MC493A1 - Nouveau procédé microbiologique - Google Patents

Description

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- à 1Aappui d1 une demande de

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BREVET D'INVENTION.;, 23 8 51

A

V

O

Cas : 1853

BREVET D'INVENTION

Nouveau procédé microbiologique

Société dite : S A N D 0 Z S.A.

-0-0-0-0-0-0-

La présente invention a pour objet un procédé

d'obtention d'un nouveau composé hétérocyclique, l'acide

AS Q

-ergolène-8-carboxylique (formule I), à l'aide d'une nouvelle souche de Claviceps paspali, Stevens 5 et Hall, ainsi qu' un procédé de transformation de ce composé en acide lysergiaue (formule II). On savait déjà que diverses souches du mycète Claviceps paspali, Stevens et Hall, sont capables de produire, dans des conditions de culture appropriées, des composés à caractère d'alca-10 loi'des, mais il s'agissait toujours dans ces cas de dérivés de l'acide lysergique, acide carboxylique hétéro-cyclique connu depuis longtemps, qui constitue entre autres une des composantes des alcaloïdes naturels de l'ergot de seigle. Il était donc inattendu de pouvoir obtenir, par 15 culture d'une nouvelle souche de Claviceps paspali, Stevens et Hall, un acide carboxylique présentant une structure

- 2 -

qui n'avait pas auparavant été abservée dans la nature ni obtenue par voie synthétique ou semi-synthétique.

COOH

NCH.

3

(I)

Cette nouvelle souche a pu être obtenue à partir de sclérotes développés sur la graminée Paspalum 5 dilatatum dans les environs de Coi'mbre (Portugal); des

échantillons en ont été déposés sous le N° NRRL J.ûQo au Ministère de l'agriculture des U.S.A. (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, Illinois. Cette souche a, contrairement à toutes celles antérieurement 10 connues de Claviceps paspali, Stevens et Hall, la propriété

de donner comme produit principal, en culture saprophytique,

A 8 Q

-ergolène-8-carboxylique. D'autre part, cette nouvelle souche de Claviceps paspali, Stevens et Hall, est capable de produire des conidies in vitro, 15 ce qui est contraire aussi aux autres souches de ce type de mycète (cf. par exemple Proc.Roy.Soc.Sériais B., 155, 33) décrites précédemment.

Pour la réalisation de procédés microbiologiques à l'échelle industrielle, il est d'une grande 20 importance que le mycète en question produise ou non des

y conidies. Il est ainsi possible d'isoler, au moyen de conidies, des spores individuelles et d'obtenir ainsi un matériel biologique génétiquement uniforme. Par ailleurs, il est beaucoup plus facile d'obtenir des mutants, par 5 action des rayons X, des ultra-violets ou d'agents chimiques, et de les isoler, en partant des conidies, qu'à partir d'un mycélium stérile. Il est possible d'autre part d'infecter Paspalum au stade d'inflorescence au moyen de conidies et d'obtenir ainsi, sur l'hote naturel, des 10 sclérotes qui se prêtent d'une façon remarquable à la conservation de la souche. On peut, par exemple, préparer à n'importe quel moment, à partir de ce matériel qui se conserve, des inoculats frais, lorsque les culutres in vitro dégénèrent au bout de plusieurs passages. On peut 15 aussi lyophiliser les conidies et, après cryodessication, les stocker pendant une durée illimitée, ce qui rend également possible la conservation d'une souche. Enfin, c'est une suspension de conidies qui se prête le mieux à l'ensemencement d'une solution nutritive, étant donné que 20 la dose inoculée peut être fixée de façon optimale et qu'il y a ainsi le maximum de facilité à opérer dans des conditions stériles (par contre, un mycélium stérile doit d'abord être homogénéisé dans un malaxeur).

Des procédés semi-synthétiques permettent de 25 préparer, à partir de l'acide 6-méthyl-^ ^'^-ergolène-

8-carboxylique obtenu conformément à la présente invention, toute une série de nouveaux dérivés présentant des propriétés pharmacologiques intéressantes.

D'autre part, un procédé déterminé, qui fait 50 également partie de la présente invention, permet de trans

former, d'aune manière simple"et avec un bon rendement, l'acide 6-méthyl-

A ^*^-ergolène-8-carboxylique en acide lysergique, composé qui présente une grande importance en tant qu'intermédiaire dans la fabrication d'agents 5 thérapeutiques de valeur, par exemple des composés ocy-tociques que sont l'ergobasine et la raéthylergobasine,

très souvent utilisés en clinique, et du plus puissant antagoniste de la sérotonine connu jusqu'à présent, le (+)-butanolamide-(21) de l'acide 1-méthyl-D-lysergique. 10 On réalise l'isolement et le développement de la nouvelle souche de Claviceps paspali, Stevens et Hall, NRRL J.OQO, par exemple de la manière suivante:

On prélève dans des conditions de stérilité, un fragment de tissu à l'intérieur d'un sclérote et on le 15 transfère sur gélose au moût de bière.

[Composition: 250 ml de moût de bière non houblonné (substance sèche = 17/0, 18 g de gélose et eau distillée q.s.p. 1 litre (pH=5*2)]. Il se développe une colonie circulaire, qui atteint, au bout de 14 jours à 20 24°, un diamètre de 15 mm. Elle est constituée d'une pellicule, épaisse d'environ 1 mm et étalée sur la gélose, ayant une structure de pseudo-sclérote, recouverte d'un duvet de mycélium aérien blanc. Un pigment de couleur brune diffuse à l'intérieur de la gélose. Il n'y a pas formation 25 de conidies.

On fragmente cette colonie au moyen d'une spatule et on la transfère dans un tube à essai contenant 12 ml d'un milieu nutritif gélosé répondant à la composition suivante:

Moût de bière 500 ml

Solides de "Cornsteep" 60 g

Acide lactique 1 ml Solution de chlorure d'ammonium jusqu'à pH 4,8

5 Gélose 20 g

Eau distillée q.s.p. 1 litre.

Autour de chaque point d'inoculation, il se forme une petite colonie mycélienne, d'abord blanche, puis d'un brun rougeâtre. Au bout de 10 jours, des conidies

10 commencent à se séparer à l'extrémité des hyphes. Au bout de 20 jours, il existe suffisamment de conidies pour qu'il soit possible d'en préparer une suspension aqueuse, avec laquelle on peut ensemencer 20 tubes de gélose inclinés

(même gélose que ci-dessus). On fait incuber ces cultures

15 à 24°. Les conidies germent au bout de 24 à J>6 heures. Au bout de 6 jours, la surface de la gélose est uniformément recouverte d'un mycélium fin et blanc; au bout de 10 jours,

il s'est formé une couche mycélienne d'un gris brunâtre,

finement ramifiée, qui est étroitement appliquée sur la

20 gélose et ne présente que de courts hyphes aériens. Sur ceux-ci, des conidies se séparent par déhiscence. Au bout de 12 jours, apparaissent en divers point du mycélium des centres où se séparent des gouttelettes d'un liquide brun-

rougeâtre. Ces gouttelettes atteignent un diamètre de

25 1 à 5 mm et présentent rapidement un trouble laiteux par suite de la présence de nombreuses conidies. Au bout de lo à 18 jours, la formation de conidies est pratiquement terminée. Une culture sur gélose inclinée, dans un tube à

essais de 2 cm de diamètre avec 12 ml de milieu nutritif

9

30 gélosé, contient environ 10 conidies.

Pour la réalisation d'une culture submergée, on prépare d'abord une culture intermédiaire de la manière suivante :

On utilise comme milieu une solution aqueuse à 4,5$ d'extrait de malt, ayant un pH de 5*4. On stérilise à 110° pendant 20 minutes un litre de cette solution dans un erlenmeyer de 2 litres, après quoi on ensemence avec g

6.10 conidies provenant d'une culture sur gélose vieille de 15 jours et on fait incuber pendant 3 jours à 24° sur un agitateur rotatif. Il se produit une culture dense constituée de fins flocons de mycélium. Ces flocons sont formés d'un enchevêtrement lâche d'hyphes et présentent un diamètre de 2 à 4 mm. Il n'est pas possible de mettre en évidence des alcaloïdes.

Pour la préparation de quantités plus importantes de culture intermédiaire, on ensemence des fermen-

teurs en verre, contenant chacun 10 litres du même milieu,

q avec 6.10 conidies par fermenteur, puis on fait incuber pendant 3 jours à 23°* avec aération à raison de 6 litres d'air par minute et agitation à raison de 300 tours par minute. Pour éviter la formation de mousse, on utilise une émulsion de silicone. Les cultures en fermenteur ainsi obtenues présentent la même constitution que les cultures sur agitateur. Pour la culture principale, il s'est montré particulièrement avantageux d'utiliser la solution nutritive suivante, qui contient, dans 1 litre d'eau distillée: Sorbitol 50 g

Acide succinique 36 g

KH2P04 2 g

- 7 -

MgSÔ^ 0,3 g

FeS0v 7 H20 1 mg

ZnSO^. 7 H20 10 mg et dont le pH est ajusté à 5A par addition de NH^OH. On 5 ensemence cette solution nutritive avec 10$ d'une culture intermédiaire vieille de 3 jours et on fait incuber par portions de 100 ml dans des erlenmeyers de 500 ml, à 23°, sur un agitateur alternatif. D'une manière analogue, on fait incuber d'autres cultures dans un fermenteur en 10 acier inoxydable contenant 170 litres de milieu nutritif. On aère alors à raison de 170 litres d'air par minute et on agite initialement à 70 tours par minute, puis à 1Ô0 tours par minute. Pour prévenir la formation de mousse, on utilise une émulsion de silicone. 15 On obtient de cette manière des cultures cons tituées de nombreuses particules mycéliennes identiques. Celles-ci ont un diamètre d'environ 5 mm et présentent un noyau sphérique compact, d'un diamètre d'environ 1 mm, formé d'un tissu pseudoparenchymateux. Ce noyau porte des 20 appendices à disposition stellaire, longs d'environ 2 mm, constitués d'hyphes disposés parallèlement. Au bout d'environ 10 jours de culture, le mycélium est brun sombre et le filtrat présente une coloration brun-rouge intense. Le pH ne présente aucune variation notable. 25 Le filtrat de culture obtenu de cette manière présente une teneur en alcaloïdes totaux, déterminée par colorimétrie, égale à 620 mg/litre, en admettant un poids moléculaire de 300.

La composition du mélange d'alcaloïdes, 30 déterminée par chromatographie sur papier, est la suivante:

Acide 6-méthyl-A ^'^_ergolène-8-

carboxylique et faibles quantités 86,5 % d'acide lysergique et d'acide isolysergique

Amide de l'acide lysergique 3*9 %

5 Amide de l'acide isolysergique 3*9 %

Ergobasine 1*0 %

Ergobasinine 0,5 %

Alcaloïdes du type clavine 4,2 %

En principe, l'acide 6-méthyl-A ^'^-ergolène-10 8-carboxylique peut être isolé du filtrat de culture au moyen de plusieurs méthodes. Un procédé avantageux consiste à l'extraire du filtrat de culture au moyen d'un échangeur de cations, par exemple Dowex 50 ou Amberlite IR 120, à le séparer de celui-ci par traitement à l'ammoniaque 15 dilué, puis à le faire cristalliser en concentrant l'éluat et en ajustant le pH de la solution au point iso-électrique.

Il est possible de transformer en acide lysergique l'acide 6-méthyl-

2^8.9.

ergolène-8-carboxylique ainsi obtenu en le traitant par des réactifs basiques, ou 20 simplement par chauffage. Il est, par exemple, avantageux de chauffer pendant quelque temps à 100° une solution de l'acide 6-méthyl-^'^-ergolène-8-carboxylique dans une lessive de soude caustique diluée; on refroidit ensuite la solution et on ajuste son pH au point iso-électrique de 25 l'acide lysergique.

On peut aussi obtenir directement l'acide lysergique à partir du filtrat de culture: par exemple,

après évaporation de la solution, on isole du résidu l'acide 6-méthyl- A8 '^-ergolène-8-carboxylique par extrac-30 tion au moyen d'une solution alcoolique d'ammoniaque, on

- 9 -

isomérise ensuite par chauffage l'acide 6-méthyl-

A8-9.

ergolène-8-carboxylique en acide lysergique, et on isole celui-ci de la solution de la manière décrite plus haut.

Il est également possible, après le traitement 5 du filtrat de culture par un échangeur d'ions, de chauffer, directement ou après addition de lessive de soude, la solution ammoniacale de l'acide 6-méthyl- £x8-9. ergolène-8-carboxylique, ce qui provoque 1'isomérisation.

Les exemples qui suivent ont pour but 10 d'illustrer la présente invention; ils ne sauraient toutefois en limiter la portée. Dans ces exemples, les points de fusion sont corrigés.

EXEMPLE 1:

Acide 6-méthyl-

A8-9.

ergolène-8-carboxylique 15 On filtre 5 litres d'un filtrat de culture de la nouvelle souche de Claviceps paspali, Stevens et Hall, ayant une teneur totale (mesurée par colorimétrie) en dérivés de l'ergoline d'environ 500 mg/l (pour un poids moléculaire de j500) et ayant un pH de 5*6, à travers une colonne 20 remplie d'eau contenant 500 g d'Amberlite, IR 120 (forme

A.

H ; diamètre de la colonne: 2,8 cm; hauteur de la colonne: 115 cm). Le débit est de 500 ml par heure. Après lavage de la colonne avec 1 litre d'eau, on élue l'acide 6-méthyl-"^-ergolène-8-carboxylique avec de l'ammoniaque à 5%. 25 On détermine par la fluorescence dans l'ultra-violet et par la réaction colorée de Keller (PeCl^/acide acétique glacial, H^SO^ concentré) la teneur en dérivés de l'ergoline des fractions éluées, chacune de 500 ml. On évapore, sous une oression de 1J> mm de mercure et à une température de bain de

- 10 -

30°, les quatre premières fractions (au total 2 l) jusqu'à réduction à 500 ml, on ajuste le pH de la solution à 5*5 au moyen d'acide acétique, on sépare par filtration de la résine précipitée (réaction colorée de Keller négative), 5 on concentre le filtrat sous pression réduite jusqu'à environ 25 ml, on ajoute 20 ml de méthanol, on fait bouillir la solution pendant une courte durée, puis on abandonne à 5° pendant quelques heures. L'acide qui a cristallisé est, après filtration, lavé à l'eau et au mé-10 thanol, puis séché pendant 2 heures à 80° sous pression réduite. Les sept fractions suivantes de l'éluat ammoniacal donnent, après avoir été traitées de la même manière, une

A 8 Q

-ergolène-8-

carboxylique cristallisé.

15 Pour la purification de l'acide brut, on ré

unit les produits cristallisés, on dissout dans l'ammoniaque alcoolique à 5$; après filtration, on ajuste le pH de la solution à 5*5 au moyen d'acide acétique 2N; on chauffe pendant une courte durée au bain-marie; on sépare 20 par filtration, au bout de quelques heures, l'acide cristallisé; on lave à l'eau et au méthanol, puis on sèche à 30° sous pression réduite. pF: 243-245° (décomposition); [a'JD = -180° (dans NaOH 0,1 N) .

Réaction colorée de Keller, van Urk et 25 Ehrlich: identique à celle de l'acide lysergique. Chroma-tographie en couche mince sur gel de silice, avec comme vecteur alcool/ammoniaque à 25$ (9:1): Rf = 0,4 à 0,45-Aspergée de réactif d1Ehrlich, la tache donne une coloration bleue.

30 Spectre dans l'U.V., déterminé dans NaOH 0,1N A max. en rm, Minimum à

» J.-L -

252 nyu. Spectre dans l'I.R.: bandes caractéristiques à 3340* 2275 (large)* 1674 et 1580 cm 1 (dans l'huile de vaseline )..

Chlorhydrate

5 On recristallise dans l'eau et l'acide chlor hydrique dilué le chlorhydrate obtenu en traitant par l'acide chlorhydrique dilué l'acide 6-méthyl- A ® ergolène-8-carboxylique décrit ci-dessus. pP: 257-259°

(décomposition); Ccz] = -176° (dans HC1 0,1N). Spectre

8 9

10 dans l'U.V. identique à celui de l'acide 6-méthyl-^ -ergolène-8-carboxylique. Spectre dans l'I.R.: bandes caractéristiques à 3380, 2600, 1708, 1660 (faible) et

1606 (faible)cm~'1" (dans l'huile de vaseline).

8 9

Acide 6-méthyl—A ' -ergolène-8-carboxylique 15 à partir du chlorhydrate

On ajoute goutte à goutte, tout en agitant, une solution binormale de carbonate acide de sodium à une suspension de 100 mg de chlorhydrate dans 5 ml d'eau, .jusqu'à ce que toute la substance soit passée en solution. 20 On ajuste alors le pH à 5*5 au moyen d'acide acétique glacial, on porte à ébullition pendant une courte durée, on sépare par filtration, au bout de quelques heures, l'acide qui a cristallisé, on lave à l'eau et au méthanol, puis on sèche à 80° sous pression réduite. pF: 245-247° 25 (décomposition); Ccz.] = -208° (dans NaOH 0,1N); la chro-

matographie en couche mince sur gel de silice avec alcool/ ammoniaque à 25$ (9:1) fait apparaître une seule substance; Rf = 0,45. La tache ne présente pratiquement aucune fluorescence dans l'U.V. et donne une coloration bleue quand 30 on l'asperge avec le réactif d'Ehrlich.

- 12 -

si

EXEMPLE 2:

.on

Acide 6-méthyl- A ' -ergolène-8-carboxylique

* 8 Q

Pour obtenir l'acide 6-méthyl-A '"-ergolène-

8-carboxylique à partir du filtrat de culture de la nouvelle souche de Claviceps paspali, on opère comme dans l'exemple 1, mais on emploie, au lieu de l'Amberlite

IR 120, l'échangeur de cations Dowex 50. On obtient l'acide t\ 8 Q

6-méthyl--^ ' -ergolène-8-carboxylique brut, cristallisé, ayant les propriétés indiquées à l'exemple 1.

EXEMPLE 3:

Acide lysergique.

On chauffe pendant deux heures au bain-marie, dans 10 ml de lessive de soude caustique 2N, 500 mg d'acide 6-méthyl-^ ^"^-ergolène-8-carboxylique brut, cristallisé, isolé, conformément à l'exemple 1, à partir du filtrat de culture de la nouvelle souche de Claviceps paspali. On traite la solution chaude au charbon actif et on ajuste le pH du filtrat à 5*5 au moyen d'acide chlorhydrique dilué et d'acide acétique glacial. Au bout de quelques heures, on sépare par filtration l'acide lysergique qui a cristallisé, on le lave à l'eau et au méthanol, puis on sèche à 80° sous pression réduite*, pF: 245-247° (décomposition).

L'acide lysergique ainsi obtenu présente toutes les caractéristiques chimiques et physiques indiquées dans la littérature concernant ce composé.

- 13 -

• r

RESUME

La présente invention comprend notamment: 1°) Un procédé de fabrication de l'acide 6-méthyl- ^ 8'^-ergolène-8-carboxylique, procédé selon lequel on cultive en saprophytisme la souche NRRL 3080 de 5 Claviceps paspali, Stevens et Hall, et on isole de mamière connue l'acide 6-méthyl-^ ^*^-ergolène-8-carboxylique du milieu de culture.

2°) Des modes d'exécution du procédé spécifié sous 1°, présentant les particularités suivantes 10 prises séparément ou en combinaison:

a) pour la culture du mycète, on utilise ses conidies;

b) pour isoler du filtrat de culture l'acide 6-méthyl- ^ 8'^-ergolène-8-carboxylique, on utilise un

15 échangeur d'ions fortement acide.

3° ) A titre de produit industriel nouveau, l'acide 6-méthyl-^ 8'^-ergolène-8-carboxylique.

4°) Un procédé d'obtention de l'acide lysergique libre, procédé selon lequel on transforme l'acide 20 6-méthyl-^"°-ergolène-8-carboxylique en acide lysergique.

5°) Des modes d'exécution du procédé spécifié sous 4°, présentant les particularités suivantes, prises séparément ou selon leurs diverses combinaisons possibles:

a) on réalise la transformation par chauffage 25 de l'acide 6-méthyl-^ ^'^-ergolène-8-carboxylique ou de ses solutions;

b) la transformation est catalysée par une base;

c) la séparation de l'acide lysergique de sa solution est réalisée en utilisant un échangeur d'ions fortement acide.

ORIGINAL

pages en fiL.

contenant mot ajouté

Renvois -mot rayé nul.

RAU

Conseil en Propriété Industrielle

28, Boul. Princess# Charlotte, 28

MONTE- CARLO

^.4

CAS : 1853

BREVET D'INVENTION

Nouveau procédé microbiologique

8 Q

L'acide 6-méthyl- *y-ergolène-8-carboxylique, sa préparation à partir- d'une culture de Claviceps paspali NRRL 3080 et sa transformation en acide lysergique.

Pas de dessin.-