RS67933B1

RS67933B1 - Bi-specifično antitelo koje vezuje dll3 i cd3

Info

Publication number: RS67933B1
Application number: RS20260391A
Authority: RS
Inventors: Tobias Raum; Peter Kufer; Jochen Pendzialek; Claudia Bluemel; Christoph Dahlhoff; Patrick Hoffmann; Ralf Lutterbuese; Elisabeth Nahrwold
Original assignee: Amgen Res Munich Gmbh
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2026-04-30
Also published as: HK1249525A1; JP7166368B2; US20170037130A1; DK3328889T3; FI3865514T3; JP2022191477A; PH12018500241A1; JO3671B1; MX385605B; US20210309743A1; AU2025202484A1; CR20180066A; KR20250008980A; US20190263907A1; LT3328889T; TN2017000549A1; CY1124472T1; MY184895A; CA3212157A1; IL320033A

Description

[0001] Opis

[0002] Predmetni pronalazak se odnosi na citotoksični bi-specifični konstrukt antitela sa jednim lancem koji obuhvata prvi domen vezivanja koji vezuje humani DLL3 na površini ciljne ćelije i drugi domen vezivanja koji vezuje humani CD3 na površini T-ćelije i CD3 makakija, pri čemu se prvi domen vezivanja vezuje za epitop DLL3 koji je sadržan unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 258, pri čemu je konstrukt antitela u formatu (scFv)2. Štaviše, pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira konstrukt antitela, vektor koji obuhvata navedeni polinukleotid i ćeliju domaćina transformisanu ili transfektovanu navedenim polinukleotidom ili vektorom. Pored toga, pronalazak obezbeđuje proces za proizvodnju konstrukta antitela prema pronalasku i medicinsku upotrebu navedenog konstrukta antitela.

[0004] Karcinom pluća malih ćelija (SCLC) je agresivan oblik karcinoma pluća sa lošom prognozom i ograničenim terapijskim opcijama, koji predstavlja oko 15% svih novodijagnostikovanih karcinoma pluća i jednak je broju od oko 25.000 novih slučajeva u SAD i 180.000 novih slučajeva širom sveta godišnje. Stope preživljavanja su ostale niske tokom nekoliko decenija, pri čemu samo 5% pacijenata sa SCLC preživi pet godina, velikim delom zbog nedostatka novih terapija za borbu protiv ovog oblika karcinoma pluća. Većina pacijenata se javlja sa bolešću u proširenom stadijumu, dok se oko trećine pacijenata javlja sa bolešću u ograničenom stadijumu, definisanom prisustvom tumora na samo jednoj strani grudnog koša i koji se uklapaju u jedno polje zračenja. Ovi stadijumi utiču na dostupne terapijske režime, pri čemu se bolest ograničenog stadijuma leči hemioterapijom i zračenjem, a bolest proširenog stadijuma samo hemioterapijom. Diseminovani, metastatski tumori sa karakteristikama sličnim limfomu su obeležje SCLC. Prva poznata dijagnoza kod pacijenata sa SCLC opisala ga je kao bolest limfnog sistema, ne prepoznajući ga kao karcinom pluća sve do 1926. godine, što naglašava deo jedinstvene prirode SCLC tumora u poređenju sa drugim solidnim tumorima.

[0006] [0003] Pacijenti obično dobro reaguju na trenutnu terapiju prve linije, koja uključuje etopozid i cisplatin, ali se neizbežno brzo vraćaju sa hemorezistentnom bolešću, za koju trenutno nisu dostupne terapijske opcije. Prognoza za relapsno-refraktorni oblik je izuzetno loša, sa brzom progresijom bolesti i kratkom medijanom preživljavanja kraćom od šest meseci. Štaviše, pacijenti sa SCLC imaju visoke stope komorbiditeta, uključujući hipertenziju, srčana oboljenja, dijabetes i paraneoplastične sindrome. Ovo, zajedno sa tipično poodmaklom starošću pacijenata sa SCLC, utiče na sposobnost pacijenata da izdrže teške hemioterapijske režime, dodatno ograničavajući opcije lečenja. Modalitet bi-specifičnog antitela, koji obuhvata scFv koji prepoznaje CD3 eksprimiran na T-ćelijama i drugi scFv koji prepoznaje antigen povezan sa tumorom, pokazao je obećavajuću efikasnost u klinici, sa visokim stopama odgovora kod hematoloških maligniteta kao što je refraktorni B-ALL (Topp, M.S. et al. Blood, 2012.120(26):p.5185-5187), što je rezultiralo odobrenjem leka Blincyto. Iako delotvornost terapija koje angažuju T-ćelije tek treba da se dokaže kod indikacija solidnih tumora, SCLC može predstavljati obećavajuću indikaciju solidnog tumora za modalitet bispecifičnog antitela CD3 x tumor cilj, s obzirom na diseminovanu prirodu bolesti. Stoga, bispecifični angažer T-ćelija koji usmerava T-ćelije protiv specifičnog tumorskog antigena predstavlja novu priliku kao nova terapijska opcija u lečenju SCLC.

[0008] DLL3 je predmetnim pronalaskom identifikovan kao tumorski antigen specifičan za SCLC sekvenciranjem sledeće generacije, upoređivanjem prevalencije DLL3 mRNK u panelu primarnih tumora pacijenata i velikoj kolekciji normalnih tkiva. Nivo ekspresije DLL3 u SCLC tumorima bio je umeren, ali veoma rasprostranjen, pri čemu je približno 90% analiziranih tumora pokazalo dokaze ekspresije DLL3 putem sekvenciranja RNK. Nasuprot SCLC tumorima, normalna tkiva su pokazala veoma nisku ekspresiju DLL3 transkripta, sa malim nivoima detektovanim u testisima, optičkom nervu i malom mozgu. Poređenje ćelijskih linija SCLC i tumora putem sekvenciranja RNK pokazalo je slične nivoe ekspresije, dok je kvantifikacija ekspresije DLL3 na površini ćelije na ćelijskim linijama SCLC ukazala na nivoe ekspresije ispod 5000 DLL3 po ćeliji, sa tipičnim nivoima ekspresije ispod 2000 DLL3/ćeliji. Ekspresija DLL3 proteina potvrđena je putem IHC, gde je 86% SCLC tumora pokazalo pozitivno bojenje na DLL3, sa homogenim i membranskim obrascem bojenja. Osim veoma slabog bojenja u malom mozgu, sva ostala normalna tkiva bila su negativna na bojenje na DLL3.

[0010] [0005] DLL3 je nekanonski Notch ligand, koji funkcioniše na ćelijski autonoman način tako što inhibira signalizaciju Notch, vezujući se za Notch u cis položaju, čime blokira interakcije između ćelija i internalizaciju Notch u ciljnoj ćeliji, što je obeležje kanonske Notch signalizacije. Primarna uloga DLL3 je u somitogenezi tokom embrionalnog razvoja. Miševi sa nokaut genom za DLL3 pokazuju segmentalni defekt aksijalnog skeleta i kranijalnog i neuronskog razvoja. Defekti somitskog obrasca se takođe vide kod ljudi sa određenim mutacijama DLL3 u polnim ćelijama, što rezultira stanjem koje se zove spondilokostalna dizostoza.

[0012] DLL3 je ranije predložen u metodama za dijagnostikovanje i lečenje glioma, pored SCLC, korišćenjem konjugata antitelo-lek (ADC) (WO 2013/126746). Korišćenje pristupa zasnovanog na ADC za DLL3 može imati ograničenja, s obzirom na niske nivoe ekspresije proteina na površini ćelije i smanjenu delotvornost ADC prema ciljevima sa niskom ekspresijom. Štaviše, ADC molekuli često pokazuju toksičnost povezanu sa slobodnim korisnim teretom, što je verovatno rezultat degradacije linkera, što dovodi do ograničenja maksimalne podnošljive doze i potencijalnih uticaja na delotvornost koji nisu povezani sa ciljem odabranim za antitelo. Manja je verovatnoća da će ovo biti problem za bi-specifični molekul koji angažuje T-ćelije, projektovan da istovremeno angažuje DLL3 i CD3, s obzirom na zahtevanu osetljivost T-ćelija prema njihovim ciljevima, a visoko potentna citotoksičnost in vitro je dokazana na ćelijskim linijama koje eksprimiraju nekoliko stotina ciljnih proteina po ćeliji. Pored toga, obično manja veličina bi-specifičnog konstrukta antitela koji angažuje T-ćelije u odnosu na normalno antitelo (IgG pune dužine) može poboljšati prodiranje u tkivo i povećati potenciju zbog efikasnijeg angažovanja ciljeva DLL3 i CD3, što rezultira poboljšanim formiranjem sinapse između T-ćelije i ciljne tumorske ćelije.

[0014] [0007] SCLC i dalje predstavlja značajnu nezadovoljenu medicinsku potrebu, i potrebne su nove terapijske opcije kako bi se poboljšali izgledi za ovu brojnu populaciju pacijenata. Gore razmatrani modalitet bi-specifičnog antitela je klinički validiran, i kao takav, konstrukt antitela koji cilja DLL3 i CD3 predstavlja obećavajuću novu mogućnost za lečenje SCLC i priliku da se poboljša preživljavanje pacijenata koji pate od ove indikacije. WO 2014/125273 opisuje metodu za lečenje ili profilaksu karcinoma pluća, pri čemu je DLL3 eksprimiran u navedenom karcinomu pluća. WO 2013/126746 otkriva izolovane DLL3 modulatore, koji mogu biti antitelo, i metode korišćenja takvih modulatora za lečenje određenih tipova karcinoma. Pošto i dalje postoji potreba za dostupnošću daljih opcija za lečenje tumorskih ili kancerskih bolesti povezanih sa prekomernom ekspresijom DLL3, ovim su obezbeđena sredstva i metode za rešavanje ovog problema u obliku bi-specifičnog konstrukta antitela sa jednim domenom vezivanja usmerenim prema DLL3 i drugim domenom vezivanja usmerenim prema CD3 na T-ćelijama.

[0016] Dakle, u prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje citotoksični bi-specifični konstrukt antitela sa jednim lancem koji obuhvata prvi domen vezivanja koji vezuje humani DLL3 na površini ciljne ćelije i drugi domen vezivanja koji vezuje humani CD3 na površini T-ćelije i CD3 makakija, pri čemu se prvi domen vezivanja vezuje za epitop DLL3 koji je sadržan unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 258, pri čemu je konstrukt antitela u formatu (scFv)2.

[0018] Mora se napomenuti da, na način na koji se koriste ovde, oblici jednine uključuju reference u množini osim ako kontekst jasno ne ukazuje drugačije. Tako, na primer, upućivanje na „reagens” uključuje jedan ili više takvih različitih reagenasa, a upućivanje na „metodu” uključuje upućivanje na ekvivalentne korake i metode poznate stručnjacima iz predmetne oblasti koji bi se mogli modifikovati ili zameniti metodama koje su ovde opisane.

[0020] Osim ako nije drugačije naznačeno, termin „najmanje” koji prethodi nizu elemenata treba razumeti tako da se odnosi na svaki element u nizu. Stručnjaci iz predmetne oblasti će prepoznati, ili će moći da utvrde koristeći samo rutinsko eksperimentisanje, mnoge ekvivalente specifičnim otelotvorenjima pronalaska koja su ovde opisana.

[0022] Termin „i/ili” gde god se ovde koristi uključuje značenje „i”, „ili” i „sve ili bilo koju drugu kombinaciju elemenata povezanih navedenim terminom”.

[0024] Termin „oko” ili „približno” kako se ovde koristi označava u opsegu od ±20%, poželjno u opsegu od ±15%, još poželjnije u opsegu od ±10% i najpoželjnije u opsegu od ±5% date vrednosti ili opsega.

[0026] U okviru ove specifikacije i patentnih zahteva koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč „obuhvatati”, i varijacije kao što su „obuhvata” i „obuhvatajući”, razumeće se tako da podrazumevaju uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka. Kada se ovde koristi, termin „obuhvatajući” može se zameniti terminom „sadržeći” ili „uključujući” ili ponekad, kada se ovde koristi, terminom „imajući”.

[0027] Kada se ovde koristi, „sastoji se od” isključuje bilo koji element, korak ili sastojak koji nije naveden u elementu zahteva. Kada se ovde koristi, „sastoji se suštinski od” ne isključuje materijale ili korake koji materijalno ne utiču na osnovne i nove karakteristike zahteva.

[0029] U svakom slučaju ovde, bilo koji od termina „obuhvatajući”, „sastoji se suštinski od” i „sastoji se od” može biti zamenjen bilo kojim od druga dva termina.

[0031] Termin „konstrukt antitela” odnosi se na molekul u kome su struktura i/ili funkcija zasnovane na strukturi i/ili funkciji antitela, npr. imunoglobulin molekula pune dužine ili celog imunoglobulin molekula. Konstrukt antitela je stoga sposoban da se veže za svoj specifični cilj ili antigen. Štaviše, konstrukt antitela prema pronalasku obuhvata minimalne strukturne zahteve antitela koji omogućavaju vezivanje za cilj. Ovaj minimalni zahtev može npr. biti definisan prisustvom najmanje tri CDR lakog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR teškog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona), poželjno svih šest CDR. Antitela na kojima su zasnovani konstrukti prema pronalasku uključuju, na primer, monoklonska, rekombinantna, himerna, deimunizovana, humanizovana i humana antitela.

[0033] [0017] U okviru definicije „konstrukata antitela” nalaze se antitela pune dužine ili cela antitela koja takođe uključuju antitela kamelida i druga imunoglobulinska antitela generisana biotehnološkim metodama ili procesima ili metodama proteinskog inženjeringa. Ova antitela pune dužine mogu biti, na primer, monoklonska, rekombinantna, himerna, deimunizovana, humanizovana i humana antitela. Takođe, u okviru definicije „konstrukata antitela” nalaze se fragmenti antitela pune dužine, kao što su VH, VHH, VL, (s)dAb, Fv, Fd, Fab, Fab', F(ab')2 ili „r IgG” („polu-antitelo”). Konstrukti antitela mogu biti i modifikovani fragmenti antitela, koji se takođe nazivaju varijante antitela, kao što su scFv, di-scFv ili bi(s)-scFv, scFv-Fc, scFv-zipper, scFab, Fab2, Fab3, dijatela, jednolančana dijatela, tandem dijatela (Tandab), tandem di-scFv, tandem tri-scFv, „minitela” ilustrovana strukturom koja je sledeća: (VH-VL-CH3)<2>, (scFv-CH3)<2>, ((scFv)<2>-CH3 CH3), ((scFv)<2>-CH3) ili (scFv-CH3-scFv)<2>, multitela kao što su trijatela ili tetratela, i antitela sa jednim domenom kao što su nanotela ili antitela sa jednim varijabilnim domenom koja obuhvataju samo jedan varijabilni domen, koji može biti VHH, VH ili VL, koji specifično vezuju antigen ili epitop nezavisno od drugih V regiona ili domena. Konstrukt antitela prema pronalasku je u formatu (scFv)2. Dalje su ovde opisana unakrsna tela, maksi tela, hetero Fc konstrukti i mono Fc konstrukti. Primeri za te formate biće opisani u daljem tekstu.

[0035] Domen vezivanja tipično može obuhvatati varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH); međutim, ne mora obuhvatati oba. Fd fragmenti, na primer, imaju dva VH regiona i često zadržavaju određenu funkciju vezivanja za antigen netaknutog domena za vezivanje antigena. Dodatni primeri za format fragmenata antitela, varijanti antitela ili domena vezivanja uključuju (1) Fab fragment, monovalentni fragment koji ima VL, VH, CL i CH1 domene; (2) F(ab')2 fragment, bivalentni fragment koji ima dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu šarke; (3) Fd fragment koji ima dva VH i CH1 domena; (4) Fv fragment koji ima VL i VH domene jedne grane antitela, (5) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji ima VH domen; (6) izolovan region koji određuje komplementarnost (CDR), i (7) jednolančani Fv (scFv) (na primer, izveden iz scFv-biblioteke). Primeri za takve konstrukte antitela opisani su npr. u WO 00/006605, WO 2005/040220, WO 2008/119567, WO 2010/037838, WO 2013/026837, WO 2013/026833, US 2014/0308285, US 2014/0302037, WO2014/144722, WO 2014/151910 i WO 2015/048272.

[0037] Štaviše, definicija termina „konstrukt antitela” uključuje monovalentne, bivalentne i polivalentne / multivalentne konstrukte i, stoga, monospecifične konstrukte, koji se specifično vezuju za samo jednu antigenu strukturu, kao i bi-specifične i polispecifične / multispecifične konstrukte, koji specifično vezuju više od jedne antigene strukture, npr. dve, tri ili više, putem različitih domena vezivanja. Štaviše, definicija termina „konstrukt antitela” uključuje molekule koji se sastoje od samo jednog polipeptidnog lanca, kao i molekule koji se sastoje od više od jednog polipeptidnog lanca, koji lanci mogu biti ili identični (homodimeri, homotrimeri ili homooligomeri) ili različiti (heterodimer, heterotrimer ili heterooligomer). Primeri za gore identifikovana antitela i njihove varijante ili derivate opisani su, između ostalog, u Harlow and Lane, Antibodies a laboratory manual, CSHL Press (1988) i Using Antibodies: a laboratory manual, CSHL Press (1999), Kontermann and Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed.2010 i Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009.

[0039] [0020] Konstrukti antitela prema predmetnom pronalasku su poželjno „in vitro generisani konstrukti antitela”. Ovaj termin se odnosi na konstrukt antitela prema gore navedenoj definiciji gde je ceo varijabilni region ili njegov deo (npr. najmanje jedan CDR) generisan selekcijom neimunih ćelija, npr. in vitro fagnim prikazom, proteinskim čipom ili bilo kojom drugom metodom u kojoj se kandidatne sekvence mogu testirati na njihovu sposobnost vezivanja za antigen. Ovaj termin stoga poželjno isključuje sekvence generisane isključivo genomskim preraspoređivanjem u imunoj ćeliji životinje. „Rekombinantno antitelo” je antitelo napravljeno upotrebom tehnologije rekombinantne DNK ili genetičkog inženjeringa.

[0041] Termin „monoklonsko antitelo” (mAb) ili konstrukt monoklonskog antitela, kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična, osim mogućih prirodnih mutacija i/ili post-translacionih modifikacija (npr. izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična i usmerena su protiv jednog antigenog mesta ili determinante na antigenu, za razliku od konvencionalnih (poliklonskih) preparata antitela koji tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (ili epitopa). Pored njihove specifičnosti, monoklonska antitela su prednost utoliko što se sintetišu u kulturi hibridoma, pa su stoga nekontaminirana drugim imunoglobulinima. Odrednica „monoklonsko” ukazuje na karakter antitela kao onog koje je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela i ne treba je tumačiti kao zahtev za proizvodnju antitela bilo kojom posebnom metodom.

[0043] Za pripremu monoklonskih antitela može se koristiti bilo koja tehnika koja obezbeđuje antitela proizvedena u kulturama kontinuiranih ćelijskih linija. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti mogu biti napravljena metodom hibridoma koju su prvi opisali Koehler et al., Nature, 256: 495 (1975), ili mogu biti napravljena metodama rekombinantne DNK (videti npr. američki patent br.4,816,567). Primeri daljih tehnika za proizvodnju humanih monoklonskih antitela uključuju tehniku trioma, tehniku humanog hibridoma B-ćelija (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) i EBV-hibridoma tehniku (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96).

[0045] [0023] Hibridomi se zatim mogu ispitati standardnim metodama, kao što su enzimski imunoasorbentni test (ELISA) i analiza površinske plazmonske rezonance (BIACORE<™>), radi identifikacije jednog ili više hibridoma koji proizvode antitelo koje se specifično vezuje za određeni antigen. Bilo koji oblik relevantnog antigena može se koristiti kao imunogen, npr. rekombinantni antigen, prirodni oblici, bilo koje varijante ili njihovi fragmenti, kao i njihov antigeni peptid. Površinska plazmonska rezonanca, kakva se primenjuje u BIAcore sistemu, može se koristiti za povećanje efikasnosti fagnih antitela koja se vezuju za epitop ciljnog antigena, kao što je DLL3 ili CD3 epsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

[0047] Još jedna primerna metoda pravljenja monoklonskih antitela uključuje ispitivanje biblioteka ekspresije proteina, npr. biblioteka fagnog prikaza ili ribozomskog prikaza. Fagni prikaz je opisan, na primer, u Ladner et al., američkom patentu br.5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

[0049] Pored upotrebe biblioteka prikaza, relevantni antigen se može koristiti za imunizaciju nehumane životinje, npr. glodara (kao što je miš, hrčak, zec ili pacov). U jednom otelotvorenju, nehumana životinja uključuje najmanje deo humanog gena za imunoglobulin. Na primer, moguće je projektovati sojeve miševa sa nedostatkom produkcije mišjih antitela sa velikim fragmentima lokusa humanog Ig (imunoglobulina). Upotrebom tehnologije hibridoma, monoklonska antitela specifična za antigen izvedena iz gena sa željenom specifičnošću mogu se proizvesti i odabrati. Videti npr. XENOMOUSE<™>, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21, US 2003-0070185, WO 96/34096 i WO 96/33735.

[0051] Monoklonsko antitelo se takođe može dobiti od nehumane životinje, a zatim modifikovati, npr. humanizovati, deimunizovati, učiniti himernim itd., upotrebom tehnika rekombinantne DNK poznatih u struci. Primeri modifikovanih konstrukta antitela uključuju humanizovane varijante nehumanih antitela, „afinitetno sazrela” antitela (videti npr. Hawkins et al. J. Mol. Biol.254, 889-896 (1992) i Lowman et al., Biochemistry 30, 10832-10837 (1991)) i mutante antitela sa izmenjenom efektorskom funkcijom ili funkcijama

[0052] (videti npr. američki patent br.5,648,260, Kontermann and Dübel (2010), loc. cit. and Little (2009), loc. cit.).

[0054] [0027] U imunologiji, sazrevanje afiniteta je proces kojim B-ćelije proizvode antitela sa povećanim afinitetom prema antigenu tokom imunskog odgovora. Sa ponovljenim izlaganjima istom antigenu, domaćin će proizvoditi antitela sukcesivno većih afiniteta. Poput prirodnog prototipa, in vitro sazrevanje afiniteta zasnovano je na principima mutacije i selekcije. In vitro sazrevanje afiniteta se uspešno koristi za optimizaciju antitela, konstrukta antitela i fragmenata antitela. Nasumične mutacije unutar CDR uvode se upotrebom zračenja, hemijskih mutagena ili PCR sklonog greškama. Pored toga, genetička raznolikost se može povećati mešanjem lanaca. Dve ili tri runde mutacije i selekcije upotrebom metoda prikaza kao što je fagni prikaz obično rezultiraju fragmentima antitela sa afinitetima u niskom nanomolarnom opsegu.

[0056] Poželjni tip varijacije supstitucije aminokiselina u konstruktima antitela uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Uopšteno, dobijena varijanta ili varijante odabrane za dalji razvoj imaće poboljšana biološka svojstva u odnosu na roditeljsko antitelo iz kojeg su generisane. Pogodan način za generisanje takvih varijanti supstitucije uključuje sazrevanje afiniteta upotrebom fagnog prikaza. Ukratko, nekoliko mesta hipervarijabilnog regiona (npr.

[0057] 6-7 mesta) se mutira da bi se generisale sve moguće supstitucije aminokiselina na svakom mestu. Varijante antitela tako generisane se prikazuju na monovalentan način iz filamentoznih fagnih čestica kao fuzije sa proizvodom gena III faga M13 upakovanog unutar svake čestice. Varijante prikazane na fagu se zatim ispituju na njihovu biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja) kao što je ovde otkriveno. Da bi se identifikovala kandidatna mesta hipervarijabilnog regiona za modifikaciju, može se izvršiti mutageneza skeniranjem alaninom kako bi se identifikovali ostaci hipervarijabilnog regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigen-antitelo kako bi se identifikovale tačke kontakta između domena vezivanja i, npr., humanog DLL3. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju prema tehnikama koje su ovde detaljno opisane. Kada se takve varijante generišu, panel varijanti se podvrgava ispitivanju kao što je ovde opisano i antitela sa superiornim svojstvima u jednom ili više relevantnih testova mogu se odabrati za dalji razvoj.

[0059] [0029] Monoklonska antitela i konstrukti antitela prema predmetnom pronalasku specifično uključuju „himerna” antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koja pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca ili lanaca identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste ili koja pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmente takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (američki patent br.4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Himerna antitela od interesa ovde uključuju „primitizovana” antitela koja obuhvataju sekvence vezivanja antigena varijabilnog domena izvedene od nehumanog primata (npr. majmuna Starog sveta, čovekolikog majmuna itd.) i sekvence humanog konstantnog regiona. Opisan je niz pristupa za pravljenje himernih antitela. Videti npr. Morrison et al., Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A.81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., američki patent br.4,816,567; Boss et al., američki patent br.4,816,397; Tanaguchi et al., EP 0171496; EP 0173494; i GB 2177096.

[0061] Antitelo, konstrukt antitela, fragment antitela ili varijanta antitela takođe se mogu modifikovati specifičnim brisanjem epitopa humanih T-ćelija (metoda nazvana „deimunizacija”) metodama otkrivenim na primer u WO 98/52976 ili WO 00/34317.

[0062] Ukratko, varijabilni domeni teškog i lakog lanca antitela mogu se analizirati na peptide koji se vezuju za MHC klase II; ovi peptidi predstavljaju potencijalne epitope T-ćelija (kao što je definisano u WO 98/52976 i WO 00/34317). Za detekciju potencijalnih epitopa T-ćelija može se primeniti pristup kompjuterskog modelovanja nazvan „nizanje peptida”, a pored toga se može pretražiti baza podataka peptida koji vezuju humani MHC klase II na motive prisutne u VH i VL sekvencama, kao što je opisano u WO 98/52976 i WO 00/34317. Ovi motivi se vezuju za bilo koji od 18 glavnih DR alotipova MHC klase II i tako predstavljaju potencijalne epitope T-ćelija. Detektovani potencijalni epitopi T-ćelija mogu se eliminisati supstitucijom malog broja aminokiselinskih ostataka u varijabilnim domenima, ili poželjno, pojedinačnim supstitucijama aminokiselina. Tipično se vrše konzervativne supstitucije. Često, ali ne isključivo, može se koristiti aminokiselina uobičajena za određeni položaj u sekvencama humanih antitela u polnim ćelijama. Sekvence humanih polnih ćelija su otkrivene npr.

[0063] u Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol.227:776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol.16 (5): 237-242; i Tomlinson et al. (1995) EMBO J.14: 14:4628-4638. V BASE direktorijum obezbeđuje sveobuhvatan direktorijum sekvenci varijabilnog regiona humanog imunoglobulina (sastavili Tomlinson, LA. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Ove sekvence se mogu koristiti kao izvor humane sekvence, npr. za okvirne regione i CDR. Konsenzusni humani okvirni regioni se takođe mogu koristiti, na primer kao što je opisano u američkom patentu br.6,300,064.

[0065] [0031] „Humanizovana” antitela, konstrukti antitela, varijante ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ili druge subsekvence antitela koje vezuju antigen) su antitela ili imunoglobulini pretežno humanih sekvenci, koji sadrže minimalnu sekvencu ili sekvence izvedene iz nehumanog imunoglobulina. Najvećim delom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primalac) u kojima su ostaci iz hipervarijabilnog regiona (takođe CDR) primaoca zamenjeni ostacima iz hipervarijabilnog regiona nehumane vrste (antitelo donor), kao što je miš, pacov, hrčak ili zec, koja ima željenu specifičnost, afinitet i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvirnog regiona (FR) Fv humanog imunoglobulina bivaju zamenjeni odgovarajućim nehumanim ostacima. Štaviše, „humanizovana antitela”, kako se ovde koristi, takođe mogu obuhvatati ostatke koji se ne nalaze ni u antitelu primaocu ni u antitelu donoru. Ove modifikacije se vrše radi daljeg prečišćavanja i optimizacije performansi antitela. Humanizovano antitelo takođe može obuhvatati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onog iz humanog imunoglobulina. Za više detalja, videti Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992).

[0067] Humanizovana antitela ili njihovi fragmenti mogu se generisati zamenom sekvenci Fv varijabilnog domena koje nisu direktno uključene u vezivanje antigena ekvivalentnim sekvencama iz humanih Fv varijabilnih domena. Primerne metode za generisanje humanizovanih antitela ili njihovih fragmenata obezbeđuju Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; i američki patent br.

[0068] 5,585,089; američki patent br.5,693,761; američki patent br.5,693,762; američki patent br.

[0069] 5,859,205; i američki patent br.6,407,213. Te metode uključuju izolovanje, manipulisanje i eksprimiranje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju sve ili deo Fv varijabilnih domena imunoglobulina iz najmanje jednog teškog ili lakog lanca. Takve nukleinske kiseline se mogu dobiti iz hibridoma koji proizvodi antitelo protiv unapred određenog cilja, kao što je gore opisano, kao i iz drugih izvora. Rekombinantna DNK koja kodira molekul humanizovanog antitela može se zatim klonirati u odgovarajući ekspresioni vektor.

[0071] Humanizovana antitela se takođe mogu proizvesti korišćenjem transgenih životinja, kao što su miševi koji eksprimiraju humane gene teškog i lakog lanca, ali su nesposobni da eksprimiraju endogene mišje gene teškog i lakog lanca imunoglobulina. Winter opisuje primernu metodu kalemljenja CDR koja se može koristiti za pripremu ovde opisanih humanizovanih antitela (američki patent br.5,225,539). Svi CDR određenog humanog antitela mogu se zameniti sa najmanje delom nehumanog CDR, ili se samo neki CDR mogu zameniti nehumanim CDR. Potrebno je zameniti samo onaj broj CDR koji je neophodan za vezivanje humanizovanog antitela za unapred određeni antigen.

[0072] Humanizovano antitelo se može optimizovati uvođenjem konzervativnih supstitucija, supstitucija konsenzusne sekvence, supstitucija u polnim ćelijama i/ili povratnih mutacija. Takvi izmenjeni imunoglobulinski molekuli mogu se napraviti bilo kojom od nekoliko tehnika poznatih u struci (npr. Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982 i EP 239400).

[0074] Termin „humano antitelo”, „konstrukt humanog antitela” i „humani domen vezivanja” uključuje antitela, konstrukte antitela i domene vezivanja koji imaju regione antitela kao što su varijabilni i konstantni regioni ili domeni koji suštinski odgovaraju sekvencama humanog imunoglobulina u polnim ćelijama poznatim u struci, uključujući, na primer, one koje su opisali Kabat et al. (1991) (loc. cit.). Humana antitela, konstrukti antitela ili humani domeni vezivanja prema pronalasku mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama humanog imunoglobulina u polnim ćelijama (npr. mutacije uvedene nasumičnom ili mestu-specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR, a naročito u CDR3. Humana antitela, konstrukti antitela ili domeni vezivanja mogu imati najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili više položaja zamenjenih aminokiselinskim ostatkom koji nije kodiran sekvencom humanog imunoglobulina u polnim ćelijama. Definicija humanih antitela, konstrukta antitela i domena vezivanja, kako se ovde koristi, takođe predviđa potpuno humana antitela, koja uključuju samo neveštački i/ili genetički neizmenjene humane sekvence antitela, kao što su ona koja se mogu dobiti korišćenjem tehnologija ili sistema kao što je Xenomouse.

[0076] U nekim otelotvorenjima, konstrukti antitela pronalaska su „izolovani” ili „suštinski čisti” konstrukti antitela. „Izolovan” ili „suštinski čist”, kada se koristi za opisivanje ovde otkrivenih konstrukta antitela, označava konstrukt antitela koji je identifikovan, odvojen i/ili povraćen iz komponente svog proizvodnog okruženja. Poželjno, konstrukt antitela je slobodan ili suštinski slobodan od povezanosti sa svim ostalim komponentama iz svog proizvodnog okruženja. Kontaminirajuće komponente njegovog proizvodnog okruženja, kao što su one koje potiču iz rekombinantnih transfektovanih ćelija, jesu materijali koji bi tipično ometali dijagnostičku ili terapijsku upotrebu polipeptida, i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. Konstrukti antitela mogu npr. činiti najmanje oko 5%, ili najmanje oko 50% težine ukupnog proteina u datom uzorku.

[0077] Podrazumeva se da izolovani protein može činiti od 5% do 99,9% težine ukupnog sadržaja proteina, zavisno od okolnosti. Polipeptid se može napraviti u značajno višoj koncentraciji upotrebom inducibilnog promotora ili promotora visoke ekspresije, tako da se pravi pri povećanim nivoima koncentracije. Definicija uključuje proizvodnju konstrukta antitela u širokom spektru organizama i/ili ćelija domaćina koji su poznati u struci. U poželjnim otelotvorenjima, konstrukt antitela će biti prečišćen (1) do stepena dovoljnog za dobijanje najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence upotrebom sekvenatora sa rotirajućom posudom, ili (2) do homogenosti putem SDS-PAGE pod neredukujućim ili redukujućim uslovima korišćenjem kumasi plave ili, poželjno, bojenja srebrom. Obično će se, međutim, izolovani konstrukt antitela pripremiti putem najmanje jednog koraka prečišćavanja.

[0079] Termin „domen vezivanja” karakteriše u vezi sa predmetnim pronalaskom domen koji se (specifično) vezuje za / stupa u interakciju sa / prepoznaje dati ciljni epitop ili dato ciljno mesto na ciljnim molekulima (antigenima), ovde: DLL3, odnosno CD3. Struktura i funkcija prvog domena vezivanja (koji prepoznaje DLL3), a poželjno i struktura i/ili funkcija drugog domena vezivanja (koji prepoznaje CD3), zasnovani su na strukturi i/ili funkciji antitela, npr. imunoglobulin molekula pune dužine ili celog imunoglobulin molekula. Prema pronalasku, prvi domen vezivanja je poželjno karakterisan prisustvom tri CDR lakog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR teškog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona). Drugi domen vezivanja poželjno takođe obuhvata minimalne strukturne zahteve antitela koji omogućavaju vezivanje za cilj. Još poželjnije, drugi domen vezivanja obuhvata najmanje tri CDR lakog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VL regiona) i/ili tri CDR teškog lanca (tj. CDR1, CDR2 i CDR3 VH regiona). Predviđeno je da se prvi i/ili drugi domen vezivanja proizvode ili da se mogu dobiti fagnim prikazom ili metodama ispitivanja biblioteka, pre nego kalemljenjem CDR sekvenci iz već postojećeg (monoklonskog) antitela u osnovu.

[0081] [0038] Prema predmetnom pronalasku, domeni vezivanja su u obliku jednog ili više polipeptida. Takvi polipeptidi mogu uključivati proteinske delove i neproteinske delove (npr. hemijske linkere ili hemijske agense za umrežavanje kao što je glutaraldehid). Proteini (uključujući njihove fragmente, poželjno biološki aktivne fragmente, i peptide, koji obično imaju manje od 30 aminokiselina) obuhvataju dve ili više aminokiselina međusobno povezanih kovalentnom peptidnom vezom (što dovodi do lanca aminokiselina). Termin „polipeptid” kako se ovde koristi opisuje grupu molekula koji se obično sastoje od više od 30 aminokiselina. Polipeptidi dalje mogu formirati multimere kao što su dimeri, trimeri i viši oligomeri, tj. koji se sastoje od više od jednog molekula polipeptida. Molekuli polipeptida koji formiraju takve dimere, trimere itd. mogu biti identični ili neidentični. Odgovarajuće strukture višeg reda takvih multimera se, konsekventno, nazivaju homo- ili heterodimeri, homo- ili heterotrimeri itd. Primer za heteromultimer je molekul antitela koji se, u svom prirodnom obliku, sastoji od dva identična laka polipeptidna lanca i dva identična teška polipeptidna lanca. Termini „peptid”, „polipeptid” i „protein” se takođe odnose na prirodno modifikovane peptide / polipeptide / proteine gde se modifikacija vrši npr. post-translacionim modifikacijama poput glikozilacije, acetilacije, fosforilacije i sličnog. „Peptid”, „polipeptid” ili „protein” kada se ovde pominju mogu takođe biti hemijski modifikovani, kao na primer pegilovani. Takve modifikacije su dobro poznate u struci i opisane su u daljem tekstu.

[0083] Poželjno je da domen vezivanja koji vezuje DLL3 i/ili domen vezivanja koji vezuje CD3 budu humani domeni vezivanja. Antitela i konstrukti antitela koji obuhvataju najmanje jedan humani domen vezivanja izbegavaju neke od problema povezanih sa antitelima ili konstruktima antitela koji poseduju nehumane varijabilne i/ili konstantne regione, kao što su oni kod glodara (npr. mišji, pacovski, kod hrčka ili zeca). Prisustvo takvih proteina izvedenih od glodara može dovesti do brzog klirensa antitela ili konstrukta antitela ili može dovesti do stvaranja imunskog odgovora pacijenta protiv antitela ili konstrukta antitela. Da bi se izbegla upotreba antitela ili konstrukta antitela izvedenih od glodara, humana ili potpuno humana antitela / konstrukti antitela mogu se generisati uvođenjem funkcije humanog antitela u glodara, tako da glodar proizvodi potpuno humana antitela.

[0085] Sposobnost kloniranja i rekonstrukcije humanih lokusa veličine megabaze u YAC i njihovog uvođenja u polne ćelije miša obezbeđuje moćan pristup za razjašnjavanje funkcionalnih komponenti veoma velikih ili grubo mapiranih lokusa, kao i za generisanje korisnih modela humanih bolesti. Nadalje, upotreba takve tehnologije za vršenje supstitucija mišjih lokusa njihovim humanim ekvivalentima mogla bi pružiti jedinstven uvid u ekspresiju i regulaciju humanih genskih produkata tokom razvoja, njihovu komunikaciju sa drugim sistemima i njihovu uključenost u indukciju i progresiju bolesti.

[0087] Važna praktična primena takve strategije je „humanizacija” humoralnog imunskog sistema miša. Uvođenje lokusa humanog imunoglobulina (Ig) u miševe kod kojih su endogeni geni za imunoglobulin inaktivisani nudi priliku za proučavanje mehanizama koji leže u osnovi programirane ekspresije i sklapanja antitela, kao i njihove uloge u razvoju Bćelija. Nadalje, takva strategija bi mogla da obezbedi idealan izvor za proizvodnju potpuno humanih monoklonskih antitela (mAb) - što je važna prekretnica ka ispunjenju obećanja terapije antitelima kod humanih bolesti. Očekuje se da će potpuno humana antitela ili konstrukti antitela minimizovati imunogene i alergijske odgovore svojstvene mišjim ili iz miševa izvedenim mAb i tako povećati delotvornost i bezbednost primenjenih antitela / konstrukta antitela. Može se očekivati da će upotreba potpuno humanih antitela ili konstrukta antitela pružiti značajnu prednost u lečenju hroničnih i povratnih humanih bolesti, kao što su inflamacija, autoimunost i kancer, koje zahtevaju ponovljenu primenu jedinjenja.

[0089] Jedan pristup ka ovom cilju bio je projektovanje sojeva miševa sa nedostatkom produkcije mišjih antitela sa velikim fragmentima humanih lokusa za imunoglobulin u očekivanju da će takvi miševi proizvoditi veliki repertoar humanih antitela u odsustvu mišjih antitela. Veliki fragmenti humanog Ig bi sačuvali veliku raznolikost varijabilnih gena, kao i pravilnu regulaciju proizvodnje i ekspresije antitela. Iskorišćavanjem mišje mašinerije za diverzifikaciju i selekciju antitela i nedostatka imunološke tolerancije na humane proteine, reprodukovani repertoar humanih antitela u ovim sojevima miševa trebalo bi da pruži antitela visokog afiniteta protiv bilo kog antigena od interesa, uključujući humane antigene.

[0090] Upotrebom tehnologije hibridoma, antigen-specifična humana mAb sa željenom specifičnošću mogla bi se lako proizvesti i odabrati. Ova opšta strategija je demonstrirana u vezi sa generisanjem prvih XenoMouse sojeva miševa (videti Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)). XenoMouse sojevi su projektovani sa veštačkim hromozomima kvasca (YAC) koji sadrže fragmente konfiguracije polnih ćelija lokusa humanog teškog lanca i kapa lakog lanca veličine 245 kb i 190 kb, respektivno, koji su sadržali osnovne sekvence varijabilnog i konstantnog regiona. YAC koji sadrže humani imunoglobulin pokazali su se kompatibilnim sa mišjim sistemom i za preraspoređivanje i za ekspresiju antitela i bili su sposobni da zamene inaktivisane mišje gene za Ig. To je dokazano njihovom sposobnošću da indukuju razvoj B-ćelija, da proizvedu repertoar potpuno humanih antitela sličan onom kod odraslih i da generišu antigen-specifična humana mAb. Ovi rezultati su takođe sugerisali da bi uvođenje većih delova humanih lokusa za imunoglobulin koji sadrže veći broj V gena, dodatne regulatorne elemente i konstantne regione humanog Ig moglo suštinski da rekapitulira puni repertoar koji je karakterističan za humani humoralni odgovor na infekciju i imunizaciju. Rad Green et al. je nedavno proširen na uvođenje više od približno 80% repertoara humanih antitela putem uvođenja YAC fragmenata konfiguracije polnih ćelija veličine megabaze lokusa humanog teškog lanca i kapa lakog lanca, respektivno. Videti Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

[0092] Proizvodnja XenoMouse miševa je dalje razmatrana i opisana u prijavama

[0093] za američke patente br.6,162,963; 6,150,584; 6,114,598; 6,075,181, i 5,939,598, kao i u japanskim patentima br.3 068 180 B2, 3068 506 B2, i 3068 507 B2. Videti

[0094] takođe Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i Green and Jakobovits J. Exp. Med.

[0095] 188:483-495 (1998), EP 0463 151 B1, WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310, i WO 03/47336.

[0097] U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International, Inc., koristili su pristup „minilokusa”. U pristupu minilokusa, egzogeni lokus imunoglobulina se imitira uključivanjem delova (pojedinačnih gena) iz lokusa imunoglobulina. Tako se jedan ili više VH gena, jedan ili više DH gena, jedan ili više JH gena, mu konstantni region i drugi konstantni region (poželjno gama konstantni region) formiraju u konstrukt za ugradnju u životinju. Ovaj pristup je opisan u američkom patentu br.5,545,807 autora Surani et al. i u američkim patentima br.

[0098] 5,545,806; 5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 5,770,429; 5,789,650; 5,814,318; 5,8 77,397; 5,874,299; i 6,255,458 svaki autora Lonberg and Kay, u američkim patentima br. 5,591,669 i 6,023.010 autora Krimpenfort and Berns, u američkim patentima br.

[0099] 5,612,205; 5,721,367; i 5,789,215 autora Berns et al., i u američkom patentu br.5,643,763 autora Choi and Dunn. Ovaj pristup je dalje opisan u GenPharm International američkim patentima br.5,569,825, 5,789,650, 5,545,806, 5,661,016, 5,814,318, i 5,364,079. Videti takođe EP 0546 073 B1, WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO

[0100] 98/24884 i američki patent br.5,981,175. Videti dalje Taylor et al. (1992), Chen et al. (1993), Tuaillon et al. (1993), Choi et al. (1993), Lonberg et al. (1994), Taylor et al. (1994), i Tuaillon et al. (1995), Fishwild et al. (1996).

[0102] [0045] Kirin je takođe demonstrirao generisanje humanih antitela iz miševa u koje su, putem mikrocitne fuzije, uvedeni veliki delovi hromozoma ili čitavi hromozomi. Videti evropske patentne prijave br.773 288 i 843961. Xenerex Biosciences razvija tehnologiju za potencijalno generisanje humanih antitela. U ovoj tehnologiji, SCID miševi se rekonstituišu humanim limfnim ćelijama, npr. B i/ili T-ćelijama. Miševi se zatim imunizuju antigenom i mogu generisati imunski odgovor protiv antigena. Videti američke patente br. 5,476,996; 5,698,767; i 5,958,765.

[0104] Odgovori u vidu humanih antimišjih antitela (HAMA) doveli su do toga da industrija priprema himerna ili na drugi način humanizovana antitela. Međutim, očekuje se da će se primetiti određeni odgovori u vidu humanih antihimernih antitela (HACA), naročito pri hroničnoj upotrebi antitela ili upotrebi u više doza. Stoga bi bilo poželjno obezbediti konstrukte antitela koji obuhvataju humani domen vezivanja protiv DLL3 i/ili humani domen vezivanja protiv CD3 kako bi se umanjila zabrinutost i/ili efekti odgovora u vidu HAMA ili HACA.

[0106] Termini „(specifično) se vezuje za”, „(specifično) prepoznaje”, „(specifično) je usmeren na” i „(specifično) reaguje sa” znače u skladu sa predmetnim pronalaskom da domen vezivanja stupa u interakciju ili specifično stupa u interakciju sa datim epitopom ili datim ciljnim mestom na ciljnim molekulima (antigenima), ovde: DLL3, odnosno CD3.

[0108] Termin „epitop” odnosi se na mesto na antigenu za koje se specifično vezuje domen vezivanja, antitelo ili imunoglobulin, ili derivat, fragment ili varijanta antitela ili imunoglobulina. „Epitop” je antigen i stoga se termin epitop ponekad ovde naziva i „antigenska struktura” ili „antigenska determinanta”. Dakle, domen vezivanja je „mesto interakcije sa antigenom”. Navedeno vezivanje/interakcija se takođe razume kao definisanje „specifičnog prepoznavanja”.

[0110] „Epitopi” mogu biti formirani od susednih aminokiselina ili nesusednih aminokiselina koje su dovedene u blizinu tercijarnim savijanjem proteina. „Linearni epitop” je epitop gde primarna sekvenca aminokiselina obuhvata prepoznati epitop. Linearni epitop tipično uključuje najmanje 3 ili najmanje 4, i obično najmanje 5 ili najmanje 6 ili najmanje 7, na primer, oko 8 do oko 10 aminokiselina u jedinstvenoj sekvenci.

[0112] [0050] „Konformacioni epitop”, za razliku od linearnog epitopa, jeste epitop kod kojeg primarna sekvenca aminokiselina koje čine epitop nije jedina definišuća komponenta prepoznatog epitopa (npr. epitop kod kojeg domen vezivanja ne prepoznaje nužno primarnu sekvencu aminokiselina). Tipično, konformacioni epitop obuhvata povećan broj aminokiselina u odnosu na linearni epitop. Što se tiče prepoznavanja konformacionih epitopa, domen vezivanja prepoznaje trodimenzionalnu strukturu antigena, poželjno peptida ili proteina ili njihovog fragmenta (u kontekstu predmetnog pronalaska, antigenska struktura za prvi domen vezivanja obuhvaćena je unutar proteina DLL3). Na primer, kada se molekul proteina savije da bi formirao trodimenzionalnu strukturu, određene aminokiseline i/ili polipeptidna osnova koji čine konformacioni epitop bivaju dovedeni u blizinu, omogućavajući antitelu da prepozna epitop. Metode određivanja konformacije epitopa uključuju, ali nisu ograničene na, kristalografiju rendgenskim zracima, dvodimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonancu (2D-NMR) spektroskopiju i ciljanu spin-markaciju i elektronsku paramagnetnu rezonantnu (EPR) spektroskopiju.

[0114] Metoda za mapiranje epitopa opisana je u nastavku: Kada se region (kontinuirani niz aminokiselina) u humanom DLL3 proteinu zameni odgovarajućim regionom nehumanog i neprimatskog DLL3 antigena (npr. mišji DLL3, mada se mogu zamisliti i drugi poput onih kod pileta, pacova, hrčka, zeca itd.), očekuje se da dođe do smanjenja vezivanja domena vezivanja, osim ako domen vezivanja nije unakrsno reaktivan za korišćeni nehumani, neprimatski DLL3. Navedeno smanjenje je poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40% ili 50%; još poželjnije najmanje 60%, 70% ili 80%, a najpoželjnije 90%, 95% ili čak 100% u poređenju sa vezivanjem za odgovarajući region u humanom DLL3 proteinu, pri čemu je vezivanje za odgovarajući region u humanom DLL3 proteinu postavljeno na 100%.

[0115] Predviđeno je da se gorepomenute humane DLL3 / nehumane DLL3 himere eksprimiraju u CHO ćelijama. Takođe je predviđeno da humane DLL3 / nehumane DLL3 himere budu fuzionisane sa transmembranskim domenom i/ili citoplazmatskim domenom drugog membranskog proteina kao što je EpCAM.

[0117] [0052] U alternativnoj ili dodatnoj metodi za mapiranje epitopa, može se generisati nekoliko skraćenih verzija ekstracelularnog domena humanog DLL3 kako bi se odredio specifičan region koji prepoznaje domen vezivanja. U ovim skraćenim verzijama, različiti ekstracelularni DLL3 domeni / subdomeni ili regioni se postepeno brišu, počevši od N-terminusa. Skraćene DLL3 verzije koje su generisane i korišćene u kontekstu predmetnog pronalaska prikazane su na slici 1. Predviđeno je da se skraćene DLL3 verzije eksprimiraju u CHO ćelijama. Takođe je predviđeno da skraćene DLL3 verzije budu fuzionisane sa transmembranskim domenom i/ili citoplazmatskim domenom drugog membranskog proteina kao što je EpCAM. Takođe je predviđeno da skraćene DLL3 verzije obuhvataju domen signalnog peptida na svom N-terminusu, na primer signalni peptid izveden iz signalnog peptida teškog lanca mišjeg IgG. Nadalje je predviđeno da skraćene DLL3 verzije obuhvataju v5 domen na svom N-terminusu (nakon signalnog peptida) koji omogućava proveru njihove pravilne ekspresije na površini ćelije. Očekuje se da će doći do smanjenja ili gubitka vezivanja kod onih skraćenih DLL3 verzija koje više ne obuhvataju DLL3 region koji prepoznaje domen vezivanja. Smanjenje vezivanja je poželjno najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%; još poželjnije najmanje 60%, 70%, 80%, a najpoželjnije 90%, 95% ili čak 100%, pri čemu je vezivanje za ceo humani DLL3 protein (ili njegov ekstracelularni region ili domen) postavljeno na 100%. Metoda za testiranje ovog gubitka vezivanja opisana je u primeru 2.

[0119] Dalja metoda za određivanje doprinosa specifičnog ostatka ciljnog antigena prepoznavanju od strane konstrukta antitela ili domena vezivanja je skeniranje alaninom (videti npr. Morrison KL & Weiss GA. Cur Opin Chem Biol.2001 Jun;5(3):302-7), gde se svaki ostatak koji se analizira zamenjuje alaninom, npr. putem mestu-usmerene mutageneze. Alanin se koristi zbog svoje nemasivne, hemijski inertne metil funkcionalne grupe koja ipak oponaša reference sekundarne strukture koje poseduju mnoge druge aminokiseline. Ponekad se masivne aminokiseline kao što su valin ili leucin mogu koristiti u slučajevima kada se želi očuvanje veličine mutiranih ostataka. Skeniranje alaninom je zrela tehnologija koja se koristi tokom dugog vremenskog perioda.

[0121] Interakcija između domena vezivanja i epitopa ili regiona koji obuhvata epitop podrazumeva da domen vezivanja pokazuje primetan afinitet za epitop / region koji obuhvata epitop na određenom proteinu ili antigenu (ovde: DLL3, odnosno CD3) i, generalno, ne pokazuje značajnu reaktivnost sa proteinima ili antigenima koji nisu DLL3 ili CD3.

[0122] „Primetan afinitet” uključuje vezivanje sa afinitetom od oko 10<-6>M (KD) ili jačim. Poželjno, vezivanje se smatra specifičnim kada je afinitet vezivanja oko 10<-12>do 10<-8>M, 10<-12>do 10<-9>M, 10<-12>do 10<-10>M, 10<-11>do 10<-8>M, poželjno oko 10<-11>do 10<-9>M. Da li domen vezivanja specifično reaguje sa ciljem ili se za njega vezuje, može se lako testirati, između ostalog, poređenjem reakcije navedenog domena vezivanja sa ciljnim proteinom ili antigenom sa reakcijom navedenog domena vezivanja sa proteinima ili antigenima koji nisu DLL3 ili CD3. Poželjno, domen vezivanja pronalaska se suštinski ili značajno ne vezuje za proteine ili antigene koji nisu DLL3 ili CD3 (tj. prvi domen vezivanja nije sposoban za vezivanje za proteine koji nisu DLL3, a drugi domen vezivanja nije sposoban za vezivanje za proteine koji nisu CD3).

[0123] Termin „suštinski / značajno se ne vezuje” ili „nije sposoban za vezivanje” označava da domen vezivanja predmetnog pronalaska ne vezuje protein ili antigen koji nije DLL3 ili CD3, tj. ne pokazuje reaktivnost veću od 30%, poželjno ne više od 20%, još poželjnije ne više od 10%, naročito poželjno ne više od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% sa proteinima ili antigenima koji nisu DLL3 ili CD3, pri čemu je vezivanje za DLL3, odnosno CD3, postavljeno na 100%.

[0125] Takođe je predviđeno da se konstrukti antitela predmetnog pronalaska vezuju za izoformu humanog DLL3 koja ima jednu ili obe od sledećih tačkastih mutacija DLL3: F172C i L218P. Videti primer 5.

[0127] Veruje se da se specifično vezivanje ostvaruje putem specifičnih motiva u aminokiselinskoj sekvenci domena vezivanja i antigena. Dakle, vezivanje se postiže kao rezultat njihove primarne, sekundarne i/ili tercijarne strukture, kao i rezultat sekundarnih modifikacija navedenih struktura. Specifična interakcija mesta interakcije sa antigenom sa njegovim specifičnim antigenom može rezultirati jednostavnim vezivanjem navedenog mesta za antigen. Štaviše, specifična interakcija mesta interakcije sa antigenom sa njegovim specifičnim antigenom može alternativno ili dodatno rezultirati pokretanjem signala, npr. usled indukcije promene konformacije antigena, oligomerizacije antigena itd.

[0129] Ovde opisani konstrukti antitela vezuju se za epitop DLL3 koji je obuhvaćen unutar regiona prikazanog u SEQ ID NO: 260, što odgovara nizu aminokiselina koji obuhvata regione EGF-3 i EGF-4. Druge grupe anti-DLL3 vezivnih sredstava su takođe generisane i njihove specifičnosti vezivanja za DLL3 su identifikovane tokom mapiranja epitopa (videti primer 2).

[0131] Najveća grupa generisanih vezivnih sredstava prepoznala je epitop unutar DSL domena. Međutim, nijedan od tih konstrukata antitela nije ispunio kriterijume za dovoljnu citotoksičnu aktivnost u inicijalnom 18-časovnom testu citotoksičnosti zasnovanom na<51>Cr, sa stimulisanim humanim CD8+ T-ćelijama kao efektorskim ćelijama i hu DLL3 transfektovanim CHO ćelijama kao ciljnim ćelijama.

[0132] U daljem inicijalnom 48-časovnom testu citotoksičnosti zasnovanom na FACS (korišćenjem nestimulisanih humanih PBMC kao efektorskih ćelija i hu DLL3 transfektovanih CHO ćelija kao ciljnih ćelija), ona vezivna sredstva koja su prepoznala DLL3 epitop unutar N-terminusa proteina imala su vrednosti EC50 između 1455 i 1580 pM. U predmetnom kontekstu, ove vrednosti se ne smatraju adekvatnim za bispecifična antitela koja su predviđena za terapijsku upotrebu u usmeravanju imunskog sistema pacijenta, konkretnije citotoksične aktivnosti T-ćelija, protiv ćelija raka.

[0134] Konačno, generisana je još jedna grupa vezivnih sredstava i karakterisana je njena citotoksična aktivnost u različitim testovima. Mapiranje epitopa ovih vezivnih sredstava otkrilo je specifičnost za DLL3 epitop sadržan unutar EGF-5 regiona, a u određenoj meri i unutar EGF-6 regiona (za detalje, videti primer 2). Opšti pregled podataka generisanih u različitim testovima citotoksičnosti (videti primere 8.3, 8.5, 8.6 i 8.7) za ova vezivna sredstva nazvana DLL3-18, DLL3-19, DLL3-20 i DLL3-21 otkrio je sledeće: Iako sva vezivna sredstva ne podbace u svim testovima u pogledu povoljnih vrednosti EC50, čitava grupa jasno postiže lošije rezultate u poređenju sa konstruktima antitela prema pronalasku. Ovo zapažanje je naglašeno tamnijim senčenjem rezultata prikazanih u tabelama 6-9.

[0136] Ukratko, može se jasno navesti da konstrukti antitela prema pronalasku (koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 260) pokazuju ubedljivo najbolje performanse aktivnosti u poređenju sa nizom drugih grupa DLL3 vezivnih sredstava koja imaju različite specifičnosti epitopa. Drugim rečima, konstrukti antitela prema pronalasku predstavljaju povoljan odnos epitopa i aktivnosti, čime podržavaju snažnu citotoksičnu aktivnost posredovanu bispecifičnim konstruktom antitela.

[0138] Predmetni pronalazak obezbeđuje citotoksični bispecifični jednolančani konstrukt antitela koji obuhvata prvi domen vezivanja koji se vezuje za humani DLL3 na površini ciljne ćelije i drugi domen vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T-ćelije i makaki CD3, pri čemu se prvi domen vezivanja vezuje za epitop DLL3 koji je sadržan unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 258, pri čemu je konstrukt antitela u formatu (scFv)2.

[0140] Poželjno, prvi domen vezivanja bispecifičnog konstrukta antitela prema pronalasku obuhvata VH region koji obuhvata CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji obuhvata CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe koju čine:

[0141] a) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 31, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 32, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 33, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 34, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 35 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 36;

[0142] b) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 41, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 42, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 43, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 44, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 45 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 46;

[0143] c) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 51, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 52, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 53, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 54, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 55 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 56;

[0144] d) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 61, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 62, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 63, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 64, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 65 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 66;

[0145] e) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 71, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 72, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 73, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 74, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 75 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 76;

[0146] f) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 81, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 82, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 83, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 84, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 85 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 86;

[0147] g) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 91, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 92, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 93, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 94, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 95 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 96;

[0148] h) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 101, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 102, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 103, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 104, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 105 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 106; i

[0149] i) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 111, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 112, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 113, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 114, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 115 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 116.

[0151] Termin „varijabilni” odnosi se na delove antitela ili imunoglobulinskih domena koji pokazuju varijabilnost u svojoj sekvenci i koji učestvuju u određivanju specifičnosti i afiniteta vezivanja određenog antitela (tj. „varijabilni domen(i)”). Uparivanje varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL) zajedno formira jedno mesto vezivanja antigena.

[0153] Varijabilnost nije ravnomerno raspoređena kroz varijabilne domene antitela; ona je koncentrisana u poddomenima svakog od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca. Ovi poddomeni se nazivaju „hipervarijabilni regioni” ili „regioni koji određuju komplementarnost” (CDR). Konzerviraniji (tj. nehipervarijabilni) delovi varijabilnih domena nazivaju se „okvirni” regioni (FRM ili FR) i obezbeđuju osnovu za šest CDR u trodimenzionalnom prostoru kako bi se formirala površina za vezivanje antigena. Varijabilni domeni prirodnih teških i lakih lanaca obuhvataju po četiri FRM regiona (FR1, FR2, FR3 i FR4), koji uglavnom usvajaju konfiguraciju β-ravni, povezanih trima hipervarijabilnim regionima, koji formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima i čine deo strukture βravni. Hipervarijabilne regione u svakom lancu FRM drži zajedno u bliskoj blizini i oni, sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca, doprinose formiranju mesta vezivanja antigena (videti Kabat et al., loc. cit.).

[0155] Termini „CDR” i njegova množina odnose se na region koji određuje komplementarnost, od kojih tri čine karakter vezivanja varijabilnog regiona lakog lanca (CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3), a tri čine karakter vezivanja varijabilnog regiona teškog lanca (CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3). CDR sadrže većinu ostataka odgovornih za specifične interakcije antitela sa antigenom i stoga doprinose funkcionalnoj aktivnosti molekula antitela: oni su glavni determinatori specifičnosti antigena.

[0157] Tačne definisane granice i dužine CDR podležu različitim sistemima klasifikacije i numeracije. CDR se stoga mogu navoditi prema Kabatu, Čotiji, kontaktu ili bilo kojim drugim definicijama granica, uključujući sistem numeracije opisan u ovom dokumentu.

[0158] Uprkos različitim granicama, svaki od ovih sistema ima određeni stepen preklapanja u pogledu onoga što čini takozvane „hipervarijabilne regione” unutar varijabilnih sekvenci.

[0159] Definicije CDR prema ovim sistemima se stoga mogu razlikovati po dužini i graničnim oblastima u odnosu na susedni okvirni region. Videti na primer Kabat (pristup zasnovan na varijabilnosti sekvence između vrsta), Čotija (pristup zasnovan na kristalografskim studijama kompleksa antigen-antitelo) i/ili Makalum (Kabat et al., loc. cit.; Chothia et al., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901-917; i MacCallum et al., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Još jedan standard za karakterizaciju mesta vezivanja antigena je AbM definicija koju koristi softver za modelovanje antitela AbM kompanije Oxford Molecular. Videti npr. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. U: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). U meri u kojoj dve tehnike identifikacije ostataka definišu regione koji se preklapaju, ali nisu identični, oni se mogu kombinovati da bi se definisao hibridni CDR. Međutim, poželjno je numerisanje u skladu sa takozvanim Kabatovim sistemom.

[0161] Tipično, CDR formiraju strukturu petlje koja se može klasifikovati kao kanonska struktura. Termin „kanonska struktura” odnosi se na konformaciju glavnog lanca koju usvajaju petlje za vezivanje antigena (CDR). Iz komparativnih strukturnih studija utvrđeno je da pet od šest petlji za vezivanje antigena ima samo ograničen repertoar dostupnih konformacija. Svaka kanonska struktura može se karakterisati torzionim uglovima polipeptidne osnove. Odgovarajuće petlje između antitela mogu, stoga, imati veoma slične trodimenzionalne strukture, uprkos visokoj varijabilnosti sekvence aminokiselina u većini delova petlji (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia et al., Nature, 1989, 342: 877; Martin and Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Štaviše, postoji odnos između usvojene strukture petlje i sekvenci aminokiselina koje je okružuju. Konformacija određene kanonske klase određena je dužinom petlje i ostacima aminokiselina koji se nalaze na ključnim pozicijama unutar petlje, kao i unutar konzerviranog okvira (tj. izvan petlje). Dodela određenoj kanonskoj klasi može se, stoga, izvršiti na osnovu prisustva ovih ključnih ostataka aminokiselina.

[0163] [0070] Termin „kanonska struktura” može takođe uključivati razmatranja u pogledu linearne sekvence antitela, na primer, onako kako je katalogizovao Kabat (Kabat et al., loc. cit.). Kabatova šema (sistem) numerisanja je široko usvojen standard za numerisanje aminokiselinskih ostataka varijabilnog domena antitela na dosledan način i predstavlja poželjnu šemu koja se primenjuje u predmetnom pronalasku, kao što je takođe pomenuto na drugom mestu u ovom dokumentu. Dodatna strukturna razmatranja se takođe mogu koristiti za određivanje kanonske strukture antitela. Na primer, one razlike koje nisu u potpunosti odražene Kabatovim numerisanjem mogu se opisati sistemom numerisanja Čotije i saradnika i/ili otkriti drugim tehnikama, na primer, kristalografijom i dvodimenzionalnim ili trodimenzionalnim kompjuterskim modelovanjem. U skladu sa tim, data sekvenca antitela može se svrstati u kanonsku klasu koja omogućava, između ostalog, identifikaciju odgovarajućih osnovnih sekvenci (npr. na osnovu želje da se u biblioteku uključi niz kanonskih struktura). Kabatovo numerisanje aminokiselinskih sekvenci antitela i strukturna razmatranja kako su ih opisali Čotija i saradnici, loc. cit., kao i njihove implikacije za tumačenje kanonskih aspekata strukture antitela, opisani su u literaturi. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate u ovoj struci. Za pregled strukture antitela, videti Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988.

[0165] CDR3 lakog lanca i, naročito, CDR3 teškog lanca mogu predstavljati najvažnije determinante u vezivanju antigena unutar varijabilnih regiona lakog i teškog lanca. U nekim konstruktima antitela, čini se da CDR3 teškog lanca predstavlja glavnu oblast kontakta između antigena i antitela. Sheme selekcije in vitro u kojima se varira samo CDR3 mogu se koristiti za variranje svojstava vezivanja antitela ili za određivanje koji ostaci doprinose vezivanju antigena. Stoga je CDR3 tipično najveći izvor molekularnog diverziteta unutar mesta vezivanja antitela. H3, na primer, može biti kratak od samo dva aminokiselinska ostatka ili duži od 26 aminokiselina.

[0167] U klasičnom antitelu pune dužine ili imunoglobulinu, svaki laki (L) lanac je povezan sa teškim (H) lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca međusobno povezana jednom ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. CH domen koji je najbliži VH regionu obično se označava kao CH1. Konstantni

domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što su citotoksičnost zavisna od antitela posredovana ćelijama i aktivacija komplementa. Fc region antitela sadržan je unutar konstantnih domena teškog lanca i, na primer, sposoban je da stupi u interakciju sa Fc receptorima koji se nalaze na površini ćelije.

[0169] [0073] Sekvenca gena antitela nakon sklapanja i somatske mutacije je veoma raznolika i procenjuje se da ovi varijabilni geni kodiraju 10<10>različitih molekula antitela (Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995). U skladu sa tim, imunski sistem obezbeđuje repertoar imunoglobulina. Termin „repertoar” odnosi se na najmanje jednu nukleotidnu sekvencu izvedenu u celini ili delimično iz najmanje jedne sekvence koja kodira najmanje jedan imunoglobulin. Sekvenca(e) se može generisati preuređivanjem in vivo V, D i J segmenata teških lanaca, kao i V i J segmenata lakih lanaca. Alternativno, sekvenca(e) se može generisati iz ćelije kao odgovor na koji dolazi do preuređivanja, npr. in vitro stimulacijom. Alternativno, deo ili sve sekvence se mogu dobiti spajanjem DNK, sintezom nukleotida, mutagenezom i drugim metodama, videti, npr. američki patent br.5,565,332.. Repertoar može uključivati samo jednu sekvencu ili može uključivati mnoštvo sekvenci, uključujući one u genetički raznolikoj kolekciji.

[0171] Poželjni konstrukt antitela prema pronalasku može se definisati i kao citotoksični bispecifični jednolančani konstrukt antitela koji je u formatu (scFv)2 i koji obuhvata prvi (poželjno humani) domen vezivanja koji se vezuje za humani DLL3 na površini ciljne ćelije i drugi domen vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T-ćelije i makaka CD3, pri čemu se prvi domen vezivanja vezuje za isti epitop DLL3 kao i antitelo izabrano iz grupe koju čine DLL3-4, DLL3-5, DLL3-6, DLL3-7, DLL3-8, DLL3-9 i DLL3-10, tj. antitelo koje obuhvata VH region koji obuhvata CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji obuhvata CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe koju čine:

[0172] a) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 31, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 32, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 33, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 34, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 35 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 36;

[0173] b) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 41, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 42, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 43, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 44, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 45 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 46;

[0174] c) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 51, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 52, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 53, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 54, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 55 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 56;

[0175] d) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 61, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 62, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 63, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 64, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 65 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 66;

[0176] e) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 71, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 72, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 73, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 74, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 75 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 76;

[0177] f) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 81, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 82, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 83, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 84, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 85 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 86; i

[0178] g) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 91, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 92, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 93, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 94, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 95 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 96.

[0180] Da li se konstrukt antitela vezuje za isti epitop DLL3 kao i drugi dati konstrukt antitela može se meriti, npr., mapiranjem epitopa pomoću himernih ili skraćenih ciljnih molekula, npr. kao što je gore opisano i u primeru 2.

[0182] Konstrukt antitela prema ovom obelodanjivanju može se definisati i kao bispecifični konstrukt antitela koji obuhvata prvi (poželjno humani) domen vezivanja koji se vezuje za humani DLL3 na površini ciljne ćelije i drugi domen vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T-ćelije, pri čemu se prvi domen vezivanja nadmeće za vezivanje sa antitelom izabranim iz grupe koju čine DLL3-4, DLL3-5, DLL3-6, DLL3-7, DLL3-8, DLL3-9 i DLL3-10, tj. antitelom koje obuhvata VH region koji obuhvata CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji obuhvata CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe onih koji su gore opisani.

[0184] Da li se konstrukt antitela nadmeće za vezivanje sa drugim datim konstruktom antitela može se meriti u testu nadmetanja, kao što je kompetitivni ELISA test ili test nadmetanja zasnovan na ćelijama. Takođe se mogu koristiti mikročestice (kuglice) vezane za avidin. Slično ELISA ploči obloženoj avidinom, kada reaguju sa biotinilovanim proteinom, svaka od ovih kuglica se može koristiti kao supstrat na kojem se može izvršiti test. Antigen se nanosi na kuglicu, a zatim se prethodno nanosi prvo antitelo. Dodaje se drugo antitelo i određuje se svako dodatno vezivanje. Očitavanje se vrši putem protočne citometrije.

[0185] U jednom otelotvorenju pronalaska, prvi domen vezivanja konstrukta antitela prema pronalasku obuhvata VH region izabran iz grupe koju čine oni prikazani u SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 435 i SEQ ID NO: 529.

[0187] U daljem otelotvorenju, prvi domen vezivanja konstrukta antitela prema pronalasku obuhvata VL region izabran iz grupe koju čine oni prikazani u SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 436 i SEQ ID NO: 530.

[0189] U drugom otelotvorenju, prvi domen vezivanja konstrukta antitela prema pronalasku obuhvata VH region i VL region izabrane iz grupe koju čine parovi VH regiona i VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 37+38; SEQ ID NO: 47+48; SEQ ID NO: 57+58; SEQ ID NO: 67+68; SEQ ID NO: 77+78; SEQ ID NO: 87+88; SEQ ID NO: 97+98; SEQ ID NO: 107+108; SEQ ID NO: 117+118; SEQ ID NO: 435+436; i SEQ ID NO: 529+530.

[0191] U još daljem otelotvorenju, prvi domen vezivanja konstrukta antitela prema pronalasku obuhvata polipeptid izabran iz grupe koju čine oni prikazani u SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 437 i SEQ ID NO: 531.

[0193] Gore navedeni prvi domeni vezivanja (koji su specifikovani svojim CDR, VH regionom i VL regionom i njihovim kombinacijama) karakterišu se kao domeni vezivanja koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 258.

[0195] [0083] Termin „bispecifični”, kako se ovde koristi, odnosi se na konstrukt antitela koji je „najmanje bispecifičan”, tj. obuhvata najmanje prvi domen vezivanja i drugi domen vezivanja, pri čemu se prvi domen vezivanja vezuje za jedan antigen ili cilj (ovde: DLL3), a drugi domen vezivanja se vezuje za drugi antigen ili cilj (ovde: CD3). U skladu sa tim, konstrukti antitela prema pronalasku obuhvataju specifičnosti za najmanje dva različita antigena ili cilja. Termin „bispecifični konstrukt antitela” prema pronalasku takođe obuhvata multispecifične konstrukte antitela, kao što su trispecifični konstrukti antitela, pri čemu ovi drugi uključuju tri domena vezivanja, ili konstrukte koji imaju više od tri (npr. četiri, pet...) specifičnosti.

[0197] S obzirom na to da su konstrukti antitela prema pronalasku (najmanje) bispecifični, oni se ne javljaju u prirodi i značajno se razlikuju od proizvoda koji se javljaju u prirodi. „Bispecifični” konstrukt antitela ili imunoglobulin je stoga veštački hibridno antitelo ili imunoglobulin koji ima najmanje dva različita mesta vezivanja sa različitim specifičnostima. Bispecifični konstrukti antitela mogu se proizvesti različitim metodama, uključujući fuziju hibridoma ili povezivanje Fab' fragmenata. Videti npr. Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990).

[0199] Najmanje dva domena vezivanja i varijabilni domeni konstrukta antitela prema predmetnom pronalasku mogu ili ne moraju obuhvatati peptidne linkere (spejser peptide). Termin „peptidni linker” u skladu sa predmetnim pronalaskom obuhvata aminokiselinsku sekvencu kojom su aminokiselinske sekvence jednog (varijabilnog i/ili vezivnog) domena i drugog (varijabilnog i/ili vezivnog) domena konstrukta antitela prema pronalasku međusobno povezane. Bitna tehnička karakteristika takvog peptidnog linkera je da ne poseduje nikakvu aktivnost polimerizacije. Među pogodnim peptidnim linkerima su oni opisani u američkim patentima br.4,751,180 i 4,935,233 ili WO 88/09344. Peptidni linkeri se takođe mogu koristiti za pričvršćivanje drugih domena ili modula ili regiona (kao što su domeni koji produžavaju poluvreme eliminacije) na konstrukt antitela prema pronalasku.

[0201] [0086] U slučaju da se koristi linker, taj linker je poželjno takve dužine i sekvence koja je dovoljna da osigura da svaki od prvog i drugog domena može, nezavisno jedan od drugog, zadržati svoje različite specifičnosti vezivanja. Za peptidne linkere koji povezuju najmanje dva domena vezivanja (ili dva varijabilna domena) u konstruktu antitela prema pronalasku, poželjni su oni peptidni linkeri koji obuhvataju samo mali broj aminokiselinskih ostataka, npr. 12 aminokiselinskih ostataka ili manje. Stoga su poželjni peptidni linkeri od 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 aminokiselinskih ostataka. Predviđeni peptidni linker sa manje od 5 aminokiselina obuhvata 4, 3, 2 ili jednu aminokiselinu(e), pri čemu su poželjni linkeri bogati glicinom (Gly). Posebno poželjna „pojedinačna” aminokiselina u kontekstu navedenog „peptidnog linkera” je Gly. U skladu sa tim, navedeni peptidni linker se može sastojati od pojedinačne aminokiseline Gly. Drugo poželjno otelotvorenje peptidnog linkera karakteriše se aminokiselinskom sekvencom Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, tj. Gly<4>Ser (SEQ ID NO: 286), ili njenim polimerima, tj. (Gly<4>Ser)x, gde je x ceo broj 1 ili veći (npr.2 ili 3). Poželjni linkeri su prikazani u SEQ ID NO: 285-293. Karakteristike navedenog peptidnog linkera, koje obuhvataju odsustvo podsticanja sekundarnih struktura, poznate su u struci i opisane su npr. u Dall'Acqua et al. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle et al. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) i Raag and Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Poželjni su peptidni linkeri koji pored toga ne podstiču nikakve sekundarne strukture. Međusobno povezivanje navedenih domena može se obezbediti, npr., genetičkim inženjerstvom, kao što je opisano u primerima. Metode za pripremu fuzionisanih i operativno povezanih bispecifičnih jednolančanih konstrukata i njihovu ekspresiju u ćelijama sisara ili bakterijama dobro su poznate u struci (npr. WO 99/54440 ili Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).

[0203] Konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku je u formatu (scFv)<2>. Ovde su dalje opisani konstrukti antitela u formatu izabranom iz grupe koju čine scFv-jednodomenska mAb, dijatela i oligomeri bilo kojeg od prethodno pomenutih formata. Termin „je u formatu” ne isključuje mogućnost da konstrukt može biti dalje modifikovan, npr. pričvršćivanjem ili fuzijom sa drugim grupama, kao što je ovde opisano.

[0205] Prema predmetnom pronalasku, i kao što je dokumentovano u priloženim primerima, konstrukt antitela prema pronalasku je „bispecifični jednolančani konstrukt antitela”, pri čemu je konstrukt antitela u formatu „jednolančanog Fv” (scFv)2. Iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana posebnim genima, oni se mogu spojiti, korišćenjem rekombinantnih metoda, pomoću sintetičkog linkera - kao što je prethodno opisano - koji omogućava da se naprave kao jedan proteinski lanac u kojem se VL i VH regioni uparuju kako bi formirali monovalentni molekul; videti npr. Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Ovi fragmenti antitela se dobijaju korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima iz predmetne oblasti, a funkcija fragmenata se procenjuje na isti način kao i kod celih antitela ili antitela pune dužine. Jednolančani varijabilni fragment (scFv) je stoga fuzioni protein varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i lakog lanca (VL) imunoglobulina, obično povezanih kratkim peptidnim linkerom od oko deset do oko 25 aminokiselina, poželjno oko 15 do 20 aminokiselina. Linker je obično bogat glicinom zbog fleksibilnosti, kao i serinom ili treoninom zbog rastvorljivosti, i može povezivati ili N-terminus VH sa C-terminusom VL, ili obrnuto. Ovaj protein zadržava specifičnost prvobitnog imunoglobulina, uprkos uklanjanju konstantnih regiona i uvođenju linkera.

[0206] Bispecifični jednolančani molekuli su poznati u struci i opisani su u WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Löffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56. Tehnike opisane za proizvodnju jednolančanih antitela (videti, između ostalog američki patent br.4,946,778, Kontermann and Dübel (2010), loc. cit. i Little (2009), loc. cit.) mogu se prilagoditi za proizvodnju jednolančanih konstrukata antitela koji specifično prepoznaju izabrani cilj (ciljeve).

[0208] Bivalentni (takođe nazvani divalentni) ili bispecifični jednolančani varijabilni fragmenti (bi-scFv ili di-scFv koji imaju format (scFv)<2>mogu se konstruisati povezivanjem dva scFv molekula (npr. pomoću linkera kao što je prethodno opisano). Ako ova dva scFv molekula imaju istu specifičnost vezivanja, dobijeni (scFv)<2>molekul će se poželjno nazivati bivalentnim (tj. ima dve valence za isti ciljni epitop). Ako dva scFv molekula imaju različite specifičnosti vezivanja, dobijeni (scFv)<2>molekul će se poželjno nazivati bispecifičnim.

[0209] Povezivanje se može izvršiti proizvodnjom pojedinačnog peptidnog lanca sa dva VH regiona i dva VL regiona, čime se dobijaju tandem scFv (videti npr. Kufer P. et al., (2004) Trends in Biotechnology 22(5):238-244). Druga mogućnost je stvaranje scFv molekula sa linker peptidima koji su suviše kratki da bi se dva varijabilna regiona zajedno uvila (npr. oko pet aminokiselina), što primorava scFv na dimerizaciju. Ovaj tip je poznat kao dijatela (videti npr. Hollinger, Philipp et al., (July 1993) Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90 (14): 6444-8.).

[0211] Ovde je dalje opisan konstrukt antitela, pri čemu teški lanac (VH) i laki lanac (VL) domena vezivanja (koji se vezuje bilo za ciljni antigen DLL3 ili za CD3) nisu direktno povezani preko peptidnog linkera kao što je gore opisano, već su domeni vezivanja formirani kao što je opisano za dijatelo. Tako, VH domena vezivanja za CD3 može biti fuzionisan sa VL domena vezivanja za DLL3 preko peptidnog linkera, a VH domena vezivanja za DLL3 je fuzionisan sa VL domena vezivanja za CD3 preko takvog peptidnog linkera.

[0213] [0092] Jednodomenska antitela obuhvataju samo jedan (monomerni) varijabilni domen antitela koji je sposoban da se selektivno veže za specifični antigen, nezavisno od drugih V regiona ili domena. Prva jednodomenska antitela su konstruisana od antitela teških lanaca pronađenih kod kamelida, i ona se nazivaju V<H>H fragmenti. Hrskavičave ribe takođe imaju antitela teških lanaca (IgNAR) iz kojih se mogu dobiti jednodomenska antitela nazvana V<NAR>fragmenti. Alternativni pristup je razdvajanje dimernih varijabilnih domena iz uobičajenih imunoglobulina, npr. od ljudi ili glodara, u monomere, čime se dobija VH ili VL kao jednodomensko antitelo. Iako se većina istraživanja jednodomenskih antitela trenutno zasniva na varijabilnim domenima teških lanaca, pokazano je da se i nanotela izvedena iz lakih lanaca specifično vezuju za ciljne epitope. Primeri jednodomenskih antitela nazivaju se sdAb, nanotela ili varijabilna jednodomenska antitela.

[0215] (Jednodomensko mAb)<2>je stoga monoklonski konstrukt antitela sastavljen od (najmanje) dva jednodomenska monoklonska antitela, koja su pojedinačno izabrana iz grupe koja obuhvata VH, VL, V<H>H i V<NAR>. Linker je poželjno u obliku peptidnog linkera. Slično tome, „scFv-jednodomensko monoklonsko antitelo” je monoklonski konstrukt antitela sastavljen od najmanje jednog jednodomenskog antitela kao što je gore opisano i jednog scFv molekula kao što je gore opisano. Ponovo, linker je na primer u obliku peptidnog linkera.

[0217] Takođe je predviđeno da konstrukt antitela prema pronalasku ima, pored svoje funkcije vezivanja za ciljne molekule DLL3 i CD3, i dalju funkciju. U ovom formatu, konstrukt antitela je trifunkcionalni ili multifunkcionalni konstrukt antitela tako što cilja na ciljne ćelije putem vezivanja za DLL3, posreduje u citotoksičnoj aktivnosti T-ćelija putem vezivanja za CD3 i obezbeđuje dalju funkciju kao što je potpuno funkcionalni Fc konstantni domen koji posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela putem regrutovanja efektorskih ćelija kao što su NK ćelije, obeleživač (fluorescentni itd.), terapeutski agens kao što je toksin ili radionuklid, i/ili sredstvo za povećanje poluvremena eliminacije u serumu, itd.

[0219] [0095] Primeri za sredstva za produženje poluvremena eliminacije u serumu konstrukata antitela prema pronalasku uključuju peptide, proteine ili domene proteina, koji su fuzionisani ili na drugi način pričvršćeni za konstrukte antitela. Grupa peptida, proteina ili proteinskih domena uključuje peptide koji se vezuju za druge proteine sa poželjnim farmakokinetičkim profilom u ljudskom telu, kao što je serumski albumin (videti WO 2009/127691). Alternativni koncept takvih peptida koji produžavaju poluvreme eliminacije uključuje peptide koji se vezuju za neonatalni Fc receptor (FcRn, videti WO 2007/098420), koji se takođe mogu koristiti u konstruktima prema predmetnom pronalasku. Koncept pričvršćivanja većih domena proteina ili kompletnih proteina uključuje npr. fuziju humanog serumskog albumina, varijanti ili mutanata humanog serumskog albumina (videti WO 2011/051489, WO 2012/059486, WO 2012/150319, WO 2013/135896, WO 2014/072481, WO 2013/075066) ili njihovih domena, kao i fuziju konstantnog regiona imunoglobulina (Fc domeni) i njihovih varijanti. Takve varijante Fc domena mogu biti optimizovane / modifikovane kako bi se omogućilo željeno uparivanje dimera ili multimera, kako bi se ukinulo vezivanje za Fc receptor (npr. Fcy receptor) ili iz drugih razloga. Dalji koncept poznat u struci za produženje poluvremena eliminacije malih proteinskih jedinjenja u ljudskom telu je pegilacija tih jedinjenja kao što je konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku.

[0221] U poželjnom otelotvorenju, bispecifični konstrukti antitela prema pronalasku mogu biti povezani (npr. putem peptidne veze) sa partnerom za fuziju (kao što je protein ili polipeptid ili peptid), npr. u svrhu produženja poluvremena eliminacije konstrukta u serumu. Ovi partneri za fuziju mogu se izabrati iz humanog serumskog albumina („HSA” ili „HALB”), kao i njegovih varijanti sekvence, peptida koji vezuju HSA, peptida koji vezuju FcRn („FcRn BP”) ili konstrukata koji obuhvataju Fc region (izveden iz antitela). Primeri sekvenci ovih partnera za fuziju prikazani su u SEQ ID NO: 295-341. Uopšteno, partneri za fuziju mogu biti povezani sa N-terminusom ili sa C-terminusom bispecifičnih konstrukata antitela prema pronalasku, bilo direktno (npr. putem peptidne veze) ili preko peptidnog linkera kao što je (GGGGS)<n>(pri čemu je „n” ceo broj 2 ili veći, npr.2 ili 3 ili 4). Pogodni peptidni linkeri prikazani su u SEQ ID NO: 285-293.

[0223] Stoga, poželjni konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku obuhvata:

[0224] (a) polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0226] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 437, i SEQ ID NO: 531;

[0228] o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 285-293; i

[0230] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, i SEQ ID NO: 434; i

[0232] o opciono His-marker, kao što je onaj prikazan u SEQ ID NO: 294;

[0233] (b) polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0234] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 437, i SEQ ID NO: 531;

[0235] o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 285-293;

[0236] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, i SEQ ID NO: 434;

[0237] o opciono peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 285-293;

[0238] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 295 i 301-330; i

[0239] o opciono His-marker, kao što je onaj prikazan u SEQ ID NO: 294;

[0240] (c) polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0241] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu QRFVTGHFGGLX<1>PANG (SEQ ID NO: 296) pri čemu je X<1>Y ili H; i

[0242] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 437, i SEQ ID NO: 531;

[0243] o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 285-293;

[0244] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, i SEQ ID NO: 434;

[0245] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu QRFVTGHFGGLHPANG (SEQ ID NO: 298) ili QRFCTGHFGGLHPCNG (SEQ ID NO: 300); i o opciono His-marker, kao što je onaj prikazan u SEQ ID NO: 294;

[0246] (d) polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0247] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 429, i SEQ ID NO: 432;

[0249] o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:

[0250] 292;

[0252] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 436, i SEQ ID NO: 530, nakon čega sledi serinski ostatak na C-terminusu;

[0254] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 331; i polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0256] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 435, i SEQ ID NO: 529;

[0258] o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:

[0259] 292;

[0261] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 430, i SEQ ID NO: 433, nakon čega sledi serinski ostatak na C-terminusu; i

[0263] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 332; (e) polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0265] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 375, SEQ ID NO: 384, SEQ ID NO: 393, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 411, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 429, i SEQ ID NO: 432;

[0267] o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:

[0268] 292;

[0270] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 436, i SEQ ID NO: 530; i

[0272] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 333; i polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0274] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 435, i SEQ ID NO: 529;

[0276] o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO:

[0277] 292;

[0279] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 367, SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 385, SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 403, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 421, SEQ ID NO: 430, i SEQ ID NO: 433, nakon čega sledi serinski ostatak na C-terminusu; i

[0281] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 334; (f) polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0283] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 437, i SEQ ID NO: 531;

[0285] o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 285-293;

[0287] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, i SEQ ID NO: 434;

[0289] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 335; i polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 336;

[0290] (g) polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0292] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 437, i SEQ ID NO: 531; i

[0293] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 337; i polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0295] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, i SEQ ID NO: 434; i

[0297] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 338; (h) polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0299] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 437, i SEQ ID NO: 531; i

[0301] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 339; i polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0303] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, i SEQ ID NO: 434; i

[0305] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 340;

[0306] ili

[0307] (i) polipeptid koji obuhvata sledećim redosledom počevši od N-terminusa:

[0309] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 437, i SEQ ID NO: 531;

[0311] o peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 285-293;

[0313] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 431, i SEQ ID NO: 434; i

[0315] o polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 341.

[0316] Na primer, poželjni bispecifični konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku obuhvata ili se sastoji od polipeptida izabranog iz grupe koju čine oni prikazani u:

[0317] SEQ ID NO: 224, SEQ ID NO: 225, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, SEQ ID NO: 228, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, SEQ ID NO: 231, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 242, SEQ ID NO: 243, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, SEQ ID NO: 246, SEQ ID NO: 247, i SEQ ID NO: 248.

[0319] Kao što je prethodno opisano, nekoliko poželjnih konstrukata antitela prema pronalasku modifikovano je fuzijom sa drugom grupom kao što je albumin ili varijante albumina. Ako se ovi fuzioni konstrukti okarakterišu u pogledu njihovih svojstava, kao što su naročito njihov afinitet prema cilju ili citotoksična aktivnost, stručnjak u ovoj oblasti biće svestan da se može očekivati da slični fuzioni konstrukti ili nemodifikovani bispecifični konstrukti antitela imaju slična (ili možda čak bolja) svojstva. Na primer, ako bispecifični konstrukt antitela fuzionisan sa albuminom ima primetnu ili željenu citotoksičnu aktivnost ili afinitet prema cilju, može se očekivati da će se ista / slična ili čak veća citotoksična aktivnost / afinitet prema cilju uočiti za isti konstrukt bez albumina.

[0321] Prema drugom poželjnom otelotvorenju, bispecifični konstrukt antitela prema pronalasku obuhvata (pored dva domena vezivanja) treći domen koji obuhvata dva polipeptidna monomera, od kojih svaki obuhvata zglob, CH2 i CH3 domen, pri čemu su navedena dva polipeptida (ili polipeptidna monomera) fuzionisana jedan sa drugim preko peptidnog linkera. Poželjno, navedeni treći domen obuhvata u N- ka C-terminalnom redosledu: zglob-CH2-CH3-linker-zglob-CH2-CH3. Poželjne aminokiselinske sekvence za navedeni treći domen prikazane su u SEQ ID NO: 541-548. Svaki od navedenih polipeptidnih monomera poželjno ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 533-540, ili koja je najmanje 90% identična tim sekvencama. U drugom poželjnom otelotvorenju, prvi i drugi domen vezivanja bispecifičnog konstrukta antitela prema pronalasku fuzionisani su sa trećim domenom preko peptidnog linkera koji je na primer izabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 285, 286, 288, 289, 290, 292 i 293.

[0323] [0101] U skladu sa predmetnim pronalaskom, „zglob” je IgG zglobni region. Ovaj region se može identifikovati analogijom koristeći Kabat numeraciju, videti Kabat pozicije 223-243. U skladu sa gore navedenim, minimalni zahtev za „zglob” su aminokiselinski ostaci koji odgovaraju IgG<1>nizu sekvence od D231 do P243 prema Kabat numeraciji. Termini CH2 i CH3 odnose se na konstantne regione 2 i 3 teškog lanca imunoglobulina. Ovi regioni se takođe mogu identifikovati analogijom koristeći Kabat numeraciju, videti Kabat pozicije 244-360 za CH2 i Kabat pozicije 361-478 za CH3. Podrazumeva se da postoji određena varijacija između imunoglobulina u pogledu njihovog IgG<1>Fc regiona, IgG<2>Fc regiona, IgG<3>Fc regiona, IgG<4>Fc regiona, IgM Fc regiona, IgA Fc regiona, IgD Fc regiona i IgE Fc regiona (videti npr. Padlan, Molecular Immunology, 31(3), 169-217 (1993)). Termin Fc monomer odnosi se na poslednja dva konstantna regiona teškog lanca IgA, IgD i IgG, i poslednja tri konstantna regiona teškog lanca IgE i IgM. Fc monomer takođe može uključivati fleksibilni zglob N-terminalno u odnosu na ove domene. Za IgA i IgM, Fc monomer može uključivati J lanac. Za IgG, Fc deo obuhvata imunoglobulinske domene CH2 i CH3 i zglob između prva dva domena i CH2. Iako granice Fc dela imunoglobulina mogu varirati, primer za Fc deo teškog lanca humanog IgG koji obuhvata funkcionalni zglob, CH2 i CH3 domen može se definisati npr. tako da obuhvata ostatke D231 (zglobnog domena) do P476 (C-terminusa CH3 domena), ili D231 do L476, respektivno, za IgG<4>, pri čemu je numeracija prema Kabatu.

[0325] Konstrukt antitela prema pronalasku može stoga da obuhvata u N- ka C-terminalnom redosledu:

[0326] (a) prvi domen vezivanja;

[0327] (b) peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 286, 292 i 293;

[0328] (c) drugi domen vezivanja;

[0329] (d) peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 285, 286, 288, 289, 290, 292 i 293;

[0330] (e) prvi polipeptidni monomer trećeg domena (koji obuhvata zglob, CH2 i CH3 domen);

[0331] (f) peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 550, 551, 552 i 553; i

[0332] (g) drugi polipeptidni monomer trećeg domena (koji obuhvata zglob, CH2 i CH3 domen).

[0334] Takođe je poželjno da konstrukt antitela prema pronalasku obuhvata u N- ka C-terminalnom redosledu:

[0336] • prvi domen vezivanja koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79,

[0337] SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO:

[0338] 437, i SEQ ID NO: 531;

[0339] • peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 286, 292 i 293;

[0340] • drugi domen vezivanja koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 377, SEQ

[0341] ID NO: 386, SEQ ID NO: 395, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 413, SEQ ID NO:

[0342] 422, SEQ ID NO: 431, i SEQ ID NO: 434;

[0343] • peptidni linker koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 285, 286, 288, 289, 290, 292 i 293; i

[0344] • treći domen koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 541-548.

[0346] Stoga, u poželjnom otelotvorenju, konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku obuhvata ili se sastoji od polipeptida izabranog iz grupe koju čine oni prikazani u SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 523, i SEQ ID NO: 524.

[0348] Tabela sekvenci (tabela 18) takođe pruža varijacije sekvenci vezivnih sredstava označenih kao DLL3-4 i DLL3-14. Tačkaste mutacije koje su umetnute u ove varijante sekvenci identifikovane su prema položaju te mutacije unutar odgovarajućeg scFv molekula. Podrazumeva se da je moguć i alternativni način identifikacije ovih položaja, u zavisnosti od referentnog polipeptida, što bi takođe mogao biti CDR region ili VH / VL region. Na primer, varijanta označena kao DLL3-4-001 ima G44C-G243C dvostruku mutaciju u svom scFv molekulu (SEQ ID NO: 437). Ovo se prevodi u G44C mutaciju u odgovarajućem VH lancu (SEQ ID NO: 435) i G101C mutaciju u odgovarajućem VL lancu (SEQ ID NO: 436).

[0350] Kovalentne modifikacije konstrukata antitela su takođe uključene u obim ovog pronalaska, i generalno se, ali ne uvek, vrše post-translaciono. Na primer, nekoliko tipova kovalentnih modifikacija konstrukta antitela uvodi se u molekul reakcijom specifičnih aminokiselinskih ostataka konstrukta antitela sa organskim agensom za derivatizaciju koji je sposoban da reaguje sa izabranim bočnim lancima ili N- ili C-terminalnim ostacima.

[0351] Cisteinilni ostaci najčešće reaguju sa α-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), kao što su hlorosirćetna kiselina ili hloroacetamid, dajući karboksimetilne ili karboksiamidometilne derivate. Cisteinilni ostaci se takođe derivatizuju reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, α-bromo-β-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetilfosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil-disulfidom, metil-2-piridil-disulfidom, phloromerkuribenzoatom, 2-hloromerkuri-4-nitrofenolom ili hloro-7-nitrobezo-2-oksa-1,3-diazolom.

[0353] Histidilni ostaci se derivatizuju reakcijom sa dietilpirokarbonatom pri pH 5,5-7,0 jer je ovaj agens relativno specifičan za histidilni bočni lanac. Para-bromofenacil-bromid je takođe koristan; reakcija se poželjno izvodi u 0,1 M natrijum-kakodilatu pri pH 6,0. Lizinilni i amino-terminalni ostaci reaguju sa anhidridima ćilibarne ili drugih karboksilnih kiselina. Derivatizacija ovim agensima ima efekat preokretanja naelektrisanja lizinilnih ostataka. Ostali pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže alfa-amino grupu uključuju imidoestre kao što je metil-pikolinimidat; piridoksal-fosfat; piridoksal; hloroborohidrid; trinitrobenzensulfonsku kiselinu; O-metilizoureu; 2,4-pentandion; i reakciju sa glioksilatom katalizovanu transaminazom.

[0355] Arginilni ostaci se modifikuju reakcijom sa jednim ili nekoliko konvencionalnih reagenasa, među kojima su fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Derivatizacija ostataka arginina zahteva da se reakcija izvodi u alkalnim uslovima zbog visokog pKa gvanidinske funkcionalne grupe. Štaviše, ovi reagensi mogu reagovati sa grupama lizina kao i sa epsilon-amino grupom arginina.

[0357] Specifična modifikacija tirozilnih ostataka može se izvršiti, sa posebnim interesom za uvođenje spektralnih obeleživača u tirozilne ostatke reakcijom sa aromatičnim diazonijumskim jedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće se koriste N-acetilimidazol i tetranitrometan za formiranje O-acetiltirozilnih vrsta, odnosno 3-nitro derivata. Tirozilni ostaci se jodiraju koristeći<125>I ili<131>I da bi se pripremili obeleženi proteini za upotrebu u radioimunološkom testu, pri čemu je pogodna prethodno opisana metoda sa hloraminom T.

[0359] [0111] Bočne karboksilne grupe (aspartil ili glutamil) selektivno se modifikuju reakcijom sa karbodiimidima (R'-N=C=N--R'), gde su R i R' opciono različite alkil grupe, kao što su 1 cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil) karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) karbodiimid.

[0361] Štaviše, aspartilni i glutamilni ostaci se konvertuju u asparaginilne i glutaminilne ostatke reakcijom sa amonijumovim jonima.

[0363] Derivatizacija bifunkcionalnim agensima korisna je za umrežavanje konstrukata antitela prema predmetnom pronalasku sa u vodi nerastvorljivim nosećim matriksom ili površinom za upotrebu u različitim metodama. Uobičajeno korišćeni agensi za umrežavanje uključuju, npr.1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, estre N-hidroksisukcinimida, na primer estre sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalne imidoestre, uključujući disukcinimidilne estre kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidilpropionat), i bifunkcionalne maleimide kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan. Agensi za derivatizaciju kao što je metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidat daju fotoaktivabilne intermedijere koji su sposobni da formiraju poprečne veze u prisustvu svetlosti. Alternativno, za imobilizaciju proteina koriste se reaktivni, u vodi nerastvorljivi matriksi, kao što su ugljeni hidrati aktivirani cijanogenbromidom i reaktivni supstrati opisani u američkim patentima br.

[0364] 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440.

[0366] Glutaminilni i asparaginilni ostaci se često deamiduju u odgovarajuće glutamilne, odnosno aspartilne ostatke. Alternativno, ovi ostaci se deamiduju u blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka spada u obim ovog pronalaska.

[0368] Druge modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa serilnih ili treonilnih ostataka, metilaciju α-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina i histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp.79-86), acetilaciju N-terminalnog amina i amidaciju bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.

[0370] [0116] Drugi tip kovalentne modifikacije konstrukata antitela uključenih u obim ovog pronalaska obuhvata izmenu obrasca glikozilacije proteina. Kao što je poznato u struci, obrasci glikozilacije mogu zavisiti i od sekvence proteina (npr. prisustvo ili odsustvo određenih aminokiselinskih ostataka za glikozilaciju, o čemu se diskutuje u nastavku), ili od ćelije domaćina ili organizma u kojem se protein proizvodi. O specifičnim sistemima ekspresije diskutuje se u nastavku.

[0372] Glikozilacija polipeptida je tipično ili N-povezana ili O-povezana. N-povezana se odnosi na pričvršćivanje dela ugljenog hidrata za bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, jesu sekvence prepoznavanja za enzimsko pričvršćivanje dela ugljenog hidrata za bočni lanac asparagina. Tako, prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-povezana glikozilacija odnosi se na pričvršćivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, iako se takođe mogu koristiti 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0374] Dodavanje mesta glikozilacije konstruktu antitela pogodno se postiže izmenom aminokiselinske sekvence tako da ona sadrži jednu ili više gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za mesta N-povezane glikozilacije). Izmena se takođe može izvršiti dodavanjem ili supstitucijom jednim ili više ostataka serina ili treonina u početnoj sekvenci (za mesta O-povezane glikozilacije). Radi lakšeg rada, aminokiselinska sekvenca konstrukta antitela se poželjno menja putem izmena na nivou DNK, naročito mutacijom DNK koja kodira polipeptid na unapred izabranim bazama tako da se generišu kodoni koji će se prevesti u željene aminokiseline.

[0376] Drugo sredstvo za povećanje broja delova ugljenih hidrata na konstruktu antitela je hemijsko ili enzimsko kuplovanje glikozida sa proteinom. Ovi postupci su korisni po tome što ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji domaćinu koja ima sposobnosti glikozilacije za N- i O-povezanu glikozilaciju. U zavisnosti od korišćenog načina kuplovanja, šećer(i) se mogu pričvrstiti za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što su one kod cisteina, (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su one kod serina, treonina ili hidroksiprolina, (e) aromatične ostatke kao što su oni kod fenilalanina, tirozina ili triptofana, ili (f) amidnu grupu glutamina. Ove metode su opisane u WO 87/05330, i u Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306.

[0378] [0120] Uklanjanje delova ugljenih hidrata prisutnih na početnom konstruktu antitela može se postići hemijski ili enzimski. Hemijska deglikozilacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluorometansulfonskoj kiselini ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovaj tretman rezultira cepanjem većine ili svih šećera osim vezivnog šećera (N-acetilglukozamina ili N-acetilgalaktozamina), dok polipeptid ostaje netaknut. Hemijska deglikozilacija je opisana u Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 i u Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. Enzimsko cepanje delova ugljenih hidrata na polipeptidima može se postići upotrebom različitih endo- i egzoglikozidaza kao što je opisano u Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. Glikozilacija na potencijalnim mestima glikozilacije može se sprečiti upotrebom jedinjenja tunikamicina kao što je opisano u Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. Tunikamicin blokira formiranje protein-N-glikozidnih veza.

[0380] Druge modifikacije konstrukta antitela se takođe ovde razmatraju. Na primer, drugi tip kovalentne modifikacije konstrukta antitela obuhvata povezivanje konstrukta antitela sa različitim neproteinskim polimerima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, različite poliole kao što su polietilen glikol, polipropilen glikol, polioksialkileni ili kopolimeri polietilen glikola i polipropilen glikola, na način izložen u američkim patentima br.

[0381] 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337. Pored toga, kao što je poznato u struci, supstitucije aminokiselina se mogu izvršiti na različitim položajima unutar konstrukta antitela, npr. radi olakšavanja dodavanja polimera kao što je PEG.

[0383] U nekim otelotvorenjima, kovalentna modifikacija konstrukata antitela prema pronalasku obuhvata dodavanje jednog ili više obeleživača. Grupa za obeležavanje može biti kuplovana sa konstruktom antitela preko odstojnih krakova različitih dužina kako bi se smanjile potencijalne sterne smetnje. Različite metode za obeležavanje proteina su poznate u struci i mogu se koristiti u sprovođenju predmetnog pronalaska. Termin „obeleživač” ili „grupa za obeležavanje” odnosi se na bilo koji detektabilni obeleživač. Generalno, obeleživači spadaju u različite klase, u zavisnosti od testa u kojem se detektuju - sledeći primeri uključuju, ali nisu ograničeni na:

[0384] a) izotopske obeleživače, koji mogu biti radioaktivni ili teški izotopi, kao što su radioizotopi ili radionuklidi (npr.<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<89>Zr,<90>Y,<99>Tc,<111>In<125>I,<131>I) b) magnetne obeleživače (npr. magnetne čestice)

[0385] c) redoks aktivne delove

[0386] d) optičke boje (uključujući, ali ne ograničavajući se na, hromofore, fosfore i fluorofore) kao što su fluorescentne grupe (npr. FITC, rodamin, lantanidni fosfori), hemiluminiscentne grupe i fluorofori koji mogu biti ili fluoresi „malih molekula” ili proteinski fluoresi

[0387] e) enzimske grupe (npr. peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza)

[0388] f) biotinilovane grupe

[0389] g) unapred određene polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr. sekvence parova leucinskog zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni koji vezuju metale, epitopni markeri, itd.)

[0391] Pod „fluorescentnim obeleživačem” podrazumeva se bilo koji molekul koji se može detektovati putem njegovih inherentnih fluorescentnih svojstava. Pogodni fluorescentni obeleživači uključuju, ali nisu ograničeni na, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, eritrozin, kumarin, metil-kumarine, piren, malahitno zeleno, stilben, Lucifer Yellow, Cascade BlueJ, Texas Red, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Oregon green, Alexa-Fluor boje (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Cascade Blue, Cascade Yellow i R-fikoeritrin (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, rodamin i Texas Red (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Pogodne optičke boje, uključujući fluorofore, opisane su u Molecular Probes Handbook čiji je autor Richard P. Haugland.

[0393] Pogodni proteinski fluorescentni obeleživači takođe uključuju, ali nisu ograničeni na, zeleni fluorescentni protein, uključujući Renilla, Ptilosarcus ili Aequorea vrste GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank Accession Number U55762), plavi fluorescentni protein (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc.1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol.6:178-182), poboljšani žuti fluorescentni protein (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferazu (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β-galaktozidazu (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

[0394] 85:2603-2607) i Renilla

[0395] (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, američke patente br.

[0396] 5,292,658; 5,418,155; 5,683,888; 5,741,668; 5,777,079; 5,804,387; 5,874,304; 5,876,995; 5,9 25,558).

[0397] Domeni leucinskog zatvarača su peptidi koji promovišu oligomerizaciju proteina u kojima se nalaze. Leucinski zatvarači su prvobitno identifikovani u nekoliko DNK-vezujućih proteina (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), i od tada su pronađeni u nizu različitih proteina. Među poznatim leucinskim zatvaračima su prirodni peptidi i njihovi derivati koji dimerizuju ili trimerizuju. Primeri domena leucinskog zatvarača pogodnih za proizvodnju rastvorljivih oligomernih proteina opisani su u PCT prijavi WO 94/10308, a leucinski zatvarač izveden iz proteina D plućnog surfaktanta (SPD) opisan je u Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191. Upotreba modifikovanog leucinskog zatvarača koji omogućava stabilnu trimerizaciju heterolognog proteina fuzionisanog sa njim opisana je u Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. U jednom pristupu, rekombinantni fuzioni proteini koji obuhvataju DLL3 fragment antitela ili derivat fuzionisan sa peptidom leucinskog zatvarača eksprimiraju se u pogodnim ćelijama domaćinima, a formirani rastvorljivi oligomerni DLL3 fragmenti antitela ili derivati se izoluju iz supernatanta kulture.

[0399] Konstrukt antitela prema pronalasku može takođe da obuhvata dodatne domene, koji su npr. od pomoći u izolaciji molekula ili se odnose na prilagođeni farmakokinetički profil molekula. Domeni korisni za izolaciju konstrukta antitela mogu se izabrati iz peptidnih motiva ili sekundarno uvedenih delova, koji se mogu uhvatiti u metodi izolacije, npr. izolacionoj koloni. Neograničavajuća otelotvorenja takvih dodatnih domena obuhvataju peptidne motive poznate kao Myc-marker, HAT-marker, HA-marker, TAP-marker, GST-marker, domen koji vezuje hitin (CBD-marker), protein koji vezuje maltozu (MBP-marker), Flag-marker, Strep-marker i njihove varijante (npr. Strepll-marker) i His-marker. Za sve ovde obelodanjene konstrukte antitela okarakterisane identifikovanim CDR poželjno je da obuhvataju domen His-markera, koji je opšte poznat kao ponavljanje uzastopnih His ostataka u aminokiselinskoj sekvenci molekula, poželjno pet, a još poželjnije šest His ostataka (heksahistidin). His-marker se može nalaziti npr. na N- ili C-terminusu konstrukta antitela, poželjno se nalazi na C-terminusu. Najpoželjnije, heksahistidinski marker (HHHHHH) povezan je preko peptidne veze sa C-terminusom konstrukta antitela prema pronalasku.

[0401] [0127] Prvi domen vezivanja konstrukta antitela prema predmetnom pronalasku vezuje se za humani DLL3 na površini ciljne ćelije i unutar regiona kao što je definisano u priloženim patentnim zahtevima. Poželjna aminokiselinska sekvenca humanog DLL3 predstavljena je sa SEQ ID NO: 252. Podrazumeva se da termin „na površini”, u kontekstu predmetnog pronalaska, znači da se domen vezivanja specifično vezuje za epitop koji obuhvata ekstracelularni domen DLL3 (DLL3 ECD). Prvi domen vezivanja prema pronalasku stoga se poželjno vezuje za DLL3 kada je on eksprimiran od strane ćelija ili ćelijskih linija koje ga prirodno eksprimiraju, i/ili od strane ćelija ili ćelijskih linija transformisanih ili (stabilno / tranzijentno) transfektovanih sa DLL3. U poželjnom otelotvorenju, prvi domen vezivanja se takođe vezuje za DLL3 kada se DLL3 koristi kao molekul „cilj” ili „ligand” u in vitro testu vezivanja kao što je BIAcore ili Scatchard. „Ciljna ćelija” može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija koja eksprimira DLL3 na svojoj površini; ciljna ćelija je poželjno ćelija koja je deo humanog ili životinjskog tela, kao što je specifična ćelija raka ili tumorska ćelija koja eksprimira DLL3.

[0403] Termin „DLL3 ECD” odnosi se na oblik DLL3 koji je suštinski bez transmembranskih i citoplazmatičnih domena DLL3. Kvalifikovani stručnjak će razumeti da je transmembranski domen identifikovan za polipeptid DLL3 prema predmetnom pronalasku identifikovan u skladu sa kriterijumima koji se rutinski primenjuju u struci za identifikaciju tog tipa hidrofobnog domena. Tačne granice transmembranskog domena mogu varirati, ali najverovatnije ne više od oko 5 aminokiselina na bilo kom kraju domena koji je ovde specifično naveden. Poželjni humani DLL3 ECD prikazan je u SEQ ID NO: 253.

[0405] Afinitet prvog domena vezivanja za humani DLL3 je poželjno ≤20 nM, poželjnije ≤10 nM, još poželjnije ≤5 nM, još poželjnije ≤2 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije ≤0,6 nM, još poželjnije ≤0,5 nM, i najpoželjnije ≤0,4 nM. Afinitet se može meriti na primer u BIAcore testu ili u Scatchard testu, npr. kao što je opisano u primerima. Druge metode određivanja afiniteta su takođe dobro poznate stručnjaku.

[0407] T ćelije ili T limfociti su tip limfocita (koji su i sami tip belih krvnih zrnaca) koji igraju centralnu ulogu u ćelijskom imunitetu. Postoji nekoliko podgrupa T ćelija, od kojih svaka ima posebnu funkciju. T ćelije se mogu razlikovati od drugih limfocita, kao što su B ćelije i NK ćelije, po prisustvu T-ćelijskog receptora (TCR) na površini ćelije. TCR je odgovoran za prepoznavanje antigena vezanih za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i sastoji se od dva različita proteinska lanca. Kod 95% T ćelija, TCR se sastoji od alfa (α) i beta (β) lanca. Kada TCR stupi u interakciju sa antigenskim peptidom i MHC (peptid / MHC kompleks), T limfocit se aktivira kroz niz biohemijskih događaja posredovanih pridruženim enzimima, koreceptorima, specijalizovanim adapterskim molekulima i aktiviranim ili oslobođenim transkripcionim faktorima.

[0408] CD3 receptorski kompleks je proteinski kompleks i sastoji se od četiri lanca. Kod sisara, kompleks sadrži CD3γ (gama) lanac, CD3δ (delta) lanac i dva CD3ε (epsilon) lanca. Ovi lanci se udružuju sa T-ćelijskim receptorom (TCR) i takozvanim ζ (zeta) lancem kako bi formirali T-ćelijski receptor CD3 kompleks i generisali signal aktivacije u T limfocitima. The CD3γ (gama), CD3δ (delta) i CD3ε (epsilon) lanci su blisko srodni proteini na površini ćelije iz superfamilije imunoglobulina koji sadrže jedan ekstracelularni imunoglobulinski domen. Intracelularni repovi molekula CD3 sadrže jedan konzervisan motiv poznat kao imunoreceptorski aktivacioni motiv na bazi tirozina ili skraćeno ITAM, koji je neophodan za signalni kapacitet TCR. Molekul CD3 epsilon je polipeptid koji je kod ljudi kodiran genom CD3E koji se nalazi na hromozomu 11. Najpoželjniji epitop CD3 epsilon obuhvaćen je unutar aminokiselinskih ostataka 1-27 ekstracelularnog domena humanog CD3 epsilon.

[0410] Preusmerena liza ciljnih ćelija putem regrutovanja T ćelija pomoću multispecifičnog, najmanje bispecifičnog, konstrukta antitela uključuje formiranje citolitičke sinapse i isporuku perforina i granzima. Angažovane T ćelije su sposobne za serijsku lizu ciljnih ćelija i na njih ne utiču mehanizmi imunog bekstva koji ometaju obradu i prezentaciju peptidnog antigena ili klonalnu diferencijaciju T ćelija; videti, na primer, WO 2007/042261.

[0412] [0133] Citotoksičnost posredovana DLL3xCD3 bispecifičnim konstruktima antitela može se meriti na različite načine. Videti primere 8.1 do 8.7. Efektorske ćelije mogu biti npr. stimulisane obogaćene (humane) CD8 pozitivne T ćelije ili nestimulisane (humane) mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC). Ako su ciljne ćelije poreklom od makakija ili eksprimiraju ili su transfektovane sa DLL3 makakija, efektorske ćelije takođe treba da budu poreklom od makakija, kao što je T-ćelijska linija makakija, npr.4119LnPx. Ciljne ćelije treba da eksprimiraju (barem ekstracelularni domen) DLL3, npr. humani ili DLL3 makakija. Ciljne ćelije mogu biti ćelijska linija (kao što je CHO) koja je stabilno ili tranzijentno transfektovana sa DLL3, npr. humani ili DLL3 makakija. Alternativno, ciljne ćelije mogu biti DLL3 pozitivna prirodno eksprimirajuća ćelijska linija, kao što je humana ćelijska linija karcinoma pluća SHP-77. Obično se očekuje da EC50 vrednosti budu niže kod ciljnih ćelijskih linija koje eksprimiraju više nivoe DLL3 na površini ćelije. Odnos efektorskih prema ciljnim ćelijama (E:T) je obično oko 10:1, ali može i varirati. Citotoksična aktivnost DLL3xCD3 bispecifičnih konstrukata antitela može se meriti u testu oslobađanja 51-hroma (vreme inkubacije oko 18 sati) ili u testu citotoksičnosti zasnovanom na FACS (vreme inkubacije oko 48 sati). Modifikacije vremena inkubacije testa (citotoksična reakcija) su takođe moguće. Druge metode merenja citotoksičnosti su dobro poznate stručnjaku i obuhvataju MTT ili MTS testove, testove zasnovane na ATP uključujući bioluminiscentne testove, test sa sulforodaminom B (SRB), WST test, klonogeni test i ECIS tehnologiju.

[0414] Citotoksična aktivnost posredovana DLL3xCD3 bispecifičnim konstruktima antitela prema predmetnom pronalasku poželjno se meri u ćelijskom testu citotoksičnosti. Takođe se može meriti u testu oslobađanja 51-hroma. Predstavljena je vrednošću EC<50>, koja odgovara polovini maksimalne efektivne koncentracije (koncentracija konstrukta antitela koja indukuje citotoksični odgovor na pola puta između osnovne linije i maksimuma). Poželjno, vrednost EC<50>za DLL3xCD3 bispecifične konstrukte antitela je ≤5000 pM ili ≤4000 pM, poželjnije ≤3000 pM ili ≤2000 pM, još poželjnije ≤1000 pM ili ≤500 pM, još poželjnije ≤400 pM ili ≤300 pM, još poželjnije ≤200 pM, još poželjnije ≤100 pM, još poželjnije ≤50 pM, još poželjnije ≤20 pM ili ≤10 pM, i najpoželjnije ≤5 pM.

[0416] Gore navedene vrednosti EC<50>mogu se meriti u različitim testovima. Stručnjak je svestan da se može očekivati da vrednost EC50 bude niža kada se kao efektorske ćelije koriste stimulisane / obogaćene CD8+ T ćelije, u poređenju sa nestimulisanim PBMC.

[0417] Nadalje se može očekivati da su vrednosti EC50 niže kada ciljne ćelije eksprimiraju visok broj ciljnog antigena u poređenju sa niskom stopom ekspresije cilja. Na primer, kada se kao efektorske ćelije koriste stimulisane / obogaćene humane CD8+ T ćelije (i kada se kao ciljne ćelije koriste ili DLL3 transfektovane ćelije kao što su CHO ćelije ili DLL3 pozitivna humana ćelijska linija karcinoma pluća SHP-77), vrednost EC<50>za DLL3xCD3 bispecifični konstrukt antitela je poželjno ≤1000 pM, poželjnije ≤500 pM, još poželjnije ≤250 pM, još poželjnije ≤100 pM, još poželjnije ≤50 pM, još poželjnije ≤10 pM, i najpoželjnije ≤5 pM. Kada se kao efektorske ćelije koriste humani PBMC, vrednost EC<50>za DLL3xCD3 bispecifični konstrukt antitela je poželjno ≤5000 pM ili ≤4000 pM (naročito kada su ciljne ćelije DLL3 pozitivna humana ćelijska linija karcinoma pluća SHP-77), poželjnije ≤2000 pM (naročito kada su ciljne ćelije DLL3 transfektovane ćelije kao što su CHO ćelije), poželjnije ≤1000 pM ili ≤500 pM, još poželjnije ≤200 pM, još poželjnije ≤150 pM, još poželjnije ≤100 pM, i najpoželjnije ≤50 pM, ili niže. Kada se kao efektorske ćelije koristi T-ćelijska linija makakija kao što je LnPx4119, a kao ciljna ćelijska linija koristi DLL3 transfektovana ćelijska linija makakija kao što su CHO ćelije, vrednost EC<50>za DLL3xCD3 bispecifični konstrukt antitela je poželjno ≤2000 pM ili ≤1500 pM, poželjnije ≤1000 pM ili ≤500 pM, još poželjnije ≤300 pM ili ≤250 pM, još poželjnije ≤100 pM, i najpoželjnije ≤50 pM.

[0419] Poželjno, DLL3xCD3 bispecifični konstrukti antitela prema predmetnom pronalasku ne indukuju / ne posreduju lizu ili suštinski ne indukuju / ne posreduju lizu DLL3 negativnih ćelija kao što su CHO ćelije. Termin „ne indukuju lizu”, „suštinski ne indukuju lizu”, „ne posreduju lizu” ili „suštinski ne posreduju lizu” znači da konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku ne indukuje ili ne posreduje lizu više od 30%, poželjno ne više od 20%, više poželjno ne više od 10%, naročito poželjno ne više od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% DLL3 negativnih ćelija, pri čemu je liza DLL3 pozitivne humane ćelijske linije karcinoma pluća SHP-77 (videti gore) postavljena na 100%. Ovo se obično primenjuje za koncentracije konstrukta antitela do 500 nM. Stručnjak zna kako da izmeri lizu ćelija bez daljeg odlaganja. Štaviše, ova specifikacija daje specifična uputstva o tome kako meriti lizu ćelija.

[0421] Razlika u citotoksičnoj aktivnosti između monomerne i dimerne izoforme pojedinačnih DLL3xCD3 bispecifičnih konstrukata antitela naziva se „razlika u potenciji”. Ova razlika u potenciji može se npr. izračunati kao odnos između vrednosti EC<50>monomerne i dimerne forme molekula, videti primer 15. Razlike u potenciji DLL3xCD3 bispecifičnih konstrukata antitela prema predmetnom pronalasku su poželjno ≤ 5, poželjnije ≤ 4, još poželjnije ≤ 3, još poželjnije ≤ 2 i najpoželjnije ≤ 1.

[0423] Prvi i/ili drugi domen(i) vezivanja konstrukta antitela prema pronalasku je/su poželjno unakrsno specifični za vrste za pripadnike reda sisara primata. Unakrsno specifični domeni vezivanja za CD3 su, na primer, opisani u WO 2008/119567. Prema jednom otelotvorenju, prvi i drugi domen vezivanja će se, pored vezivanja za humani DLL3, odnosno humani CD3, takođe vezivati za DLL3 / CD3 primata uključujući (ali ne ograničavajući se na) primate Novog sveta (kao što su Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus), primate Starog sveta (kao što su babuni i makakiji), gibone, orangutane i

[0424] nehumane homininae. Predviđeno je da se prvi domen vezivanja konstrukta antitela prema pronalasku koji se vezuje za humani DLL3 na površini ciljne ćelije takođe vezuje za DLL3 makakija. Drugi domen vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije takođe se vezuje barem za CD3 makakija. Poželjni makaki je Macaca fascicularis. Takođe je predviđen Macaca mulatta (rezus).

[0425] Bispecifični konstrukt antitela prema pronalasku obuhvata prvi domen vezivanja koji se vezuje za humani DLL3 na površini ciljne ćelije i drugi domen vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije i CD3 makakija, pri čemu se prvi domen vezivanja vezuje za epitop DLL3 koji je obuhvaćen unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 258, kako je definisano u patentnim zahtevima.

[0427] U jednom aspektu pronalaska, prvi domen vezivanja vezuje se za humani DLL3 i dalje se vezuje za DLL3 makakija, kao što je DLL3 Macaca fascicularis, a još poželjnije, za ECD DLL3 makakija. Poželjni DLL3 Macaca fascicularis prikazan je u SEQ ID NO: 271. Poželjni ECD DLL3 makakija prikazan je u SEQ ID NO: 272. Afinitet prvog domena vezivanja za DLL3 makakija je poželjno ≤15 nM, poželjnije ≤10 nM, još poželjnije ≤5 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije ≤0,5 nM, još poželjnije ≤0,1 nM, i najpoželjnije ≤0,05 nM ili čak ≤0,01 nM.

[0429] Poželjno, razlika u afinitetu konstrukata antitela prema pronalasku za vezivanje DLL3 makakija u odnosu na humani DLL3 [ma DLL3:hu DLL3] (kako je određeno npr. BIAcore ili Scatchard analizom) iznosi između 0,1 i 10, više poželjno između 0,2 i 5, još više poželjno između 0,3 i 4, još više poželjno između 0,5 i 3 ili između 0,5 i 2,5, a najpoželjnije između 0,5 i 2 ili između 0,6 i 2. Videti primere 3 i 4.

[0431] U jednom otelotvorenju konstrukta antitela prema pronalasku, drugi domen vezivanja vezuje se za humani CD3 epsilon i za CD3 epsilon vrsta Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus. Poželjno, drugi domen vezivanja se vezuje za ekstracelularni epitop ovih epsilon lanaca CD3. Takođe je predviđeno da se drugi domen vezivanja vezuje za ekstracelularni epitop humanog i Macaca epsilon lanca CD3. Najpoželjniji epitop CD3 epsilon obuhvaćen je unutar aminokiselinskih ostataka 1-27 ekstracelularnog domena humanog CD3 epsilon. Još specifičnije, epitop obuhvata najmanje aminokiselinsku sekvencu Gln-Asp-Gly-Asn-Glu. Callithrix jacchus i Saguinus oedipus su primati Novog sveta koji pripadaju porodici Callitrichidae, dok je Saimiri sciureus primat Novog sveta koji pripada porodici Cebidae.

[0433] Naročito je poželjno za konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku da drugi domen vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije i CD3 makakija obuhvata VL region koji obuhvata CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz:

[0434] (a) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 27 dokumenta WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 28 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 29 dokumenta WO 2008/119567;

[0435] (b) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 117 dokumenta WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 118 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 119 dokumenta WO 2008/119567; i (c) CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 153 dokumenta WO 2008/119567, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 154 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 155 dokumenta WO 2008/119567.

[0437] U alternativno poželjnom otelotvorenju konstrukta antitela prema predmetnom pronalasku, drugi domen vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije i CD3 makakija obuhvata VH region koji obuhvata CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 izabrane iz:

[0438] (a) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 12 dokumenta WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 13 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 14 dokumenta WO 2008/119567;

[0439] (b) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 30 dokumenta WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 31 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 32 dokumenta WO 2008/119567;

[0440] (c) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 48 dokumenta WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 49 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 50 dokumenta WO 2008/119567;

[0441] (d) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 66 dokumenta WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 67 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 68 dokumenta WO 2008/119567;

[0442] (e) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 84 dokumenta WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 85 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 86 dokumenta WO 2008/119567;

[0443] (f) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 102 dokumenta WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 103 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 104 dokumenta WO 2008/119567; (g) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 120 dokumenta WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 121 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 122 dokumenta WO 2008/119567; (h) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 138 dokumenta WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 139 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 140 dokumenta WO 2008/119567; (i) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 156 dokumenta WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 157 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 158 dokumenta WO 2008/119567; i (j) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 174 dokumenta WO 2008/119567, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 175 dokumenta WO 2008/119567 i CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 176 dokumenta WO 2008/119567.

[0445] Dalje je poželjno za konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku da drugi domen vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije i CD3 makakija obuhvata VL region izabran iz grupe koju čine VL regioni kao što je prikazano u SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 ili 165 dokumenta WO 2008/119567.

[0447] Alternativno je poželjno da drugi domen vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije i CD3 makakija obuhvata VH region izabran iz grupe koju čine VH regioni kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ili 181 dokumenta WO 2008/119567.

[0449] Još poželjnije, konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku okarakterisan je drugom domenom vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije i CD3 makakija koji obuhvata VL region i VH region izabrane iz grupe koju čine:

[0450] (a) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 17 ili 21 dokumenta WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 15 ili 19 dokumenta WO 2008/119567;

[0451] (b) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 35 ili 39 dokumenta WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 33 ili 37 dokumenta WO 2008/119567;

[0452] (c) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 53 ili 57 dokumenta WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 51 ili 55 dokumenta WO 2008/119567;

[0453] (d) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 71 ili 75 dokumenta WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 69 ili 73 dokumenta WO 2008/119567;

[0454] (e) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 89 ili 93 dokumenta WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 87 ili 91 dokumenta WO 2008/119567;

[0455] (f) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 107 ili 111 dokumenta WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 105 ili 109 dokumenta WO 2008/119567;

[0456] (g) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 125 ili 129 dokumenta WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 123 ili 127 dokumenta WO 2008/119567;

[0457] (h) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 143 ili 147 dokumenta WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 141 ili 145 dokumenta WO 2008/119567;

[0458] (i) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 161 ili 165 dokumenta WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 159 ili 163 dokumenta WO 2008/119567; i

[0459] (j) VL region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 179 ili 183 dokumenta WO 2008/119567 i VH region kao što je prikazano u SEQ ID NO: 177 ili 181 dokumenta WO 2008/119567.

[0461] U konstruktu antitela prema predmetnom pronalasku, prvi i drugi domen vezivanja imaju sledeći format: Parovi VH regiona i VL regiona su u formatu antitela sa jednim lancem (scFv). Konstrukt antitela prema pronalasku je u formatu (scFv)2. VH i VL regioni su raspoređeni po redosledu VH-VL ili VL-VH. Poželjno je da je VH-region pozicioniran N-terminalno u odnosu na sekvencu linkera, a VL-region pozicioniran C-terminalno u odnosu na sekvencu linkera.

[0463] Poželjno otelotvorenje gore opisanog konstrukta antitela prema predmetnom pronalasku okarakterisano je drugom domenom vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T ćelije i CD3 makakija koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187 dokumenta WO 2008/119567.

[0464] Stoga, u jednom otelotvorenju, konstrukt antitela prema pronalasku obuhvata polipeptid izabran iz grupe koju čine oni prikazani u SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 438 i SEQ ID NO: 532. Ovi konstrukti antitela imaju prvi domen vezivanja koji se vezuje za epitop DLL3 koji je obuhvaćen unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 258.

[0466] Modifikacije aminokiselinske sekvence ovde opisanih konstrukata antitela se takođe razmatraju. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva konstrukta antitela. Varijante aminokiselinske sekvence konstrukata antitela pripremaju se uvođenjem odgovarajućih promena nukleotida u nukleinsku kiselinu konstrukata antitela ili peptidnom sintezom. Sve dole opisane modifikacije aminokiselinske sekvence treba da rezultiraju konstruktom antitela koji i dalje zadržava željenu biološku aktivnost (vezivanje za DLL3 i za CD3) nemodifikovanog roditeljskog molekula.

[0468] Termin „aminokiselina” ili „aminokiselinski ostatak” tipično se odnosi na aminokiselinu koja ima svoju definiciju priznatu u struci, kao što je aminokiselina izabrana iz grupe koju čine: alanin (Ala ili A); arginin (Arg ili R); asparagin (Asn ili N); asparaginska kiselina (Asp ili D); cistein (Cys ili C); glutamin (Gln ili Q); glutaminska kiselina (Glu ili E); glicin (Gly ili G); histidin (His ili H); izoleucin (Ile ili I); leucin (Leu ili L); lizin (Lys ili K); metionin (Met ili M); fenilalanin (Phe ili F); prolin (Pro ili P); serin (Ser ili S); treonin (Thr ili T); triptofan (Trp ili W); tirozin (Tyr ili Y); i valin (Val ili V), iako se po želji mogu koristiti modifikovane, sintetičke ili retke aminokiseline. Generalno, aminokiseline se mogu grupisati kao one koje imaju nepolarni bočni lanac (npr. Ala, Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Val); negativno naelektrisan bočni lanac (npr. Asp, Glu); pozitivno naelektrisan bočni lanac (npr. Arg, His, Lys); ili nenaelektrisan polarni bočni lanac (npr. Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp i Tyr).

[0470] [0153] Modifikacije aminokiselina uključuju, na primer, delecije iz, i/ili insercije u, i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci konstrukata antitela. Bilo koja kombinacija delecije, insercije i supstitucije vrši se da bi se došlo do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt poseduje željene karakteristike. Aminokiselinske promene takođe mogu izmeniti post-translacione procese konstrukata antitela, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije.

[0472] Na primer, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 aminokiselina može biti umetnuto ili obrisano u svakom od CDR (naravno, u zavisnosti od njihove dužine), dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili 25 aminokiselina može biti umetnuto ili obrisano u svakom od FR. Poželjno, insercije aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije u rasponu dužine od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ostataka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intra-sekvencijalne insercije pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka. Inserciona varijanta konstrukta antitela prema pronalasku uključuje fuziju enzima na N-terminus ili na C-terminus konstrukta antitela ili fuziju sa polipeptidom koji povećava poluvreme eliminacije konstrukta antitela u serumu.

[0474] Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju CDR teškog i/ili lakog lanca, naročito hipervarijabilne regione, ali se razmatraju i FR izmene u teškom i/ili lakom lancu. Supstitucije su poželjno konzervativne supstitucije kao što je ovde opisano. Poželjno, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselina može biti zamenjeno u CDR, dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili 25 aminokiselina može biti zamenjeno u okvirnim regionima (FR), u zavisnosti od dužine CDR ili FR. Na primer, ako sekvenca CDR obuhvata 6 aminokiselina, predviđeno je da jedna, dve ili tri od tih aminokiselina budu zamenjene. Slično tome, ako sekvenca CDR obuhvata 15 aminokiselina, predviđeno je da jedna, dve, tri, doručak, četiri, pet ili šest od tih aminokiselina budu zamenjene.

[0476] Korisna metoda za identifikaciju određenih ostataka ili regiona konstrukta antitela koji su poželjne lokacije za mutagenezu naziva se „alaninsko skenirajuća mutageneza” kako su opisali Cunningham i Wells u Science, 244: 1081-1085 (1989). Ovde se identifikuje ostatak ili grupa ciljnih ostataka unutar konstrukta antitela (npr. naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys i glu) i zamenjuju neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (najpoželjnije alaninom ili polialaninom) kako bi se uticalo na interakciju aminokiselina sa epitopom.

[0478] One lokacije aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije se zatim rafinišu uvođenjem daljih ili drugih varijanti na mestima supstitucije ili umesto njih.

[0479] Dakle, dok je mesto ili region za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određeno, priroda same mutacije, sama po sebi, ne mora biti unapred određena. Na primer, da bi se analizirale ili optimizovale performanse mutacije na datom mestu, može se sprovesti alaninsko skeniranje ili nasumična mutageneza na ciljnom kodonu ili regionu, a eksprimirane varijante konstrukta antitela se skriniraju na optimalnu kombinaciju željene aktivnosti.

[0480] Tehnike za pravljenje supstitucionih mutacija na unapred određenim mestima u DNK koja ima poznatu sekvencu dobro su poznate, na primer, M13 prajmer mutageneza i PCR mutageneza. Skrining mutanata vrši se korišćenjem testova aktivnosti vezivanja antigena, kao što je vezivanje za DLL3 ili CD3.

[0482] Generalno, ako su aminokiseline zamenjene u jednom ili više ili svim CDR teškog i/ili lakog lanca, poželjno je da tako dobijena „supstituisana” sekvenca bude najmanje 60% ili 65%, više poželjno 70% ili 75%, još više poželjno 80% ili 85%, a naročito poželjno 90% ili 95% identična „originalnoj” CDR sekvenci. To znači da stepen identičnosti sa „supstituisanom” sekvencom zavisi od dužine CDR. Na primer, CDR koji ima 5 aminokiselina je poželjno 80% identičan svojoj supstituisanoj sekvenci da bi imao bar jednu zamenjenu aminokiselinu. Shodno tome, CDR konstrukta antitela mogu imati različite stepene identičnosti sa svojim supstituisanim sekvencama, npr. CDRL1 može imati 80%, dok CDRL3 može imati 90%.

[0484] Poželjne supstitucije (ili zamene) su konzervativne supstitucije. Međutim, bilo koja supstitucija (uključujući nekonzervativnu supstituciju ili jednu ili više onih iz „primera supstitucija” navedenih u tabeli 1 u nastavku) je predviđena sve dok konstrukt antitela zadržava svoju sposobnost da se veže za DLL3 preko prvog domena vezivanja i za CD3 ili CD3 epsilon preko drugog domena vezivanja i/ili njegovi CDR imaju identičnost sa tada supstituisanom sekvencom (najmanje 60% ili 65%, više poželjno 70% ili 75%, još više poželjno 80% ili 85%, a naročito poželjno 90% ili 95% identičnu „originalnoj” CDR sekvenci).

[0486] Konzervativne supstitucije su prikazane u tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije”. Ako takve supstitucije rezultiraju promenom biološke aktivnosti, tada se mogu uvesti značajnije promene, nazvane „primeri supstitucija” u tabeli 1, ili kao što je dalje opisano u nastavku u vezi sa klasama aminokiselina, a proizvodi se skriniraju na željenu karakteristiku.

[0487] Tabela 1: Aminokiselinske supstitucije

[0490]

[0493] Značajne modifikacije bioloških svojstava konstrukta antitela prema predmetnom pronalasku postižu se odabirom supstitucija koje se značajno razlikuju po svom efektu na održavanje (a) strukture polipeptidne osnove u oblasti supstitucije, na primer, kao nabrana struktura ili heliksna konformacija, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljnom mestu, ili (c) veličine bočnog lanca. Prirodni ostaci podeljeni su u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnih lanaca: (1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile; (2) neutralni hidrofilni: cys, ser, thr; (3) kiseli: asp, glu; (4) bazni: asn, gln, his, lys, arg; (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i (6) aromatični: trp, tyr, phe.

[0494] Nekonzervativne supstitucije podrazumevaće zamenu člana jedne od ovih klasa članom druge klase. Bilo koji cisteinski ostatak koji nije uključen u održavanje pravilne konformacije konstrukta antitela može biti zamenjen, generalno serinom, kako bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekula i sprečilo nepravilno umrežavanje. Nasuprot tome, cisteinska veza (ili veze) mogu se dodati antitelu kako bi se poboljšala njegova stabilnost (naročito tamo gde je antitelo fragment antitela kao što je Fv fragment).

[0496] Za aminokiselinske sekvence, identičnost i/ili sličnost sekvence određuje se korišćenjem standardnih tehnika poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na, algoritam lokalne identičnosti sekvenci autora Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math.

[0497] 2:482, algoritam poravnanja identičnosti sekvenci autora Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48:443, metodu pretrage za sličnost autora Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.85:2444, kompjuterizovane implementacije ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), program sekvence Best Fit koji su

[0498] opisali Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res.12:387-395, poželjno koristeći podrazumevana podešavanja, ili pregledom. Poželjno, procenat identičnosti izračunava se pomoću FastDB na osnovu sledećih parametara: kazna za neuparenost od 1; kazna za prazninu od 1; kazna za veličinu praznine od 0,33; i kazna za spajanje od 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

[0500] Primer korisnog algoritma je PILEUP. PILEUP kreira višestruko poravnanje sekvenci iz grupe srodnih sekvenci koristeći progresivna, parna poravnanja. Takođe može iscrtati stablo koje pokazuje odnose klasterovanja korišćene za kreiranje poravnanja. PILEUP koristi pojednostavljenje metode progresivnog poravnanja autora Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360; metoda je slična onoj koju su opisali Higgins and Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Korisni PILEUP parametri uključuju podrazumevanu težinu praznine od 3,00, podrazumevanu težinu dužine praznine od 0,10 i težinske krajnje praznine.

[0502] [0165] Još jedan primer korisnog algoritma je BLAST algoritam, opisan u: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol.215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402; i Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:5873-5787. Naročito koristan BLAST program je WU-BLAST-2 program koji je dobijen od Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 koristi nekoliko parametara pretrage, od kojih je većina postavljena na podrazumevane vrednosti. Podesivi parametri su postavljeni na sledeće vrednosti: raspon preklapanja=1, udeo preklapanja=0,125, prag reči (T)=II. HSP S i HSP S2 parametri su dinamičke vrednosti i uspostavlja ih sam program u zavisnosti od sastava konkretne sekvence i sastava konkretne baze podataka u kojoj se pretražuje sekvenca od interesa; međutim, vrednosti se mogu podesiti kako bi se povećala osetljivost.

[0504] Dodatni koristan algoritam je gapped BLAST, kao što su opisali Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res.25:3389-3402. Gapped BLAST koristi BLOSUM-62 skorove supstitucije; parametar praga T postavljen na 9; metodu dva pogotka za pokretanje produžetaka bez praznina, naplaćuje dužine praznina k po ceni od 10+k; Xu postavljen na 16, a Xg postavljen na 40 za fazu pretrage baze podataka i na 67 za fazu izlaza algoritama. Poravnanja sa prazninama se pokreću skorom koji odgovara vrednosti od oko 22 bita.

[0506] Generalno, homologija, sličnost ili identičnost aminokiselina između pojedinačnih varijanti CDR je najmanje 60% u odnosu na ovde prikazane sekvence, a tipičnije sa poželjno rastućim homologijama ili identičnostima od najmanje 65% ili 70%, još poželjnije najmanje 75% ili 80%, čak još poželjnije najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i skoro 100%. Na sličan način, „procenat (%) identičnosti sekvence nukleinske kiseline” u odnosu na sekvencu vezivnih proteina koji su ovde identifikovani definisan je kao procenat nukleotidnih ostataka u kandidatskoj sekvenci koji su identični sa nukleotidnim ostacima u kodirajućoj sekvenci konstrukta antitela. Specifična metoda koristi BLASTN modul WU-BLAST-2 postavljen na podrazumevane parametre, sa rasponom preklapanja i udelom preklapanja postavljenim na 1, odnosno 0,125.

[0508] [0168] Generalno, homologija, sličnost ili identičnost sekvence nukleinske kiseline između nukleotidnih sekvenci koje kodiraju pojedinačne varijante CDR i ovde prikazanih nukleotidnih sekvenci iznosi najmanje 60%, a tipičnije sa poželjno rastućim homologijama ili identičnostima od najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% i skoro 100%. Dakle, „varijanta CDR” je ona sa specifikovanom homologijom, sličnošću ili identičnošću sa roditeljskim CDR prema pronalasku, i deli biološku funkciju, uključujući, ali ne ograničavajući se na najmanje 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% specifičnosti i/ili aktivnosti roditeljskog CDR.

[0510] U jednom otelotvorenju, procenat identičnosti sa humanom germinalnom linijom konstrukata antitela prema pronalasku je ≥ 70% ili ≥ 75%, poželjnije ≥ 80% ili ≥ 85%, još poželjnije ≥ 90%, i najpoželjnije ≥ 91%, ≥ 92%, ≥ 93%, ≥ 94%, ≥ 95% ili čak ≥ 96%. Videti primer 7. Smatra se da je identičnost sa produktima gena germinalne linije humanih antitela važna karakteristika za smanjenje rizika da terapeutski proteini izazovu imuni odgovor protiv leka kod pacijenta tokom lečenja. Hwang & Foote ("Immunogenicity of engineered antibodies"; Methods 36 (2005) 3-10) pokazuju da smanjenje nehumanih delova lekovitih konstrukata antitela dovodi do smanjenja rizika od indukovanja antitela protiv leka kod pacijenata tokom lečenja. Upoređivanjem iscrpnog broja klinički evaluiranih lekova na bazi antitela i odgovarajućih podataka o imunogenosti, prikazan je trend da humanizacija V-regiona antitela čini protein manje imunogenim (prosečno 5,1% pacijenata) od antitela koja nose neizmenjene nehumane V-regione (prosečno 23,59% pacijenata). Veći stepen identičnosti sa humanim sekvencama je stoga poželjan za proteinska terapeutska sredstva zasnovana na V-regionu u obliku konstrukata antitela. U svrhu određivanja identičnosti germinalne linije, V-regioni VL mogu se poravnati sa aminokiselinskim sekvencama humanih germinalnih V-segmenata i J-segmenata (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) koristeći Vector NTI softver, a aminokiselinska sekvenca se izračunava deljenjem identičnih aminokiselinskih ostataka ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka VL u procentima. Isto se može uraditi za VH segmente (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) sa izuzetkom što VH CDR3 može biti isključen zbog svoje visoke raznolikosti i nedostatka postojećih humanih germinalnih VH CDR3 partnera za poravnanje. Rekombinantne tehnike se zatim mogu koristiti za povećanje identičnosti sekvence sa genima germinalne linije humanih antitela.

[0512] U daljem otelotvorenju, bispecifični konstrukti antitela prema predmetnom pronalasku pokazuju visoke prinose monomera pod standardnim uslovima istraživačkih razmera, npr. u standardnom dvostepenom procesu prečišćavanja. Poželjno, prinos monomera konstrukata antitela prema pronalasku je ≥ 0,25 mg/L supernatanta, poželjnije ≥ 0,5 mg/L, još poželjnije ≥ 1 mg/L, i najpoželjnije ≥ 3 mg/L supernatanta.

[0514] [0171] Isto tako, može se odrediti prinos dimernih izoformi konstrukta antitela, a time i procenat monomera (tj. monomer: (monomer+dimer)) konstrukata antitela. Produktivnost monomernih i dimernih konstrukata antitela i izračunati procenat monomera mogu se npr. dobiti u koraku SEC prečišćavanja supernatanta kulture iz standardizovane proizvodnje istraživačkih razmera u roler-bocama U jednom otelotvorenju, procenat monomera konstrukata antitela je ≥ 80%, poželjnije ≥ 85%, još poželjnije ≥ 90%, i najpoželjnije ≥ 95%.

[0516] U jednom otelotvorenju, konstrukti antitela imaju poželjnu stabilnost u plazmi (odnos EC50 sa plazmom prema EC50 bez plazme) od ≤ 5 ili ≤ 4, poželjnije ≤ 3,5 ili ≤ 3, još poželjnije ≤ 2,5 ili ≤ 2, i najpoželjnije ≤ 1,5 ili ≤ 1. Stabilnost konstrukta antitela u plazmi može se testirati inkubacijom konstrukta u humanoj plazmi na 37°C tokom 24 sata, nakon čega sledi određivanje EC50 u testu citotoksičnosti oslobađanjem 51-hroma. Efektorske ćelije u testu citotoksičnosti mogu biti stimulisane obogaćene humane CD8 pozitivne T ćelije. Ciljne ćelije mogu npr. biti CHO ćelije transfektovane humanim DLL3. Odnos efektorskih prema ciljnim ćelijama (E:T) može se izabrati kao 10:1. Pul humane plazme koji se koristi u ovu svrhu dobijen je iz krvi zdravih davalaca prikupljene špricevima obloženim EDTA.

[0517] Ćelijske komponente se uklanjaju centrifugiranjem, a gornja faza plazme se prikuplja i naknadno objedinjuje. Kao kontrola, konstrukti antitela se razblažuju neposredno pre testa citotoksičnosti u RPMI-1640 medijumu. Stabilnost u plazmi se izračunava kao odnos EC50 (nakon inkubacije u plazmi) prema EC50 (kontrola). Videti primer 11.

[0519] Nadalje je poželjno da je konverzija monomera u dimer konstrukata antitela prema pronalasku niska. Konverzija se može meriti pod različitim uslovima i analizirati tečnom hromatografijom visoke rezolucije sa isključenjem po veličini. Videti primer 9. Na primer, inkubacija monomernih izoformi konstrukata antitela može se vršiti 7 dana na 37°C i pri koncentracijama od npr.100 µg/ml ili 250 µg/ml u inkubatoru. Pod ovim uslovima, poželjno je da konstrukti antitela prema pronalasku pokazuju procenat dimera koji je ≤5%, poželjnije ≤4%, još poželjnije ≤3%, još poželjnije ≤2,5%, još poželjnije ≤2%, još poželjnije ≤1,5%, i najpoželjnije ≤1% ili ≤0,5% ili čak 0%.

[0521] [0174] Takođe je poželjno da citotoksični bispecifični konstrukti antitela sa jednim lancem prema predmetnom pronalasku pokazuju veoma nisku konverziju u dimer nakon određenog broja ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja. Na primer, monomer konstrukta antitela se podesi na koncentraciju od 250 µg/ml npr. u generičkom puferu za formulaciju i podvrgne trima ciklusima zamrzavanja/odmrzavanja (zamrzavanje na -80°C tokom 30 minuta, nakon čega sledi odmrzavanje tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi), nakon čega sledi SEC visoke rezolucije kako bi se odredio procenat prvobitno monomernog konstrukta antitela koji je konvertovan u dimerni konstrukt antitela. Poželjno, procenti dimera bispecifičnih konstrukata antitela su ≤5%, poželjnije ≤4%, još poželjnije ≤3%, još poželjnije ≤2.5%, još poželjnije ≤2%, još poželjnije ≤1,5%, i najpoželjnije ≤1% ili čak ≤0,5%, na primer nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja.

[0523] Citotoksični bispecifični konstrukti antitela sa jednim lancem prema predmetnom pronalasku poželjno pokazuju povoljnu termostabilnost sa temperaturama agregacije ≥45°C ili ≥50°C, poželjnije ≥52°C ili ≥54°C, još poželjnije ≥56°C ili ≥57°C, i najpoželjnije ≥58°C ili ≥59°C. Parametar termostabilnosti može se odrediti u smislu temperature agregacije antitela na sledeći način: Rastvor antitela pri koncentraciji od 250 µg/ml prebacuje se u kivetu za jednokratnu upotrebu i stavlja u uređaj za dinamičko rasejanje svetlosti (DLS). Uzorak se zagreva sa 40°C na 70°C brzinom zagrevanja od 0,5°C/min uz konstantno akviziciju izmerenog radijusa. Povećanje radijusa koje ukazuje na topljenje proteina i agregaciju koristi se za izračunavanje temperature agregacije antitela. Videti primer 10.

[0525] Alternativno, krive topljenja u zavisnosti od temperature mogu se odrediti diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC) kako bi se odredile inherentne biofizičke stabilnosti proteina konstrukata antitela. Ovi eksperimenti se izvode korišćenjem VP-DSC uređaja kompanije MicroCal LLC (Northampton, MA, U.S.A). Apsorpcija energije uzorka koji sadrži konstrukt antitela beleži se od 20°C do 90°C u poređenju sa uzorkom koji sadrži samo pufer za formulaciju. Konstrukti antitela se podešavaju na finalnu koncentraciju od 250 µg/ml npr. u SEC radnom puferu. Za beleženje odgovarajuće krive topljenja, ukupna temperatura uzorka se povećava stepenasto. Na svakoj temperaturi T beleži se apsorpcija energije uzorka i reference pufera za formulaciju. Razlika u apsorpciji energije Cp (kcal/mol/°C) uzorka minus referenca prikazuje se u odnosu na odgovarajuću temperaturu. Temperatura topljenja definisana je kao temperatura pri prvom maksimumu apsorpcije energije.

[0527] Nadalje je predviđeno da citotoksični bispecifični konstrukti antitela sa jednim lancem DLL3xCD3 prema pronalasku ne reaguju unakrsno sa (tj. suštinski se ne vezuju za) humane paraloge DLL3, DLL1 i/ili DLL4. Štaviše, predviđeno je da bispecifični konstrukti antitela DLL3xCD3 prema pronalasku ne reaguju unakrsno sa (tj. suštinski se ne vezuju za) paraloge DLL3 makakija / cyno, DLL1 i/ili DLL4. Videti primer 6.

[0528] Takođe je predviđeno da citotoksični bispecifični konstrukti antitela sa jednim lancem DLL3xCD3 prema pronalasku imaju zamućenost (merenu putem OD340 nakon koncentrisanja prečišćenog monomernog konstrukta antitela na 2,5 mg/ml i inkubacije preko noći) od ≤ 0,2, poželjno od ≤ 0,15, poželjnije od ≤ 0,12, još poželjnije od ≤ 0,1, i najpoželjnije od ≤ 0,08. Videti primer 12.

[0530] Takođe je predviđeno da se citotoksični bispecifični konstrukti antitela sa jednim lancem DLL3xCD3 prema pronalasku ne internalizuju ili da ne podležu značajnoj internalizaciji od strane ciljne ćelije. Stopa internalizacije može se ispitati npr. kao što je opisano u primeru 16. Poželjno, stopa internalizacije (npr. merena kao smanjenje citotoksičnosti) je ≤ 20% nakon 2 sata (pre-)inkubacije konstrukta antitela sa ciljnom ćelijom, poželjnije ≤ 15%, još poželjnije ≤ 10%, i najpoželjnije ≤ 5%.

[0532] Nadalje je predviđeno da odbačeni ili rastvorljivi DLL3 značajno ne narušava efikasnost ili biološku aktivnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 prema pronalasku. Ovo se može meriti npr. u testu citotoksičnosti gde se rastvorljivi DLL3 dodaje u test u rastućim koncentracijama, npr. pri 0 nM - 0,3 nM - 0,7 nM - 1 nM - 3 nM - 7 nM - 12 nM. Vrednost EC50 testiranog konstrukta antitela ne bi trebalo da bude značajno povećana u prisustvu rastvorljivog DLL3. Videti primer 17.

[0534] U daljem otelotvorenju, konstrukt antitela prema pronalasku je stabilan pri kiselom pH. Što se konstrukt antitela tolerantnije ponaša pri nefiziološkoj pH, kao što je pH 5,5 (pH koji je neophodan za sprovođenje npr. katjonske izmenjivačke hromatografije), to je veći povrat konstrukta antitela eluiranog iz jonske izmenjivačke kolone u odnosu na ukupnu količinu nanetog proteina. Povrat konstrukta antitela iz jonske (npr. katjonske) izmenjivačke kolone pri pH 5,5 je poželjno ≥ 30%, poželjnije ≥ 40%, poželjnije ≥ 50%, još poželjnije ≥ 60%, još poželjnije ≥ 70%, još poželjnije ≥ 80%, još poželjnije ≥ 90%, još poželjnije ≥ 95%, i najpoželjnije ≥ 99%. Videti primer 13.

[0536] Nadalje je predviđeno da citotoksični bispecifični konstrukti antitela sa jednim lancem prema predmetnom pronalasku pokazuju terapeutsku efikasnost ili antitumorsku aktivnost. Ovo se npr. može proceniti u studiji kao što je obelodanjeno u sledećem primeru modela ksenografta humanog tumora u poodmakloj fazi:

[0537] 1. dana studije, 5x10<6>ćelija humane DLL3 pozitivne ćelijske linije raka (npr. SHP-77) ubrizgava se potkožno u desni dorzalni bok ženki NOD/SCID miševa. Kada srednja zapremina tumora dostigne oko 100 mm<3>, in vitro ekspandirane humane CD3 pozitivne T ćelije se transplantiraju u miševe injekcijom oko 2x10<7>ćelija u peritonealnu šupljinu životinja. Miševi iz kontrolne grupe 1 sa vehikulumom ne primaju efektorske ćelije i koriste se kao netransplantirana kontrola za poređenje sa kontrolnom grupom 2 sa vehikulumom (koja prima efektorske ćelije) kako bi se pratio uticaj samih T ćelija na rast tumora. Tretman antitelom počinje kada srednja zapremina tumora dostigne oko 200 mm<3>. Srednja veličina tumora svake grupe tretmana na dan početka tretmana ne bi trebalo da se statistički razlikuje od bilo koje druge grupe (analiza varijanse). Miševi se tretiraju sa 0,5 mg/kg/dan bispecifičnog konstrukta antitela DLL3xCD3 putem intravenske bolus injekcije tokom oko 15 do 20 dana. Tumori se mere kaliperom tokom studije, a napredak se procenjuje međugrupnim poređenjem zapremina tumora (TV). Inhibicija rasta tumora T/C [%] određuje se izračunavanjem TV kao T/C% = 100 x (medijana TV analizirane grupe) / (medijana TV kontrolne grupe 2).

[0539] Stručnjak zna kako da modifikuje ili prilagodi određene parametre ove studije, kao što su broj ubrizganih tumorskih ćelija, mesto injekcije, broj transplantiranih humanih T ćelija, količina bispecifičnih konstrukata antitela koju treba primeniti i vremenski okviri, a da pritom ipak dođe do smislenog i ponovljivog rezultata. Poželjno, inhibicija rasta tumora T/C [%] je ≤ 70 ili ≤ 60, poželjnije ≤ 50 ili ≤ 40, još poželjnije ≤ 30 ili ≤ 20 i najpoželjnije ≤ 10 ili ≤ 5 ili čak ≤ 2,5.

[0541] Pronalazak dalje obezbeđuje polinukleotid / molekul nukleinske kiseline koji kodira konstrukt antitela prema pronalasku.

[0543] Polinukleotid je biopolimer sastavljen od 13 ili više nukleotidnih monomera kovalentno vezanih u lanac. DNK (kao što je cDNK) i RNK (kao što je mRNK) su primeri polinukleotida sa različitim biološkim funkcijama. Nukleotidi su organski molekuli koji služe kao monomeri ili podjedinice molekula nukleinskih kiselina kao što su DNK ili RNK.

[0544] Molekul nukleinske kiseline ili polinukleotid može biti dvolančan i jednolančan, linearan i kružan. On je poželjno obuhvaćen u vektoru koji je poželjno obuhvaćen u ćeliji domaćinu. Navedena ćelija domaćin je, npr. nakon transformacije ili transfekcije vektorom ili polinukleotidom prema pronalasku, sposobna da eksprimira konstrukt antitela. U tu svrhu, polinukleotid ili molekul nukleinske kiseline je operativno povezan sa kontrolnim sekvencama.

[0546] Genetički kod je skup pravila po kojima se informacije kodirane unutar genetičkog materijala (nukleinskih kiselina) prevode u proteine. Biološko dekodiranje u živim ćelijama vrši ribozom koji povezuje aminokiseline redosledom specifikovanim putem mRNK, koristeći tRNK molekule za nošenje aminokiselina i za čitanje mRNK po tri nukleotida odjednom. Kod definiše kako sekvence ovih nukleotidnih tripleta, nazvanih kodoni, određuju koja će aminokiselina biti sledeća dodata tokom sinteze proteina. Sa nekim izuzecima, kodon od tri nukleotida u sekvenci nukleinske kiseline određuje jednu aminokiselinu. Pošto je velika većina gena kodirana potpuno istim kodom, ovaj konkretan kod se često naziva kanonski ili standardni genetički kod. Dok genetički kod određuje sekvencu proteina za dati kodirajući region, drugi genomski regioni mogu uticati na to kada i gde se ovi proteini proizvode.

[0548] Nadalje, pronalazak obezbeđuje vektor koji obuhvata polinukleotid / molekul nukleinske kiseline prema pronalasku.

[0550] Vektor je molekul nukleinske kiseline koji se koristi kao vehikulum za prenos (stranog) genetičkog materijala u ćeliju. Termin „vektor” obuhvata - ali nije ograničen na -plazmide, viruse, kozmide i veštačke hromozome. Generalno, konstruisani vektori obuhvataju mesto početka replikacije, multiklonirajuće mesto i selektivni marker. Sam vektor je obično nukleotidna sekvenca, obično DNK sekvenca, koja obuhvata insert (transgen) i dužu sekvencu koja služi kao „osnova” vektora. Savremeni vektori pored inserta transgena i osnove mogu obuhvatati dodatne karakteristike: promotor, genetički marker, rezistenciju na antibiotike, reporterski gen, ciljnu sekvencu, marker za prečišćavanje proteina. Vektori nazvani ekspresioni vektori (ekspresioni konstrukti) specifično služe za ekspresiju transgena u ciljnoj ćeliji i generalno imaju kontrolne sekvence.

[0552] Termin „kontrolne sekvence” odnosi se na DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, opciono operatorsku sekvencu i ribozomsko mesto vezivanja. Poznato je da eukariotske ćelije koriste promotore, signale za poliadenilaciju i enhansere.

[0553] Nukleinska kiselina je „operativno povezana” kada je postavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za pre-sekvencu ili sekretornu lider-sekvencu operativno je povezana sa DNK za polipeptid ako se eksprimira kao preprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili enhanser je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je ribozomsko mesto vezivanja operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakšava translaciju. Generalno, „operativno povezana” znači da su DNK sekvence koje se povezuju susedne, a u slučaju sekretorne lider-sekvence, susedne i u okviru čitanja. Međutim, enhanseri ne moraju biti susedni. Povezivanje se vrši ligacijom na pogodnim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adaptori ili linkeri u skladu sa konvencionalnom praksom.

[0555] „Transfekcija” je proces namernog uvođenja molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida (uključujući vektore) u ciljne ćelije. Termin se uglavnom koristi za nevirusne metode u eukariotskim ćelijama. Transdukcija se često koristi za opisivanje prenosa molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida posredovanog virusom. Transfekcija životinjskih ćelija tipično uključuje otvaranje prolaznih pora ili „rupa” u ćelijskoj membrani kako bi se omogućio unos materijala. Transfekcija se može sprovesti korišćenjem kalcijum-fosfata, elektroporacijom, kompresijom ćelija ili mešanjem katjonskog lipida sa materijalom kako bi se proizveli lipozomi koji se fuzionišu sa ćelijskom membranom i deponuju svoj teret unutra.

[0557] Termin „transformacija” koristi se za opisivanje nevirusnog prenosa molekula nukleinske kiseline ili polinukleotida (uključujući vektore) u bakterije, kao i u neživotinjske eukariotske ćelije, uključujući biljne ćelije. Transformacija je, dakle, genetička izmena bakterijske ili neživotinjske eukariotske ćelije koja rezultira direktnim unosom egzogenog genetičkog materijala (molekula nukleinske kiseline) iz okruženja kroz ćelijsku membranu i naknadnom inkorporacijom. Transformacija se može izvršiti veštačkim putem. Da bi došlo do transformacije, ćelije ili bakterije moraju biti u stanju kompetencije, koje se može javiti kao vremenski ograničen odgovor na uslove okruženja, kao što su izgladnjivanje i gustina ćelija.

[0559] Štaviše, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina transformisanu ili transfektovanu polinukleotidom / molekulom nukleinske kiseline ili vektorom prema pronalasku.

[0560] Kako se ovde koristi, termini „ćelija domaćin” ili „ćelija primalac” namenjeni su da uključe bilo koju pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može biti ili koja je bila primalac vektora, egzogenih molekula nukleinske kiseline i polinukleotida koji kodiraju konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku; i/ili primalac samog konstrukta antitela. Uvođenje odgovarajućeg materijala u ćeliju vrši se putem transformacije, transfekcije i sličnog. Termin „ćelija domaćin” takođe je namenjen da uključi potomstvo ili potencijalno potomstvo pojedinačne ćelije. Pošto se određene modifikacije mogu javiti u narednim generacijama usled prirodne, slučajne ili namerne mutacije ili usled uticaja okruženja, takvo potomstvo u stvari ne mora biti potpuno identično (u morfologiji ili u genomskom ili ukupnom DNK komplementu) roditeljskoj ćeliji, ali je i dalje uključeno u opseg termina kako se ovde koristi. Odgovarajuće ćelije domaćini uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, a takođe uključuju, ali nisu ograničene na, bakterije, ćelije kvasca, ćelije gljiva, biljne ćelije i životinjske ćelije kao što su ćelije insekata i ćelije sisara, npr. mišje, pacovske, makakija ili humane.

[0562] Konstrukt antitela prema pronalasku može se proizvesti u bakterijama. Nakon ekspresije, konstrukt antitela prema pronalasku izoluje se iz ćelijske paste E. coli u rastvorljivoj frakciji i može se prečistiti npr. afinitetnom hromatografijom i/ili isključenjem po veličini. Finalno prečišćavanje se može sprovesti slično procesu prečišćavanja antitela eksprimiranog npr. u CHO ćelijama.

[0564] Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne gljive ili kvasac su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju konstrukta antitela prema

[0565] pronalasku. Saccharomyces cerevisiae, ili obični pekarski kvasac, najčešće je korišćen među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćinima. Međutim, brojni drugi rodovi, vrste i sojevi su uobičajeno dostupni i ovde korisni, kao što su Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces domaćini kao što su K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans i K. marxianus; Yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070); kandida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa;

[0566] Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis; i filamentozne gljive kao što su Neurospora, Penicillium, Tolypocladium i Aspergillus domaćini kao što su A. nidulans i A. niger.

[0567] Odgovarajuće ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog konstrukta antitela prema pronalasku potiču iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija bezkičmenjaka uključuju biljne ćelije i ćelije insekata. Identifikovani su brojni bakulovirusni sojevi i varijante i odgovarajuće permisivne ćelije domaćini insekata iz domaćina kao što su Spodoptera

[0568] frugiperda (gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (vinska mušica) i Bombyx mori. Različiti virusni sojevi za transfekciju su javno dostupni, npr. L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, a takvi virusi se mogu koristiti kao virusi ovde prema predmetnom pronalasku, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

[0570] Biljne ćelijske kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, Arabidopsis i duvana takođe se mogu koristiti kao domaćini. Vektori za kloniranje i ekspresiju korisni u proizvodnji proteina u biljnoj ćelijskoj kulturi poznati su stručnjacima iz predmetne oblasti. Videti npr. Hiatt et al., Nature (1989) 342: 76-78, Owen et al. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko et al. (1995) The Plant J 8: 745-750, i Fecker et al. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

[0572] Međutim, interesovanje je najveće za ćelije kičmenjaka, a razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postalo je rutinska procedura. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su linija CV1 bubrega majmuna transformisana putem SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija humanog embrionalnog bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, Graham et al., J. Gen Virol.36 : 59 (1977)); ćelije bubrega mladunčeta hrčka (BHK, ATCC CCL 10); ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216 (1980)); mišje sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod.23: 243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CVI ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL1587); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije psećeg bubrega (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bivo-pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije humanih pluća (W138, ATCC CCL 75); ćelije humane jetre (Hep G2, 14138065); mišji tumor mlečne žlezde (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. (1982) 383: 44-68); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija humanog hepatoma (Hep G2).

[0574] [0200] U daljem otelotvorenju, pronalazak obezbeđuje proces za proizvodnju konstrukta antitela prema pronalasku, pri čemu navedeni proces obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju konstrukta antitela prema pronalasku i izdvajanje proizvedenog konstrukta antitela iz kulture.

[0576] Kako se ovde koristi, termin „kultivisanje” odnosi se na in vitro održavanje, diferencijaciju, rast, proliferaciju i/ili razmnožavanje ćelija pod odgovarajućim uslovima u medijumu. Termin „ekspresija” uključuje bilo koji korak uključen u proizvodnju konstrukta antitela prema pronalasku uključujući, ali ne ograničavajući se na transkripciju, posttranskripcionu modifikaciju, translaciju, post-translacionu modifikaciju i sekreciju.

[0578] Kada se koriste rekombinantne tehnike, konstrukt antitela može se proizvoditi intracelularno, u periplazmatičnom prostoru ili direktno sekretovati u medijum. Ako se konstrukt antitela proizvodi intracelularno, kao prvi korak uklanjaju se čestice otpada, bilo ćelije domaćini ili lizirani fragmenti, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisuju proceduru za izolovanje antitela koja se sekretuju u periplazmatični prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta se odmrzava u prisustvu natrijum-acetata (pH 3,5), EDTA i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 minuta. Ćelijski otpad se može ukloniti centrifugiranjem. Tamo gde se antitelo sekretuje u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se generalno prvo koncentrišu korišćenjem komercijalno dostupnog filtera za koncentrisanje proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon jedinice za ultrafiltraciju. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka kako bi se inhibirala proteoliza, a antibiotici mogu biti uključeni kako bi se sprečio rast slučajnih kontaminenata.

[0580] Konstrukt antitela prema pronalasku pripremljen iz ćelija domaćina može se izdvojiti ili prečistiti korišćenjem, na primer, hromatografije na hidroksilapatitu, gel elektroforeze, dijalize i afinitetne hromatografije. Druge tehnike za prečišćavanje proteina kao što su frakcionisanje na jonskoj izmenjivačkoj koloni, taloženje etanolom, HPLC sa reverznim fazama, hromatografija na silicijum-dioksidu, hromatografija na heparin SEPHAROSE<™>, hromatografija na anjonskoj ili katjonskoj izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona sa poliasparaginskom kiselinom), hromatofokusiranje, SDS-PAGE i taloženje amonijumsulfatom takođe su dostupne u zavisnosti od antitela koje treba izdvojiti. Tamo gde konstrukt antitela prema pronalasku obuhvata CH3 domen, Bakerbond ABX smola (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) je korisna za prečišćavanje.

[0581] Afinitetna hromatografija je poželjna tehnika prečišćavanja. Matrks na koji je vezan afinitetni ligand najčešće je agaroza, ali su dostupni i drugi matriksi. Mehanički stabilni matriksi, kao što su staklo sa kontrolisanim porama ili poli(stirendivinil) benzen omogućavaju veće brzine protoka i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom.

[0583] Štaviše, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata konstrukt antitela prema pronalasku ili konstrukt antitela proizveden prema procesu iz pronalaska.

[0585] Kako se ovde koristi, termin „farmaceutska kompozicija” odnosi se na kompoziciju koja je pogodna za primenu kod pacijenta, poželjno humanog pacijenta. Naročito poželjna farmaceutska kompozicija prema ovom pronalasku obuhvata jedan ili više konstrukata antitela prema pronalasku, poželjno u terapeutski efikasnoj količini. Poželjno, farmaceutska kompozicija dalje obuhvata odgovarajuće formulacije jednog ili više (farmaceutski efikasnih) nosača, stabilizatora, ekscipijenata, diluenata, solubilizatora, surfaktanata, emulgatora, konzervansa i/ili adjuvanasa. Prihvatljivi sastojci kompozicije su poželjno netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama. Farmaceutske kompozicije prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničene na tečne, zamrznute i liofilizovane kompozicije.

[0587] Kompozicije prema pronalasku mogu obuhvatati farmaceutski prihvatljiv nosač. Generalno, kako se ovde koristi, „farmaceutski prihvatljiv nosač” označava sve vodene i nevodene rastvore, sterilne rastvore, rastvarače, pufere, npr. rastvore fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom (PBS), vodu, suspenzije, emulzije, kao što su emulzije ulje/voda, različite vrste sredstava za kvašenje, lipozome, medijume za disperziju i obloge, koji su kompatibilni sa farmaceutskom primenom, naročito sa parenteralnom primenom. Upotreba takvih medijuma i sredstava u farmaceutskim kompozicijama dobro je poznata u struci, a kompozicije koje obuhvataju takve nosače mogu se formulisati dobro poznatim konvencionalnim metodama.

[0589] [0208] Određena otelotvorenja obezbeđuju farmaceutske kompozicije koje obuhvataju konstrukt antitela prema pronalasku i dalje jedan ili više ekscipijenata kao što su oni ilustrativno opisani u ovom odeljku i na drugim mestima u ovom dokumentu. Ekscipijenti se u pronalasku u tom pogledu mogu koristiti za širok spektar svrha, kao što je prilagođavanje fizičkih, hemijskih ili bioloških svojstava formulacija, kao što je prilagođavanje viskoznosti, i/ili procesa prema pronalasku radi poboljšanja efikasnosti i/ili stabilizacije takvih formulacija i procesa protiv degradacije i kvarenja usled, na primer, stresova koji se javljaju tokom proizvodnje, transporta, skladištenja, pripreme pre upotrebe, primene i nakon toga.

[0591] U određenim otelotvorenjima, farmaceutska kompozicija može sadržati materijale za formulaciju u svrhu modifikovanja, održavanja ili čuvanja, npr. pH vrednosti, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije kompozicije (videti, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company). U takvim otelotvorenjima, odgovarajući materijali za formulaciju mogu uključivati, ali nisu ograničeni na:

[0592] • aminokiseline kao što su glicin, alanin, glutamin, asparagin, treonin, prolin, 2-fenilalanin, uključujući naelektrisane aminokiseline, poželjno lizin, lizin-acetat, arginin, glutamat i/ili histidin;

[0593] • antimikrobna sredstva kao što su antibakterijski i antifungalni agensi;

[0594] • antioksidanse kao što su askorbinska kiselina, metionin, natrijum-sulfit ili natrijumhidrogensulfit;

[0595] • pufere, puferske sisteme i sredstva za puferovanje koji se koriste za održavanje kompozicije na fiziološkom pH ili na neznatno nižem pH, tipično unutar pH opsega od oko 5 do oko 8 ili 9; primeri pufera su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline, sukcinat, fosfat, histidin i acetat; na primer, Tris pufer od oko pH 7,0-8,5, ili acetatni pufer od oko pH 4,0-5,5;

[0596] • nevodene rastvarače kao što su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje, i organske estre za injekcije kao što je etil-oleat;

[0597] • vodene nosače uključujući vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferovane medijume;

[0598] • biorazgradive polimere kao što su poliestri;

[0599] • sredstva za povećanje zapremine kao što su manitol ili glicin;

[0600] • agense za helatizaciju kao što je etilendiamintetra-sirćetna kiselina (EDTA);

[0601] • sredstva za izotoničnost i odlaganje apsorpcije;

[0602] • agense za kompleksiranje kao što su kofein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin;

[0603] • punioce;

[0604] monosaharide; disaharide; i druge ugljene hidrate (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); ugljeni hidrati mogu biti neredukujući šećeri, poželjno trehaloza, saharoza, oktasulfat, sorbitol ili ksilitol;

[0605] proteine (niske molekulske težine), polipeptide ili proteinske nosače kao što su humani ili goveđi serumski albumin, želatin ili imunoglobulini, poželjno humanog porekla;

[0606] sredstva za bojenje i aromu;

[0607] redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što su glutation, tioktinska kiselina, natrijum-tioglikolat, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol i natrijum-tiosulfat; agense za razblaživanje;

[0608] emulgatore;

[0609] hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon;

[0610] kontra-jone koji grade soli, kao što je natrijum;

[0611] konzervanse kao što su antimikrobna sredstva, antioksidansi, agensi za helatizaciju, inertni gasovi i slično; primeri su: benzalkonijum-hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil-alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik-peroksid;

[0612] komplekse metala kao što su cink-proteinski kompleksi;

[0613] rastvarače i ko-rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećere i šećerne alkohole, kao što su trehaloza, saharoza, oktasulfat, manitol, sorbitol ili ksilitol, stahioza, manoza, sorboza, ksiloza, riboza, mioinozit, galaktoza, laktitol, ribitol, mioinozitol, galaktitol, glicerol, ciklitoli (npr. inozitol), polietilen glikol; i polihidroksilne šećerne alkohole;

[0614] agense za suspendovanje;

[0615] surfaktante ili sredstva za kvašenje kao što su pluronici, PEG, estri sorbitana, polisorbati kao što su polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal; surfaktanti mogu biti deterdženti, poželjno sa molekulskom težinom >1,2 KD i/ili polieter, poželjno sa molekulskom težinom >3 KD; neograničavajući primeri za poželjne deterdžente su Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 i Tween 85; neograničavajući primeri za poželjne polietere su PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 i PEG 5000;

[0616] agense za poboljšanje stabilnosti kao što su saharoza ili sorbitol;

[0617] agense za poboljšanje toničnosti kao što su halogenidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum-hlorid, manitol, sorbitol;

[0618] • vehikulume za parenteralnu primenu uključujući rastvor natrijum-hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum-hlorid, laktatni Ringerov rastvor ili fiksna ulja;

[0620] • sredstva za intravensku primenu uključujući sredstva za nadoknadu tečnosti i hranljivih materija, sredstva za nadoknadu elektrolita (kao što su ona zasnovana na Ringerovoj dekstrozi).

[0622] Stručnjaku iz predmetne oblasti je evidentno da različiti sastojci farmaceutske kompozicije (npr. oni gore navedeni) mogu imati različite efekte, na primer, aminokiselina može delovati kao pufer, stabilizator i/ili antioksidans; manitol može delovati kao sredstvo za povećanje zapremine i/ili agens za poboljšanje toničnosti; natrijum-hlorid može delovati kao vehikulum za isporuku i/ili agens za poboljšanje toničnosti; itd.

[0624] Predviđeno je da kompozicija prema pronalasku može obuhvatati, pored ovde definisanog polipeptida prema pronalasku, dalje biološki aktivne agense, u zavisnosti od nameravane upotrebe kompozicije. Takvi agensi mogu biti lekovi koji deluju na gastrointestinalni sistem, lekovi koji deluju kao citostatici, lekovi koji sprečavaju hiperurikemiju, lekovi koji inhibiraju imunoreakcije (npr. kortikosteroidi), lekovi koji modulišu inflamatorni odgovor, lekovi koji deluju na cirkulatorni sistem i/ili agensi kao što su citokini poznati u struci. Takođe je predviđeno da se konstrukt antitela prema predmetnom pronalasku primenjuje u ko-terapiji, tj. u kombinaciji sa drugim lekom protiv raka.

[0626] [0212] U određenim otelotvorenjima, optimalnu farmaceutsku kompoziciju odrediće stručnjak iz predmetne oblasti u zavisnosti od, na primer, nameravanog puta primene, formata isporuke i željene doze. Videti, na primer, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. U određenim otelotvorenjima, takve kompozicije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo i brzinu eliminacije in vivo konstrukta antitela prema pronalasku. U određenim otelotvorenjima, primarni vehikulum ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može biti po prirodi vodeno ili nevodeno. Na primer, odgovarajući vehikulum ili nosač može biti voda za injekcije, fiziološki rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, eventualno dopunjena drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralnu primenu. Neutralni puferovani fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa serumskim albuminom su dalji egzemplarni vehikulumi. U određenim otelotvorenjima, kompozicije sa konstruktom antitela prema pronalasku mogu se pripremiti za skladištenje mešanjem odabrane kompozicije koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim agensima za formulaciju (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim otelotvorenjima, konstrukt antitela prema pronalasku može se formulisati kao liofilizat korišćenjem odgovarajućih ekscipijenata kao što je saharoza.

[0628] Kada se razmatra parenteralna primena, terapeutske kompozicije za upotrebu u ovom pronalasku mogu se obezbediti u obliku vodenog rastvora bez pirogena, parenteralno prihvatljivog, koji obuhvata željeni konstrukt antitela prema pronalasku u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Naročito pogodan vehikulum za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je konstrukt antitela prema pronalasku formulisan kao sterilan, izotoničan rastvor, propisno konzervisan. U određenim otelotvorenjima, priprema može uključivati formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su mikrosfere za injekcije, bio-erodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što su polilaktična kiselina ili poliglikolna kiselina), perle ili lipozomi, koji mogu obezbediti kontrolisano ili produženo oslobađanje proizvoda koji se može isporučiti putem depo injekcije. U određenim otelotvorenjima, takođe se može koristiti hijaluronska kiselina, što ima efekat promovisanja produženog zadržavanja u cirkulaciji. U određenim otelotvorenjima, za uvođenje željenog konstrukta antitela mogu se koristiti implantabilni uređaji za isporuku leka.

[0630] [0214] Dodatne farmaceutske kompozicije biće evidentne stručnjaku iz predmetne oblasti, uključujući formulacije koje uključuju konstrukt antitela prema pronalasku u formulacijama sa produženom ili kontrolisanom isporukom / oslobađanjem. Tehnike za formulisanje raznih drugih sredstava za produženu ili kontrolisanu isporuku, kao što su nosači lipozomi, bioerodibilne mikročestice ili porozne perle i depo injekcije, takođe su poznate stručnjaku iz predmetne oblasti. Videti, na primer, međunarodnu patentnu prijavu WO 9315722, koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih kompozicija. Preparati sa produženim oslobađanjem mogu uključivati semipermeabilne polimerne matrikse u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmova ili mikrokapsula. Matrice za produženo oslobađanje mogu uključivati poliestre, hidrogelove, polilaktide (kao što je obelodanjeno u američkom patentu br.3,773,919 i objavi evropske patentne prijave br. EP 058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli (2-hidroksietil-metakrilat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.15:167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech.12:98-105), etilen vinil acetat (Langer et al., 1981, supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibiternu kiselinu (objava evropske patentne prijave br. EP 133,988). Kompozicije sa produženim oslobađanjem mogu takođe uključivati lipozome koji se mogu pripremiti bilo kojom od nekoliko metoda poznatih u struci. Videti npr. Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82:3688-3692; objave evropske patentne prijave br. EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

[0632] Konstrukt antitela takođe može biti zarobljen u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom (na primer, mikrokapsule od hidroksimetilceluloze ili želatina i mikrokapsule od poli (metilmetakrilata), respektivno), u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomi, mikrosfere od albumina, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule), ili u makroemulzijama. Takve tehnike su obelodanjene u Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980).

[0634] Farmaceutske kompozicije koje se koriste za in vivo primenu tipično se obezbeđuju kao sterilni preparati. Sterilizacija se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Kada je kompozicija liofilizovana, sterilizacija ovom metodom može se sprovesti ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicije za parenteralnu primenu mogu se čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Parenteralne kompozicije se generalno stavljaju u posudu koja ima sterilni pristupni otvor, na primer, kesu za intravenski rastvor ili bočicu koja ima čep koji se može probiti iglom za hipodermičnu injekciju.

[0636] Drugi aspekt pronalaska uključuje samopuferske formulacije konstrukta antitela prema pronalasku, koje se mogu koristiti kao farmaceutske kompozicije, kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 2006138181A2. Dostupni su različiti prikazi o stabilizaciji proteina i materijalima i metodama formulacije korisnim u tom pogledu, kao što su Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res.8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution" in: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology.13: 61-84 (2002), i Randolph et al., "Surfactant-protein interactions", Pharm Biotechnol.13: 159-75 (2002), videti naročito delove koji se odnose na ekscipijente i njihove procese za samopuferske proteinske formulacije u skladu sa predmetnim pronalaskom, posebno u pogledu proteinskih farmaceutskih proizvoda i procesa za veterinarsku i/ili humanu medicinsku upotrebu.

[0637] Soli se mogu koristiti u skladu sa određenim otelotvorenjima pronalaska da bi se, na primer, prilagodila jonska jačina i/ili izotoničnost formulacije i/ili da bi se poboljšala rastvorljivost i/ili fizička stabilnost proteina ili drugog sastojka kompozicije u skladu sa pronalaskom. Kao što je dobro poznato, joni mogu stabilizovati prirodno stanje proteina vezivanjem za naelektrisane ostatke na površini proteina i zaklanjanjem naelektrisanih i polarnih grupa u proteinu, čime smanjuju jačinu njihovih elektrostatičkih interakcija, privlačnih i odbojnih interakcija. Joni takođe mogu stabilizovati denaturisano stanje proteina vezivanjem za, naročito, denaturisane peptidne veze (--CONH) proteina. Štaviše, jonska interakcija sa naelektrisanim i polarnim grupama u proteinu takođe može smanjiti intermolekulske elektrostatičke interakcije i time sprečiti ili smanjiti agregaciju i nerastvorljivost proteina.

[0639] Jonske vrste se značajno razlikuju po svojim efektima na proteine. Razvijen je niz kategoričkih rangiranja jona i njihovih efekata na proteine koji se mogu koristiti u formulisanju farmaceutskih kompozicija u skladu sa pronalaskom. Jedan primer je Hofmajsterova serija, koja rangira jonske i polarne nejonske rastvorene supstance prema njihovom efektu na konformacionu stabilnost proteina u rastvoru. Stabilizujuće rastvorene supstance nazivaju se „kosmotropne”. Destabilizujuće rastvorene supstance nazivaju se „haotropne”. Kosmotropi se obično koriste u visokim koncentracijama (npr. > 1 molarni amonijum-sulfat) za taloženje proteina iz rastvora („isoljavanje”). Haotropi se obično koriste za denaturaciju i/ili rastvaranje proteina („usoljavanje”). Relativna efikasnost jona u „usoljavanju” i „isoljavanju” definiše njihov položaj u Hofmajsterovoj seriji.

[0641] Slobodne aminokiseline se mogu koristiti u formulacijama konstrukta antitela prema pronalasku u skladu sa različitim otelotvorenjima pronalaska kao sredstva za povećanje zapremine, stabilizatori i antioksidansi, kao i za druge standardne upotrebe. Lizin, prolin, serin i alanin se mogu koristiti za stabilizaciju proteina u formulaciji. Glicin je koristan u liofilizaciji kako bi se osigurala pravilna struktura i svojstva liofilizovanog kolača. Arginin može biti koristan za inhibiciju agregacije proteina, kako u tečnim, tako i u liofilizovanim formulacijama. Metionin je koristan kao antioksidans.

[0643] [0221] Polioli uključuju šećere, npr. manitol, saharozu i sorbitol, i polihidroksilne alkohole kao što su, na primer, glicerol i propilen glikol, i, za potrebe ovdašnje diskusije, polietilen glikol (PEG) i srodne supstance. Polioli su kosmotropni. Oni su korisna sredstva za stabilizaciju i u tečnim i u liofilizovanim formulacijama kako bi zaštitili proteine od procesa fizičke i hemijske degradacije. Polioli su takođe korisni za podešavanje toničnosti formulacija. Među poliolima korisnim u odabranim otelotvorenjima pronalaska je manitol, koji se uobičajeno koristi da osigura strukturnu stabilnost liofilizovanog kolača u liofilizovanim formulacijama. On osigurava strukturnu stabilnost liofilizovanog kolača.

[0644] Generalno se koristi sa lioprotektantom, npr. saharozom. Sorbitol i saharoza su među poželjnim agensima za podešavanje toničnosti i kao stabilizatori za zaštitu od stresova usled zamrzavanja-odmrzavanja tokom transporta ili pripreme rasutih materijala tokom procesa proizvodnje. Redukujući šećeri (koji sadrže slobodne aldehidne ili ketonske grupe), kao što su glukoza i laktoza, mogu glikovati površinske ostatke lizina i arginina. Stoga, oni generalno nisu među poželjnim poliolima za upotrebu u skladu sa pronalaskom. Pored toga, šećeri koji grade takve reaktivne vrste, kao što je saharoza, koja se hidrolizuje na fruktozu i glukozu u kiselim uslovima i konsekventno izaziva glikaciju, takođe nisu među poželjnim poliolima pronalaska u tom pogledu. PEG je koristan za stabilizaciju proteina i kao krioprotektant i može se koristiti u pronalasku u tom pogledu.

[0646] Otelotvorenja formulacija konstrukta antitela prema pronalasku dalje obuhvataju surfaktante. Molekuli proteina mogu biti podložni adsorpciji na površinama i denaturaciji, a konsekventno i agregaciji na granicama faza vazduh-tečnost, čvrsto-tečnost i tečnost-tečnost. Ovi efekti su generalno obrnuto proporcionalni koncentraciji proteina. Ove štetne interakcije su generalno obrnuto proporcionalne koncentraciji proteina i tipično se pogoršavaju fizičkim mućkanjem, kao što je ono koje nastaje tokom transporta i rukovanja proizvodom. Surfaktanti se rutinski koriste za sprečavanje, minimiziranje ili smanjenje adsorpcije na površini. Korisni surfaktanti u pronalasku u tom pogledu uključuju polisorbat 20, polisorbat 80, druge estre masnih kiselina sorbitan-polietoksilata i poloksamer 188. Surfaktanti se takođe uobičajeno koriste za kontrolu konformacione stabilnosti proteina. Upotreba surfaktanata u tom pogledu je specifična za svaki protein jer će bilo koji dati surfaktant tipično stabilizovati neke proteine, a destabilizovati druge.

[0648] [0223] Polisorbati su podložni oksidativnoj degradaciji i često, u obliku u kojem se isporučuju, sadrže dovoljne količine peroksida da izazovu oksidaciju bočnih lanaca ostataka proteina, naročito metionina. Konsekventno, polisorbate treba koristiti pažljivo, a kada se koriste, treba ih primeniti u njihovoj najnižoj efikasnoj koncentraciji. U tom pogledu, polisorbati ilustruju opšte pravilo da ekscipijente treba koristiti u njihovim najnižim efikasnim koncentracijama.

[0650] Otelotvorenja formulacija konstrukta antitela prema pronalasku dalje obuhvataju jedan ili više antioksidanasa. Do određene mere, štetna oksidacija proteina se može sprečiti u farmaceutskim formulacijama održavanjem odgovarajućih nivoa kiseonika u okruženju i temperature, kao i izbegavanjem izlaganja svetlosti. Antioksidansi kao ekscipijenti se takođe mogu koristiti za sprečavanje oksidativne degradacije proteina. Među korisnim antioksidansima u tom pogledu su redukciona sredstva, hvatači kiseonika/slobodnih radikala i agensi za helatizaciju. Antioksidansi za upotrebu u terapeutskim proteinskim formulacijama u skladu sa pronalaskom poželjno su rastvorljivi u vodi i održavaju svoju aktivnost tokom celog roka trajanja proizvoda. EDTA je poželjan antioksidans u skladu sa pronalaskom u tom pogledu. Antioksidansi mogu oštetiti proteine. Na primer, redukciona sredstva, kao što je naročito glutation, mogu raskinuti intramolekulske disulfidne veze. Stoga se antioksidansi za upotrebu u pronalasku biraju tako da, između ostalog, eliminišu ili dovoljno smanje mogućnost da sami oštete proteine u formulaciji.

[0652] Formulacije u skladu sa pronalaskom mogu uključivati jone metala koji su kofaktori proteina i koji su neophodni za formiranje koordinacionih kompleksa proteina, kao što je cink neophodan za formiranje određenih suspenzija insulina. Joni metala takođe mogu inhibirati neke procese koji degradiraju proteine. Međutim, joni metala takođe katalizuju fizičke i hemijske procese koji degradiraju proteine. Joni magnezijuma (10-120 mM) mogu se koristiti za inhibiciju izomerizacije asparaginske kiseline u izoasparaginsku kiselinu. Joni Ca<+2>(do 100 mM) mogu povećati stabilnost humane dezoksiribonukleaze. Međutim, Mg<+2>, Mn<+2>i Zn<+2>mogu destabilizovati rhDNazu. Slično tome, Ca<+2>i Sr<+2>mogu stabilizovati faktor VIII, koji mogu destabilizovati Mg<+2>, Mn<+2>i Zn<+2>, Cu<+2>i Fe<+2>, a njegovu agregaciju mogu povećati joni Al<+3>.

[0654] [0226] Otelotvorenja formulacija konstrukta antitela prema pronalasku dalje obuhvataju jedan ili više konzervansa. Konzervansi su neophodni pri razvoju višedoznih parenteralnih formulacija koje uključuju više od jedne ekstrakcije iz iste posude. Njihova primarna funkcija je da inhibiraju mikrobni rast i osiguraju sterilnost proizvoda tokom roka trajanja ili perioda upotrebe leka. Uobičajeno korišćeni konzervansi uključuju benzil-alkohol, fenol i m-krezol. Iako konzervansi imaju dugu istoriju upotrebe kod parenteralnih lekova sa malim molekulima, razvoj proteinskih formulacija koje uključuju konzervanse može biti izazovan. Konzervansi skoro uvek imaju destabilizujući efekat (agregaciju) na proteine, i to je postalo glavni faktor u ograničavanju njihove upotrebe u višedoznim proteinskim formulacijama. Do danas je većina proteinskih lekova formulisana samo za jednokratnu upotrebu. Međutim, kada su višedozne formulacije moguće, one imaju dodatnu prednost jer omogućavaju pogodnost za pacijenta i povećanu tržišnu sposobnost. Dobar primer je humani hormon rasta (hGH) gde je razvoj konzervisanih formulacija doveo do komercijalizacije pogodnijih prezentacija u obliku višedoznih injekcionih olovki. Najmanje četiri takva uređaja u obliku olovke koji sadrže konzervisane formulacije hGH trenutno su dostupni na tržištu. Norditropin (tečni, Novo Nordisk), Nutropin AQ (tečni, Genentech) i Genotropin (liofilizovan - uložak sa dve komore, Pharmacia & Upjohn) sadrže fenol, dok je Somatrope (Eli Lilly) formulisan sa m-krezolom. Nekoliko aspekata treba razmotriti tokom formulacije i razvoja konzervisanih oblika doziranja. Efikasna koncentracija konzervansa u leku mora biti optimizovana. Ovo zahteva testiranje datog konzervansa u obliku doziranja sa opsezima koncentracija koji daju antimikrobnu efikasnost bez ugrožavanja stabilnosti proteina.

[0656] Kao što se može očekivati, razvoj tečnih formulacija koje sadrže konzervanse je izazovniji od liofilizovanih formulacija. Proizvodi osušeni zamrzavanjem mogu se liofilizovati bez konzervansa i rekonstituisati rastvaračem koji sadrži konzervans u trenutku upotrebe. Ovo skraćuje vreme tokom kojeg je konzervans u kontaktu sa proteinom, značajno minimizirajući povezane rizike po stabilnost. Kod tečnih formulacija, efikasnost konzervansa i stabilnost treba održavati tokom celog roka trajanja proizvoda (oko 18 do 24 meseca). Važna tačka koju treba napomenuti je da efikasnost konzervansa treba dokazati u finalnoj formulaciji koja sadrži aktivni lek i sve komponente ekscipijenata.

[0658] Ovde obelodanjeni konstrukti antitela takođe mogu biti formulisani kao imunolipozomi. „Lipozom” je mala vezikula sastavljena od različitih vrsta lipida, fosfolipida i/ili surfaktanta koja je korisna za isporuku leka sisaru. Komponente lipozoma su obično raspoređene u formaciju dvosloja, slično rasporedu lipida u biološkim membranama.

[0659] Lipozomi koji sadrže konstrukt antitela pripremaju se metodama poznatim u struci, kao što je opisano u Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); američkim patentima br.4,485,045 i 4,544,545; i WO 97/38731. Lipozomi sa produženim vremenom cirkulacije obelodanjeni su u američkom patentu br.5,013, 556. Naročito korisni lipozomi mogu se generisati metodom isparavanja sa reverznim fazama sa lipidnim sastavom koji obuhvata fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se ekstrudiraju kroz filtere definisane veličine pora kako bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom. Fab' fragmenti konstrukta antitela prema predmetnom pronalasku mogu se konjugovati sa lipozomima kao što je opisano u Martin et al. J. Biol. Chem.257: 286-288 (1982) putem reakcije razmene disulfida. Hemoterapeutski agens je opciono sadržan unutar lipozoma. Videti Gabizon et al. J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989).

[0661] Kada je farmaceutska kompozicija formulisana, može se čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca, kristal ili kao dehidrisani ili liofilizovani prah. Takve formulacije se mogu čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr. liofilizovanom) koji se rekonstituiše pre primene.

[0663] Biološka aktivnost ovde definisane farmaceutske kompozicije može se odrediti, na primer, testovima citotoksičnosti, kao što je opisano u sledećim primerima, u WO 99/54440 ili od strane Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

[0664] „Efikasnost” ili „in vivo efikasnost”, kako se ovde koristi, odnosi se na odgovor na terapiju farmaceutskom kompozicijom prema pronalasku, koristeći npr. standardizovane NCI kriterijume odgovora. Uspeh ili in vivo efikasnost terapije korišćenjem farmaceutske kompozicije prema pronalasku odnosi se na efektivnost kompozicije za njenu nameravanu svrhu, tj. sposobnost kompozicije da izazove svoj željeni efekat, tj. depleciju patoloških ćelija, npr. tumorskih ćelija. In vivo efikasnost se može pratiti utvrđenim standardnim metodama za odgovarajuće entitete bolesti uključujući, ali ne ograničavajući se na brojanje belih krvnih zrnaca, diferencijalnu krvnu sliku, fluorescentno aktivisano sortiranje ćelija, aspiraciju koštane srži. Pored toga, mogu se koristiti različiti specifični parametri kliničke hemije za određenu bolest i druge utvrđene standardne metode. Nadalje, mogu se koristiti kompjuterizovana tomografija, rendgen, nuklearna magnetna rezonanca (npr. za procenu odgovora zasnovanu na kriterijumima Nacionalnog instituta za rak [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Report of an international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin's lymphomas. NCI Sponsored International Working Group. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4):1244]), skeniranje pozitronskom emisionom tomografijom, brojanje belih krvnih zrnaca, diferencijalna krvna slika, fluorescentno aktivisano sortiranje ćelija, aspiracija koštane srži, biopsije/histologije limfnih čvorova i različiti specifični parametri kliničke hemije za limfom (npr. laktat-dehidrogenaza) i druge utvrđene standardne metode.

[0666] Još jedan veliki izazov u razvoju lekova kao što je farmaceutska kompozicija prema pronalasku je predvidljiva modulacija farmakokinetičkih svojstava. U tu svrhu može se uspostaviti farmakokinetički profil kandidata za lek, tj. profil farmakokinetičkih parametara koji utiču na sposobnost određenog leka da leči dato stanje. Farmakokinetički parametri leka koji utiču na sposobnost leka za lečenje određenog entiteta bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na: poluvreme eliminacije, volumen distribucije, hepatički metabolizam prvog prolaza i stepen vezivanja za serum krvi. Na efikasnost datog lekovitog agensa može uticati svaki od gore navedenih parametara.

[0668] „Poluvreme eliminacije” označava vreme tokom kojeg se 50% primenjenog leka eliminiše putem bioloških procesa, npr. metabolizma, izlučivanja itd. Pod „hepatičkim metabolizmom prvog prolaza” podrazumeva se sklonost leka da se metaboliše pri prvom kontaktu sa jetrom, tj. tokom njegovog prvog prolaska kroz jetru. „Volumen distribucije” označava stepen zadržavanja leka u različitim odeljcima tela, kao što su npr. intracelularni i ekstracelularni prostori, tkiva i organi itd. i distribuciju leka unutar ovih odeljaka. „Stepen vezivanja za serum krvi” označava sklonost leka da interaguje i da se veže za proteine seruma krvi, kao što je albumin, što dovodi do smanjenja ili gubitka biološke aktivnosti leka.

[0670] Farmakokinetički parametri takođe uključuju bioraspoloživost, vreme kašnjenja (Tlag), Tmax, stope apsorpcije, brži početak i/ili Cmax za datu količinu primenjenog leka. „Bioraspoloživost” označava količinu leka u krvnom odeljku. „Vreme kašnjenja” označava vremensko zakašnjenje između primene leka i njegove detekcije i merljivosti u krvi ili plazmi. „Tmax” je vreme nakon kojeg se postiže maksimalna koncentracija leka u krvi, a „Cmax” je maksimalno postignuta koncentracija u krvi sa datim lekom. Svi parametri utiču na vreme potrebno da se dostigne koncentracija leka u krvi ili tkivu koja je neophodna za njegov biološki efekat. Farmakokinetički parametri bispecifičnih konstrukata antitela koji pokazuju unakrsnu specifičnost među vrstama, koji se mogu odrediti u pretkliničkim ispitivanjima na životinjama na primatima koji nisu šimpanze kao što je gore navedeno, takođe su izloženi npr. u publikaciji Schlereth et al. (Cancer Immunol. Immunother.20 (2005), 1-12).

[0671] Jedno otelotvorenje obezbeđuje konstrukt antitela prema pronalasku ili konstrukt antitela proizveden prema procesu iz pronalaska za upotrebu u prevenciji, lečenju ili poboljšanju tumora ili bolesti raka ili metastatske bolesti raka.

[0673] Ovde opisane formulacije su korisne kao farmaceutske kompozicije u lečenju, poboljšanju i/ili prevenciji patološkog medicinskog stanja kako je ovde opisano kod pacijenta kome je to potrebno. Termin „lečenje” odnosi se i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Lečenje uključuje primenu ili primenu formulacije telu, izolovanom tkivu ili ćeliji pacijenta koji ima bolest/poremećaj, simptom bolesti/poremećaja ili predispoziciju ka bolesti/poremećaju, sa svrhom da se izleči, isceli, ublaži, oslobodi, izmeni, otkloni, poboljša ili utiče na bolest, simptom bolesti ili predispoziciju ka bolesti.

[0675] Termin „poboljšanje”, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo kakvo poboljšanje stanja bolesti kod pacijenta koji ima tumor ili rak ili metastatski rak kako je ovde specifikovano u daljem tekstu, putem primene konstrukta antitela prema pronalasku subjektu kome je to potrebno. Takvo poboljšanje se takođe može posmatrati kao usporavanje ili zaustavljanje progresije tumora ili raka ili metastatskog raka pacijenta. Termin „prevencija”, kako se ovde koristi, označava izbegavanje pojave ili ponovne pojave tumora ili raka ili metastatskog raka kod pacijenta kako je ovde specifikovano u daljem tekstu, putem primene konstrukta antitela prema pronalasku subjektu kome je to potrebno.

[0677] Termin „bolest” odnosi se na bilo koje stanje koje bi imalo koristi od lečenja konstruktom antitela ili farmaceutskom kompozicijom opisanom u ovom dokumentu. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja koja predisponiraju sisara za predmetnu bolest.

[0679] „Neoplazma” je abnormalni rast tkiva koji obično, ali ne uvek, formira masu. Kada takođe formira masu, obično se naziva „tumor”. Neoplazme ili tumori mogu biti benigni, potencijalno maligni (prekancerozni) ili maligni. Maligne neoplazme se obično nazivaju rak. One obično invadiraju i uništavaju okolno tkivo i mogu formirati metastaze, tj. šire se na druge delove, tkiva ili organe tela. Stoga, termin „metastatski rak” obuhvata metastaze u drugim tkivima ili organima osim onog u kojem je prvobitni tumor nastao. Limfomi i leukemije su limfoidne neoplazme. Za potrebe predmetnog pronalaska, oni su takođe obuhvaćeni terminima „tumor” ili „rak”.

[0680] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, tumor ili bolest raka biraju se iz grupe koja uključuje, ali nije ograničena na (ili se sastoji od) rak pluća, poželjno SCLC, rak dojke, grlića materice, debelog creva, kolorektalni rak, rak endometrijuma, glave i vrata, jetre, jajnika, pankreasa, prostate, kože, želuca, testisa, štitne žlezde, nadbubrežne žlezde, bubrega, bešike, materice, jednjaka, urotelijalni rak i tumor ili rak mozga, limfom, karcinom i sarkom, kao i metastatsku bolest raka koja potiče od bilo kojeg od prethodno navedenih.

[0682] Specifičnije, tumor ili bolest raka mogu se birati iz grupe koja se sastoji od raka pluća malih ćelija (SCLC), raka pluća nemalih ćelija (NSCLC), glioma, glioblastoma, melanoma, neuroendokrinog raka prostate, neuroendokrinog raka pankreasa, hepatoblastoma i hepatocelularnog karcinoma. Metastatska bolest raka može poticati od bilo kojeg od prethodno navedenih.

[0684] Pronalazak takođe obezbeđuje konstrukt antitela prema pronalasku ili konstrukt antitela proizveden prema procesu iz pronalaska za upotrebu u metodi za lečenje ili poboljšanje tumora ili bolesti raka ili metastatske bolesti raka, koja obuhvata korak primene subjektu kome je to potrebno konstrukta antitela prema pronalasku ili konstrukta antitela proizvedenog prema procesu iz pronalaska.

[0686] Termini „subjekt kome je potrebno” ili oni „kojima je potrebno lečenje” uključuju one koji već imaju poremećaj, kao i one kod kojih poremećaj treba sprečiti. Subjekt kome je potrebno ili „pacijent” uključuje humane i druge subjekte sisare koji primaju ili profilaktički ili terapeutski tretman.

[0688] Konstrukt antitela prema pronalasku će generalno biti dizajniran za specifične puteve i metode primene, za specifične doze i učestalosti primene, za specifična lečenja specifičnih bolesti, sa opsezima bioraspoloživosti i perzistencije, između ostalog. Materijali kompozicije su poželjno formulisani u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto primene.

[0690] Formulacije i kompozicije se tako mogu dizajnirati u skladu sa pronalaskom za isporuku bilo kojim odgovarajućim putem primene. U kontekstu predmetnog pronalaska, putevi primene uključuju, ali nisu ograničeni na

[0691] • lokalne puteve (kao što su epikutani, inhalacioni, nazalni, oftalmološki, aurikularni / auralni, vaginalni, mukozni);

[0692] • enteralne puteve (kao što su oralni, gastrointestinalni, sublingvalni, sublabijalni, bukalni, rektalni); i

[0694] • parenteralne puteve (kao što su intravenski, intraarterijski, intraosealni, intramuskularni, intracerebralni, intracerebroventrikularni, epiduralni, intratekalni, supkutani, intraperitonealni, ekstra-amniotski, intraartikularni, intrakardijalni, intradermalni, intralesioni, intrauterini, intravezikalni, intravitrealni, transdermalni, intranazalni, transmukozni, intrasinovijalni, intraluminalni).

[0696] Farmaceutske kompozicije i konstrukt antitela prema ovom pronalasku naročito su korisni za parenteralnu primenu, npr. supkutanu ili intravensku isporuku, na primer injekcijom kao što je bolus injekcija, ili infuzijom kao što je kontinuirana infuzija.

[0697] Farmaceutske kompozicije se mogu primeniti korišćenjem medicinskog uređaja. Primeri medicinskih uređaja za primenu farmaceutskih kompozicija opisani su u američkim patentima br.

[0698] 4,475,196; 4,439,196; 4,447,224; 4,447,233; 4,486,194; 4,487,603; 4,596,556; 4,790,824; 4,9 41,880; 5,064,413; 5,312,335; 5,312,335; 5,383,851; i 5,399,163.

[0700] Naročito, predmetni pronalazak predviđa neprekidnu primenu odgovarajuće kompozicije. Kao neograničavajući primer, neprekidna ili suštinski neprekidna, tj. kontinuirana primena može se ostvariti putem malog sistema pumpe koji pacijent nosi radi doziranja priliva terapeutskog agensa u telo pacijenta. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata konstrukt antitela prema pronalasku može se primeniti korišćenjem navedenih sistema pumpi. Takvi sistemi pumpi su generalno poznati u struci i obično se oslanjaju na periodičnu zamenu uložaka koji sadrže terapeutski agens koji treba infundirati. Prilikom zamene uloška u takvom sistemu pumpe, može doći do privremenog prekida inače neprekidnog protoka terapeutskog agensa u telo pacijenta. U takvom slučaju, faza primene pre zamene uloška i faza primene nakon zamene uloška i dalje bi se smatrale, u smislu farmaceutskih sredstava i metoda pronalaska, da zajedno čine jednu „neprekidnu primenu” takvog terapeutskog agensa.

[0702] [0247] Kontinuirana ili neprekidna primena konstrukata antitela prema pronalasku može biti intravenska ili supkutana putem uređaja za isporuku tečnosti ili malog sistema pumpe koji uključuje mehanizam za potiskivanje tečnosti iz rezervoara i mehanizam za aktiviranje mehanizma za potiskivanje. Sistemi pumpi za supkutanu primenu mogu uključivati iglu ili kanilu za prodiranje kroz kožu pacijenta i isporuku odgovarajuće kompozicije u telo pacijenta. Navedeni sistemi pumpi mogu biti direktno fiksirani ili pričvršćeni za kožu pacijenta nezavisno od vene, arterije ili krvnog suda, čime se omogućava direktan kontakt između sistema pumpe i kože pacijenta. Sistem pumpe može biti pričvršćen za kožu pacijenta tokom 24 sata do nekoliko dana. Sistem pumpe može biti male veličine sa rezervoarom za male zapremine. Kao neograničavajući primer, zapremina rezervoara za odgovarajuću farmaceutsku kompoziciju koju treba primeniti može biti između 0,1 i 50 ml.

[0704] Kontinuirana primena takođe može biti transdermalna putem flastera koji se nosi na koži i menja u intervalima. Stručnjak iz predmetne oblasti je upoznat sa sistemima flastera za isporuku leka koji su pogodni za ovu svrhu. Napominje se da je transdermalna primena naročito pogodna za neprekidnu primenu, pošto se zamena prvog istrošenog flastera može prednosno obaviti istovremeno sa postavljanjem novog, drugog flastera, na primer na površinu kože neposredno uz prvi istrošeni flaster i neposredno pre uklanjanja prvog istrošenog flastera. Problemi sa prekidom protoka ili otkazivanjem baterije se ne javljaju.

[0706] Ako je farmaceutska kompozicija liofilizovana, liofilizovani materijal se prvo rekonstituiše u odgovarajućoj tečnosti pre primene. Liofilizovani materijal se može rekonstituisati u, npr., bakteriostatskoj vodi za injekcije (BWFI), fiziološkom rastvoru, fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS) ili istoj formulaciji u kojoj je protein bio pre liofilizacije.

[0708] [0250] Kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu se primeniti subjektu u odgovarajućoj dozi koja se može odrediti npr. studijama eskalacije doze putem primene rastućih doza ovde opisanog konstrukta antitela koji pokazuje unakrsnu specifičnost među vrstama primatima koji nisu šimpanze, na primer makakijima. Kao što je gore navedeno, konstrukt antitela prema pronalasku koji pokazuje ovde opisanu unakrsnu specifičnost među vrstama može se prednostno koristiti u identičnom obliku u pretkliničkim ispitivanjima na primatima koji nisu šimpanze i kao lek kod ljudi. Režim doziranja odrediće lekar koji vodi lečenje i klinički faktori. Kao što je dobro poznato u medicinskoj veštini, doze za bilo kog pacijenta zavise od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, konkretno jedinjenje koje se primenjuje, pol, vreme i put primene, opšte zdravlje i druge lekove koji se primenjuju istovremeno.

[0710] Termin „efikasna doza” ili „efikasno doziranje” definisan je kao količina dovoljna da se postigne ili barem delimično postigne željeni efekat. Termin „terapeutski efikasna doza” definisan je kao količina dovoljna da izleči ili barem delimično zaustavi bolest i njene komplikacije kod pacijenta koji već boluje od te bolesti. Količine ili doze efikasne za ovu upotrebu zavisiće od stanja koje se leči (indikacije), isporučenog konstrukta antitela, terapeutskog konteksta i ciljeva, težine bolesti, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na terapeutski agens, puta primene, veličine (telesne težine, površine tela ili veličine organa) i/ili stanja (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta, kao i opšteg stanja sopstvenog imunskog sistema pacijenta. Odgovarajuća doza se može prilagoditi prema proceni lekara koji vodi lečenje, tako da se može primeniti pacijentu jednom ili tokom serije primena, a u cilju dobijanja optimalnog terapeutskog efekta.

[0712] Tipično doziranje može varirati od oko 0,1 µg/kg do oko 30 mg/kg ili više, zavisno od gore navedenih faktora. U specifičnim otelotvorenjima, doziranje može varirati od 1,0 µg/kg do oko 20 mg/kg, opciono od 10 µg/kg do oko 10 mg/kg ili od 100 µg/kg do oko 5 mg/kg.

[0714] Terapeutski efikasna količina konstrukta antitela prema pronalasku poželjno rezultira smanjenjem težine simptoma bolesti, povećanjem učestalosti ili trajanja perioda bez simptoma bolesti ili sprečavanjem oštećenja ili invaliditeta usled oboljenja. Za lečenje tumora koji eksprimiraju DLL3, terapeutski efikasna količina konstrukta antitela prema pronalasku, npr. anti-DLL3/anti-CD3 konstrukta antitela, poželjno inhibira rast ćelija ili rast tumora za najmanje oko 20%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80% ili najmanje oko 90% u odnosu na netretirane pacijente. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora može se proceniti na životinjskom modelu koji predviđa efikasnost kod humanih tumora.

[0716] Farmaceutska kompozicija se može primeniti kao jedina terapija ili u kombinaciji sa dodatnim terapijama, kao što su antitumorske terapije prema potrebi, npr. drugi proteinski i neproteinski lekovi. Ovi lekovi se mogu primeniti istovremeno sa kompozicijom koja obuhvata konstrukt antitela prema pronalasku kako je ovde definisano, ili odvojeno pre ili nakon primene navedenog konstrukta antitela u vremenski definisanim intervalima i dozama.

[0717] Termin „efikasna i netoksična doza”, kako se ovde koristi, odnosi se na podnošljivu dozu pronalazačkog konstrukta antitela koja je dovoljno visoka da izazove depleciju patoloških ćelija, eliminaciju tumora, smanjenje tumora ili stabilizaciju bolesti bez ili suštinski bez većih toksičnih efekata. Takve efikasne i netoksične doze mogu se odrediti npr. studijama eskalacije doze opisanim u struci i trebalo bi da budu ispod doze koja izaziva teške neželjene sporedne događaje (toksičnost koja ograničava dozu, DLT).

[0719] Termin „toksičnost”, kako se ovde koristi, odnosi se na toksične efekte leka koji se manifestuju u neželjenim događajima ili teškim neželjenim događajima. Ovi sporedni događaji mogu se odnositi na nedostatak podnošljivosti leka uopšte i/ili nedostatak lokalne tolerancije nakon primene. Toksičnost takođe može uključiti teratogene ili karcinogene efekte uzrokovane lekom.

[0721] Termin „bezbednost”, „in vivo bezbednost” ili „podnošljivost”, kako se ovde koristi, definiše primenu leka bez izazivanja teških neželjenih događaja neposredno nakon primene (lokalna tolerancija) i tokom dužeg perioda primene leka. „Bezbednost”, „in vivo bezbednost” ili „podnošljivost” mogu se proceniti npr. u redovnim intervalima tokom perioda lečenja i praćenja. Merenja uključuju kliničku procenu, npr. manifestacije na organima, i skrining laboratorijskih abnormalnosti. Klinička procena se može sprovesti, a odstupanja od normalnih nalaza zabeležiti/kodirati prema NCI-CTC i/ili MedDRA standardima.

[0722] Manifestacije na organima mogu uključiti kriterijume kao što su alergija/imunologija, krv/koštana srž, srčana aritmija, koagulacija i slično, kako je navedeno npr. u Opštim terminološkim kriterijumima za neželjene događaje v3.0 (CTCAE). Laboratorijski parametri koji se mogu testirati uključuju, na primer, hematologiju, kliničku hemiju, koagulacioni profil i analizu urina, kao i ispitivanje drugih telesnih tečnosti kao što su serum, plazma, limfna ili spinalna tečnost, likvor i slično. Bezbednost se tako može proceniti npr. fizičkim pregledom, tehnikama snimanja (tj. ultrazvukom, rendgenom, CT skeniranjem, magnetnom rezonancom (MRI)), drugim merama tehničkim uređajima (tj. elektrokardiogramom), vitalnim znacima, merenjem laboratorijskih parametara i beleženjem neželjenih događaja Na primer, neželjeni događaji kod primata koji nisu šimpanze u upotrebama i metodama prema pronalasku mogu se ispitati histopatološkim i/ili histohemijskim metodama.

[0723] Gore navedeni termini se takođe pominju npr. u Prekliničkoj proceni bezbednosti farmaceutskih proizvoda dobijenih biotehnologijom S6; ICH Harmonizovanim tripartitnim smernicama; sastanku ICH Upravnog odbora 16. jula 1997. godine.

[0725] Ovde je dalje opisan komplet koji obuhvata konstrukt antitela prema pronalasku, konstrukt antitela proizveden prema procesu iz pronalaska, polipeptid prema pronalasku, vektor prema pronalasku i/ili ćeliju domaćina prema pronalasku.

[0727] Kako je ovde opisano, termin „komplet” označava dve ili više komponenti - od kojih jedna odgovara konstruktu antitela, farmaceutskoj kompoziciji, vektoru ili ćeliji domaćinu prema pronalasku - upakovanih zajedno u posudi, primaocu ili na drugi način. Komplet se stoga može opisati kao set proizvoda i/ili pribora koji su dovoljni za postizanje određenog cilja, a koji se mogu plasirati na tržište kao jedinstvena jedinica.

[0729] Komplet može obuhvatati jednu ili više posuda (kao što su bočice, ampule, primaoci, špricevi, boce, kese) bilo kog odgovarajućeg oblika, veličine i materijala (poželjno vodootpornog, npr. plastike ili stakla) koje sadrže konstrukt antitela ili farmaceutsku kompoziciju prema predmetnom pronalasku u odgovarajućoj dozi za primenu (videti gore). Komplet može dodatno sadržati uputstva za upotrebu (npr. u obliku letka ili priručnika sa uputstvima), sredstva za primenu konstrukta antitela prema predmetnom pronalasku kao što su špric, pumpa, infuzor ili slično, sredstva za rekonstituciju konstrukta antitela prema pronalasku i/ili sredstva za razblaživanje konstrukta antitela prema pronalasku.

[0731] Ovde su opisani kompleti za jedinicu primene jedne doze. Komplet takođe može sadržati prvu posudu koja obuhvata osušeni / liofilizovani konstrukt antitela i drugu posudu koja obuhvata vodenu formulaciju. U određenim otelotvorenjima, obezbeđeni su kompleti koji sadrže jednokomorne i višekomorne napunjene špriceve (npr. tečne špriceve i liošpriceve).

[0733] Slike prikazuju:

[0734]

[0735] Slika 1

[0736] Šematski prikaz ECD DLL3 / skraćenih konstrukata DLL3 eksprimiranih na CHO ćelijama za mapiranje epitopa. Transmembranski i intracelularni domen potiču od EpCAM. Videti primer 1.

[0737] Slika 2

[0738] Mapiranje epitopa anti-DLL3 konstrukata antitela. Primeri bispecifičnih konstrukata antitela koji prepoznaju EGF-3 domen, odnosno EGF-4 domen, detektovani putem mapiranja epitopa. X-osa prikazuje PE-A (PE = fikoeritrin, A = površina signala), a y-osa prikazuje broj. Videti primer 2.

[0739] Slika 3

[0740] Unakrsna reaktivnost anti-DLL3 konstrukata antitela detektovana protočnom citometrijom: vezivanje za humani i makaki DLL3 i CD3. X-osa prikazuje FL2-H, a y-osa prikazuje broj. Videti primer 5.

[0741] Slika 4

[0742] Analiza anti-DLL3 konstrukata antitela protočnom citometrijom: nevezivanje za humane paraloge DLL1 i DLL4. X-osa prikazuje FL1-H, a y-osa prikazuje broj. Videti primer 6. Slika 5

[0743] Stabilnost anti-DLL3 konstrukata antitela nakon inkubacije tokom 96 sati u humanoj plazmi. Videti primer 11.

[0744] Slika 6

[0745] Razlika u potentnosti između monomerne i dimerne izoforme anti-DLL3 konstrukata antitela. Videti primer 15.

[0746] Slika 7

[0747] In vitro test internalizacije, sproveden kao što je opisano u primeru 16. Konstrukt antitela je preinkubiran na ciljnim ćelijama (SHP-77) u odsustvu T ćelija kako bi se izmerio gubitak konstrukta antitela usled internalizacije. Rezultati sugerišu da ne dolazi do značajne internalizacije. Rezultati postignuti sa kontrolnom metom koja je dobro poznata po svojoj internalizaciji prikazani su radi poređenja desno.

[0748] Slika 8

[0749] Rezultati studije efikasnosti na mišjem ksenograftu za SHP-77 model (slika 8A) i WM266-4 model (slika 8B). Zapremina tumora je prikazana u odnosu na vreme. Videti primer 18.

[0750] Slika 9

[0751] Farmakokinetika različitih HLE konstrukata antitela (fuzija sa albuminom na slici 9A i Fc fuzije na slici 9B) određena u primeru 20.

[0752] Primeri:

[0753] Sledeći primeri ilustruju pronalazak. Ove primere ne treba tumačiti tako da ograničavaju obim ovog pronalaska. Predmetni pronalazak je ograničen samo patentnim zahtevima.

[0755] Primer 1

[0756] Generisanje CHO ćelija koje eksprimiraju divlji tip i skraćeni DLL3

[0758] Ekstracelularni domen antigena DLL3 može se podeliti na različite poddomene ili regione koji su, za potrebe primera 1 i 2, definisani sledećim pozicijama aminokiselina: Signalni peptid: 1-26

[0759] N-terminus: 27-175

[0760] DSL: 176-215

[0761] EGF-1: 216-249

[0762] EGF-2: 274-310

[0763] EGF-3: 312-351

[0764] EGF-4: 353-389

[0765] EGF-5: 391-427

[0766] EGF-6: 429-465

[0768] Za konstrukciju skraćenih molekula DLL3 korišćenih za mapiranje epitopa, sekvence odgovarajućih osam ekstracelularnih domena (signalni peptid plus N-terminus, DSL, EGF1, EGF2, EGF3, EGF4, EGF5 i EGF6) humanog DLL3 su postepeno brisane iz antigena, počevši od N-terminusa. Generisani su sledeći molekuli; videti takođe sliku 1:

[0770]

[0771] Za generisanje CHO ćelija koje eksprimiraju humani, cynomolgus makaki („cyno”) i skraćeni humani N-terminalni V5 markirani DLL3, odgovarajuće kodirajuće sekvence za humani DLL3-ECD (SEQ ID NO: 253; videti takođe GeneBank pristupni broj NM_016941), cyno DLL3-ECD (SEQ ID NO: 272) i sedam skraćenih humanih N-terminalnih V5 markiranih DLL3-ECD verzija (videti gore) klonirane su u plazmid označen kao pEF-DHFR (pEF-DHFR je opisan u Raum et al. Cancer Immunol Immunother 50 (2001) 141-150). Za ekspresiju humanog i cyno DLL3 na površini ćelije korišćen je originalni signalni peptid, a za ekspresiju skraćenog humanog N-terminalnog DLL3 na površini ćelije korišćen je signalni peptid teškog lanca mišjeg IgG, nakon čega sledi V5 marker. Sve navedene DLL3-ECD sekvence su u okviru čitanja praćene kodirajućom sekvencom veštačkog Ser/Gly-linkera, nakon čega sledi domen koji potiče od transmembranskog / intracelularnog domena humanog EpCAM (aminokiseline 266-314 sekvence objavljene pod GenBank pristupnim brojem NM_002354). Svi postupci kloniranja sprovedeni su prema standardnim protokolima (Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (2001)). Za svaki konstrukt, odgovarajući plazmid je transfektovan u CHO ćelije sa deficitom DHFR za eukariotsku ekspresiju, kao što je opisao Kaufman R.J. (1990) Methods Enzymol. 185, 537-566.

[0773] Ekspresija humanog i cyno DLL3 na CHO ćelijama potvrđena je u FACS testu korišćenjem monoklonskog mišjeg IgG2b anti-humanog DLL3 antitela. Ekspresija sedam skraćenih verzija humanog DLL3-ECD potvrđena je korišćenjem monoklonskog mišjeg IgG2a anti-v5 marker antitela. Vezano monoklonsko antitelo detektovano je pomoću antimišjeg IgG Fc-gama-PE. Kao negativna kontrola, ćelije su inkubirane sa izotipskom kontrolom antitela umesto sa prvim antitelom. Uzorci su izmereni protočnom citometrijom.

[0775] Primer 2

[0776] Mapiranje epitopa anti-DLL3 konstrukata antitela

[0778] [0269] Ćelije transfektovane humanim DLL3 i skraćenim molekulima humanog DLL3 (videti primer 1) obojene su sirovim, nerazblaženim periplazmatičnim ekstraktom koji sadrži bispecifične DLL3xCD3 konstrukte antitela (pri čemu je domen koji vezuje CD3 nazvan I2C) fuzionisane sa humanim albuminom (varijanta 1), u PBS/1,5% FCS. Vezani molekuli su detektovani internim mišjim monoklonskim antitelom na domen koji vezuje CD3 (50 µl), nakon čega je usledilo anti-mišje IgG Fc-gama-PE (1:100, 50 µl; Jackson Immunoresearch # 115-116-071). Sva antitela su razblažena u PBS / 1,5% FCS. Kao negativna kontrola, ćelije su inkubirane sa PBS / 2% FCS umesto periplazmatičnog ekstrakta. Uzorci su izmereni protočnom citometrijom.

[0780] Regioni koje su prepoznali odgovarajući domeni koji vezuju DLL3 navedeni su u tabeli sekvenci (tabela 18). Mapirana su vezivna sredstva koja su bila specifična za epitop lociran unutar N-terminusa DLL3, unutar DSL domena i unutar različitih EGF domena.

[0782] Slika 2 prikazuje dva primera vezivnih sredstava koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar EGF-3 regiona (gubitak FACS signala u odgovarajućim skraćenim DLL3 konstruktima koji ne obuhvataju EGF-3). Slika 2 takođe prikazuje primer vezivnog sredstva koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar EGF-3 regiona (gubitak FACS signala u odgovarajućim skraćenim DLL3 konstruktima koji ne obuhvataju EGF-4).

[0784] Neka od vezivnih sredstava opisana su kao specifična za epitop koji se nalazi u regionu nazvanom EGF-5/[6]. Uglaste zagrade treba da ukažu na to da je FACS signal vezivnog sredstva smanjen (tj. niti je potpuno prisutan niti potpuno izgubljen) za skraćeni DLL3 konstrukt u kojem je preostao samo EGF-6 domen (poslednji konstrukt na slici 1).

[0786] Bispecifični DLL3xCD3 konstrukti korišćeni u sledećim primerima odabrani su među onim konstruktima koji imaju

kao domen koji vezuje CD3 i koji imaju C-terminalnu fuziju sa divljim tipom humanog serumskog albumina, videti npr. SEQ ID NO: 224-230, 233-235, 238-241.

[0788] Primer 3

[0789] Određivanje afiniteta antitela prema humanom i cynomolgus DLL3 pomoću Biacore sistema

[0791] Eksperimenti Biacore analize sprovedeni su korišćenjem rekombinantnih fuzionih proteina humani / cyno DLL3-ECD sa kokošijim albuminom kako bi se odredilo vezivanje za metu konstrukata antitela prema pronalasku.

[0792] Detaljnije, na CM5 senzorske čipove (GE Healthcare) imobilisano je približno 600-800 RU odgovarajućeg rekombinantnog antigena korišćenjem acetatnog pufera pH 4,5 prema uputstvu proizvođača. Uzorci bispecifičnog konstrukta antitela DLL3xCD3 naneti su u seriji razblaženja sledećih koncentracija: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM i 3,13 nM razblaženih u HBS-EP radnom puferu (GE Healthcare). Protok je bio 30 µl/min tokom 3 minuta, a zatim je ponovo primenjen HBS-EP radni pufer tokom 8 minuta do 20 minuta pri protoku od 30 µl/ml. Regeneracija čipa je izvršena korišćenjem rastvora 10 mM glicina i 10 mM NaCl pH 1,5. Skupovi podataka su analizirani korišćenjem softvera BiaEval. Generalno su sprovedena dva nezavisna eksperimenta.

[0794] Bispecifični konstrukti antitela DLL3xCD3 prema pronalasku pokazali su veoma visoke afinitete prema humanom DLL3 u subnanomolarnom opsegu (sa izuzetkom DLL3-13 koji ima KD vrednost u veoma niskom jednocifrenom nanomolarnom opsegu). Vezivanje za makaki DLL3 bilo je uravnoteženo, takođe pokazujući afinitete u sličnim opsezima.

[0795] Vrednosti afiniteta, kao i izračunata razlika u afinitetu, prikazani su u tabeli 2.

[0797] Tabela 2: Afiniteti bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 prema humanom i makaki DLL3 određeni Biacore analizom, kao i izračunate razlike u afinitetu između vrsta.

[0799]

[0800] Nadalje, potvrđeno je da je vezivanje bispecifičnih konstrukata antitela i za humani CD3 i za makaki CD3 u Biacore testu u niskom dvocifrenom nanomolarnom opsegu (podaci nisu prikazani).

[0802] Primer 4

[0803] Analiza afiniteta bispecifičnog konstrukta antitela DLL3xCD3 prema humanom i makaki DLL3 na ćelijama pozitivnim na ciljni antigen zasnovana na Sčardovoj analizi i određivanje razlike u afinitetu između vrsta

[0805] Afiniteti bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 prema CHO ćelijama transfektovanim humanim ili makaki DLL3 takođe su određeni Sčardovom analizom kao najpouzdanijom metodom za merenje potencijalnih razlika u afinitetu između humanog i makaki DLL3. Za Sčardovu analizu, eksperimenti vezivanja do zasićenja se sprovode korišćenjem monovalentnog sistema detekcije kako bi se precizno odredilo monovalentno vezivanje bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 za odgovarajuću ćelijsku liniju.

[0807] 2 x 10<4>ćelija odgovarajuće ćelijske linije (rekombinantna CHO ćelijska linija koja eksprimira humani DLL3, rekombinantna CHO ćelijska linija koja eksprimira makaki DLL3) inkubirano je sa po 50 µl trostruke serije razblaženja (dvanaest razblaženja u odnosu 1:2) odgovarajućeg bispecifičnog konstrukta antitela DLL3xCD3 (dok se ne dostigne zasićenje) počevši od 10-20 nM, nakon čega je usledila inkubacija od 16 sata na 4°C uz mućkanje i jedan korak ispiranja ostataka. Zatim su ćelije inkubirane još jedan sat sa 30 µl rastvora konjugata CD3xALEXA488. Nakon jednog koraka ispiranja, ćelije su resuspendovane u 150 µl FACS pufera koji sadrži 3,5% formaldehida, inkubirane još 15 minuta, centrifugirane, resuspendovane u FACS puferu i analizirane korišćenjem FACS Cantoll aparata i FACS Diva softvera. Podaci su generisani iz dva nezavisna seta eksperimenata, od kojih je svaki koristio triplikate. Odgovarajuća Sčardova analiza je izračunata da bi se ekstrapoliralo maksimalno vezivanje (Bmax). Koncentracije bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 pri polumaksimalnom vezivanju su određene tako da odražavaju odgovarajuće KD vrednosti. Vrednosti merenja u triplikatu su prikazane kao hiperbolične krive i kao krive u obliku slova S kako bi se demonstrirali odgovarajući opsezi koncentracija od minimalnog do optimalnog vezivanja.

[0808] Vrednosti prikazane u tabeli 3 izvedene su iz dva nezavisna eksperimenta po bispecifičnom konstruktu antitela DLL3xCD3. Sčardova analiza zasnovana na ćelijama potvrdila je da bispecifični konstrukti antitela DLL3xCD3 prema pronalasku imaju subnanomolarni afinitet prema humanom DLL3 i makaki DLL3 i da imaju malu razliku u afinitetu između cyno/humanih vrsta od oko 1.

[0810] Tabela 3: Afiniteti (KD) bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 određeni Sčardovom analizom zasnovanom na ćelijama sa izračunatom razlikom u afinitetu KD makaki DLL3 / KD humani DLL3. Konstrukti antitela su mereni u dva nezavisna eksperimenta, od kojih je svaki koristio triplikate.

[0812]

[0815] Primer 5

[0816] Bispecifično vezivanje i unakrsna reaktivnost među vrstama

[0818] Radi potvrde vezivanja za humani DLL3 i CD3 i za cyno DLL3 i CD3, konstrukti antitela prema pronalasku testirani su protočnom citometrijom koristeći

[0819] • CHO ćelije transfektovane humanim DLL3, veštačkom izoformom humanog DLL3 (karakterisanom tačkastim mutacijama F172C i L218P) i makaki DLL3, respektivno, • humanu ćelijsku liniju karcinoma pluća SHP-77 pozitivnu na humani DLL3, • humanu ćelijsku liniju T-ćelijske leukemije HPB-all koja eksprimira CD3 (DSMZ, Braunschweig, ACC483), i

[0821] • cynomolgus T-ćelijsku liniju LnPx 4119 koja eksprimira CD3.

[0823] Za protočnu citometriju, 200,000 ćelija odgovarajućih ćelijskih linija inkubirano je tokom 60 minuta na 4°C sa 50 µl prečišćenog konstrukta antitela u koncentraciji od 5 µg/ml. Ćelije su isprane dva puta u PBS/2% FCS, a zatim inkubirane sa internim mišjim antitelom (2 µg/ml) specifičnim za deo koji vezuje CD3 bispecifičnih konstrukata antitela tokom 30 minuta na 4°C. Nakon ispiranja, vezana mišja antitela detektovana su kozjim anti-mišjim Fcγ-PE (1:100) tokom 30 minuta na 4°C. Uzorci su izmereni protočnom citometrijom.

[0824] Netransfektovane CHO ćelije korišćene su kao negativna kontrola.

[0826] Rezultati su prikazani na slici 3. Bispecifični konstrukti antitela DLL3xCD3 prema pronalasku obojili su CHO ćelije transfektovane humanim DLL3, veštačkom izoformom DLL3 i cyno DLL3, a takođe su obojili i humanu ćelijsku liniju karcinoma pluća SHP-77 pozitivnu na humani DLL3 (prirodni ekspresor). Humane i cyno T-ćelijske linije koje eksprimiraju CD3 takođe su prepoznate od strane konstrukata antitela. Štaviše, nije bilo bojenja ćelija negativne kontrole (netransfektovane CHO, podaci prikazani u primeru 6).

[0828] Primer 6

[0829] Potvrda odsustva vezivanja za humane paraloge

[0831] Humani paralogi DLL3, DLL1 i DLL4, stabilno su transfektovani u CHO ćelije. Sekvence paraloga korišćene u predmetnom primeru identifikovane su u listi sekvenci (SEQ ID NO: 283 i 284). Ekspresija proteina potvrđena je FACS analizama sa antitelima specifičnim za odgovarajuće paraloge: Korišćena su antitela anti-humani DLL1 MAB1818 (R&D; 5 µg/ml) i anti-humani DLL4 MAB1506 (R&D; 5 µg/ml) za DLL4.

[0833] Test protočne citometrije sproveden je kao što je opisano u primeru 5, sa izuzetkom što su vezana mišja antitela detektovana kozjim anti-mišjim FITC (1:100). Rezultati su prikazani na slici 4. Analiza je potvrdila da nijedan od bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 prema pronalasku ne reaguje unakrsno sa humanim paralozima DLL3, DLL1 i DLL4.

[0834] Primer 7

[0835] Identitet sa humanom germinativnom linijom

[0837] U cilju analize identiteta / sličnosti sekvence konstrukata antitela sa genima humane germinativne linije antitela, domeni koji vezuju DLL3 prema pronalasku poravnati su na sledeći način: izvršeno je poravnanje kompletne VL uključujući sve CDR; izvršeno je poravnanje kompletne VH uključujući CDR 1 i 2, ali isključujući CDR3, sa genima humane germinativne linije antitela (Vbase). Više detalja može se naći u specifikaciji ove prijave. Rezultati su prikazani u tabeli 4 u nastavku:

[0839] Tabela 4: Identitet VH i VL sa humanom germinativnom linijom

[0841]

[0844] Primer 8

[0845] Citotoksična aktivnost

[0847] Potentnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 prema pronalasku u preusmeravanju efektorskih T-ćelija protiv ciljnih ćelija koje eksprimiraju DLL3 analizirana je u pet in vitro testova citotoksičnosti:

[0848] • Potentnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 u preusmeravanju stimulisanih humanih CD8+ efektorskih T-ćelija protiv CHO ćelija transfektovanih humanim DLL3 merena je u 18-časovnom testu oslobađanja hroma-51.

[0849] • Potentnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 u preusmeravanju stimulisanih humanih CD8+ efektorskih T-ćelija protiv humane ćelijske linije karcinoma pluća SHP-77 pozitivne na DLL3 merena je u 18-časovnom testu oslobađanja hroma-51.

[0851] • Potentnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 u preusmeravanju T-ćelija u nestimulisanim humanim PBMC protiv CHO ćelija transfektovanih humanim DLL3 merena je u 48-časovnom FACS-testu citotoksičnosti.

[0852] • Potentnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 u preusmeravanju T-ćelija u nestimulisanim humanim PBMC protiv humane ćelijske linije SHP-77 pozitivne na DLL3 merena je u 48-časovnom FACS-testu citotoksičnosti.

[0853] • Radi potvrde da su unakrsno reaktivni bispecifični konstrukti antitela DLL3xCD3 sposobni da preusmere makaki T-ćelije protiv CHO ćelija transfektovanih makaki DLL3, sproveden je 48-časovni FACS-test citotoksičnosti sa makaki T-ćelijskom linijom kao efektorskim T-ćelijama.

[0855] Primer 8.1

[0856] Test oslobađanja hroma sa stimulisanim humanim T-ćelijama

[0858] Stimulisane T-ćelije obogaćene za CD8<+>T-ćelije dobijene su kao što je opisano u nastavku. Petri šolja (prečnika 145 mm, Greiner bio-one GmbH, Kremsmünster) obložena je komercijalno dostupnim anti-CD3 specifičnim antitelom (OKT3, Orthoclone) u finalnoj koncentraciji od 1 µg/ml tokom 1 sata na 37°C. Nevezani protein je uklonjen jednim korakom ispiranja sa PBS.3 - 5 x 10<7>humanih PBMC dodato je u prethodno obloženu Petri šolju u 120 ml RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom / 10% FCS / IL-220 U/ml (Proleukin<®>, Chiron) i stimulisano tokom 2 dana. Trećeg dana, ćelije su sakupljene i isprane jednom sa RPMI 1640. IL-2 je dodat do finalne koncentracije od 20 U/ml i ćelije su ponovo kultivisane jedan dan u istom medijumu za kulturu ćelija kao gore. CD8<+>citotoksični T-limfociti (CTL) obogaćeni su deplecijom CD4<+>T-ćelija i CD56<+>NK-ćelija korišćenjem Dynal-Beads prema protokolu proizvođača.

[0860] [0289] Ciljne CHO ćelije transfektovane cyno DLL3 ili humanim DLL3 isprane su dva puta sa PBS i markirane sa 11,1 MBq<51>Cr u finalnoj zapremini od 100 µl RPMI sa 50% FCS tokom 60 minuta na 37°C. Zatim su markirane ciljne ćelije isprane 3 puta sa 5 ml RPMI i potom korišćene u testu citotoksičnosti. Test je sproveden u ploči sa 96 bunarčića u ukupnoj zapremini od 200 µl dopunjenog RPMI sa E:T odnosom 10:1. Korišćena je početna koncentracija od 0,01-1 µg/ml prečišćenog bispecifičnog konstrukta antitela i njegova trostruka razblaženja. Vreme inkubacije za test bilo je 18 sati. Citotoksičnost je određena kao relativna vrednost oslobođenog hroma u supernatantu u odnosu na razliku maksimalne lize (dodavanje Triton-X) i spontane lize (bez efektorskih ćelija). Sva merenja su izvršena u kvadruplikatu. Merenje aktivnosti hroma u supernatantima izvršeno je u Wizard 3" gama brojaču (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Köln, Nemačka). Analiza rezultata je izvršena pomoću programa Prism 5 za Windows (verzija 5.0, GraphPad Software Inc., San Diego, California, SAD). Vrednosti EC50 koje je izračunao program za analizu iz sigmoidnih kriva doza-odgovor korišćene su za poređenje citotoksične aktivnosti.

[0862] Primer 8.2

[0863] Potentnost preusmeravanja stimulisanih humanih efektorskih T-ćelija protiv CHO ćelija transfektovanih humanim DLL3

[0865] Citotoksična aktivnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 prema pronalasku analizirana je u testu citotoksičnosti oslobađanjem hroma-51 (<51>Cr) koristeći CHO ćelije transfektovane humanim DLL3 kao ciljne ćelije i stimulisane humane CD8+ T-ćelije kao efektorske ćelije. Eksperiment je sproveden kao što je opisano u primeru 8.1.

[0867] Rezultati su prikazani u tabeli 5. Bispecifični konstrukti antitela DLL3xCD3 pokazali su veoma potentnu citotoksičnu aktivnost protiv CHO ćelija transfektovanih humanim DLL3 u jednocifrenom pikomolarnom opsegu.

[0869] Tabela 5: Vrednosti EC50 [pM] bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 analiziranih u testu citotoksičnosti oslobađanjem hroma-51 (<51>Cr) koristeći CHO ćelije transfektovane humanim DLL3 kao ciljne ćelije i stimulisane humane CD8 T-ćelije kao efektorske ćelije.

[0872]

[0873]

[0876] Primer 8.3

[0877] Potentnost preusmeravanja stimulisanih humanih efektorskih T-ćelija protiv humane ćelijske linije karcinoma pluća SHP-77 pozitivne na DLL3

[0879] Citotoksična aktivnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 analizirana je u testu citotoksičnosti oslobađanjem hroma-51 (<51>Cr) koristeći humanu ćelijsku liniju karcinoma pluća SHP-77 pozitivnu na DLL3 kao izvor ciljnih ćelija i stimulisane humane CD8+ T-ćelije kao efektorske ćelije. Test je sproveden kao što je opisano u primeru 8.1.

[0881] U skladu sa rezultatima testova oslobađanja hroma-51 sa stimulisanim obogaćenim humanim CD8+ T-limfocitima kao efektorskim ćelijama i CHO ćelijama transfektovanim humanim DLL3 kao ciljnim ćelijama, bispecifični konstrukti antitela DLL3xCD3 prema predmetnom pronalasku takođe su potentni u citotoksičnoj aktivnosti protiv ciljnih ćelija koje su prirodni ekspresori (videti tabelu 6).

[0883] Tabela 6: Vrednosti EC50 [pM] bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 analiziranih u 18-časovnom testu citotoksičnosti oslobađanjem hroma-51 (<51>Cr) sa humanom ćelijskom linijom karcinoma pluća SHP-77 pozitivnom na DLL3 kao izvorom ciljnih ćelija i stimulisanim obogaćenim humanim CD8 T-ćelijama kao efektorskim ćelijama.

[0884] Redovi 1-10: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 260. (Redovi 1-7: Konstrukti antitela prema pronalasku koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar EGF-3 regiona. Redovi 8-10: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar EGF-4 regiona.) Redovi 11-14: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 koji je sadržan unutar EGF-5/[EGF-6] regiona.

[0887]

[0888]

[0891] Primer 8.4

[0892] FACS-test citotoksičnosti sa nestimulisanim humanim PBMC

[0894] Izolacija efektorskih ćelija

[0895] Humani mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremljene su centrifugiranjem u Ficoll gradijentu gustine iz obogaćenih preparata limfocita (buffy coats), sporednog proizvoda banaka krvi koje prikupljaju krv za transfuziju. Buffy coats je isporučila lokalna banka krvi, a PBMC su pripremljeni istog dana kada je krv prikupljena. Nakon Ficoll centrifugiranja u gradijentu gustine i ekstenzivnog ispiranja sa Dulbecco PBS (Gibco), preostali eritrociti su uklonjeni iz PBMC putem inkubacije sa puferom za lizu eritrocita (155 mM NH<4>Cl, 10 mM KHCO<3>, 100 µM EDTA). Trombociti su uklonjeni putem supernatanta nakon centrifugiranja PBMC na 100 x g. Preostali limfociti uglavnom obuhvataju B i T limfocite, NK ćelije i monocite. PBMC su čuvani u kulturi na 37°C/5% CO<2>u RPMI medijumu (Gibco) sa 10% FCS (Gibco).

[0897] Deplecija CD14<+>i CD56<+>ćelija

[0898] [0295] Za depleciju CD14<+>ćelija korišćene su humane CD14 MicroBeads (Miltenyi Biotec, MACS, #130-050-201), a za depleciju NK ćelija humane CD56 MicroBeads (MACS, #130-050-401). PBMC su izbrojani i centrifugirani tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi na 300 x g. Supernatant je odbačen, a talog ćelija je resuspendovan u MACS izolacionom puferu [80 µL/ 10<7>ćelija; PBS (Invitrogen, #20012-043), 0,5% (v/v) FBS (Gibco, #10270-106), 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich, #E-6511)]. Dodate su CD14 MicroBeads i CD56 MicroBeads (20 µL/10<7>ćelija) i inkubirane tokom 15 minuta na 4-8°C. Ćelije su isprane MACS izolacionim puferom (1 - 2 mL/10<7>ćelija). Nakon centrifugiranja (videti gore), supernatant je odbačen, a ćelije su resuspendovane u MACS izolacionom puferu (500 µL/10<8>ćelija). CD14/CD56 negativne ćelije su zatim izolovane korišćenjem LS kolona (Miltenyi Biotec, #130-042-401). PBMC bez CD14+/CD56+ ćelija su kultivisani u kompletnom RPMI medijumu, tj.

[0899] RPMI1640 (Biochrom AG, #FG1215) dopunjenom sa 10% FBS (Biochrom AG, #S0115), 1x neesencijalnim aminokiselinama (Biochrom AG, #K0293),10 mM Hpuferom (Biochrom AG, #L1613), 1 mM natrijum-piruvatom (Biochrom AG, #L0473) i 100 U/mL penicilina/streptomicina (Biochrom AG, #A2213) na 37°C u inkubatoru do potrebe.

[0901] Markiranje ciljnih ćelija

[0902] Za analizu lize ćelija u testovima protočne citometrije, korišćena je fluorescentna membranska boja DiOC<18>(DiO) (Molecular Probes, #V22886) za markiranje CHO ćelija transfektovanih humanim DLL3 ili makaki DLL3 kao ciljnih ćelija i njihovo razlikovanje od efektorskih ćelija. Ukratko, ćelije su sakupljene, isprane jednom sa PBS i podešene na 10<6>ćelija/mL u PBS koji sadrži 2% (v/v) FBS i membransku boju DiO (5 µL/10<6>ćelija). Nakon inkubacije tokom 3 minuta na 37°C, ćelije su isprane dva puta u kompletnom RPMI medijumu i broj ćelija je podešen na 1,25 x 10<5>ćelija/mL. Vitalnost ćelija određena je korišćenjem 0,5% (v/v) izotoničnog rastvora EosinG (Roth, #45380).

[0904] Analiza zasnovana na protočnoj citometriji

[0905] Ovaj test je dizajniran da kvantifikuje lizu CHO ćelija transfektovanih cyno ili humanim DLL3 u prisustvu serijskih razblaženja bispecifičnih konstrukata antitela DLL3. Pomešane su jednake zapremine DiO-markiranih ciljnih ćelija i efektorskih ćelija (tj. PBMC bez CD14<+>ćelija) što je rezultiralo odnosom E:T ćelija od 10:1.160 µl ove suspenzije prebačeno je u svaki bunarčić ploče sa 96 bunarčića. Dodato je 40 µL serijskih razblaženja bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 i bispecifična negativna kontrola (bispecifični konstrukt antitela zasnovan na CD3 koji prepoznaje irelevantan ciljni antigen) ili kompletni RPMI medijum kao dodatna negativna kontrola. Citotoksična reakcija posredovana bispecifičnim antitelom odvijala se tokom 48 sati u vlažnom inkubatoru sa 7% CO<2>. Zatim su ćelije prebačene u novu ploču sa 96 bunarčića i gubitak integriteta membrane ciljnih ćelija je praćen dodavanjem propidijum-jodida (PI) u finalnoj koncentraciji od 1 µg/mL. PI je boja koja ne prolazi kroz membranu i koja je normalno isključena iz vijabilnih ćelija, dok je mrtve ćelije preuzimaju i postaju prepoznatljive po fluorescentnoj emisiji.

[0906] Uzorci su izmereni protočnom citometrijom na instrumentu FACSCanto II i analizirani softverom FACSDiva (oba od Becton Dickinson). Ciljne ćelije su identifikovane kao DiO-pozitivne ćelije. PI-negativne ciljne ćelije klasifikovane su kao žive ciljne ćelije. Procenat citotoksičnosti izračunat je prema sledećoj formuli:

[0909]

[0911] n = broj događaja

[0913] Korišćenjem softvera GraphPad Prism 5 (Graph Pad Software, San Diego), procenat citotoksičnosti je ucrtan u odnosu na odgovarajuće koncentracije konstrukta antitela. Krive doza-odgovor analizirane su pomoću četiri parametrijska logistička regresiona modela za evaluaciju sigmoidnih kriva doza-odgovor sa fiksnim nagibom krive i izračunate su EC50 vrednosti.

[0915] Primer 8.5

[0916] Potentnost preusmeravanja nestimulisanih humanih PBMC protiv CHO ćelija transfektovanih humanim DLL3

[0918] Citotoksična aktivnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 analizirana je u FACS-testu citotoksičnosti koristeći CHO ćelije transfektovane humanim DLL3 kao ciljne ćelije i nestimulisane humane PBMC kao efektorske ćelije. Test je sproveden kao što je opisano u gore navedenom primeru 8.4.

[0920] Rezultati FACS-testova citotoksičnosti sa nestimulisanim humanim PBMC kao efektorskim ćelijama i CHO ćelijama transfektovanim humanim DLL3 kao ciljnim ćelijama prikazani su u tabeli 7.

[0922] Tabela 7: Vrednosti EC50 [pM] bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 izmerene u 48-časovnom FACS-testu citotoksičnosti sa nestimulisanim humanim PBMC kao efektorskim ćelijama i CHO ćelijama transfektovanim humanim DLL3 kao ciljnim ćelijama.

[0923] Redovi 1-10: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 260. (Redovi 1-7: Konstrukti antitela prema pronalasku koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar EGF-3 regiona. Redovi 8-10: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar EGF-4 regiona.) Redovi 11-14: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 koji je sadržan unutar EGF-5/[EGF-6] regiona.

[0926]

[0929] Očekivano, vrednosti su generalno bile više u testovima citotoksičnosti sa nestimulisanim PBMC kao efektorskim ćelijama u poređenju sa testovima citotoksičnosti koji koriste stimulisane humane CD8+ T-ćelije (videti primer 8.2).

[0931] Primer 8.6

[0932] Potentnost preusmeravanja nestimulisanih humanih PBMC protiv humane ćelijske linije karcinoma pluća SHP-77 pozitivne na DLL3

[0934] Citotoksična aktivnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 je nadalje analizirana u FACS-testu citotoksičnosti koristeći humanu ćelijsku liniju karcinoma pluća SHP-77 pozitivnu na DLL3 kao izvor ciljnih ćelija i nestimulisane humane PBMC kao efektorske ćelije. Test je sproveden kao što je opisano u gore navedenom primeru 8.4.

[0935] Rezultati su prikazani u tabeli 8.

[0937] Tabela 8: Vrednosti EC50 [pM] bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 izmerene u 48-časovnom FACS-testu citotoksičnosti sa nestimulisanim humanim PBMC kao efektorskim ćelijama i humanom ćelijskom linijom SHP-77 kao izvorom ciljnih ćelija.

[0938] Redovi 1-10: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 260. (Redovi 1-7: Konstrukti antitela prema pronalasku koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar EGF-3 regiona. Redovi 8-10: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar EGF-4 regiona.) Redovi 11-14: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 koji je sadržan unutar EGF-5/[EGF-6] regiona.

[0941]

[0944] Primer 8.7

[0945] Potentnost preusmeravanja makaki T-ćelija protiv CHO ćelija koje eksprimiraju makaki DLL3

[0947] Konačno, citotoksična aktivnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 analizirana je u FACS-testu citotoksičnosti koristeći CHO ćelije transfektovane makaki (cyno) DLL3 kao ciljne ćelije i makaki T-ćelijsku liniju 4119LnPx (Knappe et al. Blood 95:3256-61 (2000)) kao izvor efektorskih ćelija. Markiranje ciljnih CHO ćelija transfektovanih makaki DLL3 i analiza citotoksične aktivnosti zasnovana na protočnoj citometriji sprovedeni su kao što je gore opisano.

[0949] [0305] Rezultati su prikazani u tabeli 9. Bispecifični konstrukti antitela DLL3xCD3 prema pronalasku indukovali su makaki T-ćelije iz ćelijske linije 4119LnPx da efikasno ubijaju CHO ćelije transfektovane makaki DLL3. Konstrukti antitela su se pokazali kao potentni sa dvocifrenim pikomolarnim EC50 vrednostima u ovom testu, što potvrđuje da su veoma aktivni u makaki sistemu.

[0951] Tabela 9: Vrednosti EC50 [pM] bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 izmerene u 48-časovnom FACS-testu citotoksičnosti sa makaki T-ćelijskom linijom 4119LnPx kao efektorskim ćelijama i CHO ćelijama transfektovanim makaki DLL3 kao ciljnim ćelijama. Redovi 1-10: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 260. (Redovi 1-7: Konstrukti antitela prema pronalasku koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar EGF-3 regiona. Redovi 8-10: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 sadržan unutar EGF-4 regiona.) Redovi 11-14: Konstrukti antitela koji se vezuju za epitop DLL3 koji je sadržan unutar EGF-5/[EGF-6] regiona.

[0954]

[0957] Primer 9

[0958] Konverzija monomera u dimer nakon (i) tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja i (ii) 7 dana inkubacije pri 250 µg/ml

[0960] Monomerni bispecifični konstrukti antitela DLL3xCD3 podvrgnuti su različitim uslovima stresa, nakon čega je usledio SEC visoke efikasnosti (HP-SEC) kako bi se odredio procenat inicijalno monomernog konstrukta antitela koji je konvertovan u dimerni konstrukt antitela.

[0961] (i) 25 µg monomernog konstrukta antitela podešeno je na koncentraciju od 250 µg/ml generičkim puferom za formulaciju, a zatim zamrznuto na -80°C tokom 30 minuta, nakon čega je usledilo odmrzavanje tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja, sadržaj dimera je određen pomoću HP-SEC. (ii) 25 µg monomernog konstrukta antitela podešeno je na koncentraciju od 250 µg/ml generičkim puferom za formulaciju, nakon čega je usledila inkubacija na 37°C tokom 7 dana. Sadržaj dimera je određen pomoću HP-SEC.

[0963] SEC kolona visoke rezolucije TSK Gel G3000 SWXL (Tosoh, Tokyo-Japan) povezana je na Äkta Purifier 10 FPLC (GE Lifesciences) opremljen autosemplerom A905. Pufer za ekvilibraciju kolone i radni pufer sastojao se od 100 mM KH2PO4 - 200 mM Na2SO4 podešenog na pH 6,6. Rastvor antitela (25 µg proteina) nanet je na ekvilibrisanu kolonu i elucija je vršena pri protoku od 0,75 ml/min uz maksimalni pritisak od 7 MPa. Čitav ciklus je praćen na optičkoj apsorbanci od 280, 254 i 210 nm. Analiza je urađena integracijom pikova signala na 210 nm zabeleženog u Unicorn softveru za Äkta uređaj.

[0964] Sadržaj dimera izračunat je deljenjem površine pika dimera ukupnom površinom pikova monomera i dimera.

[0966] Rezultati su prikazani u tabeli 10 u nastavku. Bispecifični konstrukti antitela DLL3xCD3 prema pronalasku pokazali su procente dimera od 0,0% nakon tri ciklusa zamrzavanja/odmrzavanja i procente dimera od ≤ 2% nakon 7 dana inkubacije na 37°C.

[0968] Tabela 10: Procenat monomernih naspram dimernih bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 određen ekskluzionom hromatografijom visoke efikasnosti (HP-SEC).

[0970]

[0971]

[0974] Primer 10

[0975] Termostabilnost

[0977] Temperatura agregacije antitela određena je na sledeći način: 40 µl rastvora konstrukta antitela pri 250 µg/ml prebačeno je u kivetu za jednokratnu upotrebu i postavljeno u Wyatt uređaj za dinamičko rasejanje svetlosti DynaPro Nanostar (Wyatt). Uzorak je zagrevan sa 40°C na 70°C brzinom zagrevanja od 0,5°C/min uz konstantno prikupljanje izmerenog radijusa. Povećanje radijusa koje ukazuje na topljenje proteina i agregaciju korišćeno je od strane softverskog paketa isporučenog uz DLS uređaj za izračunavanje temperature agregacije konstrukta antitela.

[0979] Svi testirani bispecifični konstrukti antitela DLL3xCD3 prema pronalasku pokazali su termičku stabilnost sa temperaturama agregacije ≥45°C, kao što je prikazano u tabeli 11 u nastavku. Grupa konstrukata antitela koji se vezuju za epitop DLL3 koji je sadržan unutar EGF-4 regiona (kao što je prikazano u SEQ ID NO: 259) čak je imala termičku stabilnost od ≥50°C, preciznije, od ≥54°C.

[0981] Tabela 11: Termostabilnost bispecifičnih konstrukata antitela određena pomoću DLS (dinamičko rasejanje svetlosti)

[0983]

[0984]

[0987] Primer 11

[0988] Stabilnost nakon inkubacije tokom 24 sata u humanoj plazmi

[0990] Prečišćeni bispecifični konstrukti antitela inkubirani su u odnosu 1:5 u pulu humane plazme na 37°C tokom 96 sati u finalnoj koncentraciji od 2-20 µg/ml. Nakon inkubacije u plazmi, konstrukti antitela su upoređeni u testu oslobađanja hroma-51 sa stimulisanim obogaćenim humanim CD8+ T-ćelijama i CHO ćelijama transfektovanim humanim DLL3 u početnoj koncentraciji od 0,01-0,1 µg/ml i sa odnosom efektorskih prema ciljnim ćelijama (E:T) od 10:1 (test kao što je opisano u primeru 8.1). Neinkubirani, sveže odmrznuti bispecifični konstrukti antitela uključeni su kao kontrole.

[0992] Rezultati su prikazani u tabeli 12 u nastavku; primeri rezultata za dva konstrukta antitela DLL-4 i DLL-14 takođe su prikazani na slici 5. Svi testirani konstrukti antitela imali su veoma povoljnu stabilnost u plazmi (EC<50>plazma / EC<50>kontrola) od ≤ 2,5. Grupa konstrukata antitela koji se vezuju za epitop DLL3 koji je sadržan unutar EGF-4 regiona (kao što je prikazano u SEQ ID NO: 259) čak je imala stabilnost u plazmi od ≤ 1,5, preciznije, od ≤ 1,1.

[0994] Tabela 12: Vrednosti EC50 konstrukata antitela sa i bez inkubacije u plazmi i izračunata vrednost plazma / kontrola

[0996]

[0997]

[1000] Primer 12

[1001] Zamućenost pri koncentraciji antitela od 2500 µg/ml

[1003] 1 ml rastvora prečišćenog konstrukta antitela koncentracije od 250 µg/ml koncentrovan je pomoću jedinica za koncentrisanje centrifugiranjem na 2500 µg/ml. Nakon 16 sati skladištenja na 5°C, zamućenost rastvora antitela određena je merenjem optičke apsorpcije OD340 nm u odnosu na generički pufer za formulaciju.

[1005] Rezultati su prikazani u tabeli 13 u nastavku. Svi testirani konstrukti antitela imaju veoma povoljnu zamućenost od ≤ 0,1, sa izuzetkom jednog konstrukta sa zamućenošću neznatno iznad 0,1. Grupa konstrukata antitela koji se vezuju za epitop DLL3 koji je sadržan unutar EGF-4 regiona (kao što je prikazano u SEQ ID NO: 259) čak ima zamućenost od ≤ 0,08.

[1007] Tabela 13: Zamućenost konstrukata antitela nakon koncentrisanja na 2,5 mg/ml tokom noći

[1009]

[1012] Primer 13

[1013] Homogenost proteina pomoću katjonske izmenjivačke hromatografije visoke rezolucije

[1014] Homogenost proteina konstrukata antitela prema pronalasku analizirana je pomoću katjonske izmenjivačke hromatografije (CIEX) visoke rezolucije.

[1016] 50 µg monomera konstrukta antitela razblaženo je sa 50 ml pufera za vezivanje A (20 mM natrijum-dihidrogenfosfata, 30 mM NaCl, 0,01% natrijum-oktanata, pH 5,5), a 40 ml ovog rastvora naneto je na BioPro SP-F kolonu od 1 ml (YMC, Nemačka) povezanu na Äkta Micro FPLC uređaj (GE Healthcare, Nemačka). Nakon vezivanja uzorka, izvršen je korak ispiranja sa dodatnim puferom za vezivanje. Za eluciju proteina primenjen je linearno rastući gradijent soli korišćenjem pufera B (20 mM natrijum-dihidrogenfosfata, 1000 mM NaCl, 0,01% natrijum-oktanata, pH 5,5) do 50% procenta pufera B tokom 10 zapremina kolone. Čitav ciklus je praćen na optičkoj apsorbanci od 280, 254 i 210 nm. Analiza je urađena integracijom pikova signala na 280 nm zabeleženog u Unicorn softveru za Äkta uređaj.

[1018] Rezultati su prikazani u tabeli 14 u nastavku. Svi testirani konstrukti antitela imaju veoma povoljnu homogenost od ≥ 80% (površina ispod krive (= AUC) glavnog pika). Grupa konstrukata antitela koji se vezuju za epitop DLL3 koji je sadržan unutar EGF-3 regiona (kao što je prikazano u SEQ ID NO: 258) čak ima homogenost od ≥ 90%.

[1020] Tabela 14: Homogenost proteina konstrukata antitela (% AUC glavnog pika)

[1022]

[1023] Primer 14

[1024] Površinska hidrofobnost merena pomoću HIC Butyl

[1026] Površinska hidrofobnost bispecifičnih konstrukata antitela prema pronalasku testirana je hidrofobnom interakcionom hromatografijom (HIC) u protočnom režimu.

[1028] 50 µg monomera konstrukta antitela razblaženo je generičkim puferom za formulaciju do finalne zapremine od 500 µl (10 mM limunske kiseline, 75 mM lizin HCl, 4% trehaloze, pH 7,0) i naneto na Butyl Sepharose FF kolonu od 1 ml (GE Healthcare, Nemačka) povezanu na Äkta Purifier FPLC sistem (GE Healthcare, Nemačka). Čitav ciklus je praćen na optičkoj apsorbanci od 280, 254 i 210 nm. Analiza je urađena integracijom pikova signala na 280 nm zabeleženog u Unicorn softveru za Äkta uređaj. Ponašanje pri eluciji je procenjeno poređenjem površine i brzine uspona i pada signala proteina, čime je indikovan intenzitet interakcije BiTE fuzije sa albuminom i matriksa.

[1030] Konstrukti antitela su imali dobro ponašanje pri eluciji, koja je uglavnom bila brza i potpuna.

[1032] Primer 15

[1033] Razlika u potentnosti između monomerne i dimerne izoforme bispecifičnih konstrukata antitela

[1035] U cilju određivanja razlike u citotoksičnoj aktivnosti između monomerne i dimerne izoforme pojedinačnih bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 (što se naziva razlikom u potentnosti), sproveden je 18-časovni test citotoksičnosti oslobađanjem hroma-51 kao što je gore opisano (primer 8.1) sa prečišćenim monomerom i dimerom bispecifičnog konstrukta antitela. Efektorske ćelije su bile stimulisane obogaćene humane CD8+ T-ćelije. Ciljne ćelije su bile CHO ćelije transfektovane humanim DLL3. Odnos efektorskih prema ciljnim ćelijama (E:T) bio je 10:1. Razlika u potentnosti izračunata je kao odnos između EC50 vrednosti.

[1037] Rezultati su prikazani u tabeli 15 u nastavku; primeri rezultata za dva konstrukta antitela DLL-4 i DLL-14 takođe su prikazani na slici 6. Razlike u potentnosti testiranih bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 bile su između 0,2 i 1,0. Prema tome, ne postoji značajno aktivniji dimer u poređenju sa njegovim odgovarajućim monomerom.

[1038] Tabela 15: Razlika u potentnosti između monomerne i dimerne izoforme

[1040]

[1043] Primer 16

[1044] In vitro test internalizacije

[1046] Merene su promene u potentnosti bispecifičnog konstrukta antitela DLL3xCD3 kao funkcija preinkubacije konstrukta na ciljnim ćelijama u odsustvu T-ćelija. Ako se konstrukt antitela internalizuje, trebalo bi da podlegne lizozomalnoj degradaciji. Efektivna koncentracija bi trebalo da se smanjuje s vremenom, a samim tim bi trebalo da se smanji i prividna potentnost. Ovaj efekat se opaža kod drugih ciljnih antigena, za koje je ovo poznat fenomen, ali nije primećen nikakav uticaj kod bispecifičnog konstrukta antitela DLL3xCD3. Test je sproveden na sledeći način:

[1047] T-ćelije su izbrojane i razblažene do koncentracije od1 x 10<5>/ ml u medijumu za test. SHP-77 ćelije su izbrojane i zasejane u gustini od 2500 ćelija po bunarčiću (cpw). Konstrukt antitela je serijski razblažen 1:2 (sa Bravo), pri početnoj koncentraciji od 100 nM. Konstrukt antitela je dodat u ploče za kulturu kako bi se omogućila inkubacija od 0 sati, 1 sat ili 2 sata pre dodavanja T-ćelija. Zatim su T-ćelije zasejane u gustini od 25000 cpw, a test je inkubiran tokom 48 sati na 37°C. Preživljavanje SHP-77 ćelija analizirano je sistemom Steady-Glo<®>(25 µl/bunarčić). Rezultati su prikazani na slici 7 i sugerišu da nema značajne internalizacije konstrukta antitela DLL3-4 x CD3 (I2C).

[1048] Primer 17

[1049] Studija oslobađanja

[1051] U cilju analize da li je citotoksična aktivnost bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 prema pronalasku značajno narušena prisustvom oslobođenog DLL, sproveden je sledeći test: T-ćelije su izbrojane i razblažene do koncentracije od1 x 10<5>/ ml u medijumu za test. SHP-77 ćelije su izbrojane i razblažene do koncentracije od 1,25 x 10<5>/ ml u medijumu za test sa rastućim koncentracijama rastvorljivog DLL3 između 0,3 nM i 12 nM. SHP-77 ćelije su zasejane u gustini od 2500 ćelija po bunarčiću (cpw), a T-ćelije su dodate u gustini od 25000 cpw. Konstrukt antitela je serijski razblažen 1:2 (sa Bravo) i dodat u kulturu (sa Bravo). Inkubacija je trajala 48 sati na 37°C. Preživljavanje SHP-77 ćelija analizirano je sistemom Steady-Glo<®>(25 µl/bunarčić).

[1053] Primer 18

[1054] Studija efikasnosti na mišjem ksenograft modelu

[1056] Antitumorska aktivnost HLE bispecifičnog konstrukta antitela DLL3xCD3 (SEQ ID NO: 517517) testirana je na modelu ženki NOD/SCID miševa kojima su 1. dana studije supkutano ubrizgane 5x10<6>ćelije humanog DLL3 pozitivnog SCLC (SHP-77 luc) ili 5x10<6>ćelije humanog DLL3 pozitivnog melanoma (WM 266-4). Efektorske ćelije (2x10<7>in vitro ekspandiranih i aktiviranih živih humanih CD3+ T-ćelija) ubrizgane su intraperitonealno 12. dana. Početak tretmana bio je 16. dana (WM 266-4) ili 18. dana (SHP-77 luc). Konstrukt antitela je primenjen četiri puta svakih pet dana (q5dx4) putem i.v. bolus injekcija. Grupe za tretman su bile sledeće:

[1057] • SCLC model (SHP-77 luc) / 7 miševa po grupi

[1059] o Grupa tretirana vehikulumom sa T-ćelijama

[1061] o Bispecifični konstrukt antitela DLL3xCD3: 10 mg/kg po primeni • Melanoma model (WM266-4) / 9 miševa po grupi

[1063] o Grupa tretirana vehikulumom sa T-ćelijama

[1065] o Bispecifični konstrukt antitela DLL3xCD3: 10 mg/kg po primeni

[1066] o Bispecifični konstrukt antitela DLL3xCD3: 2 mg/kg po primeni

[1068] [0326] Tumori su mereni kaliperom tokom studije, a napredak je evaluiran međugrupnim poređenjem zapremina tumora (TV). Inhibicija rasta tumora T/C [%] dana x određuje se izračunavanjem zapremine tumora kao T/C (%) = 100 x (medijana TV analizirane grupe) / (medijana TV kontrolne grupe), a izračunate vrednosti su prikazane u sledećoj tabeli 16:

[1070] Tabela 16: T/C vrednosti studija mišjih ksenografta sa SHP-77 luc ćelijama i WM266-4 ćelijama

[1072]

[1075] Rezultati su nadalje prikazani na slikama 8A i 8B. Značajna inhibicija rasta tumora pokazana je u oba tumorska modela i pri oba testirana nivoa doza od 2 i 10 mg/kg.

[1077] Primer 19

[1078] Eksploratorna toksikološka studija na cyno majmunima

[1080] Eksploratorna toksikološka studija sprovedena je sa bispecifičnim konstruktom antitela DLL3xCD3 bez produženog poluvremena eliminacije (SEQ ID NO: 554). Tri ženke cynomolgus majmuna primale su doze putem kontinuirane i.v. infuzije tokom 16 dana (5, 15 i 45 µg/kg/dan tokom po 3 dana, nakon čega je sledilo 100 µg/kg/dan tokom 7 dana). Nisu uočena klinička zapažanja povezana sa testiranim supstancama, promene telesne temperature, konzumacije hrane ili telesne težine.

[1081] U skladu sa očekivanjima za farmakologiju bispecifičnog konstrukta antitela DLL3xCD3, cirkulišuće populacije T-limfocita (ukupni T-limfociti, T-pomoćni i T-citotoksični limfociti, NK ćelije, B-limfociti i CD25+ aktivirani T-limfociti) bile su smanjene prvog dana doziranja i ostale su niže tokom čitavog trajanja studije kod svih životinja.

[1082] Markeri aktivacije (CD69 i CD25 na aktiviranim T-ćelijama) bili su povećani 1. dana, ali ne i u kasnijim vremenskim tačkama studije.

[1084] Ukratko, bispecifični konstrukt antitela DLL3xCD3 se veoma dobro tolerisao čak i pri najvišoj testiranoj dozi (100 µg/kg/d, > 300 x EC<50>).

[1086] Primer 20

[1087] PK studije na cyno majmunima

[1089] PK studija na cyno majmunima sprovedena je sa prethodno netretiranim mužjacima cynomolgus majmuna. Tri različita bispecifična konstrukta antitela DLL3xCD3 (I2C) fuzionisana sa albuminom (DLL3-4, DLL3-6 i DLL3-14) primenjena su kao i.v. pojedinačni bolus u koncentraciji od 12 µg/kg. Za svaki od molekula korišćena je grupa od dve životinje.

[1091] Posebna PK studija na cyno majmunima sprovedena je pod istim uslovima, ali sa DLL3-4 u različitim verzijama Fc fuzije.

[1093] Uzorci krvi su prikupljeni pre doziranja i 0,05, 0,5, 1, 4, 8, 24, 48, 72, 120, 168, 240 i 336 sati nakon doziranja. Serum je pripremljen za određivanje serumskih koncentracija molekula u imunotestu. Test je izveden hvatanjem konstrukata antitela preko njihovog ciljnog dela, dok je antitelo usmereno protiv dela konstrukta koji vezuje CD3 korišćeno za detekciju. Profili koncentracije u serumu u zavisnosti od vremena korišćeni su za određivanje PK parametara. Farmakokinetički parametri su određeni korišćenjem standardnih metoda nekompartmentalne analize (NCA). Procenjeni su sledeći PK parametri: AUC<inf>(površina ispod krive koncentracije u serumu u zavisnosti od vremena), V<ss>(volumen distribucije u stanju dinamičke ravnoteže), CL (sistemski klirens) i terminalno t<1/2>(terminalno poluvreme eliminacije). Za sve konstrukte antitela, nivoi u serumu su se mogli kvantifikovati u svim vremenskim tačkama kod svih životinja nakon njihove primene. Ni kod jedne od tretiranih životinja nisu zabeležena klinička zapažanja.

[1094] Farmakokinetika testiranih konstrukata antitela prikazana je na slici 9, a PK parametri su sumirani kao srednja vrednost za n=2 u tabeli 17 u nastavku.

[1096] Konstrukti fuzionisani sa albuminom pokazali su povoljan PK profil u skladu sa režimom doziranja jednom ili dva puta nedeljno kod humanog pacijenta. Još povoljniji PK profil koji podržava doziranje jednom nedeljno ili čak svake druge nedelje primećen je kod Fc fuzionog konstrukta (scFc).

[1098] Tabela 17: Farmakokinetički parametri HLE varijanti bispecifičnih konstrukata antitela DLL3xCD3 kod cynomolgus majmuna

[1100]

[1101] <c>i v<e>n s<e>k<t>a L<i>s 18: a<e>l ab<T>

[1102]

[1103]

[1104]

[1105]

[1106]

[1107]

[1108]

[1109]

[1110]

[1111]

[1112]

[1113]

[1114]

[1115]

[1116]

[1117]

[1118]

[1119]

[1120]

[1121]

[1122]

[1123]

[1124]

[1125]

[1126]

[1127]

[1128]

[1129]

[1130]

[1131]

[1132]

[1133]

[1134]

[1135]

[1136]

[1137]

[1138]

[1139]

[1140]

[1141]

[1142]

[1143]

[1144]

[1145]

[1146]

[1147]

[1148]

[1149]

[1150]

[1151]

[1152]

[1153]

[1154]

[1155]

[1156]

[1157]

[1158]

[1159]

[1160]

[1161]

[1162]

[1163]

[1164]

[1165]

[1166]

[1167]

[1168]

[1169]

[1170]

[1171]

[1172]

[1173]

[1174]

[1175]

[1176]

[1177]

[1178]

[1179]

[1180]

[1181]

[1182]

[1183]

[1184]

[1185]

[1186]

[1187]

[1188]

[1189]

[1190]

[1191]

[1192]

[1193]

[1194]

[1195]

[1196]

[1197]

[1198]

[1199]

[1200]

[1201]

[1202]

[1203]

[1204]

[1205]

[1206]

[1207]

[1208]

[1209]

[1210]

[1211]

[1212]

[1213]

[1214]

[1215]

[1216]

[1217]

[1218]

[1219]

[1220]

[1221]

[1222]

[1223]

[1224]

[1225]

[1226]

Claims

1. Patentni zahtevi

1. Citotoksični bispecifični jednolančani konstrukt antitela koji obuhvata prvi domen vezivanja koji se vezuje za humani DLL3 na površini ciljne ćelije i drugi domen vezivanja koji se vezuje za humani CD3 na površini T-ćelije i makaki CD3, pri čemu se prvi domen vezivanja vezuje za epitop DLL3 koji je sadržan unutar regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 258, pri čemu je konstrukt antitela u formatu (scFv)2.

2. Konstrukt antitela prema patentnom zahtevu 1, pri čemu se prvi domen vezivanja dalje vezuje za makaki DLL3, poželjno za Macaca fascicularis DLL3.

3. Konstrukt antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2, pri čemu se drugi domen vezivanja vezuje za humani CD3 epsilon i za Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus CD3 epsilon.

4. Konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, pri čemu prvi domen vezivanja obuhvata VH region koji obuhvata CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji obuhvata CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 odabrane iz grupe koja se sastoji od:

a) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 31, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 32, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 33, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 34, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 35 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 36;

b) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 41, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 42, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 43, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 44, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 45 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 46;

c) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 51, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 52, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 53, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 54, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 55 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 56;

d) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 61, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 62, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 63, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 64, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 65 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 66;

e) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 71, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 72, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 73, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 74, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 75 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 76;

f) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 81, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 82, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 83, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 84, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 85 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 86;

g) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 91, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 92, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 93, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 94, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 95 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 96;

h) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 101, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 102, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 103, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 104, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 105 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 106; i

i) CDR-H1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 111, CDR-H2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 112, CDR-H3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 113, CDR-L1 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 114, CDR-L2 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 115 i CDR-L3 kao što je prikazano u SEQ ID NO: 116.

5. Konstrukt antitela prema patentnom zahtevu 4, pri čemu prvi domen vezivanja obuhvata a) VH region odabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 435 i SEQ ID NO: 529; i/ili b) VL region odabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 436 i SEQ ID NO: 530.

6. Konstrukt antitela prema patentnom zahtevu 4 ili 5, pri čemu prvi domen vezivanja obuhvata

a) VH region i VL region odabrane iz grupe koja se sastoji od parova VH regiona i VL regiona kao što je prikazano u SEQ ID NO: 37+38; SEQ ID NO: 47+48; SEQ ID NO: 57+58;

SEQ ID NO: 67+68; SEQ ID NO: 77+78; SEQ ID NO: 87+88; SEQ ID NO: 97+98; SEQ ID NO: 107+108; SEQ ID NO: 117+118; SEQ ID NO: 435+436; i SEQ ID NO: 529+530, ili b) polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 437 i SEQ ID NO: 531.

7. Konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 6, koji obuhvata polipeptid odabran iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, SEQ ID NO: 213, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, SEQ ID NO: 216, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 438 i SEQ ID NO: 532.

8. Konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 4 do 7, koji obuhvata ili se sastoji od polipeptida odabranog iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 523 i SEQ ID NO: 524.

9. Polinukleotid koji kodira konstrukt antitela kao što je definisano u bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

10. Vektor koji obuhvata polinukleotid kao što je definisano u patentnom zahtevu 9.

11. Ćelija domaćin transformisana ili transfektovana polinukleotidom kao što je definisano u patentnom zahtevu 9 ili vektorom kao što je definisano u patentnom zahtevu 10.

12. Postupak za proizvodnju konstrukta antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, pri čemu navedeni postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina kao što je definisano u patentnom zahtevu 11 pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju navedenog konstrukta antitela i izolovanje proizvedenog konstrukta antitela iz kulture.

13. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8.

14. Konstrukt antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8 za upotrebu u lečenju tumora ili kancerske bolesti ili metastatske kancerske bolesti.

15. Konstrukt antitela za upotrebu prema patentnom zahtevu 14, pri čemu je tumor ili kancerska bolest odabrana iz grupe koja se sastoji od raka pluća malih ćelija (SCLC), raka pluća nemalih ćelija (NSCLC), glioma, glioblastoma, melanoma, neuroendokrinog raka prostate, neuroendokrinog raka pankreasa, hepatoblastoma, hepatocelularnog karcinoma i metastatske kancerske bolesti poreklom od bilo čega od prethodno navedenog.