RS65128B1 - Jedinjenja - Google Patents

Description

Opis

Povezana aplikacija

[0001] Ovaj predmet traži prednosti i prioritet u odnosu na US 62/689602 podnetu 25. juna 2018. (25.06.2018).

Polje pronalaska

[0002] Ovaj pronalazak se odnosi na nova polimiksina jedinjenja, na farmaceutske kompozicije koje uključuju jedinjenja i na upotrebu jedinjenja i farmaceutskih kompozicija za medicinski tretman, na primer, tretman mikrobnih infekcija, posebno infekcija sa gramnegativnim bakterijama.

Poreklo

[0003] WO 2013/072695 i WO 2014/188178 opisuju derivate polimiksina u kojima su N-terminalni masni acil ostatak i susedni ostatak diaminobutirne kiseline Polimiksin B ili Kolistina zamenjeni sa terminalnom grupom koja ima amino supstituent. Ovakvi derivati imaju dobru antibakterijsku aktivnost uz smanjenu citotoksičnost.

[0004] WO 2015/135976 takođe opisuje derivate polimiksina u kojima su ponovo N-terminalni masni acil ostatak i susedna diaminobutirna kiselina Polimiksin B i Kolistina zamenjeni sa terminalnom grupom koja ima amino supstituent. U ovom slučaju, pokazano je da su specifični položaj amino supstituenta i položaj drugih supstituenata u N-terminalnom ostatku važni za jaku antimikrobnu aktivnost na niz ključnih patogena, kao što su Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Acinetobacter baumannii. Otkrivena jedinjenja takođe zadržavaju malu citotoksičnost.

[0005] WO 2016/083531 opisuje derivate polimiksina u kojima su ponovo N-terminalni masni acil ostatak i susedna diaminobutirna kiselina Polimiksin B i Kolistina zamenjeni sa terminalnom grupom koja ima amino supstituent, kao što su grupe predstavljene u WO 2013/072695, WO 2014/188178 i WO 2015/135976. Dodatno, ostaci amino kiseline na položajima 6 i/ili 7 su supstituisani u odnosu na Polimiksin B i Kolistin.

[0006] WO 2017/054047 opisuje derivate polimiksin dekapeptida u kojima je N-terminalni masni acil ostatak Polimiksin B zamenjen sa terminalnom grupom koja ima aromatičnu funkcionalnu grupu. Pored toga, ostatak amino kiseline na položaju 3 i ostaci amino kiselina na položajima 6 i/ili 7 su supstituisani u odnosu na Polimiksin B.

[0007] US 2012/316105 opisuje derivate polimiksin dekapeptida u kojima je N-terminalni masni acil ostatak Polimiksin B obično zamenjen sa terminalnom grupom koja ima aromatičnu funkcionalnu grupu. Pored toga, ostatak amino kiseline na položaju 3 je supstituisan u odnosu na Polimiksin B.

[0008] WO 2016/166103 opisuje derivate polimiksina u kojima su ponovo N-terminalni masni acil ostatak i susedna diaminobutirna kiselina Polimiksin B ili Kolistina zamenjeni sa terminalnom grupom koja ima aromatičnu funkcionalnu grupu. .

[0009] Koh i saradnici su dali pregled antimikrobnih sredstava. Između ostalog, Koh i saradnici su razmatrali primere iz US 2012/316105. Da bi bili korisniji za parenteralnu terapiju sistemskih infekcija od trenutno raspoloživih polimiksina, novi derivati polimiksina moraju da imaju bar istu aktivnost kao i ovi poznati polimiksini a da imaju značajno manju renalnu toksičnost in vivo.

Kratak sadržaj pronalaska

[0010] Pronalazak je definisan u pripadajućim patentnim zahtevima.

[0011] Generalno, pronalazak obezbeđuje jedinjenja koja imaju deacilovano polimiksin jezgro kao što je nonapeptid jezgro Polimiksin B ili Kolistin sa ostatkom amino kiseine na položaju 3 supstituisanim sa L-Dap, koja ima -C(O)-CH2CH(3-Cl-Ph)CH2NH2grupu, kako je ovde definisano, na svom N terminusu. Ova jedinjenja su našla primenu u postupku tretmana ili profilakse, opciono u kombinaciji sa drugim aktivnim sredstvom. Jedinjenja mogu da se koriste za lečenje mikrobne infekcije kao što je infekcija Gram-negativnim bakterijama.

[0012] Pokazano je da jedinjenja iz ovog pronalaska imaju malu citotoksičnost uravnoteženu sa prihvatljivim vrednostima leka u bubrezima nakon parenteralnog doziranja. Pokazano je da su jedinjenja iz ovog pronalaska superiorna u odnosu i na Polimiksin B, kao i na jedinjenja modifikovanog polimiksina poznatog u tehnici, uključujući ona koja su prethodno zabeležena od strane ovog podnosioca. Ova superiornost se manifestuje jednom ili više od sledećih karakteristika: manja citotoksičnost, prihvatljive vrednosti leka u bubrezima (to jest, prihvatljiva renalna toksičnost, koja je rezultat toga što vrednosti leka u bubregu nisu visoke) nakon parenteralnog doziranja, efikasnost u modelima butina i pluća miševa i/ili superiorna MIC protiv patogenih bakterijskih sojeva, dok su u ostalim karakteristikama ekvivalentni sa jedinjenjima iz prethodnog stanja tehnike.

[0013] Jedinjenja poznata u tehnici obično ispoljavaju jednu ili možda dve od ovih karakteristika koje im daju prednost, ali ne sve. Na primer, sada je relativno često da se pronađu jedinjenja polimiksina koja imaju manju citotoksičnost, ali je ova manja citotoksičnost često praćena smanjenom antibakterijsom aktivnošću. Dalje, jedinjenja koja imaju manju citotoksičnost mogu nakon doziranja ipak da se nađu u velikim vrednostima u bubrezima. Ova jedinjenja su stoga i dalje toksična i nisu korisna u postupcima medicinskog tretmana.

[0014] U prvom aspektu pronalaska, dato je jedinjenje formule (II) i njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvati i njegovi zaštićeni oblici.

[0015] Jedinjenje formule (II) je predstavljeno na ovaj način:

[0016] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje formule (II), opciono zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.

[0017] U narednom aspektu, dato je jedinjenje formule (II), ili farmaceutska kompozicija koja uključuje jedinjenje formule (II), za upotrebu u postupku tretmana ili profilakse.

[0018] U još jednom aspektu, ovde je dato jedinjenje formule (II), ili farmaceutska kompozicija koja uključuje jedinjenje formule (II), za upotrebu u postupku lečenja mikrobne infekcije.

[0019] Mikrobna infekcija može da bude bakterijska infekcija, kao što je infekcija Gramnegativnim bakterijama. Infekcija Gram-negativnim bakterijama može da bude izabrana iz grupe koja se sastoji od Escherichia spp., Klebsiella spp., Enterobacter- spp., Salmonella spp., Shigella spp., Citrobacter spp. i drugih Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Stenotrophomonas i Legionella.

[0020] Ovde su opisani postupci za izradu jedinjenja formule (II) kao i međuproizvoda jedinjenja za upotrebu u izradi jedinjenja formule (II).

[0021] Ovi i drugi aspekti i ostvarenja pronalaska su niže detaljno opisani.

Detaljan opis pronalaska

[0022] Ovaj pronalazak obezeđuje jedinjenja formule (II) kako je niže detaljno opisano, za upotrebu u medicinskom tretmanu, opciono zajedno sa drugim aktivnim sredstvom.

[0023] U širem smislu, jedinjenja formule (II) imaju polimiksin jezgro, koje je nonapeptid jezgro i grupu -C(O)-CH2CH(3-Cl-Ph)CH2NH2na N-terminusu polimiksin jezgra. Grupa vezana za -C(O)- je supstituisana γ-aminopropil grupa. γ-aminopropil grupa je supstituisana na β-položaju u odnosu na -C(O)- radikal sa 3-Cl-Ph.

[0024] Ostatak prve amino kiseline je egzociklični lanac jedinjenja iz pronalaska – koji odgovara položaju 3 u polimiksinu – je L-Dap ostatak (diaminopropionatna kiselina), pre nego L-Dab ostatak (L-diaminobutirna kiselina), kako je prisutno u Polimiksin B i Kolistin.

[0025] Ostaci amino kiselina na položajima 6 i 7 polimiksin jedinjenja (po numeraciji korišćenoj za polimiksin) odgovaraju ostacima amino kiselina prisutnim u Polimiksin B.

[0026] Da bi bili korisniji za parenteralnu terapiju sistemskih infekcija nego trenutno poznate serije jedinjenja polimiksina, novi derivati polimiksina moraju bar da dostignu antibakterijsku aktivnost koju imaju poznata jedinjenja polimiksina a da imaju značajno manju renalnu toksičnost in vivo.

[0027] Sada je otkriveno da nije dovoljno da jedinjenja polimiksina ispoljavaju manju toksičnost, jer ona često nije povezana sa smanjenom toksičnošću in vivo. Prema tome, akumulacija leka u bubrezima i njegov klirens iz bubrega mora takođe da bude povoljan. Drugim rečima, kombinacija citotoksičnosti i nivoa leka u bubrezima nakon parenteralnog doziranja je ono što dovodi do povoljnog profila toksičnosti in vivo.

[0028] Ovo može da se pokaže preko primera poređenja pokazanog u niže datoj Tabeli A, gde se PMBN odnosi na nonapeptidno jezgro Polimiksin B a PMEN se odnosi na nonapeptidno jezgro Polimiksin E, sa pokazanim supstitucijama na ostacima amino kiselina na položajima 3 i 6 (u skladu sa numeracijom za polimiksin), gde odgovarajući (na primer, Dap zamenjuje Dab na položaju 3, a cikloheksilalanin (CHA) zamenjuje fenilalanin na položaju 6).

Tabela A

[0029] Citotoksičnost se odnosi na izmerenu IC50u odnosu na vrednost zabeleženu za Polimiksin B prema HK-2 ćelijskoj liniji. Vrednost leka se odnosi na količinu jedinjenja (µg/g bubrega) nađenu u bubrezima za 4 ili 16 sati nakon 17.2 mg/kg sc doze kod miševa.

* Jedinjenja su dozirana ili u 4 doze sa razmakom od 8 h po 25 mg slobodne baze/kg/dozi ili 4 dana tid u intervalima od po 4 sata sa 17.2 mg slobodne baze/kg/dozi. Nakon doziranja, urin se sakuplja nakon 16-24 h da se odrede urinarni biomarkeri za renalnu toksičnost (KIM-1, albumin, cistatin C). Jedinjenja su graduisana kao - (nema razlike u odnosu na kontrolu) do +++ (jak odgovor za sve biomarkere).

** U WO 2015/135976 brojka 13.3 je navedena za ovo jedinjenje (Primer D77). Ovo jedinjenje je sada još dva puta testirano a relativna vrednost je izračunata na osnovu vrednosti za PMB u istom eksperimentu. Srednja vrednost je bila 23.

*** U WO 2016/083531 IC50od 255 µg/mL je navedena za ovo jedinjenje (Primer 38) nasuprot 12 µg/mL za Polimiksin B. Međutim, broj za PMB korišćen u ovoj aplikaciji je srednja vrednost iz više eksperimenata. Ovde data brojka od 9.2 je dobijena poređenjem sa IC50vrednošću za PMB određenom u istom eksperimentu.

[0030] Ovaj podnosilac prijave je prethodno u WO 2015/135976 otkrio polimiksin nonapeptide sa N-terminalnom γ-aminopropil grupom supstituisanom sa fenil ili benzil ostatkom. Međutim, fenil ili benzil supstituent je dat na α-položaju, pre nego na β-položaju, u odnosu na -X- grupu. WO 2015/135976 takođe opisuje polimiksin nonapeptid sa N-terminalnom β-aminoetil grupom supstituisanom na α-položaju sa benzil grupom. Ovde je amino funkcionalna grupa data na β-položaju pre nego na γ-položaju, u odnosu na -X-grupu.

[0031] Mada ova poznata jedinjenja pokazuju obećavajuću aktivnost i umereno poboljšanu citotoksičnost u poređenju sa Polimiksin B, ova jedinjenja su inferiorna u odnosu na jedinjenja iz ovog pronalaska po tome što ne pokazuju kombinaciju male citotoksičnosti izbalansiranu sa prihvatljivim vrednostima u bubrezima nakon doze.

[0032] Ovo je pokazano u primeru poređenja u niže datoj Tabeli B, gde se PMBN odnosi na Polimiksin B nonapeptid jezgro, supstitucijama ostatka amino kiseline na položaju 3, kada je to odgovarajuće (na primer, Dap koji zamenjuje Dab na položaju 3).

Tabela B

[0033] Ovaj podnosilac je prethodno u WO 2016/083531 otkrio polimiksin nonapeptide sa modifikovanim N-terminalnim grupama, posebno onim koje uključuju β-aril ili β-aralkil grupe. Međutim, ova poznata jedinjenja imaju lipofilni ostatak amino kiseline na položaju 6, kao što je cikloheksilalanin ostatak, dok jedinjenja u ovom slučaju imaju, na primer, fenilalanin, leucin, norleucin, valin ili norvalin ostatak na položaju 6. Ova poznata jedinjenja su takođe inferiorna u odnosu na jedinjenja iz ovog pronalaska u pogledu loše kombinacije citotoksičnosti i nivoa leka u bubrezima nakon doze.

[0034] Ovo je pokazano poređenjem primera u niže datoj Tabeli C, gde se PMBN odnosi na Polimiksin B nonapeptid jezgro, sa pokazanim supstitucijama na ostacima amino kiselina na položajima 3 i 6, gde je to odgovarajuće (na primer, Dap zamenjuje Dab na položaju 3, a cikloheksilalanin (CHA) zamenjuje fenilalanin na položaju 6).

Tabela C

[0035] Jedinjenja 50 i 58 su poznata iz WO 2016/083531 i ovo su jedinjenja koja su u tom slučaju identifikovana kao Izomer 1.

Polimiksin jedinjenja

[0036] Jedinjenja formule (II) su N-terminalni derivati jedinjenja polimiksin nonapeptid serija. Jezgro jedinjenja formule (II) je derivat Polimiksin B nonapeptida (PMBN, Polimiksin B 2-10), gde je ostatak amino kiseline na položaju 3 supstituisan sa L-Dap. Jedinjenja formule (I) imaju -C(O)-CH2CH(3-Cl-Ph)CH2NH2grupu na N terminusu polimiksin jezgra. Ovo je niže detaljno opisano.

[0037] Jedinjenja iz pronalaska sadrže stereocentar na β-položaju γ-aminopropil grupe u N-terminalnom ostatku. Nađeno je da je jedan od stereoizomera povezan sa manjom citotoksičnošću i manjim vrednostima leka u bubrezima. Ovaj stereoizomer je stereoizomer koji mnogo brže eluira pri reverzno faznoj hromatografiji, kako je detaljno opisano u primerima izrade ovog slučaja.

[0038] Jedinjenje formule (II) ima nonapeptidno jezgro i grupu -C(O)-CH2CH(3-Cl-Ph)CH2NH2na N terminusu polimiksin jezgra. Grupa koja je vezana za -C(O)- je supstituisana γ-aminopropil grupa. γ-aminopropil grupa je supstituisana na β-položaju u odnosu na -C(O)- ostatak sa m-Cl-Ph. Supstituisana γ-aminopropil grupa može da se predstavi na sledeći način:

[0039] U jednom ostvarenju, supstituisana γ-aminopropil grupa može da se predstavi na sledeći način:

Jedinjenje (II)

[0040] Jedinjenje formule (II) je niže pokazano:

i njegove soli, solvati i zaštićeni oblici.

[0041] Jedinjenje formule (II) može da bude jedinjenje formule (IIa) kako je niže pokazano:

i njegove soli, solvati i zaštićeni oblici.

[0042] Jedinjenje formule (II) može da bude jedinjenje formule (IIb) kako je niže pokazano:

i njegove soli, solvati i zaštićeni oblici.

Polimiksin jedinjenja

[0043] Jedinjenja za upotrebu u ovom predmetu su bazirana na modifikovanim oblicima poznatih polimiksin jedinjenja, kao što su Polimiksin B nonapeptid i Kolistin nonapeptid. Polimiksin B nonapeptid ima strukturu kako je niže pokazano:

gde su označeni položaji 2, 4 i 10 (prema sistemu numeracije korišćenim za Polimiksin B dekapeptid), a ostaci amino kiselina su u L-konfiguraciji, ukoliko nije drugačije navedeno.

[0044] Jedinjenja iz pronalaska su derivati polimiksin B nonapeptida, gde je (i) N terminalna amino grupa, -NH2, zamenjena sa -NH-C(O)-CH2CH(3-Cl-Ph)CH2NH2grupom kako je ovde opisano; i (ii) ostatak amino kiseline na položaju 3 je supstituisan sa L-Dap.

Postupci sinteze

[0045] Izrada jedinjenja iz pronalaska biće poznata stručnjaku sa iskustvom u tehnici, posebno ukoliko imaju znanja o postupcima opisanim u WO 2015/135976 za izradu modifikovanih polimiksin nonapeptida. Postupci opisani u tehnici mogu jednostavno da se prilagode za primenu u izradi jedinjenja iz ovog predmeta, uzimajući u obzir nove N terminalne grupe korišćene u ovom predmetu.

[0046] Generalno, jedinjenje iz pronalaska može da se izradi udvajanjem odgovarajuće zaštićenog polimiksin nonapeptid međuproizvoda sa karboksilnom kiselinom koja ima supstituisanu γ-aminopropil grupu. Produkt ove reakcije je obično zaštićeni oblik jedinjenja formule (II). Uklanjanje zaštitnih grupa može da se izvrši po želji. Ovo je opšta strategija poznata iz WO 2015/135976.

[0047] Pogodan zaštićeni nonapeptid međuproizvod može kao takav da se izradi u skladu sa postupcima datim u WO 2015/135976. Kako je ovde opisano, odgovarajuće zaštićeni nonapeptid međuproizvod može takođe da se izradi sintezom linearnog nonapeptida u čvrstoj fazi, nakon toga cepanjem linearnog oblika iz čvrstog nosača a nakon toga ciklizacijom linearnog oblika između amino ostataka na položajima 4 i 10.

[0048] Jedinjenja iz pronalaska mogu da se izrade uobičajenim sintezama peptida, koristeći postupke poznate stručnjaku sa iskustvom u tehnici. Pogodni postupci uključuju sintezu čvrste faze kao što su opisali Visser i saradnici, J. Peptide Res, 61, 2003, 298- 306, Vaara i saradnici, Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 52, 2008.3229-3236, ili Velkov i saradnici, ACS Chem. Biol.9, 2014, 1172. Ovi postupci uključuju pogodnu strategiju zaštite i postupke za fazu ciklizacije.

[0049] Kada je potrebno, jedinjenje formule (II) može bar delimično da bude prečišćeno, na primer da se odvoje diastereomerni oblici produkta.

Zaštićeni oblici

[0050] Jedinjenja formule (II) mogu da se obezbede u zaštićenom obliku. U ovom slučaju, reaktivne funkcionalne grupe, kao što je amino grupa, mogu da se maskiraju da se spreči njihova reakcija u toku faze sinteze. Zaštitna grupa se uvodi da maskira reaktivnu funkcionalnu grupu i ove zaštitne grupe mogu da se uklone u kasnijoj fazi sinteze da se oslobodi originalna reaktivna funkcionalna grupa.

[0051] U jednom ostvarenju, zaštićeni oblik je jedinjenje u kome je amino, hidroksilna, tiolna i/ili karboksilna funkcionalna grupa zaštićena (maskirana) zaštitnom grupom. U jednom ostvarenju, zaštićeni oblik je jedinjenje u kome su zaštićene funkcionalne grupe bočnog lanca ostataka amino kiselina iz jedinjenja.

[0052] U Jedinjenju formule (II), ostaci amino kiselina na položajima 5, 8 i 9 su Dab ostaci, a bočni lanac Dab ostatka uključuje amino funkcionalnu grupu. Funkcionalna grupa amino kiseline svakog Dab ostatka može da se zaštiti sa amino zaštitnom grupom, kako je ovde opisano. Slično tome, ostatak amino kiseline na položaju 3 je Dap a bočni lanac ostatka ove amino kiseline ukjučuje amino funkcionalnu grupu.

[0053] N terminalna grupa je supstituisana γ-aminopropil grupa. Amino funkcionalna grupa može da bude zaštićena sa amino zaštitnom grupom, kako je ovde opisano.

[0054] Zaštitne grupe, kao što su one za ostatke amino kiselina, su dobro poznate i dobro opisane u tehnici.

[0055] Amino kiseline koje imaju zaštićenu bočnu grupu, opciono zajedno sa amino i karboksi zaštitom, su raspoložive na tržištu. Prema tome, zaštićeno polimiksin jedinjenje može da se izradi od odgovarajuće zaštićene amino kiseline kao početnog materijala..

[0056] Velkov i saradnici opisuju postepenu izradu polimiksin jedinjenja na čvrstoj fazi koristeći odgovarajuće zaštićenu amino kiselinu. Otkrivena je upotreba zaštićenih oblika treonina i Dab (videti dodatne informacije).

[0057] Kada se koristi, zaštitna grupa treba da bude takva da može da se ukloni pod uslovima koji značajno ne narušavaju strukturu polimiksin jezgra, na primer, uslovima koji ne menjaju stereohemiju ostataka amino kiseline.

[0058] U jednom ostvarenju, zaštitne grupe su kiselo labilne, bazno labilne, ili mogu da se uklone pod uslovima redukcije.

[0059] Primer zaštitnih grupa za amiono funkcionalnu grupu uključuje Boc (tercbutoksikarbonil), Bn (benzil, Bzl), CbZ (benziloksikarbonil, Z), 2-Cl-Z (2-hlor), ivDde (1-[4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden]-3-metilbutil), Fmoc (fluorenilmetiloksikarbonil), HSOs-Fmoc (sulfonilovani Fmoc, kao što je 2-sulfo-Fmoc, kako je opisano u, na primer Schechter i saradnici, J.Med Chem 2002, 45 (19) 4264), Dde (1-[4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden]etil), Mmt (4-metoksitritil), Mtt (4-metiltritil), Nvoc (6-nitroveratroiloksikarbonil), Tfa (trifluroacetil) i Alloc (aliloksikarbonil).

[0060] Primer zaštitnih grupa za aromatičnu azotnu funkcionalnu grupu uključuje Boc, Mtt, Trt i Dnp (dinitrofenil).

[0061] U jednom ostvarenju, zaštitna grupa za amino funkcionalnu grupu je izabrana od Boc, ivDde , CbZ, Bn i Fmoc i HSOs-Fmoc.

[0062] U jednom ostvarenju, zaštitna grupa za amino funkcionalnu grupu je Boc, ivDde, Fmoc ili CbZ, kao što su Boc, ivDde ili Cbz.

[0063] Boc zaštita može da se obezbedi za amino funkcionalnu grupu prisutnu u bočnim lancima ostataka amino kiseline prisutnim na položajima 5, 8 i 9 i opciono na položaju 3..

[0064] Primer zaštitnih grupa za hidroksilnu funkcionalnu grupu uključuje Trt (tritil), Bn (benzil) i tBu (terc-butil).

[0065] U jednom ostvarenju, zaštitna grupa za hidroksilnu funkcionalnu grupu je tBu.

[0066] Dalji primer zaštitnih grupa uključuje silil etar zaštitne grupe, kao što su TMS, TES, TBS, TIPS, TBDMS i TBDPS. Ove zaštitne grupe mogu na primer da se uklone sa TBAF.

[0067] Primer zaštitnih grupa za karboksilnu funkcionalnu grupu uključuje Bn (benzil, Bz), tBu (terc-butil), TMSET (trimetilsililetil) i Dmab ({1-[4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden]-3-metilbutil}amino benzil).

[0068] Primer zaštitnih grupa za aromatičnu azotnu funkcionalnu grupu, na primer kada je ovakva funkcionalna grupa prisutna u grupi -Ar, uključuje Boc, Mtt, Trt i Dnp (dinitrofenil).

[0069] U nekim ostvarenjima, zaštćeni su samo neki tipovi funkcionalnih grupa. Na primer, mogu da budu zaštićene samo amino grupe, kao što su amino grupe u bočnom lancu ostatka amino kiseline.

[0070] U jednom ostvarenju, zaštićene su amino grupe i hidroksilne grupe.

LogP

[0071] Jedinjenje formule (II) može da ima particioni koeficijent, koji se izražava kao LogP vrednost, sa određenimi ograničenjem. Particioni koeficijent može da obezbedi indikaciju o lipofilnosti jedinjenja.

[0072] Pronalazači su utvrdili da jedinjenja koja imaju veću lipofilnost imaju nižu citotoksičnost. Jedinjenja iz pronalaska obično imaju LogP vrednosti koje su povezane sa nižom citotoksičnošću, kao što su niže opisane LogP vrednosti.

[0073] LogP vrednost za jedinjenje može da se odredi eksperimentalno (na primer podelom jedinjenja između oktanola i vode), ili može da se predvidi korišćenjem standardnih računarskih postupaka.

[0074] Na primer, referenca za LogP može da bude referenca za ALogP, koja može da se odredi postupcima koje su opisali Ghose i saradnici J. Phys. Chem. A, 1998, 102, 3762-3772. Prema tome, ALogP je Ghose/Crippen grupa-doprinosa za LogP.

[0075] U jednom ostvarenju, jedinjenje ima LogP vrednost, kao što je ALogP vrednost, od najmanje -6.5, od najmanje -6.6, od najmanje -6.7, od najmanje -6.8, od najmanje -6.9, od najmanje -7.0, od najmanje -7.5, ili od najmanje -8.0.

[0076] U jednom ostvarenju, jedinjenje ima LogP vrednost, kao što je ALogP, vrednost, od najviše -6.4, od najviše -6.3 od najviše -6.2, od najviše -6.1, od najviše -6.0, od najviše -5.9, ili od najviše -5.8.

[0077] U jednom ostvarenju, jedinjenje ima LogP vrednost u okviru opsega sa gornjim i donjim granicama koje su odgovarajuće izabrane od prethodno datih granica, na primer u rasponu od -5.8 to -8.0, kao što je -6.0 do -6.7, kao što je -6.3 do -6.7. Ovi opsezi mogu da budu izabrani kada je R<2>nesupstituisana alkil grupa.

[0078] U narednom ostvarenju, jedinjenje ima LogP vrednost u rasponu od -6.7 do -7.4. Ovaj raspon može da bude izabran kada je -R<2>alkil grupa supstituisana sa jednom hidroksilnom grupom.

[0079] Nađeno je da jedinjenja koja imaju LogP vrednosti, kao što su ALogP vrednosti, u granicama koje su prethodno diskutovane imaju odličnu aktivnost i protiv polimiksin osetljivih i polimiksin-rezistentnih bakterijskih sojeva. Jedinjenja mogu da imaju uporedivu antibakterijsku aktivnost u odnosu na polimiksin B. Kao prednost, ova jedinjenja mogu takođe da imaju smanjenu citotoksičnost u poređenju sa polimiksinom B.

[0080] Naši pronalazači su otkrili da jedinjenje koje ima optimalne LogP vrednosti može da se dobije izborom -R<15>grupe u ovom predmetu, zajedno sa odgovarajućim izborima ostataka amino kiselina na položaju 6 i/ili 7 (kao što je sa odgovarajućim izborom -R<1>i/ili

-R<2>).

Aktivno sredstvo

[0081] Svako od jedinjenja formule (II) može da se koristi zajedno sa drugim aktivnim sredstvom. Pronalazači su otkrili da ovakve kombinacije imaju veću biološku aktivnost nego što bi moglo da se očekuje od pojedinačne aktivnosti oba jedinjenja. Jedinjenja formule (II) mogu da se koriste da pojačaju aktivnost drugog aktivnog sredstva. Preciznije, jedinjenja formule (II) mogu da se koriste zajedno da drugim aktivnim sredstvom da pojačaju antimikrobnu aktivnost tog sredstva, na primer, protiv Gram-negativnih bakterija.

[0082] Bez želje da se veže za teoriju, veruje se da jedinjenja formule (II) deluju na spoljašnju membranu ćelije, na primer ćeliju Gram-negativne bakterije, da omoguće preuzimanje drugog aktivnog sredstva u ćeliji. Prema tome, sredstva koja inače nisu sposobna ili slabo prolaze spoljašnju membranu mogu da dospeju u ciljanu ćeliju delovanjem jedinjenja formule (II).

[0083] U jednom ostvarenju, kombinacija jedinjenja formule (II) sa drugim aktivnim sredstvom je aktivna protiv Gram-negativnih bakterija. Ovde, nije neophodno da pojedinačno ili jedinjenje formule (II) ili drugo aktivno sredstvo deluju protiv Gram-negativnih bakterija.

[0084] U jednom ostvarenju, drugo aktivno sredstvo je sredstvo koje ima izmerenu MIC vrednost protiv određenog mikroorganizma, kao što je bakterija, koja je manja od 10, manja od 5, ili manja od 1 mikroorganizam/mL. Mikroorganizam može da bude Gram-negativna bakterija kao što je Gram-negativna bakterija izabrana iz grupe koja se sastoji od E. coli, S. enterica, K. pneumoniae, K. oksitoca; E. cloacae, E. aerogenes, E. agglomerans, A. calcoaceticus, A. baumannii; Pseudomonas aeruginosa i Stenotrophomonas maltophila.

[0085] Primeri drugih aktivnih sredstava koja deluju protiv Gram-negativnih bakterija uključuju beta-laktame, tetracikline, aminoglikozide i hinolone.

[0086] U jednom ostvarenju, drugo aktivno sredstvo je sredstvo koje ima izmerenu MIC vrednost protiv određenog mikroorganizma, kao što je Gram-negativna bakterija, koja je veća od 4, veća od 8, veća od 16 ili veća od 32 mikroorganizma/mL. U ovom ostvarenju, drugo aktivno sredstvo može da bude aktivno protiv Gram-pozitivnih bakterija. Na primer, drugo aktivno sredstvo je sredstvo koje ima izmerenu MIC vrednost protiv određene Gram-pozitivne bakterije koja je manja od 10, manja od 5 ili manja od 1 mikroorganizam/mL. Ovde, jedinjenje formule (II) deluje da omogući preuzimanje drugog aktivnog sredstva u ćeliju Gram-negativne bakterije. Na taj način je drugo aktivno sreredstvo sposobno da deluje na cilj u okviru ćelije Gram-negativne bakterije, pri čemu cilj može da bude isti kao i cilj drugog aktivnog sredstva u ćeliji Gram-pozitivne bakterije.

[0087] Gram-pozitivna bakterija može da bude izabrana iz grupe koja se sastoji od Staphylococcus i Streptococcus bacteria, kao što su S. aureus (including MRSA), S. epidermis, E. faecalis i E. faecium.

[0088] Primeri drugih aktivnih sredstava koja deluju protiv Gram-pozitivnih bakterija (sa MIC vrednostima kako je prethodno dato, na primer) i umereno deluju protiv Gramnegativnih bakterija, uključuju rifampicin, novobiocin, makrolide, pleuromutiline. U jednom ostvarenju, jedinjenje koje ima umerenu aktivnost protiv Gram-negativnih bakterija može da ima izmerenu MIC vrednost protiv Gram-negativne bakterije koja je manja od 32, manja od 64 ili manja od 28 mikrograma/mL.

[0089] Za upotrebu su takođe pogodna sredstva koja imaju aktivnost protiv Gram-pozitivnih bakterija a koja su u osnovi inaktivna protiv Gram-negativnih bakterija. Primeri uključuju fusidinsku kiselinu, oksazolidine (na primer, linezolid), glikopeptide (na primer vankomicin), daptomicin i lantobiotike. U jednom ostvarenju, jedinjenje koje u osnovi ne deluje protiv amnegativnih bakterija može da ima izmerenu MIC vrednost protiv Gram-negativnih bakterija koja je već od 32, veća od 64, veća od 128, veća od 256 mikroorganizama/mL.

[0090] Pod normalnim uslovima ova sredstva nisu u suštini pogodna za upotrebu protiv Gram-negativnih bakterija zbog svoje relativno male sposobnosti da prođu kroz spoljašnju membranu ćelija Gram-negativnih bakterija. Kako je prethodno objašnjeno, kada se koriste zajedno sa jedinjenjem formule (II), ovakva sredstva su pogodna za upotrebu.

[0091] U jednom ostvarenju, aktivno sredstvo može da bude izabrano iz grupe koja sadrži rifampicin (rifampin), rifabutin, rifalazil, rifapentin, rifaksimin, aztreonam, oksacilin, novobiocin, fusidinsku kiselinu, azitromicin, ciprofloksacin, meropenem, tigeciklin, minociklin, eritromicin, klaritromicin i mupirocin i njihove farmaceutski prihvatljive oblike soli, solvata i proleka.

[0092] Naši pronalazači su našli da polimiksin jedinjenja formule (II) mogu da se koriste zajedno sa nekim jedinjenjima iz familije rifamicina za lečenje mikrobnih infekcija. Familija rifampicina uključuje izolate rifamicina A, B, C, D, E, S i SV i sintetički dobijene verzije ovih jedinjenja, kao što su rifampicin (rifampin), rifabutin, rifalazil, rifapentin i rifaksimin i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvati.

[0093] U jednom ostvarenju, aktivno sredstvo je rifampicin (rifampin) i farmceutski prihvatljivi njegovi oblici soli, solvata i proleka.

Soli, solvati i drugi oblici

[0094] Primeri soli jedinjenja formule (II) uključuju sve farmaceutski prihvatljive soli, kao što su, bez ograničenja, soli nastale dodavanjem jakih mineralnih kiselina kaošto su HCl i HBr soli i soli nastale dodavanjem jakih organskih kiselina, kao što je so metansulfonske kiseline. Drugi primeri soli uključuju sulfat i acetat kao što su acetat kao takav, trifluoroacetat ili trihloroacetat.

[0095] U jednom ostvarenju, jedinjenja iz ovog otkrića su data kao sulfatna so ili so trifluorosirćetne kiseline (TFA). U jednom ostvarenju, jedinjenja iz ovog otkrića su data kao acetatne soli, kao što je acetat.

[0096] Jedinjenje formule (II) može takođe da bude formulisano kao prolek. Prolekovi mogu da uključe antibakterijsko jedinjenje kako je ovde opisano u kome je jedna ili više amino grupa zaštićeno sa grupom koja može da se cepa in vivo, da se oslobodi biološki aktivno jedinjenje. U jednom ostvarenju, prolek je "amin prolek". Primeri amin prolekova uključuju sulfometil, kako je na primer opisano u Bergen i saradnici, Antimicrob. Agents and Chemotherapy, 2006, 50, 1953 ili HSO3-FMOC, kako je opisano u, na primer Schechter i saradnici, J.Med Chem 2002, 45(19) 4264 i njihove soli. Drugi primeri amin prolekova su dati od strane Krise and Oliyai u Biotechnology: Pharmaceutical Aspects, 2007, 5(2), 101-131.

[0097] U jednom ostvarenju jedinjenje formule (II) je dato kao prolek.

[0098] Referenca za jedinjenje formule (II), ili za bilo koje drugo ovde opisano jedinjenje, je takođe referenca za solvat tog jedinjenja. Primeri solvata uključuju hidrate.

[0099] Jedinjenje formule (II), ili bilo koje drugo ovde opisano jedinjenje, uključuje jedinjenje u kome je atom zamenjen sa izotopom koji se prirodno pojavljuje ili koji se ne pojavljuje prirodno. U jednom ostvarenju izotop je stabilan izotop. Tako ovde opisano jedinjenje uključuje, na primer jedinjenja koja sadrže deuterijum i slično. Na primer, H može da bude u bilo kom izotopnom obliku, uključujući<1>H,<2>H (D) i<3>H (T); C može da bude u bilo kom izotopnom obliku, uključujući<12>C,<13>C i<14>C; O može da bude u bilo kom izotopnom obliku, uključujući<16>O i<18>O; i slično.

[0100] Neka jedinjenja formule (II), ili bilo koje drugo ovde opisano jedinjenje, može da egzistira u jednoj ili više određenih geometrijskih, optičkih, enantiomernih, diastereomernih, epimernih, atropičnih, stereoizomernih, tautomernih, konformacionih ili anomernih oblika, uključujući ali bez ogrničenja na, cis- i trans-oblike; E- i Z-oblike; c-, t- i r-oblike; endo- i egzo-oblike; R-, S- i mezo-oblike; D- i L-oblike; d- i l- oblike; (+) i (-) oblike; keto-, enol- i enolat- oblike; sin- i anti- oblike; sinklinalne- i antiklinalne- oblike; α- i β- oblike; aksialne i ekvatorijalne oblike; oblike čamca-, stolice-, zavoja-, koverte- i polustolice; i njihove kombinacije, ovde u daljem tekstu zajednički označeni kao "izomeri" (ili "izomerni oblici").

[0101] Treba napomenuti, izuzev niže datog objašnjenja za tautomerne oblike, da su posebno isključeni iz naziva "izomeri," kako je ovde koriste, strukturni (ili konstitucionalni) izomeri (to jest, izomeri koji se razlikuju po vezama između atoma pre nego samo po položaju atoma u prostoru). Na primer, referencu za metoksi grupu, -OCH3, ne treba tumačiti kao referencu za njen strukturni izomer, hidroksimetil grupu, -CH2OH. Slično tome, referencu za ortohlorofenil grupu ne treba tumačiti kao referencu za njen strukturni izomer, meta-hlorfenil grupu. Međutim, referenca za grupu struktura može dobro da uključi strukturno izomerne oblike koji su obuhvaćeni tom klasom (na primer, C1-6alkil uključuje n-propil i izo-propil; butil uključuje n-, izo-, sec- i terc-butil; metoksifenil uključuje orto-, meta- i para-metoksifenil).

[0102] Ukoliko nije drugačije navedeno, referenca za određeno jedinjenje uključuje sve njegove izomerne oblike, uključujući njihove smeše (na primer, racematne smeše). Postupci za izradu (na primer, asimetričnom sintezom) i razdvajanje (na primer, frakcionom kristalizacijom i hromatografskim postupcima) ovih izomernih oblika su ili poznati u tehnici ili se lako dobijaju prilagođavanjem postupaka koji su ovde navedeni, ili poznatim postupcima, na poznati način.

[0103] Jedan aspeket ovog pronalaska se odnosi na jedinjenja u skoro potpuno prečišćenom obliku i/ili u obliku skoro potpuno oslobođenog od kontaminata.

[0104] U jednom ostvarenju, skoro potpuno prečišćeni oblik je najmanje 50% težinski, na primer, najmanje 60% težinski, na primer, najmanje 70% težinski, na primer, najmanje 80% težinski, na primer, najmanje 90% težinski, na primer, najmanje 95% težinski, na primer, najmanje 97% težinski, na primer, najmanje 98% težinski, na primer, najmanje 99% težinski.

[0105] Ukoliko nije drugačije navedeno, skoro potpuno prečišeni oblik se odnosi na jedinjenje u bilo kom stereoizomernom ili enantiomernom obliku. Na primer, u jednom ostvarenju, skoro potpuno čist oblik se odnosi na smešu stereoizomera, to jest, prečišćeno u odnosu na druga jedinjenja. U jednom ostvarenju, skoro potpuno prečišeni oblik se odnosi na jedan stereoizomer, na primer, optički čist stereoizomer. U jednom ostvarenju, skoro potpuno prečišeni oblik se odnosi na smešu enantiomera. U jednom ostvarenju, skoro potpuno prečišeni oblik se odnosi na ekvimolarnu smešu enantiomera (to jest, racematnu smešu, racemat). U jednom ostvarenju, skoro potpuno prečišeni oblik se odnosi na jedan enantiomer, na primer, optički čist enantiomer.

[0106] U jednom ostvarenju, kontaminati predstavljaju ne više od 50% težinski, na primer, ne više od 40% težinski, na primer, ne više od 30% težinski, na primer, ne više od 20% težinski, na primer, ne više od 10% težinski, na primer, ne više od 5% težinski, na primer, ne više od 3% težinski, na primer, ne više od 2% težinski, na primer, ne više od 1% težinski.

[0107] Ukoliko nije drugačije navedeno, kontaminati se odnose na druga jedinjenja, to jest, različita od stereoizomera ili enantiomera. U jednom ostvarenju, kontaminati se odnose na druga jedinjena i druge stereoizomere. U jednom ostvarenju, kontaminati se odnose na druga jedinjenja i drugi enantiomer.

[0108] U jednom ostvarenju, skoro potpuno čist oblik je najmanje 60% optički čist (to jest, 60% jedinjenja, na molarnoj bazi, je željeni stereoizomer ili enantiomer i 40% je neželjeni stereoizomer ili enantiomer), na primer, najmanje 70% optički čist, na primer, najmanje 80% optički čist, na primer, najmanje 90% optički čist, na primer, najmanje 95% optički čist, na primer, najmanje 97% optički čist, na primer, najmanje 98% optički čist, na primer, najmanje 99% optički čist.

Postupci tretmana

[0109] Jedinjenja formule (II), ili farmaceutske formulacije koje sadrže ova jedinjenja, su pogodna za upotrebu u postupcima tretmana i profilakse. Jedinjenja mogu da se primene na subjektu kome je to potrebno. Jedinjenja su pogodna za upotrebu zajedno sa aktivnim sredstvom ("drugim aktivnim sredstvom"), na primer drugim aktivnim sredstvom koje je antimirkobno sredstvo.

[0110] Jedinjenja formule (II) su za upotrebu u postupku tretmana terapijom ljudskog ili životinjskog organizma. U nekim aspektima pronalaska, jedinjenje formule (II) može da se primeni na sisaru, kao što je čovek, kako bi se lečila mikrobna infekcija.

[0111] Naziv "mikrobna infekcija" se odnosi na invaziju domaćina životinje od strane patogenih mikroba. Ovo uključuje prekomerni rast mikroba koji su normalno prisutni u ili na telu životinje. Uopštenije, mikrobna infekcija može da bude bilo koja situacija u kojoj prisustvo mikrobne populacije čini štetu životinji domaćinu. Prema tome, životinja "pati" od mikrobne infekcije kada je prekomerni broj mikrobne populacije prisutan u ili na telu životinje, ili kada prisustvo mikrobne populacije nanosi štetu ćelijama ili drugim tkivima životinje.

[0112] Jedinjenja mogu da se koriste za lečenje subjekta koji ima mikrobnu infekciju, ili postoji rizik od infekcije sa mikroorganizmima, kao što su bakterije.

[0113] Mikrobna infekcija može da bude bakterijska infekcija kao što je infekcija Gramnegativnim bakterijama.

[0114] Primeri Gram-negativnih bakterija uključuju, ali se ne ograničavaju samo na, Escherichia spp., Klebsiella spp., Entero- bacter spp., Salmonella spp., Citrobacter spp. i druge Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Stenotrophomonas i Legionella i brojne druge.

[0115] Medicinski relevantni Gram-negativni bacili uključuju mnoštvo vrsta. Neke od njih primarno dovode do respiratornih problema (Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa), primarnih urinarnih problema (Escherichia coli, Enterobacter cloacae) i primarnih gastrointestinalnih problema (Salmonella enterica).

[0116] Gram-negativne bakterije zajedno sa nozokomijalnim infekcijama uključuju Acinetobacter baumannii, koje izazivaju bakterinemiju, sekundarni meningitis i pneumoniju povezanu sa ventilacijom u jedinicama intenzivne nege u bolnicama.

[0117] U jednom ostvarenju vrsta Gram-negativne bakterije je izabrana iz grupe koja se sastoji od E. coli, S. enterica, K. pneumoniae, K. oksitoca; E. cloacae, E. aerogenes, E. agglomerans, A. calcoaceticus, A. baumannii; Pseudomonas aeruginosa i Stenotrophomonas maltophila.

[0118] U jednom ostvarenju vrsta Gram-negativne bakterije je izabrana iz grupe koja se sastoji od E. coli, K. pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i A. baumannii.

[0119] Jedinjenja formule (II) ili kompozicije koje ih sadrže su korisna za tretman infekcije kože i mekih tkiva, gastrointestinalne infekcije, infekcije urinarnog trakta, pneumonije, sepse, intra-abdominalne infekcije i obstetrikalne/ginekološke infekcije. Infekcije mogu da budu infekcije Gram-negativnim bakterijama.

[0120] Jedinjenja formule (II) ili kompozicije koje ih sadrže su korisna za tretman infekcija Pseudomonas uključujući infekcije sa P. aeruginosa, na primer infekcija kože i mekog tkiva, gastrointestinalne infekcije, infekcije urinarnog trakta, pneumonije i sepse.

[0121] Jedinjenja formule (II) ili kompozicije koje ih sadrže su korisna za tretman infekcija sa Acinetobacter uključujući infekcija sa A. baumanii, za pneumoniju, infekciju rana, infekciju urinarnog trakta i sepse.

[0122] Jedinjenja formule (II) ili kompozicije koje ih sadrže su korisna za tretman infekcija sa Klebsiella uključujući infekcije sa K. pneumoniae, za pneumoniju, intraabdominalnu infekciju, infekciju urinarnog trakta, meningitis i sepsu.

[0123] Jedinjenja formule (II) ili kompozicije koje ih sadrže su korisna za tretman infekcija sa E. coli uključujući infekcije sa E. coli, za bakteraemiju, holecistitis, holangitis, intraabdominalnu infekciju, infekciju urinarnog trakta, neonatalni meningitis i pneumoniju.

[0124] Jedinjenja formule (II) ili kompozicije koje ih sadrže mogu da se koriste zajedno sa aktivnim sredstvom u postucima tretmana.

[0125] Aktivno sredstvo može da bude sredstvo koje je aktivno protiv mikroorganizama. Aktivno sredstvo može da bude aktivno protiv Gram-negativnih bakterija. Aktivno sredstvo može da bude aktivno protiv mikroorganizama izabranih sa liste koja je prethodno data.

[0126] U jednom ostvarenju, drugo aktivno sredstvo ima MIC vrednost od 10 mikroorganizama/mL ili manju protiv mikroorganizama kao što je E. coli, bez prisustva jedinjenja formule (II). Mikroorganizam može da bude mikroorganizam izabran iz pretnodno date grupe.

[0127] Specifična jedinjenja za upotrebu kao druga aktivna sredstva su ovde opisana i uključuju:

rifampicin, rifabutin, rifalazil, rifapentin i rifaksimin;

oksacilin, meticilin, ampicilin, kloksacilin, karbenicilin, piperacilin, tricarcilin, flukloksacilin i nafcilin;

azitromicin, klaritromicin, eritromicin, telitromicin, cetromicin i solitromicin;

aztreonam i BAL30072;

meropenem, doripenem, imipenem, ertapenem, biapenem, tomopenem i panipenem; tigeciklin, omadaciklin, eravaciklin, doksiciklin i minociklin;

ciprofloksacin, levofloksacin, moksifloksacin i delafloksacin;

fusidinsku kiselinu;

Novobiocin;

teihoplanin, telavancin, dalbavancin i oritavancin,

i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvate.

[0128] U jednom ostvarenju, specifična jedinjenja za upotrebu kao druga aktivna sredstva su ovde opisana i uključuju rifampicin (rifampin), rifabutin, rifalazil, rifapentin, rifaksimin, aztreonam, oksacilin, novobiocin, fusidinsku kiselinu, azitromicin, ciprofloksacin, meropenem, tigeciklin, eritromicin, klaritromicin i mupirocin i njihove farmaceutski prihvatljive soli i solvate.

[0129] U alternativnom aspektu, jedinjenja formule (II) su pogodna za upotrebu u tretmanu gljivičnih infekcija, na primer u kombinaciji zajedno sa antifungalnim sredstvom.

Antifungalno sredstvo može da bude izabrano od polien antifungala, na primer amfotericina B, imidazola, triazola, ili tiazol antifungala, na primer mikonazola, flukonazola ili abafungina, alilamina, ehinokandina, ili drugog sredstva, na primer ciklopiroksa.

Tretman

[0130] Naziv "tretman," kako se ovde koristi u kontekstu lečenja stanja, generalno se odnosi na tretman i terapiju, bilo ljudi ili životinje (na primer, veterinarska primena), u kome se postiže neki željeni terapeutski efekat, na primer, zaustavljanje progresije stanja, i uključuje smanjenje brzine progresije, zaustavljanje brzine progresije, ublažavanje simptoma stanja, poboljšanje stanja i izlečenje stanja. Takođe je uključen tretman kao profilaktička mera (to jest, profilaksa). Na primer, izrazom "tretman" je obuhvaćena upotreba na pacijentima kod kojih se još nije razvilo stanje ali koji su u riziku od razvoja stanja.

[0131] Naziv "terapeutski efektivna količina," kako se ovde koristi, se odnosi na onu količinu jedinjenja ili materijala, kompozicije ili doznog oblika koji sadrži jedinjenje, koja je efikasna da dovede do nekog željenog terapeutskog efekta, srazmerno razumnom odnosu koristi i rizika, kada se primenjuje u skladu sa željenim režimom tretmana.

[0132] Naziv "tretman" uključuje kombinovani tretman i terapiju, kako je ovde opisano, u kome se kombinuju dva ili više tretmana ili terapija, na primer, po redu ili istovremeno.

Kombinovana terapija

[0133] Jedinjenje formule (II) može da se primeni zajedno sa aktivnim sredstvom. Primena može da bude istovremena, odvojena ili po redu.

[0134] Postupci i način primene će da zavise od farmakokinetike jedinjenja formule (II) i drugog aktivnog sredstva.

[0135] Pod "istovremenom" primenom se podrazumeva da se jedinjenje formule (II) i drugo aktivno sredstvo primenjuju na subjektu u jednoj dozi istim načinom primene.

[0136] Pod "odvojenom" aprimenom se podrazumeva da se jedinjenje formule (II) i drugo aktivno sredstvo primenjuju na subjektu na dva različita načina primene koji se vrše u isto vreme. Ovo može da se desi, na primer, kada se jedno sredstvo primenjuje infuzijom a drugo se daje oralno u toku trajanja infuzije.

[0137] Pod "po redu" se podrazumeva da se dva sredstva primenjuju u različitim vremenskim tačkama, pod uslovom da je aktivnost prvog primenjenog sredstva prisutna i traje u subjektu u vreme kada se primeni drugo aktivno sredstvo.

[0138] Generalno, doziranje po redu se dešava kada se drugo od dva sredstva primenjuje u toku 48 sati, kao što je u toku 24 sata, kao što je u toku 12, 6, 4, 2 ili 1 sat nakon prvog sredstva. Alternativno, prvo može da se primeni aktivno sredstvo a nakon toga jedinjenje formule (II).

[0139] Konačno, redosled i vreme primene jedinjenja i drugog aktivnog sredstva u kombinovanom tretmanu će da zavisi od farmakokinetičkih karakteristika svakog od njih.

[0140] Količina jedinjenja formule (II) koja će da se primeni na subjektu će konačno da zavisi od prirode subjekta i bolesti koja se tretira. Isto tako, količina aktivnog sredstva koje se primenjuje na subjektu će konačno da zavisi od prirode subjekta i bolesti koja se tretira.

Formulacije

[0141] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje formule (II) zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Farmaceutska kompozicija može dodatno da uključi drugo aktivno sredstvo. U alternativnom ostvarenju, kada je drugo aktivno sredstvo dato za upotrebu u terapiji, drugo aktivno sredstvo može da bude formulisano odvojeno od jedinjenja formule (II). Niže data objašnjenja u vezi sa jedinjenjem formule (II) mogu prema tome da se primene na drugo aktivno sredstvo, kao odvojeno formulisano.

[0142] Mada je moguće da se Jedinjenje formule (II) primeni samo ili zajedno sa drugim aktivnim sredstvom, poželjno je da bude prisutno kao farmaceutska formulacija (na primer, kompozicija, preparat, medikament) koja uključuje najmanje jedno jedinjenje formule (II) kako je ovde opisano, zajedno sa jednim ili više drugih farmaceutski prihvatljivih sastojaka dobro poznatih stručnjaku sa iskustvom u tehnici, uključujući ali bez ograničenja na, farmaceutski prihvatljive nosače, razblaživače, ekscipijente, adjuvanse, punioce, pufere, konzervanse, antioksidanse, lubrikanse, stabilizatore, solubilizatore, surfaktante (na primer, sredstva za vlaženje), sredstva za maskiranje ukusa, sredstva za bojenje, arome i zaslađivače. Formulacija može dalje da uključi druga aktivna sredstva, na primer, druga terapeutska ili profilaktička sredstva.

[0143] Prema tome, ovaj pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutske kompozicije, kako je ovde definisano. Ovde su takođe opisani postupci za izradu farmaceutske kompozicije koja uključuje smešu najmanje jednog jedinjenja formule (II), kako je ovde opisano, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih sastojaka dobro poznatih stručnjaku sa iskustvom u tehnici, na primer, nosača, razblaživača, ekscipijenata, itd. Ako se formulišu kao posebne jedinice (na primer, tablete, itd.), svaka jedinica sadrži prethodno odmerenu količinu (dozu) jedinjenja. Kompozicija opciono dalje uključuje drugo aktivno sredstvo u prethodno odmerenoj količini.

[0144] Naziv "farmaceutski prihvatljivo," kako se ovde koristi, se odnosi na jedinjenja, sastojke, materijale, kompozicije, dozne oblike, itd., koji su, u skladu sa zdravom medicinskom procenom, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima subjekta na koji se odnosi (na primer, ljude) bez prevelike toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugih problema ili komplikacija, srazmerno razumom odnosu korist/rizik. Svaki nosač, razblaživač, ekscipijent, itd., mora takođe da bude "prihvatljiv" u smislu da je kompatibilan sa drugim sastojcima formulacije.

[0145] Pogodni nosači, razblaživači, ekscipijenti, itd., mogu da se nađu u standardnoj farmaceutskoj literaturi, na primer, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990; i Handbook of Pharmaceutical Excipients, 5th edition, 2005.

[0146] Formulacije mogu da se izrade bilo kojim postupkom dobro poznatim u farmaceutskoj tehnici. Ovi postupci uključuju fazu dovođenja u kontakt jedinjenja formule (II) sa podlogom koja se sastoji od jednog ili više pratećih sastojaka. Generalno, formulacije se izrađuju ujednačenim i bliskim dovođenjem u vezu jedinjenja sa nosačima (na primer, tečnim nosačima, fino usitnjenim čvrstim nosačem, itd.) a nakon toga oblikovanjem produkta ukoliko je potrebno.

[0147] Formulacija može da se izradi tako da se dobije brzo ili sporo oslobađanje; trenutno, odloženo, programirano, ili kontinuirano oslobađanje; ili njihova kombinacija.

[0148] Formulacije mogu odgovarajuće da budu u obliku tečnosti, rastvora (na primer, vodeni, ne-vodeni), suspenzija (na primer, vodene, ne-vodene), emulzija (na primer, ulje-uvodi, voda-u-ulju), eliksira, sirupa, elektuara, vodica za usta, kapi, tableta (uključujući, na primer, obložene tablete), granula, praškova, lozengi, pastila, kapsula (uključujući, na primer, čvrste i meke želatinske kapsule), kaheta, pilula, ampula, bolusa, supozitorija, pesara, tinktura, gela, pasti, masti, krema, losiona, ulja, pena, sprejova, magle ili aerosola.

[0149] Formulacije mogu pogodno da budu u obliku poveza, lepljivog flastera, zavoja, preliva, ili slično koji su impregnirani sa jedim ili više jedinjenja i opciono sa jednim ili više drugih farmaceutski prihvatljivih sastojaka, uključujući na primer, pojačivače penetracije, permeacije i apsorpcije. Formulacije mogu takođe pogodno da budu u obliku depoa ili rezervoara.

[0150] Jedinjenje može da bude rastvoreno u, suspendovano u ili izmešano sa jednim ili više drugih farmaceutski prihvatljivih sastojaka. Jedinjenje može da bude prisutno u lipozomu ili drugom mikropartikulatu koji je osmišljen da usmeri jedinjenje, na primer, ka komponentama krvi ili jednom ili više organa. Kada se koristi lipozom, zna se da lipozom može da sadrži i jedinjenje formule (II) i drugo aktivno sredstvo.

[0151] Formulacije pogodne za oralnu primenu (na primer, gutanje) uključuju tečnosti, rastvore (na primer, vodene, ne-vodene), suspenzije (na primer, vodene, ne-vodene), emulzije (na primer, ulje-u-vodi, voda-u-ulju), eliksire, sirupe, elektuare, tablete, granule, praškove, kapsule, kahete, pilule, ampule, boluse.

[0152] Formulacije pogodne za bukalnu primenu uključuju vodice za usta, lozenge, pastile, kao i poveze, lepljive flastere, depoe i rezervoare. Lozenge obično uključuju jedinjenje u aromatičnoj podlozi, obično saharozi i akaciju ili tragakantu. Vodice za usta obično uključuju jedinjenje u odgovarajućem tečnom nosaču.

[0153] Formulacije pogodne za sublingvalnu primenu uključuju tablete, lozenge, pastile, kapsule i pilule.

[0154] Formulacije pogodne za oralnu transmukoznu primenu uključuju rastvore (na primer, vodene, ne-vodene), suspenzije (na primer, vodene, ne-vodene), emulzije (na primer, ulje-uvodi, voda-u-ulju), vodice za usta, lozenge, pastile, kao i poveze, lepljive flastere, depoe i rezervoare.

[0155] Formulacije pogodne za ne-oralnu transmukoznu primenu uključuju rastvore (na primer, vodene, ne-vodene), suspenzije (na primer, vodene, ne-vodene), emulzije (na primer, ulje-u-vodi, voda-u-ulju), supozitorije, pesare, gele, paste, masti, kreme, losione, ulja, kao i poveze, lepljive flastere, depoe i rezervoare.

[0156] Formulacije pogodne za transdermalnu primenu uključuju gele, paste, masti, kreme, losione i ulja kao i poveze, lepljive flastere, zavoje, prelive, depoe i rezervoare.

[0157] Tablete mogu da se izrade na uobičajene načine, na primer, kompresijom ili oblikovanjem, opciono sa jednim ili više dodatnih sastojaka. Komprimovane tablete mogu da se izrade kompresijom jedinjenja u slobodno-tečnom obliku kao što su praškovi ili granule, opciono izmešani sa jednim ili više vezivnih sredstava (na primer, povidon, želatin, akacija, sorbitol, tragakanta, hidroksipropilmetil celuloza); puniocima ili razblaživačima (na primer, laktoza, mikrokristalna celuloza, kalcijum hidrogen fosfat); lubrikansima (na primer, magnezijum stearat, talk, silicijum); dezintegratorima (na primer, natrijum sklob glikolat, unakrsno vezani povidon, unakrno vezana natrijum karboksimetil celuloza); površinski aktivnim ili disperzionim ili sredstvima za vlaženje (na primer, natrijum lauril sulfat); konzervansima (na primer, metil-hidroksibenzoat, propil p-hidroksibenzoat, sorbinska kiselina); aromama, sredstvima za pojačavanje arome i zaslađivačima u pogodnoj mašini. Oblikovane tablete mogu da se izrade oblikovanjem smeše praškastog jedinjenja ovlaženog sa inertnim tečnim razblaživačem u odgovarajućoj mašini. Tablete opciono mogu da budu obložene i mogu da budu formulisane tako da se obezbedi sporo ili kontrolisano oslobađanje jedinjenja iz njih koristeći, na primer, hidroksipropilmetil celulozu u različitim odnosima da se obezbedi željeni profil oslobađanja.

[0158] Tablete mogu opciono da budu sa omotačem, na primer, da utiče na oslobađanje, na primer, enteričnim omotačem da se obezbedi oslobađanje u delovima creva izvan želuca.

[0159] Masti se tipično izrađuju od jedinjenja i parafinske ili podloge za masti koja se meša sa vodom.

[0160] Kreme se obično izrađuju od jedinjenja i podloge za kreme tipa ulje-u-vodi. Ukoliko se želi, vodena faza u podlozi za kremu može da uključi, na primer, najmanje približno 30% m/m polihidrathog alkohola, to je, alkohola koji ima dve ili više hidroksilnih grupa, kao što su propilen glikol, butan-1,3-diol, manitol, sorbitol, glicerol i polietilen glikol i njihove smeše. Topične formulacije po želji mogu da uključe jedinjenje koje poječava apsorpciju ili penetraciju jedinjenja kroz kožu ili druge obuhvaćene oblasti. Primeri ovakvih pojačivača dermalne penetracije uključuju dimetilsulfoksid i njegove analoge.

[0161] Emulzije se obično izrađuju od jedinjenja i uljane faze, koja koja se opciono sastoji samo od emulgatora (takođe poznat kao emulent), ili može da uključi smešu najmanje jednog emulgatora sa mašću ili uljem ili i mašću i uljem. Hidrofilni emulgator može da bude uključen zajedno sa lipofilnim emulgatorom koji deluje kao stabilizator. Takođe je moguće da se uključe i ulje i mast. Zajedno, emulgator(i) sa ili bez stabilizatorom(ima) stvara takozvani emulgujući vosak a vosak zajedno sa uljem i/ili mašću stvara takozvanu emulgujuću masnu podlogu koja formira fazu dispergovanog ulja u formulacijama krema.

[0162] U pogodne emulgente i stabilizatore emulzija spadaju Tween 60, Span 80, cetostearil alkohol, miristil alkohol, gliceril monostearat i natrijum lauril sulfat. Izbor pogodnog ulja ili masti za formulaciju se zasniva na postizanju željenih kozmetičkih karakteristika, pošto rastvorljivost jedinjenja u većini ulja koja se koriste u formulacijama farmaceutske emulzije može da bude veoma mala. Prema tome, krema treba da bude ne-masni, ne-lepljivi i perivi produkt sa željenom konzistencijom da se izbegne curenje iz tuba ili druge ambalaže. Mogu da se koriste mono ili dibazni alkil estri ravnog ili račvastog lanca, kao što su diizoadipat, izocetil stearat, propilen glikol diestar masnih kiselina kokosa, izopropil miristat, decil oleat, izopropil palmitat, butil stearat, 2-etilheksil palmitat ili mešavina estara račvastog lanca poznatog kao Crodamol CAP. Ovi mogu da se koriste sami ili u kombinaciji u zavisnosti od traženih karakteristika. Alternativno, mogu da se koriste lipidi visoke tačke topljenja kao što su beli meki parafin i/ili tečni parafin ili druga mineralna ulja.

[0163] Formulacije pogodne za intranazalnu primenu, u kojima je nosač tečnost, uključuju, na primer, nazalni sprej, nazalne kapi ili aerosol koji se primenjuje pomoću nebulizera, uključujući vodene ili uljane rastvore jedinjenja. Kao alternativni postupak za primenu može da se koristi oslobađanje suvog praška kao alternativa nebulizovanim aerosolima.

[0164] Formulacije pogodne za intranazalnu primenu, kada je nosač u čvrstom stanju, uključuju, na primer, one u kojima je nosač prisutan u obliku grubog praška koji ima veličinu čestica, na primer, u opsegu od približno 20 do približno 500 mikrona koji se primenjuje ušmrkavanjem, to jest, brzom inhalacijom kroz kroz nosni prolaz iz posude sa praškom koja se drži blizu nosa.

[0165] Formulacije pogodne za pulmonarnu primenu (na primer, terapija inhalacijom ili insuflacijom) uključuju one prisutne kao aerosol sprej iz pakovanja pod pritiskom, uz upotrebu odgovarajućeg propelanta kao što su dihlorodifluorometan, trihlorfluorometan, dihlortetrafluoroetan, ugljen dioksid, ili drugi pogodni gasovi. Pored toga ili alternativno, formulacija za pulmonarnu primenu može da bude formulisana za primenu iz nebulizera ili inhalera suvog praška. Na primer, formulacija može da bude sa nosačima ili lipozomima da se obezbedi odgovarajuća veličina čestica koje dospevaju do odgovarajućih delova pluća, da se potpomogne oslobađanje odgovarajućih doza za poboljšanje zadržavanja u plućnom tkivu.

[0166] Formulacije pogodne za okularnu primenu uključuju kapi za oči pri čemu je jedinjenje rastvoreno ili suspendovano u odgovarajućem nosaču, posebno vodenom rastvaraču za jedinjenje.

[0167] Formulacije pogodne za rektalnu primenu mogu da budu u obliku supozitorija sa odgovarajućom podlogom koja uključuje, na primer prirodna ili očvrsla ulja, voskove, masti, polutečne ili tečne poliole, na primer, kakao buter ili salicilat; ili kao rastvor ili suspenzija za tretman klizmama.

[0168] Formulacije pogodne za vaginalnu primenu mogu da budu u obliku pesara, tampona, krema, gela, pasti, pena ili sprej formulacija koje pored jedinjenja sadrže takve nosače za koje se u tehnici zna da su odgovarajući.

[0169] Formulacije pogodne za parenteralnu primenu (na primer, injekcijom ili infuzijom, intravenski ili subkutano), uključuju vodene ili ne-vodene, izotonične, apirogene, sterilne tečnosti (na primer, rastvore, suspenzije), u kojima je jedinjenje rastvoreno, suspendovano ili na drugi način obezbeđeno (na primer, u lipozomu ili drugim mikropartikulama). Ovakve tečnosti mogu dodatno da sadrže druge farmaceutski prihvatljive sastojke, kao što su antioksidansi, puferi, konzervansi, stabilizatori, bakteriostatici, sredstva za suspendovanje, sredstva za zgušnjavanje i rastvorci koji omogućavaju izotoničnost formulacije sa krvlju (ili drugim relevantnim tečnostima u organizmu) primaoca. Primeri ekscipijenata uključuju, na primer, vodu, alkohol, šećere, poliole, glicerol, biljna ulja i slično. Primeri pogodnih izotoničnih nosača za upotrebu u ovakvim formulacijama uključuju injekcije natrijum hlorida, Ringerov rastvor, ili injekcije Ringer laktata. Uobičajeno, koncentracija jedinjenja u tečnosti je od približno 1 ng/mL do približno 500 µg/mL, na primer približno 1 ng/mL do približno 100 µg/mL, na primer od približno 10 ng/mL do približno 10 µg/mL, na primer od približno 10 ng/mL do približno 1 µg/mL. Formulacije mogu da budu u obliku jednodoznih ili višedoznih zatvorenih kontejnera, na primer, ampula i bočica a mogu da se čuvaju u suvomzamrznutom (liofiliziranom) stanju koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer vode za injekcije, neposredno pre upotrebe. Ekstemporalni injekcioni rastvori i suspenzije mogu da se izrade od sterilnih praškova, granula i tableta.

Doziranje

[0170] Generalno, postupci iz pronalaska mogu da uključe primenu na subjektu efektivne količine jedinjenja formule (II) tako da se obezbedi antimikrobni efekat. Jedinjenje formule (II) može da se primeni u količini dovoljnoj da potencira aktivnost drugog aktivnog sredstva. Drugo aktivno sredstvo se primenjuje na subjektu u efektivnoj količini tako da se obezbedi antimikrobni efekat.

[0171] Stručnjak sa iskustvom u tehnici će znati da odgovarajuće doziranje jedinjenja formule (II) ili aktivnog sredstva i kompozicija koje uključuju jedinjenje formule (II) ili aktivno sredstvo može da varira od pacijenta do pacijenta. Određivanje optimalnog doziranja će generalno da uključi ravnotežu vrednosti terapeutske koristi u odnosu na bilo koji rizik ili ozbiljna neželjena dejstva. Izabrana vrednost doze će da zavisi od različitih faktora uključujući, ali bez ograničenja na, aktivnost određenog jedinjenja formule (II) ili aktivnog sredstva, načina primene, vremena primene, brzine izlučivanja jedinjenja, trajanja tretmana, drugih lekova, jedinjenja, i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji, težine stanja i vrste, pola, starosti, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta.

Količina jedinjenja formule (II) ili aktivnog sredstva i način primene će da budu isključivo odluka lekara, veterinara ili kliničara, mada se generalno doza bira tako da se na mestu delovanja postigne lokalna koncentracija koja će da dostigne željeni efekat bez izazivanja značajnih neželjenih ili štetnih neželjenih efekata.

[0172] Primena može da se izvrši u jednoj dozi, kontinuirano ili povremeno (na primer, u podeljenim dozama u odgovarajućim intervalima) u toku trajanja tretmana. Postupci za određivanje najefikasnijih sredstava i doza primene su dobro poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici i zavisiće od formulacije korišćene u terapiji, svrhe terapije, ciljane ćelije(a) koje se tretiraju i subjekta koji se tretira. Pojedinačne ili višestruke primene mogu da se izvedu sa vrednošću doze i oblikom koje izabere ordinirajući lekar, veterinar ili kliničar. .

[0173] Generalno, odgovarajuća doza jedinjenja formule (II) ili aktivnog sredstva je u opsegu od približno 10 µg do približno 250 mg (još češće približno 100 µg do približno 25 mg) po kilogramu telesne težine subjekta po danu. Kada je jedinjenje formule (II) ili aktivno sredstvo so, estar, amid, prolek, ili slično, primenjena količina se izračunava na bazi osnovnog jedinjenja i zbog toga se koristi proporcionalno povećana aktuelna težina.

Kitovi

[0174] Jedan aspekt koji je ovde opisan ali nije deo pronalaska se odnosi na kit koji uključuje (a) Jedinjenje formule (II), ili kompoziciju koja sadrži jedinjenje kako je definisano u bilo kojoj od formula (II), na primer, obično se nalazi u odgovarajućoj ambalaži i/ili sa pogodnim pakovanjem; i (b) uputstvo za upotrebu, na primer, pisano uputstvo kako da se primeni jedinjenje ili kompozicija.

[0175] Pisana uputstva mogu takođe da sadrže listu indikacija za koje je jedinjenje formule (II) odgovarajući tretman.

[0176] U jednom ostvarenju, kit dalje uključuje (c) drugo aktivno sredstvo ili kompoziciju koja uključuje drugo aktivno sredstvo. Ovde, pisana uputstva mogu takođe da uključe listu indikacija za koje je drugo aktivno sredstvo zajedno sa jedinjenjem formule (II) pogodno za tretman.

Načini primene

[0177] Jedinjenje formule (II), drugo aktivno sredstvo, ili farmaceutska kompozicija koja uključuje jedinjenje formule (II), ili drugo aktivno sredstvo mogu da se primene na subjektu na bilo koji uobičajeni način primene, bilo sistemski/periferno ili topično (to jest, na mestu željenog delovanja).

[0178] Načini primene uključuju, ali bez ograničenja na, oralno (na primer, gutanjem); bukalno; sublingvalno; transdermalno (uključujući, na primer, preko poveza, flastera, itd.); transmukozno (uključujući, na primer, preko poveza, flastera, itd.); intranazalno (na primer, nazalni sprej); okularno (na primer, kapi za oči); pulmonarno (na primer, inhalacijom ili insuflacionom terapijom koristeći, na primer, aerosol, na primer preko usta ili nosa); rektalno (na primer, supozitorije ili klizme); vaginalno (na primer, pesari); parenteralno, na primer, injekcijom ili infuzijom, uključujući subkutano, intradermalno, intramuskularno, intravenozno, intraarterijalno, intrakardijačno, intratekalno, intraspinalno, intrakapsularno, subkapsularno, intraorbitalno, intraperitonealno, intratrahealno, subkutikularno, intraartikularno, subarahnoidno i intrasternalno; preko implanta depoa ili rezervoara, na primer, subkutano ili intramuskularno.

Subjekt/pacijent

[0179] Subjekt/pacijent može da bude hordat, kičmenjak, sisar, placentni sisar, torbar (na primer, kengur, vombat), glodar (na primer, zamorac, hrčak, pacov, miš), murin (na primer, miš), dvozupci (na primer, zečevi), avian (na primer, ptice), canine (na primer, pas), feline (na primer, mačka), equine (na primer, konj), porcine (na primer, svinja), ovine (na primer, ovca), bovine (na primer, krava), primat, simian (na primer, majmun), majmun (na primer, marmozet, babun), ape (na primer, gorila, šimpanza, oranguton, gibon), ili čovek. Osim toga, subjekt/pacijent može da bude bilo koji njihov oblik u toku razvoja, na primer, fetus.

[0180] U jednom ostvarenju, subjekt/pacijent je čovek.

[0181] Takođe je predviđeno da pronalazak može da se odnosi na ne-humanu životinju koja ima mikrobnu infekciju. Ne-humana životinja može da bude glodar. Glodari uključuju pacove, miševe, hrčke, činčile i druge male glodare slične veličine koji se koriste za laboratorijska istraživanja.

Druge opcije

[0182] Svaka i bilo koja kompatibilna kombinacija prethodno opisanih ostvarenja je eksplicitno ovde otkrivena, kao da je svaka i bilo koja kombinacija pojedinačno i eksplicitno navedena.

[0183] Različiti dalji aspekti i ostvarenja iz ovog pronalaska će biti prihvatljivi stručnjaku sa iskustvom u tehnici u skladu sa ovim otkrićem.

[0184] "I/ili" kada se ovde koriste treba da se tumače kao specifično otkriće svake od dve navedene karakteristike ili komponente sa ili bez one druge. Na primer, "A i/ili B" treba da se tumači kao specifično otkriće svakog od (i) A, (ii) B i (iii) A i B, kao da je svaki ovde pojedinačno naveden.

[0185] Ukoliko kontekst na nalaže drugačije, opisi i definicije prethodno datih karakteristika nisu ograničenje na bilo koji određeni aspekt ili ostvarenje iz pronalaska i podjednako se primenjuju na sve opisane aspekte i ostvarenja. Kada odgovarajuća ostvarenja mogu tehnički da se kombinuju, otkriće se proširuje na sve permutacije i kombinacije ostvarenja koja su ovde data.

[0186] Neki aspekti i ostvarenja iz pronalaska će da budu ilustrovana preko primera i prema prethodno opisanim slikama.

Primeri

[0187] Naredni primeri su dati samo kao ilustracija ovog pronalaska i ne treba da ograničavaju okvir pronalaska, kako je ovde opisano.

Skraćenice

[0188]

Skraćenica Značenje

PMBN Polimiksin B nonapeptid

PMB Polimiksin B

Thr Treonin

Ser Serin

DSer D-serin

Leu Leucin

lie Izoleucin

Phe Fenilalanin

DPhe D-fenilalanin

Val Valin

Dab α,γ-Diaminobutirna kiselina

DIPEA N,N-diizopropiletilamin

HATU 2-(7-aza-1H-benzotriazol-1-il)-1,1-3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat DCM Dihlormetan

TFA Trifluorosirćetna kiselina

ND Nije određeno

N/A Nije primenljivo

DMF N,N-Dimetilformamid

PMBH Polimiksin B heptapeptid (3-10)

PMBD Polimiksin B dekapeptid

Pro Prolin

Dap α,β-Diaminopropionska kiselina

Gly Glicin

NorLeu Norleucin

Ruphos 2-Dicikloheksilfosfino-2’,6’-diizopropoksibifenil

Xphos 2-Dicikloheksilfosfino-2’,4’,6’-triizopropilbifenil

SFC Superkritična tečna hromatografija

Fmoc Fluorenilmetiloksikarbonil

Cbz Benziloksikarbonil

HCTU O-(1H-6-Hlorbenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronijum heksafluorofosfat Boc terc-Butiloksikarbonil

PyBOP (Benzotriazol-1-iloksi)tripirolidinofosfonijum heksafluorofosfat

NMM N-Metil morfolin

THF Tetrahirofuran

ivDde 1-(4,4-Dimetil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden)-3-metilbutil

DPPA Difenilfosforil azid

TIS Tri-izopropil silan

HOBt 1-Hidroksibenzotriazol

IPA Izopropanol

Sintetički primeri

Sinteze N-Terminalnih kiselina

[0189] U ovom radu, 3-supstituisane 4-aminobutanoatne kiseline su korišćene u odgovarajuće zaštićenom obliku. Sinteze ne-standardnih amino kiselina su niže detaljno date, zajedno sa metodologijom za razdvajanje enantiomera.

4-((terc-Butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatna kiselina - Izomer 1 i Izomer 2

[0190]

(i) Metil 3-(3-hlorfenil)-4-nitrobutanoat

[0191]

[0192] Smeša 3-hlorcinamatne kiseline (10 g), metanola (100 mL) i koncentrovane sumporne kiseline (4 mL) se meša 20 h na sobnoj temperaturi. Smeša se upari do sušenja i ostatak podeli između dihlorometana (DCM) i vode. Vodena faza se izdvoji i ekstrahuje sa dodatnom količinom DCM. Organski ekstrakti se kombinuju, suše sa magnezijum sulfatom, filtriraju i upare do sušenja, da se dobije metil estar kao bela čvrsta supstanca (10.19 g). Ova čvrsta supstanca se rastvori u nitrometanu (32 mL) i tretira sa 1,8-diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en (DBU) (8.5 mL). Smeša se meša 20 h na sobnoj temperaturi, nakon toga upari do sušenja i ostatak podeli između 0.5 M vodenog rastvora HCl i dietil etra. Vodena faza se izdvoji i ekstrahuje sa dodatnom količinom dietil etra. Organski ekstrakti se kombinuju, isperu sa slanim rastvorom, suše sa magnezijum sulfatom, filtriraju i upare do sušenja. Ostaci se prečiste preko silika gela, uz eluiranje sa heksanom i etil acetatom (0-100%). Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare do sušenja, da se dobije traženi produkt kao žuto ulje (9.93 g, 70% prinos).

[0193]<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ (ppm) 2.71-2.79 (2H, m), 3.66 (3H, s), 3.93-4.01 (1H, m), 4.62 i 4.73 (2H, ABq, pojavljuje se kao 2x dd, J 12.8, 8.0 Hz), 7.11-7.28 (4H, m).

(ii) Metil 4-amino-3-(3-hlorfenil)butanoat

[0194]

[0195] U rastvor metil 3-(3-hlorfenil)-4-nitrobutanoata (9.93 g) u sirćetnoj kiselini (90 mL) izmešanom na približno 0°C se u porcijama dodaje cink u prahu (20.1 g) (pažnja: odložena egzotermna reakcija). Smeša se ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu i meša 19 h. Smeša se upari do sušenja i ostatak podeli između vodenog rastvora NaHCO3i etil acetata. Smeša se nakon toga filtrira preko Celite i vodene i organske faze se razdvoje.

Vodena faza se ponovo ekstrahuje sa novom količinom etil acetata. Organski ekstrakti se kombinuju, isperu sa slanim rastvorom, suše sa magnezijum sulfatom, filtriraju i upare do sušenja, da se dobije traženi produkt kao narandžasto ulje (4.80 g).

(iii) Naslovljeno jedinjenje - racemat

[0196] Smeša metil 4-amino-3-(3-hlorfenil)butanoata (4.80 g), di-terc-butil dikarbonata (5.28 g) i dihlorometana (100 mL) se meša 18 h na sobnoj temperaturi. Smeša se upari do sušenja i ostatak prečisti preko silika gela, uz eluiranje sa petrol etrom 40-60 i etil acetatom (0-100%). Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare do sušenja, da se dobije Boc-zaštićeni estar metil 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoata kao krem čvrsta supstanca (2.59 g).

[0197] Smeša metil 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoata (2.49 g), litijum hidroksida (546 mg), 1,4-dioksana (40 mL) i vode (40 mL) se meša 64 h na sobnoj temperaturi. Smeša se nakon toga upari do sušenja. Ostaci se rastvore u vodi, neutrališu sa 1 M vodenim rastvorom HCl i ekstrahuju sa etil acetatom (x 2). Organski ekstrakti se kombinuju, isperu sa slanim rastvorom, suše sa magnezijum sulfatom, filtriraju i upare do sušenja, da se dobije traženi produkt kao žuto ulje (2.51 g).

m/z 314 (MH<+>) C15H20ClNO4zahteva 313.11.<1>H NMR (400MHz, CD3OD): δ (ppm) 1.40 (9H, s), 2.42-2.73 (2H, m), 3.24-4.49 (4.4 H, m, uključuje CH3OD, CH2i CH), 7.17-7.38 (4H, m).

(iv) Naslovljeno jedinjenje - razdvajanje izomera - postupak 1

[0198] 4-((terc-Butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatna kiselina (2.09 g) se rastvori u 60 mg/mL u metanolu i nakon toga prečisti pomoću SFC po niže opisanim uslovima (uslovi preparativnog odvajanja 1). Kombinovane frakcije koje sadrže obogaćeni izomer 1 (bržeprotočne) i izomer 2 (sporije-protočne) se kombinuju, koncentruju i svaka pojedinačno ponovo prečisti pod istim hromatografskim uslovima.

[0199] Kombinovane frakcije svakog od izomera 1 i izomera 2 se nakon toga upare skoro do sušenja koristeći rotacioni evaporator, prenesu u finalne posude sa DCM, koji se ukloni u struji azota na 40°C pre nego što se 16 sati čuva u vakuumskoj pećnici na 40°C i 5 mbar.

4-((terc-Butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatna kiselina (izomer 1)

[0200] Bela čvrsta supstanca, 883mg, 95.6% ee. Vreme zadržavanja 2.89 min na analitičkom sistemu 1. 4-((terc-Butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatna kiselina (izomer 2)

[0201] Bela čvrsta supstanca, 876 mg, 98.6% ee. Vreme zadržavanja 3.29 min na analitičkom sistemu 1.

Uslovi preparativnog razdvajanja 1:

[0202]

Berger Multigram II SFC

Detalji kolone: Lux A1 (Phenomenex, 21.2 mm x 250 mm, 5 µm)

Temperatura kolone: 40°C

Brzina protoka: 50 mL/min

BPR: 125 BarG

Detektor talasne dužine: 210 nm

Zapremina injektora: 300 µL (18 mg)

Izokratski uslovi: 12:88 EtOH: CO2(0.1% v/v NH3)

Uslovi analize 1:

Waters UPC2

Detalji kolone: Lux C4 (Phenomenex, 4.6mm x 250mm, 5 µm)

Temperatura kolone: 40°C

Brzina protoka: 4 mL/min

Detektor talasne dužine: 210-400 nm

Zapremina injektora: 1.0 µL

BPR: 125 BarG

Izokratski uslovi: 10:90 EtOH:CO2(0.1% v/v NH3)

(v) Naslovljeno jedinjenje - razdvajanje izomera - postupak 2

[0204] 4-((terc-Butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatna kiselina se prečisti pomoću SFC koristeći niže opisane uslove (uslovi preparativnog razdvajanja 2). Nakon razdvajanja, frakcije se izdvoje sušenjem koristeći rotacioni evaporator na temperaturi kupatila od 40°C da se dobiju traženi razdvojeni enantiomeri. Sporije-protočna enantiomer se dalje prečisti na istoj koloni uz eluiranje sa 20% B.

Uslovi preparativnog razdvajanja 2:

[0205]

Instrument: Thar 200 preparativna SFC (SFC-10)

Kolona: ChiralPakAY, 300 x 50 mm I.D., 10 µm

Mobilna faza: A za CO2i B za IPA

Gradijent: B 25%

Brzina protoka: 200 mL /min

Pozadinski pritisak: 100 bar

Temperatura kolone: 38°C

Talasna dužina: 220 nm

Vreme ciklusa: ~4.5 min

Analitički uslovi 2:

[0206]

Instrument: Waters UPC2 analitička SFC (SFC-H)

Kolona: ChiralPak AY, 150 x 4.6 mm I.D., 3 µm

Mobilna faza: A za CO2i B za IPA (0.05% DEA)

Gradijent: B 5-40%

Brzina protoka: 2.5 mL/min

Pozadinski pritisak: 100 bar

Temperatura kolone: 40°C

Talasna dužina: 220 nm

4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatna kiselina (izomer 1) .

[0207] Vreme zadržavanja 2.796 min. Dodeljena (R)-stereohemija upoređivanjem sa niže datim izomerom (2)

4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatna kiselina (izomer 2).

[0208] Vreme zadržavanja 3.264 min. Dodeljena (S)-stereohemija kristalografijom malih molekula BOC- oslobođenog materijala, kako je niže opisano.

(vi) Potvrda stereohemije

Trifluorosirćetna so (S)-4-amino-3-(3-hlorfenil)butanoatne kiseline

[0209] U rastvor 4-(terc-butoksikarbonilamino)-3-(3-hlorfenil)butanoatne kiseline izomer 2 (vreme zadržavanja 3.264 min prema analitičkom postupku 2) (1.5 g, 4.78 mmol) u dihlormetanu (20 ml) ohlađenom ledenom vodom se doda trifluorosirćetna kiselina (5 mL). Nakon dodavanja, smeša se meša 4 sata na toj temperaturi. Reaktivna smeša se nakon toga koncentruje. Sirova smeša se rastvori u vodi (10 mL) i liofilizira da se dobije produkt; TFA so (S)-4-amino-3-(3-hlorfenil)butanoatne kiseline (1.5 g, 95% prinos). LC-MS: m/z 214 (M+H)<+>(S)-4-Amino-3-(3-hlorfenil)butanoatna kiselina

[0210] U rastvor trifluoroacetatne soli (S)-4-amino-3-(3-hlorfenil)butanoatne kiseline (0.5 g, 1.53 mmol) u vodi (10 mL) se dodaje razblažen vodeni rastvor amonijum hidroksida sve dok pH ne dostigne 7. Dobijeni rastvor se ostavi u otvorenoj boci zapremine 25 mL i čuva na sobnoj temperaturi 1 dan. Nakon kristalizacije, osnovni rastvor se dekantuje i čvrsti kristali se podvrgnu studiji difrakcije X-zraka.

[0211] Studija difrakcije X-zraka pokazuje da jedinjenje ima (S) stereohemiju.

[0212] Uslovi difrakcije X-zraka:

Koristi se Bruker APEX-II CCD difraktometar.

[0213] Tokom prikupljanja podataka kristali se čuvaju na 302.71 K. Koristeći Olex2 (Dolomanov i saradnici), struktura je rešena pomoću ShelXT [2] programa za rešavanje strukture (Sheldrick A71) koristeći Intrinsic Phasing i redefinisana sa ShelXL [3] paketom za prečišćavanje koristeći metod najmanjeg kradrata (Sheldrick C71).

4-((terc-Butoksikarbonil)amino)-3-(2-hlorfenil)butanoatna kiselina

[0214]

[0215] Jedinjenje se izrađuje od 2-hlorcinamatne kiseline po postupku za 4-((tercbutoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatnu kiselinu kako je prethodno opisano u fazama (i) do (iii). Jedinjenje je dobijeno kao bezbojno ulje.

m/z 314 (MH<+>), C15H2OClNO4tačna masa 313.11.

3-Benzil-4-((terc-butoksikarbonil)amino)butanoatna kiselina

[0216]

[0217] Metil 3-benzil-4-nitrobutanoat (Tetrahedron Asymmetry, 19, 2008, 945) se konvertuje u naslovljeno jedinjenje po postupku za 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatnu kiselinu kako je prethodno opisano u fazama (i) do (iii).

m/z 294 (MH<+>), C16H23NO4tačna masa 293.16.

4-((terc-Butoksikarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoatna kiselina

[0218]

(i) Etil 3-(3-bromofenil)-4-nitrobutanoat

[0219]

[0220] Smeša natrijum hidrida (60%) u mineralnom ulju (394.26 mg, 9.86 mmol) i 1,2-dimetoksietana (22.5 mL) (DME) se ohladi na 0°C. U kapima se dodaje trietilfosfonoacetat (10.2 mL, 51.43 mmol) i smeša meša u toku 10 min. U kapima se dodaje rastvor 3-bromobenzaldehida (1.0 mL, 8.57 mmol) u DME (5 mL). Reaktivna smeša se zagreje na sobnu temperaturu i refluksuje 3h.

[0221] Smeša se upari do sušenja i ostatak podeli između heksana i vode. Vodeni sloj se izdvoji i ekstrahuje sa novom količinom heksana. Organski ekstrakti se kombinuju, isperu sa vodom, suše sa MgSO4, filtriraju i upare do sušenja. Ostaci se prečiste preko silika gela uz eluiranje sa petrol etrom 40-60 i etil acetatom (0-100%). Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare do sušenja, da se dobije etil (E)-3-(3-bromofenil)prop-2-enoat kao bela čvrsta supstanca (1.44 g, 65%). Supstanca se konvertuje u etil 3-(3-bromofenil)-4-nitrobutanoat koristeći uslove za nitraciju u izradi 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatne kiseline u fazi (i), kako je prethodno opisano, da se dobije produkt sa 60% prinosa.

m/z 316, 318 (MH<+>). C12H14BrNO4zahteva 315.01.

(ii) Etil 4-amino-3-(3-bromofenil)butanoat

[0222]

[0223] Etil 3-(3-bromoofenil)-4-nitrobutanoat (1.08 g) se konvertuje u etil 4-amino-3-(3-bromofenil)butanoat koristeći prethodno opisane uslove za 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatnu kiselinu u fazi (ii), da se dobije produkt sa 67% prinosa.

m/z 286 i 288 (MH<+>), C12H16BrNO2tačna težina 285.04.

(iii) Etil 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-bromofenil)butanoat

[0224]

[0225] Etil 4-amino-3-(3-bromofenil)butanoat (655 mg) se konvertuje u etil 4-((tercbutoksikarbonil)amino)-3-(3-bromofenil)butanoat po uslovima koji su prethodno opisano za 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatnu kiselinu u fazi (iii), da se dobije produkt u prinosu od 72%.

m/z 386 i 388 (MH<+>), C17H24BrNO4tačna težina 385.09.

(iv) Etil 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoat

[0226]

[0227] Smeša Ruphos (48.3 mg, 0.1 mmol), tribaznog kalijum fosfata (330 mg, 1.55 mmol), etil 3-(3-bromofenil)-4-(terc-butoksikarbonilamino)butanoata (200 mg, 0.52 mmol) i izobutilboratne kiseline (132 mg, 1.29 mmol) u toluenu (9 mL) se degasira četiri puta izvlačenjem/ispiranjem sa azotom a nakon toda se doda paladijum (II) acetat (5.8 mg, 0.03 mmol). Smeša se meša 100 min na 110°C. Reaktivna smeša se ostavi da se ohladi nakon čega se filtrira kroz Celite i ostavi u rastvoru u toku noći. Smeša se upari do sušenja i prečisti preko silika gela, uz eluiranje sa petrol etrom 40-60 i etil acetatom (0-100%). Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare do sušenja, da se dobije etil 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoat kao bezbojno ulje, (74 mg, 39%).

m/z 364 (MH<+>). C21H33NO4tačna težina 363.24.

(v) Naslovljeno jedinjenje

[0228] Smeša etil 4-(terc-butoksikarbonilamino)-3-(3-izobutilfenil)butanoata (74 mg, 0.2 mmol) i litijum hidroksida (15 mg, 0.6 mmol) u 1,4-dioksanu (3 mL) i vodi (3 mL) se meša 16 h na sobnoj temperaturi. Smeša se upari do sušenja i ostatak podeli između etil acetata i vode. Organska faza se izdvoji i odbaci. Vodena faza se zakiseli sa 1M HCl (aq) i ekstrahuje sa etil acetatom (x2). Organski ekstrakti se kombinuju, suše sa MgSO4, filtriraju i upare do sušenja, da se dobije 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoatna kiselina kao bezbojno ulje (65mg). m/z 336 (MH<+>) C19H29NO4tačna težina 335.21.

4-((terc-Butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorbenzil)butanoatna kiselina

[0229]

[0230] 2-(3-Hlorfenil) acetaldehid se konvertuje u etil 3-(3-hlorbenzil)-4-nitrobutanoat kako je opisano za 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoatnu kiselinu u fazi (i), kako je prethodno opisano. Redukcijom i zaštitom kao u fazama (ii) i (iii), a nakon toga hidrolizom kao u prethodnoj fazi (v) dobija se naslovljeno jedinjenje kao bezbojno ulje.

m/z 328 (MH<+>) . C16H22ClNO4tačna težina 327.12.

4-(((Benziloksi)karbonil)amino)-3-(3-izopropilfenil)butanoatna kiselina

[0231]

[0232] Smeša etil 4-amino-3-(3-izopropilfenil)butanoata (1.55g, 6.21 mmol) (izrađuje se po postupku za 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoatnu kiselinu faze (i) do (ii), kako je prethodno opisano) i natrijum bikarbonata (0.783 g 9.32 mmol) se rastvori u vodi (10 mL) i 1,4-dioksanu (5 mL). Smeša se ohladi u ledenom kupatilu i tretira sa rastvorom benzil hlorformata (0.98 mL, 6.84 mmol). Smeša se meša 1 h na 10°C, nakon toga ostavi da se zagreje na sobnu temperaturu. Nakon 20 h mešanja, smeša se upari do sušenja i ostatak podeli između dietil etra i 0.5 M vodenog rastvora HCl. Vodeni sloj se izdvoji i ekstrahuje sa novom količinom dietil etra. Organski ekstrakti se kombinuju, isperu sa slanim rastvorom, suše preko anhidrovanog MgSO4, i upare. Sirovi produkt se prečisti preko silika gela, uz eluiranje sa petrol etrom 40-60 i etil acetatom (0-100%). Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i upare do bledo žutog ulja (1.74g, 73%). Etil estar se hidrilizuje sa litijum hidroksidom kako je prethodno opisano u fazi (iii) za izradu 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3- izobutilfenil)butanoatne kiseline, a nakon atoga prečisti hromatografijom na silika gelu uz eluiranje sa petrol etrom 40-60 i etil acetatom (0-100%) da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bela čvrsta supstanca (60%).

m/z 356 (MH<+>). C21H25NO4tačna težina: 355.18.

4-([1,1’-bifenil]-3-il)-3-(((terc-butoksikarbonil)amino)metil)butanoatna kiselina

[0233]

(i) 4-Amino-3-(3-bromofenil)butanoatna kiselina hidrohlorid

[0234]

[0235] Smeša 4-(3-bromofenil)pirolidin-2-ona (1.0 g, 4.16 mmol) i 6 M vodenog rastvora HCl (15.0 mL, 90 mmol) se zagreva 16 h na 100°C. Smeša se upari do sušenja, ponovo upari zajedno sa vodom, nakon toga sa etil acetatom i nakon toga sa dihlormetan (DCM), da se dobije traženi produkt kao bela čvrsta supstanca, u pretpostavljenom kvantitativnom prinosu. m/z 258 i 260 (MH<+>) C10H12BrNO2tačna težina: 257.01.

(ii) 3-(3-Bromofenil)-4-(terc-butoksikarbonilamino)butanoatna kiselina

[0236]

[0237] Smeša 4-amino-3-(3-bromofenil)butanoatne kiseline hidrohlorid (1.31 g, 4.45 mmol), terc-butoksikarbonil terc-butil karbonata (Boc-O-Boc, 1.41g, 6.45mmol), 1,4-dioksana (8mL) i 1 M vodenog rastvora NaOH (8.0 mL, 8 mmol) se meša 64 h na sobnoj temperaturi. Smeša se upari do sušenja. Ostaci se rastvore u vodi, neutrališu sa 1 M vodenim rastvorom HCl i ekstrahuju sa etil acetatom (x 2). Organski ekstrakti se kombinuju, suše preko MgSO4, filtriraju i upare do sušenja, da se dobije traženi produkt (1.60 g, 86%) kao bezbojno ulje. m/z 357.5 i 359.4 (MH<+>). C15H20BrNO4tačna težina: 357.06.

(iii) Naslovljeno jedinjenje

[0238] Smeša 3-(3-bromofenil)-4-(terc-butoksikarbonilamino)butanoatne kiseline (2.69 g, 7.51 mmol), fenilboratne kiseline (2.3 g, 18.8 mmol), paladijum (II) acetata (84 mg, 0.38 mmol), Xphos (716 mg, 1.5 mmol) i tribaznog kalijum fosfata (4781.9 mg, 22.53 mmol) u 1,4-dioksanu (130 mL) se meša 2h na 100°C u atmosferi azota. Smeša se nakon toga ostavi da se ohladi na sobnu temperaturu, filtrira preko Celite, ispere sa etil acetatom i upari do sušenja. Ostaci se prečiste preko silika gela, uz eluiranje sa petrol etrom i etil acetatom (0-100%). Odgovarajuće frakcije se kombinuju i upare do sušenja, da se dobije traženi produkt, 1.44g, kao siva čvrsta supstanca (42% prinos).

m/z 355 (M<+>), nađeno. C21H25NO4tačna masa: 355.18.

(iv) Asimetrično razdvajanje

[0239] 4-([1,1’-bifenil]-3-il)-3-(((terc-butoksikarbonil)amino)metil)butanoatna kiselina (1.44 g) se rastvori u 30 mg/mL u MeOH i nakon toga se prečisti pomoću SFC, po niže datom postupku. Kombinovane frakcije svakog od izomera 1 (brže-protočne) i izomera 2 (sporijeprotočne) se nakon toga upare skoro do sušenja koristeći rotacioni evaporator, prenesu u finalne posude sa DCM, iz kojih je prethodno uklonjen pod strujom komprimovanog vazduha na 40°C a nakon toga ostavi u vakuumskoj pećnici na 40°C i 5 mbar do konstantne težine.

[0240] 4-([1,1’-bifenil]-3-il)-3-(((terc-butoksikarbonil)amino)metil)butanoatna kiselina izomer 1. Bela čvrsta supstanca 523 mg. Vreme zadržavanja: (uslovi analize 3) 2.70 min. ee 99.8%.

[0241] 4-([1,1’-bifenil]-3-il)-3-(((terc-butoksikarbonil)amino)metil)butanoatna kiselina izomer 2. Bela čvrsta supstanca 537 mg. Vreme zadržavanja: (uslovi analize 3) 3.46 min. ee 99.8%.

Uslovi prečišćavanja 3:

[0242]

Berger Multigram II SFC

Detalji kolone: Lux A1 (Phenomenex, 21.2 mm x 250 mm, 5 µm)

temperatura kolone: 40°C

Brzina protoka: 50 mL/min

BPR: 100 BarG

Detektor talasne dužine: 215 nm

Zapremina injektora: 1,000 µL (30 mg)

Izokratski uslovi: 15:85 EtOH:CO2(0.2% v/v NH3)

Uslovi analize 3:

[0243]

Waters UPC2

Detalji kolone: Amy-C ( YMC Gmbh, 4.6 mm x 250 mm, 5 µm)

temperatura kolone: 40°C

Brzina protoka: 4 mL/min

Detektor talasne dužine: 210-400nm

Zapremina injektora: 1.0 µL

BPR: 125 BarG

Izokratski uslovi: 15:85 EtOH:CO2(0.2% v/v NH3)

4-((terc-Butoksikarbonil)amino)-3-(3-metilfenil)butanoatna kiselina

[0244]

[0245] 4-(3-Metilfenil)pirolidin-2-on se konvertuje u naslovljeno jedinjenje po postupku koji je prethodno opisan za izradu 4-([1,1’-bifenil]-3-il)-3-(((tercbutoksikarbonil)amino)metil)butanoatne kiseline u fazama (i) do (ii). Naslovljeno jedinjenje se dobija kao bezbojno ulje.

m/z 294 (MH<+>). C16H23NO4tačna težina 293.16.

4-((terc-Butoksikarbonil)amino)-3-(3,5-dihlorfenil)butanoatna kiselina

[0246]

[0247] 3,5-Dihlorbenzaldehid se konvertuje u naslovljeno jedinjenje po postupku koji je prethodno opisan za izradu 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-izobutilfenil)butanoatne kiseline u fazama (i) do (iii). Etil estar se hidrilizuje kako je opisano u fazu (v) u izradi (3-izobutilfenil)butanoatne kiseline, da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bezbojno ulje. m/z 348. (MH<+>). C15H19Cl2NO4tačna težina 347.07.

4-((terc-Butoksikarbonil)amino)-3-(3-(tiofen-3-il)fenil)butanoatna kiselina

[0248]

[0249] Etil 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-bromofenil)butanoat (207 mg, 0.54 mmol) reaguje sa 3-tienilboratnom kiselinom po prethodno opisanom postupku za izradu (3-izobutilfenil)butanoatne kiseline u fazi (iv). Produkt se hidrilizuje kako je opisano u fazi (v) da se dobije naslovljeno jedinjenje kao bezbojno ulje.

m/z 362 (MH<+>). C19H23NO4S tačna težina 361.13.

Međuproizvodi Polimiksin Nonapeptida i jedinjenja produkta

Međuproizvod 1: H-Thr(O-tBu)-Dap(BOC)-Ciklo[Dab-Dab(BOC)-DPhe-Leu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr]

[0250] Prethodno opisan u WO 2015/135976 kao Međuproizvod 11 - Tetra- (N-Boc)-L-Thr(O-tBu)-L-Dap-Polimiksin B heptapeptid.

Međuproizvod 2: H-Thr(O-tBu)- Dap(BOC)-Ciklo[Dab-Dab(BOC)-Leu-Leu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr]

[0251] Prethodno opisan u WO 2015/135976 kao Međuproizvod 14 - Tetra- (N-Boc)-L-Thr(O-tBu)-L-Dap-Polimiksin E heptapeptid.

Međuproizvod 3: H-Thr(O-tBu)- Dap(BOC)-Ciklo[Dab-Dab(BOC)-Dleu-L-Abu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr(O-tBu)]

[0252]

(i) CBZ-Thr(O-tBu)-Dap(Boc)-Dab-Dab(Boc)-Dleu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu)-je izrađen na smoli sintezom čvrste faze peptida koristeći Fmoc hemiju, po metodologiji za prethodno opisan opšti postupak 3. Sekvence su započele sa hlortritil hlorid (CTC)-smolom (2.0 g), prethodno napunjene sa Fmoc-Thr(tBu)-OH do količine od 0.75 mmol/g. Peptid vezan za smolu (3.93 g, koji odgovara 1.5 mmol) se stavi u konusnu bocu zapremine 500 mL i tretira sa 4% hidrazinom u DMF (100 mL). Smeša se stavi u šejker i blago mućka 30 min. Smeša se sipa u sinterovanu kolonu, nakon toga ispere sa DMF (3 x 100 mL). Primenom vazduha pod pritiskom uklone se poslednji tragovi DMF. Postupak se nakon toga ponovi sa THF i sa DCM.

[0254] Smola se nakon toga tretira sa 4:1 DCM: heksafluoroizopropanol (100 mL) da dođe do cepanja peptida od smole. Nakon 30 min kolona se osuši i postupak se ponovi. Smola se nakon toga tri puta ispere sa DCM (100 mL). Kombinovani eluenti i ispirci se upare pod sniženim pritiskom i suše pod vakuumom u toku noći. Dobija se 724 mg bele čvrste supstance (2.35 g, quant.).

m/z 1552, C73H126N14O22očekivano 1550.92.

(ii) CBZ-Thr(O-tBu)- Dap(Boc)-ciklo[Dab-Dab(Boc)-DLeu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu)]

[0255] Sirovi CBZ-Thr(O-tBu)-Dap(Boc)-Dab-Dab(Boc)-DLeu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu)-OH (724 mg, 0.466 mmol) se rastvori u DMF (75 mL), tretira sa diizopropiletilaminom (DIPEA) (361 mg 0.49 mL, 2.8 mmol), a nakon toga ohladi u ledenom kupatilu. U kapima se dodaje difenil fosforil azid (256 mg, 0.2 mL, 0.93 mmol), nakon toga smeša meša 2 h uz hlađenje u ledenom kupatilu. Ledeno kupatilo se ukloni i rastvor meša na sobnoj temperaturi narednih 2 h. Rastvarač se upari i ostatak prenese na SiO2ISCO kolonu (40 g) i prečisti hromatografijom sa 0-10% MeOH u DCM. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i upare do bele pene. Dobija se 418 mg (58%).

m/z 1534, C73H124N14O21zahteva 1532.91.

(iii) Naslovljeno jedinjenje

[0256] CBZ-Thr(O-tBu)- Dap(Boc)-ciklo[Dab-Dab(Boc)-DLeu-L-Abu-Dab(Boc)-Dab(Boc)-Thr(O-tBu)] (531mg, 0.346 mmol) se rastvori u metanolu (50 mL) i tretira sa amonijum formatom (545 mg, 8.6 mmol) i 10% Pd/C (173 mg). Nakon mešanja na sobnoj temperaturi u toku noći, reaktivna smeša se filtrira kroz Celite i ostatak ispere sa MeOH. Rastvarač se upari i ostatak rastvori u EtOAc, koji sadrži 10% MeOH, ispere sa vodom x 3 i suši sa magnezijum sulfatom. Rastvarač se upari da se dobije bela čvrsta supstanca. Kako bi se uklonili tragovi formata, čvrsta supstanca se rastvori u metanolu (160 mL) i mućka sa Ambersep 900 smolom (12 mL) u toku 30 minuta. Smeša se filtrira i upari do sušenja, da se dobije 464 mg bele čvrste supstance (96%).

m/z 1400, C65H118N14O19očekivano 1398.87.

Opšti postupci

[0257] Potpune sinteze derivata polimiksin nonapeptida se izvode kako je niže dato.

[0258] Linear peptid sa ortogonalnom zaštitom γ-amino grupe Dab ostatka uključenog u ciklizaciju se sklopi na smoli, sa C-terminalnom amino kiselinom (obično Thr) vezanom za čvrstu fazu. Nakon delimične deprotekcije Dab uključene u ciklizaciju (ostatak 4 u polimiksin sistemu numeracije), a nakon toga uklanjanjem sa smole, dobijeni linearni peptidi se ciklišu van smole. Koriste se dva opšta postupka, kako je niže opisano.

Opšti postupak 1: potpuna sinteza koristeći CBZ zaštitu amino grupa

[0259] Sinteza zaštićenog linearnog peptida (ostaci 2-10 i N-terminalne grupe) se izvodi u automatizovanom sintesajzeru peptida koristeći standardnu Fmoc hemiju čvrste faze peptida. Posebno, sinteza se izvodi upotrebom Fmoc-Thr(tBu)-PEG-PS smole kao početnog materijala. Udvajanje Fmoc-amino kiselina sa CBZ zaštitom na terminalnim amino grupama se izvodi korišćenjem 5 molarnih ekvivalenata (u odnosu na količinu smole) Fmoc amino kiseline i HATU u DMF sa aktivacijom in situ, koristeći 10 molarnih ekvivalenata DIPEA. Fmoc deprotekcija se izvodi korišćenjem 20% piperidina u dimetilformamidu. BOC se koristi kao ortogonalna zaštitna grupa na Dab uključenoj u ciklizaciji.

[0260] Smola za koju je vezan linearni peptid se tretira sa TFA/TIS/H2O (96/2/2v/v) u toku 2 h da se oslobodi Dab ostatak uključen u ciklizaciju i da dođe do cepanja peptida od smole. Ovaj materijal se ciklizuje pomoću PyBop/HOBt/NMM (4/4/8 molarni ekvivalenti u odnosu na početne količine) u DMF u toku 3 h. Sirovi materijal se delimično upari, prenese u smešu acetonitril/voda i liofilizira u toku noći. CBZ grupe se nakon toga uklone koristeći 10% Pd/C u smeši acetatna kiselina/Me OH/voda (5/4/1 v/v).

[0261] Sirovi produkt se prečisti a diastereomeri se razdvoje preparativnom HPLC (Tabela 3). Napomena, specifični uslovi su optimizovani za svaki par diastereomera.

Opšti postupak 2: potpuna sinteza korišćenjem Boc zaštite amino grupa

[0262] Sinteza zaštićenog linearnog peptida (ostaci 2-10 i N-terminalna grupa) se izvodi na automatizovanom sintesajzeru peptida koristeći Fmoc hemiju čvrste faze peptida. Posebno, sinteza se izvodi upotrebom hlortritil hlorid (CTC)-smole, u koju je prethodno dodat Fmoc-Thr(tBu)-OH (količina ~0.78mmol/g), na skali od 0.05 - 0.1 mmol. Udvajanje Fmoc-amino kiselina se izvodi korišćenjem 5 molarnih ekvivalenata (u odnosu na količinu smole) Fmoc amino kiseline i HATU u DMF uz aktivaciju in situ, upotrebom 10 molarnih ekvivalenata DIPEA. Fmoc deprotekcija se izvodi upotrebom 20% piperidina u dimetilformamidu. ivDde zaštitna grupa se koristi kao ortogonalna zaštita na Dab ostatku uključenom u ciklizaciju.

[0263] Za uklanjanje ivDde grupe, linearni peptid se tretira sa 3% hidrazinom u DMF (100 mL po 100 µmol, ponavlja se dva puta) a nakon toga ispira sa DMF x 3, EtOH x 3 i dietil etrom x 3. Delimično deprotektovan linearni peptid se nakon toga cepa od smole ispiranjem smole sa 20% HFIP u DCM. Dobijeni ostatak se rastvori u smeši 50% acetonitril/voda i suši zamrzavanjem u toku noći. Zaštićeni linearni peptid se rastvori in DMF (20 mL/mmol smole) ciklizuje sa DPPA, (3 molarna ekvivalenta u odnosu na količinu smole) i DIPEA (6 molarnih ekvivalenata u odnosu na količinu smole). Ovaj rastvor se meša u toku noći na sobnoj temperaturi. BOC grupe se uklone sa TFA a sirovi peptid liofilizira.

[0264] Sirovi produkt se prečisti i diastereomeri razdvoje preparativnom HPLC koristeći uslove za preparativnu HPLC 4, kako je niže opisano. Napomena, specifični uslovi su optimizovani za svaki par diastereomera.

Opšti postupak 3: Udvajanje kiseline za nonapeptid i razdvajanje

[0265] Postupci za udvajanje N terminusa nonapeptida za amino kiselinu su niže opisani u vezi sa primerima jedinjenja 5 i 6. Opisani uslovi mogu da se prilagode drugim kombinacijama nonapeptida i amino kiseline.

Faza 1

[0266] H-Thr(O-tBu)-Dap(BOC)-Ciklo[Dab-Dab(BOC)-DPhe-Leu-Dab(BOC)-Dab(BOC)-Thr]. (Međuproizvod 1) (0.07 mmol) se rastvori u dihlormetanu (4 mL) i tretira sa 4-((tercbutoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatnom kiselinom (1.5 ekvivalent u odnosu na polimiksin substrat), N,N-diizopropiletilaminom (3.0 equiv.), a nakon toga sa HATU (2.0 equivalent). Nakon 16 h, završetak reakcije se potvrdi pomoću LCMS i reaktivna smeša se upari do sušenja. Doda se voda (približno 10 mL) i smeša triturira a nakon toga energično meša u toku 1 h. Dobijeni precipitat se sakupi filtriranjem i suši pod vakuumom u toku noći.

Faza 2

[0267] Boc-zaštićeni derivat iz Faze 1 se rastvori u dihlormetanu (3 mL) i tretira sa TFA (1 mL). Reaktivna smeša se meša na sobnoj temperaturi sve dok se pomoću LCMS ne potvrdi da je deprotekcija završena. Rastvarač se upari i ostatak prečisti preparativnom HPLC hromatografijom koristeći uslove date za uslove preparativne HPLC 4 za razdvajanje diastereomera. Frakcije koje sadrže ranije izdvojeni diastereomer se kombinuju, upare do male zapremine i liofiliziraju da se dobije Primer 5 kao TFA so. Frakcije koje sadrže kasnije izdvojeni diastereomer se kombinuju, upare do male zapremine i liofiliziraju da se dobije Primer 6 kao TFA so.

[0268] Treba imati na umu da su specifični uslovi optimizovani za svaki par diastereomera.

Preparativna HPLC uslovi 4:

[0269]

Kolona: Waters Sunfire C18 OBD 5 µm x 19 mm x 150 mm

Mobilna faza: A: voda/acetonitril 90/10, v/v, 0.15% TFA

B: acetonitril/voda 90/10, v/v, 0.15% TFA

Brzina protoka : 10 mL/min

Gradijent: Vreme (min) % mobilna faza A

0 100%

3 100%

8 85%

13.5 85%

15 75%

18 0%

23 100%

25 100%

Detekcija: 210 nm

Analitička HPLC uslovi 4:

[0270]

Kolona: Phenomenex Hyperclone C18 BDS 5 µm x 4.6 mm x 150 mm Mobilna faza: A: voda/acetonitril 90/10, v/v, 0.15% TFA.

B: acetonitril/voda 90/10, v/v, 0.15% TFA

Brzina protoka: 1 mL/min

Gradijent: Vreme (min) % mobilna faza A

0 100%

21 0%

23 0%

23.5 100

25 100

Detekcija: 210, 254 nm

Zapremnina injektiranja: 20 µL

Opšti postupak 3b: Udvajanje pojedinačnih enantiomera za nonapeptid

[0271] Enantiomerno čiste amino kiseline se udvoje sa N terminusom nonapeptid jedinjenja koristeći iste uslove kako je prethodno opisano za Opšti postupak 3a za enantiomerno izmešane amino kiseline.

Jedinjenja Primera 5 i 6

Udvajanje 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatne kiseline (izomer 2)

[0272] (Vreme zadržavanja 3.46 min analitički postupak 1 ili 3.264 min analitički postupak 2) po uslovima opšteg postupka 3a a nakon toga deprotekcijom dobija se Primer 5. Primeru (5) je dodeljena (S) stereohemija nakon određivanja X-zracima apsolutne konfiguracije 4-amino-3-(3-hlorfenil)butanoatne kiseline dobijene od 4-((terc-bu- toksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatne kiseline (izomer 2).

[0273] Udvajanjem 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatne kiseline (izomer 1, Vreme zadržavanja 2.89 min analitički postupak 1 ili 2.796 min analitički postupak 2) pod uslovima za Opšti postupak 3a a nakon toga deprotekcijom se dobija Primer 6. Primeru (6) je dodeljena (R) stereohemija nakon određivanja X-zracima apsolutne konfiguracije 4-amino-3-(3-hlorfenil)butanoatne kiseline dobijene od 4-((terc-butoksikarbonil)amino)-3-(3-hlorfenil)butanoatne kiseline (izomer 1).

Opšti postupak 4: konverzija u acetatnu so

[0274] Acetatni oblik AG1-X2 smole (Bio-Rad Laboratories Ltd) 200-4-meša se regeneriše ispiranjem sa 10% vodenim rastvorom sirćetne kiseline a nakon toga sa 1% vodenim rastvorom sirćetne kiseline i prenese u friturirani nosač. Rastvor jedinjenja u obliku TFA soli u vodi se nanese na kolonu, koristeći punjenje od 30 g smole za 1 g TFA soli i kolona ostavi da kaplje pod gravitacijom, uz eluiranje sa vodom. Frakcije koje sadrže produkt se kombinuju i liofiliziraju do bele čvrste supstance.

Analize finalnih jedinjenja se vrše pomoću HPLC koristeći uslove koji su prethodno opisani (uslovi za analitičku HPLC).

[0275] Niže je dat primer analitičkih podataka za jedinjenja iz Primera 5 i 6 kao acetatnih soli.

[0276] Primer 5: (brži izomer)<1>H NMR acetatne soli (400 MHz, D2O): δ (ppm) 0.70 (3 H, d, J 6.1 Hz), 0.77 (3 H, d, J 6.3 Hz), 0.78-0.90 (1H, m), 1.13 (3H, d, J 6.3 Hz), 1.17 (3H, d, J 6.4Hz), 1.36-1.52 (2H, m), 1.75-2.06 (17 H, m, uključuje 1.91, s, OAc), 2.10-2.30 (4H, m), 2.72-2.91 (4H, m), 3.02-3.49 (14H, m), 4.12-4.32 (8 H, m), 4.48 (1 H, dd, J 5.6, 9.0 Hz), 4.54-4.60 (1H, m), 4.63-4.68 (1H, m), 7.25-7.41(9H, m). m/z 1145 [MH<+>], 573[M+2H]<2+>.

[0277] Primer 6: (sporiji izomer)<1>H NMR acetatne soli (400 MHz, D2O): δ (ppm) 0.60- 0.67 (6 H, m), 0.69 - 0.84 (4 H, m), 1.16 (3H, d, J 6.4Hz), 1.33-1.50 (2 H, m), 1.76-2.04 (19 H, m, uključuje 1.88, s, OAc), 2.06-2.26 (4 H, m), 2.67-2.86 (4 H, m), 3.00-3.46 (14 H, m), 3.98-4.04 (1 H, m) 4.14-4.30 (7H, m), 4.45 (1 H, dd, J 5.6, 9.0 Hz), 4.54 (1 H, pojavljuje se kao t, J 8.3 Hz), 4.72 (1 H, dd, J 5.0, 8.9 Hz), 7.20-7.40 (9 H, m). m/z 1145 [MH<+>], 573[M+2H]<2+>.

[0278] U svim primerima, diastereomeri su bili dodeljeni na bazi vremena zadržavanja pri HPLC (brzo i sporo eluirani izomeri) zajedno sa hemijskim promenama Thr ostatka koji se kreću od 1.13 ppm u brzo eluiranom izomeru, do približno 0.65 ppm u sporo eluiranom izomeru.

Primer i Rerferentna jedinjenja

[0279] Tabela 1 daje primer jedinjenja iz pronalaska zajedno sa referentnim jedinjenjima datim za korisno razumevanje pronalaska. Ovo su jedinjenja koja imaju opštu strukturu kako je niže pokazano:

[0280] Grupa R je u tabeli pokazana zajedno sa ostacima amino kiselina na položajima 6 i 7 (AA-6 i AA-7 tim redom, koristeći sistem numeracije za polimiksin).

[0281] U ovom primeru i jedinjenjima referentnog primera, ostatak amino kiseline na položaju QQQ je L-Thr, ostatak amino kiseline na položaju 3 je L-Dap i amino kiselina na položaju QQQ je L-Thr.

[0282] Apsolutna stereohemija u bočnom lancu -R je dodeljena poređenjem sa primerom 5 i Primerom 6 koji su u korelaciji sa materijalom poznate apsolutne stereohemije.

[0283] U primerima i referentnim primerima 1-6 i 15-33 određivanje je izvršeno poređenjem relativnih vremena zadržavanja i<1>H NMR spektra diastereomera (na primer, uzimajući u obzir hemijske promene Thr ostatka na položaju 2).

[0284] U referentnim Primerima 7-14 određivanje je izvršeno poređenjem relativnih vremena zadržavanja HPLC diastereomera.

[0285] Tabela daje HPLC vremena zadržavanja za jedinjenja iz primera. Uslovi HPLC korišćeni za analizu su niže navedeni.

Kolona: Phenomenex Hyperclone BDS C18, 4.6 mm x 150mm, 5 µm

Brzina protoka: 1 mL/min

Eluent:

A = 10% AcN/90 % Voda/0.15% TFA

B = 90% AcN/10 %voda/0.15% TFA

Gradijent:

minuta %A %B

0 100 0

20 40 60

21 0 100

23 0 100

23.5 100 0

25 100 0

Detekcija: 210, 254 nm

[0286] U Tabeli 1, zvezdica (*) ukazuje na referentni primer.

ja eninj jed atn enferrer

er i im

- Pr1 ael

Tab

l t

l t

l t

l t

Biološki rezultati

[0287] Testirana su jedinjenja iz pronalaska i referentni primeri a rezultati su upoređivani sa komparativnim primerima koji uključuju jedinjenja prethodno zabeležena u tehnici.

Određivanje MIC

[0288] Inokulum je izrađen pripremom direktne suspenzije izolovanih kolonija (izabranih nakon 18-24 sata sa Mueller-Hinton agar ploče) podešene sa 0.5 McFarland standardom. Ispitivanje MIC se izvodi sa dvostrukim serijskim razblaženjima antibiotika u katjon-podešenom Mueller-Hinton bujonu u sterilnim mikrotitarskim pločama sa 96 udubljenja u ukupnoj zapremini od 170 µL (150 µL bujona koji sadrži antimikrobno sredstvo, 20 µL inokuluma). Analize se izvode u duplikatu. Ploče se inkubiraju aerobno bez mućkanja 18-20 sati na 35°C pri čemu se MIC definiše kao najmanja koncentracija leka koja sprečava vidljivi rast. Nekoliko jedinjenja je podvrgnuto višestrukim testovima i tamo gde je to slučaj, prisutna MIC je srednja dobijena vrednost. MIC vrednosti su izrađene u µg/mL.

In Vitro ispitivanje toksičnosti za renalne ćelije

[0289] In vitro ispitivanje toksičnosti za renalne ćelije se izvodi u skladu sa niže datim protokolom.

[0290] HK-2 ćelije se održavaju i ispituju u Keratinocyte-SFM medijumu obogaćenom sa 5 ng/mL Epidermal Growth Factor (EGF) i 50 µg/mL Bovine Pituitary Extract (BPE). Ćelije se zaseju sa po 7,500 ćelija po udubljenju u ploče sa 96 udubljenja i ostave da se šire u toku noći. Polimiksin B (PMB) i test jedinjenja se rastvore u 10% DMSO u vodi da se dobije osnovni rastvor od 20 i 60 mg/mL, tim redom. Test jedinjenja se razblaže da se dobije najveća koncentracija od 3,000 ili 1,000 µg/mL sa semi-log razblaženjima da se dobije opseg od 9 tačaka koncentracije plus vehikulum kontrola. PMB se takođe razblaži da se dobije najveća koncentracija od 1,000 µg/ml sa semi-log razblaženjima. Vrednosti vode i DMSO se održavaju konstantno na 5% i 0.5% tim redom. Test jedinjenja se inkubiraju sa ćelijama u toku 24 h na 37°C 5% CO2u vlažnoj atmosferi. CellTiter-Blue se razblaži u PBS (1:4), doda 20% (v/v) i inkubira 2 h na 37°C a nakon toga se detektuje fluorescentni produkt.

[0291] Pozadinske vrednosti samo za medijum su oduzete pre analize rezultata GraphPad Prism.

Pojedinačne vrednosti su normalizovane sa udubljenjima vehikulum kontrole za svako jedinjenje. Vrednosti koncentracije jedinjenja su nanete kao log vrednosti da se omogući izrada krive dozaodgovor. Početak krive je označen kao nula i određene su IC50vrednosti.

[0292] IC50vrednosti se ispoljavaju u odnosu na vrednosti za PMB u istom eksperimentu. Kada je izvršeno više određivanja, date su srednje vrednosti.

Merenja vrednosti u bubregu nakon četiri sata.

[0293] Jedinjenja se doziraju subkutano u količini od 17.2 mg/kg slobodne baze na miševima (n = 2 ili 3). Četiri sata nakon doziranja, životinje se eutaniziraju i bubrezi odstrane, očiste od masnog i vezivnog tkiva, izmere i odmah brzo zamrznu. Nakon topljenja na sobnoj temperaturi, parovi bubrega iz svake životinje se prenesu u konusne epruvete zapremine 2 mL u kojima se nalaze prethodno odmerene cerijum stabilizovane perle cirkonijum oksida. Doda se trifluorosirćetna kiselina, TFA (0.25 mL, 0.15% v/v u vodi) i epruvete se stave na FastPrep-24 homogenizator (MP Biomedicals Europe) i podvgnu tri ciklusa od po 30 sekundi pri brzini od 6 m/sec. Alkvot (200 µL) homogenata se razblaži sa izračunatom zapreminom TFA rastvora (0.15% v/v u vodi) da se dobije finalna koncentracija od 0.167 grama bubrega/gram homogenata.

[0294] Homogenati bubrega (100 µL) se izmešaju sa metanolom (190 µL) i TFA (110 µL, 10% v/v u vodi) i ostave u toku noći na -20°C zbog precipitacije proteina. Nakon 10 minuta centrifugiranja pri 13,000rpm i na 6°C, 200 µL supernatanta se prenese u staklene umetke i analizira pomoću LC-MS-MS.

Tabela 2 – Biološki rezultati

nastavla se

Dodatni biološki rezultati

Poređenje renalne toksičnosti - Primera 5 i Referentnih Primera D77 i 38

[0295] Miševima (n = 6) se subkutano tri puta dnevno doziraju Polimiksin B, kolistin sulfat, Referentni primer D77, Referentni Primer 38 ili Primer 5 u količini od 17.2 mg slobodne baze/kg. Sa početkom odmah nakon prve doze na dan 4, miševi se prenesu u pojedinačne metaboličke kaveze i naredna 24 sata se uzima urin da se odredi vrednost biomarkera (albumin, cistatin C, KIM-1). Geometrijski prosek vrednosti biomarkera je pokazan u niže datoj tabeli:

[0296] PMB pokazuju raspon od 4 eksperimenta a kolistin od 2 eksperimenta.

[0297] Porast albumina, cistatina C ili KIM-1 u urinu su znaci oštećenja bubrega. Primer 5 pokazuje najniže vrednosti za sva 3 biomarkera renalne toksičnosti.

[0298] Referentni Primer D77 je opisan u WO 2015/135976. Referentni Primer 38 je opisan u WO 2016/083531.

Poređenje renalne toksičnosti - Primeri 5, 9 i 17

[0299] Miševima (n = 6) se subkutano doziraju PMB, Primer 5, Referentni Primer 9 ili Referentni Primer 17 u količini od 25 mg slobodne baze/kg podeljeno u 4 doze u intervalima od 8 h. Nakon četvrte doze, životinje se prenesu u pojedinačne metaboličke kaveze i u toku 24 h se uzima urin za određivanje urinarnih biomarkera. Nakon uzimanja urina, miševi se eutaniziraju a bubrezi uzmu za histopatologiju.

[0300] Ni jedna od životinja u grupama Primera 5 ili Referentnog Primera 9 nije histopatologijom pokazala bilo koji znak degeneracije ili regeneracije. Nasuprot tome, svih 6 životinja treteiranih sa PMB su pokazali minimalnu tubularnu regeneraciju.

[0301] U odvojenom eksperimentu, Referentni Primer 17 je upoređivan sa PMB.

[0302] Takođe su procenjeni znaci histopatologije:

Upoređivanje renalne toksičnosti za Primer 5 i PMB kod cinomolgus majmuna

[0303] Mužjacima cinomolgus majmuna (n = 3) je u toku 1 h intravenskom infuzijom doziran Primer 5 u količini od 20mg/kg/doza, 3 puta dnevno u toku 7 dana. U odvojenom eksperimentu, mužjacima miševa (n = 3) je na isti način doziran PMB u količini od 4mg/kg/doza. U oba eksperimenta, kontrolnim životinjama je 3 puta dnevno doziran fiziološki rastvor.

[0304] Po završetku perioda od 7 dana, uzima se krv i u serumu se određuju vrednosti azota uree i kreatinina kao indikatora oštećenja bubrega. U slučaju Primera 5, srednja BUN i vrednosti kreatinina su povećane manje od 50% u poređenju sa kontrolnim životinjama koje su primale fiziološki rastvor. Međutim, za životinje dozirane sa PMB, vrednost BUN je povećana 76% u poređenju sa kontrolnim životinjama a vrednost kreatinina je bila 2.6 x veća.

[0305] Bubrezi su uzeti na kraju 7-dnevnog perioda doziranja i mikroskopski ispitani. Od 3 životinje tretirane sa PMB, kod 2 je pokazana blaga tubularna degeneracija a kod 1 minimalno. Od životinja tretiranih sa Primerom 5, 1 je pokazala blagu tubularnu degeneraciju a 2 su pokazale minimalnu degeneraciju.

[0306] Doza u ovim eksperimentima je bila 5 x veća za Primer 5 nego za PMB, ali su znaci renalne toksičnosti smanjeni. Nađena količina leka iz jednog ciklusa doziranja na dan 7 doziranja (AUC0-8hr) je bila 234 µg.hr/mL za Primer 5 i 117 µg.hr/mL za PMB.

Efikasnost jedinjenja u modelu neutropenične butine miševa inficiranih sa E. coli ATCC 25922

[0307] Nakon neutropenije (ciklofosfamid 150 mg/kg d-4, 100 mg/kg d-1), CD-1 miševima (n = 5) je u svaku butinu inokulirano približno 105 cfu E. coli ATCC25922. Miševima je IV dozirano 0.125, 0.5 i 3 mg/kg PMB sulfata ili test jedinjenja (ekvivalentno težini slobodne baze) 1, 3.5 i 6 h nakon infekcije. Devet h nakon infekcije miševi su eutanizirani a butine pripremljene za brojane kolonija.

[0308] Smanjenje u broju kolonija u odnosu na kontrolu sa vehikulumom je pokazano u niže datoj tabeli. U svakom slučaju, smanjenje uočeno sa PMB u istom eksperimentu je pokazano u zagradama:

[0309] Sva jedinjenja su slično efikasna kao PMB.

Efikasnost jedinjenja u modelu neutropenične butine miševa inficiranih sa K. Pneumoniae ATCC 43816

[0310] Nakon neutropenije (ciklofosfamid 150 mg/kg d-4, 100 mg/kg d-1), CD-1 miševima (n = 5) je u svaku butinu inokulirano približno 105 cfu K. pneumoniae ATCC43816. Miševima se IV doziraju odgovarajuće doze PMB sulfata ili test jedinjenja (ekvivalentno težini slobodne baze) za 2, 6 i 10 h nakon infekcije. Šesnaest h nakon infekcije miševi se eutaniziraju i butine pripreme za brojanje kolonija.

[0311] Smanjenje u broju kolonija u odnosu na kontrolu sa vehikulumom je pokazano u niže datoj tabeli. U svakom slučaju, smanjenje uočeno sa PMB u istom eksperimentu je pokazano u zagradama:

[0312] Oba jedinjenja su slično efikasna kao PMB.

Efikasnost jedinjenja u modelu neutropenične butine miševa inficiranih sa A. baumannii NCTC13301

[0313] Nakon neutropenije (ciklofosfamid 150 mg/kg d-4, 100 mg/kg d-1), CD-1 miševima (n = 5) je u svaku butinu inokulirano približno 105 cfu A. baumannii NCTC13301. Miševi su IV dozirani sa 0.125, 0.5, 1 i 4 mg/kg PMB sulfata ili test jedinjenja (ekvivalentno težini slobodne baze) za 2, 6 i 10 h nakon infekcije. Šesnaest h nakon infekcije miševi se eutaniziraju i butine pripreme za brojanje kolonija.

[0314] Smanjenje u broju kolonija u odnosu na kontrolu sa vehikulumom je pokazano u niže datoj tabeli. U svakom slučaju, smanjenje uočeno sa PMB u istom eksperimentu je pokazano u zagradama:

[0315] Oba jedinjenja su slično efikasna kao PMB.

Efikasnost jedinjenja u modelu neutropeničnog pluća miševa inficiranih sa A. baumannii NCTC13301

[0316] Nakon neutropenije (ciklofosfamid 200 mg/kg d-4, 150 mg/kg d-1), CD-1 miševima (n = 8) je intranazalno inokulirano približno 107 cfu A. baumannii NCTC13301 po pluću.

Miševima je SC doziran PMB sulfat (20 mg/kg) ili odgovarajuća doza test jedinjenja (ekvivalenta težina slobodne baze) za 2, 6 i 10 h posle infekcije. Šesnaest h nakon infekcije miševi se eutaniziraju i pluća pripreme za brojanje kolonija.

[0317] Smanjenje u broju kolonija u odnosu na kontrolu sa vehikulumom je pokazano u niže datoj tabeli. U svakom slučaju, smanjenje uočeno sa PMB u istom eksperimentu je pokazano u zagradama:

[0318] PMB nije efikasan u ovom modelu u maksimalnoj tolerantnoj dozi. Primer 5 je mnogo efikasniji u dozi od 20 mg/kg a mogao bi takođe da bude doziran u većim vrednostima da se postigne veći efekat zbog smanjene toksičnosti

Efikasnost jedinjenja u modelu neutropeničnog pluća miševa inficiranih sa P. aeruginosa ATCC 27853

[0319] Nakon neutropenije (ciklofosfamid 200 mg/kg d-4, 150 mg/kg d-1), CD-1 miševima (n = 8) je intranazalno inokulirano približno 104 - 105 cfu P. aeruginosa ATCC27853 po pluću. Miševima je SC doziran PMB sulfat (20 mg/kg) ili odgovarajuća doza test jedinjenja (ekvivalenta težina slobodne baze) za 2, 6 i 10 h posle infekcije. Šesnaest h nakon infekcije miševi se eutaniziraju i pluća pripreme za brojanje kolonija.

[0320] Smanjenje u broju kolonija u odnosu na kontrolu sa vehikulumom je pokazano u niže datoj tabeli. U svakom slučaju, smanjenje uočeno sa PMB u istom eksperimentu je pokazano u zagradama:

[0321] U ovom modelu, oba jedinjenja pokazuju superiornu efikasnost u odnosu na PMB. MIC vrednosti za Primer 5 u prisustvu Rifampicina

[0322]

[0323] MIC vrednosti (µg/mL) su određene mikrorazblaženjem bujona pod CLSI uslovima.

[0324] I PMB i Primer 5 pokazuju jaku sinergiju sa rifampicinom čak protiv sojeva sa smanjenom osetljivošću na Polimiksine.

Studija stereohemije

[0325] Jedinjenja iz pronalaska sadrže stereocentar na β-položaju γ-aminopropil grupe u N-terminalnom ostatku. Sa iznenađenjem je nađeno da je jedan od stereoizomera na ovom položaju obično povezan sa manjom citotoksičnošću i manjim vrednostim leka u bubregu. Ovo je stereoizomer koji eluira mnogo brže pri reverzno faznoj hromatografiji.

[0326] Na primer, u paru diastereoizomera koji se odnose na Primere 5 i 6, diastereomer koji eluira brže iz kolone pri reverzno-faznoj HPLC pokazuje manje prisustvo u bubrezima i manju citotoksičnost nego odgovarajući sporiji izomer. Brži diastereomer (Primer 5) je dobijen od (S)-4-amino-3-(3-hlorfenil butanoatne kiseline, analizom X-zracima male molekule odgovarajuće amino kiseline (kako je pokazano u niže datoj šemi).

Šema 1

Spori izomer na RP-HPLC

za Primer 6

Stereohemija potvrđena X-zracima Asimetrična hromatografija

ChiralPak AY

Stereohemija potvrđena X-zracima

Brzi izomer na RP-HPLC

u poređenju sa Primerom 5

[0327] Druga poređenja su pokazana u niže datoj Tabeli 3. Diastereomeri (epimeri u N-terminalnoj grupi) koji eluiraju mnogo brže pri reverzno faznoj hromatografiji i koji imaju NMR hemijske promene slične onima datim za Primer 5, izgleda da imaju istu apsolutnu stereohemiju kao Primer 5, kako je prethodno opisano.

[0328] Dodeljena apsolutna stereohemija za svako od jedinjenja u Tabeli 3 je pokazana u Tabeli 1. Referentni primeri su označeni sa (*).

Tabela 3 – rezultati stereohemije

[0329] Citotoksičnost se odnosi na izmerene IC50u odnosu na zabeležene za Polimiksin B protiv HK-2 ćelijske linije.

[0330] Nivo leka se odnosi na količinu jedinjenja nađenu u bubregu 4 sata nakon doze od 17.2 mg/kg sc (µg/g) u modelu miševa.

Dodatni rezultati

Renalna toksičnost Referentnog Primera 24 u poređenju sa PMB nakon četiri doze kod miševa

[0331] Grupama mužjaka CD-1 miševa (n = 5) je subkutano četiri puta u intervalima od 8 h doziran ili Polimiksin B (PMB) u količini od 12.5 ili 25 mg slobodne baze/kg, ili jedinjenje iz Referentnog Primera 24 u količini od 25, 50 ili 75 mg slobodne baze/kg. Neposredno nakon četvrte doze miševi se prenesu u metaboličke kaveze i 24 h se sakuplja urin za određivanje urinarnih biomarkera. Nakon uzimanja urina, miševi se žrtvuju zbog renalne histopatologije. Prosečne vrednosti biomarkera su pokazane u niže datoj Tabeli 4.

Tabela 4 – biomarkeri u urinu

[0332] Biomarkeri urina su normalizovani na kreatinin u urinu.

[0333] Za svih pet biomarkera ekspresija pri 50mg/kg Referentnog Primera 24 je niža nego pri 25mg/kg PMB a za dva (Kim-1, NGAL) od pet biomarkera ekspresija pri dozi od 75mg/kg je manja nego za PMB pri 25mg/kg.

[0334] Rezultati histopatologije su pokazani u niže datoj Tabeli 5.

Tabela 5 – rezultati histopatologije

[0335] Renalna histopatologija pri dozi Referentnog primera 24 od 50 mg/kg je manje ozbiljna nego za PMB u dozi od 25 mg/kg i renalna histopatologija je slična za dozu od 75 mg/kg Primera 24 u poređenju sa dozom PMB od 25 mg/kg.

Reference

[0336]

de Visser i saradnici J. Peptide Res, 61, 2003, 298

Dolomanov i saradnici J. Appl. Cryst.42, 2009, 339

Felluga i saradnici Tetrahedron Asymmetry, 19, 2008, 945

Sheldrick Acta Cryst. A71, 2015, 3-8

Sheldrick Acta Cryst. C71, 2015, 3-8

Vaara i saradnici Antimicrob. Agents i Chemotherapy, 52, 2008.3229

Velkov i saradnici ACS Chem. Biol.9, 2014, 1172

Velkov i saradnici ACS Chem. Biol.9, 2014, 1172

WO 2014/188178

WO 2016/083531

WO 2013/072695

WO 2015/135976

WO 2017/054047

US 2012/316105

WO 2016/166103

Koh i saradnici Amino Acids 2017, 49, 1653

Claims (7)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule (II), naznačeno time što je to jedinjenje:

   i njegove soli, solvati i zaštićeni oblici.
2. 2. Jedinjenje formule (II) u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to jedinjenje:

   i njegove soli, solvati i zaštićeni oblici.
3. 3. Jedinjenje formule (II) u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to jedinjenje:

   i njegove soli, solvati i zaštićeni oblici.
4. 4. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3, opciono zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača.
5. 5. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3 ili farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačena time što je za upotrebu u postupku tretmana ili profilakse.
6. 6. Jedinjenje u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 3 ili farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačena time što je za upotrebu u postupku lečenja mikrobne infekcije, kao što je bakterijska infekcija.
7. 7. Jedinjenje ili farmaceutska kompozicija za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 6, naznačena time što je mikrobna infekcija infekcija Gram-megativnim bakterijama, kao što je infekcija Gram-negativnim bakterijama izabranim od Escherichia spp., Klebsiella spp., Enterobacter spp., Salmonella spp., Shigella spp., Citrobacter spp., Morganella morganii, Yersinia pseudotuberculosis i drugih Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Moraxella, Helicobacter, Stenotrophomonas, Bdellovibrio, bakterija sirćetne kiseline, Legionella i alfa-proteobakterija. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Kneginje Ljubice 5, 11000 Beograd 84