Pro-KH2 (exemple lp) et 10,5 20 mg de K-hydroxysuccinimide sont dissous dans 0,9 mg de DÎ.ÎF. Après addition de 14 mg de dicyclohexyl-carbodiimide, le récipient de réaction est purgé à l'azote, fermé et agité pendant 3 1/2 heures à 45°. On précipite le produit brut par addition de 15 ml d'éther exempt de peroxydes et on le purifie par un partage de Craig dans 25 le système méthanol-tampon-chloroforme-tétrachlorure de carbone 11:3:6:7 [tampon comme dans l'exemple 1 k)Jen effectuant 240 opérations avec des volumes de phases de chacun 3 ml. Le produit pur est isolé à partir des éléments de partage 108-129 (rmax = 118 ; K -- 0,97) par concentration et élimination du tampon par 30. sublimation, sous forme d'une poudre amorphe.

DS : Rf(52) = 0,29 î Rf(70) = 0,65 ; Rf(100) = 0,38 Exemple 3

Bmp-Gly-Asn-Lou-Ser-Thr-C^s-Yal-Leu-Gly-Lys-Ieu-Thr-

• Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-?he-His~Thr-Tyr~Pro-Gln~Thr-Asn-Thr~Gly~

3 11

35 Val-Gly-Ala-Pro-NK^ (-hydrochloride) = désamino-Val -Lys

Leu12 - Tyr22 -Asn2^ - Thr2^- Calcitonine M).

50 mg. de Bmp-Gly-Asn-Leu-3er~t3u)-ïhr(tBu)-Cys-Val-Leu-

• Gly-Lys ( Boc ) -Leu-Thr ( tBu ) -Gln-Asp ( 0 tBu ) -Phe-Asn-Lys ( Boc ) -Ph e-IIi s-

2.1

Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly~Ala-Pro-iNHg sont transformés en le peptide ci-dessus par acidolyse avec l'acide chlorhydrique 12 K à 0° comme décrit dans l'exemple 1. DC : Hf(101A) =0,51 ; Rf(112E) = 0,45 5 Electrophorèse en couche mince : pH 1,9, 16 volt/cm,

1 1/2 heures : migration d'environ 3,7 cm vers la cathode.

Le dotriacontapeptidamide protégé peut être préparé par exemple de la façon suivante :

• a) Z-Leu~Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OMe

10 • 4,15 g de H~Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OMe Gîelv. 53,

2135 (l970)]]sont dissous dans 40 ml de DMF, additionnés de 3,26 g de Z-Leu-01vTp et laissés au repos pendant une huit à 22° . Le pentapeptide qui se forme est cristallisé par addition d'eau-et purifié par cristallisation dans le méthanol-chloroforme-éther de 15 pétrole et dans le méthanol-eau ; P.F. 2049

PS : R^chloroforme-méthanol 9:1) =0,39 ; R.f(89) = 0,52

b) H-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OMe

• ' — • ■ — ■ - '' ■ -i-i. ... m-. ..n • —— ■■■ ~ •

4,8 g de Z—pentapeptide sont hydrogénés dans 100 ml de méthanol jusqu'à saturation comme d'habitudé et la solution-20 débarassée du catalyseur par filtration est concentrée à sec,

ce qui donne une mousse blanche amorphe.

PS : R^fchloroforme-méthanol 9:1) =0,14 : Rf(89) =0,29

c) Z-I.ys/Boc )-Ieu-Thr( tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OMe

4 g de H-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(0t3u)-Phe~0Me et 3,5 g 25 &e Z-Lys(Boç)-0Np sont dissous dans 25 ml de DMF et laissés au repos pendant une nuit à 22°. L'hexapeptide qui se forme est précipité sous forme d'une gelée par addition d'éther et purifié par cristallisation dans le m'éthanol-ester acétique-éther de pétrole ; P.F. 211-212°.

30 DS : R^chloroforme-méthanol 9:1) =0,50 ; R^(89) = 0,55

d) Z-Lys(Boc)-I-eu-Thr(tBu)-Gln-Asp(0tBu)-Phe-KHI.;H2

5 g de l'ester méthylique ci-dessus sont dissous par chauffage dans 50 ml de DMF, additionnés de 5 ml d'hydrate d'hydrazine et laissés en repos pendant 5 heures à 22°. On préci-

35 pite par "addition de 250 ml d'eau, filtre le précipité pulvérulent fin et le lave à l'eau jusqu'à réaction de foline négative P.F. 200° environ.

^ -d

DS : Rf(chloroforme-méthanol 9:1) = 0,24 ; Rf(89) = 0,27

e) Z-Thr( tI3u)-Tyr( tBu)-Pro-Gln-Thr( tBu)-Asn-Thr-( tBu)-G1 y-Va 1 - G 1 y-Al a-Pr o -1 .H 2

393 mg de 2-Thr(tBu)-Tyr(t3u)-Pro-0H (DOS 2 050 434) 5 et 66 yil de N-méthylmorpholine sont dissous dans 5 ml de tétra-hydrofuranne refroidis à -20° et additionnés en 1 minute de 82 Jil de chlorocarbonate d'isobutyle. On agite pendant encore 10 minutes à -1-5°, ajoute alors une solution refroidie préalablement à 0° de 300 mg de H-Gln-Thr(t3u)-Asn-Thr(t3u)-Gly-Val-Gly-

_ •—♦—" s

10 Ala-Pro-KH^ (analogue à exemple 1 j)j dans 6 ml de trifluoro-éthanol-chloroforme (6:4) ; agite pendant une heure à 0° et abandonne au repos pondant une nuit à 22°. Le mélange réactionnel est concentré jusqu'à formation d'une masse gélatineuse et on précipite celle-ci du tétrachlorure de carbone-éther de pétrole. 15 Pour la purification le produit brut est soumis à un partage de Craig dans le système mathanol-tampon-chloroforme-tétrachlorure de carbone 10:3:5:4 [tampon comme dans l'exemple IkQ en effectuant 400 opérations avec un volume de phases de chacun 3 ml. Des éléments de.partage 118-143 (**„_„ =130 ; K = 0,48) on isole par 20 concentration à sec et élimination du tampon par sublimation à 40° s sous vide élevé le dodécapeptide chromatographiauement pur sous forme d'une poudre amorphe.

DS : Rf(43C) = 0,42 ; Rf(52A) = 0,37 ; Rf(70) = 0,65

f) H~thr(t3u)~Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(t3u)-Asn-Thr-(tBu)~ 25 Gly-Val-Gly-Ala-Pro-r.H9

1,56 g de dodécapeptide de e) sont dissous dans 80 ml de méthanol et hydrogénés comme-d'habitude. Le produit est obtenu, par concentration de la solution d'hydrogénation à sec, sous forme d'un résidu amorphe fondant à 160° environ. 30 DS : Rf(43C) = 0,30 ; Rf(52A) = 0,21 ; Rf(70) = 0,56

g) j£-Asn-Iys(Boc)-Phe-His-Thr(t3u)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr ( tBu)-Asn-Thr( tBu ) -Gly-Val-Gly-Ala-?ro-LrH0

445 mg de Z-Asn-Lys-(Boc)-Phe-His-r.Hr.H2CHelv. 5_3, 2135 _(1970)"3 sont dissous par chauffage dans 4 ml de DMF et additionnas 35 successivement à -20° de 350 jul d'acide chlorhydrique 3,2 N dans le dioxanne et de 83jul de nitrite de tert.-butyle. On agite pendant encore 15 minutes à -10°, ajoute alors une solution de 400 mg de dodécapeptide hydrogéné ci-dessus dans 5 ml de DMF,

23

ainsi que 192 pi d1éthyl-diidopropylanine et agite pendant 2

heures à 0°. On ajoute alors encore une fois 48 ^1 d'éthyl-

diisopropylamine et on laisse au repos pendant une nuit à 0°♦

le produit brut est précipité en versant le mélange réactionnel

5 goutte à goutte dans 100 ml d'éther et purifié par un partage de Craig dans le système méthar.ol-tampon-chlorof orme-tétrachlorure de carbone 10:3:7:4 [tampon comme dans l1exemple-1 k j( avec des volumes de phases de chacun 3 ml en 650 opérations. On isole comme .

d'habitude des éléments de partage 230-275 (r *v ) 255, K = 0}65)

max

10 1'hexadécapeptide pur sous forme d'une poudre amorphe.

DS : Rf(43C) = 0,37 ; Rf(52A) = 0,27 ; Rf(70) = 0,63 ' ^) H-Asn-Lys|fBoc)-Phe-His--Thr( tBu)-Tyr(t3u)-?ro~Cln~

Thr(tBu)-Asn-Thr(t3u)-Gly-Val-C-I.y--Ala-Pro-.".Hot acétate 250 ml d1hexadécapeptide de g) sont hydrogénés comme 15 d'habitude dans 30 ml d'acide acétique à 80 $. Après séparation du catalyseur par filtration, le filtrat est concentré à environ 4 ml et lyophilisé.

DS : Rf(43C) = 0,24 ; Rf(52) = 0,14 ; Rf(96) =0,34 i) %-lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-GIn-Asn-0tBu)-Pho-Asn-Lys 20 " " ^Boc)-Phe~His-Thr(tBu)~?yr'tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-

Asn-ghr( tBu)-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-I\"H0 274 mg de Z~Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gln-sp(0t3u)-Phe~

KHNHg sont dissous par chauffage dans 2 ml de IMF et additionnés successivement de 154 jal d'acide chlorhydrique 3,2 N dans le 25 dioxanne et de 37 }il de nitrite de tert.-butyle. On agite pendant 15 minutes à -10°, ajoute une solution de 275. mg de l'acétate d'hexadécapeptide ci-dessus dans 2 ml de DMF refroidi au préalable à 0°, ainsi que 85 )il d'éthyl-diisopropylamine et agite pendant 2 heures à 0°. Après une nouvelle addition de 21 p.1 30 d1éthyl-diisopropylamine on laisse reposer pendant 15 heures à 0° et précipite le produit brut avec 1'éther-éther de pétrole sous forme d'un précipité pulvérulent. Pour la purification, oh le • ' soumet à un partage de Craig dans le système méthanol-tampon-chloroforme-tétraclilorure de carbone 10:3:5 : 5 [tampon comme dans 35 l'exemple 1 k] avec des volumes de phases de 3 ml chacun en _ . effectuant 345 opérations. Des éléments de répartition 98-132

(r = 115 ; K = 0,5) on isole comme d'habitude le docosapeptide max chromatographiauement pur.

2 4

DS : Rf(43e) = 0,39 ; Rf(52) = 0,29 ; Rf(96) = 0,48

j ) H-Lys ( Boc )-Ieu-Thr/ tBu)-Gin-AsT3-(-Ot3u)-Phc-Acn-Lyg(Boc )

Phc-His-Thr( tBu)-T.yr( t3u)-Pro-Gln-Thr( tBu)-Asn~Thr~

( tBu ) -G 1 y-Va 1-G1 y- Al a-Pr o-lvH 2

5 173 mg de docosapeptide de k) sont hydrogénés dans 30 rnl d'acide acétique à 80 fo avec 50 ml de palladium sur noir pendant

15 heures, le filtrat est concentré à environ 3-4 ml et lyophilisé.

Pour éliminer l'acide acétique le lyophilisât est reprécipité d'un.

mélange de trifluoroéthanol et de solution de bicarbonate de sodium

10 DS : Rf(52) = 0,21 ; Rf(70) = 0,63 ; Rf(10Q) = 0,17

k) BnrD-Gly~Asn-Ieu-c'er(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Icu-Gly-

Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gin-As ^(0 tBu)-?he~Asn-Lys(Boc)-

~Phe-His~ghrf t3u)~Tyr( t3u)-?ro-Gln-Thr( tBu)-Asn-Thr

. ( t Su ) -G 1 y-Va 1 -G 1 y-Al a -P r o - r:H 2

15 127 nig de docasapeptide décrit sous j), 65 ng de Bmp-Gly-

Asn-Leu-Ser-tBu)-Thr(t3u)-Cys~Val-Leu-Gly-0H (DOS 2 050 434)

12 mg de N-hydroxy-succinimide et 17,5 mg de dicyclohexyl-

carbodiimide sont dissous ou mis en suspension dans 0,5 ml de Dî.'F

et sont agitis pendant 3 1/2 heures à 45°.

20 Le produit brut est précipité par addition de 50 ml d'éther et purifié par un partage de Craig dans le système mdthanoj tampoh-chloroforme-tétrachlorure de carbone 10:3:5:4ftampon comme dans l'exemple 1 kjen effectuant 250 opérations avec des volumes de phases de 3 ml chacun. Des éléments de partage 88-110

25 (r = 100 : K = 0,67) on isole comme d'habitude le'dotriaconta-^ ^ max ' '

pentide protégé chrornatographiquement unitaire sous forme d'une poudre amorphe.

DS : Rf(52) = 0,28 ; Rf(70) = 0,65 î Rf(100) = 0,27 Exemple 4

30 Bmp~Gly-Asn-leu-Ser-Thr~Cys~?.Iet~Leu~Gly-I.ys-Leu--Thr-Gln~

Asp-leu--Asn-Lys-Leu-His-Thr-Tyr~Pro-Gln~Thr-Asn-Thr-Gly~Val~Gly-Ala-Pro-NH^, hydrochloride (Dé-samino-Lys"^ - Leu"^'

-Tyr^ - Asn^ - Thr^ - Calcitonine M)

50 mg de ï>mp-Gly-Asn-Leu-r:er( tBu)-Thr[t3u)-Cys-ï.îet-35 Leu-Gly-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Asn-I,ys(Boc)-• Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln~Thr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-KHg sont scindés en le peptide libre par traitement avec l'acide chlorhydrique 12 K à 0° comme décrit dans l'exemple 1

*5

DC : Rf(45) =0,47 ; Rf(101A) =0,50 ; Rf(ll2E) = 0,42 Electrophorèse en couche mince : pH 1,9» 16 volt/cm, 1 1/2 heure : migration d1environ 3,7 cm vers la cathode.

Le dotriacontapeptidamide protégé peut être obtenu de la . 5 façon suivante :

a) K-Leu-ThrftBu)~Gln--Aso(0t3u)~Ieu-OMe

3,6 g de Z-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(0tBu)-Leu-0î.!e (BOO 2 050 434) sont hydrogénés dans 90 ml de méthanol avec 360 mg de palladium sur noir en absorbant C02 jusqu'à saturation, on sépare le 10 catalyseur par filtration et concentre le filtrat à sec.

DS : R^(chloroforme-méthanol 9:1) =0,15 ; R^(89) = 0,32.

b) 7~Lys-(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(0t3u)~Ieu-0IiIe 840 mg de H-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(0tBu)-Leu-0ï.Ie sont dissous dans 5 ml de DMF, additionnés de 765 mg de Z-Lys(Boc)0I'Ip et 15 abandonnés au repos pendant une nuit à 22°. On concentre ensuite sous vide élevé jusqu'à l'obtention d'un sirop et on précipite le produit brut sous forme d'une gelée par addition de 30 ml d'éther.

• On effectue la purification par reprécipitation du méthanol~éster acétique-éther de pétrole, le dérivé de l'hexapeptide pur présente 20 un point de fusion de 218-220° «. •

DS : R^chloroforme-méthanol 9:1) =0,41 ; R^.(89) =0,61

c) Z-Lys (Boc)-Leu-Thr ( tBu) -Gln-Asp ( OtBu )-Leu-NHI.H2 720 mg de l'ester méthylique de l'hexapeptide décrit sous b) sont dissous dans 40 ml de méthanol et, après addition 25 de 3,6 ml d'hydrate d'hydrazine, abandonnés au repos pendant 5

heures à 22°. L'hydrazide d'hexapeptide qui se forme est précipité par addition de 75 ml d'eau, séparé par filtration, bien lavé à l'eau et séché. P.P. 215-218°.

DS : R^(chloroforme-méthanol 8:2) =0,55 ; R^(89) = 0,29 30 d) Z-Asn-I.ysfBoc )-Leu-His-Thr(' tBu)-Tyrf t3u)-Pro-Gln-

ffhr( tBu)-Asn-Thr( tBuj-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-P.'Hg 636 mg de Z-Asn-Lys(Boc )-Leu-His-i,KI.H2( ."OS 2 050 434)

sont dissous par chauffage dans 10 ml de DMF, refroidis à -20° .et-additionnés successivement de 525 pl d'acide chlorhydrique, 35 3,2 N dans le dioxanne etll9 pl de nitri te de tert.-butyle.

On agite pendant 15 minutes à -15° et ajoute alors une solution préalablement refroidie à 0° de 600 mg de H-Thr(t3u)-Tyr(tBu)— Pro-Gln-Thr(tBu)-Asn~Thr(tBu)Gly-Val-Gly-Ala-Pro-I\rH2 (exemple 3 f^ dans 4,5 ml de DMF, ainsi que 230 pl de N-méthylmorpholine.

26

On agite pendant 2 heures à 0° ajoute encore 46 yl de N-méthyl-morpholine et laisse reposer pendant, une nuit à 0°. Le produit burt est précipité avec 100 ml d'éther et soumis à un partage de Craig dans le système acétonitrile-tampon-chloroforme-méthanol 5 1:1:1:1[tampon comme dans l'exemple 1 k3 en effectuant 500 opérations avec des volumes de phases de chacun 3 ml. L'hexapeptide pur est obtenu à partir des éléments de partage 38-62 (r =50 ;

max

K = 0,11) par concentration à sec et élimination du tampon par sublimation à 40° sous vide élevé, sous forme d'une poudre 10 amorphe.

DS : Rf(43C) = 0,38 ; Rf(52A) = 0,28 ; Rf(70) = 0,51 d) H-Asn-Iys(3oc)~Lsu-Hir3-Thr(tBu)-Tyr(t3u)-Pro-Gln--Thr-

(t3u)-Asn-Thr( t3u)-Gly-y"al-Gl.y-Ala-Pro~I\fH2, acétate 380 mg d'hexadécapeptide de d) sont hydrogénés dans 45 ml 15 d'acidz acétique à 80 5b avec 50 mg de palladium sur noir jusqu'à disparition du produit de départ (.contrôle par chromatographie en couche mince). Après séparation du catalyseur par filtration on concentre jusqu'à environ 4 ml et 011 lyophilise.

DS : Rf(43C) =0,29 ; Rf(70) = 0,40 20 f) Z-Lys-(Boc)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Ast)(OtBu)-Leu-Asn-Lys

(Boc)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(t3u)-Pro-Gln-Thr(tBu)-Asn-

1.1 — 1 - » —■ ■ 'V i— -n ..... - - n 1 ■ ■ ■ — ■ »■■■

Thr(t3u)-Gly-Val-Gly-Ala-?ro-r;H0 230 mg de Z-Lys(Boc)-Leu~Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Leu-KHNH2 sont dissous dans 2 ml de DMF et additionnés successivement 25 de 134 jil d'acide chlorhydrique 2,3 N dans le dioxanr.e et de 32 )il de nitrite de tert.-butyle. La solution est agitée à -10°

pendant 15 minutes, après quoi on ajoute une solution de 306 mg de l'acétate d'hexadécapeptide décrit en c) dans 3 mi de DMF et 63 ji 1 de N-méthylmorpholine. On agite pendant encore 2 heures à C° 30 ajoute encore 15 jxl de K-méthylmorpholine, laisse au repos pendant une nuit à 0° et précipite le produit brut par addition de 60 ml d'éther et de 30 ml d'éther de pétrole. Pour lapurification, on le soumet à un partage de Craig avec 240 opérations dans le système méthanol-tampon-chloroforme-tétrachlorure de carbone 35 10:3:5:5 [tampon comme dans l'exemple 1 . Des éléments de partage 83-107 (rm = 95 ; K = 0,65), on isole comme d'habitude max

'le docasapeptide pur sous forme d'une poudre amorphe.

27

DS : Rf(52) = 0,27 ; Rf(70) = 0,59 î Rf(l00) = 0,41 g) H-Iys( Boc ) -Ieu-Thr(t3u)-Gln-Asp(OtBu)-Lou-Asn-Lys

4

(Boc )-Leu-His-Thr( t3u ) -T,yr( tBu ) -Pro-Gln-Thr( tBu ) -Asn-Thr( t3u)-Gly-Val~Gly-Ala-Pro~i<H0

■ 1 ■ 1 ■ — ■' ■ ■■ ~eu

5 100 mg du docosapeptide de f) sont hydrogénés dans 16 ml d'acide acétique à 80 £ avec 15 mg de palladium sur noir pendant une' nuit, séparés par filtration du catalyseur, le filtrat est concentré à environ 2 ml et lyophilisé. Pour éliminer l'acide acétique on dissout le résidu dans 0,6 ml de trifluoroéthanol et on

10 le reprécipite par addition goutte à goutte d'une solution à 5 f»

de bicarbonate de sodium.

DS : Rf(52) = 0,18 ; Rf(70) = 0,50 ; Rf(100) = 0,20

h) Bnrp-Gly-Asn-Lcu-^erÇ tBu)-Thr( t3u)-C.ys-n!et-Ieu-Gly-

Lys ( Boc ) -Leu-Thr ( tBu ) -Gln-Asp( OtBu ) -leu-A.sn-Lys

15' • (Bos)-Ieu-His-Thr(t3u)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(tBu)-

As n -Thr ( 13u ) -G ly-Va 1 -G 1 y-A 1 a -P r o - I'-.H ^ *■ c

4 3 mg de Bmp-Gly Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys~Met-Leu~ Gly-OH (DOS 2 050 454), 80 rng du docosapeptide hydrogéné ci-dessus •7,5 mg de K-hydroxysuccinimide et 10 mg de dicyclohexylcarbodiimide 20 sont dissous dans 0,6 mg de DMF, et le mélange est agité en atmosphère d'azote pendant 3 /2 heures à 45°. Le produit brut est alors précipité par addition de 15 ml d'éther et purifié au moyen d'un'partage selon Craig dans le système méthanol-tampon-chloro-forme-tétrachlorure de carbone 11:3: 6:7 [tampon comme dans 1'exem-25 pie 1 kl, en 200 opérations avec des volumes de phase de chacun 3 ml, On isole la substance pure comme d'ordinaire à partir des éléments de partage 90-115 (rmax - 100 ; K = 1,0) sous forme d'une poudre amorphe.

RS : Rf(52) = 0,27 ; Rf(70) = 0,66 ; Rf(100) = 0,31 . 30 Exemple 5

H-Cys-Gly Asn-Leu-S er-Thr-Cys-I.îet-Leu-Gly-Lys-Leu-Thr-Gln-Asp-Leu-Asn-Lys-Leu-His-Thr-Tyr-Pro-Gln-Thr-Asr.-Thr-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NHp, hydrochloride (Lys"1"1 - Leu12' -Tyr22

-Asn2^ - Thr2^ - calcitonine M).

35 50 mg de Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr{tBu)-Cys-Met~ -

•Leu-Gly-Ï ys(Boc)-Leu-ThrrtBu)-Gln-Aep(0t3u)~leu-Asn-Lys(Boc)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr(t3u)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Val~ Gly-Ala-Pro-KHg sont scindés en le peptide libre, comme montré

\

dans l'exemple 1 par traitement avec l'acide chlorhydrique 12 II à 0°.

DC : Rf(45) =0,43 î Rf(101A) =0,43 ; Rf(112E) = 0,38. Electrophorèse en couche mince : pH 1,9 : 16 volt/cm; 5 1 1/2 heure, migration d'environ 4,9 cm vers la cathode.

Le dotriacontapeptidamide protégé petit être préparé comme suit :

110 mg de Boc-Oys-Gly-Asn-Leu-Ser1'tBu)-Thr(tBu)-Cys-IJet-Leu~Gly-0H (Helv. 5J3, 556 (1970) 185 mg de H-Lys(Boc)-Leu-Thr(tBu)-10 Gln-Asp(0 t3u)-L eu-Asn-Lys(Boc)-Leu-His-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Pro-Gln-Thr ( t3u)-Asn-Thr(tBu^Gly-Val-Gly-Ala-Pro-KH^ fexemple 4 g] et 17,2 mg de K-hydroxyeuccinimide sont dissous par cl.auffange dans 1,5 ml de LMP, additionnés de 23 mg de dicyclohexylcarbo-diimide et agités sous azote pendant 3 1/2 heures "à 45°. On pré-15' cipite alors le produit brut par addition de 30 ml d'éther exempt de peroxydes et on lepurifie dans un partage de Craig en effectuant 350 opérations dans le système méthanol-tampon-chloroforme-tétrachlorure de carbone 11:3:6:7 Ltampon comme dans l'exemple 1 k^]. On. isole le dotriacontapeptide protégé chroraatographiquement 25 pur à partir des éléments de partage 140-179 (rmov = 159 î K =

III c*-A.

0,83) par évaporation à sec et élimination du tampon par sublimation à 45° sous vide élevé.

DS : Rf(52A) = 0,28 ; Rf(70) = 0,54 ; Rf(100) = 0,29 ■ Exemple 6

25 ' H-Cys-Gly-Acn-Leu-Ser-Thr-C^s-I.îet-Leu-Gly-Yhr-Tyr-Thr-

Gln-Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His'-Thr-Phc-Pro-Gln-Thr-Ala-Thr-Gly-Val-

Gly-Ala-Pro-NH2 -calcitonine M).

On dissout 202 mg de BOO~Cys~Gly~Asn-Leu-Ser-tBu)~Thr (tBu)-Cys-î.îet-Leu-Gly~Thr(tBu)-Tyr(t3u)-Thr(t3u)--Gln~Asp-30 (OtBu)-Phe-Asn-Lys(Boc)Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-

Ala-Thr(t3u)-Gly-Val-Gly Ala-Pro-KHg dans 6 ml d'acide trifluoroacétique à 90 vi, on dégaze à l'azote et laisse au repos pendant 90 minues à 23°• On verse alors dans 50 ml d'éther exempt de .peroxydes glacé, filtre le précipité à 23°. On verse alors dans 35 50 Etl d'éther exempt de peroxydes glacé, filtre le précipité au vide, le lave à l'éther et le sèche sous vide à 40°. On obtient 27

18 •) mg de Thr -calcitonine r.; sous, forme de trifluoroacétate. • On transforme ce dernier par élution sur une colonne d'échangeur d'ions n° II de Ilerck (faiblement basique, forme acétate) en

2çj l'acétate ; le rendement est de 158 mg en acétate lyophilisé.

Pour la purification, on dissout 80 mg de l'acétate dans 5 ml d'eau et on additionne la solution sous agitation de 1,2 ml d'échangeur d'ions II de Merck (faiblement basique, forme de 5 base libre), il s'établit un pH d'environ 6,5 et il se produit une fine précipitation. Pour compléter la précipitation, on agite pendant 2 heures et le pH s'élève à 7,1.

On filtre alors au vide le précipité et l'échangeur d'ione ensemble, on lave à fond à l'eau et sépare le peptide de l'échan-10 geur d'ions par l'acide acétique à 90 ^ chaud. On sépare l'échangeur d'ions par filtration au vide, lave à l'acide acétique à

90 fo et lyophilise la solution acétique. On obtient ainsi 74 mg

27 ~ *

de Thr -calcitonine M sous forme de sel acétique qui présente un degré de pureté élevé d'après la chromatographie er. couche

15 mince et 11électrophorèse.

DA : Rf(52) = 0,49 (calcitonine M : Rf(52) = 0,55) DC : Rf(101A) = 0,52 (calcitonine M : Rf(101A) = 0,57). Dans 1*électrophorèse en couche mince (plaques de 20 cellulose, pH 1,9, 2 heures, 280 V) la migration vers la cathode est de 4,5 cm (calcitonine il : migration 4,5 cm). Dans l'analyse des aminoacides d'après l'hydrolyse totale (HC1 6 K, 110°, 24 heures), le produit montre le rapport calculé des aminoacides.

Le produit de départ peut être préparé comme suit : 25 a) Z-Ala-Thrf tBu ^-Glv-OMe,

On agite un mélange de 18,9 g de Z-Ala-ONp, 13,4 g de H-Thr(t3u)-Gly-0Me, 100 ml de DI.IF et 6,2 ml de N-méthylmorpho-line pendant 17 heures à la température ambiante, chasse le solvant sous vide élevé, reprend le résidu dans l'ester acétique, 30 lave et sèche comme décrit dans l'exemple 1 sous a), évapore la solution et cristallise le résidu dans 1'éther-éther de pétrole, P.P. 104-106° ; 16 g.

b) H-Ala~Thr( t3u)~GIy~0I\îe

13,3 g du produit obtenu en a) sont hydrogénés dans le 35 méthanol en présence de 1,5 g de palladium sur noir (à 10 £)• On obtient 9,4 g d'une résine incolore.

c) Z-Thr(t3u)--Ala-Thr(t3u)-Gly-0Ine

30

On dissout 9,4 g du produit obtenu sous b) et 13,2 g de Z-Thr(tBu)-OSu dans 100 ml de L'HP et on laisse au repos à la terpérature ambiante pendant 17 heures. On précipite alors le produit en le versant dans 500 ml d'eau glacée, filtre au vide, 5 sèche et cristallise dans 1'acétone-éther de pétrole en ajoutant un peu d'eau. P.P. 193-19t5° ; 13,6 g.

• d) H-Thr(t3u)-Ala-Thr(tBu)-Gly-OMe 13,1 g du produit de c) sont hydrogénés dans 750 ml de méthanol avec 2,6 g de palladium sur noir. On obtient 9,95 g d'une 10 huile incolore.

e) ?.-Gin-Thr(t3u)-Ala-Thr'tBu)-Gly-OMe Ce composé est obtenu de façon analogue à ce qui est décrit dans l'exemple 1 sous g) pour le dérivé de pentapeptide. Il cristallise dans le méthanol. P.P. 198-202° ; 10,7 g. 15 f) H-Gln-Thr(tBu)-Ala-Thr(tBu)-Gly-OMe

10 g du produit de e) sont hydrogénés dans un litre de méthanol avec 2 g de palladium sur noir. Le produit (8,2 g) est utilisé tel quel.

g) Z-Thr(tBuj-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Ala-Thr(tBu)-Gly-OMe

20 On ajoute à 8,2 g du produit de f) 8,3 g de Z-Thr(t3u)-Phc-

Pro-0H[Helv. _^_3, 2135 (1970)J ajoute encore 4,0 g de N-hydroxy-succinimide et 4,2 g de dicyclohexylcarbodiimide et on agite le . mélange pendant 17 heures à la température ambiante. On sépare alors la dicyclohexylurée par filtration sous vide, verse le 25 filtrat dans 1,3 1 d'eau glacée, sépare le précipité par filtration après deux heures, le sèche et le triture avec' 120 ml d'ester acétique. La poudre insoluble est filtrée au vide, lavée à l'ester acétique et séchée." On obtient 8,5 g d'un produit ayant les valeurs de Hf suivantes :

30 DS : Rf(l21A) = 0,78 ; Rf(102A) = 0,85 ; Rf(43C) = 0,71

h) Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Ala-Thr(t3u)-Gly-0H On dissout 5,15 g du produit de g) en chauffant avec 110

ml de méthanol à 90 $, refroidit à 23° et ajoute 13,5 ml de lessive de soude ao_ueuse 1,0 K. Après 10 minutes, on ajoute 45ml et 35 après 5 autres minutes encore 25 ml d'eau. Après 251 minutes on ' verse la solution dans 270 ml d'acide chlorhydrique 0,05 î< glacé, filtre le précipité, le lave à l'eau glacée et avec de l'acéto-■nitrile-eau (1:4) et le sèche. Le produit montre dans DS : RF(45) = 0,27 ; Rf(100) = 0,33 ; Rf(4 3C) = 0,'28 4,1 g

31

i) H-Thr-CtBu)~Phe~Pro-GIn-Thr(tBu )~Ala-Thr(tBu)-Gly--OH

On met 3,65 g du produit de h) on suspension dans 125 ml de DMF et on hydrogène en présence de 0,5 g de palladium sur noir (à 10 fa de Pd). Le prodv.it (2,62 g) est trituré à l'eau, 5 filtré au vide et séché.

DS : Rf(lOO) =0,12 ; Rf(52) =0,23

3) Z— Asn-Lys(Boc)-Pho-His-Thr(t3u)-Phe~Pro~GIn-Thr(tBu)-Ala~Thr(t3u)-G3 y-OH.

On dissout 7,2 g de Z-Asn-IysCBocOPhe-His-NH-KHg 10 (^Helv. 5_3, 2135 (1970)"^ en chauffant à 80° dans 30 ml de DMF, refroidit à -30° et ajoute 7,74 ml d'acide chlorhydrique 3,7 N dans le dioxanne. On ajoute alors à -30° 1,42 ml de nitrite de tert.-butyle laisse réagir à -10° pendant 10 minutes, refroidit de nouveau à -30° et ajoute alors goutte à goutte une solution 15 de 6,45 g de H-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(t3u)-Ala-Thr(tBu)-Gly-0H et 7,8 ml de N-éthyl-diisopropylamine dans 70 ml de BîaF. On laisse reposer pendant 18 heures à 0° et verse alors la solution dans 400 ml d'acide acétique à 1 c/= glacé. Le précipité est filtré au vide, lavé à l'eau et séché sous vide sur chlorure de calcium» 20 Le produit est mis à digérer avec de 1'acétonitrile, filtré au vide et séché.

DS : Rf(70) = 0,33 ; Rf(100) =0,21 . k) Z-Asn-LysfBoc)-?hs-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr ( tBu ) -AIs-Th r' tBu ) -SI y-Va 1--G1 y~AIa-Pro-NH2 25 . A un mélange de 7,5 g de Z— Asn-I.ys(Boc)-Phe-His-Thr( tBu)~

Phe-Pro-Gln-îhr(t3u)-Ala-Thr(tBu)-Gly-0H, 0,99 g de K-hydroxy-succinimide, 1,84 g de HO/al-Gly-Ala-Pro-ITHg CHelv. loc. cit3et 70 ml' de DÏIF on ajoute 1,11 g de d'icyclohexylcarbodiimide et agite pendant 5 heures à 45°. De mélange est alors versé daiis 1,2 litre 30 d'éther glacé, on filtre le précipité au vide et on le sèche. Le produit brut est agité deux fois avec chaque fois 200 ml d'acéto-nitrile-méthar.ol (9*.l) filtré au vide et séché.

DS : Rf(45) = 0,50 ; Rf(96) = 0,46 ; Rf(lOO) = 0,29 Rf(121) = 0,80 ; rendement 8,5 g 35 1) H-Asn-Lvs(Boc)-Ph3-His-Thr'tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-

Ala-Thr'tBu)-Gly-Val-GIy-Ala-Pro-LH^, acétate

32

7,05 g du produit décrit en k) sont hydrogénés dans 4 00 ml d'acidc acétique à 80 c!= en présence de 1 g de palladium sur noir (10 fo Pd). Le produit (6,6 g) montre dans DS :

Rf(96) = 0,35 ; Rf(121) = 0,72 ; Rf(45) = 0,27 5 m) Z-Thr(t3u)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp-(OtBu)-

Pho-Asn-I.ys ( Boc )-Phe-His-Thr ( t3u) -Pho-Pro-GIn-Thr (tBu)-Ala-Thr( t3u)-Giy-Val-Gly-Ala-?ro--j.H^. On dissout'565 mg de Z-Thr(tBu)-Tyr(t3u)-Thr(tBu)-Gln-Asp-(OtB^-Phe-i'.H-KHgfHelv.loc «cit. ) en chauffant à 80° dans 4 ml de 10 DLIF, refroidit à -20°, ajoute 0,35 ml d'acide chlorhydrique, 3,7 N dans le dixanne et 0,067 ml de nitrite de tert.-butyle et on agite pendant 10 minutes à -15°, on ajoute ensuite goutte à goutte une solution refroidie à 0° de 600 ml d'acétate de H-Asn~lys(3oc)-Phe-His-Thr(t3u)-Phe-Pro~Gln-Thr(t3u)-Ala-Thr(tBu)-Gly Val-Gly 15 Ala-Pro-îtHg dans 5 ml de DMF et 0,33 ml de jV-éthyldiisopropylamino.

On agite pendant 5 minutes à -15°, laisse se réchauffer à 23° et agite pendant 6 heures. On verse alors dans 100 ml d'eau glacée, filtre le précipité au vide, le lave à l'eau et le sache sous vide sur chlorure de calcium. Pour la purification, on .préci-20 pite le produit dans le méthanol-eau et triture le produit préci- ' pité après séchage avec de l'acétohe. On obtient 650 mg de produit. DS : RF(43C) = 0,33 î Rf(70) = 0,60

n) H~Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr'tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Pha-Asn~ Lys(Boc)-Pha-Hi s~Thr(t3u)-Phe-Pro-GIn-Thr(t3u)-Ala-Thr(t3u)~

25 Crly-'vsl-Gly-Ala-Pro-r^

610 mg du produit obtenu en ni) sont hydrogénés dans 25 ïïi!

d'acide acétique à 80 $ en présence de palladium sur noir. Le pro duit est dissous dans 50 ml de n-butanol saturé d'eau, et, pour

éliminer l'acide acétique, la solution est lavée deux fois avec

30 une solution diluée de carbonate de sodium, puis deux fois avec une solution de chlorure de sodium à mi-saturation et finalement avec de l'eau. On évapore alors la phase butanolique et obtient

605 Mg du produit sous forme d'une mousse incolore.

DS : Rf(100) =0,20 ; Rf(96) = 0,40.

35 0 ) Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-c'er~tBu)-Thr( t3u)-Cys-.*:et-

Leu-Gly~Thr( t3u)-Tyr( tBu)-Thr-'t3u)-Gln~Asp(0t3u)~Phe-Asn--Lys(3oc )-Phe-His-Thr( tBu)-?he-?ro-Gln-Thr( t3u)-Ala-Thr (tBu)-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-KH0

3 3

Un mélange de 605 mg de H-Thr'tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)~ Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(Boc)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr (t3u)-Ala-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-Àla-Pro-ÀH^, 290 mg de décapeptide Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-r:p.r-tBu)-Thr( tBu)-Cys-I-.:et-Ieu-Gly-OH^Kelv. 5 5_3> 556 (1970^) 46 mg de 1-hydroxybenzotriazole et 10 ml de DMF

est additionné de 75 mg de dicyclohc-xylcarbodiimide et agité pen-'dant 90 minutes à 40° et 18 heures à 23°, on sépare par filtration au vide la dicyclohexylurée qui s'est formée et on verse le filtrat dans 100 ml d'éther exempt de peroxydes, glacé. On filtre 10 le précipité au vide, le lave à l'éther et sèche. On reprécipite le produit brut pour le purifier, deux fois du EMF-éther et deux fois du BIïIF-eau. On soumet le produit précipité à un partage à contre-courant avec 200 opérations (système solvant 3,66 litres de méthanol, 1 litre de tampon, 2 litres de chloroforme, 2,32 litres 15 de tétrachlorure de carbohe ; tampon ; 29 ml d'acide acétique et 19 g d'acétate d'ammonium). La substance pure se trouve dans les fractions 123-137, coefficientde partage K = 0,76.

PS : Rf(100) = 0,32 ; Rf(52A) = 0,41.

Exemple 7 •

20 H-C^s-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-leu-Thr-

Gln~Asp~Phe~Asn-Lys~Phe-His~Thr-Phe-Pro~Gln-Thr-Ala-Thr-Gly-Val~ Gly Ala-Pro-NH2, acétate (Leu12 -Thr27 -calcitonine M).

_490 îng de Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-tBu)-?hr(tBu)-Cys~;vIet-Leu-Gly-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys(Boc)-25 Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Ala-Thr(t3u)-Gly-Val-Gly~ Ala-Pro-NHg sont ajoutés à 12 ml d'acide trifluoroacétique à 90 ^ glacé, on dégaze à l'azote et chauffe à la température ambiante. On abandonne pendant 90 minutes à'la température .ambiante, refroidit de nouveau à 0°, verse la solution dans 150 ml d'éther exempt 30 de peroxydes glacé, laisse reposer pendant 2 heures à 0°, filtre au vide le précipité, lave à l'éther et sèche. On dissous dans 15 ml d'acide acétique à 5 ?> et filtre sur une colonne échangeuse d'ions Ti0 II de Merck, faiblement basique, forme acétate, pour éliminer l'acide trifluoroacétique. On lave la colonne trois fois

35 avec chaque fois 10 ml d'acide acétique à 5 7° réunit les éluats et

1P p7

• lyophilise. On obtient 432 mg de Leu -Thr -calcitonine LT, acétate, sous forme d'une poudre légère incolore.

DC Rf(lOlA) =0,50

DA : Rf(R2) = 0,45 ''

Dans 1'élcctrophorèse en couche mince sur plaques de cellulose (pH 1,9» 280 V, 2 heures) la migration vers la cathode est de 4,5 cm.

Le produit de départ peut être obtenu comme suit : '5 a) Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(0t3u)~Phe-I\:H-lxll2

On dissout 12,7 g de H-Leu-Thr( tBu)-Gln-Asp (0 tBu )-Phe-0I.!e dans 100 ml de DM?, ajoute 9,0 g de Z~Thr(tBu)-05u et laisse au repo pendant 17 heures à 25°. On précipite alors à l'eau, filtre au vide, sèche et cristallise dans l'ester acétique, rendement 14,2 g: 10 pour une purification plus poussée,-on reprécipite du méthanol-

eau. P.P. 197-199°• Pour la transformation en hydrazide on dissout 13,9 g de Z-Thr(t3u)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-OMe obtenu dans 700 ml de méthanol, ajoute 70. ml d'hydrate d'hydrazine et laisse reposer à la température ambiante pendant 45 minutes. On 15 concentre alors sous vide à un volume de 300 ml et précipite par addition de 500 ml d'eau. On filtre au vide, lave à l'eau à neutralité et sèche. On obtient 13,5 g d'hydrazide brut qu'on purifie en le reprécipitant une fois dans le BIJF-eau et on cris-- tallise dans le méthanol. On obtient 11 g de produit cristallin 20 fondant à 225-227°. .

b) Z-Thr(tBu)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(0t3u)~Phe-Asn-Lys (Boc)Phe-Kis-Thr(tBu)~Phe-Pro-Gln~Thr(tBu)-Ala-Thr-( tBu)-Gly-7al~Gly-Àla-Pro-I\H2 On chauffe une suspension de 4,00 g de ^-Thr(t3u)-Leu-2^ Thr(t3u)-Gln-Asp(0t3u)-?he-I\:Iî~i;H2 et 25 ml de DMF sous agitation jusqu'à ce qu'à 70° tout soit dissous, on refroidit la solution à -20° et ajoute 2,50 ml d'acide chlorhydrique 3,70' N dans le dioxanne. On ajouts alors goutte à goutte 0,48 ml de nitrite de tert.-butyle en agitant et refroidissant à -20° laisse se réchauf-30 fer à -10° et agite à cette température pendant encore 15 minutes.

• On ajoute ensuite goutte à goutte une solution préalablement refroidie à -10° de 4,2 g de H-Asn-Lys ( Boc )--Phe-Ki s-Thr ( tBu) ~ Phe-Pro-Gln-Thr(t3u)-Ala~Thr(t3u)-Gly~Val-Gly la-Pro-Î.f^,

.acétate, dans 50 ml de DMF et 1,6 ml de K-éthyl-diisopropylamine, 35 laisse se réchauffer à 0° et agite pendant encore 60 minutes, en ajoutant lentement goutte à goutte encore 0,8 ml de l'.-éthyl-diiso-propylamir.e. On laisse réagir pendant 17 heures à 23° et il se produit une précipitation gélatineuse. On ajoute alors 500 ml d'éther exempt" de peroxydes, glacé, filtre le' précipité, le lave

35

à l'éther et le sèche. On triture le produit avec 200 ml d'eau glacée, filtre au vide et reprécipite trois fois du LUF-eau et deux fois du IMF-ester acétique. On obtient ainsi 4 ;98 g de produit. DS : R?(70) = 0,61 ; Rf(lOO) = 0,38 5 c ) H ■- Th r ( 13u ) -I. e u ■- Th r ( 13 u ) -G 1 n ■- A s -p ( 01B u ) -Ph e - A s n- L y s

(Boc)-Phe-Hi s-Thr(t3u)-?he-Pro-Gln-Thr(t3u)-Ala~Thr(t3u)-G-l y- V'al-G ly~Al a-Pr o-M-Ig On dissout 3,0 g du produit obtenu en b) dans 200 ml d'acide acétique à 90 $ et on hydrogène comme d'habitude en pré-10 sence de 0,5 g de palladium sur noir (10 $ Pd). On dissout l'acétate obtenu, pour éliminer l'acide acétique, dans 200 ml de n-buta-nol saturé d'eau et lave la solution plusieurs fois avec une solution diluée de carbonate de sodium, une solution diluée de chlorure de sodium et finalement avec de l'eau. On sépare par centrifuga-15 tion les émulsions compactes qui se forment pendant le lavage de la solution butanoliaue. On évapore alors à sec la solution butano-lique et obtient 2,15 g de H-Thr(tBu)-Leu-Thr(t3u)-Gln-Asp(0tBu)~ Phe-Asn-Iys(Boc)?he-His-Thr(t3u)-?he-Pro-Gln-Thr(t3u)-Ala-Thr (tBu)-Gly Val-Gly-Ala-Pro-NHg, sous forme d'une résine incolore. 20 ' DS : Rf(96) = 0,37 ; Rf(100) = 0,19

d) ]3oc-Cys-Gly-Asr.-Ieu-Sor-(t3u)-Thr(t3u)-Cys-Met~Leu-Gly-Thr(t3u)-Leu-Thr(t3u)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys (Boc)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(t3u)-Ala-Thr ( tBu ) —Gjy — 7 sl-Gly-Ala-Pro-I .H0 25 Un mélange de 2,01 g du produit obtenu en c), 1,00 g de

Boc-Cys~Gly-Asn-Leu-Ser-t3u)-Thr(t3u)-Cys-i',iet-Leu-Gly-0K, 250 mg de N-hydroxysuccinimide et 30 ml de DI.îP sont additionnés sous agitation de '00 mg de dicyclohexylcarbodiirnide et agité pendant 6 heures à 43°. On refroidit alors le mélange à 0° pendant 3 ' 30 heures, filtre au vide la dicyclohexylurée qui s'est formée et verse le filtrat dans 250 ml d'éther exempt de peroxydes glacé. On filtre au vide le précipité, lave à l'éther et sèche. Pour purifier le produit on le précipite trois fois du Di.lF-eau et ensuite trois fois du Dr.IF-acétone. On obtient ainsi 1,72 g de 35 Leu12 -Thr27 -calcitonine I.î protégée, purifiée.

t

36

DS : Rf(52A) = 0,33 ; Rf(100)...= 0,30 ; Rf(107) = 0,58 Exemple 8

H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Lïet-Leu-Gly-Thr-Leu-Thr-Gln-Asp~Phe~Asn~Lys~Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln~Thr-Asn-Thr-Gly-5 Val-Gly-Ala-Pro-KH^ (Leu12 -Asn2^ - Thr27 -calcitonine M)

On dissout 170 mg de Boc-Cys-Asn~Leu-3er(tBu)-Thr-(tBu)-Cys-Icet-I.eu~Gly-Thr( tBu)-Leu-Thr ( tBu)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-Asn-Lys (Boc)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBu)-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-KH^ dans 5 ml d'acide trifluoroacétique à 90 fi, 10 laisse reposer à 25° pendant 90 minutes, précipite le trifluoro-acétate de peptide avec de l'éther exempt de peroxydes, filtre au vide, lave à l'.éther, sèche et on dissout dans l'acide acétique à 1 fi. On filtre ensuite sur une colonne échangeuse d'ions de Merck (faiblement basique, forme acétate), on élue avec de 15 l'acide acétique à 1 fi et lyophilise 1'éluat (116 mg). Pour la purification de l'acétate obtenu, on le dissout dans 5 ml d'eau (pH de la solution ) 4,2) et ajoute par portions sous agitation en tout 2,8 ml d'échangeur d'ions J.ïerck K° II (faiblement basique, forme base). Dans cette -opération le pH s'élève lentement et, 20 lorsqu'il atteint environ 6,7 la précipitation du peptide libre commence. On agite pendant en tout 2 heures et on atteint ainsi une valeur de pH de 7,1. On filtre alors ensemble le précipité et l'échangeur d'ions, lave à l'eau et dissout ensuite le peptide pour le séparer de l'échangeur d'ions par agitation avec de 25 l'acide acétique chauffé à 60°. On filtre au vide, lave à l'acide acétique à 90 fi et lyophilise. On obtient 98 mg de Leu -Asn Thr27-calcitonine M sous forme d'acétate de grande pureté. DC: Rf(101A) = 0,33 DA : Rf(52) = 0,47. Le procédé de purification selon l'invention par précipitation du peptide dans le 30 domaine isoélectrique décrit ici fait l'objet d'une demande suisse au nom de la demenderesse.

Le peptide protégé employé comme produit de départ peut être préparé comme suit :

a) Z-Thr't3u)-Leu-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys 35 (Boc)-Ph e-Ki s-Th r(tBu)~Ph e-P ro-GIn-Thr(13u)-A sn-Thr

( tBu ) - G1 ?/• - V a 1 - G1 y- A1 a -P r o ~NH ^

37

On dissout 38O mg de Z-Thr(tBu)-Lcu-Thr(tBu)-Gln-Asp (OtBuî-Phe-riïïîxHg (cf« exemple 7) dans 5 ml de DI.1F sous agitation en chauffant à 70° on refroidit la solution à -20° ajoute 0,265 ml d'acide chlorhydrique 3,71 K dans le dioxanne, puis 0,051 ml de 5 nitrite de tert.-butyle et on laisse réagir pendant 10 minutes à -10°. On ajoute alors une solution refroidie à -10° de H-Asn-lys (Boc)-Phe-Kis-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(t3u)-Asn-Thr(t3u)-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-I-îHg, acétate (cf. exemple 1, n) dans 5 ml de BIvîF et 0,20 ml de N-éthyldiisopropylarnine et agite pendant une heure a 10 0°. Pendant ce temps on ajoute encore 0,07 ml de K-éthyl-

diisopropylamine, laisse le mélange se réchauffer à la température ambiante et abandonne au repos pendant une heure à 25° et 20 heures à 5° et il se forme un précipité gélatineux. On précipite par additionde 100 ml d'eau glacée, sépare le précipité par 15 filtration au vi.'e après une heure à 0° , le lave à l'eau e t le sèche. On triture la poudre avec l'éther, filtre au vide et sèche de nouveau. Le produit brut (poudre incolore) est précipité,

pour la purification, une fois du DMF-eau et deux fois du D?.IF~ ' acétone. On obtient 440- mg de produit.

20 DS : Rf(70) = 0,52 ; Rf(lOO) = 0,31 5 Rf(96) = 0,40

b) jg-ThrftBu)-Leu-Thr'tBu)-Gln-Ast/OtBu)-Phe-Asn-Lys (Boc)-Phe-Ki s-Thr'tBu)-Pho-Pro-Gln-Thr(tBu)-Asn-Thr(t3u)-Gly-7al-Gly-Ala-Pro-KH0

On dissout 260 mg du produit obtenu en a) dans 25 ml 25 d'acide acétique à 80 fio et on hydrogène comme d'habitude en présence de 50 mg de palladium sur noir (10 fi Pd). On dissout le produit (266 g de résine) dans 20 ml de n-butanol saturé d'eau pour éliminer l'acide acide acétique. On lave plusieurs fois avec une solution de carbonate de sodium, une solution diluée de 30 chlorure de sodium et de l'eau et évapore alors la phase butano-lique. Rendement : 199 mg.

DS : Rf(100) =0,13 ; Rf(96) = 0,36'

c) Boc-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser'tBu)-Thr'tBu)-Cys-Met~ J,eu-Gly-Thr ' tBu. ) -I su-Thr •' tBu ) -Gin-A su ( 0 tBu ) ~?he~

35 Asn-L.vs ( Boc ) Phe-Hi s-Thr [ t3u)-Phs-GIn-Thr ( tBu ) ~Asn-

ThrftBu)-Gly-Yal-Gly-Ala-Pro-KH 0

38

■A un mélange de 102 mg de Boc-Cys~Gly-Asn-Leu-3er-(tBu)-Thr(t3u)-Cys-Jïlet-Leu-Gly-0H, 199 rcg H~Thr( tBu)-Leu-Thr( tBu)-Gln-Asp ( OtBu ) -?he-Asn-Iys ■' Boc ) -Phe-His-Thr( tBu)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Asn-Thr(tBuj-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-i.Hg, 16 mg de 5 N-hydroxysuccinimide et 3 ml de LKF sous agitation, on ajoute

27 mg de dicyclohexylcarbodiimide, agite pendant 6 heures à 45°, verse le mélange dans l'éther glacé et filtre le précipité au vide après 2 heures à 0°. On lave à l'éther, sèche, dissout la poudre sous chauffage dans 5 ml de DMF, refroidit à la tempéra-10 ture ambiante et précipite le produit par addition de 50 ml d'ester acétique. On filtre au vide, lave à l'ester acétique, sèche, dissout la poudre par chauffage dans 10 ml de Iù,IF~méthanoI (1:1), refroidit dans la glace et précipite par addition d'eau glacée. On filtre après 17 heures à 0°. le fin précipité, le 15- lave à l'eau et le sèche sous vide sur chlorure de calcium. On obtient 175 mg de dotriacontapeptide protégé sous rubrique,

R3 : Rf(107) = 0,60 ; Rf'52A) = 0,23 ; Rf(100) = 0,22 Exemple 9

H-Cys~Gly-Asn-Leu~Ser-Thr-Cys~IvIet-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr~

' 20 Gln-Asp-Phe-Asn~Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Asn-Ile~Gly~

Val-Gly-Ala-Pro-NHg (Asn -calcitonine M).

A 2,5 ml d'acide trifluoroacétique à 90 fi glacé, on ajouts sous agitation et dégazage à l'azote 115 mg de BOC-Cys-

Gly-Asn-Leu-Ser( tBu)-Thr( tBu)-Cys-Ue t-Leu-Gly~T'hr( tBu)-Tyr( tBu) -

25 Thr(tBu)-Gln-Asp'OtBu)-Phe-Asn-Lys(BOC)-Phe-Hi s-Thr(tBu. )-

Phe-Pro-GIn-Thr'tBu)-Asn-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-î'iKg finement pulvérisé. Après dissolution du peptide on laissé la solution s'échauffer à 21° et on laisse au repos pendant 90 minutes.

On verse alors dans 50 ml d'éther exempt de peroxydes glacé, fil-

30 tre au vide et sèche. On obtient 84 mg de sel trifluoroacétique de l'Asn -calcitonine M. Pour la transformation en l'acétate,

on dissout dans l'acide acétique à 1 fi- et filtre sur une colonne

échangQuse d'ions N° II de l'Jerck (faiblement basique, forme

- 20

acétate). On lyophilise l'éluat et obtient 75 mg d'Asn -'35 calcitonine 11 sous forme d'acétate. Le produit présente d'après l'hydrolyse totale (HC1 6 îî, 24 heures 110°) le rapport d'amino-• acides attendu.

39

Par chromatographie en couche mince, sur plaques de cellulose le produit présente les valeurs de Rf suivantes (entre parenthèses les valeurs de comparaison de la calcitonine Iv:) ; Rf(101A) =0,55 {0,60) ; Rf(112A) =0,58 (0,62). 5 Le peptide protégé utilisé comme produit de départ peut

être obtenu comme suit :

a) Z-Asn-Ile-Gly-OMe

On abandonne au repos à la température ambiante pendant 18 heures un mélange de 91» de H-Ils-Gly-OMe «, HC1, 16,3 g de 10 Z-Asn-ONp, 50 ml de DJvîF, et 4,1 ml de N-éthyl~morpholine. La solution se prend en une gelée. On ajoute alors 300 ml d'éther, triture, filtre au vide, sèche, triture la poudre insoluble avec 200 ml d'eau, filtre au vide, sèche et recristallise dans l'ester acétique-hexane. On obtient 15 g de Z-Asn-Ile-Gly-OMe fondant à 15 218-219°. -

b) H-A sn-11e-GIy-0 M e

14 g de Z-Asn-Ile-Gly-OMe sont mis en suspension dans 500 ml de DLÏF ethydrogénés avec 1 g de palladium sur noir (10 fi Pd). Le produit de départ se dissout. Quand l'hydrogénà-20 tion est terminée on sépare le catalyseur par filtration et on évapore à sec. On obtient 9}7 g de H-Asn-Ile-Gly-Oî.Ie qui ne contient plus de produit de départ.

c) Z-Thr7t3u)-Asn-Ile-Gly-0r.!e

Un mélange de 9,5 g de H-Asn-Ile-Gly-OLIe, 80 ml de LI.'IF 25 et 13,6 g de Z-Thr(t3u)-05u est laissé au repos pendant 18 heures à 25° et le tout se solidifie. On ajoute 300 ml d'éther, on triture, filtre au vide et sèche. On triture alors avec 200 ml d'eau, filtre a.i vide et sèche. On cristallise le résidu dans 1'éthanol ; 12,4 g fondant à.207-208°. 30 d) H-Thr't3u)-Asn-Ile-Gly-0Me

11,0 g de Z-Thr ( tBu)-Asn-Ile-Gly-Oï.le sont dissous par chauffage dans r500 ml de pî.IF et hydrogénés en présence de 1 g de palladium sur noir (10 Pd). Cuand 1'absorption.d'hydrogène est terminée, on sépare le catalyseur par filtration et évapore à 35 sec. On obtient 8,0 g de H-Thr(t3u)-Asn-Ile-Gly-0I'.'e ; par chromatographie en couche mince sur plaques de gel de silice, on 'a Rf(43A) = 0,12 ; Rf = 0,23 dans le système chloroforme-méthanol• (70:30).-

40

e) Z-Gln~Thr(tBu)-Asn-Ile-Gly-OMe

7,5 g de II-Thr(t3u)-Asn~Ile~Gly-0î.Ie sont dissous dans 100 ml de DMF et on ajoute 7,7 g de Z-Gln-ONp. Le mélange réac-tionnel se prend lentement en une masse solide.

5 Après 18 heures, à la température- ambiante, on ajoute

375 ml d'éther, on triture à fond, filtre au vide, sèche, triture avec 250 ml d'eau, filtre au vide et sèche encore une fois. On précipite ensuite du mélange trifluoroéthanol-eau ; on obtient 11 g fondant à 275-277°. Le produit est très difficilement 10 soluble dans les solvants organiques usuels.

f) H-Gln-Thr(tBu)-Asn-Ile—Gly-OMe

8,5 g de ?-Gln-Thr(tBu)-Asn-Ile-Gly~OMe sont mis en suspension dans 500'ml de DIïiF et hydrogénés en présence de 1,5 g de palladium sur noir (10 fi Pd). Le produit initialement insolu-15 ble entre en solution. Quand l'hydrogénation est termiée, on sépare le catalyseur par filtration et on évapore ; on obtient 6,5 g de H-Gln-Thr(t3u)-Asn-Ile-Gly-0Me sous forme d'une résine. Par chromatographie en couche mince on a Rf(43C) = 0,20 ;

• Rf(101A) = 0,16. • . ■.

20 g) Z-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Asn-Ile-Gly-0f.1e

6.0 g de H-Gln-Thr(tBu)-Asn-Ile-Gly-OI.Ie sont dissous dans 500 ml de Pî.lF et additionnés de 5,8 g de Z-Thr(tBu)-Phe™ Pro-OH, 2,3 g de N-hydroxy-succinimide et 3 g de dicyclohexyl-carbodiimide. On agite le mélange réactionnel pendant 16 heures à

25 la température ambiante, sépare la dicyclohexylurée par filtration au vide, concentre à un volume de 200 ml et verse dans 1,5 litre d'éther. On laisse reposer pendant 3 heures à 0° et filtre au vide le fin précipité (10 g de poudre). On triture la poudre avec 200 ml d'eau, filtre au vide et sèche. On obtient 9,6 g de produit 30 brut que, pour le purifier, on triture d'abord avec l'ester acétique. On filtre au vide, sèche et met en suspension dans l'acétone, on filtre au vide de nouveau et on sèche. Le produit insoluble (3,3 g) est suffisamment pur pour être employé. Dans la chromatographie en couche mince sur plaques de gel de silice 35 on a Rf(l02A) = 0,66.

h ) 7. - Th r ( t B u ) -Ph e -P r o ~ G1 n - Th r ( 13 u ) - A s n ~ 11 s ~ GI y- 0 H

3.1 g de 2~Thr( t3uN'-Phe-Pro-GIn-Thr( t3u)-Asn-Ile-Gly-0He sont dissous par chauffage dans un mélange de 155 ml de méthanol,

41

45 ml de dioxanne et 55 ml d'eau. On refroidit à la température ambiante, ajoute 8 ml de NaOH 1,0 M et laisse au repos à la température ambiante pendant 30 minutes.

• On refroidit alors à 0° et ajoute 150 ml d'eau glacée et 24 ml d'acide chlorhydrique 1,0 K. On filtre au vide le précipité, le lave à l'eau glacée et le sèche. On obtient 2,56 g de poudre qui se montre unitaire d'après la chromatographie en couche mince ;"Rf(45) =0,21 ; Rf(lOO) = 0,19.

j) H-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Asn-Ile-Gly-OH On dissout 2,37 g de Z-Thr(t3u)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Asn-Ile-Gly-OH dans 60 ml d'acide acétique à 80 fi et on hydrogène en présence de 200 mg de palladium sur noir (10 fi Pd). Quand l'hydrogénation est terminée on filtre au vide, évapore et sèche. On obtient 2,28 g de résine, qui par chromatographie en couche mince se présente comme exempte de produit de départ non hydrogéné ; Rf(52) = 0,21 ; Rf(107) = 0,53-

k) Z-Asn-Lys(Boc)- Phe~His-Thr(tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-» Asn-Ile-Gly-OH ■ On dissout 1,41 g de Z-Asn-L.ys(Boc )-Phe-His-KHlVH^

dans 20 ml de DMF et on refroidit à -30°. On ajoute alors 1,5 ml d'acide chlorhydrique 3,2 K dans le dioxanne, puis 0,29 ml de nitrite de tert.-butyle. On laisse se réchauffer à -12° et agite pendant 15 minutes à -12°. On ajoute ensuite goutte'à goutte une solution refroidie à 0° de 1,65 g de H~Thr(t3u)-Phe-Pro-Gln-Thr(tBu)-Asn-Ile-Gly-OH et 1,2 ml d'une solution à 40 fi d'hydroxyde de triméthylbenzylammonium dans le méthanol dans 30 ml de D?JF et 6 ml d'eau. On agite en refroidissant à la glace et ajoute en 30 minutes encore 1,1. ml de K-éthyl-diisopropylaœine.

On laisse reposer pendant 5 heures à 0° et pendant -ce temps, il se dépose un précipité gélatineux. On verse alors le mélange réactionnel dans 300 ml d'acide acétique à 1 fi>, agite pendant 2 heures à 0° et filtre le précipité au vide. On lave à l'eau, sèche, additionne de 50 ml de méthanol et agite pendant 2 heures à la température ambiante. On filtre alors au vide le Z~Asn~I.ys(Boc)Phe-His-ïhr(tBu)-Phe-Pro-Gln~Thr(t3u)-Asn-Il-Gly~ • OH. On obtient 3^9 mg ; à la chromatographie en couche mince sur plaques de gel de 'silice, on a rf(100) = 0,18 ; Rf(52) = 0,24; Rf(70) = 0,33-

42

1) Z-Asn-Lys(Boc)-Phe-His-Thr! t3u)-Phe-Pro-GIn-Thr(t3u)-

Asn-Ile-Gly— V a I -G l.v-AI a-P r o -KH ^

Un mélange de 420 mg de Z-Asn-Iys(Boc)-Phe-His-Thr(tBu)-Phe-Pro~Gln-Thr(tBu)-Asn-Ils-Gly~OH, 55 mg de N-hydroxysuccir.imide 5 et 7 ml de Di.îF est additionné sous agitation de 62 mg de dicyclo-hexylcarboddimide et 103 mg de H-Val-Gly-Ala-Pro-îJîg• On chauffe alors à 45° et agite pendant 5 heures à cette température. On refroidit ensuite à 0° et verse dans 80 ml d'éther glacé. On filtre au vide le précipité, on le sèche et, pour le purifier, 10 on le reprécipite une fois du DI.ïF-acétone puis du DÎ.IF-acétonitrile on obtient 420 mg de 1'hexadécapeptide sous rubrique. Dans la chromatographie en couche mince sur plaques de gel de silice on a : Rf(100) = 0,24 ; Rf(107) = 0,60.

m) H-A s n-Iys(B o c)-Phe-H i s-Th r(13u)-Ph g-Pro-G1n-Thr 15 (t3u)-Asn-Ile-Gl.y-Val-GIy-Ala-Pro-KH2

On dissout 395 mg du produit obtenu en 1) dans 25 ml d'acide acétique à 80 fi et on hydrogène en présence de 100 mg de palladium sur noir (10 fi> Pd). Quand l'hydrogénation est terminée on sépare le catalyseur par filtration au vide et on évapore à 20 sec. On obtient 380 mg de produit qui ne contientplus du produit de départ d'après la chromatographie en couche mince sur plaques de gel de silice ; Rf(107) = 0,30.

n) Z-Thr(t3u)-Tyr(t3u)~Thr(t3u)-Gln~Asp-(0t3u)~

Phe-Asn-Iys(5oc)-Phe-His-Thr't3u)-Phe-Pro-GIn-Thr 25 ( t Bu ) - As n-11 e -G 1 y- V a 1 -G 1 y-A1 a -P r o - r-H 0

" 1 1 - " 1 ■ y~X

On dissout 358 mg de Z-Thr(t3u)-Tyr(t3u)-Thr(t3u)-Gln-Asp (OtBu)-Phe-î.HIMI^ par chauffate dans 3 ml de LÎ.IF, refroidit à -20° et ajoute 0,26 ml d'acide chlorhydrique 3,2 K dans le dioxanne, puis 0,045 ml de nitrite de tert.-butyle. On agite à ^15° 30 pendant 15 minutes. On ajoute alors une solution refroidis à 0° de 380 mg du produit obtenu en m) dans un mélange de 10 ml de DMF, 2 ml d'eau, 1 ml d ' acétoni trile, 2 ml de dimé thylsulfoxyde et 0,2 ml de K-éthyldiisopropylamine et on agite à 0° pendant .18 heures. le produit précipité est filtré au vide, et pour le 35 purifier, reprécipité deux fois du DI.IF-ester acétique. On agite alors la poudre avec 20 ml de méthanol, filtre au vide le produit insoluble dans le méthanol et on le sèche. On obtient 210 mg du •peptide sous rubrique. Dans la chromatographie en couche mince,

43

il présente : Rf(43C) = 0,40 ; Rf(100) =0,28 ; Rf(96) = 0,42. o) H-Thr( tBu)-Tyr( t3u)-Thr( tBu )--Gln-Asr>( OtBu)-Pho-

J[ sn-lys(Boc)-Phe-His-Thr'tBu)-?he-Pro-Gln-Thr(tBu)-A s n -11 o - G1 y - Y a 1 - G1 y -- AI a - P r o - N H ^ 5 On dissout 220 mg du produit obtenu en n) dans 15 ml d'acide acétique à 80 cj° et on hydrogène en présence de 20 mg de palladium sur noir (10 fi Pd), Quand 1'hydrogénation est terminée, on filtre au vide pour séparer le catalyseur et on évapore à sec. On obtient un résidu de 210 mg. Pour chasser 10 l'acide acétique, on dissout le résidu dans 15 ml de n-butanol saturé d'eau et on lave là solution avec une solution diluée de bicarbonate de sodium, puis plusieurs fois à l'eau. On évapore alors à sec la phase butanolique, ce qui donne 202 mg du peptide sous rubrique exempt d'acide acétique. La chromatographie en 15 couche mince donne Rf(96) = 0,40 ; Rf(43C) - 0,32.

p) Boc-Cys-Gly~Asn-Leu-Ser( tBu)-Thr'■ tBu)-Cys-Het-Leu-• Gly-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Gln-Asp(OtBu)-Phe-Asn-Lys (Boc ) -Phe-Hi s-Thr ( tBu)-Phe-Pro-GIn-Thr(tBu)-Asn-11 e - G1 y-Y a I -G 1 y-Al a ~P r o - Is"H ^ 20 Un mélange de 97 mg de Boc-Oys-Gly--Asn~Leu-Ser-(tBu)~

Thr(t3u)-Cys-I,;et~Leu-Gly-0H, 195 mg du peptide obtenu en o), 16 mg de K hydroxybenzotriazole et 3 ml de DMF est additionné de 16 mg de dicyclohexylcarbodiimide et on agite sous azote' pendant 5 heures à 45°. On verse alors le mélange réactionnel dans 25 • 50 ml d'éther exempt de peroxydes glacé et on filtre au vide le fin précipité. Pour purifier le produit, on le reprécipite deux fois du DMF-eau et deux fois du LIvIF-ester acétique. On obtient ainsi 120 mg du peptide protégé sôus rubrique. Par chromatographie en couche mince sur plaques de gel de silice on a :

30 Rf(52A) = 0,31 5 Rf(100) =0,17 ; Rf(107) = 0,65

Claims (2)

1. 44

   R ■') VBI'iDI C A TI ON S

   1 - Procédé de préparation de nouveaux peptides, . caractérisé en ce qu'on prépare de façon en soi connue des dotriacontapeptidamides de formule I :

   1 2 3-4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5 H-Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys- X -Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Asp-Phe-Asn-~Lys-Phe-His~Thr~Phe~Pro-Gln~Thr-Ala-Ile-Gly-.29 30 31 32

   Val-Gly-Ala-Pro-MI2 (i)

   10 dans laquelle X représente un radical de L-méthionine, de L—valine de L-norvaline, de L-leucine, de L-isoleucine, de L-norleucine ou d'acide L- J^-aminobutyricme et dans laquelle la L-alanine2^

   P7

   est remplacée par la L-asparagine et/ou la isoleucine par la L-thréonine et dans laquelle éventuellement un ou plusieurs des 15 aminoacides dans les positions 11, 12, 16, 19, 22 et 24 sont

   11

   échangés contre un autre aminoacide, à savoir la l-thréonine

   12

   contre la L-lysine, la L-tyrosine contre la L-leucine, la L-

   phénylalanine^ contre la L-leucine, la L-phér.ylalanine^

   22

   contre la L-leucine, la L-phénylalanine contre la L-tyrosine 20 et la I—glutamine h contre la L-arginine, leurs dérivés ainsi que les sels d'addition et -complexes de ces composés.
2. 2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on prépare les composés de formule I

   1 2 3 4 5 6 7 8. 9 10 11 12 13 14 25 H-Cys-Gly-Asn-Leu-?er-Thr-Cys- X -Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly 29 30 31 32

   Va'l-Gly-Ala-Pro-NHg - -(I)

   30 dans laquelle X représente un radical de L-méthionine, de L—valine,

   de L-norvaline, de L-leucine, de L-isoleucine, de L~norleucine ou i 2 6

   d'acide L-J-aminobutyrinue et dans laciuelle la L-alanine

   27

   est remplacée par la L-asparagine et/ou la L-isoleucine

   ' par la L-thréonine et dans laquelle éventuellement un ou plusieurs

   35 des aminoacides dans les positions 11, 12, 16, 19, 22 et 24 sont

   échangés contre un autre amino-acid-e, à savoir la L-thréonine"^

   12

   contre la L-lysine, la L-tyrosine ' contre la L-leucine, la L-phenylalanine1^ contre la L-leucine, la L-phénylalanine1^

   45

   ?2

   contre la L-leucine, la L-phdnylalaninc contre la L-tyrosine et 24

   la L-g3utamine contre la L-arginine, leurs dérivés ainsi que les sels d'addition d'acides et les complexes de ces composés, et que a) dans des composés de formule I :

   5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 H-Cys-Gly-Asn-Leu~Ser-îhr-Cys- X -Leu~Gly-Thr~Tyr-Thr-Gln~ 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 Asp~Phe~Asn~Lys~Phe~His-Thr-?he-Pro~Gln-Thr~Ala-Ile-Gly-29 30 31 32

   10 Val~Gly~Ala-Pro-I\H2 " (l)

   dans laquelle X ala signification ci-dessus et dans laquelle la on

   ?6 ~

   L-alanine est remplacée par la L-asparagine et/ou la L-isoleucine par la L-thréonine et dans laquelle éventuellement un ou plusieurs des aminoacides dans les positions 11, 12, 16, 19, 22, et 24

   15 sont remplacés par les aminoacides cités ci-dessus, ou dans leurs dérivés, dans lesquels au moins un.groupe amino ou un groupe carboxyle est protégé par un groupe protecteur séparable, on sépare ce(s) groupe(s), ou b) on oxyde en 'disùlfures des composés de formule II : 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

   H-Cys~Gly-Asn~Leu-Ser~Thr-Cys- X -^Leu-Gly-Thr-Tyr-îhr-Gln-15 16 17 18 19 20 21 22 2'3 24 25 26 27 28

   Asp-Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-ïhr-Ala-Ile~Gly~

   29 30 31 32

   25 Val-Gly-Ala-Pro-KH2 (II)

   dans laquelle X a la signification ci-dessus et dans laquelle la L~analine2^ est remplacée par la L-asparagine et/ou la L-isoleucine 27 par la L-thréonine et dans laquelle éventuellement un ou plusieurs des aminoacides dans les positions 11, 12, 16, 19, 30 22 et 24 sont remplacés par les aminoacides cités ci-dessus ou leurs dérivés dans lesquels les groupes mercapto sont libres ou protégés par le groupe trityle ou un groupe acylamidométhyle, et, si on le désire, on transforme les peptidamides obtenus en leurs sels d'addition d'acides ou complexes.

   35 3 - Procédé selon l'une des revendications let 2,

   caractérisé en ce qu'on part de composés dans lesquels les groupes carboxyle sont protégés par le groupe ester de tert.-butyle.

   46

   4 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, carac térisé en ce qu'on part de composés dans lesquels les groupes amino sont protégés par le groupe tert.-butyloxycarbonyle.

   5 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, carac térisé en ce qu'on part de composés dans lesquels les groupes hydroxyle dans les chaînes latérales sont protégés par le groupe éther de tert.-butyle.

   6 - Procédé selon l*une des revendications 1 à 5, carac

   26 27

   térisé en ce qu'on répare la Asn -Thr -calcitonine I-.I, ses dérivés, sels d'addition d'acides ou complexes.

   7 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, carac

   26 27

   térisé en ce qu'on prépare la désamino-Asn -Thr -calcitonine IJ ses sels d'addition d'acides ou complexes.

   8 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, carac

   8 11 12 22 térisé en ce qu'on prépare la désarr.ino-Val -Lys -Leu '-Tyr -

   Q/t 07

   Asn -Thr -calcitonine î.I, ses sels d'addition d'acides ou complexes.

   9 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on prépare la ddsamino-Lys'^-Leu"'"2'^ -Tyr22 -Asn2^-Thr27~calcitonine M, ses sels -d'addition d'acides ou.complexes.

   10 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5> caractérisé en ce qu'on prépare la Lys'1''L-Leu12, ^-Tyr22-

   f\C f^n

   Asn -Thr -calcitonine !v!; ses dérivés, sels d'addition d'acides ou complexes.

   11 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5}

   27

   caractérisé en ce qu'on prépare la Thr -calcitonine M, ses dérivés, sels d'addition d'acides ou complexes.

   12 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5,

   lp pn caractérisé en ce qu'on prépare la Leu -Thr -calcitonine M, ses dérivés, sels d'addition d'acides ou complexes.

   13 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5,

   1 26 27

   caractérisé en ce qu'on prépare la Leu "-Asn -Thr -calcitonine Ivî, ses dérivés sels d'addition d'acides ou complexes.

   14 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, et 10 à 13, caractérisé en ce qu'on prépare des dérivés N^-acylés 'des peptides contenant un groupe î£~arnino libre.

   r *• «

   47

   15 - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6 et 10 à 13j caractérisé en ce qu'on prépare des dérivés -alcanoyle inférieur des peptides contenant un groupe ^-amino libre.

   16 - Peptidamides de formule I :

   5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

   H-Cys-Gly-Asn-Leu~~er-Thr-Cys- X -Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-

   15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

   Àsp-Phe-Asn-Lys-Phe-His~Thr-Phe-Pro~Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-

   29 30 31 32

   10 Val-Gly-Ala-Pro-r:H2

   dans laquelle X représente un radical de I— méthionien, de L-valine,

   de L-norvalin^ de l-leucine, de L-isoleucine, de L-norlcucine ou d'acide L-©(-aminobutyriaue et dans laquelle, la L-alanine2^ est

   27

   remplacée par la L-asparagine et/ou la L-isoleucine par la

   15 L-thréonine et dans laquelle éventuellement un ou plusieurs des aminoacides dans les positions 11,-12, 16, 19, 22 et 24 sont

   échangés contre un autre aminoacide, à savoir la L-thréonine11

   12

   contre la L-lysine,. la L-tyrosine contre la L-leucine, la L-phénylalanine1^ contre la L-leucine, la L-phénylalanine1^ contre la

   22

   20 L-leucine, la L-phénylalanine contre la L-tyrosine, et la

   24- /

   L-glutair.ine contre la L-arginine, leurs dérivés ainsi que les sels d'addition d'acides et complexes de ces composés. 1 17 - Asn2^~Thr27~calcitonine M, ses dérivés, sels d'ad dition d'acides et complexes.

   ?6 27

   25 18 - Désamino-Asn -Thr -calcitonine M, ses sels d'ad dition d'acides et complexes.

   19 - Désamino-Val8~Lys11~Leu12-Tyr22-Asn26~Thr27~ calcitonine M, sels sels d'addition d'acides et complexes.

   20 - Désamino-Lys11-Leu12,16,19~Tyr22-Asn^6-Thr27- . 30 calcitonine M, ses sels d'addition d'acides et complexes.

   21 - Lys11-Leu12'1^,1^-Tyr22-Asn2°~Thr27~calcitonine ï.I,

   ses dérivés, sels d'addition d'acides et complexes,

   27

   22 - Thr -calcitonine î.î, ses dérivés, sels d'addition d'acides et complexes.

   12 27 /

   35 23 - Leu - Thr -calcitonine K, ses dérivés, sels d'addition d'acides et complexes.

   24 - Leu12-Asn2^-Thr2^-calcitoninc ses dérivés, sels

   • d'addition d'acides et complexes.

   * « . I.

   48

   ? 6

   25 - Asn -calcitonine M, ses dérivés, sels d'addition d'acides et complexes,

   26 - Dérivés N-acyles des peptides selon l'une des revendications 16, 17 et 21 à 25.

   5 27 - Dérivés IT-alcanoyle inférieur des peptides selon l'une des revendications 16, 17 et 21 à 25.

   28 - Complexes des composés selon l'une des revendications 16 à 27» avec le phosphate de zinc, le pyrophosphate de zinc et/ou l'hydroxyde de zinc,

   10 29 - Complexes des composés selon l'une des revendications

   16 à 27, avec la polyoxygélatine, le phosphate de polyphlorétine, les polyphosphates ou l'acide polyglutamique.

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   Procuration de CIBA-GEIGY AG.