MD3328889T2 - Constructe de anticorp bispecific de legare a DLL3 şi CD3 - Google Patents

Constructe de anticorp bispecific de legare a DLL3 şi CD3 Download PDF

Info

Publication number
MD3328889T2
MD3328889T2 MDE20180562T MDE20180562T MD3328889T2 MD 3328889 T2 MD3328889 T2 MD 3328889T2 MD E20180562 T MDE20180562 T MD E20180562T MD E20180562 T MDE20180562 T MD E20180562T MD 3328889 T2 MD3328889 T2 MD 3328889T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
seq
cdr
dll3
antibody construct
antibody
Prior art date
Application number
MDE20180562T
Other languages
English (en)
Inventor
Tobias Raum
Peter Kufer
Jochen Pendzialek
Claudia Bluemel
Christoph Dahlhoff
Patrick Hoffmann
Ralf Lutterbuese
Elisabeth Nahrwold
Original Assignee
Amgen Res Munich Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Res Munich Gmbh filed Critical Amgen Res Munich Gmbh
Publication of MD3328889T2 publication Critical patent/MD3328889T2/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00113—Growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4225—Growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/55—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Prezenta invenţie se referă la un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unui Tcell. Mai mult, invenţia oferă o polinucleotidă care codifică constructul anticorpului, un vector cuprinzând polinucleotida menţionată şi o celulă gazdă transformată sau transfectată cu polinucleotida sau vectorul menţionat. Mai mult, invenţia oferă un procedeu pentru producerea constructului anticorpului conform invenţiei, o utilizare medicală a constructului anticorp menţionat şi un kit care cuprinde acest construct de anticorp.

Description

Prezenta invenţie se referă la un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T aşa cum este definit în revendicări. Mai mult, invenţia furnizează o polinucleotidă care codifică constructul anticorpului, un vector cuprinzând polinucleotida menţionată şi o celulă gazdă transformată sau transfectată cu polinucleotida sau vectorul menţionat aşa cum este definit în revendicări. Mai mult, invenţia oferă un procedeu pentru producerea constructului de anticorp din invenţie, o utilizare medicală a constructului de anticorp menţionat şi un kit care cuprinde constructul de anticorp menţionat aşa cum este definit în revendicări.
Cancerul pulmonar cu celule mici (SCLC) este o formă agresivă de cancer pulmonar cu un prognostic slab şi opţiuni terapeutice limitate, reprezentând aproximativ 15% din toate cazurile de cancer pulmonar nou diagnosticat şi egal cu aproximativ 25.000 de cazuri noi în US şi 180.000 de cazuri noi la nivel mondial pe an. Ratele de supravieţuire au rămas scăzute timp de câteva decenii, doar 5% dintre pacienţii cu SCLC supravieţuind cinci ani, în mare parte din cauza lipsei de noi terapii pentru combaterea acestei forme de cancer pulmonar. Majoritatea pacienţilor prezintă boală în stadiu extensiv, în timp ce aproximativ o treime dintre pacienţi prezintă boală în stadiu limitat, definită de prezenţa tumorilor în doar o parte a pieptului şi care se încadrează într-un singur câmp de radiaţii. Aceste etape au impact asupra regimentelor terapeutice disponibile, cu boală în stadiu limitat tratată cu chimioterapie şi radiaţii şi boală în stadiu extins tratată numai cu chimioterapie. Tumorile diseminate, metastatice cu caracteristici asemănătoare limfomului sunt un semn distinctiv al SCLC. Primul diagnostic cunoscut al pacienţilor cu SCLC a descris-o ca pe o boală a sistemului limfatic, nefiind recunoscută de cancer pulmonar până în 1926, ceea ce evidenţiază o parte din natura unică a tumorilor SCLC în comparaţie cu alte tumori solide.
Pacienţii răspund de obicei bine la terapia curentă de primă linie, care include etopozidă şi cisplatină, dar recidivează repede invariabil cu boală chimiorezistentă, pentru care nu sunt disponibile în prezent opţiuni terapeutice. Prognosticul în regimul refractar recidivant este extrem de slab, cu progresie rapidă a bolii şi supravieţuire mediană scurtă de mai puţin de şase luni. Mai mult, pacienţii cu SCLC au rate ridicate de comorbidităţi, inclusiv hipertensiune arterială, boli cardiace, diabet şi sindroame paraneoplazice. Acestea, împreună cu vârsta de obicei avansată a pacienţilor cu SCLC, au un impact asupra capacităţii pacienţilor de a suporta regimuri chimio dure, limitând în continuare opţiunile de tratament.
O modalitate de anticorp bispecific, cuprinzând un scFv care recunoaşte CD3 exprimat pe celulele T şi un alt scFv care recunoaşte un antigen asociat tumorii, a demonstrat o eficacitate promiţătoare în clinică, cu rate ridicate de răspuns în tumorile hematologice maligne, cum ar fi B-ALL refractar (Topp, MS şi colab. Blood, 2012. 120 (26): p.5185-5187), rezultând în aprobarea Blincyto. În timp ce eficacitatea terapiilor cu implicarea celulelor T nu a fost încă demonstrată într-o indicaţie tumorală solidă, SCLC poate reprezenta o indicaţie tumorală solidă promiţătoare pentru modalitatea anticorpului bispecific ţintă al tumorii CD3 x, dată fiind natura diseminată a bolii. Prin urmare, o angajare de celule T bispecifice care direcţionează celulele T împotriva unui antigen tumoral specific prezintă o nouă oportunitate ca o nouă opţiune terapeutică în tratamentul SCLC.
DLL3 a fost identificat în prezent ca un antigen tumoral specific SCLC prin secvenţierea generaţiei următoare, comparând prevalenţa ARNm DLL3 într-un grup de tumori primare ale pacientului şi o colecţie mare de ţesuturi normale. Nivelul expresiei DLL3 în tumorile SCLC a fost moderat, dar foarte răspândit, cu aproximativ 90% dintre tumorile analizate prezentând dovezi ale expresiei DLL3 prin ARN-secv. Spre deosebire de tumorile SCLC, ţesuturile normale au prezentat o expresie foarte scăzută a transcriptului DLL3, cu niveluri mici detectate în testicul, nervul optic şi cerebel. Compararea liniilor celulare SCLC şi tumorilor prin ARN-secv a arătat niveluri de expresie similare, în timp ce cuantificarea suprafeţei celulare a expresiei DLL3 pe liniile celulare SCLC a indicat niveluri de expresie sub 5000 DLL3 per celulă, cu niveluri de expresie tipice sub 2000 DLL3/celulă. Expresia proteinei DLL3 a fost confirmată de IHC, unde 86% din tumorile SCLC au prezentat colorare pozitivă pentru DLL3, cu un model de colorare omogen şi membranos. În afară de colorarea foarte slabă a cerebelului, toate celelalte ţesuturi normale au fost negative pentru colorarea DLL3.
DLL3 este un ligand Notch non-canonic, funcţionând într-o manieră celulară autonomă pentru a inhiba semnalizarea Notch, legându-se de Notch în cis, blocând astfel interacţiunile celulă la celulă şi internalizarea Notch în celula ţintă, un semn distinctiv al semnalizării Notch canonice. Rolul principal pentru DLL3 este în somitogeneză în timpul dezvoltării embrionare. Şoarecii cu eliminări DLL3 prezintă defecte segmentare ale scheletului axial şi ale dezvoltării craniene şi neuronale. Defecte ale modelării somitice sunt, de asemenea, observate la oameni cu anumite mutaţii ale liniei germinale DLL3, rezultând o afecţiune numită dizostoză spondilocostală.
DLL3 a fost propus anterior în metode pentru diagnosticarea şi tratarea gliomului, pe lângă SCLC, utilizând un conjugat anticorp-medicament (ADC) (WO 2013/126746). Utilizarea unei abordări bazate pe ADC pentru DLL3 poate avea limitări, având în vedere nivelurile scăzute de expresie ale proteinei pe suprafaţa celulei şi performanţa redusă a ADC împotriva ţintelor cu expresie scăzută. Mai mult, moleculele ADC demonstrează adesea toxicitatea legată de capul exploziv liber, probabil un rezultat al degradării linkerului, rezultând limitări maxime tolerate ale dozei şi impacturi potenţiale asupra eficacităţii fără legătură cu ţinta aleasă pentru anticorp. Aceasta este mai puţin probabil să fie o problemă pentru o moleculă bispecifică care se angajează cu celule DLL3 şi DL3 simultan, având în vedere sensibilitatea necesară a celulelor T pentru ţintele lor şi s-a demonstrat citotoxicitatea in vitro foarte puternică pe liniile celulare care exprimă mai multe sute de proteine ​​ţintă per celulă. În plus, dimensiunea de obicei mai mică a unui construct de anticorpi bispecifici T care se angajează în raport cu un anticorp normal (IgG de lungime întreagă) poate îmbunătăţi penetrarea ţesuturilor şi creşte potenţa datorită angajării mai eficiente a ţintelor DLL3 şi CD3, rezultând o formare îmbunătăţită a sinapselor între celula T şi celula tumorii ţintă.
SCLC rămâne o nevoie medicală semnificativă nesatisfăcută şi sunt necesare noi opţiuni terapeutice pentru a îmbunătăţi perspectivele pentru această populaţie considerabilă de pacienţi. Modalitatea de anticorp bispecific discutată mai sus este validată clinic şi, ca atare, un construct de anticorp care vizează DLL3 şi CD3 reprezintă o nouă posibilitate promiţătoare pentru tratamentul SCLC şi o oportunitate de a îmbunătăţi supravieţuirea pacienţilor care suferă de această indicaţie. WO2014/125273 descrie reactivi de legare DLL3 pentru tratamentul şi/sau diagnosticarea cancerului. În special, WO2014/125273 descrie liza celulară a celulelor care exprimă DMS79 DLL3 prin activarea celulelor T de anticorpi policlonali bispecifici anti-DLL3-anti-CD3. Deoarece este încă nevoie să avem disponibile alte opţiuni pentru tratamentul bolilor tumorale sau canceroase legate de supraexprimarea DLL3, sunt furnizate aici mijloace şi metode pentru soluţionarea acestei probleme sub forma unui construct de anticorp bispecific cu un domeniu de legare direcţionat către DLL3 şi un al doilea domeniu de legare direcţionat către CD3 pe celulele T.
Astfel, într-un prim aspect, prezenta invenţie oferă un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR. 260 şi în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR. 258 conform definiţiilor din revendicări. Într-un al doilea aspect, prezenta invenţie furnizează un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR. 260 şi în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR. 259 conform definiţiilor din revendicări.
Trebuie remarcat faptul că, aşa cum sunt utilizate aici, formele de singular „u», „un» şi „ul» includ referinţe la plural, cu excepţia cazului în care contextul indică în mod clar contrariul. Astfel, de exemplu, referinţa la „un reactiv» include unul sau mai mulţi dintre aceşti reactivi diferiţi, şi referinţa la „metodă» include referinţa la etape echivalente şi metode cunoscute celor cu calificare obişnuită în domeniu care ar putea fi modificate sau substituite pentru metodele descrise aici.
Cu excepţia cazului în care se indică altfel, termenul „cel puţin» care precede o serie de elemente trebuie înţeles că se referă la fiecare element din serie. Cei cu calificare în domeniu vor recunoaşte sau vor putea constata folosind nu mai mult decât experimentarea de rutină, multe echivalenţe la exemplele de realizare specifice ale invenţiei descrise aici. Astfel de echivalenţe sunt intenţionaţe să fie cuprinse de prezenta invenţie.
Termenul "şi/sau" oriunde este utilizat aici include sensul de "şi", "sau" şi "toate sau orice altă combinaţie a elementelor legate de termenul menţionat".
Termenul "aproximativ" sau "aproximativ" aşa cum este utilizat aici înseamnă în intervalul ± 20%, preferabil în intervalul ± 15%, mai preferabil în intervalul ± 10% şi cel mai preferabil în intervalul ± 5% dintr-o anumită valoare sau interval.
De-a lungul acestei descrieri şi a revendicărilor care urmează, cu excepţia cazului în care contextul impune altfel, cuvântul „cuprinde» şi variaţii precum „cuprinzând», vor fi înţelese ca implicând includerea unui număr întreg sau a unei etape sau a unui grup de numere întregi sau paşi, dar nu excluderea oricărui alt număr întreg sau pas sau grup de număr întreg sau pas. Când este utilizat aici, termenul "cuprinzând" poate fi substituit cu termenul "conţinând" sau "incluzând" sau uneori când este utilizat aici cu termenul "având".
Atunci când este utilizat aici, „constând din» exclude orice element, etapă sau ingredient nespecificat în elementul revendicării. Atunci când este utilizat aici, „constând în esenţă din» nu exclude materialele sau etapele care nu afectează material caracteristicile de bază şi noi ale revendicării.
În fiecare caz de aici, oricare dintre termenii "cuprinzând", "constând în esenţă din" şi "constând din" poate fi înlocuit cu oricare dintre ceilalţi doi termeni.
Termenul "construct de anticorp" se referă la o moleculă în care structura şi/sau funcţia se bazează pe structura şi/sau funcţia unui anticorp, de ex., a unei molecule de imunoglobulină de lungime completă sau întreagă. Un construct de anticorp este, prin urmare, capabil să se lege de ţinta sau antigenul său specific. Mai mult, un construct de anticorp conform invenţiei cuprinde cerinţele structurale minime ale unui anticorp care permit legarea ţintei. Această cerinţă minimă este definită de prezenţa a cel puţin celor trei CDR-uri de lanţ uşor (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 din regiunea VL) şi a celor trei CDR-uri de lanţ greu (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 din regiunea VH), adică a tuturor şase CDR-uri. Anticorpii pe care se bazează constructele conform invenţiei includ, de exemplu, anticorpi monoclonali, recombinaţi, himerici, dezimunizaţi, umanizaţi şi umani.
În definiţia „constructelor de anticorpi» conform invenţiei sunt anticorpi cu lungime completă sau întregi, incluzând, de asemenea, anticorpi de camelide şi alţi anticorpi imunoglobulinici generaţi prin metode sau procedee de inginerie biotehnologică sau proteică. Aceşti anticorpi de lungime completă pot fi, de exemplu, anticorpi monoclonali, recombinaţi, himerici, dezimunizaţi, umanizaţi şi umani. De asemenea, în definiţia „constructe de anticorpi» se află fragmente de anticorpi de lungime completă, cum ar fi VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 sau „r IgG» („jumătate de anticorp»). Constructele de anticorp conform invenţiei pot fi, de asemenea, fragmente modificate de anticorpi, numite şi variante de anticorpi, cum ar fi scFv, di-scFv sau bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-fermoar, scFab, Fab2, Fab3, diacorpi, diacorpi cu lanţ unic, diacorpi tandem (Tandab), di-scFv tandem, tri-scFv tandem, „minicorpi» exemplificaţi printr-o structură care este după cum urmează: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2, ((scFv)2-CH3 + CH3), ((scFv)2-CH3) sau (scFv-CH3-scFv)2, multicorpi cum ar fi triacorpi sau tetracorpi şi anticorpi cu un singur domeniu cum ar fi nanocorpi sau anticorpi cu un singur domeniu variabil cuprinzând doar un domeniu variabil, care ar putea fi VHH, VH sau VL, care leagă specific un antigen sau epitop independent de alte regiuni V sau domenii. Alte formate preferate ale constructelor anticorpului conform invenţiei sunt corpii încrucişaţi, maxi corpii, constructele hetero Fc şi constructele mono Fc. Exemple pentru aceste formate vor fi descrise aici mai jos.
Un domeniu de legare poate cuprinde în mod tipic o regiune variabilă a lanţului uşor al anticorpului (VL) şi o regiune variabilă a lanţului greu al anticorpului (VH); cu toate acestea, nu trebuie să cuprindă ambele. Fragmentele Fd, de exemplu, au două regiuni VH şi adesea păstrează o anumită funcţie de legare la antigen a domeniului intact de legare la antigen. Exemple suplimentare pentru formatul de fragmente de anticorpi, variante de anticorpi sau domenii de legare includ (1) un fragment Fab, un fragment monovalent având domeniile VL, VH, CL şi CH1; (2) un fragment F(ab')2, un fragment bivalent având două fragmente Fab legate printr-o punte disulfură la regiunea balamalei; (3) un fragment Fd având cele două domenii VH şi CH1; (4) un fragment Fv având domeniile VL şi VH ale unui singur braţ al unui anticorp, (5) un fragment dAb (Ward şi colab., (1989) Nature 341: 544-546), care are un domeniu VH; (6) o regiune izolată de determinare a complementarităţii (CDR) şi (7) un singur lanţ Fv (scFv), acesta din urmă fiind preferat (de exemplu, derivat dintr-o bibliotecă scFv). Exemple de realizări ale constructelor de anticorpi conform invenţiei sunt de ex. descrise în WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, WO2014/144722, WO 2014/151910, şi WO 2015/048272.
Mai mult, definiţia termenului „construct de anticorp» include constructe monovalente, bivalente şi polivalente/multivalente şi, prin urmare, constructe monospecifice, care se leagă specific de o singură structură antigenică, precum şi constructe bispecifice şi polispecifice/multispecifice, care leagă specific mai mult decât o structură antigenică, de ex două, trei sau mai multe, prin domenii de legare distincte. Mai mult, definiţia termenului „construct de anticorp» include molecule care constau dintr-un singur lanţ polipeptidic, precum şi molecule constând din mai multe lanţuri polipeptidice, care lanţuri pot fi identice (homodimeri, homotrimeri sau homo oligomeri) sau diferite (heterodimeri, heterotrimeri sau heterooligomeri). Exemple de anticorpi identificaţi mai sus şi variante sau derivaţi ai acestora sunt descrise, inter alia, înHarlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) and Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann and Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed. 2010 and Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.
Constructele de anticorp conform prezentei invenţii sunt, de preferinţă, „constructe de anticorp generate in vitro». Acest termen se referă la un construct de anticorp conform definiţiei de mai sus, în care toată sau o parte a regiunii variabile (de ex., cel puţin un CDR) este generată într-o selecţie de celule neimune, de ex., un afişaj de fagi in vitro, cip proteic sau orice alt altă metodă în care secvenţele candidate pot fi testate pentru capacitatea lor de a se lega de un antigen. Astfel, acest termen exclude, de preferinţă, secvenţele generate exclusiv de rearanjarea genomică într-o celulă imună la un animal. Un „anticorp recombinant» este un anticorp produs prin utilizarea tehnologiei de ADN recombinant sau a ingineriei genetice.
Termenul „anticorp monoclonal» (mAb) sau construct de anticorp monoclonal aşa cum este utilizat aici se referă la un anticorp obţinut dintr-o populaţie de anticorpi substanţial omogeni, adică, anticorpii individuali care cuprind populaţia sunt identici, cu excepţia posibilelor mutaţii care apar în mod natural şi/sau post- modificări ale translaţiei (de ex., izomerizări, amidări) care pot fi prezente în cantităţi minore. Anticorpii monoclonali sunt foarte specifici, fiind direcţionaţi împotriva unui singur situs antigenic sau determinant asupra antigenului, spre deosebire de preparatele convenţionale (policlonale) de anticorpi care includ de obicei diferiţi anticorpi direcţionaţi împotriva diferiţilor determinanţi (sau epitopi). În plus faţă de specificul lor, anticorpii monoclonali sunt avantajoşi prin faptul că sunt sintetizaţi prin cultura hibridomului, deci necontaminat de alte imunoglobuline. Modificatorul „monoclonal» indică caracterul anticorpului ca fiind obţinut dintr-o populaţie substanţial omogenă de anticorpi şi nu trebuie interpretat ca necesitând producerea anticorpului prin nici o metodă particulară.
Pentru prepararea anticorpilor monoclonali, poate fi utilizată orice tehnică care furnizează anticorpi produşi de culturi de linie celulară continuă. De exemplu, anticorpii monoclonali care trebuie utilizaţi pot fi produşi prin metoda hibridoma descrisă mai întâi de Koehler şi colab., Nature, 256: 495 (1975), sau poate fi realizat prin metode de ADN recombinant (vezi, de ex., brevetul US nr. 4.816.567). Exemple de alte tehnici de producere a anticorpilor monoclonali umani includ tehnica triomului, tehnica hibridomului cu celule B umane (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) şi tehnica EBV-hibridoma (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).
Hibridomele pot fi apoi testate folosind metode standard, cum ar fi testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) şi analiza rezonanţei plasmonului de suprafaţă (BIACORE™), pentru a identifica unul sau mai mulţi hibridomi care produc un anticorp care se leagă specific cu un antigen specificat. Orice formă a antigenului relevant poate fi utilizată ca imunogen, de ex., antigen recombinant, forme naturale, orice variante sau fragmente ale acestuia, precum şi o peptidă antigenică a acestuia. Rezonanţa plasmonului de suprafaţă, utilizată în sistemul BIAcore, poate fi utilizată pentru a creşte eficienţa anticorpilor fagi care se leagă de un epitop al unui antigen ţintă, cum ar fi DLL3 sau CD3 epsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Metode 183 (1995), 7-13).
O altă metodă exemplificativă de fabricare a anticorpilor monoclonali include screening-ul bibliotecilor de expresie a proteinelor, de ex., bibliotecile de afişarea fagilor sau afişare a ribozomilor. Afişarea de fagi este descrisă, de exemplu, în Ladner şi colab., brevet U.S. Nr. 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson şi colab., Nature, 352: 624-628 (1991) şi Marks şi colab., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).
În plus faţă de utilizarea bibliotecilor de afişare, antigenul relevant poate fi utilizat pentru imunizarea unui animal neuman, de ex., un rozător (cum ar fi un şoarece, hamster, iepure sau şobolan). Într-o variantă de realizare, animalul non-uman include cel puţin o parte a unei gene a imunoglobulinei umane. De exemplu, este posibil să se proiecteze tulpini de şoarece deficiente în producţia de anticorpi de şoarece cu fragmente mari de locusuri de Ig (imunoglobulină) umană. Folosind tehnologia hibridomului, pot fi produşi şi selectaţi anticorpi monoclonali specifici antigenului derivaţi din gene cu specificitatea dorită. Vezi, de ex., XENOMOUSE™, Green şi colab. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096, şi WO 96/33735.
Un anticorp monoclonal poate fi, de asemenea, obţinut de la un animal neuman şi apoi modificat, de ex., umanizat, dezimunizat, făcut himeric etc., utilizând tehnici de ADN recombinant cunoscute în domeniu. Exemplele de constructe de anticorpi modificaţi includ variante umanizate de anticorpi neumani, anticorpi „cu afinitate maturată» (vezi, de ex., Hawkins şi colab. J. Mol. Biol. 254, 889-896 (1992) şi Lowman şi colab., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991)) şi mutanţi de anticorpi cu funcţii efectoare modificate (vezi, de ex., brevetul US 5.648.260, Kontermann şi Dübel (2010), loc. cit. şi Little (2009), loc. cit.).
În imunologie, maturarea afinităţii este procesul prin care celulele B produc anticorpi cu afinitate crescută pentru antigen în cursul unui răspuns imun. Cu expuneri repetate la acelaşi antigen, o gazdă va produce anticorpi cu afinităţi succesiv mai mari. La fel ca prototipul natural, maturizarea afinităţii in vitro se bazează pe principiile mutaţiei şi selecţiei. Maturarea afinităţii in vitro a fost utilizată cu succes pentru a optimiza anticorpii, constructele de anticorpi şi fragmentele de anticorpi. Mutaţiile aleatorii din interiorul CDR-urilor sunt introduse folosind radiaţii, mutageni chimici sau PCR predispuse la erori. În plus, diversitatea genetică poate fi mărită prin amestecarea lanţului. Două sau trei runde de mutaţie şi selecţie folosind metode de afişare, cum ar fi afişarea fagilor, duc de obicei la fragmente de anticorpi cu afinităţi în domeniul nanomolar scăzut.
Un tip preferat de variaţie substituţională a aminoacizilor constructelor de anticorpi implică substituirea unuia sau mai multor reziduuri de regiune hipervariabilă ale unui anticorp părinte (de ex., un anticorp umanizat sau uman). În general, variantele rezultate selectate pentru dezvoltarea ulterioară vor avea proprietăţi biologice îmbunătăţite în raport cu anticorpul părinte din care sunt generaţi. O modalitate convenabilă de a genera astfel de variante de substituţie implică maturarea afinităţii folosind afişarea fagilor. Pe scurt, mai multe situsuri ale regiunii hipervariabile (de ex., 6-7 situsuri) sunt mutate pentru a genera toate substituţiile posibile de aminoacizi la fiecare situs. Variantele de anticorpi astfel generate sunt afişate într-un mod monovalent din particule de fagi filamentoase ca fuziuni cu produsul genei III din M13 ambalat în fiecare particulă. Variantele afişate pe fagi sunt apoi selectate pentru activitatea lor biologică (de ex., afinitate de legare) aşa cum este dezvăluit aici. Pentru a identifica situsurile regiunii hipervariabile candidate pentru modificare, se poate efectua mutageneză de scanare a alaninei pentru a identifica reziduurile regiunii hipervariabile contribuind semnificativ la legarea antigenului. Alternativ sau suplimentar, poate fi benefic să se analizeze o structură cristalină a complexului antigen-anticorp pentru a identifica punctele de contact dintre domeniul de legare şi, de exemplu, DLL3 uman. Astfel de reziduuri de contact şi reziduuri învecinate sunt candidaţi la substituţie în conformitate cu tehnicile elaborate aici. Odată ce astfel de variante sunt generate, panoul de variante este supus screeningului aşa cum este descris aici şi anticorpii cu proprietăţi superioare într-una sau mai multe teste relevante pot fi selectaţi pentru dezvoltare ulterioară.
Anticorpii monoclonali şi constructele de anticorpi conform prezentei invenţii includ în mod specific anticorpi "himerici" (imunoglobuline) în care o porţiune a lanţului greu şi/sau uşor este identică sau omologă cu secvenţele corespunzătoare din anticorpi derivaţi dintr-o anumită specie sau aparţinând unei anumite clase sau subclase de anticorpi, în timp ce restul lanţului (lanţurilor) este/sunt identice sau omoloage cu secvenţele corespunzătoare din anticorpii derivaţi de la o altă specie sau aparţinând altei clase de anticorpi sau subclase, precum şi fragmente ale acestor anticorpi, atât de mult cât prezintă activitatea biologică dorită (brevetul US nr. 4.816.567; Morrison şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 81: 6851-6855 (1984)). Anticorpii himerici de interes din prezenta includ anticorpi „primitivi» care cuprind secvenţe de legare a antigenului domeniului variabil derivat de la un primat neuman (de ex., Old World Monkey, Ape etc.) şi secvenţe de regiune constantă umană. Au fost descrise o varietate de abordări pentru producerea anticorpilor himerici. Vezi de ex., Morrison şi colab., Proc. Natl. Acad. ScL S.U.A. 81:6851, 1985; Takeda şi colab., Nature 314:452, 1985, Cabilly şi colab., brevet U.S. Nr. 4.816.567; Boss şi colab., brevet U.S. Nr. 4.816.397; Tanaguchi şi colab., EP 0171496; EP 0173494; şi GB 2177096.
Un anticorp, un construct de anticorp, un fragment de anticorp sau o variantă de anticorp pot fi, de asemenea, modificate prin ştergerea specifică a epitopilor de celule T umane (o metodă numită "dezimunizare") prin metodele dezvăluite, de exemplu, în WO 98/52976 sau WO 00/34317. Pe scurt, domeniile variabile ale lanţului greu şi uşor ale unui anticorp pot fi analizate pentru peptide care se leagă de MHC clasa II; aceste peptide reprezintă potenţiali epitopi ai celulelor T (aşa cum sunt definiţi în WO 98/52976 şi WO 00/34317). Pentru detectarea potenţialilor epitopi de celule T, se poate aplica o abordare de modelare computerizată denumită „filetare peptidică» şi, în plus, o bază de date cu peptide de legare MHC clasa II umană poate fi căutată pentru motive prezente în secvenţele VH şi VL, aşa cum este descris în WO 98/52976 şi WO 00/34317. Aceste motive se leagă de oricare dintre cele 18 alotipuri majore MHC clasa II DR şi astfel constituie epitopi potenţiali ai celulelor T. Epitopii potenţiali de celule T detectaţi pot fi eliminaţi prin substituirea unui număr mic de reziduuri de aminoacizi în domeniile variabile sau, de preferinţă, prin substituţii de aminoacizi unici. De obicei, se fac substituţii conservatoare. Adesea, dar nu exclusiv, poate fi utilizat un aminoacid comun unei poziţii în secvenţele de anticorpi ai liniei germinale umane. Se dezvăluie secvenţe ale liniei germinale umane de ex. în Tomlinson şi colab. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798; Cook, G.P. şi colab. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; şi Tomlinson şi colab. (1995) EMBO J. 14: 14: 4628-4638. Directorul V BASE oferă un director cuprinzător de secvenţe de regiuni variabile ale imunoglobulinei umane (compilat de Tomlinson, LA. şi colab. MRC Center for Protein Engineering, Cambridge, Marea Britanie). Aceste secvenţe pot fi utilizate ca sursă de secvenţă umană, de ex., pentru regiunile cadru şi CDR-uri. Pot fi de asemenea utilizate regiuni cadru umane de consens, de exemplu aşa cum este descris în brevetul US nr. 6.300.064.
Anticorpii „umanizaţi», constructele de anticorpi, variantele sau fragmentele acestora (cum ar fi Fv, Fab, Fab', F(ab')2 sau alte subsecvenţe de anticorpi de legare la antigen) sunt anticorpi sau imunoglobuline cu secvenţe majoritar umane, care conţin (o) secvenţă(e) minimă(e) derivată(e) din imunoglobulină neumană. În cea mai mare parte, anticorpii umanizaţi sunt imunoglobuline umane (anticorp receptor) în care reziduurile dintr-o regiune hipervariabilă (de asemenea, CDR) a receptorului sunt înlocuite cu reziduuri dintr-o regiune hipervariabilă a unei specii neumane (de ex., rozătoare) (anticorp donator) cum ar fi şoarecele, şobolanul, hamsterul sau iepurele având specificitatea, afinitatea şi capacitatea dorite. În unele cazuri, reziduurile regiunii cadru Fv (FR) ale imunoglobulinei umane sunt înlocuite cu reziduuri neumane corespunzătoare. Mai mult, "anticorpii umanizaţi", aşa cum se utilizează aici, pot cuprinde, de asemenea, reziduuri care nu se găsesc nici în anticorpul receptor, nici în anticorpul donator. Aceste modificări sunt făcute pentru a rafina şi optimiza în continuare performanţa anticorpilor. Anticorpul umanizat poate cuprinde, de asemenea, cel puţin o porţiune dintr-o regiune constantă a imunoglobulinei (Fc), în mod tipic aceea a unei imunoglobuline umane. Pentru mai multe detalii, a se vedea Jones şi colab., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann şi colab., Nature, 332: 323-329 (1988); şi Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).
Anticorpii umanizaţi sau fragmente ale acestora pot fi generaţi prin înlocuirea secvenţelor domeniului variabil Fv care nu sunt direct implicate în legarea antigenului cu secvenţe echivalente din domeniile variabile Fv umane. Metode exemplare pentru generarea de anticorpi umanizaţi sau fragmente ale acestora sunt furnizate de Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; de Oi şi colab. (1986) BioTechniques 4: 214; şi cu US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.693.762; US 5.859.205; şi US 6.407.213. Aceste metode includ izolarea, manipularea şi exprimarea secvenţelor de acid nucleic care codifică toate sau o parte din domeniile variabile ale imunoglobulinei Fv din cel puţin unul dintr-un lanţ greu sau uşor. Astfel de acizi nucleici pot fi obţinuţi dintr-un hibridom care produce un anticorp împotriva unei ţinte predeterminate, aşa cum este descris mai sus, precum şi din alte surse. ADN-ul recombinant care codifică molecula de anticorp umanizat poate fi apoi clonat într-un vector de expresie adecvat.
Anticorpii umanizaţi pot fi, de asemenea, produşi folosind animale transgenice, cum ar fi şoareci care exprimă gene ale lanţului greu şi uşor uman, dar sunt incapabili să exprime genele lanţului greu şi uşor ale imunoglobulinei endogene de şoarece. Winter descrie o metodă exemplară de grefarea CDR care poate fi utilizată pentru a prepara anticorpii umanizaţi descrişi aici (brevetul US nr.5.225.539). Toate CDR-urile unui anumit anticorp uman pot fi înlocuite cu cel puţin o porţiune dintr-un CDR non-uman sau doar unele dintre CDR-uri pot fi înlocuite cu CDR-uri neumane. Este necesar doar să se înlocuiască numărul de CDR necesare pentru legarea anticorpului umanizat la un antigen predeterminat.
Un anticorp umanizat poate fi optimizat prin introducerea de substituţii conservatoare, substituţii de secvenţă consens, substituţii ale liniei germinale şi/sau mutaţii din spate. Astfel de molecule de imunoglobulină modificate pot fi realizate prin oricare dintre mai multe tehnici cunoscute în domeniu, (de ex., Teng şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. S.U.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor şi colab., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson şi colab., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982, şi EP 239 400).
Termenul "anticorp uman", "construct de anticorp uman" şi "domeniu de legare umană" include anticorpi, constructe de anticorpi şi domenii de legare având regiuni de anticorpi cum ar fi regiuni variabile şi constante sau domenii care corespund în mod substanţial secvenţelor de imunoglobulină a liniei germinale umane cunoscute în domeniu, inclusiv, de exemplu, cele descrise de Kabat şi colab. (1991) (loc. cit.). Anticorpii umani, constructele de anticorpi sau domeniile de legare ale invenţiei pot include reziduuri de aminoacizi necodificate de secvenţe de imunoglobulină ale liniei germinale umane (de ex., mutaţii introduse prin mutageneză aleatorie sau situs-specific in vitro sau prin mutaţie somatică in vivo), de exemplu în CDR-uri şi, în special, în CDR3. Anticorpii umani, constructele de anticorpi sau domeniile de legare pot avea cel puţin una, două, trei, patru, cinci sau mai multe poziţii înlocuite cu un reziduu de aminoacizi care nu este codificat de secvenţa de imunoglobulină a liniei germinale umane. Definiţia anticorpilor umani, a constructelor de anticorpi şi a domeniilor de legare, aşa cum este utilizată aici, are în vedere şi anticorpii complet umani, care includ doar secvenţe umane de anticorpi modificate non-artificial şi/sau genetic, deoarece aceştia pot fi derivaţi folosind tehnologii sau sisteme, cum ar fi Xenomouse.
În unele variante de realizare, constructele anticorpului conform invenţiei sunt construct de anticorpi "izolate" sau "substanţial pure". "Izolat" sau "substanţial pur", atunci când este utilizat pentru a descrie constructele anticorpului dezvăluite aici, înseamnă un construct de anticorp care a fost identificat, separat şi/sau recuperat dintr-o componentă a mediului său de producţie. De preferinţă, constructul anticorpului este liber sau substanţial lipsit de asociere cu toate celelalte componente din mediul său de producţie. Componentele contaminante ale mediului său de producţie, cum ar fi cel care rezultă din celulele transfectate recombinante, sunt materiale care ar interfera în mod obişnuit cu utilizările diagnostice sau terapeutice pentru polipeptidă şi pot include enzime, hormoni şi alte substanţe dizolvate proteice sau neproteice. Constructele anticorpului pot constitui, de ex., cel puţin aproximativ 5% sau cel puţin aproximativ 50% din greutatea proteinei totale dintr-o probă dată. Se înţelege că proteina izolată poate constitui de la 5% la 99,9% din greutatea conţinutului total de proteine, în funcţie de circumstanţe. Polipeptida poate fi realizată la o concentraţie semnificativ mai mare prin utilizarea unui promotor inductibil sau promotor cu expresie ridicată, astfel încât să fie produs la niveluri crescute de concentraţie. Definiţia include producerea unui construct de anticorp într-o mare varietate de organisme şi/sau celule gazdă care sunt cunoscute în domeniu. În realizări preferate, constructul anticorpului va fi purificat (1) într-un grad suficient pentru a obţine cel puţin 15 reziduuri de secvenţă de aminoacizi cu N-terminal sau intern prin utilizarea unei cupe de secvenţiere de filare sau (2) la omogenitate prin SDS-PAGE în condiţii nereducătoare sau reducătoare utilizând pete de albastru Coomassie sau, de preferinţă, de argint. În mod obişnuit, totuşi, un construct de anticorp izolat va fi preparat prin cel puţin o etapă de purificare.
Termenul "domeniu de legare" caracterizează în legătură cu prezenta invenţie un domeniu care (în mod specific) se leagă de/interacţionează cu/recunoaşte un epitop ţintă dat sau un situs ţintă dat pe moleculele ţintă (antigeni), aici: DLL3 şi CD3, respectiv. Structura şi funcţia primului domeniu de legare (recunoscând DLL3) şi, de preferinţă, şi structura şi/sau funcţia celui de-al doilea domeniu de legare (recunoscând CD3), se bazează pe structura şi/sau funcţia unui anticorp, de ex. a unei molecule de imunoglobulină de lungime întreagă sau întreagă. Conform invenţiei, primul domeniu de legare este caracterizat prin prezenţa a trei CDR de lanţ uşor (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 din regiunea VL) şi trei CDR de lanţ greu (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 din regiunea VH). Al doilea domeniu de legare cuprinde, de asemenea, de asemenea, cerinţele structurale minime ale unui anticorp care permit legarea ţintei. Mai preferabil, al doilea domeniu de legare cuprinde cel puţin trei CDR-uri cu lanţ uşor (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 din regiunea VL) şi/sau trei CDR-uri cu lanţ greu (adică CDR1, CDR2 şi CDR3 din regiunea VH). Se preconizează că primul şi/sau al doilea domeniu de legare este produs prin sau poate fi obţinut prin afişarea fagilor sau prin metode de screening de bibliotecă, mai degrabă decât prin grefarea secvenţelor CDR dintr-un anticorp preexistent (monoclonal) într-un eşafod cadru.
Conform prezentei invenţii, domeniile de legare sunt sub forma uneia sau mai multor polipeptide. Astfel de polipeptide pot include părţi proteice şi părţi neproteinice (de ex., linkeri chimici sau agenţi chimici de reticulare, cum ar fi glutaraldehida). Proteinele (inclusiv fragmente ale acestora, de preferinţă fragmente biologic active şi peptide, având de obicei mai puţin de 30 de aminoacizi) cuprind doi sau mai mulţi aminoacizi cuplaţi între ei printr-o legătură peptidică covalentă (rezultând un lanţ de aminoacizi). Termenul "polipeptidă" aşa cum este utilizat aici descrie un grup de molecule, care constau de obicei din mai mult de 30 de aminoacizi. Polipeptidele pot forma în continuare multimeri, cum ar fi dimerii, trimerii şi oligomerii superiori, adică constând din mai multe molecule de polipeptidă. Moleculele polipeptidice care formează astfel de dimeri, trimeri etc. pot fi identice sau neidentice. Structurile corespunzătoare de ordin superior ale acestor multimeri sunt, în consecinţă, denumite homo- sau heterodimeri, homo- sau heterotrimeri etc. Un exemplu pentru un hereteromultimer este o moleculă de anticorp, care, în forma sa naturală, constă din două lanţuri polipeptidice uşoare identice şi două lanţuri polipeptidice grele identice. Termenii "peptidă", "polipeptidă" şi "proteină" se referă, de asemenea, la peptide/polipeptide/proteine modificate în mod natural în care modificarea este efectuată de ex. prin modificări post-translaţionale precum glicozilarea, acetilarea, fosforilarea şi altele asemenea. O "peptidă", "polipeptidă" sau "proteină", la care se face referire aici, poate fi, de asemenea, modificată chimic, cum ar fi pegilată. Astfel de modificări sunt bine cunoscute în domeniu şi descrise aici mai jos.
De preferinţă, domeniul de legare care se leagă de DLL3 şi/sau domeniul de legare care se leagă de CD3 este/sunt domenii de legare umane. Anticorpii şi constructele de anticorpi cuprinzând cel puţin un domeniu de legare uman evită unele dintre problemele asociate cu anticorpii sau constructele de anticorpi care posedă regiuni non-umane, cum ar fi de rozătoare (de ex. murin, şobolan, hamster sau iepure) regiuni variabile şi/sau constante. Prezenţa unor astfel de proteine derivate din rozătoare poate duce la eliminarea rapidă a anticorpilor sau a constructelor de anticorpi sau poate duce la generarea unui răspuns imun împotriva anticorpului sau a constructului de anticorp de către un pacient. Pentru a evita utilizarea anticorpilor derivaţi de rozătoare sau a constructelor de anticorpi, anticorpii/constructele umane sau anticorpi umani compleţi pot fi generaţi prin introducerea funcţiei anticorpului uman într-un rozător, astfel încât rozătoarele să producă anticorpi complet umani.
Abilitatea de a clona şi de a reconstrui locusuri umane de dimensiunea megabazei în YAC şi de a le introduce în linia germinativă a şoarecilor oferă o abordare puternică pentru elucidarea componentelor funcţionale ale locusurilor foarte mari sau mapate grosier, precum şi generarea de modele utile de boală umană. În plus, utilizarea unei astfel de tehnologii pentru înlocuirea locusurilor de şoarece cu echivalenţii lor umani ar putea oferi informaţii unice asupra expresiei şi reglării produselor genetice umane în timpul dezvoltării, comunicării lor cu alte sisteme şi implicării lor în inducerea şi progresia bolii.
O aplicaţie practică importantă a unei astfel de strategii este „umanizarea» sistemului imunitar umoral al şoarecelui. Introducerea locusurilor imunoglobulinei umane (Ig) în şoareci la care genele Ig endogene au fost inactivate oferă posibilitatea de a studia mecanismele care stau la baza expresiei şi asamblării programate a anticorpilor, precum şi rolul lor în dezvoltarea celulelor B. Mai mult, o astfel de strategie ar putea oferi o sursă ideală pentru producerea de anticorpi monoclonali complet umani (mAb) - o etapă importantă pentru îndeplinirea promisiunii terapiei cu anticorpi în bolile umane. Se aşteaptă ca anticorpii sau constructele de anticorpi complet umani să minimizeze răspunsurile imunogene şi alergice intrinseci la mAb-urile de şoareci sau derivate de la şoareci şi astfel să crească eficacitatea şi siguranţa anticorpilor/constructelor de anticorpi administraţi. Se poate aştepta ca utilizarea anticorpilor complet umani sau a constructelor de anticorpi să ofere un avantaj substanţial în tratamentul bolilor umane cronice şi recurente, cum ar fi inflamaţia, autoimunitatea şi cancerul, care necesită administrări repetate de compuşi.
O abordare a acestui obiectiv a fost de a proiecta tulpini de şoarece deficiente în producţia de anticorpi de şoarece cu fragmente mari de locusuri Ig umane în anticiparea faptului că astfel de şoareci ar produce un repertoriu larg de anticorpi umani în absenţa anticorpilor de şoarece. Fragmente mari de Ig umană ar păstra marea diversitate de gene variabile, precum şi reglarea adecvată a producţiei şi exprimării anticorpilor. Prin exploatarea maşinăriilor de şoarece pentru diversificarea şi selecţia anticorpilor şi lipsa toleranţei imunologice la proteinele umane, repertoriul de anticorpi umani reprodus în aceste tulpini de şoarece ar trebui să producă anticorpi cu afinitate ridicată împotriva oricărui antigen de interes, inclusiv antigeni umani. Folosind tehnologia hibridomului, mAb-urile umane specifice antigenului cu specificitatea dorită ar putea fi produse şi selectate cu uşurinţă. Această strategie generală a fost demonstrată în legătură cu generarea primelor tulpini de şoarece XenoMouse (vezi Green şi colab. Nature Genetics 7: 13-21 (1994)). Tulpinile XenoMouse au fost proiectate cu cromozomi artificiali de drojdie (YAC) care conţin fragmente de configuraţie a liniei germinale de 245 kb şi 190 kb fragmente de configuraţie a liniei germinale dimensionate ale locusului lanţului greu uman şi, respectiv, al locusului lanţului uşor kappa, care conţinea secvenţe variabile de bază şi regiuni constante. YAC-urile care conţin Ig umană s-au dovedit a fi compatibile cu sistemul şoarecelui atât pentru rearanjare, cât şi pentru exprimarea anticorpilor şi au fost capabile să înlocuiască genele Ig de şoarece inactivate. Acest lucru a fost demonstrat de capacitatea lor de a induce dezvoltarea celulelor B, de a produce un repertoriu uman asemănător adulţilor cu anticorpi complet umani şi de a genera mAb umani specifici antigenului. Aceste rezultate au sugerat, de asemenea, că introducerea unor porţiuni mai mari ale locusurilor Ig umane care conţin un număr mai mare de gene V, elemente de reglare suplimentare şi regiuni constante de Ig umane ar putea recapitula substanţial repertoriul complet care este caracteristic răspunsului umoral uman la infecţie şi imunizare. Lucrarea lui Green şi colab. a fost extinsă recent la introducerea a mai mult de aproximativ 80% din repertoriul de anticorpi umani prin introducerea fragmentelor YAC de configuraţie a liniei germinale de dimensiunea megabazei, locusuri ale lanţului greu uman şi, respectiv, locusuri ale lanţului uşor kappa. Vezi Mendez şi colab. Nature Genetics 15: 146-156 (1997).
Producţia de XenoMouse de şoarece este discutată în continuare şi delimitată în brevetul U.S. Nr. 6.673.986, brevetele U.S. Nr. 6.162.963; 6.150.584; 6.114.598; 6.075.181, şi 5.939.598 precum şi cererile de brevet US şi brevetele japoneze nr. 3 068 180 B2, 3 068 506 B2, şi 3 068 507 B2. Vezi de asemenea Mendez şi colab. Nature Genetics 15:146-156 (1997) şi Green şi Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), EP 0 463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310, şi WO 03/47336.
Într-o abordare alternativă, alţii, inclusiv GenPharm International, Inc., au folosit o abordare „minilocus». În abordarea minilocusului, un locus de Ig exogenă este mimat prin includerea de piese (gene individuale) din locusul Ig. Astfel, una sau mai multe gene VH, una sau mai multe gene DH, una sau mai multe gene JH, o regiune constantă mu şi o a doua regiune constantă (de preferinţă o regiune constantă gamma) sunt formate într-un construct pentru inserare într-un animal. Această abordare este descrisă în brevetul US nr. 5.545.807 de către Surani şi colab. şi brevetele US Nr. 5.545.806; 5.625.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016; 5.770.429; 5.789.650; 5.814.318; 5.877.397; 5.874.299; şi 6.255.458 fiecare la Lonberg şi Kay, brevetele U.S. Nr. 5.591.669 şi 6.023.010 la Krimpenfort şi Berns, brevetele U.S. Nr. 5.612.205; 5.721.367; şi 5.789.215 la Berns şi colab., şi brevetul U.S. Nr. 5.643.763 la Choi şi Dunn. Această abordare este descrisă în GenPharm International brevetele U.S. Nr. 5.569.825, 5.789.650, 5.545.806, 5.661.016, 5.814.318, şi 5.364.079, precum şi cererile de brevet de bază. Vezi de asemenea EP 0 546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, şi WO 98/24884 şi brevetul U.S. Nr. 5.981.175. Vezi în continuare Taylor şi colab. (1992), Chen şi colab. (1993), Tuaillon şi colab. (1993), Choi şi colab. (1993), Lonberg şi colab. (1994), Taylor şi colab. (1994), şi Tuaillon şi colab. (1995), Fishwild şi colab. (1996).
Kirin a demonstrat, de asemenea, generarea de anticorpi umani de la şoareci în care, prin fuziunea microcelulară, au fost introduse bucăţi mari de cromozomi sau cromozomi întregi. A se vedea cererile de brevet european nr. 773 288 şi 843 961. Xenerex Biosciences dezvoltă o tehnologie pentru generarea potenţială de anticorpi umani. În această tehnologie, şoarecii SCID sunt reconstituiţi cu celule limfatice umane, de ex., celule B şi/sau T. Şoarecii sunt apoi imunizaţi cu un antigen şi pot genera un răspuns imun împotriva antigenului. Vezi brevetele U.S. Nr. 5.476.996; 5.698.767; şi 5.958.765.
Răspunsurile la anticorpi umani anti-şoarece (HAMA) au condus industria să prepare anticorpi himerici sau altfel umanizaţi. Cu toate acestea, este de aşteptat ca anumite răspunsuri la anticorpi anti-himerici umani (HACA) să fie observate, în special în utilizările cronice sau cu doze multiple ale anticorpului. Astfel, ar fi de dorit să se furnizeze constructe de anticorpi cuprinzând un domeniu de legare uman împotriva DLL3 şi/sau un domeniu de legare uman împotriva CD3 pentru a vicia preocupările şi/sau efectele răspunsului HAMA sau HACA.
Termenii "(în mod specific) se leagă de", (specific) recunoaşte","este (specific) direcţionat către "şi" (specific) reacţionează cu "înseamnă în conformitate cu această invenţie că un domeniu de legare interacţionează sau interacţionează specific cu un anumit epitop sau un situs ţintă dat pe moleculele ţintă (antigeni), aici: DLL3 şi CD3, respectiv.
Termenul "epitop" se referă la un situs de pe un antigen de care se leagă specific un domeniu de legare, un anticorp sau imunoglobulină, sau un derivat, fragment sau variantă de anticorp sau imunoglobulină. Un "epitop" este antigenic şi, prin urmare, termenul de epitop este uneori denumit şi aici ca "structură antigenică" sau "determinant antigenic". Astfel, domeniul de legare este un „situs de interacţiune cu antigenul». Această legare/interacţiune este, de asemenea, înţeleasă de a defini o „recunoaştere specifică».
"Epitopii" pot fi formaţi atât din aminoacizi contigui, cât şi din aminoacizi necontigui juxtapuşi prin pliere terţiară a unei proteine. Un "epitop liniar" este un epitop în care o secvenţă primară de aminoacizi cuprinde epitopul recunoscut. Un epitop liniar include în mod tipic cel puţin 3 sau cel puţin 4 şi, de obicei, cel puţin 5 sau cel puţin 6 sau cel puţin 7, de exemplu, aproximativ 8 până la aproximativ 10 aminoacizi într-o secvenţă unică.
Un "epitop conformaţional", spre deosebire de un epitop liniar, este un epitop în care secvenţa primară a aminoacizilor care cuprind epitopul nu este singura componentă definitorie a epitopului recunoscut (de ex., un epitop în care secvenţa primară de aminoacizi este nu neapărat recunoscut de domeniul de legare). De obicei, un epitop conformaţional cuprinde un număr crescut de aminoacizi faţă de un epitop liniar. În ceea ce priveşte recunoaşterea epitopilor conformaţionali, domeniul de legare recunoaşte o structură tridimensională a antigenului, de preferinţă o peptidă sau proteină sau fragment al acestuia (în contextul prezentei invenţii, structura antigenică pentru primul domeniu de legare este cuprinsă în proteina DLL3). De exemplu, atunci când o moleculă de proteină se pliază pentru a forma o structură tridimensională, anumiţi aminoacizi şi/sau scheletul polipeptidic care formează epitopul conformaţional devin juxtapuse permiţând anticorpului să recunoască epitopul. Metodele de determinare a conformaţiei epitopilor includ, dar nu sunt limitate la, cristalografie cu raze X, spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară bidimensională (2D-RMN) şi etichetare de spin direcţionată către situs şi spectroscopie de rezonanţă paramagnetică de electron (EPR)
O metodă pentru maparea epitopului este descrisă în următoarele: Atunci când o regiune (o întindere de aminoacid contiguu) din proteina DLL3 umană este schimbată/înlocuită cu regiunea corespunzătoare a unui antigen DLL3 neuman şi non-primat (de ex., DLL3 de şoarece, dar altele precum pui, şobolan, hamster, iepure etc. ar putea fi, de asemenea, de conceput), este de aşteptat să se producă o scădere a legării domeniului de legare, cu excepţia cazului în care domeniul de legare este reactiv încrucişat pentru DLL3 non-uman, non-primat utilizat. Respectiva scădere este de preferinţă de cel puţin 10%, 20%, 30%, 40% sau 50%; mai preferabil cel puţin 60%, 70% sau 80%, şi cel mai preferabil 90%, 95% sau chiar 100% în comparaţie cu legarea la regiunea respectivă în proteina DLL3 umană, prin care se leagă la regiunea respectivă la om proteina DLL3 este setată să fie 100%. Se preconizează că himerele DLL3 umane/DLL3 non-umane menţionate mai sus sunt exprimate în celule CHO. De asemenea, se preconizează că himerele DLL3 umane/DLL3 neumane sunt fuzionate cu un domeniu transmembranar şi/sau un domeniu citoplasmatic al unei proteine diferite legate de membrană, cum ar fi EpCAM.
Într-o metodă alternativă sau suplimentară pentru maparea epitopului, pot fi generate mai multe versiuni trunchiate ale domeniului extracelular DLL3 uman pentru a determina o regiune specifică care este recunoscută de un domeniu de legare. În aceste versiuni trunchiate, diferitele domenii/subdomenii extracelulare DLL3 sau regiuni sunt şterse treptat, începând de la capătul N-terminal. Versiunile trunchiate DLL3 care au fost generate şi utilizate în contextul prezentei invenţii sunt prezentate în Figura 1. Se are în vedere ca versiunile DLL3 trunchiate să fie exprimate în celule CHO. De asemenea, este prevăzut ca versiunile trunchiate DLL3 să fie fuzionate cu un domeniu transmembranar şi/sau un domeniu citoplasmatic al unei proteine diferite legate de membrană, cum ar fi EpCAM. De asemenea, se preconizează că versiunile DLL3 trunchiate cuprind un domeniu peptidic de semnal la capătul N-terminal, de exemplu o peptidă semnal derivată din peptida semnal cu lanţ greu IgG de şoarece. Mai mult, este prevăzut ca versiunile trunchiate DLL3 să cuprindă un domeniu v5 la capătul N-terminal (după peptida semnalului) care permite verificarea exprimării corecte a acestora pe suprafaţa celulei. Se aşteaptă o scădere sau o pierdere a legării cu acele versiuni DLL3 trunchiate care nu mai cuprind regiunea DLL3 care este recunoscută de domeniul de legare. Scăderea legării este de preferinţă de cel puţin 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; mai preferabil cel puţin 60%, 70%, 80% şi cel mai preferabil 90%, 95% sau chiar 100%, prin care legarea la întreaga proteină DLL3 umană (sau regiunea sau domeniul său extracelular) este setată să fie 100%. O metodă de testare a acestei pierderi de legare este descrisă în Exemplul 2.
O altă metodă pentru a determina contribuţia unui reziduu specific al unui antigen ţintă la recunoaşterea de către un construct de anticorp sau un domeniu de legare este scanarea alaninei (vezi de ex. Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol. 2001 Jun;5(3):302-7), unde fiecare reziduu de analizat este înlocuit cu alanină, de ex. prin mutageneză direcţionată către situs. Alanina este utilizată datorită grupului său funcţional metil nevoluminos, inert chimic, care totuşi imită referinţele structurii secundare pe care o posedă mulţi dintre ceilalţi aminoacizi. Uneori, aminoacizii voluminoşi, cum ar fi valina sau leucina, pot fi utilizaţi în cazurile în care se doreşte conservarea dimensiunii reziduurilor mutante. Scanarea cu alanină este o tehnologie matură care a fost utilizată pentru o perioadă lungă de timp.
Interacţiunea dintre domeniul de legare şi epitopul sau regiunea care cuprinde epitopul implică faptul că un domeniu de legare prezintă o afinitate apreciabilă pentru epitopul/regiunea care cuprinde epitopul pe o anumită proteină sau antigen (aici: DLL3 şi respectiv CD3) şi, în general, nu prezintă o reactivitate semnificativă cu alte proteine sau antigeni decât DLL3 sau CD3. „Afinitate apreciabilă» include legarea cu o afinitate de aproximativ 10-6 M (KD) sau mai puternică. De preferinţă, legarea este considerată specifică atunci când afinitatea de legare este de aproximativ 10-12 până la 10-8 M, 10-12 până la 10-9 M, 10-12 până la 10-10 M, 10-11 până la 10-8 M, preferabil de aproximativ 10-11 până la 10-9 M. Dacă un domeniu de legare reacţionează în mod specific cu sau se leagă de o ţintă poate fi testat cu uşurinţă, printre altele, comparând reacţia domeniului de legare menţionat cu o proteină sau antigen ţintă cu reacţia domeniului de legare menţionat cu proteine ​​sau antigeni, altele decât DLL3 sau CD3. De preferinţă, un domeniu de legare al invenţiei nu se leagă în mod esenţial sau substanţial de alte proteine ​​sau antigeni decât DLL3 sau CD3 (adică, primul domeniu de legare nu este capabil să se lege de alte proteine ​​decât DLL3 şi al doilea domeniu de legare nu este capabil de legare la alte proteine ​​decât CD3).
Termenul „nu se leagă în mod esenţial/substanţial» sau „nu este capabil de legare» înseamnă că un domeniu de legare conform prezentei invenţii nu leagă o altă proteină sau antigen decât DLL3 sau CD3, adică nu prezintă reactivitate mai mare de 30 %, preferabil nu mai mult de 20%, mai preferabil nu mai mult de 10%, în special preferabil nu mai mult de 9%, 8%, 7%, 6% sau 5% cu alte proteine ​​sau antigeni decât DLL3 sau CD3, prin care se leagă la DLL3 sau CD3, respectiv, este setat să fie 100%.
De asemenea, se preconizează că constructele de anticorpi conform prezentei invenţii se leagă la o izoformă DLL3 umană având una sau ambele dintre următoarele mutaţii punctuale DLL3: F172C şi L218P. Vezi Exemplul 5.
Se consideră că legarea specifică se realizează prin motive specifice în secvenţa de aminoacizi a domeniului de legare şi a antigenului. Astfel, legarea se realizează ca urmare a structurii lor primare, secundare şi/sau terţiare, precum şi a rezultatului modificărilor secundare ale structurilor menţionate. Interacţiunea specifică a situsului de interacţiune antigen cu antigenul său specific poate duce la o legare simplă a situsului menţionat la antigen. Mai mult, interacţiunea specifică a situsului de interacţiune antigen cu antigenul său specific poate duce alternativ sau suplimentar la iniţierea unui semnal, de ex. datorită inducerii unei modificări a conformaţiei antigenului, a unei oligomerizări a antigenului etc.
Constructele anticorpului conform invenţiei se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 260, corespunzător unei întinderi de aminoacizi care cuprinde regiunile EGF-3 şi EGF-4 aşa cum sunt definite în revendicări. Au fost generate şi alte grupuri de lianţi anti-DLL3 şi specificităţile lor de legare a DLL3 au fost identificate în timpul mapării epitopului (vezi Exemplul 2).
Cel mai mare grup de lianţi generaţi a recunoscut un epitop în domeniul DSL. Cu toate acestea, niciuna dintre aceste constructe de anticorpi nu a îndeplinit criteriile pentru o activitate citotoxică suficientă într-un test iniţial de citotoxicitate bazat pe 51Cr de 18 ore cu celule T CD8+ umane stimulate ca celule efectoare şi celule CHO transfectate cu DLL3 hu ca celule ţintă.
Într-un test iniţial de citotoxicitate bazat pe FACS de 48 de ore (folosind PBMC uman nestimulat ca celule efectoare şi celule CHO transfectate cu hu DLL3 ca celule ţintă), aceşti lianţi care au recunoscut un epitop DLL3 în capătul N-terminal al proteinei au avut valori EC50 între 1455 şi 1580 pM. În contextul actual, aceste valori nu sunt considerate adecvate pentru anticorpii bispecifici care sunt furnizaţi pentru o utilizare terapeutică în direcţionarea sistemului imunitar al unui pacient, mai exact a activităţii citotoxice a celulelor T, împotriva celulelor canceroase.
În cele din urmă, un alt grup de lianţi a fost generat şi caracterizat pentru activitatea sa citotoxică într-o varietate de teste. Maparea epitopului acestor lianţi a dezvăluit o specificitate pentru un epitop DLL3 cuprins în regiunea EGF-5 şi, într-o oarecare măsură, şi în regiunea EGF-6 (pentru detalii, vezi Exemplul 2). O vedere de ansamblu a datelor generate în diferite teste de citotoxicitate (vezi exemplele 8.3, 8.5, 8.6 şi 8.7) pentru aceşti lianţi denumiţi DLL3-18, DLL3-19, DLL3-20 şi DLL3-21 au dezvăluit următoarele: Deşi nu toţi lianţii eşuează în toate testele în ceea ce priveşte valorile EC50 favorabile, întregul grup este în mod clar subeficient în comparaţie cu constructele anticorpilor conform invenţiei. Această observaţie este evidenţiată printr-o umbrire mai întunecată a rezultatelor prezentate în Tabelele 6-9.
Pe scurt, se poate afirma clar că constructele de anticorp conform invenţiei (care se leagă de un epitop al DLL3 cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 260) arată de departe cea mai bună performanţă a activităţii în comparaţie cu o varietate de alte grupuri de lianţi DLL3 având diferite specificităţi de epitopi. Cu alte cuvinte, constructele de anticorpi conform invenţiei prezintă o relaţie favorabilă epitop-activitate, susţinând astfel activitatea citotoxică mediată de un anticorp bispecific puternic.
Într-un aspect, prezenta invenţie oferă un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T şi CD3 de macac, în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 260, în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 258, în care primul domeniu de legare a constructului de anticorp bispecific al invenţiei cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din:
a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 31, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 32, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 33, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 34, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 35 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 36;
b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 41, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 42, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 43, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 44, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 45 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 46;
c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 51, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 52, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 53, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 54, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 55 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 56;
d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 61, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 62, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 63, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 64, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 65 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 66;
e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 71, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 72, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 73, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 74, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 75 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 76;
f) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 81, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 82, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 83, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 84, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 85 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 86;
g) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 91, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 92, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 93, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 94, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 95 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 96;
h) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 101, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 102, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 103, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 104, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 105 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 106; şi
i) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 111, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 112, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 113, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 114, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 115 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 116.
Termenul „variabil» se referă la porţiunile de anticorpi sau domenii de imunoglobulină care prezintă variabilitate în secvenţa lor şi care sunt implicate în determinarea specificităţii şi afinităţii de legare a unui anticorp particular (adică „domeniul(e) variabil(e)»). Împerecherea unui lanţ greu variabil (VH) şi a unui lanţ uşor variabil (VL) formează împreună un singur situs de legare a antigenului.
Variabilitatea nu este distribuită uniform în domeniile variabile ale anticorpilor; este concentrată în subdomenii ale fiecărei regiuni variabile ale lanţului greu şi uşor. Aceste subdomenii sunt numite „regiuni hipervariabile» sau „regiuni care determină complementaritatea» (CDR). Porţiunile mai conservate (adică, nehipervariabile) ale domeniilor variabile sunt numite regiuni "cadru" (FRM sau FR) şi oferă un eşafod pentru cele şase CDR-uri în spaţiu tridimensional pentru a forma o suprafaţă care leagă antigenul. Domeniile variabile ale lanţurilor grele şi uşoare care apar în mod natural cuprind fiecare patru regiuni FRM (FR1, FR2, FR3 şi FR4), adoptând în mare măsură o configuraţie de foaie β, conectată prin trei regiuni hipervariabile, care formează bucle de conectare şi, în unele cazuri, formează parte a structurii foii β. Regiunile hipervariabile din fiecare lanţ sunt ţinute împreună în apropiere de FRM şi, împreună cu regiunile hipervariabile din celălalt lanţ, contribuie la formarea situsului de legare a antigenului (vezi Kabat şi colab., loc. cit.).
Termenii "CDR" şi pluralul său "CDR" se referă la regiunea de determinare a complementarităţii din care trei alcătuiesc caracterul de legare al unei regiuni variabile cu lanţ uşor (CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3) şi trei alcătuiesc caracterul de legare al unei regiuni variabile cu lanţ greu (CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3). CDR-urile conţin majoritatea reziduurilor responsabile de interacţiunile specifice ale anticorpului cu antigenul şi, prin urmare, contribuie la activitatea funcţională a unei molecule de anticorp: sunt principalii factori determinanţi ai specificităţii antigenului.
Limitele CDR definitive exacte şi lungimile sunt supuse unor sisteme diferite de clasificare şi numerotare. Prin urmare, CDR-urile pot fi menţionate de Kabat, Chothia, contact sau orice altă definiţie a limitelor, inclusiv sistemul de numerotare descris aici. În ciuda limitelor diferite, fiecare dintre aceste sisteme are un anumit grad de suprapunere în ceea ce constituie aşa-numitele „regiuni hipervariabile» în cadrul secvenţelor variabile. Definiţiile CDR conform acestor sisteme pot, prin urmare, să difere în lungime şi zone de graniţă în raport cu regiunea cadru adiacentă. Vezi de exemplu Kabat (o abordare bazată pe variabilitatea secvenţei între specii), Chothia (o abordare bazată pe studii cristalografice a complecşilor antigen-anticorp) şi/sau MacCallum (Kabat şi colab., loc. cit.; Chothia şi colab., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; şi MacCallum şi colab., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Un alt standard pentru caracterizarea situsului de legare a antigenului este definiţia AbM utilizată de software-ul de modelare a anticorpilor AbM de la Oxford Molecular. Vezi, de ex., secvenţa de proteine şi analiza structurii domeniilor variabile ale anticorpilor. În: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). În măsura în care două tehnici de identificare a reziduurilor definesc regiuni care se suprapun, dar nu regiuni identice, ele pot fi combinate pentru a defini un CDR hibrid. Totuşi, este preferată numerotarea în conformitate cu aşa-numitul sistem Kabat.
De obicei, CDR-urile formează o structură de buclă care poate fi clasificată ca o structură canonică. Termenul „structură canonică» se referă la conformaţia lanţului principal care este adoptat de buclele de legare a antigenului (CDR). Din studii structurale comparative, s-a constatat că cinci dintre cele şase bucle de legare a antigenului au doar un repertoriu limitat de conformaţii disponibile. Fiecare structură canonică poate fi caracterizată prin unghiurile de torsiune ale scheletului polipeptidic. Prin urmare, buclele corespondente dintre anticorpi pot avea structuri tridimensionale foarte asemănătoare, în ciuda variabilităţii ridicate a secvenţei de aminoacizi în majoritatea părţilor buclelor. (Chothia şi Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia şi colab., Nature, 1989, 342: 877; Martin şi Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Mai mult, există o relaţie între structura de buclă adoptată şi secvenţele de aminoacizi care o înconjoară. Conformaţia unei anumite clase canonice este determinată de lungimea buclei şi de resturile de aminoacizi care se află în poziţii cheie în buclă, precum şi în cadrul conservat (adică, în afara buclei). Atribuirea la o anumită clasă canonică se poate face, prin urmare, pe baza prezenţei acestor resturi cheie de aminoacizi.
Termenul "structură canonică" poate include, de asemenea, consideraţii cu privire la secvenţa liniară a anticorpului, de exemplu, aşa cum este catalogat de Kabat (Kabat şi colab., loc. cit.). Schema (sistemul) de numerotare Kabat este un standard adoptat pe scară largă pentru numerotarea reziduurilor de aminoacizi dintr-un domeniu variabil de anticorp într-o manieră consistentă şi este schema preferată aplicată în prezenta invenţie, aşa cum este menţionat şi în altă parte aici. Consideraţii structurale suplimentare pot fi, de asemenea, utilizate pentru a determina structura canonică a unui anticorp. De exemplu, acele diferenţe care nu sunt reflectate pe deplin de numerotarea Kabat pot fi descrise de sistemul de numerotare al lui Chothia şi colab. şi/sau dezvăluite prin alte tehnici, de exemplu, cristalografia şi modelarea computaţională bidimensională sau tridimensională. În consecinţă, o anumită secvenţă de anticorpi poate fi plasată într-o clasă canonică care permite, printre altele, identificarea secvenţelor de schelet adecvate (de ex., pe baza dorinţei de a include o varietate de structuri canonice într-o bibliotecă). Numerotarea Kabat a secvenţelor de aminoacizi a anticorpilor şi consideraţiile structurale descrise de Chothia şi colab., loc. cit. şi implicaţiile lor pentru aspectele canonice de construire ale structurii anticorpilor sunt descrise în literatura de specialitate. Structurile subunităţii şi configuraţiile tridimensionale ale diferitelor clase de imunoglobuline sunt bine cunoscute în domeniu. Pentru o revizuire a structurii anticorpilor, vezi Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow şi colab., 1988.
CDR3 al lanţului uşor şi, în special, CDR3 al lanţului greu pot constitui cei mai importanţi factori determinanţi în legarea antigenului în regiunile variabile ale lanţului uşor şi greu. În unele constructe de anticorpi, lanţul greu CDR3 pare să constituie zona principală de contact dintre antigen şi anticorp. Schemele de selecţie in vitro în care CDR3 singur este variat pot fi utilizate pentru a varia proprietăţile de legare ale unui anticorp sau pentru a determina ce reziduuri contribuie la legarea unui antigen. Prin urmare, CDR3 este de obicei cea mai mare sursă de diversitate moleculară în cadrul situsului de legare a anticorpului. H3, de exemplu, poate fi la fel de scurt ca două resturi de aminoacizi sau mai mare de 26 de aminoacizi.
Într-un anticorp clasic de lungime completă sau imunoglobulină, fiecare lanţ uşor (L) este legat de un lanţ greu (H) printr-o legătură disulfură covalentă, în timp ce cele două lanţuri H sunt legate între ele prin una sau mai multe legături disulfurice în funcţie de izotipul lanţului H. Domeniul CH cel mai apropiat de VH este de obicei desemnat ca CH1. Domeniile constante ("C") nu sunt direct implicate în legarea antigenului, dar prezintă diferite funcţii efectoare, cum ar fi citotoxicitatea dependentă de anticorp, mediată de celule şi activarea complementului. Regiunea Fc a unui anticorp este cuprinsă în domeniile constante ale lanţului greu şi este, de exemplu, capabilă să interacţioneze cu receptorii Fc situaţi la suprafaţa celulei.
Secvenţa genelor de anticorpi după asamblare şi mutaţie somatică este foarte variată şi se estimează că aceste gene variate codifică 1010 molecule diferite de anticorpi (Immunoglobulin Genes, ediţia a II-a, ed. Jonio şi colab., Academic Press, San Diego, CA, 1995). În consecinţă, sistemul imunitar oferă un repertoriu de imunoglobuline. Termenul "repertoriu" se referă la cel puţin o secvenţă de nucleotide derivată în totalitate sau parţial din cel puţin o secvenţă care codifică cel puţin o imunoglobulină. Secvenţele pot fi generate prin rearanjarea in vivo a segmentelor V, D şi J ale lanţurilor grele şi ale segmentelor V şi J ale lanţurilor uşoare. Alternativ, secvenţele pot fi generate dintr-o celulă ca răspuns la rearanjarea care are loc, de ex., stimularea in vitro. Alternativ, o parte sau toate secvenţele pot fi obţinute prin îmbinarea ADN-ului, sinteza nucleotidelor, mutageneză şi alte metode, vezi, de ex., brevetul US 5.565.332. Un repertoriu poate include o singură secvenţă sau poate include o multitudine de secvenţe, inclusiv cele dintr-o colecţie genetică diversă.
Un construct de anticorp conform prezentei dezvăluiri poate fi definit şi ca un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare (de preferinţă uman) care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă de acelaşi epitop al DLL3 ca un anticorp selectat din grupul constând din DLL3-4, DLL3-5, DLL3-6, DLL3-7, DLL3-8, DLL3-9, şi DLL3-10, adică, un anticorp care cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din:
a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 31, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 32, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 33, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 34, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 35 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 36;
b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 41, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 42, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 43, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 44, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 45 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 46;
c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 51, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 52, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 53, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 54, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 55 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 56;
d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 61, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 62, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 63, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 64, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 65 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 66;
e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 71, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 72, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 73, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 74, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 75 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 76;
f) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 81, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 82, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 83, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 84, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 85 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 86; şi
g) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 91, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 92, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 93, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 94, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 95 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 96.
Indiferent dacă un construct de anticorp se leagă sau nu de acelaşi epitop al DLL3 ca un alt construct de anticorp dat poate fi măsurat de ex. prin maparea epitopului cu molecule ţintă himerice sau trunchiate, de ex. aşa cum este descris aici mai sus şi în Exemplul 2.
Un construct de anticorp conform prezentei dezvăluiri poate fi definit şi ca un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare (de preferinţă uman) care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare concurează pentru legarea cu un anticorp selectat din grupul constând din DLL3-4, DLL3-5, DLL3-6, DLL3-7, DLL3-8, DLL3-9 şi DLL3- 10, adică, un anticorp care cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din cele descrise mai sus.
Indiferent dacă un construct de anticorp concurează sau nu pentru legarea cu un alt construct de anticorp dat poate fi măsurat într-un test de concurenţă, cum ar fi un ELISA competitiv sau un test de concurenţă pe bază de celule. Pot fi utilizate şi microparticule cuplate cu avidină (mărgele). Similar unei plăci ELISA acoperite cu avidină, atunci când reacţionează cu o proteină biotinilată, fiecare dintre aceste mărgele poate fi utilizată ca substrat pe care se poate efectua un test. Antigenul este acoperit pe o mărgea şi apoi pre-acoperit cu primul anticorp. Se adaugă al doilea anticorp şi se determină orice legare suplimentară. Citirea are loc prin citometrie de flux.
Într-o formă de realizare a invenţiei, primul domeniu de legare a constructului anticorpului conform invenţiei cuprinde o regiune VH selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 47, SECV ID NR: 57, SECV ID NR: 67, SECV ID NR: 77, SECV ID NR: 87, SECV ID NR: 97, SECV ID NR: 107, SECV ID NR: 117, SECV ID NR: 435, şi SECV ID NR: 529.
Într-o altă variantă de realizare, primul domeniu de legare a constructului de anticorp din invenţie cuprinde o regiune VL selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 38, SECV ID NR: 48, SECV ID NR: 58, SECV ID NR: 68, SECV ID NR: 78, SECV ID NR: 88, SECV ID NR: 98, SECV ID NR: 108, SECV ID NR: 118, SECV ID NR: 436, şi SECV ID NR: 530.
Într-o altă variantă de realizare, primul domeniu de legare al constructului de anticorp din invenţie cuprinde o regiune VH şi o regiune VL selectată din grupul constând din perechi de regiune VH şi regiune VL aşa cum este descris în SECV ID NR: 37+38; SECV ID NR: 47+48; SECV ID NR: 57+58; SECV ID NR: 67+68; SECV ID NR: 77+78; SECV ID NR: 87+88; SECV ID NR: 97+98; SECV ID NR: 107+108; SECV ID NR: 117+118; SECV ID NR: 435+436; şi SECV ID NR: 529+530.
Într-o altă variantă de realizare, primul domeniu de legare a constructului de anticorp din invenţie cuprinde o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR.: 39, SECV ID NR: 49, SECV ID NR: 59, SECV ID NR: 69, SECV ID NR: 79, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 99, SECV ID NR: 109, SECV ID NR: 119, SECV ID NR: 437, şi SECV ID NR: 531.
Primele domenii de legare de mai sus (care sunt specificate prin CDR-urile lor, regiunea VH şi regiunea VL şi combinaţiile acestora) se caracterizează ca domenii de legare care se leagă la un epitop DLL3 cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 258.
Termenul "bispecific" aşa cum este utilizat aici se referă la un construct de anticorp care este "cel puţin bispecific", adică cuprinde cel puţin un prim domeniu de legare şi un al doilea domeniu de legare, în care primul domeniu de legare se leagă de un antigen sau ţintă (aici: DLL3), şi al doilea domeniu de legare se leagă de un alt antigen sau ţintă (aici: CD3). În consecinţă, constructele de anticorpi conform invenţiei cuprind specificităţi pentru cel puţin doi antigeni sau ţinte diferite. Termenul „construct de anticorp bispecific» al invenţiei cuprinde, de asemenea, constructe de anticorpi multispecifici, cum ar fi constructe de anticorpi trispecifici, acestea din urmă incluzând trei domenii de legare, sau constructe având mai mult de trei (de ex., patru, cinci ...) specificităţi.
Având în vedere că constructele anticorpului conform invenţiei sunt (cel puţin) bispecifice, ele nu apar în mod natural şi sunt semnificativ diferite de produsele naturale. Un construct de anticorp "bispecific" sau imunoglobulină este, prin urmare, un anticorp hibrid artificial sau imunoglobulină având cel puţin două situsuri de legare distincte cu specificităţi diferite. Constructele de anticorpi bispecifici pot fi produse printr-o varietate de metode, inclusiv fuziunea hibridomilor sau legarea fragmentelor Fab'. See, de ex., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990).
Cel cel puţin două domenii de legare şi domeniile variabile ale constructului anticorpului din prezenta invenţie pot cuprinde sau nu linkeri peptidici (peptide distanţier). Termenul "linker peptidic" cuprinde în conformitate cu prezenta invenţie o secvenţă de aminoacizi prin care secvenţele de aminoacizi ale unui domeniu (variabil şi/sau de legare) şi un alt domeniu (variabil şi/sau de legare) al constructului anticorpului conform invenţiei sunt legate între ele. O caracteristică tehnică esenţială a unui astfel de linker peptidic este că acesta nu cuprinde nici o activitate de polimerizare. Printre linkerii peptidici adecvaţi sunt cei descrişi în brevetele US 4.751.180 şi 4.935.233 sau WO 88/09344. Linkerii peptidici pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a ataşa alte domenii sau module sau regiuni (cum ar fi domeniile care se extind cu timpul de înjumătăţire) la constructul anticorpului conform invenţiei.
În cazul în care se utilizează un linker, acest linker are, de preferinţă, o lungime şi o secvenţă suficiente pentru a se asigura că fiecare dintre primul şi al doilea domeniu îşi pot păstra, independent unul de celălalt, specificităţile de legare diferenţiale. Pentru linkeri peptidici care conectează cel puţin două domenii de legare (sau două domenii variabile) în constructul anticorpului conform invenţiei, sunt preferaţi acei linkeri peptidici care cuprind doar un număr de resturi de aminoacizi, de ex. 12 reziduuri de aminoacizi sau mai puţin. Astfel, sunt preferaţi linkeri peptidici de 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 sau 5 resturi de aminoacizi. Un linker peptidic prevăzut cu mai puţin de 5 aminoacizi cuprinde 4, 3, 2 sau un aminoacid(i), în care sunt preferaţi linkeri bogaţi în Gly. Un aminoacid „unic» preferat în special în contextul „linkerului peptidic» este Gly. În consecinţă, linkerul peptidic menţionat poate consta din aminoacidul unic Gly. O altă realizare preferată a unui linker peptidic este caracterizată prin secvenţa de aminoacizi Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, adică Gly4Ser (SECV ID NR.: 286), sau polimeri ai acestuia, adică (Gly4Ser)x, în care x este un întreg de 1 sau mai mare (de ex. 2 sau 3). Linkeri preferaţi sunt descrişi în SECV ID NR: 285-293. Caracteristicile linkerului peptidic menţionat, care cuprind absenţa promovării structurilor secundare, sunt cunoscute în domeniu şi sunt descrise de ex. în Dall'Acqua şi colab. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle şi colab. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) şi Raag şi Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Sunt de preferat linkeri peptidici care, în plus, nu promovează nici o structură secundară. Legătura dintre domeniile menţionate între ele poate fi asigurată, de ex., prin inginerie genetică, aşa cum este descris în exemple. Metodele de preparare a constructelor de lanţ unic bispecifice fuzionate şi legate funcţional şi de a le exprima în celule de mamifere sau bacterii sunt bine cunoscute în domeniu (de ex., WO 99/54440 sau Sambrook şi colab., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).
Aşa cum este descris aici mai sus, invenţia furnizează un exemplu de realizare preferat în care constructul anticorpului este într-un format selectat din grupul constând din (scFv)2, mAb cu domeniu unic scFv, diacorpi şi oligomeri ai oricăruia dintre formatele anterior menţionate. Termenul „este într-un format» nu exclude faptul că constructul poate fi modificat în continuare, de ex. prin ataşare sau fuziune la alte fragmente, aşa cum este descris aici.
Conform unui exemplu de realizare preferat în mod particular, şi aşa cum este documentat în exemplele anexate, constructul anticorpului conform invenţiei este un "construct de anticorp bispecific cu un singur lanţ", mai preferabil un "Fv cu un singur lanţ" bispecific (scFv). Deşi cele două domenii ale fragmentului Fv, VL şi VH, sunt codificate de gene separate, ele pot fi unite, folosind metode recombinante, printr-un linker sintetic - aşa cum este descris mai sus - care le permite să fie realizate ca un singur lanţ proteic în care regiunile VL şi VH le împerechează pentru a forma o moleculă monovalentă; vezi, de ex., Huston şi colab. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci SUA 85: 5879-5883). Aceste fragmente de anticorpi sunt obţinute folosind tehnici convenţionale cunoscute de specialiştii în domeniu, iar fragmentele sunt evaluate pentru funcţionare în acelaşi mod ca şi anticorpii compleţi sau de lungime completă. Un fragment variabil cu un singur lanţ (scFv) este, prin urmare, o proteină de fuziune a regiunii variabile a lanţului greu (VH) şi a lanţului uşor (VL) de imunoglobuline, de obicei conectată cu o peptidă scurtă de legătură de aproximativ zece până la aproximativ 25 aminoacizi, preferabil aproximativ 15 până la 20 de aminoacizi. Linkerul este de obicei bogat în glicină pentru flexibilitate, precum şi serină sau treonină pentru solubilitate şi poate conecta capătul N-terminal al VH cu capătul C-terminal al VL, sau invers. Această proteină păstrează specificitatea imunoglobulinei originale, în ciuda îndepărtării regiunilor constante şi a introducerii linkerului.
Moleculele bispecifice cu lanţ unic sunt cunoscute în domeniu şi sunt descrise în WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Löffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Tehnici descrise pentru producerea de anticorpi cu lanţ unic (vezi, între altele, brevetul US 4.946.778, Kontermann and Dübel (2010), loc. cit. şi Little (2009), loc. cit.) poate fi adaptat pentru a produce constructe de anticorpi cu lanţ unic care recunosc în mod specific (o) ţintă (ţinte) aleasă.
Fragmentele variabile bivalente (denumite şi divalente) sau bispecifice cu un singur lanţ (bi-scFvs sau di-scFvs având formatul (scFv)2 pot fi proiectate prin legarea a două molecule scFv (de ex., cu linkeri aşa cum este descris mai sus). Dacă aceste două molecule scFv au aceeaşi specificitate de legare, molecula rezultată (scFv)2 va fi de preferinţă numită bivalentă (adică are două valenţe pentru acelaşi epitop ţintă). Dacă cele două molecule scFv au specificităţi de legare diferite, molecula rezultată (scFv)2 va fi de preferinţă numită bispecifică. Legătura se poate face prin producerea unui singur lanţ peptidic cu două regiuni VH şi două regiuni VL, producând scFv în tandem (vezi de ex. Kufer P. şi colab., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). O altă posibilitate este crearea de molecule scFv cu peptide linker care sunt prea scurte pentru ca cele două regiuni variabile să se plieze împreună (de ex., aproximativ cinci aminoacizi), forţând scFv-urile să dimerizeze. Acest tip este cunoscut sub numele de diacorpi (vezi, de ex., Hollinger, Philipp şi colab., (Iulie 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8.).
Conform unui alt exemplu preferat de realizare a anticorpului conform invenţiei, lanţul greu (VH) şi lanţul uşor (VL) al unui domeniu de legare (care se leagă fie la antigenul ţintă DLL3, fie la CD3) nu sunt conectate direct printr-un linker peptidic aşa cum este descris mai sus, dar domeniile de legare sunt formate aşa cum este descris pentru diacorp. Astfel, VH al domeniului de legare CD3 poate fi fuzionat cu VL al domeniului de legare DLL3 printr-un linker peptidic şi VH al domeniului de legare DLL3 este fuzionat cu VL al domeniului de legare CD3 prin intermediul unui astfel de linker peptidic.
Anticorpii cu un singur domeniu cuprind doar un domeniu variabil de anticorpi (monomeric) care este capabil să se lege selectiv de un antigen specific, independent de alte regiuni sau domenii V. Primii anticorpi cu un singur domeniu au fost proiectaţi din anticorpi cu lanţ greu găsit în camelide şi aceştia sunt numiţi fragmente VHH. Peştii cartilaginoşi au, de asemenea, anticorpi cu lanţ greu (IgNAR) din care pot fi obţinuţi anticorpi cu un singur domeniu numiţi fragmente VNAR. O abordare alternativă este împărţirea domeniilor variabile dimerice de imunoglobuline comune, de ex. de la oameni sau rozătoare în monomeri, obţinând astfel VH sau VL ca un singur domeniu Ab. Deşi majoritatea cercetărilor privind anticorpii cu un singur domeniu se bazează în prezent pe domenii variabile ale lanţului greu, nanocorpii derivaţi din lanţurile uşoare s-au dovedit a se lega în mod specific de epitopii ţintă. Exemplele de anticorpi cu un singur domeniu se numesc sdAb, nanocorpi sau anticorpi cu un singur domeniu variabil.
A (cu un singur domeniu mAb)2 este, prin urmare, un construct de anticorp monoclonal compus din (cel puţin) doi anticorpi monoclonali cu un singur domeniu, care sunt selectaţi individual din grupul care cuprinde VH, VL, VHH and VNAR. Linkerul este de preferinţă sub forma unui linker peptidic. În mod similar, un "mAb cu domeniu unic scFv" este un construct de anticorp monoclonal compus din cel puţin un anticorp cu un singur domeniu aşa cum este descris mai sus şi o moleculă scFv aşa cum este descris mai sus. Din nou, linkerul este de preferinţă sub forma unui linker peptidic.
De asemenea, este prevăzut ca prezenta invenţie să furnizeze un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T şi CD3 de macac, în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 260, în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 259, în care primul domeniu de legare al constructului de constructului de anticorp bispecific cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din:
a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 121, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 122, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 123, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 124, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 125 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 126;
b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 132, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 134, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 141, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 142, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 143, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 144, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 145 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 146;
d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 151, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 152, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 153, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 154, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 155 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 156; şi
e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 161, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 162, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 163, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 164, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 165 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 166;
f) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 439, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 134, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
g) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 440, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 134, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
h) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 132, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 441, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
i) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 132, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 442, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
j) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 132, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 443, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
k) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 132, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 444, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
l) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 439, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 441, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136; şi
m) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 440, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 442, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136.
Într-o variantă de realizare, primul domeniu de legare al constructului de anticorp conform invenţiei cuprinde o regiune VH selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR.: 127, SECV ID NR: 137, SECV ID NR: 147, SECV ID NR: 157, SECV ID NR: 167, SECV ID NR: 445, SECV ID NR: 446, SECV ID NR: 447, SECV ID NR: 448, SECV ID NR: 449, SECV ID NR: 450, SECV ID NR: 451, SECV ID NR: 452, SECV ID NR: 453, SECV ID NR: 454, şi SECV ID NR: 455.
Într-o altă variantă de realizare, primul domeniu de legare a constructului de anticorp din invenţie cuprinde o regiune VL selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 128, SECV ID NR: 138, SECV ID NR: 148, SECV ID NR: 158, SECV ID NR: 168, SECV ID NR: 456, SECV ID NR: 457, SECV ID NR: 458, SECV ID NR: 459, SECV ID NR: 460, SECV ID NR: 461, SECV ID NR: 462, SECV ID NR: 463, SECV ID NR: 464, SECV ID NR: 465, SECV ID NR: 466, SECV ID NR: 467, SECV ID NR: 468, SECV ID NR: 469, şi SECV ID NR: 470.
Într-o altă variantă de realizare, primul domeniu de legare al constructului de anticorp din invenţie cuprinde o regiune VH şi o regiune VL selectată din grupul constând din perechi de regiune VH şi regiune VL aşa cum este descris în SECV ID NR: 127+128; SECV ID NR: 137+138; SECV ID NR: 147+148; SECV ID NR: 157+158; SECV ID NR: 167+168; SECV ID NR 137+456; SECV ID NR 137+457; SECV ID NR 137+458; SECV ID NR 137+459; SECV ID NR 137+460; SECV ID NR 445+138; SECV ID NR 446+138; SECV ID NR 447+138; SECV ID NR 445+460; SECV ID NR 448+461; SECV ID NR 449+462; SECV ID NR 450+463; SECV ID NR 450+464; SECV ID NR 450+465; SECV ID NR 450+466; SECV ID NR 450+467; SECV ID NR 450+468; SECV ID NR 451+463; SECV ID NR 452+463; SECV ID NR 453+463; SECV ID NR 451+468; SECV ID NR 454+469; şi SECV ID NR 455+470.
Într-o altă variantă de realizare, primul domeniu de legare a constructului de anticorp conform invenţiei cuprinde o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR.: 129, SECV ID NR: 139, SECV ID NR: 149, SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 471, SECV ID NR: 472, SECV ID NR: 473, SECV ID NR: 474, SECV ID NR: 475, SECV ID NR: 476, SECV ID NR: 477, SECV ID NR: 478, SECV ID NR: 479, SECV ID NR: 480, SECV ID NR: 481, SECV ID NR: 482, SECV ID NR: 483, SECV ID NR: 484, SECV ID NR: 485, SECV ID NR: 486, SECV ID NR: 487, SECV ID NR: 488, SECV ID NR: 489, SECV ID NR: 490, SECV ID NR: 491, SECV ID NR: 492, şi SECV ID NR: 493.
Primele domenii de legare de mai sus (care sunt specificate prin CDR-urile lor, regiunea VH şi regiunea VL şi combinaţiile acestora) se caracterizează ca domenii de legare care se leagă la un epitop DLL3 cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 259.
Un construct de anticorp conform prezentei dezvăluiri poate fi de asemenea definit ca un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare (de preferinţă uman) care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare se leagă de acelaşi epitop al DLL3 ca un anticorp selectat din grupul constând din DLL3-13, DLL3-14 şi DLL3-15, adică un anticorp care cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR -H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din:
a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 121, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 122, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 123, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 124, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 125 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 126;
b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 132, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 134, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136; şi
c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 141, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 142, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 143, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 144, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 145 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 146.
Un construct de anticorp conform prezentei dezvăluiri poate fi de asemenea definit ca un construct de anticorp bispecific care cuprinde un prim domeniu de legare (de preferinţă uman) care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T, în care primul domeniu de legare concurează pentru legarea cu un anticorp selectat din grupul constând din DLL3-13, DLL3-14 şi DLL3-15, adică un anticorp care cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR -H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din cele descrise mai sus.
De asemenea, se preconizează că constructul de anticorp conform invenţiei are, pe lângă funcţia sa de a se lega de moleculele ţintă DLL3 şi CD3, o funcţie suplimentară. În acest format, constructul de anticorp este un construct trifuncţional sau multifuncţional al anticorpului prin ţintirea celulelor ţintă prin legarea la DLL3, medierea activităţii celulelor T citotoxice prin legarea CD3 şi asigurarea unei funcţii suplimentare, cum ar fi un domeniu constant Fc complet funcţional care mediază citotoxicitatea celulară dependentă de anticorp prin recrutarea celulelor efectoare, precum celulele NK, o etichetă (fluorescentă etc.), un agent terapeutic, cum ar fi o toxină sau un radionuclid şi/sau mijloace de îmbunătăţire a timpului de înjumătăţire plasmatică etc.
Exemplele de mijloace de extindere a timpului de înjumătăţire plasmatică a constructelor anticorpului conform invenţiei includ peptide, proteine sau domenii ale proteinelor, care sunt fuzionate sau ataşate în alt mod la constructele anticorpului. Grupul de peptide, proteine sau domenii de proteine include peptide care se leagă de alte proteine cu profil farmacocinetic preferat în corpul uman, cum ar fi albumina serică (vezi WO 2009/127691). Un concept alternativ al unor astfel de peptide care se prelungesc cu timpul de înjumătăţire include peptidele care se leagă la receptorul neonatal Fc (FcRn, vezi WO 2007/098420), care poate fi, de asemenea, utilizat în constructele prezentei invenţii. Conceptul de ataşare a unor domenii mai mari de proteine sau proteine complete include de ex. fuziunea albuminei serice umane, variante sau mutanţi ai albuminei serice umane (vezi WO 2011/051489, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2013/135896, WO 2014/072481, WO 2013/075066) sau domenii ale acestora precum şi fuziunea regiunii constante a imunoglobulinelor (domenii Fc) şi a variantelor acestora. Astfel de variante ale domeniilor Fc pot fi optimizate/modificate pentru a permite asocierea dorită de dimeri sau multimeri, pentru a elimina legarea receptorului Fc (de ex., receptorul Fcγ) sau din alte motive. Un alt concept cunoscut în domeniu pentru a prelungi timpul de înjumătăţire al compuşilor proteici mici din corpul uman este pegilarea acelor compuşi, cum ar fi constructul anticorpului din prezenta invenţie.
Într-o variantă preferată, constructele anticorpului bispecific conform invenţiei pot fi legate (de ex., prin legătura peptidică) cu un partener de fuziune (cum ar fi o proteină sau polipeptidă sau peptidă), de ex. în scopul extinderii timpului de înjumătăţire plasmatică al constructului. Aceşti parteneri de fuziune pot fi selectaţi dintre albumina serică umană ("HSA" sau "HALB"), precum godeuri ca variante de secvenţă ale acestora, peptide care se leagă de HSA, peptide care se leagă de FcRn ("FcRn BP") sau constructe care conţin o (derivat din anticorp) regiune Fc. Secvenţe exemplare ale acestor parteneri de fuziune sunt descrise în SECV ID NR: 295-341. În general, partenerii de fuziune pot fi legaţi la capătul N-terminal sau la capătul C-terminal al anticorpilor bispecifici conform invenţiei, fie direct (de ex., prin legătura peptidică), fie printr-un linker peptidic, cum ar fi (GGGGS)n (în care "n" este un număr întreg ca 2 sau mai mare, de ex. 2 sau 3 sau 4). Linkerii peptidici adecvaţi sunt descrişi în SECV ID NR: 285-293.
Prin urmare, un construct de anticorp preferat conform prezentei invenţii cuprinde:
(a) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 39, SECV ID NR: 49, SECV ID NR: 59, SECV ID NR: 69, SECV ID NR: 79, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 99, SECV ID NR: 109, SECV ID NR: 119, SECV ID NR: 129, SECV ID NR: 139, SECV ID NR: 149, SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 437, SECV ID NR: 471, SECV ID NR: 472, SECV ID NR: 473, SECV ID NR: 474, SECV ID NR: 475, SECV ID NR: 476, SECV ID NR: 477, SECV ID NR: 478, SECV ID NR: 479, SECV ID NR: 480, SECV ID NR: 481, SECV ID NR: 482, SECV ID NR: 483, SECV ID NR: 484, SECV ID NR: 485, SECV ID NR: 486, SECV ID NR: 487, SECV ID NR: 488, SECV ID NR: 489, SECV ID NR: 490, SECV ID NR: 491, SECV ID NR: 492, SECV ID NR: 493, şi SECV ID NR: 531;
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constănd din SECV ID NR: 285-293; şi
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 350, SECV ID NR: 359, SECV ID NR: 368, SECV ID NR: 377, SECV ID NR: 386, SECV ID NR: 395, SECV ID NR: 404, SECV ID NR: 413, SECV ID NR: 422, SECV ID NR: 431, şi SECV ID NR: 434; şi
o opţional o etichetă His, cum ar fi cea descrisă în SECV ID NR.: 294;
(b) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 39, SECV ID NR: 49, SECV ID NR: 59, SECV ID NR: 69, SECV ID NR: 79, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 99, SECV ID NR: 109, SECV ID NR: 119, SECV ID NR: 129, SECV ID NR: 139, SECV ID NR: 149, SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 437, SECV ID NR: 471, SECV ID NR: 472, SECV ID NR: 473, SECV ID NR: 474, SECV ID NR: 475, SECV ID NR: 476, SECV ID NR: 477, SECV ID NR: 478, SECV ID NR: 479, SECV ID NR: 480, SECV ID NR: 481, SECV ID NR: 482, SECV ID NR: 483, SECV ID NR: 484, SECV ID NR: 485, SECV ID NR: 486, SECV ID NR: 487, SECV ID NR: 488, SECV ID NR: 489, SECV ID NR: 490, SECV ID NR: 491, SECV ID NR: 492, SECV ID NR: 493, şi SECV ID NR: 531;
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constănd din SECV ID NR: 285-293;
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 350, SECV ID NR: 359, SECV ID NR: 368, SECV ID NR: 377, SECV ID NR: 386, SECV ID NR: 395, SECV ID NR: 404, SECV ID NR: 413, SECV ID NR: 422, SECV ID NR: 431, şi SECV ID NR: 434;
o o polipeptidă linker având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 285-293;
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 295 şi 301-330; şi
o opţional o etichetă His, cum ar fi cea descrisă în SECV ID NR.: 294;
(c) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi QRFVTGHFGGLX1PANG (SECV ID NR: 296) în care X1 este Y sau H; şi
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 39, SECV ID NR: 49, SECV ID NR: 59, SECV ID NR: 69, SECV ID NR: 79, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 99, SECV ID NR: 109, SECV ID NR: 119, SECV ID NR: 129, SECV ID NR: 139, SECV ID NR: 149, SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 437, SECV ID NR: 471, SECV ID NR: 472, SECV ID NR: 473, SECV ID NR: 474, SECV ID NR: 475, SECV ID NR: 476, SECV ID NR: 477, SECV ID NR: 478, SECV ID NR: 479, SECV ID NR: 480, SECV ID NR: 481, SECV ID NR: 482, SECV ID NR: 483, SECV ID NR: 484, SECV ID NR: 485, SECV ID NR: 486, SECV ID NR: 487, SECV ID NR: 488, SECV ID NR: 489, SECV ID NR: 490, SECV ID NR: 491, SECV ID NR: 492, SECV ID NR: 493, şi SECV ID NR: 531;
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constănd din SECV ID NR: 285-293;
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 350, SECV ID NR: 359, SECV ID NR: 368, SECV ID NR: 377, SECV ID NR: 386, SECV ID NR: 395, SECV ID NR: 404, SECV ID NR: 413, SECV ID NR: 422, SECV ID NR: 431, şi SECV ID NR: 434;
o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi QRFVTGHFGGLHPANG (SECV ID NR: 298) sau QRFCTGHFGGLHPCNG (SECV ID NR: 300); şi
o opţional o etichetă His, cum ar fi cea descrisă în SECV ID NR.: 294;
(d) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 348, SECV ID NR: 357, SECV ID NR: 366, SECV ID NR: 375, SECV ID NR: 384, SECV ID NR: 393, SECV ID NR: 402, SECV ID NR: 411, SECV ID NR: 420, SECV ID NR: 429, şi SECV ID NR: 432;
o o polipeptidă linker având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 292; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 38, SECV ID NR: 48, SECV ID NR: 58, SECV ID NR: 68, SECV ID NR: 78, SECV ID NR: 88, SECV ID NR: 98, SECV ID NR: 108, SECV ID NR: 118, SECV ID NR: 128, SECV ID NR: 138, SECV ID NR: 148, SECV ID NR: 158, SECV ID NR: 168, SECV ID NR: 436, SECV ID NR: 456, SECV ID NR: 457, SECV ID NR: 458, SECV ID NR: 459, SECV ID NR: 460, SECV ID NR: 461, SECV ID NR: 462, SECV ID NR: 463, SECV ID NR: 464, SECV ID NR: 465, SECV ID NR: 466, SECV ID NR: 467, SECV ID NR: 468, SECV ID NR: 469, SECV ID NR: 470, şi SECV ID NR: 530, urmat de un reziduu de serină la capătul C-terminal; o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 331; şi
o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 47, SECV ID NR: 57, SECV ID NR: 67, SECV ID NR: 77, SECV ID NR: 87, SECV ID NR: 97, SECV ID NR: 107, SECV ID NR: 117, SECV ID NR: 127, SECV ID NR: 137, SECV ID NR: 147, SECV ID NR: 157, SECV ID NR: 167, SECV ID NR: 435, SECV ID NR: 445, SECV ID NR: 446, SECV ID NR: 447, SECV ID NR: 448, SECV ID NR: 449, SECV ID NR: 450, SECV ID NR: 451, SECV ID NR: 452, SECV ID NR: 453, SECV ID NR: 454, şi SECV ID NR: 455, şi SECV ID NR: 529;
o o polipeptidă linker având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 292; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 349, SECV ID NR: 358, SECV ID NR: 367, SECV ID NR: 376, SECV ID NR: 385, SECV ID NR: 394, SECV ID NR: 403, SECV ID NR: 412, SECV ID NR: 421, SECV ID NR: 430, şi SECV ID NR: 433 urmat de un reziduu de serină la capătul C-terminal; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 332;
(e) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 348, SECV ID NR: 357, SECV ID NR: 366, SECV ID NR: 375, SECV ID NR: 384, SECV ID NR: 393, SECV ID NR: 402, SECV ID NR: 411, SECV ID NR: 420, SECV ID NR: 429, şi SECV ID NR: 432;
o o polipeptidă linker având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 292;
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 38, SECV ID NR: 48, SECV ID NR: 58, SECV ID NR: 68, SECV ID NR: 78, SECV ID NR: 88, SECV ID NR: 98, SECV ID NR: 108, SECV ID NR: 118, SECV ID NR: 128, SECV ID NR: 138, SECV ID NR: 148, SECV ID NR: 158, SECV ID NR: 168, SECV ID NR: 436, SECV ID NR: 456, SECV ID NR: 457, SECV ID NR: 458, SECV ID NR: 459, SECV ID NR: 460, SECV ID NR: 461, SECV ID NR: 462, SECV ID NR: 463, SECV ID NR: 464, SECV ID NR: 465, SECV ID NR: 466, SECV ID NR: 467, SECV ID NR: 468, SECV ID NR: 469, SECV ID NR: 470, şi SECV ID NR: 530; şi
o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 333; şi
o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 47, SECV ID NR: 57, SECV ID NR: 67, SECV ID NR: 77, SECV ID NR: 87, SECV ID NR: 97, SECV ID NR: 107, SECV ID NR: 117, SECV ID NR: 127, SECV ID NR: 137, SECV ID NR: 147, SECV ID NR: 157, şi SECV ID NR: 167, SECV ID NR: 435, SECV ID NR: 445, SECV ID NR: 446, SECV ID NR: 447, SECV ID NR: 448, SECV ID NR: 449, SECV ID NR: 450, SECV ID NR: 451, SECV ID NR: 452, SECV ID NR: 453, SECV ID NR: 454, SECV ID NR: 455, şi SECV ID NR: 529;
o o polipeptidă linker având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 292; o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 349, SECV ID NR: 358, SECV ID NR: 367, SECV ID NR: 376, SECV ID NR: 385, SECV ID NR: 394, SECV ID NR: 403, SECV ID NR: 412, SECV ID NR: 421, SECV ID NR: 430, şi SECV ID NR: 433 urmat de un reziduu de serină la capătul C-terminal; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 334;
(f) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 39, SECV ID NR: 49, SECV ID NR: 59, SECV ID NR: 69, SECV ID NR: 79, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 99, SECV ID NR: 109, SECV ID NR: 119, SECV ID NR: 129, SECV ID NR: 139, SECV ID NR: 149, SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 437, SECV ID NR: 471, SECV ID NR: 472, SECV ID NR: 473, SECV ID NR: 474, SECV ID NR: 475, SECV ID NR: 476, SECV ID NR: 477, SECV ID NR: 478, SECV ID NR: 479, SECV ID NR: 480, SECV ID NR: 481, SECV ID NR: 482, SECV ID NR: 483, SECV ID NR: 484, SECV ID NR: 485, SECV ID NR: 486, SECV ID NR: 487, SECV ID NR: 488, SECV ID NR: 489, SECV ID NR: 490, SECV ID NR: 491, SECV ID NR: 492, SECV ID NR: 493, şi SECV ID NR: 531;
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constănd din SECV ID NR: 285-293;
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 350, SECV ID NR: 359, SECV ID NR: 368, SECV ID NR: 377, SECV ID NR: 386, SECV ID NR: 395, SECV ID NR: 404, SECV ID NR: 413, SECV ID NR: 422, SECV ID NR: 431, şi SECV ID NR: 434;
o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 335; şi o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 336;
(g) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din : 39, SECV ID NR: 49, SECV ID NR: 59, SECV ID NR: 69, SECV ID NR: 79, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 99, SECV ID NR: 109, SECV ID NR: 119, SECV ID NR: 129, SECV ID NR: 139, SECV ID NR: 149, SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 437, SECV ID NR: 471, SECV ID NR: 472, SECV ID NR: 473, SECV ID NR: 474, SECV ID NR: 475, SECV ID NR: 476, SECV ID NR: 477, SECV ID NR: 478, SECV ID NR: 479, SECV ID NR: 480, SECV ID NR: 481, SECV ID NR: 482, SECV ID NR: 483, SECV ID NR: 484, SECV ID NR: 485, SECV ID NR: 486, SECV ID NR: 487, SECV ID NR: 488, SECV ID NR: 489, SECV ID NR: 490, SECV ID NR: 491, SECV ID NR: 492, SECV ID NR: 493, şi SECV ID NR: 531; şi
o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 337; şi
o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 350, SECV ID NR: 359, SECV ID NR: 368, SECV ID NR: 377, SECV ID NR: 386, SECV ID NR: 395, SECV ID NR: 404, SECV ID NR: 413, SECV ID NR: 422, SECV ID NR: 431, şi SECV ID NR: 434; şi
o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 338;
(h) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din : 39, SECV ID NR: 49, SECV ID NR: 59, SECV ID NR: 69, SECV ID NR: 79, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 99, SECV ID NR: 109, SECV ID NR: 119, SECV ID NR: 129, SECV ID NR: 139, SECV ID NR: 149, SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 437, SECV ID NR: 471, SECV ID NR: 472, SECV ID NR: 473, SECV ID NR: 474, SECV ID NR: 475, SECV ID NR: 476, SECV ID NR: 477, SECV ID NR: 478, SECV ID NR: 479, SECV ID NR: 480, SECV ID NR: 481, SECV ID NR: 482, SECV ID NR: 483, SECV ID NR: 484, SECV ID NR: 485, SECV ID NR: 486, SECV ID NR: 487, SECV ID NR: 488, SECV ID NR: 489, SECV ID NR: 490, SECV ID NR: 491, SECV ID NR: 492, SECV ID NR: 493, şi SECV ID NR: 531; şi
o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 339; şi
o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 350, SECV ID NR: 359, SECV ID NR: 368, SECV ID NR: 377, SECV ID NR: 386, SECV ID NR: 395, SECV ID NR: 404, SECV ID NR: 413, SECV ID NR: 422, SECV ID NR: 431, şi SECV ID NR: 434; şi o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 340; sau
(i) o polipeptidă cuprinzând în următoarea ordine începând de la capătul N-terminal:
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 39, SECV ID NR: 49, SECV ID NR: 59, SECV ID NR: 69, SECV ID NR: 79, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 99, SECV ID NR: 109, SECV ID NR: 119, SECV ID NR: 129, SECV ID NR: 139, SECV ID NR: 149, SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 437, SECV ID NR: 471, SECV ID NR: 472, SECV ID NR: 473, SECV ID NR: 474, SECV ID NR: 475, SECV ID NR: 476, SECV ID NR: 477, SECV ID NR: 478, SECV ID NR: 479, SECV ID NR: 480, SECV ID NR: 481, SECV ID NR: 482, SECV ID NR: 483, SECV ID NR: 484, SECV ID NR: 485, SECV ID NR: 486, SECV ID NR: 487, SECV ID NR: 488, SECV ID NR: 489, SECV ID NR: 490, SECV ID NR: 491, SECV ID NR: 492, SECV ID NR: 493, şi SECV ID NR: 531;
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constănd din SECV ID NR: 285-293;
o o polipeptidă având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 350, SECV ID NR: 359, SECV ID NR: 368, SECV ID NR: 377, SECV ID NR: 386, SECV ID NR: 395, SECV ID NR: 404, SECV ID NR: 413, SECV ID NR: 422, SECV ID NR: 431, şi SECV ID NR: 434; şi
o o polipeptidă având secvenţa de aminoacizi descrisă în SECV ID NR: 341. De exemplu, un construct preferat de anticorp bispecific conform prezentei invenţii cuprinde sau constă dintr-o polipeptidă selectată din grupul constând din cei descrişi în:
SECV ID NR: 224, SECV ID NR: 225, SECV ID NR: 226, SECV ID NR: 227, SECV ID NR: 228, SECV ID NR: 229, SECV ID NR: 230, SECV ID NR: 231, SECV ID NR: 232, SECV ID NR: 233, SECV ID NR: 234, SECV ID NR: 235, SECV ID NR: 236, SECV ID NR: 237; SECV ID NR: 242, SECV ID NR: 243, SECV ID NR: 244, SECV ID NR: 245, SECV ID NR: 246, SECV ID NR: 247, SECV ID NR: 248, SECV ID NR: 249, SECV ID NR: 250, şi SECV ID NR: 251.
Aşa cum s-a descris mai sus, mai multe constructe preferate de anticorpi conform invenţiei sunt modificate prin fuziune cu un alt fragment, cum ar fi albumina sau variante de albumină. Dacă aceste constructe de fuziune sunt caracterizate pentru proprietăţile lor, cum ar fi în special afinitatea lor la ţintă sau activitatea citotoxică, persoana calificată va fi conştientă că se poate aştepta ca constructe de fuziune similare sau constructe de anticorpi bispecifici nemodificaţi să aibă proprietăţi similare (sau posibil chiar mai bune). De exemplu, dacă un construct de anticorp bispecific fuzionat cu albumina are o activitate citotoxică apreciabilă sau dorită sau afinitate ţintă, se poate aştepta ca aceeaşi/similară sau chiar o activitate citotoxică/afinitate ţintă mai mare să fie observată pentru acelaşi construct w/o albumină.
Conform unei alte variante preferate, constructul de anticorp bispecific conform invenţiei cuprinde (pe lângă cele două domenii de legare) un al treilea domeniu care cuprinde doi monomeri polipeptidici, fiecare cuprinzând o balama, un domeniu CH2 şi un domeniu CH3, în care respectivele două polipeptide (sau monomeri polipeptidici) sunt fuzionaţi între ei printr-un linker peptidic. De preferinţă, al treilea domeniu cuprinde într-o ordine N- la C-terminal: balama-CH2-CH3-linker-balama-CH2-CH3. Secvenţele de aminoacizi preferate pentru al treilea domeniu menţionat sunt descrise în SECV ID NR: 541-548. Fiecare dintre monomerii polipeptidici menţionaţi are, de preferinţă, o secvenţă de aminoacizi care este selectată din grupul constând din SECV ID NR: 533-540, sau care este cel puţin 90% identic cu acele secvenţe. Într-un alt exemplu de realizare preferat, primul şi al doilea domeniu de legare a constructului de anticorp bispecific al invenţiei sunt fuzionate cu al treilea domeniu printr-un linker peptidic care este, de exemplu, selectat din grupul constând din SECV ID NR.: 285, 286, 288, 289, 290, 292 şi 293.
În conformitate cu prezenta invenţie, o "balama" este o regiune de balama IgG. Această regiune poate fi identificată prin analogie folosind numerotarea Kabat, a se vedea poziţiile 223-243 Kabat. În conformitate cu cele de mai sus, cerinţa minimă pentru o "balama" sunt reziduurile de aminoacizi corespunzătoare secţiunii de secvenţă IgG1 de la D231 la P243 conform numerotării Kabat. Termenii CH2 şi CH3 se referă la regiunile constante 2 şi 3 ale lanţului greu al imunoglobulinei. Aceste regiuni pot fi, de asemenea, identificate prin analogie folosind numerotarea Kabat, vezi poziţiile Kabat 244-360 pentru CH2 şi poziţiile Kabat 361-478 pentru CH3. Se înţelege că există unele variaţii între imunoglobuline în ceea ce priveşte regiunea lor IgG1 Fc, regiunea IgG2 Fc, regiunea IgG3 Fc, regiunea IgG4 Fc, regiunea IgM Fc, regiunea IgA Fc, regiunea IgD Fc şi regiunea IgE Fc (vezi, de ex., Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)). Termenul monomer Fc se referă la ultimele două regiuni constante de lanţ greu ale IgA, IgD şi IgG şi la ultimele trei regiuni constante de lanţ greu ale IgE şi IgM. Monomerul Fc poate include, de asemenea, balama flexibilă N-terminală la aceste domenii. Pentru IgA şi IgM, monomerul Fc poate include lanţul J. Pentru IgG, porţiunea Fc cuprinde domeniile de imunoglobulină CH2 şi CH3 şi balama între primele două domenii şi CH2. Deşi limitele porţiunii Fc ale unei imunoglobuline pot varia, poate fi definit un exemplu pentru o porţiune Fc cu lanţ greu IgG umană care cuprinde o balama funcţională, domeniul CH2 şi CH3, de ex. pentru a cuprinde reziduuri D231 (ale domeniului balama) la P476 (a capătului C-terminal al domeniului CH3), sau D231 la L476, respectiv, pentru IgG4, în care numerotarea este conform Kabat.
Constructul de anticorp conform invenţiei poate cuprinde deci într-o ordine N- la C-terminal:
(a) primul domeniu de legare;
(b) un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 286, 292 şi 293;
(c) al doilea domeniu de legare;
(d) un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constînd din SECV ID NR: 285, 286, 288, 289, 290, 292 şi 293;
(e) primul monomer polipeptidic din al treilea domeniu (cuprinzând o balama, un domeniu CH2 şi un domeniu CH3);
(f) un linker peptidic având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 550, 551, 552 şi 553; şi
(e) al doilea monomer polipeptidic din al treilea domeniu (cuprinzând o balama, un domeniu CH2 şi un domeniu CH3);
De asemenea, este de preferat ca constructul anticorpului conform invenţiei să cuprindă în ordine N- la C-terminal:
• primul domeniu de legare având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 39, SECV ID NR: 49, SECV ID NR: 59, SECV ID NR: 69, SECV ID NR: 79, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 99, SECV ID NR: 109, SECV ID NR: 119, SECV ID NR: 129, SECV ID NR: 139, SECV ID NR: 149, SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 437, SECV ID NR: 471, SECV ID NR: 472, SECV ID NR: 473, SECV ID NR: 474, SECV ID NR: 475, SECV ID NR: 476, SECV ID NR: 477, SECV ID NR: 478, SECV ID NR: 479, SECV ID NR: 480, SECV ID NR: 481, SECV ID NR: 482, SECV ID NR: 483, SECV ID NR: 484, SECV ID NR: 485, SECV ID NR: 486, SECV ID NR: 487, SECV ID NR: 488, SECV ID NR: 489, SECV ID NR: 490, SECV ID NR: 491, SECV ID NR: 492, SECV ID NR: 493, şi SECV ID NR: 531;
• o peptidă linker având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NRs: 286, 292 şi 293;
• al doilea domeniu de legare având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NR: 350, SECV ID NR: 359, SECV ID NR: 368, SECV ID NR: 377, SECV ID NR: 386, SECV ID NR: 395, SECV ID NR: 404, SECV ID NR: 413, SECV ID NR: 422, SECV ID NR: 431, şi SECV ID NR: 434; • o peptidă linker având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NRs: 285, 286, 288, 289, 290, 292 şi 293; şi • al treilea domeniu având o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând din SECV ID NRs: 541-548. Prin urmare, într-un exemplu de realizare preferat, constructul anticorpului conform prezentei invenţii cuprinde sau constă dintr-o polipeptidă selectată din cele descrise în SECV ID NR: 517, SECV ID NR: 518, SECV ID NR: 519, SECV ID NR: 520, SECV ID NR: 521, SECV ID NR: 522, SECV ID NR: 523, SECV ID NR: 524, SECV ID NR: 525, SECV ID NR: 526, SECV ID NR: 527, şi SECV ID NR: 528. Tabelul de secvenţe (Tabelul 18) oferă, de asemenea, variaţii de secvenţă ale lianţilor denumiţi DLL3-4 şi DLL3-14. Mutaţiile punctuale care au fost inserate în aceste variante de secvenţă sunt identificate în funcţie de poziţia acestei mutaţii în cadrul moleculei scFv respective. Se înţelege că este posibilă şi o modalitate alternativă de identificare a acestor poziţii, în funcţie de polipeptida de referinţă, care ar putea fi la fel de bine regiunea CDR sau regiunea VH/VL. De exemplu, varianta denumită DLL3-4-001 are o dublă mutaţie G44C-G243C în molecula sa scFv (SECV ID NR.: 437). Aceasta se traduce printr-o mutaţie G44C în lanţul VH corespunzător (SECV ID NR.: 435) şi o mutaţie G101C în lanţul VL corespunzător (SECV ID NR.: 436). Modificările covalente ale constructelor anticorpului sunt, de asemenea, incluse în scopul acestei invenţii şi, în general, dar nu întotdeauna, sunt realizate post-translaţional. De exemplu, mai multe tipuri de modificări covalente ale constructului anticorpului sunt introduse în moleculă prin reacţia resturilor specifice de aminoacizi ale constructului anticorpului cu un agent organic de derivatizare care este capabil să reacţioneze cu lanţurile laterale selectate sau cu resturile N- sau C-terminale. Reziduurile de cisteinil reacţionează cel mai frecvent cu α-haloacetaţi (şi aminele corespunzătoare), cum ar fi acidul cloracetic sau cloracetamida, pentru a da derivaţi carboximetil sau carboxiamidometil. Reziduurile de cisteinil sunt, de asemenea, derivate prin reacţie cu bromotrifluoroacetonă, acid α-bromo-β- (5-imidozoil) propionic, fosfat de cloracetil, N-alchilmaleimide, 3-nitro-2-piridil disulfură, 2-piridil disulfură de metil, p-cloromercuribenzoat, 2-cloromercuri-4-nitrofenol sau cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol. Reziduurile de histidil sunt derivatizate prin reacţie cu dietilpirocarbonat la pH 5,5-7,0 deoarece acest agent este relativ specific pentru lanţul lateral al histidilului. Bromura de para-bromfenacil este de asemenea utilă; reacţia se efectuează de preferinţă în cacodilat de sodiu 0,1 M la pH 6,0. Reziduurile de lizinil şi amino terminale reacţionează cu anhidridele acidului succinic sau cu alţi carboxilici. Derivatizarea cu aceşti agenţi are ca efect inversarea sarcinii reziduurilor de lizinil. Alţi reactivi adecvaţi pentru derivatizarea reziduurilor care conţin alfa-amino includ imidoesteri precum metil picolinimidat; fosfat de piridoxal; piridoxal; cloroborohidrură; acid trinitrobenzensulfonic; O-metilizourea; 2,4-pentandionă; şi reacţie catalizată de transaminază cu glioxilat. Reziduurile de arginil sunt modificate prin reacţia cu unul sau mai mulţi reactivi convenţionali, printre care fenilglioxal, 2,3-butandionă, 1,2-ciclohexandionă şi ninhidrină. Derivatizarea reziduurilor de arginină necesită ca reacţia să fie efectuată în condiţii alcaline din cauza pKa ridicat al grupării funcţionale a guanidinei. Mai mult, aceşti reactivi pot reacţiona cu grupările de lizină, precum şi cu grupa epsilon-amino a argininei. Modificarea specifică a reziduurilor de tirozil poate fi făcută, cu un interes deosebit în introducerea etichetelor spectrale în reziduurile de tirozil prin reacţie cu compuşi aromatici de diazoniu sau tetranitrometan. Cel mai frecvent, N-acetilimidizolul şi tetranitrometanul sunt utilizate pentru a forma specii de, respectiv, derivaţi 3-nitro. Reziduurile de tirozil sunt iodate folosind 125I sau 131I pentru a prepara proteine ​​marcate pentru utilizare în radioimunoteste, metoda T cu cloramină descrisă mai sus fiind adecvată. Grupările laterale carboxil (aspartil sau glutamil) sunt modificate selectiv prin reacţia cu carbodiimide (R'-N=C=N--R'), în care R şi R' sunt opţional grupări alchil diferite, cum ar fi 1-ciclohexil-3- (2-morfolinil-4-etil) carbodiimidă sau 1-etil-3- (4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimidă. Mai mult, resturile de aspartil şi glutamil sunt transformate în resturi de asparaginil şi glutaminil prin reacţie cu ioni de amoniu. Derivatizarea cu agenţi bifuncţionali este utilă pentru reticularea constructelor de anticorpi conform prezentei invenţii la o matrice de suport sau suprafaţă insolubilă în apă pentru utilizare într-o varietate de metode. Agenţii de reticulare utilizaţi în mod obişnuit includ, de ex., 1,1-bis (diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehidă, esteri N-hidroxisuccinimidici, de exemplu, esteri cu acid 4-azidosalicilic, imidoesteri homobifuncţionali, inclusiv esteri disuccinimidilici precum 3,3'-ditiobis (succinimidilpropionat) şi maleimide bifuncţionale precum bis-N-maleimido-1,8-octan. Agenţi de derivare cum ar fi metil-3 -[(p-azidofenil) ditio] propioimidat produc intermediari fotoactivabili care sunt capabili să formeze legături încrucişate în prezenţa luminii. Alternativ, matrici reactive insolubile în apă, cum ar fi carbohidraţi activaţi cu bromură de cianogen şi substraturi reactive, aşa cum este descris în brevetul US nr. Nr. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; şi 4.330.440 sunt utilizaţi pentru imobilizarea proteinelor. Reziduurile de glutaminil şi asparaginil sunt frecvent deamidate la reziduurile de glutamil şi respectiv, aspartil. Alternativ, aceste reziduuri sunt deamidate în condiţii uşor acide. Oricare dintre aceste reziduuri se încadrează în scopul acestei invenţii. Alte modificări includ hidroxilarea prolinei şi lizinei, fosforilarea grupărilor hidroxil ale reziduurilor seril sau treonil, metilarea grupărilor α-amino ale lizinei, argininei şi histidinei lanţurilor laterale (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), acetilarea aminei N-terminale şi amidarea oricărei grupări carboxil C-terminale. Un alt tip de modificare covalentă a constructelor anticorpului inclus în scopul acestei invenţii cuprinde modificarea modelului de glicozilare a proteinei. După cum se ştie în domeniu, modelele de glicozilare pot depinde atât de secvenţa proteinei (de ex., de prezenţa sau absenţa unor resturi de aminoacizi de glicozilare particulare, discutate mai jos), fie de celula gazdă sau organismul în care este produsă proteina. Sistemele de expresie particulare sunt discutate mai jos. Glicozilarea polipeptidelor este de obicei fie N-legată, fie O-legată. N-legat se referă la ataşarea fragmentului carbohidrat la lanţul lateral al unui reziduu de asparagină. Secvenţele tri-peptidice asparagină-X-serină şi asparagină-X-treonină, în care X este orice aminoacid cu excepţia prolinei, sunt secvenţele de recunoaştere pentru ataşarea enzimatică a fragmentului carbohidrat la lanţul lateral al asparaginei. Astfel, prezenţa oricăreia dintre aceste secvenţe tri-peptidice într-o polipeptidă creează un potenţial situs de glicozilare. Glicozilarea O-legată se referă la ataşarea unuia dintre zaharurile N-acetilgalactozamină, galactoză sau xiloză, la un hidroxiaminoacid, cel mai frecvent serină sau treonină, deşi pot fi utilizate şi 5-hidroxiprolină sau 5-hidroxilizină. Adăugarea situsurilor de glicozilare la constructul anticorpului se realizează în mod convenabil prin modificarea secvenţei de aminoacizi astfel încât să conţină una sau mai multe dintre secvenţele tri-peptidice descrise mai sus (pentru situsurile de glicozilare N-legate). Modificarea poate fi făcută, de asemenea, prin adăugarea sau substituirea cu unul sau mai multe reziduuri de serină sau treonină la secvenţa de pornire (pentru locurile de glicozilare legate de O). Pentru uşurinţă, secvenţa de aminoacizi a unui construct de anticorpi este modificată, de preferinţă, prin modificări la nivelul ADN-ului, în special prin mutarea ADN-ului care codifică polipeptida la baze preselecţionate astfel încât să se genereze codoni care se vor translata în aminoacizii doriţi. Un alt mijloc de creştere a numărului de fragmente de carbohidraţi pe structura anticorpului este prin cuplarea chimică sau enzimatică a glicozidelor cu proteina. Aceste proceduri sunt avantajoase prin faptul că nu necesită producerea de proteine ​​într-o celulă gazdă care are capacităţi de glicozilare pentru glicozilare legată de N- şi O-. În funcţie de modul de cuplare utilizat, zaharul (zaharuri) poate fi ataşat la (a) arginină şi histidină, (b) grupări carboxil libere, (c) grupări sulfhidril libere precum cele ale cisteinei, (d) grupări hidroxil libere precum cele ale serinei, treoninei sau hidroxiprolinei, (e) reziduuri aromatice precum cele ale fenilalaninei, tirozinei sau triptofanului sau (f) grupului amidic al glutaminei. Aceste metode sunt descrise în WO 87/05330 şi în Aplin şi Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., Pp. 259-306. Îndepărtarea fracţiunilor de carbohidraţi prezente pe constructul anticorpului iniţial poate fi realizată chimic sau enzimatic. Deglicozilarea chimică necesită expunerea proteinei la compusul acid trifluormetansulfonic sau la un compus echivalent. Acest tratament are ca rezultat scindarea majorităţii sau a tuturor zaharurilor, cu excepţia zaharului care leagă (N-acetilglucozamina sau N-acetilgalactozamina), lăsând polipeptida intactă. Deglicozilarea chimică este descrisă de Hakimuddin şi colab., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 şi de Edge şi colab., 1981, Anal. Biochem. 118:131. Scindarea enzimatică a fragmentelor de carbohidraţi pe polipeptide poate fi realizată prin utilizarea unei varietăţi de endo- şi exo-glicozidaze, aşa cum este descris de Thotakura şi colab., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. Glicozilarea la potenţialele locuri de glicozilare poate fi prevenită prin utilizarea compusului tunicamicină aşa cum este descris de Duskin şi colab., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. Tunicamicina blochează formarea legăturilor proteină-N-glicozidă. Alte modificări ale constructului anticorpului sunt, de asemenea, avute în vedere aici. De exemplu, un alt tip de modificare covalentă a constructului anticorpului cuprinde legarea constructului anticorpului la diferiţi polimeri neproteici, incluzând, dar fără a se limita la, diferiţi polioli precum polietilenglicol, polipropilenglicol, polioxialchileni sau copolimeri de polietilenglicol şi polipropilenglicol, în modul stabilit în brevetele US nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 sau 4.179.337. În plus, aşa cum se ştie în domeniu, substituţiile de aminoacizi pot fi făcute în diferite poziţii în cadrul constructului anticorpului, de ex. pentru a facilita adăugarea de polimeri precum PEG. În unele variante de realizare, modificarea covalentă a constructelor anticorpului conform invenţiei cuprinde adăugarea uneia sau mai multor etichete. Grupul de marcare poate fi cuplat la constructul anticorpului prin intermediul braţelor distanţatoare de diferite lungimi pentru a reduce potenţialul obstacol steric. Diferite metode pentru marcarea proteinelor sunt cunoscute în domeniu şi pot fi utilizate în realizarea prezentei invenţii. Termenul „etichetă» sau „grup de etichetare» se referă la orice etichetă detectabilă. În general, etichetele se încadrează într-o varietate de clase, în funcţie de testul în care urmează să fie detectate - următoarele exemple includ, dar nu se limitează la:
a) etichete izotopice, care pot fi izotopi radioactivi sau grei, precum radioizotopi sau radionuclizi (de ex., 3H, 14C, 15N, 35S, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I)
b) etichete magnetice (de ex., particule magnetice)
c) fragmente active redox
d) coloranţi optici (incluzând, dar nelimitându-se la, cromofori, fosfor şi fluorofori), cum ar fi grupări fluorescente (de ex., FITC, rodamină, fosfor lantanid), grupuri chemioluminescente şi fluorofori care pot fi fie fluoruri cu „moleculă mică», fie fluoruri proteinacee
e) grupări enzimatice (de ex., peroxidază de hrean, β-galactozidază, luciferază, fosfatază alcalină)
f) grupări biotinilate
g) epitopi polipeptidici predeterminaţi recunoscuţi de un raporter secundar (de ex., secvenţe pereche cu fermoar de leucină, situsuri de legare pentru anticorpi secundari, domenii de legare a metalelor, etichete de epitop etc.)
Prin "etichetă fluorescentă" se înţelege orice moleculă care poate fi detectată prin proprietăţile sale fluorescente inerente. Etichetele fluorescente adecvate includ, dar nu se limitează la, fluoresceină, rodamină, tetrametilrodamină, eozină, eritrozină, cumarină, metil-cumarine, piren, verde malachit, stilben, galben licurici, Cascade BlueJ, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, verde Oregon, coloranţi Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633,
Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow şi R-ficoeritrină (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rhodamine, şi Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Coloranţii optici adecvaţi, inclusiv fluoroforii, sunt descrişi în Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland.
Etichetele fluorescente proteice adecvate includ, de asemenea, dar nu sunt limitate la, proteine fluorescente verzi, inclusiv Renilla, Ptilosarcus, sau specii Aequorea ale GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank Accession Number U55762), proteina albastru fluorescent (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim şi colab., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), proteină fluorescentă galbenă îmbunătăţită (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferază (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β galactozidază (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. S.U.A. 85:2603-2607) şi Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, brevete U.S. Nr. 5.292.658; 5.418.155; 5.683.888; 5.741.668; 5.777.079; 5.804.387; 5.874.304; 5.876.995; 5.925.558).
Domeniile fermoarului de leucină sunt peptide care promovează oligomerizarea proteinelor în care se găsesc. Fermoarele de leucină au fost identificate iniţial în mai multe proteine care leagă ADN-ul (Landschulz şi colab., 1988, Science 240: 1759) şi de atunci au fost găsite într-o varietate de proteine diferite. Printre fermoarele de leucină cunoscute se numără peptidele naturale şi derivaţii acestora care dimerizează sau trimerizează. Exemple de domenii cu fermoar de leucină adecvate pentru producerea de proteine oligomerice solubile sunt descrise în cererea PCT WO 94/10308 şi fermoarul de leucină derivat din proteina surfactant pulmonar D (SPD) descris în Hoppe şi colab., 1994, FEBS Letters 344: 191. Utilizarea unui fermoar de leucină modificat care permite trimerizarea stabilă a unei proteine heteroloage fuzionate la aceasta este descrisă în Fanslow şi colab., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. Într-o abordare, proteinele de fuziune recombinante care cuprind un fragment de anticorp DLL3 sau un derivat fuzionat la o peptidă cu fermoar de leucină sunt exprimate în celule gazdă adecvate, iar fragmentele sau derivaţii oligomerici de anticorp DLL3 sau derivaţii care se formează sunt recuperaţi din supernatantul de cultură.
Constructul anticorpului conform invenţiei poate cuprinde, de asemenea, domenii suplimentare, care sunt de ex. utile la izolarea moleculei sau se referă la un profil farmacocinetic adaptat al moleculei. Domeniile utile pentru izolarea unui construct de anticorp pot fi selectate dintre motivele peptidice sau fragmentele introduse secundar, care pot fi capturate într-o metodă de izolare, de ex. o coloană de izolare. Exemplele nelimitative ale unor astfel de domenii suplimentare cuprind motive peptidice cunoscute sub numele de Myc-tag, HAT-tag, HA-tag, TAP-tag, GST-tag, domeniul de legare a chitinei (eticheta CBD), proteina de legare a maltozei (eticheta MBP), eticheta Flag, eticheta Strep şi variantele acestora (de exemplu, eticheta Strepll) şi eticheta His. Toate constructele de anticorp descrise aici caracterizate prin CDR-urile identificate sunt preferate să cuprindă un domeniu cu etichetă His, care este în general cunoscut ca o repetare a reziduurilor His consecutive în secvenţa de aminoacizi a unei molecule, de preferinţă de cinci, şi mai preferabil de şase reziduuri His (hexa-histidină). Eticheta His poate fi localizată de ex. la capătul N- sau C-terminal al constructului anticorpului, de preferinţă este situat la capătul C-terminal. Cel mai preferabil, o etichetă hexa-histidină (HHHHHH) este legată printr-o legătură peptidică la capătul C-terminal al constructului anticorpului conform invenţiei.
Primul domeniu de legare al constructului anticorpului conform prezentei invenţii se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă în regiune aşa cum este definită în revendicări. Secvenţa de aminoacizi preferată a DLL3 umană este reprezentată de SECV ID NR: 252. Se înţelege că termenul "la suprafaţă", în contextul prezentei invenţii, înseamnă că domeniul de legare se leagă specific de un epitop cuprins în domeniul extracelular DLL3 (DLL3 ECD). Primul domeniu de legare conform invenţiei, prin urmare, se leagă de preferinţă la DLL3 atunci când este exprimat prin exprimarea naturală a celulelor sau liniilor celulare şi/sau prin celule sau linii celulare transformate sau (stabil/tranzitor) transfectate cu DLL3. Într-o realizare preferată, primul domeniu de legare se leagă de asemenea de DLL3 atunci când DLL3 este utilizat ca moleculă "ţintă" sau "ligand" într-un test de legare in vitro cum ar fi BIAcore sau Scatchard. "Celula ţintă" poate fi orice celulă procariotă sau eucariotă care exprimă DLL3 pe suprafaţa sa; de preferinţă, celula ţintă este o celulă care face parte din corpul uman sau animal, cum ar fi o DLL3 specifică care exprimă cancer sau celula tumorală.
Termenul "DLL3 ECD" se referă la o formă de DLL3 care este în esenţă lipsită de domenii transmembranare şi citoplasmatice ale DLL3. Se va înţelege de către specialiştii în domeniu că domeniul transmembranar identificat pentru polipeptida DLL3 din prezenta invenţie este identificat în conformitate cu criteriile utilizate în mod obişnuit în domeniu pentru identificarea acelui tip de domeniu hidrofob. Limitele exacte ale unui domeniu transmembranar pot varia, dar cel mai probabil nu mai mult de aproximativ 5 aminoacizi la ambele capete ale domeniului specificat aici. Un DLL3 ECD uman preferat este arătat în SECV ID NR: 253.
Afinitatea primului domeniu de legare pentru DLL3 uman este de preferinţă ≤20 nM, mai preferabil ≤10 nM, chiar mai preferabil ≤5 nM, chiar mai preferabil ≤2 nM, chiar mai preferabil ≤1 nM, chiar mai preferabil ≤06 nM, chiar mai preferabil ≤05 nM şi cel mai preferabil ≤0,4 nM. Afinitatea poate fi măsurată de exemplu într-un test BIAcore sau într-un test Scatchard, de ex. aşa cum este descris în Exemple. Alte metode de determinare a afinităţii sunt, de asemenea, bine cunoscute persoanei calificate.
Celulele T sau limfocitele T sunt un tip de limfocit (el însuşi un tip de celule albe din sânge) care joacă un rol central în imunitatea mediată de celule. Există mai multe subseturi de celule T, fiecare cu o funcţie distinctă. Celulele T se pot distinge de alte limfocite, cum ar fi celulele B şi celulele NK, prin prezenţa unui receptor de celule T (TCR) pe suprafaţa celulei. TCR este responsabil pentru recunoaşterea antigenilor legaţi de moleculele complexului de histocompatibilitate majoră (MHC) şi este compus din două lanţuri de proteine ​​diferite. În 95% din celulele T, TCR constă dintr-un lanţ alfa (α) şi beta (β). Când TCR se angajează cu peptida antigenică şi MHC (complexul peptidă/MHC), limfocitul T este activat printr-o serie de evenimente biochimice mediate de enzime asociate, co-receptori, molecule adaptoare specializate şi factori de transcripţie activaţi sau eliberaţi
Complexul receptorului CD3 este un complex proteic şi este compus din patru lanţuri. La mamifere, complexul conţine un lanţ CD3γ (gamma), un lanţ CD3δ (delta) şi două lanţuri CD3ε (epsilon). Aceste lanţuri se asociază cu receptorul de celule T (TCR) şi aşa-numitul lanţ ζ (zeta) pentru a forma complexul CD3 al receptorului de celule T şi pentru a genera un semnal de activare în limfocitele T. Lanţurile CD3γ (gamma), CD3δ (delta) şi CD3ε (epsilon) sunt proteine de suprafaţă celulară foarte înrudite ale superfamiliei imunoglobulinei conţinând un singur domeniu de imunoglobulină extracelulară. Cozile intracelulare ale moleculelor CD3 conţin un singur motiv conservat cunoscut sub numele de motiv de activare pe bază de tirozină imunoreceptoare sau ITAM pe scurt, care este esenţial pentru capacitatea de semnalizare a TCR. Molecula epsilon CD3 este o polipeptidă care la om este codificată de gena CD3E care se află pe cromozomul 11. Cel mai preferat epitop al CD3 epsilon este cuprins în resturile de aminoacizi 1-27 din domeniul extracelular CD3 epsilon uman.
Liza redirecţionată a celulelor ţintă prin recrutarea celulelor T de către un construct multispecific, cel puţin bispecific de anticorp implică formarea sinapselor citolitice şi livrarea de perforină şi granzime. Celulele T angajate sunt capabile de liză a celulelor ţintă seriale şi nu sunt afectate de mecanismele de evacuare imunitară care interferă cu procesarea şi prezentarea antigenului peptidic sau cu diferenţierea clonală a celulelor T; vezi, de exemplu, WO 2007/042261.
Citotoxicitatea mediată de constructele de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 poate fi măsurată în diferite moduri. Vezi Exemplele 8.1 până la 8.7. Celulele efectoare pot fi de ex. celule T CD8 pozitive stimulate îmbogăţite (umane) sau celule mononucleare (umane) din sânge periferic nestimulat (uman) (PBMC). Dacă celulele ţintă sunt de origine de macac sau sunt expres sau sunt transfectate cu DLL3 de macac, celulele efectoare ar trebui să fie, de asemenea, de origine de macac, cum ar fi o linie de celule T de macac, de ex. 4119LnPx. Celulele ţintă trebuie să exprime (cel puţin domeniul extracelular al) DLL3, de ex. DLL3 uman sau macac. Celulele ţintă pot fi o linie celulară (cum ar fi CHO) care este transfectată stabil sau tranzitor cu DLL3, de ex. DLL3 uman sau de macac. Alternativ, celulele ţintă pot fi o linie celulară expresoare natural pozitivă DLL3, cum ar fi linia celulară de carcinom pulmonar uman SHP-77. De obicei, valorile EC50 sunt de aşteptat să fie mai mici cu liniile celulare ţintă care exprimă niveluri mai ridicate de DLL3 pe suprafaţa celulei. Raportul efector la celulă ţintă (E:T) este de obicei aproximativ 10:1, dar poate varia, de asemenea. Activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 poate fi măsurată într-un test de eliberare în crom 51 (timp de incubaţie de aproximativ 18 ore) sau într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS (timp de incubaţie de aproximativ 48 de ore). Modificări ale timpului de incubaţie a testului (reacţie citotoxică) sunt, de asemenea, posibile. Alte metode de măsurare a citotoxicităţii sunt bine cunoscute persoanei calificate şi cuprind teste MTT sau MTS, teste bazate pe ATP, inclusiv teste bioluminescente, testul de sulforodamină B (SRB), testul WST, testul clonogen şi tehnologia ECIS.
Activitatea citotoxică mediată de constructele de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 conform prezentei invenţii este de preferinţă măsurată într-un test de citotoxicitate pe bază de celule. Poate fi, de asemenea, măsurată printr-un test de eliberare a crom 51. Este reprezentată de valoarea EC50, care corespunde concentraţiei maxime la jumătate efective (concentraţia constructului anticorpului care induce un răspuns citotoxic la jumătatea distanţei dintre linia de bază şi maxim). Preferabil, valoarea EC50 a constructelor de anticorp bispecifice DLL3xCD3 este ≤5000 pM sau ≤4000 pM, mai preferabil ≤3000 pM sau ≤2000 pM, chiar mai preferabil ≤1000 pM sau ≤500 pM, chiar mult mai preferabil ≤400 pM sau ≤300 pM, chiar mai preferabil ≤200 pM, chiar mai preferabil ≤100 pM, chiar mai preferabil ≤50 pM, chiar mai preferabil ≤20 pM sau ≤10 pM, şi cel mai preferabil ≤5 pM.
Valorile EC50 date mai sus pot fi măsurate în diferite teste. Persoana calificată este conştientă că se poate aştepta ca o valoare EC50 să fie mai mică atunci când celulele T CD8+ stimulate/îmbogăţite sunt utilizate ca celule efectoare, comparativ cu PBMC nestimulat. De asemenea, se poate aştepta ca valorile EC50 să fie mai mici atunci când celulele ţintă exprimă un număr mare de antigen ţintă comparativ cu o ţintă de şobolan cu expresie scăzută. De exemplu, atunci când celulele T CD8+ umane stimulate/îmbogăţite sunt utilizate ca celule efectoare (şi celulele SHP-77 cu carcinom pulmonar uman pozitiv DLL3 sunt folosite ca celule ţintă), valoarea EC50 a constructului de anticorp bispecific DLL3 xCD3 este preferabil ≤1000 pM, mai preferabil ≤500 pM, chiar mai preferabil ≤250 pM, chiar mai preferabil ≤100 pM, chiar mai preferabil ≤50 pM, chiar mai preferabil ≤10 pM, şi cel mai preferabil ≤5 pM. Când PBMC umane sunt utilizate ca celule efectoare, valoarea EC50 a DLL3xCD3 a constructului de anticorp bispecific este preferabil ≤5000 pM sau ≤4000 pM (în particular când celulele ţintă sunt o linie de celule SHP-77 de carcinom pulmonar uman pozitive DLL3), mai preferabil ≤2000 pM (în particular când celulele ţintă sunt DLL3 transfectate ca celule CHO), mai preferabil ≤1000 pM sau ≤500 pM, chiar mai preferabil ≤200 pM, chiar mai preferabil ≤150 pM, chiar mai preferabil ≤100 pM, şi cel mai preferabil ≤50 pM, sau mai puţin. Când o linie de celule T de macac precum LnPx4119 este utilizată ca celule efectoare, şi o linie de celule transfectate DLL3 de macac ca celule CHO este utilizată ca linie de celule ţintă, valoarea EC50 a constructului de anticorp bispecific DLL3 xCD3 este preferabil ≤2000 pM sau ≤1500 pM, mai preferabil ≤1000 pM sau ≤500 pM, chiar mai preferabil ≤300 pM sau ≤250 pM, chiar mai preferabil ≤100 pM, şi cel mai preferabil ≤50 pM.
De preferinţă, constructele anticorpului bispecific DLL3xCD3 conform prezentei invenţii nu induc/mediază liza sau nu induc în mod esenţial/mediază liza celulelor DLL3 negative, cum ar fi celulele CHO. Termenul "nu induc liza", "nu induc în mod esenţial liza", "nu mediazăi liza" sau "nu mediază în mod esenţial liza" înseamnă că un construct de anticorp conform prezentei invenţii nu induce sau nu mediază liza mai mult de 30 %, de preferinţă nu mai mult de 20%, mai preferabil nu mai mult de 10%, în special preferabil nu mai mult de 9%, 8%, 7%, 6% sau 5% din celulele DLL3 negative, prin care liza unui carcinom uman pulmonar DLL3 pozitiv în linia celulară SHP-77 (vezi mai sus) este setată să fie 100%. Acest lucru se aplică de obicei pentru concentraţiile de anticorp de până la 500 nM. Persoana calificată ştie cum să măsoare liza celulară fără alte întrebări. Mai mult, prezenta specificaţie dă instrucţiuni specifice cum se măsoară liza celulară.
Diferenţa de activitate citotoxică între izoforma monomerică şi dimerică a constructelor individuale de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 este denumită „decalaj de potenţă». Acest decalaj de potenţă poate de ex. să fie calculat ca raport între valorile EC50 ale formei monomerice şi dimerice a moleculei, vezi Exemplul 15. Lacunele de potenţă ale constructelor anticorpului bispecific DLL3xCD3 conform prezentei invenţii sunt de preferinţă ≤ 5, mai preferabil ≤ 4, chiar mai preferabil ≤ 3, chiar mai preferabil ≤ 2 şi cel mai preferabil ≤ 1.
Primul domeniu de legare al constructului anticorpului conform invenţiei este, de preferinţă, specii încrucişate specifice pentru membrii ordinului mamiferelor primatelor. Domeniile de legare CD3 specifice speciilor încrucişate sunt, de exemplu, descrise în WO 2008/119567. Conform unei variante de realizare, primul domeniu de legare, pe lângă legarea la DLL3 uman, se va lega şi de DLL3 a primatelor, incluzând (dar fără a se limita la) noi primate în lume (cum ar fi Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus sau Saimiri sciureus), primatele lumii vechi (cum ar fi babuini şi macaci), gibonii, orangutani şi homininae neumane. Se preconizează că primul domeniu de legare al constructului anticorpului conform invenţiei care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă se leagă, de asemenea, cel puţin de DLL3 de macac. Al doilea domeniu de legare a constructului anticorpului conform invenţiei care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T se leagă şi de CD3 de macac. Un macac preferat este Macaca fascicularis. Macaca mulatta (Rhesus) este, de asemenea, prevăzută. Domeniile de legare CD3 specifice speciilor încrucişate sunt, de exemplu, descrise în WO 2008/119567. De asemenea, orice domeniu (domenii) de legare suplimentară a constructului anticorpului conform invenţiei este/sunt, de preferinţă, specii încrucişate specifice pentru membrii din ordinul mamiferelor primatelor.
Constructul de anticorp bispecific conform invenţiei cuprinde un prim domeniu de legare care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T şi CD3 de macac, în care primul domeniu de legare se leagă la un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 260 conform definiţiilor din revendicări.
Într-un aspect al invenţiei, primul domeniu de legare se leagă de DLL3 uman şi se leagă în continuare de DLL3 de macac, cum ar fi DLL3 din Macaca fascicularis şi, mai preferabil, de DLL3 ECD de macac. Un DLL3 preferat de Macaca fascicularis este descris în SECV ID NR: 271. Un DLL3 ECD preferat de macac este descris în SECV ID NR: 272. Afinitatea primului domeniu de legare pentru DLL3 de macac este preferabil ≤15 nM, mai preferabil ≤10 nM, even mai preferabil ≤5 nM, even mai preferabil ≤1 nM, even mai preferabil ≤05 nM, even mai preferabil ≤0,1 nM, şi cel mai preferably ≤0,05 nM sau chiar ≤0,01 nM.
Preferabil golul de afinitate al constructelor de anticorp conform invenţiei pentru legarea DLL3 de macac faţă de DLL3 uman [ma DLL3:hu DLL3] (determinat de ex. prin BiaCore sau prin analiză Scatchard) este între 0,1 şi 10, mai preferabil între 0,2 şi 5, chiar mai preferabil între 0,3 şi 4, chiar mai preferabil între 0,5 şi 3 sau între 0,5 şi 2,5, şi cel mai preferabil între 0,5 şi 2 sau între 0,6 şi 2. Vezi Exemplele 3 şi 4.
Într-o variantă de realizare a constructului anticorpului conform invenţiei, al doilea domeniu de legare se leagă de epsilon CD3 uman şi de epsilon CD3 de Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus sau Saimiri sciureus De preferinţă, al doilea domeniu de legare se leagă de un epitop extracelular al acestor lanţuri epsilon CD3. De asemenea, se preconizează că al doilea domeniu de legare se leagă de un epitop extracelular al lanţului epsilon CD3 uman şi Macaca. Cel mai preferat epitop al CD3 epsilon este cuprins în resturile de aminoacizi 1-27 din domeniul extracelular CD3 epsilon uman. Chiar mai specific, epitopul cuprinde cel puţin secvenţa de aminoacizi Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Callithrix jacchus şi Saguinus oedipus sunt ambii primate de lumea nouă aparţinând familiei Callitrichidae, în timp ce Saimiri sciureus este un primat de lumea nouă aparţinând familiei Cebidae.
Este preferat în special pentru constructul anticorpului din prezenta invenţie ca al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman şi CD3 de macac de pe suprafaţa unei celule T cuprinde o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate dintre:
(a) CDR-L1 descris în SECV ID NR. 27 din WO 2008/119567, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 28 din WO 2008/119567 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 29 din WO 2008/119567;
(b) CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 117 din WO 2008/119567, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 118 din WO 2008/119567 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 119 din WO 2008/119567; şi
(c) CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 153 din WO 2008/119567, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 154 din WO 2008/119567 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 155 din WO 2008/119567,
Într-o variantă preferată alternativă a constructului anticorpului din prezenta invenţie, al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T şi CD3 de macac cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H 1, CDR-H2 şi CDR-H3 selectat dintre:
(a) CDR-H1 descris în SECV ID NR. 12 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 13 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 14 din WO 2008/119567;
(b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 30 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 31 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 32 din WO 2008/119567;
(c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 48 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 49 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 50 din WO 2008/119567;
(d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 66 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 67 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 68 din WO 2008/119567;
(e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 84 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 85 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 86 din WO 2008/119567;
(f) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 102 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 103 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 104 din WO 2008/119567;
(g) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 120 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 121 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 122 din WO 2008/119567;
(h) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 138 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 139 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 140 din WO 2008/119567;
(i) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 156 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 157 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 158 din WO 2008/119567; şi
(j) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 174 din WO 2008/119567, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 175 din WO 2008/119567 şi CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 176 din WO 2008/119567,
De asemenea, este preferat pentru constructul anticorpului prezentei invenţii ca al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman de pe suprafaţa unei celule T şi CD3 de macac cuprinde o regiune VL selectată din grupul constând dintr-o regiune VL aşa cum este descrisă în SECV ID NR: 35, 39, 125, 129, 161 sau 165 din WO 2008/119567.
Se preferă alternativ ca al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T şi CD3 de macac cuprinde o regiune VH selectată din grupul constând dintr-o regiune VH aşa cum este descris în SECV ID NR.: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 sau 181 din WO 2008/119567.
Mai preferabil, constructul anticorpului din prezenta invenţie este caracterizat prin al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T şi CD3 de macac cuprinzând o regiune VL şi o regiune VH selectată din grupul constând din:
(a) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 17 sau 21 din WO 2008/119567 şi regiunea VH cum s-a descris în SECV ID NR: 15 sau 19 din WO 2008/119567;
(b) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 35 sau 39 din WO 2008/119567 şi regiunea VH cum s-a descris în SECV ID NR: 33 sau 37 din WO 2008/119567;
(c) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 53 sau 57 din WO 2008/119567 şi regiunea VH cum s-a descris în SECV ID NR: 51 sau 55 din WO 2008/119567;
(d) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 71 sau 75 din WO 2008/119567 şi regiunea VH cum s-a descris în SECV ID NR: 69 sau 73 din WO 2008/119567;
(e) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 89 sau 93 din WO 2008/119567 şi regiunea VH cum s-a descris în SECV ID NR: 87 sau 91 din WO 2008/119567;
(f) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 107 sau 111 din WO 2008/119567 şi regiunea VH cum s-a descris în SECV ID NR: 105 sau 109 din WO 2008/119567;
(g) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 125 sau 129 din WO 2008/119567 şi regiunea VH cum s-a descris în SECV ID NR: 123 sau 127 din WO 2008/119567;
(h) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 143 sau 147 din WO 2008/119567 şi regiunea VH cum s-a descris în SECV ID NR: 141 sau 145 din WO 2008/119567;
(i) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 161 sau 165 din WO 2008/119567 şi regiunea VH cum s-a descris în SECV ID NR: 159 sau 163 din WO 2008/119567; şi
(j) o regiune VL cum s-a descris în SECV ID NR: 179 sau 183 din WO 2008/119567 şi regiunea VH cum s-a descris în SECV ID NR: 177 sau 181 din WO 2008/119567.
Conform unui exemplu de realizare preferat al constructului anticorpului din prezenta invenţie, domeniile de legare şi în special al doilea domeniu de legare (care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T) au următorul format: Perechile de regiuni VH şi regiuni VL sunt în formatul unui anticorp cu lanţ unic (scFv). Regiunile VH şi VL sunt aranjate în ordinea VH-VL sau VL-VH. Este de preferat ca regiunea VH să fie poziţionată N-terminal la o secvenţă linker, şi regiunea VL să fie poziţionată C-terminal la o secvenţă linker.
O variantă preferată a constructului de anticorp descrisă mai sus a prezentei invenţii este caracterizată prin al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T şi CD3 de macac cuprinzând o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul constând SECV ID NRs: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 sau 187 din WO 2008/119567.
Prin urmare, într-un exemplu de realizare preferat, constructul anticorpului conform invenţiei cuprinde o polipeptidă selectată dintre cele descrise în SECV ID NR: 40, SECV ID NR: 50, SECV ID NR: 60, SECV ID NR: 70, SECV ID NR: 80, SECV ID NR: 90, SECV ID NR: 100, SECV ID NR: 110, SECV ID NR: 120, SECV ID NR: 211, SECV ID NR: 212, SECV ID NR: 213, SECV ID NR: 214, SECV ID NR: 215, SECV ID NR: 216, SECV ID NR: 217, SECV ID NR: 438 şi SECV ID NR: 532. Aceste constructe de anticorpi au un prim domeniu de legare care se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 258.
Într-o variantă alternativă, constructul anticorpului conform invenţiei cuprinde o polipeptidă selectată din grupul constând din cei descrişi în SECV ID NR: 130, SECV ID NR: 140, SECV ID NR: 150, SECV ID NR: 160, SECV ID NR: 170; SECV ID NR: 218, SECV ID NR: 219, SECV ID NR: 220, SECV ID NR: 494, SECV ID NR: 495, SECV ID NR: 496, SECV ID NR: 497, SECV ID NR: 498, SECV ID NR: 499, SECV ID NR: 500, SECV ID NR: 501, SECV ID NR: 502, SECV ID NR: 503, SECV ID NR: 504, SECV ID NR: 505, SECV ID NR: 506, SECV ID NR: 507, SECV ID NR: 508, SECV ID NR: 509, SECV ID NR: 510, SECV ID NR: 511, SECV ID NR: 512, SECV ID NR: 513, SECV ID NR: 514, SECV ID NR: 515, şi SECV ID NR: 516. Aceste constructe de anticorpi au un prim domeniu de legare care se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 259.
Sunt de asemenea avute în vedere modificările secvenţei de aminoacizi a constructelor de anticorpi descrise aici. De exemplu, poate fi de dorit să se îmbunătăţească afinitatea de legare şi/sau alte proprietăţi biologice ale constructului anticorpului. Variantele secvenţei de aminoacizi ale constructelor de anticorpi sunt preparate prin introducerea modificărilor adecvate de nucleotide în constructele de anticorp ale acidului nucleic sau prin sinteza peptidelor. Toate modificările descrise mai jos ale secvenţei de aminoacd ar trebui să conducă la un construct de anticorp care încă păstrează activitatea biologică dorită (legarea la DLL3 şi la CD3) a moleculei parentale nemodificate.
Termenul "aminoacid" sau "reziduu de aminoacid" se referă în mod tipic la un aminoacid având definiţia sa recunoscută în domeniu, cum ar fi un aminoacid selectat din grupul constând din: alanină (Ala sau A); arginină (Arg sau R); asparagină (Asn sau N); acid aspartic (Asp sau D); cisteină (Cys sau C); glutamina (Gln sau Q); acid glutamic (Glu sau E); glicină (Gly sau G); histidină (His sau H); izoleucina (He sau I): leucina (Leu sau L); lizină (Lys sau K); metionină (Met sau M); fenilalanină (Phe sau F); pro lină (Pro sau P); serină (Ser sau S); treonină (Thr sau T); triptofan (Trp sau W); tirozină (Tyr sau Y); şi valină (Val sau V), deşi modificaţi, sintetici sau rari aminoacizii pot fi utilizaţi după cum se doreşte. În general, aminoacizii pot fi grupaţi ca având un lanţ lateral nepolar (de ex., Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); un lanţ lateral încărcat negativ (de ex., Asp, Glu); un lanţ lateral încărcat pozitiv (de ex., Arg, His, Lys); sau un lanţ lateral polar neîncărcat (de ex., Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp şi Tyr).
Modificările aminoacizilor includ, de exemplu, ştergeri din şi/sau inserţii în şi/sau substituţii ale reziduurilor din secvenţele de aminoacizi ale constructelor anticorpului. Orice combinaţie de ştergere, inserare şi substituţie este făcută pentru a ajunge la constructul final, cu condiţia ca constructul final să posede caracteristicile dorite. Modificările aminoacizilor pot, de asemenea, modifica procesele post-translaţionale ale constructelor anticorpului, cum ar fi schimbarea numărului sau poziţiei situsurilor de glicozilare.
De exemplu, 1, 2, 3, 4, 5 sau 6 aminoacizi pot fi inseraţi sau şterse în fiecare dintre CDR-uri (desigur, în funcţie de lungimea lor), în timp ce 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 sau 25 aminoacizi pot fi inseraţi sau şterşi în fiecare dintre FR. De preferinţă, inserţiile de secvenţe de aminoacizi includ fuziuni amino- şi/sau carboxil-terminale variind în lungime de la 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 sau 10 reziduuri la polipeptide care conţin o sută sau mai multe reziduuri, precum şi inserţii intra-secvenţă ale resturilor de aminoacizi unici sau multipli. O variantă de inserţie a constructului anticorpului conform invenţiei include fuziunea la capătul N-terminal sau la capătul C-terminal al constructului anticorpului unei enzime sau fuziunea la o polipeptidă care creşte timpul de înjumătăţire plasmatică al constructului anticorpului.
Situsurile cu cel mai mare interes pentru mutageneză substituţională includ CDR-urile lanţului greu şi/sau uşor, în special regiunile hipervariabile, dar sunt avute în vedere şi modificări ale FR în lanţul greu şi/sau uşor. Substituţiile sunt preferabil substituţii conservatoare aşa cum este descris aici. De preferinţă, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 sau 10 aminoacizi pot fi substituiţi într-un CDR, în timp ce 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 sau 25 aminoacizi pot fi substituiţi în regiunile cadru (FR), în funcţie de lungimea CDR sau FR. De exemplu, dacă o secvenţă CDR cuprinde 6 aminoacizi, se preconizează că unul, doi sau trei dintre aceşti aminoacizi sunt substituiţi. În mod similar, dacă o secvenţă CDR cuprinde 15 aminoacizi, este prevăzut ca unul, doi, trei, patru, cinci sau şase dintre aceşti aminoacizi să fie substituiţi.
O metodă utilă pentru identificarea anumitor reziduuri sau regiuni ale constructelor de anticorpi care sunt locaţii preferate pentru mutageneză se numeşte „mutageneză cu scanare de alanină» aşa cum este descris de Cunningham şi Wells în Science, 244: 1081-1085 (1989). Aici, este identificat un reziduu sau un grup de reziduuri ţintă din constructul anticorpului (de ex., reziduuri încărcate, cum ar fi arg, asp, his, lys şi glu) şi înlocuit cu un aminoacid neutru sau încărcat negativ (cel mai preferabil alanină sau polialanină) să afecteze interacţiunea aminoacizilor cu epitopul.
Acele locaţii ale aminoacizilor care demonstrează sensibilitate funcţională la substituţii sunt apoi rafinate prin introducerea de variante suplimentare sau alte variante la sau pentru, locurile de substituţie. Astfel, în timp ce locul sau regiunea pentru introducerea unei variaţii a secvenţei de aminoacizi este predeterminată, natura mutaţiei în sine nu trebuie să fie predeterminată. De exemplu, pentru a analiza sau optimiza performanţa unei mutaţii la un anumit situs, scanarea alaninei sau mutageneza aleatorie pot fi efectuate la un codon sau regiune ţintă, iar variantele de construct exprimate ale anticorpului sunt selectate pentru combinaţia optimă a activităţii dorite. Tehnicile pentru realizarea mutaţiilor de substituţie la situsurile predeterminate din ADN având o secvenţă cunoscută sunt bine cunoscute, de exemplu, mutageneza primerului M13 şi mutageneza PCR. Screeningul mutanţilor se face folosind teste ale activităţilor de legare a antigenului, cum ar fi legarea DLL3 sau CD3.
În general, dacă aminoacizii sunt substituiţi într-unul sau mai multe sau toate CDR-urile lanţului greu şi/sau uşor, este de preferat ca secvenţa „substituită» obţinută atunci să fie de cel puţin 60% sau 65%, mai preferabil 70% sau 75%, chiar mai preferabil 80% sau 85%, şi în mod special preferabil 90% sau 95% identică cu secvenţa CDR „originală». Aceasta înseamnă că este dependentă de lungimea CDR în măsura în care este identică cu secvenţa „substituită». De exemplu, un CDR având 5 aminoacizi este de preferinţă 80% identic cu secvenţa sa substituită pentru a avea cel puţin un aminoacid substituit. În consecinţă, CDR-urile constructului anticorpului pot avea diferite grade de identitate faţă de secvenţele lor substituite, de exemplu, CDRL1 poate avea 80%, în timp ce CDRL3 poate avea 90%.
Substituţiile preferate (sau înlocuirile) sunt substituţii conservatoare. Cu toate acestea, orice substituţie (inclusiv substituţie neconservativă sau una sau mai multe din „substituţiile exemplare» enumerate în Tabelul 1 de mai jos) este avută în vedere atât timp cât constructul anticorpului îşi păstrează capacitatea de a se lega la DLL3 prin primul domeniu de legare şi la CD3 sau CD3 epsilon prin intermediul celui de-al doilea domeniu de legare şi/sau CDR-urile sale au o identitate cu secvenţa apoi substituită (cel puţin 60% sau 65%, mai preferabil 70% sau 75%, chiar mai preferabil 80% sau 85%, şi în mod special preferabil 90% sau 95% identic cu secvenţa CDR „originală»).
Substituţiile conservatoare sunt prezentate în Tabelul 1 sub titlul „substituţii preferate». Dacă astfel de substituţii duc la o schimbare a activităţii biologice, atunci pot fi introduse modificări mai substanţiale, denumite „substituţii exemplare» în Tabelul 1, sau aşa cum este descris mai jos în referinţă la clasele de aminoacizi, şi produsele selectate pentru o caracteristică dorită.
Tabelul 1: Substituţii de aminoacizi
Original Substituţii de exemplu Substituţii preferate Ala (A) val, leu, ile val Arg (R) lys, gln, asn lys Asn (N) gln, his, asp, lys, arg gln Asp (D) glu, asn glu Cys (C) ser, ala ser Gln (Q) asn, glu asn Glu (E) asp, gln asp Gly (G) Ala ala His (H) asn, gln, lys, arg arg Ile (I) leu, val, met, ala, phe leu Leu (L) norleucină, ile, val, met, ala ile Lys (K) arg, gln, asn arg Met (M) leu, phe, ile leu Phe (F) leu, val, ile, ala, tyr tyr Pro (P) Ala ala Ser (S) Thr thr Thr (T) Ser ser Trp (W) tyr, phe tyr Tyr (Y) trp, phe, thr, ser phe Val (V) ile, leu, met, phe, ala leu
Modificări substanţiale ale proprietăţilor biologice ale constructului anticorpului conform prezentei invenţii se realizează prin selectarea substituţiilor care diferă semnificativ prin efectul lor asupra menţinerii (a) structurii scheletului polipeptidic în zona substituţiei, de exemplu, ca o foaie sau conformaţie elicoidală, (b) sarcina sau hidrofobicitatea moleculei la locul ţintă sau (c) cea mai mare parte a lanţului lateral. Reziduurile naturale sunt împărţite în grupuri pe baza proprietăţilor comune ale lanţului lateral: (1) hidrofob: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofil neutru: cys, ser, thr; (3) acid: asp, glu; (4) bazic: asn, gin, his, lys, arg; (5) reziduuri care influenţează orientarea lanţului: gly, pro; şi (6) aromatic: trp, tyr, phe.
Înlocuirile neconservative vor presupune schimbul unui membru al uneia dintre aceste clase cu o altă clasă. Orice rest de cisteină care nu este implicat în menţinerea conformaţiei corecte a constructului anticorpului poate fi substituit, în general cu serină, pentru a îmbunătăţi stabilitatea oxidativă a moleculei şi pentru a preveni reticularea aberantă. În schimb, se pot adăuga legături de cisteină la anticorp pentru a îmbunătăţi stabilitatea acestuia (în special în cazul în care anticorpul este un fragment de anticorp, cum ar fi un fragment Fv).
Pentru secvenţe de aminoacizi, identitatea şi/sau similitudinea secvenţei este determinată prin utilizarea tehnicilor standard cunoscute în domeniu, incluzând, dar fără a se limita la, algoritmul de identitate a secvenţei locale al Smith şi Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482, algoritmul de aliniere a identităţii secvenţei lui Needleman şi Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443, căutarea metodei de similaritate a lui Pearson şi Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Ştiinţă. SUA. 85: 2444, implementări computerizate ale acestor algoritmi (GAP, BESTFIT, FASTA şi TFASTA în pachetul software Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), Programul de secvenţă Best Fit descris de Devereux şi colab., 1984, Nucl. Acid Res. 12: 387-395, preferabil folosind setările implicite sau prin inspecţie. De preferinţă, identitatea procentuală este calculată de FastDB pe baza următorilor parametri: penalizare de nepotrivire de 1; penalizare gap de 1; penalizare pentru dimensiunea decalajului de 0,33; şi penalizarea de aderare de 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.
Un exemplu de algoritm util este PILEUP. PILEUP creează o aliniere de secvenţă multiplă dintr-un grup de secvenţe conexe utilizând alinieri progresive, în perechi. Poate, de asemenea, să traseze un copac care să arate relaţiile de grupare utilizate pentru a crea alinierea. PILEUP foloseşte o simplificare a metodei de aliniere progresivă a lui Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35: 351-360; metoda este similară cu cea descrisă de Higgins şi Sharp, 1989, CABIOS 5: 151-153. Parametri utili PILEUP, care includ o greutate implicită a golului de 3,00, o greutate implicită a lungimii golului de 0,10 şi goluri finale ponderate.
Un alt exemplu de algoritm util este algoritmul BLAST, descris în: Altschul şi colab., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul şi colab., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; şi Karin şi colab., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. S.U.A. 90:5873-5787. Un program BLAST deosebit de util este programul WU-BLAST-2 care a fost obţinut de Altschul şi colab., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 foloseşte mai mulţi parametri de căutare, majoritatea fiind setaţi la valorile implicite. Parametrii reglabili sunt setaţi cu următoarele valori: interval suprapunere = 1, fracţie suprapunere = 0,125, prag cuvânt (T) = II. Parametrii HSP S şi HSP S2 sunt valori dinamice şi sunt stabiliţi de programul în sine, în funcţie de compoziţia secvenţei particulare şi a compoziţiei bazei de date particulare în raport cu care se caută secvenţa de interes; cu toate acestea, valorile pot fi ajustate pentru a creşte sensibilitatea.
Un algoritm util suplimentar este BLAST decalat ca raportat de Altschul şi colab., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. BLAST golit foloseşte scoruri de substituţie BLOSUM-62; parametru prag T setat la 9; metoda cu două lovituri pentru a declanşa extensii fără gol, încarcă lungimi de goluri de k un cost de 10 + k; Xu setat la 16, şi Xg setat la 40 pentru etapa de căutare a bazei de date şi la 67 pentru etapa de ieşire a algoritmilor. Alinierile golite sunt declanşate de un scor care corespunde la aproximativ 22 de biţi.
În general, omologia aminoacizilor, similitudinea sau identitatea dintre variantele CDR individuale sunt de cel puţin 60% faţă de secvenţele descrise aici şi mai tipic cu omologii sau identităţi de preferinţă crescătoare de cel puţin 65% sau 70%, mai preferabil de cel puţin 75% sau 80%, chiar mai preferabil cel puţin 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% şi aproape 100%. În mod similar, „procent (%) identitate de secvenţă a acidului nucleic» în raport cu secvenţa de acid nucleic a proteinelor de legare identificate aici este definită ca procentul de reziduuri de nucleotide dintr-o secvenţă candidat care sunt identice cu resturile de nucleotide din codificarea secvenţei constructului anticorpului. O metodă specifică utilizează modulul BLASTN al WU-BLAST-2 setat la parametrii impliciţi, cu intervalul de suprapunere şi fracţia de suprapunere setată la 1 şi, respectiv, 0,125.
În general, omologia secvenţei de acid nucleic, similitudinea sau identitatea dintre secvenţele de nucleotide care codifică variantele CDR individuale şi secvenţele de nucleotide descrise aici sunt de cel puţin 60% şi, mai tipic, cu omologii sau identităţi de preferinţă crescătoare de cel puţin 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, sau 99% şi aproape 100%. Astfel, o „variantă CDR» este una cu omologia specificată, asemănarea sau identitatea cu CDR-ul părinte al invenţiei şi împărtăşeşte funcţia biologică, incluzând, dar fără a se limita la, cel puţin 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, sau 99% a specificităţii şi/sau activităţii CDR părinte.
Într-o variantă, procentul de identitate faţă de linia germinativă umană a constructelor anticorpului conform invenţiei este ≥ 70% sau ≥ 75%, mai preferabil ≥ 80% sau ≥ 85%, chiar mai preferabil ≥ 90%, şi cel mai preferabil ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95% sau chiar ≥ 96%. Vezi Exemplul 7. Identitatea faţă de produsele genei germinale ale anticorpilor umani este considerată a fi o caracteristică importantă pentru a reduce riscul proteinelor terapeutice de a provoca un răspuns imun împotriva medicamentului la pacient în timpul tratamentului. Hwang & Foote ("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) demonstrează că reducerea porţiunilor neumane de construct de anticorpi medicamentoşi duce la o scădere a riscului de a induce anticorpi anti-medicament la pacienţi în timpul tratamentului. Prin compararea unui număr exhaustiv de medicamente pentru anticorpi evaluaţi clinic şi datele imunogenităţii respective, se arată tendinţa că umanizarea regiunilor V ale anticorpilor face proteina mai puţin imunogenă (în medie 5,1% dintre pacienţi) decât anticorpii care prezintă regiuni V neumane nealterate (în medie 23,59% dintre pacienţi). Un grad mai mare de identitate a secvenţelor umane este, prin urmare, de dorit pentru terapeutica proteică bazată pe regiunea V sub formă de constructe de anticorpi. În acest scop al determinării identităţii liniei germinale, regiunile V ale VL pot fi aliniate cu secvenţele de aminoacizi ale segmentelor V ale liniei germinale umane şi ale segmentelor J (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) folosind software-ul Vector NTI şi secvenţa de aminoacizi calculată prin împărţirea resturilor de aminoacizi identici la numărul total de resturi de aminoacizi ale VL în procente. Acelaşi lucru poate fi valabil şi pentru segmentele VH (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) cu excepţia faptului că VH CDR3 poate fi exclus din cauza diversităţii sale ridicate şi a lipsei partenerilor de aliniere existenţi ai liniei germinale umane VH CDR3. Tehnicile recombinate pot fi apoi utilizate pentru a creşte identitatea secvenţei la genele germinale ale anticorpilor umani.
Într-o altă variantă de realizare, constructele anticorpilor bispecifici conform prezentei invenţii prezintă randamente ridicate de monomeri în condiţii standard de scară de cercetare, de ex., într-un proces standard de purificare în doi paşi. De preferinţă, randamentul în monomeri al constructelor de anticorpi conform invenţiei este ≥ 0,25 mg/L supernatant, mai preferabil ≥ 0,5 mg/L, chiar mai preferabil ≥ 1 mg/L, şi cel mai preferabil ≥ 3 mg/L supernatant.
În mod similar, randamentul izoforme constructelor anticorpilor dimerici şi, prin urmare, procentul de monomer (adică, monomer: (monomer + dimer)) din constructele anticorpului pot fi determinate. Productivitatea constructelor de anticorpi monomerici şi dimerici şi procentul de monomer calculat pot de ex. să fie obţinut în etapa de purificare SEC a supernatantului de cultură din producţia standardizată la scară de cercetare în sticle cilindru. Într-un exemplu de realizare, procentul de monomer al constructelor anticorpului este ≥ 80%, mai preferabil ≥ 85%, chiar mai preferabil ≥ 90% şi cel mai preferabil ≥ 95%.
Într-un exemplu de realizare, constructele anticorpului au o stabilitate plasmatică preferată (raportul EC50 cu plasmă la EC50 w/o plasma) de ≤ 5 sau ≤ 4, mai preferabil ≤ 3,5 sau ≤ 3, even mai preferabil ≤ 2,5 sau ≤ 2, şi cel mai preferabil ≤ 15 sau ≤ 1. Stabilitatea plasmatică a unui construct de anticorp poate fi testată prin incubarea constructului în plasma umană la 37°C timp de 24 de ore urmată de determinarea EC50 într-un test de citotoxicitate cu eliberare de crom 51. Celulele efectoare din testul de citotoxicitate pot fi stimulate de celule T CD8 pozitive umane îmbogăţite. Celulele ţintă pot de ex. să fie celule CHO transfectate cu DLL3 uman. Raportul efector-celulă ţintă (E:T) poate fi ales ca 10: 1. Bazinul de plasmă umană utilizat în acest scop este derivat din sângele donatorilor sănătoşi colectat de seringile acoperite cu EDTA. Componentele celulare sunt îndepărtate prin centrifugare şi faza plasmatică superioară este colectată şi ulterior reunită. Ca martor, constructele de anticorpi sunt diluate imediat înainte de testul de citotoxicitate în mediu RPMI-1640. Stabilitatea plasmei este calculată ca raport dintre EC50 (după incubarea plasmei) şi EC50 (martor). Vezi Exemplul 11.
De asemenea, este de preferat ca conversia monomerului în dimer a constructelor anticorpului conform invenţiei să fie redusă. Conversia poate fi măsurată în condiţii diferite şi analizată prin cromatografie de excludere cu dimensiuni ridicate. Vezi Exemplul 9. De exemplu, incubaţia izoformelor monomerice a constructelor anticorpului poate fi efectuată timp de 7 zile la 37°C şi concentraţii de ex. 100 µg/ml sau 250 µg/ml într-un incubator. În aceste condiţii, este de preferat ca constructele anticorpului conform invenţiei să prezinte un procent de dimeri care este ≤5%, mai preferabil ≤4%, chiar mai preferabil ≤3%, chiar mai preferabil ≤2,5%, chiar mai preferabil ≤2%, chiar mai preferabil ≤1,5% şi cel mai preferabil ≤1% sau ≤0,5% sau chiar 0%.
De asemenea, este de preferat ca constructele de anticorpi bispecifici conform prezentei invenţii să prezinte o conversie de dimeri foarte scăzută după un număr de cicluri de îngheţ/dezgheţ. De exemplu, monomerul de construct de anticorpi este ajustat la o concentraţie de 250 µg/ml, de ex. în tampon de formulare generic şi supus la trei cicluri de îngheţ/dezgheţ (îngheţ la -80°C timp de 30 de minute urmat de decongelare timp de 30 de minute la temperatura camerei), urmat de SEC de înaltă performanţă pentru a determina procentul de construct de anticorp monomeric iniţial, care au fost transformate în constructe de anticorp dimeric. De preferinţă, procentele dimerice ale constructelor de anticorpi bispecifici sunt ≤5%, mai preferabil ≤4%, chiar mai preferabil ≤3%, chiar mai preferabil ≤2,5%, chiar mai preferabil ≤2%, chiar mai preferabil ≤1,5%, şi cel mai mult de preferinţă ≤1% sau chiar ≤0,5%, de exemplu după trei cicluri de îngheţ/dezgheţ.
constructele de anticorpi bispecifici conform prezentei invenţii prezintă de preferinţă o termostabilitate favorabilă cu temperaturi de agregare ≥45°C sau ≥50°C, mai preferabil ≥52°C sau ≥54°C, chiar mai preferabil ≥56°C sau ≥57°C, şi cel mai preferabil ≥58°C sau ≥59°C. Parametrul de termostabilitate poate fi determinat în termeni de temperatură de agregare a anticorpilor după cum urmează: Soluţia de anticorp la o concentraţie de 250 µg/ml este transferată într-o cuvă de unică folosinţă şi plasată într-un dispozitiv Dynamic Light Scattering (DLS). Proba este încălzită de la 40°C la 70°C la o rată de încălzire de 0,5°C/min, cu achiziţie constantă a razei măsurate. Creşterea razei indicând topirea proteinei şi agregarea este utilizată pentru a calcula temperatura de agregare a anticorpului. Vezi Exemplul 10.
Alternativ, curbele de topire a temperaturii pot fi determinate prin calorimetrie de scanare diferenţială (DSC) pentru a determina stabilităţile intrinseci ale proteinelor biofizice ale constructelor anticorpului. Aceste experimente sunt efectuate folosind un dispozitiv VP-DSC MicroCal LLC (Northampton, MA, S.U.A.). Absorbţia energetică a unei probe care conţine un construct de anticorp este înregistrată de la 20°C la 90°C comparativ cu o probă care conţine doar tamponul de formulare. Constructele anticorpului sunt ajustate la o concentraţie finală de 250 µg/ml, de ex. în tamponul de rulare SEC. Pentru înregistrarea curbei de topire respective, temperatura generală a probei este mărită în trepte. La fiecare temperatură T se captează energia probei şi se înregistrează referinţa tamponului de formulare. Diferenţa de absorbţie a energiei Cp (kcal/mol/° C) a eşantionului minus referinţa este reprezentată grafic în funcţie de temperatura respectivă. Temperatura de topire este definită ca temperatura la prima maximă de absorbţie a energiei.
De asemenea, se preconizează că constructul anticorpului bispecific DLL3xCD3 conform invenţiei nu reacţionează încrucişat cu (adică nu se leagă în mod esenţial) de paralogii DLL3 umani DLL1 şi/sau DLL4. Mai mult, se preconizează că constructul anticorpului bispecific DLL3xCD3 conform invenţiei nu reacţionează încrucişat cu (adică nu se leagă în mod esenţial) DLL3 de paralogii DLL1 şi/sau DLL4 de macac/cyno. Vezi Exemplul 6.
Constructele anticorpului bispecific DLL3 xCD3 conform invenţiei sunt, de asemenea, prevăzute să aibă o turbiditate (măsurată prin OD340 după concentraţia de anticorp monomeric purificat la 2,5 mg/ml şi incubare peste noapte) de ≤ 0,2, de preferinţă de ≤ 0,15, mai preferabil de ≤ 0,12, chiar mai preferabil de ≤ 0,1 şi cel mai preferabil de ≤ 0,08. Vezi Exemplul 12.
Constructele anticorpului bispecific DLL3xCD3 conform invenţiei sunt, de asemenea, avute în vedere să nu fie internalizate sau să nu fie supuse internalizării semnificative de către celula ţintă. Rata de internalizare poate fi testată de ex. aşa cum este descris în Exemplul 16. De preferinţă, rata de internalizare (de ex. măsurată ca o scădere a citotoxicităţii) este ≤ 20% după o (pre) incubare de 2 ore a constructului anticorpului cu celula ţintă, mai preferabil ≤ 15%, chiar mai preferabil ≤ 10% şi cel mai preferabil ≤ 5%.
De asemenea, se preconizează că DLL3 revărsat sau solubil nu afectează în mod semnificativ eficacitatea sau activitatea biologică a constructelor de anticorp bispecific DLL3xCD3 conform invenţiei. Acest lucru poate fi măsurat de ex. într-un test de citotoxicitate în care se adaugă DLL3 solubil la concentraţii crescânde la test, de ex. la 0 nM - 0,3 nM - 0,7 nM - 1 nM - 3 nM - 7 nM - 12 nM. Valoarea EC50 a constructului anticorpului testat nu ar trebui să fie crescută semnificativ în prezenţa DLL3 solubil. Vezi Exemplul 17.
Într-o altă variantă de realizare, constructul anticorpului conform invenţiei este stabil la pH acid. Cu cât constructul anticorpului se comportă mai tolerant la pH nefiziologic, cum ar fi pH 5,5 (un pH care este necesar pentru a rula, de ex., o cromatografie cu schimb de cationi), cu atât este mai mare recuperarea constructului anticorpului eluat dintr-o coloană de schimb ionic faţă de cantitatea totală de proteine încărcate. Recuperarea constructului anticorpului dintr-o coloană de schimb ionic (de ex., cationic) la pH 5,5 este de preferinţă ≥ 30%, mai preferabil ≥ 40%, mai preferabil ≥ 50%, chiar mai preferabil ≥ 60%, chiar mai preferabil ≥ 70%, chiar mai preferabil ≥ 80%, chiar mai preferabil ≥ 90%, chiar mai preferabil ≥ 95% şi cel mai preferabil ≥ 99%. Vezi Exemplul 13.
De asemenea, se preconizează că constructele anticorpilor bispecifici conform prezentei invenţii prezintă eficacitate terapeutică sau activitate antitumorală. Acest lucru poate de ex. să fie evaluat într-un studiu, după cum este dezvăluit în următorul exemplu de model de xenogrefă tumorală umană în stadiu avansat:
În ziua 1 a studiului, 5x106 celule ale unei linii celulare canceroase pozitive DLL3 umane (de ex., SHP-77) sunt injectate subcutanat în flancul dorsal drept al şoarecilor femele NOD/SCID. Când volumul mediu al tumorii atinge aproximativ 100 mm3, celulele T CD3 pozitive umane expandate in vitro sunt transplantate în şoareci prin injectarea a aproximativ 2x107 celule în cavitatea peritoneală a animalelor. Şoarecii din grupul de control 1 al vehiculului nu primesc celule efectoare şi sunt folosiţi ca martor netransplantat pentru comparaţie cu grupul de control 2 al vehiculului (primind celule efectoare) pentru a monitoriza impactul celulelor T singure asupra creşterii tumorii. Tratamentul cu anticorpi începe când volumul mediu al tumorii ajunge la aproximativ 200 mm3. Dimensiunea medie a tumorii pentru fiecare grup de tratament în ziua începerii tratamentului nu trebuie să fie statistic diferită de nici un alt grup (analiza varianţei). Şoarecii sunt trataţi cu 0,5 mg/kg/zi dintr-un anticorp DLL3xCD3 bispecifc prin injecţie intravenoasă în bolus timp de aproximativ 15 până la 20 de zile. Tumorile sunt măsurate prin etrier în timpul studiului şi progresul evaluat prin compararea intergrupului volumelor tumorale (TV). Inhibarea creşterii tumorale T/C [%] este determinată prin calcularea TV ca T/C% = 100 x (TV median al grupului analizat)/(TV median al grupului de control 2).
Persoanele calificate ştiu cum să modifice sau să adapteze anumiţi parametri ai acestui studiu, cum ar fi numărul de celule tumorale injectate, locul de injectare, numărul de celule T umane transplantate, cantitatea de anticorpuri bispecifici care trebuie administrate şi momentele de timp, în timp ce se ajunge încă la un rezultat semnificativ şi reproductibil. De preferinţă, inhibarea creşterii tumorii T/C [%] este ≤ 70 sau ≤ 60, mai preferabil ≤ 50 sau ≤ 40, chiar mai preferabil ≤ 30 sau ≤ 20 şi cel mai preferabil ≤ 10 sau ≤ 5 sau chiar ≤ 2,5.
Invenţia oferă în plus o polinucleotidă care codifică un construct de anticorp al invenţiei.
O polinucleotidă este un biopolimer compus din 13 sau mai mulţi monomeri nucleotidici legaţi covalent într-un lanţ. ADN (cum ar fi ADNc) şi ARN (cum ar fi ARNm) sunt exemple de polinucleotide cu funcţie biologică distinctă. Nucleotidele sunt molecule organice care servesc drept monomeri sau subunităţi ale moleculelor de acid nucleic precum ADN sau ARN. Molecula de acid nucleic sau polinucleotida poate fi dublu catenară şi monocatenară, liniară şi circulară. Este cuprinsă de preferinţă într-un vector care este preferabil cuprins într-o celulă gazdă. Această celulă gazdă este, de ex. după transformare sau transfecţie cu vectorul sau polinucleotida conform invenţiei, capabilă să exprime constructul anticorpului. În acest scop, polinucleotida sau molecula de acid nucleic este legată operativ de secvenţe martor.
Codul genetic este setul de reguli prin care informaţiile codificate în materialul genetic (acizii nucleici) sunt translate în proteine. Decodarea biologică în celulele vii este realizată de ribozom care leagă aminoacizii într-o ordine specificată de ARNm, folosind molecule de ARNt pentru a transporta aminoacizii şi pentru a citi trei nucleotide ARNm la un moment dat. Codul defineşte modul în care secvenţele acestor triplete de nucleotide, numite codoni, specifică ce aminoacid va fi adăugat în timpul sintezei proteinelor. Cu unele excepţii, un codon cu trei nucleotide într-o secvenţă de acid nucleic specifică un singur aminoacid. Deoarece marea majoritate a genelor sunt codificate cu exact acelaşi cod, acest cod particular este adesea denumit codul genetic canonic sau standard. În timp ce codul genetic determină secvenţa de proteine pentru o anumită regiune de codificare, alte regiuni genomice pot influenţa când şi unde sunt produse aceste proteine.
Mai mult, invenţia furnizează un vector care cuprinde o polinucleotidă conform invenţiei.
Un vector este o moleculă de acid nucleic utilizată ca vehicul pentru a transfera material genetic (străin) într-o celulă. Termenul „vector» cuprinde - dar nu se limitează la - plasmide, virusuri, cosmide şi cromozomi artificiali. În general, vectorii proiectaţi cuprind o origine a replicării, un situs de multiclonare şi un marker selectabil. Vectorul în sine este, în general, o secvenţă nucleotidică, de obicei o secvenţă ADN, care cuprinde o inserţie (transgenă) şi o secvenţă mai mare care serveşte drept „coloana vertebrală» a vectorului. Vectorii moderni pot cuprinde caracteristici suplimentare în afară de inserţia transgenică şi o coloană vertebrală: promotor, marker genetic, rezistenţă la antibiotice, genă raportor, secvenţă de ţintire, etichetă de purificare a proteinelor. Vectorii numiţi vectori de expresie (constructe de expresie) sunt în mod specific pentru expresia transgenului în celula ţintă şi, în general, au secvenţe de control.
Termenul "secvenţe de control" se referă la secvenţe de ADN necesare pentru exprimarea unei secvenţe de codare legate operabil într-un anumit organism gazdă. Secvenţele de control care sunt potrivite pentru procariote, de exemplu, includ un promotor, opţional o secvenţă operator şi un situs de legare a ribozomilor. Se ştie că celulele eucariote utilizează promotori, semnale de poliadenilare şi potenţiatori.
Un acid nucleic este „legat operabil» atunci când este plasat într-o relaţie funcţională cu o altă secvenţă de acid nucleic. De exemplu, ADN-ul pentru o pre-secvenţă sau un lider secretor este legat operabil de ADN-ul pentru o polipeptidă dacă este exprimat ca o preproteină care participă la secreţia polipeptidei; un promotor sau amplificator este legat operabil de o secvenţă de codificare dacă afectează transcrierea secvenţei; sau un situs de legare a ribozomului este legat în mod operaţional de o secvenţă de codificare dacă este poziţionat astfel încât să faciliteze translaţia. În general, „legat operabil» înseamnă că secvenţele ADN care sunt legate sunt adiacente şi, în cazul unui lider secretor, adiacente şi în fază de citire. Cu toate acestea, amplificatorii nu trebuie să fie adiacenţi. Legarea se realizează prin ligare la situsuri de restricţie convenabile. Dacă astfel de situsuri nu există, adaptoarele sau linkerele oligonucleotidice sintetice sunt utilizate în conformitate cu practica convenţională.
„Transfecţia» este procesul de introducere deliberată a moleculelor de acid nucleic sau a polinucleotidelor (inclusiv a vectorilor) în celulele ţintă. Termenul este utilizat mai ales pentru metodele non-virale în celulele eucariote. Transducţia este adesea utilizată pentru a descrie transferul de molecule de acid nucleic sau polinucleotide mediate de virus. Transfecţia celulelor animale implică de obicei deschiderea porilor tranzitorii sau „găurii» în membrana celulară, pentru a permite absorbţia materialului. Transfecţia poate fi efectuată folosind fosfat de calciu, prin electroporare, prin stoarcere celulară sau prin amestecarea unei lipide cationice cu materialul pentru a produce lipozomi, care se fuzionează cu membrana celulară şi îşi depun încărcătura în interior.
Termenul "transformare" este utilizat pentru a descrie transferul non-viral al moleculelor de acid nucleic sau polinucleotidelor (inclusiv vectori) în bacterii şi, de asemenea, în celule eucariote non-animale, inclusiv celule vegetale. Transformarea este, prin urmare, modificarea genetică a unei celule eucariote bacteriene sau non-animale, rezultată din absorbţia directă prin membrana (celulele) celulară din mediul înconjurător şi încorporarea ulterioară a materialului genetic exogen (molecule de acid nucleic). Transformarea poate fi efectuată prin mijloace artificiale. Pentru ca transformarea să se întâmple, celulele sau bacteriile trebuie să se afle într-o stare de competenţă, care ar putea apărea ca răspuns limitat la condiţii de mediu, cum ar fi înfometarea şi densitatea celulară.
Mai mult, invenţia furnizează o celulă gazdă transformată sau transfectată cu molecula de polinucleotidă/acid nucleic sau cu vectorul invenţiei.
Aşa cum sunt utilizate aici, termenii „celulă gazdă» sau „celulă receptor» sunt intenţionaţi să includă orice celulă individuală sau cultură celulară care poate fi sau a fost/au fost receptori de vectori, molecule de acid nucleic exogene şi polinucleotide care codifică constructul anticorpului din prezenta invenţie; şi/sau destinatarii constructului anticorpului în sine. Introducerea materialului respectiv în celulă se realizează prin transformare, transfecţie şi altele asemenea. Termenul "celulă gazdă" este, de asemenea, destinat să includă descendenţi sau descendenţi potenţiali ai unei singure celule. Deoarece anumite modificări pot apărea în generaţiile următoare, fie din cauza mutaţiei naturale, accidentale sau deliberate, fie din cauza influenţelor mediului, astfel de descendenţi nu pot fi, de fapt, complet identici (în morfologie sau în complement genomic sau ADN total) cu celula părinte, dar este încă inclus în domeniul de aplicare al termenului aşa cum este utilizat aici. Celulele gazdă adecvate includ celule procariote sau eucariote şi includ, dar nu se limitează la, bacterii, celule de drojdie, celule fungice, celule vegetale şi celule animale, cum ar fi celule de insecte şi celule de mamifere, de exemplu, murine, de şobolan, de macac sau umane.
Constructul anticorpului conform invenţiei poate fi produs în bacterii. După exprimare, constructul anticorpului conform invenţiei este izolat din pasta de celule E. coli într-o fracţiune solubilă şi poate fi purificat prin, de ex., cromatografie de afinitate şi/sau excludere de mărime. Purificarea finală poate fi efectuată similar procesului de purificare a anticorpului exprimat, de ex., în celule CHO.
În plus faţă de procariote, microbii eucarioţi, cum ar fi ciupercile filamentoase sau drojdia, sunt adecvate clonării sau gazdele de expresie pentru constructul anticorpului conform invenţiei. Saccharomyces cerevisiae, sau drojdia comună de brutărie, este cea mai frecvent utilizată în rândul microorganismelor gazdă eucariote inferioare. Cu toate acestea, o serie de alte genuri, specii şi tulpini sunt în mod obişnuit disponibile şi utile aici, cum ar fi gazde deSchizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces cum ar fi K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans, şi K. marxianus; yarrowia (EP 402 226); Pichia pastoris (EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces cum ar fi Schwanniomyces occidentalis; şi ciuperci filamentoase precum Neurospora, Penicillium, Tolypocladium şi Aspergillus gazde precum A. nidulans şi A. niger.
Celulele gazdă adecvate pentru exprimarea constructului de anticorp glicozilat conform invenţiei sunt derivate din organisme multicelulare. Exemplele de celule nevertebrate includ celule de plante şi insecte. Au fost identificate numeroase tulpini şi variante baculovirale şi celule gazdă permisive de insecte corespunzătoare de la gazde cum ar fi Spodoptera frugiperda (omidă), Aedes aegypti (ţânţar), Aedes albopictus (ţânţar), Drosophila melanogaster (musca fructelor) şi Bombyx mori. O varietate de tulpini virale pentru transfecţie sunt disponibile publicului, de ex., varianta L-1 a Autographa californica NPV şi tulpina Bm-5 a Bombyx mori NPV, şi astfel de virusuri pot fi folosiţi ca virus aici conform prezentei invenţii, în special pentru transfecţia celulelor de Spodoptera frugiperda.
Culturile de celule vegetale de bumbac, porumb, cartofi, soia, petunie, roşii, arabidopsis şi tutun pot fi folosite şi ca gazde. Clonarea şi vectorii de expresie utili în producţia de proteine ​​în cultura celulelor vegetale sunt cunoscute de specialiştii în domeniu. Vezi de ex. Hiatt şi colab., Nature (1989) 342: 76-78, Owen şi colab., (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko şi colab., (1995) The Plant J 8: 745-750, şi Fecker şi colab., (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.
Cu toate acestea, interesul a fost cel mai mare pentru celulele vertebrate, iar propagarea celulelor vertebrate în cultură (cultura ţesuturilor) a devenit o procedură de rutină. Exemple de linii de celule gazdă de mamifere utile sunt linia CV1 de rinichi de maimuţă transformată prin SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linia renală embrionară umană (293 sau 293 celule subclonate pentru creştere în cultură în suspensie, Graham şi colab., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)); celule de rinichi de pui de hamster (BHK, ATCC CCL 10); celule ovariene de hamster chinezesc/-DHFR (CHO, Urlaub şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA 77: 4216 (1980)); celule sertoli de şoarece (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); celule de rinichi de maimuţă (CVI ATCC CCL 70); celule de rinichi de maimuţă verde africană (VERO-76, ATCC CRL1587); celule de carcinom cervical uman (HELA, ATCC CCL 2); celule de rinichi de canine (MDCK, ATCC CCL 34); celule de ficat de şobolan buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celule de plămân uman (W138, ATCC CCL 75); celule de ficat uman (Hep G2,1413 8065); celule de tumoare mamară de şoarece (MMT 060562, ATCC CCL5 1); celule TRI (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); celule MRC 5; celule FS4; şi linie de hepatom uman (Hep G2).
Într-o altă variantă de realizare, invenţia furnizează un procedeu pentru producerea unui construct de anticorp conform invenţiei, procedeul menţionat cuprinzând cultivarea unei celule gazdă a invenţiei în condiţii care permit exprimarea constructului anticorpului invenţiei şi recuperarea constructului anticorpului produs din cultură.
Aşa cum este utilizat aici, termenul "cultivare" se referă la întreţinerea, diferenţierea, creşterea, proliferarea şi/sau propagarea in vitro a celulelor în condiţii adecvate într-un mediu. Termenul "expresie" include orice etapă implicată în producerea unui anticorp construit conform invenţiei incluzând, dar fără a se limita la, transcriere, modificare post-transcripţională, translaţie, modificare post-translaţională şi secreţie.
Atunci când se utilizează tehnici recombinante, constructul anticorpului poate fi produs intracelular, în spaţiul periplasmatic sau secretat direct în mediu. Dacă constructul anticorpului este produs intracelular, ca prim pas, resturile de particule, fie celule gazdă, fie fragmente lizate, sunt îndepărtate, de exemplu, prin centrifugare sau ultrafiltrare. Carter şi colab., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) descriu o procedură pentru izolarea anticorpilor care sunt secretaţi în spaţiul periplasmatic al E. coli. Pe scurt, pasta celulară este decongelată în prezenţa acetatului de sodiu (pH 3,5), EDTA şi fenilmetilsulfonilfluorură (PMSF) timp de aproximativ 30 de minute. Resturile celulare pot fi îndepărtate prin centrifugare. În cazul în care anticorpul este secretat în mediu, supernatanţii din astfel de sisteme de expresie sunt, în general, mai întâi concentraţi utilizând un filtru de concentraţie de proteine disponibil comercial, de exemplu, o unitate de ultrafiltrare Amicon sau Millipore Pellicon. Un inhibitor de protează, cum ar fi PMSF, poate fi inclus în oricare dintre etapele anterioare pentru inhibarea proteolizei şi pot fi incluse antibiotice pentru a preveni creşterea contaminanţilor accidentali.
Constructul anticorpului conform invenţiei preparat din celulele gazdă poate fi recuperat sau purificat folosind, de exemplu, cromatografie cu hidroxilapatită, electroforeză pe gel, dializă şi cromatografie de afinitate. Alte tehnici pentru purificarea proteinelor, cum ar fi fracţionarea pe o coloană cu schimb de ioni, precipitarea etanolului, HPLC cu fază inversă, cromatografie pe silice, cromatografie pe heparină SEPHAROSE™, cromatografie pe un anion sau răşină schimbătoare de cationi (cum ar fi o coloană de acid poliaspartic), cromat -focalizarea, SDS-PAGE şi precipitaţia cu sulfat de amoniu sunt disponibile, de asemenea, în funcţie de anticorpul de recuperat. În cazul în care constructul anticorpului conform invenţiei cuprinde un domeniu CH3, răşina Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) este utilă pentru purificare.
Cromatografia de afinitate este o tehnică de purificare preferată. Matricea de care este ataşat ligandul de afinitate este cel mai adesea agaroză, dar sunt disponibile şi alte matrice. Matricele stabile mecanic, cum ar fi sticla cu pori controlaţi sau poli(stirendivinil)benzenul, permit viteze de curgere mai rapide şi timpi de procesare mai scurţi decât se poate obţine cu agaroză.
Mai mult, invenţia furnizează o compoziţie farmaceutică cuprinzând un construct de anticorp conform invenţiei sau un construct de anticorp produs în conformitate cu procedeul invenţiei.
Aşa cum este utilizat aici, termenul "compoziţie farmaceutică" se referă la o compoziţie care este adecvată pentru administrare la un pacient, de preferinţă un pacient uman. Compoziţia farmaceutică preferată în mod deosebit a acestei invenţii cuprinde unul sau mai multe constructe de anticorpi conform invenţiei, de preferinţă într-o cantitate eficientă terapeutic. De preferinţă, compoziţia farmaceutică mai cuprinde formulări adecvate ale unuia sau mai multor purtători (eficienţi farmaceutic), stabilizatori, excipienţi, diluanţi, solubilizatori, agenţi tensioactivi, emulgatori, conservanţi şi/sau adjuvanţi. Constituenţii acceptabili ai compoziţiei sunt de preferinţă netoxici pentru destinatari la dozele şi concentraţiile utilizate. Compoziţiile farmaceutice conform invenţiei includ, dar nu se limitează la, compoziţii lichide, congelate şi liofilizate.
Compoziţiile inventive pot cuprinde un purtător acceptabil farmaceutic. În general, aşa cum este utilizat aici, "purtător acceptabil farmaceutic" înseamnă orice soluţie apoasă şi neapoasă, soluţii sterile, solvenţi, tampoane, de ex. soluţii saline tamponate cu fosfat (PBS), apă, suspensii, emulsii, cum ar fi emulsii ulei/apă, diferite tipuri de agenţi de umectare, lipozomi, medii de dispersie şi acoperiri, care sunt compatibile cu administrarea farmaceutică, în special cu administrarea parenterală. Utilizarea unor astfel de medii şi agenţi în compoziţii farmaceutice este bine cunoscută în domeniu, iar compoziţiile care cuprind astfel de purtători pot fi formulate prin metode convenţionale bine cunoscute.
Anumite variante de realizare furnizează compoziţii farmaceutice care cuprind constructul anticorpului conform invenţiei şi în plus unul sau mai mulţi excipienţi, cum ar fi cei descrişi în mod ilustrativ în această secţiune şi în alte părţi din prezenta. Excipienţii pot fi utilizaţi în invenţie în acest sens pentru o mare varietate de scopuri, cum ar fi ajustarea proprietăţilor fizice, chimice sau biologice ale formulărilor, cum ar fi ajustarea vâscozităţii, sau a proceselor invenţiei pentru a îmbunătăţi eficacitatea şi sau pentru a stabiliza astfel formulări şi procese împotriva degradării şi deteriorării datorate, de exemplu, stresurilor care apar în timpul fabricaţiei, transportului, depozitării, pregătirii înainte de utilizare, administrării şi ulterior.
În anumite variante, compoziţia farmaceutică poate conţine materiale de formulare în scopul modificării, menţinerii sau conservării, de ex., pH-ului, osmolarităţii, vâscozităţii, clarităţii, culorii, izotonicităţii, mirosului, sterilităţii, stabilităţii, ratei dizolvării sau eliberării, adsorbţiei sau pătrunderii compoziţiei (vezi, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, a 18 a Ediţie, (ed.A.R. Genrmo), 1990, Mack Publishing Company). În astfel de exemple, materialele de formulare adecvate pot include, dar nu se limitează la:
• aminoacizi precum glicină, alanină, glutamină, asparagină, treonină, prolină, 2-fenilalanină, inclusiv aminoacizi încărcaţi, preferabil lizină, acetat de lizină, arginină, glutamat şi/sau histidină
• antimicrobiene precum agenţii antibacterieni şi antifungici
• antioxidanţi precum acidul ascorbic, metionina, sulfitul de sodiu sau hidrogensulfitul de sodiu;
• tampoane, sisteme de tamponare şi agenţi de tamponare care sunt utilizaţi pentru a menţine compoziţia la pH fiziologic sau la un pH uşor mai mic, în mod obişnuit într-un interval de pH de la aproximativ 5 la aproximativ 8 sau 9; exemple de tampoane sunt boratul, bicarbonatul, Tris-HCI, citraţii, fosfaţii sau alţi acizi organici, succinat, fosfat, histidină şi acetat; de exemplu tampon Tris de aproximativ pH 7,0-8,5 sau tampon acetat de aproximativ pH 4,0-5,5;
• solvenţi neapoşi, cum ar fi propilenglicol, polietilenglicol, uleiuri vegetale precum uleiul de măsline şi esteri organici injectabili, cum ar fi oleatul de etil;
• purtători apoşi, inclusiv apă, soluţii alcoolice/apoase, emulsii sau suspensii, inclusiv soluţie salină şi medii tamponate;
• polimeri biodegradabili precum poliesterii;
• agenţi de încărcare, cum ar fi manitolul sau glicina;
• agenţi chelatori precum acidul etilendiamin tetraacetic (EDTA);
• agenţi izotonici şi de întârziere a absorbţiei;
• agenţi de complexare precum cofeina, polivinilpirolidona, beta-ciclodextrina sau hidroxipropil-beta-ciclodextrina)
• umpluturi;
• monozaharide; dizaharide; şi alţi carbohidraţi (cum ar fi glucoza, manoza sau dextrinele); carbohidraţii pot fi zaharuri nereducătoare, de preferinţă trehaloză, zaharoză, octasulfat, sorbitol sau xilitol;
• proteine, polipeptide sau purtători proteici (cu greutate moleculară mică), cum ar fi albumina serică umană sau bovină, gelatina sau imunoglobulinele, de preferinţă de origine umană;
• agenţi de colorare şi aromatizare;
• agenţi reducători cu conţinut de sulf, cum ar fi glutation, acid tioctic, tioglicolat de sodiu, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol şi tiosulfat de sodiu
• agenţi de diluare;
• agenţi emulgatori;
• polimeri hidrofili cum ar fi polivinilpirolidona)
• contra-ioni care formează sare, cum ar fi sodiu;
• conservanţi precum antimicrobieni, anti-oxidanţi, agenţi de chelare, gaze inerte şi altele asemenea; exemple sunt: clorură de benzalconiu, acid benzoic, acid salicilic, timerosal, alcool fenetilic, metilparaben, propilparaben, clorhexidină, acid sorbic sau peroxid de hidrogen);
• complecşi metalici, cum ar fi complex de proteine Zn;
• solvenţi şi co-solvenţi (cum ar fi glicerină, propilenglicol sau polietilenglicol);
• zaharuri şi alcooli zaharici, cum ar fi trehaloza, zaharoza, octasulfatul, manitolul, sorbitolul sau xilitol stachioza, manoza, sorboza, xiloză, riboză, mioinizitoza, galactoză, lactitol, ribitol, mioinizitol, galactitol, glicerol, ciclitoli (de ex. inozitol), polietilenglicol; şi alcooli zaharici polihidrici;
• agenţi de suspendare;
• agenţi tensioactivi sau agenţi de umectare precum pluronici, PEG, esteri de sorbitan, polisorbaţi precum polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamină, lecitină, colesterol, tiloxapal; surfactanţii pot fi detergenţi, de preferinţă cu o greutate moleculară > 1,2 KD şi/sau un polieter, de preferinţă cu o greutate moleculară > 3 KD; exemple nelimitative pentru detergenţii preferaţi sunt Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 şi Tween 85; exemple nelimitative pentru polieteri preferaţi sunt PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 şi PEG 5000;
• agenţi de îmbunătăţire a stabilităţii, cum ar fi zaharoza sau sorbitolul;
• agenţi de îmbunătăţire a tonicităţii, cum ar fi halogenuri ale metalelor alcaline, de preferinţă clorură de sodiu sau potasiu, manitol sorbitol;
• vehicule de livrare parenterală, inclusiv soluţie de clorură de sodiu, dextroză Ringer, dextroză şi clorură de sodiu, Ringer lactat sau uleiuri fixe;
• vehicule de administrare intravenoasă, inclusiv suplimente de lichide şi substanţe nutritive, suplimente de electroliţi (cum ar fi cele bazate pe dextroză Ringer).
Este evident pentru specialiştii în domeniu că diferiţii constituenţi ai compoziţiei farmaceutice (de ex., cei enumeraţi mai sus) pot avea efecte diferite, de exemplu, şi aminoacidul poate acţiona ca tampon, stabilizator şi/sau antioxidant; manitolul poate acţiona ca un agent de încărcare şi/sau ca agent de intensificare a tonicităţii; clorura de sodiu poate acţiona ca vehicul de livrare şi/sau agent de îmbunătăţire a tonicităţii; etc.
Se preconizează că compoziţia invenţiei ar putea cuprinde, în plus faţă de polipeptida conform invenţiei definită aici, agenţi biologic activi suplimentari, în funcţie de utilizarea intenţionată a compoziţiei. Astfel de agenţi pot fi medicamente care acţionează asupra sistemului gastro-intestinal, medicamente care acţionează ca citostatice, medicamente care previn hiperuricemia, medicamente care inhibă imunoreacţiile (de ex. corticosteroizi), medicamente care modulează răspunsul inflamator, medicamente care acţionează asupra sistemului circulator şi/sau agenţi precum citokinele cunoscute în domeniu. De asemenea, se preconizează că constructul anticorpului conform prezentei invenţii este aplicat într-o co-terapie, adică în combinaţie cu un alt medicament anticancer.
În anumite variante de realizare, compoziţia farmaceutică optimă va fi determinată de către un specialist în domeniu, în funcţie de, de exemplu, calea de administrare intenţionată, formatul de eliberare şi doza dorită. Vezi, de exemplu, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. În anumite variante de realizare, astfel de compoziţii pot influenţa starea fizică, stabilitatea, viteza de eliberare in vivo şi viteza de clearance in vivo a constructului anticorpului conform invenţiei. În anumite variante de realizare, vehiculul primar sau purtătorul dintr-o compoziţie farmaceutică poate fi fie apos, fie neapos. De exemplu, un vehicul sau purtător adecvat poate fi apă pentru injecţie, soluţie salină fiziologică sau lichid cefalorahidian artificial, eventual suplimentat cu alte materiale comune în compoziţii pentru administrare parenterală. Soluţia salină tamponată neutră sau soluţia salină amestecată cu albumina serică sunt în continuare vehicule exemplare. În anumite variante de realizare, constructul anticorpului din compoziţiile invenţiei poate fi preparat pentru depozitare prin amestecarea compoziţiei selectate având gradul de puritate dorit cu agenţi de formulare opţionali (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) sub forma unei turte liofilizate sau a unei soluţii apoase. Mai mult, în anumite variante de realizare, constructul anticorpului conform invenţiei poate fi formulat ca un liofilizat utilizând excipienţi adecvaţi, cum ar fi zaharoza.
Când se are în vedere administrarea parenterală, compoziţiile terapeutice pentru utilizare în această invenţie pot fi furnizate sub forma unei soluţii apoase fără pirogeni, acceptabile parenteral, cuprinzând constructul de anticorp dorit conform invenţiei într-un vehicul acceptabil farmaceutic. Un vehicul deosebit de potrivit pentru injecţia parenterală este apa distilată sterilă în care constructul anticorpului conform invenţiei este formulat ca o soluţie sterilă, izotonică, conservată corespunzător. În anumite variante de realizare, preparatul poate implica formularea moleculei dorite cu un agent, cum ar fi microsfere injectabile, particule bio-erodabile, compuşi polimerici (cum ar fi acidul polilactic sau acidul poliglicolic), perle sau lipozomi, care pot furniza eliberarea controlată sau susţinută a produsului care poate fi livrat prin injecţie depozit. În anumite variante de realizare, acidul hialuronic poate fi de asemenea utilizat, având ca efect promovarea unei durate susţinute în circulaţie. În anumite variante de realizare, dispozitivele de eliberare a medicamentelor implantabile pot fi utilizate pentru a introduce constructul de anticorp dorit.
Compoziţii farmaceutice suplimentare vor fi evidente specialiştilor în domeniu, inclusiv formulări care implică constructul anticorpului conform invenţiei în formulări cu eliberare/administrare susţinută sau controlată. Tehnicile pentru formularea unei varietăţi de alte mijloace de eliberare susţinută sau controlată, cum ar fi purtători de lipozomi, microparticule bio-erodabile sau perle poroase şi injecţii de depozit, sunt, de asemenea, cunoscute specialiştilor în domeniu. Vezi, de exemplu, cererea de brevet internaţional WO9315722, care descrie eliberarea controlată a microparticulelor polimerice poroase pentru livrarea compoziţiilor farmaceutice. Preparatele cu eliberare susţinută pot include matrici polimerice semipermeabile sub formă de articole modelate, de ex., filme sau microcapsule. Matricile cu eliberare susţinută pot include poliesteri, hidrogeluri, polilactide (aşa cum este dezvăluit în brevetul US nr. 3.773.919 şi publicaţia cererii de brevet european Nr. EP 058481), copolimeri de L-glutamic acid şi gamma etil-L-glutamat (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli(2-hidroxietil-metacrilat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 şi Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), acetat de etilen vinil (Langer et al., 1981, supra) sau acid poli-D(-)-3-hidroxibutiric (publicaţia cererii de brevet european Nr. EP 133.988). Compoziţiile cu eliberare susţinută pot include, de asemenea, lipozomi care pot fi preparaţi prin oricare dintre mai multe metode cunoscute în domeniu. Vezi, de ex., Eppstein şi colab., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. S.U.A. 82:3688-3692; publicaţiile cererilor de brevet European Nr. EP 036.676; EP 088.046 şi EP 143.949.
Constructul anticorpului poate fi, de asemenea, prins în microcapsule preparate, de exemplu, prin tehnici de coacervare sau prin polimerizare interfacială (de exemplu, hidroximetilceluloză sau gelatină-microcapsule şi, respectiv, microcapsule de poli (metilmetacilat)), în sisteme de eliberare a medicamentelor coloidale (de exemplu, lipozomi, microsfere de albumină, microemulsii, nanoparticule şi nanocapsule), sau în macroemulsii. Astfel de tehnici sunt dezvăluite în Remington's Pharmaceutical Sciences, ediţia a 16-a, Oslo, A., Ed., (1980).
Compoziţiile farmaceutice utilizate pentru administrarea in vivo sunt de obicei furnizate ca preparate sterile. Sterilizarea poate fi realizată prin filtrare prin membrane de filtrare sterile. Când compoziţia este liofilizată, sterilizarea utilizând această metodă poate fi efectuată fie înainte, fie după liofilizare şi reconstituire. Compoziţiile pentru administrare parenterală pot fi stocate sub formă liofilizată sau într-o soluţie. Compoziţiile parenterale sunt, în general, plasate într-un recipient având un orificiu de acces steril, de exemplu, o pungă de soluţie intravenoasă sau o fiolă având un dop străpuns de un ac hipodermic de injecţie.
Un alt aspect al invenţiei include constructul de anticorpi cu auto-tamponare a formulărilor invenţiei, care pot fi utilizate ca compoziţii farmaceutice, aşa cum este descris în cererea de brevet internaţional WO 06138181A2. O varietate de expuneri sunt disponibile cu privire la materialele şi metodele de stabilizare şi formulare a proteinelor utile în acest sens, cum ar fi Arakawa şi colab., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick şi colab., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution" în: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, ed. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), şi Randolph şi colab., "Surfactant-protein interactions", Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), a se vedea în special părţile relevante pentru excipienţi şi procedeele acestora pentru formulări de proteine ​​auto-tamponate în conformitate cu invenţia actuală, în special în ceea ce priveşte produsele farmaceutice proteice şi procedeele pentru utilizări medicale veterinare şi/sau umane.
Sărurile pot fi utilizate în conformitate cu anumite exemple de realizare ale invenţiei pentru, de exemplu, a regla tăria ionică şi/sau izotonicitatea unei formulări şi/sau pentru a îmbunătăţi solubilitatea şi/sau stabilitatea fizică a unei proteine ​​sau a altui ingredient al unei compoziţii, în conformitate cu invenţia. După cum se ştie, ionii pot stabiliza starea nativă a proteinelor prin legarea la reziduurile încărcate de pe suprafaţa proteinei şi prin protejarea grupărilor încărcate şi polare din proteină şi prin reducerea rezistenţei interacţiunilor lor electrostatice, a interacţiunilor atractive şi respingătoare. Ionii pot stabiliza, de asemenea, starea denaturată a unei proteine ​​prin legarea, în special, a legăturilor peptidice denaturate (--CONH) ale proteinei. Mai mult, interacţiunea ionică cu grupările încărcate şi polare dintr-o proteină poate reduce, de asemenea, interacţiunile electrostatice intermoleculare şi, prin urmare, poate preveni sau reduce agregarea şi insolubilitatea proteinelor.
Speciile ionice diferă semnificativ prin efectele lor asupra proteinelor. Au fost dezvoltate o serie de clasificări categorice ale ionilor şi efectele acestora asupra proteinelor care pot fi utilizate în formularea compoziţiilor farmaceutice în conformitate cu invenţia. Un exemplu este seria Hofmeister, care clasifică soluţii ionice şi polare neionice prin efectul lor asupra stabilităţii conformaţionale a proteinelor în soluţie. Solutele stabilizatoare sunt denumite „kosmotrope». Solutele destabilizante sunt denumite „haotrope». Kosmotropele sunt utilizate în mod obişnuit la concentraţii mari (de ex.,> 1 molar de sulfat de amoniu) pentru a precipita proteinele din soluţie („eliminare prin sărare»). Haotropele sunt utilizate în mod obişnuit pentru dentare şi/sau pentru a solubiliza proteinele („în sărare»). Eficacitatea relativă a ionilor la „în sărare» şi „din sărare» defineşte poziţia lor în seria Hofmeister.
Aminoacizii liberi pot fi utilizaţi în constructul anticorpului conform formulărilor invenţiei în conformitate cu diferite variante ale invenţiei ca agenţi de încărcare, stabilizatori şi antioxidanţi, precum şi alte utilizări standard. Lizina, prolina, serina şi alanina pot fi utilizate pentru stabilizarea proteinelor într-o formulare. Glicina este utilă în liofilizare pentru a asigura structura şi proprietăţile corecte ale turtei. Arginina poate fi utilă pentru a inhiba agregarea proteinelor, atât în formulări lichide, cât şi în formulări liofilizate. Metionina este utilă ca antioxidant.
Poliolii includ zaharuri, de ex., manitol, zaharoză şi sorbitol şi alcooli polihidrici, cum ar fi, de exemplu, glicerol şi propilenglicol şi, în scopuri de discuţie aici, polietilenglicol (PEG) şi substanţe înrudite. Poliolii sunt kosmotropici. Sunt agenţi stabilizatori utili atât în formulări lichide, cât şi în formulări liofilizate pentru a proteja proteinele de procesele de degradare fizică şi chimică. Poliolii sunt, de asemenea, utili pentru ajustarea tonicităţii formulărilor. Printre polioli utili în anumite exemple de realizare ale invenţiei se numără manitolul, utilizat în mod obişnuit pentru a asigura stabilitatea structurală a turtei în formulările liofilizate. Asigură stabilitatea structurală a turtei. Este utilizat în general cu un lioprotector, de ex., zaharoză. Sorbitolul şi zaharoza sunt printre agenţii preferaţi pentru ajustarea tonicităţii şi ca stabilizatori pentru a proteja împotriva tensiunilor de îngheţ-dezgheţ în timpul transportului sau preparării volumelor în timpul procesului de fabricaţie. Zaharurile reducătoare (care conţin grupări de aldehidă sau cetonă libere), cum ar fi glucoza şi lactoza, pot glica reziduuri de lizină şi arginină de suprafaţă. Prin urmare, în general nu se numără printre poliolii preferaţi pentru utilizare în conformitate cu invenţia. În plus, zaharurile care formează astfel de specii reactive, cum ar fi zaharoza, care este hidrolizată în fructoză şi glucoză în condiţii acide şi, în consecinţă, generează glicare, nu sunt, de asemenea, printre poliolii preferaţi ai invenţiei în acest sens. PEG este util pentru stabilizarea proteinelor şi ca crioprotector şi poate fi utilizat în invenţie în acest sens.
Variantele constructului anticorpului conform formulărilor invenţiei cuprind în plus agenţi tensioactivi. Moleculele de proteine pot fi susceptibile la adsorbţie pe suprafeţe şi la denaturare şi agregare consecventă la interfeţele aer-lichid, solid-lichid şi lichid-lichid. Aceste efecte se amplifică în general invers cu concentraţia de proteine. Aceste interacţiuni dăunătoare cresc în general invers cu concentraţia de proteine şi de obicei sunt exacerbate de agitaţia fizică, cum ar fi cea generată în timpul transportului şi manipulării unui produs. Surfactanţii sunt utilizaţi în mod obişnuit pentru a preveni, minimiza sau reduce adsorbţia la suprafaţă. Surfactanţii utili din invenţie în această privinţă includ polisorbat 20, polisorbat 80, alţi esteri ai acizilor graşi ai polietoxilaţilor de sorbitan şi poloxamer 188. Surfactanţii sunt, de asemenea, utilizaţi în mod obişnuit pentru a controla stabilitatea conformaţională a proteinelor. Utilizarea agenţilor tensioactivi în acest sens este specifică proteinelor, deoarece orice agent tensioactiv dat va stabiliza de obicei unele proteine ​​şi le va destabiliza pe altele.
Polisorbaţii sunt susceptibili la degradarea oxidativă şi adesea, după cum se furnizează, conţin cantităţi suficiente de peroxizi pentru a provoca oxidarea lanţurilor laterale ale reziduurilor de proteine, în special a metioninei. În consecinţă, polisorbaţii trebuie utilizaţi cu atenţie şi, atunci când sunt folosiţi, trebuie utilizaţi la cea mai mică concentraţie efectivă. În acest sens, polisorbaţii exemplifică regula generală conform căreia excipienţii trebuie utilizaţi în concentraţiile lor eficiente cele mai scăzute.
Variante ale constructului anticorpului conform formulărilor invenţiei cuprind în continuare unul sau mai mulţi antioxidanţi. Într-o oarecare măsură oxidarea dăunătoare a proteinelor poate fi prevenită în formulările farmaceutice prin menţinerea nivelurilor adecvate de oxigen şi temperatură ambientală şi evitarea expunerii la lumină. Excipienţii antioxidanţi pot fi folosiţi şi pentru a preveni degradarea oxidativă a proteinelor. Printre antioxidanţii utili în această privinţă se numără agenţii reducători, eliminatorii de oxigen/radicali liberi şi agenţii de chelare. Antioxidanţii pentru utilizare în formulări de proteine terapeutice în conformitate cu invenţia sunt de preferinţă solubili în apă şi îşi menţin activitatea pe toată durata de valabilitate a unui produs. EDTA este un antioxidant preferat în conformitate cu invenţia în acest sens. Antioxidanţii pot deteriora proteinele. De exemplu, agenţii reducători, cum ar fi glutationul în special, pot perturba legăturile disulfură intramoleculare. Astfel, antioxidanţii pentru utilizare în invenţie sunt selectaţi pentru, printre altele, să elimine sau să reducă suficient posibilitatea de a se deteriora proteinele în formulare.
Formulările în conformitate cu invenţia pot include ioni metalici care sunt co-factori proteici şi care sunt necesari pentru a forma complecşi de coordonare a proteinelor, cum ar fi zincul necesar pentru a forma anumite suspensii de insulină. Ionii metalici pot, de asemenea, inhiba unele procese care degradează proteinele. Cu toate acestea, ionii metalici catalizează şi procesele fizice şi chimice care degradează proteinele. Ionii de magneziu (10-120 mM) pot fi folosiţi pentru a inhiba izomerizarea acidului aspartic în acid izoaspartic. Ionii Ca+2 (până la 100 mM) pot creşte stabilitatea dezoxiribonucleazei umane. Mg+2, Mn+2, şi Zn+2, de altfel, pot destabiliza rhDNaza. Similar, Ca+2 şi Sr+2 pot stabiliza Factor ulVIII, poate fi destabilizat de Mg+2, Mn+2 şi Zn+2, Cu+2 şi Fe+2, şi agregarea sa poate fi crescută de ioni Al+3.
Variantele constructului anticorpului conform formulărilor invenţiei cuprind în continuare unul sau mai mulţi conservanţi. Conservanţii sunt necesari atunci când se dezvoltă formulări parenterale cu doze multiple care implică mai multe extracţii din acelaşi recipient. Funcţia lor principală este de a inhiba creşterea microbiană şi de a asigura sterilitatea produsului pe toată durata de valabilitate sau pe durata utilizării produsului medicamentos. Conservanţii utilizaţi în mod obişnuit includ alcoolul benzilic, fenolul şi m-crezolul. Deşi conservanţii au o istorie lungă de utilizare cu parenteralele cu molecule mici, dezvoltarea formulărilor de proteine ​​care includ conservanţi poate fi o provocare. Conservanţii au aproape întotdeauna un efect destabilizator (agregare) asupra proteinelor, iar acest lucru a devenit un factor major în limitarea utilizării lor în formulări de proteine ​​cu doze multiple. Până în prezent, majoritatea medicamentelor proteice au fost formulate numai pentru o singură utilizare. Cu toate acestea, atunci când sunt posibile formulări cu mai multe doze, acestea au avantajul suplimentar de a permite confortul pacientului şi o comercializare crescută. Un bun exemplu este cel al hormonului de creştere uman (hGH) în care dezvoltarea formulărilor conservate a condus la comercializarea unor prezentări mai convenabile, cu stilou de injecţie multi uz. Cel puţin patru astfel de dispozitive stilou care conţin formulări conservate de hGH sunt disponibile în prezent pe piaţă. Norditropin (lichid, Novo Nordisk), Nutropin AQ (lichid, Genentech) şi Genotropin (liofilizat - cartuş cu cameră dublă, Pharmacia & Upjohn) conţin fenol în timp ce Somatrope (Eli Lilly) este formulat cu m-crezol. Mai multe aspecte trebuie luate în considerare în timpul formulării şi dezvoltării formelor de dozare conservate. Concentraţia eficientă de conservant în produsul medicamentos trebuie optimizată. Acest lucru necesită testarea unui conservant dat sub formă de dozare cu intervale de concentraţie care conferă eficacitate antimicrobiană fără a compromite stabilitatea proteinelor.
Aşa cum era de aşteptat, dezvoltarea formulărilor lichide care conţin conservanţi este mai dificilă decât formulările liofilizate. Produsele liofilizate pot fi liofilizate fără conservant şi reconstituite cu un conservant care conţine diluant în momentul utilizării. Acest lucru scurtează timpul pentru care un conservant este în contact cu proteina, minimizând semnificativ riscurile de stabilitate asociate. Cu formulările lichide, eficacitatea şi stabilitatea conservanţilor trebuie menţinute pe întreaga durată de valabilitate a produsului (aproximativ 18 până la 24 de luni). Un punct important de remarcat este că eficacitatea conservantului trebuie demonstrată în formularea finală care conţine medicamentul activ şi toate componentele excipientului.
Constructele de anticorp descrise aici pot fi de asemenea formulate ca imuno-lipozomi. Un "lipozom" este o veziculă mică compusă din diferite tipuri de lipide, fosfolipide şi/sau surfactant care este utilă pentru livrarea unui medicament la un mamifer. Componentele lipozomului sunt aranjate în mod obişnuit într-o formaţiune bistratificată, similară cu aranjamentul lipidic al membranelor biologice. Lipozomii care conţin constructul anticorpului sunt preparaţi prin metode cunoscute în domeniu, cum sunt descrise în Epstein şi colab., Proc. Natl. Acad. Sci. SUA, 82: 3688 (1985); Hwang şi colab., Proc. Natl Acad. Sci. SUA, 77: 4030 (1980); brevete US Nr. 4.485.045 şi 4.544.545; şi WO 97/38731. Lipozomii cu timp de circulaţie îmbunătăţit sunt dezvăluiţi în brevetul US nr. 5.013, 556. Lipozomii deosebit de utili pot fi generaţi prin metoda de evaporare în fază inversă cu o compoziţie lipidică cuprinzând fosfatidilcolină, colesterol şi fosfatidiletanolamină derivată de PEG (PEG-PE). Lipozomii sunt extrudaţi prin filtre cu dimensiunea definită a porilor pentru a produce lipozomi cu diametrul dorit. Fragmentele Fab' din constructul anticorpului din prezenta invenţie pot fi conjugate cu lipozomii aşa cum este descris în Martin şi colab. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) printr-o reacţie de schimb de disulfură. Un agent chimioterapeutic este opţional conţinut în lipozom. Vezi Gabizon şi colab. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).
Odată ce compoziţia farmaceutică a fost formulată, aceasta poate fi depozitată în flacoane sterile sub formă de soluţie, suspensie, gel, emulsie, solid, cristal sau sub formă de pulbere deshidratată sau liofilizată. Astfel de formulări pot fi stocate fie într-o formă gata de utilizare, fie într-o formă (de ex., liofilizată) care este reconstituită înainte de administrare.
Activitatea biologică a compoziţiei farmaceutice definite aici poate fi determinată, de exemplu, prin teste de citotoxicitate, aşa cum este descris în exemplele următoare, în WO 99/54440 sau de Schlereth şi colab. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). "Eficacitate" sau "eficacitate in vivo", aşa cum se utilizează aici, se referă la răspunsul la terapie de către compoziţia farmaceutică a invenţiei, utilizând de ex. criterii standardizate de răspuns NCI. Succesul sau eficacitatea in vivo a terapiei folosind o compoziţie farmaceutică conform invenţiei se referă la eficacitatea compoziţiei pentru scopul propus, adică la capacitatea compoziţiei de a-şi provoca efectul dorit, adică la epuizarea celulelor patologice, de ex. celulele tumorale. Eficacitatea in vivo poate fi monitorizată prin metode standard stabilite pentru entităţile respective ale bolii, incluzând, dar fără a se limita la, numărul de celule albe din sânge, diferenţiale, sortarea celulelor activate cu fluorescenţă, aspiraţia măduvei osoase. În plus, pot fi utilizaţi diferiţi parametri chimici clinici specifici bolii şi alte metode standard stabilite. Mai mult, tomografie asistată de computer, raze X, tomografie cu rezonanţă magnetică nucleară (de ex., pentru evaluarea răspunsului bazată pe criteriile Institutului Naţional al Cancerului [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Raportul unui grup de lucru internaţional pentru standardizarea criteriilor de răspuns pentru limfoamele non-Hodgkin. Grupul de lucru internaţional sponsorizat de NCI. J Clin Oncol. 1999 apr; 17 (4): 1244]), scanare tomografică cu emisie de pozitroni, număr de celule albe din sânge, diferenţiale, sortare celulară activată cu fluorescenţă, aspiraţie a măduvei osoase, biopsii/histologii ale ganglionilor limfatici şi diferiţi parametri chimici clinici specifici limfomului (de ex., lactat dehidrogenază) şi pot fi utilizate alte metode standard stabilite.
O altă provocare majoră în dezvoltarea medicamentelor, cum ar fi compoziţia farmaceutică a invenţiei, este modularea previzibilă a proprietăţilor farmacocinetice. În acest scop, poate fi stabilit un profil farmacocinetic al medicamentului candidat, adică un profil al parametrilor farmacocinetici care afectează capacitatea unui anumit medicament de a trata o afecţiune dată. Parametrii farmacocinetici ai medicamentului care influenţează capacitatea unui medicament de a trata o anumită entitate de boală includ, dar nu se limitează la: timpul de înjumătăţire, volumul de distribuţie, metabolismul hepatic la prima trecere şi gradul de legare a serului sanguin. Eficacitatea unui medicament dat poate fi influenţată de fiecare dintre parametrii menţionaţi mai sus.
„Timp de înjumătăţire» înseamnă timpul în care 50% dintr-un medicament administrat sunt eliminate prin procese biologice, de ex. metabolism, excreţie etc. Prin „metabolism hepatic la prima trecere» se înţelege tendinţa unui medicament de a fi metabolizat la primul contact cu ficatul, adică în timpul primei sale treceri prin ficat. „Volumul de distribuţie» înseamnă gradul de reţinere a unui medicament în diferite compartimente ale corpului, cum ar fi de ex. spaţii intracelulare şi extracelulare, ţesuturi şi organe etc. şi distribuţia medicamentului în aceste compartimente. „Gradul de legare a serului sanguin» înseamnă tendinţa unui medicament de a interacţiona şi de a se lega de proteinele serice din sânge, cum ar fi albumina, ducând la o reducere sau pierderea activităţii biologice a medicamentului.
Parametrii farmacocinetici includ, de asemenea, biodisponibilitatea, timpul de întârziere (Tlag), Tmax, ratele de absorbţie, debut mai mare şi/sau Cmax pentru o cantitate dată de medicament administrat. „Biodisponibilitate» înseamnă cantitatea de medicament din compartimentul de sânge. „Timp de întârziere» înseamnă întârzierea dintre administrarea medicamentului şi detectarea şi măsurarea acestuia în sânge sau plasmă. „Tmax» este timpul după care se atinge concentraţia maximă în sânge a medicamentului, iar „Cmax» este concentraţia de sânge maxim obţinută cu un anumit medicament. Timpul pentru atingerea unei concentraţii în sânge sau ţesuturi a medicamentului care este necesar pentru efectul său biologic este influenţat de toţi parametrii. Parametrii farmacocinetici ai constructelor de anticorpi bispecifici care prezintă specificitate încrucişată, care pot fi determinaţi în testarea preclinică pe animale la primatele non-cimpanzeu, aşa cum s-a subliniat mai sus, sunt, de asemenea, expuşi, de ex. în publicaţie de Schlereth şi colab. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).
O variantă de realizare oferă constructul anticorpului conform invenţiei sau constructul anticorpului produs în conformitate cu procedeul invenţiei pentru utilizare în prevenirea, tratamentul sau ameliorarea unei boli tumorale sau canceroase sau a unei boli canceroase metastatice.
Formulările descrise aici sunt utile ca compoziţii farmaceutice în tratamentul, ameliorarea şi/sau prevenirea stării medicale patologice aşa cum este descris aici la un pacient care are nevoie de acestea. Termenul "tratament" se referă atât la tratamentul terapeutic, cât şi la măsurile profilactice sau preventive. Tratamentul include aplicarea sau administrarea formulării pe corp, un ţesut izolat sau o celulă de la un pacient care are o boală/tulburare, un simptom al unei boli/tulburări sau o predispoziţie către o boală/tulburare, cu scopul de a trata, vindeca, ameliora, ameliora, modifica, remedia, ameliora, îmbunătăţi sau afecta boala, simptomul bolii sau predispoziţia spre boală.
Termenul "ameliorare", aşa cum este utilizat aici, se referă la orice îmbunătăţire a stării de boală a unui pacient care are o tumoare sau cancer sau un cancer metastatic, aşa cum este specificat mai jos, prin administrarea unui construct de anticorp conform invenţiei la un subiect care are nevoie de acesta. O astfel de îmbunătăţire poate fi văzută şi ca o încetinire sau oprire a progresiei p a tumorii sau a cancerului sau cancerului metastatic al pacientului. Termenul "prevenire", aşa cum este utilizat aici, înseamnă evitarea apariţiei sau reapariţiei unui pacient care are o tumoare sau cancer sau un cancer metastatic, aşa cum este specificat mai jos, prin administrarea unui construct de anticorp conform invenţiei unui subiect în nevoie de aceasta.
Termenul "boală" se referă la orice afecţiune care ar beneficia de tratamentul cu constructul anticorpului sau compoziţia farmaceutică descrisă aici. Aceasta include tulburări sau boli cronice şi acute, inclusiv acele condiţii patologice care predispun mamiferul la boala în cauză.
Un "neoplasm" este o creştere anormală a ţesutului, de obicei, dar nu întotdeauna formează o masă. Atunci când se formează şi o masă, este denumită în mod obişnuit „tumoare». Neoplasmele sau tumorile pot fi benigne, potenţial maligne (precanceroase) sau maligne. Neoplasmele maligne sunt denumite în mod obişnuit cancer. De obicei, invadează şi distrug ţesutul înconjurător şi pot forma metastaze, adică se răspândesc în alte părţi, ţesuturi sau organe ale corpului. Prin urmare, termenul "cancer metastatic" cuprinde metastaze la alte ţesuturi sau organe decât cel al tumorii originale. Limfoamele şi leucemiile sunt neoplasme limfoide. În scopul prezentei invenţii, acestea sunt cuprinse, de asemenea, de termenii „tumoare» sau „cancer».
Într-o variantă preferată a invenţiei, boala tumorală sau a cancerului este selectată din grupul care include, dar nu se limitează la, (sau constă din) cancer pulmonar, de preferinţă SCLC, sân, col uterin, colon, colorectal, endometrial, cap şi gât, ficat, ovarian, pancreatic, de prostată, piele, gastric, testicul, tiroidă, suprarenal, renal, vezică urinară, uterin, esofagian, tumoare urotelială şi cerebrală sau cancer, limfom, carcinom şi sarcom şi o boală metastatică a cancerului derivată din oricare de mai sus.
Mai precis, boala tumorală sau cancer poate fi selectat din grupul constând din cancer pulmonar cu celule mici (SCLC), cancer pulmonar cu celule non-mici (NSCLC), gliom, glioblastom, melanom, cancer de prostată neuroendocrin, cancer pancreatic neuroendocrin, hepatoblastom, şi carcinom hepatocelular. Boala cancerului metastatic poate fi derivată din oricare dintre cele de mai sus.
Termenii „subiect care are nevoie» sau cei „care au nevoie de tratament» îi include pe cei care au deja tulburare, precum şi pe cei în care tulburarea trebuie prevenită. Subiectul care are nevoie sau „pacient» include subiecţi umani şi alte mamifere care primesc fie tratament profilactic, fie terapeutic.
Constructul anticorpului conform invenţiei va fi în general proiectat pentru căi şi metode specifice de administrare, pentru dozaje şi frecvenţe specifice de administrare, pentru tratamente specifice bolilor specifice, cu intervale de biodisponibilitate şi persistenţă, printre altele. Materialele compoziţiei sunt de preferinţă formulate în concentraţii care sunt acceptabile pentru locul de administrare.
Formulările şi compoziţiile astfel pot fi proiectate în conformitate cu invenţia pentru livrare pe orice cale de administrare adecvată. În contextul prezentei invenţii, căile de administrare includ, dar nu se limitează la acestea
• căi topice (cum ar fi epicutanee, inhalatorii, nazale, oftalmice, auriculare/auditive, vaginale, mucoase);
• căi enterale (cum ar fi oral, gastrointestinal, sublingual, sublabial, bucal, rectal); şi
• căi parenterale (cum ar fi intravenoasă, intraarterială, intraosoasă, intramusculară, intracerebrală, intracerebroventriculară, epidurală, intratecală, subcutanată, intraperitoneală, extraamniotică, intraarticulară, intracardică, intradermică, intralezională, intrauterină, intravezicală, intravitreală, transdermală, intranazală, transmucozală, intrasinovială, intraluminală).
Compoziţiile farmaceutice şi constructul de anticorpi conform acestei invenţii sunt utile în special pentru administrare parenterală, de ex., administrare subcutanată sau intravenoasă, de exemplu prin injecţie, cum ar fi injecţia în bolus, sau prin perfuzie, cum ar fi perfuzie continuă. Compoziţiile farmaceutice pot fi administrate folosind un dispozitiv medical. Exemple de dispozitive medicale pentru administrarea compoziţiilor farmaceutice sunt descrise în brevetele US nr. 4.475.196; 4.439.196; 4.447.224; 4.447, 233; 4.486.194; 4.487.603; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335; 5.312.335; 5.383.851; şi 5.399.163.
În special, prezenta invenţie asigură o administrare neîntreruptă a compoziţiei adecvate. Ca un exemplu nelimitativ, neîntrerupt sau substanţial neîntrerupt, adică administrarea continuă poate fi realizată de un sistem mic de pompare purtat de pacient pentru măsurarea afluxului de agent terapeutic în corpul pacientului. Compoziţia farmaceutică care cuprinde constructul anticorpului conform invenţiei poate fi administrată prin utilizarea respectivelor sisteme de pompare. Astfel de sisteme de pompare sunt în general cunoscute în domeniu şi se bazează în mod obişnuit pe schimbul periodic de cartuşe care conţin agentul terapeutic care trebuie perfuzat. Când se schimbă cartuşul într-un astfel de sistem de pompare, poate apărea o întrerupere temporară a fluxului de altfel neîntrerupt al agentului terapeutic în corpul pacientului. Într-un astfel de caz, faza de administrare anterioară înlocuirii cartuşului şi faza de administrare care urmează înlocuirii cartuşului ar fi totuşi luate în considerare în sensul mijloacelor farmaceutice şi metodelor invenţiei alcătuind împreună o „administrare neîntreruptă» a unui astfel de agent terapeutic.
Administrarea continuă sau neîntreruptă a constructelor anticorpului conform invenţiei poate fi intravenoasă sau subcutanată prin intermediul unui dispozitiv de livrare a fluidului sau a unui sistem de pompare mic, incluzând un mecanism de acţionare a fluidului pentru a scoate fluidul dintr-un rezervor şi un mecanism de acţionare pentru acţionarea mecanismului de acţionare. Sistemele de pompare pentru administrare subcutanată pot include un ac sau o canulă pentru pătrunderea pielii unui pacient şi livrarea compoziţiei adecvate în corpul pacientului. Respectivele sisteme de pompare pot fi fixate direct sau ataşate la pielea pacientului independent de o venă, arteră sau vas de sânge, permiţând astfel un contact direct între sistemul de pompare şi pielea pacientului. Sistemul de pompare poate fi ataşat la pielea pacientului timp de 24 de ore până la câteva zile. Sistemul de pompare poate fi de dimensiuni mici, cu un rezervor pentru volume mici. Ca exemplu nelimitativ, volumul rezervorului pentru compoziţia farmaceutică adecvată care trebuie administrată poate fi între 0,1 şi 50 ml.
Administrarea continuă poate fi, de asemenea, transdermică prin intermediul unui plasture purtat pe piele şi înlocuit la intervale de timp. Un specialist în domeniu este conştient de sistemele de patch-uri pentru administrarea de medicamente adecvate în acest scop. Este de remarcat faptul că administrarea transdermică este deosebit de susceptibilă de administrare neîntreruptă, deoarece schimbul unui prim plasture epuizat poate fi realizat în mod avantajos simultan cu plasarea unui nou, al doilea plasture, de exemplu pe suprafaţa pielii imediat adiacentă primului plasture epuizat, şi imediat înainte de îndepărtarea primului plasture epuizat. Nu apar probleme de întrerupere a fluxului sau întreruperea celulei de alimentare.
Dacă compoziţia farmaceutică a fost liofilizată, materialul liofilizat este mai întâi reconstituit într-un lichid adecvat înainte de administrare. Materialul liofilizat poate fi reconstituit în, de exemplu, apă bacteriostatică pentru injecţie (BWFI), soluţie salină fiziologică, soluţie salină tamponată cu fosfat (PBS) sau aceeaşi formulare în care se afla proteina înainte de liofilizare.
Compoziţiile prezentei invenţii pot fi administrate subiectului la o doză adecvată care poate fi determinată de ex. prin studii de creştere a dozei prin administrarea de doze crescânde ale constructului anticorpului conform invenţiei care prezintă specificitatea încrucişată descrisă aici la primatele care nu sunt cimpanzei, de exemplu macaci. Aşa cum s-a arătat mai sus, constructul anticorpului conform invenţiei care prezintă specificitatea speciilor încrucişate descrisă aici poate fi utilizată în mod avantajos în formă identică în testarea preclinică la primatele non-cimpanzeu şi ca medicament la om. Regimul de dozare va fi determinat de medicul curant şi de factorii clinici. Aşa cum este bine cunoscut în domeniul medical, dozele pentru orice pacient depind de mulţi factori, inclusiv dimensiunea pacientului, suprafaţa corpului, vârsta, compusul care trebuie administrat, sexul, timpul şi calea de administrare, starea generală de sănătate şi alte medicamente fiind administrate concomitent.
Termenul "doză eficientă" sau "dozare eficientă" este definit ca o cantitate suficientă pentru a obţine sau cel puţin parţial atingerea efectului dorit. Termenul "doză eficientă terapeutic" este definit ca o cantitate suficientă pentru a vindeca sau cel puţin parţial stoparea bolii şi a complicaţiilor acesteia la un pacient care suferă deja de boală. Cantităţile sau dozele eficiente pentru această utilizare vor depinde de starea de tratat (indicaţia), de constructul de anticorpi eliberaţi, de contextul terapeutic şi obiective, de severitatea bolii, de terapia anterioară, de istoricul clinic al pacientului şi de răspunsul la agentul terapeutic, calea de administrare, dimensiunea (greutatea corpului, suprafaţa corpului sau dimensiunea organului) şi/sau starea (vârsta şi starea generală de sănătate) a pacientului şi starea generală a sistemului imunitar propriu al pacientului. Doza adecvată poate fi ajustată în funcţie de judecata medicului curant astfel încât să poată fi administrată pacientului o dată sau peste o serie de administrări şi pentru a obţine efectul terapeutic optim.
O dozare tipică poate varia de la aproximativ 0,1 µg/kg până la aproximativ 30 mg/kg sau mai mult, în funcţie de factorii menţionaţi mai sus. În realizări specifice, doza poate varia de la 1,0 µg/kg până la aproximativ 20 mg/kg, opţional de la 10 µg/kg până la aproximativ 10 mg/kg sau de la 100 µg/kg până la aproximativ 5 mg/kg.
O cantitate eficientă terapeutic dintr-un construct de anticorp conform invenţiei are ca rezultat, de preferinţă, o scădere a severităţii simptomelor bolii, o creştere a frecvenţei sau a duratei perioadelor fără simptome a bolii sau o prevenire a afectării sau dizabilităţii din cauza afectării bolii. Pentru tratarea tumorilor care exprimă DLL3, o cantitate eficientă terapeutic din constructul anticorpului conform invenţiei, de ex. un construct de anticorp anti-DLL3/anti-CD3, de preferinţă inhibă creşterea celulară sau creşterea tumorii cu cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 40%, cel puţin aproximativ 50%, cel puţin aproximativ 60%, cel puţin aproximativ 70%, la cel puţin aproximativ 80% sau cel puţin aproximativ 90% faţă de pacienţii netrataţi. Capacitatea unui compus de a inhiba creşterea tumorii poate fi evaluată într-un model animal predictiv al eficacităţii tumorilor umane.
Compoziţia farmaceutică poate fi administrată ca singură terapeutică sau în combinaţie cu terapii suplimentare, cum ar fi terapiile anti-cancer, după cum este necesar, de ex. alte medicamente proteice şi neproteice. Aceste medicamente pot fi administrate simultan cu compoziţia care cuprinde constructul anticorpului conform invenţiei aşa cum este definit aici sau separat înainte sau după administrarea respectivului construct de anticorp la intervale şi doze definite în timp util.
Termenul "doză eficientă şi non-toxică", aşa cum este utilizat aici, se referă la o doză tolerabilă a unui construct de anticorp inventiv care este suficient de mare pentru a provoca epuizarea celulelor patologice, eliminarea tumorii, restrângerea tumorii sau stabilizarea bolii fără sau în esenţă fără efecte toxice majore. Astfel de doze eficiente şi netoxice pot fi determinate de exemplu prin studii de creştere a dozei descrise în stadiul tehnicii şi ar trebui să fie sub doza care să inducă evenimente adverse severe (toxicitate care limitează doza, DLT).
Termenul "toxicitate", aşa cum este utilizat aici, se referă la efectele toxice ale unui medicament manifestate în evenimente adverse sau evenimente adverse severe. Aceste evenimente secundare se pot referi la o lipsă de tolerabilitate a medicamentului în general şi/sau o lipsă de toleranţă locală după administrare. Toxicitatea poate include, de asemenea, efecte teratogene sau cancerigene cauzate de medicament.
Termenul "siguranţă", "siguranţă in vivo" sau "tolerabilitate" aşa cum este utilizat aici defineşte administrarea unui medicament fără a induce evenimente adverse severe direct după administrare (toleranţă locală) şi pe o perioadă mai lungă de aplicare a medicamentului. „Siguranţa», „siguranţa in vivo» sau „tolerabilitatea» pot fi evaluate de ex. la intervale regulate în timpul tratamentului şi perioada de urmărire. Măsurătorile includ evaluarea clinică, de ex. manifestări ale organelor şi screeningul anomaliilor de laborator. Se poate efectua evaluarea clinică şi se pot înregistra/codifica abateri la constatările normale în conformitate cu standardele NCI-CTC şi/sau MedDRA. Manifestările organelor pot include criterii precum alergie/imunologie, sânge/măduvă osoasă, aritmie cardiacă, coagulare şi altele asemenea, aşa cum este stabilit de ex. în Criteriile terminologice comune pentru evenimente adverse v3.0 (CTCAE). Parametrii de laborator care pot fi testaţi includ, de exemplu, hematologia, chimia clinică, profilul de coagulare şi analiza urinei şi examinarea altor fluide corporale precum ser, plasmă, lichid limfoid sau spinal, seroase şi altele asemenea. Siguranţa poate fi astfel evaluată de ex. prin examinare fizică, tehnici imagistice (adică ultrasunete, raze X, scanări CT, imagistica prin rezonanţă magnetică (RMN), alte măsuri cu dispozitive tehnice (adică electrocardiogramă), semne vitale, prin măsurarea parametrilor de laborator şi înregistrarea evenimentelor adverse. De exemplu, evenimentele adverse la primatele non-cimpanzeu în utilizările şi metodele conform invenţiei pot fi examinate prin metode histopatologice şi/sau histochimice.
Termenii de mai sus se mai referă de ex. în evaluarea preclinică a siguranţei produselor farmaceutice derivate din biotehnologie S6; ICH Harmonised Tripartite Guideline; ICH Steering Committee meeting din 16 iulie 1997.
Într-o altă variantă de realizare, invenţia oferă un kit care cuprinde un construct de anticorp conform invenţiei, un construct de anticorp produs în conformitate cu procesul invenţiei, o polipeptidă a invenţiei, un vector al invenţiei şi/sau o celulă gazdă din invenţie.
În contextul prezentei invenţii, termenul "kit" înseamnă două sau mai multe componente - dintre care una corespunde constructului anticorpului, compoziţiei farmaceutice, vectorului sau celulei gazdă a invenţiei - ambalate împreună într-un recipient, recipient sau in alt fel. Prin urmare, un kit poate fi descris ca un set de produse şi/sau ustensile care sunt suficiente pentru a atinge un anumit obiectiv, care poate fi comercializat ca o singură unitate.
Kitul poate cuprinde unul sau mai mulţi recipienţi (cum ar fi flacoane, fiole, recipiente, seringi, sticle, pungi) de orice formă, dimensiune şi material adecvat (de preferinţă impermeabil, de ex. plastic sau sticlă) care conţine constructul anticorpului sau compoziţia farmaceutică din prezenta invenţie într-o doză adecvată pentru administrare (vezi mai sus). Kitul poate conţine în plus instrucţiuni de utilizare (de ex., sub formă de prospect sau manual de instrucţiuni), mijloace pentru administrarea constructului anticorpului din prezenta invenţie, cum ar fi o seringă, pompă, infuzor sau altele asemenea, mijloace pentru reconstituirea constructului anticorpului invenţiei şi/sau mijloacele pentru diluarea constructului anticorpului conform invenţiei.
Invenţia furnizează, de asemenea, kituri pentru o unitate de administrare cu doză unică. Trusa conform invenţiei poate conţine, de asemenea, un prim recipient care cuprinde un construct de anticorp uscat/liofilizat şi un al doilea recipient care cuprinde o formulare apoasă. În anumite variante ale acestei invenţii, sunt furnizate kituri care conţin seringi preumplute cu o singură cameră şi cu mai multe camere (de ex., seringi cu lichid şi lioseringi).
Figurile arată:
Figura 1 Reprezentarea schematică a constructelor DLL3 ECD/DLL3 trunchiate exprimate pe celule CHO pentru maparea epitopului. Transmembrana şi domeniul intracelular sunt derivate din EpCAM. Vezi Exemplul 1.
Figura 2 Cartarea epitopului constructelor anticorpilor anti-DLL3. Exemple de constructe de anticorpi bispecifici care recunosc domeniul EGF-3 şi, respectiv, domeniul EGF-4, aşa cum sunt detectate prin maparea epitopului. Axa x descrie PE-A (PE = ficoeritrina, A = zona semnalului), iar axa y prezintă numărul. Vezi Exemplul 2.
Figura 3 Reactivitatea încrucişată a constructelor anticorpilor anti-DLL3 detectată prin citometrie în flux: legare la DLL3 şi CD3 umane şi de macac. Axa x descrie FL2-H, iar axa y reprezintă numărul. Vezi Exemplul 5.
Figura 4 Analiza constructelor de anticorpi anti-DLL3 prin citometrie în flux: fără legare la paralogii umani DLL1 şi DLL4. Axa x descrie FL1-H, iar axa y reprezintă numărul. Vezi Exemplul 6.
Figura 5 Stabilitatea constructelor anticorpilor anti-DLL3 după incubare timp de 96 de ore în plasmă umană. Vezi Exemplul 11.
Figura 6 Decalajul de potenţă între izoforma monomerică şi dimerică a constructelor anticorpului anti-DLL3. Vezi Exemplul 15.
Figura 7 Test de internalizare in vitro, efectuat aşa cum este descris în Exemplul 16. Constructul anticorpului a fost pre-incubat pe celulele ţintă (SHP-77) în absenţa celulelor T pentru a măsura pierderea constructului anticorpului datorită internalizării. Rezultatele sugerează că nu are loc o internalizare semnificativă. Rezultatele obţinute cu o ţintă de control care este bine cunoscută pentru internalizarea sa sunt prezentate pentru comparaţie în partea dreaptă.
Figura 8 Rezultatele studiului de eficienţă a xenogrefei de şoarece la modelul SHP-77 (Fig. 8A) şi modelul WM266-4 (Figura 8B). Volumul tumorii este reprezentat grafic în funcţie de timp. Vezi Exemplul 18.
Figura 9 Farmacocinetica diferitelor constructe de anticorpi HLE (fuziunea albuminei din Fig. 9A şi fuziunile Fc din Fig. 9B) aşa cum se determină în Exemplul 20.
Exemple:
Următoarele exemple ilustrează invenţia. Aceste exemple nu ar trebui interpretate ca limitând scopul acestei invenţii. Prezenta invenţie este limitată numai de revendicări.
Exemplul 1
Generarea de celule CHO care exprimă tipul sălbatic şi DLL3 trunchiat
Domeniul extracelular al antigenului DLL3 poate fi împărţit în diferite subdomenii sau regiuni care sunt definite, în sensul Exemplelor 1 şi 2, de următoarele poziţii ale aminoacizilor:
Peptida semnal: 1-26
N-terminal: 27-175
DSL: 176-215
EGF-1: 216-249
EGF-2: 274-310
EGF-3: 312-351
EGF-4: 353-389
EGF-5: 391-427
EGF-6: 429-465
Pentru constructul moleculelor trunchiate DLL3 utilizate pentru cartarea epitopului, secvenţele celor opt domenii extracelulare respective (peptida semnal plus N-terminal, DSL, EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5 şi EGF6) ale DLL3 umane au fost şterse treptat din antigen, începând de la capătul N-terminal. Au fost generate următoarele molecule; vezi şi Figura 1:
• Hu DLL3 ECD/ECD complet SECV ID NR: 263 • Hu DLL3 ECD/până la DSL SECV ID NR: 264 • Hu DLL3 ECD/ până la EGF-1 SECV ID NR: 265 • Hu DLL3 ECD/până la EGF-2 SECV ID NR: 266 • Hu DLL3 ECD/până la EGF-3 SECV ID NR: 267 • Hu DLL3 ECD / până la EGF-4 SECV ID NR: 268 • Hu DLL3 ECD/până la EGF-5 SECV ID NR: 269 • Hu DLL3 ECD/numai EGF-6 SECV ID NR: 270
Pentru generarea de celule CHO care exprimă macacul cynomolgus, uman ("cyno") şi DLL3 marcat cu N-terminal V5 trunchiat uman, secvenţele de codare respective pentru DLL3-ECD uman (SECV ID NR.: 253; vezi şi numărul de acces GeneBank NM_016941), cyno DLL3-ECD (ID SECV NR.: 272) şi cele şapte versiuni DLL3-ECD marcate cu N-terminal V5 uman trunchiat (vezi mai sus) au fost clonate într-o plasmidă denumită pEF-DHFR (pEF-DHFR este descris în Raum şi colab. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Pentru expresia la suprafaţa celulară a DLL3 umană şi cyno, s-a folosit peptida semnal originală şi pentru expresia suprafeţei celulare a DLL3 N-terminal trunchiat uman s-a utilizat o peptidă semnal cu lanţ greu IgG de şoarece, urmată de o etichetă V5. Toate secvenţele DLL3-ECD menţionate au fost urmate în cadru de secvenţa de codificare a unui linker Ser/Gly artificial urmat de un domeniu derivat din domeniul transmembranar/intracelular al EpCAM uman (aminoacizii 266-314 ai secvenţei publicate în accesarea GenBank număr NM_002354). Toate procedurile de clonare au fost efectuate conform protocoalelor standard (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, ediţia a 3-a, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)). Pentru fiecare construct, o plasmidă corespunzătoare a fost transfectată în celule CHO cu deficit de DHFR pentru expresie eucariotă, aşa cum este descris de Kaufman R.J. (1990) Metode Enzymol. 185, 537-566.
Expresia DLL3 umană şi cyno pe celulele CHO a fost verificată într-un test FACS utilizând un anticorp DLL3 anti-uman IgG2b monoclonal de şoarece. Expresia celor şapte versiuni trunchiate ale DLL3-ECD umană a fost verificată folosind un anticorp anti-v5 de tip IgG2a monoclonal de şoarece. Anticorpul monoclonal legat a fost detectat cu un IgG anti-şoarece Fc-gamma-PE. Ca martor negativ, celulele au fost incubate cu anticorp de control izotip în locul primului anticorp. Probele au fost măsurate prin citometrie în flux.
Exemplul 2
Cartarea epitopului constructelor de anticorpi anti-DLL3
Celulele transfectate cu DLL3 uman şi cu moleculele DLL3 umane trunchiate (vezi Exemplul 1) au fost colorate cu extract brut periplasmic nediluat care conţine constructe de anticorp bispecific DLL3xCD3 (cu domeniul de legare CD3 fiind denumit 12C) fuzionate cu o albumină umană (varianta 1), în PBS/1,5% FCS. Moleculele legate au fost detectate cu un anticorp de domeniu de legare monoclonal anti-CD3 de şoarece (50 µl) urmat de un IgG anti-şoarece Fc-gamma-PE (1: 100, 50 µl; Jackson Immunoresearch # 115-116-071) Toţi anticorpii au fost diluaţi în PBS/1,5% FCS. Ca martor negativ, celulele au fost incubate cu PBS/2% FCS în locul extractului periplasmatic. Probele au fost măsurate prin citometrie în flux.
Regiunile care au fost recunoscute de domeniile de legare DLL3 respective sunt indicate în tabelul de secvenţe (Tabelul 18). Lianţii au fost mapaţi care erau specifici pentru un epitop situat în capătul N-terminal al DLL3, în domeniul DSL şi în diferitele domenii EGF.
Figura 2 prezintă doi lianţi exemplari care se leagă de un epitop DLL3 cuprins în regiunea EGF-3 (pierderea semnalului FACS în respectivele constructe trunchiate DLL3 care nu cuprind EGF-3). Figura 2 arată, de asemenea, un liant exemplar care se leagă la un epitop DLL3 cuprins în regiunea EGF-3 (pierderea semnalului FACS în constructele DLL3 trunchiate respective care nu conţin EGF-4).
Unii dintre lianţi sunt descrişi ca fiind specifici unui epitop situat în regiunea denumită EGF-5/[6]. Parantezele pătrate sunt menite să indice că semnalul FACS al liantului este scăzut (adică nici complet prezent, nici complet pierdut) pentru constructul DLL3 trunchiat având doar domeniul EGF-6 rămas (ultimul construct din Figura 1).
Constructele bispecifice DLL3xCD3 utilizate în exemplele următoare sunt alese dintre acele constructe având „I2C» ca domeniu de legare CD3 şi având o fuziune C-terminală cu o albumină serică umană de tip sălbatic, vezi de ex. SECV ID NR: 224-230, 233-235, 238-241.
Exemplul 3
Determinarea bazată pe biacore a afinităţii anticorpilor pentru DLL3 uman şi cynomolgus.
Experimentele de analiză Biacore au fost efectuate folosind proteine de fuziune DLL3-ECD umane/cyno recombinate cu albumină de pui pentru a determina legarea ţintei constructelor de anticorpi conform invenţiei.
În detaliu, cipurile senzorului CM5 (GE Healthcare) au fost imobilizate cu aproximativ 600-800 RU din antigenul recombinant respectiv folosind tampon acetat pH 4,5 conform manualului producătorului. Probele de construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 au fost încărcate în serii de diluţie de următoarele concentraţii: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM şi 3,13 nM diluate în tampon de funcţionare HBS-EP (GE Healthcare). Debitul a fost de 30 µl/min timp de 3 min, apoi tamponul de funcţionare HBS-EP a fost aplicat din nou timp de 8 min până la 20 min la un debit de 30 µl/ml. Regenerarea cipului a fost efectuată utilizând 10 mM glicină 10 mM soluţie NaCl pH 1,5. Seturile de date au fost analizate folosind software-ul BiaEval. În general s-au efectuat două experimente independente.
Constructele anticorpului bispecific DLL3xCD3 conform invenţiei au arătat afinităţi foarte mari faţă de DLL3 uman în domeniul subnanomolar (cu excepţia DLL3-13 având o valoare KD în domeniul nanomolar foarte scăzut cu o unitate). Legarea la DLL3 de macac a fost echilibrată, prezentând şi afinităţi în intervale similare. Valorile de afinitate, precum şi decalajul de afinitate calculat sunt prezentate în Tabelul 2.
Tabelul 2: Afinităţile constructelor anticorpului bispecific DLL3xCD3 la DLL3 uman şi de macac, determinate prin analiza Biacore, precum şi decalările de afinitate interspecifice calculate.
Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 KD hu DLL3 [nM] KD cyno DLL3 [nM] Decalaj de afinitate KD mac/KD hu DLL3-4 0,41 0,55 1,34 DLL3-5 0,82 1,03 1,26 DLL3-6 0,55 0,75 1,36 DLL3-7 0,19 0,29 1,52 DLL3-8 0,69 0,96 1,39 DLL3-9 0,35 0,54 1,54 DLL3-10 0,24 0,33 1,38 DLL3-13 1,74 5,55 3,19 DLL3-14 0,47 0,86 1,83 DLL3-15 0,45 0,69 1,53
Mai mult, legarea constructelor anticorpului bispecific atât la CD3 uman cât şi la CD3 de macac a fost confirmată într-un test Biacore într-un interval nanomolar redus de 2 cifre (datele nu sunt prezentate).
Exemplul 4
Analiza bazată pe Scatchard a afinităţii constructului anticorpului bispecific DLL3xCD3 cu DLL3 uman şi de macac pe celulele ţintă de antigen pozitive şi determinarea decalajului de afinitate interspecific
Afinităţile constructelor de anticorp bispecific DLL3xCD3 la celulele CHO transfectate cu DLL3 uman sau de macac au fost, de asemenea, determinate prin analiza Scatchard ca cea mai fiabilă metodă de măsurare a decalajelor de afinitate potenţiale între DLL3 uman şi de macac. Pentru analiza Scatchard, experimentele de legare a saturaţiei sunt efectuate folosind un sistem de detectare monovalentă pentru a determina cu precizie legarea monovalentă a constructelor de anticorp bispecific DLL3xCD3 la linia celulară respectivă.
2 x 104 celule din linia celulară respectivă (linia celulară CHO care exprimă DLL3 recombinant umană, linia celulară CHO care exprimă DLL3 de macac recombinant) au fost incubate fiecare cu 50 µl dintr-o serie de diluţie în tripletă (doisprezece diluţii la 1: 2) din constructul de anticorp bispecific DLL3xCD3 (până se ajunge la saturaţie) începând de la 10-20 nM urmată de 16 ore de incubaţie la 4°C sub agitare şi o etapă de spălare reziduală. Apoi, celulele au fost incubate încă o oră cu 30 µl dintr-o soluţie conjugată CD3xALEXA488. După o etapă de spălare, celulele au fost resuspendate în 150 µl tampon FACS conţinând 3,5% formaldehidă, incubate încă 15 minute, centrifugate, resuspendate în tampon FACS şi analizate folosind o maşină Cantoll FACS şi software-ul FACS Diva. Datele au fost generate din două seturi independente de experimente, fiecare folosind triplicate. Analiza respectivă Scatchard a fost calculată pentru a extrapola legarea maximă (Bmax). Concentraţiile de constructe de anticorp bispecific DLL3xCD3 la legarea a jumătate din maxim au fost determinate reflectând KD-urile respective. Valorile măsurătorilor triplicate au fost reprezentate grafic sub formă de curbe hiperbolice şi sub formă de curbe în formă de S pentru a demonstra variaţii de concentraţie adecvate de la legarea minimă la cea optimă.
Valorile descrise în Tabelul 3 au fost derivate din două experimente independente pentru fiecare construct de anticorp bispecific DLL3xCD3. Analiza Scatchard bazată pe celule a confirmat faptul că constructele anticorpului bispecific DLL3xCD3 conform invenţiei sunt subnanomolare în afinitate la DLL3 uman şi la DLL3 de mac şi prezintă un decalaj mic de afinitate interspecii cyno/umană în jurul a 1.
Tabelul 3: Afinităţile (KD) ale constructelor anticorpilor bispecifici DLL3xCD3 aşa cum s-a determinat în analiza Scatchard bazată pe celule cu decalajul de afinitate calculat KD de macac DLL3/KD DLL3 uman. Constructele anticorpului au fost măsurate în două experimente independente, fiecare folosind triplicate.
Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 Afinitate bazată pe celule hu DLL3 [nM] Afinitate pe bază de celule mac DLL3 [nM] Decalaj de afinitate KD mac/KD hu DLL3-4 0,39 0,24 0,6 DLL3-5 0,33 0,22 0,7 DLL3-6 0,33 0,23 0,7 DLL3-7 0,21 0,33 1,6 DLL3-8 0,18 0,34 1,9 DLL3-9 0,30 0,49 1,6 DLL3-10 0,37 0,32 0,8 DLL3-13 0,24 0,29 1,2 DLL3-14 0,53 0,51 1,0 DLL3-15 0,25 0,50 2,0
Exemplul 5
Legare bispecifică şi reactivitate încrucişată între specii
Pentru confirmarea legării la DLL3 şi CD3 uman şi la DLL3 şi CD3 cyno, constructele de anticorpi bispecifici conform invenţiei au fost testaţi prin citometrie în flux folosind
• celulele CHO transfectate cu DLL3 uman, cu o izoformă DLL3 umană artificială (caracterizată prin mutaţiile punctuale F172C şi L218P) şi, respectiv, cu DLL3 de macac,
• linia celulară de carcinom uman pulmonar DLL3 pozitiv SHP-77,
• Linia celulară de leucemie cu celule T umane care exprimă CD3 HPB-all (DSMZ, Braunschweig, ACC483) şi
• linia de celule T care exprimă CD3 cynomolgus LnPx 4119
Pentru citometrie în flux, 200.000 de celule din liniile celulare respective au fost incubate timp de 60 min la 4°C cu 50 µl de anticorp bispecific purificat la o concentraţie de 5 µg/ml. Celulele au fost spălate de două ori în PBS/2% FCS şi apoi incubate cu un anticorp intern de şoarece (2 µg/ml) specific pentru partea de legare CD3 a constructelor anticorpilor bispecifici timp de 30 de minute la 4°C. După spălare, anticorpii de şoarece legaţi au fost detectaţi cu un Fcy-PE anti-şoarece de capră (1: 100) timp de 30 de minute la 4°C. Probele au fost măsurate prin citometrie în flux. Celulele CHO netransfectate au fost utilizate ca martor negativ.
Rezultatele sunt prezentate în Figura 3. Constructele de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 conform invenţiei au colorat celule CHO transfectate cu DLL3 uman, izoforma DLL3 artificială şi cu DLL3 cyno şi au colorat, de asemenea, linia celulară SHP-77 de carcinom uman pulmonar DLL3 pozitiv uman (expresor natural). Liniile de celule umane şi cyno T care exprimă CD3 au fost, de asemenea, recunoscute de constructele de anticorpi bispecifici. Mai mult, nu a existat nici o colorare a celulelor de control negative (CHO netransfectat, date prezentate în Exemplul 6).
Exemplul 6
Confirmarea absenţei legării la paralogii umani
Paralogii DLL3 umani DLL1 şi DLL4 au fost transfectaţi stabil în celule CHO. Secvenţele paralogilor utilizate în prezentul exemplu sunt identificate în listarea secvenţei (SECV ID NR.: 283 şi 284). Expresia proteinelor a fost confirmată în analizele FACS cu anticorpi specifici pentru paralogii respectivi: Anticorpii au fost DLL1 MAB1818 anti-uman (R&D; 5 µg/ml), şi DLL4 MAB1506 anti-uman (R&D; 5 µg/ml) pentru DLL4.
Testul de citometrie în flux a fost efectuat aşa cum este descris în Exemplul 5, cu excepţia faptului că anticorpii de şoarece legaţi au fost detectaţi cu un FITC anti-şoarece de capră (1:100). Rezultatele sunt prezentate în Figura 4. Analiza a confirmat că niciunul dintre anticorpii bispecifici DLL3xCD3 din invenţie nu reacţionează încrucişat cu paralogii DLL3 umani DLL1 şi DLL4.
Exemplul 7
Identitate la linia germinală umană
Pentru a analiza identitatea/similitudinea secvenţei constructelor anticorpului cu genele germinale ale anticorpului uman, domeniile de legare DLL3 conform invenţiei au fost aliniate după cum urmează: VL complet, inclusiv toate CDR-urile, a fost aliniat; VH complet incluzând CDR-urile 1 şi 2, dar cu excepţia CDR3 a fost aliniat cu genele germinale ale anticorpilor umani (Vbaza). Mai multe detalii găsiţi în specificaţiile acestei aplicaţii. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 4 de mai jos:
Tabelul 4: Identitatea VH şi VL cu linia germinativă umană
Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 % identitate la linia germinativă umană [VH/VL] DLL3-4 96,9/93,3 DLL3-5 96,9/96,6 DLL3-6 96,9/96,6 DLL3-7 93,9/96,6 DLL3-8 94,8/96,6 DLL3-9 96,9/95,5 DLL3-10 91,9/95,5 DLL3-13 95,9/95,7 DLL3-14 94,9/94,6 DLL3-15 93,9/94,6
Exemplul 8
Activitate citotoxică
Potenţa constructelor anticorpului bispecific DLL3xCD3 conform invenţiei în redirecţionarea celulelor T efectoare împotriva celulelor ţintă care exprimă DLL3 a fost analizată în cinci teste de citotoxicitate in vitro:
• Potenţa constructelor anticorpului bispecific DLL3xCD3 în redirecţionarea celulelor T efectoare CD8+ umane stimulate împotriva celulelor CHO transfectate DLL3 umane a fost măsurată într-un test de eliberare a cromului 51 în 18 ore.
• Potenţa constructelor anticorpului bispecific DLL3xCD3 în redirecţionarea celulelor T efectoare CD8+ umane stimulate împotriva liniei celulare a carcinomului pulmonar uman DLL3 pozitiv SHP-77 a fost măsurată într-un test de eliberare de de crom 51 de 18 ore.
• Potenţa constructelor anticorpului bispecific DLL3xCD3 în redirecţionarea celulelor T în PBMC uman nestimulat împotriva celulelor CHO transfectate cu DLL3 uman a fost măsurată într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS de 48 de ore.
• Potenţa constructelor anticorpului bispecific DLL3xCD3 în redirecţionarea celulelor T în PBMC uman nestimulat împotriva liniei de celule umane DLP-pozitive SHP-77 a fost măsurată într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS de 48 de ore.
• Pentru confirmarea faptului că constructele de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 cu reacţie încrucişată sunt capabile să redirecţioneze celulele T de macac împotriva celulelor CHO transfectate cu DLL3 de macac, s-a efectuat un test de citotoxicitate bazat pe FACS de 48 de ore cu o linie de celule T de macac ca celule T efectoare.
Exemplul 8.1
Test de eliberare a cromului cu celule T umane stimulate
Celulele T stimulate îmbogăţite pentru celulele T CD8+ au fost obţinute aşa cum este descris în cele ce urmează. O cutie Petri (145 mm diametru, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) a fost acoperită cu un anticorp specific anti-CD3 disponibil comercial (OKT3, Orthoclone) într-o concentraţie finală de 1 µg/ml timp de 1 oră la 37°C. Proteina nelegată a fost îndepărtată printr-o etapă de spălare cu PBS. 3 - 5 x107 PBMC uman au fost adăugate la placa Petri preacoperită în 120 ml RPMI 1640 cu glutamină stabilizată/10% FCS/IL-2 20 U/ml (Proleukin®, Chiron) şi stimulate timp de 2 zile. În a treia zi, celulele au fost colectate şi spălate o dată cu RPMI 1640. IL-2 a fost adăugat la o concentraţie finală de 20 U/ml şi celulele au fost cultivate din nou timp de o zi în acelaşi mediu de cultură celulară ca mai sus. limfocite T citotoxice CD8+ (CTL) au fost îmbogăţite prin depleţie cu celule T CD4+ şi celule NK CD56+ utilizând Dynal-Beads conform protocolului producătoruluil.
Celulele ţintă CHO transfectate cu DLL3 Cyno sau DLL3 uman au fost spălate de două ori cu PBS şi marcate cu 11,1 MBq 51Cr într-un volum final de 100 µl RPMI cu 50% FCS timp de 60 minute la 37°C. Ulterior, celulele ţintă marcate au fost spălate de 3 ori cu 5 ml RPMI şi apoi utilizate în testul de citotoxicitate. Testul a fost efectuat într-o placă cu 96 de godeuri într-un volum total de 200 µl RPMI suplimentat cu un raport E: T de 10: 1. S-a utilizat o concentraţie iniţială de 0,01 - 1 µg/ml de anticorp bispecific purificat şi diluţii de trei ori ale acestuia. Timpul de incubaţie pentru test a fost de 18 ore. Citotoxicitatea a fost determinată ca valori relative ale cromului eliberat în supernatant în raport cu diferenţa de liză maximă (adăugarea de Triton-X) şi liză spontană (fără celule efectoare). Toate măsurătorile au fost efectuate în patru exemplare. Măsurarea activităţii cromului în supernatante a fost efectuată într-un contor gamma Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Köln, Germania). Analiza rezultatelor a fost efectuată cu Prism 5 pentru Windows (versiunea 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, SUA). Valorile EC50 calculate prin programul de analiză din curbele sigmoidale de răspuns la doză au fost utilizate pentru compararea activităţii citotoxice.
Exemplul 8.2
Potenţa de redirecţionare a celulelor T efectoare umane stimulate împotriva celulelor CHO transfectate cu DLL3 umane
Activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 conform invenţiei a fost analizată într-un test de citotoxicitate cu eliberare de crom 51 (51Cr) folosind celule CHO transfectate cu DLL3 uman ca celule ţintă şi a stimulat celulele T CD8+ umane ca celule efectoare. Experimentul a fost realizat aşa cum este descris în Exemplul 8.1.
Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 5. Constructele de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 au arătat o activitate citotoxică foarte puternică împotriva celulelor CHO transfectate cu DLL3 umane în intervalul picomolar de 1 cifră.
Tabelul 5: Valorile EC50 [pM] ale constructelor anticorpului bispecific DLL3xCD3 analizate într-un test de citotoxicitate eliberează 51-crom (51Cr) utilizând celule CHO transfectate cu DLL3 uman ca celule ţintă şi au stimulat celulele T CD8 umane ca celule efectoare.
Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 EC50 [pM] DLL3-4 3,8 DLL3-5 4,2 DLL3-6 2,1 DLL3-7 2,2 DLL3-8 1,2 DLL3-9 1,2 DLL3-10 1,4 DLL3-13 1,8 DLL3-14 5,4 DLL3-15 9,8
Exemplul 8.3
Potenţa de redirecţionare a celulelor T efectoare umane stimulate împotriva liniei celulare SHP-77 a carcinomului pulmonar uman DLL3 pozitiv
Activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 a fost analizată într-un test de citotoxicitate cu eliberare a 51-crom (51Cr) utilizând linia celulară SHP-77 de carcinom pulmonar uman pozitiv DLL3 ca sursă de celule ţintă şi a stimulat celulele T CD8 + umane ca celule efectoare. Testul a fost efectuat aşa cum este descris în Exemplul 8.1.
În conformitate cu rezultatele testelor de eliberare a crom 51 cu limfocite T CD8 + umane îmbogăţite stimulate ca celule efectoare şi celule CHO transfectate DLL3 umane ca celule ţintă, constructele anticorpului bispecific DLL3xCD3 ale prezentei invenţii sunt, de asemenea, puternice în activitatea citotoxică împotriva celulelor expresorului natural ţintă (vezi Tabelul 6).
Exemplul 8.4
Test de citotoxicitate bazat pe FACS cu PBMC uman nestimulat
Izolarea celulelor efectoare
Celulele mononucleare din sângele periferic uman (PBMC) au fost preparate prin centrifugare cu gradient de densitate Ficoll din preparate de limfocite îmbogăţite (straturi tamponate), un produs secundar al băncilor de sânge care colectează sânge pentru transfuzii. Straturile Buffy au fost furnizate de o bancă locală de sânge, iar PBMC au fost preparate în aceeaşi zi de recoltare a sângelui. După centrifugarea densităţii Ficoll şi spălări extinse cu PBS Dulbecco (Gibco), eritrocitele rămase au fost îndepărtate din PBMC prin incubare cu tampon de liză eritrocitară (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 100 µM EDTA). Trombocitele au fost îndepărtate prin supernatant la centrifugarea PBMC la 100 x g. Limfocitele rămase cuprind în principal limfocitele B şi T, celulele NK şi monocitele. PBMC s-au păstrat în cultură la 37°C/5% CO2 în mediu RPMI (Gibco) cu 10% FCS (Gibco).
Depleţia celulelor CD14+ şi CD56+
Pentru epuizarea celulelor CD14+, s-au folosit MicroBeads CD14 umane (Milteny Biotec, MACS, # 130-050-201), pentru epuizarea celulelor NK CD56 MicroBeads umane (MACS, # 130-050-401). PBMC au fost numărate şi centrifugate timp de 10 minute la temperatura camerei cu 300 x g. Supernatantul a fost aruncat şi peleta de celule resuspendată în tampon de izolare MACS [80 µl/107 celule; PBS (Invitrogen, # 20012-043), 0,5% (v/v) FBS (Gibco, # 10270-106), 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich, # E-6511)]. CD14 MicroBeads şi CD56 MicroBeads (20 µL/107 celule) au fost adăugate şi incubate timp de 15 minute la 4 - 8°C. Celulele au fost spălate cu tampon de izolare MACS (1-2 ml/107 celule). După centrifugare (vezi mai sus), supernatantul a fost aruncat şi celulele resuspendate în tampon de izolare MACS (500 µl/108 celule). Celulele negative CD14/CD56 au fost apoi izolate folosind coloane LS (Miltenyi Biotec, # 130-042-401). PBMC fără celule CD14 +/CD56 + au fost cultivate în mediu complet RPMI adică RPMI1640 (Biochrom AG, # FG1215) suplimentat cu 10% FBS (Biochrom AG, # S0115), 1x aminoacizi neesenţiali (Biochrom AG, # K0293), Tampon 10 mM Hepes (Biochrom AG, # L1613), piruvat de sodiu 1 mM (Biochrom AG, # L0473) şi 100 U/ml penicilină/streptomicină (Biochrom AG, # A2213) la 37°C într-un incubator după necesar.
Etichetarea celulei ţintă
Pentru analiza lizei celulare în testele de citometrie în flux, colorantul cu membrană fluorescentă DiOC18 (DiO) (Molecular Probes, # V22886) a fost utilizat pentru a eticheta celulele CHO transfectate DLL3-umane sau de macac DLL3 ca celule ţintă şi să le distingă de celulele efectoare. Pe scurt, celulele au fost recoltate, spălate o dată cu PBS şi ajustate la 106 celule/ml în PBS conţinând 2% (v/v) FBS şi colorantul membranar DiO (5 µl/106 celule). După incubare timp de 3 minute la 37°C, celulele au fost spălate de două ori în mediu RPMI complet şi numărul de celule ajustat la 1,25 x 105 celule/ml. Vitalitatea celulelor a fost determinată folosind 0,5% (v/v) soluţie izotonică de EosinG (Roth, # 45380).
Analiza bazată pe citometrie de flux
Această analiză a fost concepută pentru a cuantifica liza celulelor CHO transfectate cu DLL3 cyno sau umane în prezenţa diluţiilor seriale ale constructelor de anticorpi bispecifici DLL3. Au fost amestecate volume egale de celule ţintă marcate cu DiO şi celule efectoare (adică PBMC w/o celule CD14+), rezultând un raport de celule E:T de 10:1. 160 µl din această suspensie au fost transferate în fiecare godeu al unei plăci cu 96 de godeuri. S-au adăugat 40 µl de diluţii seriale ale constructelor de anticorp bispecific DLL3xCD3 şi un control negativ bispecific (un construct de anticorp bispecific bazat pe CD3 care recunoaşte un antigen ţintă irelevantă) sau mediu complet RPMI ca un control negativ suplimentar. Reacţia citotoxică mediată de anticorpi bispecifici a continuat timp de 48 de ore într-un incubator umidificat cu 7% CO2. Apoi celulele au fost transferate pe o nouă placă cu 96 de godeuri şi pierderea integrităţii membranei celulare ţintă a fost monitorizată prin adăugarea de iodură de propidiu (PI) la o concentraţie finală de 1 µg/ml. PI este un colorant impermeabil la membrană care în mod normal este exclus din celulele viabile, în timp ce celulele moarte îl preiau şi devin identificabile prin emisie fluorescentă.
Probele au fost măsurate prin citometrie de flux pe un instrument FACSCanto II şi analizate prin software-ul FACSDiva (ambele de la Becton Dickinson). Celulele ţintă au fost identificate ca fiind celule DiO-pozitive. Celulele ţintă PI-negative au fost clasificate drept celule ţintă vii. Procentul de citotoxicitate a fost calculat conform următoarei formule:
n = numărul de evenimente
Folosind software-ul GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), procentul de citotoxicitate a fost reprezentat în funcţie de concentraţiile corespunzătoare de constructe de anticorpi bispecifici. Curbele de răspuns la doză au fost analizate cu cele patru modele de regresie logistică parametrice pentru evaluarea curbelor de răspuns la doză sigmoidă cu panta fixă pe vârf şi au fost calculate valorile EC50.
Exemplul 8.5
Potenţa de redirecţionare a PBMC uman nestimulat împotriva celulelor CHO transfectate DLL3 umane
Activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 a fost analizată într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS utilizând celule CHO transfectate cu DLL3 uman ca celule ţintă şi PBMC uman nestimulat ca celule efectoare. Testul a fost efectuat aşa cum este descris în Exemplul 8.4 de mai sus.
Rezultatele testelor de citotoxicitate bazate pe FACS cu PBMC uman nestimulat ca celule efectoare şi celule CHO transfectate DLL3 umane ca ţinte sunt prezentate în Tabelul 7.
De aşteptat, valorile EC50 au fost în general mai mari în testele de citotoxicitate cu PBMC nestimulat ca celule efectoare, comparativ cu testele de citotoxicitate folosind celule T CD8+ umane stimulate (vezi Exemplul 8.2).
Exemplul 8.6
Potenţa de redirecţionare a PBMC uman nestimulat împotriva liniei celulare SHP-77 a carcinomului pulmonar DLL3-pozitiv
Activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 a fost, de asemenea, analizată într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS utilizând linia celulară SHP-77 de carcinom pulmonar DLL3 uman pozitiv ca sursă de celule ţintă şi PBMC uman nestimulat ca celule efectoare. Testul a fost efectuat aşa cum este descris în Exemplul 8.4 de mai sus. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 8.
Exemplul 8.7
Potenţa de redirecţionare a celulelor T de macac împotriva celulelor CHO care exprimă DLL3 de macac
În final, activitatea citotoxică a constructelor de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 a fost analizată într-un test de citotoxicitate bazat pe FACS folosind celule CHO transfectate cu macac (cyno) DLL3 ca celule ţintă şi linia 4119LnPx de celule T de macac (Knappe şi colab. Blood 95: 3256- 61 (2000)) ca sursă de celule efectoare. Marcarea celulelor ţintă a celulelor CHO transfectate cu DLL3 de macac şi analiza bazată pe citometrie în flux a activităţii citotoxice a fost efectuată aşa cum s-a descris mai sus.
Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 9. Celulele T de macac din linia celulară 4119LnPx au fost induse pentru a distruge eficient celulele CHO transfectate cu DLL3 de macac prin construct de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 conform invenţiei. Constructele anticorpului au prezentat puternice valori EC50 picomolare din 2 cifre în acest test, confirmând că sunt foarte active în sistemul de macac.
Exemplul 9
Conversia monomerului în dimer după (i) trei cicluri de îngheţ/dezgheţ şi (ii) 7 zile de incubaţie la 250 µg/ml
Constructul de anticorp bispecific monomeric DLL3xCD3 a fost supus unor condiţii de stres diferite, urmate de SEC de înaltă performanţă pentru a determina procentul de construct de anticorp monomeric iniţial, care fusese transformat în construct de anticorp dimeric.
(i) 25 µg de construct de anticorp monomeric au fost ajustate la o concentraţie de 250 µg/ml cu tampon de formulare generic şi apoi congelate la -80°C timp de 30 min urmate de decongelare timp de 30 min la temperatura camerei. După trei cicluri de îngheţ/dezgheţ, conţinutul de dimer a fost determinat de HP-SEC.
(ii) 25 µg de construct de anticorp monomeric au fost ajustate la o concentraţie de 250 µg/ml cu tampon generic de formulare urmat de incubare la 37°C timp de 7 zile. Conţinutul de dimeri a fost determinat de HP-SEC.
O coloană SEC de înaltă rezoluţie TSK Gel G3000 SWXL (Tosoh, Tokyo-Japonia) a fost conectată la un Äkta Purifier 10 FPLC (GE Lifesciences) echipat cu un autosampler A905. Echilibrarea coloanei şi tamponul de funcţionare au constat din 100 mM KH2PO4 - 200 mM Na2SO4 ajustat la pH 6,6. Soluţia de anticorp (25 µg proteină) a fost aplicată pe coloana echilibrată şi eluarea a fost efectuată la un debit de 0,75 ml/min la o presiune maximă de 7 MPa. Întreaga rulare a fost monitorizată la 280, 254 şi 210 nm absorbanţă optică. Analiza a fost făcută prin integrarea maximă a semnalului de 210 nm înregistrat în foaia de evaluare a rulării software-ului Äkta Unicorn. Conţinutul de dimeri a fost calculat prin împărţirea ariei vârfului dimerului la aria totală a monomerului plus vârful dimerului.
Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 10 de mai jos. Constructele anticorpului bispecific DLL3xCD3 conform invenţiei au prezentat procente de dimeri de 0,0% după trei cicluri de îngheţ/dezgheţ şi procente de dimeri de ≤ 2% după 7 zile de incubaţie la 37°C.
Tabelul 10: Procentul de construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 monomeric versus dimeric, determinat prin cromatografie de excludere a mărimii de înaltă performanţă (HP-SEC).
Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 Procentul de dimer după trei cicluri de îngheţ/dezgheţ Procentul de dimer după 7 zile de incubaţie la 37°C DLL3-4 0,7 0,0 DLL3-5 1,5 0,0 DLL3-6 1,3 0,0 DLL3-7 1,2 0,0 DLL3-8 1,5 0,0 DLL3-9 1,8 0,0 DLL3-10 0,6 0,0 DLL3-13 1,6 0,0 DLL3-14 0,4 0,0 DLL3-15 1,2 0,0
Exemplul 10
Termostabilitate
Temperatura de agregare a anticorpilor a fost determinată după cum urmează: 40 µl de soluţie de construct de anticorp la 250 µg/ml au fost transferaţi într-o cuvă de unică folosinţă şi plasaţi într-un dispozitiv Wyatt Dynamic Light Scattering DynaPro Nanostar (Wyatt). Proba a fost încălzită de la 40°C la 70°C la o rată de încălzire de 0,5°C/min, cu achiziţie constantă a razei măsurate. Creşterea razei indicând topirea proteinei şi agregarea a fost utilizată de pachetul software livrat cu dispozitivul DLS pentru a calcula temperatura de agregare a constructului anticorpului.
Toate constructele de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 testate conform invenţiei au prezentat stabilitate termică cu temperaturi de agregare ≥45°C, aşa cum se arată în Tabelul 11 de mai jos. Grupul de constructe de anticorpi de legare la un epitop al DLL3 care este cuprins în regiunea EGF-4 (aşa cum este descris în SECV ID NR.: 259) au avut chiar şi o stabilitate termică de ≥50°C, mai precis, de 2: 54°C.
Tabelul 11: Termostabilitatea constructelor de anticorpi bispecifici, determinată de DLS (dispersie dinamică a luminii)
Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 Termostabilitate (agregare DLS°C) DLL3-4 59,3 DLL3-5 45,4 DLL3-6 58,8 DLL3-7 58,2 DLL3-8 49,8 DLL3-9 49,6 DLL3-10 52,9 DLL3-13 54,0 DLL3-14 57,0 DLL3-15 56,3
Exemplul 11
Stabilitate după incubare timp de 24 de ore în plasmă umană
Constructele de anticorpi bispecifici purificate au fost incubate la un raport de 1: 5 într-un bazin de plasmă umană la 37°C timp de 96 ore la o concentraţie finală de 2-20 µg/ml. După incubaţia plasmatică, constructele anticorpului au fost comparate într-un test de eliberare de crom 51 cu celule T CD8 + umane îmbogăţite stimulate şi celule CHO transfectate cu DLL3 umane la o concentraţie iniţială de 0,01-0,1 µg/ml şi cu un efector pentru celula ţintă (E: T) raport de 10: 1 (test aşa cum este descris în Exemplul 8.1). Constructele de anticorpi bispecifici proaspăt dezgheţate neincubate au fost incluse ca martori.
Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 12 de mai jos; rezultatele exemplare pentru cele două constructe de anticorpi DLL-4 şi DLL-14 sunt, de asemenea, prezentate în Figura 5. Toate constructele testate de anticorpi au avut o stabilitate plasmatică foarte favorabilă (EC50 plasma/EC50 control) de ≤ 2,5. Grupul de constructe de anticorpi de legare la un epitop al DLL3 care este cuprins în regiunea EGF-4 (aşa cum este descris în SECV ID NR.: 259) au avut chiar şi o stabilitate plasmatică de ≤ 1,5, mai precis, de ≤ 1,1.
Tabelul 12: Valorile EC50 ale constructelor anticorpului cu şi fără incubaţie plasmatică şi valoarea calculată plasmă/control
Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 EC50 [pM] w/plasmă fără plasmă Raport plasmă-control (control EC50 plasmă/control EC50) DLL3-4 3,6 3,8 0,9 DLL3-5 5,4 4,2 1,3 DLL3-6 4,8 2,1 2,3 DLL3-7 2,7 2,2 1,2 DLL3-8 1,0 1,2 0,8 DLL3-9 1,2 1,2 1,0 DLL3-10 2,5 1,4 1,8 DLL3-13 2,0 1,8 1,1 DLL3-14 4,8 5,4 0,9 DLL3-15 7,8 9,8 0,8
Exemplul 12
Turbiditate la concentraţia de anticorpi de 2500 µg/ml
1 ml de soluţie de construct de anticorp purificat cu o concentraţie de 250 µg/ml a fost concentrată prin unităţi de concentraţie de centrifugare la 2500 µg/ml. După 16 ore de stocare la 5°C, turbiditatea soluţiei de anticorp a fost determinată prin măsurarea absorbţiei optice OD340 nm împotriva tamponului de formulare generic.
Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 13 de mai jos. Toate constructele de anticorpi testate au o turbiditate foarte favorabilă de ≤ 0,1, cu excepţia unei construct cu o turbiditate uşor peste 0,1. Grupul de constructe de anticorpi de legare la un epitop al DLL3 care este cuprins în regiunea EGF-4 (aşa cum este descris în SECV ID NR.: 259) au chiar o turbiditate ≤ 0,08.
Tabelul 13: Turbiditatea constructelor anticorpului după concentrare la 2,5 mg/ml peste noapte
Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 Turbiditate la 2500 µg/ml [OD340] DLL3-4 0,073 DLL3-5 0,106 DLL3-6 0,080 DLL3-7 0,089 DLL3-8 0,069 DLL3-9 0,085 DLL3-10 0,091 DLL3-13 0,075 DLL3-14 0,073 DLL3-15 0,078
Exemplul 13
Omogenitatea proteinelor prin cromatografie cu schimb de cationi de înaltă rezoluţie
Omogenitatea proteinelor constructelor de anticorpi conform invenţiei a fost analizată prin cromatografie cu schimb de cationi de înaltă rezoluţie CIEX.
50 µg de monomer construct de anticorp au fost diluaţi cu 50 ml tampon de legare A (20 mM dihidrogen fosfat de sodiu, 30 mM NaCl, 0,01% octanat de sodiu, pH 5,5) şi 40 ml din această soluţie au fost aplicaţi la un 1 ml BioPro coloană SP-F (YMC, Germania) conectată la un dispozitiv Micro FPLC Äkta (GE Healthcare, Germania). După legarea probei, a fost efectuată o etapă de spălare cu tampon de legare suplimentar. Pentru eluarea proteinelor, s-a aplicat un gradient de sare în creştere liniar folosind tampon B (20 mM dihidrogen fosfat de sodiu, 1000 mM NaCI, 0,01% octanat de sodiu, pH 5,5) până la 50% procent tampon B pe 10 volume de coloane. Întreaga rulare a fost monitorizată la 280, 254 şi 210 nm absorbanţă optică. Analiza a fost făcută prin integrarea maximă a semnalului de 280 nm înregistrat în foaia de evaluare a rulării software-ului Äkta Unicorn.
Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 14 de mai jos. Toate constructele de anticorpi testate au o omogenitate foarte favorabilă de ≥ 80% (aria de sub curba (= ASC) a vârfului principal). Grupul de constructe de anticorpi de legarea la un epitop al DLL3 care este cuprins în regiunea EGF-3 (aşa cum este descris în SECV ID NR.: 258) au chiar o omogenitate ≥ 90%.
Tabelul 14: Omogenitatea proteinelor în constructele anticorpului (% AUC de vârf principal)
Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 Omogenitatea proteinelor % ASC a vârfului principal DLL3-4 96 DLL3-5 100 DLL3-6 95 DLL3-7 93 DLL3-8 100 DLL3-9 93 DLL3-10 90 DLL3-13 100 DLL3-14 100 DLL3-15 83
Exemplul 14
Hidrofobicitatea suprafeţei măsurată prin butil HIC
Hidrofobicitatea de suprafaţă a constructelor de anticorpi bispecifici conform invenţiei a fost testată în cromatografie de interacţiune hidrofobă HIC în modul flux.
50 µg de monomer de construct de anticorpi au fost diluaţi cu tampon generic de formulare până la un volum final de 500 µl (10 mM acid citric, 75 mM lizină HCI, 4% trehaloză, pH 7,0) şi aplicate pe o coloană FF de 1 ml de butil sefaroză (GE Healthcare, Germania) conectat la un sistem FPLC Äkta Purifier (GE Healthcare, Germania). Întreaga rulare a fost monitorizată la 280, 254 şi 210 nm absorbanţă optică. Analiza a fost făcută prin integrarea maximă a semnalului de 280 nm înregistrat în foaia de evaluare a rulării software-ului Äkta Unicorn. Comportamentul de eluare a fost evaluat prin compararea ariei şi vitezei de creştere şi declin a semnalului proteic, indicând astfel puterea de interacţiune a fuziunii de albumină BiTE cu matricea.
Constructele anticorpului au avut un comportament bun de eluare, care a fost în mare parte rapid şi complet.
Exemplul 15
Decalajul de potenţial între monomer şi izoforma dimerică a constructelor de anticorpi bispecifici
Pentru a determina diferenţa de activitate citotoxică între monomer şi izoforma dimerică a constructelor individuale de anticorp bispecific DLL3xCD3 (denumită decalaj de potenţă), a fost efectuată o analiză de citotoxicitate cu eliberare de crom 51 de 18 ore, aşa cum este descris mai sus (Exemplul 8.1), cu constructul de anticorp bispecific purificat monomer şi dimer. Celulele efectoare au fost îmbogăţit stimulate cu celule T CD8 + umane. Celulele ţintă au fost celule CHO transfectate cu DLL3 hu. Raportul efector-celulă ţintă (E:T) a fost de 10:1. Decalajul de potenţă a fost calculat ca raport între valorile EC50.
Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 15 de mai jos; rezultatele exemplare pentru cele două constructe de anticorpi DLL-4 şi DLL-14 sunt, de asemenea, prezentate în Figura 6. Decalajul de potenţă al constructelor de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 testate a fost între 0,2 şi 1,0. Prin urmare, nu există un dimer substanţial mai activ în comparaţie cu monomerul respectiv.
Tabelul 15: Decalajul de potenţă între monomer şi izoforma dimerică
Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3 Monomer EC50 [pM] Dimer EC50 [pM] Raport EC50 monomer/dimer EC50 DLL3-4 3,8 5,7 0,7 DLL3-5 4,2 11 0,4 DLL3-6 2,1 13 0,2 DLL3-7 2,2 4,2 0,5 DLL3-8 1,2 3,4 0,4 DLL3-9 1,2 3,8 0,3 DLL3-10 1,4 1,4 1,0 DLL3-13 1,8 3,0 0,6 DLL3-14 5,4 8,7 0,6 DLL3-15 9,8 25 0,4
Exemplul 16
Test de internalizare in vitro
S-au măsurat modificările potenţei constructului de anticorp bispecific DLL3xCD3 ca funcţie de preincubare a constructului pe celulele ţintă în absenţa celulelor T. Dacă constructul anticorpului este interiorizat, acesta ar trebui să fie supus degradării lizozomale. Concentraţia eficientă ar trebui să scadă în timp şi, astfel, potenţa aparentă ar trebui să scadă şi ea. Efectul este observat cu alte ţinte, pentru care acesta este un fenomen cunoscut, dar nu s-a observat nici un impact cu constructul de anticorp bispecific DLL3xCD3. Testul a fost efectuat după cum urmează:
Celulele T au fost numărate şi diluate la o concentraţie de 1 x 105 /ml în mediu de testare. Celulele SHP-77 au fost numărate şi placate la 2500 celule per godeu (cpw). Constructul anticorpului a fost diluat în serie 1:2 (cu Bravo), la o concentraţie iniţială de 100 nM. Constructul anticorpului a fost adăugat la plăcile de testare a culturii pentru 0 oră, 1 oră sau 2 ore de incubaţie înainte de adăugarea celulelor T. Apoi celulele T au fost placate la 25000 cpw, şi testul a fost incubat timp de 48 de ore la 37°C. Supravieţuirea celulei SHP-77 a fost analizată cu sistemul Steady-Glo® (25 µl/godeu). Rezultatele sunt prezentate în Figura 7 şi nu sugerează nici o internalizare semnificativă a constructului anticorpului DLL3-4 x CD3 (I2C).
Exemplul 17
Studiu de vărsare
Pentru a analiza dacă activitatea citotoxică a constructelor anticorpului bispecific DLL3xCD3 conform invenţiei este semnificativ afectată de prezenţa DLL vărsat, a fost efectuată următoarea analiză: Celulele T au fost numărate şi diluate la o concentraţie de 1 x 105/ml în mediu de testare. Celulele SHP-77 au fost numărate şi diluate la o concentraţie de 1,25 x 105/ml în mediu de testare cu concentraţii crescânde de DLL3 solubil între 0,3 nM şi 12 nM. Celulele SHP-77 au fost placate la 2500 celule per godeu (cpw), iar celulele T au fost adăugate la 25000 cpw. Constructul anticorpului a fost diluat în serie 1: 2 (cu Bravo) şi adăugat la testul de cultură (cu Bravo). Incubaţia a avut loc timp de 48 de ore la 37°C. Supravieţuirea celulei SHP-77 a fost analizată cu sistemul Steady-Glo® (25 µl/godeu).
Exemplul 18
Studiu de eficacitate a xenogrefelor de şoarece
Activitatea antitumorală a unui construct de anticorp bispecific HLE DLL3xCD3 (SECV ID NR.: 517) a fost testat într-un model de şoareci femele NOD/SCID care au fost injectaţi subcutanat în ziua 1 a studiului cu 5x106 celule DLL3 umane SCLC (SHP-77 luc) sau 5x106 celule de melanom DLL3 pozitive umane (WM 266-4). Celulele efectoare (2x107celule T CD3 + umane vii expandate şi activate in vitro) au fost injectate intraperitoneal în ziua 12. Începutul tratamentului a fost în ziua 16 (WM 266-4) sau în ziua 18 (SHP-77 luc). Constructul anticorpului a fost administrat de patru ori la fiecare cinci zile (q5dx4) prin i.v. injecţii în bolus. Grupurile de tratament au fost după cum urmează:
• model SCLC (SHP-77 luc)/7 şoareci per group
o Grupa tratată de vehicul cu celule T
o un construct de anticorp bispecific DLL3xCD3: 10 mg/kg per administrare
• Model de melanom (WM266-4)/9 şoareci per grup
o Grupa tratată cu vehicul cu celule T
o Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3: 10 mg / kg per administrare
o Construct de anticorp bispecific DLL3xCD3: 2 mg/kg per administrare
Tumorile au fost măsurate prin etrier în timpul studiului şi progresul evaluat prin compararea intergrupului volumelor tumorale (TV). Inhibarea creşterii tumorii T/C [%] în ziua x este determinată prin calcularea volumului tumorii ca T/C (%) = 100 x (TV median al grupului analizat)/(TV median al grupului de control) şi valorile calculate sunt descrise în următorul tabel 16:
Tabelul 16: Valorile T/C ale studiilor xenogrefelor de şoarece cu celule SHP-77 luc şi celule WM266-4
Ziua de studiu T/C (%) model SHP-77 10 mg/kg T/C (%) model WM266-4 10 mg/kg T/C (%) model WM266-4 2 mg/kg 15 103 101 101 17 92 76 77 20 64 42 47 23 50 36 38 26 52 31 35 29 34 46 40 31 33 56 55 33 30 64 75 36 24 fără fără 38 19 fără fără
Rezultatele sunt prezentate în plus în Figura 8A şi 8B. Inhibarea semnificativă a creşterii tumorii a fost prezentată în ambele modele tumorale şi la ambele niveluri de doză testate de 2 şi 10 mg/kg.
Exemplul 19
Studiu de toxicologie exploratorie pe cyno
S-a efectuat un studiu de toxicologie exploratorie cu un construct de anticorp bispecific extins DLL3xCD3 fără timp de înjumătăţire (SECV ID NR.: 554). Trei maimuţe femele cynomolgus au fost dozate prin perfuzie i.v. continuu timp de 16 zile (5, 15 şi 45 µg/kg/zi timp de 3 zile fiecare, urmată de 100 µg/kg/zi timp de 7 zile). Nu au fost observaţii clinice legate de articolele de testare, modificări ale temperaturii corporale, consumului de alimente sau greutăţii corporale.
În concordanţă cu aşteptările pentru farmacologia unui construct de anticorp bispecific DLL3xCD3, populaţiile de limfocite T circulante (limfocite T totale, limfocite T-helper şi citotoxice T, celule NK, limfocite B şi limfocite T activate CD25 +) prima zi de dozare şi a rămas mai mică pe toată durata studiului la toate animalele. Markerii de activare (CD69 şi CD25 pe celulele T activate) au fost crescuţi în ziua 1, dar nu la momentele ulterioare ale studiului.
Pentru a rezuma, constructul de anticorp bispecific DLL3xCD3 a fost foarte bine tolerat chiar şi la cea mai mare doză testată (100 µg/kg/zi,> 300 x EC50).
Exemplul 20
Studii PK cyno
S-a efectuat un studiu PK cyno cu maimuţe masculi naivi cynomolgus. Trei constructe de anticorp bispecific diferite DLL3xCD3 (I2C) fuzionate cu albumină (DLL3-4, DLL3-6 şi DLL3-14) au fost administrate ca bolus unic i.v. la o concentraţie de 12 µg/kg. Pentru fiecare dintre molecule a fost utilizat un grup de două animale.
Un studiu separat PK cyno a fost realizat în aceleaşi condiţii, dar cu DLL3-4 în diferite versiuni de fuziune Fc.
Probele de sânge au fost colectate pre-doză şi la 0,05, 0,5, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240 şi 336 ore după doză. Serul a fost preparat pentru determinarea concentraţiilor serice ale moleculelor într-un test imunologic. Testul a fost realizat prin captarea constructelor anticorpului prin fragmentul lor ţintă, în timp ce un anticorp îndreptat împotriva părţii de anticorp care leagă CD3 a fost utilizat pentru detectare. Profilele serice de concentraţie-timp au fost utilizate pentru a determina parametrii PK. Parametrii farmacocinetici au fost determinaţi utilizând metode standard de analiză necompartimentală (NCA). Au fost evaluaţi următorii parametri PK: AUCinf (zona sub curba concentraţiei serice-timp), Vss (volumul de distribuţie la starea de echilibru), CL (clearance sistemic) şi terminalul t1/2 (timpul de înjumătăţire terminal). Pentru toate constructele de anticorpi, nivelurile serice au fost cuantificabile pentru toate momentele de timp la toate animalele după administrarea lor. Nu s-au făcut observaţii clinice la nici unul dintre animalele tratate.
Farmacocinetica constructelor de anticorpi testate este prezentată în Figura 9, iar parametrii PK sunt rezumaţi ca medie de n = 2 în tabelul 17 de mai jos.
Constructele fuzionate cu albumină au prezentat un profil PK favorabil, în concordanţă cu un program de dozare o dată sau de două ori pe săptămână la un pacient uman. S-a observat un profil PK şi mai favorabil care susţine o dată pe săptămână o doză sau chiar o dată la două săptămâni, cu un construct de fuziune Fc (scFc).
Tabelul 17: Parametrii farmacocinetici ai variantelor HLE ale constructelor de anticorpi bispecifici DLL3xCD3 la maimuţele cynomolgus
Construct de anticorp AUCinf [ng * h / ml] Vss [ml/kg] CL [ml/h/kg] t1/2 [h] DLL3-4 x I2C HALB 20,669 70 0,58 98 DLL3-6 x I2C HALB 20,228 67 0,59 103 DLL3-14 x I2C HALB 21,597 107 0,55 154 DLL3-4 x I2C scFc 29,746 118 0,40 213 DLL3-4 (cc) x I2C scFc 24,769 144 0,48 234 DLL3-4 x I2C hetero Fc 14,639 166 0,82 173
Tabelul 18: Lista de secvenţe
SECV ID NR epitop DLL3 Denumire Format/Sursă Secvenţă de aminoacizi 1 DLL3-1 VH CDR1 DYGIH 2 DLL3-1 VH CDR2 VISYHGSNKYYARSVKG 3 DLL3-1 VH CDR3 EIPFGMDV 4 DLL3-1 VL CDR1 RSSQSLLHSDGYNYLD 5 DLL3-1 VL CDR2 LGSNRAS 6 DLL3-1 VL CDR3 MQALQTPLT 7 DLL3-1 VH 8 DLL3-1 VL 9 N-term. DLL3-1 scFv 10 DLL3-1 xI2C moleculă bispecifică 11 DLL3-2 VH CDR1 GYYMH 12 DLL3-2 VH CDR2 WINPNSGDTNYAQKFQG 13 DLL3-2 VH CDR3 DANIAALDAFEI 14 DLL3-2 VL CDR1 RASQSISSYLN 15 DLL3-2 VL CDR2 AASSLQS 16 DLL3-2 VL CDR3 QQSYSTPLT 17 DLL3-2 VH 18 DLL3-2 VL 19 N-term. DLL3-2 scFv 20 DLL3-2 xI2C moleculă bispecifică 21 DLL3-3 VH CDR1 SYGMH 22 DLL3-3 VH CDR2 VISYHGRDTYYARSVKG 23 DLL3-3 VH CDR3 DGATVTSYYYSGMDV 24 DLL3-3 VL CDR1 RASQGISNYLA 25 DLL3-3 VL CDR2 LASSLQS 26 DLL3-3 VL CDR3 QQYNFYPFT 27 DLL3-3 VH 28 DLL3-3 VL 29 EGF-1 DLL3-3 scFv 30 DLL3-3 xI2C bispecifică moleculă 31 DLL3-4 VH CDR1 SYYWS 32 DLL3-4 VH CDR2 YVYYSGTTNYNPSLKS 33 DLL3-4 VH CDR3 IAVTGFYFDY 34 DLL3-4 VL CDR1 RASQRVNNNYLA 35 DLL3-4 VL CDR2 GASSRAT 36 DLL3-4 VL CDR3 QQYDRSPLT 37 DLL3-4 VH 38 DLL3-4 VL 39 EGF-3 DLL3-4 scFv 40 DLL3-4 xI2C moleculă bispecifică 41 DLL3-5 VH CDR1 SYYWS 42 DLL3-5 VH CDR2 YIYYSGRTNYYPSLKS 43 DLL3-5 VH CDR3 IAVAGFFFDY 44 DLL3-5 VL CDR1 RASQSVNKNYLA 45 DLL3-5 VL CDR2 GASSRAT 46 DLL3-5 VL CDR3 QQYDRSPLT 47 DLL3-5 VH 48 DLL3-5 VL 49 EGF-3 DLL3-5 scFv 50 DLL3-5 xI2C moleculă bispecifică 51 DLL3-6 VH CDR1 SFYWS 52 DLL3-6 VH CDR2 YIYYSGTTNYNPSLKS 53 DLL3-6 VH CDR3 IAVAGFFFDY 54 DLL3-6 VL CDR1 RASQSVNKNYLA 55 DLL3-6 VL CDR2 GASSRAT 56 DLL3-6 VL CDR3 QQYDRSPLT 57 DLL3-6 VH 58 DLL3-6 VL 59 EGF-3 DLL3-6 scFv 60 DLL3-6 xI2C moleculă bispecifică 61 DLL3-7 VH CDR1 SFYWS 62 DLL3-7 VH CDR2 YIYYSGTTNYNPSLKS 63 DLL3-7 VH CDR3 IAVAGFFFDY 64 DLL3-7 VL CDR1 RASQSVNKNYLA 65 DLL3-7 VL CDR2 GASSRAT 66 DLL3-7 VL CDR3 QQYDRSPLT 67 DLL3-7 VH 68 DLL3-7 VL 69 EGF-3 DLL3-7 scFv 70 DLL3-7 xI2C moleculă bispecifică 71 DLL3-8 VH CDR1 SFYWS 72 DLL3-8 VH CDR2 YIYYSGTTNYNPSLKS 73 DLL3-8 VH CDR3 IAVAGFFFDY 74 DLL3-8 VL CDR1 RASQSVNKNYLA 75 DLL3-8 VL CDR2 GASSRAT 76 DLL3-8 VL CDR3 QQYDRSPLT 77 DLL3-8 VH 78 DLL3-8 VL 79 EGF-3 DLL3-8 scFv 80 DLL3-8 xI2C moleculă bispecifică 81 DLL3-9 VH CDR1 SFYWS 82 DLL3-9 VH CDR2 YIYYSGTTNYNPSLKS 83 DLL3-9 VH CDR3 IAVAGFFFDY 84 DLL3-9 VL CDR1 RASQSVNKNYLA 85 DLL3-9 VL CDR2 GASSRAT 86 DLL3-9 VL CDR3 QQYDRSPLT 87 DLL3-9 VH 88 DLL3-9 VL 89 EGF-3 DLL3-9 scFv 90 DLL3-9 xI2C moleculă bispecifică 91 DLL3-10 VH CDR1 SYYWS 92 DLL3-10 VH CDR2 YIFYNGITNYNPSLKS 93 DLL3-10 VH CDR3 IHSGSFSFDY 94 DLL3-10 VL CDR1 RASQSVSRGYLA 95 DLL3-10 VL CDR2 GASSRAT 96 DLL3-10 VL CDR3 QQYDTSPIT 97 DLL3-10 VH 98 DLL3-10 VL 99 EGF-3 DLL3-10 scFv 100 DLL3-10 xI2C moleculă bispecifică 101 DLL3-11 VH CDR1 NAGMS 102 DLL3-11 VH CDR2 RIKNKIDGGTTDFAAPVKG 103 DLL3-11 VH CDR3 RGWYGDYFDY 104 DLL3-11 VL CDR1 RSSQSLLHSNGYNYLD 105 DLL3-11 VL CDR2 LGSNRAS 106 DLL3-11 VL CDR3 MQALQTPFT 107 DLL3-11 VH 108 DLL3-11 VL 109 EGF-3 DLL3-11 scFv 110 DLL3-11 xI2C moleculă bispecifică 111 DLL3-12 VH CDR1 SYDIH 112 DLL3-12 VH CDR2 VISSHGSNKNYARSVKG 113 DLL3-12 VH CDR3 DGYSGNDPFYYYYHGMDV 114 DLL3-12 VL CDR1 RASQSISSYLN 115 DLL3-12 VL CDR2 AASSLQS 116 DLL3-12 VL CDR3 QQSFTTPLT 117 DLL3-12 VH 118 DLL3-12 VL 119 EGF-3/[4] DLL3-12 scFv 120 DLL3-12 xI2C moleculă bispecifică 121 DLL3-13 VH CDR1 SYYMH 122 DLL3-13 VH CDR2 IINPSDGSTNYAQNFQG 123 DLL3-13 VH CDR3 GGNSAFYSYYDMDV 124 DLL3-13 VL CDR1 RSSQSLVYRDGNTYLS 125 DLL3-13 VL CDR2 KVSNWQS 126 DLL3-13 VL CDR3 MQGTHWPPT 127 DLL3-13 VH 128 DLL3-13 VL 129 EGF-4 DLL3-13 scFv 130 DLL3-13 xI2C moleculă bispecifică 131 DLL3-14 VH CDR1 NYYMH 132 DLL3-14 VH CDR2 IINPSDGSTSYAQKFQG 133 DLL3-14 VH CDR3 GGNSAFYSYYDMDV 134 DLL3-14 VL CDR1 RSSQSLVYRDGNTYLS 135 DLL3-14 VL CDR2 KVSNWQS 136 DLL3-14 VL CDR3 MQGTHWPPT 137 DLL3-14 VH 138 DLL3-14 VL 139 EGF-4 DLL3-14 scFv 140 DLL3-14 xI2C moleculă bispecifică 141 DLL3-15 VH CDR1 GYYIH 142 DLL3-15 VH CDR2 IINPSDGSTSYGQNFQG 143 DLL3-15 VH CDR3 GGNSAFYSYYDMDV 144 DLL3-15 VL CDR1 RSSQSLAYRDGNTYLS 145 DLL3-15 VL CDR2 KVSNWQS 146 DLL3-15 VL CDR3 MQGTHWPPT 147 DLL3-15 VH 148 DLL3-15 VL 149 EGF-4 DLL3-15 scFv 150 DLL3-15 xI2C moleculă bispecifică 151 DLL3-16 VH CDR1 GHYMH 152 DLL3-16 VH CDR2 IINPSDGSTNYAQKFQG 153 DLL3-16 VH CDR3 GTTWHYSYYDMDV 154 DLL3-16 VL CDR1 RSSQSLVYRDGNTYLT 155 DLL3-16 VL CDR2 KVSNWQS 156 DLL3-16 VL CDR3 MQGTHWPPT
157 DLL3-16 VH 158 DLL3-16 VL 159 EGF-4 DLL3-16 scFv 160 DLL3-16 xI2C moleculă bispecifică 161 DLL3-17 VH CDR1 NYFMH 162 DLL3-17 VH CDR2 IINPSDGSTSYAQNFQG 163 DLL3-17 VH CDR3 GGNSAFYSYYDMDV 164 DLL3-17 VL CDR1 RSSQSLVYRDGNTYLS 165 DLL3-17 VL CDR2 RVSNWQS 166 DLL3-17 VL CDR3 MQGTYWPPT 167 DLL3-17 VH 168 DLL3-17 VL 169 EGF-4 DLL3-17 scFv 170 DLL3-17 xI2C moleculă bispecifică 171 DLL3-18 VH CDR1 NYGMH 172 DLL3-18 VH CDR2 VISHHGSSKYYARSVKG 173 DLL3-18 VH CDR3 DWWELVFDY 174 DLL3-18 VL CDR1 KSSQSLLHSDGKTFLY 175 DLL3- VL CDR2 EVSNRFS 176 DLL3-18 VL CDR3 LQGIHLPFT 177 DLL3-18 VH 178 DLL3-18 VL 179 EGF-5/[6] DLL3-18 scFv 180 DLL3-18 xI2C moleculă bispecifică 181 DLL3-19 VH CDR1 NSRMGVS 182 DLL3-19 VH CDR2 HIFSNDGKSYSTSLKS 183 DLL3-19 VH CDR3 YNYDSSGYYYSFFDY 184 DLL3-19 VL CDR1 RASQSISSYLN 185 DLL3-19 VL CDR2 AASSLQS 186 DLL3-19 VL CDR3 QQGYSSPFT 187 DLL3-19 VH 188 DLL3-19 VL 189 EGF-5/[6] DLL3-19 scFv 190 DLL3-19 xI2C moleculă bispecifică 191 DLL3-20 VH CDR1 NARMGVS 192 DLL3-20 VH CDR2 HIFSTDEKSYSTSLKS 193 DLL3-20 VH CDR3 YYYDSSGYYYSFFDY 194 DLL3-20 VL CDR1 RASQSIRSYLN 195 DLL3-20 VL CDR2 GASNLQS 196 DLL3-20 VL CDR3 QQSYSSPFT 197 DLL3-20 VH 198 DLL3-20 VL 199 EGF-5/[6] DLL3-20 scFv 200 DLL3-20 xI2C moleculă bispecifică 201 DLL3-21 VH CDR1 SYYIH 202 DLL3-21 VH CDR2 IINPSGGSKSYAQKFRG 203 DLL3-21 VH CDR3 SMSTVTSDAFDI 204 DLL3-21 VL CDR1 RASQSISNYLN 205 DLL3-21 VL CDR2 AASSLQS 206 DLL3-21 VL CDR3 QQSYSAPLT 207 DLL3-21 VH 208 DLL3-21 VL 209 EGF-5/[6] DLL3-21 scFv 210 DLL3-21 xI2C moleculă bispecifică 211 EGF-3 DLL3-4 xF12Q moleculă bispecifică 212 EGF-3 DLL3-5 xF12Q moleculă bispecifică 213 EGF-3 DLL3-6 xF12Q moleculă bispecifică 214 EGF-3 DLL3-7 xF12Q moleculă bispecifică 215 EGF-3 DLL3-8 xF12Q moleculă bispecifică 216 EGF-3 DLL3-9 xF12Q moleculă bispecifică 217 EGF-3 DLL3-10 xF12Q moleculă bispecifică 218 EGF-4 DLL3-13 xF12Q moleculă bispecifică 219 EGF-4 DLL3-14xF12Q moleculă bispecifică 220 EGF-4 DLL3-15 xF12Q moleculă bispecifică 221 N-term. DLL3-1 xI2C -HALB varianta 1 moleculă bispecifică -HALB varianta 1 222 N-term. DLL3-2 xI2C -HALB varianta 1 moleculă bispecifică -HALB varianta 1 223 EGF-1 DLL3-3 xI2C -HALB moleculă bispecifică -HALB 224 EGF-3 DLL3-4 xI2C -HALB moleculă bispecifică -HALB 225 EGF-3 DLL3-5 xI2C -HALB moleculă bispecifică -HALB 226 EGF-3 DLL3-6 xI2C -HALB moleculă bispecifică -HALB 227 EGF-3 DLL3-7 xI2C -HALB moleculă bispecifică -HALB 228 EGF-3 DLL3-8 xI2C -HALB moleculă bispecifică -HALB 229 EGF-3 DLL3-9 xI2C -HALB moleculă bispecifică -HALB 230 EGF-3 DLL3-10 xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 231 EGF-3 DLL3-11 xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 232 EGF-3/[4] DLL3-12 xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 233 EGF-4 DLL3-13 xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 234 EGF-4 DLL3-14 xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 235 EGF-4 DLL3-15 xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 236 EGF-4 DLL3-16 xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 237 EGF-4 DLL3-17xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 238 EGF-5/[6] DLL3-18 xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 239 EGF-5/[6] DLL3-19 xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 240 EGF-5/[6] DLL3-20 xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 241 EGF-5/[6] DLL3-21 xI2C - HALB moleculă bispecifică -HALB 242 EGF-3 DLL3-4 xF12Q -HALB moleculă bispecifică -HALB 243 EGF-3 DLL3-5 xF12Q -HALB moleculă bispecifică -HALB 244 EGF-3 DLL3-6 xF12Q -HALB moleculă bispecifică -HALB 245 EGF-3 DLL3-7 xF12Q -HALB moleculă bispecifică -HALB 246 EGF-3 DLL3-8 xF12Q -HALB moleculă bispecifică -HALB 247 EGF-3 DLL3-9 xF12Q -HALB moleculă bispecifică -HALB 248 EGF-3 DLL3-10 xF12Q -HALB moleculă bispecifică -HALB 249 EGF-4 DLL3-13 xF12Q -HALB moleculă bispecifică -HALB 250 EGF-4 DLL3-14 xF12Q -HALB moleculă bispecifică -HALB 251 EGF-4 DLL3-15 xF12Q -HALB moleculă bispecifică -HALB 252 - DLL3 umană umană 253 - DLL3 ECD umană umană 254 - DLL3 N-term. Hu umană 255 - DLL3 DSL dom Hu umană ARCEPPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECE 256 - DLL3 EGF-1 Hu umană APLVCRAGCSPEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCT 257 - DLL3 EGF-2 Hu umană GPGPCDGNPCANGGSCSETPRSFECTCPRGFYGLRCE 258 - DLL3 EGF-3 Hu umană SGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCE 259 - DLL3 EGF-4 Hu umană RVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCE 260 - DLL3 EGF-3+4 Hu umană 261 - DLL3 EGF-5 Hu umană DLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCR 262 - DLL3 EGF-6 Hu umană RADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGARCE
263 - DLL3 ECD x EpCA M umană artificială 264 - V5 x DLL3-DSL hu x EpCA M artificială 265 - V5 x DLL3-EGF1 hu x EpCA M artificială 266 - V5 x DLL3-EGF2 hu x EpCA M artificială 267 - V5 x DLL3-EGF3 hu x EpCA M artificială 268 - V5 x DLL3-EGF4 hu x EpCA M artificială 269 - V5 x DLL3-EGF5 hu x EpCA M artificială 270 - V5 x DLL3-EGF6 hu x EpCA M artificială 271 - Macaq ue DLL3 cyno 272 - Macaq ue DLL3 ECD cyno 273 - Ma DLL3 N-term. cyno 274 - Ma DLL3 DSL dom. cyno ARCELPAVGTACTRLCRPRSAPSRCGPGLRPCAPLEDECE 275 - Ma DLL3 EGF-1 cyno APPVCRAGCSLEHGFCEQPGECRCLEGWTGPLCM 276 - Ma DLL3 EGF-2 cyno GPGPCDGNPCANGGSCSETPGSFECTCPRGFYGLRCE 277 - Ma DLL3 EGF-3 cyno SGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCE 278 - Ma DLL3 EGF-4 cyno RVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHALRCRCRAGFAGPRCE 279 - Ma DLL3 EGF-3+4 cyno SGVTCADGPCFNGGLCVGGADPDSAYICHCPPGFQGSNCEKRVDRCSLQPCRNGGLCLDLGHA LRCRCRAGFAGPRCE 280 - Ma DLL3 EGF-5 cyno NLDDCAGRACANGGTCVEGGGAHRCSCALGFGGRDCR 281 - Ma DLL3 EGF-6 cyno RADPCAARPCAHGGRCYAHFSGLVCACAPGYMGSRCE 282 - Ma DLL3 ECD x EpCA M artificială 283 - DLL1 umană umană 284 - DLL4 umană umană 285 - linker 1 artificială GGGG 286 - linker 2 artificială GGGGS 287 - linker 3 artificială GGGGQ 288 - linker 4 artificială SGGGGS 289 - linker 5 artificială PGGGGS 290 - linker 6 artificială PGGDGS 291 - linker 7 artificială GGGGSGGGS 292 - linker 8 artificială GGGGSGGGGS 293 linker 9 artificială GGGGSGGGGSGGGGS 294 - Hexa-his artificială HHHHHH 295 - Ab156 artificială RDWDFDVFGGGTPVGG 296 - FcRn BP liniar artificială QRFVTGHFGGLXPANG 297 - FcRn BP-Y liniar artificială QRFVTGHFGGLYPANG 298 - FcRn BP-H liniar artificială QRFVTGHFGGLHPANG 299 nucleu FcRn BP-H artificială TGHFGGLHP 300 FcRn BP-H ciclic artificială QRFCTGHFGGLHPCNG 301 - HALB umană 302 - HALB varianta 1 artificială 303 - HALB varianta 2 artificială 304 - HALB varianta 3 artificială 305 - HALB varianta 4 artificială 306 - HALB varianta 5 artificială 307 - HALB varianta 6 artificială 308 - HALB varianta 7 artificială 309 - HALB varianta 8 artificială 310 - HALB varianta 9 artificială 311 - HALB varianta 10 artificială 312 - HALB varianta 11 artificială 313 - HALB varianta 12 artificială 314 - HALB varianta 13 artificială 315 - HALB varianta 14 artificială 316 - HALB varianta 15 artificială 317 - HALB varianta 16 artificială 318 - HALB varianta 17 artificială 319 - HALB varianta 18 artificială 320 - HALB varianta 19 artificială 321 - HALB varianta 20 artificială 322 - HALB varianta 21 artificială 323 - HALB varianta 22 artificială 324 - HALB varianta 23 artificială 325 - HALB varianta 24 artificială 326 - HALB varianta 25 artificială 327 - HALB varianta 26 artificială 328 - HALB varianta 27 artificială 329 - HALB varianta 28 artificială 330 - HALB varianta 29 artificială 331 - HC corp de încrucişare 1 artificială 332 - LC corp de încrucişare 1 artificială 333 - HC corp de încrucişare 2 artificială 334 - LC corp de încrucişare 2 artificială 335 - Hetero-Fc ligand Fc artificială 336 - Hetero -Fc partener Fc artificială 337 - Fc ţintă maxi-corp 1 artificială 338 - Fc CD3 maxi-corp 1 artificială 339 - Fc ţintă maxi-corp 2 artificială 340 - Fc CD3 maxi-corp 2 artificială 341 - Mono Fc artificială 342 - CDR-L1 al F6A artificială GSSTGAVTSGYYPN 343 CDR-L2 al F6A artificială GTKFLAP 344 CDR-L3 al F6A artificială ALWYSNRWV 345 CDR-H1 al F6A artificială IYAMN 346 CDR-H2 al F6A artificială RIRSKYNNYATYYADSVKS 347 CDR-H3 al F6A artificială HGNFGNSYVSFFAY 348 VH al F6A artificială 349 VL al F6A artificială 350 VH-VL al F6A artificială 351 CDR-L1 al H2C artificială GSSTGAVTSGYYPN 352 CDR-L2 al H2C artificială GTKFLAP 353 CDR-L3 al H2C artificială ALWYSNRWV 354 CDR-H1 al H2C artificială KYAMN 355 CDR-H2 al H2C artificială RIRSKYNNYATYYADSVKD 356 CDR-H3 al H2C artificială HGNFGNSYISYWAY 357 VH al H2C artificială 358 VL al H2C artificială 359 VH-VL al H2C artificială 360 CDR-L1 al H1E artificială GSSTGAVTSGYYPN 361 CDR-L2 al H1E artificială GTKFLAP 362 CDR-L3 al H1E artificială ALWYSNRWV 363 CDR-H1 al H1E artificială SYAMN 364 CDR-H2 al H1E artificială RIRSKYNNYATYYADSVKG 365 CDR-H3 al H1E artificială HGNFGNSYLSFWAY 366 VH al H1E artificială 367 VL al H1E artificială 368 VH-VL al H1E artificială 369 CDR-L1 al G4H artificială GSSTGAVTSGYYPN 370 CDR-L2 al G4H artificială GTKFLAP 371 CDR-L3 al G4H artificială ALWYSNRWV 372 CDR-H1 al G4H artificială RYAMN 373 CDR-H2 al G4H artificială RIRSKYNNYATYYADSVKG 374 CDR-H3 al G4H artificială HGNFGNSYLSYFAY 375 VH al G4H artificială 376 VL al G4H artificială 377 VH-VL al G4H artificială 378 CDR-L1 al A2J artificială RSSTGAVTSGYYPN 379 CDR-L2 al A2J artificială ATDMRPS 380 CDR-L3 al A2J artificială ALWYSNRWV 381 CDR-H1 al A2J artificială VYAMN 382 CDR-H2 al A2J artificială RIRSKYNNYATYYADSVKK 383 CDR-H3 al A2J artificială HGNFGNSYLSWWAY 384 VH al A2J artificială 385 VL al A2J artificială
386 VH-VL al A2J artificială 387 CDR-L1 al E1L artificială GSSTGAVTSGYYPN 388 CDR-L2 al E1L artificială GTKFLAP 389 CDR-L3 al E1L artificială ALWYSNRWV 390 CDR-H1 al E1L artificială KYAMN 391 CDR-H2 al E1L artificială RIRSKYNNYATYYADSVKS 392 CDR-H3 al E1L artificială HGNFGNSYTSYYAY 393 VH al E1L artificială 394 VL al E1L artificială 395 VH-VL al E1L artificială 396 CDR-L1 al E2M artificială RSSTGAVTSGYYPN 397 CDR-L2 al E2M artificială ATDMRPS 398 CDR-L3 al E2M artificială ALWYSNRWV 399 CDR-H1 al E2M artificială GYAMN 400 CDR-H2 al E2M artificială RIRSKYNNYATYYADSVKE 401 CDR-H3 al E2M artificială HRNFGNSYLSWFAY 402 VH al E2M artificială 403 VL al E2M artificială 404 VH-VL al E2M artificială 405 CDR-L1 al F7O artificială GSSTGAVTSGYYPN 406 CDR-L2 al F7O artificială GTKFLAP 407 CDR-L3 al F7O artificială ALWYSNRWV 408 CDR-H1 al F7O artificială VYAMN 409 CDR-H2 al F7O artificială RIRSKYNNYATYYADSVKK 410 CDR-H3 al F7O artificială HGNFGNSYISWWAY 411 VH al F7O artificială 412 VL al F7O artificială 413 VH-VL al F7O artificială 414 CDR-L1 al F12Q artificială GSSTGAVTSGNYPN 415 CDR-L2 al F12Q artificială GTKFLAP 416 CDR-L3 al F12Q artificială VLWYSNRWV 417 CDR-H1 al F12Q artificială SYAMN 418 CDR-H2 al F12Q artificială RIRSKYNNYATYYADSVKG 419 CDR-H3 al F12Q artificială HGNFGNSYVSWWAY 420 VH al F12Q artificială 421 VL al F12Q artificială 422 VH-VL al F12Q artificială 423 CDR-L1 al I2C artificială GSSTGAVTSGNYPN 424 CDR-L2 al I2C artificială GTKFLAP 425 CDR-L3 al I2C artificială VLWYSNRWV 426 CDR-H1 al I2C artificială KYAMN 427 CDR-H2 al I2C artificială RIRSKYNNYATYYADSVKD 428 CDR-H3 al I2C artificială HGNFGNSYISYWAY 429 VH al I2C artificială 430 VL al I2C artificială 431 VH-VL al I2C artificială 432 F12q VH al F12q artificială 433 VL al F12q artificială 434 VH-VL al F12q artificială 435 DLL3-4-001 (G44C) VH 436 DLL3-4-001 (G234 C) VL 437 DLL3-4-001 (G44C- G243C ) scFv 438 DLL3-4-001 (CC) xI2C moleculă bispecifică 439 DLL3-14-D55E VH-CDR2 IINPSEGSTSYAQKFQG 440 DLL3-14-G56A VH-CDR2 IINPSDASTSYAQKFQG 441 DLL3-14-D171E VL-CDR1 RSSQSLVYREGNTYLS 442 DLL3-14-G172A VL-CDR1 RSSQSLVYRDANTYLS 443 DLL3-14-N173Q VL-CDR1 RSSQSLVYRDGQTYLS 444 DLL3-14-T174A VL-CDR1 RSSQSLVYRDGNAYLS 445 DLL3-14-L43Q VH 446 DLL3-14-D55E VH 447 DLL3-14-G56A VH 448 DLL3-14 -L43Q-D55E VH 449 DLL3-14-L43Q-G56A VH 450 DLL3-14-G44C VH 451 DLL3-14-L43Q-G44C VH 452 DLL3-14-G44C-D55E VH 453 DLL3-14-G44C-G56A VH 454 DLL3-14-L43Q-G44C-D55E VH 455 DLL3-14-L43Q-G44C-G56A VH 456 DLL3-14 -D171E VL 457 DLL3-14-G172A VL 458 DLL3-14-N173Q VL 459 DLL3-14-T174A VL 460 DLL3-14-G208S VL 461 DLL3-14-D171EG208S VL 462 DLL3-14 G172A -G208S VL 463 DLL3-14-Q243C VL 464 DLL3-14-D171E-Q243C VL 465 DLL3-14-G172A Q243C VL 466 DLL3-14 -N173Q Q243C VL 467 DLL3-14 -T174A- Q243C VL 468 DLL3-14 -G208S- Q243C VL 469 DLL3-14-D171E- G208S-Q243C VL 470 DLL3-14-G172A G208S-Q243C VL 471 DLL3- 14-001 scFv 472 DLL3- 14-002 scFv 473 DLL3-14 -003 scFv 474 DLL3-14 -004 scFv 475 DLL3-14 -005 scFv 476 DLL3-14 -006 scFv 477 DLL3-14 -007 scFv 478 DLL3-14 -008 scFv 479 DLL3-14 -009 scFv 480 DLL3-14 -010 scFv 481 DLL3-14 -011 scFv 482 DLL3-14 -012 (CC) scFv 483 DLL3-14-013 scFv 484 DLL3-14-014 scFv 485 DLL3-14-015 scFv 486 DLL3-14-016 scFv 487 DLL3-14-017 scFv 488 DLL3-14-018 scFv 489 DLL3-14-019 scFv 490 DLL3-14-020 scFv 491 DLL3-14-021 scFv 492 DLL3-14-022 scFv 493 DLL3-14-023 scFv 494 DLL3-14-001 xI2C moleculă bispecifică 495 DLL3-14-002 xI2C moleculă bispecifică 496 DLL3-14-003 xI2C moleculă bispecifică 497 DLL3-14-004 xI2C moleculă bispecifică 498 DLL3-14-005 xI2C moleculă bispecifică 499 DLL3-14-006 xI2C moleculă bispecifică 500 DLL3-14-007 xI2C moleculă bispecifică 501 DLL3-14-008 xI2C moleculă bispecifică 502 DLL3-14-009 xI2C moleculă bispecifică 503 DLL3-14-010 xI2C moleculă bispecifică
504 DLL3-14-011 xI2C moleculă bispecifică 505 DLL3-14-012 (CC) xI2C moleculă bispecifică 506 DLL3-14-013 xI2C moleculă bispecifică 507 DLL3-14-014 xI2C moleculă bispecifică 508 DLL3-14-015 xI2C moleculă bispecifică 509 DLL3-14-016 xI2C moleculă bispecifică 510 DLL3-14-017 xI2C moleculă bispecifică 511 DLL3-14-018 xI2C moleculă bispecifică 512 DLL3-14-019 xI2C moleculă bispecifică 513 DLL3-14-020 xI2C moleculă bispecifică 514 DLL3-14-021 xI2C moleculă bispecifică 515 DLL3-14-022 xI2C moleculă bispecifică 516 DLL3-14-023 xI2C moleculă bispecifică 517 DLL3-4 xI2C -scFc moleculă HLE bispecifică 518 DLL3-4 xI2C-scFc_d elGK moleculă HLE bispecifică 519 DLL3-4-001 (CC) xI2C-scFc moleculă HLE bispecifică 520 DLL3-4-001 (CC) xI2C-scFc _delG K moleculă HLE bispecifică 521 DLL3-6xI2C -scFc moleculă HLE bispecifică 522 DLL3-6 xI2C-scFc_d elGK moleculă HLE bispecifică 523 DLL3-6-001 (CC) xI2C-scFc moleculă HLE bispecifică 524 DLL3-6-001 (CC) xI2C-scFc_d elGK moleculă HLE bispecifică 525 DLL3-14 xI2C-scFc moleculă HLE bispecifică 526 DLL3-14 HLE bispecifică xI2C-scFc_d elGK moleculă 527 DLL3-14-012 (CC) xI2C-scFc moleculă HLE bispecifică 528 DLL3-14-012 (CC) xI2C-scFc_d elGK moleculă HLE bispecifică 529 DLL3-6-001 (CC) VH 530 DLL3-6-001 (CC) VL 531 DLL3-6-001 (CC) scFv 532 DLL3-6-001 (CC) xI2C moleculă bispecifică 533 Fc monom er-1 +c/-g 534 Fc monom er-2 +c/-g/ delGK 535 Fc monom er-3 -c/+g 536 Fc monom er-4 -c/+g/ delGK 537 Fc monom er-5 -c/-g 538 Fc monom er-6 -c/-g/ delGK 539 Fc monom er-7 +c/+g 540 Fc monom er-8 +c/+g/ delGK 541 scFc-1 542 scFc-2 543 scFc-3 544 scFc-4 545 scFc-5 546 scFc-6 547 scFc-7 548 scFc-8 549 linker (G4S)4 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 550 linker (G4S)5 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 551 linker (G4S)6 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 552 linker (G4S)7 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 553 linker (G4S)8 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS 554 DLL3-22 moleculă bispecifică

Claims (23)

1. Construct de anticorp bispecific cuprinzând un prim domeniu de legare care se leagă de DLL3 uman pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 uman pe suprafaţa unei celule T şi CD3 de macac, în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 260, în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 258, în care primul domeniu de legare cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectate din grupul constând din:
a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 31, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 32, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 33, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 34, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 35 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 36;
b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 41, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 42, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 43, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 44, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 45 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 46;
c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 51, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 52, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 53, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 54, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 55 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 56;
d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 61, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 62, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 63, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 64, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 65 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 66;
e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 71, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 72, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 73, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 74, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 75 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 76;
f) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 81, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 82, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 83, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 84, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 85 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 86;
g) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 91, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 92, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 93, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 94, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 95 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 96;
h) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 101, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 102, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 103, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 104, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 105 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 106; şi
i) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 111, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 112, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 113, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 114, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 115 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 116.
2. Construct de anticorp conform revendicării 1, în care primul domeniu de legare se leagă în continuare la DLL3 de macac, de preferinţă la DLL3 de Macaca fascicularis.
3. Construct de anticorp conform revendicării 1 sau 2, în care al doilea domeniu de legare se leagă de CD3 epsilon uman şi de CD3 epsilon de Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus sau Saimiri sciureus.
4. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările precedente, în care constructul de anticorp este într-un format selectat din grupul constând din (scFv)2, mAb cu domeniu unic scFv, diacorpi şi oligomeri din formatele precedente.
5. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 4, în care primul domeniu de legare cuprinde
a) o regiune VH selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 37, SECV ID NR: 47, SECV ID NR: 57, SECV ID NR: 67, SECV ID NR: 77, SECV ID NR: 87, SECV ID NR: 97, SECV ID NR: 107, SECV ID NR: 117, SECV ID NR: 435 şi SECV ID NR: 529; şi/sau
b) o regiune VL selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 38, SECV ID NR: 48, SECV ID NR: 58, SECV ID NR: 68, SECV ID NR: 78, SECV ID NR: 88, SECV ID NR: 98, SECV ID NR: 108, SECV ID NR: 118, SECV ID NR: 436 şi SECV ID NR: 530.
6. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 5, în care primul domeniu de legare cuprinde
a) o regiune VH şi o regiune VL selectată din grupul constând din perechi dintr-o regiune VH şi o regiune VL aşa cum este descrisă în SECV ID NR. 37+38; SECV ID NR: 47+48; SECV ID NR: 57+58; SECV ID NR: 67+68; SECV ID NR: 77+78; SECV ID NR: 87+88; SECV ID NR: 97+98; SECV ID NR: 107+108; SECV ID NR: 117+118; SECV ID NR: 435+436; şi SECV ID NR: 529+530, şi/sau
b) o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 39, SECV ID NR: 49, SECV ID NR: 59, SECV ID NR: 69, SECV ID NR: 79, SECV ID NR: 89, SECV ID NR: 99, SECV ID NR: 109, SECV ID NR: 119, SECV ID NR: 437 şi SECV ID NR: 531.
7. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 6, cuprinzând o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 40, SECV ID NR: 50, SECV ID NR: 60, SECV ID NR: 70, SECV ID NR: 80, SECV ID NR: 90, SECV ID NR: 100, SECV ID NR: 110, SECV ID NR: 120, SECV ID NR: 211, SECV ID NR: 212, SECV ID NR: 213, SECV ID NR: 214, SECV ID NR: 215, SECV ID NR: 216, SECV ID NR: 217, SECV ID NR: 438 şi SECV ID NR: 532.
8. Construct de anticorp bispecific cuprinzând un prim domeniu de legare care se leagă de DLL3 umană pe suprafaţa unei celule ţintă şi un al doilea domeniu de legare care se leagă de CD3 umană pe suprafaţa unei celule T şi CD3 de macac, în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 260, în care primul domeniu de legare se leagă de un epitop al DLL3 care este cuprins în regiune aşa cum este descris în SECV ID NR.: 259, în care primul domeniu de legare cuprinde o regiune VH cuprinzând CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 şi o regiune VL cuprinzând CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 selectată din grupul constând din:
a) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 121, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 122, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 123, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 124, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 125 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 126;
b) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 132, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 134, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
c) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 141, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 142, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 143, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 144, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 145 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 146;
d) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 151, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 152, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 153, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 154, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 155 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 156;
e) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 161, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 162, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 163, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 164, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 165 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 166;
f) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 439, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 134, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
g) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 440, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 134, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
h) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 132, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 441, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
i) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 132, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 442, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
j) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 132, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 443, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
k) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 132, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 444, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136;
l) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 439, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 441, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136; şi
m) CDR-H1 cum s-a descris în SECV ID NR: 131, CDR-H2 cum s-a descris în SECV ID NR: 440, CDR-H3 cum s-a descris în SECV ID NR: 133, CDR-L1 cum s-a descris în SECV ID NR: 442, CDR-L2 cum s-a descris în SECV ID NR: 135 şi CDR-L3 cum s-a descris în SECV ID NR: 136.
9. Construct de anticorp conform revendicării 8, în care primul domeniu de legare se leagă în continuare la DLL3 de macac, de preferinţă la DLL3 de Macaca fascicularis.
10. Construct de anticorp conform revendicării 8 sau 9, în care al doilea domeniu de legare se leagă de CD3 epsilon uman şi de CD3 epsilon de Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus sau Saimiri sciureus.
11. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările precedente, în care constructul de anticorp este într-un format selectat din grupul constând din (scFv)2, mAb cu domeniu unic scFv, diacorpi şi oligomeri din formatele precedente.
12. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările 8 până la 11, în care primul domeniu de legare cuprinde
a) o regiune VH selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 127, SECV ID NR: 137, SECV ID NR: 147, SECV ID NR: 157, SECV ID NR: 167, SECV ID NR: 445, SECV ID NR: 446, SECV ID NR: 447, SECV ID NR: 448, SECV ID NR: 449, SECV ID NR: 450, SECV ID NR: 451, SECV ID NR: 452, SECV ID NR: 453, SECV ID NR: 454, şi SECV ID NR: 455; şi/sau
b) o regiune VL selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 128, SECV ID NR: 138, SECV ID NR: 148, SECV ID NR: 158, SECV ID NR: 168, SECV ID NR: 456, SECV ID NR: 457, SECV ID NR: 458, SECV ID NR: 459, SECV ID NR: 460, SECV ID NR: 461, SECV ID NR: 462, SECV ID NR: 463, SECV ID NR: 464, SECV ID NR: 465, SECV ID NR: 466, SECV ID NR: 467, SECV ID NR: 468, SECV ID NR: 469, şi SECV ID NR: 470.
13. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările 8 până la 12, în care primul domeniu de legare cuprinde
a) o regiune VH şi o regiune VL selectate din grupul constând din perechi dintr-o regiune VH şi o regiune VL aşa cum este descris în SECV ID NRs: 127+128; SECV ID NRs: 137+138; SECV ID NRs: 147+148; SECV ID NRs: 157+158; SECV ID NRs: 167+168; SECV ID NRs 137+456; SECV ID NRs 137+457; SECV ID NRs 137+458; SECV ID NRs 137+459; SECV ID NRs 137+460; SECV ID NRs 445+138; SECV ID NRs 446+138; SECV ID NRs 447+138; SECV ID NRs 445+460; SECV ID NRs 448+461; SECV ID NRs 449+462; SECV ID NRs 450+463; SECV ID NRs 450+464; SECV ID NRs 450+465; SECV ID NRs 450+466; SECV ID NRs 450+467; SECV ID NRs 450+468; SECV ID NRs 451+463; SECV ID NRs 452+463; SECV ID NRs 453+463; SECV ID NRs 451+468; SECV ID NRs 454+469; şi SECV ID NRs 455+470; şi/sau
b) o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 129, SECV ID NR: 139, SECV ID NR: 149, SECV ID NR: 159, SECV ID NR: 169, SECV ID NR: 471, SECV ID NR: 472, SECV ID NR: 473, SECV ID NR: 474, SECV ID NR: 475, SECV ID NR: 476, SECV ID NR: 477, SECV ID NR: 478, SECV ID NR: 479, SECV ID NR: 480, SECV ID NR: 481, SECV ID NR: 482, SECV ID NR: 483, SECV ID NR: 484, SECV ID NR: 485, SECV ID NR: 486, SECV ID NR: 487, SECV ID NR: 488, SECV ID NR: 489, SECV ID NR: 490, SECV ID NR: 491, SECV ID NR: 492, şi SECV ID NR: 493.
14. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările 8 până la 13, cuprinzând o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 130, SECV ID NR: 140, SECV ID NR: 150, SECV ID NR: 160, SECV ID NR: 170; SECV ID NR: 218, SECV ID NR: 219, SECV ID NR: 220, SECV ID NR: 494, SECV ID NR: 495, SECV ID NR: 496, SECV ID NR: 497, SECV ID NR: 498, SECV ID NR: 499, SECV ID NR: 500, SECV ID NR: 501, SECV ID NR: 502, SECV ID NR: 503, SECV ID NR: 504, SECV ID NR: 505, SECV ID NR: 506, SECV ID NR: 507, SECV ID NR: 508, SECV ID NR: 509, SECV ID NR: 510, SECV ID NR: 511, SECV ID NR: 512, SECV ID NR: 513, SECV ID NR: 514, SECV ID NR: 515, şi SECV ID NR: 516.
15. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările 1-7, cuprinzând sau constând dintr-o polipeptidă selectată din grupul constând din cele descrise în SECV ID NR: 517, SECV ID NR: 518, SECV ID NR: 519, SECV ID NR: 520, SECV ID NR: 521, SECV ID NR: 522, SECV ID NR: 523, SECV ID NR: 524.
16. Polinucleotidă care codifică un construct de anticorp aşa cum este definit în oricare dintre revendicările precedente.
17. Vector cuprinzând o polinucleotidă conform definiţiei din revendicarea 16.
18. Celulă gazdă transformată sau transfectată cu polinucleotida definită în revendicarea 16 sau cu vectorul definit în revendicarea 17.
19. Procedeu pentru producerea unui construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 15, procedeul menţionat cuprinzând cultivarea unei celule gazdă, astfel cum este definită în revendicarea 18, în condiţii care permit exprimarea respectivului construct de anticorp şi recuperarea constructului de anticorp produs din cultură.
20. Compoziţie farmaceutică cuprinzând un construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările de la 1 până la 15 sau produsă conform procedeului din revendicarea 19.
21. Construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 15, sau produs conform procedeului din revendicarea 19, pentru utilizare în prevenirea, tratamentul sau ameliorarea unei tumori sau boli canceroase sau a unei boli canceroase metastatice.
22. Construct de anticorp pentru utilizare conform revendicării 21, în care tumoarea sau boala canceroasă este selectată din grupul constând din cancer pulmonar, de preferinţă SCLC, sân, col uterin, colon, colorectal, endometrial, cap şi gât, ficat, ovarian, pancreatic, prostată, piele, gastric, testicul, tiroidă, suprarenală, renală, vezicală, uterină, esofagiană, urotelială şi tumoare cerebrală sau cancer, limfom, carcinom şi sarcom şi o boală canceroasă metastatică derivată din oricare dintre cele de mai sus.
23. Kit care cuprinde un construct de anticorp conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 15, un construct de anticorp produs conform procedeului din revendicarea 19, o polinucleotidă definită în revendicarea 16, un vector definit în revendicarea 17 şi/sau o celulă gazdă definită în revendicarea 18.
MDE20180562T 2015-07-31 2016-08-01 Constructe de anticorp bispecific de legare a DLL3 şi CD3 MD3328889T2 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562199930P 2015-07-31 2015-07-31
US201662290896P 2016-02-03 2016-02-03
PCT/EP2016/068285 WO2017021349A1 (en) 2015-07-31 2016-08-01 Bispecific antibody constructs binding dll3 and cd3

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3328889T2 true MD3328889T2 (ro) 2021-10-31

Family

ID=56800252

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20180562T MD3328889T2 (ro) 2015-07-31 2016-08-01 Constructe de anticorp bispecific de legare a DLL3 şi CD3

Country Status (37)

Country Link
US (6) US10294300B2 (ro)
EP (4) EP4706771A2 (ro)
JP (5) JP6824245B2 (ro)
KR (4) KR102749378B1 (ro)
CN (3) CN119371549A (ro)
AU (4) AU2016302569B2 (ro)
CA (2) CA2986848C (ro)
CL (2) CL2018000267A1 (ro)
CO (1) CO2018000877A2 (ro)
CR (1) CR20180066A (ro)
CY (1) CY1124472T1 (ro)
DK (1) DK3328889T3 (ro)
ES (1) ES2884211T3 (ro)
FI (1) FI3865514T3 (ro)
HR (2) HRP20260436T1 (ro)
HU (1) HUE055112T2 (ro)
IL (3) IL320033A (ro)
JO (1) JO3671B1 (ro)
LT (2) LT3328889T (ro)
MA (3) MA71409A (ro)
MD (1) MD3328889T2 (ro)
MX (2) MX385605B (ro)
MY (1) MY184895A (ro)
NZ (1) NZ737339A (ro)
PE (1) PE20181152A1 (ro)
PH (1) PH12018500241A1 (ro)
PL (1) PL3328889T3 (ro)
PT (1) PT3328889T (ro)
RS (2) RS67933B1 (ro)
SG (1) SG10201911548QA (ro)
SI (1) SI3328889T1 (ro)
SM (1) SMT202100482T1 (ro)
TN (1) TN2017000549A1 (ro)
TW (1) TWI793062B (ro)
UA (1) UA126964C2 (ro)
WO (1) WO2017021349A1 (ro)
ZA (1) ZA202006983B (ro)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109456410B (zh) * 2007-04-03 2022-01-28 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
SG194399A1 (en) * 2008-10-01 2013-11-29 Amgen Res Munich Gmbh Cross-species-specific pscaxcd3, cd19xcd3, c-metxcd3, endosialinxcd3, epcamxcd3, igf-1rxcd3 or fapalpha xcd3 bispecific single chain antibody
CA2738568C (en) 2008-10-01 2024-02-20 Micromet Ag Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
EP3907242A1 (en) 2010-01-29 2021-11-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-dll3 antibody
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
JO3519B1 (ar) 2013-01-25 2020-07-05 Amgen Inc تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
TWI652279B (zh) 2013-11-11 2019-03-01 中外製藥股份有限公司 含改變的抗體可變區之抗原結合分子
EP4632120A3 (en) 2014-11-11 2026-01-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Library of antigen-binding molecules including modified antibody variable region
JP2017536830A (ja) 2014-11-26 2017-12-14 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３及びｃｄ３８に結合するヘテロ二量体抗体
SG11201704283PA (en) 2014-11-26 2017-06-29 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
MX383614B (es) 2015-05-21 2025-03-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas de union triespecificas y metodos de uso.
TWI793062B (zh) * 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
EA039859B1 (ru) * 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI717375B (zh) 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
SG11201805770UA (en) 2016-02-03 2018-08-30 Amgen Res Munich Gmbh BCMA and CD3 Bispecific T Cell Engaging Antibody Constructs
CA3011942A1 (en) 2016-02-03 2017-08-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
DK3579848T3 (da) 2017-02-08 2025-01-20 Dragonfly Therapeutics Inc Multispecifikke bindende proteiner til aktivering af naturlige dræberceller og terapeutiske anvendelser heraf til behandling af kræft
KR20240060739A (ko) 2017-02-20 2024-05-08 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Her2, nkg2d 및 cd16에 결합하는 단백질
WO2018191438A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
AU2018265856B2 (en) 2017-05-12 2023-04-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
TWI901940B (zh) 2017-08-03 2025-10-21 美商安進公司 介白素-21突變蛋白及治療方法
CN111051306B (zh) 2017-09-08 2023-01-03 美国安进公司 Kras g12c的抑制剂及其使用方法
SI3694529T1 (sl) 2017-10-13 2024-10-30 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecifične beljakovine in načini uporabe
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
EP3720963A4 (en) 2017-12-05 2021-12-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULE WITH CHANGED BINDING OF THE VARIABLE ANTIBODY REGIONS CD3 AND CD137
EP3732195A4 (en) * 2017-12-28 2022-02-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CYTOTOXICITY-INDUCING THERAPEUTIC
WO2019139987A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Elstar Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered t cells for the treatment of diseases
JP2019122373A (ja) 2018-01-12 2019-07-25 アムジエン・インコーポレーテツド 抗ｐｄ−１抗体及び治療方法
SG11202007482WA (en) 2018-02-08 2020-09-29 Dragonfly Therapeutics Inc Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
SG11202007579TA (en) 2018-02-08 2020-09-29 Dragonfly Therapeutics Inc Combination therapy of cancer involving multi-specific binding proteins that activate natural killer cells
JP7353576B2 (ja) 2018-02-20 2023-10-02 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｄ３３、ｎｋｇ２ｄ、及びｃｄ１６に結合する多重特異性結合タンパク質、ならびにその使用方法
US20210221894A1 (en) * 2018-04-03 2021-07-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding nkg2d, cd16 and an antigen associated with tumors, mdscs and/or tams
WO2019195408A1 (en) * 2018-04-03 2019-10-10 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting dll3, and use thereof
UY38182A (es) * 2018-04-10 2019-10-31 Amgen Inc Receptores quiméricos de dll3 y métodos para su uso
IL277863B2 (en) 2018-04-11 2026-02-01 Inhibrx Inc Multispecific polypeptide constructs with forced CD3 binding and related methods and uses
WO2019217145A1 (en) 2018-05-08 2019-11-14 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-dll3 antibodies and uses thereof
TWI848953B (zh) * 2018-06-09 2024-07-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
WO2020010250A2 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
CA3105891A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs containing a constrained cd3 binding domain and a receptor binding region and methods of using the same
AU2019315226B2 (en) 2018-08-03 2025-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing two antigen-binding domains that are linked to each other
EP3833392A4 (en) 2018-08-08 2022-05-18 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR BINDING CD33, NKG2D AND CD16 AND METHODS OF USE
EP3833385A4 (en) 2018-08-08 2021-12-22 Dragonfly Therapeutics, Inc. PROTEINS THAT BINDING NKG2D, CD16 AND A TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN
EA202091888A1 (ru) 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
EP3856771A4 (en) * 2018-09-25 2022-06-29 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
CN113260634A (zh) 2018-09-28 2021-08-13 中外制药株式会社 包含改变的抗体可变区的抗原结合分子
WO2020077257A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
EP3864045A2 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
JP7410143B2 (ja) * 2018-11-01 2024-01-09 山▲東▼新▲時▼代▲薬▼▲業▼有限公司 二重特異性抗体及びその用途
AU2020226893B2 (en) 2019-02-21 2025-02-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
GB2597851B (en) 2019-02-21 2024-05-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
US11673953B2 (en) 2019-03-01 2023-06-13 Allogene Therapeutics, Inc. DLL3 targeting chimeric antigen receptors and binding agents
US20220184127A1 (en) * 2019-04-08 2022-06-16 Phanes Therapeutics, Inc. Humanized anti-dll3 chimeric antigen receptors and uses thereof
KR20220008866A (ko) 2019-05-14 2022-01-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. EpCAM 결합 단백질 및 사용 방법
CN114206942A (zh) * 2019-06-07 2022-03-18 美国安进公司 双特异性结合构建体
KR20220030956A (ko) 2019-07-05 2022-03-11 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 Pd-1/cd3 이중 특이성 단백질에 의한 혈액암 치료
EP3996735A4 (en) * 2019-07-12 2023-07-19 The Research Foundation for The State University of New York COMPOSITIONS AND METHODS FOR BLOCKING AND BINDING CXCR4 TO MODULATE CELLULAR FUNCTION
EP3819312A1 (en) * 2019-11-10 2021-05-12 Amgen, Inc Dosing regimen for anti-dll3 agents
GB201918230D0 (en) 2019-12-11 2020-01-22 Prec Therapeutics Ltd Antibodies and their uses
EP4077377A4 (en) * 2019-12-17 2024-07-03 Phanes Therapeutics, Inc. BISPECIFIC ANTIBODIES WITH ALTERNATING INTERCHAIN CYSTEINES AND USES THEREOF
AU2020416273A1 (en) 2020-01-03 2022-07-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
IL294879A (en) 2020-01-29 2022-09-01 Inhibrx Inc Monodomain antibodies of cd28 and their multivalent and multispecific constructs
US12486331B2 (en) 2020-01-31 2025-12-02 Gensun Biopharma Inc. Bispecific T cell engagers
KR20220162690A (ko) * 2020-01-31 2022-12-08 젠선 바이오파마, 인코포레이티드 이중특이성 t 세포 관여항체
US12060434B2 (en) * 2020-02-25 2024-08-13 Gensun Biopharma Inc. Trispecific T cell engagers
EP4118113A1 (en) 2020-03-12 2023-01-18 Amgen Inc. Method for treatment and prophylaxis of crs in patients comprising a combination of bispecifc antibodies binding to cds x cancer cell and tnfalpha or il-6 inhibitor
CA3173587A1 (en) * 2020-03-31 2021-10-07 Chugai Seiyaku Kabushiki-Kaisha Dll3-targeting multispecific antigen-binding molecules and uses thereof
EP4142790A1 (en) * 2020-04-29 2023-03-08 Amgen Inc. Pharmaceutical formulation
CN115836088A (zh) 2020-05-06 2023-03-21 蜻蜓疗法股份有限公司 结合nkg2d、cd16和clec12a的蛋白质
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
AU2021333577B2 (en) 2020-08-25 2025-09-11 Gilead Sciences, Inc. Multi-specific antigen binding molecules targeting HIV and methods of use
WO2022060901A1 (en) 2020-09-16 2022-03-24 Amgen Inc. Methods for administering therapeutic doses of bispecific t-cell engaging molecules for the treatment of cancer
KR20230110523A (ko) * 2020-10-22 2023-07-24 얀센 바이오테크 인코포레이티드 델타-유사 리간드 3(dll3) 항원 결합 영역을 포함하는 단백질 및 그의 용도
CA3200317A1 (en) * 2020-11-06 2022-05-12 Amgen Inc. Multitargeting bispecific antigen-binding molecules of increased selectivity
WO2022187539A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Dragonfly Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer using multi-specific binding proteins that bind nkg2d, cd16 and a tumor-associated antigen
KR20230156079A (ko) 2021-03-09 2023-11-13 젠코어 인코포레이티드 Cd3과 cldn6에 결합하는 이종이량체 항체
WO2022237647A1 (zh) * 2021-05-08 2022-11-17 上海齐鲁制药研究中心有限公司 针对dll3的结合分子及其应用
KR20240006585A (ko) * 2021-05-10 2024-01-15 암젠 인크 Dll3 및 pd-1을 표적으로 하는 병용 요법을 위한 투여 요법
CA3220933A1 (en) * 2021-06-30 2023-01-05 Amgen Inc. Method of reconstituting lyophilized formulation
CN113461821B (zh) * 2021-09-03 2021-12-28 苏州近岸蛋白质科技股份有限公司 抗cd3人源化抗体
CR20240135A (es) * 2021-09-17 2024-05-17 Wuxi Biologics Ireland Ltd Moléculas de unión a d3 y usos de estas
WO2023053272A1 (en) 2021-09-29 2023-04-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Uses of dll3-targeting multispecific antigen-binding molecules
KR20240141178A (ko) * 2022-02-10 2024-09-25 상하이 치루 파마슈티컬 리서치 앤 디벨롭먼트 센터 리미티드 이중특이적 항원-결합 분자 및 이의 용도
CA3252619A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Xencor, Inc. Anti-CD28 and anti-PSMA antibodies
EP4545564A4 (en) * 2022-06-23 2026-01-14 Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co Ltd Antigen-binding molecule specifically binding to DLL3 and CD3, and its pharmaceutical use
CN120303300A (zh) * 2022-12-08 2025-07-11 安进公司 治疗表达dll3的癌症的方法
WO2025035356A1 (en) * 2023-08-14 2025-02-20 Zhejiang Shimai Pharmaceutical Co., Ltd. Antibodies against dll3 and uses thereof
TW202539735A (zh) * 2023-12-22 2025-10-16 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 一種包含特異性結合ｄｌｌ３和ｃｄ３的雙特異性抗體的醫藥組成物
WO2025146127A1 (zh) * 2024-01-05 2025-07-10 海南先声再明医药股份有限公司 针对dll3和cd3的双特异性抗体及其应用
CN120647761A (zh) * 2024-03-15 2025-09-16 信达生物制药(苏州)有限公司 抗dll3抗体及其用途
WO2025217101A2 (en) 2024-04-09 2025-10-16 Amgen Inc. Agonistic anti-il-2rbg heavy‑chain antibodies
WO2025252840A1 (en) 2024-06-04 2025-12-11 Technische Universitaet Muenchen, In Vertretung Des Freistaates Bayern Half-life modulation by a tag comprising at least one constant domain of an immunoglobulin light chain
WO2026008059A1 (en) * 2024-07-04 2026-01-08 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Anti-dll3 constructs and uses thereof
WO2026060304A1 (en) 2024-09-13 2026-03-19 Amgen Inc. Subcutaneous administration of anti-dll3 agent for treatment of cancer
WO2026075950A1 (en) 2024-10-01 2026-04-09 Amgen Inc. Dosing regimen for anti-dll3 agent

Family Cites Families (187)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4447A (en) 1846-04-04 Car- wheel
US5013A (en) 1847-03-13 Improvement in apparatus for the manufacture of malleable iron
US1985A (en) 1841-02-18 Charles m
US233A (en) 1837-06-14 Improvement in plows
US556A (en) 1838-01-09 Machine foe
US3180193A (en) 1963-02-25 1965-04-27 Benedict David Machines for cutting lengths of strip material
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3691016A (en) 1970-04-17 1972-09-12 Monsanto Co Process for the preparation of insoluble enzymes
CA1023287A (en) 1972-12-08 1977-12-27 Boehringer Mannheim G.M.B.H. Process for the preparation of carrier-bound proteins
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4195128A (en) 1976-05-03 1980-03-25 Bayer Aktiengesellschaft Polymeric carrier bound ligands
US4330440A (en) 1977-02-08 1982-05-18 Development Finance Corporation Of New Zealand Activated matrix and method of activation
CA1093991A (en) 1977-02-17 1981-01-20 Hideo Hirohara Enzyme immobilization with pullulan gel
US4229537A (en) 1978-02-09 1980-10-21 New York University Preparation of trichloro-s-triazine activated supports for coupling ligands
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4615885A (en) 1983-11-01 1986-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
AU612370B2 (en) 1987-05-21 1991-07-11 Micromet Ag Targeted multifunctional proteins
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
ATE108965T1 (de) 1987-12-09 1994-08-15 Omron Tateisi Electronics Co Induktives datenübertragungssystem.
KR970008597B1 (ko) 1987-12-28 1997-05-27 닛뽄 세키유가가쿠 가부시키가이샤 열가소성수지 조성물의 제조방법
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
US5683888A (en) 1989-07-22 1997-11-04 University Of Wales College Of Medicine Modified bioluminescent proteins and their use
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5292658A (en) 1989-12-29 1994-03-08 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center Cloning and expressions of Renilla luciferase
ES2284161T3 (es) 1990-01-12 2007-11-01 Amgen Fremont Inc. Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
FR2664073A1 (fr) 1990-06-29 1992-01-03 Thomson Csf Moyens de marquage d'objets, procede de realisation et dispositif de lecture.
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU8507191A (en) 1990-08-29 1992-03-30 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69133557D1 (de) 1990-08-29 2007-03-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
JP3126980B2 (ja) 1991-03-11 2001-01-22 ザ・ユニバーシテイ・オブ・ジヨージア・リサーチ・フアウンデーシヨン・インコーポレーテツド レニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼのクローニング及び発現
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
ATE255131T1 (de) 1991-06-14 2003-12-15 Genentech Inc Humanisierter heregulin antikörper
WO1992022645A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
AU3328493A (en) 1991-12-17 1993-07-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
CA2135313A1 (en) 1992-06-18 1994-01-06 Theodore Choi Methods for producing transgenic non-human animals harboring a yeast artificial chromosome
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
ATE240394T1 (de) 1992-10-23 2003-05-15 Immunex Corp Methoden zur herstellung löslicher, oligomerer proteine
US5981175A (en) 1993-01-07 1999-11-09 Genpharm Internation, Inc. Methods for producing recombinant mammalian cells harboring a yeast artificial chromosome
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US7045128B2 (en) 1993-05-24 2006-05-16 Immunex Corporation Antibodies against flt3-ligand
AU694745B2 (en) 1993-09-10 1998-07-30 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Uses of green fluorescent protein
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
US5777079A (en) 1994-11-10 1998-07-07 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
ATE219517T1 (de) 1995-08-18 2002-07-15 Morphosys Ag Protein-/(poly)peptidbibliotheken
CA2230759C (en) 1995-08-29 2012-02-21 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric animal and method for producing the same
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5804387A (en) 1996-02-01 1998-09-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP)
US5876995A (en) 1996-02-06 1999-03-02 Bryan; Bruce Bioluminescent novelty items
US5925558A (en) 1996-07-16 1999-07-20 The Regents Of The University Of California Assays for protein kinases using fluorescent protein substrates
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
ATE549918T1 (de) 1996-12-03 2012-04-15 Amgen Fremont Inc Menschliche antikörper, die ausdrücklich menschliches tnf alpha binden
WO1998026277A2 (en) 1996-12-12 1998-06-18 Prolume, Ltd. Apparatus and method for detecting and identifying infectious agents
WO1998052976A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
AU765703B2 (en) 1998-03-27 2003-09-25 Bruce J. Bryan Luciferases, fluorescent proteins, nucleic acids encoding the luciferases and fluorescent proteins and the use thereof in diagnostics, high throughput screening and novelty items
KR100508289B1 (ko) 1998-04-21 2005-08-17 마이크로메트 에이지 Ｃｄ１９×ｃｄ３ 특이 폴리펩티드 및 그의 용도
WO2000006605A2 (en) 1998-07-28 2000-02-10 Micromet Ag Heterominibodies
US7254167B2 (en) 1998-10-30 2007-08-07 Broadcom Corporation Constellation-multiplexed transmitter and receiver
EP1051432B1 (en) 1998-12-08 2007-01-24 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
US7230167B2 (en) 2001-08-31 2007-06-12 Syngenta Participations Ag Modified Cry3A toxins and nucleic acid sequences coding therefor
EP3698626A1 (en) 2001-11-30 2020-08-26 Amgen Fremont Inc. Transgenic animals bearing human ig lambda light chain genes
US8486859B2 (en) 2002-05-15 2013-07-16 Bioenergy, Inc. Use of ribose to enhance plant growth
EP1600459A3 (en) * 2002-06-28 2005-12-07 Domantis Limited Ligand
US7904068B2 (en) 2003-06-06 2011-03-08 At&T Intellectual Property I, L.P. System and method for providing integrated voice and data services utilizing wired cordless access with unlicensed spectrum and wired access with licensed spectrum
ZA200601699B (en) 2003-10-16 2007-05-30 Micromet Ag Multispecific deimmunized CD3-binders
EP2228698B1 (en) 2005-03-14 2012-06-27 Omron Corporation Programmable controller system
WO2006138181A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 Amgen Inc. Self-buffering protein formulations
US8234145B2 (en) 2005-07-12 2012-07-31 International Business Machines Corporation Automatic computation of validation metrics for global logistics processes
BRPI0604215A (pt) 2005-08-17 2007-04-10 Biosigma Sa método para projetar oligonucleotìdeos para técnicas de biologia molecular
JP5686953B2 (ja) 2005-10-11 2015-03-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 交差種特異的（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を含む組成物および該組成物の使用
JP2007122396A (ja) 2005-10-27 2007-05-17 Hitachi Ltd ディスクアレイ装置及びその障害対応検証方法
CA2633593A1 (en) * 2005-12-16 2007-10-04 Genentech, Inc. Method for diagnosing, prognosing and treating glioma
TW200745163A (en) 2006-02-17 2007-12-16 Syntonix Pharmaceuticals Inc Peptides that block the binding of IgG to FcRn
US7919297B2 (en) 2006-02-21 2011-04-05 Cornell Research Foundation, Inc. Mutants of Aspergillus niger PhyA phytase and Aspergillus fumigatus phytase
US7574748B2 (en) 2006-03-07 2009-08-18 Nike, Inc. Glove with support system
US7990860B2 (en) 2006-06-16 2011-08-02 Harris Corporation Method and system for rule-based sequencing for QoS
US8430938B1 (en) 2006-07-13 2013-04-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Control algorithm for autothermal reformer
KR101146588B1 (ko) 2006-08-11 2012-05-16 삼성전자주식회사 Ｆｉｎ 구조체 및 이를 이용한 핀 트랜지스터의 제조방법
CN100589507C (zh) 2006-10-30 2010-02-10 华为技术有限公司 一种拨号提示系统及方法
US7466008B2 (en) 2007-03-13 2008-12-16 Taiwan Semiconductor Manufacturing Company, Ltd. BiCMOS performance enhancement by mechanical uniaxial strain and methods of manufacture
SG10201808730VA (en) * 2007-04-03 2018-11-29 Amgen Res Munich Gmbh Cross-species-specific binding domain
CN109456410B (zh) 2007-04-03 2022-01-28 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
US8209741B2 (en) 2007-09-17 2012-06-26 Microsoft Corporation Human performance in human interactive proofs using partial credit
US8464584B2 (en) 2007-10-19 2013-06-18 Food Equipment Technologies Company, Inc. Beverage dispenser with level measuring apparatus and display
WO2009067987A1 (de) 2007-11-29 2009-06-04 Luk Lamellen Und Kupplungsbau Beteiligungs Kg Kraftübertragungsvorrichtung, insbesondere zur leistungsübertragung zwischen einer antriebsmaschine und einem abtrieb
US8376279B2 (en) 2008-01-23 2013-02-19 Aurora Flight Sciences Corporation Inflatable folding wings for a very high altitude aircraft
CN102089325A (zh) 2008-04-17 2011-06-08 埃博灵克斯股份有限公司 能够结合血清白蛋白的肽，以及包含其的化合物、构建体和多肽
CA2738568C (en) 2008-10-01 2024-02-20 Micromet Ag Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
CN102341172A (zh) 2009-03-04 2012-02-01 日产自动车株式会社 废气净化催化剂及其制造方法
US8463191B2 (en) 2009-04-02 2013-06-11 Qualcomm Incorporated Beamforming options with partial channel knowledge
CN102741280B (zh) 2009-10-30 2015-12-02 诺维信生物制药丹麦公司 白蛋白变体
EP3907242A1 (en) * 2010-01-29 2021-11-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-dll3 antibody
US20130225496A1 (en) 2010-11-01 2013-08-29 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin Variants
CN103298648B (zh) 2010-12-30 2016-04-13 C.劳勃.汉默斯坦两合有限公司 适于机动车辆座椅的包括两对导轨的纵向调节装置
MX353816B (es) 2011-05-05 2018-01-30 Albumedix As Variantes de albumina.
EP3321286B1 (en) 2011-08-23 2021-01-06 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
US20130078250A1 (en) 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
HK1200842A1 (en) 2011-11-18 2015-08-14 Albumedix Ltd Proteins with improved half-life and other properties
RU2014138474A (ru) * 2012-02-24 2016-04-10 СтемСентРкс, Инк. Новые модуляторы и способы применения
MX2014010278A (es) 2012-03-16 2015-03-05 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
WO2014072481A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
US9243058B2 (en) * 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
JO3519B1 (ar) * 2013-01-25 2020-07-05 Amgen Inc تركيبات أجسام مضادة لأجل cdh19 و cd3
GB201302447D0 (en) * 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
AR095374A1 (es) * 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res Munich Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
US20140308285A1 (en) 2013-03-15 2014-10-16 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
MX357011B (es) 2013-03-15 2018-06-22 Amgen Inc Anticuerpos biespecificos heterodimericos.
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
JP6071725B2 (ja) 2013-04-23 2017-02-01 カルソニックカンセイ株式会社 電気自動車の駆動力制御装置
EP3049440B1 (en) 2013-09-25 2020-03-25 Amgen Inc. V-c-fc-v-c antibody
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
CN104592392B (zh) * 2015-01-21 2018-08-28 武汉友芝友生物制药有限公司 一种双特异性抗体EpCAM×CD3的构建及应用
JP6749312B2 (ja) * 2014-07-31 2020-09-02 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハーＡＭＧＥＮ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｍｕｎｉｃｈ）ＧｍｂＨ 最適化された種間特異的二重特異性単鎖抗体コンストラクト
UY36245A (es) * 2014-07-31 2016-01-29 Amgen Res Munich Gmbh Constructos de anticuerpos para cdh19 y cd3
US10105142B2 (en) 2014-09-18 2018-10-23 Ethicon Llc Surgical stapler with plurality of cutting elements
TWI796283B (zh) * 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
EA039859B1 (ru) * 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI829617B (zh) * 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI717375B (zh) * 2015-07-31 2021-02-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｃｄ７０及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) * 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI793062B (zh) * 2015-07-31 2023-02-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｄｌｌ３及ｃｄ３抗體構築體
SG11201805770UA (en) * 2016-02-03 2018-08-30 Amgen Res Munich Gmbh BCMA and CD3 Bispecific T Cell Engaging Antibody Constructs
CA3011942A1 (en) * 2016-02-03 2017-08-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
US11284893B2 (en) 2019-04-02 2022-03-29 Covidien Lp Stapling device with articulating tool assembly

Also Published As

Publication number Publication date
HK1249525A1 (zh) 2018-11-02
JP7166368B2 (ja) 2022-11-07
US20170037130A1 (en) 2017-02-09
DK3328889T3 (da) 2021-08-23
FI3865514T3 (fi) 2026-03-30
JP2022191477A (ja) 2022-12-27
PH12018500241A1 (en) 2018-08-13
JO3671B1 (ar) 2020-08-27
MX385605B (es) 2025-03-18
US20210309743A1 (en) 2021-10-07
AU2025202484A1 (en) 2025-05-01
CR20180066A (es) 2018-05-29
KR20250008980A (ko) 2025-01-16
US20190263907A1 (en) 2019-08-29
LT3328889T (lt) 2021-08-10
TN2017000549A1 (en) 2019-04-12
CY1124472T1 (el) 2022-07-22
MY184895A (en) 2021-04-30
CA3212157A1 (en) 2017-02-09
IL320033A (en) 2025-06-01
EP3865514B9 (en) 2026-05-20
BR112018000475A2 (pt) 2018-09-18
RS62248B1 (sr) 2021-09-30
MA64193B1 (fr) 2026-04-30
IL256871B (en) 2022-10-01
IL296409B1 (en) 2025-06-01
JP2025106535A (ja) 2025-07-15
US20250340639A1 (en) 2025-11-06
EP4382169A3 (en) 2024-10-09
CL2018000267A1 (es) 2018-10-05
CN108271376B (zh) 2021-11-12
SI3328889T1 (sl) 2021-09-30
MX2021009793A (es) 2021-09-08
TWI793062B (zh) 2023-02-21
ZA202006983B (en) 2023-03-29
US11591396B2 (en) 2023-02-28
RS67933B1 (sr) 2026-04-30
TW201708261A (zh) 2017-03-01
KR20220075455A (ko) 2022-06-08
CN108271376A (zh) 2018-07-10
MX2018001154A (es) 2018-05-23
US20230312717A1 (en) 2023-10-05
UA126964C2 (uk) 2023-03-01
US20200332002A1 (en) 2020-10-22
AU2016302569A1 (en) 2017-12-07
JP6827583B2 (ja) 2021-02-10
IL256871A (en) 2018-03-29
CN119371549A (zh) 2025-01-28
PT3328889T (pt) 2021-08-25
KR20180033501A (ko) 2018-04-03
AU2022268314A1 (en) 2022-12-15
JP2021061859A (ja) 2021-04-22
IL296409A (en) 2022-11-01
MA42530A (fr) 2021-03-24
ES2884211T3 (es) 2021-12-10
KR102404077B1 (ko) 2022-06-02
JP2021000088A (ja) 2021-01-07
IL256871B2 (en) 2023-02-01
EP3328889A1 (en) 2018-06-06
SG10201911548QA (en) 2020-01-30
AU2025271449A1 (en) 2026-01-08
PL3328889T3 (pl) 2021-12-06
EP3328889B1 (en) 2021-06-23
JP7668256B2 (ja) 2025-04-24
WO2017021349A1 (en) 2017-02-09
HRP20260436T1 (hr) 2026-05-08
HUE055112T2 (hu) 2021-10-28
AU2016302569B2 (en) 2022-08-25
CA2986848C (en) 2023-12-05
NZ778573A (en) 2025-06-27
US12304952B2 (en) 2025-05-20
NZ737339A (en) 2022-09-30
CA2986848A1 (en) 2017-02-09
CN114292336A (zh) 2022-04-08
HRP20211073T1 (hr) 2021-10-01
TW202346349A (zh) 2023-12-01
EP3865514B1 (en) 2026-02-11
IL296409B2 (en) 2025-10-01
CO2018000877A2 (es) 2018-04-19
LT3865514T (lt) 2026-05-11
EP4382169A2 (en) 2024-06-12
MA71409A (fr) 2025-04-30
MA42530B1 (fr) 2021-09-30
EP4706771A2 (en) 2026-03-11
SMT202100482T1 (it) 2021-09-14
PE20181152A1 (es) 2018-07-17
KR102749378B1 (ko) 2025-01-03
EP3865514A1 (en) 2021-08-18
US10683351B2 (en) 2020-06-16
CN114292336B (zh) 2024-10-18
JP2018527908A (ja) 2018-09-27
JP6824245B2 (ja) 2021-02-03
CL2020003046A1 (es) 2021-04-09
US12435139B2 (en) 2025-10-07
NZ778605A (en) 2025-05-30
KR20250008981A (ko) 2025-01-16
US10294300B2 (en) 2019-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12435139B2 (en) Antibody constructs for DLL3 and CD3
US11155629B2 (en) Method for treating glioblastoma or glioma with antibody constructs for EGFRVIII and CD3
MD3328891T2 (ro) Constructe de anticorp pentru FLT3 și CD3
MD3328893T2 (ro) Construcții de anticorpi bispecifici care leagă mezotelina şi CD3
AU2016302573A1 (en) Antibody constructs for CD70 and CD3
IL255076B2 (en) Bispecific antibody constructs for cdh3 and cd3
HK40056849B (en) Bispecific antibody binding dll3 and cd3
HK40105213A (en) Antibody constructs for dll3 and cd3
HK40056849A (en) Bispecific antibody binding dll3 and cd3
HK40064560A (en) Bispecific antibody constructs binding egfrviii and cd3
HK1249525B (en) Bispecific antibody constructs binding dll3 and cd3
HK1249523B (en) Bispecific antibody constructs binding egfrviii and cd3
BR112018001531B1 (pt) Construtos de anticorpo para cd70 e cd3, seus usos, composição farmacêutica e kit