ES2971732T3 - Compuestos - Google Patents

Abstract

La invención proporciona un compuesto de polimixina de fórmula (I) y sus sales, solvatos y formas protegidas, composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de fórmula (I), y el uso de los compuestos y composiciones en métodos de tratamiento, tales como métodos para el tratamiento de infecciones microbianas. Los compuestos de fórmula (I) se representan así: fórmula (I) en la que -R15 es un grupo: fórmula (II) y -R16 es hidrógeno; -R17 es hidrógeno; -L- es un enlace covalente o metileno; y -Ar es arilo opcionalmente sustituido. Los grupos -X-, -R1, -R2, -R3, -R4 y -R8 son como se definen en el presente documento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos

Solicitud relacionada

El presente caso reivindica beneficio y la prioridad del documento US 62/689602 presentado el 25 de junio de 2018 (25.06.2018).

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos compuestos de polimixina, composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos, y el uso de los compuestos y las composiciones farmacéuticas para tratamiento médico, por ejemplo, tratamiento de infecciones microbianas, particularmente infecciones por bacterias gramnegativas.

Antecedentes

Los documentos WO 2013/072695 y WO 2014/188178 describen derivados de polimixina en los que el resto de acilo graso N-terminal y el resto de ácido diaminobutírico adyacente de Polimixina B o Colistina se reemplazan por un grupo terminal que tiene un sustituyente amino. Dichos derivados tienen buena actividad antibacteriana mientras que tienen una citotoxicidad reducida.

El documento WO 2015/135976 también describe derivados de polimixina en los que, de nuevo, el resto de acilo graso N-terminal y el ácido diaminobutírico adyacente de la Polimixina B o Colistina se reemplazan por un grupo terminal que tiene un sustituyente amino. En este caso, se demostró que la posición específica del sustituyente amino y la colocación de otros sustituyentes en el resto N-terminal son importantes para una fuerte actividad antimicrobiana en un rango de patógenos clave, tales comoEscherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosayAcinetobacter baumannii.Los compuestos descritos también conservaron una baja citotoxicidad.

El documento WO 2016/083531 también describe derivados de polimixina en los que, de nuevo, el resto de acilo graso N-terminal y el ácido diaminobutírico adyacente de la Polimixina B o Colistina se reemplazan por un grupo terminal que tiene un sustituyente amino, tal como los grupos presentes en los documentos WO 2013/072695, WO 2014/188178 y WO 2015/135976. Además, el residuo de aminoácido en las posiciones 6 y/o 7 está sustituido con respecto a la Polimixina B y la Colistina.

El documento WO 2017/054047 describe derivados decapéptidos de polimixina en los que la fracción acilo graso N-terminal de polimixina B se reemplaza por un grupo terminal que tiene funcionalidad aromática. Además, el residuo de aminoácido en la posición 3 y los residuos de aminoácido en las posiciones 6 y/o 7 están sustituidos con respecto a la polimixina B.

El documento US 2012/316105 describe derivados decapéptidos de polimixina en los que la fracción acilo graso N-terminal de polimixina B típicamente se reemplaza por un grupo terminal que tiene funcionalidad aromática. Además, el residuo de aminoácido en la posición 3 está sustituido con respecto a la Polimixina B.

El documento WO 2016/166103 describe derivados de polimixina en los que nuevamente la fracción acilo graso N-terminal y el ácido diaminobutírico adyacente de polimixina B o colistina se reemplazan por un grupo terminal que tiene funcionalidad aromática.

Koh et al. es una revisión de los agentes antimicrobianos. Entre otros, Koh et al. analizan los ejemplos de US 2012/316105

Para ser más útiles para la terapia parenteral de infecciones sistémicas que las polimixinas disponibles actualmente, los nuevos derivados de polimixina deben al menos igualar la actividad de estas polimixinas conocidas, mientras que tienen una toxicidad renal significativamente menorin vivo.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto general, la invención proporciona compuestos que tienen un núcleo de polimixina desacilado, tal como un núcleo nonapéptido de Polimixina B o Colistina con el residuo aminoacídico en la posición 3 sustituido con L-Dap, que tiene un grupo un grupo C(O)-CH2CH(3-Cl-Ph)CH2NH2, como se define en el presente documento, en su extremo N terminal. Dichos compuestos encuentran uso en un procedimiento de tratamiento o profilaxis, opcionalmente en combinación con un segundo agente activo. Los compuestos pueden usarse para tratar una infección microbiana, tal como una infección bacteriana gramnegativa.

Se muestra que los compuestos de la presente invención tienen una baja citotoxicidad equilibrada con niveles aceptables de fármaco en el riñón después de la dosificación parenteral. Se ha demostrado que los compuestos de la presente invención son superiores tanto a la Polimixina B, como a los compuestos de polimixina modificada conocidos en la técnica, incluidos los descritos previamente por el presente solicitante. Esta superioridad se manifiesta en una o más de las siguientes características: menor citotoxicidad, niveles aceptables de fármaco en el riñón (es decir, una toxicidad renal aceptable, que es resultado de que los niveles de fármaco en el riñón no son altos) después de la dosificación parenteral, eficacia en modelos de muslo y pulmón de ratón, y/o una MIC superior contra cepas bacterianas patógenas, mientras que son equivalentes a los compuestos de la técnica anterior en las demás.

Típicamente, los compuestos conocidos en la técnica exhiben una, o quizás dos de estas características ventajosas, pero no todas. Por ejemplo, ahora es relativamente común encontrar compuestos de polimixina que tengan menor citotoxicidad, pero esta menor citotoxicidad suele ir acompañada de una reducción en la actividad antibacteriana. Adicionalmente, los compuestos que tienen una citotoxicidad inferior pueden, sin embargo, encontrarse dentro del riñón en niveles altos después de la dosificación. Dichos compuestos son, por lo tanto, aún tóxicos, y no son útiles en los procedimientos de tratamiento médico.

En un primer aspecto de la invención, se proporciona un compuesto de fórmula (I), y sales, solvatos, formas protegidas del mismo.

El compuesto de fórmula (II) se representa de este modo:

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (II), opcionalmente junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.

En un aspecto más se proporciona un compuesto de fórmula (II), o una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (II), para su uso en un procedimiento de tratamiento o profilaxis.

En aún un aspecto adicional se proporciona un compuesto de fórmula (II), o una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (II), para su uso en un procedimiento para tratar una infección microbiana. Una infección microbiana puede ser una infección bacteriana, tal como una infección bacteriana gramnegativa. La infección bacteriana gramnegativa puede seleccionarse del grupo que consiste enEscherichiaspp.,Klebsiellaspp.,Enterobacterspp.,Salmonellaspp.,Shigellaspp.,Citrobacterspp., y otras Enterobacteriaceae,Pseudomonasspp.,Acinetobacterspp.,Stenotrophomonas,yLegionella.

Se describe en el presente documento procedimientos para la preparación de compuestos de fórmula (I), así como compuestos intermedios para su uso en la preparación de los compuestos de fórmula (I).

Estos y otros aspectos y realizaciones de la invención se describen con más detalle a continuación.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona compuestos de fórmula (II) como se describe en más detalle a continuación, para su uso en tratamiento médico, opcionalmente junto con un segundo agente activo.

En términos generales, los compuestos de fórmula (II) tienen un núcleo de polimixina, que es un núcleo nonapeptídico, y un grupo -C(O)-CH2CH(3-Cl-Ph)CH2NH2 en el extremo N-terminal del núcleo de polimixina. El grupo conectado a C(O)- es un grupo Y-aminopropilo sustituido. El grupo Y-aminopropilo está sustituido en la posición p con respecto a la fracción -C(O)- con 3-Cl-Ph.

El primer residuo de aminoácidos en la cadena exocíclica de los compuestos de la invención, correspondiente a la posición 3 en polimixina, es un residuo L-Dap (ácido diaminopropiónico), en lugar de un residuo L-Dab (ácido L-diaminobutírico), como está presente en Polimixina B y Colistina.

Los residuos de aminoácidos en las posiciones 6 y 7 del compuesto de polimixina (siguiendo la numeración utilizada para la polimixina) pueden corresponder a los residuos de aminoácidos presentes en la Polimixina B.

Para ser más útil para la terapia parenteral de infecciones sistémicas que las series conocidas actualmente de compuestos de polimixina, los nuevos derivados de polimixina deben al menos igualar la actividad antibacteriana de los compuestos de polimixina conocidos, mientras que tienen una toxicidad renal significativamente menorin vivo.

Se ha encontrado ahora que no es suficiente que un compuesto de polimixina exhiba una citotoxicidad más baja, ya que tal no se asocia frecuentemente con una toxicidad reducidain vivo.Por lo tanto, la acumulación del fármaco en el riñón y su eliminación a partir de allí también debe ser favorable. En otras palabras, la combinación de la citotoxicidad y los niveles de fármacos en el riñón después de la dosificación parenteral es lo que conduce a un perfil de toxicidadin vivofavorable.

Esto se puede mostrar a través de las comparaciones de ejemplo que se muestran en la Tabla A a continuación, donde PMBN se refiere al núcleo nonapeptídico de la Polimixina B, y PMEN se refiere al núcleo nonapeptídico de la Polimixina E, con las sustituciones de los residuos de aminoácidos en las posiciones 3 y 6 (según a la numeración de la Polimixina) mostrada, cuando sea apropiado (por ejemplo, reemplazando Dap a Dab en la posición 3, y reemplazando ciclohexilalanina (CHA) a fenilalanina en la posición 6).

Tabla A

La citotoxicidad se refiere a la CI50 medida en relación con la registrada para la Polimixina B contra una línea celular HK-2. El nivel de fármaco se refiere a la cantidad de compuesto (pg/g de riñón) que se encuentra en el riñón a las 4 o 16 horas después de una dosis sc de 17,2 mg/kg en un ratón.

* Los compuestos se dosificaron para 4 dosis con 8 h de diferencia a 25 mg de base libre/kg/dosis o 4 días tid a intervalos de 4 horas a 17,2 mg de base libre/kg/dosis. Después de la dosificación, se recogió la orina durante 16-24 h para la determinación de biomarcadores urinarios de toxicidad renal (KIM-1, albúmina, cistatina C). Los compuestos se clasificaron como - (indistinguible para el vehículo de control) a +++ (respuesta fuerte de todos los biomarcadores).

** En el documento WO 2015/135976 se citó una cifra de 13,3 para este compuesto (Ejemplo D77). Este compuesto ahora se ha probado dos veces más y el valor relativo se calculó en función del valor para PMB en el mismo experimento. El valor medio fue 23

*** En el documento WO 2016/083531 se cita una CI50 de 255 pg/ml para este compuesto (Ejemplo 38) en comparación con 12 |jg/ml para Polimixina B. Sin embargo, la cifra de PMB utilizada en esa aplicación fue un valor mediano de múltiples experimentos. La cifra de 9,2 citada aquí es en comparación con el valor de CI50 para PMB determinado en el mismo experimento

El presente solicitante ha divulgado previamente en el documento WO 2015/135976 nonapéptidos de polimixina con un grupo Y-aminopropilo N-terminal sustituido con un resto fenilo o bencilo. Sin embargo, el sustituyente fenilo o bencilo se proporciona en la posición a, en lugar de la posición p, en relación con el grupo -X-. El documento WO 2015/135976 también describe un nonapéptido de polimixina con un grupo p-aminoetilo N-terminal sustituido en la posición a con un grupo bencilo. En este caso, la funcionalidad amino se proporciona en la posición p en lugar de la posición y, en relación con el grupo -X-.

Si bien estos compuestos conocidos muestran una actividad prometedora y una citotoxicidad moderadamente mejorada en comparación con la Polimixina B, estos compuestos son inferiores a los compuestos de la presente invención, ya que no muestran una combinación de baja citotoxicidad en conjunto con la equilibrada con niveles renales aceptables después de la dosificación.

Esto se muestra a través de las comparaciones de ejemplo que se muestran en la Tabla B a continuación, donde PMBN se refiere al núcleo nonapeptídico de Polimixina B, con las sustituciones al residuo de aminoácidos en las posiciones 3, cuando sea apropiado (por ejemplo, Dap reemplaza Dab en la posición 3).

Tabla B

El presente solicitante ha divulgado previamente en el documento WO 2016/083531 nonapéptidos de polimixina con grupos N-terminales modificados, particularmente aquellos que incluyen grupos p-arilo o p-aralquilo. Sin embargo, estos compuestos conocidos tienen un residuo de aminoácido lipófilo en la posición 6, tal como un residuo de ciclohexilalanina, mientras que los compuestos del presente caso tienen, por ejemplo, un residuo de fenilalanina, leucina, norleucina, valina o norvalina en la posición 6. Estos compuestos de nuevo son inferiores a los compuestos de la presente invención en vista de la mala combinación de citotoxicidad y niveles de fármaco en el riñón después de la dosificación.

Esto se muestra a través de las comparaciones de ejemplo que se muestran en la Tabla C a continuación, donde PMBN se refiere al núcleo nonapeptídico de Polimixina B, con las sustituciones de los residuos de aminoácidos en las posiciones 3 y 6 mostradas, cuando sea apropiado (por ejemplo, reemplazando Dap a Dab en la posición 3, y reemplazando ciclohexilalanina (CHA) a fenilalanina en la posición 6).

Tabla C

Los compuestos 50 y 58 se conocen a partir del documento WO 2016/083531, y estos son los compuestos identificados comoIsómero 1en ese caso.

Compuestos de polimixina

Los compuestos de fórmula (II) son derivados N-terminales de la serie de nonapéptidos de polimixina de los compuestos. El núcleo del compuesto de fórmula (II) es un derivado de nonapéptido de Polimixina B (PMBN, Polimixina B 2-10), donde el residuo de aminoácidos en la posición 3 está sustituido con L-Dap. Los compuestos de fórmula (I) tienen un grupo C(O)-CH2CH(3-Cl-Ph)CH2NH2 en el extremo N terminal del núcleo de polimixina. Esto se describe con detalle a continuación.

Los compuestos de la invención contienen un estereocentro en la posición p del grupo Y-aminopropilo en la fracción N-terminal. Se ha encontrado que uno de los estereoisómeros está asociado con una menor citotoxicidad y menores niveles de fármacos en el riñón. Este estereoisómero es el estereoisómero que se eluye más rápidamente en la cromatografía de fase inversa, como se describe en detalle en los ejemplos trabajados del presente caso.

En el compuesto de fórmula (II) tiene un núcleo nonapéptido y un grupo -C(O)-CH2CH(3-Cl-Ph)CH2NH2 en el extremo N del núcleo de polimixina. El grupo que está conectado a -C(O)- es un grupo Y-aminopropilo sustituido. El grupo<y>-aminopropilo está sustituido en la posición p con respecto al resto -C(O)- con m-CI-Ph. El grupo Y-aminopropilo sustituido se puede representar así:

En una realización, el grupo Y-aminopropilo sustituido se puede representar así:

El compuesto de fórmula (II) se muestra a continuación:

El compuesto de fórmula (II) puede ser un compuesto de fórmula (IIa) como se muestra a continuación:

y sales, solvatos y formas protegidas del mismo.

El compuesto de fórmula (II) puede ser un compuesto de fórmula (IIb) como se muestra a continuación:

y sales, solvatos y formas protegidas del mismo.

Compuestos de polimixina

Los compuestos para su uso en el presente caso se basan en formas modificadas de compuestos conocidos de polimixina, tales como nonapéptido de Polimixina B y nonapéptido de Colistina.

El nonapéptido de polimixina B tiene la siguiente estructura:

HsN-ThrbDab-D

donde se indican las posiciones 2, 4 y 10 (con referencia al sistema de numeración utilizado para el decapéptido de Polimixina B), y los residuos de aminoácidos están en la configuración L-, a menos que se indique lo contrario. Los compuestos de la invención son derivados del nonapéptido de polimixina B, donde (i) el grupo amino N terminal, -NH2, se reemplaza por el grupo -NH-C(O)-CH2CH(3-Cl-Ph)CH2NH como se describe en el presente documento; y (ii) el residuo de aminoácidos en la posición 3 está sustituido con L-Dap,

Métodos de síntesis

La preparación de los compuestos de la invención resultará familiar para los expertos en la técnica, particularmente teniendo conocimiento de los procedimientos descritos en el documento WO 2015/135976 para la preparación de nonapéptidos de polimixina modificados. Los procedimientos descritos en la técnica pueden adaptarse fácilmente para su uso en la preparación de los compuestos del presente caso, teniendo en cuenta los nuevos grupos N-terminales empleados en el presente caso.

Generalmente, un compuesto de la invención se puede preparar acoplando un intermedio de nonapéptido de polimixina adecuadamente protegido con un ácido carboxílico que tiene el grupo Y-aminopropilo sustituido. El producto de esta reacción es típicamente la forma protegida del compuesto de fórmula (I). La eliminación de los grupos protectores se puede llevar a cabo según se desee. Esta es la estrategia general conocida a partir del documento WO 2015/135976.

Un intermedio nonapeptídico protegido adecuadamente puede prepararse de acuerdo con los procedimientos expuestos en el documento Wo 2015/135976. Como se describe en el presente documento, un intermedio nonapeptídico protegido adecuadamente también se puede preparar por síntesis en fase sólida de un nonapéptido lineal, seguido de la escisión de la forma lineal del soporte sólido y después la posterior ciclación de esa forma lineal entre los residuos amino en las posiciones 4 y 10.

Los compuestos de la invención pueden prepararse mediante síntesis peptídica convencional, usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los procedimientos adecuados incluyen la síntesis en fase sólida tal como se describe por de Visseret al, J. Peptide Res,61, 2003, 298-306, Vaaraet al, Antimicrob. Agents and Chemotherapy,52, 2008. 3229-3236, o por Velkovet al. ACS Chem. Biol.9, 2014, 1172. Estos procedimientos incluyen una estrategia de protección adecuada y procedimientos para la etapa de ciclación.

Cuando sea necesario, el compuesto de fórmula (I) se puede purificar al menos parcialmente, por ejemplo, para separar formas diastereoméricas del producto.

Formas protegidas

Los compuestos de fórmula (II), pueden proporcionarse en una forma protegida. En este caso, la funcionalidad reactiva, tal como la funcionalidad amino, puede enmascararse para evitar su reacción durante una etapa de síntesis.

Se proporciona un grupo protector para enmascarar la funcionalidad reactiva, y estos grupos protectores pueden eliminarse en una etapa posterior de la síntesis para revelar la funcionalidad reactiva original.

En una realización, la forma protegida es un compuesto en el que la funcionalidad amino, hidroxilo, tiol y/o carboxilo está protegida (enmascarada) por un grupo protector. En una realización, la forma protegida es un compuesto en el que se protege la funcionalidad de la cadena lateral de los residuos de aminoácidos con el compuesto.

En el compuesto de fórmula (II), los residuos de aminoácidos en las posiciones 5, 8 y 9 son residuos Dab, y la cadena lateral del residuo Dab incluye la funcionalidad amino. La funcionalidad de aminoácidos de cada residuo Dab puede protegerse con un grupo protector de amino, como se describe en el presente documento. De forma similar, el residuo de aminoácidos en la posición 3 es Dap, y la cadena lateral de este residuo de aminoácidos incluye la funcionalidad amino.

El grupo N-terminal es un grupo Y-aminopropilo sustituido. La funcionalidad amino puede protegerse con grupos protectores de amino, como se describe en el presente documento.

Los grupos protectores, tales como aquellos para residuos de aminoácidos, se conocen bien y están bien descritos en la técnica.

Los aminoácidos que tienen protección de grupo lateral, opcionalmente junto con la protección de amino y carboxi, están disponibles en el mercado. Por lo tanto, un compuesto de polimixina protegido puede prepararse a partir de materiales de partida de aminoácidos apropiadamente protegidos.

Velkovet al.describen la preparación por etapas de compuestos de polimixina en la fase sólida utilizando un aminoácido adecuadamente protegido. Se divulga el uso de formas protegidas de treonina y Dab (véase la Información complementaria).

Cuando se usa un grupo protector, puede eliminarse en condiciones que no alteran sustancialmente la estructura del núcleo de polimixina, por ejemplo, condiciones que no alteran la estereoquímica de los residuos de aminoácidos. En una realización, los grupos protectores son lábiles a los ácidos, lábiles a las bases, o se pueden eliminar en condiciones reductoras.

Los grupos protectores ejemplares para la funcionalidad amino incluyen Boc (tere-butoxicabonilo), Bn (bencilo, Bzl), CbZ (benciloxicarbonilo, Z), 2-Cl-Z (2-cloro), ivDde (1-[4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno]-3-metilbutilo), Fmoc (fluorenilmetiloxicarbonilo), HSO3-Fmoc (Fmoc sulfonilado, tal como 2-sulfo-Fmoc, como se describe, por ejemplo, en Schechteret al, J.Med Chem2002,45(19) 4264), Dde (1-[4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno]etilo), Mmt (4-metoxitritilo), Mtt (4-metiltritilo), Nvoc (6-nitroveratroiloxicarbonilo), Tfa (trifluroacetilo), y Alloc (aliloxicarbonilo).

Los grupos protectores ejemplares para la funcionalidad nitrógeno aromático incluye Boc, Mtt, Trt y Dnp (dinitrofenilo). En una realización, el grupo protector para la funcionalidad amino se selecciona de Boc, ivDde, CbZ, Bn y Fmoc y HSO3-Fmoc.

En una realización, el grupo protector para la funcionalidad amino es Boc, ivDde, Fmoc o CbZ, tal como Boc, ivDde o Cbz.

La protección Boc puede proporcionarse para la funcionalidad amino presente en las cadenas laterales de los residuos de aminoácidos presentes en las posiciones 5, 8 y 9, y opcionalmente la posición 3.

Los grupos protectores ejemplares para la funcionalidad hidroxilo incluyen Trt (tritilo), Bn (bencilo), y tBu (tere-butilo). En una realización, el grupo protector para la funcionalidad hidroxilo es tBu.

Los grupos protectores ejemplares adicionales incluyen grupos protectores silil éter, tales como TMS, TES, TBS, TIPS, TBDMS, y Tb DPS. Dichos grupos protectores pueden eliminarse con TBAF, por ejemplo.

Los grupos protectores ejemplares para la funcionalidad carboxilo Bn (bencilo, Bz), tBu (tere-butilo), TMSET (trimetilsililetilo) y Dmab ({1-[4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno]-3-metilbutil}amino bencilo).

Los grupos protectores ejemplares para la funcionalidad nitrógeno aromático, por ejemplo, cuando dicha funcionalidad está presente en el grupo -Ar, incluye Boc, Mtt, Trt y Dnp (dinitrofenilo).

En algunas realizaciones, solamente algunos tipos de funcionalidad están protegidos. Por ejemplo, solamente pueden protegerse grupos amino, tales como grupos amino en la cadena lateral de un residuo de aminoácidos.

En una realización, los grupos amino y los grupos hidroxilo están protegidos.

LogP

Un compuesto de fórmula (II), puede tener un coeficiente de partición, tal como se expresa como un valor LogP, dentro de ciertos límites. El coeficiente de partición puede proporcionar una indicación de la lipofilicidad del compuesto.

Los inventores han establecido que los compuestos que tienen una lipofilicidad más alta tienen una peor citotoxicidad. Los compuestos de la invención tienen típicamente valores LogP que están asociados con una menor citotoxicidad, tales como los valores LogP descritos a continuación.

Un valor LogP para un compuesto se puede determinar experimentalmente (por ejemplo, mediante el reparto del compuesto entre octanol y agua), o se puede predecir utilizando procedimientos computacionales estándar.

Por ejemplo, una referencia a LogP puede ser una referencia a ALogP, que puede determinarse utilizando los procedimientos descritos por Ghoseet al. J. Phys. Chem. A,1998, 102, 3762-3772. Por lo tanto, ALogP es la estimación de contribución de grupos de Ghose/Crippen para LogP.

En una realización, un compuesto tiene un valor LogP, tal como un valor ALogP, de al menos -6,5, al menos -6,6, al menos -6,7, al menos -6,8, al menos -6,9, al menos -7,0, al menos -7,5, o al menos -8,0.

En una realización, un compuesto tiene un valor LogP, tal como un valor ALogP, de como máximo -6,4, como máximo -6,3, como máximo -6,2, como máximo -6,1, como máximo -6,0, como máximo -5,9, o como máximo -5,8.

En una realización, un compuesto tiene un valor LogP dentro de un rango que tiene límites superior e inferior seleccionados apropiadamente de los límites dados anteriormente, por ejemplo dentro del intervalo de -5,8 a -8,0, tal como de -6,0 a -6,7, tal como de -6,3 a -6,7. Estos rangos pueden seleccionarse cuando el grupo -R2 es alquilo sin sustituir.

En otra realización, el compuesto tiene un valor LogP dentro del intervalo -6,7 a -7,4. Este intervalo puede seleccionarse cuando el grupo -R2 es alquilo sustituido con un grupo hidroxilo.

Se ha encontrado que los compuestos que tienen valores LogP, tales como los valores ALogP, dentro de los límites analizados anteriormente, tienen una excelente actividad contra cepas bacterianas tanto susceptibles a polimixina como resistentes a polimixina-. Los compuestos pueden tener una actividad antimicrobiana comparable con respecto a la polimixina B. Ventajosamente, dichos compuestos también pueden tener una citotoxicidad reducida en comparación con la polimixina B.

Los presentes inventores han encontrado que un compuesto que tiene valores óptimos de LogP puede obtenerse seleccionando el grupo -R15 del presente caso, junto con opciones apropiadas de residuos de aminoácidos en la posición 6 y/o 7 (tal como con la selección apropiada de -R1 y/o -R2).

Agente activo

Los compuestos de fórmula (II) pueden usarse cada uno junto con un segundo agente activo. Los inventores han encontrado que dichas combinaciones tienen mayor actividad biológica que la que se esperaría de la actividad individual de ambos compuestos. Los compuestos de fórmula (II) se pueden usar para potenciar la actividad del segundo agente activo. En particular, los compuestos de fórmula (II) se pueden usar junto con un segundo agente activo para mejorar la actividad antimicrobiana de ese agente, por ejemplo, contra bacterias gramnegativas.

Sin desear quedar ligando por la teoría, se cree que los compuestos de fórmula (II) actúan sobre la membrana externa de una célula, por ejemplo, una célula bacteriana gramnegativa, para facilitar la captación del segundo agente activo en esa célula. Por lo tanto, los agentes que de otra manera son incapaces o malos para cruzar la membrana externa pueden captarse hacia una célula diana por la acción de los compuestos de fórmula (II).

En una realización, la combinación de un compuesto de fórmula (II) con el segundo agente activo es activa contra bacterias gramnegativas. En este caso, no es esencial que individualmente el compuesto de fórmula (II) o el segundo agente activo tengan actividad contra las bacterias gramnegativas.

En una realización, el segundo agente activo es un agente que tiene un valor de MIC medido contra un microorganismo particular, tal como una bacteria, que es menor de 10, menor de 5, o menor de 1 microgramos/ml. El microorganismo puede ser una bacteria gramnegativa, tal como una bacteria gramnegativa seleccionada del grupo que consiste enE. coli, S. entérica, K. pneumoniae, K. oxitoca; E. cloacae, E. aerogenes, E. agglomerans, A. calcoaceticus, A. baumannii;Pseudomonas aeruginosa,yStenotrophomonas maltophila.

Los ejemplos de segundos agentes activos que tienen actividad contra bacterias gramnegativas incluyen beta-lactamas, tetraciclinas, aminoglucósidos y quinolonas.

En una realización, el segundo agente activo es un agente que tiene un valor de MIC medido contra un microorganismo particular, tal como una bacteria gramnegativa, que es mayor de 4, mayor de 8, mayor de 16 o mayor de 32 microgramos/ml. En esta realización, el segundo agente activo puede ser activo contra bacterias grampositivas. Por ejemplo, el segundo agente activo es un agente que tiene un valor de MIC medido contra una bacteria grampositiva particular que es menor de 10, menor de 5, o menor de 1 microgramos/ml. En este caso, el compuesto de fórmula (II) actúa para facilitar la captación del segundo agente activo en la célula bacteriana gramnegativa. Por lo tanto, el segundo agente activo puede actuar sobre un objetivo dentro de la célula bacteriana gramnegativa, cuyo objetivo puede ser el mismo que el objetivo del segundo agente activo en una célula bacteriana grampositiva.

Las bacterias grampositivas pueden seleccionarse del grupo que consiste en bacteriasStaphylococcusyStreptococcus,tales como S.aureus(incluyendo MRSA), S.epidermis, E. faecalis,yE. faecium.

Los ejemplos de segundos agentes activos que tienen actividad contra las bacterias grampositivas (por ejemplo, a los valores de MIC indicados anteriormente), y la actividad moderada contra las bacterias gramnegativas, incluyen rifampicina, novobiocina, macrólidos, pleuromutilinas. En una realización, un compuesto que tiene actividad moderada contra bacterias gramnegativas puede tener un valor de MIC medido contra una bacteria gramnegativa que es menor de 32, menor de 64, o menor de 128 microgramos/ml.

También son adecuados para su uso agentes que tienen actividad contra bacterias grampositivas y que están esencialmente inactivos contra bacterias gramnegativas. Los ejemplos incluyen ácido fusídico, oxazolidininas (por ejemplo, linezolid), glucopéptidos (por ejemplo, vancomicina), daptomicina y lantibióticos. En una realización, un compuesto que esencialmente no tiene actividad contra bacterias gramnegativas puede tener un valor de MIC medido contra una bacteria gramnegativa que es mayor de 32, mayor de 64, mayor de 128, mayor de 256 microgramos/ml.

En circunstancias normales, dichos agentes no son necesariamente adecuados para su uso contra bacterias gramnegativas debido a su capacidad relativamente mala para cruzar la membrana externa de una célula bacteriana gramnegativa. Como se ha explicado anteriormente, cuando se usan junto con un compuesto de fórmula (II), dichos agentes son adecuados para su uso.

En una realización, el agente activo puede seleccionarse del grupo que consiste en rifampicina, rifabutina, rifalazilo, rifapentina, rifaximin, aztreonam, oxacilina, novobiocina, ácido fusídico, azitromicina, ciprofloxacina, meropenem, tigeciclina, minociclina, eritromicina, claritromicina y mupirocina, y sales, solvatos y formas de profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Los presentes inventores han encontrado que los compuestos de polimixina de fórmula (II) pueden usarse junto con ciertos compuestos de la familia de la rifamicina para tratar infecciones microbianas. La familia de la rifamicina incluye aislamientos de rifamicina A, B, C, D, E, S y SV, y versiones derivadas sintéticamente de estos compuestos, tal como rifampicina, rifabutina, rifalazilo, rifapentina y rifaximina, y sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En una realización, el agente activo es rifampicina y sales, solvatos y formas de profármacos farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Sales, solvatos y otras formas

Los ejemplos de sales del compuesto de fórmula (II) incluyen todas las sales farmacéuticamente aceptables, tales como, sin limitación, sales de adición de ácidos de ácidos minerales fuertes tales como sales HCI y HBr y sales de adición de ácidos orgánicos fuertes tal como una sal de ácido metanosulfónico. Otros ejemplos de sales incluyen sulfatos y acetatos tales como el propio acetato, trifluoroacetato o tricloroacetato.

En una realización, los compuestos de la presente divulgación se proporcionan como una sal de sulfato o una sal de ácido trifluoroacético (TFA). En una realización, los compuestos de la presente divulgación se proporcionan como sales de acetato, tales como acetato.

Un compuesto de fórmula (II) también se puede formular como un profármaco. Los profármacos pueden incluir un compuesto antibacteriano descrito en el presente documento en el que uno o más grupos amino están protegidos con un grupo que puede escindirsein vivo,para liberar el compuesto biológicamente activo. En una realización, el profármaco es un "profármaco de amina". Los ejemplos de profármacos de amina incluyen sulfometilo, como se describe en, por ejemplo, Bergenet al, Antimicrob. Agents and Chemotherapy,2006, 50,1953 o HSO3-FMOC, como se describe, por ejemplo, en Schechteret al, J.Med Chem2002,45(19) 4264, y sales de los mismos. Se proporcionan ejemplos adicionales de profármacos amina por Krise y Oliyai enBiotechnology: Pharmaceutical Aspects,2007,5(2),101-131.

En una realización, un compuesto de fórmula (II) se proporciona como un profármaco.

Una referencia a un compuesto de fórmula (II), o cualquier otro compuesto descrito en el presente documento, es también una referencia a un solvato de ese compuesto. Los ejemplos de solvatos incluyen hidratos.

Un compuesto de fórmula (II), o cualquier otro compuesto descrito en el presente documento, incluye un compuesto donde un átomo se reemplaza por un isótopo de origen natural o sintético. En una realización, el isótopo es un isótopo estable. Por lo tanto, un compuesto descrito aquí incluye, por ejemplo, compuestos que contienen deuterio y similares. Por ejemplo, H puede estar en cualquier forma isotópica, incluyendo 1H, 2H (D) y 3H (T); C puede estar en cualquier forma isotópica, incluyendo 12C, 13C y 14C; O puede estar en cualquier forma isotópica, incluyendo 16O y 18O; y similares.

Ciertos compuestos de fórmula (II), o cualquier otro compuesto descrito en el presente documento, pueden existir en una o más formas geométricas particulares, ópticas, enantioméricas, diasterioméricas, epiméricas, atrópicas, estereoisoméricas, tautoméricas, conformacionales o anoméricas, incluyendo, pero sin limitación, formas cis y trans; formas E y Z; formas c, t- y r-; formas endo y exo; formas R, S y meso; formas D y L; formas d y l; formas (+) y (-); ceto-, enol y enolato; formas sin y anti; formas sinclinal y anticlinal; formas a y p; formas axiales y ecuatoriales; formas barco, silla, torsión, envolvente-, y semisilla; y combinaciones de los mismos, en lo sucesivo en el presente documento denominadas de forma colectiva como “isómeros” (o “formas isoméricas”).

Cabe destacar que, excepto como se analiza a continuación para formas tautómeras, específicamente excluidas del término "isómeros", como se utiliza en el presente documento, son isómeros estructurales (o constitucionales) (es decir, isómeros que difieren en las conexiones entre átomos en lugar de simplemente por la posición de los átomos en el espacio). Por ejemplo, una referencia a un grupo metoxi, -OCH3, no debe interpretarse como una referencia a su isómero estructural, un grupo hidroximetilo, -CH2OH. De forma similar, una referencia al orto-clorofenilo no debe interpretarse como una referencia a su isómero estructural, el metaclorofenilo. Sin embargo, una referencia a una clase de estructuras bien puede incluir formas estructuralmente isoméricas que pertenecen a esa clase (por ejemplo, alquilo C1-6 incluye n-propilo e iso-propilo; butilo incluye n-, iso-, sec-, y ferc-butilo; metoxifenilo incluye orto-, meta- y para-metoxifenilo).

A menos que se especifique de otro modo, una referencia a un compuesto particular incluye todas las formas isoméricas, incluyendo mezclas (por ejemplo, mezclas racémicas) de las mismas. Los procedimientos de preparación (por ejemplo, síntesis asimétrica) y separación (por ejemplo, cristalización fraccionada y medios cromatográficos) de dichas formas isoméricas se conocen en la técnica o se obtienen fácilmente adaptando los procedimientos enseñados en el presente documento o procedimientos conocidos, de una manera conocida.

Un aspecto de la presente invención se refiere a compuestos en forma sustancialmente purificada y/o en una forma sustancialmente libre de contaminantes.

En una realización, la forma sustancialmente purificada es de al menos el 50 % en peso, por ejemplo, al menos el 60 % en peso, por ejemplo, al menos el 70 % en peso, por ejemplo, al menos el 80 % en peso, por ejemplo, al menos el 90 % en peso, por ejemplo, al menos el 95 % en peso, por ejemplo, al menos el 97 % en peso, por ejemplo, al menos el 98 % en peso, por ejemplo, al menos el 99 % en peso.

A menos que se especifique de otro modo, la forma sustancialmente purificada se refiere al compuesto en cualquier forma estereoisomérica o enantiomérica. Por ejemplo, en una realización, la forma sustancialmente purificada se refiere a una mezcla de estereoisómeros, es decir, purificara con respecto a otros compuestos. En una realización, la forma sustancialmente purificada se refiere a un estereoisómero, por ejemplo, estereoisómero ópticamente puro. En una realización, la forma sustancialmente purificada se refiere a una mezcla de enantiómeros. En una realización, la forma sustancialmente purificada se refiere a una mezcla de enantiómeros equimolar (es decir, una mezcla racémica, un racemato). En una realización, la forma sustancialmente purificada se refiere a un enantiómero, por ejemplo, un enantiómero ópticamente puro.

En una realización, los contaminantes representan no más del 50 % en peso, por ejemplo, no más del 40% en peso, por ejemplo, no más del 30% en peso, por ejemplo, no más del 20% en peso, por ejemplo, no más del 10% en peso, por ejemplo, no más del 5% en peso, por ejemplo, no más del 3% en peso, por ejemplo, no más del 2% en peso, por ejemplo, no más del 1% en peso.

A menos que se especifique de otro modo, los contaminantes se refieren a otros compuestos, es decir, distintos de los estereoisómeros o enantiómeros. En una realización, los contaminantes se refieren a otros compuestos y otros estereoisómeros. En una realización, los contaminantes se refieren a otros compuestos y al otro enantiómero.

En una realización, la forma sustancialmente purificada es al menos el 60 % ópticamente pura (es decir, el 60 % del compuesto, sobre una base molar, es el estereoisómero o enantiómero deseado, y el 40 % es el estereoisómero o enantiómero no deseado), por ejemplo, al menos el 70 % ópticamente pura, por ejemplo, al menos el 80 % ópticamente pura, por ejemplo, al menos el 90 % ópticamente pura, por ejemplo, al menos el 95 % ópticamente pura, por ejemplo, al menos el 97 % ópticamente pura, por ejemplo, al menos el 98 % ópticamente pura, por ejemplo, al menos el 99 % ópticamente pura.

Métodos de tratamiento

Los compuestos de fórmula (II), o formulaciones farmacéuticas que contienen estos compuestos, son adecuados para su uso en procedimientos de tratamiento y profilaxis. Los compuestos pueden administrarse a un sujeto que lo necesite. Los compuestos son adecuados para su uso junto con un agente activo ("un segundo agente activo"), por ejemplo, un segundo agente activo que es un agente antimicrobiano.

Los compuestos de fórmula (II) son para su uso en un procedimiento de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. En algunos aspectos de la invención, un compuesto de fórmula (II) puede administrarse a un sujeto mamífero, tal como un ser humano, para tratar una infección microbiana.

El término "infección microbiana" se refiere a la invasión del animal huésped por microbios patógenos. Esto incluye el crecimiento excesivo de microbios que normalmente están presentes en o sobre el cuerpo de un animal. Más generalmente, una infección microbiana puede ser cualquier situación en la que la presencia de una o más poblaciones microbianas dañe a un animal huésped. Por lo tanto, un animal "padece" una infección microbiana cuando un número excesivo de una población microbiana está presente en o sobre el cuerpo de un animal, o cuando la presencia de una población o poblaciones microbianas daña las células u otro tejido de un animal.

Los compuestos pueden usarse para tratar un sujeto que tiene una infección microbiana, o está en riesgo de infección por un microorganismo, tal como una bacteria.

La infección microbiana puede ser una infección bacteriana, como una infección bacteriana gramnegativa.

Los ejemplos de bacteria gramnegativa incluyen, pero sin limitación,Escherichiaspp.,Klebsiellaspp.,Enterobacterspp.,Salmonellaspp.,Citrobacterspp., y otras Enterobacteriaceae,Pseudomonasspp.,Acinetobacterspp.,Stenotrophomonas,yLegionellay numerosas otras.

Los bacilos gramnegativos médicamente relevantes incluyen una multitud de especies. Algunos de ellos causan principalmente problemas respiratorios(Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa),principalmente problemas urinarios(Escherichia coli, Enterobacter cloacae),y principalmente problemas gastrointestinales(Salmonella enterica).

Las bacterias gramnegativas asociadas con infecciones nosocomiales incluyenAcinetobacter baumannii,que causa bacteriemia, meningitis secundaria y neumonía asociada a ventilador en unidades de cuidados intensivos de establecimientos hospitalarios.

En una realización la especie bacteriana gramnegativa se selecciona del grupo que consiste enE. coli, S. enterica, K. pneumoniae, K. oxitoca;E. cloacae, E. aerogenes, E. agglomerans,A. calcoaceticus, A. baumannii;Pseudomonas aeruginosa,yStenotrophomonas maltophila.

En una realización la especie bacteriana gramnegativa se selecciona del grupo que consiste enE. coli, K. pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa,yA. baumannii.

Los compuestos de fórmula (II), o composiciones que comprenden los mismos, son útiles para el tratamiento de infecciones cutáneas y tejidos blandos, infección gastrointestinal, infección del tracto urinario, neumonía, septicemia, infecciones intraabdominales e infecciones obstétricas/ginecológicas. Las infecciones pueden ser infecciones bacterianas gramnegativas.

Los compuestos de fórmula (II), o composiciones que comprenden los mismos, son útiles para el tratamiento de infecciones porPseudomonas,incluyendo infección porP. aeruginosa,por ejemplo, infecciones cutáneas y de tejido blando, infección gastrointestinal, infección del tracto urinario, neumonía y sepsis.

Los compuestos de fórmula (II), o composiciones que comprenden los mismos, son útiles para el tratamiento de infecciones porAcinetobacter,incluyendo infección porA. baumanii,para neumonía, infecciones de heridas, infección del tracto urinario y sepsis.

Los compuestos de fórmula (II), o composiciones que comprenden los mismos, son útiles para el tratamiento de infecciones porKlebsiella,incluyendo infecciones porK. pneumoniae,para neumonía, infección intraabdominal, infección del tracto urinario, meningitis y sepsis.

Los compuestos de fórmula (II), o composiciones que comprenden los mismos, son útiles para el tratamiento de infección porE. coli,incluyendo infecciones porE. coli,para bacteriemia, colecistitis, colangitis, infección intraabdominal, infección del tracto urinario, meningitis neonatal y neumonía.

Los compuestos de fórmula (II), o composiciones que comprenden los mismos, pueden usarse junto con un agente activo en los procedimientos de tratamiento.

El agente activo puede ser un agente que tenga actividad contra el microorganismo. El agente activo puede ser activo contra bacterias gramnegativas. El agente activo puede ser activo contra un microorganismo seleccionado de la lista dada anteriormente.

En una realización, el segundo agente activo tiene un valor de MIC de 10 microgramos/ml o menos contra un microorganismo tal comoE. coli,en ausencia del compuesto de fórmula (II). El microorganismo puede ser un microorganismo seleccionado del grupo anterior.

Los compuestos específicos para su uso como segundos agentes activos se describen en el presente documento e incluyen:

rifampicina, rifabutina, rifalazilo, rifapentina, y rifaximin;

oxacilina, meticilina, ampicilina, cloxacilina, carbenicilina, piperacilina, tricarcilina, flucloxacilina, y nafcilina;

azitromicina, claritromicina, eritromicina, telitromicina, cetromicina, y solitromicina;

aztreonam y BAL30072;

meropenem, doripenem, imipenem, ertapenem, biapenem, tomopenem, y panipenem;

tigeciclina, omadaciclina, eravaciclina, doxiciclina, y minociclina;

ciprofloxacina, levofloxacina, moxifloxacino, y delafloxacino;

ácido fusídico;

novobiocina;

teicoplanina, telavancina, dalbavancina, y oritavancina,

y sales farmacéuticamente aceptables y solvatos de los mismos;

En una realización, los compuestos específicos para su uso como segundos agentes activos se describen en el presente documento e incluyen rifampicina, rifabutina, rifalazilo, rifapentina, rifaximin, aztreonam, oxacilina, novobiocina, ácido fusídico, azitromicina, ciprofloxacina, meropenem, tigeciclina, eritromicina, claritromicina y mupirocina, y sales y solvatos farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En un aspecto alternativo, los compuestos de fórmula (II) son adecuados para su uso en el tratamiento de infecciones fúngicas, por ejemplo, en combinación junto con un agente antifúngico. El agente antifúngico puede seleccionarse de un polieno antifúngico, por ejemplo, anfotericina B, un imidazol, triazol, o tiazol antifúngico, por ejemplo, miconazol, fluconazol o abafungina, una alilamina, una equinocandina, u otro agente, por ejemplo ciclopirox.

Tratamiento

El término "tratamiento", cuando se usa en el contexto del tratamiento de una afección, se refiere generalmente al tratamiento y terapia, ya sea de un ser humano o un animal (por ejemplo, en aplicaciones veterinarias), en el que se consigue algún efecto terapéutico deseado, por ejemplo, la inhibición del progreso de la afección, e incluye una reducción en la velocidad de progreso, un alto en la velocidad de progreso, el alivio de los síntomas de la afección, la mejora de la afección y la cura de la afección. También se incluye el tratamiento como medida profiláctica (es decir, profilaxis). Por ejemplo, el uso con pacientes que aún no han desarrollado la afección, pero que están en riesgo de desarrollarla, está incluido en el término "tratamiento".

El término "cantidad terapéuticamente eficaz", como se utiliza en el presente documento, se refiere a esa cantidad de un compuesto, o un material, composición o forma de dosificación que comprende un compuesto, que es eficaz para producir algún efecto terapéutico deseado, proporcionado con una relación beneficio/riesgo razonable, cuando se administra de acuerdo con un régimen de tratamiento deseado.

El término "tratamiento" incluye tratamientos y terapias de combinación, como se describe en el presente documento, en las que se combinan dos o más tratamientos o terapias, por ejemplo, de forma secuencial o simultánea.

Terapia de combinación

Un compuesto de fórmula (II) se puede administrar junto con un agente activo. La administración puede ser simultánea, por separado o secuencial.

Los procedimientos y la forma de administración dependerán de la farmacocinética del compuesto de fórmula (II) y el segundo agente activo.

Por administración "simultánea", se entiende que un compuesto de fórmula (II) y un segundo agente activo se administran a un sujeto en una dosis única por la misma vía de administración.

Por administración "separada", se entiende que un compuesto de fórmula (II) y un segundo agente activo se administran a un sujeto por dos vías de administración diferentes que ocurren al mismo tiempo. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando un agente se administra por infusión y el otro se administra por vía oral durante el transcurso de la infusión.

Por "secuencial" se entiende que los dos agentes se administran en diferentes puntos en el tiempo, siempre que la actividad del primer agente administrado esté presente y en curso en el sujeto en el momento en que se administra el segundo agente activo.

Generalmente, se producirá una dosis secuencial de tal forma que el segundo de los dos agentes se administre en 48 horas, tal como en 24 horas, tal como en 12, 6, 4, 2 o 1 horas del primer agente. Como alternativa, el agente activo se puede administrar primero, seguido del compuesto de fórmula (II).

En última instancia, el orden y el momento de la administración del compuesto y el segundo agente activo en el tratamiento de combinación dependerán de las propiedades farmacocinéticas de cada uno.

La cantidad del compuesto de fórmula (II) que se administrará a un sujeto dependerá en última instancia de la naturaleza del sujeto y de la enfermedad a tratar. Asimismo, la cantidad de agente activo que se administrará a un sujeto dependerá en última instancia de la naturaleza del sujeto y de la enfermedad a tratar.

Formulaciones

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula (II) junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender adicionalmente un segundo agente activo. En una realización alternativa, cuando se proporciona un segundo agente activo para su uso en terapia, el segundo agente activo puede formularse por separado a partir del compuesto de fórmula (II). Por lo tanto, los comentarios a continuación hechos en relación con el compuesto de fórmula (II) también pueden aplicarse al segundo agente activo, según se formuló por separado.

Si bien es posible que el compuesto de fórmula (II) se administre solo o junto con el segundo agente activo, es deseable presentarlo como una formulación farmacéutica (por ejemplo, composición, preparación, medicamento) que comprenda al menos un compuesto de fórmula (II), como se describe en el presente documento, junto con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, vehículos farmacéuticamente aceptables, diluyentes, excipientes, adyuvantes, cargas, tampones, conservantes, antioxidantes, lubricantes, estabilizantes, solubilizantes, tensioactivos (por ejemplo, agentes humectantes), agentes enmascarantes, agentes colorantes, agentes saporíferos y agentes edulcorantes farmacéuticamente aceptables. La formulación puede comprender además otros agentes activos, por ejemplo, otros agentes terapéuticos o profilácticos.

Por lo tanto, la presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas, como se ha definido anteriormente. También se describe en el presente documento procedimientos para preparar una composición farmacéutica que comprende mezclar al menos un compuesto de fórmula (II), como se describe en el presente documento, junto con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, vehículos, diluyentes, excipientes, etc. Si se formulan como unidades discretas (por ejemplo, comprimidos, etc.), cada unidad contiene una cantidad predeterminada (dosificación) del compuesto. La composición opcionalmente comprende además el segundo agente activo en una cantidad predeterminada.

La expresión "farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en el presente documento, se refiere a compuestos, ingredientes, materiales, composiciones, formas farmacéuticas, etc., que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos del sujeto en cuestión (por ejemplo, un ser humano) sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acordes con una relación beneficio/riesgo razonable. Cada vehículo, un diluyente, excipiente, etc. también debe ser «aceptable» en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación.

Los vehículos, diluyentes, excipientes, etc. adecuados se pueden encontrar en textos farmacéuticos convencionales, por ejemplo, “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 18a edición, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990; y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5a edición, 2005.

Las formulaciones se pueden preparar mediante cualquier procedimiento bien conocido en la técnica de la farmacia. Dichos procedimientos incluyen la etapa de asociar el compuesto de fórmula (II) con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando de manera uniforme e íntima el principio con vehículos (por ejemplo, vehículos líquidos, vehículo sólido finamente dividido, etc.), y luego dando forma al producto, en caso de necesitarse.

La formulación puede prepararse para proporcionar una liberación rápida o lenta; liberación inmediata, retrasada, temporalizada o sostenida; o una combinación de los mismos.

Las formulaciones pueden estar adecuadamente en forma de líquidos, soluciones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), suspensiones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite en agua, agua en aceite), elixires, jarabes, electuarios, enjuagues bucales, gotas, comprimidos (incluyendo, por ejemplo, comprimidos revestidos), gránulos, polvos, pastillas para chupar, pastillas, cápsulas (incluyendo, por ejemplo, cápsulas duras y blandas de gelatina), sellos, píldoras, ampollas, bolos, supositorios, pesarios, tinturas, geles, pastas, pomadas, cremas, lociones, aceites, espumas, pulverizadores, brumas o aerosoles.

Las formulaciones pueden proporcionarse adecuadamente como un parche, emplasto adhesivo, vendaje, apósito, o similares, que está impregnado con uno o más compuestos, y opcionalmente uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo, por ejemplo, mejoradores de la penetración, la permeación y la absorción.

Las formulaciones también pueden proporcionarse adecuadamente en forma de un depósito o reservorio.

El compuesto puede disolverse, suspenderse o mezclarse con uno o más ingredientes farmacéuticamente aceptables. El compuesto puede presentarse en un liposoma u otra micropartícula que esté diseñada para dirigir el compuesto, por ejemplo, a componentes sanguíneos o a uno o más órganos. Cuando se usa un liposoma, se observa que el liposoma puede contener tanto el compuesto de fórmula (II), como un segundo agente activo.

Las formulaciones adecuadas para la administración oral (por ejemplo, por ingestión) incluyen líquidos, soluciones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), suspensiones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite en agua, agua en aceite), elixires, jarabes, electuarios, comprimidos, gránulos, polvos, cápsulas, sellos, píldoras, ampollas, bolos.

Las formulaciones adecuadas para la administración bucal incluyen enjuagues bucales, pastillas para chupar, pastillas, así como parches, emplastos adhesivos, depósitos y reservorios. Las pastillas para chupar típicamente comprenden el compuesto en una base con sabor, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto. Las pastillas comprenden típicamente el compuesto en una matriz inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia. Los enjuagues bucales comprenden típicamente el compuesto en un vehículo líquido adecuado.

Las formulaciones adecuadas para la administración sublingual incluyen comprimidos, pastillas para chupar, pastillas, cápsulas y píldoras.

Las formulaciones adecuadas para la administración transmucosa oral incluyen líquidos, soluciones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), suspensiones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite en agua, agua en aceite), enjuagues bucales, pastillas para chupar, pastillas, así como parches, emplastos adhesivos, depósitos y reservorios.

Las formulaciones adecuadas para la administración transmucosa no oral incluyen líquidos, soluciones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), suspensiones (por ejemplo, acuosas, no acuosas), emulsiones (por ejemplo, aceite en agua, agua en aceite), supositorios, pesarios, geles, pastas, pomadas, cremas, lociones, aceites, así como parches, emplastos adhesivos, depósitos y reservorios.

Las formulaciones adecuadas para la administración transdérmica incluyen geles, pastas, pomadas, cremas, lociones y aceites, así como parches, emplastos adhesivos, vendajes, aderezos, depósitos y reservorios.

Los comprimidos pueden fabricarse por medios convencionales, por ejemplo, compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos de compresión pueden prepararse prensando en una máquina adecuada el compuesto en forma fluida como polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con uno o más aglutinantes (por ejemplo, povidona, gelatina, goma arábiga, sorbitol, tragacanto, hidroxipropilmetilcelulosa); cargas o diluyentes (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina, fosfato de hidrógeno y calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice); desintegrantes (por ejemplo, glicolato sódico de almidón, povidona reticulada, carboximetilcelulosa sódica reticulada); agentes de superficie activa o dispersantes o humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio); conservantes (por ejemplo,, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, ácido sórbico); aromas, agentes potenciadores del sabor, y edulcorantes. Los comprimidos moldeados pueden fabricarse por moldeo en una máquina adecuada de una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos se pueden revestir o marcar opcionalmente y se pueden formular para proporcionar una liberación lenta o controlada del compuesto en el mismo usando, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar el perfil de liberación deseado. Los comprimidos pueden proporcionarse opcionalmente con un revestimiento, por ejemplo, para afectar a la liberación, por ejemplo, un revestimiento entérico, para proporcionar una liberación en partes del intestino distintas del estómago.

Las pomadas se preparan típicamente a partir del compuesto y una base de pomada parafínica o miscible en agua.

Las cremas se preparan típicamente a partir del compuesto y una base de crema de aceite en agua. Si se desea, la fase acuosa de la base de crema puede incluir, por ejemplo, al menos aproximadamente el 30 % p/p de un alcohol polihídrico, es decir, un alcohol que tiene dos o más grupos hidroxilo tal como propilenglicol, butano-1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol y polietilenglicol, y mezclas de los mismos. Las formulaciones tópicas pueden incluir, a ser posible, un compuesto que potencie la absorción o la penetración del compuesto a través de la piel u otras zonas afectadas. Los ejemplos de dichos potenciadores de la penetración dérmica incluyen dimetilsulfóxido y análogos relacionados.

Las emulsiones se preparan típicamente a partir del compuesto y una fase oleosa, que puede comprender opcionalmente simplemente un emulsionante (también conocido como un agente emulsionante), o puede comprender una mezcla de al menos un emulsionante con una grasa o un aceite o con una grasa y un aceite. Un emulsionante hidrófilo puede incluirse junto con un emulsionante lipófilo que actúa como estabilizante. También es posible incluir tanto un aceite como una grasa. Conjuntamente, el emulsionante (o emulsionantes) con o sin el estabilizador (o estabilizadores) constituyen la denominada cera emulsionante y la cera junto con el aceite y/o la grasa constituyen la denominada base de pomada emulsionante que forma la fase oleosa dispersa de las formulaciones de crema.

Los emulgentes y estabilizantes de emulsión adecuados incluyen Tween 60, Span 80, alcohol cetoestearílico, alcohol miristílico, monostearato de glicerilo y lauril sulfato sódico. La elección de los aceites o grasas adecuados para la formulación es a base de lograr las propiedades cosméticas deseadas, ya que la solubilidad del compuesto en la mayoría de los aceites que probablemente se usarán en formulaciones de emulsión farmacéutica puede ser muy baja. Por lo tanto, la crema debería ser un producto no graso, que no manche y lavable, con la consistencia adecuada para evitar la filtración desde tubos u otros contenedores. Pueden usarse ésteres de alquilo de cadena lineal o ramificada, mono o dibásicos como di-isoadipato, estearato de isocetilo, propilenglicol diéster de ácidos grasos de coco, miristato de isopropilo, oleato de decilo, palmitato de isopropilo, estearato de butilo, palmitato de 2-etilhexilo o una mezcla de ésteres de cadena ramificada conocida como Crodamol CAP. Estos pueden usarse solos o en combinación, dependiendo de las propiedades requeridas. Como alternativa, pueden usarse lípidos de elevado punto de fusión tales como parafina blanca blanda y/o parafina líquida, u otros aceites minerales.

Las formulaciones adecuadas para la administración intranasal, donde el vehículo es un líquido, incluyen, por ejemplo, aerosol nasal, gotas nasales, o mediante la administración de aerosol por nebulizador, incluyen soluciones acuosas o aceitosas del compuesto. Como procedimiento alternativo de administración, se puede usar una administración de polvo seco como alternativa a los aerosoles nebulizados.

Las formulaciones adecuadas para la administración intranasal, donde el vehículo es un sólido, incluyen, por ejemplo, las que se presentan como un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 500 micrómetros que se toma de la manera en que se administra el rapé, es decir, mediante inhalación rápida a través de las fosas nasales a partir de un envase con el polvo sujetado cerca de la nariz.

Las formulaciones adecuadas para la administración pulmonar (por ejemplo, por inhalación o terapia de insuflación) incluyen las que se presentan como un aerosol en aerosol de un paquete presurizado, con el uso de un propulsor adecuado, tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano, dióxido de carbono u otros gases adecuados. Además, o como alternativa, una formulación para administración pulmonar puede formularse para la administración desde un nebulizador o un inhalador de polvo seco. Por ejemplo, la formulación puede estar dotada de vehículos o liposomas para proporcionar un tamaño de partícula adecuado para alcanzar las partes apropiadas del pulmón, para ayudar a la administración de una dosis apropiada para mejorar la retención en el tejido pulmonar.

Las formulaciones adecuadas para administración ocular incluyen gotas oculares en las que el compuesto se disuelve o se suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso para el compuesto.

Las formulaciones adecuadas para administración rectal pueden presentarse como un supositorio con una base adecuada que comprende, por ejemplo, aceites naturales o endurecidos, ceras, grasas, polioles semilíquidos o líquidos, por ejemplo, manteca de cacao o un salicilato; o como solución o suspensión para tratamiento por enema.

Las formulaciones adecuadas para administración vaginal se pueden presentar como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contienen además del compuesto, los vehículos que se conocen en la técnica como apropiados.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral (por ejemplo, por inyección o infusión, por vía intravenosa o subcutánea), incluyen líquidos estériles, acuosos o no acuosos, isotónicos, libres de pirógenos, (por ejemplo, soluciones, suspensiones), en los que el compuesto se disuelve, suspende o proporciona de otro modo (por ejemplo, en un liposoma u otra micropartícula). Dichos líquidos pueden contener adicionalmente otros ingredientes farmacéuticamente aceptables, tales como antioxidantes, tampones, conservantes, estabilizantes, bacteriostáticos, agentes de suspensión, agentes espesantes y solutos que presentan la formulación isotónica con la sangre (u otro fluido corporal relevante) del recipiente deseado. Ejemplos de excipientes incluyen, por ejemplo, agua, alcoholes, azúcares, polioles, glicerol, aceites vegetales y similares. Ejemplos de vehículos isotónicos adecuados para su uso en dichas formulaciones incluyen inyección de cloruro de sodio, solución de Ringer, o inyección de Ringer lactada. Típicamente, la concentración del compuesto en el líquido es de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 500 jg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 1 ng/ml a aproximadamente 100|jg/ml, por ejemplo, de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 10jg/m l, por ejemplo, de aproximadamente 10 ng/ml a aproximadamente 1 jg/ml. Las formulaciones se pueden presentar en recipientes sellados de dosis unitaria o multidosis, por ejemplo, ampollas y viales, y se pueden almacenar en un estado deshidratado por congelación (liofilizado) que requiere solo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Se pueden preparar soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos estériles.

Dosificación

Generalmente, los procedimientos de la invención pueden comprender administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula (II) para proporcionar un efecto antimicrobiano. El compuesto de fórmula (II) se puede administrar en una cantidad suficiente para potenciar la actividad de un segundo agente activo. El segundo agente activo se administra a un sujeto en una cantidad eficaz para proporcionar un efecto antimicrobiano.

Un experto en la técnica apreciará que las dosificaciones apropiadas del compuesto de fórmula (II) o el agente activo, y las composiciones que comprenden el compuesto de fórmula (II) o el agente activo, pueden variar de paciente a paciente. La determinación de la dosificación óptima generalmente implicará el equilibrio del nivel de beneficio terapéutico frente a cualquier riesgo o efectos secundarios perjudiciales. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores que incluyen, pero sin limitación, la actividad del compuesto particular de fórmula (II) o el agente activo, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación, la gravedad de la afección y la especie, el sexo, la edad, el peso, la afección, la salud en general y el historial médico previo del paciente. La cantidad de compuesto de fórmula (II) o el agente activo y la vía de administración serán finalmente a criterio del médico, veterinario, o clínico, aunque se seleccionará generalmente la dosificación para conseguir concentraciones locales en el sitio de acción que consiguen el efecto deseado sin causar efectos secundarios dañinos o perjudiciales considerables.

La administración puede efectuarse en una dosis, continua o intermitentemente (por ejemplo, en dosis divididas a intervalos adecuados) durante el transcurso del tratamiento. Los procedimientos para determinar los medios y dosificaciones de administración más eficaces son bien conocidos para los expertos en la técnica y variarán con la formulación usada para la terapia, la finalidad de la terapia, la célula o células diana a tratar y el sujeto que se va a tratar. Las administraciones únicas o múltiples pueden llevarse a cabo con el nivel de dosis y el patrón a seleccionar por el tratamiento médico, veterinario o clínico.

En general, una dosis adecuada de un compuesto de fórmula (II) o el agente activo está en el intervalo de aproximadamente 10 pg a aproximadamente 250 mg (más típicamente de aproximadamente 100 pg a aproximadamente 25 mg) por kilogramo de peso corporal del sujeto al día. Cuando el compuesto de fórmula (II) o el agente activo es una sal, un éster, una amida, un profármaco, o similares, la cantidad administrada se calcula sobre la base del compuesto precursor y, por lo tanto, el peso real a usar se aumenta proporcionalmente.

Kits

Un aspecto descrito en el presente documento pero que no es parte de la invención se refiere a un kit que comprende (a) un compuesto de fórmula (II), o una composición que comprende un compuesto como se define en una cualquiera de las fórmula (II), por ejemplo, típicamente proporcionado en un contenedor adecuado y/o con un envase adecuado; y (b) instrucciones de uso, por ejemplo, instrucciones escritas sobre cómo administrar el compuesto o la composición.

Las instrucciones escritas también pueden incluir una lista de indicaciones para las cuales el compuesto de fórmula (II) es un tratamiento adecuado.

En una realización, el kit comprende además (c) un segundo agente activo, o una composición que comprende el segundo agente activo. En este caso, las instrucciones escritas también pueden incluir una lista de indicaciones para las cuales el segundo agente activo, junto con el compuesto de fórmula (II), es adecuado para el tratamiento.

Vías de administración

Un compuesto de fórmula (II), un segundo agente activo, o una composición farmacéutica que comprende el compuesto de fórmula (II), o el segundo agente activo pueden administrarse a un sujeto por cualquier vía de administración conveniente, ya sea sistémica/periféricamente o tópicamente (es decir, en el sitio de la acción deseada).

Las vías de administración incluyen, pero sin limitación, oral (por ejemplo, por ingestión); bucal; sublingual; transdérmica (que incluye, por ejemplo, por un parche, escayola, etc.); transmucosal (que incluye, por ejemplo, por un parche, escayola, etc.); intranasal (por ejemplo, por pulverización nasal); ocular (por ejemplo, con gotas para los ojos); pulmonar (por ejemplo, por terapia de inhalación o insuflación usando, por ejemplo, a través de un aerosol, por ejemplo, a través de la boca o la nariz); rectal (por ejemplo, por supositorio o enema); vaginal (por ejemplo, por pesario); parenteral, por ejemplo, por inyección o infusión, incluyendo vía subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intratecal, intraespinal, intracapsular, subcapsular, intraorbital, intraperitoneal, intratraqueal, subcuticular, intraarticular, subaracnoidea e intraesternal; por implante de un depósito o un reservorio, por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular.

El sujeto/paciente

El sujeto/paciente puede ser un cordado, un vertebrado, un mamífero, un mamífero placentario, un marsupial (por ejemplo, canguro, wombat), un roedor (por ejemplo, una cobaya, un hámster, una rata, un ratón), murino (por ejemplo, un ratón), un lagomorfo (por ejemplo, un conejo), aviar (por ejemplo, un pájaro), canino (por ejemplo, un perro), felino (por ejemplo, un gato), equino (por ejemplo, un caballo), porcino (por ejemplo, un cerdo), ovino (por ejemplo, una oveja), bovino (por ejemplo, una vaca), un primate, simio (por ejemplo, un mono o macaco), un mono (por ejemplo, mono tití, babuíno), un macaco (por ejemplo, gorila, un chimpancé, orangután, gibón) o un ser humano. Adicionalmente, el sujeto/paciente puede ser cualquiera de sus formas de desarrollo, por ejemplo, un feto.

En una realización, el sujeto/paciente es un ser humano.

También se prevé que la invención se pueda poner en práctica en un animal no humano que tiene una infección microbiana. Un mamífero no humano puede ser un roedor. Los roedores incluyen ratas, ratones, cobayas, chinchillas y otros roedores pequeños de tamaño similar utilizados en investigaciones de laboratorio.

Otras opciones

Todas y cada una de las combinaciones compatibles de las realizaciones descritas anteriormente se divulgan explícitamente en el presente documento, como si todas y cada una de las combinaciones se citaran individual y explícitamente.

Diversos aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación.

" y/o" cuando se usa en el presente documento debe tomarse como descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin la otra. Por ejemplo, "A y/o B" debe tomarse como una descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B e (iii) A y B, como si cada uno de ellos se expusiera individualmente en el presente documento.

A menos que el contexto indique otra cosa, las descripciones y definiciones de las características expuestas anteriormente no se limitan a ningún aspecto o realización particular de la invención, y se aplican igualmente a todos los aspectos y realizaciones que se describen. Cuando se pueden combinar realizaciones técnicamente apropiadas y, por lo tanto, la divulgación se extiende a todas las permutaciones y combinaciones de las realizaciones se proporcionan en el presente documento.

Ciertos aspectos y realizaciones de la invención se ilustrarán ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras descritas anteriormente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente para ilustrar la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención, como se describe en el presente documento.

Abreviaturas

Abreviatura Significado

PMBN nonapéptido de Polimixina B

PMB Polimixina B

Thr Treonina

Ser Serina

DSer D-serina

Leu Leucina

Ile Isoleucina

Phe Fenilalanina

DPhe D-fenilalanina

Val Valina

Dab Ácido a,Y-diaminobutírico

DIPEA W,W-diisopropiletilamina

HATU<hexafluorofosfato de 2-(7-aza-1H->benzotriazol-1-il)-1,1-3,3-tetrametiluronio

DCM diclorometano

TFA Ácido trifluoroacético

ND No determinado

N/A No aplicable

Abreviatura Significado

DMF N,N-Dimetilformamida

PMBH Heptapéptido de polimixina B (3-10)

PMBD Decapéptido de Polimixina B

Pro Prolina

Dap Ácido a,p-diaminopropiónico

Gly Glicina

NorLeu Norleucina

Ruphos<2-Diciclohexilfosfino-2',6->diisopropoxibifenilo

Xphos<2-Diciclohexilfosfino-2',4',6'->triisopropilbifenilo

SFC Cromatografía de fluidos supercríticos

Fmoc Fluorenilmetiloxicarbonilo

Cbz Benciloxicarbonilo

hexafluorofosfato de O-(1H-6-HCTU clorobenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

Boc terc-Butiloxicarbonilo

PyBOP<hexafluorofosfato de (benzotriazol-1->iloxi)tripirrolidinofosfonio

NMM N-Metil morfolina

THF Tetrahidrofurano

ivDde<1-(4,4-Dimetil -2,6-dioxociclohex-1->ilideno)-3-metilbutilo

DPPA Difenilfosforil azida

TIS Tri-isopropil silano

HOBt 1-Hidroxibenzotriazol

IPA Isopropanol

Ejemplos de síntesis

Síntesis de ácidos N-terminales

En el presente trabajo, se usaron ácidos 4-aminobutanoicos 3-sustituidos en forma adecuadamente protegida. La síntesis de aminoácidos no estándar se detalla a continuación, junto con la metodología para la separación de enantiómeros

Ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico - Isómero 1 e Isómero 2

Una mezcla de ácido 3-clorocinnámico (10 g), metanol (100 ml) y ácido sulfúrico concentrado (4 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 20 h. La mezcla se evaporó a sequedad y los residuos se repartieron entre diclorometano (DCM) y agua. La fase acuosa se separó y se extrajo con más cantidad de DCM. Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron con sulfato de magnesio, se filtraron y se evaporaron a sequedad, produciendo el éster metílico en forma de un sólido de color blanco (10,19 g). Este sólido se disolvió en nitrometano (32 ml) y se trató con 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (DBU) (8,5 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 h, después se evaporó a sequedad y los residuos se repartieron entre HCl acuoso 0,5 M y éter dietílico. La fase acuosa se separó y se extrajo con más cantidad de éter dietílico. Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron con sulfato de magnesio, se filtraron y se evaporaron a sequedad. Los residuos se purificaron sobre sílice, eluyendo con hexano y acetato de etilo (0-100%). Las fracciones apropiadas se combinaron y se evaporaron a sequedad, produciendo el producto deseado en forma de un aceite de color amarillo (9,93 g, rendimiento del 70 %).

1H RMN (400 MHz, CDCla): 8 (ppm) 2,71-2,79 (2H, m), 3,66(3H, s), 3,93-4,01 (1H, m), 4,62 y 4,73 (2H, ABc, aparece como 2x dd,J12,8, 8,0 Hz), 7,11-7,28 (4H, m).

(ii) 4-amino-3-(3-clorofenil)butanoato de metilo

A una solución de 3-(3-clorofenil)-4-nitrobutanoato de metilo (9,93 g) en ácido acético (90 ml) agitada a aprox. 0 oC se le añadió en porciones polvo de cinc (20,1 g) -(precaución: exotermia retardada). La mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente, con agitación durante 19 h. La mezcla se evaporó a sequedad y los residuos se repartieron entre NaHCO3 acuoso y acetato de etilo. Después, la mezcla se filtró a través de Celite y las fases acuosas y orgánicas se separaron. La fase acuosa se extrajo de nuevo con más cantidad de acetato de etilo. Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron con sulfato de magnesio, se filtraron y se evaporaron a sequedad, produciendo el producto deseado en forma de un aceite de color naranja (4,80 g).

(iii) Compuesto del título - racémico

Una mezcla de 4-amino-3-(3-clorofenil)butanoato de metilo (4,80 g), dicarbonato de di-ferc-butilo (5,28 g) y diclorometano (100 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 18 h. La mezcla se evaporó a sequedad y los residuos se purificaron sobre sílice, eluyendo con éter de petróleo al 40-60 y acetato de etilo (0-100%). Las fracciones apropiadas se combinaron y se evaporaron a sequedad, produciendo 4-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoato de éster metílico Boc-protegido en forma de un sólido de color crema (2,59 g).

Una mezcla de 4-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoato de metilo (2,49 g), hidróxido de litio (546 mg), 1,4-dioxano (40 ml) y agua (40 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 64 h. Después, la mezcla se evaporó a sequedad. Los residuos se disolvieron en agua, se neutralizaron con HCl acuoso 1 M y se extrajeron con acetato de etilo (x 2). Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron con sulfato de magnesio, se filtraron y se evaporaron a sequedad, produciendo el producto deseado en forma de un aceite de color amarillo (2,51 g).

m/z 314 (MH+) C15H20ClNO4 requiere 313,11. 1H RMN (400 MHz, CD3OD): 8 (ppm) 1,40 (9H, s), 2,42-2,73 (2H, m), 3,24-4,49 (4,4 H, m, incluye CH3OD, CH2, y CH), 7,17-7,38 (4H, m).

(iv) Compuesto del título - separación de isómeros - procedimiento 1

Se disolvió ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico (2,09 g) hasta 60 mg/ml en metanol, y después se purificó por SFC usando las condiciones descritas a continuación (condiciones de separación preparativa 1). Las fracciones combinadas que contenían el isómero enriquecido 1 (ejecución más rápida) y el isómero 2 (ejecución más lenta) se combinaron, se concentraron y cada uno se purificó de nuevo individualmente en las mismas condiciones de cromatografía.

Después, las fracciones combinadas de cada uno del isómero 1 y el isómero 2 se evaporaron casi hasta sequedad utilizando un evaporador rotatorio, se transfirieron en recipientes finales con DCM, que se eliminó retiró en una corriente de nitrógeno a 40 °C antes de almacenarse en un horno de vacío a 40 °C y 5 mbar durante 16 horas. Ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico (isómero 1)

Sólido de color blanco, 883 mg, 95,6 % de e.e. Tiempo de retención 2,89 min en el sistema analítico 1.

Ácido 4-((terc-Butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico (isómero 2)

Sólido de color blanco, 876 mg, 98,6 % de e.e. Tiempo de retención 3,29 min en el sistema analítico 1.

Condiciones de separación preparativa 1:

Berger Multigram II SFC

Detalles de la columna: Lux A1 (Phenomenex, 21,2 mm x 250 mm, 5 |im)

Temperatura de la columna: 40 DC

Caudal: 50 ml/min

BPR: 125 BarG

Longitud de onda del detector: 210 nm

Volumen de inyección: 300 |il (18 mg)

Condiciones isocráticas: 12:88 de EtOH: CO2 (NH3 al 0,1% v/v)

Condiciones de análisis 1:

Waters UPC2

Detalles de la columna: Lux C4 (Phenomenex, 4,6 mm x 250 mm, 5 |im)

Temperatura de la columna: 40 °C

Caudal: 4 ml/min

Longitud de onda del detector: 210-400 nm

Volumen de inyección: 1,0 |il

BPR: 125 BarG

Condiciones isocráticas: 10:90 de EtOH:CO2 (NH3 al 0,1 % v/v)

(v) Compuesto del título - separación de isómeros - procedimiento 2

Ácido 4-((terc-Butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico purificado por SFC usando las condiciones descritas a continuación (condiciones de separación preparativa 2). Tras la separación, las fracciones se eliminaron por secado a través de un evaporador rotatorio a una temperatura de baño de 40 °C para obtener los enantiómeros separados deseados. El enantiómero de ejecución lenta se purificó adicionalmente en la misma columna eluyendo con el 20 % de B.

Condiciones de separación preparativa 2:

Instrumento: Thar 200 preparative SFC (SFC-10)

Columna: ChiralPak AY, 300 * 50 mm de D.I., 10 pm

Fase móvil: A para CO2 y B para IPA

Gradiente: B al 25%

Caudal: 200 ml/min

Contrapresión: 100 bar

Temperatura de la columna: 38 °C

Longitud de onda: 220 nm

Tiempo de ciclo: ~4,5 min

Condiciones analíticas 2:

Instrumento: Waters UPC2 analytical SFC (SFC-H)

Columna: ChiralPak AY, 150 * 4,6 mm de D.I., 3 pm

Fase móvil: A para CO2 y B para IPA (DEA al 0,05 %)

Gradiente: B al 5-40 %

Caudal: 2,5 ml/min

Contrapresión: 100 bar

Temperatura de la columna: 40 °C

Longitud de onda: 220 nm

Ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico (isómero 1)

Tiempo de retención 2,796 min. Asignada la estereoquímica(R)por comparación con el isómero (2) a continuación Ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico (isómero 2).

Tiempo de retención 3,264 min. Asignada la estereoquímica(S)por cristalografía de molécula pequeña del material BOC-desprotegido, como se describe a continuación.

(vi) Confirmación de estereoquímica

Sal trifluoroacetato del ácido (S)-4-amino-3-(3-clorofenil)butanoico

A una mezcla enfriada con hielo-agua de ácido 4-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(3-clorofenil)butanoico isómero 2 (Tiempo de retención 3,264 min en el procedimiento de análisis 2) (1,5 g, 4,78 mmol) en diclorometano (20 ml) se le añadió ácido trifluoroacético (5 ml). Después de la adición, la mezcla se agitó a esta temperatura durante 4 horas. Después, la mezcla de reacción se concentró. La mezcla en bruto se disolvió en agua (10 ml) y se liofilizó para proporcionar el producto; Sal TFA del ácido (S)-4-amino-3-(3-clorofenil)butanoico (1,5 g, rendimiento del 95%). LC-MS:m/z214 (M+H)+

Ácido (S)-4-amino-3-(3-clorofenil)butanoico

A una solución de la sal del ácido trifluoroacético de ácido (S)-4-amino-3-(3-clorofenil)butanoico (0,5 g, 1,53 mmol) en agua (10 ml), se le añadió hidróxido de amonio ac. diluido hasta que el pH llegó a 7. La solución resultante se almacenó en un matraz abierto de 25 ml y se mantuvo a temperatura ambiente durante 1 día. Tras la cristalización, las aguas madre se decantaron, y los cristales sólidos se sometieron a estudios de difracción de rayos X.

Los estudios de difracción de rayos X mostraron que el compuesto tenía la estereoquímica (S).

Condiciones de difracción de rayos X:

Se utilizó el difractómetro Bruker APEX-II CCD.

El cristal se mantuvo a 302,71 K durante la recolección de datos. Usando Olex2 (Dolomanov et al.), la estructura se resolvió con el programa de solución de estructuras ShelXT [2] (Sheldrick A71) utilizando la fase de fase intrínseca y se refinó con el paquete de refinamiento ShelXL [3] utilizando la minimización de mínimos cuadrados (Sheldrick C71).

Ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(2-clorofenil)butanoico

on

El compuesto se preparó a partir de ácido 2-clorocinnámico siguiendo la metodología del ácido4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-dorofenil)butanoico como se describe en las etapas (i) a (iii) anteriores. El compuesto se obtuvo en forma de un aceite incoloro.

m/z 314 (MH+), Ci5H2OClNO4 masa exacta 313,11.

Ácido 3-bencil-4-((terc-butoxicarbonil)amino)butanoico

3-Bencil-4-nitrobutanoato de metilo(Tetrahedron Asymmetry,19, 2008, 945) se convirtió en el compuesto del título siguiendo la metodología del ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico como se describe en las etapas (i) a (iii) anteriores.

m/z 294 (MH+), C16H23NO4 masa exacta 293,16.

Ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-isobutilfenil)butanoico

(i) 3-(3-bromofenil)-4-nitrobutanoato de etilo

Una mezcla de hidruro sódico (60%) en aceite mineral (394,26 mg, 9,86 mmol) y 1,2-dimetoxietano (22,5 ml) (DME) se enfrió a 0°C. Se añadió gota a gota trietilfosfonoacetato (10,2 ml, 51,43 mmol) y la mezcla se agitó durante 10 min. Una solución de 3-bromobenzaldehído (1,0 ml, 8,57 mmol) en DME (5 ml) se añadió gota a gota. La mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se calentó a reflujo durante 3 h.

La mezcla se evaporó a sequedad y los residuos se repartieron entre hexano y agua. La capa acuosa se separó y se extrajo con más cantidad de hexano. Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con agua, se secaron con MgSO4, se filtraron y se evaporaron a sequedad. Los residuos se purificaron sobre sílice eluyendo con éter de petróleo 40-60 y acetato de etilo (0-100%). Las fracciones apropiadas se combinaron y se evaporaron a sequedad, produciendo (E)-3-(3-bromofenil)prop-2-enoato de etilo en forma de un sólido de color blanco (1,44 g, 65%). Esto se convirtió en 3-(3-bromofenil)-4-nitrobutanoato de etilo usando las condiciones para la nitración en la preparación de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico en la etapa (i), como se ha descrito anteriormente, para dar el producto con un rendimiento del 60 %.

m/z 316, 318 (MH+). C-i2H-MBrNO4 requiere 315,01.

(ii) 4-Amino-3-(3-bromofenil)butanoato de etilo

El 3-(3-bromofenil)-4-nitrobutanoato de etilo (1,08 g) se convirtió en 4-amino-3-(3-bromofenil)butanoato de etilo usando las condiciones descritas anteriormente para el ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico en la etapa (ii), para dar el producto con un rendimiento del 67 %.

m/z 286 y 288 (MH+), C-i2H-i6BrNO2 masa exacta 285,04.

(iii) 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-bromofenil)butanoato de etilo

El 4-amino-3-(3-bromofenil)butanoato de etilo (655 mg) se convirtió en 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-bromofenil)butanoato de etilo en las condiciones descritas anteriormente para el ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico en la etapa (iii), para dar el producto con un rendimiento del 72 %.

m/z 386 y 388 (MH+), C-i7H24BrNO4 masa exacta 385,09.

(iv) 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-isobutilfenil)butanoato de etilo

Una mezcla de Ruphos (48,3 mg, 0,1 mmol), fosfato potásico tribásico (330 mg, 1,55 mmol), 3-(3-bromofenil)-4-(tercbutoxicarbonilamino)butanoato de etilo (200 mg, 0,52 mmol) y ácido isobutilborónico (132 mg, 1,29 mmol) en tolueno (9 ml) se desgasificó cuatro veces por evacuación/lavado abundante con nitrógeno antes de añadir acetato de paladio (II) (5,8 mg, 0,03 mmol). La mezcla se agitó a 110°C durante 100 min. La mezcla de reacción se dejó enfriar antes de filtrarse a través de Celite y se dejó durante una noche en solución. La mezcla se evaporó a sequedad y se purificó sobre sílice, eluyendo con éter de petróleo al 40-60 y acetato de etilo (0-100%). Las fracciones apropiadas se combinaron y se evaporaron a sequedad, produciendo 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-isobutilfenil)butanoato de etilo en forma de un aceite incoloro, (74 mg, 39 %).

m/z 364 (MH+). C21H33NO4 masa exacta 363,24.

(v) Compuesto del título

Una mezcla de 4-(terc-butoxicarbonilamino)-3-(3-isobutilfenil)butanoato de etilo (74 mg, 0,2 mmol) e hidróxido de litio (15 mg, 0,6 mmol) en 1,4-dioxano (3 ml) y agua (3 ml) se agitó a temperatura ambiente durante 16 h. La mezcla se evaporó a sequedad y los residuos se repartieron entre acetato de etilo y agua. La fase orgánica se separó y se descartó. El producto acuoso se acidificó con HCl 1 M (ac.) y se extrajo con acetato de etilo (x 2). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron con MgSO4, se filtraron y se evaporaron a sequedad, produciendo ácido4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-isobutilfenil)butanoico en forma de un aceite incoloro (65 mg). m/z 336 (MH+) C19H29NO4 masa exacta 335,21.

Ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-dorobencil)butanoico

Cl'OH

><A<o>

2-(3-Clorofenil) acetaldehído se convirtió en 3-(3-clorobencil)-4-nitrobutanoato de etilo como se describe para el ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-isobutilfenil)butanoico en la etapa (i), como se ha descrito anteriormente. La reducción y la protección como en la etapa (ii) y (iii), seguidas de hidrólisis como en la etapa (v) anterior, proporcionaron el compuesto del título en forma de un aceite incoloro.

m/z 328 (MH+). CiaH22ClNO4 masa exacta 327,12.

Ácido 4-(((benciloxi)carbonil)amino)-3-(3-isopropilfenil)butanoico

Una mezcla de 4-amino-3-(3-isopropilfenil)butanoato de etilo (1,55 g, 6,21 mmol) (preparada usando la metodología del ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-isobutilfenil)butanoico en las etapas (i) a (ii), como se ha descrito anteriormente), y bicarbonato sódico (0,783 g 9,32 mmol) se disolvió en agua (10 ml) y 1,4-dioxano (5 ml). La mezcla se enfrió en un baño de hielo, y se trató con una solución de cloroformiato de bencilo (0,98 ml, 6,84 mmol). La mezcla se agitó a 10°C durante 1 h, después se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de agitar durante 20 h, la mezcla se evaporó a sequedad, y los residuos se repartieron entre éter dietílico y HCl acuoso 0,5 M. La capa acuosa se separó y se extrajo con más cantidad de éter dietílico. Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre MgSO4 anhidro y se evaporaron. El producto en bruto se purificó sobre sílice, eluyendo con éter de pet. al 40-60 y acetato de etilo (0-100 %). Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron para dar un aceite de color amarillo pálido (1,74 g, 73 %). El éster etílico se hidrolizó con hidróxido de litio como se ha descrito previamente en la etapa (iii) para la preparación de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-isobutilfenil)butanoico, seguido de cromatografía sobre sílice eluyendo con éter de petróleo al 40-60 y acetato de etilo (0-100 %) para proporcionar el compuesto del título en forma de un sólido de color blanco (60%).

m/z 356 (MH+). C21H25NO4 masa exacta: 355,18.

Ácido 4-([1,1'-bifenil]-3-il)-3-(((terc-butoxicarbonil)amino)metil)butanoico

(i) Clorhidrato del ácido 4-amino-3-(3-bromofenil)butanoico

Una mezcla de 4-(3-bromofenil)pirrolidin-2-ona (1,0 g, 4,16 mmol) y HCl acuoso 6 M (15,0 ml, 90 mmol) se calentó a 100°C durante 16 h. La mezcla se evaporó a sequedad, se co-evaporó con agua, seguido de acetato de etilo y después diclorometano (DCM), produciendo el producto deseado en forma de un sólido de color blanco, en un supuesto rendimiento cuantitativo.

m/z 258 y 260 (MH+) C10H-i2BrNO2 masa exacta: 257,01.

(ii) ácido 3-(3-bromofenil)-4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico

Una mezcla de clorhidrato del ácido 4-amino-3-(3-bromofenil)butanoico (1,31 g, 4,45 mmol), terc-butil carbonato de ferc-butoxicarbonilo (Boc-O-Boc, 1,41 g, 6,45 mmol), 1,4-dioxano (8 ml) y NaOH acuoso 1 M (8,0 ml, 8 mmol) se agitó a temperatura ambiente durante 64 h. La mezcla se evaporó a sequedad. Los residuos se disolvieron en agua, se neutralizaron con HCl acuoso 1 M y se extrajeron con acetato de etilo (x 2). Los extractos orgánicos se combinaron, se secaron con MgSO4, se filtraron y se evaporaron a sequedad, produciendo el producto deseado (1,60 g, 86 %) en forma de un aceite incoloro.

m/z 357,5 y 359,4 (MH+). C-i5H20BrNO4 masa exacta: 357,06.

(iii) Compuesto del título

Una mezcla de ácido 3-(3-bromofenil)-4-(ferc-butoxicarbonilamino)butanoico (2,69 g, 7,51 mmol), ácido fenilborónico (2,3 g, 18,8 mmol), acetato de paladio (II) (84 mg, 0,38 mmol), Xphos (716 mg, 1,5 mmol) y fosfato potásico tribásico (4781,9 mg, 22,53 mmol) en 1,4-dioxano (130 ml) se agitó a 100°C en una atmósfera de nitrógeno durante 2 h. Después, la mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente, se filtró a través de Celite, se lavó con acetato de etilo y se evaporó a sequedad. Los residuos se purificaron sobre sílice, eluyendo con éter de petróleo y acetato de etilo (0 100 %). Las fracciones apropiadas se combinaron y se evaporaron a sequedad, produciendo el producto deseado, 1,44 g, en forma de un sólido de color gris (rendimiento del 42 %).

m/z 355 (M+), observado. C21H25NO4 masa exacta: 355,18.

(iv) Separación quiral

Se disolvió ácido 4-([1,1-bifenil]-3-il)-3-(((ferc-butoxicarbonil)amino)metil)butanoico (1,44 g) para dar 30 mg/ml en MeOH y después se purificó por SFC, usando el procedimiento a continuación. Después, las fracciones combinadas de cada uno del isómero 1 (ejecución más rápida) y el isómero 2 (ejecución más lenta) se evaporaron casi hasta sequedad utilizando un evaporador rotatorio, se transfirieron en recipientes finales con DCM, que se retiró en una corriente de aire comprimido a 40 °C antes de almacenarse en un horno de vacío a 40 °C y 5 mbar hasta un peso constante.

Ácido 4-([1,1-bifenil]-3-il)-3-(((ferc-butoxicarbonil)amino)metil)butanoico, isómero 1. Sólido de color blanco 523 mg. Tiempo de retención: (condiciones de análisis 3) 2,70 min.e.e. del99,8 %.

Ácido 4-([1,1-bifenil]-3-il)-3-(((ferc-butoxicarbonil)amino)metil)butanoico, isómero 2. Sólido de color blanco 537 mg. Tiempo de retención: (condiciones de análisis 3) 3,46 min.e.e. del99,8 %.

Condiciones de purificación 3:

Berger Multigram II SFC

Detalles de la columna: Lux A1 (Phenomenex, 21,2 mm x 250 mm, 5 |im)

Temperatura de la columna: 40°C

Caudal: 50 ml/min

BPR: 100 BarG

Longitud de onda del detector: 215 nm

Volumen de inyección: 1,000 |il (30 mg)

Condiciones isocráticas: 15:85 de EtOH:CO2 (NH3 al 0,2 % v/v)

Condiciones de análisis 3:

Waters UPC2

Detalles de la columna: Amy-C (YMC Gmbh, 4,6 mm x 250 mm, 5 |im)

Temperatura de la columna: 40 °C

Caudal: 4 ml/min

Longitud de onda del detector: 210-400 nm

Volumen de inyección: 1,0 |il

BPR: 125 BarG

Condiciones isocráticas: 15:85 de EtOH:CO2 (NH3 al 0,2 % v/v)

Ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-metilfenil)butanoico

Se convirtió 4-(3-metilfenil)pirrolidin-2-ona en el compuesto del título usando la metodología descrita anteriormente para la preparación de ácido 4-([1,1'-bifenil]-3-il)-3-(((terc-butoxicarbonil)amino)metil)butanoico en las etapas (i) a (ii). El compuesto del título se obtuvo en forma de un aceite incoloro.

m/z 294 (MH+). C16H23NO4 masa exacta 293,16.

Ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3,5-diclorofenil)butanoico

3,5-Diclorobenzaldehído se convirtió en el compuesto del título usando la metodología descrita anteriormente para la preparación de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-isobutilfenil)butanoico en las etapas (i) a (iii). El éster etílico se hidrolizó como se describe para la etapa (v) en la preparación de ácido (3-isobutilfenil)butanoico, para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro.

m/z 348. (MH+). C15H1gChNO4 masa exacta 347,07.

Ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-(tiofen-3-il)fenil)butanoico

Se hizo reaccionar 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-bromofenil)butanoato de etilo (207 mg, 0,54 mmol) con ácido 3-tienilborónico usando la metodología descrita anteriormente para la preparación de ácido (3-isobutilfenil)butanoico en la etapa (iv). El producto se hidrolizó como se describe en la etapa (v) para proporcionar el compuesto del título en forma de un aceite incoloro.

m/z 362 (MH+). C19H23NO4S masa exacta 361,13.

Nonapéptidos de polimixina intermedios y compuestos de producto

Intermedio1: H-Thr(O-tBu)-Dap(BOC)-Ciclo[Dab-Dab(BOC)-DPhe-Leu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr]

Descrito previamente en el documento WO 2015/135976 como el Intermedio 11 - Tetra-(N-Boc)-L-Thr(O-tBu)-L-Dap-Polimixina B heptapéptido.

Intermedio 2:H-Thr(O-tBu)- Dap(BOC)-Ciclo[Dab-Dab(BOC)-Leu-Leu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr]

Descrito previamente en el documento WO 2015/135976 como el Intermedio 14 - Tetra-(N-Boc)-L-Thr(O-tBu)-L-Dap-Polimixina E heptapéptido.

Intermedio 3:H-Thr(O-tBu)- Dap(BOC)-Ciclo[Dab-Dab(BOC)-Dleu-L-Abu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr(O-tBu)]

El péptido lineal CBZ-Thr(O-tBu)-Dap(Boc)-Dab(ivDde)-Dab(Boc)-Dleu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu) se preparó sobre resina por síntesis peptídica de fase sólida usando química Fmoc, usando la metodología del Método general 3 descrito anteriormente. La secuencia comenzó con resina de cloruro de clorotritilo (CTC) (2,0 g), cargada previamente con Fmoc-Thr(tBu)-OH a una carga de 0,75 mmol/g. El péptido unido a resina (3,93 g, correspondientes a 1,5 mmol) se puso en un matraz cónico de 500 ml y se trató con hidrazina al 4 % en DMF (100 ml). La mezcla se puso en un agitador y se agitó suavemente durante 30 min. La mezcla se vertió en una columna sinterizada, después se lavó con DMF (3 x 100 ml). Se aplicó aire comprimido para eliminar las últimas trazas de DMF. Después, el procedimiento se repitió con THF y con DCM.

Después, la resina se trató con 4:1 de DCM: hexafluoroisopropanol (100 ml) para escindir el péptido de la resina. Después de 30 min, la columna se drenó y el procedimiento se repitió. Después, la resina se lavó tres veces con DCM (100 ml). Los eluyentes y los lavados combinados se evaporaron a presión reducida y se secaron al vacío durante una noche. Se obtuvieron 724 mg de sólido de color blanco (2,35 g, cuant.).

m/z 1552, C73H126N14O22 requiere 1550,92.

(ii) CBZ- Thr(O-tBu)- Dap(Boc)-ciclo[Dab-Dab(Boc)-DLeu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu)]

Se disolvió CBZ-Thr(O-tBu)-Dap(Boc)-Dab-Dab(Boc)-DLeu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu)-OH en bruto (724 mg, 0,466 mmol) en DMF (75 ml), se trató con diisopropiletilamina (DIPEA) (361 mg 0,49 ml, 2,8 mmol) y después se enfrió en un baño de hielo. Se añadió gota a gota difenil fosforil azida (256 mg, 0,2 ml, 0,93 mmol), después la mezcla se agitó durante 2 h con enfriamiento en baño de hielo. El baño de hielo se retiró y la solución se agitó a temperatura ambiente durante 2 h más. El disolvente se evaporó y el residuo se aplicó a una columna sobre SO2 ISCO (40 g) y se sometió a cromatografía con MeOH al 0-10 % en DCM. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se evaporaron para dar una espuma de color blanco. Se obtuvieron 418 mg (58%).

m/z 1534, C73H124N14O21 requiere 1532,91.

(iii) Compuesto del título

CBZ- Thr(O-tBu)- Dap(Boc)-ciclo[Dab-Dab(Boc)-DLeu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu)] (531 mg, 0,346 mmol) se disolvió en metanol (50 ml) y se trató con formiato amónico (545 mg, 8,6 mmol) y Pd al 10 %/C (173 mg). Después de agitar a temperatura ambiente durante la noche, la mezcla de reacción se filtró a través de Celite, y el residuo se lavó con MeOH. El disolvente se evaporó y el residuo se disolvió en EtOAc, que contenía MeOH al 10 %, se lavó con agua x 3 y se secó con sulfato de magnesio. El disolvente se evaporó para dejar un sólido de color blanco. Para eliminar cualquier traza de formiato, el sólido se disolvió en metanol (160 ml) y se agitó una resina Ambersep 900 (12 ml) durante 30 minutos. La mezcla se filtró y se evaporó a sequedad, para obtener 464 mg de sólido de color blanco (96 %).

m/z 1400, C65H118N14O19 requiere 1398,87.

Métodos generales

La síntesis total de los derivados de nonapéptido de polimixina se realizó como se indica a continuación.

Un péptido lineal con protección ortogonal del grupo y-amino del residuo Dab implicado en la ciclación se construyó sobre la resina, con el aminoácido C-terminal (típicamente Thr) unido a la fase sólida. Después de la desprotección parcial del Dab implicado en la ciclación (residuo 4 en el sistema de numeración de la polimixina), seguido de la eliminación de la resina, los péptidos lineales resultantes se eliminaron por ciclación de la resina. Se utilizaron dos procedimientos generales, como se describe a continuación.

Método general 1: Síntesis total usando protección CBZ de grupos amina

La síntesis del péptido lineal protegido (residuos 2-10 y grupo N-terminal) se realizó en un sintetizador peptídico automatizado usando la química de péptidos en fase sólida Fmoc estándar. Específicamente, la síntesis se realizó utilizando la resina Fmoc-Thr (tBu)-PEG-PS como material de partida. El acoplamiento de los aminoácidos Fmoc con la protección CBZ en los grupos amino terminales se realizó utilizando 5 equivalentes molares (relativos a la carga de resina) de Fmoc aminoácido y HATU en DMF con activación in situ, utilizando 10 equivalentes molares de DIPEA. La desprotección de Fmoc se realizó con piperidina al 20 % en dimetilformamida. Se utilizó BOC como el grupo protector ortogonal en el Dab implicado en la ciclación.

El péptido lineal unido a la resina se trató con TFA/TIS/H2O (96/2/2 v/v) durante 2 h para revelar el residuo Dab implicado en la ciclación, y para escindir el péptido de la resina. Este material se cicló usando PyBop/HOBt/NMM (4/4/8 equivalentes molares relativos a la carga inicial) en DMF durante 3 h. El material en bruto se evaporó parcialmente, se recogió en acetonitrilo/agua y se liofilizó durante una noche. Después, los grupos CBZ se eliminaron usando Pd al 10 %/C en ácido acético/MeOH/agua (5/4/1 v/v).

El producto en bruto se purificó y los diastereómeros se separaron por HPLC preparativa (Tabla 3). Cabe apreciar que las condiciones específicas se optimizaron para cada par de diastereómeros.

Método general 2: Síntesis total usando protección Boc de grupos amina

La síntesis del péptido lineal protegido (residuos 2-10 y grupo N-terminal) se realizó en un sintetizador peptídico automatizado usando la química de péptidos en fase sólida Fmoc estándar. Específicamente, la síntesis se realizó usando una resina de cloruro de clorotritilo (CTC), precargada con Fmoc-Thr(tBu)-OH (carga ~0,78 mmol/g), en una escala de 0,05 - 0,1 mmol. El acoplamiento de los Fmoc-aminoácidos se realizó usando 5 equivalentes molares (relativos a la carga de resina) de Fmoc aminoácido y HATU en DMF con activación in situ, utilizando 10 equivalentes molares de DIPEA. La desprotección de Fmoc se realizó con piperidina al 20 % en dimetilformamida. El grupo protector ivDde se usó como protección ortogonal en el residuo Dab implicado en la ciclación.

Para eliminar el grupo ivDde, el péptido lineal se trató con hidrazina al 3%en DMF (100 ml por 100 |imol, repetido dos veces) seguido de lavado con DMF x 3, EtOH x 3 y éter dietílico x 3. Después, el péptido lineal parcialmente desprotegido se escindió de la resina lavando la resina con HFIP al 20 % en DCM. El residuo resultante se disolvió en acetonitrilo al 50 %/agua y se liofilizó durante una noche. El péptido lineal protegido se disolvió en DMF (20 ml/mmol de resina) ciclada con DPPA, (3 equivalentes molares relativos a la carga de la resina) y DIPEA (6 equivalentes molares relativos a la carga de la resina). Esta solución se agitó a temperatura ambiente durante una noche. Los grupos BOC se eliminaron con TFA, y el péptido en bruto se liofilizó.

El producto en bruto se purificó y los diastereómeros se separaron por HPLC preparativa usando las condiciones de HPLC preparativa 4 descritas a continuación. Cabe apreciar que las condiciones específicas se optimizaron para cada par de diastereómeros.

Método general 3: Acoplamiento de ácido a nonapéptido y separación

A continuación se describen procedimientos para acoplar el N terminal de un nonapéptido a un aminoácido en relación con los compuestos ejemplares 5 y 6. Las condiciones descritas pueden adaptarse a otras combinaciones de nonapéptido y aminoácido.

Etapa 1

H-Thr(O-‘Bu)- Dap(BOC)-Ciclo[Dab-Dab(BOC)-DPhe-Leu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr]. (Intermedio 1) (0,07 mmol) se disolvió en diclorometano (4 ml), y se trató con ácido con 4-((ferc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico (1,5 equiv. con respecto al sustrato de polimixina), W,A/-diisopropiletilamina (3,0 equiv.), seguido de HATU (2,0 equivalente). Después de 16 h, la finalización de la reacción se confirmó por LCMS y la mezcla de reacción se evaporó a sequedad. Se añadió agua (aprox. 10 ml) y la mezcla se trituró y después se agitó vigorosamente durante 1 h. El precipitado resultante se recogió por filtración y se secó al vacío durante una noche.

Etapa 2

El derivado Boc-protegido de la Etapa 1 se disolvió en diclorometano (3 ml) y se trató con TFA (1 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente hasta que el análisis por LCMS confirmó una desprotección completa. El disolvente se evaporó y el residuo se sometió a cromatografía por HPLC preparativa usando las condiciones dadas en las Condiciones de HPLC preparativa 4 para separar los diastereómeros. Las fracciones que contenían el diastereómero de ejecución temprana se combinaron, se evaporaron a bajo volumen y se liofilizaron para proporcionar el Ejemplo 5 en forma de la sal de TFA. Las fracciones que contenían el diastereómero de ejecución tardía se combinaron, se evaporaron a bajo volumen y se liofilizaron para proporcionar el Ejemplo 6 en forma de la sal de TFA. Cabe apreciar que las condiciones específicas se optimizaron para cada par de diastereómeros.

Condiciones de HPLC preparativa 4:

Columna: Waters Sunfire C18 OBD 5 pm x 19 mm x 150 mm

Fase móvil: A: 90/10 de agua/acetonitrilo, v/v, TFA al 0,15%.

B: 90/10 de acetonitrilo/agua, v/v, TFA al 0,15%

Caudal: 10 ml/min

Gradiente: Tiempo (min) % de fase móvil A

0 100 %

3 100 %

8 85 %

13,5 85 %

15 75 %

18 0%

23 100 %

25 100 %

Detección: 210 nm

Condiciones de HPLC analítica 4:

Columna: Phenomenex Hyperclone C18 BDS 5 |jm x 4,6 mm x 150 mm

Fase móvil: A: 90/10 de agua/acetonitrilo, v/v, TFA al 0,15%.

B: 90/10 de acetonitrilo/agua, v/v, TFA al 0,15 %

Caudal: 1 ml/min

Gradiente: Tiempo (min) % de fase móvil A

0 100 %

20 40 %

21 0%

23 0%

23,5 100

25 100

Detección: 210, 254 nm

Volumen de inyección: 20 |il

Método general 3b: Acoplamiento de enantiómeros individuales a nonapéptido

Los aminoácidos enantioméricamente puros se acoplaron al extremo N-terminal de los compuestos nonapeptídicos usando las mismas condiciones que se describen anteriormente en el Método general 3a para los aminoácidos enantioméricamente mezclados.

Ejemplos de compuesto 5 y 6

El acoplamiento del ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico (isómero 2) (Tiempo de retención 3,46 min para el procedimiento analítico 1 o 3,264 min para el procedimiento analítico 2) en las condiciones del Método general 3a seguido de desprotección proporcionó el Ejemplo 5. El Ejemplo (5) se asignó a la estereoquímica (S) tras la determinación por rayos X de la configuración absoluta de ácido 4-amino-3-(3-clorofenil)butanoico derivado de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico (isómero 2).

El acoplamiento del ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico (isómero 1, tiempo de retención 2,89 min para el procedimiento analítico 1 o 2,796 min para el procedimiento analítico 2) en las condiciones del Método general 3a seguido de desprotección proporcionó el Ejemplo 6. El Ejemplo (6) se asignó a la estereoquímica (R) tras la determinación por rayos X de la configuración absoluta de ácido 4-amino-3-(3-clorofenil)butanoico derivado de ácido 4-((terc-butoxicarbonil)amino)-3-(3-clorofenil)butanoico (isómero 1).

Método general 4: Conversión en la sal acetato

La resina AG1-X2 (Bio-Rad Laboratories Ltd) forma acetato malla 200-4, se regeneró por lavado con acético acuoso al 10 % seguido de ácido acético acuoso al 1 %, y se puso en un cartucho sinterizado. Una solución del compuesto en forma de una sal TFA en agua se aplicó a la columna, usando una carga de 30 g de resina a 1 g de sal TFA, y la columna se dejó gotear bajo la gravedad, eluyendo con agua. Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se liofilizaron para dar un sólido de color blanco.

El análisis de los compuestos finales se realizó por HPLC usando las condiciones descritas anteriormente (Condiciones de HPLC analítica).

Los datos analíticos ejemplares para los compuestos del Ejemplo 5 y 6, como sales acetato, se dan a continuación. Ejemplo 5: (isómero más rápido) 1H RMN de la sal acetato (400 MHz, D2O): 8 (ppm) 0,70 (3 H, d,J6,1 Hz), 0,77 (3 H, d, J 6,3 Hz), 0,78-0,90 (1H, m), 1,13 (3H, d, J 6,3 Hz), 1,17 (3H, d, J 6,4 Hz), 1,36-1,52 (2H, m), 1,75-2,06 (17 H, m, incluye 1,91, s, OAc), 2,10-2,30 (4H, m), 2,72-2,91 (4H, m), 3,02-3,49 (14H, m), 4,12-4,32 (8 H, m), 4,48 (1 H, dd, J 5,6, 9,0 Hz), 4,54-4,60 (1H, m), 4,63-4,68 (1H, m), 7,25-7,41(9H, m). m/z 1145 [MH+], 573[M+2H]2+.

Ejemplo 6: (isómero más lento) 1H RMN de la sal acetato (400 MHz, D2O): 8 (ppm) 0,60- 0,67 (6 H, m), 0,69 - 0,84 (4 H, m), 1,16 (3H, d, J 6,4 Hz), 1,33-1,50 (2 H, m), 1,76-2,04 (19 H, m, incluye 1,88, s, OAc), 2,06-2,26 (4 H, m), 2,67 2,86 (4 H, m), 3,00-3,46 (14 H, m), 3,98-4,04 (1 H, m) 4,14-4,30 (7H, m), 4,45 (1 H, dd, J 5,6, 9,0 Hz), 4,54 (1 H, aparece como t, J 8,3 Hz), 4,72 (1 H, dd, J 5,0, 8,9 Hz), 7,20-7,40 (9 H, m). m/z 1145 [MH+], 573[M+2H]2+.

En todos los ejemplos, los diastereómeros se asignaron en función del tiempo de retención de HPLC (isómeros de elución rápida y lenta) junto con el desplazamiento químico del residuo de Thr que se mueve desde 1,13 ppm en el isómero de elución rápida, hasta aproximadamente 0,65 ppm en el isómero de elución lenta.

Compuestos ejemplares y de referencia

La Tabla 1 enumera compuestos ejemplares de la invención junto con compuestos de referencia proporcionados para la comprensión útil de la invención. Estos son compuestos que tienen la estructura general que se muestra a continuación:

El grupo R se muestra en la tabla junto con los residuos de aminoácidos en las posiciones 6 y 7 (AA-6 y AA-7 respectivamente, utilizando el sistema de numeración de la polimixina).

En estos compuestos de ejemplo y de ejemplo de referencia, el residuo de aminoácido en la posición QQQ es L-Thr, el residuo de aminoácido en la posición 3 es L-Dap y el aminoácido en la posición QQQ es L-Thr.

La estereoquímica absoluta en la cadena lateral -R se ha asignado en comparación con el Ejemplo 5 y el Ejemplo 6, que se han correlacionado con material de estereoquímica absoluta conocida.

En los ejemplos y ejemplos de referencia 1-6 y 15-33, la determinación se realizó comparando los tiempos de retención relativos y el espectro de 1H RMN de los diastereómeros (por ejemplo, teniendo en cuenta el desplazamiento químico del residuo de Thr en la posición 2).

En los Ejemplos de referencia 7-14, la determinación se realizó por comparación de los tiempos de retención de HPLC relativos de los diastereómeros.

La tabla proporciona los tiempos de retención de HPLC para los compuestos ejemplares. Las condiciones de HPLC que se usaron para el análisis se exponen a continuación.

Columna: Phenomenex Hyperclone BDS C18, 4,6 mm x 150 mm, 5 pm

Caudal: 1 ml/min

Eluyente:

A = 10 % de AcN/90 % de agua/0,15 % de TFA

B = 90 % de AcN/10 % de agua/0,15 % de TFA

Gradiente: Min % de A % de B

0 100 0

20 40 60

21 0 100

23 0 100

23,5 100 0

25 100 0

Detección: 210, 254 nm

En la Tabla 1, un asterisco (*) indica un ejemplo de referencia.

��

��

��

��

��

Resultados b io lógicos

Los compuestos de la invención se probaron, y los resultados se compararon con ejemplos comparativos, que incluyen compuestos descritos previamente en la técnica.

Determinación de MIC

El inóculo se preparó haciendo una suspensión directa de colonias aisladas (seleccionadas de una placa de agar Mueller-Hinton de 18-24 horas) ajustada al estándar de 0,5 McFarland. La prueba de MIC se realizó mediante diluciones de antibióticos seriadas dos veces en caldo Mueller-Hinton ajustado en cationes en placas de microtitulación de 96 pocillos estériles en un volumen total de 170 pl (150 pl de caldo que contenía el agente antimicrobiano, 20 pl de inóculo). Los ensayos se realizaron por duplicado. Las placas se incubaron de forma aerobia sin agitación durante 18 20 horas a 35 °C con la MIC definida como la concentración más baja de fármaco que impidió un crecimiento visible. Varios de los compuestos se sometieron a múltiples pruebas, y cuando este fue el caso, la MIC presentada es el valor mediano obtenido. Los valores de MIC se citan en pg/ml.

Ensayo de toxicidad de células renales in vitro

El ensayo de toxicidad de células renalesin vitrose realizó de acuerdo con el siguiente protocolo.

Las células HK-2 se mantuvieron y ensayaron en medio de queratinocito-SFM complementado con 5 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y 50 pg/ml de extracto de pituitaria bovina (BPE). Las células se sembraron a 7.500 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se dejaron adherir durante la noche. La polimixina B (PMB) y los compuestos de ensayo se disolvieron en DMSO al 10% en agua para dar una solución madre de 20 y 60 mg/ml, respectivamente. Los compuestos de ensayo se diluyeron para proporcionar una concentración máxima de 3.000 o 1.000 pg/ml con diluciones semi-logarítmicas un intervalo de concentración de 9 puntos más el vehículo de control. La PMB también se diluyó para dar una concentración máxima de 1.000 pg/ml con diluciones semi-logarítmicas. Los niveles de agua y DMS<o>se mantuvieron constantes en el 5 % y el 0,5 %, respectivamente. Los compuestos de ensayo se incubaron con células durante 24 horas a 37 °C en CO2 al 5 % en una atmósfera humidificada. Se diluyó CellTiter-Blue en PBS (1:4) y se añadió al 20 % (v/v) y se incubó a 37 °C durante 2 h antes de que se detectara el producto fluorescente.

Los valores de fondo de solo medios se restaron antes de analizar los datos utilizando GraphPad Prism. Los valores individuales se normalizaron con respecto a los pocillos de vehículo de control para cada compuesto. Los valores de concentración del compuesto se representaron gráficamente como valores logarítmicos para permitir el ajuste de una curva de dosis-respuesta. La parte inferior de la curva se limitó a cero y se determinaron los valores de CI50.

Los valores de CI50 se expresan en relación con los de PMB en el mismo experimento. Cuando se han realizado múltiples determinaciones, se presentan valores medianos.

Mediciones de nivel en el riñón en cuatro horas

Los compuestos se dosificaron por vía subcutánea a 17,2 mg/kg de base libre a ratones (n = 2 o 3). Cuatro horas después de la dosificación, los animales se sacrificaron y se extrajeron los riñones, se les recortó la grasa y el tejido conjuntivo, se pesaron y se congelaron inmediatamente. Después de descongelar a temperatura ambiente, se colocaron el par de riñones de cada animal en tubos cónicos de 2 ml que contenían perlas de óxido de zirconio estabilizadas con cerio previamente pesadas. Se añadió ácido trifluoroacético, TFA (0,25 ml, 0,15 % v/v en agua) y los tubos se cargaron en un homogeneizador FastPrep-24 (MP Biomedicals Europe) y se sometieron a 3 ciclos de 30 segundos cada uno a una velocidad de 6 m/s. Una alícuota (200 pl) del homogeneizado se diluyó con un volumen calculado de solución de TFA (0,15 % v/v en agua) para dar una concentración final de 0,167 gramos de riñón/gramo de homogeneizado.

Los homogeneizados de riñón (100 pl) se mezclaron con metanol (190 pl) y TFA (110 pl, 10 % v/v en agua) y se almacenaron durante la noche a -20 °C para la precipitación de proteínas. Después de 10 min de centrifugación a 13.000 rpm y 6 °C, se transfirieron 200 pl de los sobrenadantes a insertos de vidrio y se analizaron por LC-MS-MS.

Datos bio lóg icos adicionales

Comparación de toxicidad renal - Ejemplo 5 y Ejemplos de referencia D77 y 38

A los ratones (n = 6) se les dosificó por vía subcutánea tres veces al día polimixina B, sulfato de colistina, Ejemplo de referencia D77, Ejemplo de referencia 38 o Ejemplo 5 a 17,2 mg de base libre/kg. Comenzando inmediatamente después de la primera dosis el día 4, los ratones se transfirieron a jaulas metabólicas individuales y la orina se recolectó durante las siguientes 24 horas para la determinación de los niveles de biomarcadores (albúmina, cistatina C, KIM-1). Los niveles de biomarcadores medios geométricos se presentan en la siguiente tabla:

Los valores de PMB muestran el rango de 4 experimentos y la colistina de 2 experimentos.

La elevación de la albúmina, cistatina C o KIM-1 en la orina son signos de daño renal. El ejemplo 5 mostró los niveles más bajos de los 3 biomarcadores de toxicidad renal.

El Ejemplo de referencia D77 se describe en el documento WO 2015/135976. El Ejemplo de referencia 38 se describe en el documento WO 2016/083531.

Comparación de toxicidad renal - Ejemplos 5, 9 y 17

A los ratones (n = 6) se les dosificó por vía subcutánea PMB, Ejemplo 5, Ejemplo 9 o Ejemplo 17 a 25 mg de base libre/kg para cuatro dosis en intervalos de 8 h. Después de la cuarta dosis, los animales se transfirieron a jaulas metabólicas individuales y se recogió la orina durante 24 horas para la determinación de los biomarcadores urinarios. Después de recoger la orina, los ratones se sacrificaron y los riñones se extrajeron para la histopatología.

Ninguno de los animales en los grupos del Ejemplo 5 o del Ejemplo de referencia 9 mostró signos de degeneración o regeneración mediante histopatología. Por el contrario, los 6 animales tratados con PMB mostraron una regeneración tubular mínima.

En un experimento separado, el Ejemplo de referencia 17 se comparó con la PMB.

También se evaluaron los signos histopatológicos:

Comparación de la toxicidad renal del Ejemplo 5 y PMB en mono Cynomolgus

A monos Cynomolgus macho (n = 3) se les dosificó una infusión intravenosa durante 1 h a 20 mg/kg/dosis, 3 veces al día durante 7 días con el Ejemplo 5. En un experimento separado, a los monos macho (n = 3) se les administró PMB durante el mismo periodo a 4 mg/kg/dosis. En ambos experimentos, a los animales de control se les dosificó 3 veces al día una solución salina.

Al final del periodo de 7 días, se tomaron muestras de sangre y se determinaron los niveles séricos de nitrógeno ureico en sangre y creatinina como indicadores de daño renal. En el caso del Ejemplo 5, los niveles medios de BUN y creatinina se elevaron en menos del 50 % en comparación con los animales de control con solución salina. Sin embargo, para los animales que recibieron PMB, el nivel de BUN se elevó al 76 % en comparación con los animales de control y el nivel de creatinina fue del 2,6 x más alto.

Los riñones se extrajeron al final del periodo de dosificación de 7 días y se examinaron microscópicamente. De los tres animales tratados con PMB, 2 mostraron degeneración tubular leve y 1 mínima. De los animales tratados con el Ejemplo 5, 1 mostró una degeneración tubular leve y 2 mostraron una degeneración mínima.

La dosis en estos experimentos fue un 5 x más alta para el Ejemplo 5 que para PMB pero se redujeron los signos de toxicidad renal. La exposición al fármaco de un ciclo de dosificación el día 7 de la dosis (AUC0-8 h) fue de 234 pg.h/ml para el Ejemplo 5 y 117 pg.h/ml para PMB.

Eficacia de los compuestos en un modelo de muslo murino neutropénico infectado con E. coli ATCC 25922Después de hacerlos neutropénicos (ciclofosfamida 150 mg/kg d-4, 100 mg/kg d-1), se inocularon ratones CD-1 (n = 5) en cada muslo con aprox. 105 ufc deE. coliATCC25922. A los ratones se les administró una dosis intravenosa de 0,125, 0,5 y 3 mg/kg de sulfato de PMB o compuesto de ensayo (base libre de peso equivalente) 1, 3,5 y 6 h después de la infección. 9 h después de la infección, los ratones se sacrificaron y los muslos se prepararon para el recuento de colonias.

La disminución en los recuentos de colonias en relación con el vehículo de control se muestra en la tabla a continuación. En cada caso, la disminución observada con PMB en el mismo experimento se muestra entre paréntesis:

Todos los compuestos fueron eficaces de forma similar para PMB.

Eficacia de los compuestos en un modelo de musculo murino neutropénico infectado con K. Pneumoniae ATCC 43816Después de hacerlos neutropénicos (ciclofosfamida 150 mg/kg d-4, 100 mg/kg d-1), se inocularon ratones CD-1 (n = 5) en cada muslo con aprox. 105 ufc deK. pneumoniaeATCC43816. A los ratones se les administraron IV dosis adecuadas de sulfato de PMB o compuesto de ensayo (base libre de peso equivalente) 2, 6 y 10 h después de la infección. 16 h después de la infección, los ratones se sacrificaron y los muslos se prepararon para el recuento de colonias.

La disminución en los recuentos de colonias en relación con el vehículo de control se muestra en la tabla a continuación. En cada caso, la disminución observada con PMB en el mismo experimento se muestra entre paréntesis:

Ambos compuestos fueron eficaces de forma similar para PMB.

Eficacia de los compuestos en un modelo de musculo murino neutropénico infectado con A. baumannii NCTC13301Después de hacerlos neutropénicos (ciclofosfamida 150 mg/kg d-4, 100 mg/kg d-1), se inocularon ratones CD-1 (n = 5) en cada muslo con aprox. 105 ufc deA. baumanniiNCTC13301. A los ratones se les administró una dosis intravenosa de 0,125, 0,5, 1 y 4 mg/kg de sulfato de PMB o compuesto de ensayo (base libre de peso equivalente) 2, 6 y 10 h después de la infección. 16 h después de la infección, los ratones se sacrificaron y los muslos se prepararon para el recuento de colonias.

La disminución en los recuentos de colonias en relación con el vehículo de control se muestra en la tabla a continuación. En cada caso, la disminución observada con PMB en el mismo experimento se muestra entre paréntesis:

Ambos compuestos fueron eficaces de forma similar para PMB.

Eficacia de los compuestos en un modelo de pulmón murino neutropénico infectado con A. baumannii NCTC13301Después de hacerlos neutropénicos (ciclofosfamida 200 mg/kg d-4, 150 mg/kg d-1), se inocularon ratones CD-1 (n = 8) por vía intranasal con aprox. 107 ufc por pulmón deA. baumanniiNCTC13301. A los ratones se les administró SC sulfato de PMB (20 mg/kg) o dosis apropiadas de compuesto de ensayo (base libre de peso equivalente) 2, 6 y 10 h después de la infección. 16 h después de la infección, los ratones se sacrificaron y los pulmones se prepararon para el recuento de colonias.

La disminución en los recuentos de colonias en relación con el vehículo de control se muestra en la tabla a continuación. En cada caso, la disminución observada con PMB en el mismo experimento se muestra entre paréntesis:

La PMB no fue eficaz en este modelo a la dosis máxima tolerada. El ejemplo 5 fue más eficaz a 20 mg/kg y también podría administrarse a niveles más altos para lograr un mayor efecto debido a la toxicidad reducida.

Eficacia de los compuestos en un modelo de pulmón murino neutropénico infectado con P. aeruginosa ATCC 27853Después de hacerlos neutropénicos (ciclofosfamida 200 mg/kg d-4, 150 mg/kg d-1), se inocularon ratones CD-1 (n = 8) por vía intranasal con 104 - 105 ufc por pulmón deP. aeruginosaATCC27853. A los ratones se les administraron SC dosis adecuadas de sulfato de PMB o compuesto de ensayo (base libre de peso equivalente) 2, 6 y 10 h después de la infección. 16 h después de la infección, los ratones se sacrificaron y los pulmones se prepararon para el recuento de colonias.

La disminución en los recuentos de colonias en relación con el vehículo de control se muestra en la tabla a continuación. En cada caso, la disminución observada con PMB en el mismo experimento se muestra entre paréntesis:

Ambos compuestos mostraron una eficacia superior a PMB en este modelo.

Valores de MIC para el Ejemplo 5 en presencia de Rifampicina

Los valores de MIC (|jg/ml) se determinaron mediante microdilución en caldo en condiciones CLSI.

Tanto PMB como el Ejemplo 5 muestran una fuerte sinergia con la rifampicina incluso contra cepas con susceptibilidad reducida a las polimixinas.

Estudio estereoquímico

Los compuestos de la invención contienen un estereocentro en la posición p del grupo Y-aminopropilo en el resto N-terminal. Sorprendentemente, se ha encontrado que uno de los estereoisómeros en esta posición está usualmente asociado con una menor citotoxicidad y menores niveles de fármacos en el riñón. Este es el estereoisómero que se eluye más rápidamente en la cromatografía de fase inversa.

Por ejemplo, en el par de diastereoisómeros relacionados con los Ejemplos 5 y 6, el diastereómero que se eluye más rápido de una columna de HPLC de fase inversa muestra una menor exposición renal y menor citotoxicidad que el isómero más lento correspondiente. El diastereómero más rápido (Ejemplo 5) se deriva del ácido (S)-4-amino-3-(3-clorofenil butanoico), mediante análisis de rayos X de molécula pequeña del aminoácido correspondiente (como se muestra en el siguiente esquema).

Esquema 1

Isómero lento en RP-HPLC

véase Ejemplo 6

Se muestran comparaciones adicionales en la Tabla 3 a continuación. Los diastereómeros (epímeros en el grupo N-terminal) que se eluyen más rápidamente en la cromatografía de fase inversa, y que tienen desplazamientos químicos de RMN similares a los dados para el Ejemplo 5, probablemente tengan la misma estereoquímica absoluta que el Ejemplo 5, como se ha descrito anteriormente.

La estereoquímica absoluta asignada a cada uno de los compuestos en la Tabla 3 se muestra en la Tabla 1. Los ejemplos de referencia están marcados con un asterisco (*).

Tabla 3 - Resultados de estereoquímica

La citotoxicidad se refiere a la CI50 medida en relación con la registrada para la Polimixina B contra una línea celular HK-2.

El nivel de fármaco se refiere a la cantidad de compuesto encontrada en el riñón 4 horas después de una dosis sc de 17,2 mg/kg (pg/g) en un modelo de ratón.

Datos adicionales

Toxicidad renal del Ejemplo de referencia 24 en comparación con PMB después de cuatro dosis en ratón

A grupos de ratones macho CD-1 (n = 5) se les administró por vía subcutánea cuatro veces en intervalos de 8 h Polimixina B (PMB) a 12,5 o 25 mg de base libre/kg, o el compuesto del Ejemplo de referencia 24 a 25, 50 o 75 mg de base libre/kg. Inmediatamente después de la cuarta dosis, los ratones se transfirieron a jaulas metabólicas y se recogió la orina durante 24 h para la determinación de biomarcadores urinarios. Después de la recolección de orina, los ratones se sacrificaron para la histopatología renal. Los niveles medios de biomarcadores se muestran en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4 - Biomarcadores urinarios

Los biomarcadores urinarios se normalizaron con respecto a la creatinina urinaria.

Para los cinco biomarcadores, la expresión a 50 mg/kg del Ej. 24 fue menor que a 25 mg/kg de PMB, y para dos (Kim-1, NGAL), la expresión de los cinco biomarcadores a 75 mg/kg de dosis fue menor que para PMB a 25 mg/kg.

Los resultados de la histopatología se muestran en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5 - Resultados de histopatología

La histopatología renal a la dosis de 50 mg/kg del Ejemplo de referencia 24 fue menos grave que para PMB a una dosis de 25 mg/kg, y la histopatología renal fue similar a una dosis de 75 mg/kg del Ejemplo 24 en comparación con una dosis de PMB a 25 mg/kg.

Referencias

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Dolomanov et al. J. Appl. Cryst. 42, 2009, 339

Felluga et al. Tetrahedron Asymmetry, 19, 2008, 945

Sheldrick Acta Cryst. A71, 2015, 3-8

Sheldrick Acta Cryst. C71, 2015, 3-8

Vaara et al. Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 52, 2008. 3229

Velkov et al. ACS Chem. Biol. 9, 2014, 1172

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WO 2014/188178

WO 2016/083531

WO 2013/072695

WO 2015/135976

WO 2017/054047

US 2012/316105

WO 2016/166103

Koh et al. Amino Acids 2017, 49, 1653

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de Fórmula (II):

   y sales, solvatos y formas protegidas del mismo.
2. 2. Un compuesto de fórmula (II) de acuerdo con la reivindicación 1, que es un compuesto:

   y sales, solvatos y formas protegidas del mismo.
3. 3. Un compuesto de fórmula (II) de acuerdo con la reivindicación 1, que es un compuesto:

   y sales, solvatos y formas protegidas del mismo.
4. 4. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, opcionalmente junto con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.
5. 5. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 para uso en un procedimiento de tratamiento o profilaxis.
6. 6. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4 para uso en un procedimiento de tratamiento de una infección microbiana, tal como una infección bacteriana.
7. 7. Un compuesto o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la infección microbiana es una infección bacteriana Gram-negativa, tal como una infección por una bacteria Gram-negativa seleccionada deEscherichia spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Citrobacter spp., Morganella morganii, Yersinia pseudotuberculosis y otras Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio,bacterias del ácido acético,Legionellay alfaproteobacterias.