MD3570834T2 - Inhibitori biciclici ai histon deacetilazei - Google Patents

Abstract

În acest document se furnizează compuşi şi săruri acceptabile farmaceutic ale acestora, şi compoziţii farmaceutice ale acestora, utile în tratamentul afecţiunilor asociate cu inhibarea HDAC (de exemplu, HDAC2).

Description

CERERI CONEXE

Prezenta cerere revendică prioritatea Cererii provizorii din SUA nr. 62/445.022 depusă la data de 11 ianuarie 2017 şi Cererii provizorii din SUA nr. 62/555.298 depusă la data de 7 septembrie 2017.

DECLARAŢIE PRIVIND CERCETAREA ŞI DEZVOLTAREA SPONSORIZATE FEDERAL

Prezenta invenţie a fost realizată cu sprijinul Guvernului în cadrul grantului SBIR (Small Business Innovation Research) 1R43AG048651-01A1, acordat de Institutul Naţional de Sănătate (NIH). Guvernul are anumite drepturi asupra invenţiei.

BAZELE INVENŢIEI

S-a demonstrat faptul că inhibitorii histon deacetilazei (HDAC) modulează transcripţia şi induc stoparea creşterii celulare, diferenţierea şi apoptoza. Inhibitorii HDAC sporesc, de asemenea, efectele citotoxice ale agenţilor terapeutici utilizaţi în tratamentul cancerului, inclusiv radiaţiile şi medicamentele chimioterapeutice. Marks, P., Rifkind, R. A., Richon, V. M., Breslow, R., Miller, T., Kelly, W. K. Histone deacetylases and cancer: causes and therapies. Nat Rev Cancer, 1, 194-202, (2001); and Marks, P. A., Richon, V. M., Miller, T., Kelly, W. K. Histone deacetylase inhibitors. Adv Cancer Res, 91, 137-168, (2004). În plus, dovezile recente indică faptul că dereglarea transcripţională poate contribui la patogeneza moleculară a anumitor tulburări neurodegenerative, cum ar fi boala Huntington, atrofia musculară spinală, scleroza laterală amiotropă şi ischemia. Langley, B., Gensert, J. M., Beal, M. F., Ratan, R. R. Remodeling chromatin and stress resistance in the central nervous system: histone deacetylase inhibitors as novel and broadly effective neuroprotective agents. Curr Drug Targets CNS Neurol Disord, 4, 41-50, (2005). O recenzie recentă a rezumat dovezile pentru faptul că activitatea aberantă a histon acetiltransferazei (HAT) şi a histon deacetilazelor (HDAC) poate reprezenta un mecanism de bază comun care contribuie la neurodegenerare. În plus, utilizând un model de depresie la şoareci, Nestler a evidenţiat recent potenţialul terapeutic al inhibitorilor de deacetilare a histonelor (HDAC5) în depresie. Tsankova, N. M., Berton, O., Renthal, W., Kumar, A., Neve, R. L., Nestler, E. J. Sustained hippocampal chromatin regulation in a mouse model of depression and antidepressant action. Nat Neurosci, 9, 519-525, (2006).

Există 18 histon deacetilaze umane cunoscute, grupate în patru clase pe baza structurii domeniilor accesorii ale acestora. Clasa I include HDAC1, HDAC2, HDAC3 şi HDAC8 şi are omologie cu drojdia Rpd3. HDAC4, HDAC5, HDAC7 şi HDAC9 aparţin clasei IIa şi au omologie cu drojdia Hda1. HDAC6 şi HDAC10 conţin două situsuri catalitice şi aparţin clasei IIb. Clasa III (sirtuinele) include SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT4, SIRT5, SIRT6 şi SIRT7. HDAC11 este un alt membru recent identificat al familiei HDAC şi a conservat resturi în centrul său catalitic, care sunt împărtăşite de deacetilazele atât de clasa I, cât şi de clasa II şi uneori este plasat în clasa IV. În schimb, s-a dovedit faptul că HDAC sunt puternice regulatoare în sens negativ ale proceselor de memorie pe termen lung. Inhibitorii HDAC nespecifici sporesc plasticitatea sinaptică, precum şi memoria pe termen lung (Levenson şi colab., 2004, J. Biol. Chem. 279:40545-40559; Lattal şi colab., 2007, Behav Neurosci 121:1125-1131; Vecsey şi colab., 2007, J. Neurosci 27:6128; Bredy, 2008, Learn Mem 15:460-467; Guan şi colab., 2009, Nature 459:55-60; Malvaez şi colab., 2010, Biol. Psychiatry 67:36-43; Roozendaal şi colab., 2010, J. Neurosci. 30:5037-5046). De exemplu, inhibarea HDAC poate transforma un eveniment de învăţare care nu conduce la memoria pe termen lung într-un eveniment de învăţare care are ca rezultat o memorie semnificativă pe termen lung (Stefanko şi colab., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:9447-9452). În plus, inhibarea HDAC poate genera, de asemenea, o formă de memorie pe termen lung care persistă dincolo de punctul în care memoria normală eşuează. S-a dovedit faptul că inhibitorii HDAC ameliorează deficienţele cognitive la modelele genetice ale bolii Alzheimer (Fischer şi colab., 2007, Nature 447:178-182; Kilgore şi colab., 2010, Neuropsychopharmacology 35:870-880). Aceste demonstraţii sugerează faptul că modularea memoriei prin inhibarea HDAC are un potenţial terapeutic considerabil pentru multe tulburări cognitive şi de memorie. Rolul HDAC individuale în memoria pe termen lung a fost explorat în două studii recente. Kilgore şi colab. 2010, Neuropsychopharmacology 35:870-880 au dezvăluit faptul că inhibitorii HDAC nespecifici, cum ar fi butiratul de sodiu, inhibă HDAC de clasa I (HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8) cu efect redus asupra membrilor familiei HDAC de clasa IIa (HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9). Acest lucru sugerează faptul că inhibarea HDAC de clasa I poate fi critică pentru îmbunătăţirea cunoaşterii observate în multe studii. Într-adevăr, supra expresia specifică creierului anterior şi neuronilor a HDAC2, dar nu şi a HDAC1, a scăzut densitatea coloanei dendritice, densitatea sinaptică, plasticitatea sinaptică şi formarea memoriei. (Guan şi colab., 2009, Nature, 459:55-60). În schimb, şoarecii knockout pentru HDAC2 au prezentat densitate sinaptică crescută, plasticitate sinaptică crescută şi densitate dendritică crescută în neuroni. Aceşti şoareci cu deficienţă de HDAC2 au prezentat, de asemenea, învăţare şi memorie îmbunătăţite într-o baterie de învăţare a paradigmelor comportamentale. Această lucrare demonstrează faptul că HDAC2 este un regulator cheie al sinaptogenezei şi al plasticităţii sinaptice. În plus, Guan şi colab. au arătat faptul că tratamentul cronic al şoarecilor cu SAHA (un inhibitor HDAC 1,2,3,6, 8) a reprodus efectele observate la şoarecii cu deficienţă de HDAC2 şi a recuzat deficienţa cognitivă la şoarecii cu supraexpresie de HDAC2. Inhibarea HDAC2 (în mod selectiv sau în combinaţie cu inhibarea altor HDAC de clasa I; ca ţintă primară sau ca parte a unui complex cu alte proteine) reprezintă o ţintă terapeutică atractivă. Inhibarea selectivă poate fi realizată prin ţintirea izoformelor HDAC specifice, cum ar fi HDAC2, izolat sau ca parte a unui complex multi-proteic funcţional. O astfel de inhibare are potenţialul de a îmbunătăţi cunoaşterea şi de a facilita procesul de învăţare prin creşterea densităţii sinaptice şi dendritice la populaţiile de celule neuronale. În plus, inhibarea HDAC-urilor specifice, cum ar fi HDAC2, poate fi, de asemenea, utilă din punct de vedere terapeutic în tratarea unei largi varietăţi de alte boli şi tulburări. WO 2012/149540 descrie inhibitori ai HDAC despre care se spune că sunt utili pentru promovarea funcţiei cognitive şi îmbunătăţirea învăţării şi formării memoriei. Wagner, F. F. şi colab., Chem. Sci., 2015, 804-815 descrie anumiţi inhibitori ai HDAC2.

REZUMAT

Variantele de realizare a invenţiei sunt definite în revendicări. Sunt dezvăluite compuşi şi săruri ale acestora acceptabile din punct de vedere farmaceutic şi compoziţii farmaceutice, care sunt utile în tratamentul afecţiunilor asociate cu activitatea HDAC (de exemplu HDAC2). (A se vedea, de exemplu, Tabelele 1 şi 2).

Compuşii dezvăluiţi furnizează un avantaj în siguranţa hematologică şi echilibrul general al potenţei, profilurilor ADME şi PK în comparaţie cu inhibitorii anteriori. De exemplu, simpla înlocuire a hidrogenului pentru metil între Comparatorul E şi Compusul 2 conduce la o scădere dramatică a inhibării CYP2D6. A se vedea, de exemplu, Tabelul 2. De asemenea, această înlocuire furnizează beneficii distincte PK faţă de analogul de pirimidină nesubstituit, prezentând un timp de înjumătăţire mai lung, clearance mai mic, biodisponibilitate mai mare şi o expunere de >5 ori mai mare a creierului. A se vedea, de exemplu, Tabelul 3. În mod similar, adăugarea unui atom de orto-fluor suplimentar a realizat un beneficiu semnificativ de siguranţă în liniile de celule progenitoare eritroide şi mieloide pentru Compusul 1 în raport cu Comparatorul I.A se vedea, de exemplu, Tabelul 5.

Compuşii descrişi produc, de asemenea, modificări în morfologia coloanei dendritice în regiunea CA1 a hipocampului dorsal la şoarecii de tip sălbatic. A se vedea, de exemplu, Tabelul 7. Măsurile morfologiei coloanei dendritice pot identifica agenţii farmacologici care sunt susceptibili de a promova sau distorsiona funcţia cognitivă normală şi protejează împotriva sau exacerbează tulburările cognitive.

Afecţiunile care pot fi tratate de compuşii dezvăluiţi includ, dar fără a se limita la, tulburări neurologice, tulburări sau afecţiuni ale memoriei sau ale funcţiei cognitive, tulburări de învăţare prin extincţie, boli sau infecţii fungice, boli inflamatorii, boli hematologice, boli neoplazice, tulburări psihiatrice şi pierderi de memorie.

DESCRIERE DETALIATĂ

1. Compuşi

În prezenta invenţie este furnizat un compus cu formula:

sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic:

2. Definiţii

Astfel cum sunt utilizaţi în prezenta invenţie, termenii "subiect" şi "pacient" pot fi utilizaţi în mod interschimbabil şi desemnează un mamifer care are nevoie de tratament, de exemplu animale de companie (de exemplu câini, pisici şi altele asemenea), animale de fermă (de exemplu vaci, porci, cai, oi, capre şi altele asemenea) şi animale de laborator (de exemplu şobolani, şoareci, porcuşori de guineea şi altele asemenea). De obicei, subiectul este un om care are nevoie de tratament.

Sunt incluse sărurile acceptabile din punct de vedere farmaceutic, precum şi formele neutre ale compuşilor descrişi în prezenta invenţie. Pentru utilizare în medicamente, sărurile compuşilor se referă la "săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic" netoxice. Formele de sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic includ săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic acide/anionice sau bazice/cationice. Sărurile acceptabile din punct de vedere farmaceutic bazice/cationice includ sărurile de sodiu, potasiu, calciu, magneziu, dietanolamină, n-metil-D-glucamină, L-lizină, L-arginină, amoniu, etanolamină, piperazină şi trietanolamină. Sărurile acceptabile din punct de vedere farmaceutic acide/anionice includ, de exemplu, acetat, benzensulfonat, benzoat, bicarbonat, bitartrat, carbonat, citrat, diclorhidrat, gluconat, glutamat, glicolilarsanilat, hexilresorcinat, bromhidrat, clorhidrat, malat, maleat, malonat, mesilat, nitrat, stearat, succinat, sulfat, tartrat şi tosilat.

Termenul "purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic" se referă la un purtător, adjuvant sau vehicul netoxic care nu distruge activitatea farmacologică a compusului cu care este formulat. Purtătorii, adjuvanţii sau vehiculele acceptabile din punct de vedere farmaceutic care pot fi utilizaţi în compoziţiile descrise în prezenta invenţie includ, dar fără a se limita la, schimbătoare de ioni, alumină, stearat de aluminiu, lecitină, proteine serice, cum ar fi albumină serică umană, substanţe tampon cum ar fi fosfaţi, glicină, acid sorbic, sorbat de potasiu, amestecuri parţiale de gliceride ale acizilor graşi vegetali saturaţi, apă, săruri sau electroliţi, cum ar fi sulfat de protamină, hidrogen fosfat disodic, hidrogen fosfat de potasiu, clorură de sodiu, săruri de zinc, siliciu coloidal, trisilicat de magneziu, polivinil pirolidonă, substanţe pe bază de celuloză, polietilen glicol, carboximetilceluloză de sodiu, poliacrilaţi, ceară, polimeri bloc de polietilen-polioxipropilenă, polietilen glicol şi grăsime de lână.

Termenii "tratament", "trata" şi "tratare" se referă la inversarea, atenuarea, reducerea probabilităţii de a dezvolta sau inhibarea progresului unei boli sau tulburări sau a unuia sau mai multor simptome ale acesteia, astfel cum este descris în prezenta invenţie. În unele variante de realizare, tratamentul poate fi administrat după ce s-au dezvoltat unul sau mai multe simptome, adică tratament terapeutic. În alte variante de realizare, tratamentul poate fi administrat în absenţa simptomelor. De exemplu, tratamentul poate fi administrat unui individ susceptibil înainte de apariţia simptomelor (de exemplu în lumina antecedentelor de simptome şi/sau în lumina factorilor genetici sau a altor factori de susceptibilitate), adică tratament profilactic. De asemenea, tratamentul poate fi continuat după ce simptomele s-au rezolvat, de exemplu pentru a preveni sau a întârzia reapariţia acestora.

Termenul "cantitate eficientă" sau "cantitate eficientă din punct de vedere terapeutic" include o cantitate dintr-un compus descris în prezenta invenţie care va provoca un răspuns biologic sau medical din partea unui subiect.

3. Utilizări, formulare şi administrare

În unele variante de realizare, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utili în tratarea afecţiunilor asociate cu activitatea HDAC. Astfel de afecţiuni includ, de exemplu, pe cele descrise mai jos.

Rapoarte recente au detaliat importanţa acetilării histonelor în funcţiile sistemului nervos central ("SNC"), cum ar fi diferenţierea neuronală, formarea memoriei, dependenţa de droguri şi depresia (Citrome, Psychopharmacol. Bull. 2003, 37, Suppl. 2, 74-88; Johannessen, CNS Drug Rev. 2003, 9, 199-216; Tsankova şi colab., 2006, Nat. Neurosci. 9, 519-525; Bousiges şi colab., 2013, PLoS ONE 8(3), e57816). Prin urmare, într-un aspect, compuşii şi compoziţiile furnizate pot fi utile în tratarea unei tulburări neurologice. Exemple de tulburări neurologice includ: (i) boli neurodegenerative cronice, cum ar fi degenerescenta lobară frontotemporală (demenţa frontotemporală, FTD), FTD-GRN, scleroza laterală amiotrofică familială şi sporadică (FALS şi respectiv SLA), boala Parkinson familială şi sporadică, demenţa rezultată din boala Parkinson, boala Huntington, boala Alzheimer familială şi sporadică, scleroză multiplă, distrofie musculară, atrofie olivopontocerebeloasă, atrofie sistemică multiplă, boala Wilson, paralizie supranucleară progresivă, boală difuză a corpului Lewy, degenerescenţă corticodentatonigrală, epilepsie mioclonică progresivă familială, degenerare strionigrală, distonie de torsiune, tremur familial, sindrom Down, sindrom Gilles de la Tourette, boala Hallervorden-Spatz, neuropatie periferică diabetică, demenţă pugilistică, demenţă rezultată din SIDA, demenţă asociată vârstei, tulburări de memorie asociate vârstei şi boli neurodegenerative asociate amiloidozei, cum ar fi cele cauzate de proteina prionică (PrP) care este asociată cu encefalopatia spongiformă transmisibilă (boala Creutzfeldt-Jakob, sindromul Gerstmann-Straussler-Scheinker, scrapie şi kuru) şi cele cauzate de acumularea excesivă de cistatină C (angiopatie ereditară de cistatină C); şi (ii) tulburări neurodegenerative acute, cum ar fi leziuni cerebrale traumatice (de exemplu leziuni cerebrale asociate intervenţiilor chirurgicale), edem cerebral, leziuni ale nervilor periferici, leziuni ale măduvei spinării, boala Leigh, sindrom Guillain-Barre, tulburări de depozitare lizozomală, cum ar fi lipofuscinoza, boala Alper, sindromul piciorului neliniştit, vertij ca urmare a degenerării SNC; patologii care apar din cauza abuzului cronic de alcool sau droguri inclusiv, de exemplu, degenerarea neuronilor din locus coeruleus şi cerebel, tulburări de mişcare induse de droguri; patologii care apar din cauza îmbătrânirii, inclusiv degenerarea neuronilor cerebeloşi şi a neuronilor corticali care conduce la deficienţe cognitive şi motorii; şi patologii care apar din cauza abuzului cronic de amfetamină, inclusiv degenerarea neuronilor ganglionari bazali care conduce la deficienţe motorii; modificări patologice rezultate din traumatisme focale, cum ar fi accident vascular cerebral, ischemie focală, insuficienţă vasculară, encefalopatie hipoxico-ischemică, hiperglicemie, hipoglicemie sau traume directe; patologii care apar ca efect secundar negativ al medicamentelor terapeutice şi al tratamentelor (de exemplu degenerarea neuronilor cortexului cingulat şi entorhinal ca răspuns la dozele anticonvulsivante ale antagoniştilor din clasa NMDA a receptorului glutamat) şi demenţa asociată Wernicke-Korsakoff. Tulburările neurologice care afectează neuronii senzoriali includ ataxia Friedreich, diabetul, neuropatia periferică şi degenerarea neuronală a retinei. Alte tulburări neurologice includ leziuni ale nervilor sau traume asociate cu leziuni ale măduvei spinării. Tulburările neurologice ale sistemului limbic şi cortical includ amiloidoza cerebrală, atrofia Pick şi sindromul Rett. Într-un alt aspect, tulburările neurologice includ tulburări de dispoziţie, cum ar fi tulburările afective şi anxietatea; tulburări ale comportamentului social, cum ar fi defecte de caracter şi tulburări de personalitate; tulburări de învăţare, memorie şi inteligenţă, cum ar fi retardul mintal şi demenţa. Prin urmare, într-un aspect, compuşii şi compoziţiile dezvăluite pot fi utile în tratarea schizofreniei, delirului, tulburării de hiperactivitate cu deficienţă de atenţie (ADHD), tulburării schizoafective, bolii Alzheimer, demenţei vasculare, sindromului Rubinstein-Taybi, depresiei, maniei, tulburărilor de deficienţă de atenţie, dependenţei de droguri, demenţei, demenţei care include manifestări BPSD, agitaţiei, apatiei, anxietăţii, psihozelor, tulburărilor de personalitate, tulburărilor bipolare, tulburării afective unipolare, tulburărilor obsesiv-compulsive, tulburărilor de alimentaţie, tulburărilor de stres posttraumatic, iritabilităţii, tulburării de comportament şi dezinhibare ale adolescenţilor. Acestea pot fi, de asemenea, utile pentru tinitus spontan, toxic, neoplazic, post-traumatic şi post-infecţios şi tulburări de miros.

Transcrierea este considerată a fi un pas cheie pentru formarea memoriei pe termen lung (Alberini, 2009, Physiol. Rev. 89, 121-145). Transcrierea este promovată de modificări specifice ale cromatinei, cum ar fi acetilarea histonelor, care modulează interacţiunile histonă-ADN (Kouzarides, 2007, Cell, 128:693-705), precum şi interacţiunile factor de transcripţie-ADN. Enzimele modificatoare, cum ar fi histon acetiltransferazele (HAT) şi histon deacetilazele (HDAC), reglează starea de acetilare pe cozile histonice. În general, acetilarea histonelor promovează expresia genetică, în timp ce deacetilarea histonelor conduce la reducerea la tăcere a genelor, deşi tratamentul cu inhibitori ai HDAC poate avea ca rezultat atât reglarea în sens ascendent, cât şi reglarea în sens descendent a nivelurilor de expresie ale genelor specifice. Numeroase studii au arătat faptul că o proteină puternică de legare a elementelor de răspuns HAT cAMP proteină de legare a elementului (CREB) (CBP), este necesară pentru forme de durată a plasticităţii sinaptice şi de memorie pe termen lung (pentru recenzie, a se vedea Barrett, 2008, Learn Mem 15:460-467). Prin urmare, într-un aspect, compuşii şi compoziţiile furnizate pot fi utile pentru promovarea funcţiei cognitive şi îmbunătăţirea învăţării şi formării memoriei.

Compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie pot fi, de asemenea, utilizate pentru tratarea bolilor sau infecţiilor fungice.

Într-un alt aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie pot fi utilizate pentru tratarea bolilor inflamatorii cum ar fi accident vascular cerebral, poliartrită reumatoidă, lupus eritematos, colită ulcerativă şi leziuni traumatice la nivelul creierului (Leoni şi colab., PNAS, 99(5); 2995-3000(2002); Suuronen şi colab. J. Neurochem. 87; 407-416 (2003) şi Drug Discovery Today, 10: 197-204 (2005).

Într-un alt aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie pot fi utilizate pentru tratarea unui cancer cauzat de proliferarea celulelor neoplazice. Astfel de cancere includ, de exemplu, tumori solide, neoplasme, carcinoame, sarcoame, leucemii, limfoame şi altele asemenea. Într-un aspect, cancerele care pot fi tratate de compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie includ, dar fără a se limita la: cancer cardiac, cancer pulmonar, cancer gastrointestinal, cancer al tractului genito-urinar, cancer hepatic, cancer al sistemului nervos, cancer ginecologic, cancer hematologic, cancer de piele şi cancer al glandelor suprarenale. Într-un aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea cancerelor cardiace selectate dintre sarcom (angiosarcom, fibrosarcom, rabdomiosarcom, liposarcom), mixom, rabdomiom, fibrom, lipom şi teratom. Într-un alt aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea cancerului pulmonar selectat dintre carcinom bronhogen (celule scuamoase, celule mici nediferenţiate, celule mari nediferenţiate, adenocarcinom), carcinom alveolar (bronhiolar), adenom bronşic, sarcom, limfom, hamartom condromat şi mezoteliom. Într-un aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea cancerului gastrointestinal selectat dintre esofag (carcinom cu celule scuamoase, adenocarcinom, leiomiosarcom, limfom), stomac (carcinom, limfom, leiomiosarcom), pancreas (adenocarcinom ductal, insulinom, glucagonom, gastrinom, tumori carcinoide, vipom), intestin subţire (adenocarcinom, limfom, tumori carcinoide, sarcom Kaposi, leiomiom, hemangiom, lipom, neurofibrom, fibrom) şi intestin gros (adenocarcinom, adenom tubular, adenom vilos, hamartom, leiomiom). Într-un aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea cancerului tractului genitourinar selectat dintre rinichi (adenocarcinom, tumoare Wilm [nefroblastom], limfom, leucemie), vezică urinară şi uretră (carcinom cu celule scuamoase, carcinom cu celule de tranziţie, adenocarcinom), prostată (adenocarcinom, sarcom) şi testicule (seminom, teratom, carcinom embrionar, teratocarcinom, coriocarcinom, sarcom, carcinom cu celule interstiţiale, fibrom, fibroadenom, tumori adenomatoide, lipom). Într-un aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea cancerului hepatic selectat dintre hepatom (carcinom hepatocelular), colangiocarcinom, hepatoblastom, angiosarcom, adenom hepatocelular şi hemangiom.

În unele variante de realizare, compuşii descrişi în prezenta invenţie sunt utili în tratarea cancerului osos selectat dintre sarcom osteogen (osteosarcom), fibrosarcom, histiocitom fibros malign, condrosarcom, sarcom Ewing, limfom malign (sarcom cu celule reticulare), mielom multiplu, cordom tumoral cu celule gigant maligne, osteocondrom (exostoze osteocartilaginoase), condrom benign, condroblastom, condromixofibrom, osteom osteoid şi tumori cu celule gigantice.

Într-un aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea cancerului sistemului nervos selectat dintre craniu (osteom, hemangiom, granulom, xantom, osteită deformantă), meninge (meningiom, meningiosarcom, gliomatoză), creier (astrocitom, meduloblastom, gliom, ependimom, germinom [pinealom], glioblastom multiform, oligodendrogliom, schwanom, retinoblastom, tumori congenitale) şi măduva spinării (neurofibrom, meningiom, gliom, sarcom).

Într-un aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea cancerului ginecologic selectat dintre uter (carcinom endometrial), col uterin (carcinom cervical, displazie cervicală pre-tumorală), ovare (carcinom ovarian [cistadenocarcinom seros, cistadenocarcinom mucinos, carcinom neclasificat], tumori cu celule granuloase-tecale, tumori cu celule Sertoli-Leydig, disgerminom, teratom malign), vulvă (carcinom cu celule scuamoase, carcinom intraepitelial, adenocarcinom, fibrosarcom, melanom), vagin (carcinom cu celule clare, carcinom cu celule scuamoase, sarcom botrioid (rabdomiosarcom embrionar) şi trompe uterine (carcinom). Într-un aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea cancerului de piele selectat dintre melanom malign, carcinom bazocelular, carcinom cu celule scuamoase, sarcom Kaposi, aluniţe nevi displazici, lipom, angiom, dermatofibrom, cheloizi şi psoriazis. Într-un aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea cancerului glandelor suprarenale selectat dintre neuroblastom. Într-un aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea cancerelor care includ, dar fără a se limita la: leucemii, inclusiv leucemii acute şi leucemii cronice, cum ar fi leucemia limfocitară acută (LLA), leucemia mieloidă acută (LMA), leucemia limfocitară cronică (LLC), leucemie mielogenă cronică (LMC) şi leucemie cu celule păroase; limfoame, cum ar fi limfoame cu celule T cutanate (LCTC), limfoame cu celule T periferice necutanate, limfoame asociate cu virusul limfrotropic al celulelor T umane (HTLV), cum ar fi leucemia/limfomul cu celule T adulte (LCTA), boala Hodgkin şi limfoame non-Hodgkin, limfoame cu celule mari, limfoame cu celule B mari difuze (LCBMD); limfom Burkitt; mezoteliom, limfom al sistemului nervos central primar (SNC); mielom multiplu; tumori solide în copilărie, cum ar fi tumori cerebrale, neuroblastom, retinoblastom, tumoare Wilm, tumori osoase şi sarcoame ale ţesuturilor moi, tumori solide comune la adulţi, cum ar fi cancere de cap şi gât (de exemplu oral, laringian şi esofagian), cancere genito-urinare (de exemplu prostată, vezica urinară, renal, uterin, ovarian, testicular, rectal si de colon), cancer pulmonar, cancer mamar, cancer pancreatic, melanom si alte cancere de piele, cancer al stomacului, tumori cerebrale, cancer hepatic si cancer tiroidian. Într-un aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea unei afecţiuni la un subiect, selectate dintre o tulburare neurologică, tulburare sau deficienţă a memoriei sau funcţiei cognitive, tulburare de învăţare a extincţiei, boală sau infecţie fungică, boală inflamatorie, boală hematologică, tulburări psihiatrice şi boală neoplazică. Într-un aspect, compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie sunt utile în tratarea unei afecţiuni selectate dintre a) o tulburare sau deficienţă a funcţiei cognitive asociată cu boala Alzheimer, boala Huntington, pierderea memoriei indusă de convulsii, schizofrenie, sindrom Rubinstein Taybi, sindrom Rett, X fragil, demenţă corporală Lewy, demenţă vasculară, degenerescenţă lobară fronto-temporală (demenţă frontotemporală, FTD), FTD-GRN, ADHD, dislexie, tulburare bipolară şi tulburări sociale, cognitive şi de învăţare asociate cu autism, leziuni traumatice ale capului, tulburări de deficienţă de atenţie, tulburări de anxietate, răspuns la frică condiţionat, tulburare de panică, tulburare obsesiv-compulsivă, tulburare de stres posttraumatic (PTSD), fobie, tulburare de anxietate socială, recuperare în urma dependenţei de substanţe, deficienţă a memoriei asociată vârstei (AAMI), declin cognitiv asociat vârstei (ARCD), ataxie sau boala Parkinson; b) o boală hematologică selectată dintre leucemie mieloidă acută, leucemie promielocitară acută, leucemie limfoblastică acută, leucemie mielogenă cronică, sindroame mielodisplazice şi siclemie; c) o boală neoplazică; şi d) o tulburare de învăţare a extincţiei selectată dintre extincţia fricii şi tulburare de stres post-traumatic. Într-un aspect, afecţiunea tratată de compuşii şi compoziţiile descrise în prezenta invenţie este boala Alzheimer, boala Huntington, demenţa frontotemporală, ataxia Freidreich, tulburarea de stres post-traumatică (PTSD), boala Parkinson, depresia sau recuperarea în urma dependenţei de substanţe. Într-un aspect, prezenta dezvăluire furnizează un procedeu de tratare a unei afecţiuni descrise în prezenta invenţie, care cuprinde administrarea la un subiect a unei cantităţi eficiente dintr-un compus, sau o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic descrisă în prezenta invenţie sau o compoziţie a acestuia. De asemenea, este furnizată utilizarea unuia sau mai multor compuşi sau a sărurilor acestora acceptabile din punct de vedere farmaceutic descrise în prezenta invenţie sau a unei compoziţii furnizate, pentru tratarea unei afecţiuni descrise în prezenta invenţie. De asemenea, este furnizată utilizarea unuia sau mai multor compuşi sau a sărurilor acestora acceptabile din punct de vedere farmaceutic descrise în prezenta invenţie pentru fabricarea unui medicament pentru tratarea unei afecţiuni descrise în prezenta invenţie. Subiecţii pot fi de asemenea selectaţi dacă suferă de una sau mai multe dintre afecţiunile descrise înainte de începerea tratamentului cu unul sau mai mulţi dintre compuşii descrişi sau săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic sau compoziţii. Prezenta dezvăluire furnizează, de asemenea, compoziţii acceptabile din punct de vedere farmaceutic care cuprind un compus descris în prezenta invenţie sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic; şi un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic. Aceste compoziţii pot fi utilizate pentru a trata una sau mai multe dintre afecţiunile descrise anterior. Compoziţiile descrise în prezenta invenţie pot fi administrate pe cale orală, parenterală, prin pulverizare prin inhalare, topic, rectal, nazal, bucal, vaginal sau printr-un rezervor implantat. Termenul "parenteral" astfel cum este utilizat în prezenta invenţie include tehnici de injectare sau perfuzare subcutanată, intravenoasă, intramusculară, intraarticulară, intrasinovială, intrasternală, intratecală, intrahepatică, intralezională şi intracraniană. Formele de dozare lichide, preparatele injectabile, formele de dispersie solide şi formele de dozare pentru administrarea topică sau transdermică a unui compus sunt incluse în prezenta invenţie. Cantitatea de compuşi furnizaţi care pot fi combinaţi cu materiale purtător pentru a produce o compoziţie într-o formă de dozare unică va varia în funcţie de pacientul care urmează să fie tratat şi de modul particular de administrare. În unele variante de realizare, compoziţiile furnizate pot fi formulate astfel încât o doză între 0,01 - 100 mg/kg greutate corporală/zi din compusul furnizat, cum ar fi, de exemplu, 0,1 - 100 mg/kg greutate corporală/zi, să poată fi administrată unui pacient care primeşte aceste compoziţii. De asemenea, trebuie să se înţeleagă faptul că o doză şi un regim de tratament specific pentru orice pacient anume vor depinde de o varietate de factori, inclusiv vârsta, greutatea corporală, starea generală de sănătate, sexul, dieta, timpul de administrare, rata de excreţie, combinaţia de medicamente, raţionamentul medicului curant şi severitatea bolii particulare care este tratată. Cantitatea de compus furnizat în compoziţie va depinde de asemenea de compusul particular din compoziţie.

EXEMPLIFICARE

Spoturile au fost vizualizate cu lumină UV (254 şi 365 nm). Purificarea prin coloană şi cromatografie rapidă a fost efectuată utilizând silicagel (200-300 ochiuri). Sistemele de solvenţi sunt raportate sub formă de raportul solvenţilor.

Spectrele RMN au fost înregistrate pe un spectrometru Bruker 400 (400 MHz). Schimbările chimice 1H sunt raportate în valori δ în ppm cu tetrametilsilan (TMS, = 0,00 ppm) în calitate de standard intern. A se vedea, de exemplu, datele furnizate în Tabelul 1.

Spectrele CLSM au fost obţinute pe un spectrometru de masă Agilent 1200 seria 6110 sau 6120 cu modul de ionizare ESI (+). A se vedea, de exemplu, datele furnizate în Tabelul 1.

Exemplul 1

Sinteza SM-A.

La un amestec de 6-cloro-3-nitropiridin-2-amină (4,58 g, 26,4 mmoli), acid 2,4-fluorofenilboronic (5,00 g, 31,7 mmoli) şi Cs2CO3 (25,73 g, 79,2 mmoli) în dioxan/H2O (100 mL/10 mL) s-a adăugat Pd(PPh3)4 (1,10 g, 0,95 mmoli) sub atmosferă de N2. Amestecul s-a agitat la 100 °C timp de 2 ore şi apoi s-a concentrat în vid. Restul s-a dizolvat cu EtOAc (200 mL) şi soluţia s-a spălat cu soluţie salină (100 mL × 3). Stratul organic s-a uscat pe Na2SO4 anhidru şi apoi s-a concentrat în vid. Restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (PE : EtOAc = 7 : 1 ∼ 5 : 1) pentru a rezulta SM-A (4,0 g, 61%) sub formă de solid galben. MS 252,1 [M + H]+.

Sinteza SM-B.

La o soluţie sub agitare de SM-A (4,0 g, 15,94 mmoli) în piridină (60 mL) s-a adăugat prin picurare carbonocloridat de fenil (7,50 g, 47,81 mmoli) la 0 °C. După finalizarea adăugării, amestecul s-a agitat la 50 °C timp de 4 ore. Amestecul s-a concentrat în vid. Restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (PE : DCM = 3: 2 ∼ 1 : 1) pentru a rezulta SM-B (7,1 g, 91%) sub formă de solid galben. MS 492,1 [M + H]+.

Sinteza 1672-1.

La o soluţie de prop-2-in-1-amină (5,0 g, 90,9 mmoli) şi Et3N (18,4 g, 181,8 mmoli) în DCM (100 mL) s-a adăugat (Boc)2O (23,8 g, 109,1 mmoli) prin picurare în timp ce se răceşte amestecul de reacţie cu o baie de gheaţă. Amestecul rezultat s-a îndepărtat din baia de gheaţă odată ce s-a finalizat adăugarea şi apoi s-a agitat la temperatura camerei timp de 16 ore. Atunci când reacţia s-a finalizat, amestecul s-a diluat cu DCM (200 mL), s-a spălat cu soluţie salină (100 mL x 3) şi stratul organic s-a uscat pe Na2SO4 anhidru şi apoi s-a concentrat în vid. Restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (PE : EtOAc = 100 : 1 ∼ 10 : 1) pentru a rezulta 1672-1 (10 g, 71%) sub formă de ulei incolor. MS 178,3 [M + 23]+, 100,3 [M - 56]+.

Sinteza 1672-2.

La o soluţie de 1672-1 (10 g, 64,5 mmoli) în DMF (200 mL) s-a adăugat NaH (60% în ulei mineral) (2,84 g, 71 mmoli) lent sub baie de gheaţă. Amestecul rezultat s-a agitat la temperatura camerei timp de 1 oră, după care s-a adăugat 3-bromoprop-1-ină (9,2 g, 77,4 mmoli) în amestecul menţionat anterior, apoi amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura camerei timp de 2 ore. Amestecul de reacţie s-a stins cu apă (500 mL) şi apoi s-a extras cu t-BuOMe (250 mL × 3). Straturile organice combinate s-au spălat cu soluţie salină (200 mL × 3), s-au uscat pe Na2SO4 anhidru şi apoi s-au concentrat în vid. Restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (PE : EtOAc = 100 : 1 ∼ 10 : 1) pentru a rezulta 1672-2 (12 g, 96%) sub formă de ulei galben. MS 138,1 [M - 56]+.

Sinteza 1672-3.

La o soluţie de 2-cloracetonitril (3,13 g, 41,4 mmoli) şi [Cp∗RuCl(cod)] (394 mg, 1,0 mmol) în DCE (40 mL) s-a adăugat o soluţie de 1672-2 (4,0 g, 20,7 mmoli) în DCE (80 mL) prin picurare timp de 30 de minute sub atmosferă de N2. Amestecul rezultat s-a agitat la 40 °C timp de 16 ore. Solventul s-a îndepărtat în vid şi restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (PE : EtOAc = 10 : 1 ∼ 2 : 1) pentru a rezulta 1672-3 (2,1 g, 22%) sub formă de solid kaki. MS 269,3 [M + H]+.

Sinteza 1672-4.

La o soluţie de MeOH (30 mL) s-a adăugat NaH (60% în ulei mineral) (940 mg, 23,5 mmoli) pe baie de gheaţă şi s-a agitat timp de 30 de minute. Apoi s-a adăugat 1672-C (2,1 g, 7,8 mmoli) în amestecul menţionat anterior şi s-a agitat la 35 °C timp de 16 ore. Amestecul s-a stins cu apă (30 mL), s-a extras cu DCM (10 mL × 3). Straturile organice combinate s-au spălat cu soluţie salină (10 mL × 3), s-au uscat pe Na2SO4 anhidru şi apoi s-au concentrat în vid. Restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (PE : EtOAc = 100 : 1 ∼ 10 : 1) pentru a rezulta 1672-4 (1,8 g, 94%) sub formă de solid cafeniu. MS 265,1 [M + H]+.

Sinteza 1672-5.

La o soluţie de 1672-4 (120 mg, 0,45 mmoli) în DCM (6 mL) răcită într-o baie de gheaţă s-a adăugat TFA (2 mL) prin picurare. Amestecul de reacţie rezultat s-a agitat la temperatura camerei timp de 1 oră, după care solventul s-a îndepărtat în vid pentru a rezulta 1672-5 sub formă de produs brut care a fost trecut la etapa următoare fără purificare suplimentară. MS 165,1 [M + H]+.

Sinteza 1672-6.

La un amestec de 1672-5 (0,45 mmoli, produsul brut din ultima etapă) şi SM-B (150 mg, 0,30 mmoli) în DMSO (10 mL) s - a adăugat Na2CO3 (259 mg, 3,44 mmoli) şi amestecul de reacţie rezultat s-a agitat la 25 °C timp de 2 ore. Amestecul s-a diluat cu apă (30 mL) şi s-a extras cu EtOAc (20 mL × 3). Stratul organic combinat s-a spălat cu soluţie salină (10 mL × 3), s-a uscat pe Na2SO4 anhidru şi apoi s-a concentrat în vid. Restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (DCM : MeOH = 100 : 1 ∼ 30 : 1) pentru a rezulta 1672-6 (120 mg, 89%) sub formă de solid galben. MS 442,1 [M + H]+.

Sinteza Compusului 1.

Un amestec de 1672-6 (120 mg, 0,27 mmoli) şi Pd/C (120 mg) în MeOH (10 mL) s-a agitat la temperatura camerei timp de 1 oră sub atmosferă de H2. Apoi, Pd/C s-a îndepărtat prin filtrare prin celite. Filtratul s-a concentrat şi restul s-a purificat prin Prep-TLC (DCM : MeOH = 15 : 1) pentru a rezulta Compusul 1 (70 mg, 70%) sub formă de solid galben. MS 412,1 [M + H]+, 434,1 [M + 23]+.

Exemplul 2

Sinteza 156-A.

La un amestec de 6-cloro-3-nitropiridin-2-amină (10,00 g, 57,6 mmoli), acid tiofen-2-ilboronic (8,12 g, 63,4 mmoli) şi Cs2CO3 (37,56 g, 115,2 mmoli) în dioxan/H2O (200 mL/20 mL) s-a adăugat Pd(PPh3)4 (2,44g, 2,88 mmoli) sub atmosferă de N2. Amestecul s-a agitat la 95 °C timp de 2 ore şi apoi s-a concentrat în vid. Restul s-a dizolvat cu EtOAc (200 mL) şi soluţia s-a spălat cu soluţie salină (100 mL × 3). Stratul organic s-a uscat pe Na2SO4 anhidru şi apoi s-a concentrat în vid. Restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (PE : EtOAc = 5 : 1 ∼ 3 : 1) pentru a rezulta 156-A (10,0 g, 79%) sub formă de solid galben

Sinteza 156-B.

La o soluţie agitată de 156-A (1,30 g, 5,88 mmoli) în piridină (20 mL) s-a adăugat prin picurare carbonocloridat de fenil (2,29 g, 14,7 mmoli). După finalizarea adăugării, amestecul s-a încălzit până la 50 °C şi s-a agitat timp de 4 ore. Apoi amestecul s-a concentrat în vid, iar restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (PE : EtOAc = 8: 1 ∼ 3 : 1) pentru a rezulta 156-B (2,4 g, 89%) sub formă de solid galben.

Sinteza 213-A.

O soluţie de 3-oxopirolidin-1-carboxilat de terţ-butil (150,0 g, 809,8 mmoli) şi DMF-DMA (289,5 g, 2,4 moli) în THF (1500 mL) s-a agitat la 70 °C timp de 16 ore. Soluţia s-a concentrat în vid pentru a rezulta 213-A sub formă de produs brut, care s-a utilizat direct în etapa următoare fără purificare suplimentară.

Sinteza 213-B.

La o soluţie de 213-A (809,8 mmoli, produsul brut din ultima etapă) în EtOH (1000 mL) s -a adăugat Et3N (409.7 g, 4,0 moli) şi clorhidrat de acetimidamidă (306,2 g, 3,2 moli). Soluţia rezultată s-a încălzit până la 80 °C timp de 24 de ore. După ce amestecul s-a răcit până la temperatura camerei, amestecul s-a diluat cu apă (500 mL) şi s-a extras cu DCM (500 mL x 3). Stratul organic combinat s-a spălat cu soluţie salină (500 mL × 3), s-a uscat pe Na2SO4 anhidru şi apoi s-a concentrat în vid. Restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (PE : DCM = 10 : 1 ∼ 1 : 2) pentru a rezulta 213-B (105,0 g, 55%) sub formă de solid brun.

Sinteza 213-C.

La o soluţie de 213-B (105,0 g, 446,3 mmoli) în DCM (1000 mL) s-a adăugat TFA (333 mL) prin picurare. Amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura camerei timp de 1 oră, după care soluţia s-a concentrat în vid pentru a rezulta 213-C sub formă de produs brut care s-a utilizat direct în etapa următoare.

Sinteza 213-D.

Un amestec de 213-C (325,1 mmoli, produsul brut din ultima etapă) şi 156-B (75,0 g, 162,5 mmoli) în DMSO (750 mL) s-a agitat la temperatura camerei timp de 10 minute, apoi, s-a adăugat Na2CO3 (137,8 g, 1,3 moli) şi amestecul de reacţie s-a agitat la temperatura camerei timp de 2 ore. Apoi amestecul s-a diluat cu apă (1000 mL) şi s-a extras cu EtOAc (500 mL × 3). Straturile organice combinate s-au spălat cu soluţie salină (500 mL × 3), s-au uscat pe Na2SO4 anhidru şi apoi s-au concentrat în vid. Restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (PE : EA = 10 : 1 ∼ 1 : 2) pentru a rezulta 213-D (44,0 g, 71%) sub formă de solid galben.

Sinteza Compusului 2.

Un amestec de 213-D (44,0 g, 115,1 mmoli) şi Pd/C (22,0 mg) în MeOH (250 mL) şi DCM (250 mL) s-a agitat la temperatura camerei timp de 1 oră sub atmosferă de H2. Pd/C s-a îndepărtat prin filtrare prin Celite. Filtratul s-a concentrat in vacuo şi restul s-a purificat prin cromatografie pe coloană pe silicagel (DCM : MeOH = 50 : 1 ∼ 15 : 1) pentru a rezulta Compusul 2 (26,0 g, 64%) sub formă de solid galben deschis.

Tabelul 1. Date spectrometrice pentru Compuşi

Nr. Structură SM calc. SM constatată Date 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 1 411 412 δ 8,58 (s, 1 H), 8,53 (s, 1 H), 7,97 - 7,91 (m, 1H), 7,44 - 7,40 (m, 2H), 7,32 - 7,26 (m, 1H), 7,18 - 7,13 (m, 2H), 5,28 (s, 2H), 4,82 (s, 4H), 4,52 (s, 2H), 3,38 (s, 3H). 2 352 353 δ 8,70 (s, 1H), 8,60 (s, 1H), 7,53 - 7,47 (m, 2H), 7,42 - 7,40 (q, J = 4,0 Hz, 1H), 7,13 - 7,07 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 7,06 - 7,05 (t, J = 1,2 Hz, 1H), 5,18 (s, 2H), 4,78 - 4,75 (d, J = 10,4 Hz, 4H), 2,64 (s, 3H).

Procedee generale de testare

Test enzimatic HDAC2 şi HDAC1

În cele ce urmează este descris un protocol de testare pentru măsurarea deacetilării unui substrat peptidic de către enzimele HDAC2 sau HDAC1.

Toate HDAC umane recombinante s-au achiziţionat de la BPS Bioscience. Substratul, FAM-TSRHK(AC)KL-CONH, s-a sintetizat la NanoSyn. Reacţiile finale de testare au conţinut 100 mM HEPES (pH 7,5), 50 mM KC1, 0,1% BSA, 0,01% Triton X-100, 1% DMSO, 1 uM substrat şi 5 nM enzimă HDAC. Enzima şi compuşii s-au pre-incubat la 25 °C timp de 5 ore şi reacţiile s-au iniţiat prin adăugarea de substrat. 10 uL reacţii s-au incubat timp de 17 ore la 25 °C şi s-au finalizat prin adăugarea de 40 uL tampon care conţine 100 mM HEPES (pH 7,5), 0,1% BSA, 0,01% Triton X-100 şi 0,05% SDS. Substratul şi peptidele produşilor prezente în fiecare probă s-au separat electroforetic utilizând instrumentul de electroforeză capilară LabChip 3000. Modificarea intensităţii relative a fluorescenţei substratului şi a cantităţilor maxime de produs reflectă activitatea enzimatică. Progresul reacţiei s-a determinat ca raport produs-sumă (PSR): P/(S+P), unde P reprezintă înălţimea maximă a peptidei produsului şi S reprezintă înălţimea maximă a peptidei substratului. Reacţiile s-au efectuat în duplicat la 12 concentraţii, (3X diluţii în serie începând cu 30 uM). Valorile IC50 s-au calculat utilizând un model logistic cu 4 parametri.

Testul de inhibiţie enzimatică HDAC2 în lizat de celule SY5Y cu substrat HDAC-Glo2

Cultura celulară şi tratamente cu inhibitori

Celulele SH-SY5Y (Sigma) s-au cultivat în mediu esenţial modificat de la Eagle suplimentat cu 10% ser fetal bovin şi pen/strep. Cu douăzeci şi patru de ore înainte de dozarea compusului, 20 uL celule s-au placat în plăci albe cu 384 godeuri la o densitate de 1.500 celule/godeu. Compuşii s-au diluat în serie în DMSO simplu şi apoi s-au diluat 1:100 v/v în mediu fără FBS şi s-au amestecat. Mediul s-a îndepărtat din celulele placate şi s-au adăugat compuşii diluaţi în mediu fără ser (1% v/v DMSO final) şi s-au incubat la 37 °C timp de cinci ore. Apoi, s-a adăugat zece uL reactiv HDAC-Glo 2 cu 0,1% Triton X-100, placa s-a amestecat şi s-a lăsat să se dezvolte la temperatura camerei timp de 100 minute. Apoi, plăcile s-au citit cu un luminometru Spectramax LMax utilizând un timp de integrare de 0,4 s. Curbele de răspuns la doză s-au construit cu date normalizate în care CI-994 la 100 uM s-a definit ca inhibare 100% şi DMSO singur ca inhibare 0%.

Testul UFC eritroide şi mieloide

Compuşii au fost testaţi pentru a evalua efectele potenţiale asupra progenitorilor eritroizi şi mieloizi umani utilizând teste de celule formatoare de colonii. Progenitorii clonogeni ai liniilor eritroide umane (CFU-E, BFU-E), granulocite-monocite (CFU-GM) şi multipotenţiale (CFU-GEMM) au fost evaluaţi într-o formulare de mediu semisolidă pe bază de metilceluloză care conţine rhIL-3 (10 ng/mL), rhGM-SCF (10 ng/mL), rhSCF (50 ng/mL) şi Epo (3 U/mL).

Celule

Celulele normale cu densitate uşoară ale măduvei osoase umane derivate din măduva osoasă normală (NorCal Biologics, California) şi calificate la ReachBio, au fost stocate în faza gazoasă a azotului lichid (-152°C) până când au fost necesare pentru test. În ziua experimentului, celulele au fost dezgheţate rapid, conţinutul fiecărui flacon a fost diluat în 10 mL de mediu Dulbecco modificat de la Iscove, care conţine 10% ser fetal bovin (IMDM + 10% FBS) şi a fost spălat prin centrifugare (aproximativ 1200 rpm timp de 10 minute, temperatura camerei). Supernatantul a fost aruncat şi peletele celulare au fost resuspendate într-un volum cunoscut de IMDM + 10% FBS. A fost efectuată o numărare de celule (3% acid acetic glacial) şi o evaluare a viabilităţii (testul de excludere cu albastru tripan) pentru proba de măduvă osoasă.

Compuşi

În ziua experimentului, compuşii au fost dizolvaţi în DMSO la o concentraţie stoc de 10 mM. S-au preparat diluţii în serie din concentraţia stoc pentru a obţine concentraţii de 2 şi 0,4 mM. Atunci când se adaugă în mediul pe bază de metilceluloză la 1:1000 (v/v), au fost atinse concentraţiile finale de testare de 10, 2 şi 0,4 µM. În plus, 5-FU a fost evaluat la 1,0, 0,1 şi 0,01 µg/mL.

Rezumatul procedeului

Progenitorii clonogeni ai liniilor eritroide umane (CFU-E şi BFU-E) şi mieloide (CFU-GM) au fost formaţi în formulările de mediu pe bază de metilceluloză descrise anterior. Toţi compuşii au fost adăugaţi în mediu pentru a rezulta concentraţiile finale dorite (10, 2 şi 0,4 μM). 5-Fluorouracil (Sigma Aldrich) a fost utilizat ca martor pozitiv pentru proliferarea progenitorilor (inhibarea creşterii coloniilor) şi a fost introdus în culturile de măduvă osoasă umană la 1,0, 0,1 şi 0,01 µg/mL. Au fost de asemenea iniţiate culturi martor cu solvent (care nu conţin compus, dar conţin 0,1% DMSO), precum şi martori standard (care nu conţin compus şi nici DMSO).

Testele umane mieloide şi eritroide progenitoare au fost iniţiate la 2,0 × 104 celule per cultură. După 14 zile de cultură, coloniile mieloide şi eritroide au fost evaluate din punct de vedere microscopic şi au fost marcate de către personalul instruit. Coloniile au fost împărţite în următoarele categorii în funcţie de dimensiune şi morfologie: CFU-E, BFU-E, CFU-GM şi CFU-GEMM

Analize statistice ale numerelor CFC

Media ± o abatere standard a trei culturi replicate a fost calculată pentru progenitorii din fiecare categorie (CFU-E, BFU-E etc.). Au fost efectuate teste t cu două cozi pentru a evalua dacă a existat o diferenţă în numărul de colonii generate între martorul cu solvent şi culturile tratate. Datorită subiectivităţii potenţiale a enumerării coloniilor, o valoare p mai mică de 0,01 este considerată semnificativă. Pentru a calcula concentraţia de inhibare de 50% a creşterii coloniilor (ICso) pentru fiecare compus, a fost generată o curbă de răspuns la doză, reprezentând logul concentraţiei de compus faţă de procentul de creştere a coloniei martor utilizând software-ul XLfit (IDBS). Concentraţia de 50% inhibare a creşterii coloniilor (IC50) a fost calculată pe baza ajustării curbei sigmoide utilizând modelul doză-răspuns, un singur situs formula: y = A + [(B - A)/(1 + ((C/x) ^ D))], unde A = valoarea iniţială (răspunsul de bază), B = răspuns maxim, C = centru (concentraţia de medicament care provoacă un răspuns la jumătatea distanţei dintre A şi B) şi D= panta curbei în punctul mijlociu. În plus, grafice şi curbe suplimentare de răspuns la doză au fost generate utilizând GraphPad Prism 7.0.

Evaluarea morfologică a coloniilor

Au fost făcute fotografii ale coloniilor reprezentative derivate din progenitor hematopoietic din diferite linii, ilustrând colonii în prezenţa martorului cu solvent, precum şi colonii în prezenţa compuşilor de testat.

Enumerarea coloniilor eritroide (CFU-E şi BFU-E), mieloide (CFU-GM) şi cu potenţial multiplu (CFU-GEMM) a fost efectuată de către personalul instruit. A fost analizată distribuţia tipurilor de colonii, precum şi a coloniei generale şi a morfologiei celulare. Pentru analiza statistică, numerele de colonii din culturile tratate cu compus au fost comparate cu culturile martor cu solvent. 5-FU a fost utilizat ca martor pozitiv pentru toxicitate în aceste teste şi efectele inhibitoare obţinute pentru acest compus au fost exact cele aşteptate. Experimentul a fost utilizat pentru a evalua efectul potenţial al compuşilor de testat asupra proliferării eritroidei umane şi a progenitorilor mieloizi într-un mediu pe bază de metilceluloză. Valorile ICso au fost calculate din XLfit. Curbele de răspuns la doză pentru toxicitatea eritroidă şi mieloidă generate de XLfit. În cele din urmă, potrivirea curbei de regresie neliniară şi ICsos ± 95% CI, au fost calculate prin Prism 7.0.-GEMM.

Testul de inhibare a CYP

Compuşii au fost testaţi pentru a evalua potenţialul inhibitor al acestora asupra CYP2D6 şi CYP3A4 (midazolam) utilizând microzomi hepatici umani. Microzomii hepatici umani au fost obţinuţi de la BD Gentest şi fiecare compus a fost rulat în duplicat.

Compuşii de testat şi inhibitorii de referinţă (chinidină pentru 2D6, ketoconazol pentru 3A4) au fost placaţi pe o placă cu 96 de godeuri prin transferul a 8 µL de 10 mM soluţii stoc de compus în DMSO la 12 µL de acetonitril. Au fost preparate soluţii de dozare cu inhibitor individual pentru CYP2D6 şi CYP3A4 (8 µL de stoc de DMSO adăugat la 12 µL de acetonitril). Apoi s-au adăugat 400 µL de 0,2 mg/mL HLM în godeurile de analiză şi apoi s-au adăugat 2 µL de 400 x compus de testare în godeurile desemnate pe gheaţă. Apoi, s-au adăugat 200 µL de 0,2 mg/mL HLM în godeurile de analiză şi apoi s-a adăugat 1 µL de soluţii de inhibitor de referinţă în godeurile desemnate. Următoarele soluţii au fost adăugate (în duplicat) pe o placă de analiză cu 96 de godeuri pe gheaţă: Compuşii de testat şi inhibitorii de referinţă (chinidină pentru 2D6, ketoconazol pentru 3A4) au fost testaţi utilizând următoarea procedură experimentală:

1. Se prepară compusul de testat şi inhibitorii de referinţă (400 ×) într-o placă cu 96 de godeuri:

1.1. Se transferă 8 µL de 10 mM compuşi de testat la 12 µL de ACN.

1.2. Se prepară soluţie de dozare cu inhibitor individual pentru CYP3A4, CYP2D6: 8 µL de stoc de DMSO la 12 µL de ACN.

2. Se prepară 4 × cofactor NADPH (66,7 mg NADPH în 10 mL tampon K 0,1 M, pH 7,4)

3. Se prepară 4 × substrat (2 mL pentru fiecare izoformă) astfel cum este indicat în tabelul de mai jos (de adaugă HLM acolo unde este necesar pe gheaţă).

4. Se prepară 0,2 mg/mL soluţie HLM (10 µL din 20 mg/mL la 990 µL de tampon K 0,1 M) pe gheaţă.

5. Se adaugă 400 µL de 0,2 mg/mL HLM în godeurile de analiză şi apoi se adaugă 2 µL de 400 x compus de testare în godeurile desemnate pe gheaţă.

6. Se adaugă 200 µL de 0,2 mg/mL HLM în godeurile de analiză şi apoi se adaugă 1 µL de soluţie de inhibitor de referinţă în godeurile desemnate.

7. Se adaugă următoarele soluţii (în duplicat) într-o placă de analiză cu 96 de godeuri pe gheaţă:

7.1. Se adaugă 30 µL de 2 × compus de testat şi compus de referinţă în 0,2 mg/mL soluţie HLM;

7.2. Se adaugă 15 µL de 4 x soluţie de substrat.

8. Se preincubează placa de analiză cu 96 de godeuri şi soluţia de NADPH la 37 °C timp de 5 minute.

9. Se adaugă 15 µL de soluţie NADPH 8 mM preîncălzită în plăcile de testare pentru a iniţia reacţia

10. Se incubează placa de analiză la 37 °C. 5 minute pentru 3A4, 10 minute pentru 2D6.

11. Se opreşte reacţia prin adăugarea a 120 µL de ACN care conţine standard intern. Pentru CYP3A4, standardul intern este 1'OH-midazolam-D4 (10 µM soluţie diluată până la o concentraţie finală de 0,1 µM prin adăugarea de 100 µL stoc standard intern la 10 mL ACN). Pentru CYP2D6, standardul intern este 1-OH-Bufuralol-maleat-[D9] (49 µM soluţie diluată până la o concentraţie finală de 0,1 µM prin adăugarea a 20 µL stoc standard intern la 10 mL ACN).

12. După stingere, de scutură plăcile la vibrator (IKA, MTS 2/4) timp de 10 minute (600 rpm/min) şi apoi se centrifughează la 5594 g timp de 15 minute (Thermo Multifuge × 3R).

13. Se transferă 50 µL de supernatant din fiecare godeu într-o placă de analiză cu 96 de godeuri care conţine 50 µL de apă ultrapură (Millipore, ZMQS50F01) pentru analiza prin CL/SM.

Evaluarea inhibării izoformei CYP este după cum urmează, pe baza rezultatelor testului: dacă procentul de inhibare a CYP este mai mare de 50%, indică o inhibare puternică; dacă procentul de inhibare a CYP este între 30 - 50%, indică o inhibare uşoară; dacă procentul de inhibare a CYP este mai mic de 30%, indică o inhibare uşoară sau deloc. Dacă procentul de inhibare a CYP este mai mic de -30%, aceasta indică faptul că compusul poate avea un fel de activare a acestei izoforme.

Măsurarea solubilităţii cinetice apoase

Compuşii au fost evaluaţi pentru solubilitatea cinetică a acestora în tampon sau apă. Alicote de 8 µL de soluţii stoc de referinţă şi compus de testat (10 mM în DMSO) au fost adăugate în 792 µL tampon de 100 mM fosfat (0,1 M NaPO4, pH 7,4). Concentraţia finală de DMSO este 1%. Tuburile cu probe au fost agitate timp de 1 oră (1000 rpm) la temperatura camerei. O curbă de calibrare a fost preparată utilizând 300 µM soluţie de dozare (SS) în MeOH/ACN(4:1) (SS = se adaugă 6 µL 10 mM compus în 194 µL MeOH/ACN(4:1)). Probele au fost centrifugate timp de 10 minute (12000 rpm) pentru a precipita particulele nedizolvate, iar supernatanţii au fost transferaţi într-un tub sau o placă nouă. Supernatanţii au fost diluaţi de 10 ori şi de 100 de ori cu tampon 100 mM. Probele au fost apoi pregătite pentru analiză prin CL-SM/SM (Se adaugă 5 µL de probe de compus (nediluate, diluate de 10 ori şi diluate de 100 de ori) şi probe de curbă standard la 95 µL de ACN care conţine standard intern. Standardele interne utilizate sunt Propranolol, Ketoconazol şi Tamoxifen.

Evaluarea expunerii creierului şi a plasmei pentru compuşi după administrarea intravenoasă (IV) şi orală (PO) la şoareci

Compuşii au fost dozaţi la şoareci la 10 mg/kg sau 30 mg/kg PO şi au fost dozaţi la 1 mg/kg IV. Trei animale pentru recoltare la fiecare moment pentru plasmă prin sângerare la 0,25, 0,5, 1, 4, 12 şi 24 de ore. Sângerare terminală pentru plasmă şi recoltare de probe pentru creier la 0,25, 0,5, 1, 4, 12 şi 24 de ore (de asemenea, trei animale per grup de moment de expunere a creierului). În total, şase momente pentru plasmă şi şase momente pentru creier.

Recoltare de probe:

Plasmă: animalul a fost reţinut manual la momentele desemnate, s-a recoltat aproximativ 150 µL sânge/moment într-o eprubetă K2EDTA prin puncţie orbitală retro sau puncţie cardiacă sub anestezie cu izofluran. Proba de sânge a fost centrifugată (2000 g, 4 °C, 5 minute) pentru a genera plasmă în 30 de minute după sângerare.

Creier: La momentele desemnate, a fost efectuată o incizie pe linia mediană în scalpul animalelor şi pielea a fost retrasă. Utilizând mici tăietoare de oase şi rongeurs, s-a îndepărtat craniul de deasupra creierului. Se îndepărtează creierul utilizând o spatulă şi se clăteşte cu soluţie salină rece. S-a plasat creierul în eprubete cu capac cu şurub şi apoi s-au depozitat eprubetele la -70 °C până la analiză.

Anumite avantaje ale Compuşilor 1 şi 2

Din punct de vedere al descoperirii de medicamente, este important ca compuşii să aibă profiluri acceptabile asemănătoare medicamentelor într-o serie de parametri. Este tipică profilarea compuşilor nu numai pentru potenţa in vitro, ci şi în studiile predictive de absorbţie, distribuţie, excreţie şi metabolizare (ADME) in vitro şi în experimentele farmacocinetice (PK) in vivo. În unele cazuri, compuşii sunt, de asemenea, profilaţi în studii predictive de siguranţă in vitro. Recoltarea in vitro a datelor ADME şi de siguranţă împreună cu datele PK, ajută la identificarea beneficiilor anumitor caracteristici structurale şi permite optimizarea relaţiei de activitate a structurii (SAR) pentru a proiecta compuşi cu profiluri optimizate asemănătoare medicamentelor pentru profilarea in vivo. Compuşii prezenţi nu numai că furnizează un avantaj în siguranţa hematologică, dar furnizează şi un echilibru general de potenţă, profiluri ADME şi PK.

Compuşii de aminoanilin uree cum ar fi Comparatorul A şi Comparatorul B din Tabelul 2 au fost descrişi anterior în WO 2017/007755 şi WO 2017/007756. Atunci când sunt analizate într-un test in vitro al unităţilor formatoare de colonii (UFC) din celulele măduvei osoase umane, analizând celulele progenitoare eritroide şi mieloide (predictive pentru neutropenie) şi în comparaţie cu perechea compusă de aminopiridin uree Comparator B, o modificare a unui singur atom din nucleul de diaminopiridin uree al Comparatorului B conduce la o îmbunătăţire semnificativă a siguranţei prezise atât în liniile eritroide, cât şi mieloide în raport cu ureea schelei de aminoanilină a Comparatorului A.A se vedea Tabelul 2.Mergând mai departe, atunci când gruparea 4-fluorofenil a Comparatorului B este înlocuită cu o grupare tiofen (Comparatorul C), dar componenta pirolopirazină a ureei este menţinută aceeaşi, se obţine o îmbunătăţire similară a profilului de siguranţă prezis în raport cu Comparatorul A aminoanilin uree. Acest lucru demonstrează faptul că ureele compuşilor diaminopiridinici cu componente identice de pirolidin uree sunt mai sigure decât aminoanilin ureele corespunzătoare.

În timp ce compuşii de pirolopirazin uree, Comparatorul B şi Comparatorul C, au arătat o potenţă bună în testele de potenţă in vitro, valorile din testul UFC in vitro încă necesită îmbunătăţiri. O linie mieloidă ICso >5 µM (care corespunde aproximativ la >30% rămânând la 10 µM) prezice probabilitatea scăzută de neutropenie clinică, la fel este pragul ţintă pentru siguranţă acceptabilă (Referinţe: Pessina şi colab. Toxicological Sciences 2003, 75, 355-367; Clarke şi colab. Gen. Eng. & Biotech. News 2010, 14-15.). S-a constatat faptul că prin modificarea pirolopirazinei într-o pirolopirimidină, a fost atins un profil de siguranţă îmbunătăţit în mod semnificativ in vitro. Comparând perechea Comparator B (pirolopirazină) cu Comparatorul D (pirolopirimidină), se observă o îmbunătăţire semnificativă a celulelor progenitoare UFC atât eritroide cât şi mieloide. Acest lucru este valabil şi pentru perechile de aminopiridin uree care posedă un buzunar de tiofen, Comparatorul C (pirolopirazină) şi Comparatorul E (pirolopirimidină). Deşi pirimidina a adus cu ea un profil de siguranţă îmbunătăţit, ambii compuşi de pirimidină nesubstituiţi, Comparatorul D şi Comparatorul E au prezentat o inhibare semnificativă a CYP2D6 la 10 µM. Cu toate acestea, substituirea pe inelul pirimidinic la poziţia dintre atomii de azot, Compusul 2 (pirolopirimidină substituită cu metil) nu a arătat nicio inhibare semnificativă a CYP2D6 sau CYP3A4 la 10 µM. Aceste rezultate dovedesc faptul că modificări chimice uşoare, cum ar fi deplasarea atomului de azot pe o poziţie de pe un inel din Comparatorii B şi D şi înlocuirea hidrogenului cu metil (Comparatorii E şi Compusul 2) produc creşteri dramatice ale siguranţei.

Tabelul 2. Compararea profilului in vitro al Compusului 2 cu multipli comparatori.

Comp. Structură Analiza lizatului de celule HDAC2 SY5Y IC50 (µM) IC50 enzimatic recombinant HDAC (µM) Procent de inhibare a CYP @ 10 µM: Procent de UFC martor rămase @ 10 µM HDAC2 HDAC1 2D6 3A4 Eritroidă Mieloidă A 0,369 0,142 0,027 34 -22 0 0 B 0,485 0,475 0,119 9 1,5 9 25 C 0,279 0,301 0,095 0,2 1 20 20 D 0,331 0,627 0,239 85 2 47 84 E 0,278 0,511 0,142 50 -17 54 83 2 0,577 0,434 0,133 -5 1 27 59

În plus faţă de substituirea între atomii de azot pirimidină care îmbunătăţeşte profilul de inhibare a CYP al compuşilor de pirolopirimidină, profilul PK al Compusului 2 este îmbunătăţit şi în raport cu Comparatorul E nesubstituit. A se vedea Tabelul 3. Metilpirimidina Compusului 2 furnizează beneficii distincte PK faţă de analogul de pirimidină nesubstituit, prezentând un timp de înjumătăţire mai lung, clearance mai mic, biodisponibilitate mai mare şi o expunere de >5 ori mai mare a creierului. Aceste rezultate dovedesc faptul că modificările chimice uşoare produc, de asemenea, beneficii substanţiale în PK.

Tabelul 3. Comparaţie în profilurile PK ale perechilor de pirimidină nesubstituită şi pirimidină substituită cu metil.

Comparatorul E Compusul 2 Structură IV şoarece (1 mpk): T1/2 (hr) 0,152 0,839 IV şoarece (1 mpk): Cl (L/hr/kg) 8,33 4,18 IV-PO şoarece (1/10 mpk): F (%) 49 100 PO şoarece (1/10 mpk): T1/2 (HR) 0,557 1,05 PO şoarece (10 mpk): Cmax creier (ng/g) (Cmax liber, ng/g) 100 583 PO şoarece (10 mpk): Cmax creier liber (ng/g) 35 173

Avantaje similare au fost obţinute prin explorarea efectelor regioizomerilor şi a modelelor de substituire asupra pirolopiridină ureelor diaminopiridinelor. De exemplu, în timp ce compusul de pirolopiridină Comparatorul F a arătat o potenţă bună in vitro, acesta a arătat niveluri ridicate de inhibare a CYP2D6 şi solubilitate extrem de scăzută. A se vedea Tabelul 4. Deplasarea azotului piridinic al pirolopiridinei (Comparatorul G) s-a dovedit a îmbunătăţi solubilitatea. Cu toate acestea, atât CYP2D6 cât şi CYP3A4 au fost inhibate la niveluri ridicate. S-a constatat faptul că adăugarea unui substituent metil adiacent la azotul piridinic al pirolopiridinei a îmbunătăţit oarecum profilul de inhibare a CYP faţă de 2D6 şi 3A4, menţinând în acelaşi timp potenţa şi solubilitatea (Comparatorul H). Substituirea metoximetilului care atrage electroni adiacentă azotului piridinic (Comparatorul H) a îmbunătăţit şi mai mult profilul de inhibare a CYP 2D6 şi 3A4, menţinând din nou potenţa şi profilul de solubilitate dorit. Rezultate similare au fost constatate între analogii mono-fluoră şi di-fluoro ai Comparatorului I şi Compusului 1, cu Compusul 1 prezentând o solubilitate uşor redusă. A se vedea Tabelul 4.

Cu toate acestea, Compusul 1 a depăşit cu mult Comparatorul I în ceea ce priveşte siguranţa in vitro, în ciuda singurei diferenţe de atom de halogen. A se vedea Tabelul 5. Un beneficiu semnificativ a fost realizat în liniile de celule progenitoare atât eritroide cât şi mieloide după tratamentul cu Compusul 1 substituit cu 2,4-difluoră în raport cu Comparatorul I.

Tabelul 4. Compararea profilului in vitro al Compusului 1 cu multipli comparatori.

Comp. Structură Analiza lizatului de celule HDAC2 SY5Y IC50 (µM) IC50 enzimatic recombinant HDAC (µM) Procent de inhibare a CYP @ 10 µM: Solubilitate (µM) HDAC2 HDAC1 2D 6 3A4 F 0,394 0,304 0,079 62 -4 1 G 0,639 0,335 0,143 94 65 55 H 0,621 0,214 0,090 57 28 78 I 0,666 0,276 0,122 2 33 121 1 0,777 0,510 0,326 -1 27 27

Tabelul 5. Datele analizei UFC in vitro pentru Compusul 10 şi Comparatorul I

Comparatorul I Compusul 1 Structură Procent de UFC martor rămase @ 10 µM: eritroide 23 57 Procent de UFC martor rămase @ 10 µM: mieloide 59 86

Tabelul 6 de mai jos prezintă rezultatele de la expunerea creierului şi plasmei după administrarea intravenoasă (IV) şi orală (PO) a compuşilor la şoareci.

Tabelul 6

Structură Cmax al creierului proiectat @ 10 mpk ng/g (*scalat pentru comparaţie) Liber al creierului proiectat @ 10 mpk uM (*scalat pentru comparaţie) PK IV T Ѕ (hr) PK IV Cl (L/hr/kg) Comparatorul D 158∗ 0,111∗ Indisponibil Indisponibil 1 2460 1,04 2,13 0,681 PO = 1,97

Efectele tratamentului oral de 14 zile cu doze mici de compuşi asupra morfologiei coloanei dendritice în hipocampul dorsal (CA1) al şoarecilor de tip sălbatic

Compuşii au fost evaluaţi pentru a determina dacă tratamentul sub-cronic ar putea produce modificări în morfologia coloanei dendritice în regiunea CA1 a hipocampului dorsal la şoarecii de tip sălbatic (WT). Compuşii au fost administraţi pe cale orală la şoareci de tip sălbatic, zilnic, timp de 14 zile. Dozele au fost alese pe baza datelor farmacocinetice, a expunerii creierului şi a potenţei. Au fost apoi evaluate efectele tratamentelor cu compuşi asupra morfologiei coloanei dendritice în regiunea CA1 a hipocampului dorsal.

Procedee: În viaţă

Şoarecilor C57BL/6J de sex masculin (vârsta de 7-8 săptămâni, n=7 per grup) li s-au administrat doze pe cale orală de compuşi Rodin sau vehicul (20% HPßCD) zilnic timp de 14 zile. Dozele pentru compuşi au fost alese pe baza datelor de expunere din experimentele farmacocinetice. Dozele unor compuşi au fost alese pentru a determina doze neeficiente, ca o extensie a studiilor anterioare care arată creşteri ale densităţii coloanei dendritice după tratamentul cu Compus 2 (la doze de 1, 3, 6 şi 20 mg/kg/zi), Compus 1 (10 mg/kg/zi). Şoarecii au fost sacrificaţi la 24 de ore după ultima doză şi au fost supuşi perfuziei transcardice pentru prepararea probelor de creier.

Procedeul de perfuzie şi recoltare a creierului

Şoarecii au fost anesteziaţi cu hidrat de cloral (4% hidrat de cloral în soluţie salină, 10ml/kg) înainte de a fi supuşi perfuziei transcardice cu 4% PFA în IX PBS (pH 7,4, temperatura camerei) la 20 mL/min timp de 54 de secunde. Imediat după perfuzie, şoarecii au fost decapitaţi şi li s-a extras creierul. Creierele au fost postfixate în fiole de scintilaţie care conţineau 4% PFA (5-10 ml) timp de 4 minute. Creierele au fost secţionate utilizând un vibratom de ţesut (Leica VT1000) pentru a recolta secţiuni (300 µm grosime) de la extremele anterioare spre posterioare ale fiecărui creier.

Marcare cu colorant balistic şi microscopie

Microscopia confocală cu scanare laser de superrezoluţie (Zeiss LSM880, Airyscan) a fost efectuată utilizând un obiectiv 63X (1,42 NA) pentru a scana neuronii marcaţi individual la rezoluţie înaltă (rezoluţie de scanare = 0,06 um µm/pixel; rezoluţie axială = 0,06 um µm/etapa focală). Neuronii ţintă au fost identificaţi în regiunea de interes a creierului prin navigare prin epifluorescenţă utilizând localizarea anatomică şi morfologia celulară. Microscopia a fost efectuată oarbă la condiţiile experimentale. Au fost testaţi minimum 7 şoareci în fiecare condiţie experimentală. Un minim de 5 probe per şoarece (interval = 5 ― 6) au fost măsurate pentru fiecare segment.

Analiza coloanei dendritice ESP şi evaluarea integrităţii membranei dendritice.

Deconvoluţia oarbă (AutoQuant) a fost aplicată imaginilor digitale tridimensionale brute care au fost apoi analizate pentru densitatea şi morfologia coloanei de către analişti instruiţi. Coloanele individuale au fost măsurate manual pentru (a) diametrul capului, (b) lungime şi (c) grosimea gâtului din stivele de imagini Z, utilizând software-ul Afraxis ESP personalizat. Fiecare dendrită a fost analizată de 3 (în medie) analişti independenţi. Software-ul de atribuire automată a imaginilor a distribuit imaginile analiştilor într-o manieră aleatorie şi a asigurat faptul că fiecare analist a efectuat măsurători cu un număr aproape egal de dendrite per grup. Analiştii au fost orbiţi la toate condiţiile experimentale (inclusiv tratamentul, regiunea creierului şi tipul de celulă). Analiza statistică a variabilităţii interanaliste pentru fiecare dendrită a fost examinată on-line şi a fost utilizată pentru a elimina dendritele care nu îndeplineau criteriile de fiabilitate interanaliste: pentru densitatea coloanei şi clasificarea morfologică a coloanei, datele analiştilor au fost mediate pentru a raporta datele pentru fiecare dendrită.

Poziţii de recoltare a dendritelor:

dHIPP, CA1 Apical 2° (0 - 50 µm):

Regiunea creierului: hipocampul dorsal (dHIPP)

Tip de celulă: neuron piramidal CA1 (CA1)

Tipul ramurilor: apicale

Ordinul ramurilor: secundare (2°)

Poziţia probei: 0 - 50 µm faţă de punctul de ramificare

Fiecare coloană dendritică identificată a fost măsurată pentru (a) lungimea coloanei, (b) diametrul capului coloanei şi (c) lăţimea gâtului. Distribuţiile populaţiei pentru fiecare măsură au fost compilate pentru fiecare probă dendritică şi au fost grupate pe grup. Valorile morfometrice brute ale coloanei dendritice (lungimea coloanei, diametrul capului, lăţimea gâtului) au fost asamblate într-o schemă utilizată pentru a descrie fenotipurile clasice ale coloanei (de exemplu ciupercă etc.). Densitatea totală a coloanei a fost, de asemenea, raportată ca suma densităţii tuturor subclaselor.

Rezultate:

Observaţii generale. Prelucrarea ţesuturilor nu a demonstrat nicio indicaţie patologică observabilă, inclusiv întreruperea anormală a membranelor somatice, blebbing dendritic sau modificări anormale ale diametrelor dendritelor pentru tipul de celulă ţintă sau alte tipuri de celule din regiunile creierului testate. Pentru un studiu adecvat pentru a studia comparaţiile, datele privind densitatea totală a coloanei au fost normalizate la procentul nivelurilor vehiculelor

Datele au fost apoi raportate ca fiind medii +/- SEM a densităţii totale a coloanei (procentul de creştere faţă de vehicul). Rezultatele sunt raportate în Tabelul 7.

Tabelul 7. Efecte asupra morfologiei coloanei la şoarecii WT după 14 zile de dozare.

Compus Structură Doza (mg/kg) Coloane totale (procent de creştere faţă de vehicul) Coloane subţiri (procent de creştere faţă de vehicul) 1 0,1 12,2 13,8 0,3 21,3∗ 23,2∗ 1 34,6∗ 45,1∗ 3 26,7∗ 25,3∗ 10 25,1∗ 19,9∗ 2 0,1 8,1 11,3 1 21,4∗ 21,2 3 24,7∗ 32,2∗ 6 15∗ 35,4∗ 20 -0,12 37,4∗ *în mod semnificativ diferit faţă de vehiculul cu valoarea p < 0,05 utilizând o ANOVA unidirecţională urmată de o analiză postHoc a lui Dunnett

Cu excepţia cazului în care este definit altfel, tuturor termenilor tehnici şi ştiinţifici utilizaţi în prezenta invenţie li se acordă semnificaţia cunoscută în mod obişnuit de către specialiştii în domeniu.

Claims (8)

1. Compus cu formula:

sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

2. Compus conform Revendicării 1, în care compusul are formula:

sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

3. Compus conform Revendicării 1, în care compusul are formula:

sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic.

4. Compoziţie farmaceutică ce cuprinde un compus conform oricăreia dintre Revendicările 1 până la 3 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic; şi un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic.

5. Compus conform oricăreia dintre Revendicările 1 până la 3 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţia farmaceutică conform Revendicării 4, pentru utilizare în tratarea afecţiunilor asociate cu activitatea HDAC.

6. Compus conform oricăreia dintre Revendicările 1 până la 3 sau o sare a acestuia acceptabilă din punct de vedere farmaceutic sau compoziţie conform Revendicării 4, pentru utilizare în tratarea unei afecţiuni selectate dintre o tulburare neurologică, tulburare sau deficienţă a memoriei sau funcţiei cognitive, tulburare de învăţare a extincţiei, boală sau infecţie fungică, boală inflamatorie, boală hematologică, tulburări psihiatrice şi boală neoplazică.

7. Compus sau compoziţie pentru utilizare conform Revendicării 6, în care afecţiunea este: a. o tulburare sau deficienţă a funcţiei cognitive asociată cu boala Alzheimer, boala Huntington, pierderea memoriei indusă de convulsii, schizofrenie, sindrom Rubinstein Taybi, sindrom Rett, depresie, X fragil, demenţă corporală Lewy, demenţă vasculară, degenerescenţă lobară frontotemporală (demenţă frontotemporală, FTD), FTD-GRN, ADHD, dislexie, tulburare bipolară şi tulburări sociale, cognitive şi de învăţare asociate cu autism, leziuni traumatice ale capului, tulburări de deficienţă de atenţie, tulburări de anxietate, răspuns la frică condiţionat, tulburare de panică, tulburare obsesiv-compulsivă, tulburare de stres posttraumatic (PTSD), fobie, tulburare de anxietate socială, recuperare în urma dependenţei de substanţe, deficienţă a memoriei asociată vârstei (AAMI), declin cognitiv asociat vârstei (ARCD), ataxie, boala Parkinson sau demenţă cauzată de boala Parkinson; sau b. o boală hematologică selectată dintre leucemie mieloidă acută, leucemie promielocitară acută, leucemie limfoblastică acută, leucemie mielogenă cronică, sindroame mielodisplazice şi siclemie; sau c. o boală neoplazică; sau d. o tulburare de învăţare a extincţiei selectată dintre extincţia fricii şi tulburare de stres posttraumatic.

8. Compus pentru utilizare conform Revendicării 7, în care afecţiunea este boala Alzheimer, boala Huntington, demenţa frontotemporală, ataxia Freidreich, tulburarea de stres post-traumatic (PTSD), boala Parkinson sau recuperarea în urma dependenţei de substanţe.