RS62815B1 - Tigit- vezivna sredstva i njihova upotreba - Google Patents

Tigit- vezivna sredstva i njihova upotreba

Info

Publication number
RS62815B1
RS62815B1 RS20211574A RSP20211574A RS62815B1 RS 62815 B1 RS62815 B1 RS 62815B1 RS 20211574 A RS20211574 A RS 20211574A RS P20211574 A RSP20211574 A RS P20211574A RS 62815 B1 RS62815 B1 RS 62815B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
tigit
seq
cases
heavy chain
Prior art date
Application number
RS20211574A
Other languages
English (en)
Inventor
Austin Gurney
Ming-Hong Xie
Original Assignee
Mereo Biopharma 5 Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mereo Biopharma 5 Inc filed Critical Mereo Biopharma 5 Inc
Publication of RS62815B1 publication Critical patent/RS62815B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se generalno odnosi na agense koji vezuju TIGIT, posebno na antitela koja specifično vezuju ekstracelularni domen TIGIT-a, kao i na metode korišćenja agenasa za modulaciju imunoloških odgovora i/ili lečenje bolesti kao što je rak.
STANJE TEHNIKE
[0002] Osnova za imunoterapiju je manipulacija i/ili modulacija imunološkog sistema, uključujući i urođene imune odgovore i adaptivne imune odgovore. Opšti cilj imunoterapije je lečenje bolesti kontrolom imunog odgovora na „strani agens“, na primer na patogen ili tumorsku ćeliju. Međutim, u nekim slučajevima imunoterapija se koristi za lečenje autoimunih bolesti koje mogu nastati kao rezultat abnormalnog imunološkog odgovora na proteine, molekule i/ili tkiva koja su normalno prisutna u telu. Imunoterapija može uključiti agense i metode za indukovanje ili poboljšanje specifičnih imunih odgovora ili za inhibiciju ili smanjenje specifičnih imunih odgovora.
[0003] Imuni sistem je veoma složen sistem sastavljen od velikog broja tipova ćelija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, T-ćelije, B-ćelije, prirodne ćelije ubice, antigen-prezentujuće ćelije, dendritske ćelije, monocite i makrofage. Ove ćelije poseduju složene i suptilne sisteme za kontrolu njihovih interakcija i odgovora. Ćelije koriste i aktivirajuće i inhibitorne mehanizme i povratne sprege da drže odgovore pod kontrolom i ne dozvoljavaju negativne posledice nekontrolisanog imunološkog odgovora (npr. autoimune bolesti).
[0004] Koncept imunonadzora raka je zasnovan na teoriji da imuni sistem može prepoznati ćelije tumora, pokrenuti imuni odgovor i potisnuti razvoj i/ili progresiju tumora. Međutim, jasno je da su mnoge kancerogene ćelije razvile mehanizme za izbegavanje imunološkog sistema koji može omogućiti nesputan rast tumora. Imunoterapija raka/tumora se fokusira na razvoj novih agenasa koji mogu da aktiviraju i/ili pojačaju imuni sistem da bi se postigao efikasniji napad na tumorske ćelije što dovodi do povećanog ubijanja tumorskih ćelija i/ili inhibicije rasta tumora. WO2015/009856 otkriva metode lečenja raka korišćenjem vezujućih antagonista za PD-1 osu i TIGIT inhibitora. Chauvin et al. diskutuju o TIGIT i PD-1 narušavanju tumorskih antigen-specifičnih CD8+ T ćelija kod pacijenata sa melanomom. Johnston i dr. diskutuju o tome da imunoreceptor TIGIT reguliše antitumorsku i antivirusnu funkciju efektora CD8+ T ćelija. Levin i dr. diskutuju o Vstm3 koji je član porodice CD28 i važan modulator funkcije T-ćelija. Yu i dr. diskutuju da površinski protein TIGIT potiskuje aktivaciju T ćelija promovišući stvaranje zrelih imunoregulatornih dendritskih ćelija. Bi i dr. diskutuju da T-ćelija lg i ITIM domen reguliše aktivaciju prirodnih ćelija ubica kod mišjeg akutnog virusnog hepatitisa. CN103073644 otkriva specifično anti-mišje TIGIT monoklonsko antitelo i metod pripreme, identifikaciju i primenu. US2009/258013 otkriva kompozicije i metode za lečenje bolesti povezanih sa imunitetom.
KRATAK SAŽETAK PRONALASKA
[0005] Izvođenja koja ne spadaju u obim priloženih zahteva treba da se posmatraju samo kao primeri pogodni za razumevanje pronalaska.
[0006] Ovaj pronalazak obezbeđuje antitela koja specifično vezuju ekstracelularni domen humanog TIGIT-a, koji sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TSDYAWN (SEK ID BR:57), CDR2 teškog lanca koji sadrži YISYSGSTSYNPSLRS (SEK ID BR:58) i CDR3 teškog lanca koji sadrži ARRQVGLGFAY ( SEK ID BR:59), i CDR1 lakog lanca koji sadrži KASQDVSTAVA (SEK ID BR:60), CDR2 lakog lanca koji sadrži SASYRYT (SEK ID BR:61), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQHYSTP (SEK ID BR:62). Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje antitela koja specifično vezuju ekstracelularni domen humanog TIGIT-a, koji sadrži (a) varijabilni region teškog lanca kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122346 i varijabilni region lakog lanca kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122347; ili (b) teški lanac kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122346 i laki lanac kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122347.
Pronalazak obezbeđuje heterodimerne agense koji sadrže ovde opisana antitela. Pronalazak takođe obezbeđuje bispecifične agense koji sadrže a) prvi krak koji se specifično vezuje za TIGIT, i b) drugi krak, pri čemu prvi krak sadrži ovde opisano antitelo. Pronalazak obezbeđuje ćelije koje sadrže ili proizvode ovde opisana antitela ili ovde opisane bispecifične agense.
Pronalazak obezbeđuje ovde opisana antitela ili bispecifične agense za upotrebu u postupcima lečenja raka. U nekim izvođenjima rak je izabran iz grupe koju čine kolorektalni rak, rak jajnika, rak pankreasa, rak pluća, rak jetre, rak dojke, rak bubrega, rak prostate, rak gastrointestinalnog trakta, melanom, rak grlića materice, rak mokraćne bešike, glioblastom i rak glave i vrata. U nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ovde opisana antitela ili bispecifične agense za upotrebu u imunoterapiji. U nekim izvođenjima, antitela ili bispecifični agensi su za upotrebu u imunoterapiji raka. U nekim izvođenjima, antitela ili bispecifični agensi su za upotrebu u postupcima indukovanja, aktiviranja, promovisanja, povećanja, poboljšanja ili produženja imunog odgovora. U nekim izvođenjima, antitela ili bispecifični agensi su za upotrebu u postupcima indukovanja, aktiviranja, promovisanja, povećanja, pojačavanja ili produženja imunog odgovora na rak i/ili tumor. U nekim izvođenjima, antitela ili bispecifični agensi su za upotrebu u postupcima inhibicije rasta tumora ili tumorskih ćelija. U nekim izvođenjima, antitela ili bispecifični agensi su za upotrebu u postupcima za lečenje raka. U nekim izvođenjima, metode obuhvataju inhibiciju rasta ćelija raka. U nekim izvođenjima, antitela ili bispecifični agensi se koriste u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim terapeutskim agensom.
[0007] Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije, kao što su farmaceutske kompozicije, koje sadrže ovde opisana antitela ili bispecifične agense. Polinukleotidi i/ili vektori koji kodiraju ovde opisana antitela ili bispecifične agense. Obezbeđene su ćelije koje sadrže ili proizvode ovde opisana antitela ili bispecifične agense, kao i ćelije koje sadrže polinukleotide i/ili vektore opisane ovde.
[0008] U jednom aspektu, predstavljeni pronalazak obezbeđuje agense koji vezuju TIGIT. U nekim slučajevima, agent vezuje TIGIT miša. U nekim slučajevima, agens vezuje humani TIGIT. U nekim slučajevima, agens vezuje mišji TIGIT i humani TIGIT. U nekim izvođenjima, agens je antitelo. U nekim slučajevima, agens je antitelo koje vezuje TIGIT miša. U nekim slučajevima, agens je antitelo koje vezuje humani TIGIT. U nekim slučajevima, agens je antitelo koje vezuje mišji TIGIT i humani TIGIT. U nekim slučajevima, agens je antitelo koje vezuje humani TIGIT i ne vezuje mišji TIGIT.
[0009] U nekim slučajevima, agens je antitelo koje se specifično vezuje za ekstracelularni domen TIGIT-a, koji sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži GSSLSSSYMS (SEK ID BR:7) ili GFSLSSSYMS (SEK ID BR:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8), i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR:9), i/ili CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQSISSYLNW (SEK ID BR:10), QASQSNIYSDLAW (SEK ID BR:14) ili QASQNIYSDLAW (SEK IDBR:81), CDR2 lakog lanca koji sadrži DALKLAS (SEK ID BR:11) ili RASTLAS (SEK ID BR:15), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHSVGNVDN (SEK ID BR:12) ili QQEHLVAWIYN ( SEK ID BR: 16). U nekim slučajevima, agens je antitelo koje sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži GSSLSSSYMS (SEK ID BR:7), CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8) i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR: :9), i/ili CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQSISSYLNW (SEK ID BR:10), CDR2 lakog lanca koji sadrži DALKLAS (SEK ID BR:11), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHSVGNVDN (SEK ID BR: 12).
U drugim slučajevima, agens je antitelo koje sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži GFSLSSSYMS (SEK ID BR:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SK ID BR:8) i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR: : 9); i/ili CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQSNIYSDLAW (SEK ID BR: 14), CDR2 lakog lanca koji sadrži RASTLAS (SEK ID BR: 15), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHLVAWIYN (SEK ID BR: 16). U drugim slučajevima, agens je antitelo koje sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži GFSLSSSYMS (SEK ID BR:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SK ID BR:8) i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR: :9); i/ili CDR1 lakog lanca koji sadrži KASKNIISDLAV (SEK ID BR: 81), CDR2 lakog lanca koji sadrži RASTLAS (SEK ID BR: 15), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHLVAWIYN (SEK ID BR: 16).
[0010] U nekim slučajevima, agens je antitelo koje specifično vezuje ekstracelularni domen TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19, ili SEK ID BR:32; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:18 ili SEK ID BR:20. U nekim slučajevima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19 ili SEK ID BR: 32; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:18 ili SEK ID BR:20. U nekim slučajevima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:17 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:18; varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:19 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:20; ili varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:32 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:20.
[0011] Pronalazak obezbeđuje antitelo koje specifično vezuje ekstracelularni domen ljudskog TIGIT-a i sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TSDYAWN (SEK ID BR:57), CDR2 teškog lanca koji sadrži YISYSGSTSYNPSLRS (SEK ID BR:58) i CDR3 teškog lanca lanca koji sadrži ARRQVGLGFAY (SEK ID BR:59), i/ili CDR1 lakog lanca koji sadrži KASQDVSTAVA (SEK ID BR:60), CDR2 lakog lanca koji sadrži SASYRYT (SEK ID BR:61) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQHYSTP (SEK ID BR:62). U nekim izvođenjima pronalaska, antitelo koje se specifično vezuje za ekstracelularni domen ljudskog TIGIT-a, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:63 ili SEK ID BR:67; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:64 ili SEK ID BR:68. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:63 ili SEK ID BR:67; i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:64 ili SEK ID BR:68. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:63 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:64, ili varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:67 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:68.
[0012] U nekim izvođenjima, antitelo koje je monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, ljudsko antitelo, rekombinantno antitelo, himerno antitelo, bispecifično antitelo, fragment antitela koji sadrži mesto vezivanja antigena, IgG antitelo, IgG1 antitelo, IgG2 antitelo ili IgG4 antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je monovalentno. U nekim izvođenjima, antitelo je dvovalentno. U nekim izvođenjima, antitelo je monospecifično. U nekim izvođenjima, antitelo je bispecifično.
[0013] U nekim slučajevima pronalaska, agens je antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT, pri čemu antitelo sadrži sekvencu aminokiselina teškog lanca izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 27, SEK ID BR:29, SEK ID BR:34 i SEK ID BR:56; i sekvencu aminokiselina lakog lanca izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR:28 i SEK ID BR:30. U nekim slučajevima, antitelo sadrži sekvencu aminokiselina teškog lanca SEK ID BR:26 i sekvencu aminokiselina lakog lanca SEK ID BR:28; sekvencu aminokiselina teškog lanca SEK ID BR:27 i sekvencu aminokiselina lakog lanca SEK ID BR:28; sekvencu aminokiselina teškog lanca SEK ID BR:29 i sekvencu aminokiselina lakog lanca SEK ID BR:30; sekvencu aminokiselina teškog lanca SEK ID BR:34 i sekvencu aminokiselina lakog lanca SEK ID BR:30; ili sekvencu aminokiselina teškog lanca SEK ID BR:56 i sekvencu aminokiselina lakog lanca SEK ID BR:30.
[0014] U nekim izvođenjima pronalaska, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT sadrži sekvencu aminokiselina teškog lanca SEK ID BR:70 i sekvencu aminokiselina lakog lanca SEK ID BR:72. U nekim izvođenjima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT obuhvata sekvencu aminokiselina teškog lanca SEK ID BR:82 i sekvencu aminokiselina lakog lanca SEK ID BR:72.
[0015] U nekim slučajevima pronalaska, antitelo koje specifično vezuje humani TIGIT, ne vezuje mišji TIGIT. U nekim slučajevima antitelo koje specifično vezuje humani TIGIT, ne vezuje TIGIT pacova. U nekim slučajevima antitelo koje specifično vezuje humani TIGIT, ne vezuje TIGIT zeca. U nekim slučajevima antitelo koje specifično vezuje humani TIGIT, ne vezuje TIGIT marmozeta. U nekim slučajevima antitelo koje specifično vezuje humani TIGIT, ne vezuje TIGIT psa. U nekim slučajevima antitelo koje specifično vezuje humani TIGIT, ne vezuje svinjski TIGIT. U nekim slučajevima, antitelo koje specifično vezuje humani TIGIT, ne vezuje TIGIT majmuna cinomolgus. U nekim slučajevima antitelo koje specifično vezuje humani TIGIT, ne vezuje TIGIT rezus majmuna.
[0016] U nekim slučajevima pronalaska, agens je antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca iz antitela izabranog iz grupe koju čine: 313R11, 313R12, 313R14 , 313R19 i 313R20. U nekim slučajevima, antitelo se bira iz grupe koju čine: 313R11, 313R12, 313R14, 313R19 i 313R20. U nekim slučajevima, antitelo je 313R19. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122180. U nekim slučajevima, antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122181. U nekim slučajevima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122180. U nekim slučajevima, antitelo sadrži laki lanac koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA122181. U nekim slučajevima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122180 i varijabilni region lakog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA122181. U nekim slučajevima, antitelo sadrži polipeptid koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122180 i polipeptid koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122181.
[0017] Još jedan primer pronalaska obezbeđuje plazmid deponovan sa ATCC i dodeljenom oznakom PTA-122180 i plazmid deponovan sa ATCC i dodeljenom oznakom PTA-122181.
[0018] U nekim izvođenjima pronalaska, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT obuhvata varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca iz antitela 313M32. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122346. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži polipeptid koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122346. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122347. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži laki lanac kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122347. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122346 i varijabilni region lakog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122347. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži polipeptid koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122346 i polipeptid koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122347.
[0019] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje plazmid deponovan sa ATCC i dodeljenom oznakom PTA-122346 i plazmid deponovan sa ATCC i dodeljenom oznakom PTA-122347.
[0020] U nekim slučajevima pronalaska, agens je monovalentan. U nekim slučajevima, agens je dvovalentan. U nekim slučajevima, agens je monospecifičan. U nekim slučajevima, agens je bispecifičan. U nekim slučajevima, bispecifični agens je heterodimerni agens ili heterodimerni molekul. U nekim slučajevima, heterodimerni agens sadrži ovde opisano antitelo koje se specifično vezuje za TIGIT.
[0021] Drugi primer pronalaska obezbeđuje izolovano antitelo koje se takmiči sa agensom (npr. antitelom) opisanim ovde, za specifično vezivanje za humani TIGIT. U nekim slučajevima, izolovano antitelo vezuje isti epitop na humanom TIGIT kao agens (npr. antitelo) opisan ovde. U nekim slučajevima, izolovano antitelo vezuje epitop na humanom TIGIT-u koji se preklapa sa epitopom na TIGIT-u vezano agensom (npr., antitelom) opisanim ovde. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline u SEK ID BR:79. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline u SEK ID BR:80. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline u SEK ID BR:79 i SEK ID BR:80. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q62 i 1109 iz SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q62 i T119 iz SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q64 i 1109 iz SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q64 i T119 iz SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q62, Q64 i 1109 iz SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q62, Q64 i T119 iz SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q62, 1109 i T119 iz SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q64, 1109 i T119 iz SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q62, Q64, 1109 i T119 iz SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji sadrži najmanje jednu aminokiselinu izabranu iz grupe koju čine: N58, E60, Q62, Q64, L65, F107, 1109, H111, T117, T119, G120 i R121 iz SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, epitop je konformacioni epitop. U nekim izvođenjima, antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT vezuje epitop koji ne sadrži aminokiselinu V100 iz SEK ID BR:4
[0022] U nekim izvođenjima svakog od prethodno navedenih aspekata i izvođenjima pronalaska, kao i drugih aspekata i izvođenja koje su ovde opisane, antitelo je deo bispecifičnog agensa koji sadrži prvi krak koji se specifično vezuje za TIGIT i drugi krak, pri čemu prvi krak sadrži anti-TIGIT antitelo opisano ovde. U nekim izvođenjima, drugi krak sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela. U nekim izvođenjima, drugi krak specifično vezuje PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM-3, LAG-3, OKS-40 ili GITR. U nekim izvođenjima, drugi krak specifično vezuje tumorski antigen. U nekim izvođenjima, drugi krak sadrži agens koji stimuliše imuni odgovor. U nekim izvođenjima, agens za stimulaciju imunog odgovora je izabran iz grupe koju čine: faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), interleukin 2 (IL-2), interleukin 3 (IL-3), interleukin 12 (IL-12), interleukin 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BB ligand, GITRL, OKS-40L, anti-CD3 antitelo, anti-CTLA4 antitelo, anti-PD-1 antitelo, anti-PD-Ll antitelo, anti-GITR antitelo, anti-OKS-40 antitelo, anti-LAG-3 antitelo i anti-TIM-3 antitelo.
[0023] U nekim izvođenjima, bispecifični agens je heterodimerni agens ili heterodimerni molekul. U nekim izvođenjima, bispecifični agens je homodimerni agens ili homodimerni molekul. U nekim izvođenjima, heterodimerni molekul sadrži prvi krak koji vezuje humani TIGIT i drugi krak koji vezuje drugi target. U nekim izvođenjima, heterodimerni molekul sadrži prvi krak koji se specifično vezuje za humani TIGIT i drugi krak, pri čemu prvi krak sadrži anti-TIGIT antitelo opisano ovde. U nekim izvođenjima, heterodimerni molekul sadrži prvi krak koji vezuje humani TIGIT i drugi krak koji sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela koje specifično vezuje drugi target. U nekim izvođenjima, heterodimerni molekul je bispecifično antitelo. U nekim izvođenjima, heterodimerni molekul sadrži prvi krak koji vezuje humani TIGIT i drugi krak koji specifično vezuje tumorski antigen. U nekim izvođenjima, heterodimerni molekul sadrži prvi krak koji vezuje humani TIGIT i drugi krak koji specifično vezuje PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, OKS-40, 4-1BB, ili GITR. U nekim izvođenjima, heterodimerni molekul sadrži prvi krak koji vezuje TIGIT i drugi krak koji sadrži imunoterapeutski agens. U nekim izvođenjima, imunoterapeutski agens je izabran iz grupe koju čine: faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), interleukin 2 ( IL-2), interleukin 3 (IL-3), interleukin 12 (IL-12), interleukin 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BB ligand, GITRL, OKS-40L, anti-CD3 antitelo, anti-CTLA-4 antitelo, anti-PD1 antitelo, anti-PD-Ll antitelo, anti-4-1BB antitelo, anti-GITR antitelo, anti-OKS-40 antitelo, anti-LAG -3 antitelo i anti-TIM-3 antitelo.
[0024] U nekim izvođenjima, heterodimerni molekul koji je ovde opisan obuhvata prvi krak koji sadrži prvi CH3 domen i drugi krak koji sadrži drugi CH3 domen pri čemu je svaki CH3 domen modifikovan da promoviše formiranje heterodimera. U nekim izvođenjima, CH3 domeni su modifikovani na osnovu elektrostatičkih efekata. U nekim izvođenjima, CH3 domeni se modifikuju korišćenjem tehnike „knobs-into-holes“.
[0025] U nekim izvođenjima, ovde opisani bispecifični agens obuhvata prvi krak koji sadrži prvi CH3 domen i drugi krak koji sadrži drugi CH3 domen pri čemu je svaki CH3 domen modifikovan da promoviše formiranje heterodimera. U nekim izvođenjima, CH3 domeni su modifikovani na osnovu elektrostatičkih efekata. U nekim izvođenjima, CH3 domeni se modifikuju korišćenjem tehnike „knobs-into-holes“.
[0026] U nekim izvođenjima svakog od gore navedenih aspekata i izvođenja, kao i drugih aspekata i izvođenja opisanih ovde, antitelo inhibira vezivanje TIGIT-a za receptor poliovirusa (PVR). U nekim izvođenjima, antitelo inhibira ili blokira interakciju između TIGIT-a i PVR-a. U nekim izvođenjima, antitelo inhibira vezivanje TIGIT-a za PVR-L2. U nekim izvođenjima, antitelo inhibira ili blokira interakciju između TIGIT-a i PVR-L2. U nekim izvođenjima, antitelo inhibira vezivanje TIGIT-a za PVR-L3. U nekim izvođenjima, antitelo inhibira ili blokira interakciju između TIGIT-a i PVR-L3. U nekim izvođenjima, antitelo je antagonist TIGIT-a. U nekim izvođenjima, antitelo inhibira TIGIT signalizaciju. U nekim izvođenjima, antitelo je antagonist TIGIT posredovane signalizacije. U nekim izvođenjima, antitelo inhibira TIGIT aktivaciju. U nekim izvođenjima, antitelo inhibira fosforilaciju TIGIT-a. U nekim izvođenjima, antitelo smanjuje ekspresiju TIGIT-a na površini ćelije.
[0027] U nekim izvođenjima svakog od gore navedenih aspekata i izvođenja, kao i drugih aspekata i izvođenja opisanih ovde, antitelo indukuje, aktivira, promoviše, povećava, pojačava i/ili produžava imuni odgovor. U nekim izvođenjima, imuni odgovor je usmeren na tumor ili tumorsku ćeliju. U nekim izvođenjima, imuni odgovor je usmeren na virus ili virusno inficiranu ćeliju. U nekim izvođenjima, antitelo povećava ćelijski posredovan imunitet. U nekim izvođenjima, antitelo povećava aktivnost T-ćelija. U nekim izvođenjima, agens povećava aktivnost citolitičkih T-ćelija (CTL). U nekim izvođenjima, antitelo povećava aktivnost prirodnih ćelija ubica (NK). U nekim izvođenjima, antitelo povećava proizvodnju IL-2 i/ili broj ćelija koje proizvode IL-2. U nekim izvođenjima, antitelo povećava proizvodnju IFN-gama i/ili broj ćelija koje proizvode IFN-gama. U nekim izvođenjima, antitelo povećava imuni odgovor Th1 tipa. U nekim izvođenjima, antitelo smanjuje proizvodnju IL-4 i/ili broj ćelija koje proizvode IL-4. U nekim izvođenjima, antitelo smanjuje IL-10 i/ili broj ćelija koje proizvode IL-10. U nekim izvođenjima, antitelo smanjuje proizvodnju IL-6 i/ili broj ćelija koje proizvode IL-6. U nekim izvođenjima, antitelo smanjuje proizvodnju IL-5 i/ili broj ćelija koje proizvode IL-5. U nekim izvođenjima, antitelo smanjuje imuni odgovor Th2 tipa. U nekim izvođenjima, antitelo smanjuje broj Treg ćelija. U nekim izvođenjima, antitelo smanjuje Treg aktivnost. U nekim izvođenjima, antitelo inhibira i/ili smanjuje supresivnu aktivnost Tregs-a. U nekim izvođenjima, antitelo smanjuje broj MDSC. U nekim izvođenjima, antitelo inhibira i/ili smanjuje supresivnu aktivnost mijeloidnih supresorskih ćelija (MDSC).
[0028] U nekim izvođenjima svakog od gore navedenih aspekata i izvođenja, kao i drugim aspektima i izvođenja opisanim ovde, antitelo inhibira rast tumora. U nekim izvođenjima, agens smanjuje rast tumora. U nekim izvođenjima, agens smanjuje rast tumora do veličine koja se ne može detektovati. U nekim izvođenjima, agens indukuje dugotrajni antitumorski imunitet.
[0029] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže agens koji je ovde opisan.
[0030] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže ovde opisano antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač.
Pronalasci obezbeđuju ovde opisana antitela ili bispecifične agense za upotrebu u postupcima lečenja raka i/ili inhibicije rasta tumora kod subjekta (npr. čoveka) ili. metode lečenja virusne infekcije kod subjekta (npr. čoveka).
[0031] U određenim izvođenjima pronalaska, svaki od gore navedenih aspekata, kao i drugi aspekti i/ili izvođenja opisane na drugom mestu ovde, antitelo je izolovano. U određenim izvođenjima, antitelo je suštinski čisto.
[0032] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje polinukleotide koji sadrže polinukleotid koji kodira ovde opisano antitelo. U nekim izvođenjima, polinukleotid je izolovan. U nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje vektore koji sadrže polinukleotide, kao i ćelije koje sadrže vektore i/ili polinukleotide. U nekim izvođenjima, pronalazak takođe obezbeđuje ćelije koje sadrže ili proizvode antitelo ili bispecifični agens koji je ovde opisan. U nekim izvođenjima, ćelija je monoklonska ćelijska linija.
[0033] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje ovde opisano antitelo ili bispecifično sredstvo za upotrebu u postupcima modulacije imunog odgovora subjekta. U nekim izvođenjima, postupak modulacije imunog odgovora obuhvata postupak indukcije, aktiviranja, promovisanja, povećanja, pojačavanja ili produženja imunog odgovora kod subjekta. U nekim izvođenjima, postupak za indukciju, aktiviranje, promovisanje, povećanje, pojačavanje ili produženje imunog odgovora kod subjekta, obuhvata primenu terapeutski efikasne količine antitela, bispecifičnog agensa ili polipeptida opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak indukcije, aktiviranja, promovisanja, povećanja, pojačavanja ili produženja imunog odgovora kod subjekta, obuhvata primenu terapeutski efikasne količine heterodimernog bispecifičnog agensa ili homodimernog bispecifičnog agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak za indukciju, aktiviranje, promovisanje, povećanje, pojačavanje ili produženje imunog odgovora kod subjekta, obuhvata primenu terapeutski efikasne količine antitela opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak za izazivanje imunog odgovora kod subjekta obuhvata davanje antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak za aktiviranje imunog odgovora kod subjekta obuhvata davanje antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak za podsticanje imunog odgovora kod subjekta obuhvata davanje antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak povećanja imunog odgovora kod subjekta obuhvata davanje antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak za pojačavanje imunog odgovora kod subjekta obuhvata davanje antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak za produženje imunog odgovora kod subjekta obuhvata primenu ovde opisanog antitela ili bispecifičnog agensa. U nekim izvođenjima, imuni odgovor je na antigensku stimulaciju. U nekim izvođenjima, antigenska stimulacija je tumor ili tumorska ćelija. U nekim izvođenjima, antigenska stimulacija je patogen. U nekim izvođenjima, antigenska stimulacija je virus. U nekim izvođenjima, antigenska stimulacija je ćelija inficirana virusom. U nekim izvođenjima, imuni odgovor je protiv tumora ili raka.
[0034] U nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ovde opisano antitelo ili bispecifični agens za upotrebu u postupcima povećanja aktivnosti imunih ćelija. U nekim izvođenjima, postupak povećanja aktivnosti imunih ćelija obuhvata dovođenje ćelija u kontakt sa efikasnom količinom antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, imune ćelije su T-ćelije, NK ćelije, monociti, makrofagi, ćelije izvedene iz mijeloida, ćelije koje predstavljaju antigen (APC) i/ili B-ćelije. U nekim izvođenjima, postupak povećanja aktivnosti NK ćelija kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak povećanja aktivnosti T-ćelija kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak povećanja aktivacije T ćelija i/ili NK ćelija kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak povećanja odgovora T-ćelija kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak povećanja aktivnosti CTL kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak inhibicije aktivnosti Tregs kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak inhibicije supresivne aktivnosti Tregs kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak inhibicije aktivnosti MDSC kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak inhibicije supresivne aktivnosti MDSC kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa opisanog ovde.
[0035] Neki primeri pronalaska obezbeđuju metode indukcije, aktiviranja, promovisanja, povećanja, pojačavanja ili produženja imunog odgovora kod subjekta, koje obuhvataju davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa koji vezuje humani TIGIT. U nekim slučajevima, postupak za indukovanje, aktiviranje, promovisanje, povećanje, pojačavanje ili produženje imunog odgovora kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa koji inhibira ili smanjuje aktivnost TIGIT. U nekim slučajevima, postupak za indukovanje, aktiviranje, promovisanje, povećanje, pojačavanje ili produženje imunog odgovora kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine agensa koji inhibira ili smanjuje TIGIT signalizaciju. U nekim slučajevima, imuni odgovor je protiv tumorske ćelije, tumora ili raka. U nekim izvođenjima, imuni odgovor je protiv virusne infekcije, virusnog antigena ili ćelije inficirane virusom.
[0036] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje ovde opisano antitelo ili bispecifični agens za upotrebu u postupcima inhibicije rasta tumorskih ćelija ili tumora koji se sastoje od dovođenja u kontakt tumora ili tumorske ćelije sa efikasnom količinom ovde opisanog antitela ili bispecifičnog agensa. U nekim izvođenjima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata dovođenje u kontakt tumora ili tumorske ćelije sa efikasnom količinom antitela.
[0037] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje ovde opisano antitelo ili bispecifični agens za upotrebu u postupcima inhibicije rasta tumora kod subjekta koji se sastoje od davanja subjektu terapeutski efikasne količine antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, postupak inhibicije rasta tumora kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela koje vezuje humani TIGIT. U nekim izvođenjima, postupak inhibicije rasta tumora kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine bispecifičnog agensa koji vezuje humani TIGIT. U nekim izvođenjima, tumor je izabran iz grupe koju čine kolorektalni tumor, tumor debelog creva, tumor jajnika, tumor pankreasa, tumor pluća, tumor jetre, tumor dojke, tumor bubrega, tumor prostate, gastrointestinalni tumor, melanom, tumor grlića materice, tumor mokraćne bešike , glioblastom i tumor glave i vrata.
[0038] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje ovde opisano antitelo ili bispecifični agens za upotrebu u postupcima lečenja karcinoma kod subjekta koji se sastoje od davanja subjektu. U nekim izvođenjima, postupak lečenja raka kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela ili bispecifičnog agensa. U nekim izvođenjima, postupak lečenja raka kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine bispecifičnog agensa koji vezuje humani TIGIT. U nekim izvođenjima, rak je izabran iz grupe koju čine kolorektalni kancer, rak jajnika, rak pankreasa, rak pluća, rak jetre, rak dojke, rak bubrega, rak prostate, rak gastrointestinalnog trakta, melanom, rak grlića materice, rak mokraćne bešike, glioblastom, i rak glave i vrata.
[0039] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje ovde opisano antitelo ili bispecifični agens za upotrebu u postupcima stimulacije i/ili indukcije dugotrajnog antitumorskog imuniteta kod subjekta koji se sastoje od davanja subjektu terapeutski efikasne količine antitela ili bispecifični agens opisan ovde.
[0040] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje ovde opisano antitelo ili bispecifični agens za upotrebu u postupcima stimulisanja zaštitnog odgovora kod subjekta koji se sastoje od davanja subjektu terapeutski efikasne količine antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde u kombinaciji sa antigenom od interesa. U nekim izvođenjima, antigen od interesa je tumorski antigen. U nekim izvođenjima, antigen od interesa je biomarker ćelije raka. U nekim izvođenjima, antigen od interesa je marker matičnih ćelija raka.
[0041] U nekim izvođenjima svakog od gore navedenih aspekata i izvođenja, kao i drugim aspektima i izvođenjima opisanim ovde, postupci obuhvataju davanje subjektu agensa za stimulaciju imunog odgovora. U nekim izvođenjima, agens za stimulaciju imunog odgovora je izabran iz grupe koju čine GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-3, IL-12, IL-1, IL-2, B7-1 (CD80) , B7-2 (CD86), anti-CD3 antitela, anti-CTLA-4 antitela, antiCD28 antitela, anti-PD-Ll antitela i anti-PD1 antitela.
[0042] U nekim izvođenjima svakog od gore navedenih aspekata i izvođenja, kao i drugim aspektima i izvođenjima opisanim ovde, postupak dalje obuhvata primenu najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je hemoterapeutski agens. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je antitelo. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je anti-PD-1 antitelo, anti-PD-Ll antitelo, anti-CTLA4 antitelo, anti-LAG-3 antitelo ili anti-TIM-3 antitelo. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je inhibitor Notch puta, Vnt puta ili RSPO/LGR puta.
[0043] U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je imunoterapeutski agens. Kako se ovde koristi, izraz "imunoterapeutski agens" se koristi u najširem smislu i odnosi se na supstancu koja direktno ili indirektno utiče ili modulira imuni sistem. U nekim izvođenjima, imunoterapeutski agens je agens koji direktno ili indirektno stimuliše imuni sistem indukujući aktivaciju ili povećanje aktivnosti bilo koje komponente imunog sistema. Pošto se antitela smatraju imunoterapijskim agensima, ovaj dodatni imunoterapeutski agens može se smatrati "drugim" imunoterapeutskim agensom. U nekim izvođenjima, drugi imunoterapeutski agens je izabran iz grupe koju čine: GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, B7-1 (CD80) , B7-2 (CD86), 4-1BB ligand, GITRL, OKS-40 ligand, anti-CD3 antitelo, anti-CTLA-4 antitelo, anti-CD28 antitelo, anti-PD-1 antitelo, anti-PD-Ll antitelo , anti-4-1BB antitelo, anti-GITR antitelo, anti-OKS-40 antitelo, anti-LAG-3 antitelo i anti-TIM3 antitelo. U nekim izvođenjima, drugi imunoterapeutski agens je fuzioni protein koji sadrži: GM-CSF, MCSF, G-CSF, IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BB ligand, GITRL, OKS-40 ligand, ili njegov fragment. U nekim izvođenjima, drugi imunoterapeutski agens je fuzioni protein koji sadrži najmanje jednu kopiju ekstracelularnog domena GITRL, OKS40 liganda ili 4-1BB liganda.
[0044] U nekim izvođenjima svakog od gore navedenih aspekata i izvođenja, kao i drugim aspektima i izvođenjima opisanim ovde, subjekt je čovek. U nekim izvođenjima, subjekt je imao tumor ili rak, barem delimično, uklonjen.
[0045] U nekim izvođenjima svakog od gore navedenih aspekata i izvođenja, kao i drugim aspektima i izvođenjima opisanim ovde, tumor ili rak eksprimiraju PD-L1. U nekim izvođenjima, postupak dalje obuhvata korak određivanja nivoa ekspresije PD-L1 u tumoru ili raku. U nekim izvođenjima, određivanje nivoa ekspresije PD-L1 se vrši pre tretmana ili kontakta sa ovde opisanim agensom. U nekim izvođenjima, ako tumor ili rak imaju povišen nivo ekspresije PD-L1, sredstvo opisano ovde se daje subjektu. U nekim izvođenjima, ako tumor ili rak imaju povišen nivo ekspresije PD-L1, tumor ili rak stupaju u kontakt sa ovde opisanim agensom.
KRATAK OPIS SLIKA
[0046]
Slika 1A i 1B. FACS analiza zečjih antitela generisanih na TIGIT miša. (A) HEK-293T ćelije su privremeno transfektovane vektorom ekspresije cDNK koji kodira mišji TIGIT ECD-CD4TM-GFP (zeleni fluorescentni protein) ili humani TIGIT ECD-CD4TM-GFP. Transfektovane ćelije su inkubirane sa zečjim antitelima i analizirane protočnom citometrijom. Specifično vezivanje je naznačeno prisustvom dijagonalnog signala unutar svakog FACS dijagrama. (B) HEK-293T ćelije su privremeno transfektovane vektorom ekspresije cDNK koji kodira mišji TIGIT-CD4TM-GFP. Transfektovane ćelije su inkubirane sa rastvorljivim mišjim PVR-Fc fuzionim proteinom u prisustvu zečjih antitela generisanih na TIGIT miša ili bez antitela i analizirane protočnom citometrijom. Specifično vezivanje je naznačeno prisustvom dijagonalnog signala unutar svakog FACS dijagrama. Blokiranje vezivanja je prikazano gubitkom specifičnog vezivanja i označeno je krugom preko FACS grafikona.
Slika 2A i 2B. Western blot analiza fosforilacije proteina nakon TIGIT-PVR interakcije. Ljudske Jurket T ćelije su stabilno transdukovane mišjim TIGIT-GFP sa oznakom FLAG, a ćelije E.G7-OVA su stabilno transdukovane mišjim PVR-GFP. (A) TIGIT fosforilacija. (B) SHP1 i Erk1/2 fosforilacija.
Slika 3. Western blot analiza TIGIT fosforilacije nakon TIGIT-PVR interakcije u odsustvu ili prisustvu anti-TIGIT antitela. Slika 4. Western blot analiza fosforilacije SHP1 i Erk1/2 nakon TIGIT-PVR interakcije u odsustvu ili prisustvu anti-TIGIT antitela.
Slika 5A i 5B. TIGIT inhibicija proizvodnje citokina. (A) Sekrecija IL-2 u B3Z T-ćelijama i B3Z T-ćelijama koje eksprimiraju TIGIT. (B) Sekrecija IL-2 u B3Z T-ćelijama i B3Z T-ćelijama koje eksprimiraju TIGIT nakon prethodnog tretmana anti-TIGIT antitelima.
Slika 6A i 6B. TIGIT inhibicija aktivnosti prirodnih ćelija ubica. (A) Citotoksičnost roditeljskih NK-92 ćelija i NK-92 ćelija koje eksprimiraju TIGIT. (B) Citotoksičnost roditeljskih NK-92 ćelija i NK-92 ćelija koje eksprimiraju TIGIT nakon prethodnog tretmana anti-TIGIT antitelima.
Slika 7A i 7B. Inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelima. Linija tumora debelog creva CT26.WT implantirana je potkožno u Balb/c miševe (n = 10 miševa/grupi). Miševima je 10., 15., 18., 22., 25. i 29. dana ubrizgano 0,25 mg/mišu anti-TIGIT antitela 313R11, anti-TIGIT antitela 313R12, mišjeg IgG1 kontrolnog antitela i mišjeg IgG2 kontrolnog antitela. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom u naznačenim vremenskim tačkama. Podaci su prikazani kao zapremina tumora (mm3) tokom dana nakon injekcije. (A) Slika prikazuje srednje vrednosti ± SEM za svaku grupu. (B) Dodatna studija sa anti-TIGIT antitelom 313R12 i kontrolnim antitelom.
Slika 8. Inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelima. Linija tumora debelog creva CT26.WT implantirana je potkožno u Balb/c miševe (n = 10 miševa/grupi). Miševima je 10., 14., 17. i 21. dana ubrizgano 0,25 mg/mišu anti-TIGIT antitela 313R12, anti-TIGIT antitela 313R13 i mišjeg IgG2 kontrolnog antitela. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom u naznačenim vremenskim tačkama. Podaci su prikazani kao zapremina tumora (mm3) tokom dana nakon injekcije. Na slici su prikazane srednje vrednosti ± SEM za svaku grupu.
Slike 9A do 9D. ELISpot testovi za IFN-gama, IL-2, IL-4 i IL-10. Ćelije su sakupljene iz slezine miševa koji imaju tumor CT26.WT tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 ili kontrolnim antitelom koji se podudara sa izotipom. Ćelije su inkubirane u prisustvu ili odsustvu AH-1 peptida, a zatim analizirane korišćenjem ELISpot kompleta. (A) Prikazana je ukupna optička gustina (TOD) ćelija koje proizvode IFN-gama. (B) Prikazan je TOD ćelija koje proizvode IL-2. (C) Prikazan je TOD ćelija koje proizvode IL-4. (B) Prikazan je TOD ćelija koje proizvode IL-10.
Slika 10. Aktivnost prirodnih ćelija ubica u populaciji splenocita kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom.
Slika 11. Treg aktivnost u populaciji splenocita kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom.
Slika 12A do 12E. FACS analiza splenocita miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom. (A) Procenat CD3+ ćelija od ukupnih živih ćelija. (B) Procenat CD4+ ćelija od ukupnih živih ćelija. (C) Procenat CD8+ ćelija od ukupnih živih ćelija. (D) Procenat CD4+ T-ćelija centralne memorije u ukupnoj populaciji CD4+. (E) Procenat CD8+ T-ćelija centralne memorije od ukupne CD8+ populacije.
Slika 13A do 13D. FACS analiza TIGIT pozitivnih ili negativnih Tregova u populaciji splenocita kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom. (A) Procenat TIGIT-pozitivnih ćelija od ukupnih živih ćelija. (B) Procenat FokP3+ ćelija od ukupnih CD4+ ćelija (identifikacija Treg-ova). (C) Procenat TIGIT-pozitivnih ćelija od ukupnih Treg ćelija. (D) Procenat TIGIT-negativnih ćelija od ukupnih Treg ćelija.
Slika 14A do 14D. FACS analiza MDSC u populaciji splenocita kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom. (A) Procenat CD 11b+ ćelija od ukupnih živih ćelija. (B) Procenat MDSC ukupnih CD11b+ ćelija. (C) Procenat G-MDSC ukupnih CD11b+ ćelija. (D) Procenat M-MDSC ukupnih CD11b+ ćelija
Slika 15. Inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelima. Renca ćelije (mišji adenokarcinom bubrega) su implantirane potkožno u Balb/c miševe (n = 10 miševa/grupi). Miševima je ubrizgano 7., 10., 14., 17., 21. i 24. dana sa 0,25 mg/mišu anti-TIGIT antitela 313R12 i mišjim IgG2 kontrolnim antitelom. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom u naznačenim vremenskim tačkama. Podaci su prikazani kao zapremina tumora (mm3) tokom dana nakon injekcije. Na slici su prikazane srednje vrednosti ± SEM za svaku grupu.
Slika 16. Inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelom 313R12 - studija doze. Linija tumora debelog creva miša CT26.WT implantirana je potkožno u Balb/c miševe (n = 10 miševa/grupi). Miševi su tretirani sa 0,5, 1, 3, 5, 10, 15 ili 30 mg/kg anti-TIGIT antitela 313R12 ili su tretirani kontrolnim antitelom. Miševima je davana intraperitonealna injekcija dva puta nedeljno za ukupno 6 doza. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom.
Slika 17A do 17F. In vivo inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelom 313R12 i anti-PD-L1 antitelom. Linija tumora debelog creva miša CT26.WT implantirana je potkožno (30.000 ćelija/miš) Balb/c miševima. Miševi su tretirani sa 0,25 mg/mišu anti-TIGIT antitela 313R12, anti-PD-Ll antitela, kombinacijom 313R12 i anti-PD-Ll antitela, ili kontrolnim antitelom (n = 10 po grupi). Miševima su davana antitela dva puta nedeljno tokom 3 nedelje. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom u naznačenim vremenskim tačkama. (A) Zapremine tumora pojedinačnih miševa unutar grupe tretirane kontrolnim antitelom. (B) Zapremine tumora pojedinačnih miševa unutar grupe tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12. (C) Zapremine tumora pojedinačnih miševa unutar grupe tretirane anti-PD-Ll antitelom. (D) Zapremine tumora pojedinačnih miševa unutar grupe tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 i anti-PD-Ll antitelom. (E) Prosečan rast tumora za četiri grupe tretmana. (F) Kriva preživelih.
Slika 18A do 18E. In vivo inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelom 313R12 i anti-PD-1 antitelom. Linija tumora debelog creva miša CT26.WT implantirana je potkožno (30.000 ćelija/miš) Balb/c miševima. Miševi su tretirani sa 0,25 mg/mišu anti-TIGIT antitela 313R12, anti-PD-1 antitela, kombinacijom 313R12 i anti-PD-1 antitela, ili kontrolnim antitelom (n = 15 po grupi). Miševima su davana antitela dva puta nedeljno tokom 3 nedelje. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom u naznačenim vremenskim tačkama. (A) Zapremine tumora pojedinačnih miševa unutar grupe tretirane kontrolnim antitelom. (B) Zapremine tumora pojedinačnih miševa unutar grupe tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12. (C) Zapremine tumora pojedinačnih miševa unutar grupe tretirane anti-PD-1 antitelom. (D) Zapremine tumora pojedinačnih miševa unutar grupe tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 i anti-PD-1 antitelom. (E) Prosečan rast tumora za četiri grupe tretmana.
Slika 19A i 19B. FACS analiza vezanja humanog TIGIT-a za PVR koji blokira anti-TIGIT antitelo. (A) HEK-293T ćelije su privremeno transfektovane vektorom ekspresije cDNK koji kodira humani TIGIT ECD-CD4TM-GFP (zeleni fluorescentni protein) ili humani TIGIT ECD-CD4TM-GFP. Transfektovane ćelije su inkubirane sa rastvorljivim humanim fuzionim proteinom PVRFc u prisustvu antitela generisanih na TIGIT (313R19, 313M26 ili 313M32) u koncentracijama od 10, 2 ili 04 µg/ml ili bez antitela i analizirane protočnom citometrijom. Specifično vezivanje je naznačeno prisustvom dijagonalnog signala unutar FACS dijagrama. Blokiranje vezivanja je prikazano gubitkom specifičnog vezivanja unutar tamnog crnog kvadrata preko FACS grafikona. (B) HEK-293T ćelije su privremeno transfektovane vektorom ekspresije cDNK koji kodira humani TIGIT ECD-CD4TM-GFP (zeleni fluorescentni protein) ili humani TIGIT ECD-CD4TM-GFP. Transficirane ćelije su inkubirane sa rastvorljivim humanim PVR-zečjim Fc fuzionim proteinom u prisustvu antitela generisanih na TIGIT (313R19 ili 313M32) u koncentracijama od 10, 5, 2,5 ili 1,25 µg/ml ili bez antitela i analizirane protočnom citometrijom. Specifično vezivanje je naznačeno prisustvom dijagonalnog signala unutar FACS dijagrama. Blokiranje vezivanja je prikazano gubitkom specifičnog vezivanja unutar tamnog crnog kvadrata preko FACS grafikona.
Slika 20. Western blot analiza TIGIT fosforilacije nakon TIGIT-PVR interakcije u odsustvu ili prisustvu anti-TIGIT antitela 313R19, 313M26 i 313M32.
Slika 21. Poravnanje sekvence ljudskog TIGIT-a (SEK ID BR:4), cinomolgus majmuna TIGIT (SEK ID BR:77) i TIGIT-a rezus majmuna (SEK ID BR:78).
Slika 22. Mapiranje epitopa pomoću FACS analize vezivanja anti-TIGIT antitela za varijante humanih TIGIT proteina koji sadrže specifične aminokiselinske supstitucije. Varijante hTIGIT-a su (1) E36Q i I41V; (2) T51M, (3) Q62H i Q64H, (4) D72E, (5) S78Y i S80A, (6) V100M, (7) I109T i T119R i (8) G135S.
Slika 23. Dijagram koji predstavlja PVR vezan za TIGIT. Struktura ljudskog TIGIT-a je predstavljena u obliku sfere, a struktura PVR-a je predstavljena u obliku trake. Aminokiseline koje sadrže bar deo epitopa 313M32 predstavljene su u obliku crne sfere. Aminokiselina koja sadrži bar deo epitopa 313M34 predstavljena je u obliku sive sfere.
Slika 24A i 24B. Studije kompetitivnog vezivanja između anti-TIGIT antitela. (A) Studija konkurencije sa 313R19 i 313M26. (B) Studija konkurencije sa 313M34 i 313R19 ili 313M34 i 313M32.
Slika 25. Poništavanje PVR-posredovane inhibicije sekrecije citokina anti-TIGIT antitelima.
Slika 26. Test ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela.
Slika 27. Inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelima 313R19 i 313M32 u modelu humanizovanog miša. Humanizovanim miševima su potkožno ubrizgane ćelije tumora melanoma dobijenih od pacijenata (OMP-M9, 75.000 ćelija/miš). Tumori su ostavljeni da rastu 19 dana dok nisu dostigli prosečnu zapreminu od približno 50 mm3. Miševi koji imaju tumor su nasumično podeljeni u grupe (n = 8 miševa po grupi). Miševi koji imaju tumor su tretirani ili kontrolnim antitelom, anti-TIGIT antitelom 313R19 ili anti-TIGIT antitelom 313M32. Miševima je davana doza od 1 ili 5 mg/kg svakih 5 dana. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom u naznačenim vremenskim tačkama.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0047] Ovaj pronalazak obezbeđuje nove agense, uključujući, ali bez ograničenja na, polipeptide, antitela i heterodimerne molekule koji moduliraju imuni odgovor. Agensi uključuju polipeptide, antitela i heterodimerne molekule koji specifično vezuju TIGIT i agense koji moduliraju TIGIT aktivaciju i/ili signalizaciju. Agensi uključuju polipeptide, antitela i heterodimerne molekule koji inhibiraju TIGIT aktivaciju i/ili signalizaciju, čime se pojačava imuni odgovor. Takođe su dati srodni polipeptidi i polinukleotidi, kompozicije koje sadrže agense i metode za pravljenje agenasa. Date su metode skrininga za agense koji moduliraju imuni odgovor. Date su metode za korišćenje novih agenasa, kao što su metode inhibicije rasta tumora i/ili metode lečenja raka. Date su i metode lečenja virusnih infekcija. Metode korišćenja novih agenasa, kao što su metode aktivacije imunog odgovora, metode stimulacije imunog odgovora, metode promovisanja imunog odgovora, metode povećanja imunog odgovora, metode aktivacije prirodnih ćelija ubica (NK) i/ili T ćelija , metode povećanja aktivnosti NK ćelija i/ili T-ćelija, metode promocije aktivnosti NK ćelija i/ili T-ćelija, metode smanjenja i/ili inhibicije supresorskih T-ćelija, i/ili metode smanjenja i /ili inhibirajuće supresorske ćelije izvedene iz mijeloida. Pored toga, ovde opisani novi agensi mogu da se koriste u postupcima inhibicije imunog odgovora, postupcima supresije imunog odgovora, postupcima za smanjenje aktivnosti T-ćelija i/ili metodama lečenja autoimunih bolesti.
I. Definicije
[0048] Da bi se olakšalo razumevanje ovog pronalaska, niz termina i fraza su definisani u nastavku.
[0049] Termini "agonist" i "agonistički" kako se ovde koriste odnose se ili opisuju agens koji je sposoban da, direktno ili indirektno, suštinski indukuje, aktivira, promoviše, poveća ili pojača biološku aktivnost targeta i/ili puta. Termin "agonist" se ovde koristi da obuhvati bilo koji agens koji delimično ili potpuno indukuje, aktivira, promoviše, povećava ili pojačava aktivnost proteina.
[0050] Termini "antagonist" i "antagonistički" kako se ovde koriste odnose se ili opisuju agens koji je sposoban da, direktno ili indirektno, delimično ili potpuno blokira, inhibira, redukuje ili neutrališe biološku aktivnost targeta i/ili puta.
Termin "antagonist" se ovde koristi da uključi bilo koji agens koji delimično ili potpuno blokira, inhibira, smanjuje ili neutrališe aktivnost proteina.
[0051] Termini "modulacija" i "modulirati" kako se ovde koriste odnose se na promenu ili izmenu biološke aktivnosti. Modulacija uključuje, ali nije ograničena na, stimulisanje aktivnosti ili inhibiranje aktivnosti. Modulacija može biti povećanje ili smanjenje aktivnosti, promena karakteristika vezivanja ili bilo koja druga promena bioloških, funkcionalnih ili imunoloških svojstava povezanih sa aktivnošću proteina, puta, sistema ili drugih bioloških ciljeva od interesa .
[0052] Termin "antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na molekul imunoglobulina koji prepoznaje i specifično vezuje target preko najmanje jednog mesta za vezivanje antigena. Target može biti protein, polipeptid, peptid, ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid ili kombinacija bilo čega od prethodnog. Kako se ovde koristi, termin obuhvata intaktna poliklonska antitela, intaktna monoklonalna antitela, fragmente antitela (kao što su Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmenti), jednolančana Fv (scFv) antitela, multispecifična antitela, bispecifična antitela, monospecifična antitela, monovalentna antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, ljudska antitela, fuzioni proteini koji sadrže mesto vezivanja antigena antitela i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji sadrži mesto vezivanja antigena sve dok antitela pokazuju željenu biološku aktivnost. Antitelo može biti bilo koja od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, ili njihove podklase (izotipovi) (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), na osnovu identiteta njihovih konstantnih domena teškog lanca koji se nazivaju alfa, delta, epsilon, gama i mu, redom. Različite klase imunoglobulina imaju različite i dobro poznate strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije. Antitela mogu biti čista ili konjugovana sa drugim molekulima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, toksine i radioizotope.
[0053] Termin "fragment antitela" se odnosi na deo intaktnog antitela i generalno se odnosi na varijabilne regione koji određuju antigene intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab’, F(ab’)2 i Fv fragmente, linearna antitela, jednolančana antitela i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. "Fragment antitela" kako se ovde koristi obuhvata mesto za vezivanje antigena ili mesto za vezivanje epitopa.
[0054] Termin "varijabilni region" antitela odnosi se na varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, bilo sam ili u kombinaciji. Generalno, varijabilni region teškog ili lakog lanca sastoji se od četiri regiona okvira povezana sa tri regiona koja određuju komplementarnost (CDR), takođe poznata kao "hipervarijabilni regioni". CDR-ovi u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini regiona okvira i, sa CDR-ovima iz drugog lanca, doprinose formiranju mesta za vezivanje antigena antitela. Postoje najmanje dve tehnike za određivanje CDR-a: (1) pristup zasnovan na varijabilnosti sekvenci među vrstama (tj. Kabat i drugi., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda MD. ), i (2) pristup zasnovan na kristalografskim studijama kompleksa antigen-antitelo (Al Lazikani i drugi., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). Pored toga, kombinacije ova dva pristupa se ponekad koriste u tehnici za određivanje CDR-a.
[0055] Termin "monoklonsko antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na homogenu populaciju antitela koja je uključena u visoko specifično prepoznavanje i vezivanje jedne antigene determinante ili epitopa. Ovo je u suprotnosti sa poliklonskim antitelima koja obično uključuju mešavinu različitih antitela koja prepoznaju različite antigene determinante. Termin "monoklonsko antitelo" obuhvata i intaktna i monoklonska antitela pune dužine, kao i fragmente antitela (npr. Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jednolančana (scFv) antitela, fuzione proteine koji sadrže fragment antitela, i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji sadrži mesto za vezivanje antigena. Dalje, "monoklonsko antitelo" se odnosi na takva antitela napravljena bilo kojom tehnikom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, proizvodnju hibridoma, selekciju faga, rekombinantnu ekspresiju i transgene životinje.
[0056] Termin "humanizovano antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitela koja su specifični lanci imunoglobulina, himerni imunoglobulini ili njihovi fragmenti koji sadrže minimalne sekvence koje nisu humane. Tipično, humanizovana antitela su humani imunoglobulini u kojima su aminokiselinski ostaci CDR-ova zamenjeni ostacima aminokiselina iz CDR-ova ne-ljudske vrste (npr. miš, pacov, zec ili hrčak) koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i/ili sposobnost vezivanja. U nekim slučajevima, aminokiselinski ostaci okvirnog varijabilnog regiona humanog imunoglobulina mogu biti zamenjeni odgovarajućim aminokiselinskim ostacima u antitelu ne-ljudske vrste. Humanizovano antitelo se može dalje modifikovati supstitucijom dodatnih aminokiselinskih ostataka bilo u okviru varijabilnog regiona i/ili unutar zamenjenih ostataka ne-ljudskih aminokiselina da bi se dalje precizirala i optimizovala specifičnost antitela, afinitet i/ili sposobnost vezivanja. Humanizovano antitelo može da sadrži varijabilne domene koji sadrže sve ili suštinski sve CDR-ove koji odgovaraju ne-ljudskom imunoglobulinu, dok su svi ili suštinski svi varijabilni regioni okvira one sekvence humanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, varijabilni domeni obuhvataju regione okvira sekvence humanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, varijabilni domeni obuhvataju regione okvira konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo takođe može da sadrži bar deo konstantnog regiona ili domena imunoglobulina (Fc), tipično onog humanog imunoglobulina.
[0057] Termin "humano antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo proizvedeno od strane čoveka ili na antitelo koje ima sekvencu aminokiselina koja odgovara antitelu proizvedenom od strane čoveka, napravljenom korišćenjem bilo koje od tehnike poznate u struci.
[0058] Termin "himerno antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo gde je aminokiselinska sekvenca molekula imunoglobulina izvedena iz dve ili više vrsta. Tipično, varijabilni regioni lakih i teških lanaca odgovaraju varijabilnim regionima antitela dobijenog od jedne vrste sisara (npr. miš, pacov, zec, itd.) sa željenom specifičnošću, afinitetom i/ili sposobnošću vezivanja, dok su konstantni regioni homologni sekvenci u antitelu izvedenom iz druge vrste. Konstantni regioni su obično ljudski da bi se izbeglo izazivanje imunološkog odgovora u antitelu.
[0059] Termini "epitop" i "antigenska determinanta" se ovde koriste naizmenično i odnose se na onaj deo antigena ili targeta koji može da bude prepoznat i specifično vezan za određeno antitelo. Kada je antigen ili target polipeptid, epitopi se mogu formirati i od susednih aminokiselina i od nesusednih aminokiselina koje se tercijarnim savijanjem proteina
1
postavljaju jedna naspram druge. Epitopi formirani od susednih aminokiselina (koji se takođe nazivaju linearnim epitopima) se tipično zadržavaju nakon denaturacije proteina, dok se epitopi formirani tercijarnim savijanjem (koji se takođe nazivaju konformacioni epitopi) obično gube denaturacijom proteina. Epitop tipično uključuje najmanje 3, a češće, najmanje 5, 6, 7 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
[0060] Termini "selektivno vezuje" ili "specifično vezuje" znače da agens reaguje češće, brže, sa dužim trajanjem, sa većim afinitetom, ili sa nekom kombinacijom gore navedenom na epitop, protein ili ciljni molekul od sa alternativnim supstancama, uključujući srodne i nesrodne proteine. U određenim izvođenjima "specifično se vezuje" znači, na primer, da agens vezuje protein ili target sa KDod oko 0,1 mM ili manje, ali češće manje od oko 1 µM. U određenim izvođenjima, "specifično se vezuje" znači da agens vezuje target sa KDod najmanje oko 0,1 µ M ili manje, najmanje oko 0,01 µ M ili manje, ili najmanje oko InM ili manje. Zbog identičnosti sekvenci između homolognih proteina u različitim vrstama, specifično vezivanje može uključiti agens koji prepoznaje protein ili target u više vrsta (npr. TIGIT miša i TIGIT čoveka). Slično, zbog homologije unutar određenih regiona polipeptidnih sekvenci različitih proteina, specifično vezivanje može uključivati agens koji prepoznaje više od jednog proteina ili targeta. Podrazumeva se da, u određenim izvođenjima, agens koji specifično vezuje prvi target može ili ne mora specifično da veže drugi target. Kao takvo, "specifično vezivanje" ne zahteva nužno (iako može uključivati) ekskluzivno vezivanje, tj. vezivanje za jedan target. Prema tome, agens može, u određenim izvođenjima, specifično da veže više od jednog targeta. U određenim izvođenjima, višestruke mete mogu biti vezane za isto mesto vezivanja antigena na agensu. Na primer, antitelo može, u određenim slučajevima, da sadrži dva identična mesta za vezivanje antigena, od kojih svako specifično vezuje isti epitop na dva ili više proteina. U određenim alternativnim izvođenjima, antitelo može biti bispecifično i sadržati najmanje dva mesta za vezivanje antigena sa različitim specifičnostima. Uopšteno, ali ne nužno, referenca na vezivanje znači specifično vezivanje.
[0061] Termini "polipeptid" i "peptid" i "protein" se ovde koriste naizmenično i odnose se na polimere aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili razgranat, može da sadrži modifikovane aminokiseline i može biti prekinut neaminokiselinama. Termini takođe obuhvataju polimer aminokiseline koji je modifikovan prirodnim putem ili intervencijom; na primer, formiranje disulfidne veze, glikozilacija, lipidacija, acetilacija, fosforilacija, ili bilo koja druga manipulacija ili modifikacija, kao što je konjugacija sa komponentom za obeležavanje. U definiciju su takođe uključeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiseline (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline), kao i druge modifikacije poznate u struci. Podrazumeva se da, pošto polipeptidi ovog pronalaska mogu biti zasnovani na antitelima ili drugim članovima superfamilije imunoglobulina, u određenim izvođenjima, "polipeptid" se može pojaviti kao jedan lanac ili kao dva ili više povezanih lanaca.
[0062] Termini "polinukleotid" i "nukleinska kiselina" i "molekul nukleinske kiseline" se ovde koriste naizmenično i odnose se na polimere nukleotida bilo koje dužine i uključuju DNK i RNK. Nukleotidi mogu biti dezoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze, i/ili njihovi analozi, ili bilo koji supstrat koji se može inkorporirati u polimer pomoću DNK ili RNK polimeraze.
[0063] Termini "identičan" ili procenat "identičnosti" u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptida, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju određeni procenat nukleotida ili aminokiselinskih ostataka koji su isti, kada se uporede i poravnaju (uključujući praznine, ako je potrebno) za maksimalnu korespondenciju, ne uzimajući u obzir bilo kakve konzervativne aminokiselinske supstitucije kao deo identiteta sekvence. Procenat identiteta se može meriti korišćenjem softvera za poređenje sekvenci ili algoritama ili vizuelnim pregledom. Različiti algoritmi i softver koji se mogu koristiti za dobijanje poravnanja aminokiselinskih ili nukleotidnih sekvenci su dobro poznati u struci. Ovo uključuje, ali nije ograničeno na, BLAST, ALIGN, Megalign, BestFit, GCG Visconsin paket i njihove varijante. U nekim izvođenjima, dve nukleinske kiseline ili polipeptida pronalaska su suštinski identične, što znači da imaju najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, a u nekim izvođenjima najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti nukleotida ili aminokiselinskog ostatka, kada se uporedi i poravna za maksimalnu korespondenciju, mereno pomoću algoritma za poređenje sekvenci ili vizuelnim pregledom. U nekim izvođenjima, identičnost postoji u regionu sekvenci koji je najmanje oko 10, najmanje oko 20, najmanje oko 40-60 nukleotida ili aminokiselinskih ostataka, najmanje oko 60-80 nukleotida ili aminokiselinskih ostataka u dužini ili bilo koja integralna vrednost između. U nekim izvođenjima, identičnost postoji u dužem regionu od 60-80 nukleotida ili aminokiselinskih ostataka, kao što je najmanje oko 80-100 nukleotida ili aminokiselinskih ostataka, a u nekim izvođenjima sekvence su suštinski identične po celoj dužini sekvenci koje se porede, na primer, kodirajući region nukleotidne sekvence.
[0064] "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je jedan aminokiselinski ostatak zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su generalno definisane u struci, uključujući osnovne bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarni bočni lanci (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), betarazgranati bočni lanci (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatični bočni lanci (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Na primer, supstitucija fenilalanina sa tirozinom se smatra konzervativnom supstitucijom. Generalno, konzervativne supstitucije u sekvencama polipeptida i/ili antitela prema pronalasku ne eliminišu vezivanje polipeptida ili antitela koje sadrži sekvencu aminokiseline, za ciljno mesto vezivanja. Metode identifikacije konzervativnih supstitucija nukleotida i aminokiselina koje ne eliminišu vezivanje su dobro poznate u struci.
[0065] Termin "vektor" kako se ovde koristi označava konstrukt, koji je sposoban da isporuči, i obično ekspresuje, jedan ili više gena ili sekvenci od interesa u ćeliji domaćinu. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore, vektore ekspresije čiste DNK ili RNK, vektore plazmida, kosmida ili faga, vektore ekspresije DNK ili RNK povezane sa katjonskim kondenzujućim agensima i vektore ekspresije DNK ili RNK inkapsulirane u lipozomima.
[0066] Polipeptid, rastvorljivi protein, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili kompozicija koja je "izolovana" je polipeptid, rastvorljivi protein, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili kompozicija koja je u obliku koji se ne nalazi u prirodi. Izolovani polipeptidi, rastvorljivi proteini, antitela, polinukleotidi, vektori, ćelije ili kompozicije obuhvataju one koji su prečišćeni do stepena da više nisu u obliku u kome se nalaze u prirodi. U nekim izvođenjima, polipeptid, rastvorljivi protein, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili kompozicija koja je izolovana je suštinski čista.
[0067] Termin "suštinski čist" kako se ovde koristi odnosi se na materijal koji je najmanje 50% čist (tj. bez kontaminanata), najmanje 90% čist, najmanje 95% čist, najmanje 98% čist ili na najmanje 99% čist.
[0068] Termin "imuni odgovor" kako se ovde koristi uključuje odgovore i urođenog imunog sistema i adaptivnog imunog sistema. Uključuje i ćelijski posredovane i/ili humoralne imune odgovore. Uključuje, ali nije ograničeno na, i T-ćelijske i B-ćelijske odgovore, kao i odgovore drugih ćelija imunog sistema kao što su prirodne ćelije ubice (NK), monociti, makrofagi itd.
[0069] Termini "rak" i "kancerogen" kako se ovde koriste odnose se ili opisuju fiziološko stanje kod sisara u kojima je populacija ćelija karakterisana neregulisanim rastom ćelija. Primeri raka uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, blastom, sarkom i hematološke karcinome kao što su limfom i leukemija.
[0070] Termini "tumor" i "neoplazma" kako se ovde koriste odnose se na bilo koju masu tkiva koja je rezultat prekomernog rasta ili proliferacije ćelija, bilo benignih (nekancerogenih) ili malignih (kancerogenih) uključujući prekancerogene lezije.
[0071] Termin "metastaza" kako se ovde koristi odnosi se na proces kojim se rak širi ili prenosi sa mesta nastanka u druge regione tela sa razvojem slične kancerogene lezije na novoj lokaciji. Generalno, "metastatička" ili "metastazirajuća" ćelija je ona koja gubi adhezivne kontakte sa susednim ćelijama i migrira krvotokom ili limfom od primarnog mesta bolesti do sekundarnih mesta u celom telu.
[0072] Izrazi "matična ćelija raka" i "CSC" i "tumorska matična ćelija" i "ćelija koja pokreće tumor" se ovde koriste naizmenično i odnose se na ćelije raka ili tumora koje: (1) imaju ekstenzivni proliferativni kapacitet; 2) sposobni su za asimetričnu ćelijsku deobu da generišu jedan ili više tipova diferenciranih ćelijskih potomaka pri čemu diferencirane ćelije imaju smanjen proliferativni ili razvojni potencijal; i (3) sposobni su za simetrične deobe ćelija radi samoobnavljanja ili samoodržavanja. Ova svojstva daju matičnim ćelijama raka sposobnost da formiraju ili uspostave tumor ili rak nakon serijske transplantacije u odgovarajućeg domaćina (na primer, miša) u poređenju sa većinom tumorskih ćelija koje ne uspevaju da formiraju tumore. Matične ćelije raka podležu samoobnavljanju u odnosu na diferencijaciju na haotičan način da bi se formirali tumori sa abnormalnim tipovima ćelija koji se mogu menjati tokom vremena kako se pojave mutacije.
[0073] Termini "ćelija raka" i "tumorska ćelija" odnose se na ukupnu populaciju ćelija izvedenih iz raka ili tumora ili prekancerogene lezije, uključujući obe ne-tumorogene ćelije, koje čine najveći deo populacije ćelija raka, i tumorogene matične ćelije (matične ćelije raka). Kako se ovde koristi, termini "ćelija raka" ili "tumorska ćelija" biće modifikovani terminom "ne-tumorogena" kada se odnose samo na one ćelije kojima nedostaje kapacitet da se obnove i diferenciraju da bi razlikovale te tumorske ćelije od matičnih.
[0074] Termin "tumorogen" kako se ovde koristi odnosi se na funkcionalne karakteristike matične ćelije raka uključujući svojstva samoobnavljanja (što dovodi do dodatnih tumorogenih matičnih ćelija raka) i proliferacije za stvaranje svih drugih tumorskih ćelija (što dovodi do diferencirane i samim tim ne-tumorogene tumorske ćelije).
[0075] Termin "tumorigenost" kako se ovde koristi odnosi se na sposobnost nasumičnog uzorka ćelija iz tumora da formira opipljive tumore nakon serijske transplantacije u odgovarajuće domaćine (npr., miševe).
[0076] Termin "subjekat" se odnosi na bilo koju životinju (npr. sisara), uključujući, ali ne ograničavajući se na, ljude, neljudske primate, pse, mačke, zečeve, glodare i slično, koji treba da budu primalac određenog tretmana. Tipično, termini "subjekat" i "pacijent" se ovde koriste naizmenično u odnosu na čoveka.
[0077] Termin "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na supstancu koju je odobrila regulatorna agencija savezne vlade ili državne vlade ili je navedena u Farmakopeji SAD ili drugoj opšte priznatoj farmakopeji za upotrebu kod životinja, uključujući ljude.
[0078] Izrazi "farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili pomoćno sredstvo" ili "prihvatljivi farmaceutski nosač" odnose se na ekscipijens, nosač ili pomoćno sredstvo koje se može primeniti subjektu, zajedno sa najmanje jednim agensom ovog pronalaska, i koji ne uništava njegovu farmakološku aktivnost i nije toksičan kada se primenjuje u dozama dovoljnim da isporuče terapeutski efekat. Generalno, stručnjaci u ovoj oblasti i FDA SAD smatraju da je farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, nosač ili pomoćno sredstvo neaktivan sastojak bilo koje formulacije.
[0079] Termini "efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" ili "terapeutski efekat" odnose se na količinu agensa opisanog ovde, antitela, polipeptida, polinukleotida, malog organskog molekula ili drugog leka koji je efikasan za "lečenje" bolesti ili poremećaja kod subjekta kao što je sisar. U slučaju raka ili tumora, terapeutski efikasna količina agensa (npr. polipeptida ili antitela) ima terapeutski efekat i kao takva može da poveća ili pojača imuni odgovor, poveća ili pojača antitumorski odgovor, poveća citolitičku aktivnost imunih ćelija, poveća ubijanje tumorskih ćelija, poveća ubijanje tumorskih ćelija od strane imunoloških ćelija, smanji broj tumorskih ćelija; smanji tumorigenost, tumorigene učestalosti ili tumorogen kapacitet, smanji broj ili učestalost matičnih ćelija raka; smanji veličinu tumora; smanji populaciju ćelija raka; inhibira ili zaustavlja infiltraciju ćelija raka u periferne organe uključujući, na primer, širenje raka u meko tkivo i kost; inhibira i zaustavlja metastaze tumora ili ćelija raka; inhibira i zaustavljaju rast tumora ili ćelija raka; donekle ublaži jedan ili više simptoma povezanih sa rakom; smanji morbiditet i mortalitet; poboljša kvalitet života; ili kombinacija takvih efekata.
[0080] Termini "lečenje" ili "tretman" ili "ublažavanje" odnose se na obe (1) terapeutske mere koje leče, usporavaju, smanjuju simptome i/ili zaustavljaju napredovanje dijagnostikovano patološko stanje ili poremećaj i (2) profilaktičke ili preventivne mere koje sprečavaju ili usporavaju razvoj ciljanog patološkog stanja ili poremećaja. Stoga oni kojima je potreban tretman uključuju one koji već imaju ovaj poremećaj; one koji su skloni da imaju poremećaj; i one kod kojih se poremećaj treba sprečiti. U slučaju raka ili tumora, subjekt se uspešno „leči“ prema metodama ovog pronalaska ako pacijent pokaže jedno ili više od sledećeg: povećan imuni odgovor, povećan antitumorski odgovor, povećanu citolitičku aktivnost imunih ćelija, povećano ubijanje tumorskih ćelija, povećano ubijanje tumorskih ćelija od strane imunih ćelija, smanjenje broja ili potpuno odsustvo ćelija raka; smanjenje veličine tumora; inhibiciju ili odsustvo infiltracije ćelija raka u periferne organe uključujući širenje ćelija raka u meko tkivo i kost; inhibiciju ili odsustvo metastaza tumora ili ćelija raka; inhibiciju ili odsustvo rasta raka; olakšanje jednog ili više simptoma povezanih sa specifičnim rakom; smanjen morbiditet i mortalitet; poboljšanje kvaliteta života; smanjenje tumorigenosti; smanjenje broja ili učestalosti matičnih ćelija raka; ili neka kombinacija efekata.
[0081] Kako se koristi u ovom pronalasku i zahtevima, oblici jednine "jedan", "ovaj" i "taj" uključuju oblike množine osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0082] Podrazumeva se da gde god su ovde opisana izvođenja govorom koji "sadrži" inače analogna ostvarenja opisana u terminima "sastoje se od" i/ili "sastoje se u suštini od". Takođe se podrazumeva da svuda gde su ovde opisana izvođenja jezikom koji se „u suštini sastoji od“ takođe su obezbeđena analogna ostvarenja opisana u terminima „sastoje se od“.
[0083] Kako se ovde koristi, opis "oko" ili "približno" neke vrednosti ili parametra uključuje (i opisuje) izvođenja koja su usmerena na tu vrednost ili parametar. Na primer, opis koji se odnosi na „oko X“ uključuje opis „X“.
[0084] Termin "i/ili" kako se koristi u frazi kao što je "A i/ili B" ovde je namenjen da obuhvata i A i B; A ili B; A (sam); i B (sam). Slično, termin "i/ili" kako se koristi u frazi kao što je "A, B, i/ili C" ima za cilj da obuhvati svaku od sledećih izvođenja: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (sam); B (sam); i C (sam).
II. TIGIT vezivni agensi
[0085] T-ćelijski imunoreceptor sa Ig i ITIM domenima (TIGIT) je transmembranski glikoprotein tipa I koji sadrži promenljivi domen imunoglobulina (IgV). TIGIT pripada porodici receptora poliovirusa (PVR) i vezuje se za receptor poliovirusa (PVR; CD155) sa visokim afinitetom i za PVRL-2 (CD112) i PVRL-3 (CD113) sa nižim afinitetom. TIGIT se eksprimira na T-ćelijama, uključujući regulatorne T-ćelije i memorijske T-ćelije, kao i na NK ćelijama i pojačava se nakon aktivacije naivnih CD4+ T-ćelija. Aminokiselinske sekvence (aa) pune dužine za mišji TIGIT (UniProtKB br. P86176) i humani TIGIT (UniProtKB br. K495A1) su poznate u tehnici i date su ovde kao SEK ID BR:1 i SEK ID BR:4, redom. Kako se ovde koristi, referenca na položaje aminokiselina odnosi se na numerisanje sekvenci aminokiselina pune dužine uključujući signalnu sekvencu.
[0086] Ovaj pronalazak obezbeđuje agense koji specifično vezuju TIGIT. Ovi agensi se ovde nazivaju "agensi za vezivanje TIGIT". U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je polipeptid. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje TIGIT miša. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje humani TIGIT. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje TIGIT miša i TIGIT čoveka. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT miša.
[0087] U nekim slučajevima, agens vezuje TIGIT i ometa interakciju TIGIT-a sa drugim proteinom. U nekim slučajevima, agens vezuje TIGIT i ometa interakciju TIGIT-a sa PVR-om. U nekim slučajevima, agens vezuje TIGIT i ometa interakciju TIGIT-a sa PVRL-2. U nekim slučajevima, agens vezuje TIGIT i ometa interakciju TIGIT-a sa PVRL-3. U nekim slučajevima, agent specifično vezuje TIGIT i agent ometa vezivanje TIGIT-a za PVR, i/ili ometa PVR aktivaciju TIGIT signalizacije.
[0088] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje specifično vezuje ekstracelularni domen TIGIT-a, ili njegov fragment. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje specifično vezuje ekstracelularni domen mišjeg TIGIT-a ili njegov fragment. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje specifično vezuje ekstracelularni domen ljudskog TIGIT-a, ili njegov fragment. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje specifično vezuje ekstracelularni domen TIGIT miša i TIGIT čoveka, ili njihov fragment. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje specifično vezuje Ig-like domen TIGIT-a. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje specifično vezuje IgV domen TIGIT-a. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje se vezuje za aminokiseline 22-141 ljudskog TIGIT-a i/ili aminokiseline 29-148 TIGIT-a miša. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje se vezuje za aminokiseline 22-141 SEK ID BR:4 i/ili aminokiseline 29148 SEK ID BR:1. U nekim slučajevima, agens se vezuje za aminokiseline 22-124 ljudskog TIGIT-a i/ili aminokiseline 29-127 TIGIT-a miša. U nekim slučajevima, agens se vezuje za aminokiseline 22-124 SEK ID BR:4 i/ili aminokiseline 29-127 SEK ID BR:1. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens se vezuje za SEK ID BR:3, ili njegov fragment. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens se vezuje za SEK ID BR:6, ili njegov fragment. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje se vezuje za aminokiseline 22-141 humanog TIGIT-a. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje se vezuje za aminokiseline 22-141 SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje se vezuje za aminokiseline 50-124 humanog TIGIT-a. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje se vezuje za aminokiseline 50-124 SEK ID BR:4. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens se vezuje za SEK ID BR:6, ili njegov fragment.
[0089] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži aminokiseline u SEK ID BR:79. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži aminokiseline unutar SEK ID BR:80. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži aminokiseline unutar SEK ID BR:79 i SEK ID BR:80. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q62 i 1109 SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži
1
aminokiseline Q62 i T119 SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q64 i 1109 SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q64 i T119 SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q62, Q64 i 1109 SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q62, Q64 i T119 SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q62, 1109 i T119 SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q64, 1109 i T119 SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži aminokiseline Q62, Q64, 1109 i T119 SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji sadrži najmanje jednu aminokiselinu izabranu iz grupe koju čine: N58, E60, Q62, Q64, L65, F107, 1109, H111, T117, T119, G120 i R121 SEK ID BR:4. U nekim slučajevima, epitop je konformacioni epitop. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje vezuje epitop koji ne sadrži aminokiselinu V100 SEK ID BR:4.
[0090] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens (npr. antitelo) vezuje TIGIT sa konstantom disocijacije (KD) od oko 1µM ili manje, oko 100nM ili manje, oko 40nM ili manje, oko 20nM ili manje, oko 10nM ili manje, oko 1 nM ili manje, oko 0,1 nM ili manje, 50 pM ili manje, 10 pM ili manje, ili 1 pM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje TIGIT sa KDod oko 20 nM ili manje. U nekim izvođenjima, TIGIT-vezujući agens vezuje TIGIT sa KDod oko 10 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje TIGIT sa KDod oko 1 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje TIGIT sa KDod oko 0,5 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje TIGIT sa KDod oko 0,1 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje TIGIT sa KDod oko 50 pM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje TIGIT sa KDod oko 25 pM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje TIGIT sa KDod oko 10 pM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje TIGIT sa KDod oko 1 pM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje i humani TIGIT i mišji TIGIT sa KDod oko 10 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje i humani TIGIT i mišji TIGIT sa KDod oko 1 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje i humani TIGIT i mišji TIGIT sa KDod oko 0,1 nM ili manje. U nekim slučajevima, konstanta disocijacije TIGIT-vezujućeg agensa (npr. antitela) je određena korišćenjem TIGIT fuzionog proteina koji sadrži najmanje deo ekstracelularnog domena TIGIT proteina imobilizovanog na Biacore čipu. U nekim slučajevima, konstanta disocijacije TIGIT-vezujućeg agensa (npr. antitela) je određena korišćenjem vezujućeg agensa zarobljenog anti-humanim IgG antitelom na Biacore čipu i rastvorljivog TIGIT proteina.
[0091] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za TIGIT i drugo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje drugi target. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan agens koji sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za TIGIT i drugo mesto za vezivanje antigena koje specifično vezuje drugi target. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje i TIGIT i drugi target sa KDod oko 100 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje i TIGIT i drugi target sa KDod oko 50 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje i TIGIT i drugi target sa KDod oko 20 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje i TIGIT i drugi target sa KDod oko 10 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens vezuje i TIGIT i drugi target sa KDod oko 1nM ili manje. U nekim slučajevima, afinitet jednog od mesta vezivanja antigena može biti slabiji od afiniteta drugog mesta za vezivanje antigena. Na primer, KDjednog mesta vezivanja antigena može biti oko 1 nM, a KDdrugog mesta za vezivanje antigena može biti oko 10 nM. U nekim izvođenjima, razlika u afinitetu između dva mesta vezivanja antigena može biti oko 2 puta ili više, oko 3 puta ili više, oko 5 puta ili više, oko 8 puta ili više, oko 10 puta ili više, oko 15 puta ili više, oko 20 puta ili više, oko 30 puta ili više, oko 50 puta ili više, ili oko 100 puta ili više. Modulacija afiniteta dva mesta vezivanja antigena može uticati na biološku aktivnost bispecifičnog antitela. Na primer, smanjenje afiniteta mesta vezivanja antigena za TIGIT ili drugi target, može imati poželjan efekat, na primer smanjenu toksičnost vezivnog agensa i/ili povećan terapeutski indeks.
[0092] U određenim izvođenjima pronalaska, antitelo kao što je ovde opisano vezuje humani TIGIT sa polovinom maksimalne efektivne koncentracije (EC50) od oko 1mM ili manje, oko 100nM ili manje, oko 40nM ili manje, oko 20nM ili manje, oko 10nM ili manje, oko 1 nM ili manje, ili oko 0,1 nM ili manje. U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo se vezuje za humani TIGIT sa polovinom maksimalne efektivne koncentracije (EC50) od oko 1mM ili manje, oko 100nM ili manje, oko 40nM ili manje, oko 20nM ili manje, oko 10nM ili manje, oko 1nM ili manje, ili oko 0,1 nM ili manje.
[0093] U nekim izvođenjima, antitelo je rekombinantno antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je himerno antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je humanizovano antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je ljudsko antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM antitelo. U određenim izvođenjima, antitelo je IgG1 antitelo. U određenim izvođenjima, antitelo je IgG2 antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je IgG4 antitelo. U određenim izvođenjima, antitelo je fragment antitela koji sadrži mesto za vezivanje antigena. U nekim izvođenjima, antitelo je bispecifično antitelo ili multispecifično antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je monovalentno antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je monospecifično antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je dvovalentno antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je konjugovano sa citotoksičnim delom. U nekim izvođenjima, antitelo je izolovano. U nekim izvođenjima, antitelo je suštinski čisto.
[0094] U nekim izvođenjima, antitela su poliklonska antitela. Poliklonska antitela se mogu pripremiti bilo kojim poznatom metodom. U nekim izvođenjima, poliklonalna antitela se proizvode imunizacijom životinje (npr., zeca, pacova, miša, koze, magarca) antigenom od interesa (npr. prečišćenim peptidnim fragmentom, rekombinantnim proteinom pune dužine ili fuzionim proteinom) korišćenjem višestruke potkožne ili intraperitonealne injekcije. Antigen može opciono da se konjuguje sa nosačem kao što je hemocijanin (KLH) ili serumski albumin. Antigen (sa ili bez proteina nosača) se razblaži u sterilnom fiziološkom rastvoru i obično kombinuje sa pomoćnim sredstvom (npr. potpunim ili nepotpunim Freundovim adjuvansom) da bi se formirala stabilna emulzija. Posle dovoljnog vremenskog perioda, poliklonska antitela se dobijaju od imunizovane životinje, obično iz krvi ili ascitesa. Poliklonska antitela se mogu prečistiti iz seruma ili ascitesa prema standardnim metodama u tehnici uključujući, ali bez ograničenja na, afinitetnu hromatografiju, jonoizmenjivacku hromatografiju, gel elektroforezu i dijalizu.
[0095] U nekim izvođenjima, antitelo je monoklonsko antitelo. Monoklonska antitela se mogu pripremiti korišćenjem hibridomskih metoda poznatih stručnjacima. U nekim izvođenjima, korišćenjem metode hibridoma, miš, pacov, zec, hrčak ili druga odgovarajuća životinja domaćin se imunizuje kako je gore opisano da bi se izazvala proizvodnja antitela koja specifično vezuju imunizujući antigen. U nekim izvođenjima, limfociti mogu biti imunizovani in vitro. U nekim izvođenjima, imunizujući antigen može biti humani protein ili njegov fragment. U nekim izvođenjima, imunizujući antigen može biti mišji protein ili njegov fragment.
[0096] Posle imunizacije, limfociti se izoluju i spajaju sa odgovarajućom ćelijskom linijom mijeloma koristeći, na primer, polietilen glikol. Hibridomske ćelije se biraju korišćenjem specijalizovanih medija poznatih u tehnici gde nefuzionisani limfociti i ćelije mijeloma ne preživljavaju proces selekcije. Hibridomi koji proizvode monoklonalna antitela usmerena specifično protiv izabranog antigena mogu se identifikovati različitim metodama uključujući, ali ne ograničavajući se na, imunoprecipitaciju, imunoblotiranje i in vitro testove vezivanja (npr. protočna citometrija, FACS, ELISA i radioimunoesej). Hibridomi se mogu razmnožavati ili u in vitro kulturi korišćenjem standardnih metoda ili in vivo kao tumori ascitesa kod životinje. Monoklonska antitela se mogu prečistiti iz medijuma kulture ili ascitne tečnosti prema standardnim metodama u tehnici uključujući, ali ne ograničavajući se na, afinitetnu hromatografiju, jonoizmenjivacku hromatografiju, gel elektroforezu i dijalizu.
[0097] U određenim izvođenjima, monoklonska antitela se mogu napraviti korišćenjem tehnika rekombinantne DNK koje su poznate stručnjacima. Polinukleotidi koji kodiraju monoklonsko antitelo se izoluju iz zrelih B-ćelija ili ćelija hibridoma, kao što je RT-PCR korišćenjem oligonukleotidnih prajmera koji specifično amplificiraju gene koji kodiraju teške i lake lance antitela, a njihova sekvenca se određuje korišćenjem standardnih tehnika. Izolovani polinukleotidi koji kodiraju teške i lake lance se zatim kloniraju u pogodne vektore ekspresije koji proizvode monoklonska antitela kada se transfektuju u ćelije domaćina kao što su E. coli, ćelije majmuna COS, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode imunoglobulinske proteine.
[0098] U nekim drugim izvođenjima, rekombinantna monoklonska antitela, ili njihovi fragmenti, mogu da se izoluju iz biblioteka za prikaz faga koje eksprimiraju varijabilne domene ili CDR-ove željene vrste.
[0099] Polinukleotid koji kodira monoklonsko antitelo može se modifikovati, na primer, korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK za generisanje alternativnih antitela. U nekim izvođenjima, konstantni domeni lakog lanca i teškog lanca, na primer, mišjeg monoklonskog antitela mogu biti zamenjeni konstantnim regionima, na primer, humanog antitela da bi se generisalo himerno antitelo, ili mogu biti zamenjeni neimunoglobulinskim polipeptidom da bi se generisalo fuziono antitelo. U nekim izvođenjima, konstantni regioni su skraćeni ili uklonjeni da bi se dobio željeni fragment antitela monoklonskog antitela. Lokalno usmerena mutageneza ili mutageneza visoke gustine varijabilnog regiona se može koristiti za optimizaciju specifičnosti, afiniteta, itd. monoklonskog antitela.
[0100] U nekim izvođenjima, antitelo je humanizovano antitelo. Tipično, humanizovana antitela su humani imunoglobulini u kojima su aminokiselinski ostaci CDR-a zamenjeni ostacima aminokiselina iz CDR-ova ne-ljudske vrste (npr. miš, pacov, zec, hrčak, itd.) koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i/ili sposobnost vezivanja korišćenjem metoda poznatih stručnjaku. U nekim izvođenjima, neki od aminokiselinskih ostataka varijabilnog regiona okvira humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim aminokiselinskim ostacima u antitelu iz ne-ljudske vrste. U nekim izvođenjima, humanizovano antitelo može biti dalje modifikovano supstitucijom dodatnih ostataka bilo u varijabilnom regionu okvira i/ili unutar zamenjenih ostataka koji nisu humani da bi se dalje precizirala i optimizovala specifičnost, afinitet i/ili sposobnost antitela. Uopšteno govoreći, humanizovano antitelo će sadržati regione varijabilnog domena koji sadrže sve, ili suštinski sve, CDR-ove koji odgovaraju ne-humanom imunoglobulinu, dok su svi, ili suštinski svi, regioni okvira one sekvence humanog imunoglobulina. U nekim izvođenjima, okvirni regioni su one sekvence humanog konsenzusa imunoglobulina. U nekim izvođenjima, humanizovano antitelo takođe može da sadrži bar deo konstantnog regiona ili domena imunoglobulina (Fc), tipično humanog imunoglobulina. U određenim izvođenjima, takva humanizovana antitela se koriste u terapiji jer mogu da smanje antigenost i HAMA (humano anti-mišje antitelo) odgovore kada se daju ljudskom subjektu.
[0101] U određenim izvođenjima, antitelo je ljudsko antitelo. Ljudska antitela se mogu direktno pripremiti korišćenjem različitih tehnika poznatih u struci. U nekim izvođenjima, ljudska antitela mogu biti generisana iz besmrtnih humanih B limfocita imunizovanih in vitro ili iz limfocita izolovanih od imunizovane osobe. U oba slučaja, ćelije koje proizvode antitelo usmereno protiv ciljnog antigena mogu se generisati i izolovati. U nekim izvođenjima, humano antitelo se može izabrati iz biblioteke faga, gde ta biblioteka faga eksprimira ljudska antitela. Alternativno, tehnologija prikazivanja faga može da se koristi za proizvodnju humanih antitela i fragmenata antitela in vitro, iz repertoara gena varijabilnog domena imunoglobulina od neimunizovanih donora. Tehnike za stvaranje i upotrebu biblioteka faga antitela su dobro poznate u struci. Jednom kada se antitela identifikuju, strategije sazrevanja afiniteta poznate u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, mešanje lanca i mutagenezu usmerenu na mesto, mogu se primeniti za generisanje humanih antitela višeg afiniteta.
[0102] U nekim izvođenjima, ljudska antitela se mogu napraviti u transgenim miševima koji sadrže lokuse humanog imunoglobulina. Nakon imunizacije, ovi miševi su sposobni da proizvode pun repertoar ljudskih antitela u odsustvu proizvodnje endogenog imunoglobulina.
[0103] U nekim izvođenjima, antitelo je bispecifično antitelo. Dakle, ovaj pronalazak obuhvata bispecifična antitela koja specifično prepoznaju TIGIT i najmanje jednu dodatnu metu. Bispecifična antitela su sposobna da specifično prepoznaju
1
i vezuju najmanje dva različita antigena ili epitopa. Različiti epitopi mogu biti ili unutar istog molekula (npr. dva epitopa na TIGIT-u) ili na različitim molekulima (npr. jedan epitop na TIGIT-u i jedan epitop na drugom proteinu). U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima povećanu snagu u poređenju sa pojedinačnim antitelom ili kombinacijom više od jednog antitela. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima smanjenu toksičnost u poređenju sa pojedinačnim antitelom ili kombinacijom više od jednog antitela. Stručnjacima je poznato da bilo koji terapeutski agens može imati jedinstvenu farmakokinetiku (PK) (npr., cirkulacioni poluživot). U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima sposobnost da sinhronizuje PK dva aktivna vezujuća agensa pri čemu dva pojedinačna vezujuća agensa imaju različite PK profile. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima sposobnost da koncentriše dejstva dva agensa u zajedničkoj oblasti (npr. tumor i/ili tumorsko mikrookruženje). U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima sposobnost da koncentriše dejstva dva agensa na zajedničku metu (npr. tumor ili tumorsku ćeliju). U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima sposobnost da cilja dejstva dva agensa na više od jednog biološkog puta ili funkcije. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima sposobnost da cilja dve različite ćelije i da ih približi (npr., imunska ćelija i ćelija tumora).
[0104] U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo je humanizovano antitelo. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo je ljudsko antitelo. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo je IgG1 antitelo. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo je IgG2 antitelo. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo je IgG4 antitelo. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima smanjenu toksičnost i/ili neželjene efekte. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima smanjenu toksičnost i/ili neželjene efekte u poređenju sa mešavinom dva pojedinačna antitela ili u poređenju sa antitelom kao pojedinačnim agenasom. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima povećan terapeutski indeks. U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo ima povećan terapeutski indeks u poređenju sa mešavinom dva pojedinačna antitela ili u poređenju sa antitelom kao pojedinačnim agenasom.
[0105] U nekim izvođenjima, antitela mogu specifično prepoznati i vezati humani TIGIT kao i drugu metu antigena, kao što je efektorski molekul na imunskoj ćeliji (npr. CD2, CD3, CD28, CTLA4, PD-1, PD- L1, CD80 ili CD86) ili Fc receptor (npr. CD64, CD32 ili CD16) tako da fokusiraju ćelijske odbrambene mehanizme na ćeliju koja eksprimira i/ili proizvodi prvu metu antigena. U nekim izvođenjima, antitela se mogu koristiti za usmeravanje citotoksičnih agenasa na ćelije koje eksprimiraju određeni ciljni antigen. Ova antitela poseduju krak koji vezuje antigen i krak koji vezuje citotoksični agens ili radionuklidni helator, kao što su EOTUBE, DPTA, DOTA ili TETA.
[0106] Tehnike za pravljenje bispecifičnih antitela poznate su stručnjacima u ovoj oblasti. U nekim izvođenjima, bispecifična antitela sadrže konstantne regione teškog lanca sa modifikacijama aminokiselina koje su deo interfejsa između dva teška lanca. U nekim izvođenjima, bispecifična antitela mogu da se generišu korišćenjem strategije "knobsin-to-holes". U nekim slučajevima, terminologija „ knobs“ i „holes“ se zamenjuje terminima „ protuberances “ i „ cavities “. U nekim izvođenjima, bispecifična antitela mogu da sadrže varijante zglobnih regiona nesposobnih da formiraju disulfidne veze između teških lanaca. U nekim izvođenjima, modifikacije mogu da sadrže promene u aminokiselinama koje rezultiraju izmenjenim elektrostatičkim interakcijama. U nekim izvođenjima, modifikacije mogu da obuhvataju promene u aminokiselinama koje rezultiraju izmenjenim hidrofobnim/hidrofilnim interakcijama.
[0107] Bispecifična antitela mogu biti intaktna antitela ili fragmenti antitela koji sadrže mesta za vezivanje antigena. Takođe se razmatraju antitela sa više od dve valence. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Dakle, u određenim izvođenjima antitela na TIGIT su multispecifična.
[0108] U određenim izvođenjima, ovde opisana antitela (ili drugi polipeptidi) mogu biti monospecifična. U određenim izvođenjima, svako od jednog ili više antigen-vezujućih mesta koje antitelo sadrži je sposobno da veže (ili vezuje) homologni epitop na TIGIT-u.
[0109] U određenim izvođenjima, antitelo je fragment antitela. Fragmenti antitela mogu imati različite funkcije ili mogućnosti od intaktnih antitela; na primer, fragmenti antitela mogu imati povećanu penetraciju tumora. Poznate su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela uključujući, ali ne ograničavajući se na, proteolitičku digestiju intaktnih antitela. U nekim izvođenjima, fragmenti antitela uključuju F(ab’)2 fragment koji se proizvodi digestije molekula antitela pepsinom. U nekim izvođenjima, fragmenti antitela uključuju Fab fragment generisan redukcijom disulfidnih mostova F(ab’)2 fragmenta. U drugim izvođenjima, fragmenti antitela uključuju Fab fragment koji se generiše tretmanom molekula antitela papainom i redukcionim agensom. U određenim izvođenjima, fragmenti antitela se proizvode rekombinantnim metodama. U nekim izvođenjima, fragmenti antitela uključuju Fv ili jednolančane Fv (scFv) fragmente. Fragmenti antitela Fab, Fv i scFv mogu biti eksprimirani i izlučeni iz E. coli ili drugih ćelija domaćina, omogućavajući proizvodnju velikih količina ovih fragmenata. U nekim izvođenjima, fragmenti antitela su izolovani iz biblioteka faga antitela kako je ovde diskutovano. Na primer, metode se mogu koristiti za izgradnju Fab ekspresionih biblioteka da bi se omogućila brza i efikasna identifikacija monoklonalnih Fab fragmenata sa željenom specifičnošću za TIGIT ili njegove derivate, fragmente, analoge ili homologe. U nekim izvođenjima, fragmenti antitela su linearni fragmenti antitela. U određenim izvođenjima, fragmenti antitela su monospecifični ili bispecifični. U određenim izvođenjima, antitelo je scFv. Za proizvodnju jednolančanih antitela specifičnih za TIGIT mogu se koristiti različite tehnike.
[0110] U nekim izvođenjima, posebno u slučaju fragmenata antitela, antitelo je modifikovano da bi se promenio (npr. povećao ili smanjio) njegov poluživot u serumu. Ovo se može postići, na primer, inkorporiranjem epitopa koji se vezuje za specifični receptor u fragment antitela mutacijom odgovarajućeg regiona u fragmentu antitela ili inkorporiranjem epitopa u peptidnu oznaku koja se zatim spaja sa fragmentom antitela na oba kraja ili u sredini (npr. sintezom DNK ili peptida).
[0111] Heterokonjugatna antitela su takođe u okviru ovog pronalaska. Heterokonjugatna antitela se sastoje od dva kovalentno spojena antitela. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju imune ćelije na neželjene ćelije. Takođe se smatra da se heterokonjugatna antitela mogu pripremiti in vitro korišćenjem poznatih metoda u hemiji sintetičkih proteina, uključujući one koji uključuju sredstva za umrežavanje. Na primer, imunotoksini se mogu konstruisati primenom
1
reakcije razmene disulfida ili formiranjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagenasa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat.
[0112] Za potrebe ovog pronalaska, trebalo bi da se razume da modifikovana antitela mogu sadržati bilo koji tip varijabilnog regiona koji obezbeđuje povezivanje antitela sa metom (tj., humani TIGIT). S tim u vezi, varijabilni region može sadržati ili biti izveden od bilo kog tipa sisara koji se može indukovati da pokrene humoralni odgovor i generiše imunoglobuline protiv željenog antigena. Kao takav, varijabilni region modifikovanih antitela može biti, na primer, ljudskog, mišjeg, pacova, zečevog, neljudskog primata (npr. cinomolgus majmuni, makaki, itd.) ili porekla zeca. U nekim izvođenjima, i varijabilni i konstantni regioni modifikovanih imunoglobulina su humani. U drugim izvođenjima, varijabilni regioni kompatibilnih antitela (obično izvedeni iz ne-humanog izvora) mogu biti projektovani ili posebno prilagođeni da poboljšaju svojstva vezivanja ili smanje imunogenost molekula. U tom pogledu, varijabilni regioni korisni u ovom pronalasku mogu biti humanizovani ili na drugi način izmenjeni uključivanjem uvezenih aminokiselinskih sekvenci.
[0113] U određenim izvođenjima, varijabilni domeni u teškim i lakim lancima se menjaju najmanje delimičnom zamenom jednog ili više CDR-ova i, ako je potrebno, delimičnom zamenom regiona okvira i modifikacijom i/ili izmenom sekvence. Iako CDR-ovi mogu biti izvedeni iz antitela iste klase ili čak podklase kao antitelo iz kojeg su izvedeni regioni okvira, predviđeno je da CDR-ovi mogu biti izvedeni iz antitela različite klase i često iz antitela različite vrste. Možda neće biti potrebno zameniti sve CDR sa svim CDR-ovima iz varijabilnog regiona donora da bi se preneo kapacitet vezivanja antigena jednog varijabilnog domena na drugi. Umesto toga, možda će biti potrebno samo preneti one ostatke koji su potrebni za održavanje aktivnosti mesta vezivanja antigena.
[0114] Bez obzira na promene u varijabilnom regionu, stručnjaci u ovoj oblasti će razumeti da će modifikovana antitela ovog pronalaska sadržati antitela (npr. antitela pune dužine ili njihove imunoreaktivne fragmente) u kojima je obrisan bar deo jednog ili više domena konstantnog regiona ili na drugi način izmenjen tako da se obezbede željene biohemijske karakteristike kao što su povećana lokalizacija tumora ili produženi poluživot u serumu u poređenju sa antitelom približno iste imunogenosti koje sadrži nativni ili nepromenjeni konstantni region. U nekim izvođenjima, konstantni region modifikovanih antitela će sadržati humani konstantni region. Modifikacije konstantnog regiona kompatibilne sa ovim pronalaskom obuhvataju adicije, delecije ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u jednom ili više domena. Modifikovana antitela koja su ovde otkrivena mogu da sadrže izmene ili modifikacije jednog ili više od tri konstantna domena teškog lanca (CHI, CH2 ili CH3) i/ili konstantnog domena lakog lanca (CL). U nekim izvođenjima, jedan ili više domena su delimično ili potpuno izbrisani iz konstantnih regiona modifikovanih antitela. U nekim izvođenjima, modifikovana antitela će sadržati konstrukte ili varijante sa izbrisanim domenom u kojima je ceo CH2 domen uklonjen (DCH2 konstrukti). U nekim izvođenjima, izostavljeni domen konstantnog regiona je zamenjen kratkim aminokiselinskim spejserom (npr., 10 aminokiselinskih ostataka) koji obezbeđuje deo molekularne fleksibilnosti koju tipično daje izostavljeni konstantni region.
[0115] U nekim izvođenjima, modifikovana antitela su projektovana da spoje CH3 domen direktno sa zglobnim regionom antitela. U drugim izvođenjima, peptidni spejser je umetnut između zglobnog regiona i modifikovanih CH2 i/ili CH3 domena. Na primer, mogu se eksprimirati konstrukti u kojima je CH2 domen obrisan, a preostali CH3 domen (modifikovani ili nemodifikovani) je spojen na zglobni region pomoću spejsera od 5-20 aminokiselina. Takav spejser se može dodati da bi se osiguralo da regulatorni elementi konstantnog domena ostanu slobodni i dostupni ili da region šarke ostane fleksibilan. Međutim, treba napomenuti da se aminokiselinski spejser mogu, u nekim slučajevima, pokazati kao imunogeni i izazvati neželjeni imuni odgovor na konstrukt. Shodno tome, u određenim izvođenjima, svaki spejser koji je dodat konstruktu biće relativno neimunogeni kako bi održao željene biološke kvalitete modifikovanih antitela.
[0116] U nekim izvođenjima, modifikovana antitela mogu imati samo delimičnu deleciju konstantnog domena ili supstituciju nekoliko ili samo jedne aminokiseline. Na primer, mutacija jedne aminokiseline u odabranim oblastima CH2 domena može biti dovoljna da značajno smanji vezivanje Fc. U nekim izvođenjima, mutacija jedne aminokiseline u odabranim oblastima CH2 domena može biti dovoljna da značajno smanji vezivanje Fc i poveća lokalizaciju ćelija raka i/ili penetraciju tumora. Slično, može biti poželjno da se jednostavno izbriše deo jednog ili više domena konstantnog regiona koji kontrolišu specifičnu funkciju efektora (npr. vezivanje komplementa C1k) koji će biti modulisani. Takva delimična brisanja konstantnih regiona mogu poboljšati odabrane karakteristike antitela (poluživot u serumu) dok ostale poželjne funkcije povezane sa domenom konstantnog regiona subjekta ostaju netaknute. Štaviše, kao što je gore navedeno, konstantni regioni otkrivenih antitela mogu biti modifikovani mutacijom ili supstitucijom jedne ili više aminokiseline koje poboljšavaju profil rezultujućeg konstrukta. U tom pogledu može biti moguće poremetiti aktivnost koju obezbeđuje očuvano mesto vezivanja (npr. vezivanje Fc) dok se suštinski održava konfiguracija i imunogeni profil modifikovanog antitela. U određenim izvođenjima, modifikovana antitela obuhvataju dodavanje jedne ili više aminokiseline konstantnom regionu da bi se poboljšale poželjne karakteristike kao što je smanjenje ili povećanje efektorske funkcije ili obezbeđivanje više mesta vezivanja za citotoksin ili ugljene hidrate.
[0117] U struci je poznato da konstantni region posreduje u nekoliko efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje C1 komponente komplementa za Fc region IgG ili IgM antitela (vezanih za antigen) aktivira sistem komplementa. Aktivacija komplementa je važna u opsonizaciji i lizi ćelijskih patogena. Aktivacija komplementa takođe stimuliše inflamatorni odgovor i takođe može biti uključena u autoimunu preosetljivost. Pored toga, Fc region antitela može da veže ćeliju koja eksprimira Fc receptor (FcR). Postoji veliki broj Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptore), IgE (epsilon receptore), IgA (alfa receptore) i IgM (mu receptore). Vezivanje antitela za Fc receptore na ćelijskim površinama pokreće niz važnih i raznovrsnih bioloških odgovora, uključujući uvlačenje i uništavanje čestica obloženih antitelom, čišćenje imunskih kompleksa, lizu ciljnih ćelija obloženih antitelom od strane ćelija ubica (nazvana citotoksičnost ćelija zavisna od antitela ili ADCC), oslobađanje inflamatornih medijatora, transfer placente i kontrolu proizvodnje imunoglobulina.
1
[0118] U određenim izvođenjima, modifikovana antitela obezbeđuju izmenjene efektorske funkcije koje zauzvrat utiču na biološki profil primenjenog antitela. Na primer, u nekim izvođenjima, delecija ili inaktivacija (preko tačkastih mutacija ili na drugi način) domena konstantnog regiona može smanjiti vezivanje Fc receptora cirkulišućeg modifikovanog antitela. U nekim izvođenjima, delecija ili inaktivacija (preko tačkastih mutacija ili drugi znači) domena konstantnog regiona može smanjiti vezivanje za Fc receptor modifikovanog antitela u cirkulaciji, čime se povećava lokalizacija ćelija raka i/ili penetracija tumora. U drugim izvođenjima, modifikacije konstantnog regiona povećavaju poluživot antitela u serumu. U drugim izvođenjima, modifikacije konstantnog regiona smanjuju poluživot antitela u serumu. U nekim izvođenjima, konstantni region je modifikovan da eliminiše disulfidne veze ili oligosaharidne delove. Modifikacije konstantnog regiona u skladu sa ovim pronalaskom mogu se lako napraviti korišćenjem dobro poznatih tehnika biohemijskog ili molekularnog inženjeringa.
[0119] U određenim slučajevima pronalaska, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje nema jednu ili više efektorskih funkcija. Na primer, u nekim slučajevima, antitelo nema ADCC aktivnost, i/ili nema aktivnost citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC). U određenim slučajevima, antitelo se ne vezuje za Fc receptor i/ili faktore komplementa. U određenim slučajevima, antitelo nema efektornu(e) funkciju(e).
[0120] Ovaj pronalazak dalje obuhvata varijante i ekvivalente koji su suštinski homologni rekombinantnim, monoklonalnim, himernim, humanizovanim i humanim antitelima, ili njihovim fragmentima antitela, koji su ovde opisani. Ove varijante mogu da sadrže, na primer, konzervativne supstitucione mutacije, tj. supstituciju jedne ili više aminokiselina sličnim aminokiselinama.
[0121] Ovaj pronalazak obezbeđuje metode za proizvodnju antitela koje vezuje TIGIT, uključujući bispecifična antitela koja specifično vezuju i TIGIT i drugu metu. U nekim slučajevima, postupak za proizvodnju antitela koje vezuje TIGIT obuhvata korišćenje hibridomskih tehnika. U nekim slučajevima, obezbeđen je postupak za proizvodnju antitela koje vezuje humani TIGIT. U nekim slučajevima, postupak obuhvata korišćenje polipeptida koji sadrži ekstracelularni domen mišjeg TIGIT-a ili njegovog fragmenta kao antigena. U nekim slučajevima, postupak obuhvata korišćenje polipeptida koji sadrži ekstracelularni domen humanog TIGIT-a ili njegovog fragmenta kao antigena. U nekim slučajevima, postupak obuhvata korišćenje polipeptida koji sadrži aminokiseline 29-148 mišjeg TIGIT-a kao antigena. U nekim slučajevima, postupak obuhvata korišćenje polipeptida koji sadrži aminokiseline 22-141 humanog TIGIT-a kao antigena. U nekim slučajevima, postupak obuhvata korišćenje polipeptida koji sadrži aminokiseline 29-148 SEK ID BR:1 kao antigen. U nekim slučajevima, postupak obuhvata korišćenje polipeptida koji sadrži aminokiseline 22-141 SEK ID BR:4 kao antigen. U nekim slučajevima, postupak obuhvata korišćenje polipeptida koji sadrži SEK ID BR:3 ili njegov fragment kao antigen. U nekim slučajevima, postupak obuhvata korišćenje polipeptida koji sadrži SEK ID BR:6 ili njegov fragment kao antigen. U nekim slučajevima, metoda generisanja antitela koje vezuje TIGIT obuhvata skrining biblioteke faga. U nekim slučajevima, metoda generisanja antitela koje vezuje TIGIT obuhvata skrining biblioteke humanih faga. Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje metode identifikacije antitela koje vezuje TIGIT. U nekim slučajevima, antitelo se identifikuje FACS skriningom za vezivanje za TIGIT ili njegov fragment. U nekim slučajevima, antitelo se identifikuje skriningom korišćenjem ELISA za vezivanje za TIGIT ili njegov fragment. U nekim slučajevima, antitelo se identifikuje skriningom pomoću FACS za blokiranje vezivanja TIGIT-a za PVR.
[0122] U nekim slučajevima, postupak za generisanje antitela za TIGIT obuhvata imunizaciju sisara polipeptidom koji sadrži aminokiseline 29-148 TIGIT miša. U nekim slučajevima, postupak za generisanje antitela za TIGIT obuhvata imunizaciju sisara sa polipeptidom koji sadrži aminokiseline 22-141 humanog TIGIT-a. U nekim slučajevima, postupak za generisanje antitela na TIGIT obuhvata imunizaciju sisara polipeptidom koji sadrži fragment (npr. deo) aminokiselina 29-148 mišjeg TIGIT-a. U nekim slučajevima, postupak za generisanje antitela za TIGIT obuhvata imunizaciju sisara polipeptidom koji sadrži fragment aminokiselina 22-141 humanog TIGIT-a. U nekim slučajevima, postupak dalje obuhvata izolovanje antitela ili ćelija koje proizvode antitela od sisara. U nekim slučajevima, postupak za generisanje monoklonskog antitela koje vezuje TIGIT obuhvata: (a) imunizaciju sisara polipeptidom koji sadrži fragment aminokiselina 29-148 mišjeg TIGIT-a; (b) izolovanje ćelija koje proizvode antitela od imunizovanog sisara; i (c) spajanje ćelija koje proizvode antitela sa ćelijama ćelijske linije mijeloma da bi se formirale ćelije hibridoma. U nekim slučajevima, postupak za generisanje monoklonskog antitela koje vezuje TIGIT obuhvata: (a) imunizaciju sisara polipeptidom koji sadrži fragment aminokiselina 22-141 humanog TIGIT-a; (b) izolovanje ćelija koje proizvode antitela od imunizovanog sisara; i (c) spajanje ćelija koje proizvode antitela sa ćelijama ćelijske linije mijeloma da bi se formirale ćelije hibridoma. U nekim slučajevima, postupak dalje obuhvata (d) selekciju ćelije hibridoma koja eksprimira antitelo koje vezuje TIGIT. U određenim slučajevima, sisar je miš. U nekim slučajevima, sisar je pacov. U nekim slučajevima, sisar je zec. U nekim slučajevima, antitelo se bira korišćenjem polipeptida koji sadrži aminokiseline 29-148 ili njihov fragment mišjeg TIGIT-a. U nekim slučajevima, antitelo se bira korišćenjem polipeptida koji sadrži aminokiseline 22-141 ili njihov fragment humanog TIGIT-a. U nekim slučajevima, antitelo vezuje i humani TIGIT i mišji TIGIT. U nekim slučajevima, antitelo ne vezuje mišji TIGIT. U nekim slučajevima, antitelo ne vezuje TIGIT cinomolgus majmuna. U nekim slučajevima, antitelo ne vezuje TIGIT rezus majmuna. U nekim slučajevima, antitelo ne vezuje TIGIT pacova. U nekim slučajevima, antitelo vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT miša. U nekim slučajevima, antitelo vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT majmuna cinomolgus. U nekim slučajevima, antitelo vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT rezus majmuna. U nekim slučajevima, antitelo vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT pacova.
[0123] U nekim slučajevima, postupak za proizvodnju antitela koje se vezuje za TIGIT obuhvata identifikaciju antitela korišćenjem heterodimernog molekula vezanog za membranu koji sadrži jedno mesto za vezivanje antigena. U nekim neograničavajućim izvođenjima, antitelo se identifikuje korišćenjem metoda i polipeptida opisanih u međunarodnoj publikaciji WO 2011/100566.
[0124] U nekim slučajevima, postupak za proizvodnju antitela koje se vezuje za TIGIT obuhvata skrining biblioteke koja
1
eksprimira antitela. U nekim slučajevima, biblioteka koja eksprimira antitela je biblioteka faga. U nekim slučajevima, skrining obuhvata biopaniranje. U nekim slučajevima, biblioteka koja eksprimira antitela je biblioteka ćelija sisara. U nekim slučajevima, biblioteka koja eksprimira antitela je skrinirana korišćenjem aminokiselina 29-148 mišjeg TIGIT-a ili njegovog fragmenta. U nekim slučajevima, biblioteka koja eksprimira antitela je skrinirana korišćenjem aminokiselina 22-141 humanog TIGIT-a ili njegovog fragmenta. U nekim slučajevima, antitelo identifikovano u skriningu vezuje i humani TIGIT i mišji TIGIT. U nekim slučajevima, antitelo identifikovano u skriningu je TIGIT antagonist.
[0125] U nekim slučajevima, antitelo generisano ovde opisanim metodama je TIGIT antagonist. U nekim slučajevima, antitelo generisano ovde opisanim metodama inhibira TIGIT signalizaciju. U nekim slučajevima, antitelo generisano ovde opisanim metodama inhibira TIGIT fosforilaciju.
[0126] U određenim slučajevima, ovde opisana antitela su izolovana. U određenim slučajevima, ovde opisana antitela su suštinski čista.
[0127] Antitela iz ovog pronalaska mogu se ispitati na specifično vezivanje bilo kojom metodom poznatom u struci. Imunološki testovi koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, kompetitivne i nekompetitivne sisteme ispitivanja koji koriste tehnike kao što su Biacore analiza, FACS analiza, imunofluorescencija, imunocitohemija, Western blot analiza, radioimunološke metode, ELISA, "sendvič" imunotest, imunoprecipitacione metode, precipitacione reakcije, gel difuziona reakcija precipitina, test imunodifuzije, test aglutinacije, test fiksacije komplementa, imunoradiometrijski test, fluorescentni imunoesej i imunoesej proteina A. Takvi testovi su rutinski i dobro poznati u struci (videti, npr., Ausubel et al., Urednici, 1994-danas, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY).
[0128] U neograničavajućem primeru, skrining za specifično vezivanje antitela za humani TIGIT može da se odredi korišćenjem ELISA. ELISA se sastoji od pripreme antigena (npr. TIGIT ili njegovog fragmenta), premazivanje bunarića mikrotitarske ploče sa 96 bunarića antigenom, dodavanja test antitela konjugovanih sa jedinjenjem koje se može detektovati kao što je enzimski supstrat (npr. peroksidaza rena ili alkalna fosfataza) u bunariće, inkubiranje tokom određenog vremenskog perioda i otkrivanje prisustva antitela vezanog za antigen. U nekim izvođenjima, test antitela nisu konjugovana sa jedinjenjem koje se može detektovati, već se umesto toga u bunariće dodaje sekundarno antitelo koje prepoznaje antitelo (npr. anti-Fc antitelo) i konjuguje se sa jedinjenjem koje se može detektovati. U nekim izvođenjima, umesto premazivanje bunarića sa antigenom, test antitela mogu biti obložena na bunarićima, antigen (npr. TIGIT) se dodaje u bunariće, a zatim sekundarno antitelo konjugovano sa jedinjenjem koje se može detektovati. Stručnjak u ovoj oblasti bi bio upućen u parametre koji se mogu modifikovati da bi se povećao detektovani signal kao i druge varijacije ELISA koje su poznate u struci.
[0129] U drugom neograničavajućem primeru, specifično vezivanje antitela za TIGIT može se odrediti korišćenjem FACS. FACS test skrininga može da obuhvata stvaranje cDNK konstrukta koji eksprimira antigen kao protein pune dužine (TIGIT) ili fuzioni protein (npr. TIGIT-CD4TM), transfekciju konstrukta u ćelije, eksprimiranje antigena na površini ćelija, mešanje test antitela sa transfektovanim ćelijama i inkubacija tokom određenog vremenskog perioda. Ćelije vezane testiranim antitelima mogu se identifikovati korišćenjem sekundarnog antitela konjugovanog sa jedinjenjem koje se može detektovati (npr. PE-konjugovano anti-Fc antitelo) i protočnim citometrom. Stručnjak u ovoj oblasti bi bio upućen u parametre koji se mogu modifikovati da bi se optimizovao detektovani signal, kao i druge varijacije FACS koje mogu poboljšati skrining (npr. skrining za blokirajuća antitela).
[0130] Afinitet vezivanja antitela ili drugog vezivnog agensa za antigen (npr. TIGIT) i brzina interakcije antitelo-antigen mogu se odrediti kompetitivnim testovima vezivanja. Jedan primer kompetitivnog testa vezivanja je radioimuno test koji se sastoji od inkubacije obeleženog antigena (npr.<3>H ili<125>I-TIGIT), ili njegovog fragmenta ili varijante, sa antitelom od interesa u prisustvu povećane količine neobeleženog antigena nakon čega sledi detekcija antitela vezanog za obeleženi antigen. Afinitet antitela za antigen i stope odstupanja vezivanja mogu se odrediti iz podataka Scatchard-ove analize. U nekim izvođenjima, Biacore kinetička analiza se koristi za određivanje stope uključivanja i isključivanja antitela ili agenasa koji vezuju antigen (npr. TIGIT). U nekim izvođenjima, Biacore kinetička analiza obuhvata analizu vezivanja i disocijacije antitela sa čipova sa imobilisanim antigenom (npr. TIGIT) na njihovoj površini. U nekim izvođenjima, Biacore kinetička analiza obuhvata analizu vezivanja i disocijacije antigena (npr. TIGIT) iz čipova sa imobilisanim antitelom (npr. anti-TIGIT antitelom) na njihovoj površini.
[0131] U određenim slučajevima, pronalazak obezbeđuje TIGIT-vezujući agens (npr. antitelo) koje se specifično vezuje za TIGIT, pri čemu TIGIT-vezujući agens sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet i/ili šest CDR-ova. antitela 313R11, 313R12, 313R14 ili 313R19 (videti tabelu 1). U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži jedan ili više CDR-ova 313R11, 313R12, 313R14 ili 313R19, ili njihovih humanizovanih varijanti; dva ili više CDR-ova 313R11, 313R12, 313R14 ili 313R19, ili njihove humanizovane varijante; tri ili više CDR-ova 313R11, 313R12, 313R14 ili 313R19, ili njihove humanizovane varijante; četiri ili više CDR-ova 313R11, 313R12, 313R14 ili 313R19, ili njihove humanizovane varijante; pet ili više CDR-ova od 313R11, 313R12, 313R14 ili 313R19, ili njihove humanizovane varijante; ili svih šest CDR-ova 313R11, 313R12, 313R14 ili 313R19, ili njihove humanizovane varijante.
1
Tabela 1
[0132] U određenim slučajevima, pronalazak obezbeđuje TIGIT-vezujući agens (npr. antitelo) koje specifično vezuje TIGIT, pri čemu TIGIT-vezujući agens sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži GSSLSSSIMS (SEK ID BR:7) ili GFSLSSSYMS (SEK ID BR:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8), i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR:9). U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens dalje sadrži CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQSISSYLNW (SEK ID BR:10), QASQSNIYSDLAW (SEK ID BR: 14) ili QASQNIYSDLAW (SEK ID BR:81), laki lanac CDR2 koji sadrži DALKLAS (SEK ID BR: 11) ili RASTLAS (SEK ID BR: 15), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHSVGNVDN (SEK ID BR: 12) ili QQEHLVAWIYN (SEK ID BR: 16). U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQSISSYLNW (SEK ID BR:10), QASQSNIYSDLAW (SEK ID BR:14) ili QASQNIYSDLAW (SEK ID BR:81), laki lanac CDR2 koji sadrži DALKLAS ( SEK ID BR: 11) ili RASTLAS (SEK ID BR: 15), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHSVGNVDN (SEK ID BR: 12) ili QQEHLVAWIYN (SEK ID BR: 16). U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži GSSLSSSYMS (SEK ID BR:7) ili GFSLSSSYMS (SEK ID BR:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8) i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR:9) i (b) CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQSISSYLNW (SEK ID BR: 10), QASQSNIYSDLAW (SEK ID BR:14) ili QASQNIYSDLAW (SEK ID BR:8 ), CDR2 lakog lanca koji sadrži DALKLAS (SEK ID BR: 11) ili RASTLAS (SEK ID BR: 15), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHSVGNVDN (SEK ID BR: 12) ili QQEHLVAWIYN (SEK ID BR: 16). U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži GSSLSSSYMS (SEK ID BR:7), CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8) i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP ( SEK ID BR:9) i (b) CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQSISSYLNW (SEK ID BR: 10), CDR2 lakog lanca koji sadrži DALKLAS (SEK ID BR:11) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHSVGNVDN (SEK ID BR: 12). U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži GFSLSSSYMS (SEK ID BR: 13), CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR: 8) i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP ( SEK ID BR:9) i (b) CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQNIYSDLAW (SEK ID BR: 14), CDR2 lakog lanca koji sadrži RASTLAS (SEK ID BR: 15) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHLVAWIYN (SEK ID BR: 16).
[0133] U određenim slučajevima, pronalazak obezbeđuje TIGIT-vezujući agens (npr. antitelo) koje specifično vezuje humani TIGIT, pri čemu agens za TIGIT vezuje: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži GSSLSSSYMS (SEK ID BR:7 ), GFSLSSSYMS (SEK ID BR:13), ili njihova varijanta koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (b) CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (c) CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR:9), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (d) CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQSISSYLNW (SEK ID BR: 10), QASQSNIYSDLAW (SEK ID BR: 14), QASQNIYSDLAW (SEK ID BR: 81), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiseline supstitucije; (e) laki lanac CDR2 koji sadrži DALKLAS (SEK ID BR:11 ), RASTLAS (SEK ID BR:15), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; i (f) CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHSVGNVDN (SEK ID BR: 12), QQEHLVAWIYN (SEK ID BR: 16), ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije. U određenim slučajevima, supstitucije aminokiselina su konzervativne. U nekim slučajevima, supstitucije se vrše kao deo procesa humanizacije. U nekim slučajevima, supstitucije se vrše kao deo procesa humanizacije klica.
[0134] U određenim slučajevima, pronalazak obezbeđuje TIGIT-vezujući agens (npr. antitelo) koje specifično vezuje TIGIT, pri čemu TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19, ili SEK ID BR: 32 i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 18 ili SEK ID BR: 20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:17. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:19. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:32. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 18. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19 ili SEK ID BR: 32 i/ili varijabilni region lakog lanca koji imaju najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:18 ili SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:17, SEK ID BR: 19 ili SEK ID BR:32 i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:18 ili SEK ID BR:20. U određenim
2
slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19 ili SEK ID BR: 32 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR: 18 ili SEK ID BR: 20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19 ili SEK ID BR: 32 i varijabilnog regiona lakog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR: 18 ili SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19 ili SEK ID BR: 32 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od SEK ID BR: 18 ili SEK ID BR:20.
[0135] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR: 17 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR: 18. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR: 17 i varijabilnog regiona lakog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR: 18. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od SEK ID BR: 17 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od SEK ID BR: 18.
[0136] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:19 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:19 i varijabilni region lakog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od SEK ID BR:19 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od SEK ID BR:20.
[0137] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:32 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:32 i varijabilnog regiona lakog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od SEK ID BR:32 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od SEK ID BR:20.
[0138] U određenim slučajevima, pronalazak obezbeđuje TIGIT-vezujući agens (npr. antitelo) koje se specifično vezuje za TIGIT, pri čemu TIGIT-vezujući agens sadrži: (a) teški lanac koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID-om BR:26, SEK ID BR:27, SEK ID BR:29, SEK ID BR:34 ili SEK ID BR:56; i/ili (b) laki lanac koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:28 ili SEK ID BR:30. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži: (a) teški lanac koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 29, SEK ID BR: 34, ili SEK ID BR:56; i/ili (b) laki lanac koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:28 ili SEK ID BR:30. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:26 i/ili laki lanac koji sadrži SEK ID BR:28. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:27 i/ili laki lanac koji sadrži SEK ID BR:28. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:29 i/ili laki lanac koji sadrži SEK ID BR:30. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:34 i/ili laki lanac koji sadrži SEK ID BR:30. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:56 i/ili laki lanac koji sadrži SEK ID BR:30. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:26 ili SEK ID BR:27, i laki lanac koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:28. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:29, SEK ID BR:34 ili SEK ID BR:56 i laki lanac koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:30. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji se sastoji od SEK ID BR:26 i laki lanac koji se sastoji od SEK ID BR:28. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji se sastoji od SEK ID BR:27 i laki lanac koji se sastoji od SEK ID BR:28. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji se sastoji od SEK ID BR:29 i laki lanac koji se sastoji od SEK ID BR:30. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji se sastoji od SEK ID BR:34 i laki lanac koji se sastoji od SEK ID BR:30. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji se sastoji od SEK ID BR:56 i laki lanac koji se sastoji od SEK ID BR:30.
[0139] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca antitela 313R11. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilne regione 313R11 antitela pri čemu su varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca iz antitela 313R11 sazreli afinitetno. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški i laki lanac antitela 313R11 (sa ili bez vodeće sekvence). U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo 313R11. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela 313R11 pri čemu su varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca humanizovani. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela 313R11 u humanizovanom obliku. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca antitela 313R11 kao deo teškog lanca IgG1, IgG2 ili IgG4.
[0140] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od antitela 313R11. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od varijante antitela 313R11.
[0141] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca antitela 313R12. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilne regione antitela 313R12 pri čemu su varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca iz antitela 313R12 afinitetno sazreli. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški i laki lanac antitela 313R12 (sa ili bez vodeće sekvence). U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo 313R12. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela 313R12 pri čemu su varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca humanizovani. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela 313R12 u humanizovanom obliku. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca antitela 313R12 kao deo teškog lanca IgG1, IgG2 ili IgG4.
[0142] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od antitela 313R12. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od varijante antitela 313R12.
[0143] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca antitela 313R14. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilne regione antitela 313R14 pri čemu su varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca iz antitela 313R14 sazreli afinitetno. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški i laki lanac antitela 313R14 (sa ili bez vodeće sekvence). U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo 313R14. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela 313R14 pri čemu su varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca humanizovani. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela 313R14 u humanizovanom obliku. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca 313R14 antitela kao deo teškog lanca IgG1, IgG2 ili IgG4.
[0144] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od antitela 313R14. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od varijante antitela 313R14.
[0145] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca 313R19 antitela. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilne regione 313R19 antitela gde su varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca iz 313R19 antitela sazreli afinitetno. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški i laki lanac antitela 313R19 (sa ili bez vodeće sekvence). U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo 313R19. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela 313R19 pri čemu su varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca humanizovani. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela 313R19 u humanizovanom obliku. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca 313R19 antitela kao deo teškog lanca IgG1, IgG2 ili IgG4.
[0146] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od antitela 313R19. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži, sastoji se u suštini od, ili se sastoji od varijante antitela 313R19.
[0147] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim u American Type Culture Collection (ATCC), 10801 U University Boulevard, Manassas, VA, SAD, pod uslovima Budimpeštanskog sporazuma o 27. maja 2015. godine i označen kao PTA-122180. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region lakog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim kod ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SAD, pod uslovima Budimpeštanskog sporazuma 27. maja 2015, i označen kao PTA- 122181. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži varijabilni region teškog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označen kao PTA-122180 i varijabilni region lakog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označen kao PTA-122181. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označen kao PTA-122180. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži laki lanac koji sadrži varijabilni region lakog lanca kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označen kao PTA-122181. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označen kao PTA122180 i laki lanac koji sadrži varijabilni region lakog lanca kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označenim kao PTA- 122181.
[0148] Pronalazak obezbeđuje antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži šest CDR-ova antitela 313M26 ili 313M32 (videti tabelu 2).
Tabela 2
[0149] Pronalazak obezbeđuje antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT koje obuhvata: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži TSDYAWN (SEK ID BR:57), CDR2 teškog lanca koji sadrži YISYSGSTSYNPSLRS (SEK ID BR:58) i teški lanac CDR2 lanac CDR3 koji sadrži ARRQVGLGFAY (SEK ID BR:59); i (b) CDR1 lakog lanca koji sadrži KASQDVSTAVA (SEK ID BR:60), CDR2 lakog lanca koji sadrži SASYRYT (SEK ID BR:61), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQHYSTP (SEK ID BR:62).
[0150] U određenim slučajevima, pronalazak obezbeđuje TIGIT-vezujući agens (npr. antitelo) koje specifično vezuje humani TIGIT, pri čemu TIGIT-vezujući agens sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži TSDYAWN (SEK ID BR:57 ) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (b) CDR2 teškog lanca koji sadrži YISYSGSTSYNPSLRS(SEK ID BR:58) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (c) CDR3 teškog lanca koji sadrži ARRQVGLGFAY (SEK ID BR:59) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; (d) CDR1 lakog lanca koji sadrži KASQDVSTAVA (SEK ID BR:60) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; e) laki lanac CDR2 koji sadrži SASYRYT (SEK ID BR:61 ) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije; i (f) CDR3 lakog lanca koji sadrži QQHYSTP (SEK ID BR:62) ili njegovu varijantu koja sadrži 1, 2, 3 ili 4 aminokiselinske supstitucije. U određenim slučajevima, supstitucije aminokiselina su konzervativne. U nekim slučajevima, supstitucije se vrše kao deo procesa humanizacije. U nekim slučajevima, supstitucije se vrše kao deo procesa humanizacije klica. U nekim slučajevima, supstitucije se vrše kao deo obavezujućeg procesa optimizacije.
[0151] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje antitelo koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:63 ili SEK ID BR:67 i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:64 ili SEK ID BR:68. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 63. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 67. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 64. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 68. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:63 ili SEK ID BR:67 i/ili varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 95% identičnost sekvence sa SEK. ID BR:64 ili SEK ID BR:68. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:63 ili SEK ID BR:67 i/ili varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:64 ili SEK ID BR:68.
[0152] U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:63 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:64. U određenim izvođenjima, antitelo se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:63 i varijabilnog regiona lakog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:64. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od SEK ID BR:63 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od SEK ID BR:64.
[0153] U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:67 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:68. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:67 i varijabilni region lakog lanca koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:68. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od SEK ID BR:67 i varijabilni region lakog lanca koji se sastoji od SEK ID BR:68.
[0154] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje antitelo (npr. antitelo) koje se specifično vezuje za TIGIT, pri čemu antitelo sadrži: teški lanac koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:70 i/ili laki lanac koji imaju najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:72. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži: teški lanac koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:70 i/ili laki lanac koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:72. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:70 i/ili laki lanac koji sadrži SEK ID BR:72. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži teški lanac koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:70 i laki lanac koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:72. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži teški lanac koji se sastoji od SEK ID BR:70 i laki lanac koji se sastoji od SEK ID BR:72.
[0155] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje antitelo (npr. antitelo) koje se specifično vezuje za TIGIT, pri čemu antitelo sadrži: teški lanac koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 82 i/ili laki lanac koji imaju najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:72. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži: teški lanac koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 82 i/ili laki lanac koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 72. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:82 i/ili laki lanac koji sadrži SEK ID BR:72. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži teški lanac koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:82 i laki lanac koji se u suštini sastoji od SEK ID BR:72. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži teški lanac koji se sastoji od SEK ID BR:82 i laki lanac koji se sastoji od SEK ID BR:72.
[0156] U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca 313M26 antitela. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilne regione 313M26 antitela pri čemu su varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca iz 313M26 antitela sazreli afinitetno. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži teški i laki lanac antitela 313M26 (sa ili bez vodeće sekvence). U određenim izvođenjima, antitelo je 313M26 antitelo. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela 313M26 pri čemu su varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca humanizovani. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca antitela 313M26 u humanizovanom obliku. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca 313M26 antitela kao deo teškog lanca IgG1, IgG2 ili IgG4.
[0157] U određenim izvođenjima, antitelo sadrži, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od, antitela 313M26. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od varijante antitela 313M26.
[0158] U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca 313M32 antitela. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilne regione 313M32 antitela pri čemu su varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca iz antitela 313M32 sazreli afinitetno. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži teški i laki lanac antitela 313M32 (sa ili bez vodeće sekvence). U određenim izvođenjima, antitelo je 313M32 antitelo. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca 313M32 antitela kao deo teškog lanca IgG1, IgG2 ili IgG4. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca 313M32 antitela kao deo teškog lanca humanog IgG1. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca 313M32 antitela kao deo teškog lanca humanog IgG2. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca 313M32 antitela kao deo teškog lanca humanog IgG4. U određenim izvođenjima, antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca 313M32 antitela kao deo teškog lanca humanog IgG4 se naziva 313M33 antitelo.
[0159] U određenim izvođenjima, antitelo sadrži, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od antitela 313M32. U određenim izvođenjima, antitelo sadrži, u suštini se sastoji od, ili se sastoji od varijante antitela 313M32.
2
[0160] U nekim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim u American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SAD, pod uslovima Budimpeštanskog sporazuma 11. avgusta, 2015, i označen kao PTA-122346. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim kod ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SAD, pod uslovima Budimpeštanskog sporazuma 11. avgusta 2015, i označen kao PTA-122347. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označen kao PTA-122346 i varijabilni region lakog lanca koji je kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označen kao PTA-122347. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži varijabilni region kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označen kao PTA-122346. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži laki lanac kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označen kao PTA-122347. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži varijabilni region kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označen kao PTA-122346 i laki lanac kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC i označen kao PTA-122347.
[0161] Ovaj pronalazak takođe obuhvata homodimerne agense/molekule i heterodimerne agense/molekule. U nekim slučajevima, homodimerni agensi su polipeptidi. U nekim slučajevima, heterodimerni molekuli su polipeptidi. Generalno, homodimerni molekul sadrži dva identična polipeptida. Generalno, heterodimerni molekul sadrži najmanje dva različita polipeptida. U nekim slučajevima, heterodimerni molekul je sposoban da veže najmanje dve mete, na primer, bispecifični agens. Mete mogu biti, na primer, dva različita proteina na jednoj ćeliji ili dva različita proteina na dve odvojene ćelije. Termin "krak" se ovde može koristiti da opiše strukturu homodimernog agensa, heterodimernog agensa i/ili bispecifičnog agensa. U nekim slučajevima, svaki krak sadrži najmanje jedan polipeptid. Generalno, svaki krak heterodimernog molekula ima različitu funkciju, na primer, vezuje dve različite mete. U nekim slučajevima, jedan krak može da sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela. U nekim slučajevima, jedan krak može da sadrži vezujući deo receptora. U nekim slučajevima, jedan krak može da sadrži ligand. U nekim slučajevima, jedan krak može da sadrži vezujući region liganda. U nekim slučajevima, homodimerni agens se sastoji od dva identična kraka. U nekim slučajevima, heterodimerni agens se sastoji od dva različita kraka. U nekim slučajevima, bispecifični agens se sastoji od dva različita kraka.
[0162] U nekim slučajevima, pronalzak obezbeđuje TIGIT-vezujući agens koji je homodimerni molekul. U nekim slučajevima, homodimerni molekul sadrži dva identična polipeptida. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje TIGIT-vezujući agens koji je heterodimerni molekul. U nekim slučajevima, heterodimerni molekul sadrži najmanje dva različita polipeptida. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje TIGIT-vezujući agens koji je heterodimerni agens. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje TIGIT-vezujući agens koji je bispecifičan agens. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo.
[0163] U nekim slučajevima, heterodimerni agens (npr., bispecifični agens) sadrži TIGIT koji je ovde opisan. U određenim slučajevima, heterodimerni agens sadrži agens za stimulaciju imunog odgovora ili njegov funkcionalni fragment. U nekim slučajevima, heterodimerni molekul sadrži najmanje dve funkcije (i) vezivanje za TIGIT i (ii) vezivanje za drugu metu. U nekim slučajevima, heterodimerni agens sadrži najmanje dve funkcije, (i) vezivanje za TIGIT i (ii) "nevezujuću" funkciju. U određenim slučajevima, heterodimerni molekul sadrži drugi imunoterapeutski agens ili njegov funkcionalni fragment. U nekim slučajevima, jedan krak heterodimernog molekula sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan, a jedan krak heterodimernog molekula sadrži drugi imunoterapeutski agens. U nekim slučajevima, jedan krak heterodimernog agensa sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan, a jedan krak heterodimernog agensa sadrži agens za stimulaciju imunog odgovora. Kako se ovde koristi, fraza "agens za stimulisanje imunološkog odgovora" koristi se u najširem smislu i odnosi se na supstancu koja direktno ili indirektno stimuliše imuni sistem izazivanjem aktivacije ili povećavanjem aktivnosti bilo koje komponente imunog sistema. Na primer, agensi za stimulaciju imunog odgovora mogu uključivati citokine, kao i različite antigene uključujući tumorske antigene i antigene izvedene iz patogena. U nekim slučajevima, drugi imunoterapeutski agens (npr. agens za stimulaciju imunog odgovora) uključuje, ali nije ograničen na, faktor stimulacije kolonija (npr. faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), faktor matičnih ćelija (SCF)), interleukin (npr. IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL -18), citokin (npr. gama-interferon), antitelo koje blokira imunosupresivne funkcije (npr. anti-CTLA4 antitelo, antiCD28 antitelo, anti-PD-1 antitelo, anti-PD-Ll antitelo), kao receptor (npr. TLR4, TLR7, TLR9), ili član porodice B7 (npr. CD80, CD86). U nekim slučajevima, imunoterapeutski agens uključuje, ali ne ograničava se na, agonističko antitelo (npr., anti-GITR antitelo, anti-OKS40 antitelo) ili agonistički ligand (npr. GITRL ili OKS40L).
[0164] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je heterodimerni molekul (npr., bispecifični agens) koji sadrži prvi CH3 domen i drugi CH3 domen, od kojih je svaki modifikovan da promoviše formiranje heteromultimera. U nekim slučajevima, prvi i drugi CH3 domen se modifikuju korišćenjem tehnike "knobs-in-to-holes". U nekim slučajevima, prvi i drugi CH3 domen sadrže promene u aminokiselinama koje rezultiraju izmenjenim elektrostatičkim interakcijama. U nekim slučajevima, prvi i drugi CH3 domen sadrže promene u aminokiselinama koje rezultiraju izmenjenim hidrofobnim/hidrofilnim interakcijama.
[0165] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan agens koji obuhvata konstantne regione teškog lanca izabrane iz grupe koju čine: (a) prvi humani IgG1 konstantni region, gde aminokiseline koje odgovaraju pozicijama 253 i 292 IgG1 (SEK ID BR:41) su zamenjeni glutamatom ili aspartatom, a drugi humani IgG1 konstantni region, gde su aminokiseline koje odgovaraju pozicijama 240 i 282 IgG1 (SEK ID BR:41) zamenjene lizinom; (b) prvi humani IgG2 konstantni region, gde su aminokiseline koje odgovaraju pozicijama 249 i 288 IgG2 (SEK ID BR:42) zamenjene glutamatom ili aspartatom, i drugi humani IgG2 konstantni region gde su aminokiseline koje odgovaraju pozicijama 236 i 278 IgG2 (SEK ID BR:42) zamenjene lizinom; (c) prvi humani IgG3 konstantni region, gde aminokiseline koje odgovaraju pozicijama 300 i 339 IgG3 (SEK ID BR:43) su zamenjene glutamatom ili aspartatom, a drugi humani IgG3 konstantni region gde su aminokiseline koje odgovaraju pozicijama 287 i 329 IgG3 (SEK ID BR:43) zamenjene lizinom; i (d) prvi humani IgG4 konstantni region, gde su aminokiseline koje odgovaraju pozicijama 250 i 289 IgG4 (SEK ID BR: 44) zamenjene glutamatom ili aspartatom, i drugi IgG4 konstantni region u kome su aminokiseline koje odgovaraju pozicijama 237 i 279 IgG4 (SEK ID BR:44) su zamenjeni lizinom.
[0166] U nekim slučajevima,TIGIT-vezujući agens je bispecifičan agens koji obuhvata prvi humani IgG1 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 253 i 292 IgG1 (SEK ID BR: 41), gde su aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 253 i 292 IgG1 (SEK ID BR:41) zamenjene glutamatom ili aspartatom, a drugi humani IgG1 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 240 i 282 IgG1 (SEK ID BR: 41), pri čemu su aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 240 i 282 IgG1 (SEK ID BR:41) zamenjene lizinom. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi humani IgG2 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 249 i 288 IgG2 (SEK ID BR: 42), pri čemu su aminokiseline na odgovarajućim pozicijama 249 i 288 IgG2 (SEK ID BR:42) zamenjene glutamatom ili aspartatom, a drugi humani IgG2 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 236 i 278 IgG2 (SEK ID BR:42), pri čemu su aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 236 i 278 IgG2 (SEK ID BR:42) zamenjene lizinom. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata prvi humani IgG3 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 300 i 339 IgG3 (SEK ID BR: 43), pri čemu su aminokiseline na odgovarajućim pozicijama 300 i 339 IgG3 (SEK ID BR:43) zamenjene glutamatom ili aspartatom, a drugi humani IgG3 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 287 i 329 IgG3 (SEK ID BR:43), pri čemu su aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 287 i 329 IgG3 (SEK ID BR:43) zamenjene lizinom. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata prvi humani IgG4 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 250 i 289 IgG4 (SEK ID BR: 44), pri čemu su aminokiseline na odgovarajućim pozicijama 250 i 289 IgG4 (SEK ID BR:44) zamenjene glutamatom ili aspartatom, a drugi humani IgG4 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 237 i 279 IgG4 (SEK ID BR:44), pri čemu su aminokiseline na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 237 i 279 IgG4 (SEK ID BR:44) zamenjene lizinom.
[0167] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan agens koji obuhvata prvi humani IgG1 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 253 i 292 IgG1 (SEK ID BR: 41), pri čemu su aminokiseline zamenjene glutamatom, a drugi humani IgG1 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 240 i 282 IgG1 (SEK ID BR: 41), pri čemu su aminokiseline zamenjene lizinom. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata prvi humani IgG1 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 253 i 292 IgG1 (SEK ID BR: 41), gde su aminokiseline zamenjene aspartatom, i drugi humani IgG1 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 240 i 282 IgG1 (SEK ID BR: 41), pri čemu su aminokiseline zamenjene lizinom.
[0168] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan agens koji obuhvata prvi humani IgG2 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 249 i 288 IgG2 (SEK ID BR:42), gde su aminokiseline zamenjene glutamatom, a drugi humani IgG2 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 236 i 278 IgG2 (SEK ID BR: 42), gde su aminokiseline zamenjene lizinom. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata prvi humani IgG2 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 249 i 288 IgG2 (SEK ID BR: 42), gde su aminokiseline zamenjene aspartatom, i drugi humani IgG2 konstantni region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju pozicijama 236 i 278 IgG2 (SEK ID BR: 42), pri čemu su aminokiseline zamenjene lizinom.
[0169] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan agens koji sadrži konstantni region teškog lanca SEK ID BR:45. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca SEK ID BR:46. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca SEK ID BR:47. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca SEK ID BR:48. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata prvi konstantni region teškog lanca SEK ID BR:45 i drugi konstantni region teškog lanca SEK ID BR:46. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi konstantni region teškog lanca SEK ID BR:47 i drugi konstantni region teškog lanca SEK ID BR:48.
[0170] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan agens koji sadrži konstantni region teškog lanca SEK ID BR:49. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca SEK ID BR:50. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca SEK ID BR:51. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži konstantni region teškog lanca SEK ID BR:52. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata prvi konstantni region teškog lanca SEK ID BR:49 i drugi konstantni region teškog lanca SEK ID BR:50. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje obuhvata prvi konstantni region teškog lanca SEK ID BR:51 i drugi konstantni region teškog lanca SEK ID BR:52.
[0171] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT i drugo mesto za vezivanje antigena koje vezuje drugu metu. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži GSSLSSSYMS (SEK ID BR:7) ili GFSLSSSYMS (SEK ID BR: 13), CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR: 8), i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR: 9). U nekim
2
slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži GSSLSSSYMS (SEK ID BR:7), a CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8), i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR:9). U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži GFSLSSSYMS (SEK ID BR:13), a CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8), i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR:9). U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži GSSLSSSYMS (SEK ID BR:7 ) ili GFSLSSSYMS (SEK ID BR:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8), i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR:9), i (b) drugo mesto vezivanja antigena , pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena i drugo mesto za vezivanje antigena sadrže zajednički (tj. identičan) laki lanac. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži GSSLSSSYMS (SEK ID BR:7 ) ili GFSLSSSYMS (SEK ID BR:13), CDR2 teškog lanca koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8), i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR:9), CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQSISSYLNW (SEK ID BR: :10), QASQSNIYSDLAW (SEK ID BR: 14) ili QASQNIYSDLAW (SEK ID BR: 81), laki lanac CDR2 koji sadrži DALKLAS (SEK ID BR: 11) ili RASTLAS (SEK ID BR: 15), i laki lanac CDR3 koji sadrži QQEHSVGNVDN (SEK ID BR: 12) ili QQEHLVAWIYN (SEK ID BR: 16) i (b) drugo mesto za vezivanje antigena. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto vezivanja antigena koje sadrži CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQSISSYLNW (SEK ID BR:10), QASQSNIYSDLAW (SEK ID BR:14) ili QASQNIYSDLAW (SEK ID BR:81), CDR2 lakog lanca koji sadrži DALKLAS (SEK ID BR:11) ili RASTLAS (SEK ID BR:15), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHSVGNVDN (SEK ID BR:12) ili QQEHLVAWIYN (SEK ID BR:16).
[0172] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19 ili SEK ID BR: 32 . U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99 % identitetičnosti sekvence sa SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19 ili SEK ID BR: 32. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca sa najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:18 ili SEK ID BR:20. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 18 ili SEK ID BR:20. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR: 17. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR: 19. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:32. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:18. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:20.
[0173] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:17 i prvi konstantni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:45, SEK ID BR:46, SEK ID BR:47, SEK ID BR:48, SEK ID BR:49, SEK ID BR:50, SEK ID BR:51 ili SEK ID BR:52. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:19 i prvi konstantni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:45, SEK ID BR:46, SEK ID BR: 47, SEK ID BR:48, SEK ID BR:49, SEK ID BR:50, SEK ID BR:51 ili SEK ID BR:52. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:32 i prvi konstantni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:45, SEK ID BR:46, SEK ID BR: 47, SEK ID BR:48, SEK ID BR:49, SEK ID BR:50, SEK ID BR:51 ili SEK ID BR:52.
[0174] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT i drugo mesto za vezivanje antigena koje vezuje drugu metu. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto vezivanja antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu prvo mesto vezivanja za antigen sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TSDYAWN (SEK ID BR:57), a CDR2 teškog lanca koji sadrži YISYSGSTSYNPSLRS (SEK ID BR:58), i CDR3 teškog lanca koji sadrži ARRQVGLGFAY (SEK ID BR:59). U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži TSDYAWN (SEK ID BR:57 ), CDR2 teškog lanca koji sadrži YISYSGSTSYNPSLRS (SEK ID BR:58), i CDR3 teškog lanca koji sadrži ARRQVGLGFAY (SEK ID BR:59) i (b) drugo mesto za vezivanje antigena, pri čemu je prvo mesto za vezivanje antigena i drugo mesto za vezivanje antigena mesto obuhvata zajednički (tj. identičan) laki lanac. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži: prvo mesto za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za humani TIGIT, pri čemu prvo mesto za vezivanje antigena sadrži (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži TSDYAWN (SEK ID BR:57 ), CDR2 teškog lanca koji sadrži YISYSGSTSYNPSLRS (SEK ID BR: 58), i CDR3 teškog lanca koji sadrži ARRQVGLGFAY (SEK ID BR: 59), CDR1 lakog lanca koji sadrži KASQDVSTAVA (SEK ID BR: 60), laki lanac CDR2 koji sadrži SASYRYT (SEK ID BR:61), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQHYSTP (SEK ID BR:62); i (b) drugo mesto za vezivanje antigena. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo sadrži prvo mesto za vezivanje antigena koje sadrži CDR1 lakog lanca koji sadrži KASQDVSTAVA (SEK ID BR:60), CDR2 lakog lanca koji sadrži SASYRYT (SEK ID BR:61) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQHYSTP (SEK ID BR:62).
[0175] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca
2
koji ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:63 ili SEK ID BR:67. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97% ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:63 ili SEK ID BR:67. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca sa najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:64 ili SEK ID BR:68. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo sadrži varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 64 ili SEK ID BR:68. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:63. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:67. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:64. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:68.
[0176] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:63 i prvi konstantni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:45, SEK ID BR:46, SEK ID BR:47, SEK ID BR:48, SEK ID BR:49, SEK ID BR:50, SEK ID BR:51 ili SEK ID BR:52. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži prvi varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:67 i prvi konstantni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:45, SEK ID BR:46, SEK ID BR: 47, SEK ID BR:48, SEK ID BR:49, SEK ID BR:50, SEK ID BR:51 ili SEK ID BR:52.
[0177] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje specifično vezuje humani TIGIT i drugu metu. U nekim slučajevima, druga meta je tumorski antigen. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi polipeptid koji sadrži antitelo koje specifično vezuje tumorski antigen. Bispecifično antitelo sa specifičnošću vezivanja za tumorski antigen može se koristiti za usmeravanje TIGIT-vezujućeg agensa na tumor. Ovo može biti korisno da se izazove i/ili poboljša imuni odgovor u blizini ili unutar mikrookruženja tumora. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo se može koristiti da indukuje ili pojača aktivnost tumorskih infiltriranih imunih ćelija. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo se može koristiti za indukciju ili poboljšanje aktivnosti limfocita koji infiltriraju tumor (TIL). U nekim slučajevima, bispecifično antitelo se može koristiti za inhibiciju ili smanjenje aktivnosti Treg ćelija. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo se može koristiti za inhibiciju ili smanjenje aktivnosti MSDC.
[0178] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo, pri čemu je prva meta TIGIT, a druga meta je na ćeliji imunog odgovora. U nekim slučajevima, druga meta je na T-ćeliji, NK ćeliji, B-ćeliji, makrofagu, dendritskoj ćeliji ili mijeloidnoj ćeliji. U nekim slučajevima, druga meta je PD-1, PD-L1, CTLA4, TIM-3, LAG-3, GITR, OKS-40, GITRL ili OKS-40L. U nekim slučajevima, druga meta je CD28 ili 4-1BB.
[0179] U nekim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za PD-1. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za PD-L1. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za GITR. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za OKS-40. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za CD40. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za CTLA4. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za CD28. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za GITRL. U nekim slučajevima, bispecifično antitelo obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži antitelo koje se specifično vezuje za OKS-40L.
[0180] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca iz anti-TIGIT antitela 313R11. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca iz anti-TIGIT antitela 313R12. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca iz anti-TIGIT antitela 313R14. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca iz anti-TIGIT antitela 313R19 ili 313R20. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca iz anti-TIGIT antitela 313R11 ili 313R12. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca iz anti-TIGIT antitela 313R14, 313R19 ili 313R20.
[0181] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca iz anti-TIGIT antitela 313M26. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca iz anti-TIGIT antitela 313M26.
[0182] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca iz anti-TIGIT antitela 313M32. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifično antitelo koje sadrži varijabilni region lakog lanca iz anti-TIGIT antitela 313M32.
[0183] U nekim slučajevima, bispecifični agens obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži polipeptid koji sadrži GITRL koji se specifično vezuje za GITR. U nekim slučajevima, drugi krak sadrži polipeptid koji sadrži najmanje jednu kopiju ekstracelularnog domena GITRL. U nekim slučajevima, bispecifični agens obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži polipeptid koji sadrži
2
OKS-40L koji se specifično vezuje za OKS-40. U nekim slučajevima, drugi krak sadrži polipeptid koji sadrži najmanje jednu kopiju ekstracelularnog domena OKS-40L. U nekim slučajevima, bispecifični agens sadrži prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži polipeptid koji sadrži CD40L koji se specifično vezuje za CD40. U nekim slučajevima, drugi krak sadrži polipeptid koji sadrži najmanje jednu kopiju ekstracelularnog domena CD40L. U nekim slučajevima, bispecifični agens obuhvata prvi krak koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan i drugi krak koji sadrži polipeptid koji sadrži 4-1BB ligand koji se specifično vezuje za 4-1BB. U nekim slučajevima, drugi krak sadrži polipeptid koji sadrži najmanje jednu kopiju ekstracelularnog domena 4-1BB liganda.
[0184] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan TIGIT-vezujući agens sa KD od oko 50 nM ili manje, oko 25 nM ili manje, oko 10 nM ili manje, oko 1 nM ili manje, ili oko 0,1 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan agens koji vezuje drugu metu sa KD od oko 50 nM ili manje, oko 25 nM ili manje, oko 10 nM ili manje, oko 1 nM ili manje, ili oko 0,1 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan TIGIT-vezujući agens sa KD od oko 50 nM ili manjim i vezuje drugu metu sa KD od oko 50 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan TIGIT-vezujući agens sa KD od oko 25 nM ili manje i vezuje drugu metu sa KD od oko 25 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan TIGIT-vezujući agens sa KD od oko 10 nM ili manje i vezuje drugu metu sa KD od oko 10 nM ili manje. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan TIGIT-vezujući agens sa KD od oko 1nM ili manje i vezuje drugu metu sa KD od oko 1nM ili manje.
[0185] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je bispecifičan agens koji obuhvata jedno mesto za vezivanje antigena sa afinitetom vezivanja koji je slabiji od afiniteta vezivanja drugog mesta vezivanja za antigen. Na primer, u nekim slučajevima, bispecifično sredstvo može da veže TIGIT sa KD u rasponu od oko 0,1 nM do 1 nM i može da veže drugu metu sa KD u rasponu od oko 1 nM do 10 nM. Ili bispecifično sredstvo može da veže TIGIT sa KD u rasponu od oko 1nM do 10nM i može da veže drugu metu sa KD u rasponu od oko 0,1nM do 1nM. U nekim slučajevima, bispecifično sredstvo može da veže TIGIT sa KD u rasponu od oko 0,1 nM do 1 nM i može da veže drugu metu sa KD u rasponu od oko 1 nM do 10 nM. Ili bispecifično sredstvo može da veže TIGIT sa KD u rasponu od oko 1nM do 10nM i može da veže drugu metu sa KD u rasponu od oko 0,1nM do 1nM. U nekim slučajevima, razlika u afinitetu između dva mesta vezivanja antigena može biti oko 2 puta ili više, oko 3 puta ili više, oko 5 puta ili više, oko 8 puta ili više, oko 10 puta ili više, oko 15 puta ili više, oko 30 puta ili više, oko 50 puta ili više, ili oko 100 puta ili više. U nekim slučajevima, najmanje jedan aminokiselinski ostatak u najmanje jednom CDR mestu vezivanja antigena za TIGIT je supstituisan sa drugom aminokiselinom, tako da je afinitet TIGIT-vezujućeg mesta promenjen. U nekim slučajevima, afinitet TIGIT-vezujućeg mesta je povećan. U nekim slučajevima, afinitet TIGIT-vezujućeg mesta je smanjen. U nekim slučajevima, najmanje jedan aminokiselinski ostatak u najmanje jednom CDR mestu za vezivanje antigena za drugu metu je supstituisan sa drugom aminokiselinom, tako da je afinitet drugog mesta vezivanja za antigen promenjen. U nekim slučajevima, afinitet drugog mesta vezivanja antigena je povećan. U nekim slučajevima, afinitet drugog mesta vezivanja antigena je smanjen. U nekim slučajevima, afiniteti i TIGIT-a i drugog mesta vezivanja antigena su promenjeni.
[0186] Pronalazak obezbeđuje polipeptide, uključujući, ali ne ograničavajući se na, antitela koja specifično vezuju TIGIT. U nekim slučajevima, polipeptid se vezuje za humani TIGIT. U nekim izvođenjima, polipeptid vezuje TIGIT miša. U nekim slučajevima, polipeptid vezuje TIGIT miša i TIGIT čoveka. U nekim slučajevima, polipeptid vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT miša. U nekim slučajevima, polipeptid vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT pacova. U nekim slučajevima, polipeptid vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT zeca. U nekim slučajevima, polipeptid vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT marmozeta. U nekim slučajevima, polipeptid vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT psa. U nekim slučajevima, polipeptid vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT svinje. U nekim slučajevima, polipeptid vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT majmuna cinomolgus. U nekim slučajevima, polipeptid vezuje humani TIGIT i ne vezuje TIGIT rezus majmuna.
[0187] U određenim slučajevima, polipeptid sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet i/ili šest CDR-ova antitela 313R11, 313R12, 313R14 ili 313R19 (videti Tabelu 1 ). Antitelo 313R20 sadrži iste CDR-ove i varijabilne domene teškog i lakog lanca kao antitelo 313R19, ali 313R20 sadrži IgG4 format. U nekim slučajevima, polipeptid sadrži CDR sa do četiri (tj. 0, 1, 2, 3 ili 4) aminokiselinske supstitucije po CDR. U određenim slučajevima, CDR(ovi) teškog lanca se nalaze unutar varijabilnog regiona teškog lanca. U određenim slučajevima, CDR(ovi) lakog lanca se nalaze unutar varijabilnog regiona lakog lanca.
[0188] U nekim slučajevima, pronalzak obezbeđuje polipeptid koji se specifično vezuje za TIGIT, pri čemu polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19 ili SEK ID BR:32, i/ili sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:18 ili SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:17 , SEK ID BR:19 ili SEK ID BR:32. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:18 ili SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19 ili SEK ID BR: 32, i/ili sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:18 ili SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR: 17 i/ili sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR: 18. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR: 19 i/ ili sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:32 i/ili sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:20.
[0189] U nekim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19, SEK ID BR: 19, SEK ID BR: 20 i/ili SEK ID BR: 32. Kao što je ovde definisano, polipeptid se može pojaviti kao jedan lanac ili kao dva ili više povezanih lanaca. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:
2
17 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR: 18. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR: 19 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:32 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se u suštini sastoji od SEK ID BR: 17 i sekvencu aminokiselina koja se u suštini sastoji od SEK ID BR: 18. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži s sekvencu aminokiselina koja se u suštini sastoji od SEK ID BR: :19 i sekvencu aminokiselina koja se u suštini sastoji od SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se u suštini sastoji od SEK ID BR:32 i sekvencu aminokiselina koja se u suštini sastoji od SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR: 17 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR: 18. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR: 19 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:32 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:20.
[0190] U nekim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR: 21, SEK ID BR: 22, SEK ID BR: 23, SEK ID BR: 24, SEK ID BR: 25, SEK ID BR: 26 , SEK ID BR:27, SEK ID BR:28, SEK ID BR:29, SEK ID BR:30, SEK ID BR:33, SEK ID BR:34, SEK ID BR:55 i/ili SEK ID BR: 56. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:21 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:23. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:22 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:23. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:24 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:25. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:33 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:25. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:55 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:25. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:26 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:28. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:27 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:28. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:29 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:30. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:34 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:30. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:56 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:30.
[0191] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens sadrži polipeptid koji sadrži sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 18, SEK ID BR: 19, SEK ID BR: 20, SEK ID BR:26, SEK ID BR:27, SEK ID BR:28, SEK ID BR:29, SEK ID BR:30, SEK ID BR:32, SEK ID BR:34 i SEK ID BR:56
[0192] U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:21 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:23. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:22 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:23. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:24 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:25. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:33 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:25. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:55 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:25. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:26 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:28. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:27 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:28. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:29 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:30. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:34 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:30. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:56 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:30.
[0193] U određenim slučajevima, polipeptid sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet i/ili šest CDR-ova antitela 313M26 ili 313M32 (videti tabelu 2 ovde). U nekim slučajevima, polipeptid sadrži CDR sa do četiri (tj. 0, 1, 2, 3 ili 4) aminokiselinske supstitucije po CDR. U određenim slučajevima, CDR(ovi) teškog lanca se nalaze unutar varijabilnog regiona teškog lanca. U određenim slučajevima, CDR(ovi) lakog lanca se nalaze unutar varijabilnog regiona lakog lanca.
[0194] U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje polipeptid koji se specifično vezuje za TIGIT, pri čemu polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 63 ili SEK ID BR: 67, i/ili sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:64 ili SEK ID BR:68. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:63 ili SEK ID BR:67. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:64 ili SEK ID BR:68. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 95% identičnost sekvence sa SEK ID BR: 63 ili SEK ID BR: 167 i/ili sekvencu aminokiselina koja ima najmanje oko 95% identičnost sekvence sa SEK ID BR:64 ili SEK ID BR:68. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:63 i/ili sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:64. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:67 i/ili sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:68.
[0195] U nekim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR: 63, SEK ID BR: 64, SEK ID BR: 67, SEK ID BR: 68, SEK ID BR: 69 , SEK ID BR:70, SEK ID BR:71, SEK ID BR:72, SEK ID BR:82 i/ili SEK ID BR:83. Kao što je ovde definisano, polipeptid se može pojaviti kao jedan lanac ili kao dva ili više povezanih lanaca. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:63 i sekvencu
2
aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:64.
U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:67 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:68. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:69 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:71. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:70 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:72. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:82 i sekvencu aminokiselina koja sadrži SEK ID BR:72.
[0196] U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:63 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:64. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:67 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:68. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:69 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:71. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:70 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:72. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:82 i sekvencu aminokiselina koja se sastoji od SEK ID BR:72.
[0197] Mnogi proteini, uključujući antitela, sadrže signalnu sekvencu koja usmerava transport proteina na različite lokacije. Generalno, signalne sekvence (takođe se pominju kao signalni peptidi ili vodeće sekvence) se nalaze na N-terminusu polipeptida u nastajanju. Oni ciljaju polipeptid na endoplazmatični retikulum i proteini se raspoređuju do svojih odredišta, na primer, do unutrašnjeg prostora organele, unutrašnje membrane, spoljašnje membrane ćelije ili spoljašnjosti ćelije putem sekrecije. Većina signalnih sekvenci se odcepi od proteina pomoću signalne peptidaze nakon što se proteini transportuju u endoplazmatični retikulum. Cepanje signalne sekvence od polipeptida se obično dešava na specifičnom mestu u sekvenci aminokiselina i zavisi od aminokiselinskih ostataka unutar signalne sekvence. Iako obično postoji jedno specifično mesto cepanja, više od jednog mesta cepanja može biti prepoznato i/ili može biti korišćeno od strane signalne peptidaze što rezultira nehomogenim N-terminusom polipeptida. Na primer, upotreba različitih mesta cepanja unutar signalne sekvence može rezultirati polipeptidom eksprimiranim sa različitim N-terminalnim aminokiselinama. Shodno tome, u nekim izvođenjima, polipeptidi kako su ovde opisani mogu da sadrže mešavinu polipeptida sa različitim N-terminusima. U nekim izvođenjima, N-krajevi se razlikuju po dužini za 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina. U nekim izvođenjima, polipeptid je suštinski homogen, tj. polipeptidi imaju isti N-terminus. U nekim izvođenjima, signalna sekvenca polipeptida sadrži jednu ili više (npr. jednu, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, itd.) aminokiselinskih supstitucija i/ili delecija u poređenju sa „matičnim“ ili „roditeljskim“ signalnim nizom. U nekim izvođenjima, signalna sekvenca polipeptida sadrži aminokiselinske supstitucije i/ili delecije koje omogućavaju da jedno mesto cepanja bude dominantno, što dovodi do suštinski homogenog polipeptida sa jednim N-terminusom. U nekim izvođenjima, signalna sekvenca polipeptida utiče na nivo ekspresije polipeptida, npr. na povećanu ekspresiju ili smanjenu ekspresiju.
[0198] U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom opisanim ovde. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži GSSLSSSYMS (SEK ID BR:7) ili GFSLSSSYMS (SEK ID BR:13), teški lanac CDR2 koji sadrži IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8) i CDR3 teškog lanca koji sadrži GGYRTSGMDP (SEK ID BR:9) i (b) CDR1 lakog lanca koji sadrži QASQSISSYLNW (SEK ID BR:10), QASQSNIYSDLAW (SEK ID BR:14) ili QASQNIYSDLAW (SEK ID BR:81), CDR2 lakog lanca koji sadrži DALKLAS (SEK ID BR:11) ili RASTLAS (SEK ID BR:15), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQEHSVGNVDN (SEK ID BR:12) ili QQEHLVAWIYN (SEK ID BR: 16).
[0199] U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 19 ili SEK ID BR: 32 i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:18 ili SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:17 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:18. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:19 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:20. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:32 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:20.
[0200] U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:26, SEK ID BR:27, SEK ID BR:29, SEK ID BR:34, ili SEK ID BR:56 i laki lanac koji sadrži SEK ID BR:28 ili SEK ID BR:30. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:26 i laki lanac koji sadrži SEK ID BR:28. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:27 i laki lanac koji sadrži SEK ID BR:28. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:29 i laki lanac koji sadrži SEK ID BR:30. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:34 i laki lanac koji sadrži SEK ID BR:30. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:56 i laki lanac koji sadrži SEK ID BR:30.
[0201] U određenim slučajevima, antitelo se takmiči sa antitelom 313R11 za specifično vezivanje za TIGIT. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči sa antitelom 313R12 za specifično vezivanje za TIGIT. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči sa antitelom 313R14 za specifično vezivanje za humani TIGIT. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči sa antitelom 313R19 za specifično vezivanje za humani TIGIT. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči sa antitelom 313R20 za specifično vezivanje za humani TIGIT.
[0203] U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili suštinski isti epitop, za TIGIT kao TIGIT-vezujući agens prema pronalasku. U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili suštinski isti epitop, za TIGIT kao antitelo 313R11. U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili suštinski isti epitop, za TIGIT kao antitelo 313R12. U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili suštinski isti epitop, za TIGIT kao antitelo 313R14. U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili suštinski isti epitop, za TIGIT kao antitelo 313R19. U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili suštinski isti epitop, za TIGIT kao antitelo 313R20.
[0204] U drugom slučaju, antitelo vezuje epitop na TIGIT-u koji se preklapa sa epitopom na TIGIT-u koji je vezan TIGIT-vezujućim agensom iz pronalaska. U nekim slučajevima, antitelo vezuje epitop na TIGIT-u koji se preklapa sa epitopom na TIGIT-u vezanim antitelom 313R11. U drugom aspektu, antitelo vezuje epitop na TIGIT-u koji se preklapa sa epitopom na TIGIT-u vezanim antitelom 313R12. U nekim slučajevima, antitelo vezuje epitop na TIGIT-u koji se preklapa sa epitopom na TIGIT-u vezanim antitelom 313R14. U određenim slučajevima, antitelo vezuje epitop na TIGIT-u koji se preklapa sa epitopom na TIGIT-u vezanim antitelom 313R19. U određenim slučajevima, antitelo vezuje epitop na TIGIT-u koji se preklapa sa epitopom na TIGIT-u vezanim antitelom 313R20.
[0205] U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom opisanim ovde. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži: (a) CDR1 teškog lanca koji sadrži TSDYAWN (SEK ID BR:57), CDR2 teškog lanca koji sadrži YISYSGSTSYNPSLRS (SEK ID BR:58) i CDR3 teškog lanca koji sadrži ARRQVGLGFAY (SEK ID BR:59) i (b) CDR1 lakog lanca koji sadrži KASQDVSTAVA (SEK ID BR:60), CDR2 lakog lanca koji sadrži SASYRYT (SEK ID BR:61) i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQHYSTP (SEK ID BR:62).
[0206] U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR: 63 ili SEK ID BR: 67 i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:64 ili SEK ID BR:68. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:63 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:64. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR: 167 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR: 68. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:70 i laki lanac koji sadrži SEK ID BR:72. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči za specifično vezivanje za TIGIT sa TIGIT-vezujućim agensom koji sadrži teški lanac koji sadrži SEK ID BR:82 i laki lanac koji sadrži SEK ID BR:72.
[0207] U određenim slučajevima, antitelo se takmiči sa antitelom 313M26 za specifično vezivanje za TIGIT. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči sa antitelom 313M32 za specifično vezivanje za TIGIT. U određenim slučajevima, antitelo se takmiči sa antitelom 313M32 za specifično vezivanje za humani TIGIT. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči sa referentnim antitelom za specifično vezivanje za TIGIT, pri čemu je referentno antitelo antitelo 313M26. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči sa referentnim antitelom za specifično vezivanje za TIGIT, pri čemu je referentno antitelo antitelo 313M32. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči sa referentnim antitelom za specifično vezivanje za TIGIT, pri čemu je referentno antitelo antitelo 313M33. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči sa referentnim antitelom za specifično vezivanje za humani TIGIT, pri čemu je referentno antitelo antitelo 313M32. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči sa referentnim antitelom za specifično vezivanje za humani TIGIT, pri čemu je referentno antitelo antitelo 313M33.
[0208] U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili suštinski isti epitop, za TIGIT kao TIGIT-vezujući agens kako je ovde opisano. U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili suštinski isti epitop, za TIGIT kao antitelo 313M26. U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili suštinski isti epitop, za TIGIT kao antitelo 313M32. U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili suštinski isti epitop, za TIGIT kao antitelo 313M33. U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili suštinski isti epitop, za humani TIGIT kao antitelo 313M32. U određenim slučajevima, antitelo vezuje isti epitop, ili u suštini isti epitop, za humani TIGIT kao antitelo 313M33.
[0209] U drugom slučaju, antitelo vezuje epitop za TIGIT koji se preklapa sa epitopom na TIGIT-u koji je vezan za TIGIT-vezujući agens opisan ovde. U nekim slučajevima, antitelo vezuje epitop za TIGIT koji se preklapa sa epitopom na TIGIT-u vezanim antitelom 313M26. U drugom slučaju, antitelo vezuje epitop za TIGIT koji se preklapa sa epitopom na TIGIT-u vezanim antitelom 313M32. U drugom slučaju, antitelo vezuje epitop za TIGIT koji se preklapa sa epitopom na TIGIT-u vezanim antitelom 313M33. U drugom slučaju, antitelo vezuje epitop za TIGIT koji se preklapa sa epitopom na humanom TIGIT-u vezanom antitelom 313M32. U drugom slučaju, antitelo vezuje epitop za TIGIT koji se preklapa sa epitopom na humanom TIGIT-u vezanom antitelom 313M33.
[0210] U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži aminokiseline u SEK ID BR:79 sa TIGIT-vezujućim agensom koji je ovde opisan. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži aminokiseline u SEK ID BR:80 sa TIGIT-vezujućim agensom opisanim ovde. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži aminokiseline u SEK ID BR:79 i SEK ID BR:80 sa TIGIT-vezujućim agensom opisanim ovde. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži aminokiseline Q62 i 1109 SEK ID BR:4 sa TIGIT-vezujućim agensom koji je ovde opisan. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži aminokiseline Q62 i T119 SEK ID BR:4 sa TIGIT-vezujućim agensom opisanim ovde. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje sa epitopom koji sadrži aminokiseline Q64 i 1109 SEK ID BR:4 sa TIGIT-vezujućim agensom koji je ovde opisan. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži aminokiseline Q64 i T119 SEK ID BR:4 sa TIGIT-vezujućim agensom koji je ovde opisan. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži aminokiseline Q62, Q64 i 1109 SEK ID BR:4 sa TIGIT-vezujućim agensom opisanim ovde. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži aminokiseline Q62, Q64 i T119 SEK ID BR:4 sa TIGIT-
1
vezujućim agensom koji je ovde opisan. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži aminokiseline Q62, 1109 i T119 SEK ID BR:4 sa TIGIT-vezujućim agensom opisanim ovde. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži aminokiseline Q64, 1109 i T119 SEK ID BR:4 sa TIGIT-vezujućim agensom opisanim ovde. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži aminokiseline Q62, Q64, 1109 i T119 SEK ID BR:4 sa TIGIT-vezujućim agensom opisanim ovde. U nekim slučajevima, antitelo se takmiči za vezivanje za epitop koji sadrži najmanje jednu aminokiselinu izabranu iz grupe koju čine: N58, E60, Q62, Q64, L65, F107, I109, H111, T117, T119, G120 i R121 SEK ID BR:4 sa TIGIT-vezujućim agensom opisanim ovde.
[0211] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens (npr., antitelo) ovde opisan vezuje TIGIT i modulira aktivnost TIGIT-a. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antagonist TIGIT-a i smanjuje aktivnost TIGIT-a. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens inhibira TIGIT aktivnost za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90%, ili oko 100%. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira aktivnost TIGIT je antitelo 313R11, antitelo 313R12, antitelo 313R14, antitelo 313R19 ili antitelo 313R20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira humanu TIGIT aktivnost je humanizovana verzija antitela 313R11, antitela 313R12, antitela 313R14, antitela 313R19 ili antitela 313R20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira aktivnost TIGIT je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira humanu TIGIT aktivnost je humanizovana verzija antitela 313M26 (npr., antitelo 313M32). U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira aktivnost TIGIT je antitelo 313M32.
[0212] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agensi opisani ovde vezuju TIGIT i inhibiraju ili smanjuju TIGIT signalizaciju. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens (npr. antitelo) inhibira TIGIT signalizaciju za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, na najmanje oko 90%, ili oko 100%. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens inhibira TIGIT signalizaciju miša. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens inhibira humanu TIGIT signalizaciju. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens inhibira TIGIT signalizaciju miševa i ljudi. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira TIGIT signalizaciju je antitelo 313R11, antitelo 313R12, antitelo 313R14, antitelo 313R19 ili antitelo 313R20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira TIGIT signalizaciju je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira TIGIT signalizaciju je antitelo 313M32.
[0213] TIGIT je fosforilisan na svom citoplazmatskom repu nakon interakcije sa svojim kontrareceptorom PVR. Fosforilacija TIGIT-a je početak kaskade koja uključuje nizvodne događaje koji utiču na druge poznate signalne puteve. Stoga, procena TIGIT fosforilacije može dati informacije o TIGIT aktivnosti i TIGIT signalizaciji.
[0214] Testovi fosforilacije su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i obično se koriste za praćenje aktivacije proteina i/ili aktivacije puta. Testovi se mogu koristiti za praćenje efekta različitih tretmana na aktivaciju ciljnog proteina i/ili ciljnog puta. Na primer, in vitro test fosforilacije se može koristiti za procenu efekta TIGIT antagonista na PVR-indukovanu aktivaciju TIGIT-a.
[0215] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens (npr., antitelo) inhibira vezivanje TIGIT-a za receptor. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens inhibira vezivanje TIGIT-a za PVR. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens inhibira vezivanje TIGIT-a za PVR-L2, PVR-L3 i/ili PVR-L4. U određenim slučajevima, inhibicija vezivanja agensa koji vezuje TIGIT za PVR je najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% ili najmanje oko 95%. U određenim slučajevima, inhibicija vezivanja agensa koji vezuje TIGIT za PVR-L2, PVR-L3 i/ili PVR-L4 je najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira vezivanje TIGIT-a za PVR je antitelo 313R11, antitelo 313R12, antitelo 313R14, antitelo 313R19 ili antitelo 313R20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira vezivanje TIGIT-a za PVR-L2, PVR-L3 i/ili PVR-L4 je antitelo 313R11, antitelo 313R12, antitelo 313R14, antitelo 313R19 ili antitelo 313R20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira vezivanje TIGIT-a za PVR je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira vezivanje TIGIT-a za PVR je antitelo 313M32. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji inhibira vezivanje TIGIT-a za PVR-L2, PVR-L3 i/ili PVR-L4 je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim slučajevima, agens koji se vezuje za TIGIT koji inhibira vezivanje TIGIT-a za PVR-L2, PVR-L3 i/ili PVR-L4 je antitelo 313M32.
[0216] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens (npr. antitelo) blokira vezivanje TIGIT-a za receptor. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens blokira vezivanje TIGIT-a za PVR. U određenim slučajevima, blokiranje vezivanja TIGIT-vezujućeg agensa za PVR je najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% ili najmanje oko 95%. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens blokira vezivanje TIGIT-a za PVR-L2, PVRL3 i/ili PVR-L4. U određenim slučajevima, blokiranje vezivanja TIGIT-vezujućeg agensa za PVR-L2, PVR-L3 i/ili PVR-L4 je najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji blokira vezivanje TIGIT-a za PVR je antitelo 313R11, antitelo 313R12, antitelo 313R14, antitelo 313R19 ili antitelo 313R20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji blokira vezivanje TIGIT-a za PVR-L2, PVR-L3 i/ili PVR-L4 je antitelo 313R11, antitelo 313R12, antitelo 313R14, antitelo 313R19 ili antitelo 313R20. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji blokira vezivanje TIGIT-a za PVR je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji blokira vezivanje TIGIT-a za PVR je antitelo 313M32. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji blokira vezivanje TIGIT-a za PVR-L2, PVR-L3 i/ili PVR-L4 je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agens koji blokira vezivanje TIGIT-a za PVR-L2, PVR-L3 i/ili PVR-L4 je antitelo 313M32.
[0217] Testovi vezivanja su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i ovde su opisani. Testovi vezivanja se mogu koristiti za praćenje efekta test agensa na interakciju između ciljnog proteina i partnera za vezivanje proteina (npr. receptora ili liganda). Na primer, in vitro test vezivanja se može koristiti za procenu da li antagonist TIGIT blokira interakciju TIGIT-a
2
sa PVR.
[0218] U određenim izvođenjima pronalaska, ovde opisana antitela imaju jedan ili više od sledećih efekata: inhibiraju proliferaciju tumorskih ćelija, inhibiraju rast tumora, smanjuju tumorigenost tumora, smanjuju tumorigenost tumora smanjenjem učestalosti matičnih ćelija raka u tumoru, pokreću ćelijsku smrt tumorskih ćelija, povećavaju ili pojačavaju imuni odgovor, povećavaju ili pojačavaju antitumorski odgovor, povećavaju citolitičku aktivnost imunih ćelija, povećavaju ubijanje tumorskih ćelija, povećavaju ubijanje tumorskih ćelija imune ćelije, indukuju ćelije u tumoru da se diferenciraju, diferenciraju tumorogene ćelije u ne-tumogeno stanje, indukuju ekspresiju markera diferencijacije u tumorskim ćelijama, sprečavaju metastaze tumorskih ćelija, smanjuju preživljavanje tumorskih ćelija, povećavaju inhibiciju rasta zavisnu od kontakta ćelije, povećavaju apoptozu tumorskih ćelija, smanjuju epitelnu-mezenhimsku tranziciju (EMT) ili smanjuju preživljavanje tumorskih ćelija. U nekim izvođenjima, ovde opisana antitela imaju jedan ili više od sledećih efekata: inhibiraju virusnu infekciju, inhibiraju hroničnu virusnu infekciju, smanjuju virusno opterećenje, pokreću ćelijsku smrt ćelija inficiranih virusom ili smanjuju broj ili procenat ćelija inficiranih virusom.
[0219] U određenim izvođenjima, ovde opisana antitela inhibiraju rast tumora. U određenim izvođenjima, ovde opisana antitela inhibiraju rast tumora in vivo (npr., u modelu miša, i/ili kod čoveka koji ima rak). U određenim izvođenjima, rast tumora je inhibiran najmanje dva puta, oko tri puta, oko pet puta, oko deset puta, oko 50 puta, oko 100 puta ili oko 1000 puta u poređenju sa netretiranim tumorom.
[0220] U određenim izvođenjima, ovde opisana antitela smanjuju tumorigenost tumora. U određenim izvođenjima, ovde opisana antitela smanjuju tumorigenost tumora u životinjskom modelu, kao što je model miša. U nekim izvođenjima, model miša je model mišjeg ksenotransplantata. U nekim izvođenjima, ovde opisana antitela ne vezuju TIGIT miša i nisu efikasna u modelu miša. U nekim izvođenjima, surogat TIGIT-vezujući TIGIT-vezujući agens miša se koristi u modelu miša. U određenim izvođenjima, ovde opisana antitela smanjuju tumorigenost tumora koji sadrži matične ćelije raka u životinjskom modelu, kao što je model miša. U određenim izvođenjima, broj ili učestalost matičnih ćelija raka u tumoru se smanjuje za najmanje dva puta, oko tri puta, oko pet puta, oko deset puta, oko 50 puta, oko 100 puta, ili oko 1000 puta. U određenim izvođenjima, smanjenje broja ili učestalosti matičnih ćelija raka je određeno testom ograničavanja razblaženja korišćenjem životinjskog modela. Dodatni primeri i uputstva u vezi sa upotrebom testova ograničavanja razblaživanja za određivanje smanjenja broja ili učestalosti matičnih ćelija raka u tumoru mogu se naći, na primer, u Međunarodnoj publikaciji broj WO 2008/042236; Patentna publikacija SAD br. 2008/0064049; i Publikacija patenta SAD br. 2008/0178305.
[0221] U određenim izvođenjima, ovde opisana antitela moduliraju imuni odgovor. U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo aktivira i/ili povećava imuni odgovor. U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava, promoviše ili pojačava ćelijski posredovan imunitet. U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava, promoviše ili pojačava urođeni imunitet posredovan ćelijama. U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava, promoviše ili pojačava adaptivni ćelijski posredovan imunitet. U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava, promoviše ili pojačava aktivnost T-ćelija. U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava, promoviše ili pojačava aktivnost citolitičkih T-ćelija (CTL). U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava, promoviše ili pojačava aktivnost NK ćelija. U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava, promoviše ili pojačava aktivnost ćelija ubica aktiviranih limfokinom (LAK). U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava, promoviše ili pojačava aktivnost limfocita koji infiltriraju tumor (TIF). U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo inhibira ili smanjuje aktivnost Treg ćelija. U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo inhibira ili smanjuje aktivnost MDSC. U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava, promoviše ili pojačava ubijanje tumorskih ćelija. U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava, promoviše ili pojačava inhibiciju rasta tumora.
[0222] U određenim slučajevima pronalaska, agens koji je ovde opisan je antagonist humanog TIGIT-a. U nekim slučajevima, agens je antagonist TIGIT-a i aktivira i/ili povećava imuni odgovor. U nekim slučajevima, agens je antagonist TIGIT-a i aktivira i/ili povećava aktivnost NK ćelija. U određenim slučajevima, agens povećava aktivnost za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% ili oko 100% . U nekim slučajevima, agens je antagonist TIGIT-a i aktivira i/ili povećava aktivnost T-ćelija (npr. citolitičku aktivnost T-ćelija). U određenim slučajevima, agens povećava aktivnost za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% ili oko 100% . U nekim slučajevima, agens je antagonist TIGIT-a i indukuje i/ili pojačava imuni odgovor Th1 tipa. Generalno, imuni odgovor tipa Th1 uključuje proizvodnju interferona-gama (IFN-g), IL-2 i faktora tumorske nekroze-beta (TNF-b). Za poređenje, imuni odgovor tipa Th2 generalno uključuje proizvodnju IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 i IL-13. U nekim slučajevima, agens je antagonist TIGIT-a i indukuje i/ili povećava proizvodnju citokina ili limfokina. U nekim slučajevima, indukcija i/ili povećanje proizvodnje citokina ili limfokina može biti indirektan efekat.
[0223] U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava aktivaciju NK ćelija. U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava aktivaciju T-ćelija. U određenim izvođenjima, aktivacija NK ćelija i/ili T-ćelija pomoću antitela opisanog ovde rezultira povećanjem nivoa aktivacije NK ćelija i/ili T-ćelija od najmanje oko 10%, najmanje oko 25% najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%. U određenim izvođenjima, antitelo koje povećava aktivaciju NK ćelija je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim izvođenjima, antitelo koje povećava aktivaciju NK ćelija je antitelo 313M32.
[0224] U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo je antagonist regulatorne aktivnosti T-ćelija (Treg). U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo inhibira ili smanjuje aktivnost Tregs-a. U određenim izvođenjima, inhibicija aktivnosti Treg-a pomoću antitela opisanog ovde rezultira inhibicijom supresivne aktivnosti Treg ćelije od najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75% , najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, ili oko 100%. U određenim izvođenjima, antitelo koje inhibira Treg aktivnost je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim izvođenjima, antitelo koje inhibira Treg aktivnost je antitelo 313M32.
[0225] U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo je antagonist MDSC supresorskih ćelija dobijenih iz mijeloida). U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo inhibira MDSC aktivnost. U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo inhibira MDSC aktivnost za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% ili oko 100%. U određenim izvođenjima, antitelo koje inhibira aktivnost MDSC je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim izvođenjima, antitelo koje inhibira aktivnost MDSC je antitelo 313M32.
[0226] U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava aktivnost prirodnih ćelija ubica (NK). U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava aktivnost NK ćelija za najmanje oko 10%, najmanje za oko 20%, najmanje za oko 30%, najmanje za oko 50%, najmanje za oko 75%, najmanje za oko 90%, ili oko 100%. U određenim izvođenjima, antitelo koje povećava aktivnost NK ćelija je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim izvođenjima, antitelo koje povećava aktivnost NK ćelija je antitelo 313M32.
[0227] U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava aktivnost limfocita koji infiltriraju tumor (TIL). U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava aktivnost TIL za najmanje 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% ili oko 100%. U određenim izvođenjima, antitelo koje povećava aktivnost TIL ćelija je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim izvođenjima, antitelo koje povećava aktivnost TIL ćelija je antitelo 313M32.
[0228] U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava ili pojačava aktivnost ćelija ubica aktiviranih limfokinima (LAK). U određenim izvođenjima, ovde opisano antitelo povećava aktivnost LAK-a za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 50%, najmanje oko 75%, najmanje oko 90% ili oko 100%. U određenim izvođenjima, antitelo koje povećava aktivnost LAK ćelija je antitelo 313M26 ili antitelo 313M32. U određenim izvođenjima, antitelo koje povećava aktivnost LAK ćelija je antitelo 313M32.
[0229] In vivo i in vitro testovi za određivanje da li ovde opisano antitelo modulira imuni odgovor su poznati u struci ili se razvijaju. U nekim izvođenjima, može se koristiti funkcionalni test koji detektuje aktivaciju T-ćelija. U nekim izvođenjima, može se koristiti funkcionalni test koji detektuje proliferaciju T-ćelija. U nekim izvođenjima, može se koristiti funkcionalni test koji detektuje NK aktivnost. U nekim izvođenjima, može se koristiti funkcionalni test koji detektuje aktivnost CTL. U nekim izvođenjima, može se koristiti funkcionalni test koji detektuje Treg aktivnost. U nekim izvođenjima, može se koristiti funkcionalni test koji detektuje MDSC aktivnost. U nekim izvođenjima, može se koristiti funkcionalni test koji detektuje proizvodnju citokina ili limfokina ili ćelije koje proizvode citokine ili limfokine. U nekim izvođenjima, ELISpot test se koristi za merenje frekvencije T-ćelija specifične za antigen. U nekim izvođenjima, ELISpot test se koristi za merenje oslobađanja/proizvodnje citokina i/ili se koristi za merenje broja ćelija koje proizvode citokine. U nekim izvođenjima, testovi citokina se koriste za identifikaciju odgovora tipa Th1. U nekim izvođenjima, testovi citokina se koriste za identifikaciju odgovora tipa Th2. U nekim izvođenjima, testovi citokina se koriste za identifikaciju odgovora tipa Th17. U nekim izvođenjima, FACS analiza se koristi za merenje markera aktivacije na imunim ćelijama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, T-ćelije, B-ćelije, NK ćelije, makrofage i/ili mijeloidne ćelije.
[0230] U određenim izvođenjima, ovde opisana antitela imaju protočni cirkulišući kod miševa, pacova, cinomolgus majmuna ili ljudi od najmanje oko 2 sata, najmanje oko 5 sati, najmanje oko 10 sati, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 3 dana, najmanje oko 1 nedelje, ili najmanje oko 2 nedelje. U određenim izvođenjima, antitelo je IgG (npr. IgG1, IgG2 ili IgG4) antitelo koje ima cirkulišući poluživot kod miševa, cinomolgus majmuna ili ljudi od najmanje oko 2 sata, najmanje oko 5 sati, najmanje oko 10 sati, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 3 dana, najmanje oko jedne nedelje, ili najmanje oko dve nedelje. U određenim izvođenjima, antitelo je IgG (npr. IgG1, IgG2 ili IgG4) antitelo koje ima cirkulišući poluživot kod miševa, cinomolgus majmuna ili ljudi od najmanje oko 2 sata, najmanje oko 5 sati, najmanje oko 10 sati, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 3 dana, najmanje oko jedne nedelje, ili najmanje oko dve nedelje. Postupci povećanja (ili smanjenja) poluživota agenasa kao što su polipeptidi i antitela su poznati u struci. Na primer, poznate metode povećanja cirkulišućeg poluživota IgG antitela uključuju uvođenje mutacija u Fc region koje povećavaju pH-zavisno vezivanje antitela za neonatalni Fc receptor (FcRn) na pH 6,0. Poznate metode za povećanje cirkulišućeg poluživota fragmenata antitela kojima nedostaje Fc region uključuju takve tehnike kao što je PEGilacija.
[0231] U nekim slučajevima pronalaska, TIGIT-vezujući agensi su polipeptidi. U nekim slučajevima, polipeptidi su rekombinantni polipeptidi, prirodni polipeptidi ili sintetički polipeptidi koji sadrže antitelo, ili njegov fragment, koji vezuje TIGIT. U struci je poznato da se neke sekvence aminokiselina iz ovog pronalaska mogu menjati bez značajnog uticaja na strukturu ili funkciju proteina. Stoga, pronalazak dalje uključuje varijacije polipeptida koji pokazuju značajnu aktivnost ili koji uključuju regione antitela, ili njegov fragment, koji vezuje TIGIT. U nekim slučajevima, varijacije sekvence aminokiselina polipeptida koji se vezuju za TIGIT uključuju delecije, insercije, inverzije, ponavljanja i/ili druge vrste supstitucija.
[0232] Polipeptidi, njihovi analozi i varijante, mogu se dalje modifikovati da sadrže dodatne hemijske delove koji inače nisu deo polipeptida. Derivatizovani delovi mogu poboljšati ili na drugi način modulirati rastvorljivost, biološki poluživot i/ili apsorpciju polipeptida. Komponente takođe mogu smanjiti ili eliminisati neželjene sporedne efekte polipeptida i varijanti. Pregled hemijskih delova može se naći u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22st Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.
[0233] U određenim slučajevima, polipeptidi opisani ovde su izolovani. U određenim slučajevima, polipeptidi opisani ovde su suštinski čisti.
[0234] Ovde opisani polipeptidi mogu se proizvesti bilo kojim pogodnim metodom poznatoj u struci. Takve metode se kreću od metoda direktne sinteze proteina do konstruisanja sekvence DNK koja kodira polipeptidne sekvence i ekspresije tih sekvenci u odgovarajućem domaćinu. U nekim slučajevima, DNK sekvenca se konstruiše korišćenjem rekombinantne tehnologije izolovanjem ili sintezom DNK sekvence koja kodira protein divljeg tipa od interesa. Opciono, sekvenca se
4
može mutagenizovati mutagenezom specifičnom za mesto da bi se dobili njeni funkcionalni analozi.
[0235] U nekim slučajevima, DNK sekvenca koja kodira polipeptid od interesa može biti konstruisana hemijskom sintezom korišćenjem oligonukleotidnog sintisajzera. Oligonukleotidi se mogu dizajnirati na osnovu sekvence aminokiselina željenog polipeptida i odabira onih kodona koji su favorizovani u ćeliji domaćina u kojoj će se proizvoditi rekombinantni polipeptid od interesa. Standardne metode se mogu primeniti da se sintetiše polinukleotidna sekvenca koja kodira izolovani polipeptid od interesa. Na primer, kompletna aminokiselinska sekvenca može da se koristi za konstruisanje zadnjeg-translatovanog gena. Dalje, može se sintetizovati DNK oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira određeni izolovani polipeptid. Na primer, nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida mogu da se sintetišu i zatim ligiraju. Pojedinačni oligonukleotidi obično sadrže 5’ ili 3’ prepusti za komplementarno sklapanje.
[0236] Jednom sastavljene (sintezom, mutagenezom usmerenom na mesto ili drugim metodom), polinukleotidne sekvence koje kodiraju određeni polipeptid od interesa mogu se ubaciti u vektor ekspresije i operativno povezati sa sekvencom za kontrolu ekspresije koja je odgovarajuća za ekspresiju proteina u željenom domaćinu. Pravilno sastavljanje se može potvrditi sekvenciranjem nukleotida, mapiranjem restrikcionih enzima i/ili ekspresijom biološki aktivnog polipeptida u odgovarajućem domaćinu. Kao što je dobro poznato u struci, da bi se postigli visoki nivoi ekspresije transficiranog gena u domaćinu, gen mora biti operativno povezan sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama ekspresije koje su funkcionalne u izabranom domaćinu ekspresije.
[0237] U određenim slučajevima, rekombinantni ekspresioni vektori se koriste za amplifikaciju i ekspresiju antitela koja kodiraju DNK, ili njihove fragmenate, protiv humanog TIGIT-a. Na primer, rekombinantni ekspresioni vektori mogu biti replicirani DNK konstrukti koji imaju sintetičke ili cDNK fragmente izvedene iz DNK koji kodiraju polipeptidni lanac TIGIT-vezujućeg agensa, kao što je anti-TIGIT antitelo, ili njegov fragment, operativno povezan sa pogodnim transkripcionim i/ili ili translacionim regulatornim elementom izvedenim iz gena sisara, mikroba, virusa ili insekata. Transkripciona jedinica generalno obuhvata sklop (1) genetskog elementa ili elemenata koji imaju regulatornu ulogu u ekspresiji gena, na primer, promotera ili pojačivača transkripcije, (2) strukturne ili kodirajuće sekvence koja se transkribuje u mRNA i translatuje u protein, i (3) odgovarajuće sekvence inicijacije i terminacije transkripcije i translacije. Regulatorni elementi mogu uključiti sekvencu operatora za kontrolu transkripcije. Sposobnost replikacije u domaćinu, koja se obično daje poreklom replikacije, i selekcioni gen koji olakšava prepoznavanje transformanata mogu se dodatno uključiti. DNK regioni su „operativno povezani“ kada su funkcionalno povezani jedni sa drugima. Na primer, DNK za signalni peptid (vodeći sekretorni polipetid) je operativno povezan sa DNK za polipeptid ako je eksprimiran kao prekursor koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter je operativno vezan za kodirajuću sekvencu ako kontroliše transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da dozvoljava translaciju. U nekim izvođenjima, strukturni elementi namenjeni za upotrebu u ekspresionim sistemima kvasca uključuju vodeću sekvencu koja omogućava ekstracelularnu sekreciju prevedenog proteina od strane ćelije domaćina. U drugim izvođenjima, u situacijama gde je rekombinantni protein eksprimiran bez vodeće ili transportne sekvence, on može uključivati N-terminalni metionin ostatak. Ovaj ostatak može opciono da se naknadno odcepi od eksprimiranog rekombinantnog proteina da bi se dobio konačni proizvod.
[0238] Izbor sekvence za kontrolu ekspresije i vektora ekspresije zavisi od izbora domaćina. Može se koristiti širok spektar kombinacija domaćin/vektor ekspresije. Korisni ekspresioni vektori za eukariotske domaćine uključuju, na primer, vektore koji sadrže sekvence kontrole ekspresije iz SV40, goveđeg papiloma virusa, adenovirusa i citomegalovirusa. Korisni ekspresioni vektori za bakterijske domaćine uključuju poznate bakterijske plazmide, kao što su plazmidi iz E. coli, uključujući pCR1, pBR322, pMB9 i njihove derivate, i plazmide šireg spektra domaćina, kao što su M13 i druge filamentozne jednolančane DNK fage.
[0239] Antitela ili bispecifični agensi predstavljenog pronalaska mogu biti eksprimirani iz jednog ili više vektora. Na primer, u nekim izvođenjima, jedan polipeptid teškog lanca je eksprimiran jednim vektorom, drugi polipeptid teškog lanca je eksprimiran drugim vektorom, a polipeptid lakog lanca je eksprimiran trećim vektorom. U nekim izvođenjima, prvi polipeptid teškog lanca i polipeptid lakog lanca se eksprimuje pomoću jednog vektora, a drugi polipeptid teškog lanca se eksprimuje pomoću drugog vektora. U nekim izvođenjima, dva polipeptida teškog lanca se eksprimiraju pomoću jednog vektora, a polipeptid lakog lanca se eksprimuje pomoću drugog vektora. U nekim izvođenjima, tri polipeptida se eksprimiraju iz jednog vektora. Prema tome, u nekim izvođenjima, prvi polipeptid teškog lanca, drugi polipeptid teškog lanca i polipeptid lakog lanca su eksprimirani pomoću jednog vektora.
[0240] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju antitela ili bispecifičnog agensa uključuju prokariote, ćelije kvasca, ćelije insekata ili više eukariotske ćelije pod kontrolom odgovarajućih promotera. Prokarioti uključuju gram-negativne ili grampozitivne organizme, na primer E. coli ili Bacillus. Više eukariotske ćelije uključuju uspostavljene ćelijske linije sisarskog porekla kao što je opisano u nastavku. Mogu se koristiti i translacioni sistemi bez ćelija. Odgovarajući vektori za kloniranje i ekspresiju za upotrebu sa ćelijskim domaćinima bakterija, gljivica, kvasaca i sisara, kao i metode proizvodnje proteina, uključujući proizvodnju antitela, dobro su poznati u struci.
[0241] Za ekspresiju rekombinantnih polipeptida mogu se koristiti različiti sistemi kulture sisara. Ekspresija rekombinantnih proteina u ćelijama sisara može biti poželjna jer su ovi proteini generalno pravilno presavijeni, na odgovarajući način modifikovani i biološki funkcionalni. Primeri pogodnih ćelijskih linija domaćina sisara uključuju, ali nisu ograničeni na, COS7 (izveden iz bubrega majmuna), L-929 (izveden iz fibroblasta miša), C127 (izveden iz tumora mišjih mlečnih žlezda), 3T3 (izveden iz fibroblasta miša), CHO (izveden iz jajnika kineskog hrčka), HeLa (izveden iz raka grlića materice kod ljudi), BHK (izveden iz fibroblasta bubrega hrčka), HEK-293 (izveden iz bubrega ljudskog embriona) i njihove varijante. Ekspresioni vektori kod sisara mogu sadržati netranskribovane elemente kao što su poreklo replikacije, odgovarajući promoter i pojačivač povezan sa genom koji se ekspresuje, i druge 5' ili 3' bočne ne-transkribovane sekvence, i 5' ili 3' ne-translatovane sekvence, kao što su neophodna mesta vezivanja ribozoma, mesto poliadenilacije, mesta donora i akceptora i sekvence za završetak transkripcije.
[0242] Ekspresija rekombinantnih proteina u sistemima kulture ćelija insekata (npr. bakulovirus) takođe nudi robustan postupak za proizvodnju pravilno presavijenih i biološki funkcionalnih proteina. Bakulovirusni sistemi za proizvodnju heterolognih proteina u ćelijama insekata su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti.
[0243] Dakle, ovaj pronalazak obezbeđuje ćelije koje sadrže antitela ili bispecifične agense koji su ovde opisani. U određenim izvođenjima, ćelije proizvode antitelo 313R20. U određenim izvođenjima, ćelije proizvode antitelo 313M26. U određenim izvođenjima, ćelije proizvode antitelo 313M32. U nekim izvođenjima, ćelija je hibridomska ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija je ćelija sisara. U nekim izvođenjima, ćelija je prokariotska ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija je eukariotska ćelija.
[0244] Proteini proizvedeni od transformisanog domaćina mogu se prečistiti prema bilo kom pogodnom postupku. Standardne metode obuhvataju hromatografiju (npr. jonoizmenjivačku, afinitetnu i ekskluzionu hromatografiju), centrifugiranje, diferencijalnu rastvorljivost ili bilo koju drugu standardnu tehniku za prečišćavanje proteina. Oznake afiniteta kao što su heksa-histidin, domen za vezivanje maltoze, sekvenca omotača gripa i glutation-S-transferaza mogu biti vezani za protein da bi se omogućilo lakše prečišćavanje prolaskom kroz odgovarajuće afinitetne kolone. Afinitetna hromatografija koja se koristi za prečišćavanje imunoglobulina može uključivati hromatografiju proteina A, proteina G i proteina L. Izolovani proteini se mogu fizički okarakterisati korišćenjem tehnika kao što su proteoliza, ekskluziona hromatografija (SEC), masena spektrometrija (MS), nuklearna magnetna rezonanca (NMR), izoelektrično fokusiranje (IEF), tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) i rendgenska strukturna analiza. Čistoća izolovanih proteina se može odrediti korišćenjem tehnika poznatih stručnjacima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, SDS-PAGE, SEC, kapilarnu gel elektroforezu, IEF i kapilarno izoelektrično fokusiranje (cIEF).
[0245] U nekim izvođenjima, supernatanti iz ekspresionih sistema koji luče rekombinantni protein u medijum za kulturu mogu se prvo koncentrisati korišćenjem komercijalno dostupnog filtera koncentracije proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltracione jedinice. Nakon koraka koncentrovanja, koncentrat se može naneti na odgovarajući matriks za prečišćavanje. U nekim izvođenjima, anjonska izmenjivačka smola se može upotrebiti, na primer, matriks ili supstrat koji ima bolne dietilaminoetil (DEAE) grupe. Matriks može biti akrilamid, agaroza, dekstran, celuloza ili druge vrste koje se obično koriste u prečišćavanju proteina. U nekim izvođenjima, može se primeniti korak izmene katjona. Pogodni katjonski izmenjivači uključuju različite nerastvorljive matrikse koje sadrže sulfopropil ili karboksimetil grupe. U nekim izvođenjima, hidroksiapatitni medijum se može koristiti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, keramički hidroksiapatit (CHT). U određenim izvođenjima, jedan ili više koraka HPLC sa reverznim fazama koji koriste hidrofobni RP-HPLC medijum, npr., silika gel koji ima bočne metil ili druge alifatične grupe, mogu se koristiti za dalje prečišćavanje rekombinantnog proteina (npr. TIGIT-vezujući agens). Neki ili svi prethodni koraci prečišćavanja, u različitim kombinacijama, mogu se koristiti da bi se obezbedio homogeni rekombinantni protein.
[0246] U nekim izvođenjima, heterodimerni proteini kao što su bispecifična antitela se prečišćavaju prema bilo kom od ovde opisanih postupaka. U nekim izvođenjima, anti-TIGIT bispecifična antitela se izoluju i/ili prečiste korišćenjem najmanje jednog koraka hromatografije. U nekim izvođenjima, najmanje jedan korak hromatografije obuhvata afinitetnu hromatografiju. U nekim izvođenjima, najmanje jedan korak hromatografije dalje obuhvata hromatografiju izmene anjona. U nekim izvođenjima, izolovani i/ili prečišćeni proizvod antitela sadrži najmanje 90% heterodimernih antitela. U nekim izvođenjima, izolovani i/ili prečišćeni proizvod antitela sadrži najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% heterodimernih antitela. U nekim izvođenjima, izolovani i/ili prečišćeni proizvod antitela sadrži oko 100% heterodimernih antitela.
[0247] U nekim izvođenjima, polipeptid proizveden u bakterijskoj kulturi može biti izolovan, na primer, inicijalnom ekstrakcijom iz ćelijskih peleta, nakon čega sledi jedan ili više koraka koncentrovanja, isoljavanja, vodene jonske razmene ili ekskluziona hromatografije. HPLC se može koristiti za završne korake prečišćavanja. Mikrobne ćelije koje se koriste u ekspresiji rekombinantnog proteina mogu se poremetiti bilo kojim pogodnom metodom, uključujući ciklus zamrzavanja-odmrzavanja, sonikaciju, mehaničko oštećenje ili upotrebu agenasa za lizu ćelija.
[0248] U određenim slučajevima pronalaska, TIGIT-vezujući agens je polipeptid koji nije antitelo ili ne sadrži Fc region imunoglobulina. Različiti postupci za identifikaciju i proizvodnju polipeptida bez antitela koji se vezuju sa visokim afinitetom za proteinsku metu su poznati u struci. U određenim slučajevima, tehnologija prikaza faga ili ćelija sisara može se koristiti za proizvodnju i/ili identifikaciju TIGIT-vezujućeg polipeptida. U određenim slučajevima, polipeptid sadrži proteinski nosač tipa izabranog iz grupe koju čine protein A, protein G, lipokalin, fibronektin domen, domen ankirinskog ponavljanja i tioredoksin. Različiti postupci za identifikaciju i proizvodnju polipeptida bez antitela koji se vezuju sa visokim afinitetom za proteinsku metu su poznati u tehnici. U određenim slučajevima, tehnologija prikaza faga može se koristiti za proizvodnju i/ili identifikaciju vezujućeg polipeptida. U određenim slučajevima, tehnologija prikaza ćelija sisara može da se koristi za proizvodnju i/ili identifikaciju vezujućeg polipeptida.
[0249] Dalje može biti poželjno modifikovati polipeptid da bi se povećao (ili smanjio) njegov poluživot u serumu. Ovo se može postići, na primer, inkorporacijom epitopa koji se vezuje za spaseni receptor u polipeptid mutacijom odgovarajućeg regiona u polipeptidu ili inkorporacijom epitopa u peptidnu oznaku koja je zatim fuzionisana sa polipeptidom na bilo kom kraju ili u srednji (npr. sintezom DNK ili peptida).
[0250] Heterokonjugatni molekuli su takođe u okviru ovog pronalaska. Heterokonjugatni molekuli se sastoje od dva kovalentno spojena polipeptida. Takvi molekuli su, na primer, predloženi da ciljaju imune ćelije na neželjene ćelije, kao što su tumorske ćelije. Takođe se smatra da se molekuli heterokonjugata mogu pripremiti in vitro korišćenjem poznatih metoda u hemiji sintetičkih proteina, uključujući one koji uključuju sredstva za umrežavanje. Na primer, imunotoksini se mogu konstruisati upotrebom reakcije razmene disulfida ili formiranjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagenasa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat.
[0251] U određenim slučajevima, TIGIT-vezujući agensi se mogu koristiti u bilo kom od brojnih konjugovanih (tj. imunokonjugat ili radiokonjugat) ili nekonjugovanih oblika. U određenim slučajevima, agensi se mogu koristiti u nekonjugovanom obliku da bi se iskoristili prirodni odbrambeni mehanizmi subjekta, uključujući citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) i ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) za eliminaciju malignih ćelija ili ćelija raka.
[0252] U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je konjugovan sa citotoksičnim agensom. U nekim slučajevima, TIGIT-vezujući agens je antitelo koje je konjugovano sa citotoksičnim agensom kao ADC (konjugat antitelo-lek). U nekim slučajevima, citotoksični agens je hemoterapeutski agens, uključujući, ali ne ograničavajući se na, metotreksat, adriamicin/doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin, pirolobenzodiazepine (PBD) ili druge interkalacijske agense. U nekim slučajevima, citotoksični agens je enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla ili njegovi fragmenti, uključujući, ali ne ograničavajući se na, lanac difterije A, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, lanac egzotoksina A , lanac ricina A, lanac abrina A, lanac modecina A, alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, proteini diantina, proteini Phitolaca americana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trihoteceni. U nekim slučajevima, citotoksični agens je radioizotop za proizvodnju radiokonjugata ili radiokonjugovanog antitela. Dostupni su različiti radionuklidi za proizvodnju radiokonjugovanih antitela, uključujući, ali ne ograničavajući se na,<90>Y,<125>I,<131>I,<123>I,<111>In,<131>In,<105>Rh,<153>Sm,<67>CU,<67>Ga,<166>Ho,<177>Lu,<186>Re,<188>Re,<212>Bi. Takođe se mogu koristiti konjugati antitela i jednog ili više toksina malih molekula, kao što su kaliheamicini, majtansinoidi, trihoteni i CC1065, kao i derivati ovih toksina koji imaju toksičnu aktivnost. Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu se napraviti korišćenjem različitih bifunkcionalnih agenasa za spajanje proteina kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piriditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bisdiazonijuma (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil) -etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat) i bisaktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen).
III. Polinukleotidi
[0253] U određenim izvođenjima, pronalazak obuhvata polinukleotide koji sadrže polinukleotide koji kodiraju ovde opisana antitela ili bispecifične agense. Izraz "polinukleotidi koji kodiraju polipeptid" obuhvata polinukleotid koji uključuje samo kodirajuće sekvence za polipeptid, kao i polinukleotid koji uključuje dodatne kodirajuće i/ili nekodirajuće sekvence. Polinukleotidi pronalaska mogu biti u RNK obliku ili u obliku DNK. DNK uključuje cDNK, genomsku DNK i sintetičku DNK; i može biti dvolančana ili jednolančana, i ako jednolančana može biti kodirajući ili nekodirajući (anti-sense) lanac.
[0254] U određenim slučajevima pronalaska, polinukleotid sadrži polinukleotid (npr. nukleotidnu sekvencu) koji kodira polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 18, SEK ID BR: 19, SEK ID BR:20, SEK ID BR:21, SEK ID BR:22, SEK ID BR:23, SEK ID BR:24, SEK ID BR:25, SEK ID BR:26, SEK ID BR:27, SEK ID BR:28, SEK ID BR:29, SEK ID BR:30, SEK ID BR:32, SEK ID BR:33, SEK ID BR:34, SEK ID BR:55 i SEK ID BR:56.
[0255] U određenim slučajevima, polinukleotid sadrži polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu najmanje oko 80% identičnu, najmanje oko 85% identičnu, najmanje oko 90% identičnu, najmanje oko 95% identičnu, a u nekim slučajevima, najmanje oko 96 %, 97%, 98% ili 99% identičanu polinukleotidu koji kodira sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 18, SEK ID BR: 19, SEK ID BR: 20, SEK ID BR:21, SEK ID BR:22, SEK ID BR:23, SEK ID BR:24, SEK ID BR:25, SEK ID BR:26, SEK ID BR:27, SEK ID BR:28, SEK ID BR:29, SEK ID BR:30, SEK ID BR:32, SEK ID BR:33, SEK ID BR:34, SEK ID BR:55 i SEK ID BR:56. Takođe je obezbeđen polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji se hibridizuje sa polinukleotidom koji kodira sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR: 17, SEK ID BR: 18, SEK ID BR: 19, SEK ID BR: 20, SEK ID BR:21, SEK ID BR:22, SEK ID BR:23, SEK ID BR:24, SEK ID BR:25, SEK ID BR:26, SEK ID BR:27, SEK ID BR:28, SEK ID BR:29, SEK ID BR:30, SEK ID BR:32, SEK ID BR:33, SEK ID BR:34, SEK ID BR:55 i SEK ID BR:56. U određenim slučajevima, hibridizacija je pod veoma strogim uslovima. Veoma strogi uslovi poznati su stručnjacima i mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, (1) korišćenje niske jonske snage i visoke temperature za ispiranje, na primer 15 mM natrijum hlorida/1,5 mM natrijum citrata (1x SSC) sa 0,1% natrijum dodecil sulfatom na 50°C; (2) korišćenje sredstva za denaturaciju tokom hibridizacije, kao što je formamid, na primer, 50% (v/v) formamid sa 0,1% goveđeg serumskog albumina/0,1% Ficoll/0,1% polivinilpirolidona/50 mM natrijum fosfatnog pufera na pH 6,5 u 5x SSC (0,75M NaCl, 75mM natrijum citrat) na 42°C; ili (3) korišćenje 50% formamida, 5x SSC, 50mM natrijum fosfata (pH 6,8), 0,1% natrijum pirofosfata, 5k Denhardtovog rastvora, sonifikovane DNK sperme lososa (50µg/ml), 0,1% SDS i 10% dekstran sulfata na 42°C, sa ispiranjem sa 0,2x SSC koji sadrži 50% formamida na 55° C, nakon čega sledi ispiranje u veoma strogim uslovima koje se sastoji od 0,1x SSC koji sadrži EDTA na 55°C.
[0256] U određenim slučajevima, polinukleotid sadrži polinukleotid koji kodira polipeptid koji sadrži sekvencu aminokiselina izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR: 63, SEK ID BR: 64, SEK ID BR: 67, SEK ID BR: 68 , SEK ID BR:69, SEK ID BR:70, SEK ID BR:71, SEK ID BR:72, SEK ID BR:82 i SEK ID BR:83.
[0257] U određenim slučajevima, polinukleotid sadrži polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu najmanje oko 80% identičnu, najmanje oko 85% identičnu, najmanje oko 90% identičnu, najmanje oko 95% identičnu, a u nekim slučajevima, najmanje oko 96 %, 97%, 98% ili 99% identičnu polinukleotidu koji kodira aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR:63, SEK ID BR:64, SEK ID BR:67, SEK ID BR:68, SEK ID BR:69, SEK ID BR:70, SEK ID BR:71, SEK ID BR:72, SEK ID BR:82 i SEK ID BR:83. Takođe je obezbeđen polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji se hibridizuje sa polinukleotidom koji kodira aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR: 63, SEK ID BR: 64, SEK ID BR: 67, SEK ID BR: 68, SEK ID BR:69, SEK ID BR:70, SEK ID BR:71, SEK ID BR:72, SEK ID BR:82 i SEK ID BR:83.
[0258] U nekim slučajevima, polinukleotid sadrži polinukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine: SEK ID BR:65, SEK ID BR:66, SEK ID BR:73, SEK ID BR:74, SEK ID BR:75, SEK ID BR: :76 i SEK ID BR:84. U određenim slučajevima, polinukleotid sadrži polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu najmanje oko 80% identičnu, najmanje oko 85% identičnu, najmanje oko 90% identičnu, najmanje oko 95% identičnu, a u nekim slučajevima, najmanje oko 96 %, 97%, 98% ili 99% identičnu nukleotidnoj sekvenci izabranoj iz grupe koju čine: SEK ID BR: 65, SEK ID BR: 66, SEK ID BR: 73, SEK ID BR: 74, SEK ID BR: 75, SEK ID BR:76 i SEK ID BR:84. Takođe je obezbeđen polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji se hibridizuje sa polinukleotidnom sekvencom izabranom iz grupe koju čine: SEK ID BR: 65, SEK ID BR: 66, SEK ID BR: 73, SEK ID BR: 74, SEK ID BR: 75, SEK ID BR:76 i SEK ID BR:84. U određenim slučajevima, tehnike hibridizacije se sprovode veoma strogim uslovima kao što je gore opisano.
[0259] U određenim slučajevima, polinukleotid sadrži kodirajuću sekvencu za zreli polipeptid fuzionisan u istom okviru čitanja sa polinukleotidom koji pomaže, na primer, u ekspresiji i sekreciji polipeptida iz ćelije domaćina (npr. vodeća sekvenca koja funkcioniše kao sekretorna sekvenca za kontrolu transporta polipeptida iz ćelije). Polipeptid koji ima vodeću sekvencu je pre-protein i može imati vodeću sekvencu koju cepa ćeliju domaćina da bi se formirao zreli oblik polipeptida. Polinukleotidi takođe mogu da kodiraju pro-protein koji je zreli protein plus dodatni ostaci 5' aminokiselina. Zreli protein koji ima pro-sekvencu je pro-protein i neaktivan je oblik proteina. Kada se pros-ekvenca odcepi, ostaje aktivni zreli protein.
[0260] U određenim slučajevima, polinukleotid sadrži kodirajuću sekvencu za zreli polipeptid fuzionisan u istom okviru čitanja sa sekvencom markera koja omogućava, na primer, prečišćavanje kodiranog polipeptida. Na primer, sekvenca markera može biti heksa-histidinska oznaka koju obezbeđuje pKE-9 vektor da bi se obezbedilo prečišćavanje zrelog polipeptida fuzionisanog sa markerom u slučaju bakterijskog domaćina, ili sekvenca markera može biti hemaglutinin (HA) oznaka izvedena iz proteina hemaglutinina gripa kada se koristi domaćin sisar (npr. ćelije COS-7). U nekim slučajevima, sekvenca markera je FLAG-oznaka, peptid sekvence DYKDDDDK (SEK ID BR:40) koji se može koristiti u kombinaciji sa drugim oznakama afiniteta.
[0261] Ovaj pronalzak se dalje odnosi na varijante polinukleotida opisanih ovde, pri čemu varijanta kodira, na primer, fragmente, analoge i/ili derivate.
[0262] U određenim slučajevima, ovaj pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji sadrži polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu najmanje oko 80% identičnu, najmanje oko 85% identičnu, najmanje oko 90% identičnu, najmanje oko 95% identičnu, i u neki primeri, najmanje oko 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu polinukleotidu koji kodira polipeptid koji sadrži TIGIT-vezujući agens koji je ovde opisan.
[0263] Kako se ovde koristi, termin polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu najmanje, na primer, 95% "identičnu" referentnoj nukleotidnoj sekvenci treba da znači da je nukleotidna sekvenca polinukleotida identična referentnoj sekvenci osim što je polinukleotidna sekvenca može uključiti do pet tačkastih mutacija na svakih 100 nukleotida referentne nukleotidne sekvence. Drugim rečima, da bi se dobio polinukleotid koji ima nukleotidnu sekvencu najmanje 95% identičnu referentnoj nukleotidnoj sekvenci, do 5% nukleotida u referentnoj sekvenci može biti izbrisano ili zamenjeno drugim nukleotidom, ili broj nukleotida do 5% ukupnih nukleotida u referentnoj sekvenci može se ubaciti u referentnu sekvencu. Ove mutacije referentne sekvence mogu se javiti na 5’ ili 3’ terminalnim pozicijama referentne nukleotidne sekvence ili bilo gde između tih terminalnih pozicija, isprepleteni ili pojedinačno između nukleotida u referentnoj sekvenci ili u jednoj ili više susednih grupa unutar referentne sekvence.
[0264] Varijante polinukleotida mogu sadržati promene u kodirajućim regionima, nekodirajućim regionima ili oba regiona. U nekim izvođenjima, polinukleotidna varijanta sadrži izmene koje proizvode tihe supstitucije, dodavanja ili brisanja, ali ne menjaju svojstva ili aktivnosti kodiranog polipeptida. U nekim izvođenjima, polinukleotidna varijanta sadrži tihe supstitucije koje ne rezultiraju promenom sekvence aminokiselina polipeptida (zbog degeneracije genetskog koda). Varijante polinukleotida se mogu proizvesti iz različitih razloga, na primer, da bi se optimizovala ekspresija kodona za određenog domaćina (tj., promeniti kodone u humanoj mRNK u one koje preferira bakterijski domaćin kao što je E. coli). U nekim izvođenjima, polinukleotidna varijanta sadrži najmanje jednu tihu mutaciju u nekodirajućem ili kodirajućem regionu sekvence.
[0265] U nekim slučajevima, varijanta polinukleotida se proizvodi da modulira ili menja ekspresiju (ili nivoe ekspresije) kodiranog polipeptida. U nekim slučajevima, varijanta polinukleotida se proizvodi da bi se povećala ekspresija kodiranog polipeptida. U nekim slučajevima, varijanta polinukleotida se proizvodi da bi se smanjila ekspresija kodiranog polipeptida. U nekim slučajevima, polinukleotidna varijanta ima povećanu ekspresiju kodiranog polipeptida u poređenju sa roditeljskom polinukleotidnom sekvencom. U nekim slučajevima, polinukleotidna varijanta ima smanjenu ekspresiju kodiranog polipeptida u poređenju sa roditeljskom polinukleotidnom sekvencom.
[0266] U nekim slučajevima, proizvodi se najmanje jedna polinukleotidna varijanta (bez promene sekvence aminokiselina kodiranog polipeptida) da bi se povećala proizvodnja heterodimernog molekula. U nekim slučajevima, proizvodi se najmanje jedna polinukleotidna varijanta (bez promene sekvence aminokiselina kodiranog polipeptida) da bi se povećala proizvodnja bispecifičnog antitela.
[0267] U određenim izvođenjima pronalaska, polinukleotidi su izolovani. U određenim izvođenjima, polinukleotidi su suštinski čisti.
[0268] Vektori i ćelije koje sadrže polinukleotide opisane ovde su takođe obezbeđeni. U nekim izvođenjima, ekspresioni vektor sadrži polinukleotidni molekul. U nekim izvođenjima, ćelija domaćin sadrži vektor ekspresije koji sadrži polinukleotidni molekul. U nekim izvođenjima, ćelija domaćina sadrži polinukleotidni molekul.
IV. Načini upotrebe i farmaceutske kompozicije
[0269] Antitela i bispecifični agensi pronalaska su korisni u različitim primenama, uključujući, ali ne ograničavajući se na, metode terapeutskog lečenja, kao što je lečenje raka. U nekim izvođenjima, metode terapeutskog lečenja obuhvataju imunoterapiju za rak. U određenim izvođenjima, ovde opisana antitela i bispecifični agensi su korisni za aktiviranje, promovisanje, povećanje i/ili poboljšanje imunog odgovora, inhibiciju rasta tumora, smanjenje zapremine tumora, povećanje apoptoze tumorskih ćelija i/ili smanjenje tumorigenosti tumora. U nekim izvođenjima, antitela i bispecifični agensi pronalaska su takođe korisni za imunoterapiju protiv patogena, kao što su virusi. U određenim izvođenjima, antitelo ili bispecifični agens koji je ovde opisan je koristan za aktiviranje, promovisanje, povećanje i/ili poboljšanje imunog odgovora, inhibiciju virusne infekcije, smanjenje virusne infekcije, povećanje apoptoze ćelija inficiranih virusom i/ili povećanje ubijanja ćelija zaraženih virusom. Metode upotrebe mogu biti in vitro, ex vivo ili in vivo metode.
[0270] Ovaj pronalazak obezbeđuje ovde opisana antitela i bispecifične agense za upotrebu u postupcima za aktiviranje imunog odgovora kod subjekta. U nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ovde opisana antitela i bispecifične agense za upotrebu u postupcima za promovisanje imunog odgovora kod subjekta. U nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ovde opisana antitela i bispecifične agense za upotrebu u postupcima za povećanje imunog odgovora kod subjekta. U nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje ovde opisana antitela i bispecifična sredstva za upotrebu u postupcima za poboljšanje imunog odgovora kod subjekta. U nekim izvođenjima, aktiviranje, promovisanje, povećanje i/ili poboljšanje imunog odgovora obuhvata povećanje imuniteta posredovanog ćelijama. U nekim izvođenjima, aktiviranje, promovisanje, povećanje i/ili poboljšanje imunog odgovora obuhvata povećanje aktivnosti Tćelija. U nekim izvođenjima, aktiviranje, promovisanje, povećanje i/ili poboljšanje imunog odgovora obuhvata povećanje aktivnosti CTL. U nekim izvođenjima, aktiviranje, promovisanje, povećanje i/ili poboljšanje imunog odgovora obuhvata povećanje aktivnosti NK ćelija. U nekim izvođenjima, aktiviranje, promovisanje, povećanje i/ili poboljšanje imunog odgovora obuhvata povećanje aktivnosti T-ćelija i povećanje aktivnosti NK ćelija. U nekim izvođenjima, aktiviranje, promovisanje, povećanje i/ili poboljšanje imunog odgovora obuhvata povećanje aktivnosti CTL i povećanje aktivnosti NK ćelija. U nekim izvođenjima, aktiviranje, promovisanje, povećanje i/ili poboljšanje imunog odgovora obuhvata inhibiciju ili smanjenje supresivne aktivnosti Tregova. U nekim izvođenjima, aktiviranje, promovisanje, povećanje i/ili poboljšanje imunog odgovora obuhvata inhibiciju ili smanjenje supresivne aktivnosti MDSC. U nekim izvođenjima, imuni odgovor je rezultat antigene stimulacije. U nekim izvođenjima, antigenska stimulacija je tumorska ćelija. U nekim izvođenjima, antigena stimulacija je rak. U nekim izvođenjima, antigenska stimulacija je patogen. U nekim izvođenjima, antigena stimulacija je virus. U nekim izvođenjima, antigenska stimulacija je ćelija inficirana virusom. U nekim izvođenjima bilo kog od ovde opisanih metoda, antitelo je 313M32.
[0271] U nekim izvođenjima, ovde opisana antitela i bispecifični agensi su za upotrebu u postupku povećanja imunog odgovora kod subjekta koji se sastoji od davanja subjektu. U nekim izvođenjima, postupak povećanja imunog odgovora kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela 313M32.
[0272] U nekim slučajevima pronalazak obezbeđuje upotrebu TIGIT-vezujućeg agensa koji je ovde opisan u proizvodnji ili pripremi leka za aktiviranje, promovisanje, povećanje i/ili poboljšanje imunog odgovora. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje upotrebu TIGIT-vezujućeg agensa opisanog ovde u proizvodnji ili pripremi leka za povećanje imuniteta posredovanog ćelijama. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje upotrebu TIGIT-vezujućeg agensa opisanog ovde u proizvodnji ili pripremi leka za povećanje aktivnosti T-ćelija. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje upotrebu TIGIT-vezujućeg agensa opisanog ovde u proizvodnji ili pripremi leka za povećanje aktivnosti CTL. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje upotrebu TIGIT-vezujućeg agensa opisanog ovde u proizvodnji ili pripremi leka za povećanje aktivnosti NK. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje upotrebu TIGIT-vezujućeg agensa opisanog ovde u proizvodnji ili pripremi leka za inhibiciju ili smanjenje supresivne aktivnosti Tregs-a. U nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje upotrebu agensa za vezivanje TIGIT koji je ovde opisan u proizvodnji ili pripremi leka za inhibiciju ili smanjenje supresivne aktivnosti MDSC.
[0273] Pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili bispecifične agense koji su ovde opisani za upotrebu u postupcima inhibicije i/ili redukcije TIGIT signalizacije u ćeliji. U nekim izvođenjima, postupak inhibicije i/ili smanjenja TIGIT signalizacije u ćeliji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije sa efikasnom količinom antitela 313M32. U određenim izvođenjima, ćelija je T-ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija je aktivirana T-ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija je NK ćelija. U nekim izvođenjima, ćelija je Treg. U nekim izvođenjima, ćelija je MDSC. U nekim izvođenjima, metoda je in vitro ili ex vivo metoda.
[0274] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili bispecifične agense koji su ovde opisani za upotrebu u postupcima za inhibiciju rasta tumora korišćenjem ovde opisanih antitela. U nekim izvođenjima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata korišćenje antitela 313M32. U određenim izvođenjima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata dovođenje u kontakt mešavine ćelija sa agensom koji vezuje TIGIT in vitro. Na primer, besmrtna ćelijska linija ili ćelijska linija raka pomešana sa imunim ćelijama (npr. T-ćelije ili NK ćelije) se kultiviše u medijumu kome je dodat test agens koji vezuje TIGIT. U nekim izvođenjima, ćelije tumora se izoluju iz uzorka pacijenta kao što je, na primer, biopsija tkiva, pleuralni izliv ili uzorak krvi, pomešane sa imunim ćelijama (npr. T-ćelije i/ili NK ćelije) i kultivišu u medijumu kome se dodaje test agens koji vezuje TIGIT. U nekim izvođenjima, antitelo ili bispecifično sredstvo povećava, promoviše i/ili pojačava aktivnost imunih ćelija. U nekim izvođenjima, antitelo ili bispecifično sredstvo inhibira rast tumorskih ćelija.
[0275] U nekim izvođenjima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata dovođenje u kontakt tumora ili tumorskih ćelija sa antitelom ili bispecifičnim agensom opisanim ovde in vivo. U određenim izvođenjima, kontakt tumora ili tumorske ćelije sa antitelom ili bispecifičnim agensom se sprovodi na životinjskom modelu. Na primer, test agens se može primeniti na miševe koji imaju tumore. U nekim izvođenjima, antitelo ili bispecifično sredstvo povećava, promoviše i/ili pojačava aktivnost imunih ćelija kod miševa. U nekim izvođenjima, antitelo ili bispecifično sredstvo inhibira rast tumora. U nekim izvođenjima, antitelo ili bispecifično sredstvo izazivaju regresiju tumora. U nekim izvođenjima, antitelo ili bispecifično sredstvo se primenjuje istovremeno ili ubrzo nakon uvođenja tumorskih ćelija u životinju da bi se sprečio rast tumora („preventivni model“). U nekim izvođenjima, antitelo ili bispecifični agens se primenjuje kao terapeutik nakon što tumori narastu do određene veličine ili postanu "uspostavljeni" ("terapeutski model").
[0276] U određenim izvođenjima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde. U određenim izvođenjima, subjekt je čovek. U određenim izvođenjima, subjekt ima tumor ili subjekt ima tumor koji je bar delimično uklonjen. U nekim izvođenjima, postupak inhibicije rasta tumora obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela 313M32.
[0277] Pored toga, pronalazak obezbeđuje antitelo ili bispecifične agense koji su ovde opisani za upotrebu u postupku inhibicije rasta tumora kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde. U nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje upotrebu antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde u proizvodnji ili pripremi leka za inhibiciju rasta tumora ili tumorske ćelije. U određenim izvođenjima, tumor obuhvata matične ćelije raka. U određenim izvođenjima, učestalost matičnih ćelija raka u tumoru se smanjuje primenom agensa. U nekim izvođenjima, obezbeđen je postupak za smanjenje učestalosti matičnih ćelija raka u tumoru kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela ili bispecifičnog agensa.
[0278] Pored toga, pronalazak obezbeđuje ovde opisana antitela ili bispecifične agense za upotrebu u postupku smanjenja tumorigenosti tumora kod subjekta. U određenim izvođenjima, tumor obuhvata matične ćelije raka. U nekim izvođenjima, tumorigenost tumora se smanjuje smanjenjem učestalosti matičnih ćelija raka u tumoru. U nekim izvođenjima, postupci obuhvataju korišćenje ovde opisanih antitela ili bispecifičnih agenasa. U određenim izvođenjima, učestalost matičnih ćelija raka u tumoru se smanjuje primenom antitela ili bispecifičnog agensa koji je ovde opisan. U nekim izvođenjima, postupak za smanjenje tumorigenosti tumora kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela 313M32.
[0279] U nekim izvođenjima, tumor je čvrst tumor. U određenim izvođenjima, tumor je tumor izabran iz grupe koju čine: kolorektalni tumor, tumor pankreasa, tumor pluća, tumor jajnika, tumor jetre, tumor dojke, tumor bubrega, tumor prostate, neuroendokrini tumor, gastrointestinalni tumor, melanom, tumor grlića materice, tumor mokraćne bešike, glioblastom i tumor glave i vrata. U određenim izvođenjima, tumor je kolorektalni tumor. U određenim izvođenjima, tumor je tumor jajnika. U nekim izvođenjima, tumor je tumor pluća. U određenim izvođenjima, tumor je tumor pankreasa. U određenim izvođenjima, tumor je tumor melanoma.
[0280] Ovaj pronalazak obezbeđuje ovde opisano antitelo ili bispecifični agens za upotrebu u postupcima lečenja raka koji se sastoje od davanja subjektu terapeutski efikasne količine TIGIT-vezujućeg agensa opisanog ovde (npr. subjektu kome je potrebno lečenje). U nekim izvođenjima, antitelo ili bispecifični agens inhibira ili smanjuje rast raka. U određenim izvođenjima, subjekt je čovek. U određenim izvođenjima, subjekt ima tumor raka. U određenim izvođenjima, subjektu je tumor barem delimično uklonjen. U nekim izvođenjima, postupak za lečenje raka kod subjekta obuhvata davanje subjektu terapeutski efikasne količine antitela 313M32.
[0281] U određenim izvođenjima, rak je rak izabran iz grupe koju čine kolorektalni rak, rak pankreasa, rak pluća, rak jajnika, rak jetre, rak dojke, rak bubrega, rak prostate, rak gastrointestinalnog trakta, melanom, rak grlića materice, neuroendokrini rak, rak mokraćne bešike, glioblastom i rak glave i vrata. U određenim izvođenjima, rak je rak pankreasa. U određenim izvođenjima, rak je rak jajnika. U određenim izvođenjima, rak je kolorektalni kancer. U određenim izvođenjima, rak je rak dojke. U određenim izvođenjima, rak je rak prostate. U određenim izvođenjima, rak je rak pluća. U određenim izvođenjima, rak je melanom.
[0282] U nekim izvođenjima, rak je hematološki rak. U nekim izvođenjima, hematološki rak je leukemija. U drugim izvođenjima, hematološki rak je limfom. U nekim izvođenjima, rak je izdvojen iz grupe koju čine: akutna mijeloidna leukemija (AML), Hodgkin limfom, multipli mijelom, T-ćelijska akutna limfoblastna leukemija (T-ALL), hronična limfocitna leukemija (CLL), leukemija vlašastih ćelija, hronična mijeloidna leukemija (CML), Non-Hodgkinov limfom, difuzni veliki B-ćelijski limfom (DLBCL), limfom mantle ćelija (MCL) i kožni T-ćelijski limfom (CTCL).
[0283] U nekim izvođenjima ovde opisanih metoda, postupak dalje obuhvata korak određivanja nivoa ekspresije PD-L1 u tumoru ili raku. U nekim izvođenjima, određivanje nivoa ekspresije PD-L1 se vrši pre tretmana sa antitelom ili bispecifičnim agensom koji je ovde opisan. U nekim izvođenjima, ako tumor ili rak imaju povišen nivo ekspresije PD-L1, subjektu se daje antitelo ili bispecifični agens. U nekim izvođenjima, postupak obuhvata (i) dobijanje uzorka raka ili tumora subjekta; (ii) merenje nivoa ekspresije PD-L1 u uzorku; i (iii) davanje efikasne količine antitela ili bispecifičnog agensa subjektu ako tumor ili rak imaju povišen nivo ekspresije PD-L1. U nekim izvođenjima, uzorak je uzorak biopsije. U nekim izvođenjima, uzorak sadrži tumorske ćelije, imune ćelije koje infiltriraju tumor, stromalne ćelije i bilo koju njihovu kombinaciju. U nekim izvođenjima, uzorak je uzorak ugrađen u parafin fiksiran formalinom (FFPE). U nekim izvođenjima, uzorak je arhivsko, sveže ili zamrznuto tkivo. U nekim izvođenjima, nivo ekspresije PD-L1 u uzorku se poredi sa unapred određenim nivoom ekspresije PD-L1. U nekim izvođenjima, unapred određeni nivo ekspresije PD-L1 ekspresije je nivo ekspresije PD-L1 u referentnom uzorku tumora, referentnom uzorku normalnog tkiva, nizu referentnih uzoraka tumora ili seriji referentnih uzoraka normalnog tkiva. U nekim izvođenjima, nivo ekspresije PD-L1 se određuje korišćenjem imunohistohemijskog (IHC) testa. U nekim izvođenjima, nivo ekspresije PD-L1 se određuje korišćenjem testa koji obuhvata procenu H-skora. U nekim izvođenjima, nivo ekspresije PD-L1 se određuje korišćenjem antitela koje se specifično vezuje za PD-L1. U nekim izvođenjima, PD-L1 se detektuje na tumorskim ćelijama. U nekim izvođenjima, PD-L1 se detektuje na imunskim ćelijama koje infiltriraju tumor.
[0284] Kombinovana terapija sa dva ili više terapeutskih agenasa često koristi sredstva koja deluju različitim mehanizmima delovanja, iako to nije potrebno. Kombinovana terapija upotrebom agenasa sa različitim mehanizmima delovanja može rezultirati aditivnim ili sinergijskim efektima. Kombinovana terapija može omogućiti nižu dozu svakog agensa nego što se koristi u monoterapiji, čime se smanjuju toksični neželjeni efekti i/ili povećava se terapeutski indeks agensa. Kombinovana terapija može smanjiti verovatnoću razvoja rezistentnih ćelija raka. U nekim izvođenjima,
4
kombinovana terapija obuhvata terapeutsko sredstvo koje utiče na imuni odgovor (npr. pojačava ili aktivira odgovor) i terapeutsko sredstvo koje utiče (npr. inhibira ili ubija) tumor/ćelije raka.
[0285] U nekim izvođenjima, kombinacija antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde i najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa daje aditivne ili sinergijske rezultate. U nekim izvođenjima, kombinovana terapija dovodi do povećanja terapeutskog indeksa agensa. U nekim izvođenjima, kombinovana terapija dovodi do povećanja terapeutskog indeksa dodatnog terapeutskog agensa. U nekim izvođenjima, kombinovana terapija dovodi do smanjenja toksičnosti i/ili neželjenih efekata agensa. U nekim izvođenjima, kombinovana terapija dovodi do smanjenja toksičnosti i/ili neželjenih efekata dodatnog terapeutskog agensa.
[0286] U određenim izvođenjima, pored primene antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde, postupak ili tretman dalje obuhvata primenu najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa. Dodatni terapeutski agens se može primeniti pre, istovremeno sa, i/ili posle, davanja agensa. U nekim izvođenjima, najmanje jedan dodatni terapeutski agens sadrži 1, 2, 3 ili više dodatnih terapeutskih agenasa.
[0287] Terapeutski agensi koji se mogu primeniti u kombinaciji sa ovde opisanim antitelima i bispecifičnim agensima uključuju hemoterapeutske agense. Stoga, u nekim izvođenjima, postupak ili tretman uključuje davanje antitela ili bispecifičnog agensa ovog pronalaska u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom ili u kombinaciji sa koktelom hemoterapeutskih agenasa. Tretman sa antitelom ili bispecifičnim agensom može se desiti pre, istovremeno sa ili posle primene hemoterapije. Kombinovana primena može uključiti koadministraciju, bilo u jednoj farmaceutskoj formulaciji ili korišćenjem odvojenih formulacija, ili uzastopnu primenu u bilo kom redosledu, ali generalno u vremenskom periodu tako da svi aktivni agensi mogu istovremeno da ispoljavaju svoje biološke aktivnosti. Rasporedi pripreme i doziranja za takve hemoterapeutske agense mogu se koristiti u skladu sa uputstvima proizvođača ili kako ih empirijski odredi kvalifikovani lekar. Rasporedi pripreme i doziranja za takvu hemoterapiju su takođe opisani u The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.
[0288] Korisne klase terapeutskih agenasa obuhvataju, na primer, agense protiv tubulina, auristatine, vezivna sredstva manjih žljebova DNK, inhibitore replikacije DNK, agense za alkilovanje (npr. komplekse platine kao što su cisplatin, mono(platina), bis(platina) i tri-nuklearni kompleksi platine i karboplatin), antraciklini, antibiotici, antifolati, antimetaboliti, senzibilizatori za hemoterapiju, duokarmicini, etopozide, fluorovane pirimidine, jonofore, leksitropsine, nitrozouree, platinole, purinske antimetabolite, puromicine, senzibilizatore radijacije, steroide, taksane, inhibitore topoizomeraze i slično. U određenim izvođenjima, drugi terapeutski agens je agens za alkilovanje, antimetabolit, antimitotik, inhibitor topoizomeraze ili inhibitor angiogeneze.
[0289] Hemoterapeutski agensi korisni u ovom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, alkilirajuće agense kao što su tiotepa i ciklosfosfamid (CYTOXAN); alkil sulfonati kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini kao što su benzodopa, karbokuon, meturedopa i uredopa; etilenimini i metilamelamini uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosfaoramid i trimetilolomelamin; azotni iperiti kao što su hlorambucil, hlonafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembihin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrosuree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotici kao što su aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, kaliheamicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicin, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicin, strepbicin, olivomicin, purbicinomicin, pepelomicin, potbicinomicin , tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetaboliti kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citozin arabinozid, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU; androgeni kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antinadbubrežne lekove kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; sredstva za dopunjavanje folne kiseline kao što je folinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinska kiselina; amsacrine; bestrabucil; bisantrene; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikuone; elformitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamine; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakrini; pentostatin; phenamet; pirarubicin; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK; razoksan; sizofuran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; 2,2',2"-trihlorotrietilamin; uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid (Ara-C); taksoidi, npr. paklitaksel (TAXOL) i docetaksel (TAXOTERE); hlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; analozi platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novansiderin; danipozidrin; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoinska kiselina; esperamicini; kapecitabin (XELODA); i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore navedenih. Hemoterapeutski agensi takođe uključuju antihormonske agense koji deluju da regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumore, kao što su antiestrogeni, uključujući na primer tamoksifen, raloksifen, aromatazu inhibirajući 4(5)-imidazole, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, keoksifen, keoksifen, keoksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen (FARESTON);; i anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore navedenih. U određenim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je cisplatin. U određenim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je karboplatin.
[0290] U određenim izvođenjima, hemoterapeutski agens je inhibitor topoizomeraze. Inhibitori topoizomeraze su hemoterapeutski agensi koji ometaju delovanje enzima topoizomeraze (npr. topoizomeraze I ili II). Inhibitori topoizomeraze uključuju, ali nisu ograničeni na, doksorubicin HCl, daunorubicin citrat, mitoksantron HCl, aktinomicin D, etopozid, topotekan HCl, tenipozid (VM-26) i irinotekan, kao i farmaceutski prihvatljive soli ili derivate ovih kiselina . U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je irinotekan.
[0291] U određenim izvođenjima, hemoterapeutski agens je anti-metabolit. Antimetabolit je hemikalija sa strukturom koja je slična metabolitu potrebnom za normalne biohemijske reakcije, ali dovoljno različita da ometa jednu ili više normalnih funkcija ćelija, kao što je deljenje ćelija. Anti-metaboliti uključuju, ali nisu ograničeni na, gemcitabin, fluorouracil, kapecitabin, natrijum metotreksat, ralitreksed, pemetreksed, tegafur, citozin arabinozid, tioguanin, 5-azacitidin, 6-merkaptopurin, 6-merkaptopurinat, a i kladribin, kao i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo koje od gore navedenih stavki. U određenim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je gemcitabin.
[0292] U određenim izvođenjima, hemoterapeutski agens je antimitotički agens, uključujući, ali ne ograničavajući se na, agense koji vezuju tubulin. U nekim izvođenjima, agens je taksan. U određenim izvođenjima, agens je paklitaksel ili docetaksel, ili farmaceutski prihvatljiva so, kiselina ili derivat paklitaksela ili docetaksela. U određenim izvođenjima, agens je paklitaksel (TAXOL), docetaksel (TAXOTERE), paklitaksel vezan za albumin (ABRAXANE), DHA-paklitaksel ili PG-paklitaksel. U određenim alternativnim izvođenjima, antimitotički agens sadrži vinka alkaloid, kao što je vinkristin, vinblastin, vinorelbin ili vindezin, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate. U nekim izvođenjima, antimitotički agens je inhibitor kinezina Eg5 ili inhibitor mitotičke kinaze kao što je Aurora A ili Plk1. U određenim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je paklitaksel. U određenim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je paklitaksel vezan za albumin (ABRAXANE).
[0293] U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens obuhvata agens kao što je mali molekul. Na primer, lečenje može uključiti kombinovanu primenu agensa ovog pronalaska sa malim molekulom koji deluje kao inhibitor protiv antigena povezanih sa tumorom, uključujući, ali ne ograničavajući se na, EGFR, HER2 (ErbB2) i/ili VEGF. U nekim izvođenjima, agens ovog pronalaska se primenjuje u kombinaciji sa inhibitorom protein kinaze izabranim iz grupe koju čine: gefitinib (IRESSA), erlotinib (TARCEVA), sunitinib (SUTENT), lapatanib, vandetanib (ZACTIMA), AEE788, CI-1033, cediranib (RECENTIN), sorafenib (NEXAVAR) i pazopanib (GV786034B). U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens sadrži mTOR inhibitor.
[0294] U određenim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je agens koji inhibira put matične ćelije raka. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je inhibitor Notch puta. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je inhibitor Vnt puta. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je inhibitor BMP puta. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je inhibitor Hippo puta. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je inhibitor RSPO/LGR puta. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je inhibitor mTOR/AKR puta.
[0295] U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens sadrži biološki molekul, kao što je antitelo. Na primer, lečenje može uključiti kombinovanu primenu agensa ovog pronalaska sa antitelima protiv antigena povezanih sa tumorom uključujući, ali bez ograničenja na, antitela koja vezuju EGFR, HER2/ErbB2 i/ili VEGF. U određenim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je antitelo specifično za marker matičnih ćelija raka. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je antitelo koje vezuje komponentu Notch puta. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je antitelo koje vezuje komponentu Vnt puta. U određenim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je antitelo koje inhibira put matične ćelije raka. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je inhibitor Notch puta. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je inhibitor Vnt puta. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je inhibitor BMP puta. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je antitelo koje inhibira signalizaciju b-katenina. U određenim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je antitelo koje je inhibitor angiogeneze (npr., anti-VEGF ili VEGF receptor antitelo). U određenim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je bevacizumab (AVASTIN), ramucirumab, trastuzumab (HERCEPTIN), pertuzumab (OMNITARG), panitumumab (VECTIBIX), nimotuzumab, zalutumumab ili cetuksimab (ERBITUX).
[0296] U određenim izvođenjima, pored primene antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde, postupak ili tretman dalje obuhvata primenu najmanje jednog dodatnog imunoterapeutskog agensa. U nekim izvođenjima, dodatni imunoterapeutski agens je agens koji stimuliše imuni odgovor. U nekim izvođenjima, imunoterapeutski agens (npr. agens za stimulaciju imunog odgovora) uključuje, ali nije ograničen na, faktor stimulacije kolonije (npr. faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije makrofaga (MCSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), faktor matičnih ćelija (SCF)), interleukin (npr. IL-1, IL2, IL-3, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18), antitelo koje blokira imunosupresivne funkcije (npr. anti-CTLA4 antitelo, anti-CD28 antitelo, anti-CD3 antitelo, anti-PD-1 antitelo, anti-PD-Ll antitelo), antitelo koje poboljšava funkcije imunih ćelija (npr. anti-GITR antitelo ili anti-OKS-40 antitelo), receptor sličan toll-u (npr. TLR4, TLR7, TLR9), rastvorljivi ligand (npr. GITRL ili OKS-40L) ili član porodice B7 (npr. CD80, CD86). Dodatni imunoterapeutski agens (npr. agens za stimulaciju imunog odgovora) se može primeniti pre, istovremeno sa, i/ili posle, davanja TIGIT-vezujućeg agensa. Takođe su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže TIGIT-vezujući agens i dodatni imunoterapeutski agens (npr. agens(i) za stimulaciju imunog odgovora). U nekim izvođenjima, imunoterapeutski agens sadrži 1, 2, 3 ili više imunoterapeutskih agenasa. U nekim izvođenjima, agens za stimulaciju imunog odgovora sadrži 1, 2, 3 ili više agensa za stimulaciju imunog odgovora.
[0297] U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je antitelo koje je inhibitor imunološke kontrolne tačke. U nekim izvođenjima, inhibitor imunološke kontrolne tačke je anti-PD-1 antitelo, anti-PD-Ll antitelo, anti-CTLA4 antitelo, anti-CD28 antitelo, anti-LAG3 antitelo, anti-TIM3 antitelo, anti-GITR antitelo ili anti-OKS40 antitelo. U nekim izvođenjima, inhibitor imunološke kontrolne tačke je anti-4-1BB antitelo. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je anti-PD-1 antitelo izabrano iz grupa koje se sastoje od: nivolumaba (OPDIVO), pembrolizumaba (KEITRUDA) ili pidilzumaba. U izvođenjima, dodatni terapeutski agens je anti-PD-1 antitelo izabrano iz grupa koje se sastoje od: MEDI0680, REGN2810, PGB01, BGB. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je anti-PD-Ll antitelo izabrano iz grupe koju čine: BMS935559 (MDKS-1105), ateksolizumab (MPDL3280A), durvalumab (MEDI4736) ili avelumab (MSB0010718C). U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je anti-CTLA-4 antitelo izabrano iz grupe koju čine: ipilimumab (IERVOI) ili tremelimumab. U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je anti-LAG-3 antitelo izabrano iz grupe koju čine: BMS-986016 i LAG525.
U nekim izvođenjima, dodatni terapeutski agens je anti-OKS-40 antitelo izabrano iz grupe koju čine: MEDI6469, MEDI0562 i MOKSR0916. izvođenjima, dodatni terapeutski agens je anti-4-1BB antitelo izabrano iz grupe koju čine: PF-05082566.
[0298] Dalje, tretman sa antitelom ili bispecifičnim agensom koji je ovde opisan može uključiti kombinovani tretman sa drugim biološkim molekulima, kao što su jedan ili više citokina (npr. limfokini, interleukini, interferoni, faktori tumorske nekroze i/ili faktori rasta) ili može biti praćeno hirurškim uklanjanjem tumora, uklanjanjem ćelija raka ili bilo kojom drugom terapijom koju lekar smatra neophodnom.
[0299] U nekim izvođenjima, antitelo ili bispecifično sredstvo se može primeniti u kombinaciji sa biološkim molekulom izabranim iz grupe koju čine: adrenomedulin (AM), angiopoetin (Ang), BMP, BDNF, EGF, eritropoetin (EPO), FGF , GDNF, G-CSF, GM-CSF, GDF9, HGF, HDGF, IGF, faktor koji stimuliše migraciju, miostatin (GDF8), NGF, neurotrofini, PDGF, trombopoetin, TGF-a, TGF-b, TNF-a, VEGF , PlGF, gama-IFN, IL-1, IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15 i IL-18. U nekim izvođenjima, TIGIT-vezujući agens se može primeniti u kombinaciji sa biološkim molekulom izabranim iz grupe koju čine: faktor stimulacije kolonije makrofaga (MCSF) i faktor matičnih ćelija (SCF).
[0300] U nekim izvođenjima, lečenje antitelom ili bispecifičnim agensom opisanim ovde može biti praćeno hirurškim uklanjanjem tumora, uklanjanjem ćelija raka ili bilo kojom drugom hirurškom terapijom koju lekar smatra neophodnom.
[0301] U određenim izvođenjima, lečenje uključuje primenu antitela ili bispecifičnog agensa ovog pronalaska u kombinaciji sa terapijom zračenjem. Tretman sa agensom može se desiti pre, istovremeno sa ili nakon primene terapije zračenjem. Šeme doziranja za takvu terapiju zračenjem može odrediti kvalifikovani lekar.
[0302] U određenim izvođenjima, lečenje uključuje primenu antitela ili bispecifičnog agensa ovog pronalaska u kombinaciji sa antivirusnom terapijom. Lečenje agensom se može desiti pre, istovremeno sa ili posle primene antivirusne terapije. Antivirusni lek koji se koristi u kombinovanoj terapiji zavisiće od virusa kojim je subjekt zaražen.
[0303] Kombinovana primena može uključiti ko-primenu, bilo u jednoj farmaceutskoj formulaciji ili korišćenjem odvojenih formulacija, ili uzastopno davanje bilo kojim redosledom, ali generalno u vremenskom periodu tako da svi aktivni agensi mogu istovremeno da ispoljavaju svoje biološke aktivnosti.
[0304] Za potrebe ovog pronalaska trebao bi da se razume da se kombinacija antitela ili bispecifičnog agensa opisanog ovde i najmanje jednog dodatnog terapeutskog agensa može primeniti bilo kojim redosledom ili istovremeno. U nekim izvođenjima, agens će se davati pacijentima koji su prethodno bili podvrgnuti lečenju drugim terapeutskim agensom. U nekim drugim izvođenjima, antitelo ili bispecifično sredstvo i drugi terapeutski agens će se primenjivati uglavnom istovremeno ili istovremeno. Na primer, subjektu se može dati agens dok je podvrgnut kursu lečenja sa drugim terapeutskim agensom (npr., hemoterapija). U određenim izvođenjima, antitelo ili bispecifično sredstvo će biti primenjeno u roku od 1 godine od tretmana sa drugim terapeutskim agensom. U određenim alternativnim izvođenjima, antitelo ili bispecifično sredstvo će biti primenjeno u roku od 10, 8, 6, 4 ili 2 meseca od bilo kog tretmana sa drugim terapeutskim agensom. U nekim drugim izvođenjima, antitelo ili bispecifično sredstvo će biti primenjeno u roku od 4, 3, 2 ili 1 nedelje od bilo kog tretmana sa drugim terapeutskim agensom. U nekim izvođenjima, agens će biti primenjen u roku od 5, 4, 3, 2 ili 1 dan od bilo kog tretmana sa drugim terapeutskim agensom. Dalje će biti cenjeno da se dva (ili više) agensa ili tretmana mogu primeniti na subjekta u roku od nekoliko sati ili minuta (tj. uglavnom istovremeno).
[0305] Za lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela ili bispecifičnog agensa ovog pronalaska zavisi od vrste bolesti koja se leči, težine i toka bolesti, reagovanja bolesti, da li agens se primenjuje u terapeutske ili preventivne svrhe, prethodnu terapiju, kliničku istoriju pacijenta i tako dalje, sve po nahođenju lekara. Antitelo ili bispecifični agens se može primeniti jednom ili tokom serije tretmana koji traju od nekoliko dana do nekoliko meseci, ili dok se ne postigne izlečenje ili se postigne smanjenje stanja bolesti (npr. smanjenje veličine tumora). Optimalni rasporedi doziranja mogu se izračunati na osnovu merenja akumulacije leka u telu pacijenta i variraće u zavisnosti od relativne snage pojedinačnog agensa. Lekar može da odredi optimalne doze, metodologije doziranja i stope ponavljanja. U određenim izvođenjima, doza je od 0,01 mg do 100 mg/kg telesne težine, od 0,1 mg do 100 mg/kg telesne težine, od 1 mg do 100 mg/kg telesne težine, od 1 mg do 100 mg/kg telesne težine, 1 mg do 80mg/kg telesne težine od 10mg do 100mg/kg telesne težine, od 10mg do 75mg/kg telesne težine ili od 10mg do 50mg/kg telesne težine. U određenim izvođenjima, doza agensa je od oko 0,1 mg do oko 20 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, doza agensa je oko 0,5 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, doza agensa EP 3303379 B1515101520253035 40 4550 55 je oko 1 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, doza agensa je oko 1,5 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, doza agensa je oko 2 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, doza agensa je oko 2,5 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, doza agensa je oko 5 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, doza agensa je oko 7,5 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, doza agensa je oko 10 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, doza agensa je oko 12,5 mg/kg telesne težine. U nekim izvođenjima, doza agensa je oko 15 mg/kg telesne težine. U određenim izvođenjima, doza se može davati jednom ili više puta dnevno, nedeljno, mesečno ili godišnje. U određenim izvođenjima, agens se daje jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje ili jednom u četiri nedelje.
[0306] U nekim izvođenjima, antitelo ili bispecifični agens se može primeniti u početnoj višoj dozi "puna", nakon čega sledi jedna ili više nižih doza. U nekim izvođenjima, učestalost primene se takođe može promeniti. U nekim izvođenjima, režim doziranja može da obuhvata primenu početne doze, praćene dodatnim dozama (ili dozama za "održavanje") jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje ili jednom mesečno. Na primer, režim doziranja može da obuhvata primenu početne doze punjenja, nakon čega sledi nedeljna doza održavanja od, na primer, jedne polovine početne doze. Ili režim doziranja može da obuhvata primenu početne doze punjenja, nakon čega slede doze održavanja od, na primer, jedne polovine početne doze svake druge nedelje. Ili režim doziranja može da obuhvata davanje tri početne doze tokom 3 nedelje, nakon čega slede doze održavanja od, na primer, iste količine svake druge nedelje.
[0307] Kao što je poznato stručnjacima u ovoj oblasti, primena bilo kog terapeutskog agensa može dovesti do
4
neželjenih efekata i/ili toksičnosti. U nekim slučajevima, neželjeni efekti i/ili toksičnosti su toliko ozbiljni da onemogućavaju davanje određenog agensa u terapeutski efektivnoj dozi. U nekim slučajevima, terapija lekovima se mora prekinuti, a mogu se isprobati i drugi lekovi. Međutim, mnogi agensi u istoj terapijskoj klasi često pokazuju slične neželjene efekte i/ili toksičnost, što znači da pacijent ili mora da prekine terapiju, ili, ako je moguće, trpi neprijatne neželjene efekte povezane sa terapijskim agensom.
[0308] U nekim izvođenjima, raspored doziranja može biti ograničen na određeni broj primena ili "ciklusa". U nekim izvođenjima, agens se primenjuje tokom 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili više ciklusa. Na primer, agens se primenjuje svake 2 nedelje tokom 6 ciklusa, agens se primenjuje svake 3 nedelje tokom 6 ciklusa, agens se primenjuje svake 2 nedelje tokom 4 ciklusa, agens se primenjuje svake 3 nedelje tokom 4 ciklusa, itd. Stručnjaci mogu odlučiti o rasporedima doziranja i naknadno ih modifikovati.
[0309] Antitela ili bispecifični agensi opisani ovde mogu da se daju korišćenjem strategije intermitentnog doziranja, koja može smanjiti neželjene efekte i/ili toksičnosti povezane sa primenom agensa, hemoterapeutskog agensa, itd. U nekim izvođenjima, strategija intermitentnog doziranja obuhvata davanje početne doze agensa subjektu i davanje sledećih doza agensa otprilike jednom u 2 nedelje. U nekim izvođenjima, strategija intermitentnog doziranja obuhvata davanje početne doze agensa subjektu i primenu sledećih doza agensa otprilike jednom u 3 nedelje. U nekim izvođenjima, strategija intermitentnog doziranja obuhvata primenu inicijalne doze agensa subjektu i primenu sledećih doza agensa otprilike jednom u 4 nedelje. U nekim izvođenjima, agens se primenjuje korišćenjem strategije intermitentnog doziranja, a hemoterapeutski agens se primenjuje nedeljno.
[0310] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže ovde opisana antitela ili bispecifična sredstva i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim izvođenjima, farmaceutske kompozicije nalaze primenu u imunoterapiji. U nekim izvođenjima, kompozicije nalaze primenu u inhibiciji rasta tumora. U nekim izvođenjima, farmaceutske kompozicije nalaze primenu u inhibiciji rasta tumora kod subjekta (npr. čoveka). U nekim izvođenjima, kompozicije nalaze primenu u lečenju raka. U nekim izvođenjima, farmaceutske kompozicije nalaze primenu u lečenju raka kod subjekta (npr. čoveka).
[0311] Formulacije se pripremaju za skladištenje i upotrebu kombinovanjem prečišćenog antitela ili agensa ovog pronalaska sa farmaceutski prihvatljivim nosačem (npr. nosačem ili ekscipijentom). Stručnjaci u ovoj oblasti generalno smatraju da su farmaceutski prihvatljivi nosači, ekscipijenti i/ili stabilizatori neaktivni sastojci formulacije ili farmaceutske kompozicije.
[0312] Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, netoksične pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; soli kao što je natrijum hlorid; antioksidansi uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, heksametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, fenol, butil ili benzil alkohol, alkil parabeni, kao što su metil ili propil paraben, katehol, resorcinol, ciklosolpenksanol-; polipeptide male molekularne težine (npr. manje od oko 10 aminokiselinskih ostataka); proteini kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; ugljeni hidrati kao što su monosaharidi, disaharidi, glukoza, manoza ili dekstrini; helatni agensi kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protivjoni koji stvaraju soli kao što je natrijum; metalni kompleksi kao što su kompleksi Zn-proteina; i nejonske površinski aktivne materije kao što su TWEEN ili polietilen glikol (PEG). (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22th Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.).
[0313] Farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku mogu se davati na bilo koji broj načina za lokalni ili sistemski tretman. Primena može biti lokalna putem epidermalnih ili transdermalnih flastera, masti, losiona, krema, gelova, kapi, supozitorija, sprejeva, tečnosti i praha; plućnom inhalacijom ili insuflacijom praha ili aerosola, uključujući nebulizatorom, intratrahealno i intranazalno; oralno; ili parenteralno uključujući intravenozno, intraarterijsko, intratumorsko, potkožno, intraperitonealno, intramuskularno (npr. injekcija ili infuzija) ili intrakranijalno (npr. intratekalno ili intraventrikularno).
[0314] Terapijska formulacija može biti u obliku jedinične doze. Takve formulacije obuhvataju tablete, pilule, kapsule, prahove, granule, rastvore ili suspenzije u vodi ili nevodenim medijima, ili supozitorije. U čvrstim kompozicijama kao što su tablete, glavni aktivni sastojak je pomešan sa farmaceutskim nosačem. Konvencionalni sastojci za tabletiranje uključuju kukuruzni skrob, laktozu, saharozu, sorbitol, talk, stearinsku kiselinu, magnezijum stearat, dikalcijum fosfat ili gume, i razblaživače (npr. vodu). Oni se mogu koristiti za formiranje čvrste preformulisane kompozicije koja sadrži homogenu smešu jedinjenja iz ovog pronalaska, ili njegove netoksične farmaceutski prihvatljive soli. Čvrsta preformulisana kompozicija se zatim deli na jedinične dozne oblike tipa opisanog iznad. Tablete, pilule, itd. formulacije ili kompozicije mogu biti obložene ili na drugi način spojene da bi se dobio oblik doze koji daje prednost produženog dejstva. Na primer, tableta ili pilula može da sadrži unutrašnju kompoziciju prekrivenu spoljašnjom komponentom. Štaviše, dve komponente mogu biti razdvojene enteričnim slojem koji služi da se odupre dezintegraciji i dozvoljava unutrašnjoj komponenti da netaknuta prođe kroz stomak ili da se odloži u oslobađanju. Za takve enteričke slojeve ili obloge mogu se koristiti različiti materijali, takvi materijali uključuju brojne polimerne kiseline i mešavine polimernih kiselina sa takvim materijalima kao što su šelak, cetil alkohol i celulozni acetat.
[0315] Antitela ili bispecifični agensi opisani ovde takođe mogu biti zarobljeni u mikrokapsulama. Takve mikrokapsule se pripremaju, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijskom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloze ili želatin-mikrokapsule i poli-(metilmetacilat) mikrokapsule, tim redom, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, mikrosfere albumina, mikrokapsule, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama kako je opisano u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22th Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London.
[0316] U određenim izvođenjima, farmaceutske formulacije uključuju agens iz ovog pronalaska u kompleksu sa lipozomima. Metode za proizvodnju lipozoma su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, neki lipozomi se mogu generisati revezno faznim isparavanjem sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se mogu ekstrudirati kroz filtere definisane veličine pora da bi se dobili lipozomi željenog prečnika.
[0317] U određenim izvođenjima, preparati sa produženim oslobađanjem koji sadrže antitela ili bispecifične agense opisane ovde mogu biti proizvedeni. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže agens, gde su matrice u obliku oblikovanih artikala (npr. filmova ili mikrokapsula). Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove kao što su poli(2-hidroksietilmetakrilat) ili poli(vinil alkohol), polilaktide, kopolimere L-glutaminske kiseline i 7 etil-L-glutamata, nerazgradivi etilen-vinil acetat, kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT™ (mikrosfere za injekcije koje se sastoje od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetata), saharoze acetat izobutirata i poli-D-(-)-3-hidroksibutirne kiseline.
VI. Skrining
[0318] Ovaj pronalazak omogućava metode skrininga za identifikaciju agenasa koji se vezuju za TIGIT koji moduliraju imuni odgovor. U nekim slučajevima, ovaj pronalazak obezbeđuje metode za skrining agensa kandidata, uključujući, ali ne ograničavajući se na, polipeptide, antitela, peptide, peptidomimetike, male molekule, jedinjenja ili druge lekove, koji moduliraju imuni odgovor.
[0319] U nekim slučajevima, metod skrininga kandidata za TIGIT-vezujući agens koji modulira imuni odgovor obuhvata određivanje da li agens ima efekat na imunološke ćelije. U nekim slučajevima, metod skrininga kandidata za TIGIT-vezujući agens koji modulira imuni odgovor obuhvata određivanje da li je agens sposoban da poveća aktivnost imunih ćelija. U nekim slučajevima, metoda skrininga kandidata za TIGIT-vezujući agens koji modulira imuni odgovor obuhvata određivanje da li je agens sposoban da poveća aktivnost citolitičkih ćelija, kao što su CTL i/ili NK ćelije. U nekim slučajevima, metoda skrininga kandidata za TIGIT-vezujući agens koji modulira imuni odgovor obuhvata određivanje da li je agens sposoban da smanji aktivnost imunosupresorskih ćelija, kao što su Tregs ili MDSC.
VII. Kompleti koji sadrže ovde opisane agense
[0320] Ovaj pronalazak obezbeđuje komplete koji sadrže TIGIT-vezujuće agense opisane ovde i koji se mogu koristiti za izvođenje metoda opisanih ovde. U određenim slučajevima, komplet sadrži najmanje jedno prečišćeno TIGIT-vezujuće sredstvo u jednom ili više kontejnera. U nekim slučajevima, kompleti sadrže sve komponente neophodne i/ili dovoljne za izvođenje testa detekcije, uključujući sve kontrole, uputstva za izvođenje testova i sav potreban softver za analizu i prezentaciju rezultata. Stručnjak u ovoj oblasti lako će prepoznati da se otkrivena sredstva za vezivanje TIGIT prema ovom pronalasku mogu lako ugraditi u jedan od utvrđenih formata kompleta koji su dobro poznati u ovoj oblasti.
[0321] Dalje su obezbeđeni kompleti koji sadrže TIGIT-vezujuće agense, kao i najmanje jedan dodatni terapeutski agens. U određenim izvođenjima, drugi (ili više) terapeutski agens je hemoterapeutski agens. U određenim izvođenjima, drugi (ili više) terapeutski agens je antitelo.
[0322] Izvođenja prema pronalasku mogu se dalje definisati pozivanjem na sledeće neograničavajuće primere, koji detaljno opisuju pripremu određenih antitela iz ovog otkrića i metode za korišćenje antitela iz ovog otkrića. Stručnjacima će biti očigledno da se mnoge modifikacije, kako materijala tako i metoda, mogu primeniti bez odstupanja od obima ovog otkrića.
PRIMERI
Primer 1
Generisanje anti-TIGIT antitela
[0323] Anti-TIGIT antitela su generisana korišćenjem ekstracelularnog domena TIGIT miša za imunizaciju zečeva. Supernatanti su pregledani protočnom citometrijom na vezivanje antitela za TIGIT miša i humani TIGIT i 9 klonova antitela je izabrano za dalju karakterizaciju (slika 1). Supernatanti ovih antitela su testirani na njihovu sposobnost da specifično blokiraju interakciju mišjeg TIGIT-a sa njegovim kontra-receptorom, mišjim PVR. Pokazalo se da četiri antitela blokiraju interakciju TIGIT/PVR. Važno je da su dva od ovih antitela bila u stanju da vežu humani TIGIT (313Rb1 i 313Rb2).
[0324] Varijabilni regioni teškog i lakog lanca 313Rb1 su klonirani u format mišjeg IgG1 da bi se generisalo himerno antitelo 313R11 i u format mišjeg IgG2a da bi se stvorilo himerno antitelo 313R12. Sekvence CDR-ova 313R11 i 313R12 su (i) CDR1 teškog lanca GSSLSSSYMS (SEK ID BR:7), (ii) CDR2 IIGSNGNTYYANWAKG teškog lanca (SEK ID BR:8), (iii) CDR3 teškog lanca GGYRTSGMDP (SEK ID BR:8), (iv) laki lanac CDR1 QASQSISSYLNW (SEK ID BR:10), (v) laki lanac CDR2 DALKLAS (SEK ID BR:11) i (vi) laki lanac CDR3 QQEHSVGNVDN (SEK ID BR:12). Sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 313R11 i 313R12 je SEK ID BR:17, a sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 313R11 i 313R12 je SEK ID BR:18. Sekvenca teškog lanca 313R11 je SEK ID BR:21 ili SEK ID BR:26 (bez signalne sekvence). Sekvenca teškog lanca 313R12 je SEK ID BR:22 ili SEK ID BR:27 (bez signalne sekvence). Sekvenca lakog lanca 313R11 i 313R12 je SEK ID
4
BR:23 ili SEK ID BR:28 (bez signalne sekvence).
[0325] Varijabilni regioni teškog i lakog lanca 313Rb2 su klonirani u format humanog IgG1 da bi se generisalo antitelo 313R14. CDR-ovi su modifikovani da bi se povećao afinitet za humani TIGIT, a okvirni regioni su optimizovani i/ili humanizovani generišući nekoliko varijanti, uključujući 313R19. Sekvence CDR-ova 313R14 i 313R19 su (i) CDR1 teškog lanca GFSLSSSIMS (SEK ID BR:13), (ii) CDR2 teškog lanca IIGSNGNTYYANWAKG (SEK ID BR:8), (iii) CDR3 teškog lanca GGYRTSGMDP (SEK ID BR:8). NO:9), (iv) laki lanac CDR1 KASKSNIISDLAV (SEK ID BR:14) ili KASKNIISDLAV (SEK ID BR:81), (v) laki lanac CDR2 RASTLAS (SEK ID BR:15) i (vi) laki lanac CDR3 KKEHLVAVIIN (SEK ID BR:16). Sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 313R14 je SEK ID BR:19, a sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 313R14 je SEK ID BR:20. Sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca 313R19 je SEK ID BR:32, a sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca 313R19 je SEK ID BR:20. Sekvenca teškog lanca 313R14 je SEK ID BR:24 ili SEK ID BR:29 (bez signalne sekvence). Sekvenca teškog lanca 313R19 je SEK ID BR:33 ili SEK ID BR:34 (bez signalne sekvence). Sekvenca lakog lanca 313R14 i 313R19 je SEK ID BR:25 ili SEK ID BR:30 (bez signalne sekvence).
[0326] Plazmid koji kodira polipeptid koji sadrži varijabilni region teškog lanca antitela 313R19 deponovan je u American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SAD, pod uslovima Budimpeštanskog sporazuma 27. maja, 2015, i označen kao PTA-122180. Plazmid koji kodira polipeptid koji sadrži varijabilni region lakog lanca antitela 313R19 deponovan je kod ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SAD, pod uslovima Budimpeštanskog sporazuma 27. maja 2015. i označen kao PTA-122181.
Primer 2
TIGIT signalizacija i TIGIT fosforilacija
[0327] Kao što je ovde opisano, TIGIT je fosforilisan na svom citoplazmatskom repu nakon interakcije sa svojim kontrareceptorom PVR. Fosforilacija TIGIT-a je početak kaskade koja uključuje dalje događaje koji utiču na druge poznate signalne puteve. Stoga, procena TIGIT fosforilacije kao i statusa fosforilacije nizvodnih proteina može dati informacije o TIGIT funkciji i efektu TIGIT antagonista.
[0328] Jurkat CD4+ humanoj T ćelijskoj liniji nedostaje humana ili mišja TIGIT ekspresija kao što je određeno PCR-om u realnom vremenu i FACS-om (podaci nisu prikazani). Da bi se stvorila ćelijska linija koja eksprimira TIGIT, Jurkat ćelije su inficirane lentivirusnim konstruktom koji eksprimira mišji TIGIT (mTIGIT) označen sa FLAG i zelenim fluorescentnim proteinom (GFP). Ćelijskoj liniji mišjeg limfoma E.G7-OVA nedostaje ekspresija humanog ili mišjeg PVR-a kao što je određeno PCR-om u realnom vremenu i/ili FACS-om. E.G7-OVA ćelije sintetišu i luče ovalbumin (OVA) konstitutivno, a miševi C57BL/6 imunizovani sa E.G7-OVA ćelijama dovode do H-2 K<b>ograničenih citotoksičnih limfocita specifičnih za peptid OVA 258-276. Da bi se stvorila ćelijska linija koja ekspresuje PVR, ćelije E.G7-OVA su inficirane konstruktom lentivirusa koji eksprimira mišji PVR (mPVR) i GFP. GFP-pozitivne ćelije iz svake inficirane ćelijske linije su sortirane u ploče sa 96 bunarića pomoću FACSAria II instrumenta (BD Biosciences) i izolovane pojedinačne ćelije su proširene u klonove. Pozitivnost na GFP i ekspresija mTIGIT ili mPVR potvrđeni su u klonovima dobijenim od jedne ćelije pomoću FACS analize i PCR-a u realnom vremenu (podaci nisu prikazani).
[0329] Da bi se procenila TIGIT fosforilacija kao odgovor na PVR, ćelijske linije su inkubirane u medijumu bez seruma 2 sata na 37°C. Jurkat-mTIGIT ćelije su pomešane sa roditeljskim E.G7-OVA ćelijama ili E.G7-OVA-mPVR ćelijama u odnosu ćelija od 5:1 i inkubirane 5 minuta na 37°C u prisustvu inhibitora tirozin fosfastaze (10 mM natrijum ortovanadata, New England Biolabs). Ćelijski lizati su pripremljeni i imunoprecipitirani magnetnim perlama obloženim anti-FLAG koje su uhvatile FLAG-označene mTIGIT proteine. Imunoprecipitati su procenjeni Western blot analizom. Prisustvo fosforilisanog TIGIT-a je procenjeno korišćenjem anti-fosfotirozin antitela (Cell Signaling Technology). Prisustvo ukupnog TIGIT-a je procenjeno korišćenjem anti-FLAG antitela (Cell Signaling Technology).
[0330] Primećeno je da je TIGIT jako fosforilisan u T-ćelijama kao odgovor na tumorske ćelije koje eksprimiraju mPVR u poređenju sa ćelijama koje ne eksprimiraju PVR (Slika 2A).
[0331] Da bi se procenili drugi signalni putevi koji su potencijalno zahvaćeni TIGIT-om, ćelijske linije su inkubirane u medijumu bez seruma 2 sata na 37°C. Jurkat-mTIGIT ćelije su kombinovane sa roditeljskim E.G7-OVA ćelijama ili E.G7-OVA-mPVR ćelijama u ćelijskom odnosu 5:1 i inkubirane na 37°C tokom 0, 5, 15, 45 ili 60 minuta. Pripremljeni su ćelijski lizati i procenjeni Western blot analizom. Nivoi fosforilisanog SHP1 (tirozin fosfataza 1 koji sadrži SH2) i Erk1/2 su određeni korišćenjem anti-fosfo SHP1 (Tyr564) antitela i anti-fosfo Erk1/2 (Thr202/Tyr204) antitela od Cell Signal Technology, tim redom). Nivo ukupnog Erk1/2 je procenjen korišćenjem anti-Erk1/2 antitela (Cell Signaling Technology). SHP1 je važan negativni regulator puteva transdukcije signala posredovanih citokinom, uključujući JAK/STAT put, dok su Erk1/2 protein kinaze koje učestvuju u kaskadi transdukcije signala Ras-Raf-MEK-ERK.
[0332] Kao što je prikazano na slici 2B, SHP1 i Erk1/2 su se specifično aktivirali kada su T-ćelije koje eksprimiraju TIGIT inkubirane sa tumorskim ćelijama koje eksprimiraju mPVR. Aktivacija na koju ukazuje fosforilacija primećena je već u vremenskoj tački od 5 minuta i čini se da počinje da se smanjuje za 45 minuta za Erk1/2 i za 60 minuta za SHP1. SHP1 i Erk1/2 nisu aktivirani kao odgovor na mPVR u roditeljskim Jurkat T-ćelijama koje ne eksprimiraju mTIGIT (podaci nisu prikazani).
[0333] Da bi se ispitalo da li bi antagonisti TIGIT inhibirali aktivnost TIGIT, sproveden je test fosforilacije TIGIT u prisustvu anti-TIGIT antitela. Kao što je gore opisano, ćelije Jurkat-mTIGIT su pomešane sa roditeljskim E.G7-OVA ćelijama ili E.G7-OVA-mPVR ćelijama u odnosu ćelija od 5:1 i inkubirane 5 minuta na 37°C u prisustvu 10 mM natrijuma ortovanadata i kontrolno antitelo od 20 mg/ml (poliklonalni mišji IgG; Sigma), anti-TIGIT antitelo 313R11, anti-TIGIT antitelo 313R12 ili anti-TIGIT antitelo 313Rb1. Ćelijski lizati su pripremljeni i imunoprecipitirani magnetnim perlama
4
obloženim anti-FLAG koje su uhvatile FLAG-označene mTIGIT proteine. Imunoprecipitati su procenjeni Vestern blot analizom. Prisustvo fosforilisanog TIGIT-a je procenjeno korišćenjem anti-fosfotirozin antitela. Prisustvo ukupnog TIGIT-a je procenjeno korišćenjem anti-FLAG antitela.
[0334] Kao što je ranije prikazano, mTIGIT je bio jako fosforilisan kada su Jurkat T-ćelije koje eksprimiraju mTIGIT kombinovane sa tumorskim ćelijama koje eksprimiraju mPVR. Fosforilacija mTIGIT-a kao odgovor na interakciju sa mPVR je smanjena i/ili poništena kada su ćelije inkubirane u prisustvu anti-TIGIT antitela. Smanjenje TIGIT fosforilacije bilo je najupečatljivije kod anti-TIGIT antitela 313R12 (slika 3).
[0335] Sprovedeni su dodatni eksperimenti za proučavanje da li antagonisti TIGIT inhibiraju TIGIT signalizaciju. Slično studijama opisanim ovde, Jurkat-mTIGIT ćelije su pomešane sa roditeljskim E.G7-OVA ćelijama ili E.G7-OVA-mPVR ćelijama u odnosu ćelija od 5:1 i inkubirane 15 minuta na 37°C u prisustvu povećanje koncentracije (0-40 mg/ml) antitela na TIGIT 313R11, antitela na TIGIT 313R12 ili antitela na TIGIT 313Rb1. Ćelijski lizati su pripremljeni i procenjeni Western blot analizom. Fosforilovani SHP1 (tirozin fosfataza 1 koji sadrži SH2) i fosforilovani Erk1/2 su određeni korišćenjem anti-fosfo SHP1 (Tyr562) antitela i anti-fosfo Erk1/2 (Thr202/Tyr204) antitela, tim redom. Nivo ukupnog SHP1 je procenjen korišćenjem anti-SHPl antitela. Nivo ukupnog Erk1/2 je procenjen korišćenjem anti-Erk1/2 antitela.
[0336] Fosforilacija Erk1/2 kao odgovor na interakciju mTIGIT-mPVR je jasno inhibirana anti-TIGIT antitelima na način koji zavisi od doze (slika 4). Fosforilacija SHP1 kao odgovor na interakciju mTIGIT-mPVR je inhibirana anti-TIGIT antitelom 313Rb1 i 313#11 na način koji zavisi od doze. U prikazanom eksperimentu, izgleda da antitelo 313R12 ima samo slab efekat na fosforilaciju SHP1.
[0337] Ovi rezultati snažno sugerišu da anti-TIGIT antitela inhibiraju funkciju TIGIT i utiču na nizvodne signalne puteve.
Primer 3
TIGIT inhibicija proizvodnje citokina
[0338] Hibridom T-ćelija B3Z86/90.14 (B3Z) stabilno eksprimira OVA-specifičan H-2Kb T-ćelijski receptor (TCR). B3Z ćelije su inficirane konstruktom lentivirusa koji eksprimira mišji TIGIT (mTIGIT) i stvoren je klon mTIGIT (B3Z-mTIGIT) izveden iz jedne ćelije. Ćelijska linija mišjeg limfoma E.G7-OVA stabilno eksprimira OVA i može aktivirati OVA-specifičan TCR na B3Z ćelijama, što dovodi do sekrecije IL-2. Da bi se odredio efekat interakcija mTIGIT/mPVR na sekreciju IL-2 specifičnog za antigen, roditeljske B3Z ćelije ili B3Z-mTIGIT ćelije su inkubirane sa roditeljskim E.G7-OVA ili E.G7-OVA-mPVR ćelijama (opisano gore, videti Primer 2) u odnosu 2:1 u pločama sa 12 bunarića. Posle 24 sata koncentracije IL-2 su merene u supernatantima kulture bez ćelija pomoću ELISA (R&D Sistems). Podaci su izraženi kao odnos sekrecije IL-2 od strane roditeljskih B3Z ili B3Z-mTIGIT T-ćelija kao odgovor na tumorske ćelije koje eksprimiraju mPVR u poređenju sa sekrecijom IL2 kao odgovor na mPVR-negativne tumorske ćelije.
[0339] Za roditeljske B3Z T-ćelije, lučenje IL-2 je bilo slično bez obzira na ekspresiju mPVR na tumorskim ćelijama koje predstavljaju OVA (tj. odnos od približno 1,0). Nasuprot tome, sekrecija IL-2 iz B3Z-mTIGIT T-ćelija je bila niža u prisustvu tumorskih ćelija koje eksprimiraju mPVR nego u prisustvu mPVR-negativnih tumorskih ćelija (tj. odnos <1,0) (Slika 5A). Kada su B3Z-mTIGIT T-ćelije prethodno tretirane sa 20 mg/ml anti-TIGIT antitela 313R11 ili 313R12 pre zajedničke kulture sa E.G7-OVA ćelijama, proizvodnja IL-2 više nije bila inhibirana (slika 5B).
[0340] Ovi rezultati sugerišu da aktivacija mTIGIT pomoću mPVR inhibira aktivaciju T-ćelija kao odgovor na antigen, o čemu svedoči smanjenje proizvodnje IL-2. Štaviše, blokada TIGIT-a sa TIGIT antagonistom inhibira aktivaciju TIGIT-a i izgleda da smanjuje inhibiciju aktivnosti T-ćelija povezanu sa TIGIT-om, što se vidi po većoj proizvodnji IL-2. Ovi podaci podržavaju teoriju da inhibicija TIGIT-a može "osloboditi kočnicu" supresije T-ćelija i poboljšati imune odgovore.
Primer 4
TIGIT inhibicija citotoksičnosti NK ćelija
[0341] Ćelijska linija NK-92 humane prirodne ćelije ubice (NK) je inficirana lentivirusnim konstruktom koji eksprimuje mTIGIT označen sa FLAG i GFP i klonalna ćelijska linija (NK-92-mTIGIT) je izvedena kao što je gore opisano. Ljudska B-ćelijska linija 721.221 je inficirana konstruktom lentivirusa koji eksprimuje mPVR i GFP i generisana je klonska ćelijska linija (721.221-mPVR). FACS i PCR u realnom vremenu potvrdili su da roditeljske ćelije 721.221 nemaju ekspresiju humanog ili mišjeg PVR (podaci nisu prikazani). Sposobnost roditeljskih ćelija NK-92 ili NK-92-mTIGIT ćelija da liziraju roditeljske tumorske ćelije 721.221 ili 721.221-mPVR testirana je u standardnom 4-časovnom testu oslobađanja kalceina. NK-92 ili NK-92-mTIGIT ćelije su postavljene u ploče sa V dnom sa 96 bunarića. Ciljne ćelije 721.221 ili 721-221-mPVR su obeležene sa 10 mM kalceina AM (Life Technologies) tokom 1 sata na 37°C, a zatim kombinovane sa NK-92 ćelijama u odnosu efektor:cilj od 25:1 ili 12:1. Nakon 4-časovne inkubacije na 37°C, supernatanti bez ćelija su sakupljeni i oslobađanje kalceina je kvantifikovano na fluorometru pri ekscitaciji od 485 nm i emisiji od 535 nm. U naknadnom eksperimentu, ćelije NK-92 i NK-92-mTIGIT su inkubirane u prisustvu 20 mg/ml anti-TIGIT antitela 313R11, antitela 313R12 ili kontrolnog antitela tokom X minuta. Ćelije su zatim korišćene u testu oslobađanja kalceina kao što je gore opisano.
[0342] Procenat specifične lize ćelija je određen kao: % lize = 100 X (ER-SR)/(MR-SR), gde ER, SR i MR predstavljaju eksperimentalno, spontano i maksimalno oslobađanje kalceina, ovim redom. Spontano oslobađanje je fluorescencija koju
4
emituju ciljne ćelije inkubirane samo u medijumu (tj. u odsustvu efektorskih ćelija), dok se maksimalno oslobađanje određuje lizom ciljnih ćelija sa jednakom zapreminom od 10% SDS. Podaci su predstavljeni kao odnos citotoksičnosti NK-92 ćelija (roditeljskih ili NK-92-mTIGIT) naspram 721,221-mPVR ciljnih ćelija prema citotoksičnosti NK-92 ćelija (roditeljskih ili NK-92-mTIGIT) prema roditeljskim (mPVR) -negativno) 721.221 ciljne ćelije.
[0343] Kao što je prikazano na Slici 6A, za roditeljske NK-92 ćelije, citotoksičnost protiv mPVR-pozitivnih i mPVR-negativnih 721.221 ciljnih ćelija je bila slična (tj. odnos od približno 1,0). Nasuprot tome, za ćelije NK-92-mTIGIT citotoksičnost prema 721.221-mPVR ćelijama je smanjena u poređenju sa citotoksičnošću prema mPVR-negativnoj roditeljskoj ćelijskoj liniji 721.221 (tj. odnos <1.0). Nije bilo razlike u rezultatima kada je odnos efektor:cilj bio 25:1 ili 12:1. Kada su ćelije NK-92 ili NK-92-mTIGIT tretirane anti-TIGIT antitelom 313R11 ili antitelom 313R12 pre upotrebe u testovima citotoksičnosti, inhibicija ćelijski posredovane citotoksičnosti je smanjena i/ili ukinuta (slika 6B).
[0344] Ovi rezultati sugerišu da aktivacija mTIGIT pomoću mPVR inhibira citotoksičnost posredovanu NK ćelijama. Važno je da rezultati pokazuju da antagonist TIGIT može ometati PVR-TIGIT interakciju i dovesti do obnavljanja ili „oslobađanja kočnice“ citotoksičnih sposobnosti NK ćelija.
Primer 5
In vivo inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelom
[0345] Linija tumora debelog creva miša CT26.WT implantirana je potkožno (30,000 ćelija/miš) u zadnje bokove 6-8 nedelja starih Balb/c miševa. Tumori su ostavljeni da rastu 10 dana dok ne dostignu zapreminu od približno 50 mm<3>. Miševi su tretirani sa 0,25 mg/mišu anti-TIGIT antitelima 313R11 (mIgG1 antitela), anti-TIGIT antitelima 313R12 (mIgG2a antitela), mIgG1 kontrolnim antitelom ili mIgG2a kontrolnim antitelom (n = 10 antitela i grupe za 20 po grupi za test antitela). Miševima je davana intraperitonealna injekcija dva puta nedeljno tokom tri nedelje. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim merilima 10, 15, 18, 22, 25. i 29. dana.
[0346] Kao što je prikazano na Slici 7A, anti-TIGIT antitelo 313R12 inhibira rast tumora za skoro 75% u poređenju sa kontrolnim antitelom koji se podudara sa izotipom. Tumori kod devet miševa su regresirali na nivoe koji se ne mogu detektovati do 29. dana. Anti-TIGIT antitelo 313R11 inhibira rast tumora za samo oko 15% u poređenju sa kontrolnim antitelom koji se podudara sa izotipom. Antitelo 313R11 i 313R12 se razlikuju samo po svojim IgG izotipovima, pošto je 313R12 IgG2a antitelo, a 313R11 je IgG1 antitelo. Ovi rezultati sugerišu da izotip antitela može imati značajan uticaj na terapijsku efikasnost anti-TIGIT antitela. Poznato je da mišja IgG2 antitela (ekvivalentna humanim IgG1 antitelima) imaju povećanu ADCC aktivnost u poređenju sa mišjim IgG1 antitelima (ekvivalent humanim IgG2) i ova biološka karakteristika može da igra ulogu u snažnom antitumorskom efektu antitela 313R12.
[0347] Eksperiment je ponovljen sa anti-TIGIT antitelom 313R12 i kontrolnim mIgG2a antitelom. Kao što je gore opisano, CT26.WT ćelije su implantirane potkožno (30.000 ćelija/miš) u zadnje bokove 6-8 nedelja starih Balb/c miševa. Tumori su ostavljeni da rastu 7 dana dok ne dostignu zapreminu od približno 55 mm3. Miševi su tretirani sa 0,25 mg/mišu anti-TIGIT antitela 313R12 ili mIgG2a kontrolnim antitelom (n = 10 po grupi). Miševima je davana intraperitonealna injekcija dva puta nedeljno tokom 3 nedelje. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim merilima 7, 14, 17, 21, 25, 28. i 31. Dana.
[0348] Kao što je primećeno u prethodnoj studiji, anti-TIGIT antitelo 313R12 inhibira rast tumora CT26.WT, sa inhibicijom rasta tumora primećenom kod svih deset miševa (Slika 7B). Štaviše, tumori kod 9 od 10 miševa tretiranih antitelom 313R12 regresirali su od prvobitne veličine tumora, a 8 tumora je regresiralo na nivoe koji se ne mogu detektovati nakon 2 nedelje lečenja. U ovoj studiji, tri tumora su regresirala u kontrolnoj grupi IgG2 antitela, ali je poznato da se regresija tumora može javiti kod nelečenih, imunokompetentnih miševa, posebno ako je početni broj tumorskih ćelija nizak. Međutim, potpuna inhibicija rasta i/ili regresija tumora u grupi tretiranoj antitelom 313R12 pokazala je da tretman anti-TIGIT antitelom ima značajan terapeutski efekat i da se to može pripisati modulaciji i/ili poboljšanju imunog odgovora subjekta.
[0349] Uspešna imunoterapija protiv raka će uključivati stvaranje dugotrajnog antitumorskog imuniteta. Da bi se ispitalo da li je uspostavljen dugotrajni imunitet, miševi iz studija opisanih ovde koji su imali CT26.WT tumore koji su regresirali na nivoe koji se ne mogu detektovati posle tretmana anti-TIGIT antitelom su izazvani svežim CT26.WT tumorskim ćelijama. Jedanaest miševa sa potpunom regresijom tumora je dobilo povećan broj CT26.WT ćelija (60.000 ćelija/miš) 132. dana (102 dana nakon poslednje doze anti-TIGIT antitela 313R12). Kao kontrola, 10 naivnih miševa je dobilo CT26.WT ćelije sa istim brojem CT26.WT ćelija. Miševi nisu tretirani, rast tumora je praćen, a zapremine tumora merene su elektronskim šublerom.
[0350] U kontrolnoj grupi svih 10 miševa razvilo je velike tumore do 23. dana i bili su eutanazirani. Nasuprot tome, kod 10 miševa koji su prethodno odbacili CT26.WT tumore nisu izrasli tumori. Preostali miš je razvio mali rast tumora 14 dana nakon injekcije, ali je tumor potpuno regresirao 21. dana. Ovih 11 miševa je zatim ponovo izloženo po drugi put sa 150.000 CT26.WT ćelija (5 puta više od broja ćelija prvobitnih doza). Ponovo kao kontrola, 10 naivnih miševa je dobilo CT26.WT ćelije sa istim brojem CT26.WT ćelija (150.000 ćelija/miš). Kao i u ranijem eksperimentu, svih 10 miševa u kontrolnoj grupi razvilo je velike tumore i eutanazirani su 22. dana. Nijedan tumor nije izrastao kod 6 miševa, a 2 dodatna miša su razvila male tumore koji su se potpuno povukli do 22. dana. Ostala 3 miša su imala male tumore za koje se činilo da se povlače ili stabilizuju. Ovi rezultati su sažeti u tabeli 3 i predstavljeni kao procenat miševa bez tumora u svakoj grupi.
4
Tabela 3
[0351] Ovi rezultati ukazuju na to da tretman sa anti-TIGIT antitelom može da generiše snažan i efikasan antitumorski odgovor. Važno je da se čini da je antitumorski odgovor rezultirao dugoročnim imunitetom i zaštitom od tumorskih ćelija. Primer 6
Efektorska aktivnost anti-TIGIT IgG2 antitela
[0352] Pokazalo se da je glikozilacija IgG-Fc regiona neophodna za optimalnu ekspresiju bioloških aktivnosti posredovanih preko FcγRI, FcγII, FcγRIII i C1q komponente komplementa (tj. ADCC i CDC). Na primer, mesto glikozilacije teškog lanca mišjeg IgG2a antitela je na asparaginu 314 SEK ID BR:22. Zamena asparagina ostatkom alanina dovodi do deglikozilacije antitela i smanjene aktivnosti ADCC. Generisana je deglikozilovana varijanta 313R12 anti-TIGIT antitela koje je sadržalo ostatak alanina na poziciji 314 i nazvano 313R13.
[0353] Aktivnost anti-TIGIT antitela 313R13 je upoređena sa anti-TIGIT antitelom 313R12 da bi se proučavao efekat deglikozilacije na antitumorsko delovanje. CT26.WT ćelije su implantirane (30.000 ćelija/miš) u zadnje bokove 6-8 nedelja starih Balb/c miševa. Tumori su ostavljeni da rastu 10 dana dok ne dostignu zapreminu od približno 50 mm<3>. Miševi su tretirani sa 0,25 mg/mišu anti-TIGIT antitela 313R12, anti-TIGIT antitela 313R13 ili kontrolnim antitelom mIgG2a (n = 10 po grupi za kontrolna antitela i 20 po grupi za test antitela). Miševima su davane intraperitonealne injekcije dva puta nedeljno tokom tri nedelje. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim merilima 7, 10, 14, 17. i 21. dana.
[0354] Kao što je prikazano na Slici 8, anti-TIGIT antitelo 313R12 pokazalo je značajnu inhibiciju rasta tumora u poređenju sa kontrolom koja se podudara sa izotipom. Nasuprot tome, deglikozilovano anti-TIGIT antitelo 313R13 nije pokazalo značajnu antitumorsku aktivnost.
[0355] Pošto se veruje da bi deglikozilovano antitelo imalo ograničenu ili nikakvu ADCC aktivnost, ovi rezultati sugerišu da ADCC može da igra značajnu ulogu u snažnoj antitumorskoj aktivnosti anti-TIGIT antitela 313R12.
Primer 7
ELISpot testovi za IFN-gama, IL-2, IL-4 i IL-10
[0356] ELISpot je visoko osetljiv imunološki test za detekciju ćelija koje luče citokine. Ukratko, ELISpot test koristi antitelo za hvatanje specifično za željeni citokin, prethodno obloženo na bunariće mikrotitarpločice. Stimulisane ćelije se raspršuju u otvore i imobilisano antitelo u neposrednoj blizini bilo koje ćelije koja luči citokin vezuje sekretovani citokin. Slede standardni koraci ispiranja i inkubacije sa odgovarajućim reagensima za detekciju. Na primer, obično se koristi kombinacija biotinilovanog antitela za detekciju praćenog streptavidinom konjugovanim sa alkalnom fosfatazom i obojenim rastvorom supstrata. Obojeni precipitat se formira na mestima lokalizacije citokina i pojavljuje se kao tačka, pri čemu svaka pojedinačna tačka predstavlja pojedinačnu ćeliju koja luči citokine. Tačke se mogu prebrojati automatskim čitačem ili ručno pomoću mikroskopa. U nekim izvođenjima, slika svakog bunarića se snima korišćenjem automatizovanog sistema čitača, a ukupne tačke, površina tačke ili ukupna optička gustina (TOD) se koriste za kvantifikaciju.
[0357] Ćelije koje luče IFN-gama su detektovane korišćenjem ELISpot kompleta za mišji IFN-gama (MabTech). Ćelije su izolovane iz slezine CT26.WT miševa koji su imali tumor tretiran anti-TIGIT antitelom 313R12 (n = 6) ili kontrolnim antitelom usklađenim izotipom (n = 6) (videti Primer 5). Splenociti (5 X 10<5>/bunarić) ́ iz svakog miša u svakoj grupi tretmana su raspoređeni u ploču sa 96 bunarića obloženu antitelom specifičnim za mišji IFN-gama. Ćelije su kultivisane u prisustvu ili odsustvu tumor-specifičnog CD8+ T-ćelijskog peptida AH-1 i inkubirane 48 sati. AH-1 peptid (SPSYVYHQF; SEK ID BR:31) je H2-L<d>-restriktovani epitop proteina omotača gp70 provirusa ekotropne mišje leukemije endogenog za ćelijsku liniju CT26.WT. Ćelije koje luče IFN-gama otkrivene su prema uputstvima proizvođača. Slike su snimljene korišćenjem Bioreader 6000-F-z instrumenta (BioSiy) i određeni su broj tačke, površina tačke i ukupna optička gustina. Rezultati su prikazani kao ukupna optička gustina, a podaci su izraženi kao srednja vrednost 6 S.E.M.
[0358] Kao što je prikazano na Slici 9A, ćelije koje luče IFN-gama bile su značajno povećane kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelom. Važno je da su ćelije koje luče IFN-gama povećane samo u prisustvu peptida AH-1. Ovi rezultati ukazuju da je anti-TIGIT antitelo 313R12 aktiviralo tumorspecifične CD8+ T-ćelije. Aktivacija može biti direktna ili indirektna, tj. inhibicija supresorskih ćelija.
[0359] Ćelije koje luče IL-2 su detektovane korišćenjem kompleta za mišji IL-2 ELISpot (MabTech). Ćelije su izolovane iz slezine miševa sa tumorom tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 (n = 6) ili kontrolnim antitelom koji odgovara izotipu (n = 6). Splenociti (5 X 10<5>/bunariću) iz svakog miša u svakoj tretiranoj grupi su raspoređeni u ploču sa 96 bunarića obloženu antitelom specifičnim za mišji IL-2. Ćelije su inkubirane 48 sati. Ćelije koje luče IL-2 su otkrivene prema uputstvima proizvođača. Slike su snimljene pomoću instrumenta Bioreader 6000-F-z (BioSys) i određeni su broj tačke, površina tačke i ukupna optička gustina. Rezultati su prikazani kao ukupna optička gustina, a podaci su izraženi kao srednja vrednost 6 S.E.M.
[0360] Kao što je prikazano na Slici 9B, ćelije koje luče IL-2 su bile blago smanjene kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelom. Ćelije koje luče IL-2 su smanjene na
4
ekvivalentan nivo u prisustvu ili odsustvu AH-1 peptida.
[0361] Ćelije koje luče IL-4 su detektovane korišćenjem kompleta za mišji IL-4 ELISPOT (MabTech). Ćelije su izolovane iz slezine miševa sa tumorom tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 (n = 6) ili kontrolnim antitelom koji odgovara izotipu (n = 6). Splenociti (5 X 10<5>/bunariću) iz svakog miša u okviru svake tretirane grupe su raspoređeni u ploču sa 96 bunarića obloženu antitelom specifičnim za mišji IL-4. Ćelije su inkubirane 48 sati. Ćelije koje luče IL-4 otkrivene su prema uputstvima proizvođača. Slike su snimljene pomoću instrumenta Bioreader 6000-F-z (BioSys) i određeni su broj tačke, površina tačke i ukupna optička gustina. Rezultati su prikazani kao ukupna optička gustina, a podaci su izraženi kao srednja vrednost 6 S.E.M.
[0362] Kao što je prikazano na Slici 9C, ćelije koje luče IL-4 su značajno smanjene kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelom.
[0363] Ćelije koje luče IL-10 detektovane su korišćenjem kompleta za mišji IL-10 ELISPOT (MabTech). Ćelije su izolovane iz slezine miševa sa tumorom tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 (n = 6) ili kontrolnim antitelom koji odgovara izotipu (n = 6). Splenociti (5 X 10<5>/bunariću) iz svakog miša u okviru svake tretirane grupe su raspoređeni u ploču sa 96 bunarića obloženu antitelom specifičnim za mišji IL-10. Ćelije su inkubirane 48 sati. Ćelije koje luče IL-10 su otkrivene prema uputstvima proizvođača. Slike su snimljene pomoću instrumenta Bioreader 6000-F-z (BioSys) i određeni su broj tačke, površina tačke i ukupna optička gustina. Rezultati su prikazani kao ukupna optička gustina, a podaci su izraženi kao srednja vrednost 6 S.E.M.
[0364] Kao što je prikazano na Slici 9D, ćelije koje luče IL-10 su značajno smanjene kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnim antitelom.
[0365] IFN-gama generalno proizvode NK ćelije, Th1 CD4+ T-ćelije, CD8+ T-ćelije, ćelije koje predstavljaju antigen i B-ćelije. Studije ukazuju na ulogu IFN-gama u imunitetu tumora i da on može biti regulator antitumorske aktivnosti posredovane drugim citokinima, posebno IL-12 i IL-2. Prema tome, tretman sa anti-TIGIT antitelom koji dovodi do povećanja IFN-gama treba da poboljša antitumorski imunitet.
[0366] IL-4 proizveden pomoću CD4+ Th2 ćelije indukuje diferencijaciju naivnih CD4+ T ćelija u Th2 ćelije. Pored toga, IL-4 inhibira stvaranje Th1 ćelija, inhibira proizvodnju Th1 citokina kao što su TNF-alfa i IL-12 i inhibira aktivaciju makrofaga. IL-10 uglavnom proizvode Tregs i T-ćelije pomoćnice. IL-10 je prvobitno prepoznat kao Th2 citokin koji modulira rast i/ili diferencijaciju urođenih imunih ćelija i koji potiskuje aktivaciju i efektorske funkcije T-ćelija, posebno citotoksičnih T-ćelija. Nedavno se pokazalo da IL-10 ima neke imunostimulativne efekte i stoga se smatra da ima pleiotropne funkcije. Značajno smanjenje ćelija koje proizvode IL-4 i IL-10 kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom u ovoj studiji sugeriše da ciljanje na TIGIT može dovesti do inhibicije Th2 odgovora i može inhibirati Tregs i/ili Treg funkciju.
Primer 8
Testovi citotoksičnosti ćelija
[0367] Za testove citotoksičnosti T-ćelija, ćelije su sakupljene iz slezine CT26.WT miševa koji nose tumor, opisanih iznad (Primer 5). Ćelije su postavljene u ploče sa V-dnom sa 96 bunarića u medijumu kulture RPMI 1640 (Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY) sa dodatkom 10% (v/v) fetalnog goveđeg seruma (FBS), 2mM L-glutamina, 100U/ ml penicilina i 100µg/ml streptomicina (Gibco). Ciljne ćelije CT26.WT su obeležene sa 10µM kalceina AM (Life Technologies) tokom 1 sata na 37°C i zatim kombinovane sa splenocitima u odnosu efektor:cilj (E:T) od 50:1. Posle 4-časovne inkubacije na 37°C, supernatanti bez ćelija su sakupljeni i oslobađanje kalceina je kvantifikovano na fluorometru pri ekscitaciji od 485 nm i emisiji od 535 nm. Procenat specifične ćelijske lize je određen kao: % lize = 100 X (ER-SR)/(MR-SR), gde ER, SR i MR predstavljaju eksperimentalno, spontano i maksimalno oslobađanje kalceina, ovim redom. Spontano oslobađanje je fluorescencija koju emituju ciljne ćelije inkubirane samo u medijumu (tj., u odsustvu efektorskih ćelija), dok se maksimalno oslobađanje određuje lizom ciljnih ćelija sa jednakom zapreminom od 10% SDS.
[0368] Kao što je prikazano na slici 10, CD8+ citotoksične T-ćelije iz CT26.WT miševa koji nose tumor su pokazali povećanu sposobnost da ubiju ciljne ćelije CT26.WT kada su miševi tretirani anti-TIGIT antitelom 313R12 u poređenju sa ćelijama kod miševa tretiranih kontrolnim antitelom.
[0369] Ovi rezultati sugerišu da anti-TIGIT antitelo može povećati antigen-specifičnu citotoksičnu aktivnost T-ćelija i stoga pojačati antitumorski imuni odgovor. Ova povećana citotoksična aktivnost T-ćelija može biti posledica direktnog ili indirektnog dejstva anti-TIGIT antitela, tj. inhibicije efekta supresorskih ćelija.
Primer 9
Test T regulatornih ćelija (Treg)
[0370] T regulatorne ćelije (Tregs) igraju suštinsku ulogu u održavanju homeostaze i prevenciji autoimunih odgovora. Tregovi su mala podskupina T-ćelija, od kojih su većina CD4+ ćelije i eksprimiraju CD25 (alfa lanac IL-2 receptora) i druge molekularne markere povezane sa Treg ćelijama. Foxp3, faktor transkripcije, je prepoznat kao faktor za razvoj i funkciju Treg ćelija. Foxp3 se smatra specifičnim markerom za definisanje i identifikaciju Treg ćelija i za odvajanje Tregova od drugih subpopulacija T-ćelija. Međutim, specifičnost Foxp3 za Tregova je dovedena u pitanje u ljudskim ćelijama. Pored CD4+ Treg ćelija, CD8+ Treg ćelije predstavljaju još jednu ćelijsku subpopulaciju i Foxp3 možda nije toliko presudan za njihov razvoj i funkciju u poređenju sa CD4+ Treg ćelijama.
[0371] Funkcionalnost Treg-ova kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom je procenjena određivanjem efekta koji je Tregs imao na proliferaciju naivnih CD4+ ili CD8+ T-ćelija. Naivne T-ćelije su prečišćene iz slezine netretiranih miševa korišćenjem kolone obogaćene mišjim CD3+ T-ćelijama (R&D Systems). Ove prečišćene T-ćelije su obeležene 5 µM ljubičastom bojom za praćenje (VTD; Life Technologies). 2 X 10<5>VTD-obeležene T-ćelije su inkubirane sa kuglicama obloženim anti-CD3 i anti-CD28 antitelom da bi se stimulisala ćelijska proliferacija. Tregovi su izolovani iz slezine CT26.WT miševa koji nose tumor (videti Primer 5) tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 (n = 6) ili kontrolnim antitelom koji se podudara sa izotipom (n = 5) korišćenjem kompleta za izolaciju Treg miša ( Miltenyi Biotec). Da bi se odredio uticaj Treg-ova na proliferaciju T-ćelija, stimulisane VTD-obeležene T-ćelije (efektori) su kultivisane sa izolovanim Tregovima slezine kod miševa tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 i miševa tretiranih kontrolnim antitelom ( efektor: Treg odnos 1:0,5). Dana četvrtog, ćelije su isprane i inkubirane sa anti-mišjim CD4 ili anti-mišjim CD8 antitelima. Ćelije su procenjene FACS analizom korišćenjem instrumenta FACSCanto II i softvera FACSDiva v6.1.3 (BD Biosciences). Signali VTD se smanjuju za polovinu kako se dele obeležene ćelije, stoga je kao granica analize postavljena između maksimalnog signala dobijenog bez Treg ćelija u testu i minimalnog signala dobijenog bez anti-CD3/CD28 stimulacije. Procenat ćelija unutar ovog regiona (smanjena ekspresija VTD) na CD4+ T-ćelijama i CD8+ T-ćelijama je korišćen za izračunavanje proliferacije CD4+ i CD8+ T-ćelija. Procenat potiskivanja je izračunat kao [maksimalni signal - (uzorak signala/maksimalni signal)] X 100.
[0372] Kao što je prikazano na Slici 11, tretman sa anti-TIGIT antitelom 313R12 nije imao nikakav primetan efekat na supresivnu funkciju Treg-ova izvedenih iz slezine na proliferaciju CD4+ T-ćelija. Nasuprot tome, tretman sa anti-TIGIT antitelom 313R12 smanjio je supresivnu funkciju Treg-ova izvedenih iz slezine na proliferaciju CD8+ T-ćelija za približno 30%.
[0373] Ovi rezultati sugerišu da tretman sa anti-TIGIT antitelom može da dovede do smanjene funkcije Treg-a i/ili supresije, tj., „ukidanja kočnice“ imunog odgovora. Smanjenje funkcije Treg-a ili supresija Treg-a može poboljšati ukupne antitumorske imune odgovore.
Primer 10
Karakterizacija imunih ćelija iz miševa koji nose tumor CT26.WT tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12
[0374] Da bi se bolje karakterisale imune ćelije kod miševa koji nose tumor CT26.WT tretiranih sa anti-TIGIT antitelom 313R12 splenociti izolovani od pojedinačnih miševa analizirani su pomoću FACS. Ćelije CT26.WT (20.000 ćelija/miš) su ubrizgane potkožno u zadnje bokove 6-8 nedelja starih Balb/c miševa. Tumori su ostavljeni da rastu 10 dana dok ne dostignu približno 50 mm<3>. Miševi su tretirani sa 0,25 mg/mišu anti-TIGIT antitela 313R12 ili kontrolnim antitelom usklađenim izotipom (n = 10-20 po grupi). Miševima su davane intraperitonealne injekcije dva puta nedeljno. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom. Za analizu je korišćeno šest miševa iz svake tretirane grupe. 32. dana nakon injekcije ćelije (1 dan nakon poslednje doze antitela) izolovani su splenociti. Splenociti (1 X 10<6>) su inkubirani 10 minuta sa rekombinantnim Fc proteinom da bi se blokiralo nespecifično vezivanje, a zatim su inkubirani sa antitelima konjugovanim fluorohromom u 100µl FACS pufera za bojenje (HBSS plus 2% toplotom inaktivirani teleći serum) 20 minuta na ledu. Nevezana antitela su uklonjena ispiranjem i mrtve ćelije su obeležene promenljivom bojom. Ćelije su fiksirane u 2% paraformaldehidu 20 minuta na sobnoj temperaturi i analizirane korišćenjem FACSCanto II instrumenta i FACSDiva softvera v6.1.3 (BD Biosciences).
[0375] Ukupne T-ćelije su identifikovane korišćenjem anti-mišjeg CD3e antitela, CD4+ T-ćelije korišćenjem anti-mišjeg CD4 antitela, i CD8+ T-ćelije korišćenjem anti-mišjeg CD8 antitela. Centralne memorijske ćelije su identifikovane korišćenjem antimišjeg/humanog CD44 antitela, a efektorske memorijske ćelije su identifikovane korišćenjem antihumanog CD62L antitela. FACS bojenje je urađeno kao što je gore opisano korišćenjem anti-mišjeg CD8b antitela (klon 53-5.8, BioLegend), anti-mišjeg CD4 antitela (klon GK1.5, BioLegend), anti-mišjeg CD62L antitela (klon MEL-14, BioLegend), i anti-mišjeg CD44 antitela (klon 1M7, BioLegend). Ćelije su analizirane na ekspresiju CD44<high>CD62L<high>, što ukazuje na centralne memorijske ćelije, i na ekspresiju CD44<high>CD62L<low>, što ukazuje na efektorske memorijske ćelije (zatvorene na CD8+ T-ćelijama).
[0376] FACS analiza je pokazala da su miševi sa tumorom CT26.WT tretirani anti-TIGIT antitelom 313R12 imali povećanu populaciju T-ćelija ukupnih živih splenocita u poređenju sa populacijom T-ćelija od miševa tretiranih kontrolnim antitelom (Sl. 12A). Procenat CD4+ T-ćelija (ukupnih živih ćelija) kao i procenat CD8+ T-ćelija (ukupnih živih ćelija) povećan je kod miševa tretiranih antitelom 313R12 u poređenju sa miševima tretiranim kontrolnom (Slika 12B i Slika 12C). Pored toga, povećan je procenat centralnih memorijskih ćelija u populaciji CD4+ T-ćelija (Slika 12D). Međutim, procenat centralnih memorijskih ćelija u populaciji CD8+ T-ćelija nije povećan (slika 12E).
[0377] Ovi podaci ukazuju na to da tretman sa anti-TIGIT antitelom povećava procenat populacija i CD4+ i CD8+ T-ćelija. Rezultati su u skladu sa pojačanim imunološkim odgovorom.
[0378] Da bi se procenio efekat anti-TIGIT antitela na ciljnu ekspresiju, ekspresija TIGIT na Tregs je analizirana protočnom citometrijom. Kao što je ovde opisano, Tregovi su supresorske ćelije i poznato je da CD4+ Tregovi eksprimiraju transkripcioni faktor Foxp3. Kao što je gore opisano, izolovani su splenociti iz miševa koji nose tumor CT26.WT i tretirani anti-TIGIT antitelom 313R12 ili kontrolnim antitelom. Splenociti (13106) su inkubirani 10 minuta sa rekombinantnim Fc proteinom da bi se blokiralo nespecifično vezivanje, a zatim su inkubirani sa anti-TIGIT antitelom 313R12 i anti-mišjim CD4 antitelom u 100 ml FACS pufera za bojenje (HBSS inaktiviran toplotom plus 2% teleći serum) 20 minuta na ledu. Posle ispiranja sa FACS puferom za bojenje, ćelije su obeležene bojom za fiksiranje vitalnosti ćelija,
1
fiksirane i permeabilizovane preko noći. Posle permeabilizacije, ćelije su dva puta isprane sa IX permeabilizacionim puferom. Ćelije su obojene korišćenjem anti-mišjeg Foxp3 antitela 30 minuta na ledu, isprane i fiksirane sa 2% formaldehida 20 minuta na sobnoj temperaturi. Protočna citometrija je izvedena korišćenjem FACSCanto II instrumenta, a analize podataka su urađene korišćenjem FACSDiva Software v6.1.3 (BD Biosciences).
[0379] Kao što je prikazano na Slici 13A, procenat ukupnih splenocita koji eksprimiraju TIGIT je smanjen kod miševa sa tumorom CT26.WT tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 u poređenju sa splenocitima miševa sa tumorom tretiranim kontrolnim antitelom. Procenat Fokp3+CD4+ ćelija (što ukazuje na Tregs) ukupnih CD4+ ćelija bio je približno 22-23% za obe grupe miševa i nije izgledalo da na njega utiče tretman sa anti-TIGIT antitelom (slika 13B). Međutim, procenat TIGIT-pozitivnih Treg-ova (ukupnih Treg-ova) je drastično smanjen u populaciji splenocita kod miševa sa tumorom CT26.WT tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 u poređenju sa miševima sa tumorom tretiranim kontrolnim antitelom (Sl. 13C). Suprotno tome, procenat TIGIT-negativnih Treg-ova bio je blago povećan u populaciji splenocita kod miševa sa tumorom CT26.WT tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 u poređenju sa miševima sa tumorom tretiranim kontrolnim antitelom (Slika 13D).
[0380] Ovi rezultati sugerišu da je anti-TIGIT antitelo 313R12 istrošiloTIGIT-pozitivne ćelije, posebno Tregs. Međutim, smanjenje TIGIT-pozitivnih ćelija prema proceni FACS-a može biti posledica internalizacije TIGIT proteina i/ili smanjenja ekspresije TIGIT ćelijske površine, a ne stvarnog utroška ćelija.
[0381] Supresorske ćelije izvedene iz mijeloida (MDSC) su heterogena porodica mijeloidnih ćelija i pokazalo se da su moćni supresori adaptivnog i urođenog imuniteta. MDSC suzbijaju proliferaciju i aktivaciju CD4+ T-ćelija i CD8+ T-ćelija i olakšavaju stvaranje Treg-ova. Veruje se da MDSC olakšavaju napredovanje raka tako što inhibiraju antitumorske imune odgovore, promovišu angiogenezu i stvaraju pre-metastatsko okruženje. MDSC se karakteriše ekspresijom na površini ćelije antigena diferencijacije mijeloidne loze Gr1 i CD11b. Gr1 je prvenstveno ograničen na ekspresiju na ćelijama granulocitne loze i CD11b je površinski integrin koji se nalazi na površini makrofaga, granulocita, NK ćelija i T-ćelija. Kod miševa, MDSC se mogu podeliti u dve subpopulacije, granulocitne MDSC (G-MDSC) i monocitne MDSC (M-MDSC), delimično na osnovu ovih markera. G-MDSC obično imaju višestruko jezgro i fenotip CD11b+Gr1high, dok M-MDSCs imaju monocitnu morfologiju i CD11b+Gr1lov fenotip.Pokazalo se da obe populacije MDSC potiskuju odgovore T-ćelija višestrukim mehanizmima uključujući povećanu proizvodnju arginaze, inducibilne sintaze azot-oksida (iNOS), azot-oksida i reaktivnih vrsta kiseonika. Dakle, MDSC doprinose imunosupresivnom tumorskom mikrookruženju i mogu ograničiti efekte antitumorskih imunoloških odgovora.
[0382] Mijeloidne ćelije, posebno MDSC iz miševa sa tumorom CT26.WT tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 ili kontrolnim antitelom analizirani su pomoću FACS. Splenociti (1 x 10<6>) su inkubirani 10 minuta sa rekombinantnim Fc proteinom da bi se blokiralo nespecifično vezivanje, a zatim su inkubirani 20 minuta na ledu sa antitelima konjugovanim sa fluorohromom u 100 ml FACS pufera za bojenje (HBSS plus 2% toplotno inaktivirani teleći serum). Ćelije su zatim inkubirane sa anti-mišjim CD11b antitelom i anti-mišjim Gr1 antitelom. Nevezana antitela su uklonjena ispiranjem i ćelije su obeležene bojom za održivost. Ćelije su fiksirane u 2% paraformaldehidu 20 minuta na sobnoj temperaturi i analizirane korišćenjem FACSCanto II instrumenta i FACSDiva softvera v6.1.3 (BD Biosciences).
[0383] Kao što je prikazano na slici 14A, procenat CD11b+ mijeloidnih ćelija (ukupnih živih ćelija) iz slezine CT26.WT miševa sa tumorom tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 je smanjen za približno 25% u poređenju sa CD11b+ mijeloidnim ćelijama iz miševa koji imaju tumor a tretirani su kontrolnim antitelom.Procenat CD11b+Gr1+ MDSCs (ukupnih CD11b+ mijeloidnih ćelija) u slezini miševa sa tumorom tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 smanjen je za približno 45% u poređenju sa CD11b+Gr1+ MDSC kod miševa koji imaju tumor a tretirani su kontrolnim antitelom (slika 14B). Unutar MDSC populacije, procenat G-MDSC-a (kao što je identifikovan kao CD11b+Gr1high) iz slezine CT26.WT miševa koji imaju tumor, tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12, smanjen je za približno 66%, ali procenat M-MDSC (kao što je identifikovan kao CD11b+Gr1lov) iz slezine miševa sa tumorom CT26.WT tretiranih anti-TIGIT antitelom 313R12 je povećan za približno 30% (slike 14C i 14D, redom).
[0384] Ovi rezultati sugerišu da tretman sa anti-TIGIT antitelom može poboljšati antitumorske odgovore smanjenjem supresivne aktivnosti specifičnih imunih ćelija, tj. MDSC.
Primer 11
In vivo inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelom
[0385] Renca je ćelijska linija bubrežnog adenokarcinoma izvedena iz Balb/c dobijena od ATCC. Renca ćelije (5 x 10<5>ćelija/miš) su implantirane potkožno u zadnje bokove 6-8 nedelja starih Balb/c miševa. Tumori su ostavljeni da rastu 7 dana dok ne dostignu zapreminu od približno 43 mm3. Miševi su tretirani sa 0,25 mg/mišu antiTIGIT antitela 313R12 (mIgG2a antitelo) ili mIgG2a kontrolnim antitelom (n = 10 po grupi). Miševima je davana intraperitonealna injekcija dva puta nedeljno tokom 3 nedelje. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom 7., 10., 14., 17., 21. i 24. dana.
[0386] Kao što je prikazano na slici 15, anti-TIGIT antitelo 313R12 snažno inhibira rast tumora u poređenju sa kontrolnim antitelom koje se podudara sa izotipom. Svi kontrolni miševi su eutanazirani nakon 28. dana zbog veličine tumora. Nasuprot tome, 28. dana tumori kod 8 od 10 miševa tretiranih antitelom 313R12 su regresirali, a 5 miševa od tih 10 nije imalo tumore koji se mogu detektovati. Pet od prvih deset miševa je praćeno i nijedan tumor nije detektovan do najmanje 100 dana nakon injekcije. Ovi rezultati pokazuju da je anti-tumorska aktivnost anti-TIGIT antitela 313R12 bila efikasna u nekoliko različitih tipova tumora.
2
Primer 12
In vivo inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelom - Studija doze
[0387] Pošto se pokazalo da je anti-TIGIT antitelo efikasno u inhibiciji rasta tumora, sprovedena je studija raspona doza. Linija tumora debelog creva miša CT26.WT implantirana je potkožno (30.000 ćelija/miš) Balb/c miševima i tumorima je ostavljeno da narastu do prosečne veličine od približno 35 mm<3>. Miševi su tretirani sa 30, 15, 10, 5, 3, 1 ili 0,5 mg/kg anti-TIGIT antitela 313R12 ili sa kontrolnim antitelom (n = 10 po grupi). Miševima je davana intraperitonealna injekcija jednom nedeljno, ukupno 3 doze. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom u naznačenim vremenskim tačkama.
[0388] Slika 16 prikazuje prosečnu zapreminu tumora za svaku tretiranu grupu. Tretman anti-TIGIT antitelom 313R12 snažno je inhibirao rast tumora CT26.WT pri svakoj dozi, uključujući i najniži nivo od 0,5 mg/kg. Kao što je prikazano u tabeli 4, 20. dana tumori su regresirali kod najmanje 40% miševa pri svakom nivou doze. U svakoj tretiranoj grupi bilo je pojedinačnih miševa kod kojih je tumor regresirao na nivo koji se ne može detektovati. U ovom eksperimentu nije uočena kriva doza-odgovor, što je možda bilo zbog veličine tumora na početku lečenja.
Tabela 4
[0389] Ovi rezultati pokazuju moć anti-TIGIT antitela 313R12 kao imunoterapeutskog agensa. Generalno, ovi rezultati su iznenađujući u pogledu male količine anti-TIGIT antitela koja je potrebna da se vidi značajan antitumorski efekat.
Primer 13
In vivo inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelom i anti-PD-Ll antitelom
[0390] Linija tumora debelog creva miša CT26.WT implantirana je potkožno (30.000 ćelija/miš) kod Balb/c miševa i prvog dana tretmana (10. dan nakon implantacije) tumori su bili prosečne veličine od približno 105 mm<3>. Miševi su tretirani sa 0,25 mg/mišu anti-TIGIT antitela 313R12, anti-PD-Ll antitela, kombinacijom 313R12 i anti-PD-Ll antitela, ili kontrolnim antitelom (n = 10-20 po grupi). Miševima su davana antitela dva puta nedeljno tokom 3 nedelje. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom.
[0391] Kao što je prikazano na Slici 17B, tretman sa anti-TIGIT antitelom 313R12 snažno je inhibirao rast CT26.WT tumora kod visokog procenta miševa. Treba napomenuti da tretman sa anti-TIGIT antitelom 313R12 ne samo da je u stanju da inhibira rast tumora kod većine miševa, već je u stanju da izazove regresiju pojedinačnih tumora, često do nivoa koji se ne može detektovati. Tretman anti-PD-L1 antitelom bio je mnogo manje uspešan u inhibiciji rasta tumora kao pojedinačni agens (slika 17C). Tretman kombinacijom anti-TIGIT antitela 313R12 i anti-PD-Ll antitela inhibirao je rast tumora u većoj meri nego bilo koji od agenasa sam (Slika 17D). Prosečna zapremina tumora je prikazana na Slici 17E, a procenat preživelih miševa iz svake grupe je prikazan na Slici 17F.
[0392] Jedan metod za procenu prisustva i/ili funkcionalnosti populacije antitumorskih memorijskih ćelija je ponovno izazivanje prethodno lečenih miševa svežim tumorskim ćelijama. Miševi (iz gore opisanih studija) prethodno tretirani anti-TIGIT antitelom 313R12, anti-mPD-Ll antitelom ili kombinacijom 313R12 i anti-mPD-L1 antitela korišćeni su za ponovno ispitivanje. Miševi čiji su tumori potpuno regresirali i nisu bili detektovani najmanje 128 dana nakon prve injekcije tumora, ponovo su izazvani CT26.WT tumorskim ćelijama (30.000 ćelija). Miševi podvrgnuti ponovnom izazivanju tumora primili su poslednju dozu tretmana 100 dana pre ponovnog izazivanja. Naivnim Balb/c miševima (n = 10) su injektirane tumorske ćelije CT26.WT (30.000 ćelija) kao kontrolna grupa. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom u naznačenim vremenskim tačkama. Podaci su izraženi kao srednja vrednost 6 S.E.M.
[0393] Prosečna zapremina tumora CT26.WT tumora kod naivnih miševa je stalno rasla do 28. dana sa prosečnom zapreminom tumora od približno 1750 mm<3>. Iz prethodnog eksperimenta postojala su samo dva miša sa potpuno regresiranim tumorima koji su prethodno lečeni anti-PD-Ll antitelom, ali ova dva miša su pokazala potpuni imunitet na ponovno izazivanje tumora. Bilo je 4 miša sa potpuno regresiranim tumorima koji su prethodno lečeni anti-TIGIT antitelom i tumori nisu porasli ni kod jednog od ovih miševa nakon ponovnog izazivanja i pokazali potpuni imunitet na ponovno izazivanje tumora. Pored toga, bilo je 7 miševa sa potpuno regresiranim tumorima koji su prethodno lečeni kombinacijom 313R12 i anti-PD-Ll antitela i ovi miševi su pokazali potpuni imunitet na izazivanje tumora.
[0394] Činilo se da su miševi tretirani anti-TIGIT antitelom, bilo kao pojedinačni agens ili u kombinaciji sa anti-PD-Ll antitelom, vrlo zaštićeni od ponovnog izazivanja tumorskih ćelija CT26.WT. Ovi rezultati ukazuju na postojanje imunogene memorije nakon tretmana anti-TIGIT antitelom, bilo kao pojedinačni agens ili u kombinaciji sa inhibitorom kontrolne tačke.
Primer 14
In vivo inhibicija rasta tumora anti-TIGIT antitelom i anti-PD-1 antitelom
[0395] Linija tumora debelog creva miša CT26.WT implantirana je potkožno (30.000 ćelija/miš) kod Balb/c miševa i prvog dana tretmana (7. dan nakon implantacije) tumori su bili prosečne veličine od približno 62 mm<3>. Miševi (n = 15) su tretirani sa 12,5 µg anti-TIGIT antitela 313R12, anti-PD-1 antitela, kombinacijom 313R12 i anti-PD-1 antitela, ili kontrolnim antitelom (n = 15 po grupi). Miševima su davana antitela intraperitonealnom injekcijom dva puta nedeljno tokom 3 nedelje. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom.
[0396] Kao što je prikazano na Slici 18B, tretman sa anti-TIGIT antitelom 313R12 snažno je inhibirao rast tumora. Kao što se vidi u ranijim primerima, tretman sa 313R12 ne samo da je u stanju da inhibira rast tumora, već je u stanju da izazove regresiju nekih tumora. Tretman kombinacijom anti-TIGIT antitela 313R12 i anti-PD-1 antitela inhibirao je rast tumora u većoj meri nego bilo koji od agenasa sam (Slika 18D). Prosečna zapremina tumora u četiri grupe 24. dana je prikazana na slici 18E.
[0397] Miševi koji su prethodno lečeni anti-TIGIT antitelom 313R12, anti-mPD-1 antitelom ili kombinacijom 313R12 i anti-mPD-Ll antitela korišćeni su za ponovno ispitivanje. Miševi čiji su tumori potpuno regresirali i nisu bili detektovani najmanje 100 dana nakon prve injekcije tumora, ponovo su izazvani CT26.WT tumorskim ćelijama (60.000 ćelija). Naivnim Balb/c miševima (n = 10) su injektirane tumorske ćelije CT26.WT (60.000 ćelija) kao kontrolna grupa. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom u naznačenim vremenskim tačkama. Podaci su izraženi kao srednja vrednost ± S.E.M.
[0398] Prosečna zapremina tumora CT26.WT tumora kod naivnih miševa je stalno rasla sa prosečnom zapreminom tumora 21. dana od približno 1250 mm<3>. Iz prethodnog eksperimenta bilo je 13 miševa sa potpuno regresiranim tumorima koji su prethodno lečeni kombinacijom 313R12 i anti-PD-1 antitela i ovi miševi su pokazali potpuni imunitet na izazivanje tumora.
[0399] Ovi rezultati dalje podržavaju ideju da je anti-TIGIT antitelo 313R12 veoma moćan imunoterapijski agens, čak i kada se primenjuje kao pojedinačni agens. Pored toga, efikasnost anti-TIGIT antitela može biti dodatno poboljšana kombinovanjem sa drugim imunoterapijskim agensima.
Primer 15
Generisanje anti-TIGIT monoklonskih antitela
[0400] Antitela su generisana protiv rekombinantnih humanih TIGIT aminokiselina 22-141 (R&D Sistems) i/ili rekombinantnih humanih TIGIT aminokiselina 22-138 (Sino Biological Inc.). Miševi (n=3) su imunizovani sa TIGIT-om korišćenjem standardnih tehnika. Serumi pojedinačnih miševa su testirani na humani TIGIT približno 70 dana nakon inicijalne imunizacije korišćenjem FACS analize. Životinja sa najvećim titrom antitela je odabrana za konačno povećanje antigena nakon čega su ćelije slezine izolovane za proizvodnju hibridoma. SP2/0 ćelije su korišćene kao fuzioni partneri za ćelije slezine miša. Hibridomske ćelije su postavljene u prvi bunarić na ploči sa 96 bunarića, a supernatanti su testirani na humani TIGIT pomoću FACS analize.
[0401] Za FACS skrining anti-TIGIT antitela konstruisan je himerni fuzioni protein koji omogućava ekspresiju ekstraceluralnog domena humanog TIGIT-a na površini ćelije (FLAG-hTIGIT-CD4TM-GFP) i transfektovan u ćelije HEK-293T. Posle 48 sati, transfektovane ćelije su suspendovane u ohlađenom PBS-u koji sadrži 2% FBS i heparin i inkubirane su na ledu u prisustvu 50 µl supernatanta hibridoma 30 minuta. Druga inkubacija sa 100 ml PE-konjugovanog antihumanog Fc sekundarnog antitela je izvedena da bi se detektovale ćelije vezane antitelom. Ćelije su inkubirane sa antiFLAG antitelom (Sigma-Aldrich) kao pozitivnom kontrolom i anti-PE antitelom kao negativnom kontrolom. Ćelije su analizirane na instrumentu FACSCalibur (BD Biosciences) i podaci su obrađeni korišćenjem softvera FlowJo.
[0402] Identifikovano je nekoliko hibridoma koji su vezani za humani TIGIT i odabrano antitelo 313M26. Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca 313M26 su SEK ID BR:63 i SEK ID BR:64, redom. Nukleotidne sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca 313M26 su SEK ID BR:65 i SEK ID BR:66, redom.
[0403] Antitelo 313M26 je humanizovano korišćenjem standardnih tehnika poznatih stručnjacima u ovoj oblasti. Humanizovana verzija 313M26 se ovde pominje kao 313M32 i predstavlja IgG1 antitelo. Humanizovani varijabilni region teškog lanca 313M32 je preformatisan u IgG4 okosnicu, a u kombinaciji sa lakim lancem 313M32 se naziva 313M33. Aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca 313M32 (i 313M33) su SEK ID BR:67 i SEK ID BR:68, redom. Nukleotidne sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca 313M32 su SEK ID BR:73 i SEK ID BR:74, redom. CDR-ovi teškog i lakog lanca 313M26/313M32 su navedeni u
4
tabeli 2 ovde (SEK ID NOs:57-62). Aminokiselinska sekvenca teškog lanca 313M32 sa predviđenom signalnom sekvencom je SEK ID BR:69 i bez signalne sekvence je SEK ID BR:70; aminokiselinska sekvenca lakog lanca 313M32 sa predviđenom signalnom sekvencom je SEK ID BR:71 a bez signalne sekvence je SEK ID BR:72. Nukleotidne sekvence teškog i lakog lanca 313M32 su SEK ID BR:75 i SEK ID BR:76, redom. Aminokiselinska sekvenca teškog lanca 313M33 sa predviđenom signalnom sekvencom je SEK ID BR:83 i bez signalne sekvence je SEK ID BR:82; aminokiselinska sekvenca lakog lanca 313M33 sa predviđenom signalnom sekvencom je SEK ID BR:71 a bez signalne sekvence je SEK ID BR:72. Nukleotidne sekvence teškog i lakog lanca 313M33 su SEK ID BR:84 i SEK ID BR:76, redom.
[0404] Plazmid koji kodira varijabilni region teškog lanca antitela 313M32 deponovan je u American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SAD, pod uslovima Budimpeštanskog sporazuma 11. avgusta 2015. godine i označen PTA-122346. Plazmid koji kodira laki lanac antitela 313M32 deponovan je kod ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, SAD, pod uslovima Budimpeštanskog sporazuma 11. avgusta 2015. i označen kao PTA-122347.
Tabela 5
[0405] Humanizovano anti-TIGIT antitelo 313M32 je testirano na vezivanje za TIGIT proteine iz nekoliko različitih vrsta. Utvrđeno je da 313M32 snažno vezuje humani TIGIT i da ne vezuje TIGIT iz bilo koje druge vrste koje su testirane, uključujući miša, pacova, zamorče, zeca, marmozeta, svinju, psa, rezus majmuna i majmuna cinomolgusa. Ovo je u suprotnosti sa drugim anti-TIGIT antitelom proizvedenim u OncoMed Pharmaceuticals, 313R19, koje se vezuje za TIGIT iz svih ovih vrsta osim iz zamorčeta. Antitelo 313R19 je humanizovana verzija zečjeg anti-TIGIT antitela (313R12) za koje je prvobitno utvrđeno da se vezuje i za mišji i za humani TIGIT. Tabela 5 sumira anti-TIGIT antitela i vezivanje za TIGIT miša, čoveka, majmuna cinomolgus i rezus majmuna.
Primer 16
FACS Analiza vezivanja humanog TIGIT-a za PVR koji blokiraju anti-TIGIT antitela
[0406] Humani TIGIT protein na površini ćelije je generisan vezivanjem aminokiselina 22-141 humanog TIGIT-a na transmembranski domen CD4 i C-terminalnu GFP proteinsku oznaku korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK (hTIGITCD4TM-GFP). PVR-Fc konstrukti su generisani korišćenjem standardnih tehnika rekombinantne DNK. Konkretno, ekstracelularni domen humanog PVR je vezan u okviru za Fc region zeca i rekombinantni hPVR-rbFc protein je eksprimiran u CHO ćelijama. Fuzioni proteini su prečišćeni iz medijuma ćelijske kulture korišćenjem protein A hromatografije.
[0407] HEK-293T ćelije su privremeno transfektovane konstruktom hTIGIT-CD4TM-GFP. Posle 16 sati, transfektovane ćelije su suspendovane u ohlađenom HBSS koji sadrži 2% FBS i heparin i inkubirane su na ledu sa 0,5 µg/ml fuzionog proteina hPVR-rbFc u prisustvu anti-TIGIT antitela 313R19, 313M26 ili 3160M32. Antitelo 313R19 je humanizovana verzija zečjeg anti-TIGIT antitela. 313R19 vezuje TIGIT miša i čoveka. Antitela su testirana u koncentracijama od 10, 2 i 0,4 ug/ml. Ćelije su inkubirane bez antitela ili bez hPVR-rbFc kao kontrole. Druga inkubacija sa 100 ml PE-konjugovanog anti-zečjeg Fc sekundarnog antitela je izvedena da bi se otkrile ćelije vezane hPVR-rbFc fuzionim proteinom. Ćelije su analizirane na instrumentu FACSCanto (BD Biosciences) i podaci su obrađeni korišćenjem softvera FlowJo.
[0408] Kao što je prikazano na Slici 19A, u odsustvu bilo kakvog anti-TIGIT antitela, hPVR-rbFc se snažno vezao za hTIGIT eksprimiran na površini ćelija HEK-293T. Sva tri anti-TIGIT antitela blokirala su vezivanje hPVR-rbFc za hTIGIT u najvišoj koncentraciji od 10 µg/ml. Međutim, pri nižim koncentracijama od 2 ug/ml i 0,4 µg/ml antitela, 313R19 antitelo nije blokiralo vezivanje hPVR-rbFc za TIGIT. Nasuprot tome, anti-hTIGIT antitelo 313M32 snažno je blokiralo vezivanje hPVR-rbFc za hTIGIT pri 2 µg/ml i nivo blokade je bio viši nego kod roditeljskog mišjeg antitela 313M26.Ovi rezultati sugerišu da je afinitet humanizovanog antitela 313M32 za hTIGIT veći od roditeljskog antitela 313M26 i antitela 313R19. Izveden je dodatni eksperiment korišćenjem antitela 313R19 i antitela 313M32 u koncentracijama od 10, 5, 2,5 i 1,25 µg/ml (slika 19B). Rezultati iz ove dve studije sugerišu da je afinitet antitela 313M32 za hTIGIT približno 5 puta veći od antitela 313R19. Pored toga, preliminarni Biacore rezultati su pokazali da je afinitet 313R19 bio 2nM, a afinitet 313M32 bio 0,4nM.
Primer 17
TIGIT signalizacija i TIGIT fosforilacija
[0409] TIGIT je fosforilisan na svom citoplazmatskom repu nakon interakcije sa svojim kontrareceptorom PVR. Fosforilacija TIGIT-a je početak kaskade koja uključuje nizvodne događaje koji utiču na druge poznate signalne puteve. Stoga, procena TIGIT fosforilacije može dati informacije o TIGIT funkciji i efektu TIGIT antagonista.
[0410] Jurkat CD4+ humana T ćelijska linija nema ekspresiju humanog TIGIT-a kao što je određeno PCR-om u realnom vremenu i FACS-om (podaci nisu prikazani). Da bi se stvorila ćelijska linija koja eksprimira TIGIT, Jurkat ćelije su inficirane lentivirusnim konstruktom koji eksprimira humani TIGIT (hTIGIT) označen sa FLAG i zelenim fluorescentnim proteinom (GFP). GFP-pozitivne ćelije su sortirane u ploče sa 96 bunarića pomoću FACSAria II ćelijskog sortera (BD Biosciences), pojedinačne ćelije su proširene u klonove i odabrana je klonska ćelijska linija (Jurkat-hTIGIT).
[0411] Linija humanog B ćelijskog limfoma 721.221 nema ekspresija PVR kao što je određeno PCR-om u realnom vremenu i FACS-om (podaci nisu prikazani). Da bi se stvorila ćelijska linija koja eksprimira PVR, 721.221 ćelije su inficirane lentivirusnim konstruktom koji eksprimira humani PVR (hPVR) i GFP. GFP-pozitivne ćelije su sortirane u ploče sa 96 bunarića pomoću FACSAria II ćelijskog sortera (BD Biosciences), pojedinačne ćelije su proširene u klonove i odabrana je klonska ćelijska linija (721.221-hPVR).
[0412] Da bi se procenila TIGIT fosforilacija kao odgovor na PVR, Jurkat-hTIGIT ćelije su inkubirane u medijumu bez seruma 2 sata na 37°C. Ćelije su zatim prethodno tretirane sa 20 µg/ml anti-TIGIT antitela 313R19, 313M26 ili 313M32, ili kontrolnim antitelom tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Jurkat-hTIGIT ćelije su pomešane sa roditeljskim 721.221 ćelijama ili 721.221-mPVR ćelijama u ćelijskom odnosu 5:1 i inkubirane 5 minuta na 37°C u prisustvu inhibitora tirozin fosfastaze (10mM natrijum ortovanadat, New England Biolabs). Ćelijski lizati su pripremljeni i imunoprecipitirani magnetnim perlama obloženim anti-FLAG-om koje su uhvatile FLAG-označene hTIGIT proteine. Imunoprecipitati su razdvojeni na 4-12% Bis-Tris gelovima (Novex/Life Technologies) i preneti na nitrocelulozne membrane korišćenjem iBlot 2 aparata (Life Technologies). Membrane su inkubirane sa antitirozinskim antitelom konjugovanim sa peroksidazom rena i fosforilisani TIGIT (pTIGIT) je detektovan korišćenjem standardnih reagenasa za detekciju. Prisustvo ukupnog TIGIT-a je procenjeno korišćenjem anti-FLAG antitela (Cell Signaling Technology).
[0413] Primećeno je da je hTIGIT visoko fosforilisan u Jurkat ćelijama kao odgovor na tumorske ćelije koje eksprimiraju hPVR. Ova fosforilacija je inhibirana u prisustvu anti-TIGIT antitela, posebno antitela 313M32 (slika 20).
Primer 18
Mapiranje epitopa
Mapiranje epitopa anti-hTIGIT antitela
[0414] Da bi se identifikovao vezujući epitop antitela 313M32, izvršena je analiza sa nizom varijanti humanog TIGIT-a sa specifičnim supstitucijama aminokiselina. Varijante su zasnovane na razlikama između humanih TIGIT i cinomolgus TIGIT aminokiselinskih sekvenci, SEK ID BR:4 i SEK ID BR:77, redom. Aminokiselinska sekvenca TIGIT rezus majmuna (SEK ID BR:78) je identična cinomolgus TIGIT (Slika 21). Varijante aminokiselina uvode aminokiselinske ostatke prisutne u TIGIT majmuna cinomolgus na odgovarajuće pozicije u ljudskom TIGIT-u. Generisane varijante hTIGIT imaju supstitucije na (1) E36K i I41V; (2) T51M, (3) Q62H i Q64H, (4) D72E, (5) S78Y i S80A, (6) V100M, (7) I109T i T119R i (8) G135S. Svaka varijanta hTIGIT je generisana korišćenjem hTIGIT (aa 22-141)-CD4TM-GFP konstrukta opisanog u Primeru 15.
[0415] TIGIT varijante su procenjene pomoću FACS-a sa anti-hTIGIT antitelima. HEK-293T ćelije su privremeno transfektovane sa hTIGIT-CD4TM-GFP, mTIGIT-CD4TM-GFP, ili jednom od varijanti hTIGIT-CD4TM-GFP konstrukta. Posle 16 sati, transfektovane ćelije su suspendovane u ohlađenom HBSS koji sadrži 2% FBS i inkubirane na ledu sa 1µg/ml antihTIGIT antitelima 313R12, 313M32 ili 313M34 tokom 30 minuta. 313M34 je anti-hTIGIT antitelo koje je generisano na osnovu aminokiselinskih sekvenci 10A7 antitela opisanih u američkoj publikaciji 2009/0258013. Antitelo 10A7 je antimišje TIGIT antitelo koje vezuje i mišji TIGIT i ljudski TIGIT. Druga inkubacija sa 50 ml PE-konjugovanog anti-Fc sekundarnog antitela je izvedena da bi se otkrile ćelije vezane antitelima. Ćelije su analizirane na instrumentu FACSCanto (BD Biosciences) i podaci su obrađeni korišćenjem softvera FlowJo.
[0416] Kao što je prikazano na slici 22, antitelo 313M32 se nije vezalo za TIGIT varijantu 3 sa supstitucijama aminokiselinskih ostataka 62 i 64 i TIGIT varijantu 7 sa supstitucijama na aminokiselinskim ostacima 109 i 119. Antitelo je zadržalo svoje snažno vezivanje i TIG1 hITGIT varijante , 2, 4, 5, 6 i 8. Ostaci aminokiselina 62, 64, 109 i 119 su istaknuti crnom bojom na prikazu kristalne strukture TIGIT-a vezanog za PVR (Slika 23). Struktura ljudskog TIGIT-a je prikazana u obliku sfere, a struktura PVR-a je data u obliku trake. Položaji aminokiselina otkrivaju da antitelo 313M32 vezuje hTIGIT u oblasti koja treba da blokira i/ili ometa PVR vezivanje. Važno je napomenuti da je antitelo 313R12 takođe izgubilo vezivanje za TIGIT varijantu 7 sa supstitucijama aminokiselinskih ostataka 109 i 119 što sugeriše da se 313R12 vezuje za epitop koji se preklapa sa epitopom vezanim sa 313M32. Zanimljivo je da na vezivanje antitela 313M34 za TIGIT nisu uticale supstitucije aminokiselina TIGIT varijante 3 ili varijante 7, ali su na njega uticale supstitucije aminokiselina na ostatku 100 TIGIT varijante 6. Ovaj rezultat pokazuje da antitelo 313M34 ne vezuje isti epitop kao antitelo 313M32. Relativni položaji kritičnih vezivnih ostataka za antitela 313M32 i 313M34 na TIGIT-u su naznačeni na slici 23.
[0417] Da bi se potvrdilo da se antitelo 313M26 (roditeljsko mišje anti-hTIGIT antitelo 313M32) i 313R19 (humanizovano zečje anti-hTIGIT antitelo generisano iz 313R12) vezuju za zajednički epitop, sprovedene su kompetitivne studije. Pošto su Fc delovi antitela 313M26 i 313R19 različiti, tj. mišji Fc i humani Fc, redom, može se odrediti vezivanje jednog antitela (313R19) u prisustvu ili odsustvu drugog antitela (313M26). Ukratko, ćelije HEK-293T su privremeno transfektovane ekspresionim vektorom koji kodira humani TIGIT-CD4TM-GFP. Ćelije su inkubirane 1 sat sa 0,5 µg antitela 313M19 i viškom antitela 313M26 (od 50 do 0,78 µg/ml, dvostruka razblaženja). Ćelije su isprane i inkubirane sa fluorescentno obeleženim sekundarnim antitelom specifičnim za ljudski Fc i analizirane protočnom citometrijom.
[0418] Kao što je prikazano na Slici 24A, antitelo 313M26 se takmičilo sa 313R19 za vezivanje za hTIGIT, a višak 313M26 je efikasno blokirao vezivanje 313R19 za hTIGIT. Ovi podaci ukazuju na to da se 313M26/313M32 i 313R12/313R19 vezuju za epitope koji se preklapaju i da su u skladu sa analizom epitopa prikazanom na Slici 23. U paralelnim eksperimentima, ispitivana je sposobnost 313R19 ili 313M32 da se takmiči sa 313M34 za vezivanje za TIGIT. Kao što je prikazano na slici 24B, ni 313R19 ni 313M32 antitela nisu primećena da se takmiče sa 313M34 za vezivanje za hTIGIT. Ovi rezultati pokazuju da se 313R19 i 313M32 vezuju za epitop koji se razlikuje od epitopa vezanog za 313M34. Ovi rezultati su takođe u skladu sa analizom epitopa prikazanom na slici 23.
Primer 19
Proizvodnja citokina
[0419] Pokazalo se da angažovanje TIGIT-a sa PVR (CD155) eksprimiranom na ćelijama tumora ili ćelijama koje predstavljaju antigen smanjuje funkciju efektora T-ćelija i inhibira antitumorske imune odgovore (videti npr. Joller et al., 2014, Immunity, 40:569-581). Ispitivana je sposobnost anti-TIGIT antitela 313R19 i 313M32 da blokiraju PVR-posredovanu inhibiciju lučenja citokina T-ćelija. Aktivirani humani blasti T-ćelija su generisani 10-dnevnim kultivisanjem primarnih humanih T-ćelija sa fitohemaglutininom (PHA, 2 µg/ml) i IL-2 (4 ng/ml). Blasti su ostavljeni u medijumu bez PHA/IL-2 24 sata, resuspendovani na 5 x 10<5>ćelija/ml i tretirani kontrolnim antitelom (poliklonalni humani IgG, 25 µg/ml), anti-TIGIT antitelom 313R19 ili 313M32 na 10 ili 25 µg/mL tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su zatim postavljene u bunariće koji su preko noći na 4°C obloženi anti-CD3 antitelom (Ebioscience), humanim PVR-Fc ili anti-CD3 antitelom i hPVRFc (svaki sa 10 µg/m). Supernatanti kulture bez ćelija su sakupljeni nakon 48 sati, a IFN-i i IL-2 citokini su određeni pomoću ELISA (R&D Systems). Rezultati su izraženi u odnosu na proizvodnju citokina ćelijama aktiviranim samo sa antiCD3, pri čemu je nivo anti-CD3 citokina postavljen na 1,0.
[0420] Kao što se vidi na slici 25, hPVR-Fc ne indukuje proizvodnju ni IFN-gama ni IL-2 u aktiviranim ćelijama. Međutim, hPVR-Fc snažno inhibira proizvodnju citokina koja je indukovana anti-CD3 angažovanjem. Ova inhibicija je poništena anti-TIGIT antitelima 313R19 i 313M32 i pri višoj dozi od 25 ug/ml proizvodnja IFN-gama ili IL-2 je zapravo veća od količine koju generiše anti-CD3. Aktivirane T-ćelije eksprimiraju i TIGIT i CD226, i oba mogu da stupe u interakciju sa PVR, ali interakcija TIGIT/PVR je inhibitorna, a interakcija CD226/PVR je aktivirajuća. Bez želje za vezivanjem za teoriju, sugeriše se da kada su aktivirane T-ćelije u kontaktu sa PVR, interakcija TIGIT/PVR „pobeđuje“, jer TIGIT jače vezuje PVR od CD226. Pored toga, čini se da postoje viši nivoi TIGIT-a na aktiviranim T-ćelijama nego na CD226, tako da je ukupna interakcija inhibitorna. Na primer, na slici 25 uporediti sam anti-CD3 sa anti-CD3 plus PVR. Kada je TIGIT blokiran sa 313R19 ili 313M32, inhibicija posredovana TIGIT-om je obrnuta, ali teoretski interakcija CD226/PVR se i dalje javlja i ta interakcija se aktivira. Stoga, kao što se vidi na slici 25, kada je TIGIT blokiran i T-ćelije su stimulisane anti-CD3 plus PVR, nivoi IFN-gama su zapravo viši nego kada stimulišete samo anti-CD3.
[0421] Ovi rezultati pokazuju da blokada humanog TIGIT-a sa anti-TIGIT antitelom može poremetiti TIGIT/PVR interakcije i vratiti proizvodnju citokina koja je korisna za antitumorski odgovor.
Primer 20
Ispitivanje ćelijski posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela
[0422] Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) se odnosi na ubijanje ciljne ćelije obložene antitelom od strane citotoksične efektorske ćelije kroz nefagocitni proces, koji se obično karakteriše oslobađanjem citotoksičnih granula ili ekspresijom koja izaziva smrt ćelije. molekule. Efektorske ćelije koje posreduju ADCC uključuju prirodne ćelije ubice (NK), monocite, makrofage, neutrofile, eozinofile i dendritske ćelije. Ispitivana je sposobnost anti-TIGIT antitela 313R19 i 313M32 da posreduju ADCC NK ćelija. ADCC je testiran u standardnom 4-časovnom testu oslobađanja kalceina koristeći primarne humane NK ćelije kao efektore i roditeljske Jurkat ćelije ili Jurkat-hTIGIT ćelije kao mete. Ljudske NK ćelije su izolovane direktno iz svežeg krvnog seruma (Stanford Blood Center, Palo Alto, Kalifornija) inkubacijom od 30 minuta sa RosetteSep koktelom (Stem Cell Technologies) pre centrifugiranja sa gradijentom gustine Ficoll-Hipakue (Sigma). Ciljne roditeljske Jurkat ili Jurkat-hTIGIT ćelije su označene sa 10 mM kalceina AM (Life Technologies) tokom 1 sata na 37 °C, a zatim tretirane kontrolnim poliklonalnim IgG antitelom, anti-TIGIT antitelom 313R19 ili anti-TIGIT antitelom 313M32 (313M3210 mg/mL) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Posle inkubacije, Jurkat ili Jurkat-hTIGIT ćelije su kombinovane sa NK ćelijama u odnosu efektor:cilj od 20:1 u pločama sa V-dnom sa 96 bunarića. Posle 4-časovne inkubacije na 37°C, supernatanti bez ćelija su sakupljeni i oslobađanje kalceina je kvantifikovano na fluorometru pri ekscitaciji od 485 nm i emisiji od 535 nm. Procenat specifične lize ćelija je određen kao: % lize = 1003 (ERSR)/(MR-SR), gde ER, SR i MR predstavljaju eksperimentalno oslobađanje, spontano oslobađanje i maksimalno oslobađanje kalceina, redom. Spontano oslobađanje je fluorescencija koju emituju ciljne ćelije inkubirane samo u medijumu (tj., u odsustvu efektorskih ćelija), dok se maksimalno oslobađanje određuje lizom ciljnih ćelija sa jednakom zapreminom od 10% SDS. I za Jurkat i za Jurkat-hTIGIT ćelijske linije, procenat ADCC se određuje kao procenat specifične lize u prisustvu eksperimentalnog antitela (313R19 ili 313M32) minus procenat specifične lize u prisustvu kontrolnog antitela. Kao što je prikazano na slici 26, procenat ADCC je značajno povećan u prisustvu anti-TIGIT antitela 313R19 i 313M32 kada su ciljne ćelije eksprimirale TIGIT. Sposobnost anti-TIGIT antitela da indukuju ADCC predlaže da anti-TIGIT antitela mogu imati više mehanizama za poboljšanje imunološkog odgovora na tumorske ćelije.
Primer 21
In vivo inhibicija rasta tumora kod humanizovanih miševa anti-TIGIT antitelom
[0423] Humanizovani mišji model je korišćen za proučavanje efikasnosti tretmana anti-TIGIT antitelom na humanom tumoru. Humanizovani miševi su dobijeni od Jackson Laboratories. Ovi miševi se dobijaju ubrizgavanjem ljudskih hematopoetskih matičnih ćelija (CD34<+>ćelije) u ozračene NSG miševe. Posle 15 nedelja, prisustvo zrelih humanih limfocita se potvrđuje protočnom citometrijom. Svakom mišu su potkožno ubrizgane ćelije tumora melanoma dobijenih od pacijenta (OMP-M9, 75.000 ćelija po mišu). Tumori su ostavljeni da rastu 19 dana dok nisu dostigli prosečnu zapreminu od približno 50 mm<3>. Miševi koji imaju tumor su nasumično podeljeni u grupe (n = 8 miševa po grupi). Miševi koji imaju tumor su tretirani ili kontrolnim antitelom, anti-TIGIT antitelom 313R19 ili anti-TIGIT antitelom 313M32. Miševima su davane doze od 1 mg/kg ili 5 mg/kg na svakih 5 dana. Praćen je rast tumora i merene su zapremine tumora elektronskim šublerom u naznačenim vremenskim tačkama.
[0424] Kao što je prikazano na Slici 27, rast tumora je inhibiran kod miševa tretiranih antitelom 313R19 i antitelom 313M32 u poređenju sa kontrolom. Ovi rezultati pokazuju da je ciljanje TIGIT-a bilo efikasno u povećanju antitumorskog imunog odgovora humanih limfocita i doprinosi inhibiciji rasta humanog tumora in vivo. U ovom eksperimentu, kombinacija anti-TIGIT antitela 313R19 ili 313M32 i anti-hPD-1 antitela nije inhibirala rast tumora u većoj meri od anti-TIGIT antitela kao pojedinačnih agenasa (podaci nisu prikazani).
[0425] Utvrđeno je da antitela 313M32 i 313R19 inhibiraju rast tumora u kontekstu humanih limfocita i da imaju slične in vivo potencijale. Ovi rezultati su pokazali da se humanizovani modeli miša koji imaju ksenotransplantate izvedene iz pacijenata mogu koristiti za proučavanje anti-TIGIT antitela 313M32 (koje samo vezuje humani TIGIT) paralelno sa pretkliničkim studijama sprovedenim sa anti-TIGIT antitelima 313R12 i 313R19 i modelima tumora miša.
Primer 22
Farmakokinetika anti-TIGIT antitela
[0426] Kao što je ovde opisano, anti-TIGIT antitelo 313R12 se prvenstveno vezuje za TIGIT miša i predstavlja surogat miša koji se koristi u većini pretkliničkih studija efikasnosti. Farmakokinetika anti-TIGIT antitela 313R12 je određena kod C57BL-6J miševa u dozama od 0,1, 1 i 10 mg/kg. Uzorci krvi su uzimani tokom 21 dana. 313R12 je pokazivao nelinearne 2-kompartmentalne PK karakteristike na ispitivanim nivoima doze. Veruje se da je takav klirens zavisan od koncentracije tipična karakteristika monoklonskih antitela za koja klirens posredovan sa ciljem može biti značajna komponenta ukupnog mehanizma eliminacije kada je meta u izobilju i lako dostupna leku. Pri dozi od 10 mg/kg, profil koncentracije i vremena 313R12 je dostigao približnu linearnost tokom 21 dana, što ukazuje na zasićenje pristupačnih ciljnih molekula. Procena terminalnog poluživota nije primenljiva za nelinearne PK podatke
[0427] Farmakokinetika anti-TIGIT antitela 313R19 je određena kod Balb/c miševa. Pojedinačna doza od 10 mg/kg data je svakom mišu ili IV ili IP. Uzorci krvi su uzimani tokom 21 dana. 313R19 je pokazao linearne 2-kompartmentalne PK karakteristike sa tipičnim IgG klirensom. Terminalni poluživot kod miševa pri dozi od 10 mg/kg procenjen je na 7,6 dana [0428] Farmakokinetika anti-TIGIT antitela 313R19 je takođe određena kod cinomolgus majmuna. Doze od 10, 30 i 100 mg/kg date su svakoj životinji, dva puta nedeljno po 4 doze. Svaka grupa za davanje doze se sastojala od 4 muške životinje i završetak studije je bio nakon četvrte doze bez perioda oporavka. 313R19 kod majmuna cinomolgus pokazao je linearne 2-kompartmentalne PK karakteristike sa tipičnim IgG klirensom. Terminalni poluživot kod cinomolgus majmuna je procenjeno na 15,3 dana
[0429] Farmakokinetika anti-TIGIT antitela 313M32 je određena kod Balb/c miševa. Pojedinačna doza od 1 ili 10 mg/kg data je svakom mišu IV ili 10 mg/kg IP. Uzorci krvi su uzimani tokom 21 dana. 313M32 kod miševa je pokazao linearne 2-kompartmentalne PK karakteristike, što je bilo u skladu sa činjenicom da 313M32 nije imao vezivanje za TIGIT miša koje se može detektovati. Klirens je bio spor i preliminarno je pokazao tipično IgG PK ponašanje. Terminalni poluživot kod miševa je procenjen na 11,7 dana.
[0430] Slede sekvence otkrivene u prijavi:
Mišja TIGIT aminokiselinska sekvenca (SEK ID BR:1)
Mišja
TIGIT aminokiselinska sekvenca bez predviđene signalne sekvence (SEK ID BT:2)
Mišji TIGIT ekstracelularni domen sekvence aminokiselina (SEK ID BR:3)
Humana TIGIT aminokiselinska sekvenca (SEK ID BR:4)
Humana TIGIT sekvenca aminokiselina bez predviđene signalne sekvence (SEK ID BR: 5)
Humani TIGIT ekstracelularni domen aminokiselinske sekvence (SEK ID BR:6)
313R11/313R12 Teški lanac CDR1 (SEK ID BR:7)
GSSLSSSYMS
313R11/313R12/313R14/313R19 Teški lanac CDR2 (SEK ID BR:8)
IIGSGNTYYANWAKG
313R11/313R12/313R14/313R19 Teški lanac CDR3 (SEK ID BR:9)
GGYRTSGMDP
313R11/313R12 Laki lanac CDR1 (SEK ID BR: 10)
QASQSISSYLNW
313R11/313R12 Laki lanac CDR2 (SEK ID BR: 11)
DALKLAS
313R11/313R12 Laki lanac CDR3 (SEK ID BR: 12)
QQEHSVGNVDN
313R14/313R19 Teški lanac CDR1 (SEK ID BR:13)
GFSLSSSYMS
313R14/313R19 Laki lanac CDR1 variant1 (SEK ID BR:14)
QASQSNIYSDLAW
313R14/313R19 Laki lanac CDR2 (SEK ID BR: 15)
RASTLAS
313R14/313R19 Laki lanac CDR3 (SEK ID BR:16)
QQEHLVAWIYN
313R11/313R12 aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (SEK ID BR:17)
313R11/313R12 aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (SEK ID BR:18)
313R14 aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (SEK ID BR:19)
313R14/313R19/313R20 aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (SEK ID BR:20)
313R11 aminokiselinska sekvenca teškog lanca (mIgG1) sa podvučenom signalnom sekvencom (SEK ID BR:21)
313R12 aminokiselinska sekvenca teškog lanca (mIgG2) sa podvučenom signalnom sekvencom (SEK ID BR:22)
313R11/313R12 aminokiselinska sekvenca lakog lanca sa podvučenom signalnom sekvencom (SEK ID BR:23)
1
313R14 aminokiselinska sekvenca teškog lanca (hIgG1) sa podvučenom signalnom sekvencom (SEK ID BR:24)
313R14/313R19/313R20 aminokiselinska sekvenca lakog lanca sa podvučenom signalnom sekvencom (SEK ID BR:25)
313R11 aminokiselinska sekvenca teškog lanca (mIgG1) bez signalne sekvence (SEK ID BR:26) 313R12 Sekvenca aminokiselina teškog lanca (mIgG2) bez signalne sekvence (SEK ID BR:27)
2
313R11/313R12 aminokiselinska sekvenca lakog lanca bez signalne sekvence (SEK ID BR:28)
313R14 Sekvenca aminokiselina teškog lanca (hIgG1) bez signalne sekvence (SEK ID BR:29) 313R14/313R19/313R20 aminokiselinska sekvenca lakog lanca bez predviđene signalne sekvence (SEK ID BR:30)
AH-1 peptid (SEK ID BR:31)SPSIVIHKF
313R19/313R20 aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (SEK ID BR:32)
313R19 aminokiselinska sekvenca teškog lanca (IgG1) sa podvučenom signalnom sekvencom (SEK ID BR:33)
313R19 aminokiselinska sekvenca teškog lanca (IgG1) bez signalne sekvence (SEK ID BR:34) Linker (SEK ID BR:35)
ESGGGGVT
Linker (SEK ID BR:36)
LESGGGGVT
Linker (SEK ID BR:37) GRAQVT
Linker (SEK ID BR:38)
WRAQVT
Linker (SEK ID BR:39)
ARGRAQVT FLAG Tag (SEK ID BR:40)
DYKDDDDK
Konstantni region teškog lanca humanog IgG1 (SEK ID BR:41)
4
Konstantni region teškog lanca humanog IgG2 (SEK ID BR:42
Konstantni region teškog lanca humanog IgG3 (SEK ID BR:43)
Konstantni region teškog lanca humanog IgG4 (SEK ID BR:44)
Humani IgG1 Fc region (13A verzija) (SEK ID BR:45)
Humani IgG1 Fc region (13B verzija) (SEK ID BR:46)
Humani IgG1 Fc region (13A verzija) (SEK ID BR:47)
Humani IgG2 Fc region (13B verzija) (SEK ID BR:50)
Humani IgG2 Fc region (13A verzija) (SEK ID BR:52) Humani IgG2 Fc region (13B verzija) (SEK ID BR:53)
Humani IgG2 Fc region (13B verzija) (SEK ID BR:54)
313R20 Sekvenca aminokiselina teškog lanca (IgG4) sa podvučenom signalnom sekvencom (SEK ID BR:55)
313R20 Sekvenca aminokiselina teškog lanca (IgG4) bez signalne sekvence (SEK ID BR:56) 313M26/313M32 Teški lanac CDR1 (SEK ID NO:57)
TSDTAWN
313M26/313M32 CDR2 teškog lanca (SEK ID BR:58)
YISYSGSTSYNPSLRS
313M26/313M32 Teški lanac CDR3 (SEK ID BR:59)
ARRQVGLGFAY
313M26/313M32 Laki lanac CDR1 (SEK ID BR:60)
KASQDVSTAVA
313M26/313M32 laki lanac CDR2 (SEK ID BR:61)
SASYRYT
313M26/313M32 laki lanac CDR3 (SEK ID BR:62)
QQHYSTP
313M26 aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (SEK ID BR:63)
313M26 aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (SEK ID BR:64)
313M26 nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (SEK ID BR:65)
313M26 nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (SEK ID BR:66)
313M32 Sekvenca aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca (SEK ID BR:67)
313M32 aminokiselinska sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (SEK ID BR:68)
313M32 Sekvenca aminokiselina teškog lanca (IgG1) sa predviđenom signalnom sekvencom podvučenom (SEK BR BR:69)
M32 Sekvenca aminokiselina teškog lanca (IgG1) bez signalne sekvence (SEK ID BR:70) M32 aminokiselinska sekvenca lakog lanca sa podvučenom predviđenom signalnom sekvencom (SEK ID BR:71)
M32 Aminokiselinska sekvenca lakog lanca bez signalne sekvence (SEK ID BR:72)
M32 nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca (SEK ID BR:73) M32 nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca (SEK ID BR:74)
M32 nukleotidna sekvenca teškog lanca (IgG1) (SEK ID BR:75)
1
313M32 nukleotidna sekvenca lakog lanca (SEK ID BR:76)
2
Rezus majmun TIGIT (SEK ID BR:78)
Humane TIGIT aminokiseline 55-70 (SEK ID BR:79)
TQVNVEQQDQLLAICN
Humane TIGIT aminokiseline 105-122 (SEK ID BR:80)
EYFCIYHTYPDGTYTGRI
313R14/313R19 Laki lanac CDR1 (SEK ID BR:81)
QASQNIYSDLAW
313M33 IgG4 aminokiselinska sekvenca teškog lanca bez signalne sekvence (SEK ID BR:82)
313M33 Sekvenca aminokiselina teškog lanca (IgG4) sa signalnom sekvencom (SEK ID BR:83) 313M33
nukleotidna sekvenca teškog lanca (IgG4) (SEK ID BR:84)
4

Claims (18)

Patentni zahtevi:
1. Antitelo koje specifično vezuje ekstracelularni domen humanog TIGIT-a, koji sadrži CDR1 teškog lanca koji sadrži TSDYAWN (SEK ID BR:57), CDR2 teškog lanca koji sadrži YISYSGSTSYNPSLRS (SEK ID BR:58) i CDR3 teškog lanca koji sadrži ARRQVGLGFAY (SEK ID BR:59), i CDR1 lakog lanca koji sadrži KASQDVSTAVA (SEK ID BR:60), CDR2 lakog lanca koji sadrži SASYRYT (SEK ID BR:61), i CDR3 lakog lanca koji sadrži QQHISTP (SEK ID BR:62).
2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:67 i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:68; opciono pri čemu antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEK ID BR:67 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEK ID BR:68.
3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, koje je monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, himerično antitelo, bispecifično antitelo, IgG1 antitelo, IgG2 antitelo, IgG4 antitelo ili fragment antitela koji sadrži mesto vezivanja antigena.
4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, koje sadrži sekvencu aminokiselina teškog lanca SEK ID BR:70 i sekvencu aminokiselina lakog lanca SEK ID BR:72.
5. Antitelo koje specifično vezuje ekstracelularni ćelijski domen humanog TIGIT-a, koji sadrži:
(a) varijabilni region teškog lanca kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122346 i varijabilni region lakog lanca kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122347; ili
(b) teški lanac kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122346 i laki lanac kodiran plazmidom deponovanim sa ATCC kao PTA-122347.
6. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, koje:
(a) inhibira vezivanje TIGIT-a za poliovirusni receptor (PVR);
(b) inhibira ili blokira interakciju između TIGIT-a i PVR-a;
(c) inhibira TIGIT signalizaciju;
(d) inhibira TIGIT aktivaciju;
(e) inhibira fosforilaciju TIGIT-a; i/ili
(f) smanjuje ekspresiju TIGIT-a na površini ćelije.
7. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 6, koje indukuje i/ili pojačava imuni odgovor.
8. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 7, koje:
(a) povećava imunitet posredovan ćelijama;
(b) povećava aktivnost T-ćelija;
(c) povećava aktivnost citolitičkih T-ćelija (CTL);
(d) povećava aktivnost prirodnih ćelija ubica (NK);
(e) povećava proizvodnju IL-2 i/ili broj ćelija koje proizvode IL-2;
(f) povećava proizvodnju IFN-gama i/ili broj ćelija koje proizvode IFN-gama;
(g) povećava imuni odgovor Th1 tipa;
(h) smanjuje proizvodnju IL-4 i/ili broj ćelija koje proizvode IL-4;
(i) smanjuje proizvodnju IL-10 i/ili broj ćelija koje proizvode IL-10;
(j) smanjuje imuni odgovor Th2-tipa;
(k) inhibira i/ili smanjuje supresivnu aktivnost regulatornih T-ćelija (Tregs); i/ili
(l) inhibira i/ili smanjuje supresivnu aktivnost supresorskih ćelija dobijenih iz mijeloida (MDSC).
9. Heterodimerni agens koje sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8.
10. Bispecifični agens koji sadrži:
a) prvi krak koji specifično vezuje TIGIT, i
b) drugi krak,
pri čemu prvi krak sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8.
11. Bispecifični agens prema patentnom zahtevu 10, pri čemu drugi krak:
(a) sadrži mesto vezivanja antigena iz antitela; ili
(b) specifično vezuje PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, OKS-40 ili GITR; ili
(c) specifično vezuje tumorski antigen; ili
(d) sadrži imunoterapeutski agens; opciono pri čemu je imunoterapeutski agens izabran iz grupe koju čine: faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF), faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF), faktor stimulacije kolonije granulocita (G-CSF), interleukin 2 (IL- 2), interleukin 3 (IL-3), interleukin 12 (IL-12), interleukin 15 (IL-15), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BB ligand, GITRL, OKS- 40L, anti-CD3 antitelo, anti-CTLA4 antitelo, anti-PD-1 antitelo, anti-PD-L1 antitelo, anti-GITR antitelo, anti-OKS-40 antitelo, anti-4-1BB antitelo, anti-LAG-3 antitelo, i anti-TIM-3 antitelo.
12. Ćelija koja sadrži ili proizvodi antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8 ili bispecifični agens prema patentom zahtevu 10 ili patentom zahtevu 11.
13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8 ili bispecifični agens prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
14. Izolovani polinukleotidni molekul koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8 ili bispecifični agens prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11.
15. Vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu patentnom 14.
16. Ćelija koja sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 14 ili vektor prema patentnom zahtevu 15.
17. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8 ili bispecifični agens prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11, za upotrebu u lečenju raka kod subjekta, pri čemu je rak poželjno izabran iz grupe koju čine kolorektalni rak, rak jajnika, rak pankreasa, rak pluća, rak jetre, rak dojke, rak bubrega, rak prostate, rak gastrointestinalnog trakta, melanom, rak grlića materice, rak mokraćne bešike, glioblastom i rak glave i vrata.
18. Antitelo ili bispecifični agens za upotrebu prema patentnom zahtevu 17, pri čemu tretman dalje obuhvata primenu najmanje jednog dodatnog imunoterapeutskog agensa; opciono pri čemu se imunoterapeutski agens bira iz grupe koju čine: GM-CSF, M-CSF, G-CSF, IL-2, IL-3, IL-12, IL-15, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 4-1BB ligand, GITRL, OKS-40 ligand, anti-CD3 antitelo, anti CTLA-4 antitelo, anti-PD-1 antitelo, anti-PD-L1 antitelo, anti-GITR antitelo, anti-OKS-40 antitelo, anti-4-1BB antitelo, anti-LAG-3 antitelo i anti-TIM-3 antitelo.
RS20211574A 2015-05-28 2016-05-27 Tigit- vezivna sredstva i njihova upotreba RS62815B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562167582P 2015-05-28 2015-05-28
US201562205279P 2015-08-14 2015-08-14
US201662313487P 2016-03-25 2016-03-25
PCT/US2016/034549 WO2016191643A2 (en) 2015-05-28 2016-05-27 Tigit-binding agents and uses thereof
EP16800775.5A EP3303379B1 (en) 2015-05-28 2016-05-27 Tigit-binding agents and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62815B1 true RS62815B1 (sr) 2022-02-28

Family

ID=57393726

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211574A RS62815B1 (sr) 2015-05-28 2016-05-27 Tigit- vezivna sredstva i njihova upotreba

Country Status (31)

Country Link
US (2) US10112997B2 (sr)
EP (2) EP3303379B1 (sr)
JP (2) JP6875295B2 (sr)
KR (1) KR102721641B1 (sr)
CN (2) CN109071620B (sr)
AU (1) AU2016267577B2 (sr)
BR (1) BR112017025529A2 (sr)
CA (1) CA2987607A1 (sr)
CL (1) CL2017003021A1 (sr)
CO (1) CO2017012342A2 (sr)
CY (1) CY1125260T1 (sr)
DK (1) DK3303379T3 (sr)
EC (1) ECSP17083779A (sr)
ES (1) ES2902150T3 (sr)
HR (1) HRP20211948T1 (sr)
HU (1) HUE057087T2 (sr)
IL (1) IL255577B (sr)
LT (1) LT3303379T (sr)
MA (1) MA42622B1 (sr)
MD (1) MD3303379T2 (sr)
MX (1) MX384199B (sr)
NZ (1) NZ738008A (sr)
PL (1) PL3303379T3 (sr)
PT (1) PT3303379T (sr)
RS (1) RS62815B1 (sr)
SA (1) SA517390370B1 (sr)
SI (1) SI3303379T1 (sr)
SM (1) SMT202100711T1 (sr)
TW (1) TWI715587B (sr)
WO (1) WO2016191643A2 (sr)
ZA (1) ZA201708265B (sr)

Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3208612B1 (en) 2008-04-09 2019-09-18 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
GB201403775D0 (en) 2014-03-04 2014-04-16 Kymab Ltd Antibodies, uses & methods
AU2015305754B2 (en) 2014-08-19 2018-10-25 Merck Sharp & Dohme Llc Anti-tigit antibodies
CN107207594B (zh) 2014-12-23 2019-05-07 百时美施贵宝公司 针对tigit的抗体
US10227408B2 (en) 2015-02-19 2019-03-12 Compugen Ltd. Anti-PVRIG antibodies and methods of use
EP3978929A1 (en) 2015-02-19 2022-04-06 Compugen Ltd. Pvrig polypeptides and methods of treatment
EP3283508B1 (en) 2015-04-17 2021-03-17 Alpine Immune Sciences, Inc. Immunomodulatory proteins with tunable affinities
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
CN108137691B (zh) 2015-09-02 2021-10-19 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研究发展有限公司 特异性针对人类t-细胞免疫球蛋白和itim结构域(tigit)的抗体
PL3356413T3 (pl) 2015-10-01 2022-04-19 Potenza Therapeutics, Inc. Białka anty-tigit wiążące antygen oraz sposoby ich zastosowania
WO2017152088A1 (en) * 2016-03-04 2017-09-08 JN Biosciences, LLC Antibodies to tigit
CN109069638B (zh) 2016-03-24 2022-03-29 璟尚生物制药公司 用于癌症治疗的三特异性抑制剂
IL262365B2 (en) 2016-04-15 2024-11-01 Alpine Immune Sciences Inc Immunomodulatory proteins ICOS ligand variants and uses thereof
EP4706777A2 (en) 2016-04-15 2026-03-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
TWI781934B (zh) 2016-05-27 2022-11-01 美商艾吉納斯公司 抗-tim-3抗體及其使用方法
US9567399B1 (en) 2016-06-20 2017-02-14 Kymab Limited Antibodies and immunocytokines
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
US11834490B2 (en) 2016-07-28 2023-12-05 Alpine Immune Sciences, Inc. CD112 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
US11471488B2 (en) 2016-07-28 2022-10-18 Alpine Immune Sciences, Inc. CD155 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
KR20260030924A (ko) 2016-08-09 2026-03-06 키맵 리미티드 항-icos 항체
CN110088132B (zh) 2016-08-17 2020-10-27 康姆普根有限公司 抗tigit抗体，抗pvrig抗体及其组合
SG10201912663YA (en) 2016-10-11 2020-03-30 Agenus Inc Anti-lag-3 antibodies and methods of use thereof
EP3534947A1 (en) 2016-11-03 2019-09-11 Kymab Limited Antibodies, combinations comprising antibodies, biomarkers, uses & methods
CN110662552A (zh) 2016-11-30 2020-01-07 昂科梅德制药有限公司 包含tigit结合剂的癌症治疗方法
US10759855B2 (en) 2016-12-02 2020-09-01 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Antigen binding molecules to TIGIT
CN109071656B (zh) * 2017-01-05 2021-05-18 璟尚生物制药公司 检查点调节物拮抗剂
KR102528384B1 (ko) * 2017-01-06 2023-05-02 이뮤너티바이오, 인크. 감소된 cd96/tigit 발현을 갖는 유전자 변형된 nk-92 세포
EP3589313A4 (en) * 2017-02-28 2021-05-19 Seagen Inc. ANTI-TIGITE ANTIBODY
EP3596114A2 (en) 2017-03-16 2020-01-22 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd80 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
JP2020511144A (ja) 2017-03-16 2020-04-16 アルパイン イミューン サイエンシズ インコーポレイテッド Ｐｄ−ｌ２バリアント免疫調節タンパク質及びその使用
JOP20190203A1 (ar) * 2017-03-30 2019-09-03 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لـ tigit وطرق استخدامها
US20200024351A1 (en) 2017-04-03 2020-01-23 Jounce Therapeutics, Inc. Compositions and Methods for the Treatment of Cancer
EP3615070A1 (en) 2017-04-26 2020-03-04 Bristol-Myers Squibb Company Methods of antibody production that minimize disulfide bond reduction
RS64576B1 (sr) 2017-05-01 2023-10-31 Agenus Inc Anti-tigit antitela i postupci njihove primene
CN110799213A (zh) 2017-06-01 2020-02-14 康姆普根有限公司 三联组合抗体疗法
WO2018229163A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 King's College London Methods of activating v delta 2 negative gamma delta t cells
GB201709808D0 (en) 2017-06-20 2017-08-02 Kymab Ltd Antibodies
WO2019018402A2 (en) * 2017-07-17 2019-01-24 Janssen Biotech, Inc. ANTIGEN-BINDING REGIONS DIRECTED AGAINST FIBRONECTIN TYPE III DOMAINS AND METHODS OF USING THE SAME
IL272227B2 (en) * 2017-07-27 2025-09-01 iTeos Belgium SA Anti-tigit antibodies
WO2019023504A1 (en) 2017-07-27 2019-01-31 Iteos Therapeutics Sa ANTI-TIGIT ANTIBODIES
BE1025333B1 (fr) * 2017-07-27 2019-01-23 Iteos Therapeutics S.A. Anticorps anti-tigit
US11512129B2 (en) 2017-09-29 2022-11-29 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. TIGIT antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof
KR102813968B1 (ko) 2017-10-10 2025-05-29 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Ctla-4 변이체 면역조절 단백질 및 이의 용도
SMT202600062T1 (it) 2017-10-18 2026-03-09 Alpine Immune Sciences Inc Proteine immunomodulatrici del ligando di icos variante e composizioni e metodi correlati
EP3697435A1 (en) * 2017-10-20 2020-08-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods of immunotherapy targeting tigit and/or cd112r or comprising cd226 overexpression
GB201721338D0 (en) 2017-12-19 2018-01-31 Kymab Ltd Anti-icos Antibodies
EP3728314A1 (en) 2017-12-19 2020-10-28 Kymab Limited Bispecific antibody for icos and pd-l1
SG11202006148UA (en) 2018-01-03 2020-07-29 Alpine Immune Sciences Inc Multi-domain immunomodulatory proteins and methods of use thereof
KR20200109313A (ko) 2018-01-15 2020-09-22 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. Tigit에 대한 항체 및 이의 변이체
CA3097625A1 (en) 2018-04-18 2019-10-24 Xencor, Inc. Il-15/il-15ra heterodimeric fc fusion proteins and uses thereof
SG11202010163QA (en) 2018-04-18 2020-11-27 Xencor Inc Pd-1 targeted heterodimeric fusion proteins containing il-15/il-15ra fc-fusion proteins and pd-1 antigen binding domains and uses thereof
CN112739717B (zh) * 2018-06-29 2025-02-11 璟尚生物制药公司 三特异性拮抗剂
KR20210040827A (ko) 2018-07-25 2021-04-14 이노벤트 바이오로직스 (쑤저우) 컴퍼니, 리미티드 항 tigit 항체 및 그 용도
JP2021534196A (ja) 2018-08-23 2021-12-09 シージェン インコーポレイテッド 抗ｔｉｇｉｔ抗体
EP3861016A2 (en) 2018-10-03 2021-08-11 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
AU2019359475A1 (en) 2018-10-12 2021-05-20 Xencor, Inc. PD-1 targeted IL-15/IL-15Ralpha Fc fusion proteins and uses in combination therapies thereof
WO2020113141A2 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Alpine Immune Sciences, Inc. Cd86 variant immunomodulatory proteins and uses thereof
CN113438961A (zh) 2018-12-20 2021-09-24 Xencor股份有限公司 含有IL-15/IL-15Rα和NKG2D抗原结合结构域的靶向异二聚体Fc融合蛋白
CN113614109A (zh) 2018-12-21 2021-11-05 Ose免疫疗法公司 双功能抗pd-1/il-7分子
SG11202107474RA (en) * 2019-01-07 2021-08-30 iTeos Belgium SA Anti-tigit antibodies
WO2020165374A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ose Immunotherapeutics Bifunctional molecule comprising il-15ra
WO2020176700A1 (en) * 2019-02-27 2020-09-03 Yale University Compositions and methods for enhancing mucosal immunity
EP3938396A1 (en) 2019-03-11 2022-01-19 Jounce Therapeutics, Inc. Anti-icos antibodies for the treatment of cancer
CN109734806B (zh) * 2019-03-15 2022-07-01 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 一种全人源抗huTIGIT单克隆抗体及其应用
TWI760751B (zh) 2019-05-29 2022-04-11 美商美國禮來大藥廠 Tigit及pd-1/tigit-結合分子
KR102332847B1 (ko) * 2019-06-13 2021-12-01 주식회사 녹십자 Tigit에 대한 항체 및 이의 용도
AU2020298324A1 (en) * 2019-06-21 2022-01-27 Single Cell Technology, Inc. Anti-TIGIT antibodies
US20220267475A1 (en) * 2019-06-25 2022-08-25 Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. Anti-cd47/anti-tigit bispecific antibody, preparation method therefor and application thereof
US10851157B2 (en) 2019-07-01 2020-12-01 Gensun Biopharma, Inc. Antagonists targeting the TGF-β pathway
CN114269782B (zh) * 2019-07-15 2023-12-29 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗tigit抗体及其应用
WO2021024020A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 and immune checkpoint inhibitors for treatment of cancer
CN110669139B (zh) * 2019-09-18 2025-12-02 沣潮医药科技（上海）有限公司 二聚体免疫粘附素、药物组合物和用途
CN112625130B (zh) * 2019-09-24 2023-08-29 财团法人工业技术研究院 抗-tigit抗体及使用之方法
WO2021062332A1 (en) * 2019-09-27 2021-04-01 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Combination of inhibitors of il4 signaling and immune checkpoints for treating cancer
CN115916233A (zh) 2019-10-03 2023-04-04 Xencor股份有限公司 靶向IL-12异源二聚体Fc融合蛋白
TW202128757A (zh) 2019-10-11 2021-08-01 美商建南德克公司 具有改善之特性的 PD-1 標靶 IL-15/IL-15Rα FC 融合蛋白
EP4055052A1 (en) 2019-11-05 2022-09-14 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer with anti-pd-1 antibodies
CN111018999B (zh) * 2019-12-05 2022-07-12 沣潮医药科技（上海）有限公司 二聚体免疫融合蛋白、药物组合物和用途
AU2020406083A1 (en) 2019-12-17 2022-06-16 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bifunctional molecules comprising an IL-7 variant
KR20220131260A (ko) * 2020-01-10 2022-09-27 상하이 헨리우스 바이오테크, 인크. 항tigit항체, 이를 포함하는 다중 특이적 항체 및 그 사용 방법
CN112409450B (zh) * 2020-03-29 2023-01-24 郑州大学 TIGIT-IgV的亲和剂及其应用
CN113563470B (zh) 2020-04-29 2023-02-10 广州昂科免疫生物技术有限公司 结合tigit抗原的抗体及其制备方法与应用
CA3176497A1 (en) 2020-05-07 2021-11-11 Fatima MECHTA-GRIGORIOU Antxr1 as a biomarker of immunosuppressive fibroblast populations and its use for predicting response to immunotherapy
GB202007321D0 (en) * 2020-05-18 2020-07-01 Inst De Medicina Molecular Joaeo Lobo Antunes T cells
BR112022024221A2 (pt) 2020-06-02 2022-12-20 Arcus Biosciences Inc Anticorpos para tigit
WO2021258337A1 (en) * 2020-06-24 2021-12-30 Huahui Health Ltd. Human monoclonal antibodies against tigit for immune related diseases
MX2023000197A (es) 2020-07-07 2023-02-22 BioNTech SE Arn terapeutico para el cancer positivo para vph.
CN111763660A (zh) * 2020-08-07 2020-10-13 南京大学 一种重组溶瘤痘苗病毒及其制备方法和应用
CN112190689B (zh) * 2020-08-25 2022-12-09 沣潮医药科技（上海）有限公司 Tigit免疫粘附素在调控肿瘤免疫及调节血管生成产品中的应用
AU2021372706A1 (en) * 2020-10-26 2023-06-08 Akeso Biopharma, Inc. Anti-tigit antibody, and pharmaceutical composition and use thereof
IL302402A (en) 2020-11-08 2023-06-01 Seagen Inc Combined treatment
WO2022112198A1 (en) 2020-11-24 2022-06-02 Worldwide Innovative Network Method to select the optimal immune checkpoint therapies
TW202222345A (zh) * 2020-11-26 2022-06-16 大陸商信達生物製藥（蘇州）有限公司 包含抗ｔｉｇｉｔ／ｐｄ－１雙特異性抗體的製劑及其製備方法和用途
WO2022135666A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Treatment schedule for cytokine proteins
WO2022135667A1 (en) 2020-12-21 2022-06-30 BioNTech SE Therapeutic rna for treating cancer
TW202245808A (zh) 2020-12-21 2022-12-01 德商拜恩迪克公司 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
WO2022148781A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Institut Curie Combination of mcoln activators and immune checkpoint inhibitors
AU2022253351A1 (en) 2021-04-09 2023-10-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh New scaffold for bifunctional molecules with improved properties
MX2023011796A (es) 2021-04-09 2024-01-08 Seagen Inc Métodos de tratamiento del cáncer con anticuerpos inmunorreceptor de células t con dominios ig e itim (anti-tigit).
EP4320156A1 (en) 2021-04-09 2024-02-14 Ose Immunotherapeutics Scaffold for bifunctioanl molecules comprising pd-1 or cd28 and sirp binding domains
BR112023021886A8 (pt) 2021-04-22 2024-01-09 Guangdong Fapon Biopharma Inc Polipeptídeo de fusão biespecífico multifuncional
AR125753A1 (es) 2021-05-04 2023-08-09 Agenus Inc Anticuerpos anti-tigit, anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
CN117916263B (zh) * 2021-05-10 2025-04-25 美帝马布生物公司 抗tigit抗体及其用途
JP2024525758A (ja) 2021-07-13 2024-07-12 ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア がんのための併用療法におけるｃｄ４０およびｃｄ１３７に対する多重特異性結合剤
IL310217A (en) * 2021-07-23 2024-03-01 Akeso Biopharma Inc Pharmaceutical composition and use
CN115838424A (zh) * 2021-09-22 2023-03-24 上海康岱生物医药技术股份有限公司 靶向tigit的单克隆抗体
TW202333802A (zh) 2021-10-11 2023-09-01 德商拜恩迪克公司 用於肺癌之治療性rna(二)
CN116284390A (zh) * 2021-12-21 2023-06-23 广东安普泽生物医药股份有限公司 人tigit抗体及其应用
WO2023149977A1 (en) * 2022-02-04 2023-08-10 Mereo Biopharma 5, Inc. Methods for treating cancer
PE20251671A1 (es) 2022-03-15 2025-06-30 Compugen Ltd Anticuerpos antagonistas de il-18bp y su uso en monoterapia y terapia de combinacion en el tratamiento del cancer
CA3256561A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Arcus Biosciences, Inc. Anti-tigit antibodies and their uses
WO2023234748A1 (ko) * 2022-06-03 2023-12-07 메디맵바이오 주식회사 항-tigit 항체 및 이의 용도
WO2024003360A1 (en) 2022-07-01 2024-01-04 Institut Curie Biomarkers and uses thereof for the treatment of neuroblastoma
WO2024028386A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Ose Immunotherapeutics Multifunctional molecule directed against cd28
JP2026505276A (ja) 2023-01-31 2026-02-13 ユニバーシティ オブ ロチェスター Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ感染症を治療するための免疫チェックポイント遮断療法
WO2024191807A1 (en) 2023-03-10 2024-09-19 Seagen Inc. Methods of treating cancer with anti-tigit antibodies
AU2024254671A1 (en) 2023-03-30 2025-10-02 Ose Immunotherapeutics Method of synthesis of targeted lipid nanoparticle and uses thereof
CN121358499A (zh) 2023-03-30 2026-01-16 Ose免疫疗法 靶向活化的免疫细胞以表达免疫细胞增强分子的基于脂质的纳米粒及其用途
TW202515608A (zh) 2023-06-26 2025-04-16 以色列商坎布根有限公司 Ｉｌ—１８ｂｐ拮抗抗體及其於癌症治療之單一療法及組合療法的用途
WO2025002151A1 (zh) * 2023-06-27 2025-01-02 正大天晴药业集团股份有限公司 抗tigit抗体及其应用
CN121398845A (zh) * 2023-07-14 2026-01-23 嘉和生物药业有限公司 抗pd-1/ctla-4/tigit三特异性抗体及其用途
WO2025068452A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Negio Therapeutics Guanfacine derivatives and their use in treating cancer
WO2025068461A1 (en) 2023-09-29 2025-04-03 Negio Therapeutics Guanfacine derivatives and their use in treating cancer
AR134560A1 (es) 2023-12-08 2026-01-28 Astellas Pharma Inc Terapia de combinación que implica agentes de unión biespecíficos que se unen a cldn18.2 y cd3 y agentes que estabilizan o aumentan la expresión de cldn18.2
WO2025120866A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and agents stabilizing or increasing expression of cldn18.2
WO2026033885A1 (en) 2024-08-08 2026-02-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and agents stabilizing or increasing expression of cldn18.2
WO2025120867A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Astellas Pharma Inc. Combination therapy involving bispecific binding agents binding to cldn18.2 and cd3 and anti-vegfr2 antibodies
WO2025132831A1 (en) 2023-12-19 2025-06-26 Universite D'aix-Marseille N-heteroaryl derivatives and uses thereof for treating cancer
WO2025242836A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of auto-immune or inflammatory diseases and disorders
WO2025242835A1 (en) 2024-05-22 2025-11-27 Ose Immunotherapeutics Molecules comprising masking linkers and uses thereof for the treatment of cancer
WO2025262250A1 (en) 2024-06-20 2025-12-26 Negio Therapeutics Guanfacine derivatives and their uses
WO2026068705A1 (en) 2024-09-26 2026-04-02 Ose Immunotherapeutics Lipid-based nanoparticles comprising non-glycosylated fc domains and uses thereof

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080050809A1 (en) 1999-09-28 2008-02-28 Alejandro Abuin Novel human kinases and polynucleotides encoding the same
US8044259B2 (en) 2000-08-03 2011-10-25 The Regents Of The University Of Michigan Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells
CU23007A1 (es) 2001-04-06 2004-12-17 Ct De Inmunologia Molecular Ct De Inmunologia Mole Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos
US20040185040A1 (en) * 2001-11-21 2004-09-23 Celltech R & D Limited Modulating immune responses
EP2388265A1 (en) 2002-02-22 2011-11-23 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US7193069B2 (en) 2002-03-22 2007-03-20 Research Association For Biotechnology Full-length cDNA
US20040121370A1 (en) 2002-09-11 2004-06-24 Genentech, Inc. Novel composition and methods for the treatment of immune related diseases
US8003108B2 (en) * 2005-05-03 2011-08-23 Amgen Inc. Sclerostin epitopes
EP3214095B1 (en) 2005-05-12 2019-12-11 ZymoGenetics, Inc. Compositions and methods for modulating immune responses
JP5129149B2 (ja) 2005-10-31 2013-01-23 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 癌を処置および診断するための組成物および方法
EA018260B1 (ru) 2006-09-29 2013-06-28 Онкомед Фармасьютикалз, Инк. Антитела к дельта-подобному лиганду 4 человека и их применение
EP3208612B1 (en) 2008-04-09 2019-09-18 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
US8551715B2 (en) 2010-02-12 2013-10-08 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying and isolating cells expressing a polypeptide
WO2012113813A1 (en) * 2011-02-23 2012-08-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against human il33r and uses thereof
HRP20201595T1 (hr) * 2011-11-28 2020-12-11 Merck Patent Gmbh Anti-pd-l1 protutijela i njihova uporaba
CN104968364A (zh) 2012-12-03 2015-10-07 百时美施贵宝公司 强化免疫调变性Fc融合蛋白的抗癌活性
HK1210964A1 (en) 2012-12-04 2016-05-13 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Immunotherapy with binding agents
CN103073644B (zh) * 2012-12-31 2014-03-12 中国科学技术大学 特异性抗小鼠tigit的单克隆抗体及其制备方法、鉴定及应用
US9062104B2 (en) 2013-03-14 2015-06-23 Alderbio Holdings Llc Therapeutic use of antibodies to HGF
CA2916681A1 (en) 2013-07-16 2015-01-22 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and tigit inhibitors
AU2015228372B2 (en) 2014-03-12 2018-05-31 Yeda Research And Development Co. Ltd Reducing systemic regulatory T cell levels or activity for treatment of disease and injury of the CNS
WO2015143343A2 (en) 2014-03-21 2015-09-24 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for treatment of immune-related diseases or disorders and/or therapy monitoring
SG11201700258VA (en) 2014-07-16 2017-02-27 Genentech Inc Methods of treating cancer using tigit inhibitors and anti-cancer agents
AU2015305754B2 (en) 2014-08-19 2018-10-25 Merck Sharp & Dohme Llc Anti-tigit antibodies
ES2771926T3 (es) 2014-09-13 2020-07-07 Novartis Ag Terapias de combinación
AU2015327868A1 (en) 2014-10-03 2017-04-20 Novartis Ag Combination therapies
KR20170072343A (ko) 2014-11-06 2017-06-26 제넨테크, 인크. Ox40 결합 효능제 및 tigit 억제제를 포함하는 병용 요법
WO2016100882A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novartis Ag Combination therapies
CN107207594B (zh) * 2014-12-23 2019-05-07 百时美施贵宝公司 针对tigit的抗体
JP2018503373A (ja) 2014-12-30 2018-02-08 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんの予後診断及び治療のための方法及び組成物
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
JO3620B1 (ar) 2015-08-05 2020-08-27 Amgen Res Munich Gmbh مثبطات نقطة فحص مناعية للاستخدام في علاج سرطانات محمولة عبر الدم
EP3334757A4 (en) 2015-08-14 2019-04-03 Merck Sharp & Dohme Corp. ANTI-Tigit ANTIBODY
CN108137691B (zh) 2015-09-02 2021-10-19 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研究发展有限公司 特异性针对人类t-细胞免疫球蛋白和itim结构域(tigit)的抗体
EP3349792A1 (en) 2015-09-14 2018-07-25 Compass Therapeutics LLC Compositions and methods for treating cancer via antagonism of the cd155/tigit pathway and tgf-
CA2994858C (en) 2015-09-25 2024-01-23 Genentech, Inc. Anti-tigit antibodies and methods of use
PL3356413T3 (pl) 2015-10-01 2022-04-19 Potenza Therapeutics, Inc. Białka anty-tigit wiążące antygen oraz sposoby ich zastosowania
WO2017152088A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 JN Biosciences, LLC Antibodies to tigit
CN110662552A (zh) 2016-11-30 2020-01-07 昂科梅德制药有限公司 包含tigit结合剂的癌症治疗方法

Also Published As

Publication number Publication date
MA42622A (fr) 2018-06-20
WO2016191643A3 (en) 2017-01-12
US20160376365A1 (en) 2016-12-29
HRP20211948T1 (hr) 2022-03-18
JP2021118719A (ja) 2021-08-12
WO2016191643A2 (en) 2016-12-01
EP3303379B1 (en) 2021-10-13
KR102721641B1 (ko) 2024-10-25
US20190077864A1 (en) 2019-03-14
US10544219B2 (en) 2020-01-28
US10112997B2 (en) 2018-10-30
CN109071620B (zh) 2022-05-10
EP3303379A2 (en) 2018-04-11
BR112017025529A2 (en) 2018-08-07
PL3303379T3 (pl) 2022-02-07
MA42622B1 (fr) 2021-11-30
SI3303379T1 (sl) 2022-01-31
IL255577B (en) 2022-02-01
CL2017003021A1 (es) 2018-06-01
MD3303379T2 (ro) 2022-02-28
WO2016191643A4 (en) 2017-03-23
AU2016267577A1 (en) 2017-12-21
JP6875295B2 (ja) 2021-05-19
HUE057087T2 (hu) 2022-04-28
EP3303379A4 (en) 2019-04-17
ECSP17083779A (es) 2018-02-28
JP7203446B2 (ja) 2023-01-13
CN109071620A (zh) 2018-12-21
CA2987607A1 (en) 2016-12-01
CN115429877A (zh) 2022-12-06
NZ738008A (en) 2019-08-30
JP2018521634A (ja) 2018-08-09
MX384199B (es) 2025-03-14
CO2017012342A2 (es) 2018-02-28
AU2016267577B2 (en) 2020-12-10
ES2902150T3 (es) 2022-03-25
TW201718646A (zh) 2017-06-01
PT3303379T (pt) 2022-01-06
IL255577A (en) 2018-01-31
SMT202100711T1 (it) 2022-01-10
CY1125260T1 (el) 2023-03-24
KR20180014050A (ko) 2018-02-07
ZA201708265B (en) 2025-04-30
DK3303379T3 (da) 2021-12-06
SA517390370B1 (ar) 2021-09-12
MX2017014955A (es) 2018-04-13
LT3303379T (lt) 2021-12-10
EP4011907A1 (en) 2022-06-15
TWI715587B (zh) 2021-01-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7203446B2 (ja) Ｔｉｇｉｔ結合物質およびその使用法
US10232017B2 (en) Method of treating cancer by administering tumor necrosis factor receptor ligand superfamily (TNFRSF) single-chain polypeptides
CN107530419B (zh) 治疗疾病的组合疗法
US20180346571A1 (en) Pd-l1-binding agents and uses thereof
WO2018017864A2 (en) Pvrig-binding agents and uses thereof
WO2018027025A1 (en) Cd40-binding agents and uses thereof
CA2892831A1 (en) Immunotherapy with binding agents
WO2019032945A1 (en) CD40 BINDING AGENT AND USES THEREOF
HK40075836A (en) Tigit-binding agents and uses thereof
EP3142698A2 (en) Immunotherapy with binding agents
EA039540B1 (ru) Связывающие tigit агенты и варианты их применения
OA18684A (en) Tigit-Binding Agents and Uses Thereof
HK1260639A1 (en) Tigit-binding agents and uses thereof
HK1260639B (en) Tigit-binding agents and uses thereof