MD3303379T2

MD3303379T2 - Agenți de legare TIGIT și utilizări ale acestora

Info

Publication number: MD3303379T2
Application number: MDE20180357T
Authority: MD
Inventors: Austin Gurney; Ming-Hong Xie
Original assignee: Mereo Biopharma 5 Inc
Priority date: 2015-05-28
Filing date: 2016-05-27
Publication date: 2022-02-28
Also published as: JP2018521634A; HRP20211948T1; MX2017014955A; CA2987607A1; CN115429877A; MA42622B1; EP3303379B1; JP6875295B2; US20190077864A1; MA42622A; US10544219B2; WO2016191643A3; US10112997B2; KR102721641B1; ES2902150T3; CN109071620B; TW201718646A; JP7203446B2; BR112017025529A2; WO2016191643A2

Abstract

Sunt divulgaţi agenţi care se leagă specific la TIGIT. Agenţii care se leagă la TIGIT pot include polipeptide, anticorpi, şi/sau agenţi bispecifici. Sunt de asemenea divulgate metode de utilizare ale agenţilor pentru ameliorarea răspunsului imun şi/sau tratamentul bolilor cum ar fi cancerul.

Description

DOMENIUL INVENŢIEI

Prezenta invenţie se referă în general la agenţi care se leagă la TIGIT, în special anticorpi care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT, precum şi la metode de utilizare a agenţilor pentru modularea răspunsurilor imune şi/sau tratamentul bolilor cum ar fi cancerul.

BAZELE INVENŢIEI

Baza pentru imunoterapie este manipularea şi/sau modularea sistemului imunitar, incluzând atȃt răspunsurile imune native cȃt şi răspunsurile imune adaptive. Scopul general al imunoterapiei este de a trata bolile prin controlarea răspunsul imun la un „străin agent«, de exemplu un patogen sau o celulă tumorală. Totuşi, în unele cazuri imunoterapia este utilizată pentru a trata bolile autoimune care poate apare dintr-un răspuns imun anormal împotriva proteinelor, moleculelor, şi/sau ţesuturilor prezente în mod normal în corp. Imunoterapia poate include agenţi şi metode care să inducă sau să sporească răspunsurile imune specifice sau pentru a inhiba sau reduce răspunsurile imune specifice.

Sistemul imunitar este un sistem extrem de complex făcut dintr-o număr mare de tipuri de celule, incluzând dar fără a se limita la, celule T, celule B, celule ucigaşe natural, celule care prezintă antigen, celule dendritice, monocite, şi macrofage. Aceste celule posedă sisteme complexe şi subtile pentru controlarea interacţiunilor şi răspunsurilor lor. Celulele utilizează ambele mecanisme activator şi inhibitor şi bucle de feedback pentru a menţine răspunsurile sub control şi a nu permite consecinţele negative ale unui răspuns imun necontrolat (de exemplu, bolile autoimune).

Conceptul de imunosupraveghere al cancerului este pe baza teoriei că sistemul imunitar poate recunoaşte celule tumorale, monta un răspuns imun, şi suprima dezvoltarea şi/sau progresul unei tumori. Totuşi, este clar că multe celule canceroase au dezvoltat mecanisme de a evita sistemul imunitar care poate permite creşterea neinhibată a tumorilor. Imunoterapia canceroasă/tumorală se concentrează pe dezvoltarea de noi şi inovatori agenţi care pot activa şi/sau stimula sistemul imunitar pentru a obţine un atac mai eficient împotriva celulelor tumorale conducând la uciderea crescută a celulelor tumorale şi/sau inhibarea creşterii tumorii. WO2015/009856 divulgă metode pentru tratarea cancerului utilizând antagonişti de legare a axei PD-1 şi inhibitori TIGIT. Chauvin şi colab. discută celulele T CD8+ specifice antigenului tumoral care afectează TIGIT şi PD-1 la pacienţii cu melanom. Johnston şi colab. discută că imunoreceptorul TIGIT reglează funcţiile efectoare antitumorale şi antivirale ale celulei T CD8+. Levin şi colab. discută Vstm3 care este un membru al familiei CD28 şi un modulator important al funcţionării celulei T. Yu şi colab. discută că suprafaţa proteinei TIGIT suprimă activarea celulelor T prin promovarea generării celulelor dendritice imunoregulatoare mature. Bi şi colab. discută că celula T lg şi domeniul ITIM reglează natural activarea celulei ucigaşe în hepatita virală acută murină. CN103073644 divulgă anticorpul monoclonal TIGIT anti-şoarece specific şi metoda de preparare, identificare şi aplicare a acestuia. US2009/258013 divulgă compoziţii şi metode pentru tratamentul bolilor imune asociate.

SCURT REZUMAT AL INVENŢIEI

Realizările care nu se încadrează în domeniul revendicărilor anexate trebuie să fie considerate numai ca exemple adecvate pentru înţelegere invenţiei.

Prezenta invenţie furnizează anticorpi care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT uman, care cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând TSDYAWN (SEQ ID NO:57), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO:58), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO:59), şi o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând KASQDVSTAVA (SEQ ID NO:60), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând SASYRYT (SEQ ID NO:61), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQHYSTP (SEQ ID NO:62). Prezenta invenţie mai furnizează anticorpi care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT uman, care cuprinde (a) regiunea variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122346 şi regiunea variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122347; sau (b) lanţul greu codificat de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122346 şi lanţul uşor codificat de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122347. Invenţia furnizează agenţi heterodimerici cuprinzând anticorpii descrişi aici. Invenţia furnizează de asemenea agenţi bispecifici cuprinzând a) un prim braţ care se leagă specific la TIGIT, şi b) un al doilea braţ, în care primul braţ cuprinde anticorpul descris aici. Invenţia furnizează celule care cuprind sau produc anticorpii descrişi aici sau agenţii bispecifici descrişi aici. Invenţia furnizează anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici pentru utilizare în metode pentru tratarea cancerului. În unele realizări cancerul este selectat din grupul constând din cancer colorectal, cancer ovarian, cancer pancreatic, cancer pulmonar, cancer hepatic, cancer la sân, cancer la rinichi, cancer la prostată, cancer gastrointestinal, melanom, cancer de col uterin, cancer la vezică, glioblastom, şi cancer la cap şi gât. În unele realizări, invenţia furnizează anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici pentru utilizare în imunoterapie. În unele realizări, anticorpii sau agenţii bispecifici sunt pentru utilizare în imunoterapia cancerului. În unele realizări, anticorpii sau aagenţii bispecifici sunt pentru utilizare în metode de inducere, activare, promovare, creştere, amplificare, sau prelungire a unui răspuns imun. În unele realizări, anticorpii sau agenţii bispecifici sunt pentru utilizare în metode de inducere, activare, promovare, creştere, amplificare, sau prelungire a unui răspuns imun la cancer şi/sau tumoare. În unele realizări, anticorpii sau agenţii bispecifici sunt pentru utilizare în metodele de inhibare a creşterii unei tumori sau celule tumorale. În unele realizări, anticorpii sau agenţii bispecifici sunt pentru utilizare în metode pentru tratamentul cancerului. În unele realizări, metodele cuprind inhibarea creşterii celulelor canceroase. În unele realizări, anticorpii sau agenţii bispecifici sunt utilizaţi în combinaţie cu cel puţin un agent terapeutic suplimentar.

Invenţia furnizează de asemenea compoziţii, cum ar fi compoziţiile farmaceutice, cuprinzând anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici. Polinucleotidele şi/sau vectorii codifică anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici. Sunt furnizate celule care cuprind sau produc anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici precum şi celule cuprinzând tpolinucleotidele şi/sau vectorii descrişi aici.

Într-un aspect, prezenta divulgare furnizează agenţi care se leagă la TIGIT. În unele cazuri, agentul se leagă la TIGIT de şoarece. În unele cazuri, agentul se leagă la TIGIT uman. În unele cazuri, agentul se leagă la TIGIT de şoarece şi TIGIT uman. În unele realizări, agentul este un anticorp. În unele cazuri, agentul este un anticorp care se leagă la TIGIT de şoarece. În unele cazuri, agentul este un anticorp care se leagă la TIGIT uman. În unele cazuri, agentul este un anticorp care se leagă la TIGIT de şoarece şi la TIGIT uman. În unele cazuri, agentul este un anticorp care se leagă la TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de şoarece.

În unele cazuri, agentul este un anticorp care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT, care cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7) sau GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9), şi/sau o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSISSYLNW (SEQ ID NO:10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO:14), sau QASQNIYSDLAW (SEQ IDNO:81), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând DALKLAS (SEQ ID NO:11) sau RASTLAS (SEQ ID NO: 15), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO:12) sau QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16). În unele cazuri, agentul este un anticorp care cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9), şi/sau o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSISSYLNW (SEQ ID NO:10), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând DALKLAS (SEQ ID NO:11), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12). În alte cazuri, agentul este un anticorp care cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9); şi/sau o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO:14), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând RASTLAS (SEQ ID NO: 15), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16). În alte cazuri, agentul este un anticorp care cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9); şi/sau o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO:81), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând RASTLAS (SEQ ID NO: 15), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16).

În unele cazuri, agentul este un anticorp care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT, în care anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, sau SEQ ID NO:32; şi/sau o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În unele cazuri, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, sau SEQ ID NO:32; şi/sau o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În unele cazuri, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:17 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:18; o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:19 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:20; sau o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:32 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:20.

Invenţia furnizează un anticorp care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT uman şi cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând TSDYAWN (SEQ ID NO:57), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO:58), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO:59), şi/sau o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând KASQDVSTAVA (SEQ ID NO:60), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând SASYRYT (SEQ ID NO:61), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQHYSTP (SEQ ID NO:62). În unele realizări ale invenţiei, anticorpul care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT uman, în care anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67; şi/sau o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În unele realizări, un anticorp cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67; şi/sau o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În unele realizări, un anticorp cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:63 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:64, sau o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:68.

În unele realizări, anticorpul este un anticorp monoclonal, un anticorp umanizat, un anticorp uman, un anticorp recombinant, un anticorp himeric, un anticorp bispecific, un fragment de anticorp cuprinzând un situs de legare la antigen, un anticorp IgG, un anticorp IgG1, un anticorp IgG2, sau un anticorp IgG4. În unele realizări, anticorpul este monovalent. În unele realizări, anticorpul este bivalent. În unele realizări, anticorpul este monospecific. În unele realizări, anticorpul este bispecific.

În unele cazuri din divulgare, agentul este un anticorp care se leagă specific la TIGIT, în care anticorpul cuprinde o secvenţă de aminoaacizi a lanţului greu selectată din grupul constând din: SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:34, şi SEQ ID NO:56; şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor selectată din grupul constând din: SEQ ID NO:28 şi SEQ ID NO:30. În unele cazuri, anticorpul cuprinde o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu din SEQ ID NO:26 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor din SEQ ID NO:28; o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu din SEQ ID NO:27 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor din SEQ ID NO:28; o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu din SEQ ID NO:29 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor din SEQ ID NO:30; o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu din SEQ ID NO:34 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor din SEQ ID NO:30; o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu din SEQ ID NO:56 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor din SEQ ID NO:30.

În unele realizări ale invenţiei, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman cuprinde o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu din SEQ ID NO:70 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor din SEQ ID NO:72. În unele realizări, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman cuprinde o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu din SEQ ID NO:82 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor din SEQ ID NO:72.

În unele cazuri din divulgare un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman, nu se leagă la TIGIT de şoarece. În unele cazuri un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman, nu se leagă la TIGIT de şobolan. În unele cazuri un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman, nu se leagă la TIGIT de iepure. În unele cazuri un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman, nu se leagă la TIGIT de marmoset. În unele cazuri un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman, nu se leagă la TIGIT de câine. În unele cazuri un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman, nu se leagă la TIGIT de porc. În unele cazuri un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman, nu se leagă la TIGIT de maimuţă cynomolgus. În unele cazuri un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman, nu se leagă la TIGIT de maimuţă rhesus.

În unele cazuri din divulgare, agentul este un anticorp care se leagă specific la TIGIT, în care anticorpul cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi regiunea variabilă a lanţului uşor dintr-un anticorp selectat din grupul constând din: 313R11, 313R12, 313R14, 313R19, şi 313R20. În unele cazuri, anticorpul este selectat din grupul constând din: 313R11, 313R12, 313R14, 313R19, şi 313R20. În unele cazuri, anticorpul este 313R19. În unele realizări, anticorpul cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122180. În unele cazuri, anticorpul cuprinde regiune variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122181. În unele cazuri, anticorpul cuprinde un lanţ greu cuprinzând regiune variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122180. În unele cazuri, anticorpul cuprinde un lanţ uşor cuprinzând regiunea variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122181. În unele cazuri, anticorpul cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122180 şi regiunea variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122181. În unele cazuri, anticorpul cuprinde o polipeptidă codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122180 şi o polipeptidă codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122181.

Un alt caz din divulgare furnizează o plasmidă depozitată cu ATCC şi numărul de desemnare atribuit PTA-122180 şi o plasmidă depozitată cu ATCC şi numărul de desemnare atribuit PTA-122181.

În unele realizări ale invenţiei, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi regiunea variabilă a lanţului uşor din anticorpul uman 313M32. În unele realizări, anticorpul cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122346. În unele realizări, anticorpul cuprinde o polipeptidă cuprinzând regiunea variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122346. În unele realizări, anticorpul cuprinde regiune variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC ba PTA-122347. În unele realizări, anticorpul cuprinde lanţul uşor codificat de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122347. În unele realizări, anticorpul cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122346 şi regiunea variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122347. În unele realizări, anticorpul cuprinde o polipeptidă codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122346 şi o polipeptidă codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122347.

Într-un alt aspect, invenţia furnizează o plasmidă depozitată cu ATCC şi număr de desemnare atribuit PTA-122346 şi o plasmidă depozitată cu ATCC şi numărul de desemnare atribuit PTA-122347.

În unele cazuri din divulgare, agentul este monovalent. În unele cazuri, agentul este bivalent. În unele cazuri, agentul este monospecific. În unele cazuri, agentul este bispecific. În unele cazuri, agentul bispecific este un agent heterodimeric sau moleculă heterodimerică. În unele cazuri, un agent heterodimeric cuprinde un anticorp descris aici care se leagă specific la TIGIT.

Un alt caz din divulgare furnizează un anticorp izolat care concurează pentru legare specifică la TIGIT uman cu un agent (de exemplu, anticorp) descris aici. În unele cazuri, un anticorp izolat se leagă la acelaşi epitop pe TIGIT uman ca un agent (de exemplu, anticorp) descris aici. În unele cazuri, un anticorp izolat se leagă un epitop pe TIGIT uman care se suprapune cu epitopul de pe TIGIT legat de un agent (de exemplu, anticorp) descris aici. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizi din SEQ ID NO:79. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizi din SEQ ID NO:80. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizi din SEQ ID NO:79 şi SEQ ID NO:80. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62 şi 1109 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă un epitop cuprinzând aminoacizii Q62 şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q64 şi 1109 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q64 şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, Q64, şi 1109 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, Q64, şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, 1109, şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q64, 1109, şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, Q64, 1109, şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop cuprinzând cel puţin un aminoacid selectat din grupul constând din: N58, E60, Q62, Q64, L65, F107, 1109, H111, T117, T119, G120, şi R121 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, epitopul este un epitop conformaţional. În unele realizări, un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman se leagă la un epitop care nu cuprinde aminoacidul V100 din SEQ ID NO:4.

În unele realizări ale fiecăruia din aspectele şi realizările anterior menţionate ale invenţiei, precum şi în alte aspecte şi realizări descrise aici, anticorpul este parte a unui agent bispecific cuprinzȃnd un prim braţ care se leagă specific la TIGIT şi un al doilea braţ, în care primul braţ cuprinde un anticorp anti-TIGIT descris aici. În unele realizări, al doilea braţ cuprinde un situs de legare la antigen dintr-un anticorp. În unele realizări, al doilea braţ se leagă specific la PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM-3, LAG-3, OX-40, sau GITR. În unele realizări, al doilea braţ se leagă specific la un antigen tumoral. În unele realizări, al doilea braţ cuprinde un agent de stimulare al răspunsului imun. În unele realizări, agentul de stimulare al răspunsului imun este selectat din grupul constând din: factor de stimulare al coloniilor de granulocite-macrofage (GM-CSF), factor de stimulare al coloniilor de macrofage (M-CSF), factor de stimulare al coloniilor de granulocite (G-CSF), interleukină 2 (IL-2), interleukină 3 (IL-3), interleukină 12 (IL-12), interleukină 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligand 4-1BB, GITRL, OX-40L, anticorp anti-CD3, anticorp anti-CTLA4, anticorp anti-PD-1, anticorp anti-PD-Ll, anticorp anti-GITR, anticorp anti-OX-40, anticorp anti-LAG-3, şi anticorp anti-TIM-3.

În unele realizări, agentul bispecific este un agent heterodimeric sau moleculă heterodimerică. În unele realizări, agentul bispecific este un agent homodimeric sau moleculă homodimerică. În unele realizări, o moleculă heterodimerică cuprinde un prim braţ care se leagă la TIGIT uman şi un al doilea braţ care se leagă la o a doua ţintă. În unele realizări, o moleculă heterodimerică cuprinde un prim braţ care se leagă specific la TIGIT uman şi un al doilea braţ, în care primul braţ cuprinde un anticorp anti-TIGIT descris aici. În unele realizări, o moleculă heterodimerică cuprinde un prim braţ care se leagă la TIGIT uman şi un al doilea braţ care cuprinde un situs de legare la antigen dintr-un anticorp care se leagă specific la o a doua ţintă. În unele realizări, o moleculă heterodimerică este un anticorp bispecific. În unele realizări, o moleculă heterodimerică cuprinde un prim braţ care se leagă la TIGIT uman şi un al doilea braţ care se leagă specific la un antigen tumoral. În unele realizări, o moleculă heterodimerică cuprinde un prim braţ care se leagă la TIGIT uman şi un al doilea braţ care se leagă specific la PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, OX-40, 4-1BB, sau GITR. În unele realizări, o moleculă heterodimerică cuprinde un prim braţ care se leagă la TIGIT şi un al doilea braţ care cuprinde un agent imunoterapeutic. În unele realizări, agentul imunoterapeutic este selectat din grupul constând din: factor de stimulare al coloniilor de granulocite-macrofage (GM-CSF), factor de stimulare al coloniilor de macrofage (M-CSF), factor de stimulare al coloniilor de granulocite (G-CSF), interleukină 2 (IL-2), interleukină 3 (IL-3), interleukină 12 (IL-12), interleukină 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligand 4-1BB, GITRL, OX-40L, anticorp anti-CD3, anticorp anti-CTLA-4, anticorp anti-PD-1, anticorp anti-PD-Ll, anticorp anti-4-1BB, anticorp anti-GITR, anticorp anti-OX-40, anticorp anti-LAG-3, şi anticorp anti-TIM-3.

În unele realizări, o moleculă heterodimerică descrisă aici cuprinde un prim braţ cuprinzând un prim domeniu CH3 şi un al doilea braţ cuprinzând un al doilea domeniu CH3 în care fiecare domeniu CH3 este modificat pentru a promova formarea de heterodimeri. În unele realizări, domeniile CH3 sunt modificate pe baza efectelor electrostatice. În unele realizări, domeniile CH3 sunt modificate utilizând o tehnică noduri-în-găuri.

În unele realizări, un agent bispecific descris aici cuprinde un prim braţ cuprinzând un prim domeniu CH3 şi un al doilea braţ cuprinzând un al doilea domeniu CH3 în care fiecare domeniu CH3 este modificat pentru a promova formarea de heterodimeri. În unele realizări, domeniile CH3 sunt modificate pe baza efectelor electrostatice. În unele realizări, domeniile CH3 sunt modificate utilizând o tehnică noduri-în-găuri.

În unele realizări ale fiecăruia din aspectele şi realizările anterior menţionate, precum şi în alte aspecte şi realizări descrise aici, anticorpul inhibă legare TIGIT la receptorul poliovirus (PVR). În unele realizări, anticorpul inhibă sau blochează interacţiunea între TIGIT şi PVR. În unele realizări, anticorpul inhibă legarea TIGIT la PVR-L2. În unele realizări, anticorpul inhibă sau blochează interacţiunea între TIGIT şi PVR-L2. În unele realizări, anticorpul inhibă legarea TIGIT la PVR-L3. În unele realizări, anticorpul inhibă sau blochează interacţiunea între TIGIT şi PVR-L3. În unele realizări, anticorpul este un antagonist al TIGIT. În unele realizări, anticorpul inhibă semnalizarea TIGIT. În unele realizări, anticorpul este un antagonist al semnalizării mediate de TIGIT. În unele realizări, anticorpul inhibă activarea TIGIT. În unele realizări, anticorpul inhibă fosforilarea TIGIT. În unele realizări, anticorpul scade expresia suprafeţei celulare a TIGIT.

În unele realizări ale fiecăruia dintre aspectele şi realizările anterior menţionate, precum şi în alte aspecte şi realizări descrise aici, anticorpul induce, activează, promovează, creşte, ameliorează, şi/sau prelungeşte un răspuns imun. În unele realizări, răspunsul imun este direcţionat spre o tumoare sau celulă tumorală. În unele realizări, răspunsul imun este direcţionat spre un virus sau o celulă infectată viral. În unele realizări, anticorpul creşte imunitatea mediată de celulă. În unele realizări, anticorpul creşte activitatea celulei T. În unele realizări, agentul creşte activitatea celulei T citolitice (CTL). În unele realizări, anticorpul creşte activitatea celulei ucigaşe natural (NK). În unele realizări, anticorpul creşte producţia de IL-2 şi/sau numărul de celule care produc IL-2. În unele realizări, anticorpul creşte producţia de IFN-gama şi/sau numărul de celule care produc IFN-gama. În unele realizări, anticorpul creşte un răspuns imun de tip Th1. În unele realizări, anticorpul scade producţia de IL-4 şi/sau numărul de celule care produc IL-4. În unele realizări, anticorpul scade IL-10 şi/sau numărul de celule care produc IL-10. În unele realizări, anticorpul scade producţia de IL-6 şi/sau numărul de celule care produc IL-6. În unele realizări, anticorpul scade producţia de IL-5 şi/sau numărul de celule care produc IL-5. În unele realizări, anticorpul scade un răspun imun de tip Th2. În unele realizări, anticorpul scade numărul de celule Treg. În unele realizări, anticorpul scade activitatea Treg. În unele realizări, anticorpul inhibă şi/sau scade activitatea supresivă a Treg-urilor. În unele realizări, anticorpul scade numărul de MDSC-uri. În unele realizări, anticorpul inhibă şi/sau scade activitatea supresivă a celulelor supresoare derivate din mieloide (MDSC-uri).

În unele realizări ale fiecăruia din aspectele şi realizările anterior menţionate, precum şi în alte aspecte şi realizări descrise aici, anticorpul inhibă creşterea tumorii. În unele realizări, agentul reduce creşterea tumorii. În unele realizări, agentul reduce creşterea tumorii la o dimensiune nedetectabilă. În unele realizări, agentul induce pe termen lung imunitate anti-tumorală.

Într-un alt aspect, invenţia furnizează compoziţii cuprinzând un agent descris aici.

Într-un alt aspect, invenţia furnizează compoziţii farmaceutice cuprinzând un anticorp descris aici şi un purtător acceptabil farmaceutic. Invenţia furnizează anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici pentru utilizare în metode pentru tratarea cancerului şi/sau inhibarea creşterii tumorii la un subiect (de exemplu, un om) sau metode pentru tratarea unei infecţii virale la un subiect (de exemplu, un om).

În anumite realizări ale invenţiei, fiecare din aspectele anterior menţionate, precum şi alte aspecte şi/sau realizări descrise în altă parte aici, anticorpul este izolat. În anumite realizări, anticorpul este substanţial pur.

Într-un alt aspect, invenţia furnizează polinucleotide cuprinzând o polinucleotidă care codifică un anticorp descris aici. În unele realizări, polinucleotida este izolată. În unele realizări, invenţia furnizează vectori care cuprind polinucleotida, precum şi celule care cuprind vectorii şi/sau polinucleotida. În unele realizări, invenţia furnizează de asemenea celule care cuprind sau produc un anticorp sau agent bispecific descris aici. În unele realizări, celula este o linie celulară monoclonală.

Într-un alt aspect, invenţia furnizează anticorpul sau agentul bispecific descris aici pentru utilizare în metode de modulare a răspunsului imun al unui subiect. În unele realizări, metoda de modulare a răspunsului imun cuprinde o metodă de inducere, activare, promovare, creştere, amplificare, sau prelungire a unui răspuns imun la un subiect. În unele realizări, o metodă de inducere, activare, promovare, creştere, amplificare, sau prelungire a unui răspuns imun la un subiect, cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un anticorp, agent bispecific, sau polipeptidă descrise aici. În unele realizări, o metodă de inducere, activare, promovare, creştere, amplificare, sau prelungire a unui răspuns imun la un subiect, cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent bispecific heterodimeric sau dintr-un agent bispecific homodimeric descris aici. În unele realizări, o metodă de inducere, activare, promovare, creştere, amplificare, sau prelungire a unui răspuns imun la un subiect, cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un anticorp descris aici. În unele realizări, o metodă de inducere a unui răspuns imun la un subiect cuprinde administrarea unui anticorp sau agent bispecific descrişi aici. În unele realizări, o metodă de activare a unui răspuns imun la un subiect cuprinde administrarea unui anticorp sau agent bispecific descrişi aici. În unele realizări, o metodă de promovare a unui răspuns imun la un subiect cuprinde administrarea unui anticorp sau agent bispecific descrişi aici. În unele realizări, o metodă de creştere a unui răspuns imun la un subiect cuprinde administrarea unui anticorp sau agent bispecific descrişi aici. În unele realizări, o metodă de amplificare a unui răspuns imun la un subiect cuprinde administrarea unui anticorp sau agent bispecific descrişi aici. În unele realizări, o metodă de prelungire a unui răspuns imun la un subiect cuprinde administrarea unui anticorp sau agent bispecific descrişi aici. În unele realizări, răspunsul imun este la o stimulare antigenică. În unele realizări, stimularea antigenică este o tumoare sau o celulă tumorală. În unele realizări, stimularea antigenică este un patogen. În unele realizări, stimularea antigenică este un virus. În unele realizări, stimularea antigenică este o celulă infectată viral. În unele realizări, răspunsul imun este împotriva unei tumori sau a unui cancer.

În unele realizări, invenţia furnizează anticorpul sau agentul bispecific descris aici pentru utilizare în metode de creşterea activitătii celulelor imune. În unele realizări, o metodă de creştere a activităţii celulelor imune cuprinde punerea în contact a celulelor cu o cantitate eficientă a unui anticorp sau agent bispecific descris aici. În unele realizări, celulele imune sunt celule T, celule NK, monocite, macrofage, celule derivate din mieloide, celule care prezintă antigen (APCs), şi/sau celule B. În unele realizări, o metodă de creştere a activităţii celulelor NK la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent descris aici. În unele realizări, o metodă de creştere a activităţii celulelor T la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent descris aici. În unele realizări, o metodă de creştere a activării celulelor T şi/sau celulelor NK la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent descris aici. În unele realizări, o metodă de creştere a răspunsului celulei T la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent descris aici. În unele realizări, o metodă de creştere a activităţii CTL-urilor la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent descris aici. În unele realizări, o metodă de inhibare a activităţii Treg-urilor la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent descris aici. În unele realizări, o metodă de inhibare a activităţii supresive a Treg-urilor la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent descris aici. În unele realizări, o metodă de inhibare a activităţii unor MDSC-uri la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent descris aici. În unele realizări, o metodă de inhibare a activităţii supresive a MDSC-urilor la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent descris aici.

Unele cazuri din divulgare furnizează metode de inducere, activare, promovare, creştere, amplificare, sau prelungire a unui răspuns imun la un subiect, cuprinzând administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent care se leagă la TIGIT uman. În unele cazuri, o metodă de inducere, activare, promovare, creştere, amplificare, sau prelungire a unui răspuns imun la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent care inhibă sau reduce activitatea TIGIT. În unele cazuri, o metodă de inducere, activare, promovare, creştere, amplificare, sau prelungire a unui răspuns imun la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent care inhibă sau reduce semnalizarea TIGIT. În unele cazuri, răspunsul imun este împotriva unei celule tumorale, a unei tumori, sau a cancerului. În unele realizări, răspunsul imun este împotriva unei infecţii virale, a unui antigen viral, sau a unei celule infectate viral.

Într-un alt aspect, invenţia furnizează anticorpul sau agentul bispecific descris aici pentru utilizare în metode de inhibare a creşterii celulelor tumorale sau a tumorii cuprinzând punerea în contact a tumorii sau a celulei tumorale cu o cantitate eficientă de anticorp sau agent bispecific descris aici. În unele realizări, o metodă de inhibare a creşterii unei tumori cuprinde punerea în contact a tumorii sau celulei tumorale cu o cantitate eficientă de anticorp.

Într-un alt aspect, invenţia furnizează anticorpul sau agentul bispecific descris aici pentru utilizare în metode de inhibare a creşterii unei tumori la un subiect cuprinzând administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un anticorp sau agent bispecific descris aici. În unele realizări, o metodă de inhibare a creşterii unei tumori la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un anticorp care se leagă la TIGIT uman. În unele realizări, o metodă de inhibare a creşterii unei tumori la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent bispecific care se leagă la TIGIT uman. În unele realizări, tumoarea este selectată din grupul constând din tumoare colorectală, tumoare de colon, tumoare ovariană, tumoare pancreatică, tumoare pulmonară, tumoare la ficat, tumoare la sân, tumoare la rinichi, tumoare la prostată, tumoare gastrointestinală, melanom, tumoare cervicală, tumoare la vezică, glioblastom, şi tumoare la cap şi gât.

Într-un alt aspect, invenţia furnizează anticorpul sau agentul bispecific descris aici pentru utilizare în metode pentru tratarea cancerului la un subiect cuprinzând administrarea acestora către subiect. În unele realizări, o metodă de tratare a cancerului la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic de anticorp sau agent bispecific. În unele realizări, o metodă de tratare a cancerului la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un agent bispecific care se leagă la TIGIT uman. În unele realizări, cancerul este selectat din grupul constând din cancer colorectal, cancer ovarian, cancer pancreatic, cancer pulmonar, cancer hepatic, cancer la sân, cancer la rinichi, cancer la prostată, cancer gastrointestinal, melanom, cancer de col uterin, cancer la vezică, glioblastom, şi cancer la cap şi gât.

Într-un alt aspect, invenţia furnizează anticorpul sau agentul bispecific descris aici pentru utilizare în metode de stimulare şi/sau inducere pe termen lung a imunităţii anti-tumorale la un subiect cuprinzând administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic de anticorp sau agent bispecific descris aici.

Într-un alt aspect, invenţia furnizează anticorpul sau agentul bispecific descris aici pentru utilizare în metode de stimularea a răspunsului protector la un subiect cuprinzând administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic de anticorp sau agent bispecific descris aici în combinaţie cu un antigen de interes. În unele realizări, antigenul de interes este un antigen tumoral. În unele realizări, antigenul de interes este un biomarker al celulei canceroase. În unele realizări, antigenul de interes este un marker al celulei stem canceroase.

În unele realizări ale fiecăruia din aspectele şi realizările anterior menţionate, precum şi în alte aspecte şi realizări descrise aici, metodele cuprind administrarea către subiect a unui agent de stimulare al răspunsului imun. În unele realizări, agentul de stimulare al răspunsului imun este selectat din grupul constând din GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-3, IL-12, IL-1, IL-2, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), anticorpi anti-CD3, anticorpi anti-CTLA-4, anticorpi anti-CD28, anticorpi anti-PD-Ll, şi anticorpi anti-PD1.

În unele realizări ale fiecăruia dintre aspectele şi realizările anterior menţionate, precum şi în alte aspecte şi realizări descrise aici, o metodă cuprinde în plus administrarea cel puţin a unui agent terapeutic suplimentar. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un agent chimioterapeutic. În unele realizări, agentul terapeutic suplimentar este un anticorp. În unele realizări, agentul terapeutic suplimentar este un anticorp anti-PD-1, un anticorp anti-PD-Ll, un anticorp anti-CTLA4, un anticorp anti-LAG-3, sau un anticorp anti-TIM-3. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un inhibitor al căii Notch, al căii Wnt, sau al căii RSPO/LGR.

În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un agent imunoterapeutic. Aşa cum s-a utilizat în acest document, exprimarea „agent imunoterapeutic« este utilizată în sensul cel mai larg şi se referă la o substanţă care afectează sau modulează direct sau indirect sistemul imunitar. În unele realizări, un agent imunoterapeutic este un agent care stimulează direct sau indirect sistemul imunitar prin inducerea activării sau creşterii activităţii oricărora din componentele sistemului imunitar. Deoarece anticorpii sunt consideraţi agenţi imunoterapeutici, acest agent imunoterapeutic suplimentar poate fi considerat un „al doilea« agent imunoterapeutic. În unele realizări, al doilea agent imunoterapeutic este selectat din grupul constând din: GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligand 4-1BB, GITRL, ligand OX-40, anticorp anti-CD3, anticorp anti-CTLA-4, anticorp anti-CD28, anticorp anti-PD-1, anticorp anti-PD-Ll, anticorp anti-4-1BB, anticorp anti-GITR, anticorp anti-OX-40, anticorp anti-LAG-3, şi anticorp anti-TIM-3. În unele realizări, al doilea agent imunoterapeutic este o proteină de fuziune cuprinzând: GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligand 4-1BB, GITRL, ligand OX-40, sau un fragment al acestora. În unele realizări, al doilea agent imunoterapeutic este o proteină de fuziune cuprinzând cel puţin o copie a domeniului extracelular al GITRL, ligandului OX40, sau ligandului 4-1BB.

În unele realizări ale fiecăruia dintre aspectele şi realizările anterior menţionate, precum şi în alte aspecte şi realizări descrise aici, subiectul este omul. În unele realizări, subiectul are o tumoare sau un cancer dur, cel puţin parţial îndepărtat.

În unele realizări ale fiecăruia din aspectele şi realizările anterior menţionate, precum şi în alte aspecte şi realizări descrise aici, tumoarea sau cancerul exprimă PD-L1. În unele realizări, o metodă cuprinde în plus o etapă de determinare a nivelului de expresie PD-L1 în tumoare sau cancer. În unele realizări, determinarea nivelului de expresie PD-L1 este făcută înainte de tratamentul sau de contactul cu un agent descris aici. În unele realizări, dacă tumoarea sau cancerul are un nivel de expresie ridicat al PD-L1, un agent descris aici este administrat către subiect. În unele realizări, dacă tumoarea sau cancerul are un nivel de expresie ridicat al PD-L1, tumoarea sau cancerul sunt puse în contact cu un agent descris aici..

SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR

Figurile 1A şi 1B. Analiza FACS a anticorpilor de iepure generaţi la TIGIT de şoarece. (A) Celulele HEK-293T au fost transfectate tranzient cu un vector de expresie ADNc care codifică TIGIT ECD-CD4TM-GFP de şoarece (proteină fluorescentă verde) sau TIGIT ECD-CD4TM-GFP uman. Celulele transfectate au fost incubate cu anticorpi de iepure şi analizate prin citometrie de flux. Legarea specifică este indicată prin prezenţa semnalului diagonal în fiecare grafic FACS. (B) Celulele HEK-293T au fost transfectate tranzient cu un vector de expresie ADNc care codifică TIGIT-CD4TM-GFP de şoarece. Celulele transfectate au fost incubate cu proteină de fuziune PVR-Fc solubilă de şoarece în prezenţa anticorpilor de iepure generaţi la TIGIT de şoarece sau fără anticorp şi analizate prin citometrie de flux. Legarea specifică este indicată prin prezenţa semnalului diagonal în fiecare grafic FACS. Blocarea legării este demonstrată prin pierderea legării specifice şi este indicată printr-un cerc pe graficul FACS.

Figurile 2A şi 2B. Analiză de pată Western a fosforilării proteinei după interacţiunea TIGIT-PVR. Celulele T Jurket umane au fost transduse stabil cu TIGIT-GFP de şoarece marcate cu FLAG şi celulele E.G7-OVA au fost transduse stabil cu PVR-GFP de şoarece. (A) Fosforilare TIGIT. (B) Foforilare SHP1 şi Erk1/2.

Figura 3. Analiză de pată Western a fosforilării TIGIT după interacţiunea TIGIT-PVR în absenţa sau prezenţa anticorpilor anti-TIGIT.

Figura 4. Analiză de pată Western a fosforilării SHP1 şi Erk1/2 după interacţiunea TIGIT-PVR în absenţa sau prezenţa anticorpilor anti-TIGIT.

Figurile 5A şi 5B. Inhibarea TIGIT a producţiei de citokine. (A) Secreţia de IL-2 în celulele T B3Z şi celulele T B3Z care exprimă TIGIT. (B) Secreţia de IL-2 în celulele T B3Z şi celulele T B3Z care exprimă TIGIT după pretratamentul cu anticorpi anti-TIGIT.

Figurile 6A şi 6B. Inhibarea TIGIT a activităţii celulelor ucigaşe natural. (A) Citotoxicitatea celulelor NK-92 parentale şi a celulelor NK-92 care exprimă TIGIT. (B) Citotoxicitatea celulelor NK-92 parentale şi a celulelor NK-92 care exprimă TIGIT după pretratamentul cu anticorpi anti-TIGIT.

Figurile 7A şi 7B. Inhibarea creşterii tumorii de către anticorpii anti-TIGIT. Linia tumorală de colon CT26.WT a fost implantată subcutanat în şoareci Balb/c (n = 10 şoareci/grup). Şoarecii au fost injectaţi în zilele 10, 15, 18, 22, 25, şi 29 cu 0,25mg/şoarece de anticorp anti-TIGIT 313R11, anticorp anti-TIGIT 313R12, anticorp de control IgG1 de şoarece, şi anticorp de control IgG2 de şoarece. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice la momentele de timp indicate. Datele sunt prezentate ca volum tumoral (mm3) pe zile după injecţie. (A) Figura prezintă valorile medii ± SEM pentru fiecare grup. (B) Un studiu suplimentar cu anticorp anti-TIGIT 313R12 şi un anticorp de control.

Figura 8. Inhibarea creşterii tumorii e către anticorpii anti-TIGIT. Linia tumorală de colon CT26.WT a fost implantată subcutanat în şoareci Balb/c (n = 10 şoareci/grup). Şoarecii au fost injectaţi în zilele 10, 14, 17, şi 21 cu 0,25mg/şoarece de anticorp anti-TIGIT 313R12, anticorp anti-TIGIT 313R13, şi anticorp de control IgG2 de şoarece. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice la momentele de timp indicate. Datele sunt prezentate ca volum tumoral (mm3) pe zile după injecţie. Figura prezintă valorile medii ± SEM pentru fiecare grup.

Figurile 9A până la 9D. Testele ELISpot pentru IFN-gama, IL-2, IL-4, şi IL-10. Celulele au fost recoltate din splinele şoarecilor care poartă tumoarea CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 sau cu un anticorp de control potrivit cu izotipul. Celulele au fost incubate în prezenţa sau absenţa peptidei AH-1 şi apoi analizate utilizând trusa ELISpot. (A) Este prezentată densitatea optică totală (TOD) a celulelor care produc IFN-gama. (B) Este prezentată TOD a celulelor care produc IL-2. (C) Este prezentată TOD a celulelor care produc IL-4. (B) Este prezentată TOD a celulelor care produc IL-10.

Figura 10. Activitatea celulei ucigaşe natural în populaţia de splenocite de la şoarecii trataţi cu anticorp anti-TIGIT.

Figura 11. Activitatea Treg în populaţia de splenocite de la şoarecii trataţi cu anticorp anti-TIGIT.

Figurile 12A până la 12E. Analiza FACS a splenocitelor de la şoarecii trataţi cu anticorp anti-TIGIT. (A) Procentajul de celule CD3+ din total celule vii. (B) Procentajul de celule CD4+ din total celule vii. (C) Procentajul de celule CD8+ din total celule vii. (D) Procentajul de celule T de memorie centrală CD4+ din populaţie CD4+ totală. (E) Procentajul de celule T de memorie centrală CD8+ din populaţie CD8+ totală.

Figurile 13A până la 13D. Analiza FACS a Treg-urilor pozitive sau negative TIGIT în populaţia de splenocite de la şoarecii trataţi cu anticorp anti-TIGIT. (A) Procentajul de celule pozitive TIGIT din total celule vii. (B) Procentajul de celule FoxP3+ din total celule CD4+ (identificarea Treg-urilor). (C) Procentajul de celule pozitive TIGIT din total celule Treg. (D) Procentajul de celule negative TIGIT din total celule Treg.

Figurile 14A până la 14D. Analiza FACS a MDSC-urilor din populaţia de splenocite de la şoarecii trataţi cu anticorp anti-TIGIT. (A) Procentajul de celule CD 11b+ din total celule vii. (B) Procentajul de MDSC-uri din total celule CD11b+. (C) Procentajul de G-MDSC-uri din total celule CD11b+. (D) Procentajul de M-MDSC-uri din total celule CD11b+.

Figura 15. Inhibarea creşterii tumorii de către anticorpii anti-TIGIT. Celulele renca (adenocarcinom renal murin) au fost implantate subcutanat în şoareci Balb/c (n = 10 şoareci/grup). Şoarecii au fost injectaţi în zilele 7, 10, 14, 17, 21, şi 24 cu 0,25mg/şoarece de anticorp anti-TIGIT 313R12 şi un anticorp de control IgG2 de şoarece. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice la momentele de timp indicate. Datele sunt prezentate ca volum tumoral (mm3) pe zile după injecţie. Figura prezintă valorile medii ± SEM pentru fiecare grup.

Figura 16. Inhibarea creşterii tumorii de către anticorpul anti-TIGIT 313R12 ― o doză studiu. Linia tumorală murină de colon CT26.WT a fost implantată subcutanat în şoarecii Balb/c (n = 10 şoareci/grup). Şoarecii au fost trataţi cu 0,5, 1, 3, 5, 10, 15, sau 30mg/kg de anticorp anti-TIGIT 313R12 sau au fost trataţi cu un anticorp de control. Şoarecii au fost dozaţi prin injecţie intraperitoneală de două ori o săptămână pentru un total de 6 doze. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice.

Figurile 17A până la 17F. Inhibarea creşterii tumorale in vivo de către anticorpul anti-TIGIT 313R12 şi un anticorp anti-PD-L1. Linia tumorală murină de colon CT26.WT a fost implantată subcutanat (30,000 celule/şoarece) în şoareci Balb/c. Şoarecii au fost trataţi cu 0,25mg/şoarece de anticorp anti-TIGIT 313R12, un anticorp anti-PD-Ll, o combinaţie de anticorpi 313R12 şi anti-PD-Ll, sau un anticorp de control (n = 10 pe grup). Şoarecilor le-au fost administraţi anticorpi de două ori o săptămână timp de 3 săptămâni. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice la momentele de timp indicate. (A) Volumele tumorale ale şoarecilor individuali din grup trataţi cu anticorp de control. (B) Volumele tumorale ale şoarecilor individuali din grup trataţi cu anticorp anti-TIGIT 313R12. (C) Volumele tumorale ale şoarecilor individuali din grup trataţi cu anticorp anti-PD-Ll. (D) Volumele tumorale ale şoarecilor individuali din grup trataţi cu anticorp anti-TIGIT 313R12 şi anticorp anti-PD-Ll. (E) Creşterea medie a tumorii celor patru grupuri de tratament. (F) Curba de supravieţuire.

Figurile 18A până la 18E. Inhibarea creşterii tumorale in vivo de către anticorpul anti-TIGIT 313R12 şi anticorpul anti-PD-1. Linia tumorală murină de colon CT26.WT a fost implantată subcutanat (30.000 celule/şoarece) în şoareci Balb/c. Şoarecii au fost trataţi cu 0,25mg/şoarece de anticorp anti-TIGIT 313R12, un anticorp anti-PD-1, o combinaţie de anticorpi 313R12 şi anti-PD-1, sau un anticorp de control (n = 15 pe grup). Şoarecilor le-au fost administrat anticorpi de două ori pe săptămână timp de 3 săptămâni. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice la momentele de timp indicate. (A) Volumele tumorale ale şoarecilor individuali din grupul tratat cu anticorp de control. (B) Volumele tumorale ale şoarecilor individuali din grupul tratat cu anticorp anti-TIGIT 313R12. (C) Volumele tumorale ale şoarecilor individuali din grupul tratat cu anticorp anti-PD-1. (D) Volumele tumorale ale şoarecilor individuali din grupul tratat cu anticorp anti-TIGIT 313R12 şi cu anticorp anti-PD-1. (E) Creşterea medie a tumorii celor patru grupuri de tratament.

Figurile 19A şi 19B. Analiza FACS a anticorpului anti-TIGIT care a blocat legarea TIGIT uman la PVR. (A) Celulele HEK-293T au fost transfectate tranzient cu un vector de expresie ADNc care codifică ECD-CD4TM-GFP TIGIT uman (proteină fluorescentă verde) sau ECD-CD4TM-GFP TIGIT uman. Celulele transfectate au fost incubate cu o proteină de fuziune PVR-Fc umană solubilă în prezenţa anticorpilor generaţi la TIGIT (313R19, 313M26, sau 313M32) la concentraţii de 10, 2, sau 04µg/ml sau fără anticorp şi analizate prin citometrie de flux. Legarea specifică este indicată de prezenţa unui semnal diagonal într-un grafic FACS. Blocarea de legare este demonstrată prin pierderea legării specifică într-o cutie neagră închisă pe graficul FACS. (B) Celulele HEK-293T au fost transfectate tranzient cu un vector de expresie ADNc care codifică ECD-CD4TM-GFP TIGIT uman (proteină fluorescentă verde) sau ECD-CD4TM-GFP TIGIT uman. Celulele transfectate au fost incubate cu PVR solubil uman-proteină de fuziune Fc de iepure în prezenţa anticorpilor generaţi la TIGIT (313R19 sau 313M32) la concentraţii de 10, 5, 2,5, sau 1,25µg/ml sau fără anticorp şi analizate prin citometrie de flux. Legarea specifică este indicată de prezenţa unui semnal diagonal într-un grafic FACS. Blocarea legării este demonstrată de pierderea legării specifice într-o cutie neagră închisă pe graficul FACS.

Figura 20. Analiză de pată Western a fosforilării TIGIT după interacţiunea TIGIT-PVR în absenţa sau prezenţa anticorpilor anti-TIGIT 313R19, 313M26, şi 313M32.

Figura 21. O secvenţă de aliniere a TIGIT uman (SEQ ID NO:4), TIGIT de maimuţă cynomolgus (SEQ ID NO:77), şi TIGIT de maimuţă rhesus (SEQ ID NO:78).

Figura 22. Maparea epitopului prin analiza FACS a legării anticorpului anti-TIGIT la proteinele TIGIT umane variante care conţin substituţii specifice de aminoacizi. Variantele hTIGIT sunt (1) E36K şi I41V; (2) T51M, (3) Q62H şi Q64H, (4) D72E, (5) S78Y şi S80A, (6) V100M, (7) I109T şi T119R, şi (8) G135S.

Figura 23. O diagramă reprezentând PVR legat la TIGIT. Structura TIGIT uman este prezentată în reprezentare sferică şi structura PVR este furnizată în reprezentare liniară. Aminoacizii cuprinzând cel puţin o parte din epitopul 313M32 sunt prezentaţi ca sfere negre. Aminoacizii cuprinzând cel puţin o parte din epitopul 313M34 sunt prezentaţi ca sfere gri.

Figurile 24A şi 24B. Studii de legare competitive între anticorpi anti-TIGIT. (A) Studiu competitiv cu 313R19 şi 313M26. (B) Studiu competitiv cu 313M34 şi 313R19 sau 313M34 şi 313M32.

Figura 25. Inversarea inhibării mediate de PVR a secreţiei de citokine de către anticorpii anti-TIGIT.

Figura 26. Test de citotoxicitate celulară dependentă de anticorp.

Figura 27. Inhibarea creşterii tumorii de către anticorpii anti-TIGIT 313R19 şi 313M32 într-un model de şoareci umanizaţi. Şoarecii umanizaţi au fost injectaţi subcutanat cu celule tumorale de melanom derivate de la pacient (OMP-M9, 75.000 celule/şoarece). Tumorile au fost lăsate să crească 19 zile până când ele au atins un volum mediu de aproximativ 50mm3. Şoarecii purtători de tumori au fost randomizaţi în grupuri (n = 8 şoareci pe grup). Şoarecii purtători de tumori au fost trataţi fie cu un anticorp de control, anticorp anti-TIGIT 313R19, sau anticorp anti-TIGIT 313M32. Şoarecii au fost dozaţi la fiecare 5 zile la 1 sau 5mg/kg. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice la momentele de timp indicate.

DESCRIERE DETALIATĂ A INVENŢIEI

Prezenta divulgare furnizează noi agenţi, incluzând, dar fără a se limita la, polipeptide, anticorpi, şi molecule heterodimerice care modulează răspunsul imun. Agenţii includ polipeptide, anticorpi, şi molecule heterodimerice care se leagă specific la TIGIT şi agenţi care modulează activarea şi/sau semnalizarea TIGIT. Agenţii includ polipeptide, anticorpi, şi molecule heterodimerice cre inhibă activarea şi/sau semnalizarea TIGIT, amplificȃnd prin urmare un răspuns imun. Polipeptidele şi polinucleotide înrudite, compoziţiile cuprinzând agenţii, şi metode de realizare a agenţilor sunt de asemenea furnizate. Sunt furnizate metode de selecţie a agenţilor care modulează răspunsul. Sunt furnizate metode de utilizare a noilor agenţi, cum ar fi metodele de inhibare a creşterii tumorii şi/sau metodele pentru tratarea cancerului. Sunt furnizate de asemenea metode pentru tratarea infecţiilor virale. Sunt în plus furnizate metode de utilizare a noilor agenţi, cum ar fi metodele de activare a unui răspuns imun, metodele de stimulare a unui răspuns imun, metodele de promovare a unui răspuns imun, metodele de creştere a unui răspuns imun, metodele de activare a celulelor ucigaşe natural (NK) şi/sau a celulelor T, metodele de creştere a activităţii celulelor NK şi/sau celulelor T, metodele de promovare a activităţii celulelor NK şi/sau celulelor T, metodele de scăderea şi/sau inhibarea celulelor T supresoare, şi/sau metodele de scădere şi/sau inhibare a celulelor supresoare derivate din mieloide. În plus, noii agenţi descrişi aici pot fi utilizaţi în metodele de inhibare a unui răspuns imun, metodele de suprimarea a unui răspuns imun, metodele de scădere a activităţii celulelor T, şi/sau metodele pentru tratarea bolilor autoimune.

I. Definiţii

Pentru a facilita o înţelegere a prezentei invenţii, un număr de termeni şi fraze sunt definite mai jos.

Termenii „agonist« şi „agonistic« aşa cum s-au utilizat în acest document se referă la, sau descriu un agent care este capabil de, inducerea, activarea, promovarea, creşterea, sau amplificarea substanţial directă sau indirectă a activităţii biologice a unei ţinte şi/sau căi. Termenul „agonist« este utilizat aici pentru a include orice agent care induce, activează, promovează, creşte, sau sporeşte parţială sau complet activitatea unei proteine.

Termenii „antagonist« şi „antagonistic« aşa cum s-au utilizat în acest document se referă la, sau descriu un agent care este capabil de, blocarea, inhibarea, reducerea, sau neutralizarea directă sau indirectă, parţială sau completă a activităţii biologice a unei ţinte şi/sau căi. Termenul „antagonist« este utilizat aici pentru a include orice agent care blochează, inhibă, reduce, sau neutralizează parţial sau complet activitatea unei proteine.

Termenii „modulare« şi „modulat« aşa cum s-au utilizat în acest document se referă la o modificare sau la o alterare a unei activităţi biologice. Modularea include, dar nu se limitează la, stimularea unei activitaţi sau inhibarea unei activităţi. Modularea poate fi o creştere sau o scădere a activităţii, o modificare a caracteristicilor de legare, sau orice altă modificare în proprietăţile biologice, funcţionale, sau imunologice asociate cu activitatea unei proteine, a unei căi, a unui sistem, sau a altor ţinte biologice de interes.

Termenul „anticorp« aşa cum s-a utilizat în acest document se referă la o moleculă de imunoglobulină care recunoaşte şi se leagă specific la ţintă prin cel puţin un situs de legare la antigen. Ţinta poate fi o proteină, polipeptidă, peptidă, carbohidrat, polinucleotidă, lipidă, sau o combinaţie din oricare dintre cele anterioare. Aşa cum s-a utilizat în acest document, termenul cuprinde anticorpi policlonali intacţi, anticorpi monoclonali intacţi, fragmente de anticorp (cum ar fi fragmente Fab, Fab', F(ab')2, şi Fv), anticorpi monocatenari Fv (scFv), anticorpi multispecifici, anticorpi bispecifici, anticorpi monospecifici, anticorpi monovalenţi, anticorpi himerici, anticorpi umanizaţi, anticorpi umani, proteine de fuziune cuprinzând un situs de legare la antigen al unui anticorp, şi orice alte molecule de imunoglobulină modificate cuprinzând un situs de legare la antigen atâta timp cât anticorpii prezintă activitatea biologică dorită. Un anticorp poate fi oricare din cele cinci clase majore de imunoglobuline: IgA, IgD, IgE, IgG, şi IgM, sau subclase (izotipuri) ale acestora (de exemplu, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 şi IgA2), pe baza identităţii domeniilor constante ale lanţului lor greu la care se face referire ca alfa, delta, epsilon, gama, şi respectiv mu. Diferitele clase de imunoglobuline au diferite şi bine cunoscute structuri subunitare şi configuraţii tridimensionale. Anticorpii pot fi goi sau conjugaţi la alte molecule, incluzând dar fără a se limita la, toxine şi radioizotopi.

Termenul „fragment de anticorp« se referă la o porţiune a unui anticorp intact şi se referă în general la regiunile variabile determinante antigenice ale unui anticorp intact. Exemplele de fragmente de anticorp includ, dar nu se limitează la, fragmente Fab, Fab', F(ab')2, şi Fv, anticorpi liniari, anticorpi monocatenari, şi anticorpi multispecifici formaţi din fragmente de anticorp. „Fragmentul de anticorp« aşa cum s-a utilizat în acest document cuprinde un situs de legare la antigen sau un situs de legare la epitop.

Termenul „regiune variabilă« a unui anticorp se referă la regiunea variabilă a unui lanţ uşor al anticorpului sau la regiunea variabilă a unui lanţ greu al anticorpului, fie singur sau fie în combinaţie. În general, regiunea variabilă a unui lanţ greu sau a unui lanţ uşor constă din patru regiuni cadru conectate prin trei regiuni determinante de complementaritate (regiuni CDR), cunoscute de asemenea ca „regiuni hipervariabile«. Regiunile CDR din fiecare lanţ sunt ţinute împreună în proximitate alăturată de către regiunile cadru şi, cu regiunile CDR de la celălalt lanţ, contribuie la formarea situsurilor de legare la antigen ale anticorpului. Există cel puţin două tehnici pentru determinarea regiunilor CDR: (1) o abordare pe baza variabilităţii secvenţei speciilor încrucişate (adică, Kabat şi colab., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, ediţia a 5-a, National Institutes of Health, Bethesda MD.), şi (2) o abordare pe baza studiilor cristalografice ale complecşilor antigen-anticorp (Al Lazikani şi colab., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). În plus, combinaţii din aceste două abordări sunt uneori utilizate în domeniu pentru a determina regiunile CDR.

Termenul „anticorp monoclonal« aşa cum s-a utilizat în acest document se referă la o populaţie omogenă de anticorpi implicată în recunoaşterea foarte specifică şi legarea unui singur determinant antigenic sau epitop. Aceasta este în contrast cu anticorpii policlonali care include de obicei un amestec de diferiţi anticorpi care recunosc diferiţi determinanţi antigenici. Termenul „anticorp monoclonal« cuprinde ambii anticorpi monoclonali intacţi şi cu lungime completă precum şi fragmentele de anticorp (de exemplu, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), anticorpi monocatenari (scFv), proteine de fuziune cuprinzând un fragment de anticorp, şi orice alte molecule modificate de imunoglobulină cuprinzând un situs de legare la antigen. Mai mult, „anticorpul monoclonal« se referă la astfel de anticorpi făcuţi prin orice număr de tehnici, incluzând dar fără a se limita la, producţie de hibridom, selecţie de fagi, exprimare recombinantă, şi animale transgenice.

Termenul „anticorp umanizat« aşa cum s-a utilizat aici se referă la anticorpi care sunt catene specifice de imunoglobulină, imunoglobuline himerice, sau fragmente ale acestuia care conţin secvenţe non-umane minimale. De obicei, anticorpii umanizaţi sunt imunoglobuline umane în care resturile de aminoacizi ale regiunilor CDR sunt înlocuite cu resturi de aminoacizi din regiunile CDR ale unei specii non-umane (de exemplu, şoarece, şobolan, iepure, sau hamster) care au specificitatea, afinitatea, şi/sau capacitatea de legare dorite. În unele cazuri, resturile de aminoacizi ale regiunii cadru variabile dintr-o imunoglobulină umană pot fi înlocuit cu resturile corespunzătoare de aminoacizi dintr-un anticorp dintr-o specie non-umană. Anticorpul umanizat poate fi modificat suplimentar prin substituţia resturilor suplimentare de aminoacizi fie în regiunea cadru variabilă şi/sau în resturile înlocuite non-umane de aminoacizi pentru a rafina suplimentar şi optimiza specificitatea anticorpului, afinitatea, şi/sau capacitatea de legare. Anticorpul umanizat poate cuprinde domenii variabile care conţin toate sau substanţial toate din regiunile CDR care corespund la imunoglobulina non-umană, în timp ce toate sau substanţial toate din regiunile cadru variabile sunt cele ale secvenţei de imunoglobulină umană. În unele realizări, domeniile variabile cuprind regiunile cadru dintr-o secvenţă de imunoglobulină umană. În unele realizări, domeniile variabile cuprind regiunile cadru dintr-o secvenţă consens de imunoglobulină umană. Anticorpul umanizat poate cuprinde de asemenea cel puţin o porţiune a unei regiuni sau domeniu constante de imunoglobulină (Fc), de obicei cele ale unei imunoglobuline umane.

Termenul „anticorp uman« aşa cum s-a utilizat în acest document se referă la un anticorp produs de un om sau la un anticorp având o secvenţă de aminoacizi corespunzătoare cu cea a unui anticorp produs de un om făcut utilizând oricare din tehnicile cunoscute în domeniu.

Termenul „anticorp himeric« aşa cum s-a utilizat în acest document se referă la un anticorp în care secvenţa de aminoacizi a moleculei de imunoglobulină este derivată din două sau mai multe specii. De obicei, regiunile variabile ale lanţurilor uşoare şi grele corespund regiunilor variabile ale unui anticorp derivat dintr-o specie de mamifer (de exemplu, şoarece, şobolan, iepure, etc.) cu specificitatea, afinitatea, şi/sau capacitatea de legare dorite, în timp ce regiunile constante sunt omoloage cu secvenţa dintr-un anticorp derivat dintr-o altă specie. Regiunile constante sunt uzual umane pentru a evita provocarea unui răspuns imun în anticorp.

Termenii „epitop« şi „determinant antigenic« sunt utilizaţi interschimbabil aici şi se referă la acea porţiune a unui antigen sau ţintă capabilă să fie recunoscută şi legată specific de un anumit anticorp. Când antigenul sau ţintă este o polipeptidă, epitopii poate fi formaţi atȃt din aminoacizi contigui cȃt şi din aminoacizi necontigui juxtapuşi prin plierea terţiară a proteinei. Epitopii formaţi din aminoacizi contigui (la care se face referire de asemenea ca epitopi liniari) sunt de obicei reţinuţi după denaturarea proteinei, în timp ce epitopii formaţi prin pliere terţiară (la care se face referire de asemenea ca epitopi conformaţionali) sunt de obicei pierduţi după denaturarea proteinei. Un epitop include de obicei cel puţin 3, şi mai uzual, cel puţin 5, 6, 7, sau 8-10 aminoacizi într-o conformaţie spaţială unică.

Termenii „se leagă selectiv« sau „se leagă specific« înseamnă că un agent interacţionează mai frecvent, mai rapid, cu o durată mai mare, cu afinitate mai mare, sau cu unele combinaţii ale celor de mai sus la epitop, proteină, sau molecula ţintă decât cu substanţe alternative, incluzând proteinele înrudite şi neînrudite. În anumite realizări „se leagă specific« înseamnă, de exemplu, că un agent se leagă la o proteină sau ţintă cu o Kd de aproximativ 0,1mM sau mai mică, dar mai uzual mai mică de aproximativ 1µM. În anumite realizări, „se leagă specific« înseamnă că un agent se leagă la o ţintă cu o Kd de cel puţin aproximativ 0,1µM sau mai mică, cel puţin de aproximativ 0,01µM sau mai mică, sau cel puţin de aproximativ InM sau mai mică. Datorită identităţii de secvenţă între proteinele omoloage din diferite specii, legarea specifică poate include un agent care recunoaşte o proteină sau ţintă în mai mult de o specie (de exemplu, TIGIT de şoarece şi TIGIT uman). În mod asemănător, datorită omologiei cu anumite regiuni ale secvenţelor de polipeptidă ale diferitelor proteine, legarea specifică poate include un agent care recunoaşte mai mult de o proteină sau ţintă. Se înţelege că, în anumite realizări, un agent care se leagă specific la o primă ţintă poate sau poate să nu se lege specific la o a doua ţintă. Ca atare, „legarea specifică« nu necesită în mod necesar (deşi it poate include) legarea exclusivă, adică legarea la o singură ţintă. Astfel, un agent se poate, în anumite realizări, lega specific la mai mult de o ţintă. În anumite realizări, ţinte multiple pot fi legate de către acelaşi situs de legare la antigen pe agent. De exemplu, un anticorp poate, în anumite cazuri, cuprinde două situsuri identice de legare la antigen, din care fiecare se leagă specific la acelaşi epitop pe două sau mai multe proteine. În anumite realizări alternative, un anticorp poate fi bispecific şi cuprinde cel puţin două situsuri de legare la antigen cu diferite specificităţi. În general, dar nu în mod necesar, referinţa la legare înseamnă legare specifică.

Termenii „polipeptidă« şi „peptidă« şi „proteină« sunt utilizaţi interschimbabil aici şi se referă la polimeri de aminoacizi de orice lungime. Polimerul poate fi liniar sau ramificat, el poate cuprinde aminoacizi modificaţi, şi el poate fi întrerupt de non-aminoacizi. Termenii cuprind de asemenea un polimer aminoacid care a fost modificat natural sau prin intervenţie; de exemplu, formarea legăturii disulfură, glicozilare, lipidare, acetilare, fosforilare, sau orice altă manipulare sau modificare, cum ar fi conjugarea cu o componentă de marcare. De asemenea sunt incluse în definiţie, de exemplu, polipeptidele care conţin unul sau mai mulţi analogi ai unui aminoacid (incluzând, de exemplu, aminoacizi nenaturali), precum şi alte modificări cunoscute în domeniu. Se înţelege că, deoarece polipeptida acestei invenţii poate fi pe bază de anticorpi sau alţi membri ai superfamiliei de imunoglobuline, în anumite realizări, o „polipeptidă« poate apare ca monocatenară sau ca două sau mai multe catene asociate.

Termenii „polinucleotidă« şi „acid nucleic« şi „moleculă de acid nucleic« sunt utilizaţi interschimbabil aici şi se referă la polimeri de nucleotide de orice lungime, şi includ ADN şi ARN. Nucleotidele pot fi deoxiribonucleotide, ribonucleotide, nucleotide modificate sau baze, şi/sau analogi ai lor, sau orice substrat care poate fi încorporat într-un polimer prin polimerază ADN sau ARN.

Termenii „identic« sau „identitate« procentuală în contextul a doi sau mai mulţi acizi nucleici sau polipeptide, se referă la două sau mai multe secvenţe sau subsecvenţe care sunt aceleaşi sau au un procentaj specificat de nucleotide sau resturi de aminoacid care sunt acelaşi, când sunt comparate şi aliniate (introducȃnd goluri, dacă este necesar) pentru corespondenţa maximă, neconsiderând nici o substituţie conservativă de aminoacizi ca o parte din identitatea de secvenţă. Identitatea procentuală poate fi măsurată utilizând software sau algoritmi de comparaţie a secvenţei sau prin inspecţie vizuală. Diferiţi algoritmi şi software care pot fi utilizaţi pentru a obţine alinieri de aminoacizi sau secvenţe de nucleotidă sunt bine cunoscuţi în domeniu. Aceştia includ, dar nu se limitează la, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, pachetul GCG Wisconsin, şi variante ale acestora. În unele realizări, doi acizi nucleici sau polipeptide ale invenţiei sunt substanţial identice, însemnȃnd că ele au cel puţin 70%, cel puţin 75%, cel puţin 80%, cel puţin 85%, cel puţin 90%, şi în unele realizări cel puţin 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identitate de nucleotidă sau de resturi de aminoacizi, când sunt comparate şi aliniate pentru corespondenţa maximă, după cum s-a măsurat utilizând un algoritm de comparaţie a secvenţei sau prin inspecţie vzualăi. În unele realizări, identitate există pe o regiune a secvenţelor care este cel puţin aproximativ de 10, cel puţin aproximativ de 20, cel puţin aproximativ de 40-60 de nucleotide sau resturi de aminoacizi, cel puţin de aproximativ 60-80 de nucleotide sau resturi de aminoacizi în lungime sau orice valoare integrală dintre ele. În unele realizări, există identitate pe o regiune mai lungă de 60-80 nucleotide sau resturi de aminoacizi, cum ar fi cel puţin de aproximativ 80-100 de nucleotide sau resturi de aminoacizi, şi în unele realizări secvenţele sunt substanţial identice pe întreaga lungime a secvenţelor care este comparată, de exemplu, regiunea codificatoare a unei secvenţe de nucleotide.

O „substituţie conservativă de aminoacizi« este una în care un rest de aminoacid este înlocuit cu un altă rest de aminoacid având o catenă laterală similară. Familiile de resturi de aminoacizi având catene laterale similare au fost în general definite în domeniu, incluzând catenele laterale bazice (de exemplu, lizină, arginină, histidină), catenele laterale acidice (de exemplu, acid aspartic, acid glutamic), catenele laterale polare neîncărcate (de exemplu, glicină, asparagină, glutamină, serină, treonină, tirozină, cisteină), catenele laterale nepolare (de exemplu, alanină, valină, leucină, izoleucină, prolină, fenilalanină, metionină, triptofan), catenele laterale beta-ramificate (de exemplu, treonină, valină, izoleucină) şi catenele laterale aromatice (de exemplu, tirozină, fenilalanină, triptofan, histidină). De exemplu, substituţia unei fenilalanine cu o tirozină este considerată a fi o substituţie conservativă. În general, substituţiile conservative din secvenţele de polipeptide şi/sau anticorpi ai invenţiei nu abrogă legarea polipeptidei sau anticorpului conţinând secvenţa de aminoacizi, la situsul de legare al ţintei. Metodele de identificare a nucleotidei şi substituţiilor conservative de aminoacizi care nu elimină legarea sunt bine cunoscute în domeniu.

Termenul „vector« aşa cum s-a utilizat în acest document înseamnă o construcţie, care este capabilă de livrare, şi care exprimă uzual, una sau mai multe gene sau secvenţe de interes într-o celulă gazdă. Exemple de vectori includ, dar nu sunt limitate la, vectori virali, vectori goi de expresie ADN sau ARN, plasmidă, cosmidă, sau vectori fagi, vectori de expresie ADN sau ARN asociaţi cu agenţi de condensare cationici, şi vectori de expresie ADN sau ARN încapsulaţi în lipozomi.

O polipeptidă, proteină solubilă, anticorp, polinucleotidă, vector, celulă, sau compoziţie care este „izolată« este o polipeptidă, proteină solubilă, anticorp, polinucleotidă, vector, celulă, sau compoziţie care este într-o formă negăsită în natură. Polipeptidele izolate, proteinele solubile, anticorpii, polinucleotidele, vectorii, celulele, sau compoziţiile le includ pe cele care au fost purificate la un grad la care ele nu mai sunt într-o formă în care ele sunt găsite în natură. În unele realizări, o polipeptidă, proteină solubilă, anticorp, polinucleotidă, vector, celulă, sau compoziţie care este izolată este substanţial pură.

Termenul „substanţial pur« aşa cum s-a utilizat în acest document se referă la un material care este cel puţin 50% pur (adică, fără contaminanţi), cel puţin 90% pur, cel puţin 95% pur, cel puţin 98% pur, sau cel puţin 99% pur.

Termenul „răspuns imun« aşa cum s-a utilizat în acest document include răspunsuri atȃt de la sistemul imunitar nativ cȃt şi de la sistemul imunitar adaptiv. El include ambele răspunsuri imune mediate de celulă şi/sau umorale. El include, dar nu este limitat la, ambele răspunsuri ale celulei T şi celulei B, precum şi răspunsuri de la alte celule ale sistemului imunitar cum ar fi celule ucigaşe natural (NK), monocite, macrofage, etc.

Termenii „cancer« şi „canceros« aşa cum s-au utilizat în acest document se referă la, sau descriu afecţiunea fiziologică la mamiferele în care o populaţie a celulelor este caracterizată prin creşterea neregulată a celulei. Exemple de cancer includ, dar nu sunt limitate la, carcinom, blastom, sarcom, şi cancere hematologice cum ar fi limfom şi leucemie.

Termenii „tumoare« şi „neoplasm« aşa cum s-au utilizat în acest document se referă la orice masă de ţesut care rezultă din creşterea celulară excesivă sau proliferare, fie benignă (necanceroasă) sau malignă (canceroasă) incluzând leziuni precanceroase.

Termenul „metastază« aşa cum s-a utilizat în acest document se referă la procesul prin care un cancer se răspȃndeşte sau se transferă din situsul de origine la alte regiuni ale corpului cu dezvoltarea unei leziuni canceroase similare la o nouă locaţie. În general, o celulă „metastatică« sau „metastazică« este una care îşi pierde contactele adezive cu celulele învecinate şi migrează prin fluxul sanguin sau limfatic din situsul primar al bolii la situsurile secundare prin corp.

Termenii „celulă stem canceroasă« şi „CSC« şi „celulă stem tumorală« şi „celulă care iniţiază tumoarea« sunt utilizate interschimbabil aici şi se referă la celulele de la un cancer sau tumoare care: (1) au capacitate de proliferare extensivă; 2) sunt capabile de divizarea asimetrică a celulei pentru a genera unul sau mai multe tipuri de descendenţă celulară diferenţiată în care celulele diferenţiate au redus potenţialul proliferativ sau de dezvoltare; şi (3) sunt capabile de diviziunea celulară simetrică pentru autoreînnoire sau autoîntreţinere. Aceste proprietăţi conferă celulelor stem canceroase abilitatea de a forma sau stabili o tumoare sau cancer după transplantul serial într-o gazdă adecvată (de exemplu, un şoarece) în comparaţie cu majoritatea celulelor tumorale care eşuează în a forma tumori. Celulele stem canceroase suferă autoreînnoire versus diferenţiere într-o manieră haotică pentru a forma tumori cu tipuri de celule anormale care se pot modificare în timp pe măsură ce apar mutaţiile.

Termenii „celulă canceroasă« şi „celulă tumorală« se referă la populaţia totală a celulelor derivate dintr-un cancer sau tumoare sau leziune precanceroasă, incluzând atȃt celulele netumorigenice, care cuprind grupul de populaţie celulară canceroasă, cȃt şi celulele stem tumorigenice (celule stem canceroase). Aşa cum s-a utilizat în acest document, termenii „celulă canceroasă« sau „celulă tumorală« vor fi modificaţi de termenul „non-tumorigenic« când se referă numai la acele celule care nu au capacitate de reînnoire şi se diferenţiază pentru a distinge acele celule tumorale de celulele stem canceroase.

Termenul „tumorigenic« aşa cum s-a utilizat în acest document se referă la caracteristicile funcţionale ale unei celule stem canceroase incluzând proprietăţile de autoreînnoire (dând naştere la celule stem canceroase tumorigenice suplimentare) şi proliferare pentru a genera toate celelate celule tumorale (dând naştere celulelor tumorale diferenţiate şi astfel non-tumorigenice).

Termenul „tumorigenicitate« aşa cum s-a utilizat în acest document se referă la abilitatea a unui mostre aleatoare a celulelor din tumoare de a forma tumori palpabile după transplantul serial într-o gazdă adecvată (de exemplu, şoareci).

Termenul „subiect« se referă la orice animal (de exemplu, un mamifer), incluzând, dar fără a se limita la, oameni, primate non-umane, cȃini, feline, iepuri, rozătoare, şi altele asemenea, care trebuie să fie destinatarii unui tratament particular. De obicei, termenii „subiect« şi „pacient« sunt utilizaţi interschimbabil aici cu referire la un subiect uman.

Termenul „acceptabil farmaceutic« se referă la o substanţă aprobată sau aprobabilă de către o agenţie de reglementări a Guvernului Federal sau a Guvernului Statal sau listată în U.S. Pharmacopeia sau în altă farmacopeie recunoscută în general pentru utilizare la animale, incluzând oameni.

Termenii „excipient acceptabil farmaceutic, purtător, sau adjuvant« sau „purtător acceptabil farmaceutic« se referă la un excipient, purtător, sau adjuvant care poate fi administrat unui subiect, împreună cu cel puţin un agent din prezenta divulgare, şi care nu distruge activitatea farmacologică a acestuia şi este netoxic când se administrează în doze suficiente pentru a livra un efect terapeutic. În general, cei calificaţi în domeniu şi U.S. FDA consideră un excipient acceptabil farmaceutic, purtător, sau adjuvant ca fiind un ingredient inactiv pentru orice formulare.

Termenii „cantitate eficientă« sau „cantitate eficientă terapeutic« sau „efect terapeutic« se referă la o cantitate dintr-un agent descris aici, un anticorp, o polipeptidă, o polinucleotidă, a mică moleculă organică, sau alt medicament eficient pentru a „trata« o boală sau tulburare la un subiect cum ar fi, un mamifer. În cazul cancerului sau al tumorii, cantitatea eficientă terapeutic dintr-un agent (de exemplu, polipeptidă sau anticorp) are un efect terapeutic şi ca atare poate spori sau stimula răspunsul imun, spori sau stimula răspunsul antitumoral, creşte activitatea citolitică a celulelor imune, creştere uciderii celulelor tumorale, creşterea uciderii celulelor tumorale de către celulele imune, reducerea numărului de celule tumorale; scăderea tumorigenicităţii, frecvenţei tumorigenice, sau capacităţii tumorigenice; reduce numărul sau frecvenţa celulelor stem canceroase; reduce dimensiunea tumorii; reduce populaţia de celule canceroase; inhiba sau opri infiltrarea celulei canceroase în organele periferice incluzând, de exemplu, răspȃndirea cancerului în ţesutul moale şi os; inhibarea şi oprirea metastazei tumorii sau celulei canceroase; inhibarea şi oprirea creşterii tumorii sau celulei canceroase; atenuarea într-o oarecare măsură a unuia sau mai multor simptome asociate cu cancerul; reducerea morbidităţii şi mortalităţii; îmbunătăţirea calităţii vieţii; sau o combinaţie de astfel de efecte.

Termenii „tratarea« sau „tratament« sau „pentru a trata« sau „atenuarea« sau „pentru a atenua« se referă atȃt la (1) măsurile terapeutice care vindecă, încetinesc, reduc simptomele, şi/sau opresc progresul unei afecţiuni sau tulburări patologice diagnosticate cȃt şi (2) măsurile profilactice sau preventive care previn sau încetinesc dezvoltarea unei afecţiuni sau tulburări patologice ţintite. Astfel cei care au nevoie de tratament îi includ pe cei care au deja tulburarea; pe cei predispuşi a avea tulburarea; şi pe cei la care tulburarea trebuie să fie prevenită. În cazul cancerului sau tumorii, un subiect este „tratat« cu succes în conformitate cu metodele prezentei invenţii dacă pacientul prezintă una sau mai multe din următoarele: un răspuns imun crescut, un răspuns antitumoral crescut, activitate citolitică crescută a celulelor imune, ucidere crescută a celulelor tumorale, ucidere crescută a celulelor tumorale de către celulele imune, o reducere în numărul sau absenţa completă a celulelor canceroase; o reducere a dimensiunii tumorii; inhibares sau absenţa infiltrării celulei canceroase în organele periferice incluzând răspȃndirea celulelor canceroase în ţesutul moale şi os; inhibarea sau absenţa metastazei tumorii sau celulei canceroase; inhibarea sau absenţa creşterii cancerului; uşurarea unuia sau mai multor simptome asociate cu cancerul specific; morbiditatea şi mortalitatea reduse; îmbunătăţirea calităţii vieţii; reducerea tumorigenicităţii; reducerea numărului sau frecvenţei celulelor stem canceroase; sau unele combinaţii ale efectelor.

Aşa cum s-a utilizat în prezenta divulgare şi revendicări, formele la singular „o«, „un« şi forma articulată include formele plurale în afară de cazul când contextul dictează clar altfel.

Se înţelege că oriunde sunt descrise aici realizări cu exprimarea „cuprinzând« realizările alaloge descrise altfel în termeni de „constând din« şi/sau „constând în mod esenţial din« sunt de asemenea furnizate. Este de asemenea înţeles că oriunde sunt descrise aici realizări cu exprimarea „constând în mod esenţial din« realizările analoge descrise altfel în termeni de „constând din« sunt de asemenea furnizate.

Aşa cum s-a utilizat în acest document, referinţa la „în jur de« sau „aproximativ« o valoare sau parametru include (şi descrie) realizări care sunt direcţionate spre acea valoare sau parametru. De exemplu, descriere care face referire la „în jur de X« include descrierea lui „X«.

Termenul „şi/sau« aşa cum s-a utilizat într-o frază cum ar fi „A şi/sau B« aici este intenţionat să includă ambii A şi B; A sau B; A (singur); şi B (singur). În mod asemănător, termenul „şi/sau« aşa cum s-a utilizat într-o frază cum ar fi „A, B, şi/sau C« este intenţionat să cuprindă fiecare din următoarele realizări: A, B, şi C; A, B, sau C; A sau C; A sau B; B sau C; A şi C; A şi B; B şi C; A (singur); B (singur); şi C (singur).

II. Agenţi de legare TIGIT

Imunoreceptorul celulei T cu domeniile Ig şi ITIM (TIGIT) este o glicoproteină transmembranară de tip I care conţine un domeniuvariabil de imunoglobulină (IgV). TIGIT aparţine familiei receptorului poliovirus (PVR) şi se leagă la receptorul poliovirus (PVR; CD155) cu afinitate ridicată şi la PVRL-2 (CD112) şi PVRL-3 (CD113) cu o afinitate mai scăzută. TIGIT este exprimat pe celule T, incluzând celule T regulatoare şi celule T de memorie, precum şi pe celule NK şi este reglată pozitiv după activarea celulelor T CD4+ naive. Secvenţele de aminoacizi cu lungime completă (aa) pentru TIGIT de şoarece (UniProtKB nr. P86176) şi TIGIT uman (UniProtKB nr. Q495A1) sunt cunoscute în domeniu şi sunt furnizate aici ca SEQ ID NO:1 şi SEQ ID NO:4, respectiv. Aşa cum s-a utilizat în acest document, referinţa la poziţiile de aminoacizi se referă la numărarea secvenţelor de aminoacizi cu lungime completă incluzând secvenţa semnal.

Prezenta divulgare furnizează agenţi care se leagă specific la TIGIT. Aceşti agenţi sunt referiţi aici ca „agenţi de legare TIGIT«. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este o polipeptidă. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT se leagă la TIGIT de şoarece. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT se leagă la TIGIT uman. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT se leagă la TIGIT de şoarece şi la TIGIT uman. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT se leagă la TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de şoarece.

În unele cazuri, un agent se leagă la TIGIT şi interferează cu interacţiunea TIGIT cu o a doua proteină. În unele cazuri, un agent se leagă la TIGIT şi interferează cu interacţiunea TIGIT cu PVR. În unele cazuri, un agent se leagă la TIGIT şi interferează cu interacţiunea TIGIT cu PVRL-2. În unele cazuri, un agent se leagă la TIGIT şi interferează cu interacţiunea TIGIT cu PVRL-3. În unele cazuri, un agent se leagă specific la TIGIT şi agentul întrerupe legarea TIGIT la PVR, şi/sau întrerupe activarea PVR a semnalizării TIGIT.

În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la domeniul extracelular specific al TIGIT, sau la un fragment al acestuia. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT de şoarece, sau la un fragment al acestuia. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT uman, sau la un fragment al acestuia. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT de şoarece şi al TIGIT uman, sau la un fragment al acestora. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă specific la domeniul similar cu Ig al TIGIT. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă specific la domeniul IgV al TIGIT. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă în aminoacizii 22-141 ai TIGIT uman şi/sau în aminoacizii 29-148 ai TIGIT de şoarece. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă în aminoacizii 22-141 din SEQ ID NO:4 şi/sau în aminoacizii 29-148 din SEQ ID NO:1. În unele cazuri, agentul se leagă în aminoacizii 22-124 ai TIGIT uman şi/sau aminoacizii 29-127 ai TIGIT de şoarece. În unele cazuri, agentul se leagă în aminoacizii 22-124 din SEQ ID NO:4 şi/sau în aminoacizii 29-127 din SEQ ID NO:1. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT se leagă în SEQ ID NO:3, sau într-un fragment al acestuia. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT se leagă în SEQ ID NO:6, sau într-un fragment al acestuia. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă în aminoacizii 22-141 ai TIGIT uman. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă în aminoacizii 22-141 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă în aminoacizii 50-124 ai TIGIT uman. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă în aminoacizii 50-124 din SEQ ID NO:4. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT se leagă în SEQ ID NO:6, sau într-un fragment al acesteia.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii din SEQ ID NO:79. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii din SEQ ID NO:80. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă un epitop cuprinzând aminoacizii din SEQ ID NO:79 şi SEQ ID NO:80. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă un epitop cuprinzând aminoacizii Q62 şi 1109 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă un epitop cuprinzând aminoacizii Q62 şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q64 şi 1109 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q64 şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, Q64, şi 1109 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, Q64, şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, 1109, şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q64, 1109, şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, Q64, 1109, şi T119 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la un epitop cuprinzând cel puţin un aminoacid selectat din grupul constând din: N58, E60, Q62, Q64, L65, F107, 1109, H111, T117, T119, G120, şi R121 din SEQ ID NO:4. În unele cazuri, epitopul este un epitop conformaţional. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care se leagă la un epitop care nu cuprinde aminoacidul V100 din SEQ ID NO:4.

În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT (de exemplu, un anticorp) se leagă la TIGIT cu o constantă de disociere (KD) de aproximativ 1µM sau mai mică, aproximativ 100nM sau mai mică, aproximativ 40nM sau mai mică, aproximativ 20nM sau mai mică, aproximativ 10nM sau mai mică, aproximativ 1nM sau mai mică, aproximativ 0,1nM sau mai mică, 50pM sau mai mică, 10pM sau mai mică, sau 1pM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 20nM sau mai mică. În unele realizări, un agent de legare TIGIT se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 10nM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 1nM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 0,5nM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 0,1nM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 50pM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 25pM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 10pM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 1pM sau mai mică. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT se leagă la ambele TIGIT uman şi TIGIT de şoarece cu o Kd de aproximativ 10nM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă la ambele TIGIT uman şi TIGIT de şoarece cu o Kd de aproximativ 1nM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă la ambele TIGIT uman şi TIGIT de şoarece cu o Kd de aproximativ 0,1nM sau mai mică. În unele cazuri, constanta de disociere a agentului de legare (de exemplu, un anticorp) la TIGIT este constanta de disociere determinată utilizând o proteină de fuziune TIGIT cuprinzând cel puţin o porţiune din domeniul extracelular al proteinei TIGIT imobilizată pe un cip Biacore. În unele cazuri, constanta de disociere a agentului de legare (de exemplu, un anticorp) la TIGIT este constanta de disociere determinată utilizând agentul de legare capturat cu un anticorp IgG anti-uman pe un cip Biacore şi o proteină TIGIT solubilă.

În unele cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT şi un al doilea situs de legare la antigen care se leagă specific la o a doua ţintă. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT este un agent bispecific care cuprinde un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT şi un al doilea situs de legare la antigen care se leagă specific la o a doua ţintă. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă atȃt la TIGIT cȃt şi la a doua ţintă cu o Kd de aproximativ 100nM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă atȃt la TIGIT cȃt şi la adoua ţintă cu o Kd de aproximativ 50nM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă atȃt la TIGIT cȃt şi la a doua ţintă cu o Kd de aproximativ 20nM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă atȃt la TIGIT cȃt şi la a doua ţintă cu o Kd de aproximativ 10nM sau mai mică. În unele cazuri, un agent de legare TIGIT se leagă atȃt la TIGIT cȃt şi la a doua ţintă cu o Kd de aproximativ 1nM sau mai mică. În unele cazuri, afinitatea unuia dintre situsurile de legare la antigen poate fi mai slabă decât afinitatea celuilalt situs de legare la antigen. De exemplu, KD a unui situs de legare a antigenului poate fi aproximativ 1nM şi KD a celui de al doilea situs de legare la antigen poate fi de aproximativ 10nM. În unele realizări, diferenţa de afinitate între cele două situsuri de legare la antigen poate fi de aproximativ 2 ori sau mai mult, de aproximativ 3 ori sau mai mult, de aproximativ 5 ori sau mai mult, de aproximativ 8 ori sau mai mult, de aproximativ 10 ori sau mai mult, de aproximativ 15 ori sau mai mult, de aproximativ 20 ori sau mai mult, de aproximativ 30 ori sau mai mult, de aproximativ 50 ori sau mai mult, sau de aproximativ 100 ori sau mai mult. Modularea afinităţii celor două situsuri de legare la antigen poate afecta activitatea biologică a anticorpului bispecific. De exemplu, scăderea afinităţii situsului de legare la antigen pentru TIGIT sau a doua ţintă, poate avea un efect dorit, de exemplu o toxicitate scăzută a agentului de legare şi/sau indice terapeutic crescut.

În anumite realizări ale invenţiei, anticorpul cum s-a descris aici se leagă la TIGIT uman cu o jumătate din concentraţia eficientă maximă (EC50) de aproximativ 1µM sau mai puţină, aproximativ 100nM sau mai puţină, aproximativ 40nM sau mai puţină, aproximativ 20nM sau mai puţină, aproximativ 10nM sau mai puţină, aproximativ 1nM sau mai puţină, sau aproximativ 0,1nM sau mai puţină. În anumite realizări, anticorpul descris aici se leagă la TIGIT uman cu o jumătate din concentraţia maximă eficientă (EC50) de aproximativ 1µM sau mai puţină, aproximativ 100nM sau mai puţină, aproximativ 40nM sau mai puţină, aproximativ 20nM sau mai puţină, aproximativ 10nM sau mai puţină, aproximativ 1nM sau mai puţină, sau aproximativ 0,1nM sau mai puţină.

În unele realizări, anticorpul este un anticorp recombinant. În unele realizări, anticorpul este un anticorp monoclonal. În unele realizări, anticorpul este un anticorp himeric. În unele realizări, anticorpul este un anticorp umanizat. În unele realizări, anticorpul este un anticorp uman. În unele realizări, anticorpul este un anticorp IgA, IgD, IgE, IgG, sau IgM. În anumite realizări, anticorpul este un anticorp IgG1. În anumite realizări, anticorpul este un anticorp IgG2. În unele realizări, anticorpul este un anticorp IgG4. În anumite realizări, anticorpul este un fragment de anticorp cuprinzând un situs de legare la antigen. În unele realizări, anticorpul este un anticorp bispecific sau un anticorp multispecific. În unele realizări, anticorpul este un anticorp monovalent. În unele realizări, anticorpul este un anticorp monospecific. În unele realizări, anticorpul este un anticorp bivalent. În unele realizări, anticorpul este conjugat la un radical citotoxic. În unele realizări, anticorpul este izolat. În unele realizări, anticorpul este substanţial pur.

În unele realizări, anticorpii sunt anticorpi policlonali. Anticorpii policlonali pot fi preparaţi prin orice metodă cunoscută. În unele realizări, anticorpii policlonali sunt produşi prin imunizarea unui animal (de exemplu, un iepure, şobolan, şoarece, capră, măgar) cu un antigen de interes (de exemplu, un fragment purificat de peptidă, proteină recombinantă cu lungime completă, sau proteină de fuziune) utilizând injecţii multiple subcutanate sau intraperitoneale. Antigenul poate fi conjugat opţional la un purtător cum ar fi hemocianină din Megathura crenulata (KLH) sau albumină din ser. Antigenul (cu sau fără un purtător proteină) este diluat în soluţie sterilă salină şi combinat uzual cu un adjuvant (de exemplu, adjuvant Freund complet sau incomplet) pentru a forma o emulsie stabilă. După o perioadă suficientă de timp, anticorpii policlonali sunt recuperaţi din animalul imunizat, uzual din sânge sau ascite. Anticorpii policlonali pot fi purificaţi din ser sau ascite în conformitate cu metodele standard din domeniu care includ, dar nu se limitează la, cromatografie de afinitate, cromatografie cu schimb de ioni, electroforeză în gel, şi dializă.

În unele realizări, anticorpul este un anticorp monoclonal. Anticorpii monoclonali pot fi preparaţi utilizând metode hibridom cunoscute unei persoane calificate în domeniu. În unele realizări, utilizând metoda hibridom, un şoarece, şobolan, iepure, hamster, sau alt animal gazdă adecvat, este imunizat cum s-a descris mai sus pentru a declanşa producţia anticorpilor care se leagă specific la antigenul de imunizare. În unele realizări, limfocitele pot fi imunizate in vitro. În unele realizări, antigenul de imunizare poate fi o proteină umană sau un fragment al acesteia. În unele realizări, antigenul de imunizare poate fi o proteină de şoarece sau un fragment al acesteia.

După imunizare, limfocitele sunt izolate şi fuzionate cu o linie celulară adecvată de mielom utilizând, de exemplu, polietilen glicol. Celulele hibridom sunt selectate utilizând mediu specializat aşa cum este cunoscut în domeniu şi limfocitele nefuzionate şi celulele de mielom nu supravieţuiesc procesului de selecţie. Hibridoamele care produc anticorpi monoclonali direcţionaţi specific împotriva antigenului ales pot fi identificate printr-o varietate de metode incluzând, dar fără a se limita la, imunoprecipitare, imunopătare, şi teste de legare in vitro (de exemplu, citometrie de flux, FACS, ELISA, şi radioimunotest). Hibridoamele pot fi propagate fie în cultura in vitro utilizând metode standard sau fie in vivo ca tumori ascite la un animal. Anticorpii monoclonali pot fi purificaţi din mediul de cultură sau fluidul de ascite în conformitate cu metodele standard din domeniu incluzând, dar fără a se limita la, cromatografie de afinitate, cromatografie cu schimb de ioni, electroforeză în gel, şi dializă.

În anumite realizări, anticorpii monoclonali pot fi făcuţi utilizând tehnici ADN recombinante după cum este cunoscut unei persoane calificate în domeniu. Polinucleotidele care codifică un anticorp monoclonal sunt izolate de celulele B mature sau celulele hibridom, cum ar fi prin RT-PCR utilizând iniţiatori de oligonucleotide care amplifică specific genele care codifică lanţurile grele şi uşoare ale anticorpului, şi secvenţa lor este determinată utilizând tehnici standard. Polinucleotidele izolate care codifică lanţurile grele şi uşoare sunt apoi clonate în vectori de expresie adecvaţi care produc anticorpii monoclonali când sunt transfectaţi în celule gazdă cum ar fi E. coli, celule COS simian, celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), sau celule de mielom care nu produc altfel proteine de imunoglobulină.

În anumite alte realizări, anticorpii monoclonali recombinanţi, sau fragmentele acestora, pot fi izolate din bibliotecile de afişare pe bacteriofagi care exprimă domeniile variabile sau regiunile CDR ale unei specii dorite.

Polinucleotidele care codifică un anticorp monoclonal pot fi modificate, de exemplu, prin utilizarea tehnologiei ADN-ului recombinant pentru a genera anticorpi alternativi. În unele realizări, domeniile constante ale lanţului uşor şi lanţului greu ale, de exemplu, unui anticorp monoclonal de şoarece pot fi substituite cu regiuni constante ale, de exemplu, unui anticorp uman pentru a genera un anticorp himeric, sau pentru o polipeptidă non-imunoglobulină pentru a genera un anticorp de fuziune. În unele realizări, regiunile constante sunt trunchiate sau îndepărtate pentru a genera un fragment dorit de anticorp al unui anticorp monoclonal. Mutageneza direcţionată la situs sau cu densitate mare a regiunii variabile poate fi utilizată pentru a optimiza specificitatea, afinitatea, etc. ale unui anticorp monoclonal.

În unele realizări, anticorpul este un anticorp umanizat. De obicei, anticorpii umanizaţi sunt imunoglobuline umane în care resturile de aminoacizi ale regiunilor CDR sunt înlocuite cu resturi de aminoacizi din regiunile CDR ale unei specii non-umane (de exemplu, şoarece, şobolan, iepure, hamster, etc.) care au specificitatea, afinitatea, şi/sau capacitatea de legare dorite utilizând metode cunoscute unei persoane calificate în domeniu. În unele realizări, unele din resturile de aminoacizi ale regiunii cadru variabile dintr-o imunoglobulină umană sunt înlocuite cu resturile de aminoacizi corespunzătoare dintr-un anticorp dintr-o specie non-umană. În unele realizări, un anticorp umanizat poate fi modificat suplimentar prin substituţia resturilor suplimentare fie în regiunea cadru variabilă şi/sau fie în resturile non-umane înlocuite pentru a rafina suplimentar şi optimiza specificitatea, afinitatea, şi/sau capacitatea anticorpului. În general, un anticorp umanizat va cuprinde regiunile domeniului variabil conţinând toate, sau substanţial toate, regiunile CDR care corespund imunoglobulinei non-umane în timp ce toate, sau substanţial toate, regiunile cadru sunt cele dintr-o secvenţă de imunoglobulină umană. În unele realizări, regiunile cadru sunt cele dintr-o secvenţă consens de imunoglobulină umană. În unele realizări, un anticorp umanizat poate cuprinde de asemenea cel puţin o porţiune a unei regiuni constante sau domeniu (Fc) de imunoglobulină, de obicei cea a unei imunoglobuline umane. În anumite realizări, astfel de anticorpi umanizaţi sunt utilizaţi terapeutic deoarece ei pot reduce antigenicitatea şi răspunsurile HAMA (anticorp anti-şoarece uman) când se administrează unui subiect uman.

În anumite realizări, anticorpul este un anticorp uman. Anticorpii umani pot fi preparaţi direct utilizând diferite tehnici cunoscute în domeniu. În unele realizări, anticorpii umani pot fi generaţi din limfocite B umane imortalizate imunizate in vitro sau din limfocite izolate dintr-un individ imunizat. În oricare caz, celulele care produc un anticorp direcţionat împotriva unui antigen ţintă pot fi generate şi izolate. În unele realizări, anticorpul uman poate fi selectat dintre o bibliotecă de afişare pe bacteriofagi, unde acea bibliotecă de afişare pe bacteriofagi exprimă anticorpi umani. Alternativ, tehnologia de afişare pe bacteriofagi poate fi utilizată pentru a produce anticorpi umani şi fragmente de anticorpi in vitro, din repertoriile genetice ale domeniului variabil de imunoglobulină de la donatori neimunizaţi. Tehnicile pentru generarea şi utilizarea bibliotecilor cu afişare bacteriofagă de anticorpi sunt bine cunoscute în domeniu. Odată ce anticorpii sunt identificaţi, strategiile de maturarea afinităţii cunoscute în domeniu, incluzând dar fără a se limita la, amestecarea catenei şi mutageneza direcţionată la situs, pot fi utilizate pentru a genera anticorpi umani cu afinitate mai ridicată.

În unele realizări, anticorpii umani pot fi făcuţi la şoarecii transgenici care conţin loci de imunoglobulină umană. După imunizare, aceşti şoareci sunt capabili să producă întregul repertoriu de anticorpi umani în absenţa producţiei de imunoglobulină endogenă.

În unele realizări, anticorpul este un anticorp bispecific. Astfel, această invenţie cuprinde anticorpi bispecifici care recunosc specific TIGIT şi cel puţin o ţintă suplimentară. Anticorpii bispecifici sunt capabili de recunoaşterea specifică şi legarea la cel puţin doi antigeni sau epitopi diferiţi. Epitopii diferiţi pot fi fie în aceeaşi moleculă (de exemplu, doi epitopi pe TIGIT) sau fie pe molecule diferite (de exemplu, un epitop pe TIGIT şi un epitop pe o proteină diferită). În unele realizări, un anticorp bispecific are potenţă sporită în comparaţie cu un anticorp individual sau cu o combinaţie de mai mult de un anticorp. În unele realizări, un anticorp bispecific are toxicitate redusă în comparaţie cu un anticorp individual sau cu o combinaţie de mai mult de un anticorp. Este cunoscut celor calificaţi în domeniu că orice agent terapeutic poate avea farmacocinetici (PK) unice (de exemplu, perioada de înjumătăţire în circulaţie). În unele realizări, un anticorp bispecific are abilitatea de a sincroniza PK a doi agenţi de legare activi în care cei doi agenţi de legare individuali au profile PK diferite. În unele realizări, un anticorp bispecific are abilitatea de a concentra acţiunile a doi agenţi într-o zonă comună (de exemplu, o tumoare şi/sau micromediu tumoral). În unele realizări, un anticorp bispecific are abilitatea de a concentra acţiunile a doi agenţi la o ţintă comună (de exemplu, o tumoare sau o celulă tumorală). În unele realizări, un anticorp bispecific are abilitatea de a ţinti acţiunile a doi agenţi până la mai mult de o cale sau funcţie biologică. În unele realizări, un anticorp bispecific are abilitatea de a ţinti două celule diferite şi de a le aduce mai aproape împreună (de exemplu, o celulă imună şi o celulă tumorală).

În unele realizări, anticorpul bispecific este un anticorp monoclonal. În unele realizări, anticorpul bispecific este un anticorp umanizat. În unele realizări, anticorpul bispecific este un anticorp uman. În unele realizări, anticorpul bispecific este un anticorp IgG1. În unele realizări, anticorpul bispecific este un anticorp IgG2. În unele realizări, anticorpul bispecific este un anticorp IgG4. În unele realizări, anticorpul bispecific are o toxicitate şi/sau efecte secundare scăzute. În unele realizări, anticorpul bispecific are o toxicitate şi/sau efecte secundare scăzute în comparaţie cu un amestec din cei doi anticorpi individuali sau cu anticorpii ca agenţi singuri. În unele realizări, anticorpul bispecific are un indice terapeutic crescut. În unele realizări, anticorpul bispecific are un indice terapeutic crescut în comparaţie cu un amestec din cei doi anticorpi individuali sau cu anticorpii ca agenţi singuri.

În unele realizări, anticorpii pot recunoaşte specific şi se pot lega la TIGIT uman precum şi la al doilea antigen ţintă, cum ar fi o moleculă efectoare pe o celulă imună (de exemplu, CD2, CD3, CD28, CTLA4, PD-1, PD-L1, CD80, sau CD86) sau pe un receptor Fc (de exemplu, CD64, CD32, sau CD16) astfel încât concentrează mecanismele de apărare celulară la celula care exprimă şi/sau produce primul antigen ţintă. În unele realizări, anticorpii pot fi utilizaţi pentru a direcţiona agenţii citotoxici la celulele care exprimă un anumit antigen ţintă. Aceşti anticorpi posedă un braţ de legare la antigen şi un braţ care se leagă la un agent citotoxic sau la un chelator radionuclid, cum ar fi EOTUBE, DPTA, DOTA, sau TETA.

Tehnicile pentru fabricarea anticorpilor bispecifici sunt cunoscute de către cei calificaţi în domeniu. În unele realizări, anticorpii bispecifici cuprind regiuni constante ale lanţului greu cu modificări în aminoacizii care sunt o parte din interfaţa între cele două lanţuri grele. În unele realizări, anticorpii bispecifici pot fi generaţi utilizând o strategie „noduri-în-găuri«. În unele cazuri, terminologia „noduri« şi „găuri« este înlocuită cu termenii „protuberanţe« şi „cavităţi«. În unele realizări, anticorpii bispecifici pot cuprinde variante de regiuni balama incapabile de formarea legături disulfură între lanţurile grele. În unele realizări, modificările pot cuprinde modificări în aminoacizi care conduce la interacţiuni electrostatice alterate. În unele realizări, modificările pot cuprinde modificări în aminoacizi care conduc la interacţiuni hidrofobe/hidrofile alterate.

Anticorpii bispecifici pot fi anticorpi intacţi sau fragmente de anticorp cuprinzând situsuri de legare la antigen. Anticorpii cu mai mult de două valenţe sunt de asemenea avuţi în vedere. De exemplu, se pot prepara anticorpi trispecifici. Astfel, în anumite realizări anticorpii la TIGIT sunt multispecifici.

În anumite realizări, anticorpii (sau alte polipeptide) descrişi aici pot fi monospecifici. În anumite realizări, fiecare dintre unul sau mai multe situsuri de legare la antigen pe care le conţine un anticorp sunt capabile de legare (sau se leagă) la epitopul omolog pe TIGIT.

În anumite realizări, anticorpul este un fragment de anticorp. Fragmentele de anticorp pot avea funcţii sau capabilităţi diferite faţă de anticorpii intacţi; de exemplu, fragmentele de anticorp pot avea penetrare tumorală crescută. Sunt cunoscute diferite tehnici pentru producţia de fragmente de anticorp incluzând, dar fără a se limita la, digestia proteolitică de anticorpi intacţi. În unele realizări, fragmentele de anticorp include un fragment F(ab')2 produs prin digestia pepsinei a unei molecule de anticorp. În unele realizări, fragmentele de anticorp includ un fragment Fab generat prin reducerea punţii disulfură a unui fragment F(ab')2. În alte realizări, fragmentele de anticorp includ un fragment Fab generat prin tratamentul moleculei de anticorp cu papaină şi un agent reducător. În anumite realizări, fragmentele de anticorp sunt produse prin metode recombinante. În unele realizări, fragmentele de anticorp includ fragmente Fv sau Fv monocatenare (scFv). Fragmentele de anticorp Fab, Fv, şi scFv pot fi exprimate în, şi secretate din, E. coli sau alte celule gazdă, permiţând producţia de cantităţi mari din aceste fragmente. În unele realizări, fragmentele de anticorp sunt izolate din biblioteci de afişare bacteriofage ale anticorpilor cum s-a discutat aici. De exemplu, metodele pot fi utilizate pentru construcţia bibliotecilor de expesie Fab pentru a permite identificarea rapidă şi eficientă a fragmentelor Fab monoclonale cu specificitatea dorită pentru TIGIT sau derivaţi, fragmente, analogi sau omologi ai acestuia. În unele realizări, fragmentele de anticorp sunt fragmente liniare de anticorp. În anumite realizări, fragmentele de anticorp sunt monospecifice sau bispecifice. În anumite realizări, anticorpul este un scFv. Pot fi utilizate diferite tehnici pentru producţia de anticorpi monocatenari specifici la TIGIT.

În unele realizări, în special în cazul fragmentelor de anticorp, un anticorp este modificat pentru a altera (de exemplu, creşte sau scade) perioada sa de înjumătăţire în ser. Acest lucru poate fi obţinut, de exemplu, prin încorporarea unui receptor de salvare care leagă epitopul în fragmentul de anticorp prin mutaţia regiunii adecvate în fragmentul de anticorp sau prin încorporarea epitopului într-o etichetă de peptidă care este apoi fuzionată la fragmentul de anticorp fie la capăt sau fie în mijloc (de exemplu, prin sinteză ADN sau peptidică).

Anticorpii heteroconjugaţi sunt de asemenea în domeniul prezentei invenţii. Anticorpii heteroconjugaţi sunt compuşi din doi anticorpi covalenţi îmbinaţi. Astfel de anticorpi au fost propuşi, de exemplu, să ţintească celule imune la celulele nedorite. Se are de asemenea în vedere că anticorpii heteroconjugaţi pot fi preparaţi in vitro utilizând metode cunoscute în chimia proteinei sintetice, incluzându-le pe cele care implică agenţi de reticulare. De exemplu, imunotoxinele pot fi construite utilizând o reacţie de schimb de disulfură sau prin formarea unei legături tioeter. Exemple de reactivi adecvaţi în acest scop includ iminotiolatele şi metil-4-mercaptobutirimidatele.

În scopurile prezentei invenţii, ar trebui să se aprecieze că anticorpii modificaţi pot cuprinde orice tip de regiune variabilă care prevede asocierea anticorpului cu ţinta (adică, TIGIT uman). În această privinţă, regiunea variabilă poate cuprinde sau poate fi derivată din orice tip de mamifer care poate fi indus pentru a monta un răspuns umoral şi genera imunoglobulină împotriva antigenului dorit. Ca atare, regiunea variabilă a anticorpului modificat poate fi, de exemplu, de origine umană, murină, de şobolan, iepure, primată non-umană (de exemplu maimuţă cynomolguss, macaq, etc.), sau iepure. În unele realizări, ambele regiuni variabile şi constante ale imunoglobulinei modificate sunt umane. În alte realizări, regiunile variabile ale anticorpilor compatibili (derivate uzual dintr-o sursă non-umană) pot fi modificate genetic sau adaptate specific pentru a îmbunătăţi proprietăţile de legare sau reduce imunogenicitatea moleculei. În această privinţă, regiunile variabile utile din prezenta invenţie pot fi umanizate sau altfel modificate prin includerea de secvenţe importate de aminoacizi.

În anumite realizări, domeniile variabile în ambele lanţuri grele şi uşoare, sunt alterat prin cel puţin o înlocuire parţială a unuia sau mai multor regiuni CDR şi, dacă este necesar, prin înlocuirea parţială a regiunii cadru şi modificarea şi/sau alterarea secvenţei. Deşi regiunile CDR pot fi derivate dintr-un anticorp de aceeaşi clasă sau chiar subclasă ca anticorpul din care sunt derivate regiunile cadru, se are în vedere că regiunile CDR pot fi derivate dintr-un anticorp de clasă diferită şi adesea dintr-un anticorp dintr-o specie diferită. Poate să nu fie necesară înlocuirea tuturor regiunilor CDR cu toate regiunile CDR de la o regiune donatoare variabilă pentru a transfera capacitatea de legare la antigen a unui domeniu variabil la altul. Mai degrabă, ar putea fi necesar numai transferul acelor resturi care sunt necesare pentru a menţine activitatea situsului de legare la antigen.

În ciuda alterărilor la regiunea variabilă, cei calificaţi în domeniu vor aprecia că anticorpii modificaţi ai acestei invenţii vor cuprinde anticorpi (de exemplu, anticorpi cu lungime completă sau fragmente imunoreactive ale acestora) în care cel puţin o fracţiune dintr-unul sau mai multe domenii ale regiunii constante au fost şterse sau altfel alterate astfel încât să furnizeze caracteristicile biochimice dorite cum ar fi localizarea tumorală crescută sau perioada de înjumătăţire crescută în ser când se compară cu un anticorp de aproximativ aceeaşi imunogenicitate cuprinzând o regiune constantă nativă sau nealterată. În unele realizări, regiunea constantă a anticorpului modificat va cuprinde o regiune constantă umană. Modificările în regiunea constantă compatibile cu această invenţie cuprind adăugări, deleţii sau substituţii dintr-unul sau mai mulţi aminoacizi în unul sau mai multe domenii. Anticorpii modificaţi divulgaţi aici pot cuprinde alterări sau modificări la unul sau mai multe din cele trei domenii constante ale lanţului greu (CHI, CH2 sau CH3) şi/sau la domeniul constant al lanţului uşor (CL). În unele realizări, unul sau mai multe domenii sunt parţial sau în întregime şterse din regiunile constante ale anticorpului modificat. În unele realizări, anticorpii modificaţi vor cuprinde construcţii sau variante ale domeniului şters în care întregul domeniu CH2 a fost îndepărtat (construcţii ΔCH2). În unele realizări, domeniul regiunii constante omise este înlocuit cu un scurt distanţier aminoacid (de exemplu, 10 resturi de aminoacid) care furnizează o oarecare flexibilitate moleculară împărtăşită de obicei cu regiunea constantă absentă.

În unele realizări, anticorpii modificaţi sunt modificaţi genetic pentru a fuziona cu domeniul CH3 direct la regiunea balama a anticorpului. În alte realizări, o peptidă distanţier este inserată între regiunea balama şi domeniile CH2 şi/sau CH3 modificate. De exemplu, pot fi exprimate construcţii în care domeniul CH2 a fost şters şi domeniul CH3 rămas (modificat sau nemodificat) este îmbinat la regiunea balama cu un distanţier de 5-20 aminoacizi. Un astfel de distanţier poate fi adăugat pentru a asigura că elementele regulatoare ale domeniului constant rămân libere şi accesibile sau că regiunea balama rămâne flexibilă. Totuşi, ar trebui să se observe că distanţierele aminoacid se pot, în unele cazuri, dovedi a fi imunogenice şi provoacă un răspuns imun nedorit împotriva construcţiei. Corespunzător, în anumite realizări, orice distanţier adăugat la construcţie va fi relativ non-imunogenic astfel încât să menţină calităţile biologice dorite ale anticorpului modificat.

În unele realizări, anticorpii modificaţi pot avea numai o deleţie parţială a unui domeniu constant sau substituţia câtorva sau chiar a unui singur aminoacid. De exemplu, mutaţia unui singur aminoacid în zonele selectate ale domeniului CH2 poate fi suficientă pentru a reduce substanţial legarea la Fc. În unele realizări, mutaţia unui singur aminoacid în zonele selectate ale domeniului CH2 poate fi suficientă pentru a reduce substanţial legarea la Fc şi creşte localizarea celulei canceroase şi/sau penetrării tumorale. În mod similar, se poate dori simpla ştergere a unei părţi dintr-unul sau mai multe domenii ale regiunii constante care controlează o funcţie efectoare specifică (de exemplu legarea complementului C1q) pentru a fi modulată. Astfel de deleţii parţiale ale regiunilor constante pot îmbunătăţi caracteristicile selectate ale anticorpului (perioadă de înjumătăţire în ser) în timp ce lasă alte funcţii dorite asociate cu domeniul regiunii constante a subiectului intacte. Mai mult, aşa cum s-a menţionat mai sus, regiunile constante ale anticorpilor divulgaţi pot fi modificate prin mutaţia sau substituţia unuia sau mai multor aminoacizi care sporesc profilul construcţiei rezultate. În această privinţă, poate fi posibilă întreruperea activităţii furnizate de un situs de legare conservat (de exemplu, legarea Fc) în timp ce se menţine substanţial configuraţia şi profilul imunogenic al anticorpului modificat. În anumite realizări, anticorpii modificaţi cuprind adăugarea unuia sau mai multor aminoacizi la regiunea constantă pentru a spori caracteristicile dorite cum ar fi scăderea sau creşterea funcţiilor efectoare sau asigurarea mai multor situsuri de ataşare a citotoxinei sau carbohidratului.

Este cunoscut în domeniu că regiunea constantă mediază câteva funcţii efectoare. De exemplu, legarea componentei C1 a complementului la regiunea Fc a anticorpilor IgG sau IgM (legare la antigen) activează sistemul complement. Activarea complementului este importantă în opsonizarea şi lizarea patogenilor celulari. Activarea complementului stimulează de asemenea răspunsul inflamator şi poate fi de asemenea implicată în hipersensibilitatea autoimună. În plus, regiunea Fc a unui anticorp se poate lega la o celulă care exprimă un receptor Fc (FcR). Există un număr de receptori Fc care sunt specifici pentru diferite clase de anticorpi, incluzând IgG (receptori gama), IgE (receptori epsilon), IgA (receptori alfa) şi IgM (receptori mu). Legarea anticorpului la receptorii Fc pe suprafe€tele celulare declanşează un număr de răspunsuri biologice importante şi diverse incluzând înghiţirea şi distrugere particulelor acoperite cu anticorpi, eliminarea complecşilor imunitari, lizarea celulelor ţintă acoperite cu anticorpi de către celulele ucigaşe (denumită citotoxicitate celulară dependentă de anticorp sau ADCC), eliberează mediatori inflamatorii, transferul placental, şi controlul producţiei de imunoglobulină.

În anumite realizări, anticorpii modificaţi asigură funcţii efectoare alterate care, în schimb, afectează profilurile biologice ale anticorpului administrat. De exemplu, în unele realizări, deleţia sau inactivarea (prin mutaţii punctuale sau alte mijloace) unui domeniu al regiunii constante poate reduce legarea la receptorul Fc a anticorpului modificat în circulaţie. În unele realizări, deleţia sau inactivarea (prin mutaţii punctuale sau alte mijloace) unui domeniu al regiunii constante poate reduce legarea la receptorul Fc al anticorpului modificat în circulaţie, crescȃnd prin urmare localizarea celulei canceroase şi/sau penetrarea tumorală. În alte realizări, modificările regiunii constante cresc perioada de înjumătăţire în ser a anticorpului. În alte realizări, modificările regiunii constante reduc perioada de înjumătăţire în ser a anticorpului. În unele realizări, regiunea constantă este modificată pentru a elimina legăturile disulfură sau radicalii oligozaharidă. Modificările la regiunea constantă în conformitate cu această invenţie pot fi făcute uşor utilizând tehnici de modificare genetică biochimice sau moleculare bine cunoscute.

În anumite cazuri din divulgare, un agent de legare TIGIT care este un anticorp, nu are una sau mai multe funcţii efectoare. De exemplu, în unele cazuri, anticorpul nu are nici o activitate ADCC, şi/sau nici o citotoxicitate dependentă de activitatea complementului (CDC). În anumite cazuri, anticorpul nu se leagă la un receptor Fc şi/sau factori complementari. În anumite cazuri, anticorpul nu are nici o funcţie efectoare.

Prezenta divulgare cuprinde suplimentar variante şi echivalenţi care sunt substanţial omologi anticorpilor recombinanţi, monoclonali, himerici, umanizaţi, şi umani, sau fragmentelor de anticorp ale acestora, descrise aici. Aceste variante pot conţine, de exemplu, mutaţii de substituţie conservative, adică substituţia unuia sau mai multor aminoacizi cu aminoacizi similari.

Prezenta divulgare furnizează metode pentru producerea unui anticorp care se leagă la TIGIT, incluzând anticorpi bispecifici care se leagă specific atȃt la TIGIT cȃt şi la o a doua ţintă. În unele cazuri, metoda pentru producerea un anticorp care se leagă la TIGIT cuprinde utilizarea tehnicilor hibridom. În unele cazuri, este prevăzută o metodă pentru producerea unui anticorp care se leagă la TIGIT uman. În unele cazuri, metoda cuprinde utilizarea unei polipeptide cuprinzând domeniul extracelular al TIGIT de şoarece sau un fragment al acestuia ca un antigen. În unele cazuri, metoda cuprinde utilizarea unei polipeptide cuprinzând domeniul extracelular al TIGIT uman sau un fragment al acestuia ca un antigen. În unele cazuri, metoda cuprinde utilizarea unei polipeptide cuprinzând aminoacizii 29-148 de TIGIT de şoarece ca un antigen. În unele cazuri, metoda cuprinde utilizarea unei polipeptide cuprinzând aminoacizii 22-141 de TIGIT uman ca un antigen. În unele cazuri, metoda cuprinde utilizarea unei polipeptide cuprinzând aminoacizii 29-148 din SEQ ID NO:1 ca un antigen. În unele cazuri, metoda cuprinde utilizarea unei polipeptide cuprinzând aminoacizii 22-141 din SEQ ID NO:4 ca un antigen. În unele cazuri, metoda cuprinde utilizarea unei polipeptide cuprinzând SEQ ID NO:3 sau un fragment al acesteia ca un antigen. În unele cazuri, metoda cuprinde utilizarea unei polipeptide cuprinzând SEQ ID NO:6 sau un fragment al acesteia ca un antigen. În unele cazuri, metoda de generare a unui anticorp care se leagă la TIGIT cuprinde selecţia unei biblioteci de afişare pe bacteriofagi. În unele cazuri, metoda de generare a unui anticorp care se leagă la TIGIT cuprinde selecţia unei biblioteci cu afişare pe bacteriofagi umane. Prezenta invenţie mai furnizează metode de identificarea unui anticorp care se leagă la TIGIT. În unele cazuri, anticorpul este identificat prin selecţie FACS pentru legare la TIGIT sau un fragment al acestuia. În unele cazuri, anticorpul este identificat prin selecţie utilizând ELISA pentru legare la TIGIT, sau un fragment al acestuia. În unele cazuri, anticorpul este identificat prin selecţie prin FACS pentru blocarea legării TIGIT la PVR.

În unele cazuri, o metodă de generare a unui anticorp la TIGIT cuprinde imunizarea unui mamifer cu o polipeptidă cuprinzând aminoacizii 29-148 de TIGIT de şoarece. În unele cazuri, o metodă de generare a unui anticorp la TIGIT cuprinde imunizarea unui mamifer cu o polipeptidă cuprinzând aminoacizii 22-141 de TIGIT uman. În unele cazuri, o metodă de generare a unui anticorp la TIGIT cuprinde imunizarea unui mamifer cu o polipeptidă cuprinzând un fragment (de exemplu, o porţiune) din aminoacizii 29-148 de TIGIT de şoarece. În unele cazuri, o metodă de generare a un anticorp la TIGIT cuprinde imunizarea unui mamifer cu o polipeptidă cuprinzând un fragment din aminoacizii 22-141 de TIGIT uman. În unele cazuri, metoda cuprinde în plus izolarea anticorpilor sau a celulelor care produc anticorpi de mamifer. În unele cazuri, o metodă de generare a unui anticorp monoclonal care se leagă la TIGIT cuprinde: (a) imunizarea unui mamifer cu o polipeptidă cuprinzând un fragment din aminoacizii 29-148 de TIGIT de şoarece; (b) izolarea celulelor care produc anticorpi de mamiferul imunizat; şi (c) fuzionarea celulelor care produc anticorpul cu celulele unei linii celulare de mielom pentru a forma celule hibridom. În unele cazuri, o metodă de generare a unui anticorp monoclonal care se leagă la TIGIT cuprinde: (a) imunizarea unui mamifer cu o polipeptidă cuprinzând un fragment din aminoacizii 22-141 de TIGIT uman; (b) izolarea celulelor care produc anticorpi de mamiferul imunizat; şi (c) fuzionarea celulelor care produc anticorpi cu celulele unei linii celulare de mielom pentru a forma celule hibridom. În unele cazuri, metoda cuprinde în plus (d) selectarea unei celule hibridom care exprimă un anticorp care se leagă la TIGIT. În anumite cazuri, mamiferul este un şoarece. În unele cazuri, mamiferul este un şobolan. În unele cazuri, mamiferul este un iepure. În unele cazuri, anticorpul este selectat utilizând o polipeptidă cuprinzând aminoacizii 29-148 sau un fragment al acestora de TIGIT de şoarece. În unele cazuri, anticorpul este selectat utilizând o polipeptidă cuprinzând aminoacizii 22-141 sau un fragment al acestora de TIGIT uman. În unele cazuri, anticorpul se leagă atȃt la TIGIT uman cȃt şi la TIGIT de şoarece. În unele cazuri, anticorpul nu se leagă la TIGIT de şoarece. În unele cazuri, anticorpul nu se leagă la TIGIT de maimuţă cynomolgus. În unele cazuri, anticorpul nu se leagă la TIGIT de maimuţă rhesus. În unele cazuri, anticorpul nu se leagă la TIGIT de şobolan. În unele cazuri, anticorpul se leagă la TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de şoarece. În unele cazuri, anticorpul se leagă TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de maimuţă cynomolgus. În unele cazuri, anticorpul se leagă la TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de maimuţă rhesus. În unele cazuri, anticorpul se leagă la TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de şobolan.

În unele cazuri, o metodă pentru producerea unui anticorp care se leagă la TIGIT cuprinde identificarea unui anticorp utilizând o moleculă heterodimerică legată la o membrană cuprinzând un singur situs de legare la antigen. În unele realizări nelimitative, anticorpul este identificat utilizând metodele şi polipeptidele descrise în cererea de brevet internaţional WO 2011/100566.

În unele cazuri, o metodă pentru producerea unui anticorp care se leagă la TIGIT cuprinde selecţia unei biblioteci care exprimă anticorpi. În unele cazuri, biblioteca care exprimă anticorpi este o bibliotecă de afişare pe bacteriofagi. În unele cazuri, selecţia cuprinde rotirea panoramică. În unele cazuri, biblioteca care exprimă anticorpi este bibliotecă de celule de mamifer. În unele cazuri, biblioteca care exprimă anticorpi este selectată utilizând aminoacizii 29-148 de TIGIT de şoarece sau un fragment al acestuia. În unele cazuri, biblioteca care exprimă anticorpi este selectată utilizând aminoacizii 22-141 de TIGIT uman sau un fragment al acestuia. În unele cazuri, anticorpul identificat în selecţie se leagă atȃt la TIGIT uman cȃt şi la TIGIT de şoarece. În unele cazuri, anticorpul identificat în selecţie este un antagonist TIGIT.

În unele cazuri, anticorpul generat prin metodele descrise aici este un antagonist TIGIT. În unele cazuri, anticorpul generat prin metodele descrise aici inhibă semnalizarea TIGIT. În unele cazuri, anticorpul generat prin metodele descrise aici inhibă fosforilarea TIGIT.

În anumite cazuri, anticorpii descrişi aici sunt izolaţi. În anumite cazuri, anticorpii descrişi aici sunt substanţial puri.

Anticorpii din prezenta invenţie pot fi testaţi pentru legare specifică prin orice metodă cunoscută în domeniu. Imunotestele care pot fi utilizate includ, dar nu sunt limitate la, sisteme de testare competitive şi necompetitive utilizând tehnici cum ar fi analiza Biacore, analiza FACS, imunofluorescenţă, imunocitochimie, analiză d pată Western, radioimunotest, ELISA, imunotest „sandwich«, test de imunoprecipitare, reacţie de precipitare, reacţie de precipitare a difuziei în gel, test de imunodifuzie, test de aglutinare, test de fixare a complementului, test imunoradiometric, imunotest fluorescent, şi imunotest de proteină A. Astfel de teste sunt de rutină şi sunt bine cunoscute în domeniu (vezi, de exemplu, Ausubel şi colab., Editors, 1994-prezent, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY).

Într-un exemplu nelimitativ, selecţia pentru legarea specifică a unui anticorp la TIGIT uman poate fi determinată utilizând ELISA. Un ELISA cuprinde prepararea antigenului (de exemplu, TIGIT sau un fragment al acestuia), acoperirea godeurilor unei plăci de microtitrare cu 96 de godeuri cu antigen, adăugarea anticorpilor de testare conjugaţi la un compus detectabil cum ar fi un substrat enzimatic (de exemplu peroxidază din hrean sau fosfatază alcalină) în godeu, incubarea pe o perioadă de timp, şi detectarea prezenţei unui anticorp legat la antigen. În unele realizări, anticorpii de testare nu sunt conjugaţi la un compus detectabil, dar în schimb se adaugă la godeuri un anticorp secundar care recunoaşte anticorpul (de exemplu, un anticorp anti-Fc) şi este conjugat la un compus detectabil. În unele realizări, în locul acoperirii godeului cu antigen, anticorpii de testare pot fi acoperiţi pe godeuri, antigenul (de exemplu, TIGIT) se adaugă la godeuri, urmat de un anticorp secundar conjugat la un compus detectabil. O persoană calificată în domeniu ar avea cunoştinţe despre parametrii care pot fi modificaţi pentru a creşte semnalul detectat precum şi alte variaţii ale ELISA cunoscute în domeniu.

Într-un alt exemplu nelimitativ, legarea specifică a unui anticorp la TIGIT poate fi determinată utilizând FACS. Un test de selecţie FACS poate cuprinde generarea unei construcţii ADNc care exprimă un antigen ca proteină cu lungime completă (TIGIT) sau ca proteină de fuziune (de exemplu, TIGIT-CD4TM), transfectȃnd construcţia în celule, care exprimă antigenul pe suprafaţa celulelor, amestecȃnd anticorpii testaţi cu celulele transfectate, şi incubȃnd pe o perioadă de timp. Celulele legate prin anticorpii de test pot fi identificate utilizând un anticorp secundar conjugat la un compus detectabil (de exemplu, anticorp anti-Fc conjugat PE) şi un citometru de flux. O persoană calificată în domeniu ar avea cunoştinţe despre parametrii care pot fi modificaţi pentru a optimiza semnalul detectat precum şi alte variaţii ale FACS care pot spori selecţia (de exemplu, selecţia pentru anticorpi de blocare).

Afinitatea de legare a unui anticorp sau alt agent de legare la un antigen (de exemplu, TIGIT) şi rata de oprire a unei interacţiuni anticorp-antigen poate fi determinată prin teste de legare competitive. Un exemplu al unui test de legare competitiv este un radioimunotest cuprinzând incubarea antigenului etichetat (de exemplu, 3H sau 125I-TIGIT), sau fragment sau variantă a acestuia, cu anticorpul de interes în prezenţa creşterii cantităţi dintr-un antigen etichetat urmată de detecţia anticorpului legat la antigenul etichetat. Afinitatea anticorpului pentru antigen şi rata de oprire a legării pot fi determinate din date prin analiză grafică Scatchard. În unele realizări, este utilizată analiza cinetică Biacore pentru a determina ratele de pornire şi oprire ale legării anticorpilor sau agenţilor care se leagă la un antigen (de exemplu, TIGIT). În unele realizări, analiza cinetică Biacore cuprinde analiza legării şi disocierii anticorpilor de pe cipurile cu antigen imobilizat (de exemplu, TIGIT) pe suprafaţa lor. În unele realizări, analiza cinetică Biacore cuprinde analiza legării şi disocierii antigenului (de exemplu, TIGIT) de pe cipurile cu anticorp imobilizat (de exemplu, anticorp anti-TIGIT) pe suprafaţa lor.

În anumite cazuri, divulgarea furnizează un agent de legare TIGIT (de exemplu, un anticorp) care se leagă specific la TIGIT, în care agentul de legare TIGIT cuprinde una, două, trei, patru, cinci, şi/sau şase din regiunile CDR ale anticorpului 313R11, 313R12, 313R14, sau 313R19 (vezi Tabelul 1). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde una sau mai multe din regiunile CDR ale 313R11, 313R12, 313R14, sau 313R19, sau variantele umanizate ale acestora; două sau mai multe din regiunile CDR ale 313R11, 313R12, 313R14, sau 313R19, sau variantele umanizate ale acestora; trei sau mai multe din regiunile CDR ale 313R11, 313R12, 313R14, sau 313R19, sau variantele umanizate ale acestora; patru sau mai multe din regiunile CDR ale 313R11, 313R12, 313R14, sau 313R19, sau variantele umanizate ale acestora; cinci sau mai multe din regiunile CDR ale 313R11, 313R12, 313R14, sau 313R19, sau variantele umanizate ale acestora; sau toate cele şase regiuni CDR ale 313R11, 313R12, 313R14, sau 313R19, sau variantele umanizate ale acestora.

Tabelul 1

313R11, 313R12 313R14, 313R19 HC CDR1 GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7) GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13) HC CDR2 IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8) IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8) HC CDR3 GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9) GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9) LC CDR1 QASQSISSYLNW (SEQ ID NO:10) QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14) sau QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO:81) LC CDR2 DALKLAS (SEQ ID NO:11) RASTLAS (SEQ ID NO:15) LC CDR3 QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO:12) QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO:16)

În anumite cazuri, divulgarea furnizează un agent de legare TIGIT (de exemplu, un anticorp) care se leagă specific la TIGIT, în care agentul de legare TIGIT cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7) sau GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde în plus o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSISSYLNW (SEQ ID NO:10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14), sau QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO:81), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând DALKLAS (SEQ ID NO:11) sau RASTLAS (SEQ ID NO: 15), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO:12) sau QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSISSYLNW (SEQ ID NO:10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO:14), sau QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO:81), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând DALKLAS (SEQ ID NO:11) sau RASTLAS (SEQ ID NO: 15), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO:12) sau QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde: (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7) sau GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9) şi (b) o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO:14), sau QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO:81), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând DALKLAS (SEQ ID NO:11) sau RASTLAS (SEQ ID NO: 15), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO:12) sau QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO:16). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde: (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9) şi (b) o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând DALKLAS (SEQ ID NO:11), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO:12). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde: (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9) şi (b) o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând RASTLAS (SEQ ID NO: 15), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde: (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9) şi (b) o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO:81), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând RASTLAS (SEQ ID NO: 15), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16).

În anumite cazuri, divulgarea furnizează un agent de legare TIGIT (de exemplu, un anticorp) care se leagă specific la TIGIT uman, în care agentul de legare TIGIT cuprinde: (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7), GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi; (b) o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi; (c) o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9), sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi; (d) o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSISSYLNW (SEQ ID NO: 10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO:14), QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO:81), sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi; (e) o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând DALKLAS (SEQ ID NO:11), RASTLAS (SEQ ID NO:15), sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi; şi (f) o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12), QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16), sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi. În anumite cazuri, substituţiile de aminoacizi sunt substituţii conservative. În unele cazuri, substituţiile sunt făcute ca parte dintr-un proces de umanizare. În unele cazuri, substituţiile sunt făcute ca parte a unui proces de umanizare a liniei germinale.

În anumite cazuri, divulgarea furnizează un agent de legare TIGIT (de exemplu, un anticorp) care se leagă specific la TIGIT, în care agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 19, sau SEQ ID NO:32 şi/sau o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 18 sau SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:17. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă to SEQ ID NO:19. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:32. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 18. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 19, sau SEQ ID NO:32 şi/sau o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin aproximativ 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 19, sau SEQ ID NO:32 şi/sau o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, sau SEQ ID NO:32 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând în mod esenţial din SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:19, sau SEQ ID NO:32 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând în mod esenţial din SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând din SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 19, sau SEQ ID NO:32 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând din SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20.

În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:17 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO: 18. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând în mod esenţial din SEQ ID NO:17 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând în mod esenţial din SEQ ID NO: 18. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând din SEQ ID NO:17 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând din SEQ ID NO: 18.

În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:19 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând în mod esenţial din SEQ ID NO:19 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând în mod esenţial din SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând din SEQ ID NO:19 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând din SEQ ID NO:20.

În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:32 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând în mod esenţial din SEQ ID NO:32 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând în mod esenţial din SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând din SEQ ID NO:32 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând din SEQ ID NO:20.

În anumite cazuri, invenţia furnizează un agent de legare TIGIT (de exemplu, un anticorp) care se leagă specific la TIGIT, în care agentul de legare TIGIT cuprinde: (a) un lanţ greu având cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:34, sau SEQ ID NO:56 ; şi/sau (b) un lanţ uşor având cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:28 sau SEQ ID NO:30. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde: (a) un lanţ greu având cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:34, sau SEQ ID NO:56; şi/sau (b) un lanţ uşor având cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:28 sau SEQ ID NO:30. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:26 şi/sau un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:28. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:27 şi/sau un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:28. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:29 şi/sau un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:30. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:34 şi/sau un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:30. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:56 şi/sau un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:30. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu constând în mod esenţial din SEQ ID NO:26 sau SEQ ID NO:27, şi un lanţ uşor constând în mod esenţial din SEQ ID NO:28. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu constând în mod esenţial din SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:34, sau SEQ ID NO:56 şi un lanţ uşor constând în mod esenţial din SEQ ID NO:30. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu constând din SEQ ID NO:26 şi un lanţ uşor constând din SEQ ID NO:28. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu constând din SEQ ID NO:27 şi un lanţ uşor constând din SEQ ID NO:28. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu constând din SEQ ID NO:29 şi un lanţ uşor constând din SEQ ID NO:30. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu constând din SEQ ID NO:34 şi un lanţ uşor constând din SEQ ID NO:30. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu constând din SEQ ID NO:56 şi un lanţ uşor constând din SEQ ID NO:30.

În anumite cazuri,un agent de legare TIGIT cuprinde regiune variabilă a lanţului greu şi regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R11. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde regiunile variabile ale anticorpului 313R11 în care regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor din anticorpul 313R11 au fost maturate de afinitate. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde lanţul greu şi lanţul uşor ale anticorpului 313R11 (cu sau fără secvenţa lider). În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT este anticorpul 313R11. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R11 în care regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor au fost umanizate. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R11 într-o formă umanizată. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu al anticorpului 313R11 ca parte a unui lanţ greu al IgG1, IgG2, sau IgG4.

În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, anticorpul 313R11. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, o variantă a anticorpului 313R11.

În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R12. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde regiunile variabile ale anticorpului 313R12 în care regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor din anticorpul 313R12 au fost maturate de afinitate. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde lanţul greu şi lanţ uşor ale anticorpului 313R12 (cu sau fără secvenţa lider). În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT este anticorpul 313R12. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R12 în care regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor au fost umanizate. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R12 într-o formă umanizată. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu a anticorpului 313R12 ca parte a unui lanţ greu al IgG1, IgG2, sau IgG4.

În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, anticorpul 313R12. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, o variantă a anticorpului 313R12.

În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R14. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde regiunile variabile ale anticorpului 313R14 în care regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor din anticorpul 313R14 au fost maturate de afinitate. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde lanţul greu şi lanţul uşor ale anticorpului 313R14 (cu sau fără secvenţa lider). În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT este anticorpul 313R14. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R14 în care regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor au fost umanizate. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R14 într-o formă umanizată. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu a anticorpului 313R14 ca parte a unui lanţ greu al IgG1, IgG2, sau IgG4.

În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, anticorpul 313R14. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, o variantă a anticorpului 313R14.

În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R19. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde regiunile variabile ale anticorpului 313R19 în care regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor din anticorpul 313R19 au fost maturate de afinitate. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde lanţul greu şi lanţ uşor ale anticorpului 313R19 (cu sau fără secvenţa lider). În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT este anticorpul 313R19. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R19 în care regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor au fost umanizate. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313R19 într-o formă umanizată. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu a anticorpului 313R19 ca parte a unui lanţ greu al IgG1, IgG2, sau IgG4.

În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, anticorpul 313R19. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, o variantă a anticorpului 313R19.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu Colecţia de Culturi de Tip American (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SUA, în condiţiile Tratatului de la Budapesta din 27 mai 2015, şi denumită PTA-122180. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SUA, în condiţiile Tratatului de la Budapesta din 27 mai 2015, şi denumită PTA-122181. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu ATCC şi denumită PTA-122180 şi o regiune variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC şi denumită PTA-122181. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu cuprinzând regiunea variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu ATCC şi denumită PTA-122180. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ uşor cuprinzând regiunea variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC şi denumită PTA-122181. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT cuprinde un lanţ greu cuprinzând regiunea variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitate cu ATCC şi denumită PTA-122180 şi un lanţ uşor cuprinzând regiunea variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC şi denumită PTA-122181.

Invenţia furnizează un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman, în care anticorpul cuprinde şase din regiunile CDR ale anticorpilor 313M26 sau 313M32 (vezi Tabelul 2).

Tabelul 2

313M26 şi 313M32 HC CDR1 TSDYAWN (SEQ ID NO:57) HC CDR2 YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO:58) HC CDR3 ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO:59) LC CDR1 KASQDVSTAVA (SEQ ID NO:60) LC CDR2 SASYRYT (SEQ ID NO:61) LC CDR3 QQHYSTP (SEQ ID NO:62)

Invenţia furnizează un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman care cuprinde: (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând TSDYAWN (SEQ ID NO:57), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO:58), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO:59); şi (b) o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând KASQDVSTAVA (SEQ ID NO:60), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând SASYRYT (SEQ ID NO:61), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQHYSTP (SEQ ID NO:62).

În anumite cazuri, divulgarea furnizează un agent de legare TIGIT (de exemplu, un anticorp) care se leagă specific la TIGIT uman, în care agentul de legare TIGIT cuprinde: (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând TSDYAWN (SEQ ID NO:57) sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi; (b) o CDR2 a lanţului greu cuprinzând YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO:58) sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi; (c) o CDR3 a lanţului greu cuprinzând ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO:59) sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi; (d) o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând KASQDVSTAVA (SEQ ID NO:60) sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi; (e) o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând SASYRYT (SEQ ID NO:61) sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi; şi (f) o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQHYSTP (SEQ ID NO:62) sau o variantă a acesteia cuprinzând 1, 2, 3, sau 4 substituţii de aminoacizi. În anumite cazuri, substituţiile de aminoacizi sunt substituţii conservative. În unele cazuri, substituţiile sunt făcute ca parte dintr-un proces de umanizare. În unele cazuri, substituţiile sunt făcute ca parte a unui proces de umanizare al liniei germinale. În unele cazuri, substituţiile sunt făcute ca parte a unui proces de optimizare a legării.

În anumite realizări, invenţia furnizează un anticorp care se leagă specific la TIGIT uman, în care anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67 şi/sau o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:63. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:67. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:64. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:68. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67 şi/sau o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin aproximativ 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67 şi/sau o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând în mod esenţial din SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând în mod esenţial din SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând din SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând din SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68.

În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:63 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:64. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând în mod esenţial din SEQ ID NO:63 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând în mod esenţial din SEQ ID NO:64. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând din SEQ ID NO:63 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând din SEQ ID NO:64.

În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:68. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând în mod esenţial din SEQ ID NO:67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând în mod esenţial din SEQ ID NO:68. În anumite realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu constând din SEQ ID NO:67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor constând din SEQ ID NO:68.

În anumite realizări, invenţia furnizează un anticorp (de exemplu, un anticorp) care se leagă specific la TIGIT, în care anticorpul cuprinde: un lanţ greu având cel puţin 90% identitate de secvenţă to SEQ ID NO:70 şi/sau un lanţ uşor având cel puţin 90% identitate de secvenţă to SEQ ID NO:72. În unele realizări, anticorpul cuprinde: un lanţ greu având cel puţin 95% identitate de secvenţă to SEQ ID NO:70 şi/sau un lanţ uşor având cel puţin 95% identitate de secvenţă to SEQ ID NO:72. În unele realizări, anticorpul cuprinde un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:70 şi/sau un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:72. În unele realizări, anticorpul cuprinde un lanţ greu constând în mod esenţial din SEQ ID NO:70 şi un lanţ uşor constând în mod esenţial din SEQ ID NO:72. În unele realizări, anticorpul cuprinde un lanţ greu constând din SEQ ID NO:70 şi un lanţ uşor constând din SEQ ID NO:72.

În anumite realizări, invenţia furnizează un anticorp (de exemplu, un anticorp) care se leagă specific la TIGIT, în care anticorpul cuprinde: un lanţ greu având cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:82 şi/sau un lanţ uşor având cel puţin 90% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:72. În unele realizări, anticorpul cuprinde: un lanţ greu având cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:82 şi/sau un lanţ uşor având cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:72. În unele realizări, anticorpul cuprinde un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:82 şi/sau un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:72. În unele realizări, anticorpul cuprinde un lanţ greu constând în mod esenţial din SEQ ID NO:82 şi un lanţ uşor constând în mod esenţial din SEQ ID NO:72. În unele realizări, anticorpul cuprinde un lanţ greu constând din SEQ ID NO:82 şi un lanţ uşor constând din SEQ ID NO:72.

În anumite realizări, un anticorp cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313M26. În unele realizări, anticorpul cuprinde regiunile variabile ale anticorpului 313M26 în care regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor din anticorpul 313M26 au fost maturate de afinitate. În anumite realizări, un anticorp cuprinde lanţul greu şi lanţul uşor ale anticorpului 313M26 (cu sau fără secvenţa lider). În anumite realizări, un anticorp este anticorpul 313M26. În anumite realizări, un anticorp cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313M26 în care regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor au fost umanizate. În anumite realizări, un anticorp cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313M26 într-o formă umanizată. În anumite realizări, un anticorp cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu a anticorpului 313M26 ca parte a unui lanţ greu al IgG1, IgG2, sau IgG4.

În anumite realizări, un anticorp cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, anticorpul 313M26. În anumite realizări, un anticorp cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, o variantă a anticorpului 313M26.

În anumite realizări, un anticorp cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu şi regiunea variabilă a lanţului uşor ale anticorpului 313M32. În unele realizări, anticorpul cuprinde regiunile variabile ale anticorpului 313M32 în care regiunea variabilă a lanţului greu şi/sau regiunea variabilă a lanţului uşor din anticorpul 313M32 au fost maturate de afinitate. În anumite realizări, un anticorp cuprinde lanţul greu şi lanţul uşor al anticorpului 313M32 (cu sau fără secvenţa lider). În anumite realizări, un anticorp este anticorpul 313M32. În anumite realizări, un anticorp cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu al anticorpului 313M32 ca parte a unui lanţ greu al IgG1, IgG2, sau IgG4. În anumite realizări, un anticorp cuprinde regiune variabilă a lanţului greu al anticorpului 313M32 ca parte dintr-un lanţ greu IgG1 uman. În anumite realizări, un anticorp cuprinde regiune variabilă a lanţului greu al anticorpului 313M32 ca parte dintr-un lanţ greu IgG2 uman. În anumite realizări, un anticorp cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu al anticorpului 313M32 ca parte dintr-un lanţ greu IgG4 uman. În anumite realizări, un anticorp care cuprinde regiunea variabilă a lanţului greu al anticorpului 313M32 ca parte dintr-un lanţ greu IgG4 uman este cel la care se face referire ca anticorpul 313M33.

În anumite realizări, un anticorp cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, anticorpul 313M32. În anumite realizări, un anticorp cuprinde, constă în mod esenţial din, sau constă din, o variantă a anticorpului 313M32.

În unele realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu Colecţia de Culturi de Tip American (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SUA, în condiţiile Tratatului de la Budapesta din 11 august 2015, şi denumită PTA-122346. În unele realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitate cu ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SUA, în condiţiile Tratatului de la Budapesta din 11 august 2015, şi denumită PTA-122347. În unele realizări, anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu codificată de plasmida depozitată cu ATCC şi denumită PTA-122346 şi o regiune variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC şi denumită PTA-122347. În unele realizări, anticorpul cuprinde un lanţ greu cuprinzând o regiune variabilă codificată de plasmida depozitată cu ATCC şi denumită PTA-122346. În unele realizări, anticorpul cuprinde un lanţ uşor codificat de plasmida depozitată cu ATCC şi denumită PTA-122347. În unele realizări, anticorpul cuprinde un lanţ greu cuprinzând o regiune variabilă codificată de plasmida depozitată cu ATCC şi denumită PTA-122346 şi un lanţ uşor codificat de plasmida depozitată cu ATCC şi denumită PTA-122347.

Această divulgare cuprinde de asemenea agenţi/molecule homodimerici şi agenţi/molecule heterodimerici. În unele cazuri, agenţii homodimerici sunt polipeptide. În unele cazuri, moleculele heterodimerice sunt polipeptide. În general molecula homodimerică cuprinde două polipeptide identice. În general molecula heterodimerică cuprinde cel puţin două polipeptide diferite. În unele cazuri, molecula heterodimerică este capabilă de legare la cel puţin două ţinte, de exemplu, un agent bispecific. Ţintele pot fi, de exemplu, două proteine diferite pe o singură celulă sau două proteine diferite pe două celule separate. Termenul „braţ« poate fi utilizat aici pentru a descrie structura unui agent homodimeric, unui agent heterodimeric, şi/sau a unui agent bispecific. În unele cazuri, fiecare braţ cuprinde cel puţin o polipeptidă. În general, fiecare braţ al unei molecule heterodimerice are o funcţie diferită, de exemplu, de legare la două ţinte diferite. În unele cazuri, un braţ poate cuprinde un situs de legare al antigen de la un anticorp. În unele cazuri, un braţ poate cuprinde o porţiune de legare a unui receptor. În unele cazuri, un braţ poate cuprinde un ligand. În unele cazuri, un braţ poate cuprinde o regiune de legare a unui ligand. În unele cazuri, un agent homodimeric cuprinde două braţe identice. În unele cazuri, un agent heterodimeric cuprinde două braţe diferite. În unele cazuri, un genta bispecific cuprinde două braţe diferite.

În unele cazuri, divulgarea furnizează un agent de legare TIGIT care este o moleculă homodimerică. În unele cazuri, molecula homodimerică cuprinde două polipeptide identice. În unele cazuri, divulgarea furnizează un agent de legare TIGIT care este o moleculă heterodimerică. În unele cazuri, molecula heterodimerică cuprinde cel puţin două polipeptide diferite. În unele cazuri, divulgarea furnizează un agent de legare TIGIT care este un agent heterodimeric. În unele cazuri, divulgarea furnizează un agent de legare TIGIT care este un agent bispecific. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific.

În unele cazuri, un agent heterodimeric (de exemplu, un agent bispecific) cuprinde un agent de legare TIGIT descris aici. În anumite cazuri, un agent heterodimeric cuprinde un agent de stimulare a răspunsului imun sau un fragment funcţional al acestuia. În unele cazuri, o moleculă heterodimerică cuprinde cel puţin două funcţii (i) legare la TIGIT şi (ii) legare la o a doua ţintă. În unele cazuri, un agent heterodimeric cuprinde cel puţin două funcţii, (i) legare la TIGIT şi (ii) o funcţie de „non-legare«. În anumite cazuri, o moleculă heterodimerică cuprinde un al doilea agent imunoterapeutic sau fragment funcţional al acestuia. În unele cazuri, un braţ al moleculei heterodimerice cuprinde un agent de legare TIGIT descris aici şi un braţ al moleculei heterodimerice cuprinde un al doilea agent imunoterapeutic. În unele cazuri, un braţ al agentului heterodimeric cuprinde un agent de legare TIGIT descris aici şi un braţ al agentului heterodimeric cuprinde un agent de stimulare al răspunsului imun. Aşa cum s-a utilizat în acest document, exprimarea „agent de stimulare al răspunsului imun« este utilizat în sensul cel mai larg şi se referă la o substanţă care stimulează direct sau indirect sistemul imunitar prin inducerea activării sau creşterea activităţii oricărora din componentele sistemului imunitar. De exemplu, agenţii de stimularea răspunsului imun pot include citokine, precum şi diferiţi antigeni incluzând antigeni tumorali, şi antigeni derivaţi din patogeni. În unele cazuri, al doilea agent imunoterapeutic (de exemplu, un agent de stimulare al răspunsului imun) include, dar nu este limitat la, un factor de stimulare a coloniilor (de exemplu, factor de stimulare al coloniilor de granulocite-macrofage (GM-CSF), factor de stimulare al coloniilor de macrofage (M-CSF), factor de stimulare al coloniilor de granulocite (G-CSF), factorul celulelor stem (SCF)), o interleukină (de exemplu, IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), o citokină (de exemplu, gama-interferon), un anticorp care blochează funcţiile imunosupresive (de exemplu, un anticorp anti-CTLA4, anticorp anti-CD28, anticorp anti-PD-1, anticorp anti-PD-Ll), un receptor de tip Toll (de exemplu, TLR4, TLR7, TLR9), sau un membru al familiei B7 (de exemplu, CD80, CD86). În unele cazuri, agentul imunoterapeutic include, dar nu este limitat la, un anticorp agonist (de exemplu, un anticorp anti-GITR, un anticorp anti-OX40) sau un ligand agonist (de exemplu, GITRL sau OX40L).

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este o moleculă heterodimerică (de exemplu, un agent bispecific) care cuprinde un prim domeniu CH3 şi un al doilea domeniu CH3, din care fiecare este modificat pentru a promova formarea de heteromultimeri. În unele cazuri, primul şi al doilea domeniu CH3 sunt modificate utilizând o tehnică noduri-în-găuri. În unele cazuri, primul şi al doilea domeniu CH3 cuprinde modificări în aminoacizi care conduc la interacţiuni electrostatice alterate. În unele cazuri, primul şi al doilea domeniu CH3 cuprind modificări în aminoacizi care conduc la interacţiuni hidrofobe/hidrofile alterate.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care cuprinde regiuni constante ale lanţului greu selectate din grupul constând din: (a) o primă regiune constantă IgG1 umană, în care aminoacizii corespunzători poziţiilor 253 şi 292 din IgG1 (SEQ ID NO:41) sunt înlocuiţi cu glutamat sau aspartat, şi o a doua regiune constantă IgG1 umană, în care aminoacizii corespunzători poziţiilor 240 şi 282 din IgG1 (SEQ ID NO:41) sunt înlocuiţi cu lizină; (b) o primă regiune constantă IgG2 umană, în care aminoacizii corespunzători poziţiilor 249 şi 288 din IgG2 (SEQ ID NO:42) sunt înlocuiţi cu glutamat sau aspartat, şi o a doua regiune constantă IgG2 umană în care aminoacizii corespunzători poziţiilor 236 şi 278 din IgG2 (SEQ ID NO:42) sunt înlocuiţi cu lizină; (c) o primă regiune constantă IgG3 umană, în care aminoacizii corespunzători poziţiilor 300 şi 339 din IgG3 (SEQ ID NO:43) sunt înlocuiţi cu glutamat sau aspartat, şi o a doua regiune constantă IgG3 umană în care aminoacizii corespunzători poziţiilor 287 şi 329 din IgG3 (SEQ ID NO:43) sunt înlocuiţi cu lizină; şi (d) o primă rgiune constantă IgG4 umană, în care aminoacizii corespunzători poziţiilor 250 şi 289 din IgG4 (SEQ ID NO:44) sunt înlocuiţi cu glutamat sau aspartat, şi o a doua regiune constantă IgG4 în care aminoacizii corespunzători poziţiilor 237 şi 279 din IgG4 (SEQ ID NO:44) sunt înlocuiţi cu lizină.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care cuprinde o primă regiune constantă IgG1 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 253 şi 292 din IgG1 (SEQ ID NO:41), în care aminoacizii la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 253 şi 292 din IgG1 (SEQ ID NO:41) sunt înlocuiţi cu glutamat sau aspartat, şi o a doua regiune constantă IgG1 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 240 şi 282 din IgG1 (SEQ ID NO:41), în care aminoacizii la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 240 şi 282 din IgG1 (SEQ ID NO:41) sunt înlocuiţi cu lizină. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o primă regiune constantă IgG2 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 249 şi 288 din IgG2 (SEQ ID NO:42), în care aminoacizii la poziţiile corespunzătoare poziţilori 249 şi 288 din IgG2 (SEQ ID NO:42) sunt înlocuiţi cu glutamat sau aspartat, şi o a doua regiune constantă IgG2 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 236 şi 278 din IgG2 (SEQ ID NO:42), în care aminoacizii la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 236 şi 278 din IgG2 (SEQ ID NO:42) sunt înlocuiţi cu lizină. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o primă regiune constantă IgG3 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 300 şi 339 din IgG3 (SEQ ID NO:43), în care aminoacizii la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 300 şi 339 din IgG3 (SEQ ID NO:43) sunt înlocuiţi cu glutamat sau aspartat, şi o a doua regiune constantă IgG3 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 287 şi 329 din IgG3 (SEQ ID NO:43), în care aminoacizii la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 287 şi 329 din IgG3 (SEQ ID NO:43) sunt înlocuiţi cu lizină. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o primă regiune constantă IgG4 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 250 şi 289 din IgG4 (SEQ ID NO:44), în care aminoacizii la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 250 şi 289 din IgG4 (SEQ ID NO:44) sunt înlocuiţi cu glutamat sau aspartat, şi o a doua regiune constantă IgG4 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 237 şi 279 din IgG4 (SEQ ID NO:44), în care aminoacizii la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 237 şi 279 din IgG4 (SEQ ID NO:44) sunt înlocuiţi cu lizină.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care cuprinde o primă regiune constantă IgG1 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 253 şi 292 din IgG1 (SEQ ID NO:41), în care aminoacizii sunt înlocuiţi cu glutamat, şi o a doua regiune constantă IgG1 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 240 şi 282 din IgG1 (SEQ ID NO:41), în care aminoacizii sunt înlocuiţi cu lizină. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o primă regiune constantă IgG1 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 253 şi 292 din IgG1 (SEQ ID NO:41), în care aminoacizii sunt înlocuiţi cu aspartat, şi o a doua regiune constantă IgG1 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 240 şi 282 din IgG1 (SEQ ID NO:41), în care aminoacizii sunt înlocuiţi cu lizină.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care cuprinde o primă regiune constantă IgG2 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 249 şi 288 din IgG2 (SEQ ID NO:42), în care aminoacizii sunt înlocuiţi cu glutamat, şi o a doua regiune constantă IgG2 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 236 şi 278 din IgG2 (SEQ ID NO:42), în care aminoacizii sunt înlocuiţi cu lizină. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o primă regiune constantă IgG2 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 249 şi 288 din IgG2 (SEQ ID NO:42), în care aminoacizii sunt înlocuiţi cu aspartat, şi o a doua regiune constantă IgG2 umană cu substituţii de aminoacizi la poziţiile corespunzătoare poziţiilor 236 şi 278 din IgG2 (SEQ ID NO:42), în care aminoacizii sunt înlocuiţi cu lizină.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care cuprinde o regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:45. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:46. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:47. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:48. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o primă regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:45 şi o a doua regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:46. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o primă regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:47 şi o a doua regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:48.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care cuprinde o regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:49. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:50. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:51. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:52. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o primă regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:49 şi o a doua regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:50. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o primă regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:51 şi o a doua regiune constantă a lanţului greu din SEQ ID NO:52.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman şi la un al doilea situs de legare la antigen care se leagă la o a doua ţintă. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând: un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman, în care primul situs de legare la antigen cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7) sau GFSLSSSYMS (SEQ ID NO: 13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând: un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman, în care primul situs de legare la antigen cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând: un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman, în care primul situs de legare al antigen cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând: un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman, în care primul situs de legare la antigen cuprinde (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7) sau GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9), şi (b) un al doilea situs de legare la antigen, în care primul situs de legare la antigene şi al doilea situs de legare la antigen cuprind un lanţ uşor comun (adică, identic). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând: un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman, în care primul situs de legare la antigen cuprinde (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7) sau GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9), o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSISSYLNW (SEQ ID NO:10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO: 14), sau QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO:81), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând DALKLAS (SEQ ID NO:11) sau RASTLAS (SEQ ID NO: 15), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO: 12) sau QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO:16) şi (b) un al doilea situs de legare la antigen. În unele cazuri, anticorpul bispecific cuprinde un prim situs de legare la antigen cuprinzând o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSISSYLNW (SEQ ID NO:10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO:14), sau QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO:81), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând DALKLAS (SEQ ID NO:11) sau RASTLAS (SEQ ID NO: 15), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO:12) sau QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO:16).

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:19, sau SEQ ID NO:32. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, sau SEQ ID NO:32. În unele cazuri, anticorpul bispecific cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor de cel puţin aproximativ 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În unele cazuri, anticorpul bispecific cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor de cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO: 17. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO: 19. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:32. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:18. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:20.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:17 şi o primă regiune constantă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, sau SEQ ID NO:52. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:19 şi o primă regiune constantă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, sau SEQ ID NO:52. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:32 şi o primă regiune constantă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, sau SEQ ID NO:52.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman şi un al doilea situs de legare la antigen care se leagă la o a doua ţintă. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând: un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman, în care primul situs de legare la antigen cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând TSDYAWN (SEQ ID NO:57), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO:58), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO:59). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând: un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman, în care primul situs de legare la antigen cuprinde (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând TSDYAWN (SEQ ID NO:57), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO:58), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO:59); şi (b) un al doilea situs de legare la antigen, în care primul situs de legare la antigen şi al doilea situs de legare la antigen cuprind un lanţ uşor comun (adică, identic). În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând: un prim situs de legare la antigen care se leagă specific la TIGIT uman, în care primul situs de legare la antigen cuprinde (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând TSDYAWN (SEQ ID NO:57), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO:58), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO:59), o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând KASQDVSTAVA (SEQ ID NO:60), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând SASYRYT (SEQ ID NO:61), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQHYSTP (SEQ ID NO:62); şi (b) un al doilea situs de legare la antigen. În unele cazuri, anticorpul bispecific cuprinde un prim situs de legare la antigen cuprinzând o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând KASQDVSTAVA (SEQ ID NO:60), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând SASYRYT (SEQ ID NO:61), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQHYSTP (SEQ ID NO:62).

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67. În unele cazuri, anticorpul bispecific cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor de cel puţin aproximativ 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În unele cazuri, anticorpul bispecific cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor de cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:63. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:67. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:64. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:68.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:63 şi o primă regiune constantă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, sau SEQ ID NO:52. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific cuprinzând o primă regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:67 şi o primă regiune constantă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, sau SEQ ID NO:52.

În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care se leagă specific la TIGIT uman şi la o a doua ţintă. În unele cazuri, a doua ţintă este un antigen tumoral. În unele cazuri, anticorpul bispecific cuprinde un agent de legare TIGIT descris aici şi o a doua polipeptidă cuprinzând un anticorp care se leagă specific la un antigen tumoral. Un anticorp bispecific cu o specificitate de legare pentru un antigen tumoral poate fi utilizat pentru a direcţiona agentul de legare TIGIT la o tumoare. Acest lucru poate fi util pentru a induce şi/sau spori un răspuns imun lângă sau în micromediul tumoral. În unele cazuri, un anticorp bispecific poate fi utilizat pentru a induce sau spori activitatea celulei imune infiltrate în tumoare. În unele cazuri, un anticorp bispecific poate fi utilizat pentru a induce sau spori activitatea limfocitelor infiltrate tumoral (TIL-uri). În unele cazuri, un anticorp bispecific poate fi utilizat pentru a inhiba sau scade activitatea celulelor Treg. În unele cazuri, un anticorp bispecific poate fi utilizat pentru a inhiba sau scade activitatea MSDC-urilor.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific, în care prima ţintă este TIGIT şi a doua ţintă este pe o celulă de răspuns imun. În unele cazuri, a doua ţintă este pe o celulă T, pe o celulă NK, pe o celulă B, pe o macrofagă, pe o celulă dendritică, sau pe o celulă mieloidă. În unele cazuri, a doua ţintă este PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM-3, LAG-3, GITR, OX-40, GITRL, sau OX-40L. În unele cazuri, a doua ţintă este CD28 sau 4-1BB.

În unele cazuri, un anticorp bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând un anticorp care se leagă specific la PD-1. În unele cazuri, un anticorp bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând un anticorp care se leagă specific la PD-L1. În unele cazuri, un anticorp bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând un anticorp care se leagă specific la GITR. În unele cazuri, un anticorp bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând un anticorp care se leagă specific la OX-40. În unele cazuri, un anticorp bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un anticorp TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând un anticorp care se leagă specific la CD40. În unele cazuri, un anticorp bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând un anticorp care se leagă specific la CTLA4. În unele cazuri, un anticorp bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un anticorp de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând un anticorp care se leagă specific la CD28. În unele cazuri, un anticorp bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând un anticorp care se leagă specific la GITRL. În unele cazuri, un anticorp bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând un anticorp care se leagă specific la OX-40L.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu din anticorpul anti-TIGIT 313R11. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu din anticorpul anti-TIGIT 313R12. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu din anticorpul anti-TIGIT 313R14. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu din anticorpul anti-TIGIT 313R19 sau 313R20. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor din anticorpul anti-TIGIT 313R11 sau 313R12. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor din anticorpul anti-TIGIT 313R14, 313R19, sau 313R20.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu din anticorpul anti-TIGIT 313M26. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor din anticorpul anti-TIGIT 313M26.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu din anticorpul anti-TIGIT 313M32. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp bispecific care cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor din anticorpul anti-TIGIT 313M32.

În unele cazuri, un agent bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând o polipeptidă cuprinzând GITRL care se leagă specific la GITR. În unele cazuri, al doilea braţ cuprinde o polipeptidă cuprinzând cel puţin o copie a domeniului extracelular al GITRL. În unele cazuri, un agent bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând o polipeptidă cuprinzând OX-40L care se leagă specific la OX-40. În unele cazuri, al doilea braţ cuprinde o polipeptidă cuprinzând cel puţin o copie a domeniului extracelular al OX-40L. În unele cazuri, un agent bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând o polipeptidă cuprinzând CD40L care se leagă specific la CD40. În unele cazuri, al doilea braţ cuprinde o polipeptidă cuprinzând cel puţin o copie a domeniului extracelular al CD40L. În unele cazuri, un agent bispecific cuprinde un prim braţ cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici şi un al doilea braţ cuprinzând o polipeptidă cuprinzând ligandul 4-1BB care se leagă specific la 4-1BB. În unele cazuri, al doilea braţ cuprinde o polipeptidă cuprinzând cel puţin o copie a domeniului extracelular al ligandului 4-1BB.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 50nM sau mai mică, aproximativ 25nM sau mai mică, aproximativ 10nM sau mai mică, aproximativ 1nM sau mai mică, sau aproximativ 0,1nM sau mai mică. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care se leagă la o a doua ţintă cu o Kd de aproximativ 50nM sau mai mică, aproximativ 25nM sau mai mică, aproximativ 10nM sau mai mică, aproximativ 1nM sau mai mică, sau aproximativ 0,1nM sau mai mică. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 50nM sau mai mică şi se leagă la o a doua ţintă cu o Kd de aproximativ 50nM sau mai mică. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 25nM sau mai mică şi se leagă la o a doua ţintă cu o Kd de aproximativ 25nM sau mai mică. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 10nM sau mai mică şi se leagă la o a doua ţintă cu o Kd de aproximativ 10nM sau mai mică. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care se leagă la TIGIT cu o Kd de aproximativ 1nM sau mai mică şi se leagă la o a doua ţintă cu o Kd de aproximativ 1nM sau mai mică.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un agent bispecific care cuprinde un situs de legare la antigen cu o afinitate de legare care este mai slabă decât afinitatea de legarea a celui de al doilea situs de legare la antigen. De exemplu, în unele cazuri, agentul bispecific se poate lega la TIGIT cu o Kd care variază de la aproximativ 0,1nM până la 1nM şi se poate lega la o a doua ţintă cu o Kd care variază de la aproximativ 1nM până la 10nM. Sau agentul bispecific se poate lega la TIGIT cu o Kd care variază de la aproximativ 1nM până la 10nM şi se poate lega la o a doua ţintă cu o Kd care variază de la aproximativ 0,1nM până la 1nM. În unele cazuri, agentul bispecific se poate lega la TIGIT cu o Kd care variază de la aproximativ 0,1nM până la 1nM şi se poate lega la o a doua ţintă cu o Kd care variază de la aproximativ 1nM până la 10nM. Sau agentul bispecific se poate lega la TIGIT cu o Kd care variază de la aproximativ 1nM până la 10nM şi se poate lega la o a doua ţintă cu o Kd care variază de la aproximativ 0,1nM până la 1nM. În unele cazuri, diferenţa de afinitate între cele două situsuri de legare la antigen poate fi de aproximativ 2 ori sau mai mare, de aproximativ 3 ori sau mai mare, de aproximativ 5 ori sau mai mare, de aproximativ 8 ori sau mai mare, de aproximativ 10 ori sau mai mare, de aproximativ 15 ori sau mai mare, de aproximativ 30 ori sau mai mare, de aproximativ 50 ori sau mai mare, sau de aproximativ 100 ori sau mai mare. În unele cazuri, cel puţin un rest de aminoacid în cel puţin o regiune CDR a situsului de legare la antigenului pentru TIGIT este substituit cu un aminoacid diferit astfel încât afinitatea situsului de legare la TIGIT este alterată. În unele cazuri, afinitatea situsului de legare la TIGIT este crescută. În unele cazuri, afinitatea situsului de legare la TIGIT este scăzută. În unele cazuri, cel puţin un rest de aminoacid în cel puţin o regiune CDR a situsului de legare la antigen pentru a doua ţintă este substituit cu un aminoacid diferit astfel încât afinitatea celui de al doilea situs de legare la antigen este alterată. În unele cazuri, afinitatea celui de al doilea situs de legare la antigen este crescută. În unele cazuri, afinitatea celui de al doilea situs de legare la antigen este scăzută. În unele cazuri, ambele afinităţi ale TIGIT şi celui de al doilea situs de legare la antigen sunt alterate.

Divulgarea furnizează polipeptide, incluzând, dar fără a se limita la, anticorpi care se leagă specific la TIGIT. În unele cazuri, o polipeptidă se leagă la TIGIT uman. În unele realizări, o polipeptidă se leagă la TIGIT de şoarece. În unele cazuri, o polipeptidă se leagă la TIGIT de şoarece şi la TIGIT uman. În unele cazuri, o polipeptidă se leagă la TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de şoarece. În unele cazuri, o polipeptidă se leagă la TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de şobolan. În unele cazuri, o polipeptidă se leagă la TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de iepure. În unele cazuri, o polipeptidă se leagă la TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de marmoset. În unele cazuri, o polipeptidă se leagă TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de câine. În unele cazuri, o polipeptidă se leagă TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de porc. În unele cazuri, o polipeptidă se leagă TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de maimuţă cynomolgus. În unele cazuri, o polipeptidă se leagă la TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de maimuţă rhesus.

În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde una, două, trei, patru, cinci, şi/sau şase din regiunile CDR ale anticorpului 313R11, 313R12, 313R14, sau 313R19 (vezi Tabelul 1 de aici). Anticorpul 313R20 cuprinde aceleaşi regiuni CDR şi domenii variabile ale lanţului greu şi uşor ca anticorpul 313R19, dar 313R20 cuprinde un format IgG4. În unele cazuri, o polipeptidă cuprinde regiunile CDR cu până la patru (adică, 0, 1, 2, 3, sau 4) substituţii de aminoacizi pe CDR. În anumite cazuri, regiunile CDR ale lanţului greu sunt conţinute într-o regiune variabilă a lanţului greu. În anumite cazuri, regiunile CDR ale lanţului uşor sunt conţinute într-o regiune variabilă a lanţului uşor.

În unele cazuri, divulgarea furnizează o polipeptidă care se leagă specific la TIGIT, în care polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:19, sau SEQ ID NO:32, şi/sau o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19 sau SEQ ID NO:32. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:19, sau SEQ ID NO:32, şi/sau o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:17 şi/sau o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 18. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:19 şi/sau o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:32 şi/sau o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:20.

În unele cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, şi/sau SEQ ID NO:32. Cum s-a definit aici, o polipeptidă poate apare ca monocatenară sau ca două sau mai multe catene asociate. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:17 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO: 18. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:19 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:32 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând în mod esenţial din SEQ ID NO:17 şi o secvenţă de aminoacizi constând în mod esenţial din SEQ ID NO: 18. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând în mod esenţial din SEQ ID NO:19 şi o secvenţă de aminoacizi constând în mod esenţial din SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând în mod esenţial din SEQ ID NO:32 şi o secvenţă de aminoacizi constând în mod esenţial din SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:17 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO: 18. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:19 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:32 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:20.

În unele cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:55, şi/sau SEQ ID NO:56. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:21 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:23. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:22 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:23. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:24 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:25. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:33 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:25. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:55 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:25. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:26 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:28. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:27 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:28. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:29 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:30. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:34 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:30. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:56 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:30.

În unele cazuri, un agent de legare TIGIT cuprinde o polipeptidă cuprinzând o secvenţă selectată din grupul constând din: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, şi SEQ ID NO:56.

În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:21 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:23. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:22 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:23. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:24 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:25. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:33 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:25. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:55 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:25. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:26 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:28. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:27 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:28. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:29 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:30. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:34 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:30. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:56 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:30.

În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde una, două, trei, patru, cinci, şi/sau şase din regiunile CDR ale anticorpului 313M26 sau 313M32 (vezi Tabelul 2 de aici). În unele cazuri, o polipeptidă cuprinde regiuni CDR cu până la patru (adică, 0, 1, 2, 3, sau 4) substituţii de aminoacizi pe CDR. În anumite cazuri, regiunile CDR ale lanţului greu sunt conţinute într-o regiune variabilă a lanţului greu. În anumite cazuri, regiunile CDR ale lanţului uşor sunt conţinute într-o regiune variabilă a lanţului uşor.

În unele cazuri, divulgarea furnizează o polipeptidă care se leagă specific la TIGIT, în care polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67, şi/sau o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 80% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 85%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, cel puţin aproximativ 97%, sau cel puţin aproximativ 99% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO: 167 şi/sau o secvenţă de aminoacizi având cel puţin aproximativ 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:63 şi/sau o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:64. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:67 şi/sau o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:68.

În unele cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din: SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:82, şi/sau SEQ ID NO:83. Cum s-a definit aici, o polipeptidă poate apare ca monocatenară sau ca două sau mai multe catene asociate. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:63 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:64. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:67 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:68. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:69 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:71. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:70 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:72. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:82 şi o secvenţă de aminoacizi cuprinzând SEQ ID NO:72.

În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:63 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:64. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:67 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:68. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:69 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:71. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:70 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:72. În anumite cazuri, o polipeptidă cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:82 şi o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO:72.

Multe proteine, incluzând anticorpi, conţin o secvenţă semnal care direcţionează transportul proteinelor la diferite locaţii. În general, secvenţele semnal (la care se face referire de asemenea ca peptide semnal sau secvenţe lider) sunt situate la N-terminalul polipeptidelor native. Ele ţintesc polipeptida la reticulul endoplasmatic şi proteinele sunt sortate la destinaţiile lor, de exemplu, la spaţiul interior al unui organ, la o membrană interioară, la membrana exterioară celulei, sau la exteriorul celulei prin secreţie. Majoritatea secvenţelor semnal sunt clivate din proteină printr-o peptidază semnal după ce proteinele sunt transportate la reticulul endoplasmatic. Clivarea secvenţei semnal din polipeptidă are loc uzual la un situs specific în secvenţa de aminoacizi şi este dependentă de resturile de aminoacid din secvenţa semnal. Deşi există uzual un situs de clivare specific, mai mult de un situs de clivare poate fi recunoscut şi/sau poate fi utilizat de către o peptidază semnal conducând la un N-terminal neomogen al polipeptidei. De exemplu, utilizarea de diferite situsuri de clivare într-o secvenţă semnal poate conduce la o polipeptidă exprimată cu diferiţi aminoacizi N-terminali. Corespunzător, în unele realizări, polipeptidele cum s-au descris aici, pot cuprinde un amestec de polipeptide cu diferite N-terminale. În unele realizări, N-terminalele diferă în lungime cu 1, 2, 3, 4, sau 5 aminoacizi. În unele realizări, polipeptida este substanţial omogenă, adică, polipeptidele au acelaşi N-terminal. În unele realizări, secvenţa semnal a polipeptidei cuprinde una sau mai multe (de exemplu, una, două, trei, patru, cinci, şase, şapte, opt, nouă, zece, etc.) substituţii de aminoacizi şi/sau deleţii în comparaţie cu o secvenţă semnal „nativă« sau „parentală«. În unele realizări, secvenţa semnal a polipeptidei cuprinde substituţii de aminoacizi şi/sau deleţii care permit ca un situs de clivare să fie dominant, conducȃnd prin urmare la o polipeptidă substanţial omogenă cu un N-terminal. În unele realizări, o secvenţă semnal a polipeptidei afectează nivelul de expresie al polipeptidei, de exemplu, expresie crescută sau expresia scăzută.

În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând: (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7) sau GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9) şi (b) o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând QASQSISSYLNW (SEQ ID NO:10), QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO:14), sau QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO:81), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând DALKLAS (SEQ ID NO:11) sau RASTLAS (SEQ ID NO:15), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO:12) sau QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO: 16).

În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând (a) o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, sau SEQ ID NO:32 şi (b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:18 sau SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:17 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:18. În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:19 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:20. În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:32 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:20.

În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:34, sau SEQ ID NO:56 şi un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:28 sau SEQ ID NO:30. În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:26 şi un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:28. În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:27 şi un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:28. În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:29 şi un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:30. În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:34 şi un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:30. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:56 şi un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:30.

În anumite cazuri, un anticorp concurează cu anticorp 313R11 pentru legare specifică la TIGIT. În anumite cazuri, un anticorp concurează cu anticorp 313R12 pentru legare specifică la TIGIT. În anumite cazuri, un anticorp concurează cu anticorp 313R14 pentru legare specifică la TIGIT uman. În anumite cazuri, un anticorp concurează cu anticorp 313R19 pentru legare specifică la TIGIT uman. În anumite cazuri, un anticorp concurează cu anticorp 313R20 pentru legare specifică la TIGIT uman.

În unele cazuri, un anticorp concurează cu un anticorp de referinţă pentru legare specifică la TIGIT, în care anticorpul de referinţă este anticorpul 313R11. În unele cazuri, un anticorp concurează cu un anticorp de referinţă pentru legare specifică la TIGIT, în care anticorpul de referinţă este anticorpul 313R12. În unele cazuri, un anticorp concurează cu un anticorp de referinţă anticorp pentru legare specifică la TIGIT, în care anticorpul de referinţă este anticorpul 313R14. În unele cazuri, un anticorp concurează cu un anticorp de referinţă pentru legare specifică la TIGIT, în care anticorpul de referinţă este anticorpul 313R19. În unele cazuri, un anticorp concurează cu un anticorp de referinţă pentru legare specifică la TIGIT, în care anticorpul de referinţă este anticorpul 313R20.

În anumite cazuri, un anticorp se leagă la acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT ca agentul de legare TIGIT din divulgare. În anumite cazuri, un anticorp se leagă acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT ca anticorpul 313R11. În anumite cazuri, un anticorp se leagă la acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT ca anticorpul 313R12. În anumite cazuri, un anticorp se leagă la acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT ca anticorpul 313R14. În anumite cazuri, un anticorp se leagă la acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT ca anticorpul 313R19. În anumite cazuri, un anticorp se leagă la acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT ca anticorpul 313R20.

Într-un alt caz, un anticorp se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT legat de către un agent de legare TIGIT din divulgare. În unele cazuri, anticorpul se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT legat de către anticorpul 313R11. Într-o altă realizare, anticorpul se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT legat de către anticorpul 313R12. În unele cazuri, anticorpul se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT legat de către anticorpul 313R14. În anumite cazuri, anticorpul se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT legat de către anticorpul 313R19. În anumite cazuri, anticorpul se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT legat de către anticorpul 313R20.

În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând: (a) o CDR1 a lanţului greu cuprinzând TSDYAWN (SEQ ID NO:57), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO:58), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO:59) şi (b) o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând KASQDVSTAVA (SEQ ID NO:60), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând SASYRYT (SEQ ID NO:61), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQHYSTP (SEQ ID NO:62).

În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând (a) o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:63 sau SEQ ID NO:67 şi (b) o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:64 sau SEQ ID NO:68. În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:63 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:64. În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO: 167 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:68. În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:70 şi un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:72. În anumite cazuri, un anticorp concurează pentru legare specifică la TIGIT cu un agent de legare TIGIT cuprinzând un lanţ greu cuprinzând SEQ ID NO:82 şi un lanţ uşor cuprinzând SEQ ID NO:72.

În anumite cazuri, un anticorp concurează cu anticorpul 313M26 pentru legare specifică la TIGIT. În anumite cazuri, un anticorp concurează cu anticorpul 313M32 pentru legare specifică la TIGIT. În anumite cazuri, un anticorp concurează cu anticorpul 313M32 pentru legare specifică la TIGIT uman. În unele cazuri, un anticorp concurează cu un anticorp de referinţă pentru legare specifică la TIGIT, în care anticorpul de referinţă este anticorpul 313M26. În unele cazuri, un anticorp concurează cu un anticorp de referinţă pentru legare specifică la TIGIT, în care anticorpul de referinţă este anticorpul 313M32. În unele cazuri, un anticorp concurează cu un anticorp de referinţă pentru legare specifică la TIGIT, în care anticorpul de referinţă este anticorpul 313M33. În unele cazuri, un anticorp concurează cu un anticorp de referinţă pentru legare specifică la TIGIT uman, în care anticorpul de referinţă este anticorpul 313M32. În unele cazuri, un anticorp concurează cu un anticorp de referinţă pentru legare specifică la TIGIT uman, în care anticorpul de referinţă este anticorpul 313M33.

În anumite cazuri, un anticorp se leagă la acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT ca agentul de legare TIGIT descris aici. În anumite cazuri, un anticorp se leagă la acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT ca anticorpul 313M26. În anumite cazuri, un anticorp se leagă la acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT ca anticorpul 313M32. În anumite cazuri, un anticorp se leagă la acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT ca anticorpul 313M33. În anumite cazuri, un anticorp se leagă la acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT uman ca anticorpul 313M32. În anumite cazuri, un anticorp se leagă la acelaşi epitop, sau în mod esenţial la acelaşi epitop, pe TIGIT uman ca anticorpul 313M33.

Într-un alt caz, un anticorp se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT legat de către un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, anticorpul se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT legat de către anticorpul 313M26. Într-un alt caz, anticorpul se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT legat de către anticorpul 313M32. Într-un alt caz, anticorpul se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT legat de către anticorpul 313M33. Într-un alt caz, anticorpul se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT uman legat de către anticorpul 313M32. Într-un alt caz, anticorpul se leagă la un epitop pe TIGIT care se suprapune cu epitopul pe TIGIT uman legat de către anticorpul 313M33.

În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând aminoacizi din SEQ ID NO:79 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând aminoacizi din SEQ ID NO:80 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând aminoacizi din SEQ ID NO:79 şi SEQ ID NO:80 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62 şi 1109 din SEQ ID NO:4 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62 şi T119 din SEQ ID NO:4 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare cu un epitop cuprinzând aminoacizii Q64 şi 1109 din SEQ ID NO:4 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând aminoacizii Q64 şi T119 din SEQ ID NO:4 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, Q64, şi 1109 din SEQ ID NO:4 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, Q64, şi T119 din SEQ ID NO:4 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, 1109, şi T119 din SEQ ID NO:4 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând aminoacizii Q64, 1109, şi T119 din SEQ ID NO:4 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând aminoacizii Q62, Q64, 1109, şi T119 din SEQ ID NO:4 cu un agent de legare TIGIT descris aici. În unele cazuri, un anticorp concurează pentru legare la un epitop cuprinzând cel puţin un aminoacid selectat din grupul constând din: N58, E60, Q62, Q64, L65, F107, I109, H111, T117, T119, G120, şi R121 din SEQ ID NO:4 cu un agent de legare TIGIT descris aici.

În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT (de exemplu, un anticorp) descris aici se leagă la TIGIT şi modulează activitatea TIGIT. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un antagonist TIGIT şi scade activitatea TIGIT. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT inhibă activitatea TIGIT cu cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 30%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau aproximativ 100%. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă activitatea TIGIT este anticorpul 313R11, anticorpul 313R12, anticorpul 313R14, anticorpul 313R19, sau anticorpul 313R20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă activitatea TIGIT umană este o versiune umanizată a anticorpului 313R11, a anticorpului 313R12, a anticorpului 313R14, a anticorpului 313R19, sau a anticorpului 313R20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă activitatea TIGIT este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă activitatea TIGIT umană este o versiune umanizată a anticorpului 313M26 (de exemplu, anticorpul 313M32). În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă activitatea TIGIT este anticorpul 313M32.

În unele cazuri, agenţii de legare TIGIT descrişi aici se leagă la TIGIT şi inhibă sau reduc semnalizarea TIGIT. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT (de exemplu, un anticorp) inhibă semnalizarea TIGIT cu cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 30%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau aproximativ 100%. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT inhibă semnalizarea TIGIT de şoarece. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT inhibă semnalizarea TIGIT umană. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT inhibă semnalizarea TIGIT de şoarece şi umană. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă semnalizarea TIGIT este anticorpul 313R11, anticorpul 313R12, anticorpul 313R14, anticorpul 313R19, sau anticorpul 313R20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă semnalizarea TIGIT este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă semnalizarea TIGIT este anticorpul 313M32.

TIGIT este fosforilată la coada sa citoplasmatică după interacţiunea cu contrareceptorul său PVR. Fosforilarea TIGIT este începutul unei cascade care include evenimente în aval care afectează alte căi de semnalizare cunoscute. Prin urmare, evaluarea fosforilării TIGIT poate da informaţii despre activitatea TIGIT şi semnalizarea TIGIT.

Testele de fosforilare sunt cunoscute celor calificaţi în domeniu şi sunt utilizate în mod obişnuit pentru a monitoriza activarea proteinei şi/sau activarea căii. Testele pot fi utilizate pentru a monitoriza efectul diferitelor tratamente pe activarea unei proteine ţintă şi/sau unei căi ţintă. De exemplu, un test de fosforilare in vitro poate fi utilizat pentru a evalua efectul unui antagonist TIGIT asupra activării induse de PVR a TIGIT.

În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT (de exemplu, anticorp) inhibă legarea TIGIT la un receptor. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT inhibă legarea TIGIT la PVR. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT inhibă legarea TIGIT la PVR-L2, PVR-L3, şi/sau PVR-L4. În anumite cazuri, inhibarea legării unui agent de legare TIGIT la PVR este de cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 25%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau cel puţin aproximativ 95%. În anumite cazuri, inhibarea legării unui agent de legare TIGIT la PVR-L2, PVR-L3, şi/sau PVR-L4 este de cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 25%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau cel puţin aproximativ 95%. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT care inhibă legarea TIGIT la PVR este anticorpul 313R11, anticorpul 313R12, anticorpul 313R14, anticorpul 313R19, sau anticorpul 313R20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă legarea TIGIT la PVR-L2, PVR-L3, şi/sau PVR-L4 este anticorpul 313R11, anticorpul 313R12, anticorpul 313R14, anticorpul 313R19, sau anticorpul 313R20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă legarea TIGIT la PVR este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă legarea TIGIT la PVR este anticorpul 313M32. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă legarea TIGIT la PVR-L2, PVR-L3, şi/sau PVR-L4 este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care inhibă legarea TIGIT la PVR-L2, PVR-L3, şi/sau PVR-L4 este anticorpul 313M32.

În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT (de exemplu, anticorp) blochează legarea TIGIT la un receptor. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT blochează legarea TIGIT la PVR. În anumite cazuri, blocarea legării unui agent de legare TIGIT la PVR este de cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 25%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau cel puţin aproximativ 95%. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT blochează legarea TIGIT la PVR-L2, PVR-L3, şi/sau PVR-L4. În anumite cazuri, blocarea legării unui agent de legare TIGIT la PVR-L2, PVR-L3, şi/sau PVR-L4 este de cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 25%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau cel puţin aproximativ 95%. În anumite cazuri, un agent de legare TIGIT care blochează legarea TIGIT la PVR este anticorpul 313R11, anticorpul 313R12, anticorpul 313R14, anticorpul 313R19, sau anticorpul 313R20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care blochează legarea TIGIT la PVR-L2, PVR-L3, şi/sau PVR-L4 este anticorpul 313R11, anticorpul 313R12, anticorpul 313R14, anticorpul 313R19, sau anticorpul 313R20. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care blochează legarea TIGIT la PVR este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care blochează legarea TIGIT la PVR este anticorpul 313M32. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care blochează legarea TIGIT la PVR-L2, PVR-L3, şi/sau PVR-L4 este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite cazuri, agentul de legare TIGIT care blochează legarea TIGIT la PVR-L2, PVR-L3, şi/sau PVR-L4 este anticorpul 313M32.

Testele de legare sunt cunoscute celor calificaţi în domeniu şi sunt descrise aici. Testele de legare pot fi utilizate pentru a monitoriza efectul unui agent de testare asupra interacţiunii între o proteină ţintă şi partenerul de legare al proteinei (de exemplu, receptor sau ligand). De exemplu, un test de legare in vitro poate fi utilizat pentru a evalua dacă un antagonist TIGIT blochează interacţiunea TIGIT la PVR.

În anumite realizări ale invenţiei, anticorpii descrişi aici au unul sau mai multe din următoarele efecte: inhibă proliferarea celulelor tumorale, inhibă creşterea tumorii, reduc tumorigenicitatea unei tumori, reduc tumorigenicitatea unei tumori prin reducerea frecvenţei celulelor stem canceroase în tumoare, declanşează moartea celulară a celulelor tumorale, sporesc sau stimulează răspunsul imun, sporesc sau stimulează răspunsul anti-tumoral, cresc activitatea citolitică a celulelor imune, cresc uciderea celulelor tumorale, cresc uciderea celulelor tumorale de către celulele imune, induc celule într-o tumoare pentru a se diferenţia, diferenţiază celulele tumorigenice la o stare non-tumorigenică, induc expresia markerilor de diferenţiere în celulele tumorale, previn metastaza celulelor tumorale, scad supravieţuirea celulelor tumorale, cresc inhibarea creşterii celulare dependente de contact, cresc apoptoza celulei tumorale, reduc tranziţia mezenchimală epitelială (EMT), sau scad supravieţuirea celulelor tumorale. În unele realizări, anticorpii descrişi aici au unul sau mai multe din următoarele efecte: inhibă infecţia virală, inhibă infecţia virală cronică, reduc încărcarea virală, declanşează moartea celulară a celulelor infectate cu virus, sau reduc numărul sau procentajul de celule infectate cu virus.

În anumite realizări, anticorpii descrişi aici inhibă creşterea tumorii. În anumite realizări, anticorpii descrişi aici inhibă creşterea tumorii in vivo (de exemplu, într-un model pe şoarece, şi/sau la un om având cancer). În anumite realizări, creşterea tumorii este inhibată de cel puţin aproximativ de două ori, de aproximativ trei ori, de aproximativ cinci ori, de aproximativ zece ori, de aproximativ 50 ori, de aproximativ 100 ori, sau de aproximativ 1000 ori în comparaţie cu o tumoare netratată.

În anumite realizări, anticorpii descrişi aici reduc tumorigenicitatea unei tumori. În anumite realizări, anticorpii descrişi aici reduc tumorigenicitatea unei tumori într-un model pe animal, cum ar fi un model pe şoarece. În unele realizări, modelul pe şoarece este un model pe şoarece de xenogrefă. În unele realizări, anticorpii descrişi aici nu se leagă la TIGIT de şoarece şi nu sunt eficienţi într-un model pe şoarece. În unele realizări, un agent surogat de legare TIGIT care se leagă la TIGIT de şoarece este utilizat într-un model pe şoarece. În anumite realizări, anticorpii descrişi aici reduc tumorigenicitatea unei tumori cuprinzând celule stem canceroase într-un model pe animal, cum ar fi un model pe şoarece. În anumite realizări, numărul sau frecvenţa celulelor stem canceroase într-o tumoare este redusă de cel puţin aproximativ două ori, de aproximativ trei ori, de aproximativ cinci ori, de aproximativ zece ori, de aproximativ 50 ori, de aproximativ 100 ori, sau de aproximativ 1000 ori. În anumite realizări, reducerea în numărul sau frecvenţa celulelor stem canceroase este determinată prin testul de diluţie limitativă utilizând un model pe animal. Exemple suplimentare şi indicaţii referitoare la utilizarea testelor de diluţie limitativă pentru a determina o reducere în numărul sau frecvenţa celulelor stem canceroase într-o tumoare pot fi găsite, de exemplu, publicaţia internaţională WO cu nr. 2008/042236; publicaţia de brevet S.U.A. nr. 2008/0064049; şi publicaţia brevetului S.U.A. nr. 2008/0178305.

În anumite realizări, anticorpii descrişi aici modulează un răspuns imun. În unele realizări, un anticorp descris aici activează şi/sau creşte un răspuns imun. În unele realizări, un anticorp descris aici creşte, promovează, sau ameliorează imunitatea mediată de celulă. În unele realizări, un anticorp descris aici creşte, promovează, sau ameliorează imunitatea nativă mediată de celulă. În unele realizări, un anticorp descris aici creşte, promovează, sau ameliorează imunitatea adaptivă mediată de celulă. În unele realizări, un anticorp descris aici creşte, promovează, sau ameliorează activitatea celulelor T. În unele realizări, un anticorp descris aici creşte, promovează, sau ameliorează activitatea celulelor T citolitice (CTL). În unele realizări, un anticorp descris aici creşte, promovează, sau ameliorează activitatea celulelor NK. În unele realizări, un anticorp descris aici creşte, promovează, sau ameliorează activitatea celulei ucigaşe activate de limfokină (LAK). În unele realizări, un anticorp descris aici creşte, promovează, sau ameliorează activitatea limfocitelor care se infiltrează în tumoare (TIF). În unele realizări, un anticorp descris aici inhibă sau scade activitatea celulelor Treg. În unele realizări, un anticorp descris aici inhibă sau scade activitatea MDSC. În unele realizări, un anticorp descris aici creşte, promovează, sau ameliorează uciderea celulară tumorală. În unele realizări, un anticorp descris aici creşte, promovează, sau ameliorează inhibarea creşterii tumorii.

În anumite cazuri din divulgare, un agent descris aici este un antagonist al TIGIT uman. În unele cazuri, agentul este un antagonist al TIGIT şi activează şi/sau creşte un răspuns imun. În unele cazuri, agentul este un antagonist al TIGIT şi activează şi/sau creşte activitatea celulelor NK. În anumite cazuri, agentul creşte activitatea cu cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 30%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau aproximativ 100%. În unele cazuri, agentul este un antagonist al TIGIT şi activează şi/sau creşte activitatea celulelor T (de exemplu, activitatea celulelor T citolitice). În anumite cazuri, agentul creşte activitatea cu cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 30%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau aproximativ 100%. În unele cazuri, agentul este un antagonist al TIGIT şi induce şi/sau ameliorează un răspuns imun de tip Th1. În general, un răspuns imun de tip Th1 include producţia de interferon-gama (IFN-γ), IL-2, şi de factor de necroză tumorală-beta (TNF-β). În comparaţie, un răspuns imun de tip Th2 include în general producţia de IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, şi IL-13. În unele cazuri, agentul este un antagonist al TIGIT şi induce şi/sau creşte producţia de citokine sau limfokină. În unele cazuri, inducerea şi/sau creştere producţiei de citokine sau limfokină poate fi un efect indirect.

În anumite realizări, un anticorp descris aici creşte activarea celulelor NK. În anumite realizări, un anticorp descris aici creşte activarea celulelor T. În anumite realizări, activarea celulelor NK şi/sau a celulelor T de către un anticorp descris aici conduce la o creştere în nivelul de activare a celulelor NK şi/sau a celulelor T de cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 25%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau cel puţin aproximativ 95%. În anumite realizări, un anticorp care creşte activarea celulelor NK este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite realizări, un anticorp care creşte activarea celulelor NK este anticorpul 313M32.

În anumite realizări, anticorpul descris aici este un antagonist al activităţii celulei T regulatoare (Treg). În anumite realizări, anticorpul descris aici inhibă sau scade activitatea Treg-urilor. În anumite realizări, inhibarea activităţii Treg-urilor de către un anticorp descris aici conduce la o inhibare a activităţii supresive a unei celule Treg cu cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 25%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, cel puţin aproximativ 95%, sau aproximativ 100%. În anumite realizări, un anticorp care inhibă activitatea Treg este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite realizări, un anticorp care inhibă activitatea Treg este anticorpul 313M32.

În anumite realizări, anticorpul descris aici este un antagonist de celule supresoare derivate din mieloide (MDSC-uri). În anumite realizări, anticorpul descris aici inhibă activitatea MDSC. În anumite realizări, anticorpul descris aici inhibă activitatea MDSC cu cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 30%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau aproximativ 100%. În anumite realizări, un anticorp care inhibă activitatea MDSC este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite realizări, un anticorp care inhibă activitatea MDSC este anticorpul 313M32.

În anumite realizări, anticorpul descris aici creşte activitatea celulei ucigaşe natural (NK). În anumite realizări, anticorpul descris aici creşte activitatea celulei NK cu cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 30%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau aproximativ 100%. În anumite realizări, un anticorp care creşte activitatea celulei NK este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite realizări, un anticorp care creşte activitatea celulei NK este anticorpul 313M32.

În anumite realizări, anticorpul descris aici creşte activitatea limfocitelor de a se infiltra în tumoare (TIL). În anumite realizări, anticorpul descris aici creşte activitatea TIL cu cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 30%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau aproximativ 100%. În anumite realizări, un anticorp care creşte activitatea celulei TIL este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite realizări, un anticorp care creşte activitatea celulei TIL este anticorpul 313M32.

În anumite realizări, anticorpul descris aici creşte sau ameliorează activitatea celulei ucigaşe activată de limfokine (LAK). În anumite realizări, anticorpul descris aici creşte activitatea LAK cu cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 30%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 75%, cel puţin aproximativ 90%, sau aproximativ 100%. În anumite realizări, un anticorp care creşte activitatea celulei LAK este anticorpul 313M26 sau anticorpul 313M32. În anumite realizări, un anticorp care creşte activitatea celulei LAK este anticorpul 313M32.

Testele in vivo şi in vitro pentru a determina dacă un anticorp descris aici modulează un răspuns imun sunt cunoscute în domeniu sau sunt dezvoltate. În unele realizări, poate fi utilizat un test funcţional care detectează activarea celulelor T. În unele realizări, poate fi utilizat un test funcţional care detectează proliferarea celulei T. În unele realizări, poate fi detectat un test funcţional care detectează activitatea NK. În unele realizări, poate fi utilizat un test funcţional care detectează activitatea CTL. În unele realizări, poate fi utilizat un test funcţional care detectează activitatea Treg. În unele realizări, poate fi utilizat test funcţional care detectează activitatea MDSC. În unele realizări, poate fi utilizat un test funcţional care detectează producţia de citokine sau limfokine sau de celule care produc citokine sau limfokine. În unele realizări, este utilizat un test ELISpot pentru a măsura frecvenţa celulei T specifică antigenului. În unele realizări, este utilizat un test ELISpot pentru a măsura eliberarea de citokine/producţia şi/sau pentru a măsura numărul de citokine care produc celule. În unele realizări, sunt utilizate teste de citokine pentru a identifica un răspuns de tip Th1. În unele realizări, sunt utilizate teste de citokine pentru a identifica un răspuns de tip Th2. În unele realizări, sunt utilizate teste de citokine pentru a identifica un răspuns de tip Th17. În unele realizări, este utilizată analiza FACS pentru a măsura markerii de activare pe celule imune, incluzând dar fără a se limita la, celule T, celule B, celule NK, macrofage, şi/sau celule mieloide.

În anumite realizări, anticorpii descrişi aici au o perioadă de înjumătăţire în circulaţie la şoareci, şobolani, maimuţă cynomolguss, sau oameni de cel puţin aproximativ 2 ore, cel puţin aproximativ 5 ore, cel puţin aproximativ 10 ore, cel puţin aproximativ 24 ore, cel puţin aproximativ 3 zile, cel puţin aproximativ 1 săptămână, sau cel puţin aproximativ 2 săptămâni. În anumite realizări, anticorpul este un anticorp IgG (de exemplu, IgG1, IgG2, sau IgG4) care are o perioadă de înjumătăţire în circulaţie la şoareci, maimuţă cynomolguss, sau oameni de cel puţin aproximativ 2 ore, cel puţin aproximativ 5 ore, cel puţin aproximativ 10 ore, cel puţin aproximativ 24 ore, cel puţin aproximativ 3 zile, cel puţin aproximativ 1 săptămână, sau cel puţin aproximativ 2 săptămâni. Metodele de creştere (sau scădere) a perioadei de înjumătăţire a agenţilor cum ar fi polipeptidele şi anticorpii sunt cunoscute în domeniu. De exemplu, metodele cunoscute de creştere a perioadei de înjumătăţire în circulaţie a anticorpilor IgG include introducerea de mutaţii în regiunea Fc care cresc legarea dependentă de pH a anticorpului la receptorul Fc neonatal (FcRn) la pH 6,0. Metodele cunoscute de creştere a perioadei de înjumătăţire în circulaţie a fragmentelor de anticorp care nu au regiunea Fc, includ astfel de tehnici ca PEGilarea.

În unele cazuri din divulgare, agenţii de legare TIGIT sunt polipeptide. În unele cazuri, polipeptidele sunt polipeptide recombinante, polipeptide naturale, sau polipeptide sintetice cuprinzând un anticorp, sau fragment al acestuia, care se leagă la TIGIT. Este recunoscut în domeniu că unele secvenţe de aminoacizi din divulgare pot fi variate fără efecte semnificative ale structurii sau funcţionării proteinei. Astfel, divulgarea include în plus variaţii de polipeptide care arată activitate substanţială sau care include regiuni ale unui anticorp, sau fragment al acestuia, care se leagă la TIGIT. În unele cazuri, variaţiile secvenţei de aminoacizi ale polipeptidelor care se leagă la TIGIT includ deleţii, inserţii, inversiuni, repetări, şi/sau alte tipuri de substituţii.

Polipeptidele, analogii şi variantele acestora, pot fi modificate suplimentar pentru a conţine radicali chimici suplimentari care nu sunt în mod normal o parte a polipeptidei. Radicalii derivatizaţi pot îmbunătăţi sau altfel modula solubilitatea, perioada biologică de înjumătăţire, şi/sau absorbţia polipeptidei. Radicalii pot de asemenea reduce sau elimina efectele secundare nedorite ale polipeptidei şi variantelor acesteia. O revizie a radicalilor chimici poate fi găsită în Remington: The Science and Practice of Pharmacy, ediţia a 22-a, 2012, Pharmaceutical Press, London.

În anumite cazuri, polipeptidele descrise aici sunt izolate. În anumite cazuri, polipeptidele descrise aici sunt substanţial pure.

Polipeptidele descrise aici pot fi produse prin orice metodă adecvată cunoscută în domeniu. Astfel de metode variază de la metode directe de sinteză a proteinei pentru a construi o secvenţă ADN care codifică secvenţe de polipeptidă şi care exprimă acele secvenţe într-o gazdă adecvată. În unele cazuri, o secvenţă ADN este construită utilizând tehnologie recombinantă prin izolarea sau sintetizarea unei secvenţe ADN care codifică o proteină de tip sălbatic de interes. Opţional, secvenţa poate fi mutagenizată prin mutageneză specifică situsului pentru a furniza analogi funcţionali ai acesteia.

În unele cazuri, o secvenţă ADN care codifică o polipeptidă de interes poate fi construită prin sinteză chimică utilizând un sintetizator oligonucleotidic. Oligonucleotidele pot fi concepute pe baza secvenţa de aminoacizi a polipeptidei dorite şi selectarea acelor codoni care sunt favorizaţi în celula gazdă în care va fi produsă polipeptida recombinantă de interes. Metodele standard pot fi aplicate pentru a sintetiza o secvenţă de polinucleotidă care codifică o polipeptidă izolată de interes. De exemplu, o secvenţă completă de aminoacizi poate fi utilizată pentru a construi o genă translatată înapoi. În plus, poate fi sintetizat un oligomer ADN conţinând o secvenţă de nucleotide care codifică polipeptida izolată particulară. De exemplu, pot fi sintetizate câteva oligonucleotide mici care codifică porţiuni din polipeptida dorită şi apoi ligate. Oligonucleotidele individuale conţin de obicei protuberanţele 5' sau 3' pentru ansamblarea complementară.

Odată asamblate (prin sinteză, mutageneză direcţionată la situs, sau o altă metodă), secvenţele de polinucleotide care codifică o polipeptidă particulară de interes pot fi inserate într-un vector de expresie şi legate operativ la o secvenţă de contol a expresiei adecvată pentru expresia proteinei într-o gazdă dorită. Asamblarea corespunzătoare poate fi confirmată prin secvenţierea nucleotidei, restricţia mapării enzimei, şi/sau expresia unei polipeptide active biologic într-o gazdă adecvată. Aşa cum este bine cunoscut în domeniu, pentru a obţine niveluri ridicate de expresie ale unei gene transfectate într-o gazdă, gena trebuie să fie legată operativ la secvenţe de control transcripţional şi translaţional ale expresiei care sunt funcţionale în gazda de expresie aleasă.

În anumite cazuri, sunt utilizaţi vectori de expresie recombinanţi pentru a amplifica şi exprima ADN-ul care codifică anticorpii, sau fragmente ale acestora, împotriva TIGIT uman. De exemplu, vectorii de expresie recombinanţi pot fi construcţii ADN replicabile care au fragmente ADN sintetice sau derivate din ADNc care codifică un lanţ de polipeptidă a unui agent de legare TIGIT, cum ar fi un anticorp anti-TIGIT, sau fragment al acestuia, legat operativ la elemente regulatoare transcripţionale şi/sau translaţionale adecvate derivate dintr-o genă de mamifer, microbiană, virală sau de insectă. O unitate transcripţională cuprinde în general un ansamblu de (1) un element sau elemente genetice având un rol regulator în expresia genei, de exemplu, promotori sau amelioratori transcripţionali, (2) o secvenţă structurală sau codificatoare care este transcrisă în ARNm şi translatată în proteină, şi (3) secvenţe adecvate de iniţierea şi terminarea transcripţiei şi translaţiei. Elementele regulatoare pot include o secvenţă operatoare pentru a controla transcripţia. Pot fi încorporate suplimentar, abilitatea de replicare într-o gazdă, conferită uzual de o origine de replicare, şi o genă de selecţie pentru a facilita recunoaşterea transformanţilor. Regiunile ADN sunt „legate operativ« când ele sunt legate funcţional una cu cealaltă. De exemplu, ADN pentru o peptidă semnal (lider secretor) este legate operativ la ADN pentru o polipeptidă dacă este exprimat ca precursor care participă în secreţia polipeptidei; un promotor este legat operativ la o secvenţă codificatoare dacă el controlează transcripţia secvenţei; sau un situs de legare la ribozom este legat operativ la a secvenţă codificatoare dacă este poziţionat astfel încât să permită translaţia. În unele realizări, elementele structurale destinate pentru utilizare în sistemele de expresie ale drojdiei includ o secvenţă lider care permite secreţia extracelulară a proteinei translatate de către o celulă gazdă. În alte realizări, în situaţiile unde proteina recombinantă este exprimată fără o secvenţă lider sau de transport, se poate include un rest de metionină N-terminală. Acest rest poate fi clivat opţional ulterior din proteina recombinantă exprimată pentru a furniza un produs final.

Alegerea unei secvenţe de contol a expresiei şi a unui vector de expresie depind de alegerea gazdei. Poate fi utilizată o largă varietate de combinaţii de expresie gazdă/vector. Vectorii de expresie utili pentru gazdele eucariote includ, de exemplu, vectori cuprinzând secvenţe de control ale expresiei de la SV40, virus papilom bovin, adenovirus, şi citomegalovirus. Vectorii de expresie utili pentru gazde bacteriene includ plasmidele bacteriene cunoscute, cum ar fi plasmidele din E. coli, incluzând pCR1, pBR322, pMB9 şi derivaţi ai acestora, şi plasmide gazdă în intervale mai mari, cum ar fi M13 şi alţi fagi ADN monocatenari filamentoşi.

Anticorpii sau agenţii bispecifici din prezent pot fi exprimaţi din unul sau mai mulţi vectori. De exemplu, în unele realizări, un lanţ greu de polipeptidă este exprimat de un vector, un al doilea lanţ greu de polipeptidă este exprimate de un al doilea vector şi un lanţ uşor de polipeptidă este exprimat de un al treilea vector. În unele realizări, un prim lanţ greu de polipeptidă şi un lanţ uşor de polipeptidă sunt exprimate de un vector şi un al doilea lanţ greu de polipeptidă este exprimat de un al doilea vector. În unele realizări, două lanţuri grele de polipeptide sunt exprimate de un vector şi un lanţ uşor de polipeptidă este exprimat de un al doilea vector. În unele realizări, trei polipeptide sunt exprimate dintr-un vector. Astfel, în unele realizări, un prim lanţ greu de polipeptidă, un al doilea lanţ greu de polipeptidă, şi un lanţ uşor de polipeptidă sunt exprimate de către un singur vector.

Celulele gazdă adecvate pentru expresia unui anticorp sau a unui agent bispecific includ procariote, celule de drojdie, celule de insecte, sau celule eucariote superioare sub controlul promotorilor adecvaţi. Procariotele includ organisme gram-negative sau gram-pozitive, de exemplu E. coli sau Bacillus. Celulele eucariote superioare includ linii celulare stabilite de origine de la mamifer cum s-a descris mai jos. Sistemele de translaţie fără celule pot fi de asemenea utilizate. Sunt bine cunoscuţi în domeniu vectorii de clonare şi expresie adecvaţi pentru utilizare cu celule gazdă de bacterii, fungi, drojdie, şi de mamifer, precum şi metodele de producţie a proteinei, incluzând producţia de anticorpi.

Pot fi utilizate diferite sisteme de cultură de mamifer pentru a exprima polipeptidele recombinante. Expresia de proteine recombinante în celule de mamifer poate fi dorită deoarece aceste proteine sunt în general pliate corect, modificate adecvat, şi funcţionale biologic. Exemple de linii celulare gazdă adecvate de mamifer includ, dar nu se limitează la, liniile celulare COS-7 (derivate din rinichi de maimuţă), L-929 (derivate din fibroblaste murine), C127 (derivate din tumoare mamară murină), 3T3 (derivate din fibroblaste murine), CHO (derivate din ovar de hamster chinezesc), HeLa (derivate din cancer de col uterin uman), BHK (derivate din fibroblaste de rinichi de hamster), HEK-293 (derivate din rinichi embrionar uman) şi variante ale acestora. Vectorii de expresie de mamifer pot cuprinde elemente non-transcrise cum ar fi o origine de replicare, un promotor adecvat şi un ameliorator legat la gena care urmează să fie exprimată, şi alte secvenţe non-transcrise de flancare 5' sau 3', şi secvenţe netranslatate 5' sau 3', cum ar fi situsurile necesare de legare la ribozom, un situs de poliadenilare, situsuri de îmbinare donatoare şi acceptoare, şi secvenţe de terminare transcripţionale.

Expresia proteinelor recombinante în sistemele de cultură celulară de insecte (de exemplu, baculovirus) oferă de asemenea oferă o metodă robustă pentru producerea proteinelor pliate corect şi funcţionale biologic. Sistemele Baculovirus pentru producţia de proteine heterologe în celule de insecte sunt bine cunoscute celor calificaţi în domeniu.

Astfel, prezenta invenţie furnizează celule cuprinzând anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici. În anumite realizări, celulele produc anticorpul 313R20. În anumite realizări, celulele produc anticorpul 313M26. În anumite realizări, celulele produc anticorpul 313M32. În unele realizări, celula este o celulă hibridom. În unele realizări, celula este o celulă de mamifer. În unele realizări, celula este o celulă procariotă. În unele realizări, celula este o celulă eucariotă.

Proteinele produse de o gazdă transformată pot fi purificate în conformitate cu orice metodă adecvată. Metodele standard includ cromatografia (de exemplu, schimbare de ioni, afinitate, şi cromatografie pe coloană cu dimensionare), centrifugarea, solubilitatea diferenţială, sau prin orice altă tehnică standard pentru purificarea proteinei. Etichetele de afinitate cum ar fi hexa-histidina, domeniul de legare al maltozei, secvenţa de acoperire gripală, şi transferaza glutation-S pot fi ataşate la proteină pentru a permite purificarea uşoară prin trecerea peste o coloană de afinitate adecvată. Cromatografia de afinitate utilizată pentru purificarea imunoglobulinei poate include cromatografia cu Proteină A, Proteină G, şi Proteină L. Proteinele izolate pot fi caracterizate fizic utilizând astfel de tehnici ca proteoliza, cromatografia de excludere dimensională (SEC), spectrometria de masă (MS), rezonanţa magnetică nucleară (RMN), focalizarea izoelectrică (IEF), cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC), şi cristalografia cu raze X. Puritatea proteinelor izolate poate fi determinată utilizând tehnici cunoscute celor calificaţi în domeniu, incluzând dar fără a se limita la, SDS-PAGE, SEC, electroforeză capilară în gel, IEF, şi focalizare izoelectrică capilară (cIEF).

În unele realizări, supernatanţii din sistemul de expresie care secretă proteina recombinantă în mediul de cultură pot fi mai întȃi concentraţi utilizând un filtru de concentraţie a proteinei disponibil comercial, de exemplu, o unitate de ultrafiltrare Amicon sau Millipore Pellicon. După etapa de concentraţie, concentratul poate fi aplicat unei matrice de purificare adecvate. În unele realizări, poate fi utilizată o răşină cu schimbare de ioni, de exemplu, o matrice sau substrat având grupări dietilaminoetil suspendate (DEAE). Matricile pot fi de acrilamidă, agaroză , dextran, celuloză, sau alte tipuri utilizate în mod obişnuit în purificarea proteinei. În unele realizări, poate fi utilizată o etapă de schimbare de cationi. Schimbările adecvate de cationi includ diferite matrice insolubile cuprinzând grupări sulfopropil sau carboximetil. În unele realizări, poate fi utilizat un mediu hidroxiapatit, incluzând dar fără să se limiteze la, hidroxiapatite ceramice (CHT). În anumite realizări, una sau mai multe etape HPLC cu fază inversă utilizând mediu RP-HPLC hidrofob, de exemplu, gel de siliciu având metil sau alte grupări alifatice suspendate, pot fi utilizate pentru a purifica suplimentar o proteină recombinantă (de exemplu, un agent de legare TIGIT). Unele sau toate dintre etpele de purificare anterioare, în diferite combinaţii, pot fi utilizate pentru a furniza o proteină recombinantă omogenă.

În unele realizări, proteinele heterodimerice cum ar fi anticorpii bispecifici sunt purificate conform oricărora dintre metodele descrise aici. În unele realizări, anticorpii bispecifici anti-TIGIT sunt izolaţi şi/sau purificaţi utilizând cel puţin o etapă de cromatografie. În unele realizări, acea cel puţin o etapă de cromatografie cuprinde cromatografie de afinitate. În unele realizări, acea cel puţin o etapă de cromatografie cuprinde în plus o cromatografie cu schimb de ioni. În unele realizări, produsul anticorp izolat şi/sau purificat cuprinde cel puţin 90% anticorp heterodimeric. În unele realizări, produsul anticorp izolat şi/sau purificat cuprinde cel puţin 95%, 96%, 97%, 98% sau 99% anticorp heterodimeric. În unele realizări, produsul anticorp izolat şi/sau purificat cuprinde aproximativ 100% anticorp heterodimeric.

În unele realizări, o polipeptidă produsă în cultură bacteriană poate fi izolată, de exemplu, prin extragerea iniţială din granule celulare, urmată de unul sau mai multe etape de concentrare, desalinizare, schimbare apoasă de ioni, sau cromatografie de excludere dimensională. HPLC pot fi utilizate pentru etapele de purificare finale. Celulele microbiene utilizate în expresia unei proteine recombinante pot fi perturbate prin orice metodă convenabilă, incluzând cicluri de congelare-dezgheţare, sonicare, întrerupere mecanică, sau utilizarea unor agenţi de lizare celulară.

În anumite cazuri din divulgare, agentul de legare TIGIT este o polipeptidă care nu este un anticorp sau nu cuprinde o regiune Fc de imunoglobulină. O varietate de metode pentru identificarea şi producerea polipeptidelor non-anticorp care se leagă cu afinitate ridicată la o proteină ţintă sunt cunoscute în domeniu. În anumite cazuri, tehnologia de afişare pe bacteriofagi sau mamifer poate fi utilizată pentru a produce şi/sau identifica o polipeptidă de legare la TIGIT. În anumite cazuri, polipeptida cuprinde un eşafodaj al proteinei de un tip selectat din grupul constând din proteina A, proteina G, o lipocalină, un domeniu de fibronectină, un domeniu de repetare consens al ankirinei şi tioredoxină. O varietate de metode pentru identificarea şi producerea polipeptidei non-anticorp care se leagă cu afinitate ridicată la o proteină ţintă sunt cunoscute în domeniu. În anumite cazuri, tehnologia de afişare pe bacteriofagi poate fi utilizată pentru a produce şi/sau identifica o polipeptidă de legare. În anumite cazuri, tehnologia de afişare pe celulă de mamifer poate fi utilizată pentru a produce şi/sau identific o polipetidă de legare.

Se poate dori suplimentar să se modifice o polipeptidă pentru a creşte (sau scad) perioada sa de înjumătăţire în ser. Acest lucru poate fi obţinut, de exemplu, prin încorporarea unui receptor de salvare care se leagă la epitop în polipeptidă prin mutaţia regiunii adecvate din polipeptidă sau prin încorporarea epitopului într-o etichetă de peptidă care este apoi fuzionată la polipeptidă fie la sfȃrşit sau fie în mijloc (de exemplu, prin sinteză ADN sau de peptidă).

Moleculele heteroconjugate sunt de asemenea în domeniul prezentei divulgări. Moleculele heteroconjugate sunt compuse din două polipeptide îmbinate covalent. Astfel de molecule au fost propuse, de exemplu, să ţintească celulele imune la celulele nedorite, cum ar fi celulele tumorale. Este de asemenea avut în vedere că moleculele heteroconjugate pot fi preparate in vitro utilizând metode cunoscute în chimia proteinei sintetice, incluzându-le pe cele care implică agenţi de reticulare. De exemplu, imunotoxinele pot fi construite utilizând o reacţie de schimb de disulfură sau prin formarea unei legături tioeter. Exemple de reactivi adecvaţi pentru acest scop includ iminotiolat şi metil-4-mercaptobutirimidat.

În anumite cazuri, agenţii de legare TIGIT pot fi utilizaţi în oricare dintr-un număr de forme conjugate (adică un imunoconjugat sau radioconjugat) sau neconjugate. În anumite cazuri, agenţii pot fi utilizaţi într-o formă neconjugată pentru a valorifica mecanismele de apărare naturale ale subiectului, incluzând citotoxicitatea dependentă de complement (CDC) şi citotoxicitatea celulară dependentă de anticorp (ADCC) pentru a elimina celule maligne sau canceroase.

În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este conjugat la un agent citotoxic. În unele cazuri, agentul de legare TIGIT este un anticorp care este conjugat la un agent citotoxic ca un ADC (conjugat anticorp-medicament). În unele cazuri, agentul citotoxic este un agent chimioterapic incluzând, dar fără a se limita la, metotrexat, adriamicină/doxorubicină, melfalan, mitomicină C, clorambucil, daunorubicină, pirolobenzodiazepină (PBDs), sau alţi agenţi de intercalare. În unele cazuri, agentul citotoxic este o toxină enzimatică activă de origine bacteriană, fungală, de plante, sau animală, sau fragmente ale acesteia, incluzând, dar fără a se limita la, catena de difterie A, fragmente active de nelegare ale toxinei de difterie, catenă de exotoxină A, catenă de ricin A, catenă de abrină A, catenă de modecin A, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine de diantină, proteine de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, şi PAP-S), inhibitor de Momordica charantia, curcină, crotină, inhibitor de Sapaonaria officinalis, gelonină, mitogelină, restrictocină, fenomicină, enomicină, şi tricotecenă. În unele cazuri, agentul citotoxic este un radioizotop pentru a produce un radioconjugat sau un anticorp radioconjugat. O varietate de radionuclizi sunt disponibili pentru producţia de anticorpi radioconjugaţi incluzând, dar fără a se limita la, 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 131In, 105Rh, 153Sm, 67CU, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re şi 212Bi. Pot fi de asemenea utilizaţi conjugaţii unui anticorp şi una sau mai multe toxine de micromolecule, cum ar fi caliceamicinele, maitansinoidele, tricotenele, şi CC1065, şi derivaţi ai acestor toxine care au activitate toxină. Conjugaţii unui anticorp şi agentul citotoxic pot fi făcuţi utilizând o varietate de agenţi de cuplare la proteina bifuncţională cum ar fi propionat de N-succinimidil-3-(2-piridiiditiol) (SPDP), iminotiolan (IT), derivaţi bifuncţionali de imidoesteri (cum ar fi HCl de dimetil adipimidat), esteri activi (cum ar fi suberat de disuccinimidil), aldehide (cum ar fi glutaraldehidă), compuşi bis-azido (cum ar fi hexandiamina de bis(p-azidobenzoil)), derivaţi de bis-diazoniu (cum ar fi bis-(p-diazoniubenzoil)-etilendiamină), diizocianaţi (cum ar fi toluen 2,6-diizocianat), şi compuşi de fluor bis-activi (cum ar fi 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen).

III. Polinucleotide

În anumite realizări, invenţia cuprinde polinucleotide cuprinzând polinucleotide care codifică anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici. Termenul „polinucleotide care codifică o polipeptidă« cuprinde o polinucleotidă care include numai secvenţele care codifică polipeptida precum şi o polinucleotidă care include secvenţe suplimentare codificatoare şi/sau necodificatoare. Polinucleotidele invenţiei pot fi în formă de ARN sau în formă de ADN. ADN include ADNc, ADN genomic, şi ADN sintetic; şi poate fi dublu catenar sau monocatenar, şi dacă este monocatenar poate fi cu catenă codificatoare sau cu catenă necodificatoare (anti-sens).

În anumite cazuri din divulgare, polinucleotida cuprinde o polinucleotidă (de exemplu, o secvenţă de nucleotide) care codifică o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:55, şi SEQ ID NO:56.

În anumite cazuri, o polinucleotidă cuprinde o polinucleotidă având o secvenţă de nucleotide cel puţin aproximativ 80% identică, cel puţin aproximativ 85% identică, cel puţin aproximativ 90% identică, cel puţin aproximativ 95% identică, şi în unele cazuri, cel puţin aproximativ 96%, 97%, 98% sau 99% identică cu o polinucleotidă care codifică o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:55, şi SEQ ID NO:56. De asemenea este furnizată o polinucleotidă care cuprinde o polinucleotidă care hibridizează la o polinucleotidă care codifică o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din: SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:55, şi SEQ ID NO:56. În anumite cazuri, hibridizarea este în condiţii de stringenţă ridicată. Condiţiile de stringenţă ridicată sunt cunoscute celor calificaţi în domeniu şi pot include dar nu sunt limitate la, (1) utilizarea de tărie ionică scăzută şi temperatură ridicată pentru spălare, de exemplu 15mM clorură de sodiu/1,5mM citrat de sodiu (1x SSC) cu 0,1% sulfat dodecil de sodiu la 50°C; (2) utilizarea în timpul hibridizării a unui agent de denaturare, cum ar fi formamida, de exemplu, 50% (v/v) formamidă cu 0,1% albumină din ser bovin/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirolidonă/50mM tampon de fosfat de sodiu la pH 6,5 în 5x SSC (0,75M NaCl, 75mM citrat de sodiu) la 42°C; sau (3) utilizarea a 50% formamidă, 5x SSC, 50mM fosfat de sodiu (pH 6,8), 0,1% pirofosfat de sodiu, 5x soluţie Denhardt, ADN de spermă de somon sonicată (50µg/ml), 0,1% SDS, şi 10% sulfat de dextran la 42°C, cu spălări în 0,2x SSC conţinând 50% formamidă la 55°C, urmată de o spălare la stringenţă ridicată constând din 0,1x SSC conţinând EDTA la 55°C.

În anumite cazuri, polinucleotida cuprinde o polinucleotidă care codifică o polipeptidă cuprinzând o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din: SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:82, şi SEQ ID NO:83.

În anumite cazuri, o polinucleotidă cuprinde o polinucleotidă având o secvenţă de nucleotide cel puţin aproximativ 80% identică, cel puţin aproximativ 85% identică, cel puţin aproximativ 90% identică, cel puţin aproximativ 95% identică, şi în unele cazuri, cel puţin aproximativ 96%, 97%, 98% sau 99% identică cu o polinucleotidă care codifică o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din: SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:82, şi SEQ ID NO:83. De asemenea este furnizată o polinucleotidă care cuprinde o polinucleotidă care hibridizează la o polinucleotidă care codifică o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din: SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:82, şi SEQ ID NO:83.

În unele cazuri, polinucleotida cuprinde o secvenţă de polinucleotidă selectată din grupul constând din: SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, şi SEQ ID NO:84. În anumite cazuri, o polinucleotidă cuprinde o polinucleotidă având o secvenţă de nucleotide cel puţin aproximativ 80% identică, cel puţin aproximativ 85% identică, cel puţin aproximativ 90% identică, cel puţin aproximativ 95% identică, şi în unele cazuri, cel puţin aproximativ 96%, 97%, 98% sau 99% identică cu o secvenţă de nucleotide selectată din grupul constând din: SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, şi SEQ ID NO:84. De asemenea este furnizată o polinucleotidă care cuprinde o polinucleotidă care hibridizează la o secvenţă de polinucleotidă selectată din grupul constând din: SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, şi SEQ ID NO:84. În anumite cazuri, tehnicile de hibridizare sunt efectuate în condiţii d stringenţă ridicată cum s-a descris mai sus.

În anumite cazuri, o polinucleotidă cuprinde secvenţa codificatoare pentru polipeptida matură fuzionată în acelaşi cadru de citire la o polinucleotidă care ajută, de exemplu, în expresia şi secreţia unei polipeptide dintr-o celulă gazdă (de exemplu, o secvenţă lider care funcţionează ca secvenţă secretoare pentru controlarea transportului unei polipeptide din celulă). Polipeptida având o secvenţă lider este o preproteină şi poate avea secvenţa lider clivată de către celula gazdă pentru a forma forma matură a polipeptidei. Polinucleotidele pot codifica de asemenea o proproteină care este proteina matură plus resturile de aminoacid 5' suplimentare. O proteină matură având o prosecvenţă este o proproteină şi este o formă inactivă a proteinei. Odată ce prosecvenţă este clivată, rămȃne o proteină matură activă.

În anumite cazuri, o polinucleotidă cuprinde secvenţa codificatoare pentru polipeptida matură fuzionată în acelaşi cadru de citire la o secvenţă marker care permite, de exemplu, purificarea polipeptidei codificate. De exemplu, secvenţa marker poate fi o etichetă hexa-histidină furnizată de un vector pQE-9 pentru a furniza purificarea polipeptidei mature fuzionate la marker în cazul unei gazde bacteriene, sau secvenţa marker poate fi o etichetă de hemaglutinină (HA) derivată din proteina de hemaglutinină a gripei când este utilizată o gazdă mamifer (de exemplu, celulele COS-7). În unele cazuri, secvenţa marker este o etichetă FLAG, o peptidă de secvenţă DYKDDDDK (SEQ ID NO:40) care poate fi utilizată în conjuncţie cu alte etichete de afinitate.

Prezenta divulgare se referă în plus la variante ale polinucleotidei descrise aici, în care varianta codifică, de exemplu, fragmente, analogi, şi/sau derivaţi.

În anumite cazuri, prezenta invenţie furnizează o polinucleotidă cuprinzând o polinucleotidă având o secvenţă de nucleotide cel puţin aproximativ 80% identică, cel puţin aproximativ 85% identică, cel puţin aproximativ 90% identică, cel puţin aproximativ 95% identică, şi în unele cazuri, cel puţin aproximativ 96%, 97%, 98% sau 99% identică cu o polinucleotidă care codifică o polipeptidă cuprinzând un agent de legare TIGIT descris aici.

Aşa cum s-a utilizat în acest document, exprimarea o polinucleotidă având o secvenţă de nucleotide cel puţin, de exemplu, 95% „identică« cu o secvenţă de referinţă de nucleotide, intenţionează să însemne că secvenţa de nucleotide a polinucleotidei este identică cu secvenţa de referinţă cu excepţia faptului că că secvenţa de polinucleotidă poate include până la cinci mutaţii punctuale pe fiecare 100 nucleotide ale secvenţei de referinţă de nucleotide. Cu alte cuvinte, pentru a obţine o polinucleotidă având o secvenţă de nucleotide cel puţin 95% identică cu o secvenţă de referinţă de nucleotide, până la 5% din nucleotidele din secvenţa de referinţă pot fi şterse sau substituite cu o altă nucleotidă, sau un număr de nucleotide până la 5% din totalul de nucleotide din secvenţa de referinţă poate fi inserat în secvenţa de referinţă. Aceste mutaţii ale secvenţei de referinţă pot avea loc la poziţiile terminale 5' sau 3' ale secvenţei de referinţă de nucleotide sau oriunde între acele poziţii terminale, intercalate fie individual printre nucleotidele din secvenţa de referinţă sau fie în una sau mai multe grupări contigue din secvenţa de referinţă.

Variantele de polinucleotidă pot conţine alterări în regiunile codificatoare, în regiunile necodificatoare, sau în ambele. În unele realizări, o variantă de polinucleotidă conţine alterări care produc substituţii, adăugări, sau deleţii, tăcute, dar nu alterează proprietăţile sau activităţile polipeptidei codificate. În unele realizări, o variantă de polinucleotidă cuprinde substituţii tăcute care nu conduc la nici o modificare în secvenţa de aminoacizi a polipeptidei (datorită degenerării codului genetic). Variantele de polinucleotidă pot fi produse pentru o varietate de motive, de exemplu, pentru a optimiza expresia codonului pentru o gazdă particulară (adică, modificarea codonilor în ARNm uman la cei preferaţi cu o gazdă bacteriană cum ar fi E. coli). În unele realizări, o variantă de polinucleotidă cuprinde cel puţin o mutaţie tăcută într-o regiune necodificatoare sau codificatoare a secvenţei.

În unele cazuri, este produsă o variantă de polinucleotidă pentru a modula sau altera expresia (sau nivelurile de expresie) ale polipeptidei codificate. În unele cazuri, o variantă de polinucleotidă este produsă pentru a creşte expresia polipeptidei codificate. În unele cazuri, o variantă de polinucleotidă este produsă pentru a scădea expresia polipeptidei codificate. În unele cazuri, o variantă de polinucleotidă are expresie crescută a polipeptidei codificate în comparaţie cu o secvenţă de polinucleotidă parentală. În unele cazuri, o variantă de polinucleotidă are o expresie scăzută a polipeptidei codificate în comparaţie cu o secvenţă de polinucleotidă parentală.

În unele cazuri, cel puţin o variantă de polinucleotidă este produsă (fără să modifice secvenţa de aminoacizi a polipeptidei codificate) pentru a creşte producţia unei molecule heterodimerice. În unele cazuri, cel puţin o variantă de polinucleotidă este produsă (fără să modifice secvenţa de aminoacizi a polipeptidei codificate) pentru a creşte producţia unui anticorp bispecific.

În anumite realizări ale invenţiei, polinucleotidele sunt izolate. În anumite realizări, polinucleotidele sunt substanţial pure.

Vectorii şi celulele cuprinzând polinucleotidele descris aici sunt de asemenea furnizaţi. În unele realizări, un vector de expresie cuprinde o moleculă de polinucleotidă. În unele realizări, o celulă gazdă cuprinde un vector de expresie cuprinzând molecula de polinucleotidă. În unele realizări, o celulă gazdă cuprinde o moleculă de polinucleotidă.

IV. Metode de utilizare şi compoziţii farmaceutice

Anticorpii şi agenţii bispecifici ai invenţiei sunt utili într-o varietate de aplicaţii incluzând, dar fără a se limita la, metode terapeutice de tratament, cum ar fi tratamentul cancerului. În unele realizări, metodele terapeutice de tratament cuprind imunoterapie pentru cancer. În anumite realizări, anticorpii şi agenţii bispecifici descrişi aici sunt utili pentru activarea, promovarea, creşterea, şi/sau amplificarea unui răspuns imun, inhibarea creşterea tumorii, reducerea volumului tumoral, creşterea apoptozei celulei tumorale, şi/sau reducerea tumorigenicităţii unei tumori. În unele realizări, anticorpii şi agenţii bispecifici ai invenţiei sunt de asemenea utili pentru imunoterapia împotriva patogenilor, cum ar fi virusurilr. În anumite realizări, un anticorp sau agent bispecific descris aici sunt utili pentru activarea, promovarea, creşterea, şi/sau amplificarea unui răspuns imun, inhibarea infecţiei virale, reducerea infecţiei virale, creşterea apoptozei celulelor infectate viral, şi/sau creşterea uciderii celulelor infectate cu virus. Metodele de utilizare pot fi metode in vitro, ex vivo, sau in vivo.

Prezenta invenţie furnizează anticorpii şi agenţii bispecifici descrişi aici pentru utilizare în metode pentru activarea unui răspuns imun la un subiect. În unele realizări, invenţia furnizează anticorpii şi agenţii bispecifici descrişi aici pentru utilizare în metode pentru promovarea unui răspuns imun la un subiect. În unele realizări, invenţia furnizează anticorpii şi agenţii bispecifici descrişi aici pentru utilizare în metode pentru creşterea unui răspuns imun la un subiect. În unele realizări, invenţia furnizează anticorpii şi agenţii bispecifici descrişi aici pentru utilizare în metode pentru amplificarea unui răspuns imun la un subiect. În unele realizări, activarea, promovarea, creşterea, şi/sau amplificarea unui răspuns imun cuprinde creşterea imunităţii mediate de celulă. În unele realizări, activarea, promovarea, creşterea, şi/sau amplificarea unui răspuns imun cuprinde creşterea activităţii celulei T. În unele realizări, activarea, promovarea, creşterea, şi/sau amplificarea unui răspuns imun cuprinde creşterea activităţii CTL. În unele realizări, activarea, promovarea, creşterea, şi/sau amplificarea unui răspuns imun cuprinde creşterea activităţii celulei NK. În unele realizări, activarea, promovarea, creşterea, şi/sau amplificareaa unui răspuns imun cuprinde creşterea activităţii celulei T şi creşterea activităţii celulei NK. În unele realizări, activarea, promovarea, creşterea, şi/sau amplificarea unui răspuns imun cuprind creşterea activităţii CTL şi creşterea activităţii celulei NK. În unele realizări, activarea, promovarea, creşterea, şi/sau amplificarea unui răspuns imun cuprind inhibarea sau scăderea activităţii supresive a Treg-urilor. În unele realizări, activarea, promovarea, creşterea, şi/sau amplificarea unui răspuns imun cuprind inhibarea sau scăderea activităţii supresive a MDSC-urilor. În unele realizări, răspunsul imun este un rezultat al stimulării antigenice. În unele realizări, stimularea antigenică este o celulă tumorală. În unele realizări, stimularea antigenică este cancerul. În unele realizări, stimularea antigenică este un patogen. În unele realizări, stimularea antigenică este un virus. În unele realizări, stimularea antigenică este o celulă infectată viral. În unele realizări din oricare dintre metodele descrise aici, anticorpul este 313M32.

În unele realizări, anticorpii şi agenţii bispecifici descrişi aici sunt pentru utilizare într-o metodă de creştere a unui răspuns imun la un subiect care cuprinde administrarea acestora către subiect. În unele realizări, metoda de creştere a unui răspuns imun la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic de anticorp 313M32.

În unele cazuri din divulgare, aceasta furnizează utilizarea unui agent de legare TIGIT descris aici în fabricarea sau preparare unui medicament pentru activarea, promovarea, creşterea, şi/sau amplificarea unui răspuns imun. În unele cazuri, invenţia furnizează utilizarea unui agent de legare TIGIT descris aici în fabricarea sau prepararea unui medicament pentru creşterea imunităţii mediate de celulă. În unele cazuri, invenţia furnizează utilizarea unui agent de legare TIGIT descris aici în fabricarea sau prepararea unui medicament pentru creşterea activităţii celulei T. În unele cazuri, invenţia furnizează utilizarea unui agent de legare TIGIT descris aici în fabricarea sau prepararea unui medicament pentru creşterea activităţii CTL. În unele cazuri, invenţia furnizează utilizarea unui agent de legare TIGIT descris aici în fabricarea sau prepararea unui medicament pentru creşterea activităţii NK. În unele cazuri, invenţia furnizează utilizarea unui agent de legare TIGIT descris aici în fabricarea sau prepararea unui medicament pentru inhibarea sau scăderea activităţii supresive a Treg-urilor. În unele cazuri, invenţia furnizează utilizarea unui agent de legare TIGIT descris aici în fabricarea sau prepararea unui medicament pentru inhibarea sau scăderea activităţii supresive a MDSC-urilor.

Invenţia furnizează de asemenea anticorpul sau agenţii bispecifici descrişi aici pentru utilizare în metode de inhibare şi/sau reducere a semnalizării TIGIT într-o celulă. În unele realizări, metoda de inhibare şi/sau reducere a semnalizării TIGIT într-o celulă cuprinde punerea în contact a celulei cu o cantitate eficientă a anticorpului 313M32. În anumite realizări, celula este o celulă T. În unele realizări, celula este o celulă T activată. În unele realizări, celula este o celulă NK. În unele realizări, celula este o Treg. În unele realizări, celula este o MDSC. În unele realizări, metoda este o metodă in vitro sau ex vivo.

Prezenta invenţie furnizează de asemenea anticorpul sau agenţii bispecifici descrişi aici pentru utilizare în metode pentru inhibarea creşterii unei tumori utilizând anticorpii descrişi aici. În unele realizări, metoda de inhibare a creşterii unei tumori cuprinde utilizarea anticorpului 313M32. În anumite realizări, metoda de inhibare a creşterii unei tumori cuprinde punerea în contact a unui amestec de celule cu agentul de legare TIGIT in vitro. De exemplu, o linie celulară imortalizată sau o linie celulară canceroasă amestecată cu celule imune (de exemplu, celule T sau celule NK) este cultivată în mediul la care se adaugă un agent de testare care se leagă la TIGIT. În unele realizări, celulele tumorale sunt izolate de la o mostră a pacientului cum ar fi, de exemplu, o biopsie de ţesut, efuziune pleurală, sau mostră de sânge, amestecate cu celule imune (de exemplu, celule T şi/sau celule NK), şi cultivate în mediul la care se adaugă un agent de testare care se leagă la TIGIT. În unele realizări, anticorpul sau agentul bispecific creşte, promovează, şi/sau ameliorează activitatea celulelor imune. În unele realizări, anticorpul sau agentul bispecific inhibă creşterea celulei tumorale.

În unele realizări, metoda de inhibare a creşterii unei tumori cuprinde punerea în contact a tumorii sau a celulelor tumorale cu un anticorp sau un agent bispecific descris aici in vivo. În anumite realizări, punerea în contact a tumorii sau celulei tumorale cu un anticorp sau agent bispecific este întreprinsă într-un model pe animal. De exemplu, un agent de testare poate fi administrat şoarecilor care au tumori. În unele realizări, un anticorp sau agent bispecific creşte, promovează, şi/sau ameliorează activitatea celulelor imune la şoareci. În unele realizări, un anticorp sau agent bispecific inhibă creşterea tumorii. În unele realizări, un anticorp sau agent bispecific cauzează regresia unei tumori. În unele realizări, un anticorp sau agent bispecific este administrat în acelaşi timp sau la scurt timp după introducerea celulelor tumorale în animal pentru a preveni creşterea tumorii („model preventiv«). În unele realizări, un anticorp sau agent bispecific este administrat ca terapeutic după de tumorile au crescut la o dimensiune specificată sau au devenit „stabilite« („model terapeutic«).

În anumite realizări, metoda de inhibare a creşterii unei tumori cuprinde administrarea la un subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un anticorp sau agent bispecific descrise aici. În anumite realizări, subiectul este un om. În anumite realizări, subiectul are o tumoare sau subiectul a avut o tumoare care a fost cel puţin parţial îndepărtată. În unele realizări, metoda de inhibare a creşterii unei tumori cuprinde administrarea la un subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic de anticorp 313M32.

În plus, invenţia furnizează anticorpul sau agenţii bispecifici descrişi aici pentru utilizare într-o metodă de inhibare a creşterii unei tumori la un subiect, cuprinzând administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un anticorp sau agent bispecific descrise aici. În unele realizări, invenţia furnizează utilizarea unui anticorp sau agent bispecific descrise aici în fabricarea sau prepararea unui medicament pentru inhibarea creşterii unei tumori sau celule tumorale. În anumite realizări, tumoarea cuprinde celule stem canceroase. În anumite realizări, frecvenţa celulelor stem canceroase în tumoare este redusă prin administrarea agentului. În unele realizări, este prevăzută o metodă de reducere a frecvenţei celulelor stem canceroase într-o tumoare la un subiect, cuprinzând administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic dintr-un anticorp sau agent bispecific.

În plus, invenţia furnizează anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici pentru utilizare într-o metodă de reducere a tumorigenicităţii unei tumori la un subiect. În anumite realizări, tumoarea cuprinde celule stem canceroase. În unele realizări, tumorigenicitatea unei tumori este redusă prin reducerea frecvenţei celulelor stem canceroase în tumoarea. În unele realizări, metodele cuprind utilizarea anticorpilor sau agenţilor bispecifici descrişi aici. În anumite realizări, frecvenţa celulelor stem canceroase în tumoare este redusă prin administrarea unui anticorp sau agent bispecific descrise aici. În unele realizări, o metodă de reducere a tumorigenicităţii unei tumori la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic de anticorp 313M32.

În unele realizări, tumoarea este o tumoare solidă. În anumite realizări, tumoarea este o tumoare selectată din grupul constând din: tumoare colorectală, tumoare pancreatică, tumoare pulmonară, tumoare ovariană, tumoare la ficat, tumoare la sân, tumoare la rinichi, tumoare la prostată, tumoare neuroendocrină, tumoare gastrointestinală, melanom, tumoare cervicală, tumoare vezicală, glioblastom, şi tumoare la cap şi gât. În anumite realizări, tumoarea este o tumoare colorectală. În anumite realizări, tumoarea este o tumoare ovariană. În unele realizări, tumoarea este o tumoare pulmonară. În anumite realizări, tumoarea este o tumoare pancreatică. În anumite realizări, tumoarea este o tumoare la melanom.

Prezenta invenţie furnizează anticorpul sau agentul bispecific descrise aici pentru utilizare în metode pentru tratarea cancerului cuprinzând administrarea la un subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic de agent de legare TIGIT descris aici (de exemplu, unui subiect care are nevoie de tratament). În unele realizări, anticorpul sau agentul bispecific inhibă sau reduce creşterea cancerului. În anumite realizări, subiectul este un om. În anumite realizări, subiectul are o tumoare canceroasă. În anumite realizări, subiectul a avut o tumoare cel puţin îndepărtată parţial. În unele realizări, o metodă pentru tratarea cancerului la un subiect cuprinde administrarea către subiect a unei cantităţi eficiente terapeutic de anticorp 313M32.

În anumite realizări, cancerul este un cancer selectat din grupul constând din cancer colorectal, cancer pancreatic, cancer pulmonar, cancer ovarian, cancer hepatic, cancer la sân, cancer la rinichi, cancer la prostată, cancer gastrointestinal, melanom, cancer de col uterin, cancer neuroendocrin, cancer la vezică, glioblastom, şi cancer la cap şi gât. În anumite realizări, cancerul este cancer pancreatic. În anumite realizări, cancerul este cancer ovarian. În anumite realizări, cancerul este cancer colorectal. În anumite realizări, cancerul este cancer la sân. În anumite realizări, cancerul este cancer la prostată. În anumite realizări, cancerul este cancer pulmonar. În anumite realizări, cancerul este melanom.

În unele realizări, cancerul este un cancer hematologic. În unele realizări, cancerul hematologic este o leucemie. În alte realizări, cancerul hematologic este un limfom. În unele realizări, cancerul este selectat din grupul constând din: leucemie mielogenă acută (AML), limfom Hodgkin, mielom multiplu, leucemie limfoblastică acută cu celule T (T-ALL), leucemie limfocitară cronică (CLL), leucemie cu celule păroase, leucemie mielogenă cronică (CML), limfom non-Hodgkin, limfom difuz cu celule B mari (DLBCL), limfom cu celule de manta (MCL), şi limfom cutanat cu celule T (CTCL).

În unele realizări ale metodelor descrise aici, o metodă cuprinde în plus o etapă de determinare a nivelului de expresie PD-L1 în tumoare sau cancer. În unele realizări, determinarea nivelului de expresie PD-L1 este făcută înainte de tratamentul cu un anticorp sau agent bispecific descris aici. În unele realizări, dacă o tumoare sau cancer are un nivel ridicat de expresie a PD-L1, un anticorp sau agent bispecific este administrat către subiect. În unele realizări, o metodă cuprinde (i) obţinerea unei mostre dintr-un cancer sau tumoare ale subiectului; (ii) măsurarea nivelului de expresie al PD-L1 în mostră; şi (iii) administrarea unei cantităţi eficiente a unui anticorp sau agent bispecific către subiect dacă tumoarea sau cancerul au un nivel ridicat de expresie al PD-L1. În unele realizări, mostra este o mostră de biopsie. În unele realizări, mostra cuprinde celule tumorale, celule imune care se infiltrează în tumoare, celule stromale, şi orice combinaţie a acestora. În unele realizări, mostra este o mostră înglobată în parafină fixată în formalin (FFPE). În unele realizări, mostra este din ţesut arhivat, proaspăt, sau congelat. În unele realizări, nivelul de expresie al PD-L1 în mostră este comparat cu un nivel de expresie predeterminat al PD-L1. În unele realizări, nivelul de expresie predeterminat al expresiei PD-L1 este un nivel de expresie al PD-L1 într-o mostră tumorală de referinţă, o mostră de referinţă de ţesut normal, o serie de mostre tumorale de referinţă, sau o serie de mostre de referinţă de ţesut normal. În unele realizări, nivelul de expresie al PD-L1 este determinat utilizând un test imunohistochimic (IHC). În unele realizări, nivelul de expresie al PD-L1 este determinat utilizând un test care cuprinde o evaluare de scor H. În unele realizări, nivelul de expresie al PD-L1 este determinat utilizând un anticorp care se leagă specific la PD-L1. În unele realizări, PD-L1 este detectat pe celule tumorale. În unele realizări, PD-L1 este detectat pe celule imune care se infiltrează în tumoare.

Terapia de combinaţie cu doi sau mai mulţi agenţi terapeutici utilizează adesea agenţi care funcţionează prin mecanisme de acţiune diferite, deşi acest lucru nu este necesar. Terapia de combinaţie utilizând agenţi cu mecanisme de acţiune diferite poate conduce la efecte aditive sau sinergice. Terapia de combinaţie poate permite o doză mai scăzută din fiecare agent decât este cea utilizată în monoterapie, reducȃnd prin urmare efectele secundare toxice şi/sau creşterea indicelui terapeutic al agenţilor. Terapia de combinaţie poate scade probabilitatea de dezvoltare a celulelor canceroase rezistente. În unele realizări, terapia de combinaţie cuprinde un agent terapeutic care afectează răspunsul imun (de exemplu, ameliorează sau activează răspunsul) şi un agent terapeutic care afectează (de exemplu, inhibă sau ucide) tumoarea/celule canceroase.

În unele realizări, combinaţia dintre un anticorp sau agent bispecific descrişi aici şi cel puţin un agent terapeutic suplimentar conduce la rezultate aditive sau sinergice. În unele realizări, terapia de combinaţie conduce la o creştere a indicelui terapeutic al agentului. În unele realizări, terapia de combinaţie conduce la o creştere în indicele terapeutic al agentului terapeutic suplimentar. În unele realizări, terapia de combinaţie conduce la o scădere în toxicitatea şi/sau efectele secundare ale agentului. În unele realizări, terapia de combinaţie conduce la o scădere în toxicitatea şi/sau efectele secundare ale agentului terapeutic suplimentar.

În anumite realizări, în plus faţă de administrarea unui anticorp sau agent bispecific descrişi aici, metoda sau tratamentul cuprind în plus administrarea a cel puţin unui agent terapeutic suplimentar. Un agent terapeutic suplimentar poate fi administrat înainte de, concomitent cu, şi/sau ulterior la, administrarea agentului. În unele realizări, acel cel puţin un agent terapeutic suplimentar cuprinde 1, 2, 3, sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari.

Agenţii terapeutici care pot fi administraţi în combinaţie cu anticorpii şi agenţii bispecifici descrişi aici includ agenţi chimioterapici. Astfel, în unele realizări, metoda sau tratamentul implică administrarea unui anticorp sau agent bispecific din prezenta invenţie în combinaţie cu un agent chimioterapic sau în combinaţie cu un cocktail de agenţi chimioterapeutici. Tratamentul cu un anticorp sau agent bispecific poate avea loc înainte de, concomitent cu, sau ulterioar la, administrarea de chimioterapii. Administrarea combinată poate include coadministrarea, fie într-o singură formulare farmaceutică sau fie utilizând formulări separate, sau administrarea consecutivă în orice ordine dar în general într-o perioadă de timp astfel încât toţi agenţii activi să poată să-şi exercite activităţile lor biologice simultan. Prepararea şi programele de dozare pentru astfel de agenţi chimioterapici pot fi utilizate în conformitate cu instrucţiunile fabricantului sau după cum s-a determinat empiric de către practicianul calificat în domeniu. Prepararea şi programele de dozare pentru o astfel de chimioterapie sunt de asemenea descrise în The Chimioterapie Source Book, ediţia a 4-a, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.

Clasele utile de agenţi terapeutici includ, de exemplu, agenţi anti-tubulină, auristatini, lianţi ADN caneluraţi minori, inhibitori de replicare ADN, agenţi alchilanţi (de exemplu, complecşi de platină cum ar fi cisplatină, complecşi de mono(platină), bis(platină) şi tri-nuclear platină şi carboplatină), antraciclină, antibiotice, anti-folaţi, antimetaboliţi, sensibilizatori chimioterapeutici, duocarmicină, etoposidă, fluorinat pirimidină, ionofori, lexitropsine, nitrozouree, platinoli, antimetaboliţi de purină, puromicină, sensibilizatori de radiaţie, steroizi, taxani, inhibitori de topoizomerază, alcaloizi de vinca, sau altele asemenea. În anumite realizări, al doilea agent terapeutic este un agent de alchilare, un antimetabolit, un antimitotic, un inhibitor de topoizomerază, sau un inhibitor de angiogeneză.

Agenţii chimioterapeutici utili din prezenta invenţie includ, dar nu se limitează la, agenţi alchilanţi cum ar fi tiotepa şi ciclosfosfamidă (CITOXAN); alchil sulfonaţi cum ar fi busulfan, improsulfan şi piposulfan; aziridine cum ar fi benzodopa, carbocuonă, meturedopa, şi uredopa; etilenimine şi metilamelamine incluzând altretamină, trietilenmelamină, trietilenfosforamidă, trietilentiofosforamidă şi trimetilolomelamimă; iperite de azot cum ar fi clorambucil, clornafazin, colofosfamidă, estramustină, ifosfamidă, mecloretamină, clorhidrat de oxid de mecloretamină, melfalan, novembichin, fenesterină, prednimustină, trofosfamidă, muştar de uracil; nitrozuree cum ar fi carmustină, clorozotocin, fotemustină, lomustină, nimustină, ranimustină; antibiotice cum ar fi aclacinomisină, actinomicină, autramicină, azaserină, bleomicină, cactinomicină, calicheamicină, carabicină, caminomicină, carzinofilină, cromomicină, dactinomicină, daunorubicină, detorubicină, 6-diazo-5-oxo-L-norleucină, doxorubicină, epirubicină, esorubicină, idarubicină, marcelomicină, mitomicină, acid micofenolic, nogalamicină, olivomicină, peplomicină, potfiromicină, puromicină, chelamicină, rodorubicină, streptonigrină, streptozocină, tubercidină, ubenimex, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliţi cum ar fi metotrexat şi 5-fluorouracil (5-FU); analogi ai acidului folic cum ar fi denopterin, metotrexat, pteropterin, trimetrexat; analogi de purină cum ar fi fludarabină, 6-mercaptopurină, tiamiprină, tioguanină; analogi de pirimidină cum ar fi ancitabină, azacitidină, 6-azauridină, carmofur, citozină arabinosidă, dideoxiuridină, doxifluridină, enocitabină, floxuridină, 5-FU; androgeni cum ar fi calusteron, propionat de dromostanolon, epitiostanol, mepitiostan, testolacton; anti-adrenali cum ar fi aminoglutetimidă, mitotan, trilostan; reîncărcători de acid folic cum ar fi acid folinic; aceglatonă; aldofosfamidă glicosidă; acid aminolevulinic; amsacrină; bestrabucil; bisantrenă; edatraxat; defofamină; demecolcină; diazicuonă; elformitină; acetat de eliptiniu; etoglucid; nitrat de galiu; hidroxiuree; lentinan; lonidamină; mitoguazonă; mitoxantronă; mopidamol; nitracrină; pentostatin; fenamet; pirarubicin; acid podofilinic; 2-etilhidrazidă; procarbazină; PSK; razoxan; sizofuran; spirogermaniu; acid tenuazonic; triazicuonă; 2,2',2«-triclorotrietilamină; uretan; vindesină; dacarbazină; manomustină; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitozină; arabinosidă (Ara-C); taxoide, de exemplu paclitaxel (TAXOL) şi docetaxel (TAXOTERE); clorambucil; gemcitabină; 6-tioguanină; mercaptopurină; analogi de platină cum ar fi cisplatin şi carboplatin; vinblastină; platină; etoposidă (VP-16); ifosfamidă; mitomicină C; mitoxantronă; vincristină; vinorelbină; navelbină; novantron; teniposidă; daunomicină; aminopterin; ibandronat; CPT11; inhibitor de topoizomerază RFS 2000; difluorometilornitină (DMFO); acid retinoic; esperamicine; capecitabine (XELODA); şi săruri acceptabile farmaceutic, acizi sau derivaţi ai oricărora din cele de mai sus. Agenţii chimioterapeutici includ de asemenea agenţi anti-hormonali care acţionează pentru reglarea sau inhibarea acţiunii hormonilor pe tumori cum ar fi antiestrogenii incluzând de exemplu tamoxifen, raloxifenă, aromatază inhibând 4(5)-imidazoli, 4-hidroxitamoxifen, trioxifenă, keoxifenă, LY117018, onapristonă, şi toremifenă (FARESTON); şi anti-androgeni cum ar fi flutamidă, nilutamidă, bicalutamidă, leuprolid, şi goserelin; şi săruri acceptabile farmaceutic, acizi sau derivaţi ai oricărora din cele de mai sus. În anumite realizări, agentul terapeutic suplimentar este cisplatin. În anumite realizări, agentul terapeutic suplimentar este carboplatin.

În anumite realizări, agentul chimioterapic este un inhibitor de topoizomerază. Inhibitorii de topoizomerază sunt agenţi chimioterapeutici care interferează cu acţiunea unei enzime topoizomerază (de exemplu, topoizomerază I sau II). Inhibitorii de topoizomerază includ, dar nu se limitează la, HCl de doxorubicină, citrat de daunorubicină, HCl de mitoxantronă, actinomicină D, etoposidă, HCl de topotecan, teniposidă (VM-26), şi irinotecan, precum şi săruri acceptabile farmaceutic, acizi, sau derivaţi ai oricărora din acestea. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este irinotecan.

În anumite realizări, agentul chimioterapeutic este un anti-metabolit. Un anti-metabolit este un agent chimic cu o structură care este similară cu a unui metabolit necesar pentru reacţii biochimice normale, încă suficient de diferite pentru a interfera cu una sau mai multe funcţii normale ale celulelor, cum ar fi divizarea celulei. Anti-metaboliţii includ, dar nu se limitează la, gemcitabină, fluorouracil, capecitabină, metotrexat de sodiu, ralitrexat, pemetrexat, tegafur, citozină arabinosidă, tioguanină, 5-azacitidină, 6-mercaptopurină, azatioprină, 6-tioguanină, pentostatin, fludarabină fosfat, şi cladribină, precum şi săruri acceptabile farmaceutic, acizi, sau derivaţi ai oricărora din acestea. În anumite realizări, agentul suplimentar terapeutic este gemcitabina.

În anumite realizări, agentul chimioterapeutic este un agent antimitotic, incluzând, dar fără a se limita la, agenţi care se leagă la tubulină. În unele realizări, agentul este un taxan. În anumite realizări, agentul este paclitaxel sau docetaxel, sau o sare acceptabilă farmaceutic, acid, sau derivat ade paclitaxel sau docetaxel. În anumite realizări, agentul este paclitaxel (TAXOL), docetaxel (TAXOTERE), paclitaxel legat la albumină (ABRAXANE), DHA-paclitaxel, sau PG-paclitaxel. În anumite realizări alternative, agentul antimitotic cuprinde un alkaloid vinca, cum ar fi vincristină, vinblastină, vinorelbină, sau vindesină, sau săruri acceptabile farmaceutic, acizi, sau derivaţi ai acestora. În unele realizări, agentul antimitotic este un inhibitor de kinesină Eg5 sau un inhibitor al unei kinaze mitotice cum ar fi Aurora A sau Plk1. În anumite realizări, agentul suplimentar terapeutic este paclitaxel. În anumite realizări, agentul suplimentar terapeutic este paclitaxel legat la albumină (ABRAXANE).

În unele realizări, un agent terapeutic suplimentar cuprinde un agent cum ar fi o micromoleculă. De exemplu, tratamentul poate implica administrarea combinată a unui agent din prezenta invenţie cu o micromoleculă care acţionează ca un inhibitor împotriva antigenilor asociaţi tumorii incluzând, dar fără a se limita la, EGFR, HER2 (ErbB2), şi/sau VEGF. În unele realizări, un agent din prezenta invenţie este administrat în combinaţie cu un inhibitor de protein kinază selectat din grupul constând din: gefitinib (IRESSA), erlotinib (TARCEVA), sunitinib (SUTENT), lapatanib, vandetanib (ZACTIMA), AEE788, CI-1033, cediranib (RECENTIN), sorafenib (NEXAVAR), şi pazopanib (GW786034B). În unele realizări, un agent terapeutic suplimentar cuprinde un inhibitor mTOR.

În anumite realizări, agentul suplimentar terapeutic este un agent care inhibă o cale a celulei stem canceroase. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un inhibitor al căii Notch. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un inhibitor al căii Wnt. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un inhibitor al căii BMP. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un inhibitor al căii Hippo. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un inhibitor al căii RSPO/LGR. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un inhibitor al căii mTOR/AKR.

În unele realizări, un agent terapeutic suplimentar cuprinde a moleculă biologică, cum ar fi un anticorp. De exemplu, tratamentul poate implica administrarea combinată a unui agent din prezenta invenţie cu anticorpi împotriva antigenilor asociaţi tumorii incluzând, dar fără a se limita la, anticorpi care se leagă la EGFR, HER2/ErbB2, şi/sau VEGF. În anumite realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp specific pentru un marker al celulei stem canceroase. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp care se leagă la o componentă a căii Notch. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp care se leagă la o componentă a căii Wnt. În anumite realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp care inhibă o cale a celulei stem canceoase. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un inhibitor al căii Notch. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un inhibitor al căii Wnt. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un inhibitor al căii BMP. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp care inhibă semnalizarea β-catenină. În anumite realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp care este un inhibitor de angiogeneză (de exemplu, un anticorp receptor de anti-VEGF sau VEGF). În anumite realizări, agentul suplimentar terapeutic este bevacizumab (AVASTIN), ramucirumab, trastuzumab (HERCEPTIN), pertuzumab (OMNITARG), panitumumab (VECTIBIX), nimotuzumab, zalutumumab, sau cetuximab (ERBITUX).

În anumite realizări, în plus faţă de administrarea unui anticorp sau agent bispecific descrişi aici, metoda sau tratamentul cuprinde în plus administrarea a cel puţin unui agent imunoterapeutic suplimentar. În unele realizări, agentul imunoterapeutic suplimentar este un agent de stimulare al răspunsului imun. În unele realizări, agentul imunoterapeutic (de exemplu, agentul de stimulare al răspunsului imun) include, dar nu este limitat la, un factor de stimulare al coloniilor (de exemplu, factor de stimulare al coloniilor granulocite-macrofage (GM-CSF), factor de stimulare al coloniilor macrofage (M-CSF), factor de stimulare al coloniilor granulocite (G-CSF), factorul celulelor stem (SCF)), o interleukină (de exemplu, IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), un anticorp care blochează funcţiile imunosupresive (de exemplu, un anticorp anti-CTLA4, anticorp anti-CD28, anticorp anti-CD3, anticorp anti-PD-1, anticorp anti-PD-Ll), un anticorp care ameliorează funcţiile celulei imune (de exemplu, un anticorp anti-GITR sau un anticorp anti-OX-40), un receptor de tip Toll (de exemplu, TLR4, TLR7, TLR9), un ligand solubil (de exemplu, GITRL sau OX-40L), sau un membru al familiei B7 (de exemplu, CD80, CD86). Un agent imunoterapeutic suplimentar (de exemplu, un agent de stimulare al răspunsului imun) poate fi administrat înainte de, concomitent cu, şi/sau ulterior la, administrarea agentului de legare TIGIT. Compoziţiile farmaceutice cuprinzând un agent de legare TIGIT şi un agent imunoterapeutic suplimentar (de exemplu, un agent de stimulare al răspunsului imun) sunt de asemenea furnizate. În unele realizări, agentul imunoterapeutic cuprinde 1, 2, 3, sau mai mulţi agenţi imunoterapeutici. În unele realizări, agentul de stimulare al răspunsului imun cuprinde 1, 2, 3, sau mai mulţi agenţi de stimulare ai răspunsului imun.

În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp care este un inhibitor imun al punctului de control. În unele realizări, inhibitorul imun al punctului de control este un anticorp anti-PD-1, un anticorp anti-PD-Ll, un anticorp anti-CTLA4, un anticorp anti-CD28, un anticorp anti-LAG3, un anticorp anti-TIM3, un anticorp anti-GITR, sau un anticorp anti-OX-40. În unele realizări, inhibitorul imun al punctului de control este un anticorp anti-4-1BB. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp anti-PD-1 selectat din grupările constând din: nivolumab (OPDIVO), pembrolizumab (KEYTRUDA), sau pidilzumab. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp anti-PD-1 selectat din grupările constând din: MEDI0680, REGN2810, BGB-A317, şi PDR001. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp anti-PD-Ll selectat din grupul constând din: BMS935559 (MDX-1105), atexolizumab (MPDL3280A), durvalumab (MEDI4736), sau avelumab (MSB0010718C). În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp anti-CTLA-4 selectat din grupul constând din: ipilimumab (YERVOY) sau tremelimumab. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp anti-LAG-3 selectat din grupul constând din: BMS-986016 şi LAG525. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp anti-OX-40 selectat din grupul constând din: MEDI6469, MEDI0562, şi MOXR0916. În unele realizări, agentul suplimentar terapeutic este un anticorp anti-4-1BB selectat din grupul constând din: PF-05082566.

Mai mult, tratamentul cu un anticorp sau agent bispecific descrişi aici poate include tratamentul de combinaţie cu alte molecule biologice, cum ar fi una sau mai multe citokine (de exemplu, limfokine, interleukine, interferoni, factori de necroză tumorală, şi/sau factori de creştere) sau poate fi însoţit de îndepărtarea chirurgicală a tumorilor, îndepărtarea celulelor canceroase, sau orice altă terapie considerată necesară de către medicul curant.

În unele realizări, anticorpul sau agentul bispecific poate fi administrat în combinaţie cu o moleculă biologică selectată din grupul constând din: adrenomedulină (AM), angiopoietină (Ang), BMPs, BDNF, EGF, eritropoietină (EPO), FGF, GDNF, G-CSF, GM-CSF, GDF9, HGF, HDGF, IGF, factor de stimulare al migraţiei, miostatină (GDF-8), NGF, neurotrofinȃ, PDGF, trombopoietină, TGF-α, TGF-β, TNF-α, VEGF, PlGF, gama-IFN, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, şi IL-18. În unele realizări, agentul de legare TIGIT poate fi administrat în combinaţie cu o moleculă biologică selectată din grupul constând din: factor de stimulare al coloniilor macrofage (M-CSF) şi factorul celulelor stem (SCF).

În unele realizări, tratamentul cu un anticorp sau agent bispecific descrişi aici poate fi însoţit de îndepărtarea chirurgicală a tumorilor, îndepărtarea celulelor canceroase, sau orice altă terapie chirurgicală considerată necesară de către medicul curant.

În anumite realizări, tratamentul implică administrarea unui anticorp sau agent bispecific din prezenta invenţie în combinaţie cu terapia cu radiaţie. Tratamentul cu un agent poate avea loc înainte de, concomitent cu, sau ulterior la administrarea terapiei cu radiaţie. Programele de dozare pentru o astfel de terapie cu radiaţie pot fi determinate de către practicianul medical calificat.

În anumite realizări, tratamentul implică administrarea unui anticorp sau agent bispecific din prezenta invenţie în combinaţie cu o terapie antivirală. Tratamentul cu un agent poate avea loc înainte de, concomitent cu, sau ulterior la administrarea terapiei antivirale. Medicamentul antiviral utilizat în terapia de combinaţie va depinde de virusul cu care este infectat subiectul.

Administrarea combinată poate include coadministrarea, fie într-o singură formulare farmaceutică sau fie utilizând formulări separate, sau administrarea consecutivă în orice ordine dar în general într-o perioadă de timp astfel încât toţi agenţii activi să-şi poată exercită activităţile lor biologice simultan.

Se va aprecia că combinaţia unui anticorp sau agent bispecific descrişi aici şi a cel puţin unui agent terapeutic suplimentar poate fi administrată în orice ordine sau concomitent. În unele realizări, agentul va fi administrat pacienţilor care au suferit anterior un tratament cu un al doilea agent terapeutic. În anumite alte realizări, anticorpul sau agentul bispecific şi un al doilea agent terapeutic vor fi administrate substanţial simultan sau concomitent. De exemplu, unui subiect îi poate fi dat un agent în timp ce este supus la un curs de tratament cu un al doilea agent terapeutic (de exemplu, chimioterapie). În anumite realizări, un anticorp sau agent bispecific va fi administrat într-un an de la tratamentul cu un al doilea agent terapeutic. În anumite realizări alternative, un anticorp sau agent bispecific va fi administrat în 10, 8, 6, 4, sau 2 luni de la orice tratament cu un al doilea agent terapeutic. În anumite alte realizări, un anticorp sau agent bispecific va fi administrat în 4, 3, 2, sau 1 săptămâni de la orice tratament cu un al doilea agent terapeutic. În unele realizări, un agent va fi administrat în 5, 4, 3, 2, sau 1 zile de la orice tratament cu un al doilea agent terapeutic. Se va aprecia în plus că cei doi (sau mai mulţi) agenţi sau tratamente pot fi administrate către subiect în decurs de cȃteva ore sau minute (adică, substanţial simultan).

Pentru tratamentul unei boli, dozajul adecvat al unui anticorp sau agent bispecific din prezenta invenţie depinde de tipul bolii care este tratată, severitatea şi cursul bolii, receptivitatea bolii, dacă agentul este administrat în scopuri terapeutice sau preventative, terapia anterioară, istoricul clinic al pacientului, şi aşa mai departe, toate la discreţia medicului curant. Anticorpul sau agentul bispecific poate fi administrat o dată sau pe o serie de tratamente care durează de la câteva zile la câteva luni, sau până când este efectuată o vindecare sau este obţinută o diminuare a stării de boală (de exemplu, reducerea dimensiunii tumorii). Programele optime de dozare pot fi calculate din măsurători ale acumulării de medicament în corpul pacientului şi vor varia depinzând de potenţa relativă a unui agent individual. Medicul curant poate determina dozajele optime, metodologiile de dozare, şi rata de repetare. În anumite realizări, dozajul este de la 0,01µg până la 100mg/kg din greutatea corporală, de la 0,1µg până la 100mg/kg din greutatea corporală, de la 1µg până la 100mg/kg din greutatea corporală, de la 1mg până la 100mg/kg din greutatea corporală, de la 1mg până la 80mg/kg din greutatea corporală, de la 10mg până la 100mg/kg din greutatea corporală, de la 10mg până la 75mg/kg din greutatea corporală, sau de la 10mg până la 50mg/kg din greutatea corporală. În anumite realizări, dozajul agentului este de la aproximativ 0,1mg până la aproximativ 20mg/kg din greutatea corporală. În unele realizări, dozajul agentului este de aproximativ 0,5mg/kg din greutatea corporală. În unele realizări, dozajul agentului este de aproximativ 1mg/kg din greutatea corporală. În unele realizări, dozajul agentului este de aproximativ 1,5mg/kg din greutatea corporală. În unele realizări, dozajul agentului este aproximativ 2mg/kg din greutatea corporală. În unele realizări, dozajul agentului este aproximativ 2,5mg/kg din greutatea corporală. În unele realizări, dozajul agentului este aproximativ 5mg/kg din greutatea corporală. În unele realizări, dozajul agentului este aproximativ 7,5mg/kg din greutatea corporală. În unele realizări, dozajul agentului este aproximativ 10mg/kg din greutatea corporală. În unele realizări, dozajul agentului este de aproximativ 12,5mg/kg din greutatea corporală. În unele realizări, dozajul agentului este de aproximativ 15mg/kg din greutatea corporală. În anumite realizări, dozajul poate fi dat o dată sau de mai multe ori zilnic, săptămânal, lunar, sau anual. În anumite realizări, agentul este dat o dată la fiecare săptămână, o dată la fiecare două săptămâni, o dată la fiecare trei săptămâni, sau o dată la fiecare patru săptămâni.

În unele realizări, un anticorp sau agent bispecific poate fi administrat la o doză de „încărcare« iniţială mai ridicată, urmată de una sau mai multe doze mai scăzute. În unele realizări, frecvenţa administrării poate fi de asemenea modificată. În unele realizări, un regim de dozare poate cuprinde administrarea unei doze iniţiale, urmată de doze suplimentare (sau doze de „întreţinere«) o dată pe săptămână, o dată la fiecare două săptămâni, o dată la fiecare trei săptămâni, sau o dată la fiecare lună. De exemplu, un regim de dozare poate cuprinde administrarea unei doze de încărcare iniţială, urmată de o doză de întreţinere săptămânală de, de exemplu, o jumătate din doza iniţială. Sau un regim de dozare poate cuprinde administrarea unei doze de încărcare iniţială, urmată de doze de întreţinere de, de exemplu o jumătate din doza iniţială la fiecare altă săptămână. Sau un regim de dozare poate cuprinde administrarea a trei doze iniţiale pentru 3 săptămâni, urmate de doze de întreţinere de, de exemplu, aceeaşi cantitate la fiecare altă săptămână.

Aşa cum este cunoscut celor calificaţi în domeniu, administrare oricărui agent terapeutic poate conduce la efecte secundare şi/sau toxicităţi. În unele cazuri, efectele secundare şi/sau toxicităţile sunt atȃt de severe încȃt exclud administrarea agentului particular la o doză eficientă terapeutic. În unele cazuri, terapia medicamentoasă trebuie să fie întreruptă, şi pot fi încercaţi alţi agenţi. Totuşi, mulţi agenţi din aceeaşi clasă terapeutică afişează adesea efecte secundare şi/sau toxicităţi similare, însemnând că pacientul fie trebuie să oprească terapia, sau dacă este posibil, să suporte efectele secundare neplăcute asociate cu agentul terapeutic.

În unele realizări, programul de dozare poate fi limitat la un număr specific de administrări sau „cicluri«. În unele realizări, agentul este administrat timp de 3, 4, 5, 6, 7, 8, sau mai multe cicluri. De exemplu, agentul este administrat la fiecare 2 săptămâni timp de 6 cicluri, agentul este administrat la fiecare 3 săptămâni timp de 6 cicluri, agentul este administrat la fiecare 2 săptămâni timp de 4 cicluri, agentul este administrat la fiecare 3 săptămâni timp de 4 cicluri, etc. Programele de dozare pot fi decise şi modificate ulterior de către cei calificaţi în domeniu.

Anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici pot fi administraţi utilizând o strategie de dozare intermitentă, care poate reduce efectele secundare şi/sau toxicităţile asociate cu administrarea unui agent, agent chimioterapic, etc. În unele realizări, strategia de dozare intermitentă cuprinde administrarea unei doze iniţiale a unui agent către subiect, şi administrarea ulterioară de doze de agent aproximativ o dată la fiecare 2 săptămâni. În unele realizări, strategia de dozare intermitentă cuprinde administrarea unei doze iniţiale a unui agent către subiect, şi administrarea ulterioară de doze de agent aproximativ o dată la fiecare 3 săptămâni. În unele realizări, strategia de dozare intermitentă cuprinde administrarea unei doze iniţiale a unui agent către subiect, şi administrarea ulterioară de doze de agent aproximativ o dată la fiecare 4 săptămâni. În unele realizări, agentul este administrat utilizând o strategie de dozare intermitentă şi agentul chimioterapic este administrat săptămânal.

Prezenta invenţie furnizează de asemenea compoziţii farmaceutice cuprinzând anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici şi un vehicul acceptabil farmaceutic. În unele realizări, compoziţiile farmaceutice îşi găsesc utilizare în imunoterapie. În unele realizări, compoziţiile îşi găsesc utilizare în inhibarea creşterii tumorii. În unele realizări, compoziţiile farmaceutice îşi găsesc utilizare în inhibarea creşterii tumorii la un subiect (de exemplu, un pacient uman). În unele realizări, compoziţiile îşi găsesc utilizare în tratarea cancerului. În unele realizări, compoziţiile farmaceutice îşi găsesc utilizare în tratarea cancerului la un subiect (de exemplu, un pacient uman).

Formulările sunt preparate pentru depozitare şi utilizare prin combinarea unui anticorp purificat sau agent din prezenta invenţie cu un vehicul acceptabil farmaceutic (de exemplu, un purtător sau excipient). Cei calificaţi în domeniu consideră în general purtătorii acceptabili farmaceutic, excipienţii, şi/sau stabilizatorii ca fiind ingrediente inactive ale unei formulări sau compoziţii farmaceutice.

Vehiculele adecvate acceptabile farmaceutic includ, dar nu se limitează la, tampoane netoxice cum ar fi fosfat, citrat, şi alţi acizi organici; săruri cum ar fi clorură de sodiu; antioxidanţi incluzând acid ascorbic şi metionină; conservanţi cum ar fi clorura de amoniu octadecildimetilbenzil, clorură de hexametoniu, clorură de benzalconiu, clorură de benetoniu, fenol, butil sau alcool benzilic, alchil parabene, cum ar fi metil sau propil paraben, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol, şi m-cresol; polipeptide cu masă moleculară mică (de exemplu, mai puţin de aproximativ 10 resturi de aminoacid); proteine cum ar fi albumina din ser, gelatină, sau imunoglobulină; polimeri hidrofili cum ar fi polivinilpirolidonă; aminoacizi cum ar fi glicină, glutamină, asparagină, histidină, arginină, sau lizină; carbohidraţi cum ar fi monozaharide, dizaharide, glucoză, manoză, sau dextrine; agenţi chelatori cum ar fi EDTA; zaharuri cum ar fi zaharoză, manitol, trehaloză sau sorbitol; contraioni care formează sare cum ar fi sodiu; complecşi cu metal cum ar fi complecşi cu Zn de proteine; şi surfactanţi neionici cum ar fi TWEEN sau polietilen glicol (PEG). (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, ediţia a 22-a, 2012, Pharmaceutical Press, London.).

Compoziţiile farmaceutice din prezenta invenţie pot fi administrate în orice număr de căi pentru tratamentul fie local sau fie sistemic. Administrarea poate fi topică prin plasturi epidermali sau transdermali, unguente, loţiuni, creme, geluri, picături, supozitoare, pulverizatoare, lichide şi pulberi; pulmonară prin inhalare sau insuflare de pulberi sau aerosoli, inclusiv prin nebulizator, intratraheal, şi intranazal; oral; sau parenteral incluzând intravenoasă, intraarterială, intratumorală, subcutanată, intraperitoneală, intramusculară (de exemplu, injecţie sau perfuzie), sau intracranială (de exemplu, intratecală sau intraventriculară).

Formularea terapeutică poate fi în formă de doză unitară. Astfel de formulări includ tablete, pilule, capsule, pulberi, granule, soluţii sau suspensii în apă sau mediu neapos, sau supozitoare. În compoziţiile solide cum ar fi tabletele, ingredientul activ principal este amestecat cu un purtător farmaceutic. Ingredientele de tabletare convenţionale include amidon din porumb, lactoză, zaharoză, sorbitol, talc, acid stearic, stearat de magneziu, fosfat dicalcic sau gume, şi diluanţi (de exemplu, apă). Acestea pot fi utilizate pentru a forma o compoziţie preformulată solidă conţinând un amestec omogen dintr-un compus din prezenta invenţie, sau o sare netoxică acceptabilă farmaceutic a acestuia. Compoziţia preformulată solidă este apoi subdivizată în forme de dozare unitare dintr-un tip descris mai sus. Tabletele, pilulele, etc. cu formulare sau compoziţie pot fi acoperite sau altfel compuse pentru a furniza o formă de dozare care oferă avantajul acţiunii prelungite. De exemplu, tableta sau pilula pot cuprinde o compoziţie interioară acoperită de o componentă exterioară. Mai mult, cele două componente pot fi separate printr-un strat enteric care serveşte să reziste dezintegrării şi permite componentei interioare să treacă intactă prin stomac sau să fie întârziată în eliberare. O varietate de materiale pot fi utilizate pentru astfel de straturi enterice sau acoperiri, astfel de materiale incluzȃnd un număr de acizi polimerici şi amestecuri de acizi polimerici cu astfel de materiale ca şelac, alcool cetilic şi acetat de celuloză.

Anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici pot fi de asemenea cuprinşi în microcapsule. Astfel de microcapsule sunt preparate, de exemplu, prin tehnici de coacervare sau prin polimerizare interfacială, de exemplu, hidroximetilceluloză sau microcapsule cu gelatină şi microcapsule de poli-(metilmetacilat), respectiv, în sisteme coloidale de livrare a medicamentului (de exemplu, lipozomi, microsfere de albumină, microemulsii, nanoparticule şi nanocapsule) sau în macroemulsii cum s-a descris în Remington: The Science and Practice of Pharmacy, ediţia a 22-a, 2012, Pharmaceutical Press, London.

În anumite realizări, formulările farmaceutice includ un agent din prezenta invenţie complexat cu lipozomi. Metodele pentru a produce lipozomi sunt cunoscute celor calificaţi în domeniu. De exemplu, unii lipozomi pot fi generaţi prin evaporare cu inversare de fază cu o compoziţie lipidică cuprinzând fosfatidilcolină, colesterol, şi fosfatidiletanolamină PEG-derivatizată (PEG-PE). Lipozomii pot fi extrudaţi prin filtre cu dimensiunea porilor definită pentru a da lipozomii cu diametrul dorit.

În anumite realizări, pot fi produse preparările cu eliberare susţinută cuprinzând anticorpii sau agenţii bispecifici descrişi aici. Exemple adecvate de preparări cu eliberare susţinută includ matrice semipermeabile de polimeri hidrofobi solizi conţinând un agent, unde matricele sunt în forma de articole modelate (de exemplu, filme sau microcapsule). Exemple de matrice cu eliberare susţinută includ poliesteri, hidrogeluri cum ar fi poli(2-hidroxietil-metacrilat) sau poli(vinil alcool), polilactide, copolimeri de L-acid glutamic şi 7 etil-L-glutamat, etilen-acetat de vinil nedegradabil, copolimeri degradabili de acid lactic - acid glicolic cum ar fi LUPRON DEPOT™ (microsfere injectabile compuse din copolimer de acid lactic - acid glicolic şi acetat de leuprolid), isobutirat de acetat de zaharoză, şi acid poli-D-(-)-3-hidroxibutiric.

VI. Selecţie

Prezenta divulgare furnizează metode de selecţie pentru a identifica agenţii de legare TIGIT care modulează răspunsul imun. În unele cazuri, prezenta divulgare furnizează metode pentru selecţia agenţilor candidaţi, incluzând dar fără a se limita la, polipeptide, anticorpi, peptide, peptidomimetice, micromolecule, compuşi, sau alte medicamente, care modulează răspunsul imun.

În unele cazuri, o metodă de selecţie pentru un agent de legare TIGIT candidat care modulează răspunsul imun cuprinde determinarea dacă agentul are un efect asupra celulei imune. În unele cazuri, o metodă de selecţie pentru un agent de legare TIGIT candidat care modulează răspunsul imun cuprinde determinarea dacă agentul este capabil de creşterea activităţii celulei imune. În unele cazuri, o metodă de selecţie pentru un agent de legare TIGIT candidat care modulează răspunsul imun cuprinde determinarea dacă agentul este capabil de creşterea activităţii celulelor citolitice, cum ar fi CTL-urile şi/sau celulele NK. În unele cazuri, o metodă de selecţie pentru un agent de legare TIGIT candidat care modulează răspunsul imun cuprinde determinarea dacă agentul este capabil de scăderea activităţii celulelor supresoare imune, cum ar fi Treg-urile sau MDSC-urile.

VII. Truse cuprinzând agenţii descrişi aici

Prezenta divulgare furnizează truse care cuprind agenţii de legare TIGIT descrişi aici şi care pot fi utilizaţi pentru a efectua metodele descrise aici. În anumite cazuri, o trusă cuprinde cel puţin un agent de legare TIGIT purificat în unul sau mai multe recipiente. În unele cazuri, trusele conţin toate componentele necesare şi/sau suficiente pentru a efectua un test de detecţie, incluzând toate controalele, direcţiile pentru efectuarea testelor, şi orice software necesar pentru analiza şi prezentarea rezultatelor. O persoană calificată în domeniu va recunoaşte cu uşurinţă că agenţii de legare TIGIT divulgaţi din prezenta invenţie pot fi cu uşurinţă încorporaţi în unul dintre formatele de truse stabilite care sunt bine cunoscute în domeniu.

În plus, sunt furnizate truse care cuprind un agent de legare TIGIT precum şi cel puţin un agent terapeutic suplimentar. În anumite realizări, al doilea (sau mai mulţi) agent terapeutic este un agent chimioterapic. În anumite realizări, al doilea (sau mai mulţi) agent terapeutic este un anticorp.

Realizările din prezenta divulgare pot fi definite în plus prin referinţă la următoarele exemple nelimitative, care descriu în detaliu prepararea anumitor anticorpi din prezenta divulgare şi la metodele pentru utilizarea anticorpilor din prezenta divulgare. Va fi evident celor calificaţi în domeniu că multe modificări, atȃt la materiale cȃt şi la metode, pot fi practicate fără îndepărtarea de domeniul din prezenta divulgare.

EXEMPLE

Exemplul 1

Generare de anticorpi anti-TIGIT

Anticorpii anti-TIGIT au fost generaţi utilizând domeniul extracelular al TIGIT de şoarece pentru a imuniza iepuri. Supernatanţii au fost selectaţi prin citometrie de flux pentru legarea anticorpului la TIGIT de şoarece şi la TIGIT uman şi 9 clone de anticorp au fost alese pentru caracterizare în continuare (Fig. 1). Supernatanţii din aceşti anticorpi au fost selectaţi pentru abilitatea lor de a bloca specific interacţiunea TIGIT de şoarece cu contrareceptorul său, PVR de şoarece. Patru anticorpi au arătat că blochează interacţiunea TIGIT/PVR. Important, doi din aceşti anticorpi au fost capabili să se lege la TIGIT uman (313Rb1 şi 313Rb2).

Lanţul greu şi regiunile variabile ale lanţului uşor ale 313Rb1 au fost clonate într-un IgG1 de şoarece format pentru a genera anticorpul himeric 313R11 şi într-un IgG2a de şoarece format pentru a genera anticorpul himeric 313R12. Secvenţele regiunilor CDR ale 313R11 şi 313R12 sunt (i) CDR1 a lanţului greu GSSLSSSYMS (SEQ ID NO:7), (ii) CDR2 a lanţului greu IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), (iii) CDR3 a lanţului greu GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9), (iv) CDR1 a lanţului uşor QASQSISSYLNW (SEQ ID NO:10), (v) CDR2 a lanţului uşor DALKLAS (SEQ ID NO:11), şi (vi) CDR3 a lanţului uşor QQEHSVGNVDN (SEQ ID NO:12). Secvenţa regiunii variabile a lanţului greu al 313R11 şi 313R12 este SEQ ID NO:17 şi secvenţa regiunii variabile a lanţului uşor al 313R11 şi 313R12 este SEQ ID NO:18. Secvenţa lanţului greu al 313R11 este SEQ ID NO:21 sau SEQ ID NO:26 (fără secvenţă semnal). Secvenţa lanţului greu al 313R12 este SEQ ID NO:22 sau SEQ ID NO:27 (fără secvenţă semnal). Secvenţa lanţului uşor al 313R11 şi 313R12 este SEQ ID NO:23 sau SEQ ID NO:28 (fără secvenţă semnal).

Lanţul greu şi regiuni variabile ale lanţului uşor al 313Rb2 au fost clonate la un IgG1 uman format pentru a genera anticorpul 313R14. Regiunile CDR au fost modificate pentru a creşte afinitatea pentru TIGIT uman şi regiunile cadru au fost optimizate şi/sau umanizate generȃnd câteva variante, incluzând 313R19. Secvenţele regiunilor CDR ale 313R14 şi 313R19 sunt (i) CDR1 a lanţului greu GFSLSSSYMS (SEQ ID NO:13), (ii) CDR2 a lanţului greu IIGSNGNTYYANWAKG (SEQ ID NO:8), (iii) CDR3 a lanţului greu GGYRTSGMDP (SEQ ID NO:9), (iv) CDR1 a lanţului uşor QASQSNIYSDLAW (SEQ ID NO:14) sau QASQNIYSDLAW (SEQ ID NO:81), (v) CDR2 a lanţului uşor RASTLAS (SEQ ID NO:15), şi (vi) CDR3 a lanţului uşor QQEHLVAWIYN (SEQ ID NO:16). Secvenţa regiunii variabile a lanţului greu al 313R14 este SEQ ID NO:19 şi secvenţa regiunii variabile a lanţului uşor al 313R14 este SEQ ID NO:20. Secvenţa regiunii variabile a lanţului greu al 313R19 este SEQ ID NO:32 şi secvenţa regiunii variabile a lanţului uşor al 313R19 este SEQ ID NO:20. Secvenţa lanţului greu al 313R14 este SEQ ID NO:24 sau SEQ ID NO:29 (fără secvenţă semnal). Secvenţa lanţului greu al 313R19 este SEQ ID NO:33 sau SEQ ID NO:34 (fără secvenţă semnal). Secvenţa lanţului uşor al 313R14 şi 313R19 este SEQ ID NO:25 sau SEQ ID NO:30 (fără secvenţă semnal).

O plasmidă care codifică o polipeptidă cuprinzând regiunea variabilă a lanţului greu al anticorpului 313R19 a fost depozitată cu Colecţia de Cultură de Tip Americană (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SUA, în condiţiile Tratatului de la Budapesta din 27 mai 2015, şi denumită PTA-122180. O plasmidă care codifică o polipeptidă cuprinzând regiunea variabilă a lanţului uşor al anticorpului 313R19 a fost depozitate cu ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SUA, în condiţiile Tratatului de la Budapesta din 27 mai 2015, şi denumită PTA-122181.

Exemplul 2

Semnalizare TIGIT şi fosforilare TIGIT

Cum s-a descris aici, TIGIT este fosforilată la coda sa citoplasmatică după interacţiunea cu contrareceptorul său PVR. Fosforilarea TIGIT este începutul unei cascade care include evenimente în aval care afectează alte căi cunoscute de semnalizare. Prin urmare, evaluarea fosforilării TIGIT precum şi a stării de fosforilare în aval de proteine poate da informaţii despre funcţionarea TIGIT şi efectul unui antagonist TIGIT.

Liniei celulare T umane Jurkat CD4+ îi lipseşte expresia TIGIT umană sau murină după cum s-a determinat prin PCR în timp real şi prin FACS (datele nu sunt prezentate). Pentru a genera o linie celulară care exprimă TIGIT, celulele Jurkat au fost infectate cu o construcţie lentivirus care exprimă TIGIT murin (mTIGIT) marcat cu FLAG şi proteină fluorescentă verde (GFP). Liniei celulare de limfom murine E.G7-OVA îi lipseşte expresia de PVR uman sau murin după cum s-a determinat prin PCR în timp real şi/sau prin FACS. Celulele E.G7-OVA sintetizează şi secretă ovalbumină (OVA) constitutiv şi C57BL/6 şoarecii imunizaţi cu celule E.G7-OVA dau naştere la limfocite citotoxice restricţionate H-2 Kb specifice pentru peptida OVA 258-276. Pentru a genera un PVR care exprimă linia celulară, celulele E.G7-OVA au fost infectate cu o construcţie lentivirus care exprimă PVR murin (mPVR) şi GFP. Celulele pozitive GFP din fiecare linie celulară infectată au fost sortate în plăci cu 96 de godeuri utilizând un instrument FACSAria II (BD Biosciences) şi celulele izolate singure au fost expandate în clone. Pozitivitatea GFP şi expresia mTIGIT sau mPVR au fost confirmate în clonele derivate din celule singure prin analiză FACS şi PCR în timp real (datele nu sunt prezentate).

Pentru a evalua fosforilarea TIGIT ca răspuns la PVR, liniile celulare au fost incubate în mediu fără ser timp de 2 ore la 37°C. Celulele Jurkat-mTIGIT au fost amestecate cu celule E.G7-OVA parentale sau celule E.G7-OVA-mPVR la un paort de celule de 5:1 şi incubate timp de 5 minute la 37°C în prezenţa unui inhibitor de tirozină fosfastază (10mM ortovanadat de sodiu, New England Biolabs). Lizatele celulare au fost preparate şi imunoprecipitate cu perle magnetice acoperite cu anti-FLAG care au capturat proteinele mTIGIT marcate cu FLAG. Imunoprecipitatele au fost evaluate prin Analiză de pată Western. Prezenţa TIGIT fosforilat a fost evaluată utilizând un anticorp anti-fosfotirozină (Cell Signaling Technology). Prezenţa TIGIT total a fost evaluată prin utilizarea unui anticorp anti-FLAG (Cell Signaling Technology).

S-a observat că TIGIT puternic fosforilat în celulele T ca răspuns la celulele tumorale care exprimă mPVR în comparaţie cu celulele care nu exprimă PVR (Fig. 2A).

Pentru a evalua alte căi de semnalizare potenţial afectate de TIGIT, liniile celulare au fost incubate în mediu fără ser timp de 2 ore la 37°C. Celulele Jurkat-mTIGIT au fost combinate cu celule E.G7-OVA parentale sau celule E.G7-OVA-mPVR la un raport de celule de 5:1 şi incubate la 37°C timp de 0, 5, 15, 45, sau 60 minute. Lizatele celulare au fost preparate şi au fost evaluate prin Analiză de pată Western. Nivelurile de SHP1 fosforilată (tirozină fosfatază 1 care conţine SH2) şi Erk1/2 au fost determinate utilizând un anticorp anti-fosfo SHP1 (Tyr564) anticorp şi un anticorp anti-fosfo Erk1/2 (Thr202/Tyr204), respectiv (ambii de la Cell Signaling Technology). Nivelul de Erk1/2 total a fost evaluat utilizând un anticorp anti-Erk1/2 (Cell Signaling Technology). SHP1 este un important regulator negativ al căilor de transducţie a semnalului mediat de citokine, incluzând calea JAK/STAT, în timp ce Erk1/2 sunt protein kinaze care au participat în cascada de transducţie a semnalului Ras-Raf-MEK-ERK.

Aşa cum se arată în Fig. 2B, SHP1 şi Erk1/2 au fost activate specific când celulele T care exprimă TIGIT au fost incubate cu celule tumorale care exprimă mPVR. Activarea cum s-a indicat prin fosforilare, a fost observată încă din momentul de timp de 5 minute şi a părut că începe să scadă după 45 minute pentru Erk1/2 şi după 60 minute pentru SHP1. SHP1 şi Erk1/2 nu au fost activate în răspunsul la mPVR în celulele T Jurkat parentale care nu exprimă mTIGIT (datele nu sunt prezentate).

Pentru a studia dacă antagoniştii TIGIT ar inhiba activitatea TIGIT, a fost efectuat un test de fosforilare TIGIT în prezenţa anticorpilor anti-TIGIT. Cum s-a descris mai sus, celulele Jurkat-mTIGIT au fost amestecate cu celule E.G7-OVA parentale sau celule E.G7-OVA-mPVR la un raportde celule de 5:1 şi incubate timp de 5 minute la 37°C în prezenţa a 10mM ortovanadat de sodiu şi 20µg/ml anticorp de control (IgG murin policlonal; Sigma), anticorp anti-TIGIT 313R11, anticorp anti-TIGIT 313R12, sau anticorp anti-TIGIT 313Rb1. Lizatele celulare au fost preparate şi imunoprecipitate cu perle magnetice acoperite cu anti-FLAG care au capturat proteinele mTIGIT marcate cu FLAG. Imunoprecipitarea a fost evaluată prin analiză de pată Western. Prezenţa TIGIT fosforilată a fost evaluată utilizând un anticorp anti-fosfotirozină. Prezenţa TIGIT total a fost evaluată utilizând un anticorp anti-FLAG.

Cum s-a arătat anterior, mTIGIT a fost puternic fosforilată când celulele T Jurkat care exprimă mTIGIT au fost combinate cu celulele tumorale care exprimă mPVR. Fosforilarea mTIGIT ca răspuns la interacţiunea cu mPVR a fost redusă şi/sau abrogată când celulele au fost incubate în prezenţa anticorpilor anti-TIGIT. Scăderea în fosforilarea TIGIT a fost cea mai frapantă cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 (Fig. 3).

Au fost întreprinse experimente suplimentare pentru a studia dacă antagoniştii TIGIT ar inhiba semnalizarea TIGIT. Similar cu studiile descrise aici, celulele Jurkat-mTIGIT au fost amestecate cu celule E.G7-OVA parentale sau celule E.G7-OVA-mPVR la un raport de celule de 5:1 şi incubate timp de 15 minute la 37°C în prezenţa creşterii concentraţiilor (0-40µg/ml) de anticorp anti-TIGIT 313R11, anticorp anti-TIGIT 313R12, sau anticorp anti-TIGIT 313Rb1. Lizatele celulare au fost preparate şi evaluate prin analiză de pată Western. SHP1 fosforilată (fosfatază tirozină 1 conţinând SH2) şi Erk1/2 fosforilată au fost determinate utilizând un anticorp SHP1 anti-fosfo (Tyr562) şi un anticorp Erk1/2 anti-fosfo (Thr202/Tyr204), respectiv. Nivelul de SHP1 total a fost evaluat utilizând un anticorp anti-SHP1. Nivelul de Erk1/2 total a fost evaluat utilizând un anticorp anti-Erk1/2.

Fosforilarea Erk1/2 ca răspuns la interacţiunea mTIGIT-mPVR a fost clar inhibată de către anticorpii anti-TIGIT într-o manieră dependentă de doză (Fig. 4). Fosforilarea SHP1 ca răspuns la interacţiunea mTIGIT-mPVR a fost inhibată de către anticorpul anti-TIGIT 313Rb1 şi 313#11 într-o manieră dependentă de doză. În experimentul prezentat, anticorpul 313R12 a părut să aibă numai un efect slab asupra fosforilării SHP1.

Aceste rezultate sugerează puternic că anticorpii anti-TIGIT inhibă funcţionarea TIGIT şi afectează în aval căile de semnalizare.

Exemplul 3

Inhibarea TIGIT a producţiei de citokine

Hibridomul celulei T B3Z86/90,14 (B3Z) exprimă stabil un receptor al celulei T H-2Kb specific OVA (TCR). Celulele B3Z au fost infectate cu o construcţie lentivirus care exprimă TIGIT murine (mTIGIT) şi au fost generate clonele mTIGIT derivate dintr-o singură celulă (B3Z-mTIGIT). Linia celulară de limfom murin E.G7-OVA exprimă stabil OVA şi poate activa TCR specific OVA pe celulele B3Z, conducând la secreţia de IL-2. Pentru a determina efectul interacţiunilor mTIGIT/mPVR asupra secreţiei de IL-2 specifică antigenului, celulele B3Z parentale sau celulele B3Z-mTIGIT au fost incubate cu celule E.G7-OVA parentale sau E.G7-OVA-mPVR (descrise mai sus, vezi Exemplul 2) la un raport de 2:1 în plăci cu 12 godeuri. După 24 ore, s-au măsurat concentraţiile de IL-2 în supernatanţii culturii fără celule prin ELISA (R&D Systems). Datele sunt exprimate ca raportul dintre secreţia de IL-2 şi B3Z parentale sau celulele T B3Z-mTIGIT ca răspuns la celulele tumorale care exprimă mPVR în comparaţie cu secreţia de IL-2 ca răspuns la celulele tumorale mPVR-negative.

Pentru celulele T B3Z parentale, secreţia de IL-2 a fost similară indiferent de expresia mPVR pe celulele tumorale care prezintă OVA (adică, un raport de aproximativ 1,0). În schimb, secreţia de IL-2 din celulele T B3Z-mTIGIT a fost mai scăzută în prezenţa celulelor tumorale care exprimă mPVR decât în prezenţa celulelor tumorale mPVR-negative (adică, un raport de < 1,0) (Fig. 5A). Când celulele T B3Z-mTIGIT au fost pretratate cu 20µg/ml anticorp anti-TIGIT 313R11 sau 313R12 înainte de co-cultura cu celulele E.G7-OVA, producţia de IL-2 nu a mai fost inhibată (Fig. 5B).

Aceste rezultate sugerează că activarea mTIGIT de către mPVR inhibă activarea celulelor T ca răspuns la antigen după cum s-a evidenţiat prin scăderea producţiei de IL-2. Mai mult, blocarea TIGIT cu un antagonist TIGIT inhibă activarea TIGIT şi pare să reducă inhibarea asociată cu TIGIT a activităţii celulei T cum se poate vedea prin producţia puternică de IL-2. Aceste date susţin teoria că inhibarea TIGIT poate „elibera frâna pe« supresia celulei T şi ameliora răspunsurile imune.

Exemplul 4

Inhibarea TIGIT a citotoxicităţii celulei NK

Linia celulară ucigaşă natural (NK) umană NK-92 a fost infectată cu o construcţie lentivirus care exprimă mTIGIT marcat cu FLAG şi GFP şi o linie celulară clonală (NK-92-mTIGIT) a fost derivată cum s-a descris mai sus. Linia celulară B umană 721.221 a fost infectată cu o construcţie lentivirus care exprimă mPVR şi GFP şi a fost generată o linie celulară clonală (721.221-mPVR). Celulele 721.221 parentale au fost confirmate că le lipseşte expresia de PVR uman sau murin prin FACS şi PCR în timp real (datele nu sunt prezentate). Abilitatea celulelor NK-92 parentale sau a celulelor NK-92-mTIGIT de a liza celulele 721.221 parentale sau celulele tumorale 721.221-mPVR a fost testată într-un test standard de eliberare a calceinei de 4 ore. Celulele NK-92 sau NK-92-mTIGIT au fost placate în plăci cu fundukl în formă de V cu 96 de godeuri. Ţinta 721.221 sau celulele 721-221-mPVR au fost marcate cu 10µM calceină AM (Life Technologies) timp de 1 oră la 37°C şi apoi combinate cu celulele NK-92 la un raport efector:ţintă de 25:1 sau 12:1. După 4 ore de incubare la 37°C, supernatanţii fără celule au fost recoltaţi şi calceina eliberată a fost cuantificată pe un fluorometru la o excitaţie de 485 nm şi o emisie de 535 nm. Într-un experiment de urmărire, celulele NK-92 şi NK-92-mTIGIT au fost incubate în prezenţa a 20µg/ml anticorp anti-TIGIT 313R11, anticorp 313R12, sau un anticorp de control pentru X minute. Celulele au fost apoi utilizate într-un test de eliberare a calceinei cum s-a descris mai sus.

Procentajul de lizare specifică a celulei este determinat ca: % lizare = 100 × (ER-SR)/(MR-SR), unde ER, SR, şi MR reprezintă eliberarea de calceină experimentală, spontană, şi maximă, respectiv. Eliberarea spontană este fluorescenţa emisă de celulele ţintă incubate în mediu singur (adică, în absenţa celulelor efectoare), în timp ce eliberarea maximă este determinate de lizarea celulelor ţintă cu un volum egal de 10% SDS. Date sunt prezentate ca raport dintre citotoxicitatea celulelor NK-92 (parentale sau NK-92-mTIGIT) şi faţă de celulele ţintă 721.221-mPVR şi citotoxicitatea celulelor NK-92 (parentale sau NK-92-mTIGIT) faţă de celulele ţintă 721.221 parentale (mPVR-negative).

Aşa cum se arată în Figura 6A, pentru celulele NK-92 parentale, citotoxicitatea împotriva celulelor ţintă 721.221 mPVR-pozitive şi mPVR-negative a fost similară (adică, un raport de aproximativ 1,0). În schimb, pentru celulele NK-92-mTIGIT citotoxicitatea împotriva celulelor 721.221-mPVR a fost scăzută în comparaţie cu citotoxicitatea împotriva liniei celulare 721.221 parentale mPVR-negative (adică, un raport de < 1,0). Nu a existat nici o diferenţă în rezultate când raportul efector:ţintă a fost 25: 1 sau 12:1. Când celulele NK-92 sau NK-92-mTIGIT au fost tratate cu anticorp anti-TIGIT 313R11 sau anticorp 313R12 înainte de utilizare în testul de citotoxicitate, inhibarea citotoxicităţii mediate de celulă a fost redusă şi/sau abrogată (Fig. 6B).

Aceste rezultate sugerează că activarea mTIGIT de către mPVR inhibă citotoxicitatea mediată de celula NK. Important, rezultatele demonstrează că un antagonist TIGIT poate interfera cu interacţiunea PVR-TIGIT şi conduce la o restabilire a sau „eliberării frânei asupra« capabilităţilor citotoxice ale celulelor NK.

Exemplul 5

Inhibarea creşterii tumorale in vivo de către anticorpul anti-TIGIT

Linia tumorală de colon murină CT26.WT a fost implantată subcutanat (30.000 celule/şoarece) în flancurile din spate ale şoarecilor Balb/c cu vârste de 6-8 săptămâni. Tumorile au fost lăsate să crească timp de 10 zile până când ele au atins un volum de aproximativ 50mm3. Şoarecii au fost trataţi cu 0,25mg/şoarece de anticorp anti-TIGIT 313R11 (anticorp mIgG1), anticorp anti-TIGIT 313R12 (anticorp mIgG2a,) un anticorp de control mIgG1, sau un anticorp de control mIgG2a (n = 10 pe grup pentru anticorpii de control şi 20 pe grup pentru anticorpii de test). Şoarecii au fost dozaţi prin injecţie intraperitoneală de două ori pe săptămână timp de trei săptămâni. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice în zilele 10, 15, 18, 22, 25, şi 29.

Aşa cum se arată în Figura 7A, anticorpul anti-TIGIT 313R12 a inhibat creşterea tumorii cu aproape 75% în comparaţie cu un anticorp de control potrivit cu izotip. Tumorile la nouă şoareci au regresat la niveluri nedetectabile din ziua 29. Anticorpul anti-TIGIT 313R11 a inhibat creşterea tumorii cu numai aproximativ 15% în comparaţie cu un anticorp de control potrivit cu izotip. Anticorpii 313R11 şi 313R12 diferă numai prin izotipurile lor IgG, deoarece 313R12 este un anticorp IgG2a şi 313R11 este un anticorp IgG1. Aceste rezultate sugerează că izotipul anticorpului poate avea un efect semnificativ asupra eficacităţii terapeutice a anticorpilor anti-TIGIT. Anticorpii IgG2 de şoarece (echivalenţi cu anticorpii IgG1 umani) sunt cunoscuţi ca având activitate ADCC crescută în comparaţie cu anticorpii IgG1 de şoarece (echivalenţi ai IgG2 uman) şi această caracteristică biologică poate juca un rol în puternicul efect antitumoral al anticorpului 313R12.

Experimentul a fost repetat cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 şi un anticorp de control mIgG2a. Cum s-a descris mai sus, celulele CT26.WT au fost implantate subcutanat (30.000 celule/şoarece) în flancurile din spate ale şoarecilor Balb/c cu vârste de 6-8 săptămâni. Tumorile au fost lăsate să crească timp de 7 zile până când ele au atins un volum de aproximativ 55mm3. Şoarecii au fost trataţi cu 0,25mg/şoarece de anticorp anti-TIGIT 313R12 sau cu un anticorp de control mIgG2a (n = 10 pe grup). Şoarecii au fost dozaţi prin injecţie intraperitoneală de două ori pe săptămână timp de 3 săptămâni. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice în zilele 7, 14, 17, 21, 25, 28, şi 31.

Cum s-a observat în studiul anterior, anticorpul anti-TIGIT 313R12 a inhibat creşterea tumorilor CT26.WT, cu inhibarea creşterii tumorii văzută la toţi cei zece şoareci (Fig. 7B). Mai mult, tumorile la 9 din cei 10 şoareci trataţi cu anticorpul 313R12 au regresat faţă de dimensiunea originală a tumorii, cu 8 tumori regresând la niveluri nedetectabile după 2 săptămâni de tratament. În acest studiu, au fost trei tumori care au regresat în grupul de control cu anticorp IgG2, dar este cunoscut faptul că regresia tumorii poate avea loc la şoarecii netrataţi, imunocompetenţi, în special dacă numărul iniţial al celulelor tumorale este scăzut. Totuşi, inhibarea completă a creşterii şi/sau regresia tumorii în grupul tratat c u anticorpul 313R12 au demonstrat că tratamentul cu un anticorp anti-TIGIT a avut un efect terapeutic semnificativ şi acest lucru poate fi atribuit modulării şi/sau ameliorării răspunsului imun al subiectului.

Imunoterapia de succes împotriva cancerului va include generarea imunităţii anti-tumorale pe termen lung. Pentru a studia dacă imunitatea pe termen lung a fost stabilită, şoarecii din studiile descrise aici care au avut tumori CT26.WT care au regresat la niveluri nedetectabile după tratamentul cu anticorpi anti-TIGIT au fost provocaţi cu celule tumorale CT26.WT proaspete. Unsprezece şoareci cu regresie completă a tumorii au fost injectaţi cu un număr crescut de celule CT26.WT (60.000 celule/şoarece) în ziua 132 (la 102 zile după ultima doză de anticorp anti-TIGIT 313R12). Ca control, 10 şoareci naivi au fost injectaţi cu celule CT26.WT cu acelaşi număr de celule CT26.WT. Şoarecii nu au fost trataţi, creşterea tumorii a fost monitorizată, şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice.

În grupul de control toţi cei 10 şoareci au dezvoltat tumori mari din ziua 23 şi au fost eutanasiaţi. În contrast, nici o tumoare nu a crescut la cei 10 şoareci care au respins anterior tumorile CT26.WT. Şoarecele rămas a dezvoltat o mică creştere a tumorii la 14 zile după injecţie, dar tumoarea a regresat complet în ziua 21. Aceşti 11 şoareci au fost apoi reprovocaţi pentru o a doua oară cu 150.000 de celule CT26.WT (de 5 ori numărul celulelor din doza iniţială). Din nou ca control, 10 şoareci naivi au fost injectaţi cu celule CT26.WT cu acelaşi număr de celule CT26.WT (150.000 celule/şoarece). Ca în experimentul de mai devreme, toţi cei 10 şoareci din grupul de control au dezvoltat tumori mari şi au fost eutanasiaţi în ziua 22. Nici o tumoare nu a crescut la 6 şoareci şi 2 şoareci suplimentari au dezvoltat mici tumori care au regresat complet în ziua 22. Ceilalţi 3 şoareci au avut mici tumori care au părut a regresa sau stabiliza. Aceste rezultate sunt rezumate în Tabelul 3 şi prezentate ca procentaj al şoarecilor fără tumoare din fiecare grup.

Tabelul 3

Provocare iniţială 30.000 celule 1-a reprovocare 60.000 celule A 2-a reprovocare 150.000 celule Şoareci de control 10% (1/10) 0% (0/10) 0% (0/10) Şoareci trataţi cu anticorpul1 313R12 55% (11/20) 100% (11/11) 72% (8/11) 1Şoareci trataţi cu anticorpul 313R12 numai după provocarea tumorală iniţială

Aceste rezultate au indicat că tratamentul cu un anticorp anti-TIGIT poate genera un răspuns anti-tumoral puternic şi eficient. Important, răspunsul anti-tumoral a părut să conducă la imunitate şi protecţie pe termen lung împotriva celulelor tumorale.

Exemplul 6

Activitatea efectoare a anticorpului IgG2 anti-TIGIT

S-a arătat că glicozilarea regiunii IgG-Fc este esenţială pentru expresia optimă a activităţi biologice mediate prin FcγRI, FcγII, FcγRIII şi componenta C1q a complementului (adică, ADCC şi CDC). De exemplu, situsul de glicozilare al unui lanţ greu al anticorpului IgG2a de şoarece este la asparagina 314 din SEQ ID NO:22. Substituţia asparaginei cu un rest alanină conduce la deglicozilarea anticorpului şi activitate ADCC redusă. O variantă deglicozilată a anticorpului anti-TIGIT 313R12 a fost generată astfel încât să cuprindă un rest alanină la poziţia 314, şi denumită 313R13.

Activitatea anticorpului anti-TIGIT 313R13 a fost comparată cu a anticorpului anti-TIGIT 313R12 pentru a studia efectul deglicozilării asupra activităţii anti-tumorale. Celulele CT26.WT au fost implantate (30.000 celule/şoarece) în flancurile din spate ale şoarecilor Balb/c cu vârste de 6-8 săptămâni. Tumorile au fost lăsate să crească timp de 10 zile până când ele au atins un volum de aproximativ 50mm3. Şoarecii au fost trataţi cu 0,25mg/şoarece de anticorp anti-TIGIT 313R12, anticorp anti-TIGIT 313R13, sau un anticorp de control mIgG2a (n = 10 pe grup pentru anticorpul de control şi 20 pe grup pentru anticorpii de test). Şoarecii au fost dozaţi prin injecţie intraperitoneală de două ori pe săptămână timp de trei săptămâni. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice în zilele 7, 10, 14, 17, şi 21.

Aşa cum se arată în Figura 8, anticorpul anti-TIGIT 313R12 a prezentat o inhibare semnificativă a creşterii tumorale în comparaţie cu controlul potrivit cu izotip. În contrast, anticorpul anti-TIGIT deglicozilat 313R13 nu a prezentat nici o activitate anti-tumorală semnificativă.

Deoarece se crede că anticorpul deglicozilat ar avea o activitate ADCC limitată sau deloc, aceste rezultate sugerează că ADCC poate juca un rol semnificativ în puternica activitate anti-tumorală a anticorpului anti-TIGIT 313R12.

Exemplul 7

Teste ELISpot pentru IFN-gama, IL-2, IL-4, şi IL-10

ELISpot este un imunotest foarte sensibil pentru detecţia celulelor secretoare de citokine. Pe scurt, un test ELISpot utilizează un anticorp de captură specific pentru o citokină dorită, preacoperit pe godeurile unei microplăci. Celulele stimulate sunt dispersate în godeuri şi anticorpul imobilizat în imediata vecinătate a oricărei celule care secretă citokine se leagă la citokina secretată. Urmează etapele de spălare standard şi incubare cu reactivi de detecţie adecvaţi. De exemplu, este utilizată în mod obişnuit o combinaţie a unui anticorp de detecţie biotinilat urmat de conjugatul streptavidinei la alcalin-fosfatază şi o soluţie substrat colorată. Se formează un precipitat colorat la situsurile de localizare ale citokinei şi apare ca un spot, cu fiecare spot individual reprezentând o celulă care secretă citokine individuale. Spoturile pot fi numărate cu un sistem de citire automat sau manual utilizând un microscop. În unele realizări, este capturată o imagine a fiecărui godeu utilizând un sistem de citire automat, şi spoturile totale, aria spoturilor, sau densitatea optică totală (TOD) sunt utilizate pentru cuantificare.

Celulele secretoare de IFN-gama au fost detectate utilizând o trusă ELISpot IFN-gama de şoarece (MabTech). Celulele au fost izolate din splinele şoarecilor purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 (n = 6) sau cu un anticorp de control potrivit cu izotip (n = 6) (vezi Exemplul 5). Splenocitele (5 Ч 105/godeu) de la fiecare şoarece din fiecare grup de tratament au fost dispensate într-o placă cu 96 de godeuri acoperită cu un anticorp specific pentru IFN-gama de şoarece. Celulele au fost cultivate în prezenţa sau absenţa peptidei celulei T CD8+ specifică tumorii, AH-1 şi incubate timp de 48 ore. Peptida AH-1 (SPSYVYHQF; SEQ ID NO:31) este un epitop H2-Ld-restricţionat al proteinei de anvelopare gp70 a unui endogen provirus de leucemie murină ecotropică la linia celulară CT26.WT. Celulele care secretă IFN-gama au fost detectate după instrucţiunile fabricantului. Imaginile au fost capturate utilizând un instrument Bioreader 6000-F-z (BioSys) şi s-au determinat numărul de spoturi, aria spoturilor, şi densitatea optică totală. Rezultatele sunt prezentate ca densitate optică totala şi datele sunt exprimate ca medie ± S.E.M.

Aşa cum se arată în Figura 9A, celulele care secretă IFN-gama au crescut semnificativ la şoarecii trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 în comparaţie cu şoarecii trataţi cu anticorpul de control. Important, celulele secretoare de IFN-gama au crescut numai în prezenţa peptidei AH-1. Aceste rezultate au indicat că anticorpul anti-TIGIT 313R12 a activat celulele T CD8+ specifice tumorii. Activarea poate fi directă sau indirectă, adică, o inhibare a celulelor supresoare.

Celulele secretoare de IL-2 au fost detectate utilizând o trusă ELISpot IL-2 de şoarece (MabTech). Celulele au fost izolate din splinele şoarecilor purtători de tumori trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 (n = 6) sau cu un anticorp de control potrivit cu izotip (n = 6). Splenocitele (5 Ч 105/godeu) de la fiecare şoarece din fiecare grup de tratament au fost dispensate într-o placă cu 96 de godeuri acoperită cu un anticorp specific pentru IL-2 de şoarece. Celulele au fost incubate timp de 48 ore. Celulele care secretă IL-2 au fost detectate după instrucţiunile fabricantului. Imaginile au fost capturate utilizând un instrument Bioreader 6000-F-z (BioSys) şi s-au determinat numărul de spoturi, aria spoturilor, şi densitatea optică totală. Rezultatele sunt prezentate ca densitate optică totală şi datele sunt exprimate ca medie ± S.E.M.

Aşa cum se arată în Figura 9B, celulele secretoare de IL-2 au fost puţin scăzute la şoarecii trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 în comparaţie cu şoarecii trataţi cu un anticorp de control. Celulele secretoare de IL-2 au fost scăzute la un nivel echivalent în prezenţa sau absenţa peptidei AH-1.

Celulele secretoare de IL-4 au fost detectate utilizând o trusă ELISPOT IL-4 de şoarece (MabTech). Celulele au fost izolate din splinele şoarecilor purtători de tumori trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 (n = 6) sau cu un anticorp de control potrivit cu izotip (n = 6). Splenocitele (5 Ч 105/godeu) de la fiecare şoarece din fiecare grup de tratament au fost dispensate într-o placă cu 96 de godeuri acoperită cu un anticorp specific pentru IL-4 de şoarece. Celulele au fost incubate timp de 48 ore. Celulele care secretă IL-4 au fost detectate după instrucţiunile fabricantului. Imaginile au fost capturate utilizând un instrument Bioreader 6000-F-z (BioSys) şi s-au determinat numărul de spoturi, aria spoturilor, şi densitatea optică totală. Rezultatele sunt prezentate ca densitate optică totală şi datele sunt exprimate ca medie ± S.E.M.

Aşa cum se arată în Figura 9C, celulele secretoare de IL-4 au scăzut semnificativ la şoarecii trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 în comparaţie cu şoarecii trataţi cu un anticorp de control.

Celulele secretoare de IL-10 au fost detectate utilizând o trusă ELISPOT IL-10 de şoarece (MabTech). Celulele au fost izolat din splinele şoarecilor purtători de tumori trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 (n = 6) sau cu un anticorp de control potrivit cu izotip (n = 6). Splenocitele (5 Ч 105/godeu) de la fiecare şoarece din fiecare grup de tratament au fost dispensate într-o placă cu 96 de godeuri acoperită cu un anticorp specific pentru IL-10 de şoarece. Celulele au fost incubate timp de 48 ore. Celulele care secretă IL-10 au fost detectate după instrucţiunile fabricantului. Imaginile au fost capturate utilizând un instrument Bioreader 6000-F-z (BioSys) şi s-au determinat numărul de spoturi, aria spoturilor, şi densitatea optică totală. Rezultatele sunt prezentate ca densitate optică totală şi datele sunt exprimate ca medie ± S.E.M.

Aşa cum se arată în Figura 9D, celulele secretoare de IL-10 au scăzut semnificativ la şoarecii trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 în comparaţie cu şoarecii trataţi cu un anticorp de control.

IFN-gama este în general produs de către celulele NK, celulele T Th1 CD4+, celulele T CD8+, celulele care prezintă antigen, şi celulele B. Studiile au sugerat un rol pentru IFN-gama în imunitatea tumorală şi că poate fi un regulator al activităţii anti-tumorale mediate de alte citokine, în particular IL-12 şi IL-2. Astfel, tratamentul cu un anticorp anti-TIGIT care conduce la o creştere în IFN-gama ar trebui să amelioreze imunitatea anti-tumorală.

IL-4 este produs de către celulele CD4+ Th2 şi induce diferenţierea celulelor T CD4+ naive la celulele Th2. În plus, IL-4 inhibă generarea de celule Th1, inhibă producţia de citokine Th1 cum ar fi TNF-alfa şi IL-12, şi inhibă activarea macrofagelor. IL-10 este în general produs de către Treg-uri şi celulele T ajutătoare. IL-10 a fost iniţial recunoscut ca citokină Th2 care modulează creşterea şi/sau diferenţierea celulelor imune native şi care suprimă funcţiile de activare şi efectoare ale celulelor T, în special celulele T citotoxice. Mai recent, s-a arătat că IL-10 are unele efecte stimulatoare imune şi astfel este văzut ca având funcţii pleiotropice. Scăderea semnificativă în celulele care produc IL-4 şi IL-10 de la şoarecii trataţi cu un anticorp anti-TIGIT în prezentul studiu, sugerează că ţintirea TIGIT poate conduce la inhibarea răspunsurilor Th2 şi poate inhiba Treg-urile şi/sau funcţionarea Treg-urilor.

Exemplul 8

Teste de citotoxicitate celulară

Pentru testele de citotoxicitate ale celulei T, celulele au fost recoltate din splinele şoarecilor purtători de tumori CT26.WT descrise mai sus (Exemplul 5). Celule au fost placate în plăci cu 96 de godeuri cu fundul în formă de V în mediu de cultură RPMI 1640 (Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY) suplimentat cu 10% (v/v) ser fetal bovin (FBS), 2mM L-glutamină, 100U/ml penicilină, şi 100µg/ml streptomicină (Gibco). Celulele ţintă CT26.WT au fost etichetate cu 10µM calceină AM (Life Technologies) timp de 1 oră la 37°C şi apoi combinate cu splenocite la un raport efector:ţintă (E:T) de 50:1. După 4 ore de incubare la 37°C, supernatanţii fără celule au fost recoltaţi şi eliberarea calceinei a fost cuantificată pe un fluorometru la o excitaţie de 485 nm şi o emisie de 535 nm. Procentajul de lizare specifică a celulei a fost determinat ca: % lizare = 100 × (ER-SR)/(MR-SR), unde ER, SR, şi MR reprezintă eliberarea de calceină experimentală, spontană, şi maximă, respectiv. Eliberarea spontană este fluorescenţa emisă de celulele ţintă incubate în mediu singur (adică, în absenţa celulelor efectoare), în timp ce eliberarea maximă este determinată prin lizarea celulelor ţintă cu un volum egal de 10% SDS.

Aşa cum se arată în Figura 10, celulele T citotoxice CD8+ de la şoarecii purtători de tumori CT26.WT au demonstrat o abilitate crescută de a ucide celulele ţintă CT26.WT când şoarecii au fost trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 în comparaţie cu celulele de la şoarecii trataţi cu anticorpul de control.

Aceste rezultate sugerează că un anticorp anti-TIGIT poate creştere activitatea celulei T citotoxice specifică antigenului şi prin urmare ameliora răspunsurile imune anti-tumorale. Această activitate crescută a celulei T citotoxice poate fi din cauza efectului direct sau indirect al anticorpului anti-TIGIT, adică, inhibând efectul celulelor supresoare.

Exemplul 9

Test al celulei regulatoare T (Treg)

Celulele regulatoare T (Treg-uri) joacă un rol esenţial în întreţinerea homeostazei şi prevenirea răspunsurilor autoimune. Treg-urile sunt un mic subset de celule T, din care majoritatea sunt celule CD4+ şi exprimă CD25 (o catenă alfa a receptorului IL-2) şi alţi markeri moleculari asociaţi celulei Treg. Foxp3, un factor de transcripţie, a fost recunoscut ca fiind un factor pentru dezvoltarea şi funcţionarea celulei Treg. Foxp3 a fost considerat un marker specific pentru definirea şi identificarea celulelor Treg şi pentru separarea Treg-urilor de alte subpopulaţii de celule T. Totuşi, specificitatea Foxp3 pentru Treg-uri a fost provocată în celulele umane. În plus faţă de celulele Treg CD4+, celulele Treg CD8+ reprezintă o altă subpopulaţie de celule şi Foxp3 poate să nu fie atât de crucial pentru dezvoltarea şi funcţionarea acestora în comparaţie cu celulele Treg CD4+.

Funcţionalitatea Treg-urilor la şoarecii trataţi cu un anticorp anti-TIGIT a fost evaluată prin determinarea efectului pe care Treg-urile l-au avut asupra proliferării celulelor T CD4+ sau CD8+ naive. Celulele T naïve au fost purificate din splinele şoarecilor netrataţi utilizând o coloana de îmbogăţire a celulei T CD3+ de şoarece (R&D Systems). Aceste celule T purificate au fost marcate cu 5µM de colorant de urmărire violet (VTD; Life Technologies). 2 × 105 celule T marcate cu VTD au fost incubate cu perle acoperite cu anticorpii anti-CD3 şi anti-CD28 pentru a stimula proliferarea celulară. Treg-urile au fost izolate din splinele şoarecilor purtători de tumori CT26.WT (vezi Exemplul 5) trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 (n = 6) sau cu un anticorp de control marcat cu izotip (n = 5) utilizând o trusă de izolare Treg de şoarece (Miltenyi Biotec). Pentru a determina impactul Treg-urilor asupra proliferării celulei T, celulele T stimulate (efectoare) marcate cu VTD au fost co-cultivate cu Treg-uri splenice izolate de la şoarecii trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 şi şoarecii trataţi cu anticorpul de control (raport efector:Treg de 1:0,5). În ziua 4, celulele au fost spălate, şi incubate cu anticorpi anti-şoarece CD4 sau anti-şoarece CD8. Celule au fost evaluate prin analiza FACS utilizând un instrument FACSCanto II şi software-ul FACSDiva v6.1.3 (BD Biosciences). Semnalele VTD sunt reduse cu jumătate pe măsură ce celulele marcate se divid, prin urmare intrarea de analiză a fost setată între semnalul maxim obţinut fără celulele Treg în testul şi semnalul minim obţinut fără stimulare anti-CD3/CD28. Procentajul celulelor în cadrul acestei regiuni (expresie VTD redusă) asupra celulelor T CD4+ şi celulelor T CD8+ a fost utilizat pentru a calcula proliferarea celulelor T CD4+ şi CD8+. Supresia procentuală a fost calculată ca [semnal maxim - (semnal mostră/semnal maxim)] X 100.

Aşa cum se arată în Figura 11, tratamentul cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 nu a avut nici un efect observabil asupra funcţiei supresive a Treg-urilor derivate din splină asupra proliderării celulelor T CD4+. În contrast, tratamentul cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 a redus funcţia supresivă a Treg-urilor derivate din splină asupra proliferării celulelor T CD8+ cu aproximativ 30%.

Aceste rezultate sugerează că tratamentul cu un anticorp anti-TIGIT poate conduce la funcţionarea redusă a Treg-urilor şi/sau supresie, adică, „luarea frâna de pe« răspunsul imun. O reducere a funcţionării Treg-urilor sau supresia Treg-urilor ar putea ameliora răspunsurile imune anti-tumorale totale.

Exemplul 10

Caracterizarea celulelor imune de la şoarecii purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12

Pentru a caracteriza mai bine celulele imune în şoarecii purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12, splenocitele izolate de la şoarecii individuali au fost analizate prin FACS. Celulele CT26.WT (20.000 celule/şoarece) au fost injectat subcutanat în flancurile din spate ale soarecilor Balb/c cu vârste de 6-8 săptămâni. Tumorile au fost lăsate să crească timp de 10 zile până când ele au atins aproximativ 50mm3. Şoarecii au fost trataţi cu 0,25mg/şoarece de anticorp anti-TIGIT 313R12 sau cu un anticorp de control potrivit cu izotip (n = 10-20 pe grup). Şoarecii au fost dozaţi prin injecţie intraperitoneală de două ori pesăptămână. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice. Şase şoareci din fiecare grup de tratament au fost utilizaţi pentru analiză. În ziua 32 după injectarea celulei (la 1 zi după ultima doză de anticorp) splenocitele au fost izolate. Splenocitele (1 × 106) au fost incubate timp de 10 minute cu o proteină recombinantă Fc pentru a bloca legarea nespecifică, şi apoi incubate cu anticorpi conjugaţi cu fluorocrom în 100µl tampon de colorare FACS (HBSS plus 2% ser de viţel inactivat termic) timp de 20 min pe gheaţă. Anticorpii nelegaţi au fost îndepărtaţi prin spălare şi celulele moarte au fost marcate cu un colorant de viabilitate fixabil. Celulele au fost fixate în 2% paraformaldehidă timp de 20 min la temperatura camerei şi analizate utilizând un instrument FACSCanto II şi software-ul FACSDiva v6.1.3 (BD Biosciences).

Celulele T totale au fost identificate utilizând un anticorp CD3e anti-şoarece, celule T CD4+ utilizând un anticorp CD4 anti-şoarece, şi celule T CD8+ utilizând un anticorp CD8 anti-şoarece. Celulele de memorie centrală au fost identificate utilizând un anticorp anti-şoarece/CD44 uman şi celulele de memorie efectoare au fost identificate utilizând un anticorp CD62L anti-uman. Colorarea FACS a fost făcută cum s-a descris mai sus utilizând anticorpul CD8b anti-şoarece (clona 53-5.8, BioLegend), anticorpul CD4 anti-şoarece (clona GK1.5, BioLegend), anticorpul CD62L anti-şoarece (clona MEL-14, BioLegend), şi anticorpul CD44 anti-şoarece (clona 1M7, BioLegend). Celulele au fost analizate pentru expresia CD44ridicatăCD62Lridicată, care indică celulele de memorie centrală, şi expresia CD44ridicatăCD62Lscăzută, care indică celulele de memorie efectoare (închise pe celule T CD8+).

Analiza FACS a indicat că şoarecii purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 au avut o populaţie crescută de celule T din splenocitele vii totale în comparaţie cu populaţia de celule T de la şoarecii trataţi cu un anticorp de control (Fig. 12A). Procentajul de celule T CD4+ (din total celule vii) precum şi procentajul de celule T CD8+ (din total celule vii) a fost crescut la şoarecii trataţi cu anticorpul 313R12 în comparaţie cu şoarecii trataţi cu control (Fig. 12B şi Fig. 12C). În plus, procentajul de celule de memorie centrală din populaţia de celule T CD4+ a crescut (Fig. 12D). Totuşi, procentajul de celule de memorie centrală în populaţia de celule T CD8+ nu a crescut (Fig. 12E).

Aceste date au indicat că tratamentul cu un anticorp anti-TIGIT a crescut procentajul ambelor populaţii de celule T CD4+ şi CD8+. Rezultatele sunt consistente cu un răspuns imun ameliorat.

Pentru a evalua efectul anticorpului anti-TIGIT asupra expresiei ţintă, expresia TIGIT pe Treg-uri a fost analizată prin citometrie de flux. Cum s-a descris aici, Treg-urile sunt celule supresoare şi Treg-urile CD4+ sunt cunoscute că exprimă factorul de transcripţie Foxp3. Cum s-a descris mai sus, splenocitele de la şoarecii purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 sau cu anticorp de control au fost izolate. Splenocitele (1 Ч 106) au fost incubate timp de 10 minute cu o proteină Fc recombinantă pentru a bloca legarea nespecifică şi apoi incubate cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 şi un anticorp CD4 anti-şoarece în 100µl şampon de colorare FACS (HBSS plus 2% ser de viţel inactivat termic) timp de 20 min pe gheaţă. După spălarea cu tampon de colorare FACS, celulele au fost marcate cu un colorant de viabilitate celulară fixabil, fixate, şi permeabilizate peste noapte. După permeabilizare, celulele au fost spălate de două ori cu tampon de permeabilizare IX. Celulele au fost colorate utilizând un anticorp Foxp3 anti-şoarece timp de 30 minute pe gheaţă, spălate, şi fixate cu 2% formaldehidă timp de 20 min la temperatura camerei. A fost efectuată citometria de flux utilizând un instrument FACSCanto II şi analiza datelor a fost făcută utilizând software-ul FACSDiva v6.1.3 (BD Biosciences).

Aşa cum se arată în Figura 13A, procentajul de splenocite totale care exprimă TIGIT a fost redus la şoareci purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 în comparaţie cu splenocitele de la şoarecii purtători de tumori trataţi cu anticorp de control. Procentajul de celule Foxp3+CD4+ (care indică Treg-urile) din total celule CD4+ a fost de aproximativ 22-23% pentru ambele grupuri de şoareci şi nu a părut să fie afectat de tratamentul cu anticorpul anti-TIGIT (Fig. 13B). Totuşi, procentajul de Treg-uri TIGIT-pozitive (din total Treg-uri) a fost drastic redus în populaţia de splenocite de la şoarecii purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 în comparaţie cu şoarecii purtători de tumori trataţi cu anticorpul de control (Fig. 13C). Invers, procentajul de Treg-uri TIGIT-negative a fost puţin crescut în populaţia de splenocite de la şoarecii purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 în comparaţie cu şoarecii purtători de tumori trataţi cu anticorpul de control (Fig. 13D).

Aceste rezultate sugerează că anticorpul anti-TIGIT 313R12 a epuizat celulele TIGIT-pozitive, în special Treg-urile. Totuşi, reducerea în celulele TIGIT-pozitive cum s-a evaluat prin FACS poate fi din cauza unei internalizări a proteinelor TIGIT şi/sau subreglării expresiei suprafeţei celulare TIGIT şi nu epuizării actuale a celulelor.

Celulele supresoare derivate din mieloide (MDSC-uri) sunt o familie eterogenă de celule mieloide şi s-a arătat că sunt supresori potenţi ai imunităţii atât adaptive cât şi native. MDSC-urile suprimă proliferarea şi activarea celulelor T CD4+ şi celulelor T CD8+ şi facilitează generarea de Treg-uri. Se crede că MDSC-urile facilitează progresul cancerului prin inhibarea răspunsurilor imune anti-tumorale, promovând angiogeneza, şi creând un mediu pre-metastatic. MDSC-urile sunt caracterizate prin expresia suprafeţei celulare a antigenilor de diferenţiere de origine mieloidă Gr1 şi CD11b. Gr1 este limitat în primul rând la expresie pe celule a unui descendent granulocitic şi CD11b este o integrină de suprafaţă celulară care este găsită pe suprafaţa macrofagelor, granulocitelor, celulelor NK, şi celulelor T. La şoareci, MDSC-urile pot fi divizate în două subpopulaţii, MDSC-uri granulocitice (G-MDSC) şi MDSC-uri monocitice (M-MDSC), parţial pe baza acestor markeri. G-MDSC-urile au de obicei nuclee multi-lobulare şi un fenotip CD11b+Gr1ridicat, în timp ce M-MDSC-urile au o morfologie monocitică şi un fenotip CD11b+Gr1scăzut. S-a arătat că ambele populaţii de MDSC-uri au suprimat răspunsurile celulei T prin multiple mecanisme incluzând producţia crescută de arginază, sintaza inductibilă a oxidului nitric (iNOS), oxidul nitric, şi specii reactive de oxigen. Astfel, MDSC-urile contribuie la un micromediu tumoral imunosupresiv şi pot limita efectele răspunsurilor imune anti-tumorale.

Celulele mieloide, în special MDSC-urile de la şoarecii purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 sau anticorpul de control au fost analizate prin FACS. Splenocitele (1 Ч 106) au fost incubate timp de 10 minute cu o proteină Fc recombinantă pentru a bloca legarea nespecifică, şi apoi incubate cu anticorpi conjugaţi cu fluorocrom în 100µl tampon de colorare FACS (HBSS plus 2% ser de viţel inactivat termic) timp de 20 min pe gheaţă. Celulele au fost ulterior incubate cu un anticorp CD11b anti-şoarece şi un anticorp Gr1 anti-şoarece. Anticorpii nelegaţi au fost îndepărtaţi prin spălare şi celulele au fost marcate cu un colorant de viabilitate fixabil. Celulele au fost fixate în 2% paraformaldehidă timp de 20 min la temperatura camerei şi analizate utilizând un instrument FACSCanto II şi software-ul FACSDiva v6.1.3 (BD Biosciences).

Aşa cum se arată în Figura 14A, procentajul de celule mieloide CD11b+ (din total celule vii) din splinele şoarecilor purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 a fost redus cu aproximativ 25% în comparaţie cu celulele mieloide CD11b+ de la şoarecii purtători de tumori trataţi cu anticorpul de control. Procentajul de CD11b+Gr1+ MDSC-uri (din total celule mieloide CD11b+) din splinele şoarecilor purtători de tumori trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 a fost redus cu aproximativ 45% în comparaţie cu CD11b+Gr1+ MDSC-urile de la şoarecii purtători de tumori trataţi cu anticorpul de control (Fig. 14B). În populaţia de MDSC, procentajul de G-MDSC-uri (identificate ca CD11b+Gr1ridicat) din splinele şoarecilor purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 a fost redus cu aproximativ 66%, dar procentajul de M-MDSC-uri (identificate ca CD11b+Gr1scăzut) din splinele şoarecilor purtători de tumori CT26.WT trataţi cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 a crescut cu aproximativ 30% (Fig. 14C şi 14D, respectiv).

Aceste rezultate sugerează că tratamentul cu un anticorp anti-TIGIT poate ameliora răspunsurile anti-tumorale prin reducerea activităţii supresive a celulelor imune specifice, adică, MDSC-uri.

Exemplul 11

Inhibarea creşterii tumorale in vivo de către anticorpul anti-TIGIT

Renca este o linie celulară de addenocarcinom renal derivată de la Balb/c obţinută de la ATCC. Celulele Renca (5 × 105 celule/şoarece) au fost implantate subcutanat în flancurile din spate ale şoarecilor Balb/c cu vârste de 6-8 săptămâni. Tumorile au fost lăsate să crească timp de 7 zile până când ele au atins un volum de aproximativ 43mm3. Şoarecii au fost trataţi cu 0,25mg/şoarece de anticorp anti-TIGIT 313R12 (mIgG2a anticorp) sau cu un anticorp de control mIgG2a (n = 10 pe grup). Şoarecii au fost dozaţi prin injecţie intraperitoneală de două ori pe săptămână timp de 3 săptămâni. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice în zilele 7, 10, 14, 17, 21, şi 24.

Aşa cum se arată în Figura 15, anticorpul anti-TIGIT 313R12 a inhibat puternic creşterea tumorii în comparaţie cu anticorpul de control potrivit cu izotip. Toţi şoarecii de control au fost eutanasiaţi în ziua 28 din cauza dimensiunii tumorii. În contrast, în ziua 28 tumorile de la 8 din 10 şoareci trataţi cu anticorpul 313R12 au regresat şi 5 din aceşti şoareci nu au avut tumori detectabile. Cinci din cei zece şoareci iniţiali au fost menţinuţi şi nici o tumoare nu a fost detectabilă pâna la cel puţin 100 zile după injecţie. Aceste rezultate arată că activitatea anti-tumorală a anticorpului anti-TIGIT 313R12 a fost eficientă în câteva tipuri diferite de tumoare.

Exemplul 12

Inhibarea creşterii tumorale in vivo de către anticorpul anti-TIGIT - studiu de doză

Deoarece anticorpul anti-TIGIT s-a arătat a fi eficient în inhibarea creşterii tumorii, a fost efectuat un studiu al intervalului de dozare. Linia tumorală de colon murină CT26.WT a fost implantată subcutanat (30.000 celule/şoarece) în şoarecii Balb/c şi tumorile au fost lăsate să crească la o dimensiune medie de aproximativ 35mm3. Şoarecii au fost trataţi cu 30, 15, 10, 5, 3, 1, sau 0,5mg/kg de anticorp anti-TIGIT 313R12 sau cu un anticorp de control (n = 10 pe grup). Şoarecii au fost dozaţi prin injecţie intraperitoneală o dată pe săptămână pentru un total de 3 doze. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice la momentele de timp indicate.

Figura 16 prezintă volumul tumoral mediu al fiecărui grup de tratament. Tratamentul cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 a inhibat puternic creşterea tumorilor CT26.WT la fiecare doză incluzând nivelul cel mai scăzut de 0,5mg/kg. Aşa cum se arată în Tabelul 4, în ziua 20 tumorile au regresat în cel puţin 40% din şoareci la fiecare nivel de dozare. În fiecare grup tratat au fost şoareci individuali unde tumoarea a regresat la un nivel nedetectabil. O curbă de răspuns la doză nu a fost văzută în acest experiment, ceea ce s-ar fi putut datora dimensiunii tumorilor la începutul tratamentului.

Tabelul 4

Doză în mg/kg Nr. de şoareci cu tumori regresate Nr. de şoareci cu tumori nedetectabile Control Ab 1/10 0/10 0,5 8/10 3/10 1 6/10 1/10 3 8/10 4/10 5 7/10 3/10 10 5/10 3/10 15 4/10 2/10 30 7/10 4/10

Aceste rezultate demonstrează potenţa anticorpului anti-TIGIT 313R12 ca un agent imunoterapeutic. În general, aceste rezultate sunt surprinzătoare în privinţa cantităţii mici de anticorp anti-TIGIT necesară pentru a vedea un efect antitumoral semnificativ.

Exemplul 13

Inhibarea creşterii tumorale in vivo de către anticorpul anti-TIGIT şi anticorpul anti-PD-Ll

Linia tumorală de colon murină CT26.WT a fost implantată subcutanat (30.000 celule/şoarece) în şoarecii Balb/c şi în prima zi de tratament (ziua 10 după implantare) tumorile au fost de o dimensiune medie de aproximativ 105mm3. Şoarecii au fost trataţi cu 0,25mg/şoarece de anticorp anti-TIGIT 313R12, un anticorp anti-PD-Ll, o combinaţie de anticorpi 313R12 şi anti-PD-Ll, sau un anticorp de control (n = 10-20 pe grup). Şoarecilor le-au fost administraţi anticorpi de două ori pe săptămână timp de 3 săptămâni. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice.

Cum este prezentat în figura 17B, tratamentul cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 a inhibat puternic creştere tumorilor CT26.WT la un procentaj mare al şoarecilor. Ar trebui să se observe că tratamentul cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 nu este numai capabil să inhibe creştere tumorilor la majoritatea şoarecilor, ci este capabil să inducă regresia tumorilor individuale, adesea la niveluri nedetectabile. Tratamentul cu anticorpul anti-PD-L1 a fost mult mai mai puţin de succes la inhibarea creşterii tumorii ca agent singur (Fig. 17C). Tratamentul cu combinaţia dintre anticorpul anti-TIGIT 313R12 şi un anticorp anti-PD-Ll a inhibat creşterea tumorii într-o măsura mai mare decât orice agent singur (Fig. 17D). Volumul tumoral mediu este prezentat în Figura 17E şi supravieţuirea procentuală a şoarecilor din fiecare grup este prezentată în Figura 17F.

O metodă de evaluare a prezenţei şi/sau funcţionalităţii unei populaţii de celule de memorie anti-tumorale este de a reprovoca şoarecii tratţi anterior cu celule tumorale proaspete. Şoarecii (din studiile descrise mai sus) trataţi anterior cu anticorpul anti-TIGIT 313R12, anticorpul anti-mPD-Ll, sau o combinaţie dintre anticorpii 313R12 şi anti-mPD-L1 au fost utilizaţie pentru un studiu de reprovocare. Şoarecii ale căror tumori au regresat complet şi au fost nedetectabile cel puţin 128 zile după prima injecţie tumorală au fost reprovocaţi cu celule tumorale CT26.WT (30.000 celule). Şoarecii supuşi la reprovocare tumorală au primit o ultimă doză de tratament cu 100 zile înainte de reprovocare. Şoarecii Balb/c naivi (n = 10) au fost injectaţi cu celule tumorale CT26.WT (30.000 celule) ca grup de control. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice la momentele de timp indicate. Datele sunt exprimate ca medie ± S.E.M.

Volumul tumoral mediu al tumorilor CT26.WT la şoarecii naivi a crescut în mod constant până în ziua 28 cu un volumul tumoral mediu de aproximativ 1750mm3. Din experimentul anterior, au fost numai doi şoareci cu tumori care au regresat complet care au fost trataţi anterior cu anticorpul anti-PD-Ll, dar aceşti doi şoareci au demonstrat imunitate completă la reprovocarea tumorală. Au fost 4 şoareci cu tumori care au regresat complet care au fost trataţi anterior cu anticorp anti-TIGIT şi tumorile nu au crescut în nici unul dintre aceşti şoareci după reprovocare şi au demonstrat imunitate completă la reprovocarea tumorală. În plus, au fost 7 şoareci cu tumori care au regresat complet care au fost trataţi anterior cu combinaţia de 313R12 şi un anticorp anti-PD-Ll şi aceşti şoareci au demonstrat imunitate completă la provocarea tumorală.

Şoarecii trataţi cu anticorp anti-TIGIT, fie ca singur agent sau în combinaţie cu un anticorp anti-PD-Ll, au părut a fi puternic protejaţi de reprovocarea cu celulele tumorale CT26.WT. Aceste rezultate sugerează existenţa memoriei imunogenice după tratamentul cu un anticorp anti-TIGIT, fie ca singur agent sau în combinaţie cu un inhibitor al punctului de control.

Exemplul 14

Inhibarea creşterii tumorale in vivo de către un anticorp anti-TIGIT şi un anticorp anti-PD-1

Linia tumorală de colon murină CT26.WT a fost implantată subcutanat (30.000 celule/şoarece) în şoareci Balb/c şi în prima zi de tratament (ziua 7 după implantare) tumorile au fost de o dimensiune medie de aproximativ 62mm3. Şoarecii (n = 15) au fost trataţi cu 12,5mg de anticorp anti-TIGIT 313R12, un anticorp anti-PD-1, o combinaţie dintre anticorpii 313R12 şi anti-PD-1, sau un anticorp de control (n = 15 pe grup). Şoarecilor le-au fost administraţi anticorpii prin injecţie intraperitoneală de două ori pe săptămână timp de 3 săptămâni. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice.

Cum este prezentat în Figura 18B, tratamentul cu anticorpul anti-TIGIT 313R12 a inhibat puternic creşterea tumorii. Cum s-a văzut în exemplele de mai devreme, tratamentul cu 313R12 nu este numai capabil să inhibe creştere tumorilor, ci este capabil să inducă regresia unora din tumori. Tratamentul cu combinaţia de anticorp anti-TIGIT 313R12 şi un anticorp anti-PD-1 a inhibat creşterea tumorii într-o măsura mai mare decât orice agent singur (Fig. 18D). Volumul tumoral mediu în cele patru grupuri în ziua 24 este prezentat în Figura 18E.

Şoarecii trataţi anterior cu anticorpul anti-TIGIT 313R12, anticorpul anti-mPD-1, sau o combinaţie dintre anticorpii 313R12 şi anti-mPD-Ll au fost utilizaţi pentru un studiu de reprovocare. Şoarecii ale căror tumori au regresat complet şi au fost nedetectabile cel puţin 100 zile după prima injecţie tumorală au fost reprovocaţi cu celule tumorale CT26.WT (60.000 celule). Şoarecii Balb/c naivi (n = 10) au fost injectaţi cu celule tumorale CT26.WT (60.000 celule) ca grup de control. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice la momentele de timp indicate. Datele sunt exprimate ca medie ± S.E.M.

Volumul tumoral mediu al tumorilor CT26.WT la şoarecii naivi a crescut în mod constant cu un volumul tumoral mediu în ziua 21 de aproximativ 1250mm3. Din experimentul anterior, au fost 13 şoareci cu tumori care au regresat complet care au fost trataţi anterior cu combinaţia de anticorpi 313R12 şi anti-PD-1 şi aceşti şoareci au demonstrat imunitate completă la provocarea tumorală.

Aceste rezultate susţin în plus idea că anticorpul anti-TIGIT 313R12 este un foarte potent agent imunoterapeutic, chiar când se administrează ca singur agent. În plus, eficacitatea unui anticorp anti-TIGIT poate fi ameliorată în plus prin combinarea lui cu alţi agenţi imunoterapeutici.

Exemplul 15

Generare de anticorpi monoclonali anti-TIGIT

Anticorpii au fost generaţi împotriva aminoacizilor 22-141 TIGIT uman recombinant (R&D Systems) şi/sau aminoacizilor 22-138 TIGIT uman recombinant (Sino Biologice Inc.). Şoarecii (n=3) au fost imunizaţi cu TIGIT utilizând tehnici standard. Serul de la şoarecii individuali a fost selectat împotriva TIGIT uman la aproximativ 70 zile după imunizarea iniţială utilizând analiza FACS. Animalul cu cel mai mare titru de anticorp a fost selectat pentru o stimulare finală cu antigen după care celulele din splină au fost izolate pentru producţia hibridomă. Celulele SP2/0 au fost utilizate ca parteneri de fuziune pentru celulele din splina şoarecilor. Celulele hibridom au fost placate la 1 celulă pe godeu în plăci cu 96 de godeuri, şi supernatanţii au fost selectaţi împotriva TIGIT uman prin analiză FACS.

Pentru selecţia prin FACS a anticorpilor anti-TIGIT, a fost construită o proteină himerică de fuziune care permite expresia suprafeţei celulare a domeniului extracelular al TIGIT uman (FLAG-hTIGIT-CD4TM-GFP) şi transfectată în celule HEK-293T. După 48 ore, celule transfectate au fost suspendate în PBS cu gheaţă rece conţinând 2% FBS şi heparină şi incubate pe gheaţă în prezenţa a 50µl de supernatanţi hibridomi timp de 30 minute. O a doua incubare cu 100µl anticorp secundar Fc anti-uman conjugat PE a fost efectuată pentru a detecta celulele legate de către anticorp. Celulele au fost incubate cu un anticorp anti-FLAG (Sigma-Aldrich) ca control pozitiv şi un anticorp anti-PE ca control negativ. Celulele au fost analizate pe un instrument FACSCalibur (BD Biosciences) şi datele au fost procesate utilizând software-ul FlowJo.

Au fost identificate câteva hibridoame care au legat TIGIT uman şi a fost selectat anticorpul 313M26. Secvenţele de aminoacizi ale regiunii variabile a lanţului greu şi regiunii variabile a lanţului uşor ale 313M26 sunt SEQ ID NO:63 şi SEQ ID NO:64, respectiv. Secvenţele de nucleotide ale regiunii variabile a lanţului greu şi regiunii variabile a lanţului uşor ale 313M26 sunt SEQ ID NO:65 şi SEQ ID NO:66, respectiv.

Anticorpul 313M26 a fost umanizat utilizând tehnici standard cunoscute celor calificaţi în domeniu. Versiunea umanizată a 313M26 este cea la care se face referire în acest document ca 313M32 şi este un anticorp IgG1. Regiunea variabilă a lanţului greu umanizat al 313M32 a fost reformatată pe un eşafodaj IgG4, şi în combinaţie cu lanţul uşor 313M32 lanţ uşor este denumită 313M33. Secvenţele de aminoacizi ale regiunii variabile a lanţului greu şi regiunii variabile a lanţului uşor ale 313M32 (şi 313M33) sunt SEQ ID NO:67 şi SEQ ID NO:68, respectiv. Secvenţele de nucleotidă ale regiunii variabile a lanţului greu şi regiunii variabile a lanţului uşor ale 313M32 sunt SEQ ID NO:73 şi SEQ ID NO:74, respectiv. Lanţul greu şi regiunile CDR ale lanţului uşor ale 313M26/313M32 sunt listate în Tabelul 2 de aici (SEQ ID NO:57-62). Secvenţa de aminoacizi a lanţului greu al 313M32 cu secvenţa semnal predictată este SEQ ID NO:69 şi fără o secvenţă semnal este SEQ ID NO:70; secvenţa de aminoacizi a lanţului uşor al 313M32 cu secvenţa semnal predictată este SEQ ID NO:71 şi fără o secvenţă semnal este SEQ ID NO:72. Secvenţele de nucleotidă ale lanţului greu şi lanţului uşor ale 313M32 sunt SEQ ID NO:75 şi SEQ ID NO:76, respectiv. Secvenţa de aminoacizi a lanţului greu al 313M33 cu secvenţa semnal predictată este SEQ ID NO:83 şi fără o secvenţă semnal este SEQ ID NO:82; secvenţa de aminoacizi a lanţului uşor al 313M33 cu secvenţa semnal predictată este SEQ ID NO:71 şi fără o secvenţă semnal este SEQ ID NO:72. Secvenţele de nucleotidă ale lanţului greu şi lanţului uşor ale 313M33 sunt SEQ ID NO:84 şi SEQ ID NO:76, respectiv.

O plasmidă care codifică regiunea variabilă a lanţului greu al anticorpului 313M32 a fost depozitată cu Colecţia de Cultură de Tip American (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SUA, în condiţiile Tratatului de la Budapesta din 11 august 2015, şi denumită PTA-122346. O plasmidă care codifică lanţul uşor al anticorpului 313M32 a fost depozitată cu ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SUA, în condiţiile Tratatului de la Budapesta din 11 august 2015, şi denumită PTA-122347.

Anticorpul anti-TIGIT umanizat 313M32 a fost selectat pentru legare la proteinele TIGIT dintre câteva specii diferite. S-a determinat că 313M32 se leagă puternic la TIGIT uman şi nu se leagă la TIGIT de la nici o altă specie care a fost testată, incluzând şoarece, şobolan, porc de guinea, iepure, marmoset, porc, câine, maimuţă rhesus, şi maimuţă cynomolgus. Acest lucru este în contrast cu un alt anticorp anti-TIGIT generat la OncoMed Pharmaceuticals, 313R19, care s-a legat la TIGIT de la toate aceste specii cu excepţia porcului de guinea. Anticorpul 313R19 este o versiune umanizată a unui anticorp anti-TIGIT de iepure (313R12) care a fost iniţial identificat ca legare atȃt la TIGIT de şoarece cȃt şi la TIGIT uman. Tabelul 5 rezumă anticorpii anti-TIGIT şi legarea la TIGIT de şoarece, uman, de maimuţă cynomolgus, şi de maimuţă rhesus.

Tabelul 5

Anticorp Origine Eşafodaj Tip Se leagă la mTIGIT Se leagă la hTIGIT Se leagă la cynoTIGIT Se leagă la rhTIGIT 313R12 Iepure mIgG2a Da Da Nu Nu 313R19 313R12 hIgG1 Umanizat Da Da Da Da 313M26 Şoarece mIgG2a Nu Da ND ND 313M32 313M26 hIgG1 Umanizat Nu Da Nu Nu

Exemplul 16

FACS Analiza anticorpilor anti-TIGIT care blochează legarea TIGIT uman la PVR

A fost generată o proteină TIGIT umană de suprafaţă celulară prin ligarea aminoacizilor 22-141 ai TIGIT uman la domeniul transmembranar al CD4 şi al etichetei proteice GFP C-terminală utilizând tehnici standard de ADN recombinant (hTIGIT-CD4TM-GFP). Construcţiile PVR-Fc au fost generate utilizând tehnici standard de ADN recombinant. Specific, domeniul extracelular al PVR uman a fost ligat în-cadru la o regiune Fc de iepure şi proteina hPVR-rbFc recombinantă a fost exprimată în celule CHO. Proteinele de fuziune au fost purificate din mediul de cultură celulară utilizând cromatografia proteinei A.

Celulele HEK-293T au fost transfectate tranzient cu construcţia hTIGIT-CD4TM-GFP. După 16 ore, celulele transfectate au fost suspendate în HBSS cu gheaţă rece conţinând 2% FBS şi heparină şi incubate pe gheaţă cu 0,5µg/ml proteină de fuziune hPVR-rbFc în prezenţa anticorpilor anti-TIGIT 313R19, 313M26, sau 313M32 timp de 60 minute. Anticorpul 313R19 este o versiune umanizată a unui anticorp anti-TIGIT de iepure. 313R19 se leagă la TIGIT de şoarece şi uman. Anticorpii au fost testaţi la concentraţii de 10, 2, şi 0,4ug/ml. Celulele au fost incubate fără anticorp sau fără hPVR-rbFc ca controale. O a doua incubare cu 100µl anticorp secundar Fc anti-iepure conjugat PE a fost efectuată pentru a detecta celulele legate de către proteina de fuziune hPVR-rbFc. Celulele au fost analizate pe un instrument FACSCanto (BD Biosciences) şi datele au fost procesate utilizând software-ul FlowJo.

Aşa cum se arată în Figura 19A, în absenţa oricărui anticorp anti-TIGIT, hPVR-rbFc s-a legat puternic la hTIGIT exprimat pe suprafaţa celulelor HEK-293T. Toţi cei trei anticorpi anti-TIGIT au blocat legarea hPVR-rbFc la hTIGIT la concentraţia cea mai mare de 10µg/ml. Totuşi, la concentraţii mai scăzute de 2ug/ml şi 0,4µg/ml de anticorp, anticorpul 313R19 nu a blocat legarea hPVR-rbFc la TIGIT. În contrast, anticorpul anti-hTIGIT 313M32 a blocat puternic legarea hPVR-rbFc la hTIGIT la 2µg/ml şi nivelul de blocare a fost mai ridicat decât la anticorpul parental de şoarece 313M26. Aceste rezultate au sugerat că afinitatea anticorpului 313M32 umanizat pentru hTIGIT a fost mai ridicată decât cea a anticorpului parental 313M26 şi a anticorpului 313R19. A fost efectuat un experiment suplimentar utilizând anticorpul 313R19 şi anticorpul 313M32 la concentraţii de 10, 5, 2,5, şi 1,25µg/ml (Fig. 19B). Rezultatele din aceste două studii sugerează că afinitatea anticorpului 313M32 pentru hTIGIT este de aproximativ 5 ori mai ridicată decât a anticorpului 313R19. Suplimentar, rezultatele Biacore preliminare au arătat că afinitatea 313R19 a fost de 2nM şi afinitatea 313M32 a fost de 0,4nM.

Exemplul 17

Semnalizare TIGIT şi fosforilare TIGIT

TIGIT este fosforilat la coada sa citoplasmatică după interacţiunea cu contrareceptorul său PVR. Fosforilarea TIGIT este începutul unei cascade care include evenimente în aval care afectează alte căi de semnalizare cunoscute. Prin urmare, evaluarea fosforilării TIGIT poate da informaţii despre funcţia TIGIT şi efectul unui antagonist TIGIT.

Liniei celulare T umane CD4+ Jurkat îi lipseşte expresia TIGIT umană după cum s-a determinat prin PCR în timp real şi prin FACS (datele nu sunt prezentate). Pentru a genera o linie celulară care exprimă TIGIT, celulele Jurkat au fost infectate cu o construcţie lentivirus care exprimă TIGIT uman (hTIGIT) marcat cu FLAG şi proteină fluorescentă verde (GFP). Celulele GFP-pozitive au fost sortate în plăci cu 96 de godeuri utilizând un sortator de celulă FACSAria II (BD Biosciences), celulele singure au fost expandate în clone, şi a fost selectată o linie celulară clonală (Jurkat-hTIGIT).

Liniei celulare de limfom cu celule B umane 721.221 îi lipseşte expresia PVR după cum s-a determinat prin PCR în timp real şi prin FACS (datele nu sunt prezentate). Pentru a genera o linie celulară care exprimă PVR, celulele 721.221 au fost infectat cu o construcţie lentivirus care exprimă PVR uman (hPVR) şi GFP. Celulele GFP-pozitive au fost sortate în plăci cu 96 de godeuri utilizând un sortator de celule FACSAria II (BD Biosciences), celulele singure au fost expandate în clone, şi a fost selectată o linie celulară clonală (721.221-hPVR).

Pentru a evalua fosforilarea TIGIT ca răspuns la PVR, celulele Jurkat-hTIGIT au fost incubate în mediu fără ser timp de 2 ore la 37°C. Celulele au fost apoi pretratate cu 20µg/ml de anticorpi anti-TIGIT 313R19, 313M26, sau 313M32, sau cu un anticorp de control timp de 20 minute la temperatura camerei. Celulele Jurkat-hTIGIT au fost amestecate cu celulele 721.221 parentale sau cu celulele 721.221-mPVR la un raport celular de 5:1 şi incubate timp de 5 minute la 37°C în prezenţa unui inhibitor de tirozină fosfastază (10mM ortovanadat de sodiu, New England Biolabs). Lizatele celulare au fost preparate şi imunoprecipitate cu perle magnetice acoperite cu anti-FLAG care au capturat proteinele hTIGIT marcate cu FLAG. Imunoprecipitatele au fost resolvate pe 4-12% geluri Bis-Tris (Novex/Life Technologies) şi transferate la membrana de nitroceluloză utilizând un aparat iBlot 2 (Life Technologies). Membrana a fost incubată cu un anticorp antitirozină conjugat la peroxidază din hrean şi TIGIT fosforilat (pTIGIT) a fost vizualizat utilizând reactivi de detecţie standard. Prezenţa TIGIT total a fost evaluată utilizând un anticorp anti-FLAG (Cell Signaling Technology).

S-a observat că hTIGIT este puternic fosforilat în celulele Jurkat ca răspuns la celulele tumorale care exprimă hPVR. Această fosforilare a fost inhibată în prezenţa anticorpilor anti-TIGIT, în special a anticorpului 313M32 (Fig. 20).

Exemplul 18

Maparea epitopului

Maparea epitopului anticorpilor anti-hTIGIT

Pentru a identifica epitopul de legare al anticorpului 313M32, s-a efectuat o analiză cu o serie de variante de TIGIT uman cu substituţii specifice de aminoacizi. Variantele au fost bazate pe diferenţele între secvenţele de aminoacizi de TIGIT uman şi TIGIT de cynomolgus, SEQ ID NO:4 şi SEQ ID NO:77, respectiv. Secvenţa de aminoacizi de TIGIT de maimuţă rhesus (SEQ ID NO:78) este identică cu cea de TIGIT de cynomolgus (Figura 21). Variantele de aminoacid introduc resturi de aminoacid prezente la TIGIT de maimuţă cynomolgus în poziţiile corespunzătoare din TIGIT uman. Variantele hTIGIT au generat au substituţii la (1) E36K şi I41V; (2) T51M, (3) Q62H şi Q64H, (4) D72E, (5) S78Y şi S80A, (6) V100M, (7) I109T şi T119R, şi (8) G135S. Fiecare variantă hTIGIT a fost generată utilizând construcţiile (aa 22-141)-CD4TM-GFP hTIGIT descrise în Exemplul 15.

Variantele TIGIT au fost evaluate prin FACS cu anticorpi anti-hTIGIT. Celulele HEK-293T au fost transfectate tranzient cu hTIGIT-CD4TM-GFP, mTIGIT-CD4TM-GFP, sau cu una dintre variantele de construcţii hTIGIT-CD4TM-GFP. După 16 ore, celulele transfectate au fost suspendate în HBSS cu gheaţă rece conţinând 2% FBS şi incubate pe gheaţă cu 1µg/ml anticorpi anti-hTIGIT 313R12, 313M32, sau 313M34 timp de 30 minute. 313M34 este un anticorp anti-hTIGIT care a fost generat pe baza secvenţelor de aminoacizi ale anticorpului 10A7 descris în publicaţia S.U.A. 2009/0258013. Anticorpul 10A7 este un anticorp TIGIT anti-şoarece care se leagă atȃt la TIGIT de şoarece cȃt şi la TIGIT uman. O a doua incubare cu 50µl anticorp secundar anti-Fc conjugat PE a fost efectuată pentru a detecta celulele legate de către anticorpi. Celulele au fost analizate pe un instrument FACSCanto (BD Biosciences) şi datele au fost procesate utilizând software-ul FlowJo.

Aşa cum se arată în Figura 22, anticorpul 313M32 nu s-a legat la varianta 3 TIGIT cu substituţii la resturile de aminoacid 62 şi 64 şi la varianta 7 TIGIT cu substituţii la resturile de aminoacid 109 şi 119. Anticorpul a reţinut legarea sa puternică la hTIGIT şi variantele 1, 2, 4, 5, 6, şi 8 TIGIT. Resturile de aminoacid 62, 64, 109, şi 119 sunt evidenţiate în negru pe o reprezentare a structurii cristalului de TIGIT legat la PVR (Figura 23). Structura TIGIT uman este prezentată în reprezentarea sferică şi structura PVR este furnizată în reprezentarea liniară. Poziţiile aminoacizilor dezvăluie că anticorpul 313M32 se leagă la hTIGIT într-o zonă care ar trebui să blocheze şi/sau să interfere cu legarea la PVR. Este de remarcat faptul că anticorpul 313R12 a pierdut de asemenea legarea la varianta 7 TIGIT cu substituţii la resturile de aminoacid 109 şi 119 sugerând că 313R12 se leagă la un epitop care se suprapune cu epitopul legat de către 313M32. Interesant, legarea anticorpului 313M34 la TIGIT nu a fost impactată de substituţiile de aminoacizi ale variantei 3 sau variantei 7 TIGIT, dar a fost impactată de substituţia de aminoacizi la restul 100 al variantei 6 TIGIT. Acest rezultat arată că anticorpul 313M34 nu se leagă la acelaşi epitop ca anticorpul 313M32. Poziţiile relative ale resturilor critice de legare pentru anticorpii 313M32 şi 313M34 pe TIGIT sunt indicate pe reprezentarea din Figura 23.

Pentru a confirma că anticorpul 313M26 (anticorpul anti-TIGIT murin parental al 313M32) şi 313R19 (anticorp anti-hTIGIT de iepure umanizat generat din 313R12) se leagă la un epitop comun, s-au efectuat studii de competiţie. Deoarece porţiunile Fc ale anticorpilor 313M26 şi 313R19 sunt diferite, adică, Fc murin şi respectiv Fc uman, legarea unui anticorp (313R19) în prezenţa sau absenţa celui de al doilea anticorp (313M26) poate fi determinată. Pe scurt, celulele HEK-293T au fost transfectate tranzient cu un vector de expresie care codifică TIGIT-CD4TM-GFP uman. Celulele au fost incubate timp de 1 oră cu 0,5µg de anticorp 313M19 şi un exces de anticorp 313M26 (de la 50 până la 0,78µg/ml, de 2 ori diluţii). Celulele au fost spălate şi incubate cu un anticorp secundar marcat fluorescent specific pentru Fc uman şi analizate prin citometrie de flux.

Aşa cum se arată în Figura 24A, anticorpul 313M26 a concurat cu 313R19 pentru legare la hTIGIT şi un exces de 313M26 a blocat eficient legarea 313R19 la hTIGIT. Aceste date au indicat că 313M26/313M32 şi 313R12/313R19 se leagă la epitopi care se suprapun şi sunt consistenţi cu analiza epitopului prezentată în Figura 23. În experimente paralele, a fost examinată abilitatea 313R19 sau 313M32 de a concura cu 313M34 pentru legare la TIGIT. Aşa cum se arată în Figura 24B, nici anticorpul 313R19, nici anticorpul 313M32 nu au fost observaţi că concurează cu 313M34 pentru legare la hTIGIT. Aceste rezultate au indicat că 313R19 şi 313M32 se leagă la un epitop distinct faţă de epitopul legat de 313M34. Aceste rezultate sunt de asemenea consistente cu analiza epitopului prezentată în Figura 23.

Exemplul 19

Producţie de citokine

S-a arătat că implicarea TIGIT cu PVR (CD155) exprimată pe celule tumorale sau celule care prezintă antigen subreglează funcţiile efectoare ale celulei T şi inhibă răspunsurile imune anti-tumorale (vezi de exemplu, Joller şi colab., 2014, Immunity, 40:569-581). A fost investigată abilitatea anticorpilor anti-TIGIT 313R19 şi 313M32 de a bloca inhibarea mediată de PVR a secreţiei de citokine a celulelor T. Exploziile de celule T umane activate au fost generate prin cultura de 10 zile a celulelor T umane primare cu fitohemaglutinină (PHA, 2µg/ml) şi IL-2 (4ng/ml). Exploziile au fost odihnite în mediu fără PHA/IL-2 timp de 24 ore, resuspendate la 5 Ч 105 celule/ml, şi tratate cu un anticorp de control (IgG uman policlonal, 25µg/ml), anticorpul anti-TIGIT 313R19 sau 313M32 la 10 sau 25µg/mL timp de 15 minute la temperatura camerei. Celulele au fost apoi placate în godeuri care au fost acoperite peste noapte la 4°C cu anticorp anti-CD3 (Ebiosciences), PVR-Fc uman, sau anticorp anti-CD3 şi hPVR-Fc (fiecare la 10µg/m). Supernatanţii de cultură fără celule au fost recoltaţi după 48 ore şi citokinele IFN-γ şi IL-2 au fost determinate prin ELISA (R&D Systems). Rezultatele sunt exprimate faţă de producţia de citokine de către celulele activată cu anti-CD3 singur în care nivelul de citokine anti-CD3 este stabilit la 1,0.

Cum se vede în Figura 25, hPVR-Fc nu induce producţia de IFN-gama sau IL-2 în celulele activate. Totuşi, hPVR-Fc inhibă puternic producţia de citokine care este indusă de implicarea anti-CD3. Această inhibare este inversată de către anticorpii anti-TIGIT 313R19 şi 313M32 şi la o doză mai mare de 25ug/ml, producţia de IFN-gama sau IL-2 este de fapt mai mare decât cantitatea generată de anti-CD3. Celulele T activate exprimă atȃt TIGIT cȃt şi CD226, şi ambele pot să interacţioneze cu PVR, dar interacţiunea TIGIT/PVR este inhibitoare şi interacţiunea CD226/PVR este activatoare. Fără a dori o legătură cu teoria, se sugerează că, când celulele T activate sunt în contact cu PVR, interacţiunea TIGIT/PVR „cȃştigă«, deoarece TIGIT se leagă la PVR mai puternic decât CD226. În plus, par să fie niveluri mai ridicate de TIGIT pe celulele T activate decât pe CD226, astfel încȃt interacţiunea globală este inhibitoare. De exemplu, în Figura 25 se compară anti-CD3 singur cu anti-CD3 plus PVR. Când TIGIT este blocat cu 313R19 sau 313M32 inhibarea mediată de TIGIT este inversată, dar teoretic interacţiunea CD226/PVR încă are loc, şi acea interacţiune este activatoare. Prin urmare, cum se vede în Figura 25, când TIGIT este blocat şi celulele T sunt stimulate cu anti-CD3 plus PVR, nivelurile IFN-gama sunt de fapt mai ridicate decât când se stimulează cu anti-CD3 singur.

Aceste rezultate demonstrează că blocarea TIGIT uman cu un anticorp anti-TIGIT poate întrerupe interacţiunile TIGIT/PVR şi reface producţia de citokine care este benefică unui răspuns anti-tumoral.

Exemplul 20

Test de citotoxicitate mediată de celula dependentă de anticorp

Citotoxicitatea mediată de celula dependentă de anticorp (ADCC) se referă la uciderea unei celule ţintă acoperite cu anticorp de către o celulă efectoare citotoxică printr-un proces non-fagocitic, caracterizat uzual prin eliberarea de granule citotoxice sau prin expresia moleculelor care induc moartea celulei. Celulele efectoare care mediază ADCC includ celule ucigaşe natural (NK), monocite, macrofage, neutrofile, eozinofile şi celule dendritice. A fost investigată abilitatea anticorpilor anti-TIGIT 313R19 şi 313M32 de a media celula NK, ADCC a celulei NK. ADCC a fost testată într-un test standard de 4 ore de eliberarea calceinei utilizând celule NK umane primare ca efectori şi celule Jurkat parentale sau celule Jurkat-hTIGIT ca ţinte. Celulele NK umane au fost izolate direct din straturile leucoase de sânge periferic proaspăt (Stanford Blood Center, Palo Alto, CA) printr-o incubare de 30 minute cu cocktail RosetteSep (Stem Cell Technologies) înainte de centrifugarea Ficoll-Hypaque (Sigma) în gradient de densitate. Celulele ţintă Jurkat parentale sau Jurkat-hTIGIT au fost marcate cu 10µM calceină AM (Life Technologies) timp de 1 oră la 37 °C şi apoi tratate cu un anticorp IgG policlonal de control, anticorpul anti-TIGIT 313R19, sau anticorpul anti-TIGIT 313M32 (toate la 10µg/mL) timp de 15 minute la temperatura camerei. După incubare, celulele Jurkat sau Jurkat-hTIGIT au fost combinate cu celulele NK la un raport efector:ţintă de 20:1 în plăci cu 96 de godeuri cu fundul în formă de V. După o incubare de 4 ore la 37°C, supernatanţii fără celule au fost recoltaţi şi calceina eliberată a fost cuantificată pe un fluorometru la o excitaţie de 485 nm şi o emisie de 535 nm. Procentajul de lizare specifică a celulei a fost determinat ca: % lizare = 100 Ч (ER-SR)/(MR-SR), unde ER, SR, şi MR reprezintă eliberarea experimentală, eliberarea spontană, şi respectiv eliberarea maximă de calceină. Eliberarea spontană este fluorescenţa emisă de celule ţintă incubate în mediu singur (adică, în absenţa celulelor efectoare), în timp ce eliberarea maximă este determinată prin lizarea celulelor ţintă cu un volum egal de 10% SDS. Pentru ambele linii celulare Jurkat şi Jurkat-hTIGIT, procentajul de ADCC este determinat ca procentajul de lizare specifică în prezenţa anticorpului experimental (313R19 sau 313M32) minus procentajul de lizare specifică în prezenţa anticorpului de control. Aşa cum se arată în Figura 26, procentajul ADCC a crescut semnificativ în prezenţa anticorpilor anti-TIGIT 313R19 şi 313M32 când celulele ţintă au exprimat TIGIT. Abilitatea anticorpilor anti-TIGIT de a induce ADCC ar sugera că anticorpii anti-TIGIT pot avea multiple mecanisme pentru amplificarea răspunsului imun la celulele tumorale.

Exemplul 21

Inhibarea creşterii tumorale in vivo la şoarecii umanizaţi de către un anticorp anti-TIGIT

Un model umanizat pe şoarece a fost utilizat pentru a studia eficacitatea tratamentului cu un anticorp anti-TIGIT asupra unei tumori umane. Şoarecii umanizaţi au fost obţinuţi de la Laboratoarele Jackson. Aceşti şoareci sunt creaţi prin injectarea celulelor stem hematopoietice umane (celule CD34+) în şoareci NSG iradiaţi. După 15 săptămâni, prezenţa limfocitelor umane mature este confirmată prin citometrie de flux. Fiecare şoarece a fost injectat subcutanat cu celule tumorale de melanom derivate de la pacient (OMP-M9, 75.000 celule/şoarece). Tumorile au fost lăsate să crească 19 zile până când ele au atins un volum mediu de aproximativ 50mm3. Şoarecii purtători de tumori au fost randomizaţi în grupuri (n = 8 şoareci pe grup). Şoarecii purtători de tumori au fost trataţi cu un anticorp de control, un anticorp anti-TIGIT 313R19, sau un anticorp anti-TIGIT 313M32. Şoarecii au fost dozaţi la fiecare 5 zile cu 1mg/kg sau 5mg/kg. Creşterea tumorii a fost monitorizată şi volumele tumorale au fost măsurate cu şublere electronice la momentele de timp indicate.

Aşa cum se arată în Figura 27, creşterea tumorii a fost inhibată la şoarecii trataţi cu anticorpul 313R19 şi anticorpul 313M32 în comparaţie cu controlul. Aceste rezultate arată că ţintirea TIGIT a fost eficientă la augmentarea unui răspuns imun anti-tumoral al limfocitelor umane şi a contribuit la inhibarea creşterii tumorii umane in vivo. În acest experiment, combinaţia de anticorpi anti-TIGIT 313R19 sau 313M32 şi un anticorp anti-hPD-1 nu a inhibat creşterea tumorii într-o măsură mai mare decât anticorpii anti-TIGIT ca agenţi singuri (datele nu sunt prezentate).

S-a descoperit că anticorpii 313M32 şi 313R19 inhibă creşterea tumorii în contextul limfocitelor umane şi au potenţe similar in vivo. Aceste rezultate au demonstrat că modelele umanizate pe şoarecii care poartă xenogrefe derivate de la pacienţi pot fi utilizate pentru a studia anticorpul anti-TIGIT 313M32 (care se leagă numai la TIGIT uman) în paralel cu studiile preclinice efectuate cu anticorpii anti-TIGIT 313R12 şi 313R19 şi modelele tumorale murine.

Exemplul 22

Farmacocinetici ale anticorpilor anti-TIGIT

Cum s-a descris aici, anticorpul anti-TIGIT 313R12 se leagă preferenţial la TIGIT de şoarece şi este molecula surogat de şoarece utilizată în majoritatea studiilor de eficacitate preclinică. PK a anticorpului anti-TIGIT 313R12 au fost determinate la şoarecii C57BL-6J la doze de 0,1, 1 şi 10mg/kg. Probele de sânge au fost luate pe parcursul a 21 zile. 313R12 a prezentat caracteristici PK 2-compartimentale neliniare la nivelurile de dozare studiate. Se crede că o astfel de eliminare dependentă de concentraţie este o caracteristică tipică a anticorpilor monoclonali pentru care eliminarea mediată de ţintă poate fi o componentă semnificativă a mecanismului de eliminare global când ţinta este abundentă şi cu accesibilă cu uşurinţă de către medicament. La un profil concentraţie-timp de 10mg/kg al 313R12 aproximat liniar în decursul a 21 zile, s-a sugerat saturaţia moleculei ţintă accesibile. Estimarea perioadei de înjumătăţire terminale nu este aplicabilă pentru datele PK neliniare.

PK anticorpului anti-TIGIT 313R19 au fost determinate la şoarecii Balb/c. O singură doză de 10mg/kg a fost dată fiecărui şoarece fie IV sau fie IP. Probele de sânge au fost luate pe durata a 21 zile. 313R19 au prezentat caracteristici PK 2-compartimentale liniare cu o eliminare IgG tipică. Perioada de înjumătăţire terminală la şoareci la 10mg/kg a fost estimată a fi de 7,6 zile.

PK anticorpului anti-TIGIT 313R19 au fost de asemenea determinate la maimuţa cynomolguss. Doze de 10, 30, şi 100mg/kg au fost dată fiecărui animal, de două ori pe săptămână cȃte 4 doze. Fiecare grup de dozare a fost de 4 animale masculi şi terminarea studiului a fost după a patra doză fără perioadă de recuperare. 313R19 la maimuţa cynomolguss a prezentat caracteristici PK 2-compartimentale liniare cu o eliminare IgG tipică. Perioada de înjumătăţire terminală la maimuţa cynomolguss a fost estimată a fi de 15,3 zile.

Farmacocineticile anticorpului anti-TIGIT 313M32 a fost determinate la şoarecii Balb/c. O singură doză de 1 sau 10mg/kg a fost dată fiecărui şoarece IV sau 10mg/kg IP. Probele de sânge au fost luate în decursul a 21 zile. 313M32 la şoareci a prezentat caracteristici PK 2-compartimentale liniare, care au fost consistente cu faptul că 313M32 nu a avut legare detectabilă la TIGIT de şoarece. Eliminarea a fost lentă şi a demonstrat un comportament PK IgG preliminar tipic. Perioada de înjumătăţire terminală la şoareci a fost estimată a fi de 11,7 zile.

Următoarele sunt secvenţe divulgate în cererea de brevet:

Secvenţă de aminoacizi TIGIT de şoarece (SEQ ID NO:1)

Secvenţă de aminoacizi TIGIT de şoarece fără secvenţă semnal predictată (SEQ ID NO:2)

Secvenţă de aminoacizi a domeniului extracelular TIGIT de şoarece (SEQ ID NO:3)

Secvenţă de aminoacizi TIGIT umană (SEQ ID NO:4)

Secvenţă de aminoacizi TIGIT umană fără secvenţă semnal predictată (SEQ ID NO:5)

Secvenţă de aminoacizi a domeniului extracelular TIGIT uman (SEQ ID NO:6)

CDR1 a lanţului greu al 313R11/313R12 (SEQ ID NO:7) GSSLSSSYMS

CDR2 a lanţului greu al 313R11/313R12/313R14/313R19 (SEQ ID NO:8) IIGSNGNTYYANWAKG

CDR3 a lanţului greu al 313R11/313R12/313R14/313R19 (SEQ ID NO:9) GGYRTSGMDP

CDR1 a lanţului uşor al 313R11/313R12 (SEQ ID NO: 10) QASQSISSYLNW

CDR2 a lanţului uşor al 313R11/313R12 (SEQ ID NO: 11) DALKLAS

CDR3 a lanţului uşor al 313R11/313R12 (SEQ ID NO: 12) QQEHSVGNVDN

CDR1 a lanţului greu al 313R14/313R19 (SEQ ID NO:13) GFSLSSSYMS

Varianta1 a CDR1 a lanţului uşor al 313R14/313R19 (SEQ ID NO:14) QASQSNIYSDLAW

CDR2 a lanţului uşor al 313R14/313R19 (SEQ ID NO: 15) RASTLAS

CDR3 a lanţului uşor al 313R14/313R19 (SEQ ID NO:16) QQEHLVAWIYN

Secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu al 313R11/313R12 (SEQ ID NO:17)

Secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor al 313R11/313R12 (SEQ ID NO:18)

Secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu al 313R14 (SEQ ID NO:19)

Secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor al 313R14/313R19/313R20 (SEQ ID NO:20)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (mIgG1) al 313R11 cu secvenţă semnal subliniată (SEQ ID NO:21)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (mIgG2) al 313R12 cu secvenţă semnal subliniată (SEQ ID NO:22)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor al 313R11/313R12 cu secvenţă semnal subliniată (SEQ ID NO:23)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (hIgG1) al 313R14 cu secvenţă semnal subliniată (SEQ ID NO:24)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor al 313R14/313R19/313R20 cu secvenţă semnal subliniată (SEQ ID NO:25)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (mIgG1) al 313R11 fără secvenţă semnal (SEQ ID NO:26)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (mIgG2) al 313R12 fără secvenţă semnal (SEQ ID NO:27)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor al 313R11/313R12 fără secvenţă semnal (SEQ ID NO:28)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (hIgG1) al 313R14 fără secvenţă semnal (SEQ ID NO:29)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor al 313R14/313R19/313R20 fără secvenţă semnal predictată (SEQ ID NO:30)

Peptidă AH-1 (SEQ ID NO:31) SPSYVYHQF

Secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu al 313R19/313R20 (SEQ ID NO:32)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (IgG1) al 313R19 cu secvenţă semnal subliniată (SEQ ID NO:33)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (IgG1) al 313R19 fără secvenţă semnal (SEQ ID NO:34)

Liant (SEQ ID NO:35) ESGGGGVT

Liant (SEQ ID NO:36) LESGGGGVT

Liant (SEQ ID NO:37) GRAQVT

Liant (SEQ ID NO:38) WRAQVT

Liant (SEQ ID NO:39) ARGRAQVT

Etichetă FLAG (SEQ ID NO:40) DYKDDDDK

Regiune constantă a lanţului greu IgG1 uman (SEQ ID NO:41)

Regiune constantă a lanţului greu IgG2 uman (SEQ ID NO:42)

Regiune constantă a lanţului greu IgG3 uman (SEQ ID NO:43)

Regiune constantă a lanţului greu IgG4 uman (SEQ ID NO:44)

Regiune Fc IgG1 umană (versiunea 13A) (SEQ ID NO:45)

Regiune Fc IgG1 umană (versiunea 13B) (SEQ ID NO:46)

Regiune Fc IgG1 umană (versiunea 13A) (SEQ ID NO:47)

Regiune Fc IgG1 umană (versiunea 13B) (SEQ ID NO:48)

Regiune Fc IgG2 umană (versiunea 13A) (SEQ ID NO:49)

Regiune Fc IgG2 umană (versiunea 13B) (SEQ ID NO:50)

Regiune Fc IgG2 umană (versiunea 13A) (SEQ ID NO:51)

Regiune Fc IgG2 umană (versiunea 13A) (SEQ ID NO:52)

Regiune Fc IgG2 umană (versiunea 13B) (SEQ ID NO:53)

Regiune Fc IgG2 umană (versiunea 13B) (SEQ ID NO:54)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (IgG4) al 313R20 cu secvenţă semnal subliniată (SEQ ID NO:55)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (IgG4) al 313R20 fără secvenţă semnal (SEQ ID NO:56)

CDR1 a lanţului greu al 313M26/313M32 (SEQ ID NO:57) TSDYAWN

CDR2 a lanţului greu al 313M26/313M32 (SEQ ID NO:58) YISYSGSTSYNPSLRS

CDR3 a lanţului greu al 313M26/313M32 (SEQ ID NO:59) ARRQVGLGFAY

CDR1 a lanţului uşor al 313M26/313M32 (SEQ ID NO:60) KASQDVSTAVA

CDR2 a lanţului uşor al 313M26/313M32 (SEQ ID NO:61) SASYRYT

CDR3 a lanţului uşor al 313M26/313M32 (SEQ ID NO:62) QQHYSTP

Secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu al 313M26 (SEQ ID NO:63)

Secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor al 313M26 (SEQ ID NO:64)

Secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu al 313M26 (SEQ ID NO:65)

Secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor al 313M26 (SEQ ID NO:66)

Secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului greu al 313M32 (SEQ ID NO:67)

Secvenţă de aminoacizi a regiunii variabile a lanţului uşor al 313M32 (SEQ ID NO:68)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (IgG1) al 313M32 cu secvenţă semnal predictată subliniată (SEQ ID NO:69)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului greu (IgG1) al 313M32 fără secvenţă semnal (SEQ ID NO:70)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor al 313M32 cu secvenţă semnal predictată subliniată (SEQ ID NO:71)

Secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor al 313M32 fără secvenţă semnal (SEQ ID NO:72)

Secvenţă de nucleotide a regiunii variabile a lanţului greu al 313M32 (SEQ ID NO:73)

Secvenţă de nucleotide a regiunii variabile a lanţului uşor al 313M32 (SEQ ID NO:74)

Secvenţă de nucleotide a lanţului greu (IgG1) al 313M32 (SEQ ID NO:75)

Secvenţă de nucleotide a lanţului uşor al 313M32 (SEQ ID NO:76)

TIGIT de maimuţă cynomolgus (SEQ ID NO:77)

TIGIT de maimuţă rhesus (SEQ ID NO:78)

Aminoacizii 55-70 de TIGIT uman (SEQ ID NO:79) TQVNWEQQDQLLAICN

Aminoacizii 105-122 de TIGIT uman (SEQ ID NO:80) EYFCIYHTYPDGTYTGRI

CDR1 a lanţului uşor al 313R14/313R19 (SEQ ID NO:81) QASQNIYSDLAW

Secvenţă de aminoacizi IgG4 a lanţului greu al 313M33 fără secvenţă semnal (SEQ ID NO:82)

Secvenţă de aminoacizi a lanţ greu (IgG4) al 313M33 cu secvenţă semnal (SEQ ID NO:83)

Secvenţă de nucleotide (igG4) a lanţului greu al 313M33 (SEQ ID NO:84)

Claims

1. Un anticorp care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT uman, care cuprinde o CDR1 a lanţului greu cuprinzând TSDYAWN (SEQ ID NO:57), o CDR2 a lanţului greu cuprinzând YISYSGSTSYNPSLRS (SEQ ID NO:58), şi o CDR3 a lanţului greu cuprinzând ARRQVGLGFAY (SEQ ID NO:59), şi o CDR1 a lanţului uşor cuprinzând KASQDVSTAVA (SEQ ID NO:60), o CDR2 a lanţului uşor cuprinzând SASYRYT (SEQ ID NO:61), şi o CDR3 a lanţului uşor cuprinzând QQHYSTP (SEQ ID NO:62).

2. Anticorpul conform revendicării 1, care cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu având cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor având cel puţin 95% identitate de secvenţă cu SEQ ID NO:68; opţional în care anticorpul cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu cuprinzând SEQ ID NO:67 şi o regiune variabilă a lanţului uşor cuprinzând SEQ ID NO:68.

3. Anticorpul conform revendicării 1 sau revendicării 2, care este un anticorp monoclonal, un anticorp umanizat, un anticorp himeric, un anticorp bispecific, un anticorp IgG1 un anticorp IgG2, un anticorp IgG4, sau un fragment de anticorp cuprinzând un situs de legare la antigen.

4. Anticorpul conform revendicării 1 sau revendicării 2, care cuprinde o secvenţă de aminoacizi a lanţului greu din SEQ ID NO:70 şi o secvenţă de aminoacizi a lanţului uşor din SEQ ID NO:72.

5. Un anticorp care se leagă specific la domeniul extracelular al TIGIT uman, care cuprinde:

(a) regiunea variabilă a lanţului greu codificată de plasmidă depozitată cu ATCC ca PTA-122346 şi regiunea variabilă a lanţului uşor codificată de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122347; sau

(b) lanţul greu codificat de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122346 şi lanţul uşor codificat de plasmida depozitată cu ATCC ca PTA-122347.

6. Anticorpul în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-5, care:

(a) inhibă legarea TIGIT la receptorul poliovirus (PVR);

(b) inhibă sau blochează interacţiunea între TIGIT şi PVR;

(c) inhibă semnalizarea TIGIT;

(d) inhibă activarea TIGIT;

(e) inhibă fosforilarea TIGIT; şi/sau

(f) scade expresia suprafeţei celulare a TIGIT.

7. Anticorpul în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-6, care induce şi/sau ameliorează un răspuns imun.

8. Anticorpul în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-7, care:

(a) creşte imunitatea mediată de celulă;

(b) creşte activitatea celulei T;

(c) creşte activitatea citolitică a celulei T (CTL);

(d) creşte activitatea celulei ucigaşe natural (NK);

(e) creşte producţia de IL-2 şi/sau numărul de celule care produc IL-2;

(f) creşte producţia de IFN-gama şi/sau numărul de celule care produc IFN-gama;

(g) creşte un răspuns imun de tip Th1;

(h) scade producţia de IL-4 şi/sau numărul de celule care produc IL-4;

(i) scade producţia de IL-10 şi/sau numărul de celule care produc IL-10;

(j) scade un răspuns imun de tip Th2;

(k) inhibă şi/sau scade activitatea supresivă a celulelor T regulatoare (Treg-uri); şi/sau

(l) inhibă şi/sau scade activitatea supresivă a celulelor supresoare derivate din mieloide (MDSC-uri).

9. Un agent heterodimeric cuprinzând anticorpul conform oricăreia dintre revendicările 1-8.

10. Un agent bispecific cuprinzând:

a) un prim braţ care se leagă specific la TIGIT, şi

b) un al doilea braţ,

în care primul braţ cuprinde un anticorp conform oricăreia dintre revendicările 1-8.

11. Agentul bispecific conform revendicării 10, în care al doilea braţ:

(a) cuprinde un situs de legare la antigen de la un anticorp; sau

(b) se leagă specific la PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, OX-40, sau GITR; sau

(c) se leagă specific la un antigen tumoral; sau

(d) cuprinde un agent imunoterapeutic; opţional în care agentul imunoterapeutic este selectat din grupul constând din: factor de stimulare al coloniilor de granulocite-macrofage (GM-CSF), factor de stimulare al coloniilor de macrofage (M-CSF), factor de stimulare al coloniilor de granulocite (G-CSF), interleukină 2 (IL-2), interleukină 3 (IL-3), interleukină 12 (IL-12), interleukină 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligand 4-1BB, GITRL, OX-40L, anticorp anti-CD3, anticorp anti-CTLA4, anticorp anti-PD-1, anticorp anti-PD-L1, anticorp anti-GITR, anticorp anti-OX-40, anticorp anti-4-1BB, anticorp anti-LAG-3, şi anticorp anti-TIM-3.

12. O celulă care cuprinde sau produce anticorpul în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-8 sau agentul bispecific în conformitate cu revendicarea 10 sau cu revendicarea 11.

13. O compoziţie farmaceutică cuprinzând anticorpul în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-8 sau agentul bispecific în conformitate cu revendicarea 10 sau revendicarea 11, şi un purtător acceptabil farmaceutic.

14. O moleculă izolată de polinucleotidă cuprinzând o polinucleotidă care codifică anticorpul în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-8 sau agentul bispecific în conformitate cu revendicarea 10 sau revendicarea 11.

15. Un vector cuprinzând polinucleotida conform revendicării 14.

16. O celulă cuprinzând polinucleotida conform revendicării 14 sau vectorul conform revendicării 15.

17. Anticorpul în conformitate cu oricare dintre revendicările 1-8 sau agentul bispecific în conformitate cu revendicarea 10 sau revendicarea 11, pentru utilizare în tratamentul cancerului la un subiect, în care cancerul este preferabil selectat din grupul constând din cancer colorectal, cancer ovarian, cancer pancreatic, cancer pulmonar, cancer hepatic, cancer la sân, cancer la rinichi, cancer la prostată, cancer gastrointestinal, melanom, cancer de col uterin, cancer la vezică, glioblastom, şi cancer la cap şi gât.

18. Anticorpul sau agentul bispecific pentru utilizare în conformitate cu revendicarea 17, în care tratamentul cuprinde în plus administrarea a cel puţin unui agent imunoterapeutic suplimentar; în care opţional agentul imunoterapeutic este selectat din grupul constând din: GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), ligand 4-1BB, GITRL, ligand OX-40, anticorp anti-CD3, anticorp anti-CTLA-4, anticorp anti-PD-1, anticorp anti-PD-L1, anticorp anti-GITR, anticorp anti-OX-40, anticorp anti-4-1BB, anticorp anti-LAG-3, şi anticorp anti-TIM-3.