MD3810633T2 - Compuşi - Google Patents

Abstract

Invenţia furnizează un compus de polimixină cu formula (I) şi săruri, solvaţi şi forme protejate ale acestora, compoziţii farmaceutice care cuprind compuşii cu formula (I) şi utilizarea compuşilor şi compoziţiilor în metode de tratament, cum ar fi metode de tratament al infecţiilor microbiene. Compuşii cu formula (I) sunt reprezentaţi astfel: formula (I) în care -R15 este o grupare: formula (II) şi -R16 este hidrogen; -R17 este hidrogen; -L- este o legătură covalentă sau metilen; şi -Ar este aril opţional substituit. Grupările -X-, -R1, -R2, -R3, -R4 şi -R8 sunt aşa cum sunt definite aici.

Description

Cerere asociată

Prezentul caz revendică beneficiul şi prioritatea lui US 62/689602 depusă în 25 iunie 2018 (25.06.2018).

Domeniul invenţiei

Prezenta invenţie se referă la noi compuşi de polimixină, compoziţii farmaceutice care cuprind compuşii, şi la utilizarea compuşilor şi compoziţiilor farmaceutice pentru tratament medical, de exemplu, tratamentul infecţiilor microbiene, în particular, infecţii cu bacterii Gram-negative.

Context

WO 2013/072695 şi WO 2014/188178 descriu derivaţi de polimixină în care fragmentul de acil gras N-terminal şi fragmentul adiacent de acid diaminobutiric al polimixinei B sau al colistinei sunt înlocuite cu o grupare terminală care are un substituent amino. Astfel de derivaţi au activitate antibacteriană bună, având în acelaşi timp o citotoxicitate redusă.

WO 2015/135976 descrie, de asemenea, derivaţi de polimixină în care din nou fragmentul de acil gras N-terminal şi acidul diaminobutiric adiacent al Polimixinei B sau Colistinei sunt înlocuie cu o grupare de capăt care are un substituent amino. Aici, poziţia specifică a substituentului amino şi plasarea altor substituenţi în fragmentul N-terminal s-au dovedit a fi importante pentru o activitate antimicrobiană puternică într-o serie de agenţi patogeni cheie, cum ar fi Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa şi Acinetobacter baumannii. Compuşii dezvăluiţi au păstrat, de asemenea, o citotoxicitate scăzută.

WO 2016/083531 descrie derivaţi de polimixină, în care din nou fragmentul de acil gras N-terminal şi acidul diaminobutiric adiacent al polimixinei B sau colistinei sunt înlocuiţi cu o grupare de capăt care are un substituent amino, cum ar fi acele grupări prezente în WO 2013/072695, WO 2014/188178 şi WO 2015/135976. În plus, reziduul de aminoacid din poziţiile 6 şi/sau 7 este substituit cu Polimixină B şi Colistină.

WO 2017/054047 descrie derivaţi de polimixină decapeptidă, în care fragmentul de acil gras N-terminal al polimixinei B este înlocuit cu o grupare de capăt care are funcţionalitate aromatică. În plus, reziduul de aminoacizi din poziţia 3 şi reziduurile de aminoacizi din poziţiile 6 şi/sau 7 sunt substituite în raport cu Polimixina B.

US 2012/316105 descrie derivaţi de polimixină decapeptidă în care fragmentul de acil gras N-terminal al polimixinei B este înlocuit, în mod obişnuit, cu o grupare de capăt care are funcţionalitate aromatică. În plus, reziduul de aminoacid din poziţia 3 este substituit cu Polimixină B.

WO 2016/166103 descrie derivaţi de polimixină în care din nou fragmentul de acil gras N-terminal şi acidul diaminobutiric adiacent al Polimixinei B sau al Colistinei sunt înlocuiţi cu o grupare de capăt care are funcţionalitate aromatică.

Koh şi colab. este o revizuire a agenţilor antimicrobieni. Printre altele, Koh şi colab. discută exemplele din US 2012/316105 Pentru a fi mai utili pentru terapia parenterală a infecţiilor sistemice decât polimixinele disponibile în prezent, noii derivaţi de polimixine trebuie să se potrivească cel puţin cu activitatea acestor polimixine cunoscute, având în acelaşi timp o toxicitate renală semnificativ mai mică in vivo.

Expunerea pe scurt a invenţiei

Invenţia este definită în revendicările anexate.

Într-un aspect general, invenţia furnizează compuşi care au un nucleu deacilat de polimixină, cum ar fi un nucleu nonapetidic de Polimixină B sau de Colistină, cu reziduul de aminoacid în poziţia 3 substituit cu L-Dap, care are o grupare -C(O)-CH2CH(3-CI-Ph)CH2NH2, aşa cum este definit aici, la capătul său N-terminal. Astfel de compuşi îşi găsesc utilizare într-o metodă de tratament sau profilaxie, opţional în combinaţie cu un al doilea agent activ. Compuşii pot fi utilizaţi pentru a trata o infecţie microbiană, cum ar fi o infecţie bacteriană Gram-negativă.

Compuşii din prezenta invenţie s-au dovedit a avea citotoxicitate scăzută echilibrată cu niveluri de medicament acceptabile pentru rinichi după administrare parenterală. Compuşii din prezenta invenţie se dovedesc a fi superiori, atât polimixinei B, cât şi compuşilor de polimixină modificaţi cunoscuţi în domeniu, inclusiv celor raportaţi anterior de către prezentul solicitant. Această superioritate se manifestă în ceea ce priveşte una sau mai multe dintre următoarele caracteristici: citotoxicitate mai mică, niveluri de medicament acceptabile pentru rinichi (adică, toxicitate renală acceptabilă, care rezultă din niveluri de medicamente în rinichi care nu sunt crescute) după administrare parenterală, eficacitate în modelele de coapsă şi plămâni de şoarece, şi/sau MIC superioară împotriva tulpinilor bacteriene patogene, fiind în acelaşi timp echivalente cu compuşii din stadiul tehnicii în ceea ce priveşte celelalte.

De obicei, compuşii cunoscuţi în domeniu prezintă una, sau poate două dintre aceste caracteristici avantajoase, dar nu toate. De exemplu, acum este relativ obişnuit să se găsească compuşi de polimixină cu citotoxicitate mai mică, dar această citotoxicitate mai mică este adesea însoţită de o reducere a activităţii antibacteriene. În plus, compuşii cu o citotoxicitate mai mică pot fi totuşi găsiţi în rinichi la niveluri ridicate după dozare. Astfel de compuşi sunt, prin urmare, încă toxici şi nu sunt utili în metode de tratament medical.

Într-un prim aspect al invenţiei, este furnizat un compus cu formula (II) şi săruri, solvaţi şi forme protejate acceptabile farmaceutic ale acestuia.

Compusul cu formula (II) este reprezentat astfel:

Invenţia furnizează, de asemenea, o compoziţie farmaceutică care cuprinde un compus cu formula (II), opţional, împreună cu unu sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic.

Într-un alt aspect, este furnizat un compus cu formula (II) sau o compoziţie farmaceutică care cuprinde un compus cu formula (II), pentru utilizare într-o metodă de tratament sau profilaxie.

Într-un alt aspect, este furnizat un compus cu formula (II), sau o compoziţie farmaceutică care cuprinde un compus cu formula (II), pentru utilizare într-o metodă de tratare a unei infecţii microbiene.

O infecţie microbiană poate fi o infecţie bacteriană, cum ar fi o infecţie bacteriană Gram-negativă. Infecţia bacteriană Gram-negativă poate fi selectată din grupul constând din Escherichia spp., Klebsiella spp., Enterobacterspp., Salmonella

spp., Shigella spp., Citrobacter spp. şi alte Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp.,

Acinetobacter spp., Stenotrophomonas, şi Legionella.

Aici sunt descrise metode pentru prepararea compuşilor cu formula (II) precum şi a compuşilor intermediari pentru utilizare la prepararea compuşilor cu formula (II).

Acestea şi alte aspecte şi variante de realizare a invenţiei sunt descrise mai detaliat mai jos.

Descrierea detaliată a invenţiei

Prezenta invenţie furnizează compuşi cu formula (II), aşa cum este descris mai detaliat mai jos, pentru utilizare în tratamentul medical, opţional, împreună cu un al doilea agent activ.

În linii mari, compuşii cu formula (II) au un nucleu de polimixină, care este un nucleu nonapeptidic, şi o grupare -C(O)-CH2CH(3-CI-Ph)CH2NH2 la capătul N-terminal al nucleului polimixinei. Gruparea conectată la -C(O)- este o grupare γ-aminopropil substituită. Gruparea γ-aminopropil este substituită cu 3-CI-Ph în poziţia β în raport cu fragmentul -C(O)-.

Primul reziduu de aminoacid din lanţul exociclic al compuşilor din invenţie - care corespunde poziţiei 3 în polimixină - este un reziduu L-Dap (acid diaminopropionic), mai degrabă decât un reziduu L-Dab (acid L-diaminobutiric), aşa cum este prezent în Polimixină B şi în Colistină.

Reziduurile de aminoacizi din poziţiile 6 şi 7 ale compusului polimixină (urmând numerotarea utilizată pentru polimixină) corespund acelor reziduuri de aminoacizi prezente în polimixină B.

Pentru a fi mai utili pentru terapia parenterală a infecţiilor sistemice decât seria cunoscută în prezent de compuşi de polimixină, noii derivaţi de polimixină trebuie să se potrivească cel puţin cu activitatea antibacteriană a acelor compuşi de polimixină cunoscuţi, având în acelaşi timp o toxicitate renală semnificativ mai mică in vivo.

S-a descoperit acum că nu este suficient ca un compus de polimixină să prezinte o citotoxicitate mai mică, deoarece aceasta, frecvent, nu este asociată cu o toxicitate redusă in vivo. Astfel, acumularea medicamentului în rinichi şi eliminarea acestuia de acolo trebuie să fie, de asemenea, favorabile. Cu alte cuvinte, combinaţia dintre citotoxicitate şi nivelurile de medicament în rinichi după administrare parenterală este ceea ce conduce la un profil de toxicitate in vivo.

Acest lucru poate fi arătat prin exemplu de comparaţii arătat în tabelul A de mai jos, în care PMBN se referă la nucleul nonapeptidic de polimixină B şi PMEN se referă la nucleul nonapeptidic de polimixină E, cu substituţiile la reziduurile de aminoacizi la poziţiile 3 şi 6 (conform cu numerotarea polimixinei) prezentate, atunci când este cazul (de ex., Dap înlocuieşte Dab în poziţia 3 şi ciclohexilalanina (CHA) înlocuieşte fenilalanina în poziţia 6).

Tabelul A

Compus Structură Citotoxi-citate Nivel de medicament în rinichi Toxicitate renală* 4 ore 16 ore Polimixină B 1,0 128 18 ++ Exemplu de referinţă D77, WO 2015/135976 23** 516 264 ++++ Exemplu de referinţă 38, WO 2016/083531 9,2*** 567 333 +++ Exemplul 5 11,6 170 19 +/-

Citotoxicitatea se referă la IC50 măsurată comparativ cu cea înregistrată pentru Polimixină B împotriva unei linii de celule HK-2. Nivelul de medicament se referă la cantitatea de compus (µg/g de rinichi) găsită în rinichi la 4 sau 16 ore după o doză sc de 17,2 mg/kg într-un şoarece.

* Compuşii au fost administraţi în 4 doze, la 8 ore între ele, la 25 mg de bază liberă/kg/doză, sau 4 zile tid la intervale de 4 ore la 17,2 mg de bază liberă/kg/doză. După administrare, urina a fost colectată timp de 16-24 ore pentru determinarea biomarkerilor urinari ai toxicităţii renale (KIM-1, albumină, cistatină C). Compuşii au fost clasificaţi ca - (nu se pot distinge de vehiculul de control) până la ++++ (răspuns puternic de la toţi biomarkerii).

** În WO 2015/135976 a fost indicată o cifră de 13,3 pentru acest compus (Exemplul D77). Acest compus a fost testat acum în plus de două ori, şi valoarea relativă a fost calculată pe baza valorii pentru PMB din acelaşi experiment. Valoarea medie a fost 23.

*** În WO 2016/083531 a fost indicată o IC50 de 255 µg/mL pentru acest compus (Exemplul 38) faţă de 12 µg/mL pentru Polimixină B. Cu toate acestea, cifra pentru PMB utilizată în acea aplicaţie a fost o valoare mediană din mai multe experimente. Cifra de 9,2 indicată aici este prin comparaţie cu valoarea IC50 pentru PMB determinată în acelaşi experiment

Prezentul solicitant a dezvăluit anterior în WO 2015/135976 nonapeptide de polimixină cu o grupare γ-aminopropil N-terminală substituită cu un fragment fenil sau benzil. Totuşi, substituentul fenil sau benzil este furnizat în poziţia α, mai degrabă decât în poziţia β, în raport cu gruparea -X-. WO 2015/135976 descrie, de asemenea, o nonapeptidă de polimixină cu o grupare β-aminoetil N-terminală substituită în poziţia α cu o grupare benzil. Aici, funcţionalitatea amino este furnizată în poziţia β mai degrabă decât în poziţia γ, în raport cu gruparea -X.

În timp ce aceşti compuşi cunoscuţi prezintă activitate promiţătoare şi citotoxicitate moderat îmbunătăţită în comparaţie cu Polimixina B, aceşti compuşi sunt inferiori compuşilor din prezenta invenţie prin faptul că nu prezintă o combinaţie de citotoxicitate mică împreună echilibrată cu niveluri în rinichi acceptabile după administrare.

Acest lucru este arătat prin exemplul de comparaţii arătat în tabelul B de mai jos, în care PMBN se referă la nucleul nonapeptidic de polimixină B, cu substituţiile la reziduul de aminoacizi în poziţiile 3, atunci când este cazul (de ex., Dap care înlocuieşte Dab în poziţia 3) .

Tabelul B

Compus Structură Citotoxicitate Nivel de medicament în rinichi (µg/g de rinichi, 4ore) Nivel în rinichi la 4 ore / citotoxicitate relativă Compus de referinţă D6, WO 2015/135976 4,4* 235 53 Compus de referinţă** 5,1 589 115 Compus de referinţă** 4,8 533 111 Exemplul de referinţă 1 8,8 268 30 Exemplul 5 11,6 170 15

* Acest compus este exemplul D6 din WO 2015/135976. Cifra indicată acolo pentru citotoxicitatea relativă a fost 3,7. Această cifră este media a două determinări repetate.

** Compuşii din aceste exemple de referinţă pot fi preparaţi conform metodelor descrise în WO 2015/135976.

Prezentul solicitant a dezvăluit anterior în WO 2016/083531 nonapeptide de polimixină cu grupări N-terminale modificate, în special, pe cele care includ grupări β-aril sau β-aralchil. Cu toate acestea, aceşti compuşi cunoscuţi au un reziduu de aminoacid lipofil în poziţia 6, cum ar fi un reziduu de ciclohexilalanină, în timp ce compuşii din prezentul caz au, de exemplu, un reziduu de fenilalanină, leucină, norleucină, valină sau norvalină în poziţia 6. Aceşti compuşi cunoscuţi sunt din nou inferiori compuşilor din prezenta invenţie, având în vedere combinaţia nesatisfăcătoare dintre citotoxicitate şi nivelurile de medicament din rinichi după administrare.

Acest lucru este arătat cu titlu de exemplu de comparaţii arătat în tabelul C de mai jos, în care PMBN se referă la nucleul nonapeptidic al polimixinei B, cu substituţiile arătate la reziduurile de aminoacizi în poziţiile 3 şi 6, atunci când este cazul (de ex., Dap care înlocuieşte Dab în poziţia 3, iar ciclohexilalanină (CHA) care înlocuieşte fenilalanină în poziţia 6).

Tabelul C

Compus Structură Citotoxicitate Nivel de medicament în rinichi (µg/g rinichi, 4h) Nivel în rinichi la 4 ore / citotoxicitate relativă Compus de referinţă 50 WO 2016/083531 7,4 463 63 Compus de referinţă 58, WO 2016/083531 5,2 212 32 Exemplul de referinţă 1 8,8 268 30 Exemplul de referinţă 9 12,0 159 13

Compuşii 50 şi 58 sunt cunoscuţi din WO 2016/083531, iar aceştia sunt compuşii identificaţi ca Izomer 1 în acest caz.

Compuşi de polimixină

Compuşii cu formula (II) sunt derivaţi N-terminali ai seriei de compuşi nonapeptidă de polimixină. Nucleul compusului cu formula (II) este un derivat de nonapeptidă de Polimixină B (PMBN, Polimixină B 2-10), în care reziduul de aminoacid din poziţia 3 este substituit cu L-Dap. Compuşii cu formula (I) au o grupare -C(O)-CH2CH(3-CI-Ph)CH2NH2 la capătul N-terminal al nucleului de polimixină. Acest lucru este descris detaliat mai jos.

Compuşii din invenţie conţin un stereocentru în poziţia β a grupării γ-aminopropil din fragmentul N-terminal. S-a descoperit că unul dintre stereoizomeri este asociat cu o citotoxicitate mai mică şi cu niveluri mai mici de medicament în rinichi. Acest stereoizomer este stereoizomerul care eluează mai rapid în cromatografie în fază inversă, aşa cum este descris detaliat în exemplele de lucru din prezentul caz.

Compusul cu formula (II) are un nucleu nonapeptidic şi o grupare -C(O)-CH2CH(3-CI-Ph)CH2NH2 la capătul N-terminal al nucleului de polimixină. Gruparea care este conectată la -C(O)- este o grupare γ-aminopropil substituită. Gruparea γ-aminopropil este substituită cu m-CI-Ph în poziţia β în raport cu fragmentul -C(O)-. Gruparea γ-aminopropil substituită poate fi reprezentată astfel:

Într-o variantă de realizare, gruparea γ-aminopropil substituită poate fi reprezentată astfel:

Compusul (II)

Compusul cu formula (II) este arătat mai jos:

şi săruri, solvaţi şi forme protejate ale acestuia.

Compusul cu formula (II) poate fi un compus cu formula (IIa) aşa cum este arătat mai jos:

şi săruri, solvaţi şi forme protejate ale acestuia.

Compusul cu formula (II) poate fi un compus cu formula (IIb) aşa cum este arătat mai jos:

şi săruri, solvaţi şi forme protejate ale acestuia.

Compuşi de polimixină

Compuşii pentru utilizare în prezentul caz se bazează pe forme modificate de compuşi de polimixină cunoscuţi, cum ar fi nonapeptidă de polimixină B şi nonapeptidă de colistină. Nonapeptida de polimixină B are structura arătată mai jos:

în care sunt indicate poziţiile 2, 4 şi 10 (cu referire la sistemul de numerotare utilizat pentru decapeptida de polimixină B), iar reziduurile de aminoacizi sunt în configuraţie L, cu excepţia cazului în care este indicat.

Compuşii din invenţie sunt derivaţi de nonapeptidă de polimixină B, în care (i) gruparea amino de capăt N terminal, -NH2, este înlocuită cu gruparea -NH-C(O)-CH2CH(3-CI-Ph)CH2NH2 aşa cum este descris aici; şi (ii) reziduul de aminoacid din poziţia 3 este substituit cu L-Dap.

Metode de sinteză

Prepararea compuşilor din invenţie va fi familiară persoanelor de specialitate în domeniu, în special, celor care au cunoştinţe despre metodele descrise în WO 2015/135976 pentru prepararea nonapeptidelor de polimixină modificate. Metodele descrise în domeniu pot fi adaptate cu uşurinţă pentru utilizare în prepararea compuşilor din prezentul caz, ţinând cont de noile grupări de capăt N terminal folosite în prezentul caz.

În general, un compus din invenţie poate fi preparat prin cuplarea unui intermediar de polimixină de nonapeptidă protejat corespunzător cu un acid carboxilic care are gruparea γ-aminopropil substituită. Produsul acestei reacţii este de obicei forma protejată a compusului cu formula (II). Îndepărtarea grupărilor protectoare poate fi efectuată aşa cum se doreşte. Aceasta este strategia generală cunoscută din WO 2015/135976.

Un intermediar de nonapeptidă protejat corespunzător poate fi el însuşi preparat în conformitate cu metodele prezentate în WO 2015/135976. Aşa cum este descris aici, un intermediar de nonapeptidă protejat corespunzător poate fi preparat, de asemenea, prin sinteza în fază solidă a unei nonapeptide liniare, urmată de scindarea formei liniare din suportul solid şi apoi ciclizarea ulterioară a acelei forme liniare între reziduurile amino din poziţiile 4 şi 10.

Compuşii din invenţie pot fi obţinuţi prin sinteză convenţională de peptide, utilizând metode cunoscute persoanelor de specialitate în domeniu. Metode adecvate includ sinteza în fază solidă, aşa cum este descrisă de către de Visser şi colab., J. Peptide Res, 61, 2003, 298-306, Vaara şi colab., Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 52, 2008. 3229-3236, sau de către Velkov şi colab. ACS Chem. Biol. 9, 2014, 1172. Aceste metode includ o strategie de protecţie adecvată şi metode pentru etapa de ciclizare.

Atunci când este necesar, compusul cu formula (II) poate fi cel puţin parţial purificat, de exemplu pentru a separa formele diastereomerice ale produsului.

Forme protejate

Compuşi cu formula (II) pot fi furnizaţi într-o formă protejată. Aici, funcţionalitatea reactivă, cum ar fi funcţionalitatea amino, poate fi mascată pentru a împiedica reacţia sa în timpul unei etape de sinteză. Este furnizată o grupare protectoare pentru a masca funcţionalitatea reactivă, şi aceste grupări protectoare pot fi îndepărtate într-o etapă ulterioară a sintezei pentru a releva funcţionalitatea reactivă iniţială.

Într-o variantă de realizare, forma protejată este un compus în care funcţionalitatea amino, hidroxil, tiol şi/sau carboxil este protejată (mascată) de către o grupare protectoare. Într-o variantă de realizare, forma protejată este un compus în care funcţionalitatea lanţului lateral al reziduurilor de aminoacizi cu compusul este protejată.

În compusul cu formula (II), reziduurile de aminoacizi din poziţiile 5, 8 şi 9 sunt reziduuri Dab, şi lanţul lateral al reziduului Dab include funcţionalitatea amino. Funcţionalitatea de aminoacizi a fiecărui reziduu Dab poate fi protejată cu o grupare protectoare pentru amino, aşa cum este descris aici. În mod similar, reziduul de aminoacid din poziţia 3 este Dap, şi lanţul lateral al acestui reziduu de aminoacid include funcţionalitatea amino.

Gruparea de capăt N terminal este o grupare γ-aminopropil substituită. Funcţionalitatea amino poate fi protejată cu grupări protectoare pentru amino, aşa cum este descris aici.

Grupări protectoare, cum ar fi cele pentru reziduurile de aminoacizi, sunt bine cunoscute şi bine descrise în domeniu.

Sunt disponibili comercial aminoacizi care au protecţie pentru gruprile laterale, opţional, împreună cu protecţie pentru amino şi carboxi. Astfel, un compus de polimixină protejat poate fi preparat din materii prime aminoacizi protejate în mod corespunzător.

Velkov şi colab. descriu prepararea în etape a compuşilor de polimixină pe fază solidă folosind aminoacid protejat corespunzător. Utilizarea formelor protejate de treonină şi Dab este dezvăluită (vezi Informaţii Suplimentare).

Atunci când este utilizată o grupare protectoare, aceasta poate fi îndepărtată în condiţii care nu perturbă substanţial structura nucleului de polimixină, de exemplu, în condiţii care nu modifică stereochimia reziduurilor de aminoacizi.

Într-o variantă de realizare, grupările protectoare sunt labile la acid, labile la bază, sau pot fi îndepărtate în condiţii reducătoare.

Exemple de grupări protectoare pentru funcţionalitatea amino includ Boc (terţ-butoxicabonil), Bn (benzil, Bzl), CbZ (benziloxicarbonil, Z), 2-CI-Z (2-clor), ivDde (1-[4,4-dimetil- 2,6-dioxocilcohex-1-iliden]-3-metilbutil), Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonil), HSOs-Fmoc (Fmoc sulfonilat, cum ar fi 2-sulfo-Fmoc, aşa cum este descris în, de ex. Schechter şi colab., J.Med Chem 2002, 45 (19) 4264), Dde (1-[4,4-dimetil-2,6-dioxocilcohex-1-iliden]etil), Mmt (4-metoxitritil), Mtt (4-metiltritil), Nvoc (6-nitroveratroiloxicarbonil), Tfa (trifluroacetil ) şi Alloc (aliloxicarbonil).

Exemple de grupări protectoare pentru funcţionalitatea azotului aromatic includ Boc, Mtt, Trt şi Dnp (dinitrofenil).

Într-o variantă de realizare, gruparea protectoare pentru funcţionalitatea amino este selectată dintre Boc, ivDde, CbZ, Bn şi Fmoc şi HSOs-Fmoc.

Într-o variantă de realizare, gruparea protectoare pentru funcţionalitatea amino este Boc, ivDde, Fmoc sau CbZ, cum ar fi Boc, ivDde sau Cbz.

Protejarea cu Boc poate fi asigurată pentru funcţionalitatea amino prezentă în lanţurile laterale ale reziduurilor de aminoacizi prezente în poziţiile 5, 8 şi 9 şi, opţional, în poziţia 3.

Exemple de grupări protectoare pentru funcţionalitatea hidroxil includ Trt (tritil), Bn (benzil) şi tBu (terţ-butil).

Într-o variantă de realizare, gruparea protectoare pentru funcţionalitatea hidroxil este tBu.

Alte exemple de grupări protectoare includ grupări protectoare silil eter, cum ar fi TMS, TES, TBS, TIPS, TBDMS şi TBDPS. Astfel de grupări protectoare sunt îndepărtate cu TBAF, de exemplu.

Exemple de grupări protectoare pentru funcţionalitatea carboxil includ Bn (benzil, Bz), tBu (terţ-butil), TMSET (trimetilsililetil) şi Dmab ({1-[4,4-dimetil-2,6-dioxocilcohex-1-iliden]-3-metilbutil}amino benzil).

Exemple de grupări protectoare pentru funcţionalitatea azotului aromatic, de exemplu, în cazul în care o astfel de funcţionalitate este prezentă în gruparea -Ar, includ Boc, Mtt, Trt şi Dnp (dinitrofenil).

În unele variante de realizare, sunt protejate doar anumite tipuri de funcţionalităţi. De exemplu, numai grupările amino pot fi protejate, cum ar fi grupările amino din lanţul lateral al unui reziduu de aminoacid.

Într-o variantă de realizare, grupările amino şi grupările hidroxil sunt protejate.

LogP

Un compus cu formula (II) poate avea un coeficient de partiţie, cum ar fi exprimat ca valoare LogP, în anumite limite. Coeficientul de partiţie poate oferi o indicaţie a lipofilităţii compusului.

Inventatorii au stabilit că compuşii care au o lipofilitate mai mare au o citotoxicitate mai slabă. Compuşii din invenţie au de obicei valori LogP care sunt asociate cu o citotoxicitate mai mică, cum ar fi valorile LogP descrise mai jos.

O valoare LogP pentru un compus poate fi determinată experimental (de ex., prin împărţirea compusului între octanol şi apă), sau poate fi prezisă folosind metode standard de calcul.

De exemplu, o referire la LogP poate fi o referire la ALogP, care poate fi determinată folosind metodele descrise de Ghose şi colab. J. Phys. Chem. A, 1998, 102, 3762-3772. Astfel, ALogP este estimarea contribuţiei grupului Ghose/Crippen pentru LogP.

Într-o variantă de realizare, un compus are o valoare LogP, cum ar fi o valoare ALogP, de cel puţin -6,5, cel puţin -6,6, cel puţin -6,7, cel puţin -6,8, cel puţin -6,9, cel puţin -7,0, cel puţin -7,5 sau cel puţin -8,0.

Într-o variantă de realizare, un compus are o valoare LogP, cum ar fi o valoare ALogP, de cel mult -6,4, cel mult -6,3, cel mult -6,2, cel mult -6,1, cel mult -6,0, cel mult -5,9 sau cel mult -5,8.

Într-o variantă de realizare, un compus are o valoare LogP într-un interval care are limite superioară şi inferioară selectate în mod corespunzător între limitele date mai sus, de exemplu, în intervalul -5,8 până la -8,0, cum ar fi -6,0 până la -6,7, cum ar fi -6,3 până la -6,7. Aceste intervale pot fi selectate atunci când gruparea

-R2 este alchil nesubstituit.

Într-o altă variantă de realizare, compusul are o valoare LogP în intervalul -6,7 până la -7,4. Acest interval poate fi selectat atunci când gruparea -R2 este alchil substituit cu o grupare hidroxil.

Compuşi care au valori LogP, cum ar fi valorile ALogP, în limitele discutate mai sus, s-au dovedit a avea o activitate excelentă, atât împotriva tulpinilor bacteriene sensibile la polimixină, cât şi a celor rezistente la polimixină. Compuşii pot avea activitate antimicrobiană comparabilă cu polimixina B. În mod avantajos, astfel de compuşi pot avea, de asemenea, citotoxicitate redusă în comparaţie cu polimixina B.

Inventatorii prezentei au descoperit că un compus care are valori LogP optime poate fi obţinut prin selectarea grupului -R15 din prezentul caz, împreună cu alegeri adecvate de reziduuri de aminoacizi în poziţiile 6 şi/sau 7 (cum ar fi, cu selectarea corespunzătoare a -R1 şi/sau -R2).

Agent activ

Compuşii cu formula (II) pot fi utilizaţi fiecare împreună cu un al doilea agent activ. Inventatorii au descoperit că astfel de combinaţii au o activitate biologică mai mare decât ar fi de aşteptat din activitatea individuală a ambilor compuşi. Compuşii cu formula (II) pot fi utilizaţi pentru a potenţa activitatea celui de-al doilea agent activ. În particular, compuşii cu formula (II) pot fi utilizaţi împreună cu un al doilea agent activ pentru a spori activitatea antimicrobiană a acelui agent, de exemplu, împotriva bacteriilor Gram-negative.

Fără a dori să fie legat de teorie, se crede că compuşii cu formula (II) acţionează asupra membranei exterioare a unei celule, de ex., o celulă bacteriană Gram-negativă, pentru a facilita absorbţia celui de-al doilea agent activ în acea celulă. Astfel, agenţii care altfel sunt incapabili sau slabi la traversarea membranei exterioare pot fi absorbiţi într-o celulă ţintă prin acţiunea compuşilor cu formula (II).

Într-o variantă de realizare, combinaţia unui compus cu formula (II) cu al doilea agent activ este activă împotriva bacteriilor Gram-negative. Aici, nu este esenţial ca, individual, oricare dintre compusul cu formula (II) sau al doilea agent activ să aibă activitate împotriva bacteriilor Gram-negative.

Într-o variantă de realizare, al doilea agent activ este un agent care are o valoare MIC măsurată împotriva unui microorganism particular, cum ar fi o bacterie, care este mai mică decât 10, mai mică decât 5 sau mai mică decât 1 microgram/ml. Microorganismul poate fi o bacterie Gram-negativă, cum ar fi o bacterie Gram-negativă selectată din grupul constând din E. coli, S. enterica, K. pneumoniae, K. oxytoca; E. cloacae, E. aerogenes, E. agglomerans, A. calcoaceticus, A. baumannii; Pseudomonas aeruginosa şi Stenotrophomonas maltophila.

Exemple de al doilea agent activ care are activitate împotriva bacteriilor Gram-negative includ beta-lactame, tetracicline, aminoglicozide şi chinolone.

Într-o variantă de realizare, al doilea agent activ este un agent care are o valoare MIC măsurată împotriva unui microorganism particular, cum ar fi o bacterie Gram-negativă, adică mai mare decât 4, mai mare decât 8, mai mare decât 16 sau mai mare decât 32 micrograme/ml. În această variantă de realizare, al doilea agent activ poate fi activ împotriva bacteriilor Gram-pozitive. De exemplu, al doilea agent activ este un agent care are o valoare MIC măsurată împotriva unei anumite bacterii Gram-pozitive care este mai mică decât 10, mai mică de 5 sau mai mică decât 1 microgram/ml. Aici, compusul cu formula (II) acţionează pentru a facilita absorbţia celui de-al doilea agent activ în celula bacteriană Gram-negativă. Cel de-al doilea agent activ este, prin urmare, capabil să acţioneze asupra unei ţinte în interiorul celulei bacteriene Gram-negative, ţintă care poate fi aceeaşi cu ţinta celui de-al doilea agent activ într-o celulă bacteriană Gram-pozitivă.

Bacteriile Gram-pozitive pot fi selectate din grupul constând din bacterii Staphylococcus şi Streptococcus, cum ar fi S. aureus (incluzând MRSA), S.

epidermis, E. faecalis şi E. faecium.

Exemple de al doilea agent activ care au activitate împotriva bacteriilor Gram-pozitive (la valorile MIC date mai sus, de exemplu) şi activitate moderată împotriva bacteriilor Gram-negative, includ rifampicină, novobiocină, macrolide, pleuromutiline. Într-o variantă de realizare, un compus care are activitate moderată împotriva bacteriilor Gram-negative poate avea o valoare MIC măsurată împotriva unei bacterii Gram-negative care este mai mică decât 32, mai mică decât 64 sau mai mică decât 128 micrograme/ml.

De asemenea, sunt adecvaţi pentru utilizare agenţi care au activitate împotriva bacteriilor Gram-pozitive şi care sunt în principal inactivi împotriva bacteriilor Gram-negative. Exemple includ acid fusidic, oxazolidinine (de ex., linezolid), glicopeptide (de ex., vancomicină), daptomicină şi lantibiotice. Într-o variantă de realizare, un compus care, în principal, nu are activitate împotriva bacteriilor Gram-negative poate avea o valoare MIC măsurată în raport cu cea a unei bacterii Gram-negative care este mai mare decât 32, mai mare decât 64, mai mare decât 128, mai mare decât 256 micrograme/ml.

În circumstanţe normale, astfel de agenţi nu sunt neapărat adecvaţi pentru utilizare împotriva bacteriilor Gram-negative din cauza capacităţii lor relativ slabe de a traversa membrana exterioară a unei celule bacteriene Gram-negative. Aşa cum a fost explicat mai sus, atunci când sunt utilizaţi împreună cu un compus cu formula (II), astfel de agenţi sunt adecvaţi pentru utilizare.

Într-o variantă de realizare, agentul activ poate fi selectat din grupul constând din rifampicină (rifampină), rifabutină, rifalazil, rifapentină, rifaximină, aztreonam, oxacilină, novobiocină, acid fusidic, azitromicină, ciprofloxacină, meropenem, tigeciclină, minociclină, eritromicină, claritromicină şi mupirocină, şi săruri, solvaţi şi forme de promedicament acceptabile farmaceutic ale acestora.

Inventatorii prezentei au descoperit că compuşii de polimixină cu formula (II) pot fi utilizaţi împreună cu anumiţi compuşi din familia rifamicinei pentru a trata infecţiile microbiene. Familia rifamicinei include izolate rifamicină A, B, C, D, E, S şi SV şi versiuni derivate sintetic ale acestor compuşi, cum ar fi rifampicină (rifampină), rifabutină, rifalazil, rifapentină, şi rifaximină, şi săruri şi solvaţi acceptabile farmaceutic ale acestora.

Într-o variantă de realizare, agentul activ este rifampicină (rifampină) şi sărurile, solvaţii şi forme de promedicament acceptabile farmaceutic ale acesteia.

Săruri, solvaţi şi alte forme

Exemple de săruri ale compusului cu formula (II) includ toate sărurile acceptabile farmaceutic, cum ar fi, fără limitare, săruri de adiţie acidă ale acizilor minerali puternici, cum ar fi săruri de HCI şi HBr, şi săruri de adiţie ale acizilor organici puternici, cum ar fi o sare de acid metansulfonic. Alte exemple de săruri includ sulfaţi şi acetaţi, cum ar fi acetat în sine, trifluoracetat sau tricloracetat.

Într-o variantă de realizare, compuşii din prezenta dezvăluire sunt furnizaţi sub forma unei sări sulfat sau a unei sări a acidului trifluoracetic (TFA). Într-o variantă de realizare, compuşii din prezenta dezvăluire sunt furnizaţi sub formă de săruri acetat, cum ar fi acetat.

Un compus cu formula (II) poate fi formulat, de asemenea, sub forma unui promedicament. Promedicamentele pot include un compus antibacterian descris aici, în care una sau mai multe grupări amino sunt protejate cu o grupare care poate fi scindată in vivo, pentru a elibera compusul biologic activ. Într-o variantă de realizare, promedicamentul este un "promedicament amină". Exemple de promedicamente amine includ sulfometil, aşa cum este descris în, de ex., Bergen şi colab., Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 2006, 50, 1953 sau HSO3-FMOC, aşa cum este descris în de ex.. Schechter şi colab., J.Med Chem 2002, 45(19) 4264, şi săruri ale acestuia. Alte exemple de promedicamente amine sunt date de către Krise şi Oliyai în Biotechnology: Pharmaceutical Aspects, 2007, 5(2), 101-131.

Într-o variantă de realizare, un compus cu formula (II) este furnizat sub forma unui promedicament.

O referire la un compus cu formula (II), sau la orice alt compus descris aici, este, de asemenea, o referire la un solvat al acelui compus. Exemple de solvaţi includ hidraţi.

Un compus cu formula (II), sau orice alt compus descris aici, include un compus în care un atom este înlocuit cu un izotop existent în mod natural sau care nu este natural. Într-o variantă de realizare, izotopul este un izotop stabil. Astfel, un compus descris aici include, de exemplu, compuşi care conţin deuteriu şi altele asemenea. De exemplu, H poate fi în orice formă izotopică, incluzând 1H, 2H (D) şi 3H (T); C poate fi în orice formă izotopică, incluzând 12C, 13C, şi 14C; O poate fi în orice formă izotopică, incluzând 16O şi 18O; şi altele asemenea.

Anumiţi compuşi cu formula (II) sau orice alt compus descris aici, pot exista în una sau mai multe forme particulare geometrice, optice, enantiomerice, diasteriomere, epimere, atropice, stereoizomerice, tautomerice, conformaţionale sau anomerice, incluzând, dar fără limitare la, forme cis şi trans; forme E şi Z; forme c-, t- şi r-; forme endo- şi exo-; forme R-, S- şi mezo-; forme D- şi L-; forme d- şi I-; forme (+) şi (-); forme ceto-, enol- şi enolat; forme syn- şi anti-; forme sinclinale şi anticlinale; formele α şi β; forme axiale şi ecuatoriale; forme de barcă, scaun, răsucite, plic şi jumătate de scaun; şi combinaţii ale acestora, denumite în continuare în mod colectiv „izomeri» (sau „forme izomerice»).

Este de reţinut că, cu excepţia celor discutate mai jos pentru formele tautomerice, sunt excluşi în mod specific din termenul "izomeri", aşa cum este utilizat aici, izomerii structurali (sau constituţionali) (adică izomerii care diferă în ceea ce priveşte conexiunile dintre atomi şi nu doar prin poziţia atomilor în spatiu). De exemplu, o referire la o grupare metoxi, -OCH3, nu trebuie interpretată ca o referire la izomerul său structural, o grupare hidroximetil, -CH2OH. În mod similar, o referire la orto-clorfenil nu trebuie interpretată ca o referire la izomerul său structural, meta-clorfenil. Cu toate acestea, o referire la o clasă de structuri poate include foarte bine forme izomerice structural care se încadrează în acea clasă (de ex., C1-6alchil include n-propil şi izo-propil; butil include n-, izo-, sec- şi terţ-butil; metoxifenil include orto-, meta- şi para-metoxifenil).

Cu excepţia cazului în care se specifică altfel, o referire la un anumit compus include toate astfel de forme izomerice, incluzând amestecuri (de ex., amestecuri racemice) ale acestora. Metode de preparare (de ex., sinteză asimetrică) şi separare (de ex., mijloace de cristalizare fracţionată, şi cromatografice) a unor astfel de forme izomerice sunt, fie cunoscute în domeniu, fie sunt uşor obţinute prin adaptarea într-un mod cunoscut a metodelor prezentate aici sau a metodelor cunoscute.

Un aspect al prezentei invenţii se referă la compuşi în formă substanţial purificată şi/sau într-o formă substanţial lipsită de contaminanţi.

Într-o variantă de realizare, forma substanţial purificată are cel puţin 50% în greutate, de exemplu, cel puţin 60% în greutate, de exemplu, cel puţin 70% în greutate, de exemplu, cel puţin 80% în greutate, de exemplu, cel puţin 90% în greutate, de exemplu, cel puţin 95% în greutate, de exemplu, cel puţin 97% în greutate, de exemplu, cel puţin 98% în greutate, de exemplu, cel puţin 99% în greutate.

Cu excepţia cazului în care este specificat, forma substanţial purificată se referă la compus în orice formă stereoizomerică sau enantiomerică. De exemplu, într-o variantă de realizare, forma substanţial purificată se referă la un amestec de stereoizomeri, adică, purificat în ceea ce priveşte alţi compuşi. Într-o variantă de realizare, forma substanţial purificată se referă la un stereoizomer, de exemplu, stereoizomer optic pur. Într-o variantă de realizare, forma substanţial purificată se referă la un amestec de enantiomeri. Într-o variantă de realizare, forma substanţial purificată se referă la un amestec echimolar de enantiomeri (adică, un amestec racemic, un racemat). Într-o variantă de realizare, forma substanţial purificată se referă la un enantiomer, de exemplu, enantiomer optic pur.

Într-o variantă de realizare, contaminanţii reprezintă cel mult 50% în greutate, de exemplu, nu mai mult decât 40% în greutate, de exemplu, nu mai mult decât 30% în greutate, de exemplu, nu mai mult decât 20% în greutate, de exemplu, nu mai mult decât 10% în greutate, de exemplu, nu mai mult decât 5% în greutate, de exemplu, nu mai mult decât 3% în greutate, de exemplu, nu mai mult decât 2% în greutate, de exemplu, nu mai mult decât 1% în greutate.

Cu excepţia cazului în care este specificat, contaminanţii se referă la alţi compuşi, adică alţii decât stereoizomerii sau enantiomerii. Într-o variantă de realizare, contaminanţii se referă la alţi compuşi şi alţi stereoizomeri. Într-o variantă de realizare, contaminanţii se referă la alţi compuşi şi la celălalt enantiomer.

Într-o variantă de realizare, forma substanţial purificată este optic pură cel puţin 60% (adică, 60% din compus, pe o bază molară, este stereoizomerul sau enantiomerul dorit şi 40% este stereoizomerul sau enantiomerul nedorit), de exemplu, cel puţin 70% optic pură, de exemplu, cel puţin 80% optic pură, de exemplu, cel puţin 90% optic pură, de exemplu, cel puţin 95% optic pură, de exemplu, cel puţin 97% optic pură, de exemplu, cel puţin 98% optic pură, de exemplu, cel puţin 99% optic pură.

Metode de tratament

Compuşii cu formula (II) sau formulările farmaceutice care conţin aceşti compuşi sunt adecvate pentru utilizare în metode de tratament şi profilaxie. Compuşii pot fi administraţi unui subiect care are nevoie de aceştia. Compuşii sunt adecvaţi pentru utilizare împreună cu un agent activ ("un al doilea agent activ"), de exemplu, un al doilea agent activ care este un agent antimicrobian.

Compuşii cu formula (II) sunt utilizaţi într-o metodă de tratament a corpului uman sau animal prin terapie. În unele aspecte ale invenţiei, un compus cu formula (II) poate fi administrat unui subiect mamifer, cum ar fi un om, pentru a trata o infecţie microbiană.

Termenul "infecţie microbiană" se referă la invadarea animalului gazdă de către microbi patogeni. Aceasta include creşterea excesivă a microbilor care sunt prezenţi în mod normal în sau pe corpul unui animal. Mai general, o infecţie microbiană poate fi orice situaţie în care prezenţa unei populaţii microbiene este dăunătoare unui animal gazdă. Astfel, un animal „suferă» de o infecţie microbiană atunci când un număr excesiv de populaţie microbiană este prezent în sau pe corpul unui animal, sau când prezenţa unei populaţii microbiene afectează celulele sau alt ţesut al unui animal.

Compuşii pot fi utilizaţi pentru a trata un subiect care are o infecţie microbiană, sau care are risc de infecţie cu un microorganism, cum ar fi o bacterie.

Infecţia microbiană poate fi o infecţie bacteriană, cum ar fi o infecţie bacteriană Gram-negativă.

Exemple de bacterii Gram-negative includ, dar nu se limitează la, Escherichia spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., Citrobacter spp., şi alte Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Stenotro-

phomonas şi Legionella, şi multe altele.

Bacilii Gram negativi relevanţi din punct de vedere medical includ o multitudine de specii. Unele dintre ele cauzează, în primul rând, probleme respiratorii (Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa), în primul rând probleme urinare (Escherichia coli, Enterobacter cloacae), şi în primul rând probleme gastrointestinale (Salmonella enterica).

Bacterii Gram-negative asociate cu infecţii nosocomiale includ Acinetobacter baumannii, care provoacă bacteriemie, meningită secundară şi pneumonie asociată cu ventilator în unităţile de terapie intensivă din unităţile spitaliceşti.

Într-o variantă de realizare, specia bacteriană Gram-negativă este selectată din grupul constând din E. coli, S. enterica, K. pneumoniae, K. oxytoca; E. cloacae, E. aerogenes, E. agglomerans, A. calcoaceticus, A. baumannii; Pseudomonas aeruginosa, şi Stenotrophomonas maltophila.

Într-o variantă de realizare, specia bacteriană Gram-negativă este selectată din grupul constând din E. coli, K. pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, şi A. baumannii.

Compuşii cu formula (II) sau compoziţiile care îi cuprind sunt utile pentru tratamentul infecţiilor cutanate şi al ţesuturilor moi, infecţiilor gastrointestinale, infecţiilor tractului urinar, pneumoniei, sepsisului, infecţiilor intra-abdominale şi al infecţiilor obstetrico/ginecologice. Infecţiile pot fi infecţii cu bacterii Gram-negative.

Compuşii cu formula (II) sau compoziţiile care îi cuprind sunt utili pentru tratamentul infecţiilor cu Pseudomonas, incluzând infecţii cu P. aeruginosa, de exemplu, infecţii ale pielii şi ale ţesuturilor moi, infecţii gastrointestinale, infecţii ale tractului urinar, pneumonie şi sepsis.

Compuşii cu formula (II) sau compoziţiile care îi cuprind sunt utile pentru tratamentul infecţiilor cu Acinetobacter, incluzând infecţie cu A. baumanii, pentru pneumonie, infecţii ale plăgilor, infecţii ale tractului urinar, şi sepsis.

Compuşii cu formula (II) sau compoziţiile care îi cuprind sunt utile pentru tratamentul infecţiei cu Klebsiella, incluzând infecţia cu K. pneumoniae, pentru pneumonie, infecţie intra-abdominală, infecţie a tractului urinar, meningită şi sepsis.

Compuşii cu formula (II) sau compoziţiile care îi cuprind sunt utile pentru tratamentul infecţiei cu E coli, incluzând infecţii cu E. coli, pentru bacteriemie, colecistită, colangită, infecţie intra-abdominală, infecţie urinară, meningită neonatală şi pneumonie.

Compuşii cu formula (II) sau compoziţiile care îi cuprind pot fi utilizate împreună cu un agent activ în metode de tratament.

Agentul activ poate fi un agent care are activitate împotriva microorganismului. Agentul activ poate fi activ împotriva bacteriilor Gram-negative. Agentul activ poate fi activ împotriva unui microorganism selectat din lista de mai sus.

Într-o variantă de realizare, al doilea agent activ are o valoare MIC de 10 micrograme/ml sau mai mică împotriva unui microorganism, cum ar fi E. coli, în absenţa compusului cu formula (II). Microorganismul poate fi un microorganism selectat din grupul de mai sus.

Compuşi specifici pentru utilizare ca al doilea agent activ sunt descrişi aici şi includ:

rifampicină, rifabutină, rifalazil, rifapentină şi rifaximină;

oxacilină, meticilină, ampicilină, cloxacilină, carbenicilină, piperacilină, tricarcilină, flucloxacilină, şi nafcilină;

azitromicină, claritromicină, eritromicină, telitromicină, cetromicină, şi solitromicină;

aztreonam şi BAL30072;

meropenem, doripenem, imipenem, ertapenem, biapenem, tomopenem, şi panipenem;

tigeciclină, omadaciclină, eravaciclină, doxiciclină, şi minociclină;

ciprofloxacină, levofloxacină, moxifloxacină, şi delafloxacină;

acid fusidic;

novobiocină;

teicoplanină, telavancin, dalbavancin, şi oritavancin,

şi săruri şi solvaţi acceptabile farmaceutic ale acestora;

Într-o variantă de realizare, sunt descrişi aici compuşi specifici pentru utilizare ca al doilea agent activ, şi includ rifampicină (rifampină), rifabutină, rifalazil, rifapentină, rifaximină, aztreonam, oxacilină, novobiocină, acid fusidic, azitromicină, ciprofloxacină, meropenem, tigeciclină, eritromicină, claritromicină şi mupirocină, şi săruri şi solvaţi acceptabile farmaceutic ale acestora.

Într-un aspect alternativ, compuşii cu formula (II) sunt adecvaţi pentru utilizare în tratamentul infecţiilor fungice, de exemplu, în combinaţie împreună cu un agent antifungic. Agentul antifungic poate fi selectat dintre un antifungic polienic, de exemplu, amfotericină B, un antifungic imidazol, triazol sau tiazol, de exemplu, miconazol, fluconazol sau abafungin, o alilamină, o echinocandină, sau alt agent, de exemplu, ciclopirox.

Tratament

Termenul „tratament», aşa cum este utilizat aici în contextul tratării unei afecţiuni, se referă, în general, la tratament şi terapie, indiferent dacă este vorba despre un om sau un animal (de ex., în aplicaţii veterinare), în care se obţine un anumit efect terapeutic dorit, de exemplu, inhibarea progresului afecţiunii, şi include o reducere a ratei de progres, o oprire a ratei de progres, atenuarea simptomelor afecţiunii, ameliorarea afecţiunii şi vindecarea afecţiunii. Tratamentul ca o măsură profilactică (adică, profilaxie), de asemenea, este inclus. De exemplu, utilizarea la pacienţi care nu au dezvoltat încă afecţiunea, dar care prezintă riscul de a dezvolta afecţiunea, este cuprinsă de termenul „tratament».

Termenul „cantitate eficientă terapeutic», aşa cum este utilizat aici, se referă la acea cantitate de un compus, sau de un material, compoziţie sau formă de dozare care cuprinde un compus, care este eficientă pentru producerea unui efect terapeutic dorit, proporţional cu un raport beneficiu/risc rezonabil, atunci când este administrat în conformitate cu un regim de tratament dorit.

Termenul "tratament" include tratamente şi terapii combinate, aşa cum este descris aici, în care două sau mai multe tratamente sau terapii sunt combinate, de exemplu, succesiv sau simultan.

Terapie combinată

Un compus cu formula (II) poate fi administrat împreună cu un agent activ. Administrarea poate fi simultană, separată sau succesivă.

Metodele şi modul de administrare vor depinde de farmacocinetica compusului cu formula (II) şi a celui de-al doilea agent activ.

Prin administrare "simultană", se înţelege că un compus cu formula (II) şi un al doilea agent activ sunt administraţi unui subiect într-o singură doză prin aceeaşi cale de administrare.

Prin administrare „separată», se înţelege că un compus cu formula (II) şi un al doilea agent activ sunt administrate unui subiect prin două căi diferite de administrare, având loc în acelaşi timp. Acest lucru poate să aibă loc, de exemplu, atunci când un agent este administrat prin perfuzie, iar celălalt este administrat oral în timpul perfuziei.

Prin „succesiv» se înţelege că cei doi agenţi sunt administraţi la momente de timp diferite, cu condiţia ca activitatea primului agent administrat să fie prezentă şi continuă în subiect la momentul administrării celui de-al doilea agent activ.

În general, va exista o doză succesivă astfel încât al doilea dintre cei doi agenţi să fie administrat în 48 de ore, cum ar fi în 24 de ore, cum ar fi în 12, 6, 4, 2 sau 1 oră (ore) de la primul agent. Ca alternativă, agentul activ poate fi administrat primul, urmat de compusul cu formula (II).

În cele din urmă, ordinea şi momentul administrării compusului şi a celui de-al doilea agent activ în tratamentul combinat vor depinde de proprietăţile farmacocinetice ale fiecăruia.

Cantitatea de compus cu formula (II) care urmează să fie administrată unui subiect va depinde în cele din urmă de natura subiectului şi de boala care trebuie tratată. De asemenea, cantitatea de agent activ care urmează să fie administrată unui subiect va depinde în cele din urmă de natura subiectului şi de boala care trebuie tratată.

Formulări

Într-un aspect, prezenta invenţie furnizează o compoziţie farmaceutică care cuprinde un compus cu formula (II) împreună cu un purtător acceptabil farmaceutic. Compoziţia farmaceutică poate cuprinde suplimentar un al doilea agent activ. Într-o variantă de realizare alternativă, în care un al doilea agent activ este furnizat pentru utilizare în terapie, al doilea agent activ poate fi formulat separat de compusul cu formula (II). Comentariile de mai jos făcute în legătură cu compusul cu formula (II) se pot aplica, prin urmare, şi celui de-al doilea agent activ, aşa cum este formulat separat.

Deşi este posibil ca compusul cu formula (II) să fie administrat singur sau împreună cu al doilea agent activ, este de dorit să se prezinte ca o formulare farmaceutică (de ex., compoziţie, preparat, medicament) care cuprinde cel puţin un compus cu formula (II), aşa cum este descris aici, împreună cu unul sau mai multe alte ingrediente acceptabile farmaceutic bine cunoscute persoanelor de specialitate în domeniu, incluzând, dar fără limitare la, purtători, diluanţi, excipienţi, adjuvanţi, materiale de umplutură, tampoane, conservanţi, anti-oxidanţi, lubrifianţi, stabilizatori, agenţi de solubilizare, agenţi tensioactivi (de ex., agenţi de umectare), agenţi de mascare, agenţi de colorare, agenţi de aromatizare şi agenţi de îndulcire, acceptabile farmaceutic. Formularea poate cuprinde în plus alţi agenţi activi, de exemplu, alţi agenţi terapeutici sau profilactici.

Astfel, prezenta invenţie furnizează în plus compoziţii farmaceutice, aşa cum a fost definit mai sus. De asemenea, aici sunt descrise metode de obţinere a unei compoziţii farmaceutice, care cuprinde amestecarea a cel puţin unui compus cu formula (II), aşa cum este descris aici, împreună cu unul sau mai multe alte ingrediente acceptabile farmaceutic bine cunoscute persoanelor de specialitate în domeniu, de exemplu, purtători, diluanţi, excipienţi, etc. Dacă sunt formulate ca unităţi discrete (de ex., tablete, etc.), fiecare unitate conţine o cantitate predeterminată (doză) de compus. Compoziţia conţine în mod opţional al doilea agent activ într-o cantitate predeterminată.

Termenul „acceptabil farmaceutic», aşa cum este utilizat aici, se referă la compuşi, ingrediente, materiale, compoziţii, forme de dozare etc., care sunt, în sfera de întindere a judecăţii medicale solide, adecvate pentru utilizare în contact cu ţesuturile subiectului aflat în discuţie (de ex., om), fără toxicitate excesivă, iritaţie, răspuns alergic sau altă problemă sau complicaţie, în mod proporţional cu un raport rezonabil beneficiu/risc. Fiecare purtător, diluant, excipient etc., de asemenea, trebuie să fie „acceptabil» în sensul de a fi compatibil cu celelalte ingrediente ale formulării.

Purtători, diluanţi, excipienţi etc. adecvaţi pot fi găsiţi în textele farmaceutice standard, de exemplu, Remington's Pharmaceutical Sciences, ediţia a 18-a, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990; şi în Manual de excipienţi farmaceutici, ediţia a 5-a, 2005.

Formulările pot fi preparate prin orice metodă bine cunoscută în domeniul farmaciei. Astfel de metode includ etapa de asociere a compusului cu formula (II) cu un purtător, care constituie unul sau mai multe ingrediente accesorii. În general, formulările sunt preparate prin asociere uniformă şi intimă a compusului cu purtători (de ex., purtători lichizi, purtători solizi fin divizaţi, etc.), şi apoi modelarea produsului, dacă este necesar.

Formularea poate fi preparată pentru a asigura o eliberare rapidă sau lentă; eliberare imediată, întârziată, programată sau susţinută; sau o combinaţie a acestora.

Formulările pot să fie, în mod adecvat, sub formă de lichide, soluţii (de ex., apoase, neapoase), suspensii (de ex., apoase, neapoase), emulsii (de ex., ulei în apă, apă în ulei), elixiruri, siropuri, electuare, apă de gură, picături, tablete (incluzând, de exemplu, tablete acoperite), granule, pulberi, comprimate, pastile, capsule (incluzând, de exemplu, capsule gelatinoase tari şi moi), caşete, pilule, fiole, bolusuri, supozitoare, ovule, tincturi, geluri, paste, unguente, creme, loţiuni, uleiuri, spume, spray-uri, aburi sau aerosoli.

Formulările pot fi furnizate în mod adecvat sub formă de plasture, plasture adeziv, bandaj, pansament sau altele asemenea, care sunt impregnate cu unul sau mai mulţi compuşi şi, opţional, cu unul sau mai multe alte ingrediente acceptabile farmaceutic, incluzând, de exemplu, agenţi de penetrare, de permeaţie şi amplificatori de absorbţie. Formulările pot fi furnizate, de asemenea, în mod adecvat sub formă de depozit sau rezervor.

Compusul poate fi dizolvat în, suspendat sau amestecat cu, unul sau mai multe alte ingrediente acceptabile farmaceutic. Compusul poate fi prezentat într-un lipozom sau în alte microparticule care sunt concepute pentru a ţinti compusul, de exemplu, către componentele sanguine sau către unul sau mai multe organe. Atunci când este utilizat un lipozom, se observă că lipozomul poate conţine, atât compusul cu formula (II), cât şi un al doilea agent activ.

Formulări adecvate pentru administrare orală (de ex., prin ingestie) includ lichide, soluţii (de ex., apoase, neapoase), suspensii (de ex., apoase, neapoase), emulsii (de ex., ulei în apă, apă în ulei), elixiruri, siropuri, electuare, tablete, granule, pulberi, capsule, caşete, pilule, fiole, bolusuri.

Formulări adecvate pentru administrare bucală includ apă de gură, comprimate, pastile, precum şi plasturi, plasturi adezivi, depozite şi rezervoare. Comprimatele cuprind, în mod obişnuit, compusul într-o bază aromatizată, de obicei, zaharoză şi salcâm sau tragacant. Pastilele cuprind, în mod obişnuit, compusul într-o matrice inertă, cum ar fi gelatină şi glicerină, sau zaharoză şi salcâm. Apa de gură cuprinde, în mod obişnuit, compusul într-un purtător lichid adecvat.

Formulări adecvate pentru administrare sublinguală includ tablete, comprimate, pastile, capsule şi pilule.

Formulări adecvate pentru administrare orală transmucozală includ lichide, soluţii (de ex., apoase, neapoase), suspensii (de ex., apoase, neapoase), emulsii (de ex., ulei în apă, apă în ulei), apă de gură, comprimate, pastile, precum şi plasturi, plasturi adezivi, depozite şi rezervoare.

Formulări adecvate pentru administrare transmucozală care nu este orală includ lichide, soluţii (de ex., apoase, neapoase), suspensii (de ex., apoase, neapoase), emulsii (de ex., ulei în apă, apă în ulei), supozitoare, ovule, geluri, paste, unguente, creme, loţiuni, uleiuri, precum şi plasturi, plasturi adezivi, depozite şi rezervoare.

Formulări adecvate pentru administrare transdermică includ geluri, paste, unguente, creme, loţiuni şi uleiuri, precum şi plasturi, plasturi adezivi, bandaje, pansamente, depozite şi rezervoare.

Tabletele pot fi realizate prin mijloace convenţionale, de exemplu, comprimare sau turnare, opţional, cu unul sau mai multe ingrediente accesorii. Tablete comprimate pot fi preparate prin comprimare într-o maşină adecvată a compusului într-o formă care curge liber, cum ar fi o pulbere sau granule, amestecate opţional cu unul sau mai mulţi lianţi (de ex., povidonă, gelatină, acacia, sorbitol, tragacant, hidroxipropilmetil celuloză); materiale de umplutură sau diluanţi (de ex., lactoză, celuloză microcristalină, fosfat acid de calciu); lubrifianţi (de ex., stearat de magneziu, talc, silice); agenţi de dezintegrare (de ex., amidon glicolat de sodiu, povidonă reticulată, carboximetil celuloză de sodiu reticulată); agenţi tensioactivi sau de dispersare sau de umectare (de ex., lauril sulfat de sodiu); conservanţi (de ex., p-hidroxibenzoat de metil, p-hidroxibenzoat de propil, acid sorbic); arome, agenţi de îmbunătăţire a aromei şi îndulcitori. Tabletele turnate pot fi realizate prin turnarea într-o maşină adecvată a unui amestec de compus sub formă de pulbere umezit cu un diluant lichid inert. Tabletele pot fi opţional acoperite sau marcate, şi pot fi formulate astfel încât să asigure eliberarea lentă sau controlată a compusului din acestea utilizând, de exemplu, hidroxipropilmetil celuloză în proporţii variabile pentru a furniza profilul de eliberare dorit.

Tabletele pot fi prevăzute opţional cu o acoperire, de exemplu, pentru a afecta eliberarea, de exemplu, o acoperire enterică, pentru a asigura eliberarea în părţi ale intestinului, altele decât stomacul.

Unguentele sunt preparate de obicei din compus şi dintr-o bază de unguent parafinică sau miscibilă cu apă.

Cremele sunt preparate de obicei din compus şi o bază de cremă ulei în apă. Dacă se doreşte, faza apoasă a bazei cremei poate include, de exemplu, cel puţin aproximativ 30% g/g de alcool polihidroxilic, adică un alcool care are două sau mai multe grupări hidroxil, cum ar fi propilenglicol, butan-1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol şi polietilenglicol, şi amestecuri ale acestora. Formulările topice pot include în mod dorit un compus care amplifică absorbţia sau penetrarea compusului prin piele sau prin alte zone afectate. Exemple de astfel de amplificatori de penetrare dermică includ dimetilsulfoxid şi analogi înrudiţi.

Emulsiile sunt preparate, în mod obişnuit, din compus şi o fază uleioasă, care poate cuprinde opţional doar un emulgator (cunoscut altfel ca emulsionant), sau poate cuprinde un amestec de cel puţin un emulgator cu o grăsime sau un ulei, sau, atât cu o grăsime, cât şi cu un ulei. Un emulgator hidrofil poate fi inclus împreună cu un emulgator lipofil care acţionează ca un stabilizator. De asemenea, este posibil să se includă, atât un ulei, cât şi o grăsime. Împreună, emulgatorii cu sau fără stabilizator (stabilizatori) formează aşa-numita ceară emulsionantă, iar ceara împreună cu uleiul şi/sau grăsimea formează aşa-numita bază de unguent emulgator care formează faza uleioasă dispersată a formulărilor de cremă.

Emulsionanţii şi stabilizatorii de emulsie adecvaţi includ Tween 60, Span 80, alcool cetostearilic, alcool miristil, monostearat de gliceril şi lauril sulfat de sodiu. Alegerea uleiurilor sau grăsimilor adecvate pentru formulare se bazează pe obţinerea proprietăţilor cosmetice dorite, deoarece solubilitatea compusului în majoritatea uleiurilor care pot fi utilizate în formulările de emulsii farmaceutice poate fi foarte scăzută. Astfel, crema ar trebui să fie un produs care nu este gras, care nu pătează şi lavabil, cu consistenţă adecvată pentru a evita scurgerea din tuburi sau alte recipiente. Pot fi utilizaţi esteri alchilici mono- sau dibazici cu lanţ liniar sau ramificat, cum ar fi di-izoadipat, izocetil stearat, diester de propilenglicol al acizilor graşi de cocos, miristat de izopropil, decil oleat, izopropil palmitat, butil stearat, 2-etilhexil palmitat, sau un amestec de esteri cu lanţ ramificat cunoscuţi cu denumirea de Crodamol CAP. Acestea pot fi utilizate singure sau în combinaţie, în funcţie de proprietăţile necesare. Ca alternativă, pot fi utilizate lipide cu punct de topire mare, cum ar fi parafină albă moale şi/sau parafină lichidă, sau alte uleiuri minerale.

Formulări adecvate pentru administrare intranazală, în care purtătorul este un lichid, includ, de exemplu, spray nazal, picături nazale, sau pentru administrare de aerosoli prin nebulizator, includ soluţii apoase sau uleioase de compus. Ca o metodă alternativă de administrare, o pulbere uscată pentru administrare poate fi utilizată ca alternativă la aerosoli nebulizaţi.

Formulări adecvate pentru administrare intranazală, în care purtătorul este un solid, le includ, de exemplu, pe cele prezentate sub forma unei pulberi grosiere care are o dimensiune a particulei, de exemplu, în intervalul de la aproximativ 20 până la aproximativ 500 microni, care este administrată în modul în care este prizat tutunul, adică prin inhalare rapidă prin orificiul nazal dintr-un recipient cu pulbere ţinut aproape de nas.

Formulări adecvate pentru administrare pulmonară (de ex., prin terapie prin inhalare sau insuflare) le includ pe cele prezentate sub forma unui spray de aerosoli dintr-un ambalaj presurizat, cu utilizarea unui propulsor adecvat, cum ar fi diclordifluormetan, triclorfluormetan, diclortetrafluoretan, dioxid de carbon sau alte gaze adecvate. Suplimentar sau ca alternativă, o formulare pentru administrare pulmonară poate fi formulată pentru administrare dintr-un nebulizator sau dintr-un inhalator de pulbere uscată. De exemplu, formularea poate fi furnizată cu purtători sau lipozomi pentru a asigura o dimensiune adecvată a particulelor pentru a ajunge la părţile corespunzătoare ale plămânului, pentru a ajuta la eliberarea unei substanţe adecvate pentru a spori reţinerea în ţesutul pulmonar.

Formulări adecvate pentru administrare oculară includ picături pentru ochi în care compusul este dizolvat sau suspendat într-un purtător adecvat, în special, un solvent apos pentru compus.

Formulări adecvate pentru administrare rectală pot fi prezentate sub forma unui supozitor cu o bază adecvată care cuprinde, de exemplu, uleiuri naturale sau întărite, ceară, grăsimi, polioli semi-lichizi sau lichizi, de exemplu, unt de cacao sau un salicilat; sau sub forma unei soluţii sau suspensii pentru tratament prin clismă.

Formulări adecvate pentru administrare vaginală pot fi prezentate sub formă de ovule, tampoane, creme, geluri, paste, spume sau formulări spray care conţin în plus faţă de compus, astfel de purtători care sunt cunoscuţi în domeniu ca fiind adecvaţi.

Formulări adecvate pentru administrare parenterală (de ex., pentru exemplu, prin injecţie sau perfuzie, intravenoasă sau subcutanată), includ lichide apoase sau neapoase, izotonice, apirogene, sterile (de ex., soluţii, suspensii), în care compusul este dizolvat, suspendat sau este furnizat în alt mod (de ex., într-un lipozom sau alte microparticule). Astfel de lichide pot conţine în plus alte ingrediente acceptabile farmaceutic, cum ar fi antioxidanţi, tampoane, conservanţi, stabilizatori, agenţi bacteriostatici, agenţi de suspendare, agenţi de îngroşare şi substanţe dizolvate care fac formularea izotonică cu sângele (sau cu alt fluid corporal relevant) beneficiarului dorit. Exemple de excipienţi includ, de exemplu, apă, alcooli, zaharuri, polioli, glicerol, uleiuri vegetale şi altele asemenea. Exemple de purtători izotonici adecvaţi pentru utilizare în astfel de formulări includ soluţii pentru injecţii cu clorură de sodiu, soluţia Ringer sau soluţii Ringer pentru injecţii cu lactat. În mod obişnuit, concentraţia de compus în lichid este de la aproximativ 1 ng/ml până la aproximativ 500 µg/mL, de exemplu, aproximativ 1 ng/ml până la aproximativ 100 µg/mL, de exemplu, de la aproximativ 10 ng/ml până la aproximativ 10 µg/mL, de exemplu, de la aproximativ 10 ng/mL până la aproximativ 1 µg/mL. Formulările pot fi prezentate în recipiente sigilate cu doză unitară sau cu mai multe doze, de exemplu, fiole şi flacoane, şi pot fi depozitate într-o stare uscată prin congelare (liofilizată) care necesită doar adăugarea de purtător lichid steril, de exemplu, apă pentru injecţii, imediat înainte de utilizare. Soluţiile şi suspensiile injectabile extemporanee pot fi preparate din pulberi, granule şi tablete sterile.

Doză

În general, metodele din invenţie pot cuprinde administrarea la un subiect a unei cantităţi eficiente de un compus cu formula (II), astfel încât să asigure un efect antimicrobian. Compusul cu formula (II) poate fi administrat într-o cantitate suficientă pentru a potenţa activitatea unui al doilea agent activ. Al doilea agent activ este administrat unui subiect într-o cantitate eficientă, astfel încât să asigure un efect antimicrobian.

Se va aprecia de către un specialist în domeniu că dozele adecvate de compus cu formula (II) sau de agent activ, şi de compoziţiile care cuprind compusul cu formula (II) sau agentul activ pot varia de la pacient la pacient. Determinarea dozei optime va implica, în general, echilibrarea nivelului de beneficiu terapeutic în raport cu orice risc sau efecte secundare dăunătoare. Nivelul de dozare selectat va depinde de o varietate de factori incluzând, dar fără limitare la, activitatea compusului particular cu formula (II) sau a agentului activ, calea de administrare, perioada de administrare, viteza de excreţie a compusul, durata tratamentului, alte medicamente, compuşi şi/sau materiale utilizate în combinaţie, severitatea afecţiunii şi specia, sexul, vârsta, greutatea, afecţiunea, starea generală de sănătate şi antecedentele medicale ale pacientului. Cantitatea de compus cu formula (II) sau de agent activ şi calea de administrare vor fi în cele din urmă la latitudinea medicului, medicului veterinar sau a clinicianului, deşi, în general, doza va fi selectată pentru a atinge concentraţiile locale la situsul de acţiune care să realizeze efectul dorit fără a provoca efecte secundare dăunătoare sau nocive substanţiale.

Administrarea poate fi efectuată într-o singură doză, continuu sau intermitent (de ex., în doze divizate la intervale adecvate) pe tot parcursul tratamentului. Metodele de determinare a celor mai eficiente mijloace şi doză pentru administrare sunt bine cunoscute de persoanele de specialitate în domeniu, şi vor varia în funcţie de formularea utilizată pentru terapie, scopul terapiei, celula (celulele) ţintă care este tratată, şi subiectul care este tratat. Pot fi efectuate administrări unice sau multiple, cu nivelul de doză şi modelul selectat de medicul curant, medicul veterinar sau clinician.

În general, o doză adecvată de un compus cu formula (II) sau agent activ este în intervalul de la aproximativ 10 µg până la aproximativ 250 mg (mai obişnuit, de la aproximativ 100 µg până la aproximativ 25 mg) la fiecare kilogram de greutate corporală a subiectului, pe zi. Atunci când compusul cu formula (II) sau agentul activ este o sare, un ester, o amidă, un promedicament sau altele asemenea, cantitatea administrată este calculată pe baza compusului de bază şi, astfel, greutatea reală care trebuie utilizată este crescută în mod proporţional.

Kit-uri

Un aspect descris aici, dar care nu face parte din invenţie, se referă la un kit care cuprinde (a) un compus cu formula (II) sau o compoziţie care cuprinde un compus aşa cum este definit în oricare dintre formulele (II), de ex., furnizat în mod obişnuit într-un recipient adecvat şi/sau cu ambalaj adecvat; şi (b) instrucţiuni de utilizare, de exemplu, instrucţiuni scrise despre cum să se administreze compusul sau compoziţia.

Instrucţiunile scrise pot include, de asemenea, o listă de indicaţii pentru care compusul cu formula (II) este un tratament adecvat.

Într-o variantă de realizare, trusa cuprinde suplimentar (c) un al doilea agent activ sau o compoziţie care cuprinde al doilea agent activ. Aici, instrucţiunile scrise pot include, de asemenea, o listă de indicaţii pentru care al doilea agent activ, împreună cu compusul cu formula (II), este adecvat pentru tratament.

Căi de administrare

Un compus cu formula (II), un al doilea agent activ sau o compoziţie farmaceutică care cuprinde compusul cu formula (II) sau al doilea agent activ poate fi administrată unui subiect prin orice cale convenabilă de administrare, fie sistemic/periferic, fie topic (adică la situsul de acţiune dorit).

Căile de administrare includ, dar nu sunt limitate la, orală (de ex., prin ingestie); bucală; sublinguală; transdermică (incluzând, de ex., printr-un plasture, pansament, etc.); transmucozală (incluzând, de exemplu, printr-un plasture, pansament, etc.); intranazală (de ex., prin spray nazal); oculară (de ex., prin picături pentru ochi); pulmonară (de ex., prin inhalare sau terapie prin insuflare folosind, de exemplu, un aerosol, de exemplu, prin gură sau nas); rectală (de ex., prin supozitor sau clismă); vaginală (de ex., prin pesar); parenterală, de exemplu, prin injectare, sau perfuzie, incluzând subcutanată, intradermică, intramusculară, intravenoasă, intraarterială, intracardiacă, intratecală, intraspinală, intracapsulară, subcapsulară, intraorbitală, intraperitoneală, intratraheală, subcuticulară, intraarticulară, subarahnoidă şi intrasternală; prin implantarea unui depozit sau rezervor, de exemplu, subcutanat sau intramuscular.

Subiectul / Pacientul

Subiectul/pacientul poate fi un cordat, un vertebrat, un mamifer, un mamifer placentar, un marsupial (de ex., cangur, wombat), o rozătoare (de ex., un porc de guineea, un hamster, un şobolan, un şoarece), murină ( de ex., un şoarece), un lagomorf (de ex., un iepure), aviar (de ex., o pasăre), canin (de ex., un câine), felin (de ex., o pisică), ecvin (de ex., un cal), porcină (de ex., un porc), ovină (de ex., o oaie), bovină (de ex., o vacă), o primată, simian (de ex., o maimuţă sau antropoid), o maimuţă (de ex., marmoset, babuin), un antropoid (de ex., gorilă, cimpanzeu, urangutan, gibon) sau un om. În plus, subiectul/pacientul poate fi oricare dintre formele sale de dezvoltare, de exemplu, un fetus.

Într-o variantă de realizare, subiectul/pacientul este un om.

De asemenea, este avut în vedere că invenţia poate fi pusă în practică pe un animal non-uman care are o infecţie microbiană. Un mamifer non-uman poate fi o rozătoare. Rozătoarele includ şobolani, şoareci, porci de guineea, chinchilla, şi alte rozătoare mici de dimensiuni similare utilizate în cercetările de laborator.

Alte opţiuni

Fiecare şi toate combinaţiile compatibile ale variantelor de realizare descrise mai sus sunt dezvăluite în mod explicit aici, ca şi cum fiecare combinaţie ar fi prezentată individual şi explicit.

Diverse alte aspecte şi variante de realizare a prezentei invenţii vor fi evidente pentru persoanele de specialitate în domeniu care au în vedere prezenta dezvăluire.

"şi/sau" atunci când este utilizat aici trebuie să fie considerată dezvăluire specifică a fiecăreia dintre cele două caracteristici sau componente specificate, cu sau fără cealaltă. De exemplu, "A şi/sau B" trebuie considerate dezvăluiri specifice pentru fiecare dintre (i) A, (ii) B, şi (iii) A şi B, la fel ca şi cum fiecare ar fi prezentat individual aici.

Cu excepţia cazului în care contextul dictează altfel, descrierile şi definiţiile caracteristicilor prezentate mai sus nu sunt limitate la niciun aspect sau variantă de realizare particulară a invenţiei, şi se aplică în mod egal tuturor aspectelor şi variantelor de realizare care sunt descrise. În cazul în care variantele de realizare adecvate din punct de vedere tehnic pot fi combinate, dezvăluirea se extinde la toate permutările şi combinaţiile variantelor de realizare furnizate aici.

Anumite aspecte şi variante de realizare a invenţiei vor fi acum ilustrate cu titlu de exemplu şi cu referire la figurile descrise mai sus.

Exemple

Următoarele exemple sunt furnizate numai pentru a ilustra prezenta invenţie şi nu au scopul de a limita sfera de întindere a invenţiei, aşa cum este descris aici.

Abrevieri

Abreviere Semnificaţie PMBN Nonapeptidă de polimixină B PMB Polimixină B Thr Treonină Ser Serină DSer D-serină Leu leucină lie izoleucină Phe Fenilalanină Dphe D-fenilalanină Val Valină Dab Acid α,γ-diaminobutiric DIPEA N,N-diizopropiletilamină HATU hexafluorofosfat de 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1-3,3-tetrametiluronium DCM Diclormetan TFA Acid trifluoracetic ND Nedeterminat N/A Nu se aplică DMF N,N-dimetilformamidă PMBH Heptapeptidă de polimixină B (3-10) PMBD Decapepidă de Polimixină B Pro Prolină Dap acid α,β-diaminopropionic Gly Glicină NorLeu Norleucină Ruphos 2-Diciclohexilfosfino-2',6'-diizopropoxibifenil Xphos 2-Diciclohexilfosfino-2',4',6'-triizopropilbifenil SFC Cromatografie de fluid supercritic Fmoc Fluorenilmetiloxicarbonil Cbz Benziloxicarbonil HCTU hexafluorofosfat de O-(1H-6-clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronium Boc terţ-butiloxicarbonil PyBOP hexafluorofosfat de (Benzotriazol-1-iloxi)tripirolidinofosfoniu NMM morfolină de N-metil THF Tetrahirofuran ivDde 1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-iliden)-3-metilbutil DPPA Difenilfosporil azidă TIS Tri-izopropil silan HOBt 1-hidroxibenzotriazol IPA Izopropanol

Exemple de sinteză

Sinteza acizilor de capăt N-terminal

În prezenta lucrare, acizi 4-aminobutanoici 3-substituiţi au fost utilizaţi în formă protejată adecvat. Sinteza aminoacizilor care nu sunt standard este detaliată mai jos împreună cu metodologia de separare a enantiomerilor

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic - Izomerul 1 şi Izomerul 2

(i) 3-(3-clorfenil)-4-nitrobutanoat de metil

Un amestec de acid 3-clorocinamic (10 g), metanol (100 ml) şi acid sulfuric concentrat (4 ml) a fost agitat la temperatura camerei timp de 20 de ore. Amestecul a fost evaporat până la uscare, şi reziduurile au fost împărţite între diclormetan (DCM) şi apă. Faza apoasă a fost separată şi extrasă cu DCM suplimentar. Extractele organice au fost combinate, au fost uscate cu sulfat de magneziu, au fost filtrate şi evaporate până la uscare, pentru a se obţine esterul metilic sub forma unui solid alb (10,19 g). Acest solid a fost dizolvat în nitrometan (32 mL) şi a fost tratat cu 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-enă (DBU) (8,5 mL). Amestecul a fost agitat la temperatura camerei timp de 20 ore, apoi a fost evaporat până la uscare şi reziduurile au fost împărţite între HCI 0,5 M apos şi dietil eter. Faza apoasă a fost separată şi extrasă cu dietil eter suplimentar. Extractele organice au fost combinate, au fost spălate cu saramură, au fost uscate cu sulfat de magneziu, au fost filtrate şi evaporate până la uscare. Reziduurile au fost purificate pe silice, prin eluare cu hexan şi acetat de etil (0-100%). Fracţiunile corespunzătoare au fost combinate şi evaporate până la uscare, pentru a se obţine produsul dorit sub forma unui ulei galben (9,93 g, randament 70%).

1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) 2,71-2,79 (2H, m), 3,66(3H, s), 3,93-4,01 (1H, m), 4,62 şi 4,73 (2H, ABq, apare ca 2x dd , J 12,8, 8,0 Hz), 7,11-7,28 (4H, m).

(ii) 4-amino-3-(3-clorfenil)butanoat de metil

La o soluţie de 3-(3-clorfenil)-4-nitrobutanoat de metil (9,93 g) în acid acetic (90 mL) agitată la aproximativ 0°C a fost adăugată în porţii pulbere de zinc (20,1 g) (avertisment: exotermă întârziată). Amestecul a fost lăsat să se încălzească la temperatura camerei, cu agitare timp de 19 ore. Amestecul a fost evaporat până la uscare şi reziduurile au fost împărţite între NaHCO apos şi acetat de etil. Amestecul a fost apoi filtrat prin Celite şi fazele apoase şi organice au fost separate. Faza apoasă a fost extrasă din nou cu acetat de etil suplimentar. Extractele organice au fost combinate, au fost spălate cu saramură, au fost uscate cu sulfat de magneziu, au fost filtrate şi evaporate până la uscare, pentru a se obţine produsul dorit sub forma unui ulei portocaliu (4,80 g).

(iii) Compusul din titlu - racemic

Un amestec de 4-amino-3-(3-clorfenil)butanoat de metil (4,80 g), dicarbonat de di-terţ-butil (5,28 g) şi diclormetan (100 ml) au fost agitate la temperatura camerei timp de 18 ore. Amestecul a fost evaporat până la uscare şi reziduurile au fost purificate pe silice, prin eluare cu eter de petrol 40-60 şi acetat de etil (0-100%). Fracţiunile corespunzătoare au fost combinate şi evaporate până la uscare, pentru a se obţine esterul 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoatului de metil protejat cu Boc sub forma unui solid crem (2,59 g).

Un amestec de 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoat de metil (2,49 g), hidroxid de litiu (546 mg), 1,4-dioxan (40 mL) şi apă (40 mL) a fost agitat la temperatura camerei timp de 64 de ore. Amestecul a fost apoi evaporat până la uscare. Reziduurile au fost dizolvate în apă, au fost neutralizate cu soluţie apoasă de HCI 1 M şi au fost extrase cu acetat de etil (× 2). Extractele organice au fost combinate, au fost spălate cu saramură, au fost uscate cu sulfat de magneziu, au fost filtrate şi evaporate până la uscare, pentru a se obţine produsul dorit sub forma unui ulei galben (2,51 g).

m/z 314 (MH+) C15H20ClNO4 necesită 313,11. 1H RMN (400MHz, CD3OD): δ (ppm) 1,40 (9H, s), 2,42-2,73 (2H, m), 3,24-4,49 (4,4 H, m, include CH3OD, CH2, şi CH), 7,17-7,38 (4H, m).

(iv) Compusul din titlu - separarea izomerilor - metoda 1

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic (2,09 g) a fost dizolvat la 60 mg/mL în metanol şi apoi a fost purificat prin SFC utilizând condiţiile descrise mai jos (condiţiile de separare preparativă 1). Fracţiunile combinate care conţin izomerul 1 îmbogăţit (prelucrare mai rapidă) şi izomerul 2 (prelucrare mai lentă) au fost combinate, concentrate şi fiecare a fost purificată din nou individual în aceleaşi condiţii cromatografice.

Fracţiunile combinate de fiecare izomer 1 şi izomer 2 au fost apoi evaporate până aproape de uscare folosind un evaporator rotativ, au fost transferate în vase finale cu DCM, care a fost îndepărtat sub un curent de azot la 40°C înainte de a fi depozitate într-un cuptor cu vid la 40°C şi 5 mbar timp de 16 ore.

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic (izomerul 1)

Solid alb, 883 mg, 95,6% ee. Timp de retenţie 2,89 minute în sistem analitic 1.

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic (izomerul 2)

Solid alb, 876 mg, 98,6% ee. Timp de retenţie 3,29 minute în sistem analitic 1.

Condiţii preparative de separare 1:

Berger Multigram II SFC

Detalii ale coloanei: Lux A1 (Phenomenex, 21,2 mm × 250 mm, 5 µm)

Temperatura coloanei: 40°C

Debit: 50 ml/min

BPR: 125 BarG

Lungime de undă a detectorului: 210 nm

Volum de injectare: 300 µL (18 mg)

Condiţii izocratice: 12:88 EtOH: CO2 (0,1% v/v NH3)

Condiţii de analiză 1:

Waters UPC2

Detalii ale coloanei: Lux C4 (Phenomenex, 4,6 mm × 250 mm, 5 µm)

Temperatura coloanei: 40°C

Debit: 4 ml/min

Lungime de undă a detectorului: 210-400 nm

Volum de injectare: 1,0 µL

BPR: 125 BarG

Condiţii izocratice: 10:90 EtOH:CO2 (0,1% v/v NH3)

(v) Compusul din titlu - separarea izomerilor - metoda 2

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic purificat prin SFC folosind condiţiile descrise mai jos (condiţii de separare preparativă 2). După separare, fracţiunile au fost uscate pe evaporator rotativ la temperatura băii de 40°C pentru a obţine enantiomerii separaţi doriţi. Enantiomerul cu prelucrare mai lentă a fost purificat suplimentar pe aceeaşi coloană prin eluare cu 20% B.

Condiţii preparative de separare 2:

Instrument: Thar 200 SFC preparativă (SFC-10)

Coloană: ChiralPakAY, 300 × 50 mm I.D., 10 µm

Fază mobilă: A pentru CO2 şi B pentru IPA

Gradient: B 25%

Debit: 200 ml/min

Contrapresiune: 100 bar

Temperatura coloanei: 38°C

Lungime de undă: 220 nm

Timp al ciclului: ~4,5 min

Condiţii analitice 2:

Instrument: SFC analitică Waters UPC2 (SFC-H)

Coloană: ChiralPak AY, 150 × 4,6 mm I.D., 3 µm

Faza mobilă: A pentru CO2 şi B pentru IPA (0,05% DEA)

Gradient: B 5-40%

Debit: 2,5 ml/min

Contrapresiune: 100 bar

Temperatura coloanei: 40°C

Lungime de undă: 220 nm

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic (izomerul 1).

Timp de retenţie 2,796 minute. Stereochimie (R) atribuită prin comparaţie cu izomerul (2) de mai jos.

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic (izomerul 2).

Timp de retenţie 3,264 minute. Stereochimie (S) atribuită prin cristalografie cu molecule mici a materialului deprotejat de BOC, aşa cum este descris mai jos.

(vi) Confirmarea stereochimiei

Sare trifluoracetat a acidului (S)-4-amino-3-(3-clorfenil)butanoic

La o soluţie răcită cu apă cu gheaţă de izomer 2 al acidului 4-(terţ-butoxicarbonilamino)-3-(3-clorfenil)butanoic (Timp de retenţie 3,264 minute la metoda de analiză 2) (1,5 g, 4,78 mmoli) în diclormetan (20 ml) a fost adăugat acid trifluoracetic (5 ml). După adăugare, amestecul a fost agitat la această temperatură timp de 4 ore. Amestecul de reacţie a fost apoi concentrat. Amestecul brut a fost dizolvat în apă (10 ml) şi a fost liofilizat pentru a se obţine produsul; Sare TFA a acidului (S)-4-amino-3-(3-clorfenil)butanoic (1,5 g, randament 95%). LC-MS: m/z 214 (M+H)+

Acid (S)-4-amino-3-(3-clorfenil)butanoic

La o soluţie de sare a acidului trifluoracetic a acidului (S)-4-amino-3-(3-clorfenil)butanoic (0,5 g, 1,53 mmoli) în apă (10 mL), a fost adăugat hidroxid de amoniu apos diluat până când pH-ul a ajuns la 7. Soluţia rezultată a fost depozitată într-un balon deschis de 25 ml şi a fost menţinută la temperatura camerei timp de 1 zi. După cristalizare, lichidul mamă a fost decantat, şi cristalele solide au fost supuse studiilor de difracţie de raze X.

Studiile de difracţie de raze X au arătat că compusul are stereochimia (S).

Condiţii de difracţie de raze X:

A fost folosit difractometrul CCD Bruker APEX-II.

Cristalul a fost menţinut la 302,71 K în timpul colectării datelor. Folosind Olex2 (Dolomanov şi colab.), structura a fost descifrată cu programul de soluţie de structură ShelXT [2] (Sheldrick A71) folosind Intrinsic Phasing şi a fost rafinată cu pachetul de rafinare ShelXL [3] folosind minimizarea Least Squares (Sheldrick C71).

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(2-clorfenil)butanoic

Compusul a fost preparat din acid 2-clorocinamic urmând metodologia pentru acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic, aşa cum este descris în etapele (i) până la (iii) de mai sus. Compusul a fost obţinut sub forma unui ulei incolor.

m/z 314 (MH+), C15H2OClNO4 masă exactă 313,11.

Acid 3-benzil-4-((terţ-butoxicarbonil)amino)butanoic

3-benzil-4-nitrobutanoat de metil (Tetrahedron Asymmetry, 19, 2008, 945) a fost transformat în compusul din titlu urmând metodologia pentru acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic, aşa cum este descris în etapele (i) până la (iii) de mai sus.

m/z 294 (MH+), C16H23NO4 masă exactă 293,16.

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoic

(i) 3-(3-bromfenil)-4-nitrobutanoat de etil

Un amestec de hidrură de sodiu (60%) în ulei mineral (394,26 mg, 9,86 mmoli) şi 1,2-dimetoxietan (22,5 mL) (DME) a fost răcit la 0°C. A fost adăugat prin picurare trietilfosfonoacetat (10,2 mL, 51,43 mmoli), şi amestecul a fost agitat timp de 10 min. A fost adăugată prin picurare o soluţie de 3-bromobenzaldehidă (1,0 mL, 8,57 mmol) în DME (5 mL). Amestecul de reacţie a fost încălzit la temperatura camerei şi a fost refluxat timp de 3 ore.

Amestecul a fost evaporat până la uscare şi reziduurile au fost împărţite între hexan şi apă. Stratul apos a fost separat şi a fost extras cu hexan suplimentar. Extractele organice au fost combinate, au fost spălate cu apă, au fost uscate cu MgSO4, au fost filtrate şi evaporate până la uscare. Reziduurile au fost purificate pe silice prin eluare cu eter de petrol 40-60 şi acetat de etil (0-100%). Fracţiunile corespunzătoare au fost combinate şi evaporate până la uscare, pentru a se obţine (E)-3-(3-bromfenil)prop-2-enoat de etil sub forma unui solid alb (1,44 g, 65%). Acesta a fost transformat în 3-(3-bromfenil)-4-nitrobutanoat de etil folosind condiţiile de nitrare din prepararea acidului 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic, etapa (i), aşa cum este descris mai sus, pentru a se obţine produsul cu un randament de 60%.

m/z 316, 318 (MH+). C12H14BrNO4 necesită 315,01.

(ii) 4-amino-3-(3-bromfenil)butanoat de etil

3-(3-bromofenil)-4-nitrobutanoatul de etil (1,08 g) a fost transformat în 4-amino-3-(3-bromfenil)butanoat de etil folosind condiţiile descrise mai sus pentru acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic în etapa (ii), pentru a se obţine produsul cu randament de 67%.

m/z 286 şi 288 (MH+), C12H16BrNO2 masă exactă 285,04.

(iii) 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-bromfenil)butanoat de etil

4-amino-3-(3-bromfenil)butanoat de etil (655 mg) a fost transformat în 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-bromfenil)butanoat de etil în condiţiile descrise mai sus pentru acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic în etapa (iii), pentru a se obţine produsul cu randament de 72%.

m/z 386 şi 388 (MH+), C17H24BrNO4 masă exactă 385,09.

(iv) 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoat de etil

Un amestec de Ruphos (48,3 mg, 0,1 mmoli), fosfat de potasiu tribazic (330 mg, 1,55 mmoli), 3-(3-bromofenil)-4-(terţ-butoxicarbonilamino)butanoat de etil (200 mg, 0,52 mmoli) şi acid izobutilboronic (132 mg, 1,29 mmoli) în toluen (9 mL) a fost degazat de patru ori prin evacuare / spălare cu azot înainte de adăugare de acetat de paladiu (II) (5,8 mg, 0,03 mmoli). Amestecul a fost agitat la 110°C timp de 100 min. Amestecul de reacţie a fost lăsat să se răcească înainte de a fi filtrat prin Celite şi a fost lăsat peste noapte în soluţie. Amestecul a fost evaporat până la uscare şi a fost purificat pe silice, prin eluare cu eter de petrol 40-60 şi acetat de etil (0-100%). Fracţiunile corespunzătoare au fost combinate şi evaporate până la uscare, pentru a se obţine 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoat de etil sub forma unui ulei incolor, (74 mg, 39%).

m/z 364 (MH+). C21H33NO4 masă exactă 363,24.

(v) Compusul din titlu

Un amestec de 4-(terţ-butoxicarbonilamino)-3-(3-izobutilfenil)butanoat de etil (74 mg, 0,2 mmoli) şi hidroxid de litiu (15 mg, 0,6 mmoli) în 1,4-dioxan (3 mL) şi apă (3 mL) a fost agitat la temperatura camerei timp de 16 ore. Amestecul a fost evaporat până la uscare şi reziduurile au fost împărţite între acetat de etil şi apă. Faza organică a fost separată şi aruncată. Stratul apos a fost acidulat cu HCI (apos) 1 M şi a fost extras cu acetat de etil (x2). Extractele organice au fost combinate, au fost uscate cu MgSO4, au fost filtrate şi evaporate până la uscare, pentru a se obţine acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoic sub forma unui ulei incolor (65 mg). m/z 336 (MH+) C19H29NO4 masă exactă 335,21.

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorbenzil)butanoic

2-(3-Clorfenil) acetaldehidă a fost transformată în 3-(3-clorbenzil)-4-nitrobutanoat de etil aşa cum este descris pentru acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoic în etapa (i), aşa cum este descris mai sus. Reducerea şi protejarea ca în etapele (ii) şi (iii), urmate de hidroliză ca în etapa (v) de mai sus au condus la compusul din titlu sub forma unui ulei incolor.

m/z 328 (MH+). C16H22ClNO4 masă exactă 327,12.

Acid 4-(((benziloxi)carbonil)amino)-3-(3-izopropilfenil)butanoic

Un amestec de 4-amino-3-(3-izopropilfenil)butanoat de etil (1,55 g, 6,21 mmol) (preparat folosind metodologia pentru acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoic, etapele (i) până la (ii), aşa cum este descris mai sus) şi bicarbonat de sodiu (0,783 g 9,32 mmoli) a fost dizolvat în apă (10 mL) şi 1,4 -dioxan (5 ml). Amestecul a fost răcit într-o baie de gheaţă şi a fost tratat cu o soluţie de cloroformiat de benzil (0,98 mL, 6,84 mmoli). Amestecul a fost agitat la 10°C timp de 1 oră, apoi a fost lăsat să se încălzească la temperatura camerei. După agitare timp de 20 ore, amestecul a fost evaporat până la uscare, şi reziduurile au fost împărţite între dietil eter şi soluţie apoasă de HCI 0,5 M. Stratul apos a fost separat şi extras cu dietil eter suplimentar. Extractele organice au fost combinate, au fost spălate cu saramură, au fost uscate pe MgSO4 anhidru, şi au fost evaporate. Produsul brut a fost purificat pe silice, prin eluare cu eter de petrol 40-60 şi acetat de etil (0-100%). Fracţiunile care conţin produs au fost combinate şi evaporate până la un ulei galben pal (1,74 g, 73%). Esterul etilic a fost hidrolizat cu hidroxid de litiu aşa cum a fost descris anterior în etapa (iii) pentru prepararea acidului 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoic, urmată de cromatografie pe silice prin eluare cu eter de petrol 40-60 şi acetat de etil (0-100%) pentru a se obţine compusul din titlu sub forma unui solid alb (60%).

m/z 356 (MH+). C21H25NO4 masă exactă: 355,18.

Acid 4-([1,1'-bifenil]-3-il)-3-(((terţ-butoxicarbonil)amino)metil)butanoic

(i) clorhidrat de acid 4-amino-3-(3-bromfenil)butanoic

Un amestec de 4-(3-bromfenil)pirolidin-2-onă (1,0 g, 4,16 mmoli) şi HCI 6 M apos (15,0 ml, 90 mmoli) a fost încălzit la 100°C timp de 16 ore. Amestecul a fost evaporat până la uscare, a fost evaporat concomitent cu apă, urmată de acetat de etil şi apoi diclormetan (DCM), pentru a se obţine produsul dorit sub forma unui solid alb, cu un randament cantitativ presupus.

m/z 258 şi 260 (MH+) C10H12BrNO2 masă exactă: 257,01.

(ii) Acid 3-(3-bromfenil)-4-(terţ-butoxicarbonilamino)butanoic

Un amestec de clorhidrat de acid 4-amino-3-(3-bromfenil)butanoic (1,31 g, 4,45 mmol), terţ-butoxicarbonil carbonat de terţ-butil (Boc-O-Boc, 1,41 g, 6,45 mmoli), 1,4- dioxan (8 mL) şi soluţie apoasă de NaOH 1 M (8,0 mL, 8 mmoli) a fost agitat la temperatura camerei timp de 64 de ore. Amestecul a fost evaporat până la uscare. Reziduurile au fost dizolvate în apă, au fost neutralizate cu soluţie apoasă de HCI 1 M şi au fost extrase cu acetat de etil (× 2). Extractele organice au fost combinate, au fost uscate cu MgSO4, au fost filtrate şi evaporate până la uscare, pentru a se obţine produsul dorit (1,60 g, 86%) sub forma unui ulei incolor.

m/z 357,5 şi 359,4 (MH+). C15H20BrNO4 masă exactă: 357,06.

(iii) Compusul din titlu

Un amestec de acid 3-(3-bromfenil)-4-(terţ-butoxicarbonilamino)butanoic (2,69 g, 7,51 mmoli), acid fenilboronic (2,3 g, 18,8 mmoli), acetat de paladiu (II) (84 mg, 0,38 mmoli), Xphos (716 mg, 1,5 mmoli) şi fosfat de potasiu tribazic (4781,9 mg, 22,53 mmoli) în 1,4-dioxan (130 mL) a fost agitat la 100°C sub atmosferă de azot timp de 2 ore. Amestecul a fost apoi lăsat să se răcească la temperatura camerei, a fost filtrat prin Celite, a fost spălat cu acetat de etil şi a fost evaporat până la uscare. Reziduurile au fost purificate pe silice, prin eluare cu eter de petrol şi acetat de etil (0-100%). Fracţiunile corespunzătoare au fost combinate şi evaporate până la uscare, pentru a se obţine produsul dorit, 1,44 g, sub forma unui solid gri (randament 42%).

m/z 355 (M+), observat C21H25NO4 masă exactă: 355,18.

(iv) Separarea chirală

Acid 4-([1,1'-bifenil]-3-il)-3-(((terţ-butoxicarbonil)amino)metil)butanoic (1,44 g) a fost dizolvat la 30 mg/mL în MeOH şi apoi a fost purificat prin SFC utilizând metoda de mai jos. Fracţiunile combinate de fiecare izomer 1 (prelucrare mai rapidă) şi izomer 2 (prelucrare mai lentă) au fost apoi evaporate până aproape de uscare folosind un evaporator rotativ, au fost transferate în vase finale cu DCM, care a fost îndepărtat sub un curent de aer comprimat la 40° C înainte de a fi depozitate într-un cuptor cu vid la 40°C şi 5 mbar până la greutate constantă.

Izomerul 1, acid 4-([1,1'-bifenil]-3-il)-3-(((terţ-butoxicarbonil)amino)metil)buta-

noic. 523 mg de solid alb. Timp de retenţie: (condiţii de analiză 3) 2,70 min. ee 99,8%.

Izomerul 2, acid 4-([1,1'-bifenil]-3-il)-3-(((terţ-butoxicarbonil)amino)metil)buta-

noic. 537 mg de solid alb. Timp de retenţie: (condiţii de analiză 3) 3,46 min. ee 99,8%.

Condiţii de purificare 3:

Berger Multigram II SFC

Detalii ale coloanei: Lux A1 (Phenomenex, 21,2 mm × 250 mm, 5 µm)

Temperatura coloanei: 40°C

Debit: 50 ml/min

BPR: 100 BarG

Lungime de undă a detectorului: 215 nm

Volum de injectare: 1,000 µL (30 mg)

Condiţii izocratice: 15:85 EtOH:CO2 (0,2% v/v NH3)

Condiţii de analiză 3:

Waters UPC2

Detalii ale coloanei: Amy-C ( YMC Gmbh, 4,6 mm × 250 mm, 5 µm)

Temperatura coloanei: 40°C

Debit: 4 ml/min

Lungime de undă a detectorului: 210-400 nm

Volum de injectare: 1,0 µL

BPR: 125 BarG

Condiţii izocratice: 15:85 EtOH:CO2 (0,2% v/v NH3)

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-metilfenil)butanoic

4-(3-Metilfenil)pirolidin-2-onă a fost transformată în compusul din titlu utilizând metodologia descrisă mai sus pentru prepararea acidului 4-([1,1'-bifenil]-3-il)-3-(((terţ-butoxicarbonil)amino)metil)butanoic în etapele (i) până la (ii). Compusul din titlu a fost obţinut sub forma unui ulei incolor.

m/z 294 (MH+). C16H23NO4 masă exactă 293,16.

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3,5-diclorfenil)butanoic

3,5-diclorbenzaldehidă a fost transformată în compusul din titlu utilizând metodologia descrisă mai sus pentru prepararea acidului 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoic în etapele (i) până la (iii). Esterul etilic a fost hidrolizat aşa cum a fost descris pentru etapa (v) din prepararea acidului (3-izobutilfenil)butanoic, pentru a se obţine compusul din titlu sub forma unui ulei incolor.

m/z 348. (MH+). C15H19Cl2NO4 masă exactă 347,07.

Acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-(tiofen-3-il)fenil)butanoic

4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-bromfenil)butanoat de etil (207 mg, 0,54 mmoli) a reacţionat cu acid 3-tienilboronic utilizând metodologia descrisă mai sus pentru prepararea acidului (3-izobutilfenil)butanoic în etapa (iv). Produsul a fost hidrolizat aşa cum a fost descris în etapa (v) pentru a se obţine compusul din titlu sub forma unui ulei incolor.

m/z 362 (MH+). C19H23NO4S masă exactă 361,13.

Nonapeptide de polimixine intermediare şi compuşi de produs

Intermediarul 1: H-Thr(O-tBu)-Dap(BOC)-Ciclo[Dab-Dab(BOC)-DPhe-Leu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr]

A fost descris anterior în WO 2015/135976 ca intermediar 11 - heptapeptidă de Tetra- (N-Boc)-L-Thr(O-tBu)-L-Dap-polimixină B.

Intermediarul 2: H-Thr(O-tBu)-Dap(BOC)-Ciclo[Dab-Dab(BOC)-Leu-Leu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr]

A fost descris anterior în WO 2015/135976 ca intermediar 14 - heptapeptidă de Tetra- (N-Boc)-L-Thr(O-tBu)-L-Dap-polimixină E.

Intermediarul 3: H-Thr(O-tBu)-Dap(BOC)-Ciclo[Dab-Dab(BOC)-Dleu-L-Abu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr(O-tBu)]

(i) CBZ-Thr(O-tBu)-Dap(Boc)-Dab-Dab(Boc)-Dleu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu)-OH

Peptida liniară CBZ-Thr(O-tBu)-Dap(Boc)-Dab(ivDde)-Dab(Boc)-Dleu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu) a fost preparată pe răşină prin sinteza peptidei în fază solidă folosind chimia Fmoc, folosind metodologia din metoda generală 3 descrisă mai sus. Secvenţa a început cu clorură de clorotritil (CTC)-răşină (2,0 g), preîncărcată cu Fmoc-Thr(tBu)-OH la o încărcare de 0,75 mmol/g. Peptida legată de răşină (3,93 g, care corespunde la 1,5 mmol) a fost plasată într-un balon conic de 500 ml şi a fost tratată cu hidrazină 4% în DMF (100 ml). Amestecul a fost plasat într-un agitator şi a fost agitat uşor timp de 30 de minute. Amestecul a fost turnat într-o coloană sinterizată, apoi a fost spălat cu DMF (3 x 100 mL). A fost aplicat aer comprimat pentru a îndepărta ultimele urme de DMF. Procedura a fost apoi repetată cu THF şi cu DCM.

Răşina a fost apoi tratată cu 4:1 DCM: hexafluoroizopropanol (100 mL) pentru a scinda peptida din răşină. După 30 de minute, coloana a fost drenată şi procedura a fost repetată. Răşina a fost apoi spălată de trei ori cu DCM (100 mL). Eluanţii şi substanţele de spălare combinate au fost evaporate sub presiune redusă şi au fost uscate în vid peste noapte. Au fost obţinute 724 mg de solid alb (2,35 g, cantitativ). m/z 1552, C73H126N14O22 necesită 1550,92.

(ii) CBZ- Thr(O-tBu)- Dap(Boc)-ciclo[Dab-Dab(Boc)-DLeu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu)]

CBZ-Thr(O-tBu)-Dap(Boc)-Dab-Dab(Boc)-DLeu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu)-OH brut (724 mg, 0,466 mmoli) a fost dizolvat în DMF (75 mL), a fost tratat cu diizopropiletilamină (DIPEA) (361 mg 0,49 mL, 2,8 mmoli) apoi au fost răcite într-o baie de gheaţă. A fost adăugată prin picurare difenil fosforil azidă (256 mg, 0,2 mL, 0,93 mmoli), apoi amestecul a fost agitat timp de 2 ore cu răcire în baie de gheaţă. Baia de gheaţă a fost îndepărtată şi soluţia a fost agitată la temperatura camerei timp de încă 2 ore. Solventul a fost evaporat şi reziduul a fost aplicat pe o Coloană ISCO cu SiO2 (40 g) şi a fost cromatografiat cu 0-10% MeOH în DCM. Fracţiunile care conţin produs au fost combinate şi evaporate până la o spumă albă. Au fost obţinute 418 mg (58%).

m/z 1534, C73H124N14O21 necesită 1532,91.

(iii) Compusul din titlu

CBZ- Thr(O-tBu)- Dap(Boc)-ciclo[Dab-Dab(Boc)-DLeu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu)] (531mg, 0,346 mmoli) a fost dizolvat în metanol (50 mL) şi a fost tratat cu formiat de amoniu (545 mg, 8,6 mmoli) şi 10% Pd/C (173 mg). După agitare la temperatura camerei peste noapte, amestecul de reacţie a fost filtrat prin Celite şi reziduul a fost spălat cu MeOH. Solventul a fost evaporat şi reziduul a fost dizolvat în EtOAc, conţinând 10% MeOH, a fost spălat cu apă x 3 şi a fost uscat cu sulfat de magneziu. Solventul a fost evaporat pentru a rămâne un solid alb. Pentru a îndepărta orice urmă de formiat, solidul a fost dizolvat în metanol (160 ml) şi a fost agitat cu răşină Ambersep 900 (12 ml) timp de 30 de minute. Amestecul a fost filtrat şi evaporat până la uscare, pentru a se obţine 464 mg de solid alb (96%).

m/z 1400, C65H118N14O19 necesită 1398,87.

Metode generale

Sinteza totală a derivaţilor de nonapeptidă de polimixină a fost efectuată aşa cum urmează.

O peptidă liniară cu protejare ortogonală a grupării γ-amino a reziduului Dab implicat în ciclizare a fost construită pe răşină, cu aminoacidul de capăt C-terminal (de obicei Thr) ataşat la faza solidă. După deprotejarea parţială a Dab-ului implicat în ciclizare (reziduul 4 în sistemul de numerotare a polimixinei), urmată de îndepărtarea din răşină, peptidele liniare rezultate au fost ciclizate în afara răşinii. Au fost utilizate două metode generale, aşa cum este descris mai jos.

Metoda generală 1: Sinteza totală folosind protejare cu CBZ a grupărilor amină

Sinteza peptidei liniare protejate (reziduurile 2-10 şi gruparea N-terminală) a fost efectuată pe un sintetizator automat de peptide utilizând chimia standard Fmoc a peptidei în fază solidă. Mai precis, sinteza a fost efectuată folosind răşină Fmoc-Thr(tBu)-PEG-PS ca materie primă. Cuplarea aminoacizilor Fmoc cu protecţia CBZ pe grupările amino terminale a fost realizată folosind 5 echivalenţi molari (faţă de încărcarea cu răşină) de aminoacid Fmoc şi HATU în DMF cu activare in situ, folosind 10 echivalenţi molar de DIPEA. Deprotejarea de Fmoc a fost efectuată utilizând piperidină 20% în dimetilformamidă. BOC a fost folosit ca grupare protectoare ortogonală pe Dab implicat în ciclizare.

Peptida liniară legată de răşină a fost tratată cu TFA/TIS/H2O (96/2/2v/v) timp de 2 ore pentru a releva reziduul Dab implicat în ciclizare şi pentru a scinda peptida din răşină. Acest material a fost ciclizat folosind PyBop/HOBt/NMM (4/4/8 echivalenţi molari în raport cu încărcarea iniţială) în DMF timp de 3 ore. Materialul brut a fost parţial evaporat, a fost preluat cu acetonitril/apă şi a fost liofilizat peste noapte. Grupările CBZ au fost apoi îndepărtate folosind 10% Pd/C în acid acetic/MeOH/apă (5/4/1 v/v).

Produsul brut a fost purificat, şi diastereomerii au fost separaţi prin HPLC preparativă (Tabelul 3). Este de reţinut că condiţiile specifice au fost optimizate pentru fiecare pereche de diastereomeri.

Metoda generală 2: Sinteza totală folosind protejarea cu Boc a grupărilor amină

Sinteza peptidei liniare protejate (reziduurile 2-10 şi gruparea N-terminală) a fost efectuată pe un sintetizator automat de peptide utilizând chimia standard Fmoc a peptidei în fază solidă. Mai precis, sinteza a fost efectuată utilizând răşină de clorură de clorotritil (CTC), preîncărcată cu Fmoc-Thr(tBu)-OH (încărcare ~0,78 mmol/g), pe o scară de 0,05 - 0,1 mmol. Cuplarea Fmoc-aminoacizi a fost realizată folosind 5 echivalenţi molar (faţă de încărcarea cu răşină) de aminoacid Fmoc şi HATU în DMF cu activare in situ, folosind 10 echivalenţi molar de DIPEA. Deprotejarea de Fmoc a fost efectuată utilizând piperidină 20% în dimetilformamidă. Gruparea protectoare ivDde a fost utilizată ca protecţie ortogonală pe reziduul Dab implicat în ciclizare.

Pentru a elimina gruparea ivDde, peptida liniară a fost tratată cu 3% hidrazină în DMF (100 mL la fiecare 100 µmoli, repetat de două ori), urmată de spălare cu DMF × 3, EtOH × 3 şi dietil eter × 3. Peptida liniară parţial deprotejată a fost apoi scindată din răşină prin spălarea răşinii cu 20% HFIP în DCM. Reziduul rezultat a fost dizolvat în 50% acetonitril/apă şi a fost uscat prin congelare peste noapte. Peptida liniară protejată a fost dizolvată în DMF (20 mL/mmol de răşină), a fost ciclizată cu DPPA, (3 echivalenţi molar în raport cu încărcarea răşinii) şi DIPEA (6 echivalenţi molar în raport cu încărcarea răşinii). Această soluţie a fost agitată la temperatura camerei peste noapte. Grupările BOC au fost îndepărtate cu TFA, şi peptida brută a fost liofilizată.

Produsul brut a fost purificat, şi diastereomerii au fost separaţi prin HPLC preparativă utilizând condiţiile HPLC preparative 4 descrise mai jos. Este de reţinut că condiţiile specifice au fost optimizate pentru fiecare pereche de diastereomeri.

Metoda generală 3: Cuplarea acidului la nonapeptidă şi separarea

Metodele de cuplare a capătului N-terminal al unei nonapeptide la un aminoacid sunt descrise mai jos în legătură cu exemplul de compuşi 5 şi 6. Condiţiile descrise sunt adaptabile pentru alte combinaţii de nonapeptidă şi aminoacid.

Etapa 1

H-Thr(O-tBu)-Dap(BOC)-Ciclo[Dab-Dab(BOC)-DPhe-Leu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr]. (Intermediarul 1) (0,07 mmol) a fost dizolvat în diclormetan (4 mL) şi a fost tratat cu acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic (1,5 echiv în raport cu substratul de polimixină), N,N-diizopropiletilamină (3,0 echiv.), urmată de HATU (2,0 echiv.). După 16 ore, terminarea reacţiei a fost confirmată prin LCMS şi amestecul de reacţie a fost evaporat până la uscare. A fost adăugată apă (aproximativ 10 ml) şi amestecul a fost triturat, apoi a fost agitat energic timp de 1 oră. Precipitatul rezultat a fost colectat prin filtrare şi a fost uscat în vid peste noapte.

Etapa 2

Derivatul protejat cu Boc din Etapa 1 a fost dizolvat în diclormetan (3 mL) şi a fost tratat cu TFA (1 mL). Amestecul de reacţie a fost agitat la temperatura camerei până când LCMS a confirmat deprotejarea completă. Solventul a fost evaporat şi reziduul a fost cromatografat prin HPLC preparativă utilizând condiţiile date în condiţiile de HPLC preparativă 4, pentru a separa diastereoizomerii. Fracţiunile care conţin diastereomerul de prelucrare precoce au fost combinate, au fost evaporate până la volum mic şi au fost liofilizate pentru a se obţine Exemplul 5 sub formă de sare TFA. Fracţiunile care conţin diastereomerul de prelucrare ulterioară au fost combinate, au fost evaporate până la volum mic şi au fost liofilizate pentru a se obţine Exemplul 6 sub formă de sare TFA.

Este de reţinut că condiţiile specifice au fost optimizate pentru fiecare pereche de diastereomeri.

Condiţii de HPLC preparativă 4:

Coloană: Waters Sunfire C18 OBD 5 µm × 19 mm × 150 mm Fază mobila: A: apă/acetonitril 90/10, v/v, 0,15% TFA. B: acetonitril/apă 90/10, v/v, 0,15% TFA Debit: 10 ml/min Gradient: Timp (minute) % de fază mobilă A 0 100% 3 100% 8 85% 13,5 85% 15 75% 18 0% 23 100% 25 100% Detectare: 210 nm

Condiţii analitice pentru HPLC 4:

Coloană: Phenomenex Hyperclone C18 BDS 5 µm × 4,6 mm × 150 mm Fază mobilă: A: apă/acetonitril 90/10, v/v, 0,15% TFA. B: acetonitril/apă 90/10, v/v, 0,15% TFA Debit: 1 ml/min Gradient: Timp (minute) % fază mobilă A 0 100% 20 40% 21 0% 23 0% 23,5 100 25 100 Detectare: 210, 254 nm Volum de injectare: 20 µL

Metoda generală 3b: Cuplarea enantiomerilor individuali la nonapeptidă

Aminoacizi puri enantiomeric au fost cuplaţi la capătul N-terminal al compuşilor nonapeptidă folosind aceleaşi condiţii ca cele descrise mai sus în metoda generală 3a pentru aminoacizi amestecaţi enantiomeric.

Exemplele de compuşi 5 şi 6

Cuplarea acidului 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic (izomerul 2)

(Timp de retenţie 3,46 min în metoda analitică 1 sau 3,264 min în metoda analitică 2) în condiţiile metodei generale 3a urmată de deprotejare a condus la obţinerea exemplului 5. Exemplului (5) i s-a atribuit stereochimia (S) în urma determinării cu raze X a configuraţiei absolute a acidulu 4-amino-3-(3-clorfenil)butanoic derivat din acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic (izomerul 2).

Cuplarea acidului 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic (izomer 1, timp de retenţie 2,89 min în metoda analitică 1 sau 2,796 min în metoda analitică 2) în condiţiile metodei generale 3a urmată de deprotejare a condus la obţinerea Exemplului 6. Exemplului (6) i s-a atribuit stereochimia (R) în urma determinării cu raze X a configuraţiei absolute a acidului 4-amino-3-(3-clorfenil)butanoic derivat din acid 4-((terţ-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorfenil)butanoic (izomerul 1).

Metoda generală 4: Transformarea în sare acetat

Răşină AG1-X2 (Bio-Rad Laboratories Ltd) sub formă de acetat cu 200-4 ochiuri, a fost regenerată prin spălare cu 10% acid acetic apos, urmată de 1% acid acetic apos, şi a fost plasată într-un cartuş fritat. O soluţie de compus sub formă de sare TFA în apă a fost aplicată pe coloană, utilizând o încărcare de 30 g de răşină la 1 g de sare TFA, şi coloana a fost lăsată să picure sub gravitaţie, prin eluare cu apă. Fracţiunile care conţin produs au fost combinate şi liofilizate până la un solid alb.

Analiza compuşilor finali a fost efectuată prin HPLC utilizând condiţiile descrise mai sus (condiţii HPLC analitice).

Date analitice exemplificatoare pentru compuşii din Exemplele 5 şi 6, sub formă de săruri de acetat, sunt date mai jos.

Exemplul 5: (izomer mai rapid) 1H RMN al sării acetat (400 MHz, D2O): δ (ppm) 0,70 (3 H, d, J 6,1 Hz), 0,77 (3 H, d, J 6,3 Hz), 0,78-0,90 (1H, m), 1,13 (3H, d, J 6,3 Hz), 1,17 (3H, d, J 6,4Hz), 1,36-1,52 (2H, m), 1,75-2,06 (17 H, m, include 1,91, s, OAc), 2,10-2,30 (4H, m), 2,72-2,91 (4H, m), 3,02-3,49 (14H, m), 4,12-4,32 (8 H, m), 4,48 (1 H, dd, J 5,6, 9,0 Hz), 4,54-4,60 (1H, m), 4,63-4,68 (1H, m), 7,25-7,41(9H, m). m/z 1145 [MH+], 573[M+2H]2+.

Exemplul 6: (izomer mai lent) 1H RMN al sării acetat (400 MHz, D2O): δ (ppm) 0,60- 0,67 (6 H, m), 0,69 - 0,84 (4 H, m), 1,16 (3H, d, J 6,4Hz), 1,33-1,50 (2 H, m), 1,76-2,04 (19 H, m, include 1,88, s, OAc), 2,06-2,26 (4 H, m), 2,67-2,86 (4 H, m), 3,00-3,46 (14 H, m), 3,98-4,04 (1 H, m) 4,14-4,30 (7H, m), 4,45 (1 H, dd, J 5,6, 9,0 Hz), 4,54 (1 H, apare ca t, J 8,3 Hz), 4,72 (1 H, dd, J 5,0, 8,9 Hz), 7,20-7,40 (9 H, m). m/z 1145 [MH+], 573[M+2H]2+.

În toate exemplele, diastereomerii au fost atribuiţi pe baza timpului de retenţie în HPLC (izomeri cu eluare rapidă şi lentă) împreună cu deplasarea chimică a reziduului Thr care trece de la 1,13 ppm, în izomerul cu eluare rapidă, la aproximativ 0,65 ppm, în izomerul cu eluare lentă.

Compuşi de exemplu şi de referinţă

Tabelul 1 enumeră exemple de compuşi din invenţie împreună cu compuşi de referinţă furnizaţi pentru înţelegerea utilă a invenţiei. Aceştia sunt compuşi care au structura generală arătată mai jos:

Gruparea R este arătată în tabel împreună cu reziduurile de aminoacizi la poziţiile 6 şi 7 (AA-6 şi, respectiv, AA-7 folosind sistemul de numerotare a polimixinei).

În aceşti compuşi de exemplu şi de exemplu de referinţă, reziduul de aminoacid din poziţia QQQ este L-Thr, reziduul de aminoacid din poziţia 3 este L-Dap, şi aminoacidul din poziţia QQQ este L-Thr.

Stereochimia absolută în lanţul lateral -R a fost atribuită prin comparaţie cu Exemplul 5 şi Exemplul 6 care au fost corelate cu material cu stereochimie absolută cunoscută.

În exemple şi în exemple de referinţă 1-6 şi 15-33, determinarea a fost făcută prin compararea timpilor de retenţie relativi şi a spectrului 1H RMN al diastereomerilor (de ex., luând în considerare deplasarea chimică a reziduului Thr în poziţia 2).

În Exemplele de referinţă 7-14, determinarea a fost făcută prin compararea timpilor relativi de retenţie în HPLC ai diastereomerilor.

Tabelul furnizează timpii de retenţie în HPLC pentru compuşii de exemplu. Condiţiile HPLC care au fost utilizate pentru analiză sunt prezentate mai jos.

Coloană: Phenomenex Hyperclone BDS C18, 4,6 mm × 150 mm, 5 µm

Debit: 1 ml/min

Eluant:

A = 10% AcN/90% apă/0,15% TFA

B = 90% AcN/10% apă/0,15% TFA

Gradient:

Minute % A % B 0 100 0 20 40 60 21 0 100 23 0 100 23,5 100 0 25 100 0

Detectare: 210, 254 nm

În tabelul 1, un asterisc (*) indică un exemplu de referinţă.

Tabelul 1 - Compuşi de exemplu şi de referinţă

Ex. Denumire -R AA-6 AA-7 Metoda generală Formulă Masa HPLC tR (min.) m/z 1* (S)-4-amino-3-(4-clorfenil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr] Phe Leu 3a C52H82C IN15O12 1143,6 9,6 1145 [MH+] 573 [M+2H]2+ 2* (R)-4-amino-3-(4-clorfenil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr] Phe Leu 3a C52H82C IN15O12 1143,6 9,7 1145 [MH+] 573 [M+2H]2+ 3* (S)-4-amino-3-(2-clorfenil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr] Phe Leu 3a C52H82C IN15O12 1143,6 9,1 1145 [MH+] 573 [M+2H]2+ 4* (R)-4-amino-3-(2-clorfenil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr] Phe Leu 3a C52H82C IN15O12 1143,6 9,4 1145 [MH+] 573 [M+2H]2+ 5 (S)-4-amino-3-(3-clorfenil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr] Phe Leu 3a, 3b C52H82C IN15O12 1143,6 9,6 1145 [MH+] 573 [M+2H]2+ 6 (R)-4-amino-3-(3-clorfenil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr] Phe Leu 3a, 3b C52H82C IN15O12 1143,6 9,8 1145 [MH+] 573 [M+2H]2+ 7* (R)-4-amino-3-benzilbutanoil-Thr-Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr]. Izomerul 1 Leu Leu 3a C50H87N 15012 1089,7 8,8 1091 [MH+] 546 [M+2H]2+ 8* (S)-4-amino-3-benzilbutanoil-Thr-Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr]. Izomerul 2 Leu Leu 3a C50H87N 15012 1089,7 9,1 1091 [MH+] 546 [M+2H]2+ 9* (R)-4-amino-3-benzilbutanoil-Thr-Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr]. Izomerul 1 Phe Leu 3a C53H85N 15012 1123,7 10,7 1125 [MH+] 563 [M+2H]2+ 10* (S)-4-amino-3-benzilbutanoil-Thr-Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr]. Izomerul 2 Phe Leu 3a C53H85N 15012 1123,7 11,0 1125 [MH+] 563 [M+2H]2+ 11* (R)-4-amino-3-(3-clorbenzil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr]. Izomerul 1 Phe Leu 3a C53H84C IN15O12 1157,6 11,0 1159 [MH+] 580 [M+2H]2+ 12* (S)-4-amino-3-(3-clorbenzil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr]. Izomerul 2 Phe Leu 3a C53H84C IN15O12 1157,6 11,4 1159 [MH+] 580 [M+2H]2+ 13* (S)-4-amino-3-(3-clorbenzil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr]. Izomerul 2 Leu Leu 3a C50H86C IN15O12 1123,6 10,4 1125 [MH+] 563 [M+2H]2+ 14* (R)-4-amino-3-(3-clorbenzil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr]. Izomerul 1 Leu Leu 3a C50H86C IN15O12 1123,6 9,9 1125 [MH+] 563 [M+2H]2+ 15* (S)-4-amino-3-(3-izopropilfenil)butanoil-Thr-Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr] Leu Leu 3a C52H91N 15012 1117,7 10,7 1119 [MH+] 560 [M+2H]2+ 16* (R)-4-amino-3-(3-izopropilfenil)butanoil- Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Leu-Dab-Dab-Thr] Leu Leu 3a C52H91N 15012 1117,7 10,9 1119 [MH+] 560 [M+2H]2+ 17* (S)-4-amino-3-(3-izopropilfenil)butanoil- Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr] Phe Abu 1 C53H85N 15012 1123,7 9,2 1125 [MH+] 563 [M+2H]2+ 18* (R)-4-amino-3-(3-izopropilfenil)butanoil- Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr] Phe Abu 1 C53H85N 15012 1123,7 9,4 1125 [MH+] 563 [M+2H]2+ 19* (S)-4-amino-3-(3-izopropilfenil)butanoil- Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Thr-Dab-Dab-Thr] Leu Thr 1 C50H87N 15013 1105,7 7,6 1107 [MH+] 554 [M+2H]2+ 20* (R)-4-amino-3-(3-izopropilfenil)butanoil- Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Thr-Dab-Dab-Thr] Leu Thr 1 C50H87N 15013 1105,7 7,8 1107 [MH+] 554 [M+2H]2+ 21* (S)-4-amino-3-(m-tolil)butanoil- Thr-Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr] Phe Leu 3a C53H85N 15012 1123,7 8,7 1125 [MH+] 563 [M+2H]2+ 22* (R)-4-amino-3-(m-tolil)butanoil- Thr-Dap-Ciclo[Dab-Dab-DPhe-Leu-Dab-Dab-Thr] Phe Leu 3a C53H85N 15012 1123,7 8,9 1125 [MH+] 563 [M+2H]2+ 23* (S)-4-amino-3-(3-clorfenil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Abu-Dab-Dab-Thr] Leu Abu 2 C47H80C IN15O12 1081,6 9,2 1083 [MH+] 542 [M+2H]2+ 24* (S)-3-([1,1'-bifenil]-3-il)-4-aminobutanoil-Thr-Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Abu-Dab-Dab-Thr] Leu Abu 3b C53H85N 15012 1123,7 8,5 1125 [MH+] 563 [M+2H]2+ 25* (R)-3-([1,1'-bifenil]-3-il)-4-aminobutanoil-Thr-Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Abu-Dab-Dab-Thr] Leu Abu 3b C53H85N 15012 1123,7 8,7 1125 [MH+] 563 [M+2H]2+ 26* (S)-4-amino-3-(3-izobutilfenil)butanoil- Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Abu-Dab-Dab-Thr] Leu Abu 3a C51H89N 15012 1103,7 8,9 1105 [MH+] 553 [M+2H]2+ 27* (R)-4-amino-3-(3-izobutilfenil)butanoil- Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Abu-Dab-Dab-Thr] Leu Abu 3a C51H89N 15012 1103,7 9,1 1105 [MH+] 553 [M+2H]2+ 28* (S)-4-amino-3-(3,5-diclorfenil)butanoil-- Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DnorLeu-Abu-Dab-Dab-Thr] Norleu Abu 2 C47H79C I2N15O1 2 1115,5 8,0 1117 [MH+] 559 [M+2H]2+ 29* (R)-4-amino-3-(3,5-diclorfenil)butanoil-- Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DnorLeu-Abu-Dab-Dab-Thr] Norleu Abu 2 C47H79C I2N15O1 2 1115,5 8,1 1117 [MH+] 559 [M+2H]2+ 30* (S)-4-amino-3-(3-(tiofen-3-il)fenil)butanoil-Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Abu-Dab-Dab-Thr] Leu Abu 3a C51H83N 1129,6 8,4 1131 [MH+] 566 [M+2H]2+ 15O12S 31* (R)-4-amino-3-(3-(tiofen-3-il)fenil)butanoil-Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Abu-Dab-Dab-Thr] Leu Abu 3a C51H83N 15O12S 1129,6 8,5 566 [M+2H]2+ 32* (S)-4-amino-3-(3-bromfenil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Abu-Dab-Dab-Thr] Leu Abu 3a C47H80B rN15O12 1125,5 7,1 1128 [MH+] 564 [M+2H]2+ 33* (R)-4-amino-3-(3-bromfenil)butanoil -Thr- Dap-Ciclo[Dab-Dab-DLeu-Abu-Dab-Dab-Thr]. Leu Abu 3a C47H80B rN15O12 1125,5 7,5 1128 [MH+] 564 [M+2H]2+

Rezultate biologice

Compuşii din invenţie şi compuşii de referinţă au fost testaţi, iar rezultatele au fost comparate cu exemple comparative, care includ compuşi raportaţi anterior în domeniu.

Determinarea MIC

Inoculul a fost preparat prin realizarea unei suspensii directe de colonii izolate (selectate dintr-o placă de agar Mueller-Hinton de 18-24 ore) ajustată la standardul McFarland de 0,5. Testarea MIC a fost efectuată prin diluţii în serie de antibiotice de două ori în bulion Mueller-Hinton ajustat cu cationi în plăci de microtitrare sterile cu 96 de godeuri, într-un volum total de 170 µL (150 µL de bulion care conţine agentul antimicrobian, 20 µL de inocul). Testele au fost efectuate în dublu exemplar. Plăcile au fost incubate aerob fără agitare timp de 18-20 ore la 35°C cu MIC definită ca cea mai scăzută concentraţie de medicament care a împiedicat creşterea vizibilă. Câţiva dintre compuşi au fost supuşi la mai multe teste, iar atunci când este cazul, MIC prezentată este valoarea mediană obţinută. Valorile MIC sunt exprimate în µg/mL.

Test de toxicitate in vitro pentru celule renale

Testul de toxicitate in vitro pentru celule renale a fost efectuat conform următorului protocol.

Celule HK-2 au fost menţinute şi testate în mediu Keratinocyte-SFM suplimentat cu 5 ng/ml factor de creştere epidermică (EGF) şi 50 µg/mL de extract hipofizar bovin (BPE). Celulele au fost însămânţate la 7500 de celule în fiecare godeu în plăci cu 96 de godeuri şi au fost lăsate să adere peste noapte. Polimixină B (PMB) şi compuşi de testare au fost dizolvate în 10% DMSO în apă pentru a se obţine o soluţie stoc de 20 şi, respectiv, 60 mg/mL. Compuşii de testare au fost diluaţi pentru a se obţine o concentraţie maximă de 3000 sau 1000 µg/ml cu diluţii semi-log pentru a se obţine un interval de concentraţie de 9 puncte plus vehicul de control. PMB a fost de asemenea diluat pentru a se obţine o concentraţie maximă de 1000 µg/ml cu diluţii semi-log. Nivelurile de apă şi DMSO au fost menţinute constante la 5% şi, respectiv, 0,5%. Compuşii de testare au fost incubaţi cu celule timp de 24 de ore la 37°C, 5% CO2 într-o atmosferă cu umiditate. CellTiter-Blue a fost diluat în PBS (1:4) şi au fost adăugate 20% (v/v) şi au fost incubate la 37°C timp de 2 ore înainte ca produsul fluorescent să fie detectat.

Numai valorile medii de fundal au fost scăzute înainte ca datele să fie analizate folosind GraphPad Prism. Valorile individuale pentru fiecare compus au fost normalizate la godeurile cu vehicul de control. Valorile concentraţiei de compus au fost reprezentate grafic ca valori log pentru a permite ajustarea unei curbe doză-răspuns. Partea de jos a curbei a fost restricţionată la zero şi au fost determinate valorile IC50.

Valorile IC50 sunt exprimate în raport cu cele pentru PMB în acelaşi experiment. Atunci când s-au făcut mai multe determinări, au fost prezentate valorile mediane.

Măsurători ale nivelului în rinichi la patru ore

Compuşi au fost administraţi subcutanat la 17,2 mg de bază liberă/kg la şoareci (n = 2 sau 3). La patru ore după administrare, animalele au fost eutanasiate şi rinichii au fost îndepărtaţi, au fost tăiaţi din grăsime şi din ţesut conjunctiv, au fost cântăriţi şi congelaţi imediat. După dezgheţare la temperatura camerei, perechi de rinichi de la fiecare animal au fost plasaţi în tuburi conice de 2 ml care conţineau granule de oxid de zirconiu stabilizate cu ceria cântărite în prealabil. Au fost adăugate acid trifluoracetic, TFA (0,25 ml, 0,15% v/v în apă) şi tuburile au fost încărcate pe un omogenizator FastPrep-24 (MP Biomedicals Europe) şi au fost supuse la 3 cicluri de 30 de secunde fiecare la o viteză de 6 m/sec. O alicotă (200 µL) de omogenat a fost diluată cu un volum calculat de soluţie de TFA (0,15% v/v în apă) pentru a se obţine o concentraţie finală de 0,167 grame de rinichi/gram de omogenat.

Omogenate de rinichi (100 µL) au fost amestecate cu metanol (190 µL) şi TFA (110 µL, 10% v/v în apă) şi au fost depozitate peste noapte la -20°C pentru precipitarea proteinei. După 10 min de centrifugare la 13000 rpm şi la 6°C, 200 µl de supernatanţi au fost transferaţi în inserţii de sticlă şi au fost analizaţi prin LC-MS-MS.

Tabelul 2 - Rezultate biologice

Ex. AlogP E coli K. pneumoniae P. aeruginosa A. baumannii HK-2 rel la PMB Nivel în rinichi la 4 ore (µg/g)* Nivel în rinichi la 4 ore/Rel HK-2 CA58 ATCC 25922 CA64 ATCC 13822 CCUG 59347 ATCC 27853 NCTC 13424 ATCC BAA-747 1* -6,3 4 0,125 8 0,125 0,25 0,06 0,06 0,06 8,8 267 30 2* -6,3 8 0,25 2 0,25 0,5 0,25 0,25 0,25 7,2 538 75 3* -6,3 32 1 65 0,5 0,5 0,5 1 2 ND ND ND 4* -6,3 16 0,5 16 0,25 0,5 0,25 1 1 ND ND ND 5 -6,3 8 0,125 16 0,125 0,25 0,25 0,06 0,125 11,6 170 15 6 -6,3 8 0,125 8 0,125 0,5 0,125 0,5 0,5 7,8 381 49 7* -6,9 16 0,25 32 ND 0,25 0,125 0,125 0,125 ND ND ND 8* -6,9 16 0,125 32 ND 0,5 0,06 0,25 0,125 ND ND ND 9* -6,5 8 0,25 64 0,25 0,5 0,125 0,125 0,25 12,0 159 13 10* -6,5 8 0,125 16 0,5 0,25 0,125 0,25 0,25 8 346 43 11* -5,9 4 0,5 16 0,5 0,5 0,25 0,25 0,5 5,2 163 32 12* -5,9 4 0,5 8 0,5 0,5 0,125 0,25 0,25 ND ND ND 13* -6,2 8 0,5 16 0,5 0,5 0,25 0,5 0,5 ND ND ND 14* -6,2 8 1 32 0,5 1 0,5 0,5 0,5 ND ND ND 15* -6,1 4 0,125 16 0,125 0,5 0,25 0,06 0,06 52,1 443 8,5 16* -6,1 16 0,5 8 0,25 1 0,5 0,5 0,5 ND ND ND 17* -6,5 8 0,125 16 0,125 0,25 0,125 0,06 0,06 29,0 231 8 18* -6,5 16 0,25 8 0,25 0,25 0,25 0,125 0,125 32,8 535 16,3 19* -7,9 32 0,25 64 0,25 1 0,25 0,25 0,25 101,4 386 4 20* -7,9 64 1 64 2 2 0,5 1 2 ND ND ND 21* -6,5 16 0,125 32 0,25 0,5 0,25 0,125 0,125 267 209 8 23* -7,4 32 0,125 64 0,125 0,5 0,25 0,125 ND >41 263 <6,4 22* -6,5 16 0,25 8 0,25 0,5 0,25 1 1 ND ND ND 24* -6,5 4 0,125 16 0,25 0,25 0,125 0,06 0,03 21,8 203 9 25* -6,5 16 0,25 2 0,5 0,5 0,25 0,125 0,125 ND ND ND 26* -6,4 8 0,06 8 0,5 0,5 0,25 0,03 0,06 >58 353 <6,1 27* -6,4 16 0,25 2 0,25 0,5 0,5 0,125 0,125 ND ND ND 28* -6,5 16 0,125 8 0,125 0,25 0,25 0,06 0,125 68,5 408 6,0 29* -6,5 16 0,25 8 0,25 0,5 0,25 0,125 0,125 ND ND ND 30* -6,8 8 0,125 16 0,125 0,5 0,25 0,06 ND 37,5 252 6,7 31* -6,8 16 0,125 4 0,25 0,25 0,25 0,125 ND ND ND ND 32* -7,3 32 0,25 32 0,5 0,5 0,5 0,125 0,125 ND ND ND 33* -7,3 64 0,5 16 0,5 0,5 0,5 1 1 ND ND ND

ND - nedeterminat (netestat)

* - Compus de referinţă

Date biologice suplimentare

Compararea toxicităţii renale cu Exemplul 5 şi cu exemplele de referinţă D77 şi 38

La şoareci (n = 6) au fost administrate subcutanat de trei ori pe zi Polimixină B, sulfat de colistină, Exemplul de referinţă D77, Exemplul de referinţă 38 sau Exemplul 5, la 17,2 mg de bază liberă/kg. Începând imediat după prima doză în ziua 4, şoarecii au fost transferaţi în cuşti metabolice individuale şi urina a fost colectată în următoarele 24 de ore pentru determinarea nivelurilor de biomarker (albumină, cistatină C, KIM-1). Medii geometrice ale nivelurilor de biomarkeri sunt prezentate în tabelul de mai jos:

Compus Albumină (µg/24 ore) Cistatină C (ng/24 ore) KIM-1 (ng/24 ore) PMB 1.154 - 1.912 1.155 - 1.400 4 - 22 Colistină 2.353 - 2.548 1.266 - 1.678 42 - 89 Exemplu de referinţă D77 3.639 7.542 130 Exemplu de referinţă 38 2.362 14.015 79 Exemplul 5 1.004 827 3

Valorile PMB arată intervalul din 4 experimente şi colistina din 2 experimente.

Creşterea albuminei, cistatinei C sau KIM-1 în urină sunt semne de deteriorare renală. Exemplul 5 a arătat cele mai scăzute niveluri dintre toţi cei 3 biomarkeri ai toxicităţii renale.

Exemplul de referinţă D77 este descris în WO 2015/135976. Exemplul de referinţă 38 este descris în WO 2016/083531.

Compararea toxicităţii renale - Exemplele 5, 9 şi 17

La şoareci (n = 6) au fost administrate subcutanat patru doze de PMB, Exemplul 5, Exemplul de referinţă 9 sau Exemplul de referinţă 17, la 25 mg de bază liberă/kg, la intervale de 8 ore. După a patra doză, animalele au fost transferate în cuşti metabolice individuale şi urina a fost colectată timp de 24 de ore pentru determinarea biomarkerilor urinari. După colectarea urinei, şoarecii au fost eutanasiaţi şi rinichii au fost recoltaţi pentru histopatologie.

Compus Albumină (µg/24 ore) Cistatină C (ng/24 ore) KIM-1 (ng/24 ore) PMB 1.147 1.425 58 Exemplul 5 343 448 1 Exemplul de referinţă 9 749 754 2

Niciunul dintre animalele din grupurile cu Exemplul 5 sau cu Exemplul de referinţă 9 nu au prezentat la histopatologie semne de degenerare sau regenerare. În contrast, toate cele 6 animale tratate cu PMB au prezentat o regenerare tubulară minimă.

Într-un experiment separat, Exemplul de referinţă 17 a fost comparat cu PMB.

Compus Creştere în comparaţie cu vehiculul de control Albumină Cistatină C KIM-1 PMB 29 × 2 × 771 × Exemplul de referinţă 17 2,7 × 1,8 × 4,7 ×

Au fost evaluate, de asemenea, semnele histopatologice:

PMB Exemplul de referinţă 17 Degenerescenţă/necroză tubulară 4 normal/1 minim Toate normale Tubuli bazofili 4 minim/1 uşor 3 normal/2 minim

Comparaţie dintre toxicitatea renală a exemplului 5 şi cu PMB la maimuţă Cynomolgus

La masculi de maimuţă Cynomolgus (n = 3) a fost administrat Exemplul 5 prin perfuzie intravenoasă timp de 1 oră la 20 mg/kg/doză, de 3 ori pe zi timp de 7 zile. Într-un experiment separat, la masculi de maimuţă (n = 3) a fost administrat PMB aceeaşi perioadă la 4mg/kg/doză. În ambele experimente, la animale de control a fost administrat ser fiziologic de 3 ori pe zi.

La sfârşitul perioadei de 7 zile, a fost prelevat sânge şi au fost determinate nivelurile serice de azot ureic şi creatinină din sânge ca indicatori ai deteriorării renale. În cazul Exemplului 5, nivelurile medii de BUN şi creatinină au fost crescute cu mai puţin decât 50% comparativ cu cele ale animalelor de control cu soluţie salină. Cu toate acestea, la animalele cărora le-a fost administrat PMB, nivelul de BUN a fost crescut cu 76% în comparaţie cu cel al animalele de control, iar nivelul de creatinină a fost de 2,6 × mai mare.

Rinichii au fost recoltaţi la sfârşitul perioadei de administrare de 7 zile şi au fost examinaţi microscopic. Dintre cele trei animale tratate cu PMB, 2 au prezentat degenerare tubulară uşoară şi 1 minimă. Dintre animalele tratate cu Exemplul 5, 1 a prezentat o degenerare tubulară uşoară şi 2 au prezentat o degenerare minimă.

Doza din aceste experimente a fost de 5 x mai mare cu Exemplul 5 decât cu PMB, dar semnele de toxicitate renală au fost reduse. Expunerea la medicament dintr-un ciclu de administrare, în ziua 7 de administrare (AUC0-8 ore) a fost de 234 µg.oră/mL pentru Exemplul 5 şi 117 µg.oră/mL pentru PMB.

Eficacitatea compuşilor într-un model neutropenic de coapsă murină infectat cu E. coli ATCC 25922

După ce au fost neutropenici (ciclofosfamidă 150 mg/kg ziua-4, 100 mg/kg ziua-1), şoareci CD-1 (n = 5) au fost inoculaţi în fiecare coapsă cu aproximativ 105 cfu de E. coli ATCC25922. La şoareci au fost administrate IV 0,125, 0,5 şi 3 mg/kg de sulfat de PMB sau de compus de testare (greutate echivalentă de bază liberă) la 1, 3,5 şi 6 ore după infectare. La 9 ore după infectare, şoarecii au fost eutanasiaţi şi coapsele au fost pregătite pentru numărarea coloniilor.

Scăderea numărului de colonii în raport cu un vehicul de control este arătată în tabelul de mai jos. În fiecare caz, scăderea observată cu PMB în acelaşi experiment este arătată în paranteze:

Compus Scădere log, în cfu, în comparaţie cu vehiculul de control 0,125 mg/kg 0,5 mg/kg 3 mg/kg Exemplul 5 0,1 (0,4) 2,2 (2,6) 3,4 (3,5) Exemplul de referinţă 9 0,1 (0,4) 0,5 (0,6) 3,7 (3,9) Exemplul de referinţă 17 0 (0,1) 1,3 (1,1) 3,7 (3,7) Exemplul de referinţă 24 0 (0) 0,4 (0,5) 2,4 (2,9)

Toţi compuşii au fost la fel de eficienţi ca PMB.

Eficacitatea compuşilor într-un model neutropenic de coapsă murină infectat cu K. Pneumoniae ATCC 43816

După ce au fost neutropenici (ciclofosfamidă 150 mg/kg ziua-4, 100 mg/kg ziua-1), şoareci CD-1 (n = 5) au fost inoculaţi în fiecare coapsă cu aproximativ 105 cfu de K. pneumoniae ATCC43816. La şoareci au fost administrate IV doze adecvate de sulfat de PMB sau de compus de testare (greutate echivalentă de bază liberă) la 2, 6 şi 10 ore după infectare. La 16 ore după infectare, şoarecii au fost eutanasiaţi şi coapsele au fost pregătite pentru numărarea coloniilor.

Scăderea numărului de colonii în raport cu un vehicul de control este arătată în tabelul de mai jos. În fiecare caz, scăderea observată cu PMB în acelaşi experiment este arătată în paranteze:

Doză (mg/kg) Scădere log, în cfu, în comparaţie cu vehiculul de control Exemplul 5 Exemplul de referinţă 24 0,125 0 (0,2) 0 (0,2) 0,25 ND 0,2 (0,2) 0,5 4,8 (4,9) 0,2 (0,9) 1 4,8 (5,2) ND 2 ND 4,7 (4,0) 4 5,3 (5,6) ND

ND = Nedeterminat

Ambii compuşi au fost la fel de eficienţi ca PMB.

Eficacitatea compuşilor într-un model neutropenic de coapsă murină infectat cu A. baumannii NCTC13301

După ce au fost neutropenici (ciclofosfamidă 150 mg/kg ziua-4, 100 mg/kg ziua-1), şoareci CD-1 (n = 5) au fost inoculaţi în fiecare coapsă cu aproximativ 105 cfu de A. baumannii NCTC13301. La şoareci au fost administrate IV 0,125, 0,5, 1 şi 4 mg/kg de sulfat de PMB sau de compus de testare (greutate echivalentă de bază liberă) la 2, 6 şi 10 ore după infectare. La 16 ore după infectare, şoarecii au fost eutanasiaţi şi coapsele au fost pregătite pentru numărarea coloniilor.

Scăderea numărului de colonii în raport cu un vehicul de control este arătată în tabelul de mai jos. În fiecare caz, scăderea observată cu PMB în acelaşi experiment este arătată în paranteze:

Doza (mg/kg) Scădere log, în cfu, în comparaţie cu vehiculul de control Exemplul 5 Exemplul de referinţă 24 0,125 0,4 (0,3) 0,1 (0,1) 0,5 3,1 (4,2) 2,2 (4,1) 1 6,7 (5,8) 5,5 (5,0) 4 7,4 (6,5) 5,7 (5,3)

Ambii compuşi au fost la fel de eficienţi ca PMB.

Eficacitatea compuşilor într-un model neutropenic de plămân murin infectat cu A. baumannii NCTC13301

După ce au fost neutropenici (ciclofosfamidă 200 mg/kg ziua-4, 150 mg/kg ziua-1), şoareci CD-1 (n = 8) au fost inoculaţi intranazal cu aproximativ 107 cfu în fiecare plămân cu A. baumannii NCTC13301. La şoareci a fost administrat SC sulfat de PMB (20 mg/kg) sau doze adecvate de compus de testare (greutate echivalentă de bază liberă) la 2, 6 şi 10 ore după infectare. La 16 ore după infectare, şoarecii au fost eutanasiaţi şi plămânii au fost pregătiţi pentru numărarea coloniilor.

Scăderea numărului de colonii în raport cu un vehicul de control este arătată în tabelul de mai jos. În fiecare caz, scăderea observată cu PMB în acelaşi experiment este arătată în paranteze:

Doză (mg/kg) Scădere log, în cfu, în comparaţie cu vehiculul de control Exemplul 5 Ref. Exemplul 24 2,5 0 0,9 10 0 1,6 20 2,5 (0) 2,7 (0) 30 4,0 3,9

PMB nu a fost eficient în acest model la doza maximă tolerată. Exemplul 5 a fost mai eficient la 20 mg/kg şi ar putea fi administrat, de asemenea, la niveluri mai mari pentru a obţine un efect mai mare datorită toxicităţii reduse.

Eficacitatea compuşilor într-un model neutropenic de plămân murin infectat cu P. aeruginosa ATCC 27853

După ce au fost neutropenici (ciclofosfamidă 200 mg/kg ziua-4, 150 mg/kg ziua-1), şoareci CD-1 (n = 8) au fost inoculaţi intranazal cu 104 - 105 cfu în fiecare plămân cu P. aeruginosa ATCC27853. La şoareci au fost administrate SC doze adecvate de sulfat de PMB sau de compus de testare (greutate echivalentă de bază liberă) la 2, 6 şi 10 ore după infectare. La 16 ore după infectare, şoarecii au fost eutanasiaţi şi plămânii au fost pregătiţi pentru numărarea coloniilor.

Scăderea numărului de colonii în raport cu un vehicul de control este arătată în tabelul de mai jos. În fiecare caz, scăderea observată cu PMB în acelaşi experiment este arătată în paranteze:

Doză (mg/kg) Scădere log, în cfu, în comparaţie cu vehiculul de control Exemplul 5 Exemplul de referinţă 24 2,5 0 (0) 0,8 (0,3) 5 0 (0) ND 7,5 ND 3,2 (1,0) 10 2 (0,7) ND 20 3,6 (2,6) 4,4 (3,7) 40 ND 5,7 ND = Nedeterminat

Ambii compuşi au arătat o eficacitate superioară faţă de PMB în acest model.

Valorile MIC cu Exemplul 5 în prezenţa Rifampicinei

Organism Colecţia de tulpini nr. Genotip de rezistenţă cunoscut Polimixină B (PMB) PMB+Rif (1 µg/mL) Exemplul 5 Ex. 5+Rif (1 µg/mL) E. coli ATCC 25922 NA 0,25 ≤0,015 0,125 ≤0,015 CDF-1 MCR-1 4 0,06 8 0,06 IHMA 940398 NA 16 0,06 32 0,125 K. pneumoniae ATCC 13882 NA 0,25 0,06 0,125 0,06 IHMA 580884 NA 8 0,06 16 0,125 IHMA 520329 SHV-12, KPC-2 64 0,125 >64 0,06 P. aeruginosa ATCC 27853 NA 0,5 0,125 0,25 0,125 IHMA 517175 NA 8 0,25 8 0,5 IHMA 644636 NA 32 0,5 32 1 A. baumannii NCTC 13301 OXA-23 0,25 ≤0,015 0,06 ≤0,015 IHMA 851735 OXA-23 8 0,03 0,25 ≤0,015 IHMA 517303 NA >64 0,125 >64 0,03

Valorile MIC (µg/mL) au fost determinate prin microdiluţie în bulion în condiţii CLSI.

Atât PMB cât şi Exemplul 5 prezintă o sinergie puternică cu rifampicina chiar şi împotriva tulpinilor cu sensibilitate redusă la polimixine.

Studiu de stereochimie

Compuşii din invenţie conţin un stereocentru în poziţia β a grupării γ-aminopropil din fragmentul N-terminal. În mod surprinzător, s-a descoperit că unul dintre stereoizomerii aflaţi în această poziţie este asociat de obicei cu o citotoxicitate mai mică şi cu niveluri mai scăzute de medicament în rinichi. Acesta este stereoizomerul care eluează mai rapid la cromatografia în fază inversă.

De exemplu, în perechea de diastereoizomeri referitoare la Exemplele 5 şi 6, diastereomerul care eluează mai rapid dintr-o coloană HPLC în fază inversă prezintă o expunere renală mai mică şi o citotoxicitate mai mică decât izomerul corespondent mai lent. Diastereomerul mai rapid (Exemplul 5) este derivat din acid (S)-4-amino-3-(3-clorfenil butanoic, prin analiza cu raze X a moleculelor mici ale aminoacidului corespondent (aşa cum este arătat în schema de mai jos).

Alte comparaţii sunt arătate în Tabelul 3 de mai jos. Diastereomerii (epimeri din gruparea de capăt N-terminal) care eluează mai rapid în cromatografia în fază inversă şi care au deplasări chimice RMN similare cu cele date pentru Exemplul 5, este probabil să aibă aceeaşi stereochimie absolută ca şi Exemplul 5, aşa cum este descris mai sus.

Stereochimia absolută atribuită fiecăruia dintre compuşii din Tabelul 3 este arătată în Tabelul 1. Exemplele de referinţă sunt marcate cu un asterisc (*).

Tabelul 3 - Rezultate de stereochimie

Exemplu Structură Citotoxicitate Nivel de medicament în rinichi Nivel în rinichi la 4 ore/ citotoxicitate relativă 1* Izomer „rapid». 8,8 268 30 2* Izomer „lent». 7,2 538 75 5 Izomer „rapid». 11,6 170 15 6 Izomer „lent». 7,8 381 49 9* Izomer rapid 12,0 159 13 10* Izomer lent 8,0 346 43

Citotoxicitatea se referă la IC50 măsurată, în comparaţie cu cea înregistrată pentru Polimixină B, împotriva unei linii de celule HK-2.

Nivelul de medicament se referă la cantitatea de compus găsită în rinichi la 4 ore după o doză sc de 17,2 mg/kg (µg/g) într-un model de şoarece.

Date suplimentare

Toxicitatea renală a exemplului de referinţă 24 în comparaţie cu cea a PMB după patru doze, la şoarece

La grupuri de şoareci masculi CD-1 (n = 5) au fost administrate subcutanat de patru ori la intervale de 8 ore, fie Polimixină B (PMB) la 12,5 sau 25 mg de bază liberă/kg, fie compusul din Exemplul de referinţă 24, la 25, 50 sau 75 mg de bază liberă/kg. Imediat după a patra doză, şoarecii au fost transferaţi în cuşti metabolice şi urina a fost colectată timp de 24 de ore pentru determinarea biomarkerilor urinari. După colectarea urinei, şoarecii au fost sacrificaţi pentru histopatologie renală. Nivelurile medii ale biomarkerilor sunt arătate în Tabelul 4 de mai jos.

Tabelul 4 - Biomarkeri urinari

Compus Doză (mg/kg) Biomarkeri urinari Cistatină C β-2 microglobuline Kim-1 NGAL Albumină Vehicul - 22,24 0,05 17,01 0,00 3,44 PMB 12,5 29,45 3,43 21,89 0,30 3,75 PMB 25 44,51 43,83 3.446,42 4,37 7,73 Ex 24 25 31,04 0,05 27,61 0,00 4,78 Ex 24 50 33,97 13,22 171,59 0,63 6,95 Ex 24 75 81,44 68,51 1.203,41 3,71 10,93

Biomarkerii urinari au fost normalizaţi la creatinina urinară.

Pentru toţi cei cinci biomarkeri, la 50 mg/kg, expresia de Exemplul de referinţă 24 a fost mai mică decât la 25 mg/kg de PMB, şi pentru doi (Kim-1, NGAL) din cei cinci biomarkeri expresia la doză de 75 mg/kg a fost mai mică decât pentru PMB la 25 mg/kg.

Rezultatele histopatologice sunt arătate în Tabelul 5 de mai jos.

Tabelul 5 - Rezultate histopatologice

Compus Doză (mg/kg) Histopatologie Degenerescenţă tubulară/necroză Tubuli bazofili (cortex) Cifrele mitotice au crescut Vehicul - 0/5 0/5 0/5 PMB 12,5 0/5 0/5 0/5 PMB 25 5/5 (2 minim /2 uşoară /1 moderată*) 5/5 (1 minim /2 uşor/2 moderat*) 3/5 (2 minim /1 uşor) Ex. 24 25 0/5 0/5 0/5 Ex. 24 50 2/5 (2 minim) 2/5 (2 minim) 2/5 (2 minim) Ex. 24 75 5/5 (1 minim /3 uşoară/1 moderată)) 5/5 (2 minim /1 uşor /1 moderat /1 marcat) 5/5 (5 minim)

* Un animal a murit în timpul studiului

Histopatologia renală la doza de 50 mg/kg de Exemplul de referinţă 24 a fost mai puţin severă decât cea la o doză de 25 mg/kg de PMB, şi histopatologia renală a fost similară la o doză de 75 mg/kg de Exemplul 24, în comparaţie cu cea la o doză de 25 mg/kg de PMB.

Referinţe

de Visser şi colab. J. Peptide Res, 61, 2003, 298

Dolomanov şi colab. J. Appl. Cryst. 42, 2009, 339

Felluga şi colab. Tetrahedron Asymmetry, 19, 2008, 945

Sheldrick Acta Cryst. A71, 2015, 3-8

Sheldrick Acta Cryst. C71, 2015, 3-8

Vaara şi colab. Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 52, 2008. 3229

Velkov şi colab. ACS Chem. Biol. 9, 2014, 1172

Velkov şi colab. ACS Chem. Biol. 9, 2014, 1172

WO 2014/188178

WO 2016/083531

WO 2013/072695

WO 2015/135976

WO 2017/054047

US 2012/316105

WO 2016/166103

Koh şi colab. Aminoacizi 2017, 49, 1653

Claims (7)

1. Un compus cu formula (II):

şi săruri, solvaţi şi forme protejate ale acestuia.

2. Un compus cu formula (II) conform revendicării 1, care este un compus:

şi săruri, solvaţi şi forme protejate ale acestuia.

3. Un compus cu formula (II) conform revendicării 1, care este un compus:

şi săruri, solvaţi şi forme protejate ale acestuia.

4. O compoziţie farmaceutică care cuprinde un compus conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 3, opţional împreună cu unul sau mai mulţi purtători acceptabili farmaceutic.

5. Un compus conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 3, sau o compoziţie farmaceutică conform revendicării 4, pentru utilizare într-o metodă de tratament sau profilaxie.

6. Un compus conform oricăreia dintre revendicările 1 până la 3, sau o compoziţie farmaceutică conform revendicării 4, pentru utilizare într-o metodă de tratare a unei infecţii microbiene, cum ar fi o infecţie bacteriană.

7. Un compus sau compoziţie farmaceutică pentru utilizare conform revendicării 6, în care infecţia microbiană este o infecţie bacteriană Gram-negativă, cum ar fi o infecţie cu o bacterie Gram-negativă selectată dintre Escherichia spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Citrobacter spp., Morganella morganii, Yersinia pseudotuberculosis şi alte Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, bacterii cu acid acetic, Legionella şi alfa-proteobacterii.