MX2013010823A - Celulas huesped y metodos para produccion de isobutanol. - Google Patents

Abstract

La presente descripción proporciona células huésped de levadura recombinante y métodos para usar para la producción de isobutanol. Las células huésped de levadura proporcionadas comprenden una ruta biosintética de isobutanol y por lo menos una actividad de aldehído deshidrogenasa reducida o eliminada, actividad de acetolactato reductasa reducida o eliminada; o un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de cetol-ácido reductoisomerasa.

Description

CELULAS HUESPED Y METODOS PARA PRODUCIR ISOBUTANOL CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con células huésped recombinantes y métodos para la producción fermentativa de isobutanol.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El butanol es una sustancia química industrial importante, útil como aditivo para combustibles, como sustancia química usada como materia prima en la industria de plásticos y como agente extractante de grado alimenticio en la industria de alimentos y saborizantes . Cada año se produce de 4,535,923,700 a 5,443,108,440 kg (de 10 a 12 millardos de libras) de butanol a través de medios petroc/uímicos y es probable que la necesidad de esta sustancia química de consumo incremente en el futuro.

Se conocen los métodos paia la síntesis química del isobutanol, tales como síntesis de oxo, hidrogenación catalítica de monóxido de carbono (Encyclopedia of Industrial Chemistry de Ullmann, G.° edición, 2003, Wiley-VCH Verlag GmbH y Co., Weinheim, Alemania, Vol . 5, pág. 716-719) y condensación Guerbet de metanol con n-propanol (Carlini et al., J. Catal. A. Chem. 220:215-220, 2004). Estos procesos usan materiales de inicio derivados de petroquímicos , los que son, generalmente, costosos y no ecológicos. La producción de Ref. 243615 isobutanol a partir de materias primas derivadas de plantas minimizaría las emisiones de gas que contribuyen al efecto invernadero y representaría un avance en la técnica.

El isobutanol se produce biológicamente como un subproducto de la fermentación de levadura. Es un componente de "aceite de fusel" que se forma como resultado del metabolismo incompleto de aminoácidos por parte de hongos. El isobutanol se produce específicamente del catabolismo de L-valina. Después de recolectar el grupo amino de L-valina como una fuente de nitrógeno, el ácido a-ceto resultante se descarboxila y se reduce a isobutanol por medio de enzimas de la denominada vía de Ehrlich (Dickinson et al., J. Biol . Chem. 273:25752-25756, 1998) .

Las mejoras y alternativas para la biosíntesis de butanol directamente de azúcares mejorarían la viabilidad económica y representarían un avance en la técnica.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente descripción proporciona células huésped de levadura recombinante y métodos para producir isobutanol.

En algunas modalidades, una célula huésped recombinante comprende una ruta modificada de producción de isobutanol y (a) por lo menos uno de (i) un polipéptido heterólogo con actividad de cetol-ácido reductoisomerasa (KARI, por sus siglas en inglés) seleccionado del grupo que consiste en (1) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 90 % de identidad con una enzima KARI derivada de Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium dentium, Zy omonas mobilis, Clostridium beijerinckii o Anaerostipes caccae, o un fragmento activo de este, (2) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 90 % de identidad o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad con la sec . con núm. de ident.: 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 o 65; o (ii) un polinucleótido heterólogo que codifica el polipéptido heterólogo con actividad de KARI de (a) ; y (b) por lo menos una modificación de la célula huésped que mejora el rendimiento de la ruta modificada de producción de isobutanol. En algunas modalidades, la combinación de (a) y (b) produce un incremento sinérgico en el rendimiento de la ruta de producción de isobutanol.

En algunas modalidades, una célula huésped recombinante comprende una ruta biosintética de isobutanol y (a) un polipéptido heterólogo con actividad de cetol-ácido reductoisomerasa (KARI) seleccionado del grupo que consiste en (i) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 90 % de identidad con una enzima KARI derivada de Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium dentium, Zymomonas mobilis, Clostridium beijerinckii o Anaerostipes caccae, o un fragmento activo de este, (ii) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 90 % de identidad o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad con la sec . con núm. de ident.: 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 o 65, (iii) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 90 % de identidad o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad con una enzima KARI derivada de Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium dentium, Enterococcus gallinarum, Streptococcus thermophiles, Zymomonas mobilis, Clostridium beijerinckii , Anaerostipes caccae o Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363 o un fragmento activo de este, en donde el polipéptido tiene una KM para NADH menor que aproximadamente 50, (iv) un polipéptido que tiene por lo menos aproximadamente 90 % de identidad o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad con una enzima KARI derivada de Staphylococcus capitis SK14, Staphylococcus epidermidis M23864-W1 , Staphylococcus hominis SK119, Staphylococcus aureus subsp. aureus TCH130, Staphylococcus warneri L37603, Staphylococcus epidermidis W23144, Staphylococcus saprophyticus subsp. Saprophyticus ATCC15305, Staphylococcus carnosus subsp. Carnosus TM300, Listeria monocytogenes EGD-e, Listeria grayi DSM 20601, Enterococcus casseliflavus EC30, Enterococcus gallinarum EG2, Macrococcus caseolyticus JCSC5402, Streptococcus vestibulares, Streptococcus mutans UA159, Streptococcus gordonii str, cgakkus sybstr. CH1, Streptococcus suis 89/1591 , Streptococcus infantarius subsp. infantarius ATCC BAA-102, Lactococcus lactis subsp cremoris MG1363, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides ATCC8293 , Lactobacillus buchneri ATCC 11577, Staphylococcus haemolyticus JCSC1435, Staphylococcus epidermidis ATCC12228, Streptococcus pneumoniae CGSP14, Streptococcus pneumoniae TIGRA, Streptococcus sanguinis SK36, Streptococcus salivarius SK126, Streptococcus thermophilus LMD-9, Streptococcus pneumoniae CCRI 1974M2, Lactococcus lactis subsp. lactis 111403, Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris ATCC19254, Leuconostoc mesenteroides subsp cremoris, Lactobacillus brevis subsp. gravesensis ATCC27305 o Lactococcus lactis subsp lactis NCD02118 o un fragmento activo de este, en donde el polipéptido heterólogo tiene una KM para NADH menor que aproximadamente 50, (v) un polipéptido heterólogo con actividad de KARI que tiene por lo menos aproximadamente 90 % de identidad o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad con la sec . con núm. de ident.: 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133 o 135 o un fragmento activo de este, en donde el polipéptido heterólogo tiene una ¾ para NADH menor que aproximadamente 50; (b) un polinucleótido heterólogo que codifica el polipéptido heterólogo con la actividad de KARI de (a) ; (c) actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada; (d) actividad de aldehido oxidasa reducida o eliminada; (e) actividad de acetolactato reductasa reducida o eliminada; o (f) una combinación de estos.

En una modalidad, la célula huésped recombinante comprende expresión o actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada y expresión o actividad de acetolactato reductasa reducida o eliminada.

En otra modalidad, la célula huésped recombinante comprende (i) expresión o actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada o expresión o actividad de acetolactato reductasa reducida o eliminada y (ii) un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de KARI y KM para NADH menor que 300 µ?.

En otra modalidad, la célula huésped recombinante comprende un polipéptido heterólogo con actividad de KARI con por lo menos aproximadamente 90 % o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad con la sec . con núm. de ident. : 27, 29, 141, 143, 275 o 277.

En algunas modalidades, la célula huésped recombinante comprende un polipéptido heterólogo con actividad de KARI que comprende sustituciones en los aminoácidos correspondientes a S56 y S58 de la sec. con núm. de ident.: 27. En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de KARI comprende, además, una sustitución de uno o más de los aminoácidos correspondientes a 186, N87, T131 o T191 de la sec. con núm. de ident.: 27. En algunas modalidades, el polipéptido con actividad de KARI que tiene por lo menos 90 % de identidad o por lo menos 95 % de identidad con la sec . con núm. de ident.: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 o 65.

En algunas modalidades, la célula huésped recombinante tiene una productividad efectiva de isobutanol de por lo menos aproximadamente 3 , por lo menos aproximadamente 4 o por lo menos aproximadamente 5 gramos por gramo de células después de aproximadamente 48 horas, en donde por lo menos las últimas aproximadamente 24 horas de las 48 horas son en condiciones anaerobias.

En algunas modalidades, la célula huésped recombinante comprende un polipéptido heterólogo con actividad de KARI que tiene una KM para NADH menor que aproximadamente 350, menor que aproximadamente 100, menor que aproximadamente 50 o menor que aproximadamente 10 µ? a un pH de 6.8.

En algunas modalidades, la célula huésped recombinante comprende un polipéptido heterólogo con actividad de KARI que tiene por lo menos aproximadamente 90 % de identidad o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad con la sec. con núm. de ident.: 376, 382, 378 o 275.

En algunas modalidades, la célula huésped recombinante comprende un polipéptido heterólogo con actividad de KARI que comprende una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones correspondientes a los aminoácidos A41, S56, S58, 187, T131, T191, R227 o Q246 de una enzima KARI derivada de ñnaerostipes caccae (sec. con núm. de ident.:27).

En algunas modalidades, la célula huésped recombinante comprende un polipéptido heterólogo con actividad de KARI que comprende la sec. con núm. de ident . : 33 o la sec. con núm. de ident. :35 o un fragmento activo de este.

En otra modalidad, la célula huésped¦ recombinante comprende una supresión, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa cataliza la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa corresponde al número de la comisión de la enzima EC 1.21.3, EC 1.2.1.4 y/o EC1.2.1.5. En algunas modalidades, la célula huésped es S. cerevisiae y el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa es ALD2, ALD3, ALD4 , ALD5 , ALD6 o un homólogo de estos. En algunas modalidades, la célula huésped es K. lactis y el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa es KLLA0F00440, KLLA0E23057, KLLA0D10021 o KLLA0D09999G . En algunas modalidades, la célula huésped es P. stipitis y el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa es ALD2, ALD3, ALD4 , ALD5 o ALD7. En algunas modalidades, la célula huésped es Lactobacillus plantarum y el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa es AldH. En algunas modalidades, la célula huésped es E. coli y el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa es aldA, aldB o aldH.

En otra modalidad, la célula huésped comprende una supresión, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa cataliza la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa corresponde al número de la comisión de la enzima EC 1.2.3.1. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa es AOX1 y/o A0X2.

En otra modalidad, la célula huésped comprende una supresión, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa comprende un polipéptido codificado por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en la sec . con núm. de ident.: 676, sec. con núm. de ident . : 678, sec. con núm. de ident.: 680, sec. con núm. de ident.: 682, sec. con núm. de ident. : 684, sec. con núm. de ident. : 686, sec. con núm. de ident . : 688, sec . con núm . de ident . : 690, sec . con núm . de ident . : 692, sec . con núm . de ident . : 694, sec . con núm . de ident . : 696, sec . con núm . de ident . : 702, sec . con núm . de ident . : 704, sec . con núm . de ident . : 706, sec . con núm. de ident . : 708, sec . con núm . de ident . : 710, sec . con núm . de ident . : 712, sec . con núm. de ident . : 714, sec . con núm . de ident . : 716, sec . con núm . de ident . : 718, sec . con núm . de ident . : 720, sec . con núm . de ident . : 722, sec . con núm . de ident . : 724, sec . con núm . de ident . :726, sec . con núm. de ident . : 728 y sec con núm . de ident . : 730. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa es YMR226C.

En otra modalidad, la célula huésped recombinante es una célula huésped de levadura. En algunas modalidades, la levadura se selecciona del grupo que consiste en Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia o Pichia. En algunas modalidades, la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae .

En otra modalidad, la célula huésped es una célula bacteriana. En algunas modalidades, la célula bacteriana es Clostridiu , Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Lactococcus, Leuconostoe, Oenococcus, Pediococcus o SCreptococcus cell. En algunas modalidades, la célula bacteriana no es E. coli.

En algunas modalidades, la ruta modificada de producción de isobutanol de la célula huésped recombinante comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto: (a) piruvato a acetolactato, (b) acetolactato a 2 , 3 -dihidroxiisovalerato, (c) 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a 2-cetoisovalerato, (d) 2-cetoisovalerato a isobutiraldehído y (e) isobutiraldehído a isobutanol y más de una de las conversiones de sustrato a producto está catalizada por una enzima heteróloga para la célula huésped. En algunas modalidades, todas las conversiones de sustrato a producto están catalizadas por enzimas heterólogas para la célula huésped. En algunas modalidades, por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica una enzima heteróloga para la célula huésped se integra cromosomáticamente en la célula huésped. En algunas modalidades, las conversiones de sustrato a producto están catalizadas por enzimas prácticamente localizadas para el citosol. En algunas modalidades, la conversión de sustrato a producto para isobutiraldehído a isobutanol está catalizada por una enzima alcohol deshidrogenasa que usa NADH como cofactor. En algunas modalidades, la conversión de acetolactato a 2 , 3 -dihidroxiisovalerato está catalizada por una KA I que puede usar NADH como cofactor.

En algunas modalidades, la célula huésped comprende el plásmido pLH702 o pLH701 o un plásmido que tiene las mismas regiones codificantes. En algunas modalidades, la célula huésped comprende el plásmido pBP915 o un plásmido que tiene las mismas regiones codificantes. En algunas modalidades, la célula huésped comprende el plásmido pYZ067AkivDAhADH o un plásmido que tiene las mismas regiones codificantes.

En algunas modalidades, la célula huésped comprendeuna capacidad reducida, interrumpida o eliminada para convertir acetolactato a 2 , 3-dihidroxi-2-metilbutirato.

En algunas modalidades, la célula huésped es levadura y tiene expresión o actividad de piruvato descarboxilasa reducida o eliminada. En algunas modalidades, la célula huésped tiene actividad de PDC1, PDC5 o PDC6, o una combinación de estas, reducida o eliminada.

En algunas modalidades, la célula huésped tiene expresión o actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD reducida o eliminada. En algunas modalidades, la célula huésped tiene actividad de GPD2 reducida .

En algunas modalidades, la célula huésped tiene expresión o actividad de FRA2 reducida o eliminada.

En algunas modalidades, la célula huésped produce isobutanol en condiciones anaerobias y la relación molar de isobutanol y glicerol es mayor que 1.

En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de cetol -ácido reductoisomerasa coincide con el perfil HMM determinado proporcionado en la Tabla Z con un valor E del perfil HMM de <10"3.

En algunas modalidades, la célula huésped produce isobutanol a un rendimiento mayor que aproximadamente 25 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 75 % o aproximadamente 90 % del rendimiento teórico.

En algunas modalidades, se produce isobutanol y etanol . Los métodos para producir isobutanol incluyen métodos que comprenden proporcionar una célula huésped recombinante como se describió anteriormente y poner la célula huésped en contacto con un sustrato de carbono en condiciones para producir isobutanol. En algunas modalidades, por lo menos una porción del contacto se produce en condiciones anaerobias. En algunas modalidades, el contacto se produce en presencia de un extractante. En algunas modalidades, el contacto se produce en presencia de una cantidad suficiente de extractante orgánico para formar un sistema de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica. En algunas modalidades, uno o más de la velocidad efectiva, el título efectivo o el rendimiento efectivo de isobutanol se incrementa en comparación con los métodos que usan una célula huésped recombinante que no comprende un polipéptido heterólogo con actividad de KARI, un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad de KARI, actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada, actividad de aldehido oxidasa reducida o eliminada, actividad de acetolactato reductasa reducida o eliminada, o una combinación de estos. En algunas modalidades, uno o más de la velocidad efectiva, el título efectivo o el rendimiento efectivo de isobutanol se incrementa en comparación con los métodos que usan una célula huésped recombinante que no comprende (i) un polipéptido heterólogo con actividad de KARI o un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad de KARI y (ii) por lo menos una modificación que mejora el rendimiento de la ruta modificada de producción de isobutanol. En algunas modalidades, la producción de DHMB, la producción de ácido isobutírico o ambas se reducen en comparación con los métodos que usan una célula huésped recombinante que no comprende un polipéptido heterólogo con actividad de KARI, un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad de KARI , actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada, actividad de aldehido oxidasa reducida o eliminada, actividad de acetolactato reductasa reducida o eliminada o una combinación de estos. En algunas modalidades, la producción de DHMB, la producción de ácido isobutírico o ambas se reducen en comparación con los métodos que usan una célula huésped recombinante que no comprende (i) un polipéptido heterólogo con actividad de KARI o un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad de KARI y (ii) por lo menos una modificación V que mejora el rendimiento de la ruta modificada de producción de isobutanol. En algunas modalidades, la relación molar de isobutanol y glicerol es mayor que 1.

Los métodos para producir isobutanol comprenden, además, proporcionar una célula huésped recombinante que produce isobutanol y poner la célula huésped en contacto con un sustrato de carbono en condiciones para producir isobutanol, en donde por lo menos una porción del contacto se produce en condiciones anaerobias, y en donde la relación de isobutanol y glicerol que se produce es mayor que 1.

Los métodos para producir isobutanol comprenden, además, cultivar una levadura recombinante que comprende una ruta biosintética con la capacidad de convertir piruvato a acetolactato en condiciones para producir butanol y eliminar el DHMB del cultivo.

La presente descripción proporciona, además, las composiciones producidas mediante tales métodos. En algunas modalidades, la composición comprende isobutanol y una célula huésped recombinante proporcionada anteriormente . En algunas modalidades, la composición comprende butanol y no más de aproximadamente 0.5 mM de DHMB.

La presente descripción proporciona, además, composiciones fermentativas. En algunas modalidades, una composición fermentativa comprende la célula huésped y el isobutanol producido de conformidad con los métodos proporcionados anteriormente.

Se proporciona, además, composiciones que comprenden i) una levadura recombinante con la capacidad de producir butanol, ii) butanol y iii) no más de aproximadamente 0.5 mM de DH B.

Se proporciona, además, métodos para producir una célula huésped recombinante. Tales métodos pueden comprender (a) proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una modificación en un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa o actividad de aldehido oxidasa; y (b) transformar la célula huésped con un polinucleótido que codifica un polipéptido de una ruta biosintética de isobutanol.

Se proporciona, además, métodos para reducir o eliminar la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico. Tales métodos pueden comprender (a) proporcionar la célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-52; y (b) someter la célula huésped a condiciones en donde la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico se reduce o se elimina en comparación con los métodos que usan una célula huésped recombinante que no comprende actividad de aldehido deshidrogenasa y/o aldehido oxidasa reducida o eliminada.

La presente descripción proporciona, además, ciertos polipéptidos . En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden por lo menos aproximadamente 90 % de identidad o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con las sec . con núms . de ident . : 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, . 63 , 65, 417, 419, 421, 423 , 425, 427, 429, 431, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444 , 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463 , 464 , 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474 , 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483 , 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494 , 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 624, 626, 628, 630, 632 o un fragmento activo de estas y tienen actividad de cetol-ácido reductoisomerasa . En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden por lo menos aproximadamente 90 % de identidad o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con la sec. con núm. de ident.: 417, 419, 421, 423, 425 o 427 o un fragmento activo de estas y tienen actividad de cetol-ácido reductoisomerasa. En algunas modalidades, un polipéptido comprende una secuencia con por lo menos aproximadamente 90 % de identidad, por lo menos aproximadamente 95 % de identidad o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con la sec . con núm. de ident.: 927, 928, 196, 266, 267, 389, 405, 637, 781, 782, 783, 835, 853, 854, 855, 856, 857 o 859.

Se proporciona, además, los polinucleótidos que codifican tales polipéptidos y las células huésped que comprenden tales polinucleótidos y polipéptidos.

Se proporciona, además, los métodos para convertir acetolactato a 2 , 3 -dihidroxiisovalerato . Por ejemplo, tales métodos pueden comprender (a) proporcionar un polipéptido descrito anteriormente y (b) poner el polipéptido en contacto con acetolactato en condiciones para producir 2,3-dihidroxiisovalerato.

La presente descripción proporciona, además, células de levaduras recombinantes . En algunas modalidades, una levadura recombinante comprende una ruta biosintética con la capacidad de convertir piruvato a acetolactato, y la levadura produce menos de 0.01 moles de 2 , 3 -dihidroxi -2 -metilbutirato (DHMB) por mol de azúcar consumido. En algunas modalidades, una levadura recombinante comprende la capacidad de convertir piruvato a acetolactato, y la levadura produce DHMB a una velocidad menor que aproximadamente 1.0 mM/hora. En algunas modalidades, una levadura recombinante comprende una ruta biosintética con la capacidad de convertir piruvato a acetolactato, y la levadura produce una cantidad de 2,3-dihidroxi -3 - isovalerato (DHIV) que es por lo menos aproximadamente 1.5 veces la cantidad de DHMB producido.

Se proporciona, además, los métodos para identificar un gen que participa en la producción de DHMB. En algunas modalidades, los métodos comprenden (i) proporcionar un grupo variado de cepas de levaduras que comprenden por lo menos dos o más supresiones de genes; (ii) determinar la cantidad de DHMB producido por cepas de levaduras individuales; (iii) seleccionar una cepa de levadura que produce no más de aproximadamente 1.0 mM de DHMB/hora; y (iv) identificar el gen que se elimina en la cepa de levadura seleccionada. En algunas modalidades, los métodos comprenden (i) proporcionar un grupo variado de cepas de levaduras que sobreexpresan por lo menos dos o más genes; (ii) determinar la cantidad de DHMB producido por cepas de levaduras individuales; (iii) seleccionar una cepa de levadura que produce por lo menos aproximadamente 1.0 mM de DHMB; y (iv) identificar el gen que se sobreexpresa en la cepa de levadura seleccionada.

Se proporciona, además, los métodos para la producción de butanol . En algunas modalidades, los métodos comprenden (a) cultivar una levadura recombinante que comprende una ruta biosintética con la capacidad de convertir piruvato a acetolactato en condiciones para producir butanol; y b) determinar la concentración de DHIV y/o DHMB. En algunas modalidades, el cultivo y la medición se pueden llevar a cabo simultáneamente o secuencialmente y en cualquier orden. En algunas modalidades, la medición comprende la cromatografía liquida-espectrometría de masas.

Se proporciona, además, los métodos para incrementar la actividad de cetol-ácido reductoisomerasa (KARI) . En algunas modalidades, los métodos comprenden (a) proporcionar una composición que comprende acetolactato, una enzima KARI y una enzima acetolactato reductasa y (b) reducir las concentraciones de DHMB. En algunas modalidades, la reducción de las concentraciones de DHMB se logra al reducir la actividad de la enzima acetolactato reductasa. En algunas modalidades, la reducción de las concentraciones de DHMB se logra al eliminar el DHMB de la composición.

En algunas modalidades, el incremento de productividad de la enzima KARI en una célula huésped puede comprender cultivar una célula huésped, en donde la célula huésped comprende una enzima KARI heteróloga y por lo menos una ingeniería genética que reduce, interrumpe o elimina la expresión o actividad de acetolactato reductasa, y en donde la actividad de enzima de KARI se reduce en presencia de DHMB. En algunas modalidades, la enzima de KARI tiene por lo menos aproximadamente 90 %, por lo menos aproximadamente 95 % o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con KARI de E. coli o L. lactis. En algunas modalidades, la expresión o actividad de acetolactato reductasa reducida, interrumpida o eliminada reduce, prácticamente, la presencia de DHMB.

Se proporciona, además, métodos para incrementar la actividad de dihidroxiácido deshidratasa (DHAD) . En algunas modalidades, los métodos comprenden (a) proporcionar una composición que comprende dihidroxiisovalerato (DHIV) y una enzima DHAD y (b) reducir las concentraciones de DHMB.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La presente invención se puede comprender con mayor facilidad a partir de la siguiente descripción detallada, las figuras y las descripciones que acompañan las secuencias, las cuales forman parte de la presente solicitud.

La Figura 1 muestra cuatro rutas biosintéticas de isobutanol diferentes. Las etapas marcadas "a", "b" , "c", "d", "e", "f", "g", "h", "i", "j" y "k" representan las conversiones de sustrato a producto que se describen a continuación.

La Figura 2 representa un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de KARI de Pseudomonas fluorescens ("PF5" ; sec. con núm. de ident . : 5) y KARI de Anaerostipes caccae ("K9"; sec. con núm. de ident. : 27) . Las posiciones en negrita son específicas para la mutagénesis, como se describe en la presente descripción.

Las Figuras 3A, 3B y 3C representan un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de enzimas KARI de DSM 20098 de Bifidobacterium angulatum ("Kl"; sec. con núm. de ident.: 141) , ATCC 27678 de Bifidobacterium dentium ("K2"; sec. con núm. de ident . : 143), NCIMB 8052 de Clostridium beijerinckii ("K7"; sec. con núm. de ident.: 275), DSM 14662 de Anaerostipes caccae ("K9"; sec. con núm. de ident.: 27), EG2 de Enterococcus gallinarum ("K25" sec. con núm. de ident.: 376), LMD-9 de Streptococcus thermophilus ("K26" sec. con núm. de ident.: 121), MG1363 de Lactococcus lactis subsp. cremoris ("K29"; sec. con núm. de ident.: 382), Zymomonas mobilis ("S2"; sec. con núm. de ident.: 277) y Lactococcus lactis ("LTS"; sec. con núm. de ident.: 380). Las posiciones en negrita son específicas para la mutagénesis como se describe en la presente descripción.

La Figura 4 es un mapa de plásmidos del vector pLH556 (pHR81-PIlv5-Pf5. KARI) (sec. con núm. de ident.: 138).

La Figura 5 muestra la velocidad específica de producción de isobutanol, Qp, de las dos cepas, PNY1910 y PNY2242.

La Figura 6 muestra la acumulación de DHIV + DHMB en el sobrenadante del cultivo durante el transcurso de la fermentación con PNY1910 (triángulos) y PNY2242 (diamantes) . (el DHMB y el DHIV no se distinguen mediante el método de HPLC usado. ) La Figura 7 muestra el rendimiento de glicerol, ácido pirúvico, 2, 3-butanodiol (BDO) , DHIV/DHMB, a-cetoisovalerato (aKIV) y ácido isobutírico (iBuAc) . El DHIV y el DHMB se muestran juntos dado que no se distinguen mediante el método de HPLC usado.

La Figura 8 muestra un resumen de los valores Vmáx/KM para las variantes K9G9, como se describe en el Ejemplo 16.

Las Figuras 9A, 9B y 9C muestran las relaciones de rendimiento molar de isobutanol y glicerol, los rendimientos molares de isobutanol y los títulos de isobutanol para las variantes K9 , como se describe en el Ejemplo 19.

La Figura 10 muestra una ruta biosintética de isobutanol. La etapa "a" representa la conversión de piruvato a acetolactato . La etapa "b" representa la conversión de acetolactato a DHIV. La etapa "c" representa la conversión de DHIV a KIV. La etapa "d" representa la conversión de KIV a isobutiraldehído . La etapa "e" representa la conversión de isobutiraldehído a isobutanol. La etapa "f" representa la conversión de acetolactato a DH B .

La Figura 11 muestra un árbol filogenético de homólogos YMR226C a partir de especies de levadura de ascomicetos. Una secuencia de hongos filamentosos {Neurospora crassa) se incluye como un grupo externo.

La Figura 12 muestra un alineamiento de secuencias múltiples (formato MSF) de las secuencias de nucleótidos de O F con homología con YMR226C. Los nombres de los genes que se muestran corresponden a los números de registro y las sec. con núms . de ident .. que se proporcionan en la Tabla 7. El alineamiento se produjo por AlignX (Vector NTI) .

La Figura 13 muestra un gráfico del rendimiento molar de DHMB con el tiempo.

La Figura 14 representa la producción de isobutanol y ácido isobutírico en la cepa de levadura NYLA84.

La Tabla Z es una tabla (presentada electrónicamente con la presente descripción e incorporada como referencia) del Perfil HMM de las enzimas KARI verificadas experimentalmente enumeradas en la Tabla 1 y como se describen en las publicaciones de las solicitudes de patentes de los Estados Unidos núm. 2010/0197519 y 2009/0163376, que se incorporan como referencia en la presente descripción en su totalidad.

Tabla 1. Enzimas KARI verificadas experimentalmente.

Las once posiciones en el perfil HMM que representan las columnas en el alineamiento que corresponden a las once posiciones de intercambio del cofactor en KARI de Pseudomonas fluorescens Pf-5 se identifican como las posiciones 24, 33, 47, 50, 52, 53, 61, 80, 115, 156 y 170. La Tabla Z se presenta electrónicamente con la presente descripción y se incorpora como referencia en la presente descripción.

Las secuencias proporcionadas en la lista de secuencias presentada con la presente descripción (nombre: 20120323_CL5367USNA_SEQLIST.txt; tamaño: 2,003,893 bytes; fecha de creación: 23 de marzo de 2012) se incorporan como referencia en la presente descripción.

De acuerdo con la norma ST.25 (2009) de la Organización Mundial de Propiedad Intelectual (WIPO, por sus siglas en inglés), ciertos cebadores proporcionados en la lista de secuencias y en la presente descripción usan N para representar los nucleótidos a o g o c o t. K se usa para representar g o t. M se usa para representar a o c.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado como el entendido comúnmente por una persona con conocimiento ordinario en la técnica a la que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente solicitud junto con las definiciones pertinentes. Además, a menos que se requiera lo contrario, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Todas las publicaciones, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan como referencia en su totalidad para todos los propósitos como si cada publicación individual o solicitud de patente se haya indicado, específica e individualmente, para ser incorporada como referencia, a menos que se indiquen solo secciones específicas de patentes o publicaciones de patente para incorporarse como referencia.

Si bien los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente descripción se pueden usar en la práctica o prueba de modalidades de la presente invención, se describen más abajo los métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no tienen por objeto resultar limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y de las reivindicaciones .

La última etapa en la biosíntesis de isobutanol por medio de una ruta biosintética que usa piruvato es la conversión de isobutiraldehído a isobutanol (Figura 1) . Una reacción secundaria en esta ruta es la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico que resulta en cantidades reducidas de isobutiraldehído disponible para convertir en isobutanol y rendimiento de isobutanol reducido. Para un proceso biosintético eficiente, se necesita prevenir la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico para que haya cantidades incrementadas de isobutiraldehído disponible para la conversión a isobutanol y para incrementar los rendimientos de isobutanol.

Las aldehido deshidrogenasas son una familia de enzimas que catalizan la oxidación (deshidrogenación) de aldehidos (Wang et al., J. Bacteriol. 180:822-30, 1998; Navarro-Avino et al., Yeast 15:829-42, 1999; y Saint-Prix et al., Microbiology 150:2209-20, 2004). Se necesita identificar las aldehido deshidrogenasas adecuadas que pueden modificarse para reducir o eliminar la actividad de aldehido deshidrogenasa y que pueden reducir o eliminar la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico para que haya cantidades incrementadas de isobutiraldehído disponible para la conversión a isobutanol y para incrementar los rendimientos de isobutanol.

Las aldehido oxidasas son una familia de enzimas que catalizan la producción de ácidos carboxílicos a partir de aldehidos (Nomura et al., Biosci . Biotechnol . Biochem. 62:1134-7, 1998; y Johnson et al., Genetics 151:1379-1391, 1999) . Se necesita identificar las aldehido oxidasas adecuadas que se pueden modificar para reducir o eliminar la actividad de aldehido oxidasa y que pueden reducir o eliminar la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico para que haya cantidades incrementadas de isobutiraldehído disponible para la conversión a isobutanol y para incrementar los rendimientos de isobutanol.

La ruta biosintética para la producción de butanol en levadura modificada genéticamente incluye la conversión de acetolactato a 2 , 3-dihidroxi-3-isovalerato (DHIV) que, posteriormente, se convierte a butanol. Ver la Figura 10. Sin embargo, una reacción secundaria en esta ruta, que reduce la producción total de butanol, es la conversión de acetolactato a 2 , 3-dihidroxi-2-metilbutirato (DHMB) . De hecho, los solicitantes han descubierto que el DHMB tiene efectos inhibidores sobre las enzimas (dihidroxiácido deshidratasa y cetol-ácido reductoisomerasa) en una ruta de producción de isobutanol. Para un proceso biosintético eficiente, se necesita prevenir la conversión de acetolactato a DHMB.

Los solicitantes han solucionado los problemas mencionados al proporcionar células huésped de levadura recombinante que comprenden una ruta biosintética de isobutanol; y por lo menos uno de; i) actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada, ii) actividad de aldehido oxidasa reducida o eliminada, iii) actividad de acetolactato reductasa reducida o eliminada; iv) un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de cetol-ácido reductoisomerasa; y v) un polipéptido heterólogo que tiene actividad de cetol-ácido reductoisomerasa. Además, los solicitantes proporcionan métodos para producir butanol con el uso de tales células huésped. Tales células huésped recombinantes se pueden usar para incrementar la producción de un producto de una ruta biosintética (por ejemplo, isobutanol, 1-butanol o 2-butanol) y/o para reducir o eliminar la conversión de los intermedios de la ruta a subproductos indeseables. Los solicitantes han proporcionado, además, una estrategia de evaluación adecuada para analizar las ; diversas enzimas candidatas . Las enzimas identificadas se pueden alterar para mejorar la producción de un producto de una ruta biosintética (por ejemplo, isobutanol, 1-butanol o 2-butanol) y/o para reducir o eliminar la conversión de intermedios de la ruta a subproductos indeseables.

Además, para definir esta invención se proporciona los siguientes términos, abreviaturas y definiciones.

Se comprenderá que "derivados de" , con referencia a los polipéptidos descritos en la presente descripción, incluye las secuencias sintetizadas en base a las secuencias de aminoácidos de las KARI presentes en los organismos indicados, así como los clonados directamente del material genético del organismo.

Como se usa en la presente descripción, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene" o "que contiene" o cualquier otra variación de estos implican la inclusión de un entero o grupo de enteros determinado, mas no la exclusión de cualquier otro entero o grupo de enteros y pretenden ser no excluyentes o abiertos. Por ejemplo, una composición, una mezcla, un proceso, un método, un artículo o un aparato que comprende una lista de elementos no se limita, necesariamente, solo a esos elementos, sino que puede incluir otros que no estén expresamente listados o sean inherentes a tal composición, mezcla, proceso, método, artículo o aparato. Además, a menos que se especifique expresamente n contrario, la disyunción se relaciona con un "o" incluyente y no con un "o" excluyente. Por ejemplo, una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los siguientes criterios : A es verdadero (o actual) y B es falso (o no actual) , A es falso (o no actual) y B es verdadero (o actual) , y tanto A como B son verdaderos (o actuales) .

Como se usa en la presente descripción, el término "consiste en" o variaciones tales como "consisten en" o "que consisten en" , como se usan a lo largo de la descripción y las reivindicaciones, indican la inclusión de cualquier entero o grupo de enteros mencionado, pero ningún entero o grupo de enteros adicional se puede agregar al método, estructura o composición que se especificó.

Como se usa en la presente descripción, el término "consiste esencialmente en", o variaciones tales como "consistente esencialmente en" o "que consiste esencialmente en" , tal como se usan en la descripción y las reivindicaciones, indica la inclusión de todo componente o grupo de componentes enumerados, y la inclusión opcional de todo componente o grupo de componentes enumerados que no cambian materialmente las propiedades básicas o nuevas del método, la estructura o la composición específicas. Ver . P.E. P. § 2111.03.

Además, los artículos indefinidos "un (a)" y "unos (as)" que preceden a un elemento o componente de la invención están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de instancias, es decir, veces en que se menciona el elemento o componente. Por consiguiente, "un (a)" o "unos(as)" deben interpretarse para incluir uno o al menos uno, y la forma singular de la palabra del elemento o componente incluye, además, el plural, a menos que el número, obviamente, indique que es singular.

El término "invención" o "presente invención" , como se usa en la presente descripción, es un término no limitante y no pretende referirse a ninguna modalidad de la invención particular, sino incluye todas las modalidades posibles como se describen en las reivindicaciones según se presentan o se modifican y se suplementan posteriormente, o en la descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente", que modifica la cantidad de un ingrediente o reactivo empleado en la invención, se refiere a la variación que puede producirse en la cantidad numérica, por ejemplo, a través de procedimientos de manejo de líquidos y de mediciones típicos usados para preparar concentrados o soluciones en el mundo real; a través de errores inadvertidos en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, procedencia o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y similares. El término "aproximadamente" abarca, además, cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial particular. Estén o no modificadas por el término "aproximadamente", las reivindicaciones incluyen equivalentes para las cantidades. En una modalidad, el término "aproximadamente" significa dentro del 10 % del valor numérico reportado o dentro del 5 % del valor numérico reportado .

Como se usa en la presente descripción, "sinérgico" se refiere a un efecto más que aditivo producido por una combinación (por ejemplo, un efecto mayor que la suma de efectos individuales) o un efecto aditivo cuando no se espera que los efectos individuales sean aditivos. El término se refiere, además, a la adición de un compuesto que produce menos de otro compuesto que se requiere .

El término "ruta biosintética de butanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a la ruta enzimática para producir 1-butanol, 2-butanol o isobutanol. Por ejemplo, las rutas biosintéticas de isobutanol se describen en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957, que se incorpora como referencia en la presente descripción.

El término "ruta biosintética de isobutanol" se refiere a la ruta enzimática para producir isobutanol. Ciertas rutas biosintéticas de isobutanol se ilustran en la Figura 1 y se describen en la presente descripción. Ocasionalmente, "ruta biosintética de isobutanol" se usa como sinónimo de "ruta de producción de isobutanol" .

El término "butanol", como se usa en la presente descripción, se refiere a 2-butanol, 1-butanol, isobutanol o mezclas de estos. El isobutanol también se denomina 2-metil-1-propanol .

Una célula huésped recombinante que comprende una "ruta modificada de producción de alcohol" (tal como una ruta modificada de producción de butanol o isobutanol) se refiere a una célula huésped que contiene una ruta modificada que produce alcohol de manera diferente a la manera normal en la célula huésped. Tales diferencias incluyen la producción de un alcohol que no se produce típicamente mediante la célula huésped, o una producción incrementada o más eficiente.

El término "ruta biosintética heteróloga" , como se usa en la presente descripción, se refiere a una ruta enzimática para producir un producto en el que por lo menos una de las enzimas no es endógena a la célula huésped que contiene la ruta biosintética.

El término "extractante", como se usa en la presente descripción, se refiere a uno o más solventes orgánicos que se pueden usar para extraer butanol de un caldo de fermentación .

El término "productividad de isobutanol efectiva", como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad total en gramos de isobutanol producida por gramo de células.

El término "título efectivo", como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad total de un alcohol particular (por ejemplo, butanol) producida mediante fermentación por litro de medio de fermentación. La cantidad total de butanol incluye: (i) la cantidad de butanol en el medio de fermentación; (ii) la cantidad de butanol recuperada del extractante orgánico; y (iii) la cantidad de butanol recuperada de la fase gaseosa, si se usa arrastre con gas.

El término "velocidad efectiva" , como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad total de butanol producida mediante fermentación por litro de medio de fermentación por hora de fermentación.

El término "rendimiento efectivo" , como se usa en la presente descripción, se refiere a la cantidad de butanol producida por unidad de sustrato de carbono fermentable consumido por el biocatalizador .

El término "separación", como se usa en la presente descripción, es sinónimo de "recuperación" y se refiere a la eliminación de un compuesto químico de una mezcla inicial para obtener el compuesto en una mayor pureza o a una mayor concentración que la pureza o concentración del compuesto en la mezcla inicial .

El término "fase acuosa", como se usa en la presente descripción, se refiere a la fase acuosa de una mezcla bifásica obtenida por el contacto de un caldo de fermentación con un extractante orgánico inmiscible en agua. En una modalidad de un proceso descrito en la presente descripción que incluye la extracción fermentativa, el término "caldo de fermentación" se refiere específicamente a la fase acuosa en la extracción fermentativa bifásica.

El término "fase orgánica" , como se usa en la presente descripción, se refiere a la fase no acuosa de una mezcla bifásica obtenida por el contacto de un caldo de fermentación con un extractante orgánico inmiscible en agua.

Los términos "PDC-" , "desactivación de PDC" y "PDC-KO", como se usan en la presente descripción, se refieren a una célula que ha sido modificada genéticamente para inactivar o reducir la expresión de un gen que codifica piruvato descarboxilasa (PDC) de manera que la célula carece práctica o completamente de actividad de la enzima piruvato descarboxilasa. Si la célula tiene más de un gen PDC expresado (activo) , entonces cada uno de los genes PDC activos puede desactivarse o tener una expresión mínima, lo que produce una célula PDC.

El término "polinucleótido" está previsto para acompañar un ácido nucleico singular y un ácidos nucleicos plurales, y se refiere a una molécula o construcción de ácido nucleico, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plásmido (pADN) . Un polinucleótido puede contener la secuencia del nucleótido de la secuencia de ADNc de longitud completa o un fragmento de este, que incluye las secuencias 5' y 3' no traducidas y las secuencias codificantes. El polinucleótido puede estar compuesto por cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden componerse de ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias , ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, con mayor frecuencia, bicatenarios o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. El "polinucleótido" abarca formas química, enzimática o metabólicamente modificadas.

Una secuencia de polinucleótidos puede mencionarse como "aislada", en el sentido que se ha eliminado de su ambiente natural. Por ejemplo, ún polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido o un fragmento de polipéptido que tiene actividad de dihidroxiácido deshidratasa contenido en un vector se considera aislado para los propósitos de la presente invención. Ejemplos adicionales de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huéspedes heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o prácticamente) en solución. Los ácidos o nucleicos polinucleótidos aislados de conformidad con la presente invención incluyen, además, las moléculas producidas sintéticamente. Un fragmento del polinucleótido aislado en forma de un polímero de ADN puede estar compuesto por uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

El término "ensayo de consumo de NAD(P)H" se refiere a un ensayo de enzimas para determinar la actividad específica de la enzima KARI ; el ensayo incluye determinar la desaparición del cofactor de la enzima KARI, NAD(P)H, de la reacción enzimática. Tales ensayos se describen en Aulabaugh and Schloss, Biochemistry 29: 2824-2830, 1990, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad.

El término "NAD (P) H" se refiere ya sea a NADH o a NADPH. "KARI" es la abreviatura para la enzima cetol-ácido reductoisomerasa .

El término "proximidad cercana" con referencia a la posición de los diversos residuos de aminoácidos de una enzima KARI con respecto al adenosil 2 '-fosfato de NADPH se refiere a los aminoácidos en el modelo tridimensional para la estructura de la enzima que se encuentran dentro de aproximadamente 4.5 Á del átomo de fósforo del adenosil 2'-fosfato de NADPH unido a la enzima.

El término "cetol-ácido reductoisomerasa" (cuya abreviatura es "KARI") y "acetohidroxiácido isomerorreductasa" se usan indistintamente y se refieren a las enzimas con la capacidad de catalizar la reacción de ( S ) -acetolactato a 2 , 3 -dihidroxiisovalerato , que se clasifica como EC núm. 1.1.1.86 (Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego) . Como se usa en la presente descripción, el término "enzima cetol-ácido reductoisomerasa clase I" se refiere a la forma corta que tiene, típicamente, entre 330 y 340 residuos de aminoácidos y es distinta a la forma larga, llamada clase II, que tiene, típicamente, aproximadamente 490 residuos. Estas enzimas están disponibles de muchas fuentes, que incluyen, pero no se limitan a E. coli (aminoácido de la sec . con núm. de ident . : 942; número de registro del GenBank NC_000913 REGIÓN: 3955993.3957468), Vibrio cholerae (número de registro del GenBank NC_002505 REGIÓN: 157441.158925), Pseudomonas aeruginosa, (número de registro del GenBank NC_002516, REGIÓN: 5272455.5273471) y Pseudomonas fluorescens (aminoácido de la sec. con núm. de ident.: 943; número de registro del GenBank NC_004129 REGIÓN: 6017379.6018395) . Las enzimas KARI se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos núm. 7,910, 342 y 8,129,162 y en la solicitud de la publicación de los Estados Unidos núm. 2010/0197519, las cuales se incorporan como referencia en la presente descripción en su totalidad.

La enzima - KARI se encuentra en una gran variedad de organismos y las comparaciones de secuencias de aminoácidos entre especies han revelado que hay 2 tipos de esta enzima: una forma corta (clase I) que se encuentra en hongos y en la mayoría de bacterias, y una forma larga (clase II) típica de las plantas. Las KARI de clase I tienen, típicamente, entre 330 y 340 residuos de aminoácidos. Las enzimas KARI de forma larga tienen aproximadamente 490 residuos de aminoácidos. Sin embargo, algunas bacterias, tales como Escherichia coli, tienen una forma larga, en donde la secuencia de aminoácidos difiere apreciablemente de la que se encuentra en las plantas. La enzima ARI está codificada por el gen ilvC y es una enzima esencial para el crecimiento de E. coli y otras bacterias en un medio mínimo. Las KARI de clase II consisten, generalmente, de un dominio N-terminal de 225 residuos y un dominio C-terminal de 287 de residuos. El dominio N-terminal, que contiene el sitio de unión a NADPH, tiene una aß estructura y se asemeja a los dominios que se encuentran en otras oxidorreductasas dependientes del nucleótido piridina. El dominio C-terminal consiste casi completamente de hélices a .

Las enzimas cetol-ácido reductoisomerasas (KARI) son útiles en las rutas para la producción de isobutanol con el uso de microorganismos modificados (patentes de los Estados Unidos núms . 7,851,188 y 7,993,889, que se incorporan como referencia en la presente descripción) .

Una enzima KARI que puede usar NADH puede beneficiarse del NADH producido por las rutas glicolíticas y otras rutas metabólicas existentes en la mayoría de células microbianas usadas comúnmente y puede resultar en una producción de isobutanol mejorada. Rane et al. (Arch. Biochem. Biophys . , 338: 83-89, 1997) describen el intercambio de cofactor de una cetol-ácido reductoisomerasa aislada de E. coli. Las publicaciones de las solicitudes de patentes de los Estados Unidos núms. 2009/0163376 y 2010/0197519 (que se incorporan como referencia en la presente descripción en su totalidad) describen la producción de enzimas KARI que pueden usar NADH. La publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0143997 (que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad) describe las variantes de E. coli con valores de KM mejorados para NADH.

Los términos "actividad de cetol -ácido reductoisomerasa" y "actividad de KARI" se refieren a la capacidad para catalizar la conversión de sustrato a producto de (S)-acetolactato a 2 , 3-dihidroxiisovalerato.

El término "acetolactato sintasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de piruvato a acetolactato y C02- El acetolactato tiene dos estereoisómeros {(R) y (£)),-la enzima prefiere el isómero (S)-, que se elabora por sistemas biológicos. Ciertas acetolactato sintasas se conocen con el EC núm. 2.2.1.6 {Enzyme Nomenclature 1992, Academic Press, San Diego) . Estas enzimas están disponibles de muchas fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, Bacillus subtilis (núms. del GenBank: CAB15618, Z99122, secuencia de aminoácidos del NCBI (National Center for Biotechnology Information), secuencia de nucleótidos del NCBI, respectivamente), Klebsiella pneumoniae (núms. del GenBank: AAA25079, M73842 y Lactococcus lactis (núms. del GenBank: AAA25161, L16975) .

El término "acetohidroxiácido deshidratasa" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de 2,3-dihidroxiisovalerato a a-cetoiso-valerato . Ciertas ácido acetohidroxi deshidratasas se conocen con el EC núm. 4.2.1.9. Estas enzimas están disponibles en una amplia variedad de microorganismos, que incluyen, pero no se limitan a, E. coli (núms. del GenBank YP_026248, NC_000913, S. cerevisiae (núms. del GenBank: NP_012550, NC_001142), M. maripaludis (núms. del GenBank: CAF29874, BX957219) , B . subtilis (núms. del GenBank: CAB14105, Z99115) , Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident.: 926) y Streptococcus mutans (sec. con núm. de ident . : 939) .

El término "a-ceto ácido descarboxilasa de cadena ramificada" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de -cetoisovalerato en isobutiraldehído y C02. Ciertas a-ceto ácido descarboxilasas de cadena ramificada se conocen con el EC núm. 4.1.1.72 y están disponibles de muchas fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, Lactococcus lactis (núms. del GenBank: AAS49166, AY548760; CAG34226, AJ746364, Salmonella typhimurium (núms. del GenBank: NP-461346, NC-003197) , Clostridium acetobutylicum (núms. del GenBank: NP-149189, NC-001988) , Macrococcus caseolyticus (sec. con núm. de ident.: 940) y Listeria grayi (sec. con núm. de ident.: 941).

El término "alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de isobutiraldehído a isobutanol . Ciertas alcohol deshidrogenasas de cadena ramificada se conocen con el EC núm. 1.1.1.265, pero pueden clasificarse, además, en otras alcohol deshidrogenasas (específicamente, EC 1.1.1.1 o 1.1.1.2). Estas enzimas usan NADH (dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido) y/o NADPH como donante de electrones y están disponibles de numerosas fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, S. cerevisiae (núms. del GenBank NP_010656, NC_001136 ; NP_014051, NC_001145), E. coli (núm. del GenBank: NP_417484), C. acetobutylicum (núms. del GenBank: NP_349892, NC_003030), B . indica (aminoácido de la sec . con núm. de ident . : 945) , A. xylosoxidans (aminoácido de la sec. con núm. de ident. : 944) .

El término "ceto-ácido deshidrogenasa de cadena ramificada" se refiere a una enzima que cataliza la conversión de a-cetoisovalerato a isobutiril-CoA (isobutiril-cofactor A) con el uso de NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) como aceptor de electrones. Ciertas ceto-ácido deshidrogenasas de cadena ramificada se conocen con el EC núm. 1.2.4.4. Estas ceto-ácido deshidrogenasas de cadena ramificada comprenden cuatro subunidades y las secuencias de todas las subunidades están disponibles de una gran variedad de microorganismos, que incluyen, pero no se limitan a, B . subtilis (núms. del GenBank: CAB14336, Z99116; CAB14335, Z99116; CAB14334, Z99116; y CAB14337, Z99116) y Pseudomonas putida (núms. del GenBank: AAA65614, M57613; AAA65615, M57613; AAA65617, M57613; y AAA65618, M57613).

Como se usa en la presente descripción, "actividad de aldehido deshidrogenase" se refiere a cualquier polipéptido que tiene una función biológica de una aldehido deshidrogenasa , que incluye los ejemplos proporcionados en la presente descripción. Tales polipéptidos incluyen un polipéptido que cataliza la oxidación (deshidrogenación) de aldehidos. Tales polipéptidos incluyen un polipéptido que cataliza la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico. Tales polipéptidos incluyen, además, un polipéptido que corresponde a los números de la comisión de la enzima EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4 o EC 1.2.1.5. Los polipéptidos pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, "actividad de aldehido oxidasa" se refiere a cualquier polipéptido que tiene una función biológica de una aldehido oxidasa, que incluye los ejemplos proporcionados en la presente descripción. Tales polipéptidos incluyen un polipéptido que cataliza ácidos carboxílicos a partir de aldehidos. Tales polipéptidos incluyen un polipéptido que cataliza la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico. Los polipéptidos incluyen, además, un polipéptido que corresponde a la Comisión de Enzimas núm. EC 1.2.3.1. Los polipéptidos pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente descripción .

Como se usa en la presente descripción, "actividad de piruvato descarboxilasa" se refiere a la actividad de cualquier polipéptido que tiene una función biológica de una enzima piruvato descarboxilasa, que incluye los ejemplos proporcionados en la presente descripción. Los polipéptidos incluyen un polipéptido que cataliza la conversión de piruvato en acetaldehído . Los polipéptidos incluyen, además, un polipéptido que corresponde a la Comisión de Enzimas núm. 4.1.1.1. Los polipéptidos pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente descripción. Un polipéptido que tiene actividad de piruvato descarboxilato puede ser, a manera de ejemplo, PDC1, PDC5, PDC6 o cualquier combinación de estos.

Como se usa en la presente descripción, "actividad de acetolactato reductasa" se refiere a la actividad de cualquier polipéptido que tiene la capacidad de catalizar la conversión de acetolactato a DHMB. Los polipéptidos pueden determinarse mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, "DHMB" se refiere a 2 , 3-dihidroxi-2-metilbutirato. El DHMB incluye "DHMB rápido", que tiene la configuración 2S, 3S, y "DHMB lento", que tiene la configuración 2S, 3R. Ver Kaneko et al., Phytochemistry 39: 115-120 (1995), que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad y se refiere al DHMB rápido como un ácido glicérico y al DHMB lento como ácido triglicérico .

Como se usa en la presente descripción, la "actividad reducida" se refiere a cualquier disminución medible en una actividad biológica conocida de un polipéptido cuando se compara con la misma actividad biológica del polipéptido previo al cambio que resulta en la actividad reducida. El cambio puede incluir una modificación de un polipéptido o un polinucleótido que codifica un polipéptido como se describe en la presente descripción. Se puede determinar una actividad reducida de un polipéptido descrita en la presente descripción por medio de métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, la "actividad eliminada" se refiere a la supresión completa de una actividad biológica conocida de un polipéptido cuando se compara con la misma actividad biológica del polipéptido previo al cambio que resulta en la actividad eliminada. El cambio puede incluir una modificación de un polipéptido o un polinucleótido que codifica un polipéptido, como se describe en la presente descripción. Una actividad eliminada incluye una actividad biológica de un polipéptido que no es medible cuando se compara con la misma actividad biológica del polipéptido previo al cambio que resulta en la actividad eliminada. Se puede determinar una actividad eliminada de un polipéptido descrita en la presente descripción por medio de métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente descripción.

Las frases "sustrato de carbono" o "sustrato de carbono fermentable" se refieren a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por organismos huésped de la presente invención y, particularmente, a fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en monosacáridos , oligosacáridos , polisacáridos y sustratos de un solo carbono, o mezclas de estos. Los ejemplos no limitantes de sustratos de carbono se proporcionan en la presente descripción e incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, etanol, lactato, succinato, glicerol, dióxido de carbono, metanol, glucosa, fructuosa, sacarosa, xilosa, arabinosa, dextrosa o mezclas de estos. Otros sustratos de carbono pueden incluir etanol, lactato, succinato o glicerol.

"Caldo de fermentación" , como se usa en la presente descripción, se refiere a la mezcla de agua, azúcares (fuentes de carbono fermentable) , sólidos disueltos (si hay presentes), microorganismos productores de alcohol, producto de alcohol y todos los demás constituyentes del material conservados en el recipiente de fermentación, en donde se prepara el producto de alcohol por medio de la reacción de azúcares al alcohol, agua y dióxido de carbono (CO2) por los microorganismos presentes. Ocasionalmente, como se usan en la presente descripción, los términos "medio de fermentación" y "mezcla fermentada" pueden usarse como sinónimos de "caldo de fermentación" .

"Biomasa" , como se usa en la presente descripción, se refiere a un producto natural que contiene un almidón hidrolizable que proporciona un azúcar fermentable, que incluye cualquier material celulósico o lignocelulósico y materiales que comprenden celulosa, y, opcionalmente , comprende, además, hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos , disacáridos y/o monosacáridos . La biomasa puede comprender, además, componentes adicionales, tales como proteína y/o lípidos. La biomasa puede derivarse de una sola fuente o puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente. Por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas de maíz y rastrojos de maíz, o una mezcla de pasto y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a, cultivos bioenergéticos , residuos agrícolas, residuos sólidos municipales, residuos sólidos industriales, sedimentos de la fabricación de papel, residuos orgánicos, madera y residuos de silvicultura. Los ejemplos de biomasa incluyen, pero no se limitan a, granos de maíz, mazorcas del maíz, residuos de cultivos, tales como cascaras de granos de maíz, rastrojos de maíz, hierbas, trigo, centeno, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, panizo de pradera, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de madera, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol, y mezclas de estos .

"Materia prima" , como se usa en la presente descripción, se refiere a un producto que contiene una fuente de carbono fermentable. La materia prima adecuada incluye, pero no se limita a, centeno, trigo, maíz, caña de azúcar y mezclas de estos .

El término "condiciones aerobias", como se usa en la presente descripción, se refiere a las condiciones de crecimiento en presencia de oxígeno.

El término "condiciones microaerobias" , como se usa en la presente descripción, se refiere a las condiciones de crecimiento con niveles bajos de oxígeno (por ejemplo, menores que los niveles atmosféricos normales) .

El término "condiciones anaerobias" , como se usa en la presente descripción, se refiere a las condiciones de crecimiento en ausencia de oxígeno.

El término "actividad específica", como se usa en la presente descripción, se define como las unidades de actividad en una cantidad dada de proteína. Por lo tanto, la actividad específica no se determina directamente, pero se calcula al dividir 1) la actividad en unidades/ml de la muestra de enzimas por 2) la concentración de proteína en esa muestra, entonces la actividad específica se expresa como unidades/mg, en donde una unidad enzimática se define como moles de producto formado/minuto. La actividad específica de una muestra de enzima pura totalmente activa es una característica de esa enzima. La actividad específica de una muestra de una mezcla de proteínas es una medida de la fracción relativa de proteína en esa muestra que se compone de la enzima activa de interés.

Los términos "kcat" y "KM" son del conocimiento de aquellos con experiencia en la técnica y se describen en Enzyme Structure and Mechanism, 2.° ed. (Ferst; W.H. Freeman Press, NY, 1985; págs . 98-120). KM, la constante de Michaelis, es la concentración de sustrato que produce una velocidad de mediana-máxima. El término "kcat" , llamado frecuentemente "número de recambio" , se define como el número máximo de moléculas de sustrato convertidas a productos por sitio activo por unidad de tiempo, o el número de veces que la enzima cambia por unidad de tiempo. El kcat = Vmáx/ [E] , en donde [E] es la concentración de enzimas (Ferst, supra) . Los términos "recambio total" y "número de recambio total" se usan en la presente descripción para hacer referencia a la cantidad de producto formado por la reacción de una enzima KARI con sustrato .

El término "eficiencia catalítica" se define como kcat/KM de una enzima. La eficiencia catalítica se usa para cuantificar la especificidad de una enzima para un sustrato.

Los términos "molécula de ácido nucleico aislado", "fragmento de ácido nucleico aislado" y "constructo genético" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de ARN o ADN monocatenario o bicatenario que contiene, opcionalmente, bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas. Un fragmento de ácido nucleico aislado en forma de un polímero de ADN puede estar compuesto por uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico o ADN sintético.

El término "aminoácido" se refiere a la unidad estructural química básica de una proteína o polipéptido. Las siguientes abreviaturas se usan en la presente descripción para identificar aminoácidos específicos: El término "gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de expresarse como una proteína específica, opcionalmente, que incluye secuencias reguladoras antes (secuencias no codificantes 5') y después (secuencias no codificantes 3') de la secuencia codificante. "Gen nativo" se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no sea un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de fuentes diferentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificantes que se derivan de la misma fuente, pero que están dispuestas de una forma diferente a la que se encuentra en la naturaleza. "Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su lugar natural en el genoma de un microorganismo. Un gen "extraño" se refiere a un gen que normalmente no se encuentra en el microorganismo huésped, pero que se introduce en el microorganismo huésped por medio de transferencia de genes. Los genes extraños pueden comprender genes naturales insertados en un microorganismo no natural, o genes quiméricos. Un "transgen" es un gen que se ha introducido en el genoma por medio de un procedimiento de transformación.

Como se usa en la presente descripción, "natural" se refiere a la forma de un polinucleótido, gen o polipéptido como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras, si están presentes.

Como se usa en la presente descripción, el término "secuencia codificante" o "región codificante" se refiere a una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos específica. "Secuencias reguladoras adecuadas" se refiere a las secuencias de nucleótidos que están ubicadas dirección 5' (secuencias no codificantes 5'), dentro o dirección 3' (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del AR o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir, pero no se limitan a, promotores, secuencias líder de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios efectores de unión y estructuras de tallo-bucle.

Como se usa en la presente descripción, "endógeno" se refiere a la forma nativa de un polinucleotido, gen o polipéptido en su lugar natural en el organismo o en el genoma de un organismo. El "polinucleotido endógeno" incluye un polinucleotido nativo en su lugar natural en el genoma de un organismo. El "gen endógeno" incluye un gen nativo en su lugar natural en el genoma de un organismo. "Polipéptido endógeno" incluye un polipéptido natural en su lugar natural en el organismo transcrito y traducido de un polinucleotido o gen natural en su lugar natural en el genoma de un organismo.

El término "heterólogo" , cuando se usa con referencia a un polinucleotido, un gen o un polipéptido, se refiere a un polinucleotido, gen o polipéptido que no se encuentra normalmente en el organismo huésped. "Heterólogo" incluye, además, una región codificante nativa, o porción de esta, que se reintroduce en el organismo de origen en una forma que es diferente a la del gen nativo correspondiente, por ejemplo, no en su localización natural en el genoma del organismo. El polinucleótido o gen heterólogo puede introducirse en el organismo huésped, por ejemplo, por transferencia de genes. Un gen heterólogo puede incluir una región codificante natural con regiones reguladoras no naturales que se introduce nuevamente en el huésped natural. Por ejemplo, un gen heterólogo puede incluir una región codificante natural que es una porción de un gen quimérico que incluye regiones reguladoras no naturales que se introduce nuevamente en la célula huésped natural. "Polipéptido heterólogo" incluye un polipéptido natural que se introduce nuevamente en el organismo de origen en una forma diferente del polipéptido natural correspondiente .

Un "transgén" es un gen que se ha introducido en el genoma por medio de un procedimiento de transformación.

Como se usa en la presente descripción, el término "modificación" se refiere a un cambio en un polinucleótido descrito en la presente descripción que produce una actividad reducida o eliminada de un polipéptido codificado por el polinucleótido, así como un cambio en un polipéptido descrito en la presente descripción que produce una actividad reducida o eliminada del polipéptido. Los cambios pueden realizarse por medio de métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, supresión, mutación (por ejemplo, mutagenésis espontánea, mutagenésis aleatoria, mutagenésis causada por los genes mutantes o mutagenésis transposón) , sustitución, inserción, regulación por disminución, alteración de la ubicación celular, alteración del estado del polinucleótido o polipéptido (por ejemplo, metilación, fosforilación o ubiquitinación) , eliminación de un cofactor, introducción de un ARN no codificante/ADN, introducción de un ADN/ARN de interferencia, modificación química, modificación covalente, irradiación con rayos UV o rayos X, recombinación homologa, recombinación mitótica, métodos de rempbucle de promotor y/o combinaciones de estos. Se puede encontrar una guía para determinar qué nucleótidos o residuos de aminoácidos pueden modificarse al comparar la secuencia del polinucleótido o polipéptido particular con la de polinucleótidos o polipéptidos homólogos, por ejemplo, de levadura o de bacterias, y al maximizar la cantidad de modificaciones realizadas en las regiones de homología alta (regiones conservadas) o secuencias consenso .

La frase "elemento recombinante para expresión genética" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una o más proteínas específicas, que incluyen las secuencias reguladoras antes (secuencias no codificantes 5') y después (secuencias de terminación 3') de las secuencias codificantes para las proteínas. Un gen quimérico es un elemento recombinante de expresión genética. Las regiones codificantes de un operón pueden formar un elemento recombinante de expresión genética, junto con una región promotora y de terminación unidas operativamente .

"Secuencias reguladoras" se refiere a las secuencias de nucleótidos que se localizan dirección 5' (secuencias no codificantes 5')/ dentro, o dirección 3' (secuencias no codificantes 3') de una secuencia codificante y que influyen en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad del ARN, o la traducción de la secuencia codificante asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, potenciadores , operadores, represores, señales de terminación de transcripción, secuencias líder de traducción, intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitio de procesamiento del ARN, sitio efector de unión y estructura de tallo y bucle .

El término "promotor" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN funcional. Generalmente, una secuencia de codificación se localiza en dirección 3' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de promotores diferentes que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos sintéticos de ácido nucleico. Los experimentados en la técnica comprenderán que los distintos promotores pueden dirigir la expresión de un gen en tejidos o tipos celulares diferentes, o en distintas etapas del desarrollo, o en respuesta a condiciones ambientales o fisiológicas diferentes. Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de tipos de células la mayor parte de las veces se denominan, comúnmente, "promotores constitutivos". Por otra parte, los "promotores inducibles" hacen que un gen se exprese cuando el promotor está inducido o activado por una señal o molécula específica para el promotor. Se reconoce, además, que dado que en la mayoría de casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de longitudes diferentes pueden tener una actividad promotora diferente. Por ejemplo, se comprenderá que el "promotor de FBA1" se puede usar para hacer referencia a un fragmento derivado de la región promotora del gen FBA1.

El término "terminadoras" , como se usa en la presente descripción, se refiere a las secuencias de ADN ubicadas dirección 3' de una secuencia codificante. Estas incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican las señales reguladoras que tienen la capacidad de afectar el procesamiento de ARNm o la expresión genética. La señal de poliadenilación se caracteriza, usualmente, porque afecta la adición de cadenas de ácido poliadenílico al extremo 3' del precursor de ARNm. La región 3' puede afectar la transcripción, el procesamiento o estabilidad de ARN o la traducción de la secuencia codificante relacionada. Se reconoce que dado que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido completamente, los fragmentos de ADN de longitudes diferentes pueden tener una actividad del terminador idéntica. Por ejemplo, se entenderá que "terminador CYC1" puede usarse para hacer referencia a un fragmento derivado de la región terminadora del gen CYC1.

El término "operativamente unido" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico para que la función de una se vea afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificante (es decir, que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del promotor) . Las secuencias codificantes pueden estar unidas operativamente a secuencias reguladoras en orientación codificante o no codificante .

El término "expresión", como se usa en la presente descripción, se refiere a la transcripción y acumulación estable de ARN codificante (ARNm) o no codificante derivado del fragmento de ácido nucleico de la presente invención. Además, el término "expresión" puede referirse a la traducción del ARNm en un polipéptido.

Como se usa en la presente descripción, el término "sobreexpresión" se refiere a la expresión que es mayor que la expresión endógena del mismo gen o gen relacionado. Un gen heterólogo se sobreexpresa, si la expresión pertinente es mayor que la de un gen endógeno comparable. El término sobreexpresión se refiere a un incremento en la concentración de ácido nucleico o proteína en una célula huésped. Por lo tanto, la sobreexpresión puede resultar del incremento del nivel de transcripción o traducción de una secuencia endógena en una célula huésped o puede resultar de la introducción de una secuencia heterólog'a en una célula huésped. La sobreexpresión puede resultar, además, del incremento de la estabilidad de una secuencia de ácido nucleico o de proteínas .

Como se usa en la presente descripción, el término "transformación" se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el genoma de un microorganismo huésped, lo que produce una herencia genéticamente estable. Los microorganismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformado se denominan microorganismos "transgénicos" , "recombinantes" o "transformados".

Los términos "plásmido" , "vector" y "cásete" se refieren a un elemento extracromosómico que porta, frecuentemente, genes que no forman parte del metabolismo central de la célula y, habitualmente , están en forma de fragmentos de ADN bicatenario circular. Estos elementos pueden ser secuencias de replicación autónoma, secuencias integradoras de genomas, secuencias de nucleótidos o fagos, lineales o circulares, de un AR o ADN mono o bicatenario, derivadas de cualquier fuente, en donde varias de las secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción única capaz de introducir un fragmento de un promotor y secuencia de ADN para un producto génico seleccionado junto : con la secuencia no traducida 3' apropiada en una célula. "Cásete de transformación" se refiere a un vector específico que contiene un gen exógeno y tiene otros elementos, además del gen exógeno, que facilitan la transformación de una célula huésped determinada. "Cásete de expresión" se refiere a un vector específico que contiene un gen exógeno y que tiene otros elementos, además del gen exógeno, que permiten una expresión mejorada de el gen en un huésped extraño.

El término "genoteca de saturación del sitio" se refiere a una genoteca que contiene sustituciones aleatorias en una posición de aminoácidos específica con hasta y que incluye los 20 aminoácidos posibles simultáneamente.

El término "PCR propensa a errores" se refiere a la adición de errores de copia aleatorios al imponer condiciones de reacción de PCR imperfectas o 'deficientes' que generan genotecas aleatorizadas de mutaciones en una secuencia de nucleótidos específica.

Como se usa en la presente descripción, el término "degeneración de codones" se refiere a la naturaleza en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. El técnico experimentado conoce perfectamente la "preferencia codónica" exhibida "por una célula huésped específica en el uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por ello, cuando se sintetiza un gen para expresión mejorada en una célula huésped, es conveniente diseñar el gen de manera que su frecuencia de uso de codones se aproxime a la frecuencia preferida de uso de codones de la célula huésped.

El término "optimizado por codón" , en lo que se refiere a genes o regiones codificantes de moléculas de ácido nucleico para transformación de diversos huéspedes, se refiere a la alteración de codones en el gen o regiones codificantes de las moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso de codones típicos del organismo huésped sin alterar el polipéptido codificado por el ADN. La optimización incluye reemplazar al menos uno o más que uno o un número significativo de codones con uno o más codones que son usados, más frecuentemente, en los genes de ese organismo.

Las desviaciones en la secuencia de nucleótido que comprende los codones que codifican los aminoácidos de la cadena de polipéptido permiten las variaciones en la secuencia que codifica el gen. Dado que cada codón consiste en tres nucleotidos, y los nucleotidos que comprenden el ADN se encuentran restringidos a cuatro bases específicas, existen 64 combinaciones posibles de nucleotidos, 61 de estos codifican los aminoácidos (los tres codones restantes codifican la traducción que termina las señales) . El "código genético" que muestra cuales son los codones que codifican ciertos aminoácidos se reproducen en la presente descripción como Tabla 2A. Como resultado, muchos aminoácidos se designan por más de un codón. Por ejemplo, los aminoácidos alanina y prolina se encuentran codificados por cuatro tripletes, serina y arginina por seis, en tanto que triptófano y metionina se codifican por solo un triplete . Esta degeneración permite que la composición de la base de ADN varíe ampliamente sin alterar la secuencia de aminoácido de las proteínas codificadas por el ADN.

Tabla 2A. Código genético estándar Muchos organismos muestran una parcialidad de uso de codones particulares para codificar la inserción de un aminoácido particular en una cadena de péptido creciente. La selección de codón o la preferencia codónica, las diferencias en el uso de codones entre organismos, se logra por degeneración del código genético, y está documentado con respecto a muchos organismos. La preferencia codónica se correlaciona, frecuentemente, con la. eficacia de traducción del ARN mensajero (ARNm) , el cual se cree, a su vez, que es dependiente de, entre otras, las propiedades de los codones que se traducen y la disponibilidad de las moléculas del ARN de transferencia (ARNt) particular. La predominancia de los ARNt seleccionados en una célula es, generalmente, una reflexión de los codones usados, más frecuentemente, en síntesis de péptido. En consecuencia, los genes pueden adaptarse para una expresión óptima de gen en un organismo dado en función de la optimización por codón.

Dado el gran número de secuencias de gen disponibles para una amplia variedad de animal, planta y especies microbianas, es posible calcular las frecuencias relativas de uso de codones . Las tablas de uso de codones se encuentran disponibles fácilmente, por ejemplo, en la "base de datos de uso de codones" disponible en www.kazusa.or.jp/codon/ (visitada el 20 de marzo de 2008) y estas tablas pueden adaptarse en muchas maneras. Ver Nakamura, Y., et al. Nucí. Acids Res. 28:292 (2000) . Las tablas de uso de codones para levadura, calculadas a partir de la publicación de GenBank 128.0 [15 de febrero de 2002], se reproducen más abajo en la Tabla 2B . Esta tabla usa la nomenclatura ARNm y, entonces, en lugar de timina (T) que se encuentra en el ADN, las tablas usan uracilo (U) que se encuentra en el ARN . La Tabla 2B se ha adaptado de tal manera que las frecuencias se calculan para cada aminoácido, en vez de que se calcule para los 64 codones.

Tabla 2B. Tabla del uso de codones para Saccharomyces cerevisiae Al usar esta tabla o tablas similares, las personas con conocimiento ordinario en la técnica pueden aplicar las frecuencias a cualquier secuencia dada de polipéptido y producir un fragmento de ácido nucleico de una región codificante optimizada por codón que codifica el polipéptido, si bien usa. codones óptimos para una especie dada.

La asignación aleatoria de codones en una frecuencia optimizada para codificar una secuencia dada de polipéptido puede realizase manualmente al calcular frecuencias de codones para cada aminoácido, y después, asignar los codones a la secuencia de polipéptido aleatoriamente. Adicionalmente, varios algoritmos y programas de software se encuentran fácilmente disponibles para las personas con conocimiento ordinario en la técnica. Por ejemplo, la función "EditSeq" en el paquete Lasergene, disponible de DNAstar, Inc., Madison, WI , la función de traducción inversa en el paquete VectorNTI, disponible de InforMax, Inc., Bethesda, MD, y la función "backtranslate" (traducción inversa) en el paquete GCG-Wisconsin, disponible de Accelrys, Inc., San Diego, CA. Adicionalraente, varios recursos se encuentran disponibles públicamente para las secuencias de la región codificante optimizada por codones, por ejemplo, la función "backtranslation" (traducción inversa) en www . entelechon . com/bioinformatics/backtranslation . php?lang=en g (visitada el 15 de abril de 2008) y la función "backtranseq" (secuencia de traducción inversa) disponible en http : //bioinfo .pbi . nrc . ca : 8090/EMBOSS/index. html (visitada el 9 de julio de 2002) . Al construir un algoritmo rudimentario para asignar codones basados en una frecuencia dada puede llevarse a cabo, fácilmente, además, con funciones matemáticas básicas por una persona con conocimiento ordinario en la técnica.

Las regiones codificantes optimizadas por codones pueden diseñarse mediante varios métodos conocidos para aquellos con experiencia en la técnica que incluyen paquetes de programas tales como "synthetic gene designer" (userpages.umbc.edu/~wugl/codon/sgd/, visitada el 19 de marzo de 2012) .

Un polinucleótido o fragmento de ácido nucleico es "hibridable" con otro fragmento de ácido nucleico, tal como ADNc, ADN genómico o molécula de ARN, cuando una forma raonocatenaria del fragmento de ácido nucleico puede aparearse con el otro fragmento de ácido nucleico en las condiciones apropiadas de temperatura y potencia iónica de la. solución. Las condiciones de lavado e hibridación son muy conocidas y se ejemplifican en Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.° ed. , Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989) , particularmente, el Capítulo 11 y la Tabla 11.1 de este manual (que se incorporan como referencia en la presente descripción) . Las condiciones de temperatura y potencia iónica determinan la "rigurosidad" de la hibridación. Las condiciones de rigurosidad se pueden ajustar para identificar fragmentos moderadamente similares (tales como secuencias homologas de organismos poco relacionados) con fragmentos muy similares (tales como los genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados) . Los lavados posteriores a la hibridación determinan las condiciones de rigurosidad. Un conjunto de condiciones usa una serie de lavados que comienza con SSC 6X, 0.5 % de SDS a temperatura ambiente durante 15 minutos, se repiten luego con SSC 2X, 0.5 % de SDS a 45 °C durante 30 minutos y, después, se repiten dos veces con SSC 0.2X, 0.5 % de SDS a 50 °C durante 30 minutos. Otro conjunto de condiciones rigurosas emplea temperaturas más altas, en donde los lavados son idénticos a los descritos anteriormente, salvo que la temperatura de los dos lavados finales de 30 minutos en SSC 0.2X, 0.5 % de SDS se incrementa a 60 °C. Otro conjunto de condiciones altamente rigurosas emplea dos lavados finales en SSC 0.1X, 0.1 % de SDS a 65 °C. Otro conjunto de condiciones rigurosas incluye la hibridación a 0. IX SSC, 0.1 % SDS, 65 °C y lavados con 2X SSC, 0.1 % SDS seguidos de 0. IX SSC, 0.1 % SDS, por ejemplo.

La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias, aunque dependiendo de la rigurosidad de la hibridación, son posibles las faltas de coincidencias entre bases. La rigurosidad apropiada para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables muy conocidas en la técnica. A mayor grado de similitud u homología entre las dos secuencias de nucleótidos, mayor será el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a un valor más alto de Tm) de hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el siguiente orden: ARN:AR , ADN :ARN, AD :AD . Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud, se han derivado ecuaciones para calcular la Tm (ver Sambrook et al., supra, 9.50 9.51) . Para las hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos , la posición de las faltas de coincidencias se vuelve más importante, y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (ver Satnbrook et al., supra, 11.7 11.8). En una modalidad, la longitud de un ácido nucleico hibridable es de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos. En una modalidad, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridizable es de por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos; de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos; o de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos. Además, una persona con experiencia en la técnica reconocerá que la temperatura y la concentración de sal de la solución de lavado pueden ajustarse según sea necesario en función de factores tales como la longitud de la sonda.

Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido" está previsto para abarcar un "polipéptido" singular y un el plural "polipéptidos" y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente con enlace amídico (conocidos, además, como enlace de péptidos) . El término "polipéptido" se refiere a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos , "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de "polipéptido" y el término "polipéptido" puede usarse en vez de o indistintamente con cualquiera de estos términos. Un polipéptido se puede derivar de una fuente biológica natural o se puede producir por tecnología recombinante , pero no se produce necesariamente de una secuencia de ácido nucleico designada. Puede generarse de cualquier modo, inclusive mediante síntesis química.

Por un polipéptido "aislado" o un fragmento, variante, o derivado de este se entiende un polipéptido que no se encuentra en su medio natural . No se requiere ningún nivel de purificación particular. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede eliminarse de su ambiente natural o de origen. Los péptidos producidos recombinantemente y proteínas expresadas en células huéspedes se consideran aislados para los propósitos de la invención, dado que son nativos o polipéptidos recombinantes que se han separado, fraccionado o parcial o prácticamente purificados por cualquiera técnica adecuada .

Como se usa en la presente descripción, los términos "variante" y "mutante" son sinónimos y se refieren a un polipéptido que difiere de un polipéptido mencionado específicamente por una o más inserciones, supresiones, mutaciones y sustituciones de aminoácidos creadas con el uso de, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, tales como mutagénesis. Una guía para determinar qué residuos de aminoácidos pueden reemplazarse, agregarse o eliminarse sin suprimir actividades de interés puede encontrarse al comparar la secuencia del polipéptido particular con la de polipéptidos homólogos, por ejemplo, de levaduras o de bacterias, y al minimizar la cantidad de cambios de secuencias de aminoácidos realizados en regiones de homología alta (regiones conservadas) o al reemplazar aminoácidos con secuencias consenso.

"Polipéptido modificado", como se usa en la presente descripción, se refiere a un polipéptido que es sintético, es decir, que difiere en cierta manera de un polipéptido que se encuentra en la naturaleza.

Alternativamente, las variantes de polinucleótido recombinante que codifican estos mismos polipéptidos o similares pueden sintetizarse o seleccionarse con el uso de la "redundancia" en el código genético. Varias sustituciones de codones, tales como los cambios silenciosos que producen varios sitios de restricción, pueden introducirse para optimizar la clonación en un plásmido o vector viral para expresión. Las mutaciones en la secuencia de polinucleótidos pueden reflejarse en el polipéptido o dominios de otros péptidos agregados al polipéptido para modificar las propiedades de cualquier parte del polipéptido. Por ejemplo, pueden usarse modificaciones para reducir o eliminar la expresión de una proteína objetivo e incluyen, pero no se limitan a, la supresión de todo el gen o de una porción de este, la inserción de un fragmento de ADN en el gen (en la región codificante o la promotora) para que la proteína no se exprese o se exprese en niveles más bajos, la introducción de una mutación en la región codificante que agrega un codón de terminación o cambio en el marco para que una proteína funcional no se exprese, y la introducción de una o más mutaciones en la región codificante para alterar aminoácidos y que se exprese una proteína no funcional o menos enzimáticamente activa.

Las "sustituciones" de aminoácidos pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, por ejemplo, sustituciones conservadoras de aminoácidos o pueden ser el resultado de reemplazar un aminoácido con un aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas diferentes, es decir, sustituciones no conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones "conservadoras" de aminoácidos pueden realizarse en función de la similitud en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad o la naturaleza amfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, los aminoácidos · no polar (hidrófobo) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutrales polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (acídicos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Alternativamente, las sustituciones "no conservadoras" de aminoácidos pueden realizarse al seleccionar las diferencias en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad o la naturaleza antipática de cualquiera de estos aminoácidos. Las "inserciones" o "supresiones" pueden estar dentro del intervalo de variación de conformidad con la tolerancia estructural o funcional de las proteínas recombinantes . La variación permitida se puede determinar experimentalmente al realizar sistemáticamente inserciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos en una molécula de polipéptidos con el uso de técnicas de ADN recombinante y al realizar ensayos en las variantes recombinantes resultantes para la actividad.

Una "porción sustancial" de una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos es la porción que comprende suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar putativamente ese polipéptido o gen, ya sea por evaluación manual de la secuencia por parte de una persona con experiencia en la técnica o mediante una comparación e identificación de secuencias automatizadas por computadora con el uso de algoritmos tales como BLAST (Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol . , 215:403-410 (1993)). Generalmente, se necesita una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos para identificar putativamente una secuencia de polipéptidos o de ácidos nucleicos como homologa de una proteína o un gen conocidos. Además, con relación a las secuencias de nucleótidos, las sondas de oligonucleótidos específicas del gen que comprenden de 20 a 30 nucleótidos contiguos pueden usarse en métodos dependientes de la secuencia para identificación de genes {por ejemplo, hibridación Southern) y aislamiento (por ejemplo, hibridación in situ de colonias bacterianas o placas bacteriófagas ) . Además, los oligonucleótidos cortos de 12-15 bases pueden usarse como cebadores de amplificación en PCR para obtener un fragmento de ácido nucleico particular que comprende los cebadores. Por consiguiente, "una porción" sustancial de una secuencia de nucleótidos comprende una cantidad suficiente de la secuencia para identificar y/o aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la secuencia. La descripción de la presente instruye sobre la secuencia completa de aminoácidos y de nucleótidos que codifican proteínas específicas. El técnico con experiencia, con el beneficio de las secuencias como se reportan en la presente descripción, ahora puede usar todas o una porción sustancial de las secuencias descritas para propósitos conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por lo tanto, la invención instantánea comprende las secuencias completas como se reportan en el listado de secuencias anexo, así como las porciones sustanciales de aquellas secuencias tal como se definieron anteriormente.

El término "complementario" se usa para describir la relación entre bases nucleotídicas que son capaces de hibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenina es complementaria de la timina y la citosina es complementaria de la guanina, y con respecto al ARN, la adenina es complementaria del uracilo y la citosina es complementaria de la guanina.

La frase "porcentaje de identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos, según lo determinado al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" significa, además, el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptido o polinucleótido, según sea el caso, como lo determina la coincidencia entre las cadenas de las secuencias. La "identidad" y la "similitud" pueden calcularse fácilmente mediante métodos conocidos que incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en: 1.) Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed. ) Oxford University: NY (1988); 2.) Biocomputing : Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (Griffin, A. . , and Griffin, H. G., Eds . ) Humania: NJ (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G. , Ed.) Academic (1987); y 5.) Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J. , Eds . ) Stockton: NY (1991) .

Los métodos para determinar la identidad están diseñados para dar la mejor coincidencia entre las secuencias sometidas a prueba. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos públicamente disponibles. Los cálculos de alineamientos de secuencias y de porcentajes de identidad pueden realizarse mediante el uso del programa MegAlign™ del paquete integrado para bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) . Los alineamientos múltiples de las secuencias se realizan con el "método de alineamiento Clustal" que abarca distintas variedades del algoritmo que incluyen el "método de alineamiento Clustal V" que corresponde al método de alineamiento identificado como Clustal V (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. efc al., Comput. Appl . Biosci . , 8:189-191 (1992)) e incluido en el programa MegAlign™ del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc.). Para alineamientos múltiples, los valores predeterminados corresponden a PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN=10 y PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE INTERRUPCIÓN=10. Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares y cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas con el uso del método Clustal son KTUPLE=1, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN3 , VENTANA=5 y DIAGONALES GUARDADAS=5. En el caso de los ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE=2, PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN5, VENTANA=4 y DIAGONALES GUARDADAS=4. Después del alineamiento de las secuencias por medio del uso del programa Clustal V, es posible obtener un "porcentaje de identidad" al ver la tabla de "distancias de la secuencia" en el mismo programa. Además, el "método de alineamiento Clustal " se encuentra disponible y corresponde al método de alineamiento identificado como Clustal W (descrito por Higgins y Sharp, CABIOS. 5:151-153 (1989); Higgins, D.G. et al., Comput. Appl . Biosci. 8:189-191 (1992)) e incluido en el programa MegAlign™ v6.1 del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE (DNASTAR Inc.). Parámetros predeterminados para alineamiento múltiple (PENALIDAD DE INTERRUPCIÓN=10, PENALIDAD DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN0.2 , retardo de las secuencias divergentes (%) =30 , Peso de transición del ADN=0.5, matriz de pesos para proteínas=Series de Gonnet, matriz de pesos para el ADN=IUB) . Después del alineamiento de las secuencias mediante el uso del programa Clustal W, es posible obtener un "porcentaje de identidad" al ver la "tabla de "distancias de secuencia" en el mismo programa .

Un experimentado en la técnica comprenderá muy bien que muchos niveles de identidad de secuencias son útiles para identificar polipéptidos , como a partir de otras especies, en donde los polipéptidos tienen una función o actividad igual o similar, o para describir los polinucleótidos correspondientes. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidades incluyen, pero no se limitan a: 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % o cualquier porcentaj e de enteros de 55 % a 100 % puede ser útil para describir la presente invención, tales como 55 %, 56 %, 57 % , 58 %, 59 %, 60 %, 61 o. ° / 62 % , 63 % , 64 %, 65 %, 66 % , 67 % 8. % / 69 Q, o / 70 %, 71 g, o / 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 % , 78 %, 79 Q. o / 80 %, 81 %, 82 %, 83 % , 84 %, 85 %, 86 %, 87 % , 88 %, 89 q, ¾ / 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 o, "o .

Los fragmentos de polinucleótidos adecuados no solo tienen las homologías mencionadas anteriormente, sino que comprenden, típicamente, un polinucleótido que tiene por lo menos 50 nucleótidos, por lo menos 100 nucleótidos, por lo menos 150 nucleótidos, por lo menos 200 nucleótidos, o por lo menos 250 nucleótidos. Además, los fragmentos de polinucleótidos adecuados que tienen las homologías mencionadas anteriormente codifican un polipéptido que tiene por lo menos 50 aminoácidos, por lo menos 100 aminoácidos, por lo menos 150 aminoácidos, por lo menos 200 aminoácidos, o por lo menos 250 aminoácidos.

El término "software para el análisis de secuencia" se refiere a cualquier programa de software o algoritmo computacional que resulta útil para el análisis de secuencias de nucleótido o aminoácido. El "software para análisis de secuencias" puede estar disponible comercialmente o desarrollado de manera independiente. El software típico para el análisis de secuencia incluirá, pero no se limita a: 1.) el conjunto de programas GCG (Wisconsin Package Versión 9.0, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, I) ; 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX (Altschul et al., J. Mol. Biol . , 215:403-410 (1990)) ; 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc. Madison, WI) ; 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI) ; y 5.) el programa FASTA que incorpora el algoritmo de Smith-Waterman (W. R. Pearson, Comput . Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor(s) : Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY) . Dentro del contexto de esta aplicación se entenderá que cuando el análisis se realiza con el programa de análisis de secuencias, los resultados del análisis estarán basados en los "valores predeterminados" del programa de la referencia, a menos que se especifique de cualquier otra forma. Como se usa en la presente descripción, los valores predeterminados se refieren a cualquier conjunto de valores o parámetros que se cargan originalmente con el programa la primera vez que se inicia.

Las técnicas estándar de ADN recombinante y de clonación molecular son muy conocidas en la técnica y se describen en Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) (de aquí en adelante, "Maniatis"); y en Silhavy, T. J. , Bennan, M. L. y Enquist, L. . , Experimente with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1984); y en Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley- Interscience (1987) . Otros métodos adicionales usados aquí son los incluidos en Methods in Enzymology, volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, Christine Guthrie and Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA) . Otras herramientas y técnicas moleculares son conocidas en la técnica e incluyen escisión y empalme por reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) de extensión superpuesta (Yu, et al. (2004) Fungal Genet . Biol . 41:973-981), selección positiva para mutaciones en el locus URA3 de Saccharomyces cerevisiae (Boeke, J.D. et al. (1984) Mol. Gen. Genet. 197, 345-346; M A Romanos, et al. Nucleic Acids Res. 1991, Enero 11; 19(1): 187), el sistema cre-lox de recombinación específica de sitio, así como los sitios mutantes de lox y mutaciones de sustrato FLP (Sauer, B. (1987) Mol Cell Biol 7: 2087-2096; Senecoff, et al. (1988) Journal of Molecular Biology, Volumen 201, Ejemplar 2, págs . 405-421; Albert, et al. (1995) The Plant Journal. Volumen 7, Ejemplar 4, páginas 649-659) , supresión de genes "sin costuras" (Akada, et al. (2006) Yeast; 23 (5) : 399-405) y metodología de reparación de interrupciones (Ma et al., Genetics 58:201-216; 1981).

Las manipulaciones genéticas de una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción pueden realizarse con el uso de técnicas estándar de genética y de evaluación y pueden efectuarse en cualquier célula huésped que sea adecuada para la manipulación genética (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202).

En las modalidades, una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción puede ser cualquier huésped de levadura u hongo útil para la modificación genética y para la expresión génica recombinante que incluyen las levaduras mencionadas en otra sección de la presente descripción, tal como en la Tabla 7. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser un miembro de los géneros Issatchenkia, Zygosaecha o yees, Schizosaccharomyces, Dekkera, Torulopsis, Brettanomyces, Torulaspora, Hanseniaspora, Kluveromyces, Yarrowia y algunas especies de Candida.

Polipéptidos con actividad de KARI En algunas modalidades, las células huésped recombinantes y los métodos proporcionados en la presente descripción cubren una necesidad que surge en la producción microbiana de isobutanol, en donde la enzima KARI desempeña una función vital. En la ruta biosintética de isobutanol que se muestra en la Figura 1, la conversión de sustrato a producto de acetolactato a dihidroxiisovalerato (DHIV) está catalizada por la enzima KARI. La publicación de la solicitud de los Estados Unidos núm. US2011/0244536 que se incorpora como referencia describe polipéptidos que tienen actividad de cetol-ácido reductoisomerasa que son miembros del grupo SLSL de KARI. Se descubrió que los polipéptidos que tienen actividad de KARI descritos en esta son efectivos para la producción de isobutanol. El grupo SLSL de KARI incluye las enzimas KARI enumeradas en la Tabla 3.

Tabla 3. KARI efectivas Como se describe y se demuestra en la presente descripción, los solicitantes han descubierto enzimas KARI adicionales y variantes de las enzimas KARI adicionales que resultan en una producción de isobutanol comparable y/o mayor que la observada con la KARI de Lactococcus lactis. Tales enzimas KARI y variantes resultan en un título de isobutanol comparable o mayor y/o en una productividad de isobutanol efectiva mayor en comparación con la observada con la KARI de Lactococcus lactis en las mismas condiciones. Por lo tanto, en las modalidades, los polipéptidos que tienen actividad de KARI que funcionan en una ruta de producción de isobutanol tienen un título de isobutanol y/o una productividad de isobutanol efectiva comparable o mejor que la de la KARI de Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident.: 380) .

Por lo tanto, tales polipéptidos que tienen actividad de KARI pueden ser adecuados para la producción de isobutanol. Se apreciará que con el uso de una combinación de información de estructuras y secuencias disponible en la técnica, los polipéptidos que comprenden actividad de KARI y menos de 100 % de identidad con las secuencias ejemplificadas se pueden construir para usar en las rutas biosinteticas de isobutanol. Por ejemplo, las estructuras de cristal de la enzima KARI de E. coli a una resolución de 2.6 Á se han solucionado (Tyagi, et al., Protein Sci., 14: 3089-3100, 2005) , así como la estructura de la KARI de P. aeruginosa (Ahn, et al., J. Mol. Biol . , 328: 505-515, 2003) y la enzima KARI de espinaca (Biou V., et al. The EMBO Journal, 16: 3405-3415, 1997). Además, la presente descripción describe un Perfil HMM (proporcionado en la presente descripción; Tabla Z) preparado con el uso de secuencias de aminoácidos de 25 proteínas KARI con una función verificada experimentalmente como se describe en la Tabla 1. Las enzimas KARI eran de Pseudomonas fluorescens Pf-5, Sulfolobus solfataricus P2, Pyrobaculum aerophilum cepa IM2 , Na ronomonas pharaonis DSM 2160, Bacillus subtilis subsp. subtilis cepa 168, Corynejbacterium glutamicum ATCC 13032, Phaeospririlum molischianum, Ralstonia solanacearum GMI1000, Zymomonas mobilis subsp. mobilis ZM4 , Alkalilimnicola ehrlichei MLHE-, Campylobacter lari RM2100, Marínobacter aquaeolei VT8, Psychrobacter arcticus 273-4, Hahella chejuensis KCTC 2396, Thiobacillus denitrificans ATCC 25259, Azotobacter vinelandii AvOP, Pseudomonas syringae pv. syringae B728a, Pseudomonas syringae pv. tomato cepa DC3000, Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas entomophila L48, Pseudomonas mendocina ymp, Pseudomonas aeruginosa PAOl, Bacillus cereus ATCC 10987, Bacillus cereus ATCC 10987 y Spinacia olerácea . Se espera que cualquier proteína que coincide con el Perfil HMM con un valor E de <10"3 con el uso del programa hmmsearch en el paquete HM ER sea una KARI funcional.

Se cree que la producción de isobutanol usa la ruta de glicólisis presente en el microorganismo huésped. Durante la producción de dos moléculas de piruvato de glucosa durante la glicólisis, hay una producción neta de dos moléculas de NADH de NAD+ por la reacción de la gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa . Durante la producción adicional de una molécula de isobutanol a partir de dos moléculas de piruvato, hay un consumo neto de una molécula de NAD(P)H por la reacción de KARI , y una molécula de NAD(P)H por la reacción de isobutanol deshidrogenasa . La interconversión de NADH con NADPH es, generalmente, lenta e ineficiente en la levadura ,-por lo tanto, el NADPH a consumir es generado por metabolismo (por ejemplo, por la ruta de la pentosa fosfato) que consume sustrato en el proceso. Entretanto, la célula procura mantener la homeostasis en la relación NAD+/NADH, lo que hace que el exceso de NADH que se produjo en la producción de isobutanol se consuma en una reducción desperdiciadora de otros intermedios metabólicos ; por ejemplo, por la producción de glicerol (Bakker, et al., 2001. Stoichiometry and compartmentation of NADH metabolism in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol . Rev. 25:15-37. ) . Por lo tanto, un desequilibrio entre el NADH producido y el NADPH consumido por la ruta de isobutanol puede producir una reducción en el rendimiento molar del isobutanol producido a partir de glucosa en dos maneras: 1) la operación innecesaria del metabolismo para producir NADPH, y 2) la reacción desperdiciadora de los intermedios metabólicos para mantener la homeostasis de NAD+/NADH. Los polipéptidos que tienen actividad de KARI que funcionan bien en una ruta de isobutanol y que tiene una KM baja para NADH se pueden usar para mejorar la producción de isobutanol.

La presente descripción describe, además, las sustituciones para las secuencias de enzima KARI que se proporcionan en la Tabla 3 y en la Tabla 10 para producir variantes con diferente capacidad para usar el NADH como un cofactor. Tales variantes proporcionan alternativas que se pueden usar para optimizar la eficacia de una ruta biosintética que usa KARI, tal como una ruta biosintética de isobutanol, para condiciones de producción particulares. Los ejemplos demuestran la producción de isobutanol en condiciones cambiadas de aerobias a anaerobias para las variantes de la enzima KARI K9 derivada de Anaerostipes caccae con diferentes capacidades para usar NADH. Por lo tanto, con la presente descripción, un experto en la técnica puede producir células huésped recombinantes que comprenden una enzima KARI del grupo SLSL o una enzima KARI de Enterococcus gallinarum, Streptccoccus thermophilus Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363, Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium dentium o Anaerostipes caccae, Lactococcus lactis o una variante o fragmento activo de estas adecuado para una gran variedad de condiciones de producción.

En algunas modalidades, la presente descripción proporciona un polipéptido que tiene actividad de KARI y que tiene por lo menos aproximadamente 80 %, por lo menos aproximadamente 85 %, por lo menos aproximadamente 90 %, por lo menos aproximadamente 95 %, por lo menos aproximadamente 98 % o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con una enzima KARI de la Tabla 3 o de la Tabla 10, o los Ejemplos 16, 17, 21 y que tienen una KM para NADH menor que aproximadamente 300 µ?, 100 µ?, 50 µ?, 20 µ?, 10 µ? o 5 µ?. En algunas modalidades, la presente descripción proporciona un polipéptido modificado que tiene actividad de KARI y que tiene por lo menos aproximadamente 80 %, por lo menos aproximadamente 85 %, por lo menos aproximadamente 90 %, por lo menos aproximadamente 95 %, por lo menos aproximadamente 98 % o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con una enzima KARI de la Tabla 3, Tabla 10 o Ejemplos 16, 17, 21. En algunas modalidades, tales polipéptidos tienen una KM para NADH menor que la de la enzima natural correspondiente. En algunas modalidades, la relación de la KM para NADH y la KM para NAPDH es menor que 0.1, en algunas modalidades, es menor que 1, en algunas modalidades, es menor que 2, en algunas modalidades, es menor que 4.

Las enzimas KARI y variantes de estas que son particularmente adecuadas para la producción de isobutanol incluyen, pero no se limitan a, variantes de una cetol-ácido reductoisomerasa de Anaerostipes caccae DSM 14662 (sec. con núm. de ident. : 643) : "K9G9" (sec. con núm. de ident . : 644) y "K9D3" (sec. con núm. de ident.: 645) que tienen una KM para NADH menor que la de la enzima natural (sec. con núm. de ident . : 643) .

Las células huésped proporcionadas en la presente descripción pueden comprender un polipéptido que tiene actividad de cetol-ácido reductoisomerasa. En las modalidades, tales polipéptidos tienen por lo menos aproximadamente 80 %, por lo menos aproximadamente 85 %, por lo menos aproximadamente 90 %, por lo menos aproximadamente 95 %, por lo menos aproximadamente 98 % o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con la sec . con núm. de ident . : 643, una variante activa de estos; o una KARI derivada de Anaerostipes caccae DSM 14662, o una variante activa de esta. En las modalidades, los polipéptidos tienen por lo menos aproximadamente 80 %, por lo menos aproximadamente 85 %, por lo menos aproximadamente 90 %, por lo menos aproximadamente 95 %, por lo menos aproximadamente 98 % o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con la sec. con núm. de ident.: 645 o 644. En las modalidades, los polipéptidos comprenden la sec. con núm. de ident. : 645 o 644.

En algunas modalidades, los polipéptidos que tienen actividad de KARI comprenden por lo menos aproximadamente 80 %, por lo menos aproximadamente 85 %, por lo menos aproximadamente 90 %, por lo menos aproximadamente 95 %, por lo menos aproximadamente 98 % o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 419 [JB4P] , 427 [SB2] y todas las variantes enumeradas en las Tablas 25 y 26. Tales variantes proporcionan alternativas para optimizar la eficacia de la ruta biosintética de isobutanol para condiciones de producción particulares. En el ejemplo se demuestra la producción de isobutanol bajo condiciones.

Identificación de polipéptidos adicionales que tienen actividad de KARI El Ejemplo 1 describe un análisis de la biodiversidad de genes codificadores de KARI de diversas especies bacterianas y fúngicas que revelaron KARI adecuadas para la producción de isobutanol. Con la presente descripción, un experto en la técnica podrá fácilmente identificar los polipéptidos adecuados adicionales que tienen actividad de KARI.

Las secuencias de otros polinucleótidos , genes y/o polipéptidos se pueden identificar en la literatura y en bases de datos de bioinformática muy conocidas para los experimentados en la técnica con el uso de las secuencias descritas en la presente descripción y disponibles en la técnica. Por ejemplo, tales secuencias pueden identificarse a través de la búsqueda BLAST de bases de datos disponibles al público con las secuencias de polinucleótidos o secuencias de polipéptidos proporcionadas en la presente descripción. En el método, las identidades pueden basarse en el método de alineamiento Clustal W al usar los parámetros predeterminados de PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN =10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE INTERRUPCIÓN = 0.1 y series Gonnet 250 de matriz de peso de proteína.

Adicionalmente , las secuencias de polinucleótidos o secuencias de polipéptidos descritas en la presente descripción pueden usarse para identificar otros homólogos de KARI en la naturaleza. Por ejemplo, cada enzima KARI que codifica los fragmentos de ácido nucleico descritos en la presente descripción se pueden usar para aislar genes que codifican proteínas homologas. En la técnica se conoce el aislamiento de genes homólogos por medio de protocolos que dependen de la secuencia. Los ejemplos de protocolos dependientes de secuencia incluyen, pero no se limitan a (1) métodos de hibridación de ácido nucleico; (2) métodos de amplificación de ADN y ARN, como se ilustra a través de varios usos de tecnologías de amplificación de ácido nucleico [por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés), Mullís et al., patente de los Estados Unidos núm. 4,683,202; reacción en cadena de la ligasa (LCR, por sus siglas en inglés), Tabor et al., Proc . Acad. Sci . USA 82:1074 (1985); o amplificación por desplazamiento de cadena (SDA, por sus siglas en inglés), Walker et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)]; y (3) métodos de construcción de genotecas y análisis por complementación.

Se apreciará que el experto en la técnica, con la presente descripción, puede generar fragmentos activos de los polipéptidos proporcionados en la presente descripción, por ejemplo, por truncamiento de los polipéptidos proporcionados en la presente descripción en base a alineamientos de secuencias en el extremo N-terminal y por confirmación de actividad de KARI . En las modalidades, las KARI de Anaerostipes caccae y variantes de estas que proporciona la presente descripción se truncaron en el extremo N-terminal. En una modalidad, hasta y que incluye los primeros cinco aminoácidos se truncan a partir de un polipéptido proporcionado en la presente descripción. En modalidades, el polipéptido es la sec . con núm. de ident . : 27 o una variante de esta. En una modalidad, un polipéptido que tiene actividad de KARI comprende las sec. con núms. de ident.: 635, 637 (codificada por las secuencias de polinucleótidos de las sec. con núms. de ident.: 636 y 638, respectivamente), K9_Annabel_SH (sec. con núm. de ident. :862, proteína de la sec. con núm. de ident. :863) y K9_Zeke_SH (sec. con núm. de ident.: 860, proteína de la sec. con núm. de ident.: 861) o cualquier variante enumerada en la Tabla 40.

Reducción de ¾ para NADH Tal como se muestra en la Figura 2 y en los ejemplos, las mutaciones en las posiciones correspondientes a 50, 52 y 53 y, opcionalmente , 47, de KARI de Pseudomonas fluorescens en la enzima KARI de Anaerostipes caccae resultan en KARI con una KM menor para NADH en comparación con el tipo silvestre, lo que verifica que las mutaciones en estas posiciones producen NADH que aceptan variantes de KARI altamente efectivas. Otras mutaciones adicionales de KARI de Anaerostipes caccae revelaron las posiciones que reducen aún más la KM para NADH.

Como se demuestra en la presente descripción (ver los ejemplos), la sustitución de aminoácidos en la región de unión a fosfato, particularmente, en dos o más posiciones correspondientes a las posiciones 47, 50, 52 y 53 de KARI PF5 (sec. con núm. de ident . : 5) produce menor ¾ para NADH. Por lo tanto, la presente descripción proporciona polipéptidos derivados de un organismo enumerado en la presente descripción, por ejemplo, en las Tablas 3 y 10, que tienen actividad de KARI y que comprenden sustituciones en por lo menos dos de las cuatro posiciones correspondientes a las posiciones 47, 50, 52 y 53 de KARI PF5 en comparación con la secuencia de aminoácidos natural. La presente descripción proporciona polipéptidos que tienen actividad de KARI y que comprenden sustituciones en la región de unión a fosfato. La presente descripción proporciona polipéptidos que tienen actividad de KARI y que comprenden sustituciones en las posiciones correspondientes a S56 y S58 de KARI K9 (sec. con núm. de ident.: 27). En algunas modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a S56 es A. En algunas modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a S58 es D o E. En algunas modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a S53 es Q, E, P o A. En algunas modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a S56 es V o D. En algunas modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a S58 es D o Q. En las modalidades, los polipéptidos comprenden, además, una sustitución en una o más posiciones correspondientes a 186, N87, N107, T131 o T191 de KARI K9 (sec. con núm. de ident . : 27) . En algunas modalidades, los polipéptidos comprenden una sustitución en por lo menos 2, por lo menos 3, por lo menos 4 o todas las posiciones indicadas. En algunas modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a 186 es T o V. En algunas modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a N87 es P. En algunas modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a N107 es S. En algunas modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a T131 es C, L, A, M o V. En algunas modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a T191 es A, S, D, C o G.

En las modalidades, los polipéptidos comprenden menos de 10, 15 o 20 sustituciones con respecto a la secuencia silvestre. En las modalidades, los polipéptidos coinciden con el Perfil HMM según las KARI que se verifican experimentalmente y se proporcionan en la Tabla Z con un valor E menor que < 10"3. Las secuencias se pueden comparar con el perfil HMM proporcionado en la Tabla Z con el uso del paquete de programas hmmsearch (HMMER disponible de Janelia Farm Research Campus, Ashburn, VA) .

Otros polipéptidos adicionales que tienen actividad de KARI y menor KM para NADH pueden obtenerse con el uso de los métodos descritos y demostrados en la presente descripción. Por ejemplo, un polipéptido que tiene actividad de KARI puede usarse en la construcción de una biblioteca de genes de saturación del sitio como se describe en la presente descripción. Los kits para la construcción de tales bibliotecas de genes están disponibles comercialmente (por ejemplo, de USB Corporation, Cleveland, OH, núm. 78480.) La mutagénesis sitio dirigida puede llevarse a cabo, además, con el uso de kits disponibles comercialmente (por ejemplo, el kit de mutagénesis sitio dirigida QuickChange II XL, catálogo núm. 200524, Stratagene, La Jolla, CA) . El diseño de los cebadores para los sitios objetivo para mutagénesis se conoce bien en la técnica, al igual que el alineamiento de secuencias múltiples para identificar los sitios objetivo.

Una vez que las variantes han sido generadas, la actividad de KARI con NADH o NADPH se puede evaluar fácilmente con el uso de métodos conocidos en la técnica y/o descritos en la presente descripción. Por ejemplo, la actividad de KARI se puede determinar al medir la desaparición del NADPH o del NADH de la reacción a 340 nm o al determinar la constante de Michaelis por medio de la medición de la formación de 2 , 3-dihidroxiisovalerato con el uso de HPLC/MS . Además, se puede confirmar la producción de isobutanol a partir de una cepa que comprende variantes.

Especificidad del cofactor Para determinar la especificidad del cofactor, las relaciones VmgX/KM se pueden calcular para cada cofactor en acetolactato de saturación; esas variantes con una relación mayor para NADH reaccionan a una velocidad mayor con NADH que con NADPH en condiciones de concentraciones molares iguales de los dos cofactores y acetolactato de saturación. Los valores de Vm§x y KM para NADH y NADPH pueden determinarse con el uso de métodos conocidos en la técnica y/o proporcionados en la presente descripción (ver el Ejemplo 16) . Por ejemplo, para determinar los valores de Vmgx y KM para NADH y NADPH, las proteínas parcialmente purificadas se pueden evaluar a diversas concentraciones de NADH y NADPH.

Como se demuestra en la presente descripción (ver los Ejemplos 16 y 18 y la Figura 8) , la sustitución de aminoácidos adicionales en K9G9 produce variantes que tienen especificidad incrementada para NADH. Por lo tanto, la presente descripción proporciona polipéptidos que comprenden una sustitución en una o más o todas las posiciones correspondientes a K57, Y53 y E74 de KARI ?9 (sec. con núm. de ident. : 27) . La presente descripción proporciona, además, polipéptidos que comprenden sustituciones en una o más o todas las posiciones correspondientes a Y53, K57, E74, N87 y K90. En las modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a Y53 es F. En las modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a K57 es E . En las modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a E74 es G. En las modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a N87 es P. En las modalidades, la sustitución en la posición correspondiente a K90 es M o L. En las modalidades, las variantes comprenden sustituciones de por lo menos una posición correspondiente a S56 o S58 de la sec . con núm. de ident . : 27 y comprenden, además, por lo menos una, por lo menos dos, por lo menos tres o más de tres sustituciones adicionales correspondientes a las posiciones de la sec. con núm. de ident.: 27 identificada en la presente descripción .

En las modalidades, los polipéptidos comprenden menos de 2, 3, 4, .5, 10, 15 o 20 sustituciones con respecto a la secuencia silvestre. En las modalidades, los polipéptidos coinciden con el Perfil HMM según KARI que se verifican experimentalmente y se proporcionan en la Tabla Z con un valor E menor que < 10"3.

Como se demuestra en los ejemplos, las variantes de K9SB2 (sec. con núm. de ident.: 427) se produjeron y se evaluaron para detectar las variantes con afinidad de NADPH reducida, lo que revela las posiciones adicionales para la sustitución. Por lo tanto, en las modalidades, los polipéptidos comprenden, además, sustituciones en una o más posiciones correspondientes a F53, G55, A56, W59, F67, 184, L85, Q91, M94 y P135 de la sec . con núm. de ident . : 427. En las modalidades, la sustitución en la posición G55 es D o C, la sustitución en la posición Q91 es L, la sustitución en la posición A56 es T o V, la sustitución en P135 es S, la sustitución en la posición F53 es L, la sustitución en la posición M94 es I, la sustitución en la posición F67 es L o I, la sustitución en la posición 59 es C, la sustitución en la posición 184 es L y la sustitución en la posición L85 es M.

Estructura de KARI En la técnica se proporciona información estructural útil para identificar y modificar los polipéptidos que tienen actividad de KARI, tal como en las referencias descritas aquí, así como en el Perfil HMM proporcionado con la presente descripción en la Tabla Z y en las publicaciones de las solicitudes de los Estados Unidos núms . 20100197519 y 20090163376, que se incorporan como referencia en la presente descripción Se reportó que los átomos de fosfato p2 ' oxígeno de NADPH forman enlaces de hidrógeno con cadenas laterales de Argl62, Serl65 y Serl67 de KARI de espinaca (Biou V., et al. The EMBO Journal, 16: 3405-3415, 1997).. Los estudios por Ahn et al., (J. Mol. Biol., 328: 505-515, 2003) han identificado tres sitios de unión al NADPH fosfato (Arg47, Ser50 y Thr52) para Pseudomonas aeruginosa (PAO-KARI) después de comparar su estructura con la de la KARI de espinaca. La estructura de KARI PF5 con iones unidos a NADPH, acetolactato y magnesio se construyó en base a la estructura cristalina de KARI PAOl de P. aeruginosa (PDB ID 1NP3 , Ahn H. J. et al., J. Mol. Biol., 328: 505-515, 2003) que tiene 92 % de homología de secuencias de aminoácidos con KARI PF5. La estructura de KARI PAOl es una homo-dodecamer y cada dodecamer consiste de seis homodímeros con una amplia interfase de dímeros . El sitio activo de KARI se localiza en esta interfase de dímeros. El ensamblaje biológico está formado por seis homodímeros posicionados en los bordes de un tetraedro, lo que produce un dodecamer altamente simétrico de simetría de grupos de 23 puntos .

El modelo del dímero KARI PF5 se construyó en base a las coordenadas del monómero A y del monómero B de KARI PAOl y la secuencia de KARI PF5 con el uso del visualizador de PDB DeepView/Swiss (Guex, N. and Peitsch, M.C., Electrophoresis , 18: 2714-2723, 1997). Después, este modelo se importó para el programa 0 (Jones, T.A. et al, Acta Crystallogr. A 47: 110-119, 1991) en un sistema Silicon Graphics para modificación adicional .

La estructura de KARI PAOl no tiene NADPH, sustrato o inhibidor o magnesio en el sitio activo. Por lo tanto, la estructura de KARI de la espinaca (PDB ID lyve, Biou V. et al., The EMBO Journal, 16: 3405-3415, 1997.), que tiene iones magnesio, NADPH e inhibidor (N-hidroxi-N-isopropiloxamato) en el sitio de unión a acetolactato , se usó para modelar estas moléculas en el sitio activo. La KARI vegetal tiene muy poca homología de secuencias ya sea con KARI PF5 o PAOl (<20 % de identidad de aminoácidos) ; sin embargo, las estructuras en la región del sitio activo de estas dos enzimas KARI son muy similares. Para superponer el sitio activo de estas dos estructuras de KARI, se usó los comandos LSQ_ext, LSQ_improve, LSQ_mol en el programa 0 para alinear el sitio activo del monómero A de KARI de espinaca con el monómero A del modelo de KARI PF5. Las coordenadas de NADPH, dos iones magnesio y el inhibidor unidas en el sitio activo de KARI de espinaca se extrajeron y se incorporaron en la molécula A de KARI PF5. Un grupo de las coordenadas de estas moléculas se generó para el monómero B de KARI PF5 al aplicar el operador de transformación del monómero A al monómero B calculado por el programa.

Dado que no hay NADPH en el sitio activo de la estructura cristalina de KARI PAOl, las estructuras de la región en bucle de unión a fosfato en el sitio de unión a NADPH (residuos 44-45 en KARI PAOl, 157-170 en KARI de espinaca) son muy diferentes entre ambas. Para modelar la forma unida a NADPH, el modelo del bucle de unión a fosfato de KARI PF5 (44-55) se reemplazó por el de lyve (157-170) . Cualquier discrepancia de las cadenas laterales entre estos dos se convirtió para las de la secuencia de KARI PF5 con el uso del comando mutate_replace en el program 0 y las conformaciones de las cadenas laterales reemplazadas se ajustaron manualmente. El modelo completo de KARI PF5 dimérico unido a NADPH/Mg/ inhibidor se sometió a un ciclo de minimización de energía con el uso del programa CNX (ACCELRYS San Diego CA, Burnger, A.T. and Warren, G.L., Acta Crystallogr . , D 54: 905-921, 1998) después del cual el inhibidor se reemplazó por el sustrato, acetolactato (AL) , en el modelo.

Producción de isobutanol Las células huésped proporcionadas en la presente descripción pueden comprender un polipéptido que tiene actividad de cetol-ácido reductoisomerasa . Como se describe y se demuestra en la presente descripción, los solicitantes han descubierto otras enzimas KARI adicionales y variantes de las enzimas KARI adicionales que resultan en una producción de isobutanol comparable a y/o mayor que la observada con la KARI de Lactococcus lactis (ver los ejemplos) . Por lo tanto, en las modalidades, los polipéptidos que tienen actividad de KARI que funcionan en una ruta de producción de isobutanol tienen una productividad de isobutanol efectiva y/o producen isobutanol a un título comparable a o mejor que el de KARI de Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident. : 380) . Por lo tanto, tales polipéptidos se consideran útiles para la producción de isobutanol, particularmente, en células que comprenden las rutas de producción de isobutanol descritas en la presente descripción. En las modalidades, los polipéptidos proporcionados en la presente descripción tienen una productividad de isobutanol efectiva y/o producen isobutanol a un título mayor que o aproximadamente igual que el observado con la KARI de Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident.: 380) bajo las mismas condiciones. En las modalidades, los polipéptidos proporcionados en ia presente descripción tienen una productividad de isobutanol efectiva mayor que aproximadamente 3 gramos por gramo de células, mayor que aproximadamente 4, mayor que aproximadamente 5 o mayor que aproximadamente 6 gramos por gramo de células después de aproximadamente 48 horas, en donde por lo menos las últimas aproximadamente 24 horas de las 48 horas son en condiciones anaerobias .

Además, los solicitantes han descubierto que las variantes de los polipéptidos que tienen la actividad de KARI descrita anteriormente, que incluyen los que tienen una KM para NADH menor que la del polipéptido no sustituido, proporcionan ventajas para la producción de isobutanol en condiciones anaerobias. Sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que tales variantes proporcionan una producción de isobutanol mejorada debido al uso efectivo de NADH como equivalentes reductores. En las modalidades, la producción de isobutanol que usa tal variante proporciona una acumulación reducida de glicerol. En las modalidades, la relación molar de isobutanol y glicerol se aumenta para una variante de un polipéptido que tiene la actividad de KARI descrita anteriormente con una KM para NADH menor que la del polipéptido no sustituido. En las modalidades, la relación molar de isobutanol y glicerol es mayor que 1. En las modalidades, la relación molar de isobutanol y glicerol es mayor que 2. En las modalidades, la relación molar es mayor que 3. En las modalidades, la relación molar es mayor que 4, mayor que 5 , mayor que 6 , mayor que 7 , mayor que 8 , mayor que 9, mayor que 10, mayor que 12 o mayor que 14. En las modalidades, la relación molar es encuentra en el intervalo de aproximadamente 1 a 5, de aproximadamente 1 a 10, de aproximadamente 2 a 8, de aproximadamente 5 a 10, de aproximadamente 5 a 15, de aproximadamente 10 a 15 o de aproximadamente 12 a 15.

Como se demostró en los ejemplos de la presente descripción, a medida que aumenta la especificidad bioquímica para el cofactor NADH, que se define por (NADH V^/KM) / (NADPH máx/KM) , se observa un incremento en la relación de isobutanol/glicerol , lo que sugiere que la especificidad del cofactor alterada redujo el uso de NADPH y la formación de subproducto .

Modificación de la aldehido deshidrogenasa En las modalidades de la presente invención, una célula huésped recombinante puede comprender una actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada y una ruta biosintética de isobutanol, en donde la célula huésped produce butanol . En otras modalidades, la célula huésped recombinante puede comprender una ruta biosintética de isobutanol o de 1-butanol, como se describe adicionalmente en la presente descripción. En otras modalidades, la ruta biosintética de isobutanol puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto que se selecciona del grupo que consiste en: (a) piruvato a acetolactato; (b) acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato; (c) 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a 2-cetoisovalerato; (d) 2 -cetoisovalerato a isobutiraldehído ; y (e) isobutiraldehído a isobutanol. En otras modalidades, la ruta biosintética de isobutanol puede comprender polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad de acetolactato sintasa, ceto ácido reductoisomerasa , dihidroxi ácido deshidratasa, cetoisovalerato decarboxilasa y alcohol deshidrogenasa. En otras modalidades, la célula recombinante comprende una ruta biosintética de 1-butanol. En otras modalidades, la ruta biosintética de 1-butanol comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto que se selecciona del grupo que consiste en: (a) acetil-CoA a acetoacetil -CoA; (b) acetoacetil-CoA a 3 -hidroxibutiril-CoA; (c) 3 -hidroxibutiril-CoA a crotonil-CoA; (d) crotonil-CoA a butiril-CoA; (e) butiril-CoA a buliraldehído; (f) buliraldehído a 1-butanol. En otras modalidades, la ruta biosintética de 1-butanol puede comprender polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad.

En las modalidades de la presente invención, una célula huésped recombinante puede comprender una modificación o interrupción de un polinucleótido o gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa o una modificación o interrupción de un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa. Las personas con conocimiento ordinario en la técnica conocen muchos métodos para la ingeniería genética y alteración de los genes objetivos para reducir o eliminar la expresión y pueden usarse para crear una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción. En otras modalidades, la célula huésped recombinante puede comprender una supresión, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno o gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa o en un polipéptido endógeno que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa . Tales modificaciones, interrupciones, supresiones, mutaciones y/o sustituciones pueden producir actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada. Las modificaciones que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, la supresión del gen entero o una porción del gen que codifica una proteína aldehido deshidrogenasa, insertar un fragmento de ADN en el gen codificante (ya sea en el promotor o en la región codificante) de manera que la proteína no se exprese o se exprese a niveles más bajos, introducir una mutación en la región codificante, lo que agrega un codón de terminación o cambio de marco de manera que no se expresa una proteína funcional, e introducir una o más mutaciones en la región codificante para alterar los aminoácidos de manera que se expresa una proteína no funcional o menos activa. En otras modalidades, la expresión de un gen definido puede bloquearse por la expresión de un AR no codificante o un ARN interférente y las construcciones pueden introducirse, lo que resulta en cosupresión. En otras modalidades, la síntesis o estabilidad del transcrito puede disminuirse mediante la mutación. En modalidades, la eficacia por la cual una • proteína se traduce a partir de ARNm puede modularse por la mutación. Todos estos métodos pueden practicarse, fácilmente, por una persona con experiencia en la técnica al hacer uso de las secuencias conocidas o identificadas que codifican las proteínas objetivo.

En otras modalidades, las secuencias de ADN que rodean una secuencia codificante de la aldehido deshidrogenasa objetivo son útiles, además, en algunos procedimientos de modificación y se encuentran disponibles, por ejemplo, para levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae en la secuencia genómica completa coordinada por Proyecto Genoma ID9518 de los proyectos genoma coordinados por el NCBI (siglas en inglés para Centro Nacional para la Información Biotecnológica) con el número de identificación GOPID núm. 13838. Un ejemplo no limitante adicional de las secuencias genómicas de levadura es el de Candida albicans, que se incluye en los núms . GPID 10771, 10701 y 16373. Otras secuencias genómicas de levadura pueden encontrarse fácilmente por las personas con conocimiento ordinario en la técnica en las bases de datos disponibles públicamente.

En otras modalidades, las secuencias de ADN que rodean una secuencia codificante de la aldehido deshidrogenasa objetivo pueden ser útiles para los métodos de modificación que usan la recombinación homologa. En un ejemplo no limitante de este método, las secuencias flanqueadoras del gen de aldehido deshidrogenasa se pueden colocar para limitar un gen marcador seleccionable para mediar la recombinación homologa con lo cual el gen marcador reemplaza el gen de aldehido deshidrogenasa. En otro ejemplo no limitante, las secuencias parciales del gen de aldehido deshidrogenasa y las secuencias flanqueadoras del gen de aldehido deshidrogenasa que delimitan un gen marcador seleccionable pueden usarse para mediar la recombinación homologa con lo cual el gen marcador reemplaza una porción del gen de aldehido deshidrogenasa objetivo. En las modalidades, el marcador seleccionable puede delimitarse por sitios específicos de recombinación específica del sitio, de manera que después de la expresión de la recombinasa específica del sitio correspondiente, el gen de resistencia se extirpa del gen de aldehido deshidrogenasa sin reactivar este último. En las modalidades, la recombinación específica del sitio deja atrás un sitio de recombinación que interrumpe la expresión de la proteína aldehido deshidrogenasa. En otras modalidades, el vector de recombinación homologa se puede construir para dejar, además, una supresión en el gen de aldehido deshidrogenasa después de la excisión del marcador seleccionable, como es del conocimiento de una persona con experiencia en la técnica.

En otras modalidades, se puede efectuar supresiones en el gen objetivo de aldehido deshidrogenasa con el uso de la recombinación mitótica como lo describen Wach et al. (Yeast, 10:1793-1808; 1994). El método puede incluir la preparación de un fragmento de ADN que contiene un marcador seleccionable entre regiones genómicas que pueden ser de tamaño corto 20 bp y que delimitan una secuencia objetivo de ADN. En otras modalidades, este fragmento de ADN puede prepararse por la amplificación por PCR del gen marcador seleccionable por medio del uso de oligonucleótidos cebadores que hibridizan a los extremos del gen marcador y que incluyen las regiones genómicas que pueden recombinar con el genoma de levadura. En las modalidades, el fragmento de ADN lineal se puede transformar eficientemente en levadura y se puede recombinar en el genoma, lo que resulta en un reempbucle de genes que incluye la supresión de la secuencia de ADN objetivo ( ( (como se describe, por ejemplo, en Methods in Enzymology, volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology (Parte A, 2004, Christine Guthrie and Gerald R. Fink (Eds.), Elsevier Academic Press, San Diego, CA) ) .

Además, se puede usar métodos de reempbucle del promotor para intercambiar los elementos de control transcripcional endógeno y permitir otros medios para modular la expresión, tal como lo describen Mnaimneh et al., ((2004) Cell 118 (1) :31-44) .

En otras modalidades, la actividad codificada por el gen objetivo de aldehido deshidrogenasa se puede interrumpir con el uso de mutagénesis aleatoria, después de la cual se puede realizar una evaluación para identificar las cepas con actividad reducida o prácticamente eliminada. En ese tipo de método no se necesita saber la secuencia de ADN de la región que codifica el gen objetivo, o cualquier otra región del genoma que afecte la dependencia del sustrato de carbono para cultivo. En las modalidades, una evaluación de células con actividad de aldehido deshidrogenasa reducida u otros mutantes que tienen actividad de aldehido deshidrogenasa reducida puede ser útil para las células huésped recombinantes de la presente invención.

Los métodos para crear mutaciones genéticas son comunes y muy conocidos en la técnica y pueden aplicarse al ejercicio de crear mutantes. Los métodos de ingeniería genética aleatoria usados comúnmente (revisados en ethods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) incluyen mutagenésis espontánea, mutagenésis causada por genes imitadores, mutagenésis química, irradiación con rayos UV o X o mutagenésis por transposons.

La mutagenésis química de las células huéspedes puede incluir, pero no se limitan a, tratamiento con uno de los siguientes mutágenos de ADN: etil metanosulfonato (EMS por sus siglas en inglés) , ácido nitroso, sulfato de dietilo o N-metil- 1 -nitro-N-nitroso-guanidina (MNNG) . Los métodos de mutagenésis se ha revisado en Spencer et al. (Mutagenésis in Yeast, 1996, Yeast Protocols: Methods in Cell and Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ) . En modalidades, la mutagenésis química con EMS puede realizarse como se describe en Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Además, puede usarse irradiación con luz ultravioleta (UV) o rayos X para producir mutagenésis aleatoria en células de levadura. El efecto primario de mutagenésis por irradiación UV es la formación de dímeros de pirimidina que alteran la fidelidad de replicación de ADN. Los protocolos para la mutagenésis UV de levadura pueden encontrarse en Spencer et al. (Mutagenésis in Yeast, 1996, Yeast Protocols: Methods in Cell and Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ) . En modalidades, la introducción de un fenotipo mutador puede usarse, además, para generar mutaciones cromosómicas aleatorias en células huéspedes. En modalidades, los fenotipos mutadores comunes pueden obtenerse a través de la alteración de uno o más de los siguientes genes: PMS1, MAG1, RAD18 o RAD51. En otras modalidades, la restauración del fenotipo no mutador puede obtenerse por inserción del alelo tipo silvestre. En otras modalidades, las colecciones de células modificadas producidas a partir de cualquiera de estos u otros procesos de mutagénesis aleatoria se pueden evaluar para detectar la actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada.

Los genomas se han secuenciado completamente y se han registrado y se encuentran disponibles, públicamente, para las siguientes cepas de levadura: Ashbya gossypii ATCC 10895, Candida glabrata CBS 6054, iUuyveromyces lactis NRRL Y-1140, Pichia stipitis CBS 138, Saccharomyces cerevisiae S288c, Schizosaccharomyces pombe 972h- y Yarrowia lipolytica CLIB122. Típicamente, se usa la búsqueda BLAST (descrita anteriormente) de bases de datos disponibles al público con secuencias de polinucleótidos o secuencias de polipéptidos de aldehido deshidrogenasa, tales como las proporcionadas en la presente descripción, para identificar las secuencias codificadoras de aldehido deshidrogenasa de otras células huésped, tales como células de levadura.

En otras modalidades, un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede catalizar la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico. En otras modalidades, la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico en una célula huésped recombinante se reduce o se elimina. En otras modalidades adicionales, un polinucleótido , gen o polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede corresponder al número de la comisión de la enzima EC 1.2.1.3, EC 1.2.1.4 y/o EC 1.2.1.5.

En las modalidades, una célula huésped recombinante de la presente invención puede ser S. cerevisiae, y un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede ser ALD2, ALD3 , ALD4 , ALD5 , ALD6, o combinaciones de estos. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser Kluyveromyces lactís y un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede ser KLLA0F00440, KLLA0E23057, KLLA0D10021, KLLA0D09999G, o combinaciones de estos. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser Pichia stipitis y un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede ser ALD2 , ALD3 , ALD4 , ALD5, ALD7 , o combinaciones de estos. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser Lactobacillus plantarum y un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede ser AldH. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser E. coli y un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede ser aldA, aldB, aldH, o combinaciones de estos .

En las modalidades de la presente invención, una célula huésped recombinante puede ser S. cerevisiae y un polinucleótido endógeno o gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede ser ALD2 , ALD3 , ALD4 , ALD5 , ALD6 , o combinaciones de estos. En las modalidades de la presente invención, una célula huésped recombinante puede ser S. cerevisiae y un polinucleótido endógeno o gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede ser ALD6. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser Kluyveromyces lactis y un polinucleótido endógeno o gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede ser KLLA0F00440, KLLA0E23057, KLLA0D10021, KLLA0D09999G, o combinaciones de estos. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser Pichia stipitis y un polinucleótido endógeno o gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede ser ALD2, ALD3 , ALD4 , ALD5 , ALD7 , o combinaciones de estos. En las modalidades, el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa es un homólogo de ALD6 de Saccharomyces cerevisiae . Las cepas de supresión de S. cerevisiae que contienen supresiones de genes de aldehido deshidrogenasa con un cásete de kanMX están disponibles comercialmente de la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) [catálogo núm. 4000753] .

En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser Lactobacillus plantarum y un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede ser AldH. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser E. coli y un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa puede ser aldA, aldB, aldH, o combinaciones de estos.

Los ejemplos de polinucleótidos , genes y polipéptidos de aldehido deshidrogenasa que pueden definirse para modificación o inactivación en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, los de la Tabla 4.

Tabla 4. Regiones codificantes de genes objetivo de aldehido deshidrogenasa y proteínas.

Otros ejemplos de polinucleótidos , genes y polipéptidos de aldehido deshidrogenasa que pueden definirse para modificación o inactivación en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos de aldehido deshidrogenasa, genes y/o polipéptidos que tienen por lo menos de aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 80 ° / de aproximadamente 80 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 de aproximadamente 90 % a aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencias con cualquiera de las secuencias de la Tabla 4, en donde tal polinucleótido o gen codifica, o tal polipéptido tiene, actividad de aldehido deshidrogenasa. Otros ejemplos adicionales de polinucleótidos , genes y polipéptidos de aldehido deshidrogenasa que pueden definirse para modificación o inactivación en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, una variante activa, un fragmento o derivado de cualquiera de las secuencias de la Tabla 4, en donde tal polinucleótido o gen codifica, o tal un polipéptido tiene, actividad de aldehido deshidrogenasa.

En las modalidades, las secuencias de otros polinucleótidos de aldehido deshidrogenasa ( genes y/o polipéptidos pueden identificarse en la literatura y en las bases de datos de bioinformática bien conocidas para una persona con experiencia con el uso de las secuencias descritas en la presente descripción y disponibles en la técnica. Por ejemplo, tales secuencias pueden identificarse por medio de la búsqueda BLAST de las bases de datos disponibles al público con secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos que codifican aldehido deshidrogenasa. En el método, las identidades pueden basarse en el método de alineamiento Clustal W al usar los parámetros predeterminados de PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN =10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE INTERRUPCIÓN = 0.1 y series Gonnet 250 de matriz de peso de proteína.

Adicionalmente , las secuencias de polinucleótidos o de polipéptidos de aldehido deshidrogenasa descritas en la presente descripción o conocidas en la técnica pueden usarse para identificar otros homólogos de aldehido deshidrogenasa en la naturaleza. Por ejemplo, cada uno de los fragmentos de ácido nucleico que codifican aldehido deshidrogenasa descritos en la presente descripción pueden usarse para aislar genes que codifican proteínas homologas. En la técnica se conoce el aislamiento de genes homólogos por medio de protocolos que dependen de la secuencia. Los ejemplos de protocolos dependientes de secuencia incluyen, pero no se limitan a (1) métodos de hibridación de ácido nucleico; (2) métodos de amplificación de ADN y ARN, como se ilustra a través de varios usos de tecnologías de amplificación de ácido nucleico [por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , Mullis et al., patente de los Estados Unidos núm. 4,683,202; reacción en cadena de ligasa (LCR) , Tabor et al., Proc . Acad. Sci. USA 82:1074 (1985); o amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) , Walker et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)]; y (3) métodos de construcción de genotecas y análisis por complementación .

Por lo tanto, se encuentra dentro del alcance de la presente invención proporcionar polinucleótidos , genes y polipéptidos de aldehido deshidrogenasa que tienen por lo menos de aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 75 o o a aproximadamente 80 o, ¾ / de aproximadamente 80 o, o a aproximadamente 85 "o / de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencias con cualquiera de los polinucleótidos o polipéptidos de aldehido deshidrogenasa descritos en la presente descripción (por ejemplo, las sec. con núms . de ident.: 732-765 de la Tabla 4) Las identidades se basan en el método de alineamiento Clustal con el uso de los parámetros predeterminados de PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN10 , PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE INTERRUPCIÓN0.1 y serie Gonnet 250 de la matriz de peso de proteína .

La modificación de aldehido deshidrogenasa en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción para reducir o eliminar la actividad de aldehido deshidrogenasa se puede confirmar con el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la interrupción de una aldehido deshidrogenasa particular se puede confirmar con una evaluación por PCR con el uso de los cebadores internos y externos para el gen de aldehido deshidrogenasa o por la prueba Southern blot con el uso de una sonda diseñada para la secuencia de genes de aldehido deshidrogenasa. Alternativamente, se puede usar cromatografía de gases-espectroscopia de masas o cromatografía líquida para evaluar las cepas expuestas al isobutiraldehído para la formación reducida de ácido isobutírico. Por lo tanto, la presente descripción proporciona un método para detectar las cepas con formación reducida de ácido isobutírico; el método comprende: a) proporcionar una cepa que comprende una modificación en un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa y/o una modificación en un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa; b) poner la célula en contacto con isobutiraldehído; y c) determinar la formación de ácido isobutírico; en donde la formación de ácido isobutírico se reduce en comparación con una cepa control sin la modificación. En algunas modalidades, la modificación es una supresión, mutación y/o sustitución. En algunas modalidades, la medición se lleva a cabo con el uso de cromatografía de gases-espectroscopia de masas. En algunas modalidades, el ácido isobutírico se reduce en por lo menos aproximadamente 10 %, por lo menos 20 %, por lo menos 30 %, por lo menos 40 %, por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 80 % o por lo menos 90 %. En algunas modalidades, la formación de ácido isobutírico se elimina sustancialmente .

Modificación de aldehido oxidasa En las modalidades de la presente invención, una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción puede tener una modificación o interrupción de un polinucleótido, gen o polipéptido que codifica aldehido oxidasa. En las modalidades, la célula huésped recombinante comprende una supresión, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno o gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa, o en un polipéptido endógeno que tiene actividad de aldehido oxidasa. Tales modificaciones, interrupciones, supresiones, mutaciones y/o sustituciones pueden resultar en una actividad de aldehido oxidasa reducida o eliminada.

En las modalidades de la presente invención, un polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa puede catalizar la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico. En otras modalidades, la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico en una célula huésped recombinante se reduce o se elimina. En otras modalidades, un polinucleótido, gen o polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa puede corresponder al número de la comisión de la enzima EC 1.2.3.1.

En las modalidades, una célula huésped recombinante de la presente invención puede ser Pichia stipitis y un polinucleótido, gen o polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa puede ser AOXl y/o A0X2.

Los ejemplos de polinucleótidos , genes y polipéptidos de aldehido oxidasa que pueden definirse para modificación o inactivación en una célula huésped recombinante descritos en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, los de la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5. Regiones codificantes de genes objetivo de aldehido oxidasa y proteínas.

Otros ejemplos de polinucleótidos, genes y polipéptidos de aldehido oxidasa que pueden definirse para modificación o inactivación en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos, genes y/o polipéptidos de aldehido oxidasa que tienen por lo menos de aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 85 de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencias con cualquiera de las secuencias de la Tabla 5, en donde tal polinucleótido o gen codifica un polipéptido que tiene, o tal polipéptido tiene, actividad de aldehido oxidasa. Otros ejemplos adicionales de polinucleótidos, genes y polipéptidos de aldehido oxidasa que se pueden definir para modificación o inactivación en una célula huésped recombinante descrita en la presente incluyen, pero no se limitan a, una variante activa, fragmento o derivado de cualquiera de las secuencias de la Tabla 5, en donde tal polinucleótido o gen codifica, o tal polipéptido tiene, actividad de aldehido oxidasa.

En las modalidades, un polinucleótido, gen y/o polipéptido que codifica una secuencia de aldehido oxidasa descrita en la presente descripción o conocida en la técnica se puede modificar, como se describió anteriormente para la acetolactato reductasa o la aldehido deshidrogenasa . En otras modalidades, un polinucleótido, gen y/o polipéptido que codifica aldehido oxidasa puede usarse para identificar otra secuencia de polinucleótidos , genes ' y/o polipéptidos de aldehido oxidasa y/o puede usarse para identificar un homólogo de aldehido oxidasa en otras células, como se describió anteriormente para la aldehido deshidrogenasa. Tales secuencias que codifican aldehido oxidasa pueden identificarse, por ejemplo, en la literatura y/o en bases de datos de bioinformática bien conocidas para las personas con conocimiento en la técnica. Por ejemplo, la identificación de una secuencia que codifica aldehido oxidasa en otro tipo celular con el uso de la bioinformática se puede lograr por medio de la búsqueda BLAST (como se describió anteriormente) de bases de datos disponibles al público con una secuencia de ADN y secuencia de polipéptidos que codifican hexosa cinasa, tales como cualquiera de las proporcionadas en la presente descripción. Las identidades toman como base el método de alineamiento Clustal W al usar los parámetros predeterminados de PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN =10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE INTERRUPCIÓN = 0.1 y la serie Gonnet 250 para la matriz de pesos de proteínas.

La modificación de aldehido oxidasa en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción para reducir o eliminar la actividad de aldehido oxidasa se puede confirmar con el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la interrupción de una aldehido oxidasa particular se puede confirmar con la evaluación por PCR con el uso de cebadores internos y externos para el gen de aldehido oxidasa o por la prueba de Southern blot con el uso de una sonda diseñada para la secuencia de genes de aldehido oxidasa. Alternativamente, se puede usar cromatografía de gases u otros métodos analíticos para evaluar las cepas expuestas a isobutiraldehído para la formación reducida de ácido isobutírico (como se describe y se demuestra en los ejemplos) . En algunas modalidades, el ácido isobutírico se reduce en por lo menos aproximadamente 10 %, por lo menos 20 %, por lo menos 30 %, por lo menos 40 %, por lo menos 50 %, por lo menos 60 %, por lo menos 70 %, por lo menos 80 % o por lo menos 90 %. En algunas modalidades, la formación de ácido isobutírico se elimina sustancialmente .

Los solicitantes han proporcionado células huésped recombinantes que comprenden una actividad de aldehido deshidrogenasa y/o aldehido oxidasa reducida o eliminada. En las modalidades, una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción puede comprender, además, una modificación en un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de piruvato descarboxilasa y/o una modificación en un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de hexocinasa 2. En las modalidades, una célula huésped recombinante de la presente invención puede producir una producción de una ruta biosintética (por ejemplo, isobutanol) y puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza una conversión de sustrato a producto que se selecciona del grupo que consiste en: (a) piruvato a acetolactato; (b) acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato ; (c) 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a 2-cetoisovalerato ; (d) 2-cetoisovalerato a isobutiraldehído; y (e) isobutiraldehído a isobutanol. En otras modalidades, tal célula huésped recombinante puede producir un producto de una ruta biosintética (por ejemplo, isobutanol) a un rendimiento o una cantidad mayor que el rendimiento o cantidad del mismo producto producido por una célula huésped recombinante que no comprende una actividad de aldehido deshidrogenasa y/o actividad de aldehido oxidasa reducida o eliminada. En otras modalidades, una célula huésped, recombinante de la presente invención puede reducir o eliminar la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico y se puede usar para evaluar polipéptidos candidatos que tienen actividad de aldehido deshidrogenasa y/o de aldehido oxidasa. Como tales, los solicitantes han proporcionado, además, métodos para incrementar el rendimiento o título de un producto de una ruta biosintética (por ejemplo, isobutanol), métodos para reducir o eliminar la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico, y métodos para evaluar los polipéptidos candidatos que tienen actividad de aldehido deshidrogenasa y/o aldehido oxidasa.

En las modalidades de la presente invención, se proporciona métodos para producir una célula huésped recombinante ; los métodos comprenden (a) proporcionar una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción; y (b) transformar la célula huésped con un pol inucleótido que codifica un polipéptido de una ruta biosintética (por ejemplo, una ruta biosintética de isobutanol) . En otras modalidades, se proporciona métodos para producir una célula huésped recombinante; los métodos comprenden (a) proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una modificación en un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa o en un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa; y (b) transformar la célula huésped con un polinucleótido que codifica un polipéptido de una ruta biosintética (por ejemplo, una ruta biosintética de isobutanol) . En otras modalidades, se proporciona métodos para producir una célula huésped recombinante; los métodos comprenden (a) proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una modificación en un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa o en un polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa; y (b) transformar la célula huésped con un polinucleótido que codifica un polipéptido de una ruta biosintética de isobutanol .

En las modalidades, se proporciona métodos para reducir o eliminar la conversión de isobutiraldehído a ácido isobut írico ; los métodos comprenden (a) proporcionar una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción; y (b) cultivar la célula huésped en condiciones en donde la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico se reduce o se elimina en comparación con una célula huésped recombinante que no comprende actividad de aldehido deshidrogenasa y/o de aldehido oxidasa reducida o eliminada. La conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico de una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción se puede determinar por métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY , págs . 201-202} y/o descritos en la presente descripción.

Reducción de DHMB La producción de DHMB en una célula huésped que comprende una ruta biosintética de isobutanol indica no todos los sustratos de la ruta se convierten al producto deseado. Por lo tanto, el rendimiento se reduce. Adicionalmente , el DHMB puede tener efectos inhibidores en la producción de productos. Por ejemplo, el DHMB puede reducir la actividad de las enzimas en la ruta biosintética o tener otros efectos inhibidores en el crecimiento de levadura y/o productividad durante la fermentación. Por lo tanto, los métodos descritos en la presente descripción proporcionan maneras para reducir el DHMB durante la fermentación. Los métodos incluyen tanto métodos para reducir la producción de DHMB como métodos para eliminar el DHMB de las composiciones de fermentación.

Reducción de la producción de DHMB En algunas modalidades descritas en la presente descripción, una célula huésped recombinante puede comprender capacidad reducida o eliminada de convertir acetolactato a DHMB. La capacidad de una célula huésped de convertir acetolactato a . DHMB se puede reducir o eliminar, por ejemplo, por una modificación o interrupción de un polinucleótido o gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa o una modificación o interrupción de un polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa. En otras modalidades, la célula huésped recombinante puede comprender una supresión, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno o gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa o en un polipéptido endógeno que tiene acetolactato reductasa. Tales modificaciones, interrupciones, supresiones, mutaciones y/o sustituciones pueden resultar en actividad de acetolactato reductasa reducida, prácticamente eliminada o eliminada. En algunas modalidades de la presente invención, el producto de la ruta biosintética se produce a un rendimiento o cantidad mayor en comparación con la producción del mismo producto en una célula huésped recombinante que no comprende capacidad reducida o eliminada de convertir acetolactato a DHMB.

Por lo tanto, el producto puede ser una composición que comprende butanol que se encuentra sustancialmente libre de, ó libre de DHMB. En algunas modalidades, la composición que comprende butanol contiene no más de aproximadamente 5 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 0.5 mM, aproximadamente 0.4 mM, aproximadamente 0.3 mM de DHMB o aproximadamente 0.2 mM de DHMB.

El producto puede ser, además, una composición que comprende 2 , 3 -butanodiol (BDO) que se encuentra sustancialmente libre de, o libre de DHMB. En algunas modalidades, la composición que comprende BDO contiene no más de aproximadamente 5 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 0.5 mM, aproximadamente 0.4 mM, aproximadamente 0.3 mM de DHMB o aproximadamente 0.2 mM de DHMB.

Cualquier producto de una ruta biosintética que incluye la conversión de acetolactato a un sustrato distinto a DHMB puede producirse con mayor eficacia en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción que tiene la modificación descrita de la actividad de acetolactato reductasa. Tales productos incluyen, pero no se limitan a, butanol, por ejemplo, isobutanol, 2-butanol y BDO, y aminoácidos de cadena ramificada.

En algunas modalidades, la célula huésped comprende por lo menos una supresión, mutación y/o sustitución en por lo menos un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa. En algunas modalidades, la célula huésped comprende por lo menos una supresión, mutación y/o sustitución en cada uno de por lo menos dos polinucleótidos endógenos que codifican polipéptidos que tienen actividad de acetolactato reductasa.

En algunas modalidades, un polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa puede catalizar la conversión de acetolactato a DHMB. En algunas modalidades, un polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa tiene la capacidad de catalizar la reducción de acetolactato a 2S,3S-DHMB (DHMB rápido) y/o 2S,3R-DHMB (DHMB lento).

Tabla 6 Polipéptidos y polinucleótidos que tienen actividad de acetolactato reductasa en Saccharomyces cerevisiae En algunas modalidades, la conversión de acetolactato a DHMB en una célula huésped recombinante se reduce, se elimina sustancialmente o se elimina. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa se selecciona del grupo que consiste en: YMR226C, YER081W, YIL074C, YBR006W, YPL275 , YOL059W, YIR036C, YPL061W, YPL088W, YCR105W, Y0R375C y YDR541C. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa es un polipéptido que comprende una secuencia enumerada en la Tabla 6 o una secuencia que es por lo menos aproximadamente 70 %, por lo menos aproximadamente 75 %, por lo menos aproximadamente 80 %, por lo menos aproximadamente 85 %, por lo menos aproximadamente 90 %, por lo menos aproximadamente 95 % o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con una secuencia de polipéptidos enumerada en la Tabla 6. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa es un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos enumerada en la Tabla 6 o una secuencia que es por lo menos aproximadamente 70 %, por lo menos aproximadamente 75 %, por lo menos aproximadamente 80 %, por lo menos aproximadamente 85 %, por lo menos aproximadamente 90 %, por lo menos aproximadamente 95 % o por lo menos aproximadamente 99 % idéntica a una secuencia de polinucleótidos enumerada en la Tabla 6.

Tabla 7. Homólogos de levadura YMR226C ilustrativos En algunas modalidades, un polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa es YMR226C o un homólogo de YMR226C. Por lo tanto, en algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa es un polipéptido que comprende una secuencia enumerada en la Tabla 7 o una secuencia que es por lo menos aproximadamente 70 %, por lo menos aproximadamente 75 %, por lo menos aproximadamente 80 %, por lo menos aproximadamente 85 %, por lo menos aproximadamente 90 %, por lo menos aproximadamente 95 % o por lo menos aproximadamente 99 % idéntica a una secuencia de polipéptidos enumerada en la Tabla 7. En algunas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa es un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos enumerada en la Tabla 7 o una secuencia que es por lo menos aproximadamente 70 %, por lo menos aproximadamente 75 %, por lo menos aproximadamente 80 %, por lo menos aproximadamente 85 %, por lo menos aproximadamente 90 %, por lo menos aproximadamente 95 % o por lo menos aproximadamente 99 % idéntica a una secuencia de polinucleótidos enumerada en la Tabla 7.

Las acetolactato reductasas con la capacidad de convertir acetolactato a DHMB pueden identificarse, por ejemplo, el evaluar si en la levadura alterada genéticamente hay cambios en el consumo de acetolactato, cambios en la producción de DHMB, cambios en la producción de DHIV o cambios en la producción de otro producto dirección 3' (por ejemplo, butanol) .

Una manera de identificar un gen involucrado en la producción de DHMB consiste en determinar la cantidad de DHMB producido por las cepas de levaduras individuales en una genoteca de bloqueo de levadura. Las genotecas de bloqueo se encuentran disponibles, por ejemplo, de Open Biosystems® (una división de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) . En este método, una disminución en la producción de DHMB indica que el gen que se ha bloqueado functiona para incrementar la producción de DHMB y un incremento en la producción de DHMB indica que el gen que se ha bloqueado funciona para reducir la producción de DHMB.

Una genoteca de bloqueo ("KO", por sus siglas en inglés) se puede usar de dos maneras para identificar los genes candidatos que participan en la síntesis de DHMB, estas incluyen: (1) el DHMB y el DHIV acumulados en el cultivo durante el crecimiento a partir de sustratos endógenos (acetolactato y NADPH o NADH) se pueden analizar en las muestras de cultivos. Estas muestras se pueden colocar en un baño de agua caliente (80-100 °C) durante 10-20 min, o se pueden diluir en una solución tal como ácido fórmico al 2 % que mata y permeabiliza las células. Después de cualquiera de los tratamientos, se encontrarán moléculas pequeñas en el sobrenadante después de la centrifugación (5 min, 1100 x g) . La relación de DHMB/DHIV de una cepa control (por ejemplo, BY4743) se puede comparar con la de los diferentes derivados de KO, y el gen o genes ausentes de cualquier cepa o cepas con relaciones de DHMB/DHIV excepcionalmente bajas pueden codificar la acetolactato reductasa (ALR) . (2) Las velocidades de formación de DHMB y/o DHIV in vitro a partir de sustratos exógenos (acetolactato y NADH y/o NADPH) pueden determinarse en muestras programadas tomadas de una suspensión de células permeabilizadas e inactivadas de cualquiera de las maneras descritas anteriormente. Debido a que los sustratos para la síntesis de DHMB y DHIV son los mismos, esto permite determinar las concentraciones relativas de ALR y la actividad de KARI en la muestra.

Otra manera para identificar un gen involucrado en la producción de DHMB comprende determinar la cantidad de DHMB producido por las cepas de levaduras individuales en una genoteca de sobreexpresión de levadura. Las genotecas de sobreexpresión se encuentran disponibles, por ejemplo, de Open Biosystems® (una división de Thermo Fisher Scientific, altham, MA) . En este método, una disminución en la producción de DHMB indica que el gen sobreexpresado funciona para reducir la producción de DHMB, y un incremento en la producción de DHMB indica que el gen sobreexpresado funciona para incrementar la producción de DHMB.

Otra manera de identificar un gen involucrado en la producción de DHMB consiste en analizar bioquímicamente una cepa de levadura productora de DHMB. Por ejemplo, se puede interrumpir las células productoras de DHMB. Esta interrupción se puede llevar a cabo a un pH bajo y a temperaturas bajas. Los lisados celulares se pueden separar en fracciones, por ejemplo, al agregar sulfato amónico u otras técnicas conocidas para los expertos en la técnica, y las fracciones resultantes se pueden analizar para evaluar la actividad enzimática. Por ejemplo, las fracciones se pueden analizar para evaluar la capacidad de convertir acetolactato a DHMB. Las fracciones con actividad enzimática se pueden tratar mediante métodos conocidos en la técnica para purificar y concentrar la enzima (por ejemplo, diálisis y separación cromatográfica) . Cuando se alcanza una pureza y concentración suficientes, la enzima se puede colocar en secuencia y se puede identificar el gen correspondiente que codifica la acetolactato reductasa con la capacidad de convertir acetolactato a DHMB.

Además, dado que la reducción de acetolactato a DHMB se produce en la levadura, pero no ocurre en la misma magnitud en E. coli, las acetolactato reductasas que se expresan en la levadura, pero no se expresan en E. coli, se pueden seleccionar para evaluación. Las enzimas seleccionadas se pueden expresar en la levadura u otros sistemas de expresión proteica y se pueden evaluar para analizar la capacidad de convertir acetolactato a DHMB.

Las enzimas con la capacidad de catalizar la conversión de acetolactato a DHMB se pueden evaluar al analizar las concentraciones de acetolactato, al analizar las concentraciones de DHMB, al analizar las concentraciones de DHIV o al analizar cualquiera de los productos dirección 3' en la conversión de DHIV a butanol, que incluyen isobutanol.

El DHMB se puede determinar con el uso de cualquier técnica conocida para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el DHMB se puede separar y cuantificar mediante métodos conocidos para los expertos en la técnica y las técnicas descritas en los ejemplos proporcionados en la presente descripción. Por ejemplo, el DHMB se puede separar y cuantificar con el uso de cromatografía liquida-espectrometría de masas, cromatografía liquida-resonancia magnética nuclear (NMR, por sus siglas en inglés) , cromatografía de capa fina y/o HPLC con detección de UV/Vis.

En las modalidades, los polinucleótidos de acetolactato reductasa seleccionados, los genes y/o polipéptidos descritos en la presente descripción se pueden modificar o interrumpir. Algunos métodos adecuados son conocidos para las personas con experiencia en la técnica e incluyen los descritos para la aldehido deshidrogenasa (arriba) .

La modificación de acetolactato reductasa en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción para reducir o eliminar la actividad de acetolactato reductasa se puede confirmar con el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la presencia o ausencia de una secuencia de polinucleótidos que codifica acetolactato reductasa se puede determinar con el uso de la evaluación por PCR. Una disminución en la actividad de acetolactato reductasa se puede determinar, además, en base a una reducción en la conversión de acetolactato a DHMB. Una disminución en la actividad de acetolactato reductasa se puede determinar, además, en base a una reducción en la producción de DHMB. Una disminución en la actividad de acetolactato reductasa se puede determinar, además, en base a un incremento en la producción de butanol.

Por lo tanto, en algunas modalidades, una levadura que tiene la capacidad de producir butanol produce no más de aproximadamente 5 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 0.9 mM, aproximadamente 0.8 mM, aproximadamente 0.7 mM, aproximadamente 0.6 mM, aproximadamente 0.5 mM, aproximadamente 0.4 mM o aproximadamente 0.3 mM de DHMB. En algunas modalidades, una levadura que produce butanol produce no más de aproximadamente 5 mM, aproximadamente 4 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 1 mM, aproximadamente 0.9 mM, aproximadamente 0.8 mM, aproximadamente 0.7 mM, aproximadamente 0.6 mM, aproximadamente 0.5 mM, aproximadamente 0.4 mM o aproximadamente 0.3 mM de DHMB. En algunas modalidades, una levadura que produce butanol produce no más de aproximadamente 0.2 mM o 0.2 mM de DHMB .

En algunas modalidades, una levadura con la capacidad de producir butanol produce no más de aproximadamente 10 mM de DHMB cuando se cultiva en condiciones de fermentación durante por lo menos aproximadamente 50 horas. En algunas modalidades, una levadura con la capacidad de producir butanol produce no más de aproximadamente 5 mM de DHMB cuando se cultiva en condiciones de fermentación durante por lo menos aproximadamente 20 horas, por lo menos aproximadamente 25 horas, por lo menos aproximadamente 30 horas, por lo menos aproximadamente 35 horas, por lo menos aproximadamente 40 horas, por lo menos aproximadamente 45 horas o por lo menos aproximadamente 50 horas. En algunas modalidades, una levadura con la capacidad de producir butanol produjo no más de aproximadamente 3 mM de DHMB cuando se cultivó en condiciones de fermentación durante por lo menos aproximadamente 5 horas, por lo menos aproximadamente 10 horas, por lo menos aproximadamente 15 horas, por lo menos aproximadamente 20 horas, por lo menos aproximadamente 25 horas, por lo menos aproximadamente 30 horas, por lo menos aproximadamente 35 horas, por lo menos aproximadamente 40 horas, por lo menos aproximadamente 45 horas o por lo menos aproximadamente 50 horas. En algunas modalidades, una levadura con la capacidad de producir butanol produjo no más de aproximadamente 1 mM de DHMB cuando se cultivó en condiciones de fermentación durante por lo menos aproximadamente 1 hora, por lo menos aproximadamente 5 horas, por lo menos aproximadamente 10 horas, por lo menos aproximadamente 15 horas, por lo menos aproximadamente 20 horas, por lo menos aproximadamente 25 horas, por lo menos aproximadamente 30 horas, por lo menos aproximadamente 35 horas, por lo menos aproximadamente 40 horas, por lo menos aproximadamente 45 horas o por lo menos aproximadamente 50 horas. En algunas modalidades, una levadura con la capacidad de producir butanol produjo no más de aproximadamente 0.5 mM de DHMB cuando se cultivó en condiciones de fermentación durante por lo menos aproximadamente 1 hora, por lo menos aproximadamente 5 horas, por lo menos aproximadamente 10 horas, por lo menos aproximadamente 15 horas, por lo menos aproximadamente 20 horas, por lo menos aproximadamente 25 horas, por lo menos aproximadamente 30 horas, por lo menos aproximadamente 35 horas, por lo menos aproximadamente 40 horas, por lo menos aproximadamente 45 horas o por lo menos aproximadamente 50 horas.

En algunas modalidades, una levadura que comprende por lo menos una supresión, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica una acetolactato reductasa produce no más de aproximadamente 0.5 veces, aproximadamente 0.4 veces, aproximadamente 0.3 veces, aproximadamente 0.2 veces, aproximadamente 0.1 veces, aproximadamente 0.05 veces la cantidad de DHMB producido por una levadura que contiene el polinucleótido endógeno que codifica una acetolactato reductasa cuando se cultiva en condiciones de fermentación durante la misma cantidad de tiempo.

En algunas modalidades, una levadura que tiene la capacidad de producir butanol produce una cantidad de DHIV de por lo menos aproximadamente 5 mM, por lo menos aproximadamente 6 mM, por lo menos aproximadamente 7 mM, por lo menos aproximadamente 8 mM, por lo menos aproximadamente 9 mM o por lo menos aproximadamente 10 mM.

En algunas modalidades, una levadura que tiene la i capacidad de producir butanol produce una cantidad de DHIV de por lo menos aproximadamente la cantidad de DHMB producido. En algunas modalidades, una levadura que tiene la capacidad de producir butanol produce una cantidad de DHIV que es por 10 menos aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 25 veces, aproximadamente 30 veces, aproximadamente 35 veces, aproximadamente 40 veces, aproximadamente 45 veces o aproximadamente 50 veces la cantidad de DHMB producido.

En algunas modalidades, una levadura que tiene la capacidad de producir butanol produce DHIV a una velocidad por lo menos casi igual que la velocidad de producción de DHMB. En algunas modalidades, una levadura que tiene la capacidad de producir butanol produce DHIV a una velocidad que es por lo menos aproximadamente dos veces, aproximadamente tres veces, aproximadamente cinco veces, aproximadamente diez veces, aproximadamente 15 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 25 veces, aproximadamente 30 veces, aproximadamente 35 veces, aproximadamente 40 veces, aproximadamente 45 veces o aproximadamente 50 veces la velocidad de producción de DHMB.

En algunas modalidades, una levadura que tiene la capacidad de producir butanol produce menos de 0.010 moles de DHMB por mol de glucosa consumida. En algunas modalidades, una levadura produce menos de aproximadamente 0.009, menos de aproximadamente 0.008, menos de aproximadamente 0.007, menos de aproximadamente 0.006 o menos de aproximadamente 0.005 moles de DHMB por mol de glucosa consumida. En algunas modalidades, una levadura produce menos de aproximadamente 0.004, menos de aproximadamente 0.003, menos de aproximadamente 0.002 o menos de aproximadamente 0.001 moles de DHMB por mol de glucosa consumida.

En algunas modalidades, la actividad de acetolactato reductasa se inhibe por medios químicos. Por ejemplo, la acetolactato reductasa se podría inhibir con el uso de otros sustratos conocidos, tales como los mencionados en Fujisawa et al., que incluyen L-serina, D-serina, 2-metil-DL-serina, , D-treonina, L-alo-treonina , L-3 -hidroxiisobutirato, D-3-hidroxiisobutirato, 3 -hidroxipropionato; L-3 -hidroxibutirato y D-3 -hidroxibutirato . Biochimica et Biophysica Acta 1645:89-94 (2003), que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad.

Eliminación de DHMB En otras modalidades descritas en la presente descripción, una reducción en el DHMB se puede lograr al eliminar el DHMB de una fermentación. Por lo tanto, la presente descripción describe, además, fermentaciones con concentraciones reducidas de DHMB. La eliminación de DHMB puede resultar, por ejemplo, en un producto de mayor pureza o en un producto que requiere menos procesamiento para alcanzar la pureza deseada. Por lo tanto, se proporciona, además, composiciones que comprenden productos de las rutas biosintéticas tales como etanol o butanol con pureza incrementada.

El DHMB se puede eliminar durante o después de un proceso de fermentación y se puede eliminar mediante cualquier medio conocido en la técnica. El DHMB se puede eliminar, por ejemplo, por extracción en una fase orgánica o por extracción reactiva.

En algunas modalidades, el caldo de fermentación comprende menos de aproximadamente 0.5 mM de DHMB . En algunas modalidades, el caldo de fermentación comprende menos de aproximadamente 1.0 mM de DHMB después de aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 20 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 45 horas o aproximadamente 50 horas de fermentación. En algunas modalidades, el caldo de fermentación comprende menos de aproximadamente 5.0 mM de DHMB después de aproximadamente 20 horas, aproximadamente 25 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 35 horas, aproximadamente 40 horas, aproximadamente 45 horas o aproximadamente 50 horas de fermentación.

Rutas biosintéticas de butanol Ciertas rutas biosintéticas de isobutanol adecuadas se describen en las patentes de los Estados Unidos núms . 7,851,188 y 7,993,889, que se incorporan como referencia en la presente descripción. Un diagrama de las rutas biosintéticas de isobutanol se proporciona en la Figura 1. Como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 7,851,188, las etapas en una ruta biosintética de isobutanol ilustrativas incluyen la conversión de: - piruvato a acetolactato (ver la Figura 1, etapa a de la ruta en esta) , como se ha catalizado, por ejemplo, por acetolactato sintasa (ALS) , - acetolactato a 2 , 3 -dihidroxiisovalerato (ver la Figura 1, etapa b de la ruta en esta) como se ha catalizado, por ejemplo, por acetohidroxiácido isomerorreductasa (KARI); 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a 2 -cetoisovalerato (ver la Figura 1, etapa c de la ruta en esta) como se ha catalizado, por ejemplo, por acetohidroxiácido deshidratasa, también llamada dihidroxiácido deshidratasa (DHAD) ; - 2 -cetoisovalerato a isobutiraldehído (ver la Figura 1, etapa d de la ruta en esta) como se ha catalizado, por ejemplo, por 2-ceto ácido decarboxilasa de cadena ramificada; y - isobutiraldehído a isobutanol (ver la Figura 1, etapa e de la ruta en esa figura) , como se ha catalizado, por ejemplo, por la alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada.

En otra modalidad, la ruta biosintética de isobutanol comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto: - piruvato a acetolactato, que puede catalizarse, por ejemplo, por acetolactato sintasa; - acetolactato a 2 , 3 -dihidroxiisovalerato, que puede catalizarse, por ejemplo, por cetol-ácido reductoisomerasa; 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato, que puede catalizarse, por ejemplo, por dihidroxiácido deshidratasa; a-cetoisovalerato a valina, que puede catalizarse, por ejemplo, por transaminasa o valina deshidrogenasa; - valina a isobutilamina , que puede catalizarse, por ejemplo, por valina decarboxilasa; isobutilamina a isobutiraldehído, que puede catalizarse, por ejemplo, por omega transaminasa e - isobutiraldehído a isobutanol, que puede catalizarse, por ejemplo, por una alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada.

En otra modalidad, la ruta biosintética de isobutanol comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto: - piruvato a acetolactato, que puede catalizarse, por ejemplo, por acetolactato sintasa; - acetolactato a 2 , 3-dihidroxiisovalerato, que puede catalizarse, por ejemplo, por acetohidroxiácido reductoisomerasa ; - 2 , 3-dihidroxiisovalerato a a-cetoisovalerato, que puede catalizarse, por ejemplo, por acetohidroxiácido deshidratasa; - a-cetoisovalerato a isobutiril-CoA, que puede catalizarse, por ejemplo, por ceto ácido deshidrogenasa de cadena ramificada; - isobutiril -CoA a isobutiraldehído, que puede catalizarse, por ejemplo, por aldehido deshidrogenasa de acetilación; e - isobutiraldehído a isobutanol, que puede catalizarse, por ejemplo, por una alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada .

En otra modalidad, la ruta biosintética de isobutanol comprende las conversiones de sustrato a producto que se muestran como las etapas k, g y e en la Figura 1.

Los genes y polipéptidos que pueden usarse para las conversiones de sustrato a producto descritas anteriormente, así como aquellos para otras rutas adicionales de isobutanol, se describen en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957 y en la publicación del PCT núm. WO 2011/019894, ambas incorporadas como referencia en la presente descripción. Las publicaciones de la solicitudes de patentes de los Estados Unidos núms. 2011/019894, 2007/0092957, 2010/0081154, que se incorporan como referencia en la presente descripción, describen dihidroxiácido deshidratasas que incluyen las de Lactococcus lactis y Streptococcus mutans. Las cetoisovalerato descarboxilasas incluyen las derivadas de Lactococcus lactis, Macrococcus caseolyticus (sec. con núm. de ident . : 542) y Listeria grayi (sec. con núm. de ident. : 543) . La publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0269823 y la publicación de la solicitud de los Estados Unidos núm. 2011/0269199, que se incorporan como referencia, describen las alcohol deshidrogenasas , que incluyen las que usan NADH como un cofactor. Las alcohol deshidrogenasas incluyen SadB de Achromobacter xylosoxidans . Otras alcohol deshidrogenasas adicionales incluyen ADH de hígado de caballo y ADH de Beijerinkia indica. Las alcohol deshidrogenasas incluyen las que usan NADH como un cof ctor. En una modalidad, una ruta biosintética de butanol comprende a) una cetol-ácido reductoisomerasa que tiene una KM para NADH menor que aproximadamente 300 µ?, menor que aproximadamente 100 µ?, menor que aproximadamente 50 µ?, menor que aproximadamente 20 µ? o menor que aproximadamente 10 µ?; b) una alcohol deshidrogenasa que usa NADH como un cofactor; o c) tanto a) como b) .

La patente núm. WO 2011/019894 y las publicaciones de las solicitudes de patentes de los Estados Unidos núms. 2011/019894, 2007/0092957, 2010/0081154, que se incorporan como referencia en la presente descripción en su totalidad, describen dihidroxiácido deshidratasas adecuadas. Los métodos para incrementar la actividad de DHAD se describen, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0081173 y en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 13/029,558, presentada el 17 de febrero de 2011, que se incorporan como referencia en la presente descripción en su totalidad.

Las enzimas de cetol-ácido reductoisomerasa (KARI) adecuadas se describen en las publicaciones de las solicitudes de patentes de los Estados Unidos núms. 2008/0261230 Al, 2009/0163376, 2010/0197519, 2010/0143997 y 2011/0244536, que se incorporan como referencia en la presente descripción en su totalidad. Los ejemplos de las KARI descritas allí son de Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa PA01 y Pseudomonas fluorescens PF5. En algunas modalidades, la enzima KARI tiene una actividad específica de por lo menos aproximadamente 0.1 micromoles/min/mg, por lo menos aproximadamente 0.2 micromoles/min?/mg, por lo menos aproximadamente 0 .3 micromoles/min/mg, por lo menos aproximadamente 0 .4 micromoles/min/mg, por lo menos aproximadamente 0 .5 micromoles/min/mg, por lo menos aproximadamente 0 .6 micromoles/min/mg, por lo menos aproximadamente 0 .7 micromoles/min/mg, por lo menos aproximadamente 0 .8 micromoles/min/mg, por lo menos aproximadamente 0 .9 micromoles/min/mg, por lo menos aproximadamente 1. 0 micromoles/min/mg o por lo menos aproximadamente 1. 1 micromoles/min/mg . Los polipéptidos adecuados para catalizar la conversión de sustrato a producto de acetolactato a 2 , 3 -dihidroxiisovalerato incluyen los que tiene una KM para NADH menor que aproximadamente 300 µ?, menor que aproximadamente 100 µ?, menor que aproximadamente 50 µ?, menor que aproximadamente 25 µ? o menor que aproximadamente 10 µ?.

En algunas modalidades, la KARI usa NADPH. Los métodos para determinar el consumo de NADPH son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la solicitud publicada de los Estados Unidos núm. 2008/0261230, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad, proporciona métodos para determinar el consumo de NADPH. En algunas modalidades, un ensayo de consumo de NADPH es un método que determina la desaparición del cofactor, NADPH, durante la conversión enzimática de acetolactato a a-ß-dihidroxi- isovalerato a 340 nm. La actividad se calcula con el uso del coeficiente de extinción molar de 6220 M^cm"1 para NADPH y se reporta como umoles de NADPH consumidos por min por mg de la proteína total en los extractos celulares (ver Aulabaugh and Schloss, Biochemistry 29: 2824-2830, 1990).

En algunas modalidades, la KARI tiene la capacidad de usar NADH. En algunas modalidades, la KARI tiene la capacidad de usar NADH en condiciones anaerobias. Las enzimas KARI que usan NADH se describen, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0163376, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad.

Una persona con experiencia en la técnica puede identificar otros genes adicionales que pueden usarse a través de la bioinformática o con el uso de métodos conocidos en la técnica.

La publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US 2007/0092957 Al, que se incorpora como referencia en la presente descripción, describe, además, la construcción de genes quiméricos y la ingeniería genética de bacterias y levadura para la producción de isobutanol con el uso de las rutas biosintéticas descritas.

Las rutas biosintéticas para la producción de 1-butanol que pueden usarse incluyen las descritas en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2008/0182308, que se incorpora como referencia en la presente descripción. En una modalidad, la ruta biosintética de 1-butanol comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto : - a) acetil-CoA a acetoacetil-CoA, que puede catalizarse, por ejemplo, por acetil-CoA acetiltransferasa ; - b) acetoacetil-CoA a 3 -hidroxibutiril-CoA, que puede catalizarse, por ejemplo, por 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa; - c) 3-hidroxibutiril-CoA a crotonil -CoA, que puede catalizarse, por ejemplo, por crotonasa; - d) crotonil-CoA a butiril-CoA, que puede catalizarse, por ejemplo, por butiril-CoA deshidrogenasa; - e) butiril-CoA a buliraldehído, que puede catalizarse, por ejemplo, por buliraldehído deshidrogenasa; y - f) buliraldehído a 1-butanol, que puede catalizarse, por ejemplo, por butanol deshidrogenasa.

Las rutas biosintéticas para la producción de 2 -butanol que pueden usarse incluyen las descritas en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0259410 y la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0155870, que se incorporan como referencia en la presente descripción. En una modalidad, la ruta biosintética de 2-butanol comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto: - a) piruvato a alfa-acetolactato, que puede catalizarse, por ejemplo, por acetolactato sintasa; - b) alfa-acetolactato a acetoína, que puede catalizarse, por ejemplo, por acetolactato descarboxilasa; - c) acetoína a 3 -amino-2 -butanol , que puede catalizarse, por ejemplo, por acetonina aminasa; - d) 3 -amino-2 -butanol a 3 -amino-2 -butanol fosfato, que puede catalizarse, por ejemplo, por aminobutanol cinasa; - e) 3 -amino-2 -butanol fosfato a 2-butanona, que puede catalizarse, por ejemplo, por aminobutanol fosfato fosforilasa ; y - f) 2-butanona a 2-butanol, que puede catalizarse, por ejemplo, por butanol deshidrogenasa .

En otra modalidad, la ruta biosintética de 2-butanol comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto: - a) piruvato a alfa-acetolactato, que puede catalizarse, por ejemplo, por acetolactato sintasa; - b) alfa-acetolactato a acetoína, que puede catalizarse, por ejemplo, por acetolactato descarboxilasa; - c) acetoína a 2 , 3 -butanodiol , que puede catalizarse, por ejemplo, por butanodiol deshidrogenasa; - d) 2 , 3 -butanodiol a 2-butanona, que puede catalizarse, por ejemplo, por dial deshidratasa ; y - e) 2-butanona a 2-butanol, que puede catalizarse, por ejemplo, por butanol deshidrogenasa .

En algunas modalidades de la presente invención, una célula huésped recombinante comprende una ruta biosintética . La rut biosintética puede comprender actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada y una ruta biosintética de isobutanol o 1-butanol, en donde la ruta comprende la conversión de sustrato a producto de piruvato a acetolactato . En algunas modalidades, una célula huésped que comprende una ruta biosintética con la capacidad de convertir piruvato a acetolactato comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de acetolactato sintasa. Por ejemplo, la ruta biosintética puede ser una ruta productora de butanol o una ruta productora de butanodiol . La ruta biosintética puede ser, además, una ruta productora de aminoácidos de cadena ramificada (por ejemplo, leucina, isoleucina, valina) .

En otras modalidades, la célula huésped recombinante puede comprender una ruta biosintética de isobutanol, 1-butanol o 2-butanol, como se describe en la presente descripción. En algunas modalidades, la ruta biosintética de butanol es una ruta biosintética de isobutanol. La producción de isobutanol o 2-butanol en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción puede beneficiarse de una reducción, eliminación sustancial o eliminación de la actividad de una acetolactato reductasa.

Modificaciones La supresión funcional del gen de piruvato descarboxilasa se ha usado para aumentar la disponibilidad del piruvato para usar en las rutas biosintéticas de producto. Por ejemplo, la publicación de la solicitud de los Estados Unidos núm. US 2007/0031950 Al, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad, describe una cepa de levadura con una interrupción de uno o más genes de piruvato descarboxilasa y la expresión de un gen de D-lactato deshidrogenasa, que se usar para producir ácido D-láctico. La publicación de la solicitud de los Estados Unidos núm. US 2005/0059136 Al, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad, describe cepas de levadura independientes de fuentes de dos carbonos (GCSI, por sus siglas en inglés) tolerantes a glucosa sin actividad de piruvato descarboxilasa, que pueden tener un gen exógeno de lactato deshidrogenasa. Nevoigt and Stahl {Yeast 12:1331-1337 (1996)) describen el impacto que tienen la piruvato descarboxilasa reducida y la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD aumentada en Saccharomyces cerevisiae sobre el rendimiento de glicerol. La publicación de la patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305363, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad, describe la conversión incrementada de piruvato a acetolactato al modificar la levadura para la expresión de una acetolactato sintasa ubicada en el citosol y la eliminación sustancial de la actividad de piruvato descarboxilasa.

En modalidades de la invención, una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción puede comprender una modificación en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de piruvato descarboxilasa (PDC) o una modificación en un polipéptido endógeno que tiene actividad de PDC. En modalidades, una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción puede tener una modificación o interrupción de un polinucleótido, gen y/o polipéptido que codifica PDC. En modalidades, una célula huésped recombinante comprende una supresión, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno o gen que codifica. un . polipéptido que tiene actividad de PDC o en un polipéptido endógeno que tiene actividad de PDC. Tales modificaciones, interrupciones, supresiones, mutaciones y/o sus ituciones pueden producir actividad de PDC que se reduce o se elimina, lo cual produce, por ejemplo, un fenotipo de bloqueo de PDC (PDCKO, por sus siglas en inglés) .

En modalidades de la invención, una actividad de piruvato descarboxilasa endógena de una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción convierte piruvato a acetaldehído, lo cual, después, puede convertirse a etanol o a acetil-CoA por medio de acetato. En otras modalidades, una célula huésped recombinante es fCluyveromyces lactis que contiene un gen que codifica piruvato descarboxilasa, Candida glabrata que contiene un gen que codifica piruvato descarboxilasa o Schizosaccharomyces pombe que contiene un gen que codifica piruvato descarboxilasa.

En otras modalidades, una célula huésped recombinante es Saccharomyces cerevisiae, que contiene tres isozimas de piruvato descarboxilasa codificadas por los genes PDC1, PDC5 y PDC6, así como un gen regulador de piruvato descarboxilasa, PDC2. En un ejemplo no limitante, en S. cerevisiae, se altera los genes PDC1 y PDC5 , o los genes PDC1, PDC5 y PDC6. En otro ejemplo no limitante, en S. cerevisiae, la actividad de piruvato descarboxilasa se puede reducir al alterar el gen regulador PDC2. En otro ejemplo no limitante, en 3. cerevisiae, pueden alterarse los polinucleótidos o genes que codifican las proteínas de piruvato descarboxilasa, tales como las que tienen de aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencias con PDC1, PDC2 , PDC5 y/o PDC6.

En modalidades, un polipéptido que tiene actividad de PDC o un polinucleótido o gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de PDC corresponde a la Comisión de Enzimas núm. EC 4.1.1.1. En otras modalidades, un gen de PDC de una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción no está activo bajo condiciones de fermentación usadas y, por lo tanto, el gen no necesitaría modificarse o desactivarse.

Se han informado ejemplos de células huésped recombinantes con actividad de piruvato descarboxilasa reducida debido a la interrupción de los genes que codifican piruvato descarboxilasa, tales como para Saccharomyces en Flikweert et al. (Yeast (1996) 12:247-257), para Kluyveromyces in Bianchi et al. (Mol. Microbiol . (1996) 19(1) : 27-36) y la interrupción del gen regulador en Hohmann {Mol. Gen. Genet . (1993) 241:657-666). Las cepas de Saccharomyces que no tienen actividad piruvato descarboxilasa están disponibles en ATCC con registro núm. 200027 y núm. 200028.

Los ejemplos de polinucleótidos , genes y/o polipéptidos de PDC que pueden definirse para modificación o desactivación en las células huéspedes recombinantes descritas en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, aquellas de la siguiente Tabla 8.

Tabla 8. Regiones que codifican el gen objetivo de piruvato decarboxilasa y proteínas.

Otros ejemplos de polinucleótidos , genes y polipéptidos de PDC que pueden definirse para modificación o inactivación en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos, genes y/o . polipéptidos de PDC que tienen por lo menos de aproximadamente 70 a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 75 a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 80 a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencias con cualquiera de las secuencias de la Tabla 8, en donde tal polinucleótido o gen codifica, o tal polipéptido tiene, actividad de PDC. Otros ejemplos adicionales de polinucleótidos, genes y polipéptidos de PDC que pueden definirse para modificación o inactivación en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, una variante activa, fragmento o derivado de cualquiera de las secuencias de la Tabla 8, en donde tal polinucleótido o gen codifica, o tal polipéptido tiene, actividad de PDC.

En modalidades, un polinucleótido, gen y/o polipéptido que codifica una secuencia de PDC descrita en la presente descripción o conocida en la técnica puede modificarse, como se describió anteriormente para la aldehido deshidrogenasa . En otras modalidades, se puede usar un polinucleótido, gen y/o polipéptido que codifica PDC para identificar otra secuencia de polinucleótidos , genes y/o polipéptidos de PDC o para identificar un homólogo de PDC en otras células, como se describió anteriormente para la acetolactato deshidrogenasa.

El secuencias que codifican el PDC pueden identificarse, por ejemplo, en la bibliografía y/o en las bases de datos de bioinformática muy conocidas para las personas con conocimiento ordinario en la técnica. Por ejemplo, la identificación de una secuencia que codifica el PDC en otros tipos de célula por medio por medio de la bioinformática puede llevarse a cabo a través del buscador BLAST (como se describió anteriormente) de las bases de datos públicamente disponibles con una secuencia conocida de polipéptido y ADN codificante de PDC, tal como cualquiera de aquellos proporcionados en la presente descripción. Las identidades toman como base el método de alineamiento Clustal W al usar los parámetros predeterminados de PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN =10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE INTERRUPCIÓN = 0.1 y la serie Gonnet 250 para la matriz de pesos de proteínas .

La modificación de PDC en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción para reducir o eliminar la actividad de PDC puede confirmarse al usar métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la interrupción de una piruvato descarboxilasa particular se puede confirmar con una evaluación por PCR con el uso de cebadores externos para la secuencia de genes, o por la prueba de Southern blot con el uso de una sonda diseñada para la secuencia de genes de piruvato descarboxilasa . Alternativamente, se puede usar métodos analíticos, tales como cromatografía de gases o HPLC para evaluar las cepas para una producción reducida o eliminada de acetaldehído y/o etanol.

Se ha usado supresión funcional del gen de la hexocinasa 2 para disminuir la represión por glucosa y para aumentar la disponibilidad de piruvato para el uso en rutas biosintéticas . Por ejemplo, la publicación internacional núm. O 2000/061722 Al, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad describe la producción de biomasa de levadura al cultivar aerobiamente levadura que tiene uno o más genes de hexocinasa 2 funcionalmente eliminados o análogos. Además, Rossell et al. (Yeast Research 8:155-164 (2008) descubrieron que Saccharomyces cerevisiae con una supresión del gen de la hexocinasa 2 mostró una reducción del 75 % en la capacidad fermentativa, definida como la velocidad específica de la producción de dióxido de carbono bajo condiciones anaerobias y exceso de azúcar.

Después de la inanición, la capacidad de fermentación fue similar a aquella de una cepa sin la supresión del gen de la hexocinasa 2. Diderich et al. (Applied and Environmental Microbiology 67:1587-1593 (2001) descubrieron que S. cerevisiae con una supresión del gen de la hexocinasa 2 tenía una actividad de la piruvato decarboxilasa más baja.

En modalidades, una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción puede comprender una modificación en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de hexocinasa 2 y/o una modificación en un polipéptido que tiene actividad de hexocinasa 2. En modalidades, una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción puede tener una modificación o interrupción de un polinucleótido, gen o polipéptido que codifica hexocinasa 2. En modalidades, una célula huésped recombinante comprende una supresión, mutación y/o sustitución en un polinucleótido endógeno o gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de hexocinasa 2, o un polipéptido endógeno que tiene actividad de hexocinasa 2.

Tales modificaciones, interrupciones, supresiones, mutaciones y/o sustituciones pueden resultar en actividad de hexocinasa 2 que se reduce o se elimina, y produce, por ejemplo, un fenotipo de bloqueo de hexocinasa 2 (HXK2-KO) . En modalidades, la célula huésped comprende una modificación como se describe en las solicitudes de los Estados Unidos series núms . 2011/0124060 Al y 2012/0015416 Al, que se incorporan como referencia en la presente descripción en su totalidad.

En modalidades, un polipéptido que tiene actividad de hexocinasa 2 puede catalizar la conversión de hexosa a hexosa-6-fosfato, y/o puede catalizar la conversión de D-glucosa a D-glucosa 6-fosfato, de D-fructosa a P-fructosa 6-fosfato y/o de D-manosa a D-manosa 6-fosfato. En otras modalidades, un polinucleótido, gen o polipéptido que tiene actividad de hexocinasa 2 puede corresponder al número de la comisión de la enzima EC 2.7.1.1.

En modalidades de la invención, una célula huésped recombinante puede ser S. cerevisiae y un polinucleótido, gen o polipéptido que tiene actividad de hexocinasa 2 puede ser HXK2. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser K. lactis y un polinucleótido, gen o polipéptido que tiene actividad de hexocinasa 2 puede ser RAG5. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser H. polymorpha y un polinucleótido, gen o polipéptido que tiene actividad de hexocinasa 2 puede ser HPGLK1. En otras modalidades, una célula huésped recombinante puede ser S. pombe y un polinucleótido, gen o polipéptido que tiene actividad de hexocinasa 2 puede ser HXK2.

Los ejemplos de polinucleótidos , genes y polipéptidos de hexocinasa 2 que pueden definirse para modificación o inactivación en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, los de la Tabla 9 a continuación.

Tabla 9. Regiones codificantes de genes objetivo de hexocinasa 2 y proteínas .

Otros ejemplos de de polinucleótidos, genes y polipéptidos de hexocinasa 2 que pueden definirse para modificación o inactivación en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos, genes y/o polipéptidos de hexocinasa 2 que tienen por lo menos de aproximadamente 70 % a aproximadamente 75 %, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 80 %, de aproximadamente 80 % a aproximadamente 85 %, de aproximadamente 85 % a aproximadamente 90 %, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % de identidad de secuencias con cualquiera de las secuencias de la Tabla 9, en donde tal polinucleótido o gen codifica, o tal polipéptido tiene, actividad de hexocinasa 2. Otros ejemplos adicionales de polinucleótidos , genes y polipéptidos de hexocinasa 2 que pueden definirse para modificación o inactivación en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, una variante activa, fragmento o derivado de cualquiera de las secuencias de la Tabla 9, en donde tal polinucleótido o gen codifica, o tal polipéptido tiene, actividad de hexocinasa 2.

En modalidades, un polinucleótido, gen y/o polipéptido que codifica una secuencia de hexocinasa 2 descrita en la presente descripción o conocida en la técnica puede modificarse o interrumpirse, como se describió anteriormente para la aldehido deshidrogenasa . En otras modalidades, un polinucleótido, gen y/o polipéptido que codifica hexocinasa 2 puede usarse para identificar otra secuencia de polinucleótidos, genes y/o polipéptidos de hexocinasa 2 o para identificar un homólogo de hexocinasa 2 en otras células, como se describió anteriormente para la aldehido deshidrogenasa . Tal secuencia que codifica hexocinasa 2 puede identificarse, por ejemplo, en la literatura y/o en las bases de datos de bioinformática bien conocidas para las personas con conocimiento en la técnica. Por ejemplo, la identificación de una secuencia que codifica hexocinasa 2 en otros tipos celulares con el uso de la bioinformática puede llevarse a cabo a través de la búsqueda BLAST (como se describió anteriormente) de las bases de datos disponibles al público con una secuencia de ADN y polipéptidos que codifica hexocinasa 2, como las proporcionadas en la presente descripción. Las identidades toman como base el método de alineamiento Clustal W al usar los parámetros predeterminados de PENALIZACIÓN POR INTERRUPCIÓN =10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE INTERRUPCIÓN = 0.1 y la serie Gonnet 250 para la matriz de pesos de proteínas.

La modificación de hexocinasa 2 en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción para reducir o eliminar la actividad de hexocinasa 2 se puede confirmar con el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la interrupción de hexocinasa 2 se puede confirmar con la evaluación por PCR con el uso de cebadores externos para el gen de hexocinasa 2, o por la prueba de Southern blot con el uso de una sonda diseñada para la secuencia de genes de hexocinasa 2. Alternativamente, se puede examinar las cepas de bloqueo de hexocinasa 2 putativa para un rendimiento de biomasa incrementado en los medios que contienen glucosa.

Los ejemplos de modificaciones adicionales que pueden ser útiles en las células proporcionadas en la presente descripción incluyen modificaciones para reducir la actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa y/o la interrupción en por lo menos un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad de piruvato descarboxilasa o una interrupción en por lo menos un gen que codifica un elemento regulador que controla la expresión de genes de piruvato descarboxilasa, como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305363 (incorporada como referencia en la presente descripción) , modificaciones a una célula huésped que facilitan un flujo de carbono aumentado a través de una ruta de Entner-Doudoroff o reducción de balance de equivalentes, como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0120105 (incorporada como referencia en la presente descripción). Otras modificaciones incluyen la integración de por lo menos un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza una etapa en una ruta biosintética que usa piruvato que se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. WO 2012/033832, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad. Una modificación genética que tiene el efecto de reducir la represión de glucosa, en donde la célula huésped de producción de levadura es pdc, se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US 2011/0124060, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad.

La publicación de la solicitud de Estados Unidos solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20120064561A1 , que se incorpora como referencia en la presente descripción, describe las células huésped recombinantes que comprenden (a) por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de dihidroxiácido deshidratasa; y (b) (i) al menos una supresión, mutación y/o sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis del grupo Fe-S; y/o (ii) al menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis del grupo Fe-S. En modalidades, el polipéptido que afecta la biosíntesis del agrupamiento Fe-S está codificado por AFT1, AFT2 , FRA2 , GRX3 o CCC1. En modalidades, el polipéptido que afecta la biosíntesis del grupo Fe-S es un mutante constitutivo AFT1 L99A, AFT1 L102A, AFT1 C291F o AFT1 C293F.

Adicionalmente , las células huésped pueden comprender polinucleótidos heterologos que codifican un polipéptido con actividad de fosfocetolasa y/o un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad de fosfotransacetilasa, tal como, por ejemplo, los codificados por las sec. con núms . de ident.: 962 y 963, y como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. WO 2011/159853, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad.

Isobutanol y otros productos En modalidades de la invención, se proporciona métodos para la producción de un producto de una ruta biosintética; los métodos comprenden (a) proporcionar una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción; y (b) cultivar la célula huésped en condiciones para producir el producto de la ruta biosintética. En otras modalidades, el producto se produce como un coproducto junto con etanol . En otras modalidades adicionales, el producto de la ruta biosintética es isobutanol.

En otras modalidades de la presente invención, el producto de la ruta biosintética se produce a un rendimiento o cantidad mayor en comparación con la producción del mismo producto en una célula huésped recombinante que no comprende una actividad de aldehido deshidrogenasa y/o actividad de aldehido oxidasa y/o actividad de acetolactato reductasa reducida o eliminada. En modalidades, el rendimiento se incrementa en por lo menos aproximadamente 2 %, por lo menos aproximadamente 5 % o por lo menos aproximadamente 10 %. En modalidades, este rendimiento mayor incluye la producción a un rendimiento mayor que aproximadamente 10 % del teórico, a un rendimiento mayor que aproximadamente 20 % del teórico , a un rendimiento mayor que aproximadamente 25 % del teórico, a un rendimiento mayor que aproximadamente 30 % del teórico, a un rendimiento mayor que aproximadamente 40 del teórico, a un rendimiento mayor que aproximadamente 50 del teórico, a un rendimiento mayor que aproximadamente 60 % del teórico, a un rendimiento mayor que aproximadamente 70 del teórico , a un rendimiento mayor que aproximadamente 75 % del teórico, a un rendimiento mayor que aproximadamente 80 del teórico, a un rendimiento mayor que aproximadamente 85 % del teórico , a un rendimiento mayor que aproximadamente 90 del teórico, a un rendimiento mayor que aproximadamente 95 "6 del teórico, a un rendimiento mayor que aproximadamente 96 del teórico, a un rendimiento mayor que aproximadamente 97 % del teórico , a un rendimiento mayor que aproximadamente 98 del teórico , a un rendimiento mayor que aproximadamente 99 *S del teórico, o a un rendimiento de aproximadamente 100 % del teórico. En otras modalidades, el producto se produce como un coproducto junto con etanol . En otras modalidades adicionales, el producto de la ruta biosintética es isobutanol.

Cualquier producto de una ruta biosintética que tiene la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico como un subproducto de la ruta se puede producir con mayor eficacia en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción que tiene la modificación descrita de actividad de aldehido deshidrogenasa y/o aldehido oxidasa. Una lista de tales productos incluye, pero no se limita a, isobutanol.

Huéspedes microbianos para la producción de isobutanol Los huéspedes microbianos para la producción de isobutanol pueden seleccionarse de bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levaduras. El huésped microbiano usado para la producción de butanol debe ser tolerante al isobutanol de manera que el rendimiento no está limitado por la toxicidad del butanol. Aunque se han aislado mutantes tolerantes al butanol de Clostridia solventogénica, se dispone de poca información con respecto a la tolerancia al butanol de otras cepas bacterianas potencialmente útiles. La mayoría de los estudios sobre la comparación de tolerancia al alcohol en bacterias sugiere que el butanol es más tóxico que el etanol (de Cavalho, et al., Microsc. Res. Tech., 64: 215-22, 2004) y (Kabelitz,. et al., FEMS Microbiol. Lett . , 220: 223-227, 2003, Tomas, et al., J. Bacteriol . , 186: 2006-2018, 2004) reportan que el rendimiento de 1 -butanol durante la fermentación en Clostridium acetobutylicum puede estar limitado por la toxicidad del 1-butanol. El efecto principal del 1-butanol sobre Clostridium acetobutylicum es la interrupción de las funciones de la membrana (Hermann et al., Appl. Environ. Microbiol., 50: 1238-1243, 1985) .

Los huéspedes microbianos seleccionados para la producción de isobutanol deben ser tolerantes al isobutanol y deben tener la capacidad de convertir carbohidratos a isobutanol. Los criterios para la selección de huéspedes microbianos adecuados incluyen los siguientes: tolerancia intrínseca al isobutanol, velocidad alta del uso de glucosa, disponibilidad de herramientas genéticas para la manipulación de genes y capacidad de generar alteraciones cromosómicas estables .

Las cepas huésped adecuadas con una tolerancia para isobutanol pueden identificarse mediante una evaluación en base a la tolerancia intrínseca de la cepa. La tolerancia intrínseca de los microbios al isobutanol se puede medir al determinar la concentración de isobutanol que es responsable por el 50 % de inhibición de la velocidad de crecimiento (IC50) cuando se cultivan en un medio mínimo. Los valores de IC50 pueden determinarse con el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los microbios de interés se pueden cultivar en presencia de diversas cantidades de isobutanol y la velocidad de crecimiento se puede monitorear al determinar la densidad óptica a 600 nanómetros. El tiempo de duplicación se puede calcular a partir de la parte logarítmica de la curva de crecimiento y se puede usar como un indicador de la velocidad de crecimiento. La concentración de isobutanol que produce 50 % de inhibición de crecimiento puede determinarse a partir de un gráfico de la inhibición porcentual del crecimiento contra la concentración de isobutanol. En una modalidad, la cepa huésped tiene una IC50 para isobutanol mayor que aproximadamente 0.5 % .

El huésped microbiano para la producción de isobutanol debe usar, además, glucosa a una velocidad alta. La mayoría de microbios tiene la capacidad de metabolizar carbohidratos. Sin embargo, ciertos microbios ambientales no pueden metabolizar carbohidratos para una eficacia alta y, por lo tanto, no serían huéspedes adecuados.

La capacidad de modificar genéticamente el huésped es esencial para la producción de cualquier microorganismo recombinante . El modo de la tecnología de transferencia de genes puede ser mediante electroporación, conjugación, transducción o transformación natural. Existe una amplia variedad de plásmidos conjugativos del huésped y marcadores de resistencia a fármacos. Los vectores de clonación se adaptan a los microorganismos huésped en función de la naturaleza de los marcadores de resistencia a antibióticos que pueden funcionar en ese huésped.

El huésped microbiano debe, además, manipularse para inactivar las rutas competitivas para el flujo de carbono al eliminar varios genes. Esto requiere la disponibilidad ya sea de transposones para dirigir la inactivación o de vectores de integración cromosómica . Adicionalmente , el huésped de producción debe ser sensible a la mutagénesis química de manera que las mutaciones para mejorar la tolerancia intrínseca al butanol puedan obtenerse.

Según los criterios descritos anteriormente, los huéspedes microbianos adecuados para la , producción de isobutanol incluyen, pero no se limitan a, miembros de los géneros Clostridíum, Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Vibrio, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Issatchenkia, Hansenula, Kluyveromyces y Saccharomyces . Los huéspedes adecuados incluyen: Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae . En algunas modalidades, la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae . Las levaduras de S. cerevisiae son conocidas en la técnica y están disponibles de una gran variedad de fuentes, que incluyen, pero no se limitan a, American Type Culture Collection (Rockville, MD) , Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, LeSaffre, Gert Strand AB, Ferm Solutions, North American Bioproducts, Martrex, y Lallemand. Las levaduras de S. cerevisiae incluyen, pero no se limitan a, BY4741, CE . PK 113-7D, levadura Ethanol Red®, levadura Ferm Pro™, levadura Bio-Ferm® XR, levadura de alcohol Gert Strand Pres ige Batch Turbo, levadura Gert Strand Pot Distillers, levadura Gert Strand Distillers Turbo, levadura FerMax™ Green, levadura FerMax™ Gold, levadura Thermosacc®, BG-l, PE-2, CAT-1, CBS7959, CBS7960 y CBS7961.

Construcción del huésped de producción Los microorganismos recombinantes que contienen los genes necesarios que codifican la ruta enzimática para la conversión de un sustrato de carbono fermentable a butanol pueden construirse con el uso de técnicas muy conocidas en la técnica. En la presente invención, los genes que codifican las enzimas de una de las rutas biosintéticas de isobutanol de la presente invención, por ejemplo, acetolactato sintasa, acetohidroxiácido isomerorreductasa, acetohidroxiácido deshidratasa, a-ceto ácido descarboxilasa de cadena ramificada y alcohol deshidrogenasa de cadena ramificada, pueden aislarse de varias fuentes, como se describió anteriormente .

Los métodos para obtener los genes deseados de un genoma son comunes y muy conocidos en la técnica de biología molecular. Por ejemplo, si se conoce la secuencia del gen, se pueden generar librerías genómicas adecuadas mediante la digestión de endonucleasas de restricción o se pueden examinar con sondas complementarias para la secuencia del gen deseado. Una vez que se aisla la secuencia, el ADN se puede amplificar con el uso de métodos convencionales de amplificación dirigida al cebador, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (patente de los Estados Unidos núm. 4,683,202) para obtener cantidades de ADN adecuadas para la transformación con el uso de vectores adecuados. Las herramientas para la optimización por codones para la expresión en un huésped heterólogo están fácilmente disponibles. Algunas herramientas para la optimización por codones se encuentran disponibles según el contenido de GC del microorganismo huésped.

Una vez que se identifica y se aisla los genes de la ruta relevantes, estos pueden transformarse en huéspedes de expresión adecuados por medios muy conocidos en la técnica. Los vectores o casetes útiles para la transformación de una gran variedad de células huésped son comunes y están disponibles comercialmente de empresas, tales como EPICENTRE^ (Madison, WI) , Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA) , Stratagene (La Jolla, CA) y New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) . Típicamente, el vector o cásete contiene secuencias que dirigen la transcripción y traducción del gen relevante, un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o integración cromosómica. Los vectores adecuados comprenden una región 5' del gen que aloja los controles de iniciación de la transcripción y una región 3 ' del fragmento de ADN que controla la terminación de la transcripción. Ambas regiones de control pueden derivarse de genes homólogos a la célula huésped transformada, aunque debe entenderse que estas regiones de control pueden derivarse, además, de genes que no son nativos para las especies específicas seleccionadas como huésped de producción.

Las regiones de control de iniciación o promotores, que son útiles para dirigir la expresión de las regiones codificantes de la ruta relevantes en la célula huésped deseada, son diversos y familiares para aquellos con experiencia en la técnica. Prácticamente cualquier promotor con la capacidad de dirigir estos elementos genéticos, que incluyen los usados en los ejemplos, es adecuado para la presente invención e incluyen, pero no se limitan a, CYC1, HIS3, GAL1, GALIO, ADH1 , PGK, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1 , URA3 , LEU2, ENO, TPI (útil para la expresión en Saccharomyces) ; AOX1 (útil para la expresión en Pichia) ; y lac, ara, tet, trp, 1PL, 1PR, G7, tac y trc (útil para la expresión en Escherichia coli, Alcaligenes y Pseudomonas) , así como los promotores amy, apr, npr y varios promotores de fagos útiles para la expresión en Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis y Paenibacillus macerans . Para células huésped recombinantes de levadura, varios promotores pueden usarse para construir los casetes de expresión para genes, que incluyen, pero no se limitan a, los siguientes promotores constitutivos adecuados para usar en levadura: FBA1 , TDH3 (GPD) , ADH1, ILV5, y GPM1 ; y los siguientes promotores inducibles adecuados para uso en levadura: GAL1, GALIO, 0LE1, y CUP1. Otros promotores de levaduras incluyen los promotores híbridos UAS ( PGK1 ) -FBAlp (sec. con núm. de ident . : 406), UAS (PGK1) -EN02p (sec. con núm. de ident.: 538), UAS(FBAl)-PDClp (sec. con núm. de ident.: 539), UAS (PGK1) -PDClp (sec. con núm. de ident.: 540) y UAS (PGK) -OLElp (sec. con núm. de ident . : 541) .

Los promotores, terminadores transcripcionales y regiones codificantes pueden clonarse en un plásmido de 2 micrones de levadura y transformarse en células de levadura (Ludwig, et al. Gene, 132: 33-40, 1993; publicación de la solicitud de patente de los publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20080261861A1) .

El ajuste de la cantidad de expresión génica en un huésped específico se puede lograr al variar el nivel de transcripción, tal como a través de la selección de promotores naturales o artificiales. Adicionalmente, las técnicas tales como el uso de bibliotecas de promotores para alcanzar los niveles deseados de transcripción de genes son muy conocidas en la técnica. Tales bibliotecas pueden generarse con el uso de técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, por clonación de fragmentos de ADNc aleatorios frente a casetes de genes (Goh et al. (2002) AEM 99, 17025), por modulación de las secuencias reguladoras presentes dentro de los promotores (Ligr et al. (2006) Genetics 172, 2113) o por mutagénesis de secuencias promotoras conocidas (Alper et al. (2005) PNAS, 12678; Nevoigt et al. (2006) AEM 72, 5266).

Las regiones de control de terminación pueden derivarse, además, de diversos genes nativos para los huéspedes. Opcionalmente, un sitio de terminación puede ser innecesario o puede estar incluido.

Ciertos vectores tienen la capacidad de replicarse en un intervalo amplio de bacterias huésped y pueden transferirse por conjugación. La secuencia completa y anotada de pRK404 y tres vectores relacionados pRK437, pRK442 y pRK442 (H) se encuentran disponibles. Se ha demostrado que estos derivados son herramientas valiosas para la manipulación genética en bacterias gram negativas (Scott et al., Plasmid, 50: 74-79, 2003). También están disponibles varios derivados plasmídicos con intervalo de huéspedes amplio, Inc P4 plasmid RSF1010, con promotores que pueden actuar en un intervalo de bacterias Gram negativas. Los plásmidos pAYC36 y pAYC37 tienen promotores activos junto con múltiples sitios de clonación para permitir la expresión de genes heterólogos en bacterias Gram negativas .

Además, hay una amplia disponibilidad de herramientas de reempbucle de genes cromosómicos . Por ejemplo, una variante termosensible del replicón de intervalo amplio de huéspedes pWVIOl se ha modificado para construir un plásmido pVE6002 que puede usarse para efectuar el reempbucle de genes en un intervalo de bacterias gram positivas (Maguin et al., J. Bacteriol . , 174: 5633-5638, 1992). Adicionalmente , hay transposomas in vitro disponibles para crear mutaciones aleatorias en una gran variedad de genomas de fuentes comerciales, tales como EPICENTRE®.

La expresión de una ruta biosintética de butanol en diversos huéspedes microbianos se describe en mayor detalle a continuación .

Expresión de una ruta biosintética de butanol en E. coli Los vectores o casetes útiles para la transformación de E. coli son comunes y están disponibles comercialmente de las empresas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, los genes de una ruta biosintética de isobutanol se pueden aislar de varias fuentes, se pueden clonar en un vector pUC19 modificado y se pueden transformar en NM522 de E. coli.

Expresión de una ruta biosintética de butanol en Rhodococcus erythropolis Una serie de vectores transportadores de E. coli-Rhodococcus se encuentra disponible para la expresión en R. erythropolis , que incluyen, pero no se limitan a, pRhBR17 y pDA71 (Kostichka et al., Appl . Microbiol. Biotechnol . , 62: 61-68, 2003). Adicionalmente, una serie de promotores se encuentra disponible para la expresión de genes heterólogos in R. erythropolis (Nakashima et al., Ap l. Environ.

Microbiol., 70: 5557-5568, 2004 y Tao et al., Ap l . Microbiol. Biotechnol . , 68: 346-354, 2005). La interrupción genética objetivo de genes cromosómicos en R. erythropolis se puede crear con el uso del método descrito por Tao et al . , supra, y Brans et al. (Appl. Environ. Microbiol., 66: 2029-2036, 2000) .

Los genes heterólogos requeridos para la producción de isobutanol, como se describió anteriormente, se pueden clonar inicialmente en pDA71 o pRhBR71 y se pueden transformar en E. coli. Después, los vectores se pueden transformar en R. erythropolis por electroporación, como describen Kostichka et al., supra. Los recombinantes se pueden cultivar en medio sintético que contiene glucosa y la producción de isobutanol se puede seguir con el uso de métodos conocidos en la técnica.

Expresión de una ruta biosintética de butanol en B. subtilis Además, los métodos para la expresión génica y la. creación de mutaciones en B. subtilis son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, los genes de una ruta biosintética de isobutanol se pueden aislar de varias fuentes, se pueden clonar en un vector pUC19 modificado y se pueden transformar en BE1010 de Bacillus subtilis . Adicionalmente , los cinco genes de una ruta biosintética de isobutanol se pueden separar en dos operones para expresión. Los tres genes de la ruta {bubB, ilvD y kivD) se pueden integrar en el cromosoma de BE1010 de Bacillus subtilis (Payne, et al., J. Bacteriol . , 173, 2278-2282, 1991) . Los dos genes restantes (ilvC y bdhB) se pueden clonar en un vector de expresión y se pueden transformar en la cepa de Bacillus que porta los genes de isobutanol integrados Expresión de una ruta biosintética de butanol en B. licheniformis Se puede usar la mayoría de plásmidos y vectores transportadores que se replican en B. subtilis para transformar B. licheniformis ya sea por transformación de protoplastos o por electroporacion. Los genes requeridos para la producción de isobutanol se pueden clonar en derivados de los plásmidos pBE20 o pBE60 (Nagarajan et al., Gene, 114: 121-126, 1992) . Los métodos para transformar B. licheniformis son conocidos en la técnica (Fleming et al. Appl . Environ. Microbiol . , 61: 3775-3780, 1995). Los plásmidos construidos para la expresión en B. subtilis se pueden transformar en B. licheniformis para producir un huésped microbiano recombinante que produce isobutanol.

Expresión de una ruta biosintética de butanol en Paenibacillus macerans Los plásmidos se pueden construir como se describió anteriormente para la expresión en B. subtilis y se pueden usar para transformar Paenibacillus macerans por transformación de protoplastos para producir un huésped microbiano recombinante que produce isobutanol.

Expresión de la ruta biosintética de butanol en Alcaligenes (Ralstonia) eutrophus Los métodos para la expresión génica y la creación de mutaciones en Alcaligenes eutrophus son conocidos en la técnica (Taghavi et al., Ap l . Environ. Microbiol . , 60: 3585-3591, 1994) . Los genes para una ruta biosintética de isobutanol se pueden clonar en cualquiera de los vectores del intervalo amplio de huéspedes descritos anteriormente, y se pueden electroporar para generar recombinantes que producen isobutanol. La ruta de poli (hidroxibutirato) en Alcaligenes se ha descrito en detalle, una gran variedad de técnicas genéticas para modificar el genoma de Alcaligenes eutrophus es conocida y esas herramientas se pueden aplicar para modificar una ruta biosintética de isobutanol.

Expresión de una ruta biosintética de butanol en Pseudomonas putida Los métodos para la expresión génica en Pseudomonas putida son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Ben-Bassat et al., patente de los Estados Unidos núm. 6,586,229, que se incorpora como referencia en la presente descripción) . Los genes de la ruta de butanol se pueden insertar en pPCU18 y este ADN ligado se puede electroporar en células D0T-T1 C5aARl de Pseudomonas putida electrocompetentes para generar recombinantes que producen isobutanol.

Expresión de una ruta biosintética de butanol en Saccharomyces cerevisiae Los métodos para la expresión génica en Saccharomyces cerevisiae son conocidos en la técnica (por ejemplo, Methods in Enzymology, volumen 194, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Parte A, 2004, Christine Guthrie and Gerald R. Fink, eds . , Elsevier Academic Press, San Diego, CA) . La expresión de genes en levadura requiere, típicamente, un promotor, seguido por el gen de interés y un terminador transcripcional . Varios promotores de levadura, que incluyen los usados en los ejemplos de la presente invención, se pueden usar para construir casetes de expresión para los genes que codifican una ruta biosintética de isobutanol, que incluyen, pero no se limitan a, los promotores constitutivos FBA, GPD, ADH1 y GPM, y los promotores inducibles GALl, GALIO y CUP1. Los terminadores transcripcionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, FBAt , GPDt , GPMt , ERGIOt , GALlt, CYC1 y ADH1. Por ejemplo, los promotores, terminadores transcripcionales y los genes adecuados de una ruta biosintética de isobutanol se pueden clonar en vectores transportadores de levadura de E. coli y se pueden transformar en células de levadura, como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20100129886. Estos vectores permiten la propagación de la cepa tanto en E. coli como en cepas de levadura.

Típicamente, el vector contiene un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o integración cromosómica en el huésped deseado. Típicamente, los plásmidos usados en levadura son los vectores lanzadera pRS423, pRS424, pRS425 y pRS426 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) , que contienen un origen de replicación de E. coli (por ejemplo, pMBl) , un origen de replicación de levadura de 2 µ? y un marcador para selección nutricional. Los marcadores de selección para estos cuatro vectores son His3 (vector pRS423) , Trpl (vector pRS424) , Leu2 (vector pRS425) y Ura3 (vector pRS426). La construcción de vectores de expresión con genes que codifican los polipéptidos de interés se puede llevar a cabo ya sea mediante técnicas convencionales de clonación molecular en E. coli o por el método de recombinación de reparación de interrupciones en levadura.

El método de clonación de reparación de la interrupción aprovecha la recombinación homologa sumamente eficiente en levadura. Típicamente, el ADN de un vector de levadura se digiere (por ejemplo, en su sitio de clonación múltiple) para crear una "interrupción" en su secuencia. Se generan varios insertos de los ADN de interés que contienen una secuencia de = 21 pb en ambos extremos 5' y 3' que se superponen secuencialmente entre sí, y con el terminal 5' y 3' del ADN del vector. Por ejemplo, para construir un vector de expresión de levadura para el "Gen X' , se selecciona un promotor de levadura y un terminador de levadura para el cásete de expresión. El promotor y el terminador se amplifican a partir del ADN genómico de la levadura, y el Gen X se amplifica o bien por PCR a partir de su organismo de origen o se obtiene de un vector de clonación que comprende la secuencia del Gen X. Por lo menos hay una secuencia de superposición de 21 pb entre el extremo 5' del vector linealizado y la secuencia promotora, entre el promotor y el Gen X, entre el Gen X y la secuencia terminadora, y entre el terminador y el extremo 3' del vector linealizado. Después, el vector con "interrupciones" y los insertos de ADN se cotransforman en una cepa de levadura y se siembran en una placa en el medio que contiene las mezclas de compuestos apropiados que permiten la complementación de los marcadores de selección nutricional en los plásmidos. La presencia de las combinaciones correctas de insertos puede confirmarse con mapeo por PCR mediante el uso del ADN plasmídico preparado a partir de las células seleccionadas. Después, el ADN de plásmidos aislado de levadura (usualmente bajo en concentración) se puede transformar en una cepa de E. coli, por ejemplo, TOP10, seguido por minipreparaciones y mapeo de restricción para verificar adicionalmente el constructo plasmídico. Finalmente, el constructo puede verificarse por análisis de secuencias.

Al igual que la técnica de reparación de la interrupción, la integración en el genoma de la levadura también aprovecha el sistema de recombinación homologa en levadura. Típicamente, un cásete que contiene una región codificante más elementos de control (promotor y terminador) y un marcador auxotrófico se amplifica por PCR con una ADN polimerasa de alta fidelidad mediante el uso de cebadores que se hibridan con el cásete y que contienen de 40 a 70 pares de bases de homología de secuencia con las regiones 51 y 31 del área genómíca en donde se desea la inserción. Después, el producto de la PCR se transforma en levadura y se siembra en una placa con un medio que contiene las mezclas de compuestos apropiados que permiten la selección del marcador auxotrófico integrado. Por ejemplo, para integrar el "Gen X" en la ubicación cromosómica "Y" , el constructo de promotor-región codificante X-terminador se amplifica por PCR a partir de un constructo de ADN plasmídico y se une a un marcador autotrófico (tal como URA3) por medio de PCR SOE (PCR con método de unión por extensión de traslapamiento , por sus siglas en inglés) o por métodos comunes de clonación y digestión por restricción. El cásete completo, que contiene el promotor-región codificante X-terminador-región de URA3 se amplifica por PCR con secuencias de cebadores que contienen de 40 a 70 pb de homología para las regiones 5' y 3' de la ubicación "Y" en el cromosoma de la levadura. El producto de la PCR se transforma en levadura y se selecciona en medios de crecimiento sin uracilo. Los transformantes pueden verificarse o bien por PCR de colonias o por secuenciación directa del ADN croraosómico. Expresión de una ruta biosintética de butanol en Lactobacillus plantarum El género de Lactobacillus pertenece a la familia Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores usados en la transformación de Bacillus subtilis y Streptococcus pueden usarse para Lactobacillus . Los ejemplos no limitantes de los vectores adecuados incluyen ???ß? y derivados de estos (Renault et al., Gene 183:175-182, 1996); y (O'Sullivan et al., Gene, 137: 227-231, 1993); pMBBl y pHW800, un derivado de pMBBl (Wyckoff et al., Ap l . Environ. Microbiol . , 62: 1481-1486, 1996) ; p Gl, un plásmido conjugativo (Tanimoto et al., J. Bacteriol., 1.84: 5800-5804, 2002); pNZ9520 (Kleerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol., 63: 4581-4584, 1997); pAM401 (Fujimoto et al., Ap l. Environ. Microbiol., 67: 1262-1267, 2001); y pAT392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother., 38: 1899-1903, 1994). Se han reportado, además, muchos plásmidos de Lactobacillus plantarum (van Kranenburg R, et al. Appl. Environ. Microbiol., 71: 1223-1230, 2005).

Expresión de una ruta biosintética de butanol en varias especies de Enterococcus {E. faecium, E. gallinarium y E. faecalis) El género Enterococcus pertenece a la familia Lactobacillales y muchos plásmidos y vectores usados en la transformación de las especies Lactobacilli , Bacilli y ¦Streptococci pueden usarse para las especies de Enterococcus . Los ejemplos no limitantes de los vectores adecuados incluyen ???ß? y derivados de estos (Renault et al., Gene, 183: 175-182, 1996); y (O'Sullivan et al., Gene, 137: 227-231, 1993); pMBBl y pHW800, un derivado de pMBBl (Wyckoff et al. Appl . Environ. Microbiol . , 62: 1481-1486, 1996); pMGl , un plásmido conjugativo (Tanimoto et al., J. Bacteriol . , 184: 5800-5804, 2002); pNZ9520 ( leerebezem et al., Appl. Environ. Microbiol., 63: 4581-4584, 1997); pAM401 (Fujimoto et al., Appl. Environ. Microbiol., 67: 1262-1267, 2001); y pAT392 (Arthur et al., Antimicrob. Agents Chemother., 38:, 1899-1903, 1994) . Además, pueden usarse los vectores de expresión para E. faecalis que usan el gen nisA de Lactococcus (Eichenbaum et al., Appl. Environ. Microbiol., 64: 2763-2769, 1998) . Adicionalmente , pueden usarse los vectores para el reempbucle de genes en el cromosoma de E. faecium (Nallaapareddy et al., Appl. Environ. Microbiol., 72: 334-345, 2006) .

Medios de fermentación Los medios de fermentación en la presente descripción deben contener sustratos adecuados de carbono. Los sustratos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos , tales como glucosa y fructosa, oligosacáridos , tales como lactosa, maltosa, galactosa, sacarosa, polisacáridos , tales como almidón o celulosa o mezclas de estos y mezclas no purificadas de materias primas renovables, tales como permeato de suero de queso, licor de maíz fermentado, melazas de remolacha azucarera y malta de cebada. Adicionalmente, el sustrato de carbono puede ser, además, sustratos de un solo carbono, tales como dióxido de carbono o metanol para los que se ha demostrado la conversión metabólica en productos intermedios bioquímicos clave. Además de los sustratos de uno y dos carbonos, se sabe que los microorganismos metilotróficos usan, además, muchos otros compuestos que contienen carbono, tales como metilamina, glucosamina y una gran variedad de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, se sabe que la levadura metilotrófica usa el carbono de metilamina para formar trehalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd . , [Int. Symp . ] , 7th (1993), 415-32. (eds) : Murrell, J. Collin; Kelly, Don P. Publisher: Intercept, Andover, Reino Unido de Gran Bretaña) . Del mismo modo, varias especies de Candida metabolizan alanina o ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol., 153: 485-489, 1990). Por lo tanto, se contempla que la fuente de carbono usada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y estará limitada únicamente por la elección del microorganismo.

Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de estos son adecuados en la presente descripción, en algunas modalidades, los sustratos de carbono son glucosa, fructosa y sacarosa, o mezclas de estos con azúcares de C5, tales como xilosa y/o arabinosa para células de levadura modificadas para usar azúcares de C5. La sacarosa puede derivarse de fuentes de azúcar renovables, tales como caña de azúcar, betabel azucarero, mandioca, sorgo dulce y mezclas de estos. La glucosa y la dextrosa pueden derivarse de fuentes de granos renovables a través de la sacarificación de materias primas a base de almidón que incluyen granos, tales como maíz, trigo, centeno, cebada, avena y mezclas de estos. Adicionalmente, los azúcares fermentables pueden derivarse de biomasa renovable de celulósica o lignocelulósica a través de procesos de tratamiento previo y sacarificación, como se describe, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0031918 Al, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad. La biomasa se refiere a cualquier material celulósico o lignocelulósico e incluye materiales que comprenden celulosa y, opcionalmente, también comprenden hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos . La biomasa puede comprender, además, otros componentes, tales como proteínas y/o lípidos. La biomasa puede derivarse de una sola fuente o puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente; por ejemplo, la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas del maíz y rastrojos del maíz, o una mezcla de pastos y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a, cultivos bionergéticos , residuos agrícolas, residuos sólidos municipales, residuos sólidos industriales, sedimentos de la fabricación del papel, residuos orgánicos, residuos forestales y de silvicultura. Los ejemplos de biomasa incluyen, pero no se limitan a, granos de maíz, mazorcas del maíz, residuos de cultivos, tales como cáscaras de granos de maíz, rastrojos del maíz, hierbas, trigo, paja del trigo, cebada, paja de la cebada, heno, paja de arroz, pasto panizo, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de maderas, aserrín, matas y arbustos, vegetales, frutas, flores, estiércol, y mezclas de éstos.

Además de una fuente de carbono adecuada, el medio de fermentación debe contener minerales, sales, cofactores, reguladores y otros componentes adecuados conocidos para aquellos con experiencia en la técnica, adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de la ruta enzimática necesaria para la producción de butanol descrita en la presente descripción.

Condiciones de cultivo Típicamente, las células se cultivan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 40 °C en un medio apropiado. Los medios de crecimiento adecuados en la presente descripción son medios comunes preparados comercialmente , tales como el caldo Luria Bertani (LB) , el caldo Sabouraud Dextrose (SD) o el caldo de medio de levadura (Y ) o caldo que incluye base de nitrógeno para levadura, sulfato amónico y dextrosa (como la fuente de carbono/energía) o el medio YPD, una combinación de peptona, extracto de levadura y dextrosa en proporciones óptimas para cultivar la mayoría de cepas de Saccharomyces cerevisiae . Además, pueden usarse otros medios de cultivo definidos o sintéticos, y el medio adecuado para cultivo del microorganismo específico será conocido para una persona con experiencia en la técnica de la ciencia de microbiología o fermentación. El uso de agentes conocidos para modular la represión por catabolito directa o indirectamente, por ejemplo, adenosina 21 , 3 ' -monofosfato cíclico (cAMP) , se puede incorporar, además, en el medio de fermentación.

Los intervalos de pH adecuados para la fermentación son entre pH 5.0 y pH 9.0, en donde se prefiere el pH de 6.0 a 8.0 para la condición inicial. Los intervalos adecuados de pH para la fermentación de levadura se encuentran, típicamente, entre aproximadamente pH 3.0 a aproximadamente pH 9.0. En una modalidad, se usa de aproximadamente un pH de 5.0 a aproximadamente un pH de 8.0 para la condición inicial. Los intervalos adecuados de pH para la fermentación de otros microorganismos se encuentran entre aproximadamente pH 3.0 a aproximadamente pH 7.5. En una modalidad, se usa de aproximadamente un pH de 4.5 a aproximadamente un pH de 6.5 para la condición inicial.

Las fermentaciones pueden realizarse en condiciones aerobias o anaerobias. En una modalidad, se usan condiciones anaerobias o microaerobias para la fermentación.

Fermentaciones industriales continuas y discontinuas Los procesos presentes pueden usar un método discontinuo de fermentación. Una fermentación discontinua clásica es un sistema cerrado en donde la composición del medio se define al comienzo de la fermentación y no está sujeta a alteraciones artificiales durante la fermentación. Por lo tanto, al inicio de la fermentación el medio se inocula con el microorganismo o microorganismos deseados, y se permite que la fermentación ocurra sin agregar nada al sistema. Sin embargo, típicamente, una fermentación "discontinua" es discontinua con respecto a la adición de la fuente de carbono y a menudo se hacen intentos para controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. En sistemas discontinuos, las composiciones de biomasa y metabolito del sistema cambian constantemente hasta el momento que se detiene la fermentación. Dentro de los cultivos discontinuos las células se moderan a través de una fase de retardo estático hasta una fase logarítmica de crecimiento alto para terminar con una fase estacionaria, en donde la velocidad de crecimiento disminuye o se interrumpe. Si no están tratadas, las células de la fase estacionaria, finalmente, morirán. Las células de la fase logarítmica son responsables, generalmente, de la producción en masa del producto final o intermedio .

Una variación de sistema de lotes estándar es el sistema de alimentación-lote (Fed-Batch) . Los procesos de fermentación de alimentación- lote también son adecuados en la presente descripción y comprenden un sistema de lotes típico con la excepción de que se agrega al sustrato en incremento conforme avanza la fermentación. Los sistemas semicontinuos son útiles cuando la represión por catabolito es apta para inhibir el metabolismo de las células y en donde se prefiere tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. Es difícil determinar la concentración actual del sustrato en los sistemas de alimentación por lotes y, por lo tanto, se calcula sobre la base de los cambios de factores mensurables, tales como el pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de los gases de residuos, tales como C02. Las fermentaciones discontinuas y semicontinuas son comunes y muy conocidas en la técnica y se pueden encontrar ejemplos en Thomas D. Brock in Biotechnology : A Textbook of Industrial Microbiology, Segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, o Deshpande, Mukund (Appl . Biochem. Biotechnol., 36: 227, 1992), que se incorporan como referencia en la presente descripción .

Aunque la presente invención se lleva a cabo en el modo de lotes, se contempla que el método puede ser adaptado para métodos de fermentación continua. La fermentación continua es un sistema abierto, en donde un medio de fermentación definido se agrega, continuamente, a un bioreactor y se extrae, simultáneamente, una cantidad igual de medio acondicionado para procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una densidad elevada constante en las que las células están principalmente en la fase de crecimiento logarítmica.

La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afecten el crecimiento celular o concentración del producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno, a una concentración fija y permitirá que se moderen todos los demás parámetros. En otros sistemas se puede alterar de manera continua diversos factores que afectan el crecimiento, mientras se mantiene constante la concentración celular, determinada por la turbidez del medio. Los sistemas continuos se esfuerzan por mantener condiciones de crecimiento estables y, por lo tanto, la pérdida celular debida al medio que se extrae debe equilibrarse contra la velocidad de crecimiento celular en la fermentación. Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua, así como las técnicas para maximizar la velocidad de la formación del producto, son muy conocidos en la técnica de la microbiología industrial y se detalla una variedad de métodos en Brock, supra.

Se contempla que la presente invención se puede llevar a la práctica por medio del uso de procesos discontinuos, de alimentación por lotes o continuos, y que cualquier modo conocido de fermentación puede ser adecuado. Además, se contempla que las células pueden inmovilizarse sobre un sustrato como catalizadores de células enteras y someterse a condiciones de fermentación para la producción de isobutanol. Métodos para aislar el butanol del medio de fermentación El butanol producido biológicamente puede aislarse del medio de fermentación con el uso de métodos conocidos en la técnica para fermentaciones ABE (ver, por ej mplo, Durre, Appl . Microbiol. Biotechnol . 45:639-648 (1998), Groot et al., Process . Biochem. 27:61-27 (1992) y las referencias allí contenidas. Por ejemplo, los sólidos pueden extraerse del medio de fermentación por centrifugación, filtración, decantación o similares. Después, el butanol se puede aislar del medio de fermentación con el uso de métodos tales como destilación, destilación azeotrópica, extracción líquido-líquido, adsorción, arrastre con gas, evaporación de membrana o pervaporación .

Dado que el butanol forma una mezcla azeotrópica con agua y de bajo punto de ebullición, puede usarse la destilación para separar la mezcla hasta su composición azeotrópica. La destilación puede usarse en combinación con otro método de separación para obtener la separación alrededor del azeotropo. Los métodos que pueden usarse en combinación con la destilación para aislar y purificar el butanol incluyen, pero no se limitan a, decantación, extracción líquido-líquido, adsorción y técnicas basadas en membranas. Además, el butanol puede aislarse con el uso de destilación azeotrópica al usar un arrastrante (ver, por ejemplo, Doherty y Malone, Conceptual Design of Distillation Systems, McGraw Hill, New York, 2001) .

La mezcla de butanol-agua forma un azeotropo heterogéneo para que la destilación pueda usarse en combinación con la decantación para aislar y purificar el butanol. En este método, el butanol que contiene el caldo de fermentación se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica. Después, se condensa la mezcla azeotrópica, y el butanol se separa del medio de fermentación por decantación. La fase acuosa decantada puede retornarse a la primera columna de destilación como reflujo. La fase orgánica decantada rica en butanol puede purificarse aún más por destilación en una segunda columna de destilación.

Además, el butanol puede aislarse del medio de fermentación mediante el uso de la extracción líquido- líquido en combinación con destilación. En este método, el butanol se extrae del caldo de fermentación mediante el uso de una extracción líquido- líquido con un solvente adecuado. Después, la fase orgánica que contiene butanol se destila para separar el butanol del solvente.

La destilación en combinación con la adsorción puede usarse, además, para aislar butanol de un medio de fermentación. En este método, el caldo de fermentación que contiene el butanol se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica y, después, el agua restante se elimina con el uso de un adsorbente, tal como tamices moleculares (Aden et al., Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover, Report NREL/TP-510-32438 , National Renewable Energy Laboratory, junio 2002) .

Adicionalmente , puede usarse la destilación en combinación con pervaporación para aislar y purificar el butanol del medio de fermentación. En este método, el caldo de fermentación que contiene butanol se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica y, después, el agua restante se extrae por pervaporacion a través de una membrana hidrofílica (Guo et al., J. Membr. Sci. 245, 199-210 (2004)).

La sustracción in situ de producto (ISPR, por sus siglas en inglés) (también llamada fermentación extractiva) se puede usar para eliminar el butanol (u otro alcohol fermentable) del recipiente de fermentación a medida que se produce, para permitir que el microorganismo produzca butanol en grandes cantidades Un método de ISPR para extraer el alcohol fermentativo que se ha descrito en la técnica es la extracción líquido-líquido. Generalmente, en relación con la fermentación de butanol, por ejemplo, el medio de fermentación, que incluye el microorganismo, se pone en contacto con un agente extractante orgánico antes de que la concentración de butanol alcance un nivel tóxico. El extractante orgánico y el medio de fermentación forman una mezcla bifásica. El butanol se divide en la fase del agente extractante orgánico y, de esta manera, se reduce la concentración en la fase acuosa que contiene el microorganismo, por lo que se limita la exposición del microorganismo al butanol inhibitorio.

La extracción líquido-líquido puede realizarse, por ejemplo, de conformidad con los procesos descritos en la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370, cuya descripción se incorpora en la presente descripción en su totalidad. La publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305370 describe métodos para producir y recuperar butanol de un caldo de fermentación con el uso de extracción líquido-líquido; los métodos comprenden la etapa de poner el caldo de fermentación en contacto con un extractante inmiscible en agua para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica. Típicamente, el agente extractante puede ser un agente extractante orgánico seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de C12 a C22, esteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22 saturados, monoinsaturados o poliinsaturados (y mezclas de estos) , y mezclas de estos . Los agentes extractantes para ISP pueden ser agentes extractantes no alcohólicos. El agente extractante ISPR puede ser un agente extractante orgánico exógeno, tales como alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol estearílico, 1-undecanol, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, undecanal, aldehido láurico, 20-metilundecanal , y mezclas de estos.

En algunas modalidades, el éster puede formarse al poner el alcohol en contacto con un medio de fermentación con un ácido carboxílico (por ejemplo, ácidos grasos) y un catalizador con la capacidad de esterificar el alcohol con el ácido carboxílico, como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. WO/2011/159998 , que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad. En tales modalidades, el ácido carboxílico puede funcionar como un extractante de ISPR en los que se dividen los ésteres de alcohol . El ácido carboxílico puede suministrarse en el recipiente de fermentación y/o derivarse de la biomasa que proporciona la carga de carbono fermentable en el recipiente de fermentación. Los lípidos presentes en la materia prima se pueden hidrolizar catalíticamente a ácido carboxílico y el mismo catalizador (por ejemplo, enzimas) puede esterificar el ácido carboxílico con el alcohol. El catalizador puede suministrarse a la materia prima antes de la fermentación, o puede suministrarse en el recipiente de fermentación antes o al mismo tiempo que la materia prima. Cuando el catalizador se suministra en el recipiente de fermentación, los ésteres de alcohol pueden obtenerse por hidrólisis de los lípidos en ácido carboxílico y la esterificación prácticamente simultánea del ácido carboxílico con el butanol presente en el recipiente de fermentación. El ácido carboxílico y/o aceite natural no derivado de la materia prima puede suministrarse, además, al recipiente de fermentación, con el aceite natural que se hidroliza en ácido carboxílico. Cualquier ácido carboxílico no esterificado con el alcohol puede servir como parte del agente extractante ISP . El extractante que contiene ásteres de alcohol puede separarse del medio de fermentación y el alcohol puede recuperarse del extractante. El extractante se puede reciclar al recipiente de fermentación. Por lo tanto, en el caso de la producción de butanol, la conversión del butanol en un éster puede reducir la concentración de butanol libre en el medio de fermentación, lo que protege al microorganismo del efecto tóxico de aumentar la concentración de butanol. Además, el grano sin fraccionar puede usarse allí como materia prima sin separación de lípidos, ya que los lípidos se pueden hidrolizar catalíticamente a ácido carboxílico y, por lo tanto, se reduce la velocidad de acumulación de lípidos en el extractante para ISPR.

La sustracción in situ de producto puede realizarse en un modo discontinuo o continuo. En un modo continuo de sustracción in situ de producto, el producto se elimina continuamente del reactor. En un modo discontinuo de la sustracción in situ de producto, se agrega un volumen de extractante orgánico en el recipiente de fermentación y el agente extractante no se elimina durante el proceso. Para la sustracción in situ de producto, el extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación al inicio de la fermentación y forma un medio de fermentación bifásico. Alternativamente, el agente extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación después de que el microorganismo ha alcanzado la cantidad deseada de crecimiento, que se puede determinar al medir la densidad óptica del cultivo. Además, el extractante orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación en un momento en el cual el nivel del producto de alcohol en el medio de fermentación alcanza un nivel preseleccionado. En el caso de la producción de butanol de conformidad con las modalidades de la presente invención, el agente extractante de ácido carboxílico puede entrar en contacto con el medio de fermentación en un momento antes que la concentración de butanol alcance un nivel tóxico, de manera de esterificar el butanol con el ácido carboxílico para producir esteres de butanol y, consecuentemente, reducir la concentración de butanol en el recipiente de fermentación. Posteriormente, la fase orgánica que contiene éster puede extraerse del recipiente de fermentación (y separarse del caldo de fermentación que constituye la fase acuosa) después de alcanzar un título efectivo deseado de butanol. En algunas modalidades, la fase orgánica que contiene éster se separa de la fase acuosa una vez que la fermentación del azúcar fermentable disponible en el recipiente de fermentación prácticamente se haya completado.

EJEMPLOS La presente invención se define más detalladamente a través de los siguientes ejemplos. Debe entenderse que si bien estos ejemplos indican modalidades preferidas de la invención, éstos se proporcionan con fines ilustrativos únicamente. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, aquellos con experiencia en la técnica pueden determinar las características esenciales de esta invención y, sin apartarse del espíritu ni del alcance de esta, podrán hacer varios cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones.

Métodos generales : Las técnicas estándar de clonación molecular y ADN recombinante usadas en los ejemplos son muy conocidas en la técnica y se describen en Sambrook, J. , Fritsch, E. F. y Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989, en T. J. Silhavy, M. L . Bennan, y L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1984, y en Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and iley- Interscience , N.Y., 1987.

Además, los materiales y métodos adecuados para- el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos son muy conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas para usar en los siguientes ejemplos pueden encontrarse en Manual of Methods for General Bacteriology, Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, eds . , American Society for Microbiology, Washington, DC., 1994, o por Thomas D. Brock in Biotechnolog : A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, 1989. Todos los reactivos, enzimas de restricción y materiales usados para el crecimiento y mantenimiento de células bacterianas se obtuvieron a través de Aldrich Chemicals (Milwaukee, WI) , BD Diagnostic Systems (Sparks, MD) , Life Technologies (Rockville, MD) , o Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) , a menos que se indique de cualquier otra, forma.

El significado de las abreviaturas usadas es el siguiente: "Á" significa angstrom, "min" significa minuto (s), "h" significa hora(s), "µ?" significa microlitro (s) , "ng/µ?" significa nanogramo por microlitro, "pmol/µ?" significa picomol por microlitro, "mi" significa mililitro (s) , "1" significa litro(s), "g/1" significa gramo por litro, "ng" significa nanogramo, "s" significa segundo(s), "ml/min" significa mililitro por minuto(s), "w/v" significa peso por volumen, "v/v" significa volumen por volumen, "nm" significa nanómetro (s) , "mm" significa milímetro (s) , "cm" significa centímetro (s) , "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "g" significa gramo(s), " g" significa microgramo (s) , "mg" significa miligramo (s) , "g" significa la constante de gravitación, "rpm" significa revoluciones por minuto, "HPLC" significa cromatografía de líquidos de alto rendimiento, "MS" significa espectrometría de masas, "HPLC/MS" significa cromatografía de líquidos de alto rendimiento/espectrometría de masas, "EDTA" significa ácido etilendiamino tetraacético, "dNTP" significa desoxinucleótido trifosfato, «©c significa grados Celsius y "V" significa voltaje.

Ensayo de evaluación de productividad alta de bibliotecas de genes La evaluación de productividad alta de las bibliotecas de genes de enzimas KARI mutantes se llevó a cabo como se describe en la presente descripción (con la excepción de los Ejemplos 16 y 21) : Se preparó lOx de medio de congelación que contiene 554.4 g/1 de glicerol, (NH4)2S04 68 mM, MgS04 4 mM, citrato sódico 17 mM, KH2P04132 mM, K2HP04 36 mM con agua pura molecular y esterilizada con filtro. El medio de congelación se preparó al diluir el medio de congelación lOx con el medio LB . Se usó una alícuota (200 µ?) del medio de congelación para cada pocilio de las placas del archivo de 96 pocilios (catálogo núm. 3370, Corning Inc. Corning, NY) .

Los clones de las placas de agar se seleccionaron y se inocularon en las placas del archivo de 96 pocilios que contienen el medio de congelación y se cultivaron durante la noche a 37 °C sin agitación. Después, las placas del archivo se almacenaron a -80 °C. La cepa Bw25113 de E. coli transformada con pBAD-HisB (Invitrogen) se usó siempre como el control negativo. Los controles positivos para las bibliotecas en los Ejemplos 3, 4 y 5 son KARI K9, AB1D3, AB1D3 silvestres, respectivamente.

Los clones de las placas del archivo se inocularon en las placas de 96 pocilios profundos. Cada pocilio contenía 3.0 µ? de células de placas del archivo descongeladas, 200 µ? del medio LB que contiene 100 ug/ml de ampicilina y arabinosa al 0.02 % (w/v) como un inductor. Después, las células se cultivaron durante la noche a 37 °C con 80 % de humedad con agitación (900 rpm) , se recolectaron por centrifugación (4000 rpm, 5 min a 25 °C) . (Eppendorf centrifuge, Brinkmann Instruments, Inc. Westbury, NY) y el comprimido celular se almacenó a -20 °C para el análisis posterior.

El sustrato del ensayo, {R, S) -acetolactato, se sintetizó como lo describen Aulabaugh and Schloss (Aulabaugh and Schloss, Biochemistry, 29: 2824-2830, 1990) . Todas las otras sustancias químicas usadas en el ensayo se adquirieron de Sigma .

Después de la conversión enzimática de acetolactato a a, ß-dihidroxi-isovalerato por KARI se determinó la desaparición del cofactor, NADPH o NADH de la reacción a 340 nm con el uso de un lector de placas (Molecular Device, Sunnyvale, CA) . La actividad se calculó con el uso del coeficiente de extinción molar de 6220 M^cm"1 ya sea para NADPH o para NADH. Las soluciones base usadas fueron: K2HP04 (0.2 M) ; KH2P04 (0.2 M) ; EDTA (0.5 M) ; MgCl2 (1.0 M) ; NADPH (2.0 mM) ; NADH (2.0 mM) y acetolactato (45 mM) . El regulador de reacción de 100 mi (pH 6.8) contenía: Se preparó 2.0 mi de K2HP04, 3.0 mi de KH2P04, 4.0 mi de MgCl2, 0.1 mi de EDTA y 90.9 mi de agua.

El comprimido celular congelado en placas de pocilios profundos y BugBuster se calentaron a temperatura ambiente durante 30 min al mismo tiempo. Cada pocilio de las placas de ensayo de 96 pocilios se llenó con 120 µ? del regulador de reacción y 20 µ? de NADH (2.0 mM) . Se agregó 75 µ? de BugBuster al 50 % (v/v en agua) en cada pocilio después de calentar 30 min y las células se suspendieron con el uso de un agitador de placas. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 min. Una alícuota (de 15 a 25 µ? según la actividad esperada) de lisado celular se trasladó en cada pocilio de las placas de ensayo de 96 pocilios. La absorbancia a 340 nm se registró como valor inicial, se agregó 16 µ? de acetolactato (4.5 mM, diluido con el regulador de reacción) en cada pocilio y se mezcló con agitación del lector de placas. La absorbancia a 340 nm se registró a 0 y de 10 a 30 minutos según la actividad esperada después de agregar el sustrato. La diferencia en la absorbancia (antes y después de agregar el sustrato) se usó para determinar la actividad de los mutantes. Los mutantes con una actividad de KARI mayor en comparación con el control positivo se seleccionaron para otra evaluación.

La cantidad de clones evaluados para las bibliotecas en los Ejemplos 1, 2 y 3 son de aproximadamente 12,000, 12,000 y 92, respectivamente. Los mejores ejecutantes de cada biblioteca se evaluaron nuevamente como se describe a continuación como ensayo secundario.

Ensayo secundario de mutantes activos Las células que contienen los mutantes seleccionados identificados por medio de la evaluación de productividad alta (descrita anteriormente) se cultivaron durante la noche a 37 °C, en 3.0 mi del medio LB que contiene 100 ug/ml de ampicilina y arabinosa al 0.025 % (w/v) como un inductor con agitación a 250 rpm. Después, las células se repartieron en alícuotas en placas de 96 pocilios profundos (200 µ? por pocilio) y se recolectaron por centrifugación a 4,000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Se agregó 75 µ? de BugBuster al 50 % (v/v en agua) en cada pocilio y las células se suspendieron con el uso de un agitador de placas. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 20 min. Una alícuota (de 15 a 25 µ? según la actividad esperada) de lisado celular se trasladó en cada pocilio de las placas de ensayo de 96 pocilios, que contienen 120 µ? del regulador de reacción y 20 µ? de NADH (2.0 mM) por pocilio. La absorbancia a 340 nm se registró como valor inicial, se agregó 16 µ? de acetolactato (4.5 mM, diluido con el regulador de reacción) en cada pocilio y se mezcló con agitación del lector de placas. La absorbancia a 340 nm se registró a 0, y de 5 a 10 minutos según la actividad esperada después de agregar el sustrato. La diferencia en la absorbancia (antes y después de agregar el sustrato) se usó para determinar la actividad de los mutantes. Los mutantes con actividad de KARI mayor en comparación con el control positivo se seleccionaron para otra caracterización.

Medición de la constante de Michaelis de NADH y NADPH La actividad de la enzima KARI se puede determinar rutinariamente por oxidación de NADH o NADPH, como se describió anteriormente; sin embargo, para determinar la constante de Michaelis (KM) para estos nucleótidos de piridina, la formación del producto de 2,3-dihidroxiisovalerato se determinó directamente con el uso de HPLC/MS .

La concentración proteica del extracto celular crudo de células lisadas de Bugbuster (como se describió anteriormente) se determinó con el uso del reactivo de ensayo de proteínas BioRad (BioRad Laboratories, Inc., Hercules, CA 94547). Entre 0.2 y 1.0 microgramos de proteína de extracto crudo se agregaron en un regulador de reacción que consiste en MOPS KOH 100 mM, pH 6.8, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM, glucosa- 6 - fosfato 1 mM (Sigma-Aldrich) , 0.2 unidades de glucosa- 6 - fosfato deshidrogenasa de Leuconostoc mesenteroides (Sigma-Aldrich) y varias concentraciones de NADH o NADPH, hasta un volumen de 90 µ? . La reacción se inició por la adición de 10 µ? de [S] - acetolactato hasta una concentración final de 2.5 mM y un volumen final de 100 µ? . Después de incubaciones de 10 min a 30 °C, la reacción se templó al retirar 50 µ? de la mezcla de reacción y agregarla a 150 µ? de ácido fórmico al 0.1 %. Para determinar la KM de NADH y de NADPH, las concentraciones usadas fueron 0.0003, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3 y l mM.

Para analizar para 2 , 3 -dihidroxi i sovalerato , se inyectó 2 µ? de la mezcla de reacción templada con ácido fórmico en Waters Acquity HPLC equipado con espectrómetro de masas Waters SQD (Waters Corporation, Milford, MA) . Las condiciones de cromatografía fueron: velocidad de flujo ( 0.5 ' ml/min) , en una columna Waters Acquity HSS T3 (2.1 mm de diámetro, 100 mm de longitud) . El regulador A consistió en 0.1 % (v/v) en agua, el regulador B era ácido fórmico al 0.1 % en acetoni tri lo . La muestra se analizó con el uso de regulador B al 1 % (en regulador A) durante 1 min, seguido por un gradiente lineal de regulador B al 1 % en el min 1 hasta regulador B al 75 % en el min. 1.5. El producto de reacción, 2 , 3 -dihidroxi iso-valerato , se detectó por ionización a m/z=133, con el uso de ionización por electroaspersión con voltaje con cono de -30 V. La cantidad de producto 2 , 3 -dihidroxi isovalerato se calculó por comparación con un estándar auténtico.

Para calcular la KM para NADH y para NADPH, los datos de velocidad para la formación de DHIV determinados en ensayos a una concentración fija de S-acetolactato (2.5 mM) se ajustó a la ecuación de Michaelis-Menten de un solo sustrato, con el uso de una regresión por mínimos cuadrados en Microsoft Excel, suponiendo la saturación de la concentración de acetolactato .

La construcción de plásmidos pYZ058, pLH550, pLH556 y pLH702 pYZ058 (pHR81-Pcupi-AlsS-PiLV5-KARI de levadura; sec. con núm. de ident . : 176) se derivó de pYZ090 (pHR81-PCupi-AlsS- ? PiLV5-KARI de lactis; sec. con núm. de ident.: 195). pYZ090 se cortó con las enzimas Pmel y Sfil y se ligó con un producto de PCR de KARI de levadura. El producto de PCR se amplificó de ADN genómico de la cepa BY47 1 deSaccharomyces cerevisiae (Research Genetics Inc.) con el uso de cebador superior 5'-catcatcacagtttaaacagtatgttgaagcaaatcaacttcggtgg-3 ' (sec. con núm. de ident.: 272) y el cebador inferior 5'-ggacgggccctgcaggccttattggttttctggtctcaactttctgac-31 (sec. con núm. de ident.: 273) y se digirió con las enzimas Pmel y Sfil. pYZ058 se confirmó por secuenciación . pLH550 (pHR81-PCUP1-AlsS-PILV5 -Pf5. KARI , sec. con núm. de ident.: 175) se derivó de pYZ058 (sec. con núm. de ident.: 176) . El gen de KARI Pf5 silvestre se amplificó por PCR con OT1349 (5'-catcatcacagtttaaacagtatgaaagttttctacgataaagactgcgacc-3 ' ; sec. con núm. de ident.: 177) y OT1318 (5'-gcacttgataggcctgcagggccttagttcttggctttgtcgacgattttg-31 ; sec. con núm. de ident.: 178), se digirió con las enzimas Pmel y Sfil y se ligó con el vector pYZ058, se cortó con Pmel y Sfil. El vector generado, pLH550, se confirmó por secuenciación. pLH556 (sec. con núm. de ident.: 138; Figura 4) se derivó de pLH550 al digerir el vector con las enzimas Spel y Notl, y se ligó con un conector cruzado de OT1383 (5'-ctagtcaccggtggc-3 ' , sec. con núm. de ident.: 179) y OT1384 (5 ' -ggccgccaccggtga-31 , sec. con núm. de ident.: 180) que contiene secuencias salientes para sitios Spel y Notl. La etapa de clonación elimina el gen AlsS y un fragmento grande del promotor PCUP1, con una secuencia dirección 5' residual de 160 pb que no es funcional. pLH556 se confirmó por secuenciación. pHR81 : : ILV5p-K9D3 (pLH702, sec . con núm. de ident . : 181) se derivó de pLH556. El gen de KARI mutante de K9D3 se eliminó del vector pBAD-K9D3 con el uso de las enzimas Pmel y Sfil y se ligó con pLH556 en los sitios Pmel y Sfil, para reemplazar el gen KARI de Pf5 con el gen K9D3. El vector construido se confirmó por secuenciación.

Ejemplo 1 Construcción de cepas de la ruta de isobutanol de levadura que contienen diversos genes KARI Para identificar los polipéptidos que tienen actividad de KARI y el rendimiento en la producción de isobutanol de levadura, se llevó a cabo la evaluación de biodiversidad de genes que codifican KARI a partir de diversas especies bacterianas y fúngicas . Los genes KARI se optimizaron por codones en base a las preferencias codónicas de los genes de Saccharomyces cerevisiae , en donde se indica en la Tabla 10. Para cada gen KARI, se agregó un sitio de restricción Pmel y 3 pb (AGT) adicionales en el extremo 5 ' con la secuencia 51 -GTTTAAACAGT - 3 ' (sec. con núm. de ident. : 136) antes del codón de inicio ATG y se agregó un sitio de restricción Sfil en el extremo 3' con la secuencia 51 -GGCCCTGCAGGCC- 3 ' (sec. con núm. de ident. : 137) . Todos los genes KARI fueron sintetizados por GenScript USA Inc. (Piscataway, NJ) . Cada gen KARI se subclonó en el vector pHR81-Pcupi- AlsS-P v5-Pf5. Ilv5 (sec. con núm. de ident . : 175) por medio de los sitios Pmel y Sfil (Ilv5 codifica para cetol-ácido reductoisomerasa de levadura) . Este vector contiene dos casetes de expresión: El gen de acetolactato sintasa (AlsS) de Bacillus subtilis bajo el promotor CUP1 de levadura y el gen Ilv5 de levadura controlado por el promotor Ilv5. Se realizó un análisis de secuencias para confirmar las secuencias del gen KARI .

Los vectores de KARI pHR81-PCUPl-AlsS-PIiv5 que portan los genes KARI se cotransformaron con pLH468 (pRS423 -PFBAI- DHAD- rDH3~k vD-PGEMi-hADHl ; sec. con num. de ident. : 139) en la cepa huésped BP1135 (PNY1505; Ejemplo 8) (CEN.pk 113-7D delta ura3::loxP delta his3 delta pdc6 delta pdcl : : ilvD . Sm delta pdc5::sadB delta gpd2 : : loxP delta fra2). Los transformantes de levadura se seleccionaron en placas de medio selectivo mínimo (SE-Ura-His, etanol al 2 %) después de 5-7 días a 30 °C, y se rayaron otra vez para transferirlos en SE-Ura-His para obtener parches celulares después de una incubación de 3 días más. Los parches celulares se usaron para la inoculación en matraz de agitación.

Ejemplo 2 Evaluación de la recolección de diversidad de KARI para la producción de isobutanol Los diversos genes KARI se evaluaron según sus "produc ividades efectivas" en levadura. La productividad efectiva se determinó después de cierto período de crecimiento en condiciones de oxígeno progresivamente limitadas (por ejemplo 48 h) . La biomasa de levadura se calculó asumiendo que 1 OD60o de células de levadura es equivalente a 0.3 g/1.

Las cepas de la ruta de isobutanol de levadura que portan diversos genes KARI se inocularon en 10 mi de medio de SEG-Ura,His con glucosa al 0.2 % y etanol al 0.2 % y se cultivaron aerobiamente durante la noche a 30 °C, a aproximadamente 2 OD . Los cultivos se centrifugaron y una porción de las células se resuspendió en SEG-Ura,His (glucosa al 2 %, etanol al 1 %) hasta una ODSOo inicial de 0.4 en 25 mi de volumen total en un matraz de agitación de 125 mi. Los matraces de agitación se cerraron con una tapa de plástico sólido de rosca y los cultivos se cultivaron en condiciones de oxígeno progresivamente limitadas en el matraz con intercambio mínimo de aire y oxígeno con el ambiente externo. Después de 48 h de incubación a 30 °C, 250 RPM, los cultivos se eliminaron para una medición de OD6oo y análisis de HPLC para determinar la producción de isobutanol .

A partir de los genes KARI evaluados, tal como se muestra a continuación, varios tuvieron títulos de isobutanol comparables o mejores que KARI de Lactococcus lactis . Particularmente, el clon de KARI de K9 (DSM 14662 de Anaerostipes caccae) mostró un título de isobutanol alto y una productividad de isobutanol efectiva, como se determinó después de 48 h de crecimiento en condiciones de oxígeno progresivamente limitadas (Tabla 10) .

Tabla 10. Títulos de isobutanol y productividades efectivas a partir de cepas de producción de isobutanol de levadura que portan varios genes KARI que se determinaron después de 48 h de crecimiento en condiciones de oxígeno progresivamente en matraces de agitación a 30°C.

Ejemplo 3 Análisis de enzimas KARI de las cepas de la ruta de isobutanol de levadura IpOHA (ácido N-isopropil oxalilhidroxámico) es una imitación de un intermedio de reacción para la reacción catalizada por la enzima KARI. Es un inhibidor de unión fuerte que se une al sitio activo de la enzima KARI. La síntesis de IpOHA y su unión fuerte a KARI de E. coli se describe en la literatura (A. Aulabaugh and J. V. Schloss, Biochemistry, 1990, 29, 2824-2830). Su uso para valorar el sitio activo aún no se ha reportado. IpOHA se sintetizó de [14C] -oxalato de acuerdo con literatura.

Los cultivos de levadura del Ejemplo 2 se recolectaron y se analizaron para actividades de enzimas KARI . 25 mi de los cultivos se comprimieron y se resuspendieron en 10 mi de Tris-HCl 50 mM, pH 7.5. Las células se centrifugaron nuevamente para eliminar el regulador y los comprimidos celulares se almacenan a -70 °C. Los comprimidos celulares se resuspendieron en 1 mi de Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, y se sometieron a ultrasonido. Se usó extractos celulares crudos solubles para realizar los ensayos de enzimas. Una porción de enzimas se incubó con un exceso molar de [14C] -IpOHA y concentraciones de saturación de NAD(P)H y Mg2+ . Dado que, primero, se forma un complejo reversible, sensible a la dilución, las concentraciones de extracto se conservaron altas para favorecer la complejación y, por lo tanto, reducir el tiempo que toma la formación fuertemente compleja. Dado que no se sabía desde antes cuánto tiempo tomaría cada KARI en formar el complejo fuerte, se tomó dos momentos específicos para cada muestra para verificar que los resultados coinciden. Al terminar el tiempo de incubación, se separó moléculas pequeñas de las moléculas de proteína por ultrafiltración con el uso de Microcon® (Millipore Inc., Billerica, MA) y se contó la fracción de peso molecular alto. La concentración de KARI en la muestra ya sea en µ? o mg/ml se dedujo de 1 C dpm, los volúmenes y el peso molecular de las subunidades de KARI. Simultáneamente, se llevó a cabo un ensayo de enzimas de tiempo definido, y los datos se usaron para calcular U/ml . La actividad específica se calculó al dividir U/ml por mg/ml para una muestra específica. La suposición creada consistía en que la actividad completa y la capacidad de unir IpOHA están estrictamente correlacionadas. Por lo tanto, las actividades específicas de las enzimas KARI determinadas se enumeran en la Tabla 11. La actividad de KARI en "unidades por mg" representa la actividad por miligramo de enzima KARI según el ensayo de IpOHA. La concentración proteica total se determinó por el método de Bradford y el nivel de expresión de KARI se calcula al dividir la cantidad de enzimas KARI por la cantidad de proteínas celulares solubles totales.

Tabla 11. Actividades de enzimas KARI según el ensayo de IPOHA Ejemplo 4 Construcción de una biblioteca de genes de saturación de sitio para identificar las variantes que usan NADH con una ¾ menor que el tipo silvestre Para construir el vector de expresión bacteriana a base de pBAD para KARI K9 , el gen KARI K9 (sintetizado por Genscript, Piscataway, NJ) se subclonó en el vector pBAD-ps-JEA1 (sec. con núm. de ident . : 905) por medio de los sitios Pmel y Sfil. La cetol-ácido reductoisomerasa (KARI) de Anaerostipes caccae (llamada KARI K9) se usó para la construcción de la biblioteca. Una biblioteca de genes se construyó con el uso de de kits disponibles comercialmente , T4 polinucleótido cinasa (PNK) (USB Corporation, Cleveland, Ohio, núm. 70031Z) y el kit de mutagénesis sitio dirigida de mutaciones múltiples Chang_IT (USB Corporation, Cleveland, Ohio, núm. 78480) .

Los oligonucleótidos (K9_56_58_060210f : GAAGGANNKAAANNKTGGAAGAGAGC, sec. con núm. de ident . : 144; y K9_56_58_060210r : GCTCTCTTCCAMNNTTTMNNTCCTTC, sec. con núm. de ident.: 145) fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville IA) . Primero, se fosforizaron por T4 PNK. En resumen, una mezcla de reacción de 30 µ? contenía: 3.0 µ? de regulador T4 PNK lOx suministrado con el kit, 4.0 µ? de cebador (aproximadamente 35 µ?) , 0.8 µ? de mezcla de ATP 100 mM, 0.6 µ? de T4 PNk y 22 µ? de agua. La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 1.0 h y, después, se desactivó el T4 PNK a 65 °C durante 20 min.

Después, los cebadores fosforizados se usaron directamente para la reacción de PCR posterior para introducir las mutaciones en dos sitios en KARI K9 silvestre con el uso del kit. En resumen, una mezcla de reacción de 30 µ? contenía: 3.0 µ? de regulador de reacción lOx suministrado con el kit, 3.0 µ? de cebador directo e cebador inverso fosforizados, 2.0 µ? de KARI K9 silvestre (50 ng/µ?) , 1.2 µ? de enzima Chang_IT y 17.8 µ? de agua. Esta mezcla de reacción se colocó en tubos de PCR de 200 µ? de capacidad, de cavidad fina y se usó el siguiente programa de reacción de PCR para la PCR: La temperatura inicial era de 95 °C durante 2 min, seguido por 30 ciclos de calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consistía en 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 68 °C durante 20 min. Al terminar el ciclo de temperatura, las muestras se mantuvieron a 68 °C durante 25 min más y, después, se mantuvieron a 4 °C durante el procesamiento posterior. La reacción de PCR se limpió con el uso del kit de limpieza de ADN Zymo (Zymo Research Corporation, Orange CA, núm. D4004) . El ADN se lavó de la membrana con el uso de 84 µ? de agua. La plantilla de ADN se eliminó con Dpn I (Promega, Madison I , núm. R6231) a 37 °C durante 3 h (mezcla de reacción: 10 µ? de regulador de reacción lOx, 1.0 µ? de BSA, 6.0 µ? de Dpn I y 83 µ? ADN limpio de PCR) . El ADN digerido con Dpn I se limpió nuevamente con el kit de limpieza de ADN Zymo y se digirió nuevamente con Dpn I para eliminar completamente la plantilla de ADN (mezcla de reacción: 1.5 µ? de regulador de reacción lOx, 0.15 µ? de BSA, 0.85 µ? de Dpn I y 83 µ? de ADN limpio de PCR) . La mezcla de reacción se usó directamente para transformar una cepa electro-competente de Bw25113 de E. coli ( ilvC) (que se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 8,129,162, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad) con el uso de BioRad Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA) . Los clones transformados se colocaron en estrías en placas de agar que contienen el medio LB y 100 xg/ml de ampicilina (catálogo núm. L1004, Teknova Inc. Hollister, CA) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Los clones se evaluaron para analizar la actividad con el uso de NADH. Se determinó la KM para las variantes (Tabla 12) .

Tabla 12 Valores cinéticos para las variantes de KARI K9 en los extractos de E. coli, según los ensayos de formación de DHIV Ejemplo 5 Construcción de bibliotecas de genes de saturación del sitio para reducir la KM para NADH En base al trabajo con Pseudomonas fluorescens las posiciones de KARI (KARI PF5) 24, 33, 61, 80, 156 y 170 fueron el objetivo de la mutagénesis para KARI K9. A través del alineamiento de múltiples secuencias (MSA portan varios genes KARI que se determinaron después de 48 h de crecimiento en condiciones de oxígeno progresivamente en matraces de agitación a 30 °C.) entre KARI PF5 y KARI K9 (Figura 2) , las posiciones correspondientes son 30, 39, 67, 86, 162 y 176.

Para identificar más objetivos de mutagénesis, el MSA de las enzimas KARI existentes (Kl, K2 , K7 , K9 , K25, K26, L .

Lactis y S2), determinadas para producir isobutanol en una cepa de butanologen (ver otros ejemplos) se usó para identificar más objetivos de mutagénesis. Las posiciones 41, 87, 131, 191, 227 y 246 se seleccionaron como objetivos de mutagénesis .

Los oligonucleótidos dirigidos para las posiciones 30, 39, 41, 67, 86, 87, 131, 162, 176, 191, 227 y 246 fueron sintetizados comercialmente por Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville IA) (Tabla 13) . Se usó ocho pares de oligonucleót.idos dirigidos para las posiciones 30, 67, 131, 162, 176, 191, 227 y 246 para generar Megaprimers con el uso de Supermix de Invitrogen (catálogo núm. 10572-014, Invitrogen, Carlsbad, CA) . Para cada reacción de PCR, se usó un par de cebadores, cualquier combinación de un cebador directo y un cebador inverso que codifican distintas posiciones de esos ocho pares de oligonucleótidos (por ejemplo K9_30_101110f y K9_67_101110r) . Hay un total r* o 56 combinaciones. Una mezcla de reacción de 25 µ? contenía: 22.5 µ? de solución Supermix, 1.0 µ? de cebador directo y 1.0 µ? de cebador inverso, 0.5 µ? de plantilla de ADN AB1D3 (50 ng/µ?) . La mezcla se colocó en un tubo de 200 µ? de cavidad fina para la reacción de PCR en un equipo de gradientes astercycler (Brinkmann Instruments, Inc. estbury, NY) . Se usó las siguientes condiciones para la reacción de PCR: La temperatura inicial era de 95 °C durante 1.0 min, seguido por 35 ciclos de calentamiento/enfriarniento . Cada ciclo consistía en 95 °C durante 20 s, 55 °C durante 20 s y 72 °C durante 1.0 min. Al terminar el ciclo de temperatura, las muestras se mantuvieron a 72 °C durante 2.0 min más y, después, se esperó la recuperación de las muestras a 4 °C. El producto de PCR se limpió con el uso de un kit de limpieza de ADN (catálogo núm. D4003, Zymo Research, Orange, CA) como lo recomienda el fabricante.

Después, los Megaprimers se usaron para generar bibliotecas de genes con el uso del kit de mutagénesis sitio dirigida QuickChange II XL (catálogo núm. 200524, Stratagene, La Jolla CA) . Una mezcla de reacción de 25 µ? contenía: 2.5 µ? de regulador de reacción lOx, 1.0 µ? de 50 ng/µ? de plantilla, 20.5 µ? de Megaprimer, 0.5 µ? de mezcla de dNTP 40 mM, 0.5 µ? de ADN polimerasa pfu-ultra. Excepto por el Megaprimer y las plantillas, todos los reactivos usados aquí se suministraron con el kit indicado anteriormente. Esta mezcla de reacción se colocó en un tubo de PCR de 200 µ? de capacidad, de cavidad fina y se usó las siguientes reacciones para la PCR: La temperatura inicial era de 95 °C durante 30 s, seguido por 25 ciclos de calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consistía en 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 1 min y 68 °C durante 6 min. Al terminar el ciclo de temperatura, las muestras se mantuvieron a 68 °C durante 8 min más y, después, se mantuvieron a 4 °C durante el procesamiento posterior. La mezcla de reacción de PCR se procesó con la enzima de restricción Dpn I igual que la usada en el Ej emplo 4.

Después, los oligonucleótidos K9_37&39_101110f , K9_37&39_101110r y K9_86&87_101110f , K9_86&87_101110r se usaron directamente para generar bibliotecas de genes con el uso del kit de mutagénesis sitio dirigida QuickChange II XL . Dos mezclas de reacción de 25 µ? para los dos grupos de oligonucleótidos, cada mezcla de reacción de 25 µ? contenía: 2.5 µ? de regulador de reacción 10x, 1.0 µ? de 50 ng/µ? de plantilla, 1.0 µ? de cebador directo, 1.0 µ? de cebador inverso, 0.5 µ? de mezcla de dNTP 40 mM, 0.5 µ? de ADN polimerasa pfu-ultra y 18.5 µ? de agua. El programa de PCR y el procesamiento de Dpn I posterior son los mismos.

La mezcla de ADN procesada con Dpn I se limpió con el uso del kit de limpieza de ADN Zymo según el protocolo del fabricante. Se usó el ADN limpio para transformar una cepa electrocompetente de Bw25113 de E. coli (AilvC) con el uso de BioRad Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA) . Los clones transformados se rayaron para transferirlos en placas de agar que contienen el medio LB y 100 µg/ml de ampicilina (catálogo núm. L1004, Teknova Inc. Hollister, CA) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Los clones se evaluaron para analizar la actividad mejorada con el uso de NADH. Se determinó la ¾ para los mutantes mejorados (Tabla 14) .

Tabla 13. Cebadores Tabla 14 Lista de algunos mutantes con sus valores de KM determinados Ejemplo 6 Construcción de una biblioteca combinatoria para reducir la KM para NADH En base a los resultados de la mutagénesis (Ejemplo 4) , T131L, T131A, T131V, T131 , T131C, T191D, T191C, T191S y T191G se consideran mutaciones favorables para mejorar la KM para NADH. Se produjo una biblioteca combinatoria para introducir estas mutaciones favorables en A07B5.

Todos los oligonucleótidos fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville IA) . Primero, se fosforizaron por T4 ???. En resumen, una mezcla de reacción de 20 µ? contenía: 2.0 µ? de regulador T4 PNK lOx suministrado con el kit, 2.85 µ? de cebador (aproximadamente 35 µ?, 0.6 µ? de mezcla de ATP 100 mM, 0.4 µ? de T4 PNK y 14.15 µ? de agua. La mezcla de reacción se incubó a 37 °C durante 1.0 h y, después, se desactivó el T4 PNK a 65 °C durante 20 min.

Después, los cebadores fosforizados se usaron directamente para la reacción de PCR posterior para introducir las mutaciones en dos sitios en A07B5 con el uso del kit. En resumen, una mezcla de reacción de 50 µ? contenía: 5.0 µ? de regulador de reacción lOx suministrado con el kit, 2.5 µ? de cebador directo fosforizado (0.5 µ? de cada cebador directo que se muestra en la Tabla 15), 2.5 µ? de cebador inverso (0.625 µ? de cada cebador directo que se muestra en la Tabla 15), 2.5 µ? de A07B5 (50 ng/µ?), 2.5 µ? de enzima Chang_IT y 35 µ? de agua. Esta mezcla de reacción se colocó en tubos de PCR de 200 µ? de capacidad, de cavidad fina y se usó el siguiente programa de reacción de PCR para la PCR: La temperatura inicial era de 95 °C durante 2 min, seguido por 30 ciclos de calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consistía en 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 68 °C durante 20 min. Al terminar el ciclo de temperatura, las muestras se mantuvieron a 68 °C durante 25 min más y, después, se mantuvieron a 4 °C durante el procesamiento posterior. La reacción de PCR se limpió con el uso del kit de limpieza de ADN Zymo (Zymo Research Corporation, Orange CA, núm . D4004) . El ADN se lavó de la membrana con el uso de 84 µ? de agua. La plantilla de ADN se eliminó con Dpn I (Promega, Madison WI , núm. R6231) a 37 °C durante 3 h (mezcla de reacción: 10 µ? de regulador de reacción lOx, 1.0 µ? de BSA, 6.0 µ? de Dpn I y 83 µ? ADN limpio de PCR) . El ADN digerido con Dpn I se limpió nuevamente con el kit de limpieza de ADN Zymo y se digirió nuevamente con Dpn I para eliminar completamente la plantilla de ADN (mezcla de reacción: 1.5 µ? de regulador de reacción lOx, 0.15 µ? de BSA, 0.85 µ? de Dpn I y 83 µ? de ADN limpio de PCR) .

La mezcla de ADN procesada con Dpn I se limpió con el uso del kit de limpieza de ADN Zymo según el protocolo del fabricante. Se usó el ADN limpio para transformar una cepa electrocompetente de Bw25113 de E. col i (AilvC) con el uso de BioRad Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA) . Los clones transformados se sembraron en estrías en placas de agar que contienen el medio LB y 100 µg/ml de ampicilina (catálogo núm. L1004, Teknova Inc. Hollister, CA) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Los clones se evaluaron para analizar la actividad mejorada con el uso de NADH. Se determinó la KM para los mutantes mejorados (Tabla 16) .

Tabla 15. Cebadores para el Ejemplo 6 Tabla 16.

Lista de algunos mutantes con sus valores de KM determinados Ejemplo 7 Producción de isobutanol a partir de variantes de KARI K9 Las siguientes variantes de KARI K9 se generaron como se describió anteriormente.

Tabla 17.

Variantes de KARI y los vectores de expresión de levadura correspondientes Los plásmidos de expresión de levadura se produjeron por subclonación de las variantes de genes KARI de vectores de E.coli (pBAD.KARI) en el vector pLH556 de pHR81-PIlv5-Pf5. KARI (Figura 4, sec . con núm. de ident . : 138) en los sitios Pmel y Sfil. Las cepas de la ruta de levadura se produjeron en el huésped PNY2204 (MATa ura3A::loxP his3A pdc6A pdclñ : : P [PDC1] -DHADIilvD_Sm-PDClt-pUC19-loxP-kanMX-loxP-P [FBAl] -ALS | alsS_Bs-CYClt pdc5A: :P[PDC5] -ADH | sadB_Ax-PDC51 gpd2Z : : loxP fra2A adhlñ : :UAS (PGK1) P [FBAl] -kivD_Ll (y) -ADHlt; Ejemplo 13) mediante la cotransformación de vectores de KARI como el plásmido núm. 1 de la ruta y pBP915 (pRS423-PFBAi-DHAD-PGpMi-hADHl; sec . con núm. de ident . : 182) como el plásmido núm. 2 de la ruta. Los transformantes se parcharon en el mismo medio que contiene glucosa al 2 % y etanol al 0.1 % como fuentes de carbono. Se evaluó tres parches para analizar la producción de isobutanol en condiciones microaerobias en viales de suero. Un clon que se transformó con pBP915 y el plásmido pLH702 que expresa K9D3 se denominó PNY1910.

Las colonias de levadura a partir de la transformación en placas de SE-Ura-His aparecieron después de 5-7 días. Las colonias se parcharon en placas de SE-Ura-His fresco, se incubaron a 30 °C durante 3 días. Las células parchadas se inocularon en 25 mi de medio de SEG-Ura,His con glucosa al 0.2 % y etanol al 0.2 % y se cultivaron aerobiamente durante 1-2 días a 30 °C, hasta una OD de 2-3. Las células se centrifugaron y se suspendieron nuevamente en 1 mi de medio de SEG-Ura,His (glucosa al 2 %, etanol al 0.1 %, 10 mg/1 de ergosterol, MES 50 mM, pH 5.5, tiamina 30 mg/1, ácido nicotínico 30 mg/1) . Una cantidad calculada de células se transfirió a 45 mi de volumen total del mismo medio para una OD inicial de 0.2 en un vial de suero de 60 mi, con la parte superior cerrada fuertemente con un sellador. Esta etapa se llevó a cabo en el Bio-hood regular en aire. Los viales de suero se incubaron a 30 C, 200 rpm durante 2 días. A las 48 h, las muestras se retiraron para el análisis de OD y de HPLC de glucosa, isobutanol e intermedios de la ruta. A las 24 h, se tomó muestras en una cámara anaerobia para mantener la condición anaerobia en los viales de suero. En la fase inicial de la incubación de 48 h, las células de levadura en crecimiento consumen el aire presente en la fase gaseosa (-15 mi) y el medio líquido. Después de que el oxígeno en la fase gaseosa es consumido, el cultivo se vuelve anaerobia. Por lo tanto, este experimento incluye cambiar la condición aerobia a condiciones limitantes de oxígeno y anaerobias.

De las cuatro variantes de K9, AB1G9 y AB1D3 produjeron títulos de isobutanol relativamente altos, mientras que 495B5 y AB1D1 tiene un título menor. La cepa de KARI K9 silvestre produjo el título más bajo. Sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que el título menor se debe al cambio en el balance de NADH y NADPH cuando las células se cambian de condiciones aerobias a condiciones anaerobias. Con esta base lógica, en condiciones anaerobias, la concentración y la disponibilidad de NADH incrementaron significativamente para favorecer las variantes de enzimas KARI que usan NADH. Según el análisis cinético, los mutantes AB1G9 ("K9G9") y AB1D3 ("K9D3") tienen una ¾ para NADPH relativamente alta (23 & 9.2 µ?) , además de su ¾ para NADH relativamente baja (47 & 38 µ?) . Como comparación, la KM de 495B5 y de AB1D1 son 2.5 y 1.1 µ?, respectivamente, para NADPH y la KM de wt K9 es 0.10 µ?. La KM baja de NADH de AB1G9 y AB1D3 , junto con la ¾ alta de NADPH de AB1G9 y AB1D3 pueden haber causado un uso de NADPH reducido en condiciones anaerobias, y un uso de NADH relativamente alto. Como evidencia, AB1G9 y AB1D3 tienen una acumulación de glicerol inferior (isobutanol :glicerol = 3.3) en comparación con 495B5 y AB1D1 (2-3) . La relación isobutanol : glicerol para K9 silvestre es 1:1 con las mismas condiciones de aerobias a anaerobias.

Tabla 18.

Las propiedades cinéticas de las enzimas KARI K9 silvestres y variantes y el título de isobutanol y la productividad que se determinaron con el experimento de cambio de condiciones aerobias a anaerobias en viales de suero.

Ejemplo 8 Construcción de cepas BP1135 de Saccharomyces cerevisiae (PNY1505) y PNY1507 y derivados que producen isobutanol Este ejemplo describe la construcción de las cepas BP1135 y PNY1507 deSaccharomyces cerevisiae . Estas cepas se derivaron de PNY1503 (BP1064). PNY1503 se derivó de CEN.PK 113 -7D (CBS 8340; Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversiry Centre, Países Bajos) . BP1135 contiene una supresión adicional del gen FRA2. PNY1507 se derivó de BP1135 con la supresión adicional del gen ADH1, con integración del gen kivD de Lactococcus lactis, optimizado por codones para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, en el locus ADH1.

Las supresiones/integraciones se crearon por recombinación homologa con fragmentos de PCR que contenían regiones de homología dirección 5' y dirección 3' del gen objetivo y el gen URA3 para selección de transformantes. El gen URA3 se eliminó por recombinación homologa para crear una supresión/integración sin marcas.

El procedimiento de supresión/integración sin marcas se adaptó de Akada et al., Yeast, 23:399, 2006. Generalmente, el cásete de PCR para cada supresión/integración se preparó al combinar cuatro fragmentos, A-B-U-C, y el gen a integrarse por clonación de los fragmentos individuales en un plásmido antes de amplificar el cásete completo por PCR para el procedimiento de supresión/integración . El gen a integrarse se incluyó en el cásete entre los fragmentos A y B. El cásete de PCR contenía un marcador seleccionable/seleccionable inverso, URA3 (fragmento U) , que consiste en el gen nativo CEN.PK 113 -7D URA3 , junto con las región promotora (250 pb dirección 5' del gen URA3) y terminadora (150 pb dirección 3' del gen URA3) . Los fragmentos A y C (cada uno de aproximadamente 100 a 500 pb de longitud) correspondían a la secuencia inmediatamente dirección 5' de la región objetivo (fragmento A) y se secuencia 3' de la región objetivo (fragmento C) . Los fragmentos A y C se usaron para la integración del cásete en el cromosoma mediante recombinación homologa. El fragmento B (500 pb de longitud) correspondía a las 500 pb inmediatamente dirección 3' de la región objetivo y se usó para la excisión del marcador de URA3 y el fragmento C del cromosoma por recombinación homologa, ya que una repetición directa de la secuencia correspondiente al fragmento B se creó con la integración del cásete en el cromosoma.

Supresión de FRA2.

La supresión de FRA2 se diseñó para suprimir 250 nucleótidos del extremo 31 de la secuencia codificante de manera que los primeros 113 nucleótidos de la secuencia codificante de FRA2 quedaron intactos. Un codón de terminación dentro del marco estuvo presente en 7 nucleótidos dirección 3' de la supresión. Los cuatro fragmentos del cásete de PCR para la supresión sin marcas de FRA2 se amplificaron al usar la mezcla para PCR de alta fidelidad "Phusion High Fidelity PCR Master Mix" (New England BioLabs; Ipswich, MA) y el ADN genómico de CEM.PK 113-7D como plantilla, preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen; Valencia, CA) . El fragmento A de FRA2 se amplificó con el cebador oBP594 (sec. con núm. de ident. : 183) y el cebador OBP595 (sec. con núm. de ident. : 184) , que contenía una cola de 5' con homología al extremo 5' del fragmento B de FRA2. El fragmento B de FRA2 se amplificó con el cebador OBP596 (sec. con núm. de ident. : 185) , que contiene una cola 51 con homología con el extremo 3 ' del fragmento A de FRA2 , y el cebador OBP597 (sec. con núm. de ident. :186), que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento U de FRA2. El fragmento U de FRA2 se amplificó con el cebador OBP598 (sec. con núm. de ident.: 187) , que contenía una cola de 5' con homología al extremo 3' del fragmento B de FRA2 y el cebador oBP599 (sec. con núm. de ident. : 188) , que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento C de FRA2. El fragmento C de FRA2 se amplificó con el cebador 0BP6OO (sec. con núm. de ident.: 189), que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento U de FRA2 , y el cebador 0BP6OI (sec. con núm. de ident.:190). Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . El fragmento AB de FRA2 se creó mediante PCR superpuesta al mezclar el fragmento A de FRA2 y el fragmento B de FRA2 y amplificar con los cebadores oBP594 (sec. con núm. de ident . : 183) y oBP597 (sec. con núm. de ident. : 186) . El fragmento UC de FRA2 se creó mediante PCR superpuesta al mezclar el fragmento U de FRA2 y el fragmento C de FRA2 y amplificar con los cebadores oBP598 (sec. con núm. de ident.: 187) y 0BP6OI (sec. con núm. de ident.: 190). Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa y, después, se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel (Qiagen) . El cásete ABUC de FRA2 se creó por PCR superpuesta al mezclar el fragmento AB de FRA2 y el fragmento UC de FRA2 y amplificar con los cebadores ???594 (sec. con núm. de ident. : 183) y 0BP6OI (sec. con núm. de ident. : 190) . El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) .

Se prepararon células competentes de PNY1503 y se transformaron con el cásete ABUC preparado por PCR con FRA2 al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras "Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zymo Research; Orange , CA) . Las mezclas de transformación se cultivaron en placas en medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 1 % de etanol a 30 °C. Los transformantes con una supresión de fra2 se analizaron por PCR con los cebadores oBP602 (sec. con núm. de ident . : 191) y oBP603 (sec. con núm. de ident. : 192) mediante el uso del ADN genómico preparado con el kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) . Un transformante correcto se cultivó en YPE (extracto de levadura, peptona, etanol al 1 %) y se colocó en placas con medio completo sintético que contiene ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de URA3. La supresión y eliminación del marcador se confirmaron por PCR con los cebadores OBP602 (sec. con núm. de ident.: 191) y OBP603 (sec. con núm. de ident. : 192) mediante el uso de ADN genómico preparado con un kit de levadura/bacteria de Gentra Puregene (Qiagen) . La ausencia del gen FRA2 de la cepa aislada se demostró con un resultado negativo de PCR mediante el uso de los cebadores específicos para la secuencia codificante eliminada de FRA2 , oBP605 (sec. con núm. de ident.: 193) y 0BP6O6 (sec. con núm. de ident.: 194) . El aislado correcto se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D MATa ura3A::loxP his3A pdc6A pdclA : : P [PDC1 ] -DHADIilvD_Sm-PDClt pdc5A : : P [PDC5] -ADH | sadB_Ax- PDC5t gpd2A::loxP fra2A y se designó como PNY1505 (BP1135) .

Esta cepa se transformó con plásmidos de la ruta de isobutanol (pYZ090, sec . con núm. de ident . : 195) y pLH468 (sec. con núm. de ident. : 139) , y un clon se denominó BP1168 (PNY1506) .

Se realizó la digestión de pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 195) se construyó para contener un gen quimérico que tiene la región codificante del gen alsS de Bacillus subtilis (posiciones de nucleótidos (nt) 457-2172) expresado a partir del promotor CUPl de levadura (nt 2-449) y seguido por el terminador CYC1 (nt 2181-2430) para expresión de ALS, y un gen quimérico que tiene la región codificante del gen ilvC de Lactococcus lactis (nt 3634-4656) expresado a partir del promotor ILV5 de levadura (2433-3626) y seguido por el terminador ILV5 (nt 4682-5304) para expresión de KARI.

Supresión de ADH1 e integración de kivD Ll (y) El gen ADH1 se eliminó y se reemplazó con la región codificante de kivD de Lactococcus lactis optimizada por codones para la expresión en Saecharomyees cerevisiae . El cásete sin cicatrices para la supresión de ADH1 e integración de kivD_Ll (y) se clonó primero en el plásmido pUC19 -URA3MCS , como se describe en la solicitud de Estados Unidos núm. 61/356379, presentada el 18 de junio de 2010, que se incorpora como referencia en la presente descripción. El vector es a base de pUC19 y contiene la secuencia del gen URA3 de Saccharomyces cerevisiae CE . PK 113 -7D ubicada dentro de un sitio de clonación múltiple (MCS) . El pUC19 contiene el replicón pMBl y un gen que codifica para beta-lactamasa para la replicación y selección en Escherichia coli. Adicionalmente a la secuencia codificante para URA3 , las secuencias dirección 5' (250 pb) y dirección 3' (150 pb) de este gen están presentes para la expresión del gen URA3 en levadura. El vector puede usarse para propósitos de clonación y como un vector de integración de levadura.

La región codificante de kivD de Lactococcus lactis optimizada por codones para la expresión en Saccharomyces cerevisiae se amplificó con el uso de pLH468 (sec. con núm. de ident.:139) como plantilla con el cebador OBP562 (sec. con núm. de ident.:197), que contiene un sitio de restricción Pmel, y el cebador oBP563 (sec. con núm. de ident. : 198) , que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento B de ADHl. El fragmento B de ADHl se amplificó a partir del ADN genómico preparado como se describió anteriormente con el cebador OBP564 (sec. con núm. de ident.: 199), que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' de kivD__Ll (y) , y el cebador OBP565 (sec. con núm. de ident. :200), que contiene un sitio de restricción Fsel . Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen) . El fragmento B de kivD_Ll (y) -ADHl se creó por PCR superpuesta al mezclar los productos de PCR del fragmento B de kivD_Ll (y) y ADHl y amplificar con los cebadores oBP562 (sec. con núm. de ident.: 197) y oBP565 (sec. con núm. de ident . : 200). Se realizó la digestión del producto de PCR resultante con Pmel y Fsel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de pUCl9 -URA3MCS después de la digestión con las enzimas apropiadas. El fragmento A de ADHl se amplificó a partir de ADN genómico con el cebador OBP505 (sec. con núm. de ident. : 201) , que contenía un sitio de restricción SacI, y el cebador oBP506 (sec. con núm. de ident.: 202), que contenía un sitio de restricción Ascl. El producto de PCR del fragmento A de ADHl se digirió con SacI y Ascl y se unió con ADN ligasa T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contenían el fragmento B de kivD__Ll (y) -ADHl . El fragmento C de ADHl se amplificó a partir de ADN genómico con el cebador oBP507 (sec. con núm. de ident. : 203) , que contenía un sitio de restricción Pací, y el cebador oBP508 (sec. con núm. de ident. : 204) , que contenía un sitio de restricción Salí. El producto de PCR del fragmento C de ADHl se digirió con Pací y Salí y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contienen fragmento A-kivD_Ll (y) - fragmento B de ADHl. El promotor híbrido UAS (PGK1 ) -PFBAi se amplificó a partir del vector pRS316-UAS (PGK1) -PPBAi-GUS (sec. con núm. de ident . :209) con el cebador oBP674 (sec. con núm. de ident.:205), que contiene un sitio de restricción AscI, y el cebador oBP675 (sec. con núm. de ident. :206), que contiene un sitio de restricción Pmel. Se realizó la digestión del producto de PCR UAS ( PGK1 ) - PFBAi con AscI y Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contenía kivD_Ll (y) -fragmentos ABC de ADH1. El cásete de integración completo se amplificó a partir del plásmido resultante con los cebadores OBP505 (sec. con núm. de ident.: 201) y OBP508 (sec. con núm. de ident.: 204) y se purificó con un kit de purificación de PCR (Qiagen) .

Las células competentes de PNY1505 se prepararon y transformaron con el cásete de PCR ADHl-kivD_Ll (y) construido anteriormente mediante el uso del kit "Frozen-EZ Yeast Transíormation II" (Zymo Research) . Las mezclas de transformación se cultivaron en placas en medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 1 % de etanol a 30 °C. Los transformantes se cultivaron en YPE (etanol al 1 %) y se colocaron en placas con medio completo sintético que contiene ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de URA3. La supresión de ADH1 e integración de kivD_Ll (y) se confirmaron por PCR con los cebadores externos oBP495 (sec. con núm. de ident. : 207) y ???496 (sec. con núm. de ident. : 208) y con el cebador específico de kivD_Ll (y) , ???562 (sec. con núm. de ident . : 197) y el cebador externo OBP496 (sec. con núm. de ident.: 208) mediante el uso del ADN genómico preparado con un kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) . El aislado correcto se seleccionó como la cepa CEN.PK 113 -7D MATa ura3A::loxP his3A pdc6A pdclA : : P [PDC1] -DHAD I ilvD_Sm-PDCltpdc5A: :P[PDC5] -ADH | sadB_Ax-PDC5t gpd2Z_::loxP fra2ñ adhlA : :UAS (PGKl) P [FBA1] -kivD_Ll (y) -ADHlt y se designó como PNY1507 (BP1201) . PNY1507 se transformó con plásmidos de la ruta de isobutanol pYZ090 (sec. con núm. de ident.: 195) y pBP915 (sec. con núm. de ident.: 182) y la cepa resultante se denominó PNY1513.

Construcción del vector pRS316-UAS (PGKl) -FBAlp-GUS Para clonar un cásete UAS (PGKl) -FBAlp (sec. con núm. de ident. :766, primero, un promotor FBA1 de 602 pb (FBAlp) se amplificó por PCR del ADN genómico de CEN.PK con los cebadores T-FBAl(SalI) (sec. con núm. de ident. :767) y B-FBAl(Spel) (sec. con núm. de ident. :768), y se clonó en los sitios Salí y Spel en el plásmido pWS358-PGKlp-GUS (sec. con núm. de ident. :769) después de eliminar el promotor PGKlp con una .digestión Sall/Spel del plásmido, lo que produjo pWS358-FBAlp-GUS. El plásmido pWS358 -PGKlp-GUS se generó por la inserción de un PGKlp y fragmentos de ADN del gen de beta-glucuronidasa (GUS portan varios genes KARI que se determinaron después de 48 h de crecimiento en condiciones de oxígeno progresivamente en matraces de agitación a 30 °C.) en un sitio de clonación múltiple de pWS358 que se derivó del vector pRS423 (Christianson, et al., Gene, 110:119-122, 1992). Segundo, se realizó la digestión del plásmido pWS358-FBAlp-GUS resultante con Salí y SacI, un fragmento de ADN que contenía un promotor FBAlp, el gen GUS y el terminador FBAt purificado con gel y se clonó en sitios SalI/SacI en pRS316 para crear pRS316 -FBAl -GUS . Tercero, un fragmento de ADN de 118 pb que contiene una secuencia de activación dirección 5' (UAS) ubicada entre las posiciones -519 y -402 dirección 5' del marco de lectura abierta de 3-fosfoglicerato cinasa (PGK1) , particularmente, UAS(PGKl), se amplificó por PCR a partir del ADN genómico de CE . PK con los cebadores T-U/PGK1 (Kpnl) (sec. con núm. de ident.:770) y B-U/PGKl(SalI) (sec. con núm. de ident.:771). Se realizó la digestión del producto de PCR con Kpnl y Salí y se clonó en sitios Kpnl/Sall en pRS316 -FBAlp-GUS para crear pRS316-UAS (PGK1 ) -FBAl -GUS . , Ejemplo 9 Células huésped recombinantes mejoradas que comprenden la eliminación de ALD6 El propósito de este ejemplo consiste en describir los métodos para modificar una cepa huésped de levadura para una producción de isobutanol mejorada. Estas modificaciones incluyen la integración de genes que codifican la actividad de isobutiraldehído reductasa y la eliminación de los genes nativos ALD6 y YMR226c, para codificar acetaldehído deshidrogenasa dependiente de NADP+ y una deshidrogenasa dependiente de NADPH, respectivamente.

Construcción de la cepa PNY2211 de S. cerevisiae PNY2211 se construyó en varias etapas a partir de la cepa PNY1507 de S. cerevisiae (Ejemplo 8) , tal como se describe en los siguientes párrafos. Primero, se modificó la cepa PNY1507 para contener un gen fosofocetolasa . Después, se agregó un gen acetolactato sintasa {alsS) en la cepa con el uso de un vector de integración específico para las secuencias adyacentes al gen fosfoceloasa . Finalmente, se usó recombinación homologa para eliminar el gen fosfocetolasa y las secuencias del vector de integración, lo que produce una inserción sin cicatrices de alsS en la región intergénica entre pdclA::ilvD (que se describe en el Ejemplo 12) y el gen nativo TRX1 del cromosoma XII . El genotipo resultante de PNY2211 es MATa ura3ñ::loxP his3A pdc6A pdclA : : P [PDC1] -DHADIilvD_Sm-PDClt-P [FBAl] -ALS | alsS_Bs-CYClt pdc5A : : P [PDC5] -ADH| sadB_Ax-PDC5t gpd2ñ::loxP fra2A adhlA : : UAS ( PGK1 ) P [FBAl] -kivD_Ll (y) -ADHlt .

Un cásete génico de fosfocetolasa se introdujo en PNY1507 por recombinación homologa. El constructo de integración se generó de la siguiente manera. El plásmido pRS423 : : CUPl-alsS+FBA-budA (descrito anteriormente en la patente de los Estados Unidos núm. US2009/0305363 , que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad) se digirió con Notl y Xmal para eliminar la secuencia de FBA-budA de 1.8 kb, y el vector se ligó nuevamente después del tratamiento con el fragmento Klenow. Después, el promotor CUP1 se reemplazó con una variante del promotor TEF1 (variante M4 descrita anteriormente por Nevoigt et al. Appl . Environ. Microbiol . 72: 5266-5273 (2006), que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad) por medio del servicio de síntesis de ADN y construcción de vectores de DNA2.0 (Menlo Park, CA) . El plásmido resultante, pRS423 : : TEF (M ) -alsS , se cortó con Stul y Mlul (que elimina una porción de 1.6 kb que contiene parte del gen alsS y del terminador CYC1) , se combinó con el producto de PCR de 4 kb generado de pRS426 : : GPD-xpkl+ADH-eutD (sec. con núm. de ident.:383) con los cebadores N1176 (sec. con núm. de ident.:282) y N1177 (sec. con núm. de ident.:283) y el ADN de un producto de PCR de 0.8 kb (sec. con núm. de ident . : 284) se generó a partir del ADN genómico de levadura (región promotora ENOl) con los cebadores N822 (sec. con núm. de ident. :285) y N1178 (sec. con núm. de ident. :286) y se transformó en la cepa BY4741 de S. cerevisiae (núm. de la ATCC 201388) ; metodología de clonación por reparación de interrupciones, ver Ma et al. Gene 58:201-216 (1987). Se obtuvieron los transformantes al colocar en placas las células sobre un medio sintético completo sin histidina. La unión adecuada del plásmido previsto (pRS423 : : TEF (M4 ) -xpkl+ENOl-eutD, sec. con núm. de ident. :293) se confirmó por PCR (cebadores N821 (sec. con núm. de ident. :287) y N1115 (sec. con núm. de ident . : 288) ) y por digestión por restricción (Bgll) . Posteriormente, se secuenciaron dos clones. El gen TEF (M4 ) -xpkl de 3.1 kb se aisló por digestión con SacI y Noti y se clonó en el vector pUC19-URA3 : : ilvD-TRXl (clon A, que se cortó con AflII) . Se trataron los fragmentos de clonación con el fragmento de Klenow para generar los extremos romos para la ligación. Las reacciones de ligación se transformaron en las células Stbl3 de E. coli, para selección de resistencia a la ampicilina. La inserción de TEF (M4 ) -xpkl se confirmó por PCR (cebadores N1110 (sec. con núm. de ident.: 367) y N1114 (sec. con núm. de ident.: 290)). El vector se linearizó con AflII y se trató con el fragmento de Klenow. El cásete de resistencia a geneticina Kpnl-HincII de 1.8 kb (sec. con núm. de ident. : 384) se clonó por ligación después del tratamiento con el fragmento Klenow. Las reacciones de ligación se transformaron en las células Stbl3 de E. coli, para selección de resistencia a la ampicilina. La inserción del cásete de geneticina se confirmó por PCR (cebadores N160SeqF5 (sec. con núm. de ident.: 210) y BK468 (sec. con núm. de ident. : 368)) . La secuencia de plásmidos se proporciona como la sec. con núm. de ident.: 291 (pUC19-URA3 : :pdcl : : TEF (M4 ) -xpkl : :kan) .

El cásete de integración resultante (pdcl : : TEF (M4 ) -xpkl : :KanMX: :TRX1) se aisló (la digestión de AscI y Wael generó una banda de 5.3 kb que se purificó con gel) y se transformó en PNY1507 con el uso del kit de transformación de levadura Zymo Research Frozen-EZ (cat. núm. T2001) . Los transformantes se seleccionaron al colocarlos en placas con YPE más 50 ug/ml de G418. La integración del locus previsto se confirmó por PCR (cebadores N886 (sec. con núm. de ident . : 211) y N1214 (sec. con núm. de ident.: 281)). Después, el plásmido pRS423 : : GALlp-Cre (sec. con núm. de ident.: 271), que codifica Cre recombinasa, se usó para eliminar el cásete KanMX flanqueado por loxP. La eliminación adecuada del cásete se confirmó por PCR (cebadores oBP512 (sec. con núm. de ident.: 337) y N160SeqF5 (sec. con núm. de ident .: 210) ) . Finalmente, el plásmido de integración de alsS descrito en el Ejemplo 13, pUC19-kan : : dcl : : FBA-alsS : : TRX1 , clon A) se transformó en esta cepa con el uso del marcador de selección de geneticina incluido. Dos integrantes se evaluaron para analizar la actividad de acetolactato sintasa mediante la transformación con los plásmidos pYZ090AalsS (sec. con núm. de ident. :371) y pBP915 (sec. con núm. de ident. :182) (transformados con el uso del protocolo núm. 2 en Amberg, Burke and Strathern "Methods in Yeast Genetics" (2005)) y la evaluación del crecimiento y producción de isobutanol en medios que contienen glucosa (los métodos para medición del crecimiento e isobutanol son los siguientes: las cepas se cultivaron en un medio sintético completo, menos histidina y uracilo, que contenía 0.3 % de glucosa y 0.3 % de etanol como fuentes de carbono (10 mi de medio en matraces Erlenmeyer ventilados de 125 mi (VWR, cat . núm. 89095-260). Después de la incubación durante la noche (30 °C, 250 rpm en un agitador científico Innova®40 New Brunswick) , se volvieron a diluir los cultivos a 0.2 OD (medición de Eppendorf BioPhotometer) en un medio sintético completo que contenía 2 % de glucosa y 0.05 % de etanol (20 mi de medio en matraces Erlenmeyer de 125 mi herméticamente cerrados (VWR, cat. núm. 89095-260)). Después de 48 horas de incubación (30 °C, 250 rpm en un agitador científico Innova®40 New Brunswick) , los sobrenadantes del cultivo (recolectados con unidades de filtrado del tubo de centrífuga Spin-X, Costar, cat. núm. 8169) se analizaron por HPLC conforme a los métodos descritos en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad) . Uno de los dos clones era positivo y se denominó PNY2218.

El PNY2218 se trató con Cre recombinasa y los clones resultantes se evaluaron para analizar la pérdida del gen xpkl y las secuencias del vector de integración pUC19 por PCR (cebadores N886 (sec. con núm. de ident . : 211) y N160SeqR5 (sec. con núm. de ident. : 388)) . Esto dejó únicamente el gen alsS integrado en la región intergénica pdcl-TRXl después de la recombinación del ADN dirección 5' de xpkl y el ADN homólogo introducido durante la inserción del vector de integración (una inserción "sin cicatrices" ya que el vector, el gen marcador y las secuencias loxP se han perdido) . Si bien esta recombinación podría haber ocurrido en cualquier punto, la integración del vector parece ser estable incluso sin selección de geneticina, y el evento de recombinación se observó únicamente después de la introducción de la Cre recombinasa. Un clon se designó PNY2211.

Un aislado de PNY2218 que contiene los plásmidos pYZ090AalsS y pBP915 se denominó PNY2209.

PNY1528 (integraciones de hADH en PNY2211) Las supresiones/integraciones se crearon por recombinación homologa con los productos de PCR que contienen regiones de homología dirección 5' y dirección 3' de la región objetivo y el gen URA3 para selección de transformantes. El gen URA3 se eliminó por recombinación homologa para crear una supresión/integración sin marcas.

Supresión de YPRCA15 e integración adh de hígado de caballo El locus YPRCA15 se eliminó y se reemplazó con el gen de ADH de hígado de caballo, se optimizó por codones para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, junto con la región promotora de PDC5 (538 pb) de Saccharomyces cerevisiae y la región terminadora de ADH1 (316 pb) de Saccharomyces cerevisiae. El cásete sin cicatrices para la supresión de YPRCA15- integración de P [PDC5] -adh_HL (y) -ADHlt se clonó, primero, en el plásmido pUC19-URA3MCS (descrito en el Ejemplo 8) .

Los fragmentos A-B-U-C se amplificaron con el uso de la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion (New England BioLabs; Ipswich, MA) y el ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen; Valencia, CA) . El fragmento A de YPRCA15 se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador oBP622 (sec. con núm. de ident . : 212), que contenía un sitio de restricción Kpnl, y el cebador oBP623 (sec. con núm. de ident.: 213), que contiene una cola 51 con homología con el extremo 5 ' del fragmento B de YPRCA15. El fragmento B de YPRCA15 se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador OBP624 (sec. con núm. de ident.: 214), que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento A de YPRCA15, y el cebador oBP625 (sec. con núm. de ident.: 215) que contenía un sitio de restricción de Fsel. Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen). YPRCA15, Fragmento A - YPRCA15, Fragmento B se creó por PCR de traslapamiento al mezclar los productos de la PCR YPRCA15, Fragmento A, con YPRCA15, Fragmento B, y amplificar con los cebadores oBP622 (sec. con núm. de ident.: 212) y OBP625 (sec. con núm. de ident.: 215) . El producto resultante de la PCR se digirió con Kpnl y Fsel y se ligó con T4 ADN ligasa en los sitios correspondientes de pUC19-URA3MCS después de la digestión con las enzimas apropiadas. El Fragmento C de YPRCA15 se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador OBP626 (sec. con núm. de ident . : 216), que contenía un sitio de restricción Notl, y el cebador oBP627 (sec. con núm. de ident.: 217), que contenía un sitio de restricción Pací. El producto de la PCR YPRCA15, Fragmento C, se digirió con Notl y Pací y se ligó con T4 ADN ligasa en los sitios correspondientes del plásmido que contenía los Fragmentos AB de YPRCA15. La región promotora de PDC5 se amplificó a partir del ADN genómico de CEN.PK 113 -7D con el cebador HY21 (sec. con núm. de ident.: 218) que contenía un sitio de restricción de AscI y el cebador HY24 (sec. con núm. de ident.: 219), que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' de adh_Hl (y) . adh_Hl (y) -ADHlt se amplificó de pBP915 (sec. con núm. de ident. : 182) con los cebadores HY25 (sec. con núm. de ident.: 220), que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' de P[PDC5], y HY4 (sec. con núm. de ident.: 221) que contenía un sitio de restricción de Pmel . Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . P [PDC5] -adh_HL (y) -ADHlt se creó por superposición de PCR al mezclar los productos de PCR P[PDC5] y adh_HL (y) -ADHlt y al amplificar con los cebadores HY21 (sec. con núm. de ident.: 218) y HY4 (sec. con núm. de ident. : 221) . El producto de PCR resultante se digirió con AscI y Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene los fragmentos ABC de YPRCA15. Todo el cásete de integración se amplificó a partir del plásmido resultante con los cebadores oBP622 (sec. con núm. de ident . : 212) y oBP627 (sec. con núm. de ident . : 217) .

Se preparó células competentes de PNY2211 y se transformaron con el producto de PCR de la supresión de YPRCA15- cásete de integración de P [PDC5] -adh_HL (y) -ADHlt con el uso de un kit de transformación de levadura II Frozen-EZ (Zymo Research; Orange, CA) . Las mezclas de transformación se cultivaron en placas en medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 1 % de etanol a 30 °C. Los transformantes se evaluaron por PCR con los cebadores URA3-extremo F (sec. con núm. de ident.: 222) y oBP637 (sec. con núm. de ident. : 224) . Los transformantes correctos se cultivaron en YPE (etanol al 1 %) y se colocaron en placas con medio completo sintético suplementado con EtOH al 1 % y que contiene ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de URA3. La supresión de ' YPRCA15 y la integración de P[PDC5]-adh_HL (y) -ADHlt se confirmaron por PCR con los cebadores externos oBP636 (sec. con núm. de ident.: 223) y oBP637 (sec. con núm. de ident. : 224) con el uso de ADN genómico preparado con un kit de ADN genómico YeaStar (Zymo Research) . Un aislado correcto del siguiente genotipar se seleccionó para modificación adicional: CEN.PK 113-7D MATa ura3A::loxP his3A pdc6A pdclA: :P[PDC1] -DHAD | ilvD_Sm-PDClt-P [FBA1] -ALS | alsS_Bs-CYClt pdc5A : : P [PDC5] -ADH | sadB_Ax-PDC5t gpd2A::loxP fra2A adhlA: :UAS (PGK1) P [FBA1] -kivD_Ll (y) -ADHlt yprcA15A: :P[PDC5]-ADHIadh_Hl-ADHlt .

Integración de adh de hígado de caballo en fra2A El gen de adh de hígado de caballo, optimizado por codones para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, junto con la región promotora PDC1 (870 pb) de Saccharomyces cerevisiae y la región terminadora ADH1 (316 pb) de Saccharomyces cerevisiae, se integró en el sitio de la supresión de fra2. El cásete sin cicatrices para la integración de fra2ú- P [PDC1] -adh_HL (y) -ADHlt se clonó, primero, en el plásmido pUC19-URA3MCS .

Los fragmentos A-B-U-C se amplificaron con el uso de la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion (New England BioLabs; Ipswich, MA) y el ADN genómico de CEN.PK 113 -7D como plantilla, preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen; Valencia, CA) . El fragmento C de fra2A se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador OBP695 (sec. con núm. de ident . : 229), que contenía un sitio de restricción Notl, y el cebador oBP696 (sec. con núm. de ident.: 230), que contenía un sitio de restricción de Pací . El producto de PCR del fragmento C de fra2A se digirió con Notl y Pací y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de pUC19-URA3MCS . El fragmento B de fra2A se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador oBP693 (sec. con núm. de ident . : 227) que contenía un sitio de restricción de Pmel y el cebador OBP694 (sec. con núm. de ident.: 228) que contenía un sitio de restricción de Fsel . El producto de PCR resultante se digirió con Pmel y Fsel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene el fragmento C de fra2A después de la digestión con las enzimas adecuadas. El fragmento A de fra2A se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador oBP691 (sec. con núm. de ident. : 225) , que contiene los sitios de restricción BamHI y AsiSI, y el cebador OBP692 (sec. con núm. de ident.: 226), que contiene los- sitios de restricción AscI y S aI . El producto de PCR del fragmento A de fra2A se digirió con BamHI y AscI y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contienen fragmentos BC de fra2A después de la digestión con las enzimas adecuadas. La región promotora de PDC1 se amplificó del ADN genómico de CEN.PK 113 -7D con el cebador HY16 (sec. con núm. de ident. : 231) que contenía un sitio de restricción de AscI y el cebador HY19 (sec. con núm. de ident. : 232) , que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' de adh_Hl (y) . adh__Hl (y) -ADHlt se amplificó de pBP915 con los cebadores HY20 (sec. con núm. de ident.: 233), que contienen una cola 5' con homología con el extremo 3' de P[PDC1], y HY4 (sec. con núm. de ident . : 221) que contenía un sitio de restricción de Pmel. Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . P [PDC1] -adh_HL (y) -ADHlt se creó por superposición de PCR al mezclar los productos de PCR P[PDC1] y adh_HL (y) -ADHlt y al amplificar con los cebadores HY16 (sec. con núm. de ident. : 231) y HY4 (sec. con núm. de ident. : 221) . El producto de PCR resultante se digirió con AscI y Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene los fragmentos ABC de fra2A. El cásete de integración completo se amplificó a partir del plásmido resultante con los cebadores oBP691 (sec. con núm. de ident.: 225) y oBP696 (sec. con núm. de ident.: 230) .

Las células competentes de la variante PNY2211 con adh_Hl (y) integrado en YPRCA15 se prepararon y se transformaron con el producto de PCR del cásete de integración fra2A- P [PDC1] -adh_HL (y) -ADHlt con el uso de un kit de transformación de levadura II Frozen-EZ (Zymo Research) . Las mezclas de transformación se cultivaron en placas en medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 1 % de etanol a 30 °C. Los transformantes se evaluaron por PCR con los cebadores URA3 -extremo F (sec. con núm. de ident.: 222) y OBP731 (sec. con núm. de ident.: 235) . Los transformantes correctos se cultivaron en YPE (etanol al 1 %) y se colocaron en placas con medio completo sintético suplementado con EtOH al 1 % y que contiene ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de URA3. La integración de P [PDC1] -adh_HL (y) -ADHlt se confirmó por PCR de la colonia con el cebador interno HY31 (sec. con núm. de ident . : 236) y el cebador externo oBP731 (sec. con núm. de ident. : 235) y PCR con los cebadores externos OBP730 (sec. con núm. de ident.: 234) y oBP731 (sec. con núm. de ident. : 235) con el uso de ADN genómico preparado con un kit de ADN genómico YeaStar (Zymo Research) . Un aislado correcto del siguiente genotipo se denominó PNY1528: CEN.PK 113-7D MATa ura3A : : loxP his3A pdc6A pdclA: :P[PDC1] -DHAD | ilvD_Sm-PDClt-P [FBA1] -ALS | alsS_Bs-CYClt pdc5A : : P [PDC5] -ADH | sadB_Ax-PDC5t gpd2A : : loxP fra2A: : P [PDC1] -ADH | adh_Hl-ADHlt adhlA : : UAS (PGK1) P [FBA1] -kivD_Ll(y) -ADHlt yprcA15A: :P[PDC5] -ADH | adh_Hl-ADHlt .

PNY2237 (supresión sin cicatrices de YMR226c) El gen YMR226c se eliminó de la cepa PNY1528 de S. cerevisiae por recombinación homologa con el uso de un cásete de supresión sin cicatrices lineal de 2.0 kb amplificado por PCR. El cásete se construyó de fragmentos amplificados por PCR de corte y empalme que comprenden el gen URA3 , junto con su promotor y terminador naturales como marcador seleccionable , secuencias de homología dirección 5' y dirección 3' que flanquean el locus cromosómico del gen YMR226c para promover la integración del cásete de supresión y la eliminación de la secuencia intercalada natural y una secuencia de repetición para promover la recombinación y eliminación del marcador de URA3. El cebador directo y el cebador inverso de PCR (N1251 y N1252, sec . con núms . de ident.: 247 y 248, respectivamente) amplificaron un cásete de expresión de URA3 de 1,208 pb que se origina de pLA33 (pUC19 : : loxP-URA3 -loxP (sec. con núm. de ident.: 268)). El cebador directo y el cebador inverso (N1253 y N1254, sec. con núms. de ident.: 249 y 250, respectivamente) amplificaron una secuencia de homología dirección 3' de 250 pb con un marcador de la secuencia de superposición de URA3 31 a partir de una preparación del ADN genómico de la cepa PNY2211 de S. cerevisiae (mencionada anteriormente) . El cebador directo y el cebador inverso (N1255 y N1256, sec. con núms. de ident.: 251 y 252, respectivamente) amplificaron una secuencia de repetición de 250 pb con un marcador de la secuencia de superposición de URA3 51 a partir de una preparación del ADN genómico de la cepa PNY2211 de S. cerevisiae . El cebador directo y el cebador inverso (N1257 y N1258, sec. con núms. de ident.: 253 y 254, respectivamente) amplificaron una secuencia de homología de 250 pb dirección 5' con un marcador de una secuencia de superposición y repetición 51 a partir de una preparación del ADN genómico de la cepa PNY2211 de S. cerevisia .

Aproximadamente 1.5 µ9 del cásete amplificado por PCR se transformó en la cepa PNY1528 (mencionada anteriormente) competente con el uso del kit de transformación de levadura ZYMO Research Frozen y la mezcla de transformación se colocó en placas con SE 1.0 % -uracilo y se incubó a 30 °C para seleccionar las células con un cásete de ymr226cA : :URA3 integrado. Los transformantes que aparecen después de 72 a 96 horas se rayan y se colocan posteriormente en el mismo medio y se incuban a 30 °C durante 24 a 48 horas. Las muestras rayadas se evalúan para analizar ymr226cA : : URA3 por PCR, con un cebador interno específico para casetes de supresión de URA3 5' orientados hacia afuera (N1249, sec. con núm. de ident.: 245) se parean con un cebador flanqueador específico para cromosomas orientados hacia adentro (N1239, sec. con núm. de ident. : 243) y un cebador específico para casetes de supresión de URA3 orientados hacia afuera 3' (N1250, sec. con núm. de ident.: 246) se parean con un cebador flanqueador específico para cromosomas orientados hacia adentro (N1242, sec. con núm. de ident. : 244) . Una evaluación por PCR de ymr226cA : : URA3 de PNY1528 positivo resultó en los productos de PCR 5' y 3' de 598 y 726 pb, respectivamente.

Se seleccionó tres clones de ymr226cA : : URA3 de PNY1528 positivo y se cultivaron durante la noche en medio de YPE al 1 % de los cuales 100 µ? se colocaron en placas con YPE al 1 % + 5-FOA para eliminar el marcador. Las colonias que aparecen después de 24 a 48 horas se evaluaron por PCR para analizar la pérdida del marcador con cebadores específicos para cromosomas 5' y 3' (N1239 y N1242) . Una evaluación por PCR sin marcador de ymr226cA de PNY1528 positivo resultó en un producto de PCR de 801 pb. Se obtuvo múltiples clones y uno se denominó PNY2237.

PNY2238 y PNY2243 (cepas de supresión de ALD6) Se diseñó un vector para reemplazar la secuencia codificante de ALD6 con un marcador de selección de URA2 reciclable de Cre-lox. Las secuencias 5' y 3' de ALD6 se amplificaron por PCR (pares de cebadores N1179 y N1180 y N1181 y N1182, respectivamente; sec . con núms . de ident . : 237, 238, 239 y 240, respectivamente). Después de clonar estos fragmentos en vectores TOPO (Invitrogen, cat . núm. K2875-J10) y secuenciar (cebador directo M13 (sec. con núm. de ident.: 269) e inverso (sec. con núm. de ident .: 270) ) , los flancos 5' y 3' se clonaron en pLA33 (pUC19 : : loxP : :URA3 : : loxP) (sec. con núm. de ident.: 268) en los sitios EcoRI y Sphl , respectivamente. Cada reacción de ligación se transformó en células Stbl3 de E. coli, que se incubaron en placas con LB Amp para seleccionar los transformantes. La inserción adecuada de secuencias se confirmó por PCR (cebadores M13 directos (sec. con núm. de ident. : 269) y N1180 (sec. con núm. de ident. :238) e inversos M13 (sec. con núm. de ident.:270) y N1181 (sec. con núm. de ident.:239), respectivamente).

El vector descrito anteriormente (pUC19 : : ald6A : : loxP-URA3-loxP) se linearizó con Ahdl y se transformó en PNY1528 y PNY2237 con el uso del método convencional de acetato de litio (excepto que la incubación de células con ADN se extendió hasta 2.5 h) . Los transformantes se obtuvieron en placas con medio completo sintético sin uracilo que proporcionó etanol al 1 % como la fuente de carbono. Los transformantes parchados se evaluaron por PCR para confirmar la supresión/integración, con el uso de los cebadores N1212 (sec. con núm. de ident . : 241) y N1180 (extremo 5') (sec. con núm. de ident.: 238) y N1181 (sec. con núm. de ident.: 239) y N1213 (sec. con núm. de ident.: 242) (extremo 3') . Un plásmido que porta Cre recombinasa (pRS423 : : GALlp-Cre = sec. con núm. de ident.. 271) se transformó en la cepa con el uso de la selección con marcador de histidina. Los transformantes se cambiaron de cultivo a un medio de YPE suplementado con galactosa al 0.5 %. Las colonias se evaluaron para analizar la resistencia a 5-FOA (pérdida del marcador de URA3 ) y la auxotrofía para histidina (pérdida del plásmido Cre) . La eliminación adecuada del gen URA3 al flanquear los sitios loxP se confirmó por PCR (cebadores N1262 y N1263, sec. con núms . de ident.: 255 y 256, respectivamente) . Adicionalmente, los cebadores internos para el gen ALD6 (N1230 y N1231; las sec. con núms . de ident . : 261 y 262, respectivamente) se usaron para asegurar que no hubiera merodiploides presentes. Finalmente, los clones ald6/\ : loxP se evaluaron por PCR para confirmar que no hubiera ocurrido una traslocación entre ura3ñ: : loxP (N1228 y N1229, sec. con núms. de ident.: 259 y 260) y gpd2A: : loxP (N1223 y N1225, sec. con núms. de ident.: 257 y 258) . Los dos clones positivos se identificaron a partir de la evaluación de los transformantes de PNY1528. El clon B se denominó PNY2243. Se identificó tres clones positivos a partir de los transformantes de evaluación de PNY2237. Los clones E y K se evaluaron para analizar la producción de isobutanol a pequeña escala (a continuación) . Si bien era estadísticamente idéntico en la mayoría de parámetros, el clon E se seleccionó (PNY2238) para un desarrollo adicional.

Ejemplo 10 Plásmidos de la ruta de isobutanol El propósito de este ejemplo consiste en describir la construcción o modificación de los plásmidos de la ruta de isobutanol para la producción de isobutanol en cepas huésped. pYZ067 (sec. con núm. de ident. :374) se construyó para contener los siguientes genes quiméricos: 1) la región codificante del gen ilvD de UA159 de 3. mutans con un marcador C-terminal Lumio expresado a partir del promotor FBAl de levadura seguido por el terminador FBA1 para la expresión de dihidroxi ácido deshidratasa, 2) la región codificante para ADH de hígado de caballo expresada a partir del promotor GPM1 de levadura seguido por el terminador ADH1 para la expresión de alcohol deshidrogenasa, y 3) la región codificante del gen KivD de Lactococcus lactis expresado a partir del promotor TDH3 de levadura seguido por el terminador TDH3 para la expresión de cetoisovalerato descarboxilasa . pYZ067AkivDAhADH (sec. con núm. de ident . : 385) se construyó a partir de pYZ067 (sec. con núm. de ident.: 374) al eliminar los casetes de promotores-genes-terminadores tanto para kivD como para adh. El pYZ067 se digirió con BamHI y SacI (New England BioLabs; Ipswich, MA) y el fragmento de 7934 pb se purificó en un gel de agarosa seguido por un kit de extracción en gel (Qiagen; Valencia, CA) . El fragmento de ADN aislado se trató con ADN polimerasa I, Large (Klenow) Fragment (New England BioLabs ; Ipswich, MA) y, después, se autoligó con ADN ligasa de T4 y se usó para transformar TOP10 de Escherichia coli competente (Invitrogen; Carlsbad, CA) . Los plásmidos a partir de los transformantes se aislaron y se revisaron para analizar la supresión correcta por análisis de secuencias. Un aislado de plásmidos correcto se denominó pYZ067AkivDAhADH . pYZ067AkivDAilvD (sec. con núm. de ident.: 772) se construyó para contener un gen quimérico que tiene la región codificante del gen adh de hígado de caballo (posición del nt 3148-2021) , optimizado por codones para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, expresado del promotor GPM de levadura (nt 3916-3160) y seguido por el terminador ADHl (nt 2012-1697) para la expresión de ADH. pYZ067DkivDDilvD se construyó a partir de pYZ067 al eliminar los casetes de promotores-genes-terminadores tanto para kivD como para ilvD. pYZ067 se digirió con AatlI y SacI (New England BioLabs; Ipswich, MA) y el fragmento de 10196 pb se purificó en un gel de agarosa seguido por un kit de extracción en gel (Qiagen; Valencia, CA) . El fragmento de ADN aislado se trató con ADN polimerasa I, Large (Klenow) Fragment (New England BioLabs; Ipswich, MA) y, después, se autoligó con ADN ligasa de T4. Después, el plásmido resultante se digirió con NgoMIV y BamHI (New England BioLabs; Ipswich, MA) y el fragmento de 7533 pb se purificó en un gel de agarosa seguido por un kit de extracción en gel (Qiagen; Valencia, CA) . El fragmento de ADN aislado se trató con ADN polimerasa I, Large (Klenow) Fragment (New England BioLabs; Ipswich, MA) y, después, se autoligó con ADN ligasa de T4. Los plásmidos se aislaron y se revisaron para analizar las supresiones adecuadas por análisis de secuencias. Un aislado de plásmidos correcto se denominó pYZ067DkivDDilvD . pK9G9.OLElp.ilvD (sec. con núm. de ident . : 773), se derivó de pYZ090 (sec. con núm. de ident. : 195) , se construyó para contener un gen quimérico que tiene la región codificante del gen ilvD a partir de Streptococcus mutans (posición del nt 5377-3641) expresado a partir del promotor 0LE1 de levadura (nt 5986-5387) y seguido por el terminador FBAl (nt 3632-3320) para la expresión de DHAD, y un gen quimérico que tiene la región codificante de la variante K9G9 del gen ilvC de Anaerostipes caccae (ácido nucleico y aminoácido de las sec . con núms . de ident . : 774 y 647) (nt 1628-2659) expresado a partir del promotor ILV5 de levadura (nt 427-1620) y seguido por el terminador ILV5 (nt 2685-3307) para la expresión de KARI . La construcción del plásmido se hizo de la siguiente manera. El gen quimérico del plásmido pYZ067 que tiene la región codificante del gen ilvD de Streptococcus mutans expresado a partir del promotor FBAl de levadura y seguido por el terminador FBAl se ligó en pYZ090 después de la digestión con las enzimas de restricción NgoMIV y BamHI . La región codificante de alsS y 280 pb del extremo 31 del promotor CUP1 se eliminó del plásmido resultante al digerir con las enzimas de restricción Spel y Pací y se autoligó el fragmento de ADN grande resultante. El promotor FBAl de levadura dirección 5' de ilvD se eliminó del plásmido resultante al digerir con las enzimas de restricción NgoMIV y Pmll y se reemplazó con el promotor OLE1 de levadura amplificado con los cebadores pOLEl-NgoMI (sec. con núm. de ident.: 775) y pOLEl-PmlI (sec. con núm. de ident.: 776). La región codificante del gen ilvC de Lactococcus lactis se eliminó del plásmido resultante por digestión con las enzimas de restricción Pmel y Sfil seguido por la purificación de gel del fragmento de ADN grande. La región codificante de la variante K9G9 del gen ilvC (sec. con núm. de ident . : 777) de Anaerostipes caccae se digirió fuera de pLH701 (sec. con núm. de ident. : 778) con Pmel y Sfil y se purificó con gel. Los dos fragmentos de ADN se ligaron para generar pK9G9. OLEl . ilvD .

Ejemplo 11 Construcción de PNY2240 y PNY2242 La cepa PNY2240 se derivó de PNY2211 después de la transformación con los plásmidos pLH702 (sec. con núm. de ident. : 181) y pBP915 (sec. con núm. de ident. : 182) . Los transformantes se colocaron en placas con medio completo sintético sin histidina ni uracilo (etanol al 1 % como fuente de carbono) . Los transformantes se parcharon en el mismo medio que contiene glucosa al 2 % y etanol al 0.05 % como fuentes de carbono. Se usó tres parches para inocular el medio líquido (completo sintético sin uracilo con glucosa al 0.3 % y etanol al 0.3 % como fuentes de carbono) . Para evaluar la producción de isobutanol, los cultivos líquidos se subcultivaron en medio completo sintético sin uracilo que contiene glucosa al 2 % y etanol al 0.05 % como fuentes de carbono que contenían, además, mezcla de vitaminas BME (Sigma, cat . núra. B6891) . Los cultivos se incubaron en viales de suero sellados (10 mi de medio en viales de 15 mi) a 30 °C con agitación (250 rpm en un agitador Infors Multitron) . Después de 48 horas, el medio de cultivo se filtró (columna Spin-X) y se analizó por HPLC (como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad) . Un clon se designó PNY2240.

La cepa PNY2242 se derivó de PNY2238 después de la transformación con los plásmidos pLH702 (sec. con núm. de ident. : 181) y pYZ067AkivDAhADH (descritos en la presente descripción anteriormente) . Los transformantes se colocaron en placas con medio completo sintético sin histidina ni uracilo (etanol al 1 % como fuente de carbono) . Los transformantes se parcharon en el mismo medio que contiene glucosa al 2 % y etanol al 0.05 % como fuentes de carbono. Tres parches se evaluaron para analizar la producción de isobutanol, como se describió anteriormente. Los tres funcionaron del mismo modo en cuanto al consumo de glucosa y la producción de isobutanol. Un clon se denominó PNY2242 y se caracterizó adicionalmente en condiciones de fermentación, como se describe en la presente descripción a continuación. Ejemplo 12 Construcción de la cepa BP1064 de Saccharomyces cerevisiae (PNY1503) La cepa BP1064 se derivó de CEN.PK 113-7D (CBS 8340; Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) Fungal Biodiversity Centre, Países Bajos) y contiene supresiones de los siguientes genes: URA3 , HIS3, PDC1, PDC5 , PDC6 y GPD2. BP1064 se transformó con los plásmidos pYZ090 (sec. con núm. de ident . : 195) y pLH468 (sec. con núm. de ident . : 139) para crear la cepa NGCI-070 (BP1083; PNY1504).

Las supresiones, que eliminaron completamente toda la secuencia codificante, se crearon mediante recombinación homologa con fragmentos de PCR que contenían regiones de homología dirección 5' y dirección 3' del gen objetivo y un marcador de resistencia de G418 o gen URA3 para la selección de transformantes. El marcador de resistencia G418, flanqueado por los sitios loxP, se eliminó con el uso de Cre recombinasa (pRS423 : : PGALl-cre ; sec. con núm. de ident.: 271) . El gen URA3 se eliminó por recombinación homologa para crear una supresión sin marcas o, en el caso de estar flanqueado por sitios loxP, se eliminó con recombinasa Cre. Supresión de URA3 Para eliminar la región codificante URA3 endógena, un cásete ura3 : : ????-kanMX- loxP se amplificó por PCR a partir de la plantilla pLA54 (sec. con núm. de ident. :386). pLA54 contiene el promotor TEFl de K. lactis y el marcador kanMX, y está flanqueado por los sitios loxP para permitir la recombinación con Cre recombinasa y la eliminación del marcador. Se realizó un análisis de PCR mediante el uso de ADN polimerasa Phusion y los cebadores BK505 y BK506 (sec. con núms . de ident . : 294 y 295) . La porción URA3 de cada cebador se derivó de la región 5' dirección 5' del promotor URA3 y la región 3' dirección 3' de la región codificante de manera que la integración del marcador loxP-kanMX-loxP generó el reempbucle de la región codificante de URA3. El producto de PCR se transformó en CEN.PK 113 -7D mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes se seleccionaron en YPD que contenía G418 (100 µg/ml) a 30 °C. Se analizaron los transformantes para verificar su integración correcta por PCR mediante el uso de los cebadores LA468 y LA492 (sec. con núms. de ident.: 296 y 297) y se designaron CEN.PK 113-7D Aura3 : : kanMX .

Supresión de HIS3 Los cuatro fragmentos del cásete de la PCR para la supresión sin marcas de HIS3 se amplificaron con la mezcla para PCR de alta fidelidad "Phusion High Fidelity PCR Master Mix" (New England BioLabs; Ipswich, MA) y el ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen; Valencia, CA) . El fragmento A de HIS3 se amplificó con el cebador oBP452 (sec. con núm. de ident . : 298) y el cebador oBP453 (sec. con núm. de ident.: 299), que contenía una cola 5 ' con homología al extremo 51 del fragmento B de HIS3. El fragmento B de HIS3 se amplificó con el cebador oBP454 (sec. con núm. de ident. : 300) , que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del fragmento A de HIS3, y el cebador OBP455 (sec. con núm. de ident.: 301), que contenía una cola 51 con homología al extremo 51 del fragmento U de HIS3. El fragmento U de HIS3 se amplificó con el cebador oBP456 (sec. con núm. de ident.: 302), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del fragmento B de HIS3, y el cebador OBP457 (sec. con núm. de ident.: 303), que contenía una cola 5 ' con homología al extremo 5 ' del fragmento C de HIS3. El fragmento C de HIS3 se amplificó con el cebador oBP458 (sec. con núm. de ident.: 304), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del fragmento U de HIS3, y el cebador ???459 (sec. con núm. de ident.: 305) . Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . El fragmento AB de HIS3 se creó mediante PCR superpuesta al mezclar el fragmento A de HIS3 y el fragmento B de HIS3 y amplificar con los cebadores OBP452 (sec. con núm. de ident.: 298) y OBP455 (sec. con núm. de ident.: 301). El fragmento UC de HIS3 se creó mediante PCR superpuesta al mezclar el fragmento U de HIS3 y el fragmento C de HIS3 y amplificar con los cebadores OBP456 (sec. con núm. de ident . : 302) y oBP459 (sec. con núm. de ident . : 305) . Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa y, después, se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel (Qiagen) . El cásete ABUC de HIS3 se creó mediante PCR superpuesta al mezclar el fragmento AB de HIS3 y el fragmento UC de HIS3 y amplificar con los cebadores OBP452 (sec. con núm. de ident.: 298) y OBP459 (sec. con núm. de ident. : 305) . El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3 : : kanMX y se transformaron con el cásete de PCR ABUC con HIS3 al usar un conjunto de reactivos para transformación de levaduras "Frozen-EZ Yeast Transíormation II" (Zymo Research; Orange, CA) . Las mezclas para la transformación se cultivaron en placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes con supresión de his3 se analizaron por PCR con los cebadores OBP460 (sec. con núm. de ident. : 306) y OBP461 (sec. con núm. de ident. : 307) mediante el uso del ADN genómico preparado con un kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) . Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : kanMX Ahis3::URA3.

Eliminación del marcador KanMX del sitio Aura3 y eliminación del marcador de URA3 del sitio Ahis3 El marcador KanMX se eliminó mediante la transformación de CEN.P 113-7D Aura3::kanMX Ahis3::URA3 con pRS423:: PGAL1-ere (sec. con núm. de ident . : 271) con el uso de un kit de transformación de levadura II Frozen-ÉZ (Zymo Research) y el cultivo en medio completo sintético sin histidina ni uracilo suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes se cultivaron en YP suplementado con 1 % de galactosa a 30 °C por ~6 horas para inducir la recombinasa Cre y la escisión del marcador KanMX y se cultivaron en placas sobre YPD (2 % de glucosa) a 30 °C para recuperación. Se cultivó un aislado durante toda la noche en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de URA3. Los aislados resistentes a 5-FOA se crecieron y colocaron en placas sobre YPD para remover el plásmido pRS423 : : PGALl-cre . Los aislados se controlaron para identificar la eliminación del marcador KanMX, el marcador de URA3 y el plásmido pRS423 :: PGALl-cre mediante el ensayo del crecimiento en placas YPD+G418, medio sintético completo sin placas de uracilo y medio sintético completo sin placas de histidina. Un aislado adecuado sensible a G418 y auxotrófico para uracilo e histidina se seleccionó como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 y se designó como BP857. Las supresiones y la eliminación del marcador se confirmaron por PCR y secuenciación con los cebadores oBP450 (sec. con núm. de ident. : 308) y oBP451 (sec. con núm. de ident. : 309) para Aura3 y los cebadores oBP460 (sec. con núm. de ident . : 306) y OBP461 (sec. con núm. de ident.: 307) para Ahis3 mediante el uso del ADN genómico preparado con un kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) .

Supresión de PDC6 Los cuatro fragmentos del cásete de PCR para la supresión sin marcas de PDC6 se amplificaron al usar la mezcla para PCR de alta fidelidad "Phusion High Fidelity PCR Master Mix" (New England BioLabs) y el ADN genómico CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . El fragmento A de PDC6 se amplificó con el cebador OBP440 (sec. con núm. de ident. :310) y el cebador OBP441 (sec. con núm. de ident. :311) , que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5 ' del fragmento B de PDC6. El fragmento B de PDC6 se amplificó con el cebador OBP442 (sec. con núm. de ident. :312) , que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' 1 del fragmento A de PDC6 , y el cebador ???443 (sec. con núm. de ident.: 313), que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento U de PDC6. El fragmento U de PDC6 se amplificó con el cebador oBP444 (sec. con núm. de ident. :314) , que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento B de PDC6 , y el cebador OBP445 (sec. con núm. de ident. :315), que contiene una cola 5' con homología con el extremo 5' del fragmento C de PDC6. El fragmento C de PDC6 se amplificó con el cebador oBP446 (sec. con núm. de ident.:316), que contiene una cola 5' con homología con el extremo 3' del fragmento U de PDC6 , y el cebador OBP447 (sec. con núm. de ident.:317). Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . El fragmento AB de PDC6 se creó mediante PCR superpuesta al mezclar el fragmento A de PDC6 y el fragmento B de PDC6 y amplificar con los cebadores oBP440 (sec. con núm. de ident . : 310) y ???443 (sec. con núm. de ident.: 313) . El fragmento UC de PDC6 se creó mediante PCR superpuesta al mezclar el fragmento U de PDC6 y el fragmento C de PDC6 y amplificar con los cebadores ???444 (sec. con núm. de ident.: 314) y ???447 (sec. con núm. de ident.: 317) . Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa y, después, se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel (Qiagen) . El cásete ABUC de PDC6 se creó mediante PCR superpuesta al mezclar el fragmento AB de PDC6 y el fragmento UC de PDC6 y amplificar con los cebadores ???440 (sec. OBP447 con núm. de ident.: 310) y ???447 (sec. con núm. de ident.: 317). El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113 -7D Aura3 : : loxP Ahis3 y se transformaron con el cásete ABUC con PDC6 preparado por PCR al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras "Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zymo Research) . Las mezclas para la transformación se cultivaron en placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes con supresión de pdc6 se analizaron por PCR con los cebadores oBP448 (sec. con núm. de ident . : 318) y oBP449 (sec. con núm. de ident. : 319) mediante el uso del ADN genómico preparado con un kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) . Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113 -7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6::URA3.

La cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6::URA3 se cultivó durante toda la noche en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de URA3. La supresión y la eliminación del marcador se confirmaron por PCR y secuenciación con los cebadores oBP448 (sec. con núm. de ident.: 318) y oBP449 (sec. con núm. de ident.: 319) mediante el ADN genómico preparado con el kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) . La ausencia del gen PDC6 de la cepa aislada se demostró con un resultado negativo de PCR mediante el uso de cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC6, oBP554 (sec. con núm. de ident.: 320) y oBP555 (sec. con núm. de ident.: 321) . Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 y se designó como BP891.

Supresión de PDCl-integración de ilvDSm El gen PDCl se eliminó y se reemplazó con la región codificante de ilvD de Streptococcus mutans núm. de la ATCC 700610. El fragmento A seguido por la región codificante de ilvD de Streptococcus mutans para el cásete de PCR para la supresión de PDCl-integración de ilvDSm se amplificó con el uso de la mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion (New England BioLabs) y ADN genómico de NYLA83 como plantilla, preparado con un kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) . NYLA83 es una cepa que porta la supresión de PDCl-integración de ilvDSm que se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305363, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad. El fragmento A-ilvDSm de PDCl (sec. con núm. de ident . : 322) se amplificó con el cebador oBP513 (sec. con núm. de ident.: 326) y el cebador OBP515 (sec. con núm. de ident.: 327), que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del fragmento B de PDCl. Los fragmentos B, U y C del cásete de PCR para la supresión de PDCl-integración de ilvDSm se amplificó mediante el uso de la mezcla Phusion High Fidelity PCR Master ix (New England BioLabs) y el ADN genómico de CEN.PK 113-7D como plantilla, preparado con un kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) . El fragmento B de PDCl se amplificó con el cebador OBP516 (sec. con núm. de ident . : 328) que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del fragmento A-ilvDSm de PDCl, y el cebador OBP517 (sec. con núm. de ident.: 329), que contenía una cola 5 ' con homología al extremo 51 del fragmento U de PDCl. El fragmento U de PDCl se amplificó con el cebador oBP518 (sec. con núm. de ident.: 330), que contenía una cola 51 con homología al extremo 31 del fragmento B de PDCl, y el cebador OBP519 (sec. con núm. de ident.: 331), que contenía una cola 5' con homología al extremo 5' del fragmento C de PDCl. El fragmento C de PDCl se amplificó con el cebador OBP520 (sec. con núm. de ident.: 332), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' del fragmento U de PDCl, y el cebador OBP521 (sec. con núm. de ident. : 333) . Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . El fragmento A-ilvDSm-B de PDCl se creó mediante PCR superpuesta al mezclar, el fragmento A-ilvDSmde PDCl y el fragmento B de PDCl y amplificar con los cebadores OBP513 (sec. con núm. de ident.: 326) y OBP517 (sec. con núm. de ident. : 329) . El fragmento UC de PDCl se creó mediante PCR superpuesta PDCl al mezclar el fragmento U de PDCl y el fragmento C de PDCl y amplificar con los cebadores OBP518 (sec. con núm. de ident. : 330) y OBP521 (sec. con núm. de ident.: 333) . Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa y, después, se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel (Qiagen) . El cásete A-ilvDSm-BUC de PDC1 (sec. con núm. de ident . : 323) se creó por PCR superpuesta al mezclar el fragmento A-ilvDSm-B de PDC1 y el fragmento UC de PDC1 y amplificar con los cebadores oBP513 (sec. con núm. de ident.: 326) y OBP521 (sec. con núm. de ident. : 333) . El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113 -7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 y se transformaron con el cásete PDC1 A-ilvDSm-BUC preparado por PCR al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras "Frozen-EZ Yeast Transíormation II" (Zymo Research) . Las mezclas para la transformación se cultivaron en. placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo suplementados con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes con una supresión de pdcl e integración de ilvDSm se analizaron por PCR con los cebadores OBP511 (sec. con núm. de ident.: 336) y OBP512 (sec. con núm. de ident. : 337) mediante el uso del ADN genómico preparado con un kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) . La ausencia del gen PDC1 de la cepa aislada se demostró con un resultado negativo de PCR mediante el uso de cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC1, ???550 (sec. con núm. de ident.: 338) y OBP551 (sec. con núm. de ident.: 339) . Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm-URA3.

La cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm-URA3 se cultivó durante toda la noche en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar las cepas aisladas que perdieron el marcador de URA3. La supresión de PDC1, integración de ilvDSm y eliminación del marcador se confirmaron por PCR y secuenciación con los cebadores oBP511 (sec. con núm. de ident.: 336) y OBP512 (sec. con núm. de ident . : 337) mediante el uso del ADN genómico preparado con un kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) . Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : :ilvDSm y se designó como BP907.

Supresión de PDC5- integración de sadB El gen PDC5 se eliminó y se reemplazó con la región codificante de sadB de Achromobacter xylosoxidans (el gen sadB se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0269823, que se incorpora como referencia en la presente descripción en su totalidad) . Un segmento del cásete de PCR para la supresión de PDC5- integración de sadB se clonó primero en el plásmido pUC19 -URA3MCS . pUC19-URA3MCS está basado en pUC19 y contiene la secuencia del gen URA3 de Saccharomyces cerevisiae ubicado dentro de un sitio de clonación múltiple ( CS, por sus siglas en inglés) . pUC19 contiene el replicón de p Bl y un gen que codifica la beta- lactamasa para la replicación y selección en Escherichia coli. Adicionalmente a la secuencia codificante para URA3 se incluyeron las secuencias dirección 5' y dirección 3' de este gen para la expresión del gen URA3 en levadura. El vector puede usarse para propósitos de clonación y como un vector de integración de levadura.

El ADN que abarca la región codificante URA3 junto con los 250 pb dirección 5' y los 150 pb dirección 3' de la región codificante URA3 del ADN genómico de CEN.PK 113-7D de Saccharomyces cerevisiae se amplificó con los cebadores ???438 (sec. con núm. de ident.: 334), que contenía los sitios de restricción BamHI, AscI, Pmel y Fsel, y OBP439 (sec. con núm. de ident.: 335), que contenía los sitios de restricción Xbal, Pací y Notl, mediante el uso de la mezcla Phusion High-Fidelity PCR Master ix (New England BioLabs) . El ADN genómico se preparó con el conjunto de reactivos para levaduras/bacterias Gentra Puregene (Qiagen) . El producto de PCR y pUC19 (sec. con núm. de ident. : 325) se unieron con la ADN-ligasa T4 después de la digestión con BamHI y Xbal para crear el vector pUC19-URA3MCS . El vector se confirmó por PCR y secuenciación con los cebadores oBP264 (sec. con núm. de ident. :342) y oBP265 (sec. con núm. de ident. :343).

La secuencia codificante de sadB y el fragmento B de PDC5 se clonaron en pUC19-URA3MCS para crear la porción sadB-BU del cásete de PCR de PDC5 A-sadB-BUC. La secuencia codificante de sadB se amplificó mediante el uso de pLH468-sadB (sec. con núm. de ident . : 359) como plantilla con el cebador oBP530 (sec. con núm. de ident.: 344), que contenía un sitio de restricción AscI, y el cebador oBP531 (sec. con núm. de ident.: 345), que contenía una cola 5' con homología al extremo 51 del fragmento B de PDC5. El fragmento B de PDC5 se amplificó con el cebador oBP532 (sec. con núm. de ident.: 346), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' de sadB, y el cebador oBP533 (sec. con núm. de ident. : 347) , que contenía un sitio de restricción Pmel. Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación de PCR (Qiagen) . El fragmento B de sadB-PDC5 se creó por PCR superpuesta al mezclar los productos de PCR de sadB y el fragmento B de PDC5 y amplificar con los cebadores oBP530 (sec. con núm. de ident. : 344) y OBP533 (sec. con núm. de ident. : 347) . Se realizó la digestión del producto de PCR resultante con AscI y Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de pUC19-URA3MCS después de la digestión con las enzimas apropiadas . El plásmido resultante se usó como plantilla para la amplificación de sadB-Fragmento B-Fragmento U mediante el uso de los cebadores OBP536 (sec. con núm. de ident.: 348) y OBP546 (sec. 'con núm. de ident.: 349), que contenían una cola 5 ' con homología al extremo 5 ' del fragmento C de PDC5. El fragmento C de PDC5 se amplificó con el cebador oBP547 (sec. con núm. de ident.: 350), que contenía una cola 5' con homología al extremo 3' de sadB-Fragmento B-Fragmento U de PDC5, y el cebador ???539 (sec. con núm. de ident. : 351) . Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) . sadB-Fragmento B-Fragmento U-Fragmento C de PDC5 se creó por PCR superpuesta al mezclar sadB-Fragmento B-Fragmento U y el fragmento C de PDC5 y amplificar con los cebadores oBP536 (sec. con núm. de ident.: 348) y OBP539 (sec. con núm. de ident.: 351). El producto resultante de la PCR se purificó sobre un gel de agarosa y, después, se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel (Qiagen) . El cásete PDC5 A-sadB-BUC (sec. con núm. de ident.: 324) se creó al amplificar sadB-Fragmento B-Fragmento U-Fragmento C de PDC5 con los cebadores OBP542 (sec. con núm. de ident.: 352), que contenían una cola S1 con homología a los 50 nucleótidos inmediatamente dirección 5' de la secuencia codificante de PDC5 nativo, y OBP539 (sec. con núm. de ident.: 351). El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR (Qiagen) .

Se prepararon células competentes de CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm y se transformaron con el cásete PDC5 A-sadB-BUC preparado por PCR al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras "Frozen-EZ Yeast Transformation II" (Zymo Research) . Las mezclas de transformación se sembraron en placas en medios completos sintéticos sin uracilo complementados con etanol al 1 % (sin glucosa) a 30 °C. Los transformantes con una supresión de pdc5 e integración de sadB se analizaron por PCR con los cebadores OBP540 (sec. con núm. de ident . : 353) y OBP541 (sec. con núm. de ident. : 354) mediante el uso del ADN genómico preparado con el kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) . La ausencia del gen PDC5 de la cepa aislada se demostró con un resultado negativo de PCR mediante el uso de cebadores específicos para la secuencia codificante de PDC5, OBP552 (sec. con núm. de ident.: 355) y oBP553 (sec. con núm. de ident.: 356). Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D ñura3 : : loxP ñhis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB-URA3.

CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP Ahis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB-URA3 se cultivó durante la noche en YPE (etanol al 1 %) y se sembró en placas en medio sintético completo complementado con etanol (sin glucosa) y que contiene ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de URA3. La supresión de PDC5 , la integración de sadB y la eliminación del marcador se confirmaron por PCR con los cebadores ???540 (sec. con núm. de ident.: 353) y oBP541 (sec. con núm. de ident.: 354) mediante el uso del ADN genómico preparado con un kit de levadura/bacteria Gentra Puregene (Qiagen) . Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D Aura3 : : loxP ñhis3 Apdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5 : : sadB y se designó como BP913.

Supresión de GPD2 Para eliminar la región codificante de GPD2 endógena, se amplificó por PCR un cásete gpd2 : : loxP-URA3-loxP (sec. con núm. de ident . : 361) mediante el uso de PCR de loxP-URA3-loxP (sec. con núm. de ident. :360) como plantilla de ADN. loxP-URA3-loxP contiene el marcador de URA3 de (ATCC núm. 77107) flanqueado por sitios de recombinasa loxP. Se realizó un análisis de PCR mediante el uso de ADN polimerasa de Phusion y los cebadores LA512 y LA513 (sec. con núms. de ident.: 340 y 341) . La porción GPD2 de cada cebador se derivó de la región 5' dirección 5' de la región codificante de GPD2 y de la región 3' dirección 3' de la región codificante de manera que la integración del marcador loxP-URA3 - loxP generó el reempbucle de la región codificante de GPD2. El producto de PCR se transformó en BP913 y los transformantes se seleccionaron sobre un medio sintético completo sin uracilo suplementado con etanol al 1 % (sin glucosa) . Se analizaron los transformantes para verificar su integración correcta por PCR mediante el uso de los cebadores OBP582 y AA270 (sec. con núms. de ident. : 357 y 358) .

El marcador de URA3 se recicló mediante la transformación con pRS423 : : PGALl-cre (sec. con núm. de ident.: 271) y se colocó en placas en un medio sintético completo sin histidina suplementado con etanol al 1 % a 30 °C. Los transformantes se sembraron en estrías en un medio sintético completo suplementado con etanol al 1 % y que contenía ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) y se incubaron a 30 °C para seleccionar las cepas aisladas que perdieron el marcador de URA3. Los aislados resistentes a 5-FOA se cultivaron en YPE (etanol al 1 %) para la eliminación del plásmido pRS423 : : PGALl-cre . La supresión y eliminación del marcador se confirmaron por PCR con los cebadores ???582 (sec. con núm. de ident.: 357) y OBP591 (sec. con núm. de ident. : 362) . Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa CEN.PK 113-7D ñura3 : : loxP Ahis3 ñpdc6 Apdcl : : ilvDSm Apdc5::sadB Agpd2 : : loxP y se designó como PNY1503 (BP1064). Ejemplo 13 Construcción de PNY2204 y plásmidos de la ruta de isobutanol El propósito de este ejemplo es describir la construcción de un vector para permitir la integración de un gen que codifica acetolactato sintasa en la región intergénica de origen natural entre las secuencias codificantes PDC1 y TRX1 en el Cromosoma XII. Se describe, además, las cepas resultantes del uso de este vector.

Construcción del vector de integración pUC19 -kan : : pdcl : : FBA-alsS: :TRX1 ' El cásete FBA-alsS-CYCt se construyó al mover el fragmento 1.7 kb BbvCI/PacI de pRS426 : : GPD : : alsS : : CYC (descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 7,851,188, que se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad) a pRS426 : : FBA: : ILV5 : : CYC (descrito en la patente de los Estados Unidos núm. 7,851,188, que se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad) , que se había digerido previamente con BbvCI/PacI para liberar el gen ILV5. Las reacciones de ligación se transformaron en células TOP10 de E. coli y los transformantes se analizaron por PCR mediante el uso de los cebadores N98SeqFl (sec. con núm. de ident . : 363) y N99SeqR2 (sec. con núm. de ident. : 365) . El cásete FBA-alsS-CYCt se aisló del vector con el uso de BglII y Notl para la clonación en pUC19-URA3 : : ilvD-TRXl (clon "B" ) en el sitio AflII (el fragmento Klenow se usó para que los extremos sean compatibles para la ligación) . Los transformantes que contenían el cásete alsS en ambas orientaciones en el vector se obtuvieron y se confirmaron por PCR con el uso de los cebadores N98SeqF4 (sec. con núm. de ident. : 364) y Nllll (sec. con núm. de ident.: 366) para la configuración "A" y N98SeqF4 (sec. con núm. de ident. :364) y N1110 (sec. con núm. de ident. : 367) para la configuración ' "B" . Después, se realizó una versión seleccionable con geneticina del vector de configuración "A" al eliminar el gen URA3 (fragmento Notl/Nael de 1.2 kb) y agregar un cásete de geneticina. Se usó el fragmento de Klenow para hacer que todos los extremos sean compatibles para la ligación, y se analizaron los transformantes por PCR para seleccionar un clon con el gen de resistencia a la geneticina en la misma orientación que el marcador URA3 previo mediante el uso de los cebadores BK468 (sec. con núm. de ident . : 368) y N160SeqF5 (sec. con núm. de ident. : 210) . El clon resultante se denominó pUC19-kan : :pdcl : : FBA-alsS : : TRX1 (clon A) (sec. con núm. de ident.: 387) .

Construcción de las cepas integrantes de alsS y derivados que producen isobutanol El vector de integración pUC19 -kan : :pdcl :: FBA-alsS descrito anteriormente se linearizó con Pmel y se transformó en PNY1507 (Ejemplo 8) . Pmel corta el vector dentro de la región intergénica pdcl-TRXl clonada y, por lo tanto, produce la integración dirigida a la ubicación (Rodney Rothstein, Methods in Enzymology, 1991, Volumen 194, págs . 281-301) . Los transformantes se seleccionaron en YPE más 50 ]ig/ml de G418. Los transformantes parchados se analizaron por PCR para el evento de integración mediante el uso de los cebadores N160SeqF5 (sec. con núm. de ident.: 210) y OBP512 (sec. con núm. de ident. : 337) . Se probaron dos transformantes indirectamente para determinar la función de acetolactato sintasa mediante la evaluación de la capacidad de las cepas para preparar isobutanol. Para esto, se suministraron genes adicionales de la ruta de isobutanol en los vectores lanzadera de levadura-E. coli (pYZ090AalsS y pBP915, que se describen más abajo) . Un clon se denominó PNY2205. La cepa genitora libre de plásmidos se denominó PNY2204 (MATa ura3A::loxP his3A pdc6A pdclA : : P [PDC1] -DHAD | ilvD_Sm-PDClt-pUC19-loxP-kanMX-loxP-P[FBAl]-ALS|alsS_Bs-CYClt pdc5A: :P[PDC5] -ADH | sadB_Ax-PDC5t gpd2A : : loxP fra2A adhlA: :UAS (PGK1) P [FBAl] -kivD_Ll (y) -ADHlt) .

Plásmidos de la ruta de isobutanol (pYZ090AalsS y pBP915) Se digirió pYZ090 (sec. con núm . de ident . : 195) con Spel y Notl para eliminar la mayor parte del promotor CUP1 y la totalidad de la secuencia codificante alsS y el terminador CYC . Después, se realizó la autoligación del vector posterior al tratamiento con el fragmento de Klenow y se transformó en células Stbl3 de E. coli y se seleccionó la resistencia a la ampicilina. La eliminación de la región de ADN se confirmó para dos clones independientes mediante secuenciación de ADN a través de la ligación de ligación por PCR con el cebador N191 (sec. con núm. de ident. : 370) . El plásmido resultante se denominó pYZ090ñalsS (sec. con núm. de ident.: 371). El plásmido pLH468 se construyó para la expresión de DHAD, KivD y HADH en levadura. pBP915 (sec. con núm. de ident.: 182) se construyó de pLH468 (sec. con núm. de ident.: 139) al eliminar el gen kivD y 957 pares de bases del promotor TDH3 dirección 5' de kivD. pLH468 se digirió con SwaI y el fragmento grande (12896 pb) se purificó en un gel de agarosa seguido por un kit de extracción con gel (Qiagen; Valencia, CA) . El fragmento de ADN aislado se autoligó con ADN ligasa T4 y se usó para transformar TOP10 de Escherichia coli electrocompetente (Invitrogen; Carlsbad, CA) . Se aislaron plásmidos a partir de transformantes y se controlaron para determinar la supresión apropiada por análisis de restricción con la enzima de restricción SwaI. Además, las cepas aisladas se secuenciaron a través del sitio de supresión con los cebadores ???556 (sec. con núm. de ident.: 372) y OBP561 (sec. con núm. de ident.: 373). Un clon con la supresión adecuada se denominó pBP915 (pLH468ñkivD) (sec. con núm. de ident.: 182). pYZ090 se basa en la cadena principal de pHR81 (núm. de la ATCC 87541, Manassas, VA) . pYZ090 se construyó para contener un gen quimérico que tiene la región codificante del gen alsS de Bacillus subtilis (posición de nt 457-2172) expresado del promotor CUPl de levadura (nt 2-449) y seguido por el terminador CYC1 (nt 2181-2430) para la expresión de ALS, y un gen quimérico que tiene la región codificante del gen ilvC de Lactococcus lactis (nt 3634-4656) expresado del promotor ILV5 de levadura (2433-3626) y seguido por el terminador ILV5 (nt 4682-5304) para la expresión de KARI .

Ejemplo 14.

Producción de isobutanol-PNY1910 y PNY2242 Métodos : Preparación del medio de inoculo 1 1 de medio de inoculo contenía: 6.7 g, base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos (Difco 0919-15-3); 2.8 g, suplemento del medio selectivo sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano y uracilo (Sigma Y2Ó01) ; 20 mi de 1 % (peso/volumen) de L-leucina; 4 mi de 1 % (peso/volumen) de L-triptófano; 3 g de etanol; 10 g de glucosa.

Preparación del medio de fermentación definido El volumen de caldo de cultivo después de la inoculación fue de 800 mi, con la siguiente composición final, por litro: 5 g de sulfato amónico, 2.8 g de fosfato potásico monobásico, 1.9 g de septahidrato de sulfato magnésico, 0.2 mi de antiespuma (Sigma DF204), suplemento de medio selectivo sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano y uracilo (Sigma Y2001) , 16 mg de L-leucina, 4 mg de L-triptófano, 6 mi de una mezcla de vitaminas (en 1 1 de agua, 50 mg de biotina, 1 g de Ca-pantotenato, 1 g de ácido nicotínico, 25 g de mió- inositol , 1 g de clorhidrato de cloruro de tiamina, 1 g de clorhidrato de piridoxol, 0.2 g de ácido p-aminobenzoico) 6 mi de una solución de minerales traza (en 1 1 de agua, 15 g de EDTA, 4.5 g de heptahidrato de sulfato de zinc, 0.8 g de cloruro de manganeso deshidratado, 0.3 g de hexahidrato de cloruro de cobalto, 0.3 g pentahidrato de sulfato de cobre, 0.4 g de molibdeno disódico deshidratado, 4.5 g de dihidrato de cloruro cálcico, 3 g de heptahidrato de sulfato de hierro, 1 g de ácido bórico, 0.1 g de yoduro potásico) , 30 mg de HC1 de tiamina, 30 mg de ácido nicotínico. El pH se ajustó hasta 5.2 con KOH 2N y se agregó glucosa hasta 10 g/1.

Preparación del inoculo Se inoculó un matraz de agitación de 125 mi directamente de un vial congelado al colocar con la pipeta el cultivo completo del vial (aproximadamente 1 mi) en 10 mi del medio de inoculo. Se incubó el matraz a 260 rpm y 30 °C. Se cultivó la cepa durante la noche hasta alcanzar una OD de aproximadamente 1.0. Se determinó la OD a ? = 600 nm en un espectrofotómetro Beckman (Beckman, Estados Unidos) .

Diseño experimental de los biorreactores Las fermentaciones se llevaron a cabo en 1 1 de termentadores Biostat B DCU3 (Sartorius, Estados Unidos) con un volumen de trabajo en 0.8 1. La composición de emisión de gas se monitoreó por medio de un espectrómetro de masas Prima DB (Thermo Electron Corp., Estados Unidos) . La temperatura se mantuvo a 30 °C y el pH se controló a 5.2 con KOH 2N durante toda la fermentación. Directamente después de la inoculación con 80 mi del inoculo, el dO se controló con agitación a 30 %, el H se controló a 5.25, la aireación se controló a 0.2 1/min. Una vez que se alcanzó una OD de aproximadamente de 3 , el gas se cambió a N2 para un cultivo anaerobio. Durante toda la fermentación, la glucosa se mantuvo en exceso (5-20 g/1) mediante adiciones manuales de una solución al 50 % (w/w) .

Métodos para analizar los experimentos de cultivo Se determinó la OD a ? = 600 nm en un espectrofotómetro al insertar con pipeta una muestra de caldo bien mezclada en una cubeta (CS500 VWR International, Alemania) . Si la concentración de biomasa de la muestra excedía el intervalo de absorción lineal del espectrofotómetro (típicamente, valores de OD de 0.000 a 0.300), la muestra se diluía con solución de NaCl al 0.9 % para obtener valores en el intervalo lineal.

Las mediciones de glucosa, isobutanol y otros subproductos de fermentación en el sobrenadante del cultivo se realizaron por HPLC, con el uso de una columna Bio-Rad Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Estados Unidos) , con detectores del índice de refracción (RI, por sus siglas en inglés) y de una matriz de diodos (210 nm) . Se logró la separación cromatográfica mediante el uso de 0.01 N de H2S04 como fase móvil con un índice de flujo de 0.6 ml/min y una temperatura de columna de 40 °C. En estas condiciones, el tiempo de retención de isobutanol es de 32.2 minutos. La concentración de isobutanol en las muestras de emisión de gas se determinó con el uso de un espectrómetro de masas .

Resultados La concentración de biomasa máxima determinada como densidad óptica (OD, por sus siglas en inglés) , el índice volumétrico de producción de isobutanol, el título de isobutanol final y el rendimiento de isobutanol en glucosa se presentan en la siguiente tabla. La cepa PNY2242 tenía títulos mayores e índices más rápidos que la cepa PNY1910 y produjo isobutanol con índice y título mayores específicos. Los índices específicos se muestran en la Figura 5. La acumulación del DHIV + DHMB en el sobrenadante del cultivo fue tres veces mayor con PNY1910 en comparación con la cepa PNY2242 (Figura 6). El rendimiento de glicerol, ácido pirúvico, BDO, DHIV+DHMB*, aKIV y ácido isobutírico en glucosa se muestra en la Figura 7.

*DHIV analizado por el método de HPLC incluye tanto DHIV como DHMB.

Tabla 19 Ejemplo 15.

Construcción de la genoteca de PCR propensa a errores de K9G9 La PCR propensa a errores de K9G9 se llevó a cabo para generar una genoteca que se puede analizar para detectar variantes con incrementos en los valores Km para NADPH con relación a NADH. La PCR mutagénica de K9G9 se llevó a cabo con el kit de mutagénesis del dominio GeneMorph® II EZClone (catálogo núm. 200552; Agilent Technologies, Stratagene Products División, La Jolla, CA) . Los cebadores K9G9_EZ_F1 (AAA CAT GGA AGA ATG TAA GAT GGC; sec. con núm. de ident . : 390) y K9G9_EZ_R1 (TCA GTT GTT AAT CAA CTT GTC TTC G; sec. con núm. de ident.: 391) fueron sintetizados comercialmente por Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville IA) . Aparte de los cebadores, la plantilla y H20 dd, los reactivos usados aquí fueron suministrados con el kit mencionado anteriormente. La mezcla para PCR mutagénica consistió en 4 µ? de pHR81-PI1 5 -KARI -K9. G9 (sec. con núm. de ident.: 392) (770 ng/Vg) , 1.25 µ? de cada cebador (100 ng/ µ? de soluciones base) , 5 µ? de regulador de reacción Mutazyme II ???, 1 µ? de mezcla de dNTP 40 mM, 1.5 µ? de ADN polimerasa Mutazyme II y 36 µ? de H20 dd. Se usó las siguientes condiciones para la reacción de PCR: La temperatura inicial fue 95 °C durante 2.0 min, seguida por 30 ciclos de calentamiento/enfriamiento . Cada ciclo consistió en 95 °C durante 30 s, 48 °C durante 30 s y 72 °C durante 2.0 min. Al terminar el ciclo de temperatura, la muestra se mantuvo a 72 °C durante 10.0 min más y, después, se esperó la recuperación de la muestra a 4 °C. El producto de reacción se separó de la plantilla por medio de electroforesis en gel de agarosa (agarosa al 1 %, regulador IX TBE) y se recuperó con el uso del kit de extracción de ADN con gel StrataPrep® (catálogo núm. 400766, Agilent Technologies, Stratagene Products División, La Jolla, CA) según las recomendaciones del fabricante.

Se usó el producto de reacción aislado como un megacebador para generar genotecas de genes en la "reacción EZClone" del kit indicado anteriormente. Aparte del megacebador, la plantilla y H20 dd, los reactivos usados aquí fueron suministrados con el kit indicado anteriormente. La reacción consistió en 25 µ? de la mezcla de enzimas EZClone 2x, 4 µ? de megacebador (125 ng/ µ?) , 2 µ? de K9G9 en un vector pBAD.KA I(25 ng/ µ?), 3 µ? de solución EZClone y 16 µ? de H20 dd. Para la reacción se usó las siguientes condiciones: La temperatura inicial fue de 95 °C durante 1.0 min, seguida por 30 ciclos de calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consistió en 95 °C durante 50 s, 60 °C durante 50 s y 68 °C durante 10.0 min. Al terminar el ciclo de temperatura, las muestras se mantuvieron a 72 °C durante 10.0 min más y, después, se esperó la recuperación de la muestra a 4 °C. Se agregó 1 µ? de Dpn I (10 U/µ?) y la mezcla se incubó durante 4 horas a 37 °C.

Después, 4 µ? del producto de "reacción EZClone" digerido con Dpn I se transformaron en 50 µ? de células ultracompetentes de E. coli XLIO-Gold® (proporcionadas en el kit de mutagénesis del dominio GeneMorph® II EZClone) según las recomendaciones del fabricante. Los transformantes se dispersaron en placas de agar que contienen el medio LB y 100 µg/ml de ampicilina (catálogo núm. L1004, Teknova Inc. Hollister, CA) , se incubaron a 37 °C durante la noche y se almacenaron a 4 °C. Estas etapas se repitieron con 4 µ? de producto de "reacción EZClone" digerido con Dpn I y 50 µ? de células por transformación para un total de 10 transformaciones. La genoteca resultante en XL-Gold se desprendió de las placas de agar con una solución que contiene sales M9, se combinó, se diluyó en medio que contiene el medio LB y 100 µg/ml de ampicilina y se incubó a 37 °C durante la noche. El ADN de la genoteca se aisló de las células con el kit QIAprep Spin Miniprep (catálogo núm. 2706; Qiagen, Valencia, CA) de conformidad con el protocolo proporcionado por el fabricante. Después, la genoteca amplificada se usó para transformar una cepa electrocompentente de Bw25113 de E. coli (AilvC) con el uso del Bio ad Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA) . Los clones transformados se dispersaron en placas de agar que contienen el medio LB y 100 µg/ml de ampicilina (núra. 101320-154, Teknova Inc. Hollister, CA) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Los clones se usaron para la evaluación de alto rendimiento como se describe en el Ej emplo 16.

Ej emplo 16.

Identificación de variantes de K9G9 con KM incrementada para NADPH por medio de la evaluación para la inhibición de NADP+ reducida de actividad de NADH La genoteca de K9G9 descrita en el Ejemplo 15 se evaluó para detectar variantes con inhibición de NADP+ reducida de actividad de KARI dependiente de NADH. Una variante de K9G9 con inhibición de NADP+ reducida de actividad con NADH puede mostrar, potencialmente, un incremento en la relación de la ¾ para NADPH y la KM para NADH. Con un objetivo específico para incrementar la KM para NADPH con relación a la Km para NADH, los aciertos de la evaluación se purificaron parcialmente y se realizó análisis cinéticos para determinar los parámetros de Vmáx. y de KM con NADH y con NADPH.

Ensayo de evaluación de alto rendimiento de la genoteca de genes K9G9 La evaluación de alto rendimiento de las genotecas de genes de las enzimas KARI mutantes se llevó a cabo como se describe en la presente descripción: El medio de congelación lOx que contiene 554.4 g/1 de glicerol, 68 mM de (NH4)2S04, 4 mM de MgS04 , 17 mM de citrato sódico, 132 mM de KH2P04, 36 mM de K2HP04 se preparó con agua pura molecular y esterilizada con filtro. El medio de congelación se preparó al diluir el medio de congelación lOx con el medio LB . Se usó una alícuota (200 µ?) del medio de congelación lx para cada pocilio de las placas del archivo de 96 pocilios (catálogo núm. 3370, Corning Inc. Corning, NY) .

Los clones de las placas de agar con LB se seleccionaron y se inocularon en las placas del archivo de 96 pocilios que contienen el medio de congelación y se cultivaron durante la noche a 37 °C con agitación. Después, las placas del archivo se almacenaron a -80 °C. La cepa Bw25113 de E. coli (AilvC) , como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 8,129,162, transformada con pBAD-HisB (Invitrogen) se usó siempre como el control negativo. El control positivo para la genoteca fue K9G9-KARI en la cepa Bw25113 de E. coli (AilvC) , como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. US 8, 129, 162.

Los clones de las placas del archivo se inocularon en las placas de 96 pocilios profundos. Cada pocilio contenía 3.0 µ? de células de placas del archivo descongeladas, 200 µ? del medio LB que contiene 100 g/ml de ampicilina y arabinosa al 0.02 % (w/v) como el inductor. Después, las células se cultivaron durante la noche a 37 °C con 80 % de humedad con agitación (900 rpm) , se recolectaron por centrifugación (3750 rpm, 5 min a 25 °C) (Eppendorf centrifuge, Brinkmann Instruments, Inc. estbury, NY) y el comprimido celular se almacenó a -20 °C para el análisis posterior.

El sustrato del ensayo, (R, S) -acetolactato, se sintetizó como lo describen Aulabaugh and Schloss (Aulabaugh and Schloss, Biochemistry, 29: 2824-2830, 1990) . Todas las otras sustancias químicas usadas en el ensayo se adquirieron de Sigma. Después de la conversión enzimática de acetolactato a a, ß-dihidroxiisovalerato por KARI se determinó la oxidación del cofactor, NADH, a partir de la reacción a 340 nm con el uso de un lector de placas (Saphire 2, Tecan, Mannedorf, Suiza) . La actividad se calculó con el uso del coeficiente de extinción molar de 6220 M^cm"1 de NADH.

El comprimido celular congelado en placas con pocilios profundos y BugBuster (Novagen 71456, Darmstadt, Alemania) se calentaron a temperatura ambiente durante 30 min al mismo tiempo. Se agregó 75 µ? de BugBuster al 50 % (v/v en agua) en cada pocilio después de 30 min de calentamiento y las células se suspendieron con el uso de un agitador de placas . Las placas con suspensión de comprimido celular/BugBuster al 50 % se incubaron a temperatura ambiente durante 30 min. El lisado celular se diluyó con 75 µ? de agua d.d, lo que produjo un lisado 0.5X. Los ensayos de los extractos libres de células diluidos se realizaron a 30 °C en regulador que contiene (R/S) -acetolactato 2.4 mM, HEPES 100 mM, pH de 6.8, KC1 100 mM, MgCl2 10 mM, 150 µ? de NADH, 12.5 µ? de lisado celular 0.5 X con o sin NADP+ 2.5 mM.

Identificación de variantes de K9G9 con inhibición de NADP+ reducida de actividad de NADH KARI La relación para el índice determinado de oxidación de NADH en presencia de NADP+ y el índice determinado de oxidación de NADH en ausencia de NADP+ se calculó para cada variante y pocilio de control positivo (2 por placa) . Se calculó la desviación media y la desviación estándar de las relaciones para todos los pocilios de control positivo (104 en total) .

Se consideró una variante del pocilio para contener un acierto inicial si el índice en ausencia de NADP+ fue mayor que 0.1 OD/h y si la relación de índice fue mayor que 0.45 (tres desviaciones estándar mayores que el promedio de control positivo) y menor que 1. Se identificó un total de 521 aciertos de una agrupación de 4607 variantes potenciales. Estos aciertos iniciales se consolidaron para formar una genoteca pequeña para un análisis posterior.

Evaluación secundaria del acierto de la genoteca inicial La genoteca de aciertos consolidados se cultivó por triplicado biológico y los extractos libres de células se prepararon y se sometieron a ensayos como se describió anteriormente. Después, las relaciones de índices se calcularon para las variantes y controles positivos como se describió anteriormente. Los aciertos finales que se seleccionaron para un análisis cinético detallado cumplieron con los siguientes requisitos: el índice en ausencia de NADP+ fue mayor que 0.6 OD/h, la relación de índice fue mayor que 0.51 y menor que 1, y por lo menos dos de tres réplicas biológicas cumplieron los requisitos. Se identificó diecisiete aciertos para el análisis cinético y se colocaron en estrías en placas de LB con adición de 100 pg/ml de ampicilina .

Análisis de secuencias de variantes de K9G9 La secuenciación de ADN de diecisiete variantes identificadas a partir de la evaluación secundaria de HTS se logró con el uso de TempliPhi™ (GE Healthcare) con los cebadores pBAD-For (ATGCCATAGCATTTTTATCC; sec . con núm. de ident.: 393) y pBAD-Rev (CTGATTTAATCTGTATCAGGCT; sec. con núm. de ident.: 394).

Tabla 20. Sustituciones de aminoácidos para las variantes de K9G9 Análisis cinético de variante de proteína parcialmente purificada La cepa Bw25113 de E. coli (AilvC) , como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. US 8,129,162, se usó para expresar las diecisiete variantes y el control positivo K9G9. Las cepas se cultivaron durante 8 horas en 10 mi de caldo de cultivo LB (núm. 46-060-CM, Mediatech, Manassas, VA) que contiene 100 ug/ml de ampicilina a 37 °C con agitación en matraces con deflectores, de 125 mi, con tapas ventiladas y filtradas. Se usó 200 µ? de este cultivo para inocular 100 mi de caldo de cultivo LB con 100 g/ml de ampicilina y arabinosa al 0.2 % (w/v) agregada. Estos cultivos se cultivaron durante 16 a 18 horas a 37 °C con agitación en matraces con deflectores, de 500 mi, con tapas ventiladas y filtradas. Las células se recolectaron en una alícuota de 20 mi y dos de 40 mi, los sobrenadantes se transvasaron y las pelotillas se congelaron a -80 °C.

Para purificar parcialmente la proteína, el comprimido celular correspondiente con la recolección de cultivo celular de 20 mi se descongeló y se resuspendió en 1 mi de mezcla maestra Bug Buster (Novagen 71456, Darmstadt, Alemania) . La suspensión celular se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos, seguido por 15 minutos de incubación a 60 °C para desnaturalizar las proteínas susceptibles al calor. Los detritos celulares y las proteínas desnaturalizadas se agruparon por centrifugación durante 30 minutos a 4 °C. El sobrenadante que contiene la proteína citosólica estable en calor, que incluye K9G9 y variantes, se recuperó y se almacenó a 4 °C.

El total de proteína de la fracción de proteína citosólica estable en calor se determinó por el ensayo Bradford con el uso de Coomaisse Plus (Thermo Scientific núm. 23238, Rockford, 111.). Se usó BSA como el estándar. La concentración de proteína se determinó al determinar la absorbancia a 595 nm con el uso de un espectrofotómetro Cary 300 (Agilent Technologies, Wilmington, DE) .

Para determinar los valores de Vmáx. y de ¾ para NADH y NADPH, las proteínas parcialmente purificadas se analizaron a diversas concentraciones de NADH (0, 16.4, 32.8, 65.7, 98.5, 164.3 y 246.5 µ?) y NADPH (0, 12.8, 25.6, 51.2, 76.8 y 128 µ?) . Los ensayos se llevaron a cabo a 30 °C en HEPES 100 mM (pH de 6.8), MgCl2 10 mM, KCl 100 mM y R/S-acetolactato 4.8 mM. Se agregó un total de proteína entre 0.1 y 0.35 mg/ml en el ensayo. El índice de conversión de S-acetolactato a DHIV se determinó al monitorear la oxidación de NAD(P)H a 340 nm con el uso de un espectrofotómetro Cary 300 (Agilent Technologies, Wilmington, DE) . La actividad se calculó con el uso del coeficiente de extinción molar de 6220 M^cm"1. Los valores de Vmgx. y de se calcularon al diagramar la actividad específica (U/mg) en comparación con la concentración del cofactor y los datos se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten con el uso del programa Kaleidagraph (Synergy, Reading, PA) .

Tabla 21. Valores cinéticos para las variantes de K9G9 parcialmente purificadas según los ensayos de consumo de NAD (P) H Ejemplo 17.

Recombinación manual de variantes de KARI K9 por medio de mutagénesis sitio dirigida La mutagénesis sitio dirigida de los derivados de K9G9, K9JB4 y K9JG3 (identificados en el Ejemplo 16 como 880 B4 y 881 G3 , respectivamente) se llevó a cabo para incorporar otros cambios de aminoácidos descritos en los ejemplos. La etapa inicial fue agregar a la sustitución de N87P, que se describe en el Ejemplo 5. Las mutaciones se introdujeron en los genes de KARI con los cebadores N87PC1 (CTGACATCATTATGATCTTGATCCCAGATGAAAAGCAGGCTACCATGTAC; sec . con núm. de ident . : 395) y N87PClr (GTACATGGTAGCCTGCTTTTCATCTGGGATCAAGATCATAATGATGTCAG; sec. con núm. de ident.: 396), con el uso del kit de mutagénesis sitio dirigida QuikChange® II (catálogo núm. 200523; Agilent Technologies, Stratagene Products División, La Jolla, CA) . Excepto por los cebadores, plantillas y H20 dd, todos los reactivos usados aquí fueron suministrados con el kit indicado anteriormente. Los cebadores fueron comercialmente sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville IA) . Las plantillas eran variantes de KARI K9 en vectores de E. coli (pBAD.KARI) . Para la mutagénesis de K9JB4 , la mezcla de reacción contenía 1 µ? de K9JB4 (50 ng/µ?) , 1 µ? de cada cebador (150 ng/ul) , 5 µ? de regulador de reacción ???, 1 µ? de mezcla de d TP, 1 µ? de ADN polimerasa Pfu Ultra HF y 40 µ? de H20 dd. Para la mezcla de reacción K9JG3, 1 µ? de K9JB4 (50 ng/ul) se sustituyó con 1 µ? de K9JG3 (50 ng/µ?) . Las siguientes condiciones se usaron para ambas reacciones : La temperatura inicial fue de 95 °C durante 30 s, seguida por 16 ciclos de calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consistió en 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s y 68 °C durante 5.0 min. Al terminar el ciclo de temperatura, se esperó la recuperación de las muestras a 4 °C. Se agregó 1 µ? de Dpn I (10 U/µ?) a cada reacción y las mezclas se incubaron durante 1 hora a 37 °C. 2 µ? de cada reacción mutagénica se transformaron en E. coli One Shot® TOP10 químicamente competente (Invitrogen, catálogo núm. C404003) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los transformantes se dispersaron en placas de agar que contienen el medio LB y 100 ug/ml de ampicilina (catálogo núm. L1004, Teknova Inc. Hollister, CA) y se incubaron a 37 °C durante la noche.

Después, múltiples transformantes se seleccionaron para TempliPhi™ (GE Healthcare) en base a la secuenciación de ADN con el uso de los cebadores pBAD-For (ATGCCATAGCATTTTTATCC; sec. con núm. de ident.: 393) y pBAD-Rev (CTGATTTAATCTGTATCAGGCT; sec. con núm. de ident. : 394) . Los transformantes con secuencias KARI confirmadas se inocularon en medio LB que contiene 100 ug/ml de ampicilina y se incubaron a 33 °C con agitación a 225 rpm. El ADN de plásmidos se aisló de las células con el kit QIAprep Spin Miniprep (catálogo núm. 2706; Qiagen, Valencia, CA) de conformidad con el protocolo proporcionado por el fabricante. Los clones resultantes, K9JB4P y K9JG3P, se derivaron de K9JB4 y K9JG3, respectivamente.

Otra mutagénesis sitio dirigida adicional se llevó a cabo como se describió anteriormente con modificaciones.

La variante K9JA1 se derivó de K9JG3P con el uso de los cebadores OK57E1 (GGTTTATTCGAAGGTGCGGAGGAGTGGAAAAGAGCTG; sec. con núm. de ident.: 397) y oK57Elr (CAGCTCTTTTCCACTCCTCCGCACCTTCGAATAAACC; sec. con núm. de ident.: 398) . La reacción de mutagénesis contenía 1 µ? de K9JG3P (50 ng/µ?) , 1 µ? de cada cebador (150 ng/ul) , 5 µ? de regulador de reacción ???, 1 µ? de mezcla de dNTP, 1 µ? de ADN polimerasa PfuUltra HF y 40 µ? de H20 dd. Los cultivos líquidos para los transformantes de E. coli se incubaron a 37 °C en lugar de 33 °C.

La variante K9SB2 se derivó de K9JB4P con el uso de los cebadores OY53F1 (GTAACGTTATCATTGGTTTATACGAAGGTGCGGAGGAG; sec . con núm. de ident.: 399) y oY53Flr (CTCCTCCGCLACCITCGAATAAACCAATGATAACGTTAC; sec . con núm. de ident.: 400) . La reacción de mutagénesis contenía 1 µ? de K9JB4P (50 ng/µ?) , 1 µ? de cada cebador (150 ng/ul) , 5 µ? de regulador de reacción ???, 1 µ? de mezcla de dNTP, 1 µ? de ADN polimerasa PfuUltra HF y 40 µ? de H20 dd. Los cultivos líquidos para los transformantes de E. coli se incubaron a 37 °C en lugar de 33 °C.

La variante K9SB2-K90L se derivó de K9SB2 con el uso de los cebadores OK90L1 (GATCTTGATCCCAGATGAATTGCAGGCTACCATGTACAAAAAC; sec. con núm. de ident.: 401) y oK90Llr (GTT TTT GTA CAT GGT AGC CTG CAA TTC ATC TGG GAT CAA GAT C; sec. con núm. de ident. : 402) . La reacción de mutagénesis contenía 2.5 µ? de K9SB2 (50 ng/µ?) , 1 µ? de cada cebador (150 ng/ul) , 5 µ? de regulador de reacción ???, 1 µ? de mezcla de dNTP, 1 µ? de ADN polimerasa PfuUltra HF y 38.5 µ? de H20 dd. Para los ciclos de calentamiento/enfriamiento, la etapa de 55 °C durante 30 s se incrementó hasta 1 min. Los cultivos líquidos para los transformantes de E. coli se incubaron a 37 °C en lugar de 33 °C.

La variante K9SB2-K90M se derivó de K9SB2 con el uso de los cebadores OK90M1 (CTTGATCCCAGATGAAATGCAGGCTACCATGTACAAAAAC ; sec. con 'núm. de ident.: 403) y oK90Mlr (GTT TTT GTA CAT GGT AGC CTG CAT TTC ATC TGG GAT CAA G; sec. con núm. de ident.: 404) . La reacción de mutagénesis contenía 2.5 µ? de K9SB2 (50 ng/µ?) , 1 µ? de cada cebador (150 ng/ul) , 5 µ? de regulador de reacción lOx, 1 µ? de mezcla de dNTP, 1 µ? de ADN polimerasa PfuUltra HF y 38.5 µ? de H20 dd. Para los ciclos de calentamiento/enfriamiento, la etapa de 55 °C durante 30 s se incrementó hasta 1 min. Los cultivos líquidos para los transformantes de E. coli se incubaron a 37 °C en lugar de 33 °C.

Tabla 22. Sustituciones de aminoácidos de variantes de K9G9 y combinaciones Ejemplo 18 Caracterización cinética de derivados de K9G9 purificados con relaciones incrementadas de KM de NADPH y KM de NADH K9G9 y las variantes se sobreexpresaron en la cepa Bw25113 de E. coli (AilvC) , como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 8,129,162, y se purificaron para obtener una determinación más precisa de la afinidad del cofactor y la velocidad máxima.

Para la expresión y caracterización, se usó plásmidos de E. coli (pBAD.KARI) para transformar una cepa electrocompentente de E. coli Bw25113 (ñilvC) , como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 8,129,162, con el uso de un BioRad Gene Pulser II (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA) . Los clones transformados se dispersaron en placas de agar que contienen el medio LB y 100 µ9/p?1 de ampicilina (núm. 101320-154, Teknova Inc. Hollister, CA) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Un solo transformante para cada cepa se rayó y se colocó en placas de LB con 100 pg/ml de ampicilina. Se usó una sola colonia de cada una de las placas para inocular 10 mi de caldo de cultivo LB con 100 pg/ml de ampicilina. Estos cultivos se cultivaron durante 8 horas a 37 °C con agitación en matraces con deflectores, de 125 mi, con tapas ventiladas y filtradas. Se usó 200 µ? de este cultivo para inocular dos matraces con deflectores, de 500 mi, con tapas filtradas y ventiladas, que contienen caldo de cultivo LB con 100 µ9/?t?1 de ampicilina y arabinosa al 0.2 % (w/v) . Los cultivos de expresión se cultivaron durante 16 - 18 horas a 37 °C con agitación. Las células se recolectaron en alícuotas de 40 mi por centrifugación; el sobrenadante se descartó y los comprimidos celulares se congelaron a -80 °C hasta purificación.

K9G9 y todas las variantes se purificaron con el uso del mismo proceso. Dos comprimidos celulares, que representan alícuotas de cultivos celulares de 40 mi cada una, se resuspendieron en 4 mi de mezcla maestra Bug Buster (Novagen 71456, Darmstadt, Alemania) y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente, seguido por 15 minutos a 60 °C. Las proteínas desnaturalizadas y detritos celulares se agruparon por centrifugación a 7,000 rpm durante 30 minutos y 4 °C. El sobrenadante se decantó, se conservó y se filtró a través de un filtro con jeringa de 0.2 µp? Acrodisc (PN4192, Pall, Ann Arbor, MI) . K9G9 se purificó del extracto libre de células tratado con filtro de calor con el uso de una columna de filtración con gel GE Healthcare HiLoad 26/60 Superdex 200 (17-1071-01, Buckinghamshire , Inglaterra). La columna se equilibró previamente con equilibración 0.2 CV con HEPES 50 mM (pH de 7.5) regulador de MgCl2 5 mM a un índice de flujo de 2.0 ml/min antes de la carga de proteína. K9G9 y las variantes se eluyeron con una etapa isocrática de 1.5 CV que consiste en HEPES 50 mM (pH 7.5), regulador de MgCl2 5 mM a un índice de flujo de 2.0 ral/min. Se recolectó fracciones de 2.5 mi en volumen con el uso de un recolector de fracciones Frac-950 (Buckinghamshire , Inglaterra) en una configuración de serpentina. K9G9 y las variantes se eluyeron entre las fracciones D5 - E5 o D6 - E4. Las fracciones se agruparon con el uso de un filtro giratorio de 15 mi Amicon Ultra YM-30 (UFC903008, Millipore, Billercia, MA) y se lavaron con 10 mi de HEPES 100 mM (pH de 6.8) y regulador de MgCl2 10 mM . El filtrado se descartó y la proteína purificada se lavó de la membrana con el uso de 1 mi de regulador que contiene HEPES 100 mM (pH de 6.8) y MgCl2 10 mM.

Para determinar los valores de Vmáx. y de KM para NADH y NADPH, las proteínas purificadas se sometieron a prueba a diversas concentraciones de NAD (P) H (de 0 a 1000 µ?) acopladas con un sistema de regeneración de NAD (P) H . Los ensayos se llevaron a cabo a 30 °C en un regulador que contiene MOPS 100 mM, pH de 6.8, MgCl2 10 mM, EDTA 1 mM, (R/S) -acetolactato 5 mM, glucosa-6-fosfato 1 mM, 3 mU/µ? de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa . La reacción se templó después de diez minutos con tres volúmenes de ácido fórmico al 0.1 %. La concentración de DHIV se determinó con el uso de LC-MS. El índice de conversión de S-acetolactato a DHIV se determinó al determinar la cantidad de DHIV producido en un momento determinado. Los valores de Vmáx. y de Km se calcularon al diagramar la actividad específica (U/mg) contra la concentración del cofactor y los datos se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten. Las mediciones de los valores de Km de acetolactato (a una concentración predeterminada de NADH) indicaron que la concentración de acetolactato predeterminada usada para determinar la Km del cofactor estaba saturada.

Tabla 23. Valores cinéticos para variantes de K9G9 purificadas según los ensayos de formación de DHIV Ejemplo 19.

Producción de isobutanol de derivados de K9G9 con relaciones incrementadas de ?,? de NADPH a de NADH Los plásmidos de expresión de levadura para K9JB4 , K9JB4P, K9JG3, K9JG3P, K9JA1 y K9SB2 se produjeron al subclonar las variantes de genes de KARI a partir de vectores de E.coli (pBAD.KARI) en pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9 en los sitios Pmel y Sfil. Los plásmidos resultantes junto con pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9 y pHR81-PIlv5 -KARI -K9. D3 (sec. con núm. de ident . : 181) se analizaron para evaluar la producción de isobutanol y la formación de subproductos en levadura. Las cepas de la ruta de levadura se produjeron en el huésped PNY2259 (MATa ura3A::loxP his3A pdc6A pdclA : : P [PDC1] -DHAD | ilvD_Sm-PDClt-P [FBA1] -ALS | alsS_Bs-CYClt pdc5A : : P [PDC5] -ADH | sadB_Ax-PDC5t gpd2A : : loxP fra2A : : P [PDC1] -ADH | adh_Hl-ADHlt adhlA: : UAS (PGK1) P [FBA1] -kivD_Lg(y) -ADHlt yprcA15A: :P[PDC5] -ADHIadh_Hl-ADHlt ymr226cA ald6A : : loxP; Ejemplo 22) mediante la cotransformación de vectores de KARI como el plásmido núm. 1 de la ruta, y pBP915 (pRS423-PFBAl-DHAD-PGPMl-hADHl; sec. con núm. de ident. : 182) como el plásmido núm. 2 de la ruta. Las células transformadas se colocaron en placas con medio sintético sin histidina o uracilo (etanol al 1 % como fuente de carbono) . Tres transformantes se transfirieron a placas frescas del mismo medio. Los transformantes se evaluaron para examinar la producción de isobutanol en condiciones anaerobias en viales de suero.

Después de 3-5 días, aparecieron colonias de levadura a partir de la transformación en placas con SE-Ura-His. Las tres colonias de cada variante se parcharon en placas frescas con SE-Ura-His, se incubaron a 30 °C durante 3 días.

Medios de crecimiento y procedimiento Se usó dos tipos de medios durante el procedimiento de crecimiento de las cepas de levadura: un medio precultivo aerobio y un medio de cultivo anaerobio. Todas las sustancias químicas se obtuvieron de Sigma, a menos que se indique de otra manera (St. Louis, MO) Medio precultivo aerobio (SE-Ura-His) : 6.7 g/1 de base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos (Difco, 291940, Sparks, MD) , 1.4 g/1 de suplemento de medio selectivo sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano y uracilo, etanol al 0.2 %, glucosa al 0.2 %, leucina al 0.01 % en w/v y triptófano al 0.002 % en w/v.

Medio de cultivo anaerobio (SEG-Ura-His) : MES 50 mM (pH de 5.5, 6.7 g/1 de base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos (Difco, 291940, Sparks, MD) , 1.4 g/1 de suplemento de medio selectivo sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano y uracilo, etanol al 0.1 %, glucosa al 3 %, leucina al 0.01 , triptófano al 0.002 %, 30 mg/1 de ácido nicotínico, 30 mg/1 de tiamina y 10 mg/1 de ergosterol producido en una solución 50/50 v/v de Tween /etanol .

Las células parchadas se inocularon en 25 mi de medio de SEG-Ura,His con glucosa al 0.2 % y etanol al 0.2 %, y se cultivaron en condiciones con oxígeno progresivamente limitado con una tapa cerrada durante aproximadamente 48 horas a 30 °C con agitación, hasta alcanzar un valor de OD60o objetivo de aproximadamente 1.5 a 2. Se registró los valores de OD6oo · Las células se agruparon por centrifugación y el sobrenadante se descartó. Los comprimidos celulares se transfirieron en una bolsa anaerobia Coy (Grass Lake, MI) , en donde los comprimidos se resuspendieron en 1.0 mi de medio de crecimiento anaerobio (SEG-Ura-His) . Los comprimidos celulares resuspendidos se usaron para inocular 30 mi de medio de SEG-Ura-His en botellas de suero de 50 mi ( heaton, 223748, Millville, NJ) hasta un valor de OD6oo inicial objetivo de 0.2. Se dejó que todos los medios anaerobios, viales de suero, tapones y tapas a presión se desgasificaran en la bolsa anaerobia durante por lo menos 24 horas antes de la inoculación. Las botellas de suero tenían tapones, tapas a presión y se retiraron de la bolsa anaerobia y se cultivaron a 30 °C con agitación a 240 rpm. Los cultivos anaerobios se cultivaron durante 24 a 72 horas con un valor de OD60o objetivo de por lo menos 1.2. Las etapas adicionales del crecimiento anaerobio usaron las células de la etapa de cultivo anaerobio anterior como inoculante. Se evaluó tres transformantes para analizar cada variante.

Análisis de HPLC de cepas de levadura con variantes de KARI de K9G9 tomó muestras para el análisis de HPLC y para obtener los valores de OD60o al terminar el período de crecimiento anaerobio. El análisis de HPLC se llevó a cabo con el uso de una unidad de separaciones Waters 2695, un detector con matriz de fotodiodos 2996 y un detector de índice de refracción 2414 (Waters, Milford, MA) con una precolumna Shodex Sugar SH-G y una columna para separaciones Shodex Sugar SH1011 (Shodex, JM Science, Grand Island, NY) . Los compuestos se separaron por elución isocrática a 0.01 N de ácido sulfúrico con un índice de flujo de 0.5 ml/min. Los cromatogramas se analizaron con el uso del programa Waters Empower Pro.

Se determinó los rendimientos molares para glicerol, isobutanol y la relación glicerol/isobutanol . Las desviaciones media y estándar se calcularon a partir de análisis triplicados para cada variante. Después, se usó la prueba t de Student para determinar si la diferencia en los valores fue estadísticamente significativa a partir de los valores control de K9D3. Para las variantes nuevas, se espera que los incrementos en los valores de KM para NADPH con relación a la ¾ para NADH resulten en un uso de NADPH reducido. Los resultados reportados en la siguiente tabla y en las Figuras 9A-9C indican que las variantes nuevas con relaciones incrementadas de KM de NADPH y la KM de NADH muestran mayores relaciones de isobutanol y glicerol con relación a K9D3 y K9G9. Se demostró que K9SB2 tiene un incremento del 35 % en título de isobutanol en comparación con K9D3.

Tabla 24. Cinética de las variantes de K9G9 y datos de isobutanol Ejemplo 20.

Construcción de la genoteca de PCR propensa a errores de K9SB2 La genoteca de PCR propensa a errores de K9SB2 se construyó de manera similar que la genoteca de K9G9 con las siguientes modificaciones. La mezcla para PCR mutagénica consistió en 9.5 µ? de K9SB2 en un vector pBAD . KARI (190 ng/ µ?), 1.25 µ? de cebador K9G9_EZ_F1 (100 ng/ µ?), 1.25 µ? de cebador K9G9_EZ_R1 (100 ng/ µ?) , 5 µ? de regulador de reacción lOx Mutazyme II, 1 µ? de mezcla de d TP 40 mM, 1.5 µ? de ADM polimerasa Mutazyme II y 30.5 µ? de H20 dd. La "reacción EZClone" contenía 25 µ? de la mezcla de enzimas EZClone 2x, 3 µ? de megacebador (producto de PCR mutagénica K9SB2 , 190 ng/ µ?) , 2.6 µ? de ADN de plantilla de K9SB2 (19 ng/ µ?) , 3 µ? de solución 1 EZClone y 16 µ? de H20 dd. Para la etapa de Dpn I, la mezcla se incubó durante 3 h a 37 °C. Los clones se usaron para la evaluación de alto rendimiento como se describe en el Ejemplo 21.

Ejemplo 21.

Evaluación para las variantes de K9SB2 con relaciones aún más incrementadas de Km de NADPH y Km de NADPH, en base a las relaciones incrementadas de actividad de NADH y NADPH La genoteca de K9SB2 descrita en el Ejemplo 20 se evaluó para detectar variantes con afinidad de NADPH reducida. Con un objetivo específico para incrementar la Km para NADPH con relación a la Km para NADH, los aciertos de la evaluación se purificaron parcialmente y se realizó análisis cinéticos para determinar los parámetros de Vmgx. y de Km con NADH y con NADPH.

Ensayo de evaluación de alto rendimiento de la genoteca de genes K9SB2 Las variantes se evaluaron con el uso de HTS como se describe en el Ejemplo 16, con las siguientes excepciones. El regulador de los ensayos consistió en (R/S) -acetolactato 2.4 mM, HEPES 100 mM, pH de 6.8, MgCl2 10 mM, 150 µ? de NADH o 100 µ? de NADPH y 12.5 µ? de lisado celular 0.5 X.

La relación para el índice determinado para la oxidación de 100 µ? de NADPH y el índice determinado para la oxidación de 150 µ? de NADH se calculó para cada variante y pocilio de control positivo (2 por placa) . Se consideró una variante del pocilio para contener un acierto inicial si el índice de NADH fue mayor que 0.6 OD/h y si la relación de índice (NADPH/NADH) fue menor que 0.37 (tres desviaciones estándar menores que el promedio de control positivo) . Se identificó un total de 218 aciertos de una agrupación de 4947 variantes potenciales. Estos aciertos iniciales se consolidaron para formar una genoteca pequeña para un análisis posterior.

La genoteca de aciertos iniciales consolidados se cultivó por triplicado biológico y los extractos libres de células se prepararon y se sometieron a ensayos como se describió anteriormente. Después, las relaciones de índices se calcularon para las variantes y controles positivos como se describió anteriormente. Los aciertos finales que se seleccionaron para un análisis cinético detallado cumplieron con los siguientes requisitos: la relación de índice de NADPH/NADH fue menor que 0.45, el índice de NADH fue mayor que 0.6 OD/h y por lo menos dos de tres réplicas biológicas cumplieron con los requisitos. Se identificó 107 variantes.

Los datos se analizaron, además, para identificar variantes que tenían un índice de conversión mayor para S-acetolactato a DHIV con el cofactor NADH. El índice promedio y la desviación estándar de la oxidación de NADH se calculó para todos los controles positivos. Una variante se consideró un acierto potencial si el índice de oxidación de NADH fue por lo menos 3 desviaciones estándar mayor que el índice del control positivo (2.524 OD/h) . Se identificó 68 variantes y el análisis de secuencias determinó que 17 tenían por lo menos una sustitución de aminoácidos. Las sustituciones T93A y T93I aparecieron individualmente dos veces y las variantes 2017 B12 y D6 se seleccionaron para su análisis posterior.

La secuenciación de ADN de las 107 variantes identificadas a partir de la evaluación secundaria de HTS se llevó a cabo con el uso de TempliPhi™ (GE Healthcare) con los cebadores pBAD-For (ATGCCATAGCATTTTTATCC ; sec . con núm. de ident. : 393) y pBAD-Rev (CTGATTTAATCTGTATCAGGCT; sec. con núm. de ident . : 394) . 105 secuencias eran diferentes de la genitora y las sustituciones de aminoácidos se enumeran en la primera de las dos tablas a continuación.

La secuenciación de ADN de las 68 variantes identificadas a partir de la evaluación del índice de NADH se llevó a cabo con el uso de TempliPhi™ (GE Healthcare) con los cebadores pBAD-For (ATGCCATAGCATTTTTATCC ; sec . con núm. de ident.: 393) y pBAD-Rev (CTGATTTAATCTGTATCAGGCT; sec. con núm. de ident.: 394) . 17 secuencias eran diferentes de la silvestre y las sustituciones de aminoácidos de las 2 sustituciones que aparecieron repetidamente se enumeran en la segunda tabla a continuación.

Tabla 25. Sustituciones de aminoácidos de las variantes de K9SB2 Tabla 26. Sustituciones de aminoácidos de las variantes de K9SB2 Análisis cinético de variantes de proteínas K9SB2 parcialmente purificadas La cepa Bw25113 de E. coli ( ilvC) , como se describe en la patente de los Estados Unidos núm. 8,129,162, se usó para expresar las 107 variantes a partir de la evaluación secundaria de HTS y el control positivo K9SB2. Los clones de las placas del archivo se inocularon en las placas de 96 pocilios profundos. Cada pocilio contenía 3.0 µ? de células de placas del archivo descongeladas, 200 µ? del medio LB que contiene 100 ug/ml de ampicilina y arabinosa al 0.02 % (w/v) como el inductor. Después, las células se cultivaron durante la noche a 37 °C con humedad al 80 % con agitación (900 rpm) , se recolectaron por centrifugación (4000 rpm, 7 min a 4 °C) (75004251, Thermo Scientific, Rockford, IL) y el comprimido celular se almacenó a -80 °C para su análisis posterior.

Los comprimidos celulares congelados en placas con pocilios profundos se descongelaron a temperatura ambiente durante 30 minutos al mismo tiempo. Se agregó 75 µ? de BugBuster al 50 % (Novagen 71456, Darmstadt, Alemania) (v/v en agua) eh cada una y las células se suspendieron con el uso de un agitador de placas. La suspensión de células en BugBuster al 50 % se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y, después, se incubó durante 15 minutos a 60 °C. Los detritos celulares y las proteínas susceptibles al calor desnaturalizadas se agruparon por centrifugación (4000 rpm, 15 min a 4 °C) (75004251, Thermo Scientific, Rockford, IL) y 75 µ? del sobrenadante se trasladaron a una placa de 96 pocilios de fondo plano (Corning, 3370, Corning, NY) y se diluyeron dos veces con 75 µ? de HEPES 100 mM (pH de 6.8), KC1 100 mM, MgCl2 10 mM.

El total de proteína se determinó con el uso del ensayo Bradford con Coomaisse Plus (Thermo Scientific, núm. 23238, Rockford, IL) . Se usó BSA como el estándar. La concentración de proteína se determinó al determinar la absorbancia a 595 nm con el uso de un espectrofotómetro Cary 300 (Agilent Technologies, Wilmington, DE) .

Para determinar los valores de Vm¾x. y de ¾ para NADH y para NADPH, las proteínas parcialmente purificadas se sometieron a prueba a diversas concentraciones de NADH (20, 30, 40, 60, 80, 120, 200 y 300 µ?) y NADPH (60, 80, 120, 200, 300 y 400 µ?) . Los ensayos se llevaron a cabo a 30 °C en HEPES 100 mM (pH de 6.8), MgCl2 10 mM, KC1 100 mM y R/S-acetolactato 4.8 mM. Se agregó un total de proteína entre 0.005 y 0.015 mg/ml en el ensayo. El índice de conversión de S-acetolactato a DHIV se determinó al monitorear la oxidación de NAD(P)H a 340 nm con el uso de un lector de placas Spectramax 384 Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . La actividad se calculó con el uso del coeficiente de extinción molar de 6220 M^cm"1. Los valores de Vm¾x. y de K^, se calcularon al diagramar la actividad específica (U/mg) contra la concentración del cofactor y los datos se ajustaron a la ecuación de Michaelis-Menten con el uso del programa Kaleidagraph (Synergy, Reading, PA) .

Tabla 27. Valores cinéticos para las variantes de K9SB2 parcialmente purificadas según los ensayos de consumo de NAD (P) H Ejemplo 22.

Construcción de la cepa PNY2259 El propósito de este ejemplo consiste en describir el ensamblaje de los constructos usados para reemplazar la copia cromosómica de kivD_Ll (y) en PNY2238 en el locus adhlA con kivD_Lg (y) .

La supresión/integración se creó por recombinación homologa con productos de PCR que contienen regiones de homología dirección 5' y dirección 3' de la región objetivo y el gen URA3 para selección de transformantes . El gen URA3 se eliminó por recombinación homologa para crear una supresión/integración sin marcas. El plásmido para integrar kivD_Lg(y) se derivó de un plásmido construido para integrar UAS (PGK1) P [FBA1] -kivD_Ll (y) en el locus ADH1 de Saccharomyces cerevisiae . La construcción del plásmido usado para integrar UAS (PGKl) P [FBA1] -kivD_Ll (y) en el locus ADH1 se describe a continuación. Los plásmidos se construyeron en pUC19-URA3MCS . Construcción del plásmido de supresión de ADHl/integración de UAS (PGKl) P [FBA1] -kivD Ll (y) La región codificante de kivD de Lactococcus lactis optimizada por codones para la expresión en Saccharomyces cerevisiae, kivD_Ll (y) se amplificó con el uso de pLH468 (sec. con núm. de ident . : 139) como plantilla con el cebador oBP562 (sec. con núm. de ident.: 197) que contenía un sitio de restricción de Pmel y el cebador OBP563 (sec. con núm. de ident. : 198), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 5' del fragmento B de ADH1. El fragmento B de ADH1 se amplificó a partir del ADN genómico de CEN.PK 113 -7D de Saccharomyces cerevisiae con el cebador oBP564 (sec. con núm. de ident.: 199), que contenía una cola en 5' con homología con el extremo 3' de kivD_Ll (y) , y el cebador OBP565 (sec. con núm. de ident.: 200) que contenía un sitio de restricción de Fsel. Los productos de PCR se purificaron con un kit de purificación por PCR (Qiagen; Valencia, CA) . El fragmento B de kivD_Ll (y) -ADHl se creó mediante PCR de superposición al mezclar los productos de PCR del fragmento B de kivD_Ll (y) y ADHl y la amplificación con los cebadores oBP562 (sec. con núm. de ident. : 197) y OBP565 (sec. con núm. de ident. : 200) . Se realizó la digestión del producto de PCR resultante con Pmel y Fsel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de pUCl9-URA3MCS después de la digestión con las enzimas apropiadas. El fragmento A de ADHl se amplificó a partir de ADN genómico con el cebador OBP505 (sec. con núm. de ident.: 201), que contenía un sitio de restricción SacI, y el cebador oBP506 (sec. con núm. de ident. : 202) que contenía un sitio de restricción de Ascl. Se realizó la digestión del producto de PCR del fragmento A de ADHl con SacI y Ascl y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contenía el fragmento B de kivD_Ll (y) -ADHl . El fragmento C de ADHl se amplificó a partir de ADN genómico con el cebador OBP507 (sec. con núm. de ident.: 203) que contenía un sitio de restricción de Pací y el cebador oBP508 (sec. con núm. de ident. : 204) que contenía un sitio de restricción de Salí . El producto de PCR del fragmento C de ADH1 se digirió con Pací y Salí y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene el fragmento A de ADHl-el fragmento B de kivD_Ll (y) -ADH1. El promotor híbrido UAS ( PGK1 ) -PFBAI (sec. con núm. de ident.: 406) se amplificó del vector pRS316- UAS ( PGK1 ) -PFBAI-GUS con el cebador OBP674 (sec. con núm. de ident.: 205) que contenía un sitio de restricción de AscI y el cebador OBP675 (sec. con núm. de ident.: 206) que contenía un sitio de restricción de Pmel . El producto de PCR UAS(PGKl) "PFBAI se digirió con AscI y Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene los fragmentos ABC de kivD_Ll (y) -ADH1 para generar pBP1181.

Construcción de pBP1716 y pBP1719 kivD_Ll (y) se eliminó del plásmido de supresión de ADHl/integración de UAS (PGK1) P [FBA1] -kivD_Ll (y) pBP1181. El plásmido se digirió con Pmel y Fsel y el fragmento de ADN grande se purificó en un gel de agarosa, seguido por un kit de extracción con gel (Qiagen) . El fragmento B de ADH1 se amplificó a partir del pBP1181 con el cebador oBP821 (sec. con núm. de ident.: 407) que contenía un sitio de restricción de Pmel y el cebador OBP484 (sec. con núm. de ident.: 408) que contenía un sitio de restricción de Fsel. El producto de PCR del fragmento B de ADH1 se digirió con Pmel y Fsel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del fragmento de ADN grande purificado con gel . Un fragmento de PCR correspondiente al 3' de 500 pb de kivD_Ll (y) se clonó en el vector resultante para la supresión objetivo de kivD_Ll (y) en PNY1528. El fragmento se amplificó a partir de pBP1181 con los cebadores oBP822 (sec. con núm. de ident . : 409), que contenía un sitio de restricción Notl, y ???823 (sec. con núm. de ident.: 410), que contenía un sitio de restricción de Pací. El fragmento se digirió con Notl y Pací y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes dirección 3' de URA3 en el plásmido mencionado anteriormente con la supresión de kivD_Ll (y) después de la digestión con las enzimas de restricción adecuadas. El plásmido resultante se denominó pBP1716.

La región codificante de kivD de Listeria grayi optimizada por codones para la expresión en Saccharomyces cerevisiae (sec. con núm. de ident.: 411), kivD_Lg (y) , se sintetizó por DNA2.0 (Menlo Park, CA) . kivD_Lg(y) se amplificó con los cebadores oBP828 (sec. con núm. de ident.: 412) , que contenía un sitio de restricción Pmel, y oBP829 (sec. con núm. de ident.: 413) que contenía un sitio de restricción de Pmel . El producto de PCR resultante se digirió con Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en el sitio correspondiente en pBP1716 después de la digestión con la enzima adecuada. La orientación del gen clonado se revisó por PCR con los cebadores FBAp-F (sec. con núm. de ident. : 414) y oBP829 (sec. con núm. de ident . : 413) . Un aislado con kivD_Lg(y) en la orientación correcta se denominó pBP1719. Construcción de la cepa PNY2259 El cásete de supresión de kivD_Ll (y) /integración de kivD_Lg(y) se amplificó a partir de pBP1719 con los cebadores oBP505 (sec. con núm. de ident.: 201) y OBP823 (sec. con núm. de ident. : 410) . Las células competentes del PNY2238 se produjeron y se transformaron con el producto de PCR con el uso de un kit de transformación de levadura II Frozen-EZ (Zymo Research; Orange , CA) . Las mezclas de transformación se colocaron en placas con medio sintético completo sin uracilo suplementado con etanol al 1 % a 30 °C. Las cepas de transformantes se evaluaron por PCR (JumpStart (TM) REDTaq (c) ReadyMix (TM) ) con el uso de los cebadores Ura3-end F (sec. con núm. de ident. : 222) y HY-50 (sec. con núm. de ident. : 415) . Los transformantes se cultivaron en YPE (etanol al 1 %) y se colocaron en placas con medio completo sintético suplementado con EtOH al 1 % y que contiene ácido 5-fluoro-orótico (0.1 %) a 30 °C para seleccionar los aislados que perdieron el marcador URA3. La supresión de kivD_Ll (y) y la integración de kivD_Lg (y) se confirmó por PCR con los cebadores HY-50 y oBP834 (sec. con núm. de ident. : 416) . Un aislado correcto contenía kivD_Lg(y) en el mismo locus y se expresó a partir del mismo promotor que kivD_Ll (y) en PNY2238 se denominó PNY2259.

Ejemplo 23 Construcción de dos genotecas de genes de saturación del sitio para identificar las variantes con la preferencia del cofactor para NADH En el Ejemplo 4, se usó cebadores que tienen el codón de degeneración NNK (N representa los 4 nucleótidos A, C G y T, mientras que K se refiere a G y T) . En este ejemplo, se usó mezclas de cebadores que contienen cebadores que codifican cada cambio de aminoácidos individuales de A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, V, W o Y para las posiciones 53, 56 y 58 de KARI K9 y las sustituciones para S, T, K y R se excluyeron como no deseadas para estas posiciones. El tamaño de la genoteca de saturación específica para los sitios de unión a fosfato de NADPH (53, 56 y 58) de KARI K9 es de 4,096 (en comparación con 32*32*32 o 32,768 variantes con el uso de los cebadores del código de degeneración de NNK como en el Ej emplo 4 ) .

Un método de construcción de genotecas inició desde la posición 58. Las mezclas de cebadores se produjeron, primero, al mezclar todos los cebadores específicos para las mismas posiciones (por ejemplo, la mezcla de cebadores K9_53f se produjo al mezclar los mismos moles de los 16 cebadores directos específicos para la posición 53 (enumerados en la tabla a continuación) . De la misma manera, se produjo K9_56f y K9_58f. El cebador inverso compartido es K9_191G_112210r (sec. con núm. de ident . : 174) : GGTTTCAGTTTCGCCTCTGAAGGTAGTTTC (que en este ejemplo se llama SR) . La mutación en la posición 58 se introdujo, primero, en AS6F1 por PCR. El procedimiento de mutagénesis es similar al descrito en el Ejemplo 4. En resumen, K9_58f y SR se fosforizaron . Después, los cebadores fosforizados se usaron directamente para introducir una mutación en la posición 58 en AS6F1 con el uso del kit USB Change_It (USB Corporation, Cleveland, OH, núm. 78480) . La plantilla se retiró con Dpn I. El producto de PCR limpio (Zymo DNA Clean & Concentrator-5 ; Zymo Research Corporation, Irvine, CA, catálogo núm. D4003) se transformó en células de KOB -3a. Después del crecimiento durante la noche en placas de agar LB en una incubadora a 37 °C, todas las células se recolectaron y el DNA se extrajo con el uso del kit Qiaprep Spin miniprep (Qiagen Inc. Valencia, CA, catálogo núm. 27106) Después, el ADN extraído se usó como plantillas para introducir la mutación en la posición 56 con el uso de K9_56f y SR igual que la mutagénesis para la posición 58. Por último, la mutación en la posición 53 se introdujo de la misma manera. Después de introducir las mutaciones en las tres posiciones (53, 56 y 58) en AS6F1, la genoteca nueva se evaluó como la descrita en el Ejemplo 4 y algunos mutantes seleccionados se enumeran en la tabla a continuación .

El otro método inició con las posición 53. Las mezclas de cebadores K9_56r y K9_58r se prepararon de la misma manera con el uso de los cebadores enumerados en la tabla a continuación) . El cebador directo compartido es pBAD_266f: CTCTCTACTGTTTCTCCATACCCG (sec. con núm . de ident . : 634 ; que en este ejemplo se llama SF) . La mutación en la posición 53 se introdujo, primero, en AS6F1 por PCR . El procedimiento de mutagénesis es similar al descrito anteriormente con el uso de AS6F1 como plantilla y K9_53f y SR como los dos cebadores de PCR. El ADN mutado resultante (en la posición 53) se usó como plantillas y K9_56r y SF se usaron como los cebadores de mutagénesis para introducir la mutación en la posición 56. Por último, la mutación en la posición 58 se introdujo de la misma manera con el uso de K9_58r y SF. Después de introducir las mutaciones en las tres posiciones (53, 56 y 58) en AS6F1, la genoteca nueva se evaluó como se describió anteriormente y algunos mutantes seleccionados se enumeran en la tabla 28 a continuación .

Tabla 28. Cebadores directos mutacionales .

Posición (es) Cebadores objetivo de KARI K9 53 K9_ 53F_ 031411f GTTATCATCGGATTATTCGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 544) 5 K9_ 53L_ 031411f GTTATCATCGGATTATTGGAAGGA ( sec . con núm. de ident . : 545) K9_ 53Y_ 031411f GTTATCATCGGATTATATGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 546) K9_ 53C_ _031411f GTTATCATCGGATTATGTGAAGGA (sec. con núm. de ident . : 547) K9_ 53W_ 031411f GTTATCATCGGATTATGGGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 548) K9_ _53P_ _031411f GTTATCATCGGATTACCAGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 549) K9_ 53H_ _031411f GTTATCATCGGATTACATGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 550) K9_ 53Q_ _031411f GTTATCATCGGATTACAAGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 551) K9_ _53I_ 031411f GTTATCATCGGATTAATTGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 552) K9_ 53M_ _031411f GTTATCATCGGATTAATGGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 553) K9_ 53N_ _031411f GTTATCATCGGATTAAATGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 554) K9_ 53V_ _031411f GTTATCATCGGATTAGTTGAAGGA (sec. con núm. de ident . : 555) 15 K9_ 53A_ _031411f GTTATCATCGGATTAGCTGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 556) K9_ 53D_ 031411f GTTATCATCGGATTAGATGAAGGA (sec. con núm. de ident . : 557) K9_53?_031411f GTTATCATCGGATTAGAAGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 558) ?9_ 53G_ 031411f GTTATCATCGGATTAGGTGAAGGA (sec . con núm. de ident . : 559) 56 ?9_ _56F_ 031411f GGATTACCTGAAGGATTCAAA (sec . con núm. de ident . : 560) ?9_ 56L_ 031411f GGATTACCTGAAGGATTGAAA (sec . con núm. de ident . : 561) ?9_ 56?_ 031411f GGATTACCTGAAGGATATAAA (sec . con núm. de ident . : 562) ?9_ 56C_ 031411Í GGATTACCTGAAGGATGTAAA (sec . con núm. de ident . : 563) ?9_ _56W_ 031411f GGATTACCTGAAGGATGGAAA - (sec . con núm. de ident . : 564) ?9_ 56P_ 031411f GGATTACCTGAAGGACCAAAA (sec . con núm. de ident . : 565) ?9_ 56H_ _031411f GGATTACCTGAAGGACATAAA (sec . con núm. de ident . : 566) ?9_ 56Q_ 031411f GGATTACCTGAAGGACAAAAA (sec . con núm. de ident . : 567) ?9_ 56l_ _031411f GGAT ACCTGAAGGAAT AAA (sec. con núm. de ident . : 568) ?9_ _56M_ _031411f GGATTACCTGAAGGAATGAAA ( sec . con núm. de ident . : 569) ?9_ _56N_ _031411f GGATTACCTGAAGGAAATAAA (sec . con núm. de ident . : 570) ?9_ _56V_ _031411f GGATTACCTGAAGGAGTTAAA (sec . con núm. de ident . : 571) ?9_ 56A_ 031411f GGATTACCTGAAGGAGCTAAA (sec. con núm. de ident . : 572) ?9_ _56D_ _031411f GGATTACCTGAAGGAGATAAA (sec . con núm. de ident . : 573) ?9_ _56E_ _031411f GGATTACCTGAAGGAGAAAAA (sec . con núm. de ident . : 574) ?9_ _56G_ _031411f GGATTACCTGAAGGAGGTAAA (sec . con núm. de ident . : 575) 58 K9_ 58F_ 051611f GATTACCTGAAGGATTTAAATTCTGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident. : 576) ?9_ 58L_ _051611f GATTACCTGAAGGATTTAAATTGTGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident. : 577) ?9_ 58?_ _051611f GATTACCTGAAGGATTTAAATATTGGAAGAGAGC ( sec . con núm. de ident . : 578) ?9_ 58C_ 051611f GATTACCTGAAGGATTTAAATGTTGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident. : 579) ?9_ 58W_ _051611f GATTACCTGAAGGATTTAAATGGTGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident. : 580) 5 ?9_ 58?_ _051611f GATTACCTGAAGGATTTAAACCATGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident . : 581) ?9_ _58?_ _051611f GAT ACCTGAAGGATT AAACATTGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident. : 582) ?9_ 58Q_ _051611f GATTACCTGAAGGATTTAAACAATGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident. : 583) ?9_ 581_ _051611f GATTACCTGAAGGATTTAAAATTTGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident . : 584) ?9_ _58 _ 05161 lf GATTACCTGAAGGATTTAAAATGTGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident. : 585) ?9_ _58?_ _051611f GAT ACCTGAAGGATT AAAAATTGG AGAG GC (sec. con núm. de ident. : 586) 9_ 58V_ _051611f GATTACCTGAAGGATTTAAAGTTTGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident. : 587) ?9_ 58?_ _051611f GATTACCTGAAGGATTTAAAGCTTGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident. : 588) ?9_ 58D_ _051611f GATTACCTGAAGGATTTAAAGATTGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident . : 589) ?9_ _58?_ _051611f GATTACCTGAAGGATTTAAAGAATGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident. : 590) ?9_ _58G_ _051611f GATTACCTGAAGGATTTAAAGGTTGGAAGAGAGC (sec. con núm. de ident. : 591) 15 Tabla 29. Cebadores mutacionales directos.

Posición o Cebadores posiciones especificas de KARI K9 56 K9_ _56F_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTGAATCCTTC (sec. con núm. de ident. : 592) K9_ _56L_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTCAATCCTTC (sec. con núm. de ident. : 593) K9_ _56Y_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTATATCCTTC (sec. con núm. de ident. : 594) K9_ _56C_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTACATCCTTC (sec. con núm. de ident. : 595) K9_ _56W_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTCCATCCTTC (sec. con núm. de ident . : 596) K9_ _56P_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTTGGTCCTTC ( sec . con núm. de ident. : 597) K9_ _56H_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTATGTCCTTC (sec. con núm. de ident. : 598) K9_ _56Q_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTTTGTCCTTC (sec. con núm. de ident. : 599) K9_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTAATTCCTTC (sec. con núm. de ident. : 600) K9_ _56M_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTCATTCCTTC (sec. con núm. de ident. : 601) K9_ _56N_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTATTTCCTTC ( sec . con núm. de ident. : 602) K9_ _56V_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTAACTCCTTC (sec. con núm. de ident. : 603) K9_ 56?_071211r GCTCTCTTCCATGGTTTAGCTCCTTC (sec. con núm. de ident.: 604) ?9_ _56D _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTATCTCCTTC (sec. con núm. de ident.: 605) ?9_ _56?_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTTTCTCCTTC (sec . con núm. de ident. : 606) ?9_ _56G_ _071211r GCTCTCTTCCATGGTTTACCTCCTTC (sec. con núm. de ident.: 607) 58 ?9_ 58F_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCAGAATTT (sec. con núm . de ident . : 608) ?9_ _58L_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCACAATTT (sec. con núm . de ident . : 609) ?9_ _58?_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCAATATTT (sec. con núm . de ident . : 610) ?9_ _58C_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCAACATTT (sec. con núm . de ident . : 611) ?9_ 58W_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCACCATTT (sec. con núm . de ident . : 612) ?9_ _58P_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCATGGTTT (sec. con núm . de ident . : 613) ?9_ _58H_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCAATGTTT (sec. con núm . de ident . : 614) ?9_ _58Q_ _071211r GTTCrTCTGCTCTCTTCCATTGTTT (sec. con núm . de ident . : 615) ?9_ _58I_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCAAATTTT (sec. con núm . de ident . : 616) ?9_ _58M_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCACATTTT (sec. con núm . de ident . : 617) ?9_ _58N_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCAATTTTT (sec. con núm . de ident. : 618) ?9_ _58V_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCAAACTTT (sec. con núm . de ident . : 619) ?9_ _58A_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCAAGCTTT (sec. con núm . de ident . : 620) ?9_ _58D_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCAATCTTT (sec. con núm . de ident . : 621) 9_ _58E_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCATTCTTT (sec. con núm . de ident. : 622) ?9_ _58G_ _071211r GTTCTTCTGCTCTCTTCCAACCTTT (sec. con núm . de ident . : 623) Tabla 30. Lista de algunos mutantes con sus valores de KM determinados Ejemplo 24 Construcción de una cepa ald6A y derivados productores de isobutanol Un fragmento de ADN de 5.3 kb (BglII/EcoRV) de pRS426 : : GPD-xpkl+ADH-eutD (sec. con núm. de ident. :383) que contiene casetes de expresión para los genes xpkl y eutD de Lactobacillus plantarum se agregó entre las secuencias flanqueadoras de ALD6 , en el sitio SnaBI del vector pUC19 : : ald6D : : loxP-URA3 -loxP descrito anteriormente en el Ejemplo 9. La reacción de ligación se transformó en células Stbl3 de E. coli, que se incubaron en placas con LB Amp para seleccionar los transformantes. La inserción del cásete xpkl-eutD se confirmó por PCR (cebadores) . Se obtuvo un clon positivo (pUC19 : :Aald6 : : URA3 : :xpkS) .

El vector descrito anteriormente se linearizó con Ahdl y se transformó en células de PNY1507 (que se describen en la presente descripción) preparadas con el kit de transformación de levadura Zymo Research Frozen-EZ (cat. núm. T2001) con una modificación en el protocolo del fabricante que incluía una incubación resultante adicional de 2.5 horas en 2.0 mi de medio de YPE (extracto de levadura, peptona con etanol al 1 %) . Los transformantes se obtuvieron en placas con medio completo sintético sin uracilo que proporcionó etanol al 1 % como la fuente de carbono. Los transformantes parchados se evaluaron por PCR para confirmar la supresión/integración, con el uso de los cebadores N1090 y N1213 (sec. con núms . de ident . : 779 y 242) . Un plásmido que porta Cre recombinasa (pRS423 : :GALlp-Cre; sec. con núm. de ident.. 271) se transformó en la cepa con el uso de selección con marcador de histidina. Los transformantes se cambiaron de cultivo a un medio de YPE suplementado con galactosa al 0.5 %. Las colonias se evaluaron para analizar la resistencia a 5-FOA (pérdida del marcador de URA3) y la auxotrofía para histidina (pérdida del plásmido Cre) . La eliminación adecuada del gen URA3 al flanquear los sitios loxP se confirmó por PCR con los cebadores N1212 y N1214 (sec. con núms . de ident . : 241 y 281) . Finalmente, el plásmido de integración alsS (sec. con núm. de ident. :780) se transformó en esta cepa con el uso del marcador de selección de geneticina incluido. Los integrantes se confirmaron con el uso de los cebadores N160SeqF5 y OBP512 (sec. con núms. de ident.: 388 y 337) .

Los plásmidos pYZ090AalsS y pBP915 (sec. con núms. de ident.: 371 y 182) se transformaron en la cepa por transformación con acetato de litio (protocolo núm. 2 en "Methods in Yeast Genetics" 2005. Amberg, Burke and Strathern) . Los transformantes se seleccionaron al colocar en placas con medio sintético completo sin histidina y uracilo con etanol como la fuente de carbono. Los transformantes se parcharon y, después, se parcharon nuevamente en medio sintético completo sin histidina y uracilo con glucosa al 2 % y etanol al 0.05 %. Se evaluó seis clones para detectar crecimiento y producción de isobutanol . Uno de estos se denominó PNY2216.

Ejemplo 25 Supresión de YMR226c de la cepa PNY2211 de S. cerevisiae (construcción de PNY2248) El gen YMR226c se eliminó de la cepa PNY2211 de S. cerevisiae (descrita en el Ejemplo 9) por recombinación homologa con el uso de un cásete de supresión a base de KanMX4 lineal amplificado por PCR disponible en la cepa BY4743 ymr226cA : :KanMX4 de S. cerevisiae (ATCC 4020812). Los cebadores de PCR directos e inversos N1237 (sec. con núm. de ident.:784) y N1238 (sec. con núm. de ident.:785) amplificaron un cásete de supresión ymr226cA : : KanMX4 de 2,051 pb del cromosoma XIII. El producto de PCR contenía dirección 5' y dirección 3' secuencias de 253 y 217 pb, respectivamente, que flanquean el cásete de supresión ymr226cA : :KanMX4 y son 100 % homologas con las secuencias que flanquean el locus natural YMR226c en la cepa PNY2211. La recombinación y el intercambio genético ocurren en secuencias homologas flanqueadoras que eliminan de manera efectiva el gen YMR226C e integran el cásete de supresión ymr226cA : :KanMX4.

Aproximadamente 2.0 µ9 del producto amplificado por PCR se transformó en la cepa PNY2211 hecha competente con el uso del método de litio-acetato descrito anteriormente en Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Y, págs . 201-202 (2005)), y la mezcla de transformación se colocó en placas con medio de YPE más geneticina (50 ug/ml) y se incubó a 30 °C para la selección de células con un cásete ymr226cA : : KanM 4 integrado. Los transformantes se evaluaron para detectar ymr226cA : : KanMX4 por PCR, con un cebador interno N1240 específico para el cásete de supresión KanMX4 orientado hacia afuera en 5' (sec. con núm. de ident.:786) pareado con un cebador flanqueador N1239 específico para cromosomas orientado hacia adentro (sec. con núm. de ident.:243) y un cebador N1241 específico para el cásete de supresión KanMX4 orientado hacia afuera en 3' (sec. con núm. de ident . :787) pareado con un cebador flanqueador N1242 específico para cromosomas orientado hacia adentro (sec. con núm. de ident. :244) . Se obtuvo clones positivos PNY2211 ymr226cA : : KanMX4 , uno de los cuales se denominó PNY2248.

Ejemplo 26 Producción de isobutanol con rendimiento de DHMB reducido en el bloqueo de YMR226c Los transformantes PNY2211 ymr226cñ : : KanMX4 y un control que no es de supresión (PNY2211 con YMR226C natural) se evaluaron para analizar la producción de butanol en medio con glucosa al introducir, primero, los plásmidos que contienen la ruta de isobutanol pYZ090AalsS (sec. con núm. de ident. :371) y pBP915 (sec. con núm. de ident.: 182) simultáneamente por medio del método de transformación de acetato' de litio Quick and Dirty descrito en Methods in Yeast Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2005)). La selección de plásmidos se basó en auxotrofía de histidina y uracilo en placas de selección que contienen etanol (medio completo sintético con etanol al 1.0 % -his -ura) . Después de tres a cinco días, diversos transformantes que mostraban el crecimiento más resistente se adaptaron al medio de glucosa al parchar en SD glucosa al 2.0 % + etanol al 0.05 % -his -ura y se incubaron de 48 a 72 horas a 300 °C. Tres muestras rayadas que mostraban el crecimiento más resistente se usaron para inocular un cultivo de semillas de 10 mi en SD glucosa al 0.2 % + etanol al 0.2 % -his -ura en matraces ventilados de 125 mi y se cultivaron a 30 °C, 250 rpm durante aproximadamente 24 horas. Después, las células se subcultivaron en medio completo sintético con glucosa al 2 % + etanol al 0.05 % -his -ura en matraces con tapas apretadas, de 125 mi y se incubaron 48 horas a 30 °C. Los sobrenadantes del cultivo recolectados después de la inoculación y después de 48 horas de incubación se analizaron por HPLC para determinar la producción de isobutanol y por LC/MS para cuantificar el DHMB . Las cepas control se observaron para producir DHMB a un rendimiento molar de 0.03 a 0.07 moles por mol de glucosa. No se observó ningún pico correspondiente al DHMB en los sobrenadantes del cultivo de las cepas ymr226cA, de los cuales uno se denominó PNY2249.

Ejemplo 27 Identificación de genes que codifican enzimas con actividad de acetolactato reductasa (ALR) con el uso de la genoteca de bloqueo de levadura De una genoteca de bloqueo ("KO") de >6000 cepas de levadura derivadas de la cepa BY4743, disponible de Open Biosystems® (una división de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) , se seleccionó 95 candidatos de cepas de bloqueo de genes de deshidrogenasa . Los cultivos cebadores de las cepas de bloqueo se cultivaron en placas de 96 pocilios profundos (Costar 3960, Corning Inc., Corning NY, o similares) en medio rico de YPD y se subcultivaron a una OD 600 nm inicial de -0.3 en medio que contiene base de nitrógeno para levadura al 0.67 %, ácidos de casamino al 0.1 %, glucosa al 2 % y K+-MES 0.1 M, pH de 5.5. Las muestras se tomaron en un período de 5 días para las mediciones de DHMB y DHIV. El DHIV y los dos isómeros de DHMB se separaron y se cuantificaron por cromatografía liquida-espectrometría de masas ("LC/MS", por sus siglas en inglés) en un sistema aters (Milford, MA) AcquityTQD, con el uso de una columna Atlantis T3 (parte núm. 186003539) . La columna se mantuvo a 30 °C y el índice de flujo fue de 0.5 ml/min. La fase móvil A fue ácido fórmico al 0.1 % en agua, y la fase móvil B fue ácido fórmico al 0.1 % en acetonitrilo . Cada prueba consistió en 1 min en A al 99 %, un gradiente lineal con 1 min para B al 25 %, seguido por 1 min en A al 99 %. El efluente de la columna se monitoreó para detectar picos a m/z = 133 (ESI negativo), con un voltaje de cono de 32.5V, con el detector de espectros de masa Waters ACQ_TQD (s/n QBA688) . El llamado "DHMB rápido" surgió, típicamente, a los 1.10 min, seguido por DHIV a los 1.2 min, y el DHMB "lento" surgió a los 1.75 min. Se obtuvo la separación de referencia y las áreas pico para DHIV se convirtieron a concentraciones de DHIV de µ? como referencia para los análisis de soluciones estándar preparadas a partir de una solución base acuosa 1M. Estas mediciones mostraron que la mayoría de cambios en las concentraciones de DHMB ocurrieron en las primeras 48-60 horas, entonces se tomó una sola muestra a aproximadamente ese tiempo en los experimentos posteriores. En este experimento, el DHMB rápido se encontró a concentraciones mucho mayores que el DHMB lento, que no siempre fue detectable . La relación de DHIV y DHMB rápido en la mayoría de cultivos fue de ~ 3, pero una cepa sin el gen YMR226C mostró consistentemente concentraciones muy bajas de DHMB rápido y un DHIV normal, de manera que la relación de DHIV/DHMB rápido fue de aproximadamente 100. Esto sugirió que YMR226Cp es la principal ALR en este entorno.

Para confirmar que YMR226Cp es la principal ALR en este entorno, las concentraciones in vitro de ALR y KARI se evaluaron en la cepa de supresión ymr226c (American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas VA, núm. de la ATCC 4020812) y su genitora, BY4743 (núm. de la ATCC 201390; American Type Culture Collection, Manassas VA) . Se inoculó tubos de 50 mi que contienen 6 mi de YPD a partir de placas de agar de YPD y se dejó que crecieran durante la noche (30 °C, 250 rpm) . Las células se agruparon, se lavaron una vez en agua y se resuspendieron en 1 mi de regulador de citoplasma de levadura (Van Eunen et al. FEBS Journal 277: 749-760 (2010) ) que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa de levadura (Roche, Basel, Suiza, catálogo núm. 11836170001, usado como lo indicó el proveedor, 1 tableta por 10 mis de regulador) . Se agregó tolueno (0.02 mi, Fisher Scientific, Fair Lawn NJ) y los tubos se agitaron a velocidad máxima durante 10 min en un agitador Vortex Genie 2 (Scientific Industries, Bohemia NY, modelo G-560) para permeabilización . Los tubos se colocaron en un baño de agua a 30 °C y se agregó sustratos en las siguientes concentraciones finales: (S) -acetolactato (preparado enzimáticamente como se describe a continuación en el Ejemplo 29) hasta 9.4 mM, NADPH (Sigma-Aldrich, St . Louis MO) 0.2 mM más un sistema de regeneración de NAD(P)H que consiste en glucosa-6-fosfato ~ 10 mM y 2.5 U/ml de glucosa-6 - fosfato deshidrogenasa de Leuconostoc mesenteroides (Sigma, St . Louis, MO, catálogo núm. G8404) . A intervalos de tiempo, se agregó alícuotas (0.15 mi) hasta 0.15 mi de alícuotas de ácido fórmico al 2 % para detener la reacción. Después, las muestras se analizaron para detectar DHIV y ambos isómeros de DHMB por LC/MS como se describió anteriormente; únicamente se observó DHMB rápido y DHIV. Las actividades específicas de las dos enzimas en las dos cepas se muestran en la Tabla 31.

Tabla 31. Actividades de las enzimas KARI y ALR Los datos sugieren que el producto génico YMR226C constituía el >99 % de la actividad de ALR.

Ejemplo 28 Identificación de los genes que codifican enzimas con actividad de acetolactasa reductasa (ALR) con el uso de la genoteca de sobreexpresión de levadura De una colección de "ORF de levadura" de >5000 transformantes de Y258 cada uno con un plásmido que porta un gen de levadura conocido más un marcador C-terminal, bajo el control de un promotor inducible (Open Biosystems®, una división de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) , 96 cepas con plásmidos que contienen genes asociados con actividad de deshidrogenasa se cultivaron en un formato de 96 pocilios mediante la adaptación del protocolo de crecimiento e inducción recomendado por el proveedor (Open Biosystems®) .

Las células se agruparon y se permeabilizaron con tolueno como se describió anteriormente, y se agregó una mezcla de sustrato concentrada para lograr concentraciones finales como en el Ejemplo 27. Se tomó muestras programadas y se analizaron para evaluar el DHIV y ambos isómeros de DHMB . Las relaciones de ALR/KARI se calcularon y se compararon. Las cepas con relaciones elevadas eran candidatos para la sobreproducción de actividades de ALR. Cuando los datos para índices relativos de formación de DHMB rápido y DHIV se presentaron en un diagrama de distribución de datos Minitab® (Microsoft Inc., Redmond, WA) , la mitad de las relaciones se encontraba entre ~9 y 13, y la mayoría del resto se encontraba entre 3 y 19. Las excepciones identificadas como valores atípicos incluían YER081 , YIL074C, YMR226C, YBR006W y YOR375C, para los cuales las relaciones de ALR/KARI se encontraban entre 22 y 40. En un análisis similar de relaciones relativas de formación de DHMB lento y DHIV, la mitad de las relaciones se encontraba entre 9 y 11, pero YMR226C, YPL275W, YER081W y YOL059W aparecieron como valores atípicos, con relaciones entre 13 y 25. Por lo tanto, la sobreexpresión de YMR226C y YER081 aumentó la síntesis de ambos DHMB. Adicionalmente , YIL074C, YBR006 y YOR375C aumentaron la síntesis de DHMB rápido, y YPL275W y YOL059W aumentaron la síntesis de DHMB lento. Las secuencias de ADN genómico (que pueden incluir intrones) y las secuencias de traducción de ORF de genes identificados en la sobreexpresion se proporcionan en la Tabla 6.

Ejemplo 29 Inhibición de KARI por DHMB Producción enzimática de (S) -acetolactato Se usó (S) -acetolactato como una materia prima para la síntesis de DHMB. El (S) -acetolactato se preparó enzimáticamente de la siguiente manera. Una cepa TOP10 de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA) modificada para expresar Klebsiella BudB (descrito anteriormente en la patente de los Estados Unidos núm. US 7,851,188, que se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad; ver el Ejemplo 9 de esa patente) bajo control de IPTG se usó como fuente de enzimas. Se cultivó en volúmenes de cultivo de 200-1000 mi. Por ejemplo, se cultivó 200 mi en caldo Luria (Mediatech, Manassas, VA) que contiene 0.1 mg/ml de ampicilina (Sigma, St . Louis, MO) en un matraz cónico de 0.5 1, que se agitó a 250 rpm a 37 °C. A una OD 600 de -0.4, se agregó isopropiltiogalactosida (Sigma, St . Louis, MO) hasta 0.4 mM y el crecimiento se continuó durante 2 horas antes de recolectar las células por centrifugación, para producir ~ 1 g de células en peso en húmedo. Además, se llevó a cabo purificaciones parciales a escalas desde -0.5 hasta 5 g de células húmedas. Por ejemplo, -0.5 g de células se suspendieron en 2.5 mi de regulador que contiene Na-MES 25 mM, H de 6 , se descompusieron por sonicación a 0 °C y se depuraron por centrifugación. El extracto crudo se suplemento con tiamina pirofosfato 0.1 mM, MgCl2 10 mM y EDTA 1 mM (todos de Sigma, St . Louis, MO) . Después, se agregó 0.07 mi de estreptomicina sulfato acuoso al 10 % en w/v (Sigma, St. Louis, MO) y la muestra se calentó en un baño de agua a 56 °C durante 20 min. Se depuró por centrifugación y el sulfato amónico se agregó hasta un 50 % de saturación. La mezcla se centrifugó y el comprimido se llevó hasta 0.5 mi de Na-MES 25 mM, pH de 6.2 y se usó sin caracterización adicional. Las síntesis de acetolactato se llevaron a cabo, además, a diversas escalas; Una gran preparación se realizó de la siguiente manera: se disolvió 5.5 g de piruvato sódico en Na-MES 25 mM, pH de 6.2, hasta ~ 45 mi y se suplemento con MgC12 10 mM, tiamina pirofosfato 1 mM, EDTA 1 mM (todos de (Sigma, St . Louis, MO) , acetato sódico 25 mM (Fisher Scientific, Fair Lawn NJ) y 0.25 mi de una preparación de BudB . La mezcla se agitó con un medidor de pH a temperatura ambiente. A medida que la reacción continuaba, evolucionó el C02 , y el pH aumentó. Se agregó lentamente ácido pirúvico (Alfa, Ward Hill, MA) con una bomba peristáltica para mantener el pH entre 6 y 7. A medida que el pH aumentaba, la reacción enzimática fue más lenta, pero si se permite que caiga hasta menos de 6 , la decarboxilación del ácido acetoláctico se convierte en un problema. Cuando la reacción se completó, la mezcla se almacenó a -80 °C.

Síntesis de DHMB El DHMB se sintetizó químicamente a partir de (S) -acetolactato . Tres mi de una preparación de acetolactato crudo a -0.8 M, a un pH de ~8, se trataron con 1.2 equivalentes de NaBH4 (Aldrich Chemical Co, Milwaukee, WI) . Se dejó que la reacción se asentara a temperatura ambiente durante la noche antes de dividirla en dos y desalar en dos porciones en una columna de 60 cm x 1 cm de diámetro de Biogel P-2 (Bio-Rad, Hercules, CA) con el uso de agua como la fase móvil. Las fracciones que contienen DHMB mezclados se concentraron por evaporación giratoria y se ajustaron hasta un pH de 2.2 con ácido sulfúrico.

Los diastereómeros de DHMB se separaron con el uso de un sistema de HPLC (que consiste en una bomba LKB 2249 y un controlador de gradiente (LKB, ahora una división de General Electric, Chalfont St Giles, Reino Unido) y un detector Hewlett-Packard (ahora Agilent, Santa Clara, CA) 1040A UV/vis) con un segmento Waters Atlantis T3 (5 um, 4.6 x 150 mm) a temperatura ambiente en ácido fórmico acuoso al 0.2 %, pH de 2.5 , a un índice de flujo de 0.3 ml/min, con una detección UV a 215 nm. El DHMB "rápido" se lavó a los 8.1 min y el DHMB "lento" se lavó a los 13.7 min. No hubo DHIV presente. Las fracciones agrupadas se tomaron casi hasta secar completamente y se coevaporaron con tolueno para eliminar el ácido fórmico residual. Después, el residuo se disolvió en agua y se hizo básico con trietilamina (Fisher, Fair Lawn, NJ) .

Determinación de la concentración y estructura absoluta de DHMB La concentración de las soluciones de DHMB purificado se determinó de la siguiente manera. La concentración se calculó en base a los mmoles de acetolactato usados en la reducción de NaBH . A las porciones de DHMB, se agregó una cantidad conocida de benzoato sódico (preparado al disolver ácido benzoico sólido (grado ACS, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) en NaOH acuoso) ) para producir mezclas de dos componentes en (aproximadamente) cantidades equimolares. Además, se preparó una muestra similar de DHIV a partir de la sal sódica sólida obtenida por medio de síntesis tradicional (Albany Molecular Research, Albany NY) . Las muestras se coevaporaron varias veces con D20 (Aldrich, Milwaukee, WI) y se disolvieron nuevamente en D20. Se obtuvo los espectros de NMR de protones integrados y se usaron para determinar la relación molar de DHIV o DHMB y benzoato. La comparación de los espectros de NMR de los DHMB con los espectros de la literatura para los ácidos libres en CDC13 (Kaneko et al., Phytochemistry 39: 115-120 (1995)) demostró que el DHMB rápido fue el isómero eritro. Dado que el acetolactato sintetizado enzimát icamente tiene la configuración (S) en C-2, el DHMB rápido tiene la configuración 2S, 3S . El DHMB lento tiene la configuración - treo 2S, 3R.

Las diluciones de las muestras de NMR se analizaron, además, por LC/MS con el uso de soluciones de ácido benzoico preparadas por separado como estándar. El ácido benzoico, DHIV y los dos isómeros de DHMB se separaron y se cuantificaron por LC/MS en un sistema Waters (Milford, MA) AcquityTQD, con el uso de una columna Atlantis T3 (parte núm. 186003539), como se describió anteriormente. El ácido benzoico se detectó a m/z=121 (ESI negativo) y surgió a los 2.05 min. La concentración de benzoato en las mezclas se encontraba en una ambigüedad experimental del valor esperado. El experimento mostró, además, que cualquiera de los isómeros de DHMB tuvo -80 % de la sensibilidad de DHIV en LC/MS (por ejemplo, área de pico MS observada /nraoles inyectados) a lo largo del intervalo de respuesta del instrumento. Por lo tanto, si se usa un DHIV estándar para cuantificar el DHMB encontrado en los extractos celulares o en las reacciones enzimáticas, las concentraciones de DHMB evidentes deben multiplicarse por 1.25.

Medición de la inhibición de KARI por DHMB La KARI purificada codificada por genes ya sea de Lactococcus lactis (sec. con núm. de ident . : 864), un derivado de KARI de Pseudomonas fluorescens conocida como JEA1 (sec. con núm. de ident.: 799; publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2010/0197519, que se incorpora en la presente descripción como referencia en su totalidad) o una variante de KARI de Anaerostipes caccae conocida como K9D3 (sec. con núm. de ident. :788) se evaluaron para analizar su sensibilidad a la inhibición de DHMB en ensayos espectrofotométricos en un instrumento UV160U Shimadzu (Kyoto, Japón) con una unidad de control de temperatura TCC240A, predeterminada a 30 °C. El regulador fue K+ Hepes 0.1 M, pH de 6.8, que contiene MgCl2 10 mM y EDTA 1 mM . El NADPH estaba presente a 0.2 mM y el acetolactato racémico estaba presente ya sea en un isómero (S) 3 mM o 0.725 mM . Se determinó el índice de oxidación de NADPH en presencia y ausencia ya sea de DHMB rápido o lento. La Vmgx. para cada muestra se calculó a partir del índice observado y la KM conocida de acetolactato con el uso de la ecuación de Michaelis -Menten . Se calculó la Ki volumétrica para cada medición en presencia de DHMB con el uso de la ecuación de Michaelis-Menten según se modificó para la inhibición competitiva contra el acetolactato (el término KM en la ecuación de Michaelis-Menten se multiplica por (1+[I]/ K) y la ecuación se resuelve para . Los resultados se convirtieron en mM con la finalización del experimento de NMR y se muestran en la Tabla 32.

Tabla 32. Valores de ?t para la inhibición de KARI por los isómeros de DHMB Ejemplo 30 Inhibición de DHAD por DHMB La dihidroxiácido deshidratasa (DHAD) purificada de Staphococcus mutans se analizó para evaluar la inhibición de conversión de dihidroxiisovalerato (DHIV) a 2-cetoisovalerato (2-KIV) por DHMB con el uso de una modificación de un ensayo colorimétrico como lo describen Szamosi et al., Plant Phys . 101: 999-1004 (1993). El ensayo se llevó a cabo en un tubo Eppendorf de 2 mi colocado en un bloque de calentamiento mantenido a 30 °C. La mezcla de ensayo tuvo un volumen final de 0.8 mi que contiene HEPES 100 mM-regulador KOH, pH de 6.8, MgCl2 10 mM, DHIV 0.5-10 mM, DHMB 0-40 mM y 18 ]ig de DHAD. El ensayo se inició al agregar una materia prima concentrada lOx de sustrato. Las muestras se eliminaron (0.35 mi) a los 0.1 minutos y a los 30 minutos, y la reacción se detuvo al mezclar en 0.35 mi de HC1 0.1 N con 2 , 4 -dinitrofenilhidrazina al 0.05 % (Aldrich) en un segundo tubo Eppendorf. Después de incubar 30 minutos a temperatura ambiente, se agregó 0.35 mi de NaOH 4N en la mezcla, se mezcló y se centrifugó a 15,000xG durante 2 minutos en una centrifugadora (microcentrifugador 18 Beckman-Coulter) . Después, la absorbancia de la solución a 540 ntn se determinó en una cubeta de paso óptico de 1 cm con el uso de un espectrofotómetro Cary 300 Bio UV-Vis (Varían) . En base a una curva estándar con el uso de 2-KIV (Fluka) real, una absorbancia de 1 OD a 540 nm es producida por 2-KIV 0.28 raM. El índice de formación de 2-KIV se determinó en presencia y ausencia ya sea de DHMB rápido o lento. Ambas formas de DHMB se comportaron como inhibidores competitivos de DHIV. Sus constantes de inhibición (Ki) se calcularon a partir de la ecuación de Michaelis-Menten para una inhibición competitiva simple: v S*Vmáx./ (S+KM* (1+I/Ki) ) , en donde v es el índice determinado de formación de 2-KIV, S es la concentración inicial de DHIV, Vmáx. es el índice máximo calculado a partir del índice observado a 10 mM de DHIV y sin DHMB, la KM es una constante determinada previamente de 0.5 mM, y I es la concentración de DHMB. Los isómeros rápido y lento de DHMB tuvieron constantes de inhibición calculadas de 7 mM y 5 mM, respectivamente.

Ejemplo 31 Identificación de homólogos de YMR226C Los homólogos del gen YMR226C de Saccharomyces cerevisiae se buscaron por búsquedas BLAST de la base de datos de nucleótidos no redundantes del GenBank (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), la herramienta de búsqueda BLAST de genomas fúngicos en la base de datos del genoma de Saccharomyces (www.yeastgenome.org/cgi-bin/blast-fungal.pl) y la herramienta BLAST del proyecto Genolevures (genolevures.org/blast.html#). Se identificó secuencias únicas a partir de 18 especies de levaduras que muestran una identidad de secuencias alta con Y R226C, y el ORF completo para estos genes se recuperó del registro en la base de datos asociada. Las secuencias de polipéptidos codificadas por estos ORF se determinaron por medio de la característica de traducción de Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad CA) . Las secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos se muestran a continuación en la Tabla 33. Las especies de levaduras, los números de registro de la base de datos de nucleótidos, y las secuencias de ADN y de proteínas se proporcionan en la tabla. La secuencia de S. kluyveri se encuentra en la base de datos Genolevures con el número de registro específico; las otras se encuentran en el GenBank. Las identidades porcentuales entre las secuencias se muestran en la Tabla 34.

Los 18 ORF se alinearon con el uso de AlignX (Vector NTI; el gen que codifica una deshidrogenasa dependiente de NADP+ positivo de Neurospora crassa (XM_957621, identificada en la búsqueda BLAST del GenBank con el uso de la secuencia de nucleótidos YMR226C) se usó como grupo externo. El árbol filogenético resultante se muestra en la Figura 11 y un alineamiento de secuencias se muestra en la Figura 12.

La identidad de secuencias de estos homólogos con YMR226C se encuentra de un mínimo de 55 % {Yarrowia lipolytica y Schizosaccharomyces pomhe) a un máximo de 90 % (S. paradoxus) . Una búsqueda BLAST reveló, además, un ADNc de S. pastorianus (número de registro CJ997537) con 92 % de identidad de secuencias con 484 pares de bases, pero dado que esta especie es un híbrido entre S. bayanus (cuyo homólogo YMR226C muestra 82 % de identidad con la secuencia de S. cerevisiae) y dado que únicamente una secuencia de ORF parcial estaba disponible, esta secuencia no se incluyó en la comparación. Cuando la secuencia de YMR226C de la cepa S288C de laboratorio tradicional se comparó con las secuencias de otras 12 cepas de S. cerevisiae, únicamente se encontraron 4 polimorfismos de un solo nucleótido (identidad de secuencias de 99.5 %) , lo que indica que este es un gen altamente conservado en esa especie.

Tabla 33. Homólogos de levadura YMR226C Tabla 34. Identidad porcentual del homólogo YMR226C Clave de Tabla 34: Saccharomyces paradoxus ( "Spa" ) ; Saccharomyces mikatae ( "Sm" ) ; Saccharomyces bayanus ("Sb"),-Saccharomyces castellii ("Sea"); Ashbya gossypii ( "Ag" ) ; Debaryomyces hansenii ( "Dh" ) ; Scheffersomyces stipitis ("Ss") ; Meyerozyma guilliermondii ( "Mg" ) ; Candida dubliniensis ("Cd"); Candida glabrata ("Cg"); Vanderwaltozyma polyspora ( "Vp" ) ; Saccharomyces kluyveri ("Sk"); Kluyveromyces lactis ("Kl"); Lachancea thermotolerans ("Lt"); Zygosaccharomyces rouxii ("Zr") ; Saccharomyces cerevisiae ("Sce"); Schizosaccharomyces pombe ("Spo"); Yarrowia lipolytica ("Yl"); Neurospora crassa ("Nc") Ejemplo 32 (esperado) Evaluación de aldehido deshidrogenasas de S. cerevisiae para analizar la capacidad de convertir isobutiraldehído a ácido isobutírico con el uso de ensayos enzimáticos Este ejemplo demuestra un método para determinar cuales aldehido deshidrogenasas endógenas de S. cerevisiae pueden convertir enzimáticamente isobutiraldehído a ácido isobutírico .

Las cepas de S. cerevisiae que contienen interrupciones individuales en las enzimas aldehido deshidrogenasas conocidas se obtienen de la ATCC: BY4741 ñald2 : :kanMX4 (núm. de la ATCC 4000753); BY4741 Í\ald3 : :kanMX4 (núm. de la ATCC 4000752); BY4741 ¿\ald4 : :kanMX4 (núm. de la ATCC 4001671); BY4741 &ald5 : :kanMX4 (núm. de la ATCC 4000213); y BY4741 ¿ald6 : :kanMX4 (núm. de la ATCC 4002767).

Las cepas de supresión mencionadas anteriormente se cultivan, primero, durante la noche en tubos que contienen 5 mi de medio de YPD a 30 °C. Los 5 mi de cultivos que se dejaron durante la noche se trasladan a 100 mi de medio en un matraz de 500 mi y se incuban a 30 °C con agitación a 220 rpm. Los cultivos se recolectan cuando alcanzan una O.D. de 1 a 2 a 600 nm. Las muestras se lavaron con 10 mi de Tris 20 mM (pH de 7.5) y, después, se resuspenden en 1 mi del mismo regulador Tris. Las muestras se transfirieren a tubos de 2.0 mi que contenían 0.1 mm de sílice (Lysing Matrix B, MP biomedicals) . Después, se lleva a cabo la ruptura mecánica de las células en un macerador (BIO101) . El sobrenadante se obtiene por centrifugación en una microcentrífuga a 13,000 rpm a 4 °C durante 30 min. Típicamente, se usa de 0.06 a 0.1 mg de proteína de extracto crudo en un solo ensayo. La proteína en los extractos crudos se determinó con el ensayo Bradford con la cepa Coomassie.

La actividad de aldehido deshidrogenasa se determina según un protocolo proporcionado por Sigma-Aldrich y por Bostian and Betts (Bostian, K.A. and Betts, G.F. (1978) Biochemical Journal 173, 773-786). Los extractos crudos de las cepas de supresión mencionadas anteriormente y la aldehido deshidrogenasa disponible comercialmente se evalúan con el uso de este método.

Un ensayo alterno consiste en agregar isobutiraldehído a concentraciones de 1 a 30 mM hasta aproximadamente 0.1 mg de proteína de extracto crudo en viales de GC de vidrio sellados que se incuban a 30 °C durante 30 minutos. Después, los extractos se centrifugan a través de filtros giratorios de 0.22 µp? (Corning, catálogo núm. 8169) a 3000 rpm durante 3 minutos y el filtrado se transfirió a un vial de GC para el análisis de GC-MS. Se detecta isobutiraldehído y ácido isobutírico .

El método de GC usa una GC Agilent 7890 equipada con un espectrómetro de masas 5975 para detección y una columna DB- 1701 (30 m x 0.25 mm ID, 0.25 ym de película) de Agilent (Santa Clara, CA) . El gas portador es helio a un índice de flujo constante de 1.0 ml/min; la división del inyector es de 1:10 a 250 °C; la temperatura del horno es de 40 °C durante 1 min, de 40 °C a 120 °C a 10 °C/min, y de 120 °C a 240 °C a 30 °C/min. Se usa la detección por MS en modo de exploración completa para la identificación y cuantificación de isobutiraldehído y ácido isobutírico. Se genera curvas estándar calibradas para los siguientes compuestos: isobutiraldehído, ácido isobutírico e isobutanol.

Ejemplo 33 Construcción de vectores de expresión para la expresión del gen de la ruta de isobutanol en S. Cerevisiae Construcción de pLH475-JEAl El plásmido pLH475-JEAl (sec. con núm. de ident . : 419) se construyó para la expresión de ALS y KARI en levadura. pLH475-JEAl es un vector pHR81 (núm. de la ATCC 87541) que contiene los siguientes genes quiméricos: 1) el promotor CUP1 (sec. con núm. de ident.: 789), la región codificante de acetolactato sintasa de Bacillus subtilis (AlsS; sec. con núm. de ident.: 790; proteína con la sec. con núm. de ident. 791) y el terminador 2 de- CYC1 (sec. con núm. de ident.: 792) ; 2) un promotor de ILV5 (sec. con núm. de ident.: 793), la región codificante de Pf5. IlvC-JEA1 y el terminador de ILV5 (sec. con núm. de ident.: 794); y 3) el promotor de FBA1 (sec. con núm. de ident . : 795), la región codificante de KARI de S. cerevisiae (ILV5; sec. con núm. de ident.: 796; proteína con la sec. con núm. de ident. 797) y el terminador de CYC1 (sec. con núm. de ident.: 798).

La región codificante de Pf5. IlvC-JEA1 es una secuencia que codifica KARI derivada de Pseudomonas fluorescens pero que contiene mutaciones, que se describe en las publicaciones de solicitudes de patentes de los Estados Unidos núms . 2009/0163376 y 2010/0197519, que se incorporan en la presente descripción como referencia en su totalidad. La KARI codificada por Pf5. IlvC-JEAl (sec. con núms. de ident. de ácido nucleico y de aminoácidos: 799 y 800) tiene los cambios de aminoácidos en comparación con la KARI natural de Pseudomonas fluorescens .

Vector de expresión pLH468 El plásmido pLH468 (sec. con núm. de ident. :139) se construyó para la expresión de DHAD, KivD y HADH en levadura.

Las regiones codificantes para cetoisovalerato decarboxilasa (KivD) de L. lactis y alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HADH) se sintetizaron por DNA2.0 con base en codones que se optimizaron para la expresión en Saccharo yces cerevisiae (sec. con núms. de ident.: 801 y 802, respectivamente) y se proporcionaron en plásmidos pKivDy-DNA2.0 y pHadhy-DNA2.0. Las proteínas codificadas son las sec. con núms. de ident. : 803 y 804, respectivamente. Se construyeron los vectores de expresión individuales para KivD y HADH. Para unir pLH467 (pRS426 : : P-rOm-kivDy-TDH3t) , el vector pNY8; llamado, además, pRS426. GPD-ald-GPDt , descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US2008/0182308 , Ejemplo 17, que se incorpora en la presente descripción como referencia) se digirió con las enzimas AscI y Sfil, para cortar el promotor de GPD y la región codificante de ald. Un fragmento del promotor TDH3 (sec. con núm. de ident . : 805) de pNY8 se amplificó por PCR para agregar un sitio AscI en el extremo 5' y un sitio Spel en el extremo 3', con el uso del cebador OT1068 en 51 y el cebador OT1067 en 3' (sec. con núms . de ident.: 806 y 807). El fragmento del vector pNY8 digerido con Ascl/Sfil se unió con el producto de PCR del promotor TDH3 digerido con AscI y Spel y el fragmento Spel -Sfil que contiene la región codificante de kivD optimizada por codones aislada del vector pKivD-DNA2.0. La ligación triple generó el vector pLH467 (pRS426: : PTDH3 -kivDy-TDH3t ) . El pLH467 (sec. con núm. de ident.: 808) se verificó por mapeo de restricción y secuenciación.

El pLH435 (pRS425: : PGPM1 -Hadhy-ADHlt ) se derivó del vector pRS425 : :GPM-sadB (sec. con núm. de ident.: 809) que se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305363, Ejemplo 3, que se incorpora en la presente descripción como referencia. pRS425 : :GPM-sadB es el vector pRS425 (núra. de la ATCC 77106) con un gen quimérico que contiene el promotor de GPMl (sec. con núm. de ident . : 810) , la región codificante de una butanol deshidrogenasa de Achromobacter xylosoxidans (sadB; ADN de la sec. con núm. de ident. : 811; proteína con la sec. con núm. de ident. 812) y el terminador de ADH1 (sec. con núm. de ident. : 444) . pRS425 : : GPMp-sadB contiene los sitios Bbvl y Pací en los extremos 5' y 31 de la región codificante de sadB, respectivamente. Se agregó un sitio Nhel en el extremo 51 de la región codificante sadB mediante mutagénesis sitio dirigida con el uso de los cebadores OT1074 y OT1075 (sec. con núms. de ident. : 813 y 814) para generar el vector pRS425-GPMp-sadB-NheI , que se verificó por secuenciación. El pRS425 : : Pami- sadB-Nhel se digirió con Nhel y Pací para abandonar la región codificante sadB, y se unió con el fragmento Nhel-Pací que contiene la región codificante HADH optimizada por codones del vector pHadhy-DNA2.0 para crear pLH435 (sec. con núm. de ident. : 815) .

Para combinar los casetes de expresión de KivD y HADH en un solo vector, el vector de levadura pRS411 (núm. de la ATCC 87474) se digirió con Sacly Notl y se unió con el fragmento SacI -Salí de pLH467 que contiene el cásete PTDH3 -kivDy-TDH3t junto con el fragmento Salí-Notl de pLH435 que contiene el cásete l?GPMi-Hadhy-ADHlt en una reacción de unión triple. Esto produjo el vector pRS411 : : ?>???3-kivDy-PGPM1-Kadhy (pLH441, sec. con núm. de ident . : 816), que se verificó por mapeo de restricción .

Para generar un vector de coexpresión para los tres genes en la ruta de isobutanol inferior: ilvD, kivDy y Had y, usamos pRS423 FBA ilvD(Strep) (sec. con núm. de ident.: 817), como la fuente del gen IlvD. Este vector transportador contiene un origen de replicación Fl (nt 1423 a 1879) para mantenimiento en E. coli y un origen de 2 micrones (nt 8082 a 9426) para replicación en levadura. El vector tiene un promotor FBA1 (nt 2111 a 3108; sec. con núm. de ident.: 795) y terminador FBA1 (nt 4861 a 5860; sec. con núm. de ident.: 818) . Adicionalmente, incluye el marcador His (nt 504 a 1163) para la selección en levaduras y el marcador de resistencia a la ampicilina (nt 7092 a 7949) para la selección en E. coli. La región codificante ilvD (nt 3116 a 4828; sec. con núm. de ident. : 819; proteína con la sec. con núm. de ident. 820) de UA159 de Streptococcus mutans (núm. de la ATCC 700610) está entre el promotor FBA1 y el terminador FBA1 y forma un gen quimérico para expresión. Además, una etiqueta Lumio está fusionada a la región codificante de ilvD (nt 4829-4849) .

La primera etapa fue linealizar pRS423 FBA ilvD(Strep) (también denominado pRS423 -FBA (Spel ) - IlvD {Streptococcus mutans) -Lumio) con SacI y SacII (con el sitio SacII generado con extremos romos mediante el uso de la T4 ADN polimerasa) , para dar un vector con una longitud total de 9,482 pb . La segunda etapa fue aislar el cásete kivDy-hADHy de pLH441 con SacI y Kpnl (con el sitio Kpnl generado con extremos romos mediante el uso de la T4 ADN polimerasa) , que da un fragmento de 6,063 pb . Este fragmento se unió con el fragmento del vector de 9,482 bp de pRS423 -FBA ( Spel ) - IlvD ( Streptococcus mutans) -Lumio . Este vector generado pLH468 (pRS423 : : PFBAI~ üv-D(Strep) Lumio-FB-¾lt-PTOH3-^iv y-TDH3t-PGpm-had y--¾DHlt) se confirmó por mapeo de restricción y secuenciación .

Ejemplo 34 Construcción de la cepa huésped de S. cerevisiae que contiene modificaciones en piruvato descarboxilasa y hexocinasa 2 Este ejemplo describe la inserción- inactivación de los genes endógenos PDC1, PDC5 y PDC6 de S. cerevisiae . Los genes PDC1, PDC5 y PDC6 codifican las tres isoenzimas principales de piruvato decarboxilasa . Además, se inactiva la hexocinasa 2, que es responsable por la fosforilación de glucosa y la represión transcrípcional . La cepa de inactivación de PDC/HXK2 resultante se usó como un huésped para los vectores de expresión pLH475-JEAl y pLH468.

Construcción del cásete de integración pdc6 : : PGPMI~ sadB y supresión de PDC6 : Un cásete de integración pdc6 : : PGPM1- sadB-ADHlt-URA3x se preparó al unir el segmento GPM- sadB-ADHt (sec. con núm. de ident. : 821) de pRS425: :GPM-sadB (descrito en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2009/0305363, que se incorporan como referencia) al gen URA3r del pUC19-URA3r. El pUC19-URA3r (sec. con núm. de ident . : 822) contiene el marcador URA3 de pRS426 (núm. de la ATCC 77107) flanqueado por secuencias de repetición homologas de 75 pb para permitir la recombinación homologa in vivo y la eliminación del marcador URA3. Los dos segmentos de ADN se unieron por PCR SOE (como lo describen Horton et al. (1989) Gene 77:61-68) al usar el ADN de plásmidos de pRS425::GPM-sadB y pUC19-URA3r como plantilla, con ADN polimerasa Phusion (New England Biolabs Inc., Beverly, MA; catálogo núm. F-540S) y los cebadores 114117-11A a 114117-11D (sec. con núms . de ident.: 823, 824, 825, 826) y 114117-13A y 114117-13B (sec. con núms. de ident. : 827 y 828) .

Los cebadores externos para la PCR SOE (114117-13A y 114117-13B) contenían regiones en 5 ' y 3' de -50 pb homologas para las regiones dirección 5' y dirección 3' del promotor y el terminador de PDC6 , respectivamente. El fragmento de PCR del cásete finalizado se transformó en BY4700 (núm. de la ATCC 200866) y los transformantes se mantuvieron en medio sintético completo sin uracilo y suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C con el uso de técnicas genéticas estándar {Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202). Los transformantes se analizaron por PCR mediante el uso de cebadores 112590-34G y 112590-34H (sec. con núm. de ident.: 829 y 830) y 112590-34F y 112590-49E (sec. con núms . de ident.: 831 y 832) para verificar la integración en el locus PDC6 con la supresión de la región codificante de PDC6. El marcador de URA3r se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementados con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : :PGPM1- sadB-ADHlt .

Construcción del cásete de integración pdcl:: PPDc_.-ilvD y supresión de PDC1 : Un cásete de integración pdcl:: PPDCi-ilvD-FBAlt-lIRA3r (sec. con núm. de ident.: 833) se preparó al unir el segmento ilvD-FBAlt de pLH468 al gen URA3r de pUC19-URA3r por PCR SOE (como lo describen Horton et al. (1989) Gene 77:61-68) con el uso del ADN de plásmidos de pLH468 y pUC19-URA3r como plantilla, con ADN polimerasa Phusion (New England Biolabs Inc., Beverly, MA; catálogo núm. F-540S) y los cebadores 114117-27A a 114117-27D (sec. con núms. de ident.: 823, 824, 825, 826).

Los cebadores externos para la PCR SOE (114117-27A y 114117-27D) contenían las regiones 5' y 3' de -50 pb homologas a las regiones dirección 3' del promotor de PDC1 y dirección 3' de la secuencia codificante de PDC1. El fragmento de PCR del cásete finalizado se transformó en BY4700 pdc6 : :PGPMI~ sadB-ADHlt y los transformantes se mantuvieron en medio sintético completo sin uracilo y suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C con el uso de técnicas genéticas estándar {Methods in Yeast Genetics , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) . Los transformantes se evaluaron por PCR con el uso de los cebadores 114117-36D y 135 (sec. con núms . de ident. 834 y 835) y los cebadores 112590-49E y 112590-30F (sec. con núms. de ident. 832 y 836) para verificar la integración en el locus PDC1 con la supresión de la secuencia codificante de PDC1. El marcador de URA3r se recicló por cultivo en placas con medios sintéticos completos suplementados con glucosa al 2 % y 5-FOA a 30 °C de conformidad con protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa resultante identificada "NYLA67" tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : : PGPM1- sadB-ADHlt pdcl : :_PpDCi- HvD-FBAlt .

Supresión de HIS3 Para eliminar la región codificante HIS3 endógena, un cásete his3: :URA3r2 se amplificó por PCR a partir del ADN de plantilla de URA3r2 (sec. con núm. de ident. : 837) . URA3r2 contiene el marcador de URA3 de pRS426 (núm. de la ATCC 77107) flanqueado por secuencias de repetición homologas de 500 pb para permitir la recombinación homologa in vivo y la eliminación del marcador de URA3. Se realizó el PCR mediante el uso de ADN-polímerasa Phusion e cebadores 114117-45A y 114117-45B (sec. con núms . de ident . : 838 y 839) que generó un producto de PCR de -2.3 kb. La porción de HIS3 de cada cebador se derivó de la región en 5' dirección 5' del promotor de HIS3 y la región en 3' dirección 3' de la región codificante, de manera que la integración del marcador de URA3r2 produce el reempbucle de la región codificante de HIS3. El producto de PCR se transformó en NYLA67 con el uso de técnicas genéticas estándar {Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes se seleccionaron en medio sintético completo sin uracilo y suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes se evaluaron para verificar la integración correcta al colocar en placas de réplica de los transformantes en medio, sintético completo sin histidina y suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. El marcador URA3r se recicló al colocar en placas con medio sintético completo suplementado con glucosa al 2 % y 5-FOA a 30 °C de conformidad con los protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas con medio 5-FOA sobre medios SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante, denominada NYLA73, tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : :PGPMI~ sadB-ADHlt pdcl : : PPDCi- ilvD-FBAlt ¿his3.

Supresión de HXK2 : Un cásete hxk2::URA3r se amplificó por PCR de una plantilla URA3r2 (descrita anteriormente) por medio del uso de ADN polimerasa Phusion y los cebadores 384 y 385 (sec. con núms . de ident . : 840 y 841) que generó un producto de PCR de -2.3 kb. La porción de HXK2 de cada cebador se derivó de la región 5' dirección 5' del promotor de HXK2 y la región de 3' dirección 3' de la región codificante de manera que la integración del marcador URA3r2 produce el reempbucle de la región codificante de HXK2. El producto de PCR se transformó en NYLA73 con el uso de técnicas genéticas estándar {Methods in Yeast Genetics , 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes se seleccionaron en medio sintético completo sin uracilo y suplementado con glucosa al 2 % a 30 °C. Los transformantes se evaluaron por PCR para verificar la integración correcta en el locus HXK2 con reempbucle de la región codificante de HXK2 con el uso de los cebadores N869 y N871 (sec. con núms. de ident.: 842 y 843). El marcador URA3r2 se recicló al colocar en placas con medio sintético completo suplementado con glucosa al 2 % y 5-FOA a 30 °C de conformidad con los protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al colocar parches de colonias de las placas 5-FOA sobre los medios SD -URA para verificar la ausencia de crecimiento, y por PCR para verificar la eliminación del marcador correcto por medio del uso de cebadores N946 y N947 (sec. con núms . de ident. : 844 y 845) . La cepa identificada resultante, denominada NYLA83, tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : : PGPMI~ sadB-ADHlt pdcl : : PPDCi- ilvD-FBAlt ¿\his3 Ahxk2.

Construcción del cásete de integración pdc5: :kanMX y supresión de PDC5 Un cásete pdc5::kanMX4 se amplificó por PCR a partir del ADN cromosómico de la cepa YLR134W (ATCC núm. 4034091) mediante el uso de ADN polimerasa Phusion y los cebadores PDC5 : : KanMXF y PDC5 : : KanMXR (sec. con núms. de ident. : 846 y 847) que generó un producto de PCR de 2.2 kb. La porción PDC5 de cada cebador se derivó de la región 5' dirección 5' del promotor de PDC5 y la región 3' dirección 3' de la región codificante de manera que la integración del marcador de kanMX4 produce el reempbucle de la región codificante de PDC5. El producto de PCR se transformó en NYLA83 y los transformantes se seleccionaron y se analizaron como se describió anteriormente. Los transformantes correctos identificados denominados NYLA84 tiene el genotipo: BY4700 pdc6:: PGPM1- sadB-ADHlt pdcl:: PPDC1- ilvD-FBAlt his3 Ahxk2 pdc5 : : kanMXé .

Los vectores plásmidos pLH468 y pLH475-JEAl se transformaron simultáneamente en la cepa NYLA84 (BY4700 pdc6 : :PGPM1- sadB-ADHlt pdcl : :PPDCi- HvD-FBAlt ¿\his3 Ahxk2 pdc5 : :kanMX4) con el uso de técnicas genéticas estándar {Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y la cepa resultante se mantuvo en medio sintético completo sin histidina y uracilo y suplementado con etanol al 1 % a 30 °C. Ejemplo 35 (esperado) Construcción de la cepa huésped de S. cerevisiae que contiene modificaciones en la piruvato descarboxilasa , hexocinasa 2 y aldehido deshidrogenasa .

Este ejemplo describe la inactivación de una o más aldehido deshidrogenasas que suprime o reduce la formación de ácido isobutírico. La interrupción de ALD2 se usa como ejemplo, pero el método podría usarse para la interrupción de cualquier aldehido deshidrogenasa. La cepa derivada de NYLA84 resultante se usa como huésped para los vectores de expresión pLH475-JEAl y pLH468.

Supresión de ALD2 : Un cásete de ald2 : :URA3r se amplifica por PCR de una plantilla de URA3r2 (descrita anteriormente) con el uso de una ADN polimerasa Phusion y los cebadores T001 y T002 (sec. con núms . de ident . : 848 y 849) que genera un producto de PCR de -2.3 kb . La porción ALD2 de cada cebador se deriva de la secuencia 51 y la secuencia 3' del gen ALD2 de manera que la integración del marcador URA3r2 produce el reempbucle de la región codificante de ALD2. El producto de PCR se transforma en NYLA84 con el uso de técnicas genéticas estándar {Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, págs . 201-202) y los transformantes se seleccionan en medio sintético completo sin uracilo y suplementado con etanol al 1 % a 30 °C. Los transformantes se evalúan por PCR para verificar la integración correcta en el locus ALD2 con el reempbucle de la región codificante de ALD2 con el uso de los cebadores T003 y T004 (sec. con núms . de ident . : 850 y 851) . El marcador URA3r2 se recicla al colocar en placas con medio sintético completo suplementado con etanol al 1 % y 5-FOA a 30 °C de conformidad con los protocolos estándar. La eliminación del marcador se confirma al colocar parches de colonias de las placas 5-FOA en medio de SE -URA para verificar la ausencia de crecimiento, y por PCR para verificar la eliminación correcta del marcador con el uso de los cebadores T004 y T005 (sec. con núms. de ident. : 851 y 852) . La cepa identificada resultante se denomina NYLA84 Aald2 y es del genotipo: BY4700 pdc6 : : PQPMI-sadB-ADHlt pdcl : : PPDC1- ilvD-FBAlt Ahis3 Ahxk2 Aald2.

Ejemplo 36 Producción de isobutanol en S. cerevisiae recombinante en NYLA84 Método HPLC El análisis para la composición del subproducto de glucosa y fermentación es del conocimiento de los experimentados en la técnica. Por ejemplo, un método de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) usa una columna Shodex SH-1011 con un guarda columna Shodex SH-G (ambos disponibles de aters Corporation, Milford, MA) , con detección de índice de refracción (IR) . La separación cromatogr fica se logra al usar H2S04 0.01 M como fase móvil con un régimen de flujo de 0.5 ml/min y una temperatura de columna de 50 °C. El tiempo de retención de isobutanol es 47.6 minutos.

Producción de isobutanol en S. cerevisiae recombinante en NYLA84 El propósito de este ejemplo es describir la producción de isobutanol en la cepa de levadura NYLA84. La cepa de levadura comprende supresiones de PDC1, PDC5 y PDC6 , genes que codifican tres isozimas de piruvato descarboxilasa, y la supresión de HXK2 que codifica hexocinasa 2. La cepa contiene, además, constructos para la expresión heteróloga de AlsS (acetolactato sintasa) , KARI (ceto ácido reductoisomerasa) , DHAD (dihidroxi ácido deshidratasa) , KivD (cetoisovalerato descarboxilasa) , SadB (alcohol deshidrogenasa secundaria) y HADH (alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo) .

Construcción de la cepa Los plásmidos pLH468 y pLH475-JEAl se introdujeron en NYLA84 , mediante métodos estándar de transformación mediada por PEG/acetato de litio. Los transformantes se seleccionaron en un medio completo sintético sin glucosa, histidina ni uracilo. Se usó etanol (1 % v/v) como fuente de carbono. Después de tres días, se colocaron parches en los transformantes para completar el medio sin histidina ni uracilo suplementados con ambos 2 % de glucosa y 0.5 % de etanol como fuentes de carbono. Los viales del congelador se produjeron por dilución de cultivos en fase log con glicerol al 45 % hasta una concentración final de glicerol de 15 % (w/v) .

Producción de isobutanol Los viales del congelador se usaron para inocular 80 mi de medio completo sintético sin histidina y uracilo suplementado tanto con glucosa al 2 % como etanol al 0.5 % como fuentes de carbono.

Condiciones de fermentación: Se preparó un termentador de 1 litro y se esterilizó con 0.4 1 de agua. Después del enfriamiento, se agregó el medio esterilizado por filtro para dar las siguientes concentraciones finales en la inoculación posterior de 800 mi: Medio (concentración final) : Base nitrogenada de levadura, sin aminoácidos 6.7 g/1 (Difco) 2.8 g/1, suplemento del medio de abandono sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano y uracilo (Sigma Y2001) 20 ml/1 de 1 % (peso/volumen) L-leucina 4 ml/1 de 1 % (peso/volumen) L-triptófano 1 ml/1 de solución ergosterol/tween/etanol 0.2 ml/1 Sigma DF204 10 g/1 de glucosa El termentador se fijó para controlar a un pH de 5.5 con KOH, dO al 30 %, temperatura a 30 °C y flujo de aire de 0.2 SLPM (o 0.25 wm) . En la inoculación, el flujo de aire se fijó en 0.01 SLPM, inicialmente, después, se aumentó hasta 0.2 SLPM una vez que se estableció el cultivo. La glucosa se mantuvo a 5-15 g/1 durante el transcurso mediante adición manual .

Se suministró aire continuamente en el termentador a 0.25 wm. La aireación continua produjo una extracción significativa de isobutanol de la fase acuosa del termentador. Para cuantificar la pérdida de isobutanol debido a la extracción, el gas residual del termentador se envió directamente a un espectrómetro de masas (Prima dB, Thermo Electron Corp., Madison, I) para cuantificar la cantidad de isobutanol en la corriente de gas. Los picos de isobutanol con relaciones de masa a carga de 74 o 42 se controlaron continuamente para cuantificar la cantidad de isobutanol en la corriente de gas.

La glucosa y los ácidos orgánicos en la fase acuosa se controlaron por HPLC durante la fermentación. También se usó un analizador de glucosa (YSI, Inc., Yellow Springs, OH) para controlar rápidamente la glucosa. El isobutanol en la fase acuosa se cuantificó por HPLC como se describió en el método por HPLC que se mencionó anteriormente en la presente descripción después de eliminar la fase acuosa periódicamente del termentador. El título efectivo, corregido para la pérdida de isobutanol debido a la estabilización, fue de 7.5 g/1. El título de ácido isobutírico fue de 1.28 g/1 (Figura 14) .

Ejemplo 37 (esperado) Producción de isobutanol en S. cerevisiae recombinante en l\ald2 de NYLA84.

El propósito de este ejemplo es describir la producción de isobutanol en la cepa de levadura NYLA84. La interrupción de ALD2 se usa como ejemplo, pero el ejemplo podría usarse para la interrupción de cualquier aldehido deshidrogenasa . La cepa de levadura &ald2 de NYLA84 comprende supresiones de PDC1, PDC5 y PDC6, genes que codifican tres isozimas de piruvato descarboxilasa, supresión de HXK2 que codifica hexocinasa 2, y supresión de ALD2 que codifica la aldehido deshidrogenasa. La cepa contiene, además, constructos para la expresión heterologa de AlsS (acetolactato sintasa) , KARI (ceto ácido reductoisomerasa) , DHAD (dihidroxi ácido deshidratasa) , KivD (cetoisovalerato decarboxilasa) y SadB (alcohol deshidrogenasa secundaria) .

Construcción de la cepa Los plásmidos pLH468 y pLH475-JEAl se introdujeron en ¿ald2 de NYLA84 mediante métodos estándar de transformación mediada por PEG/acetato de litio. Los transformantes se seleccionan en un medio completo sintético sin glucosa, histidina ni uracilo. Se usa etanol (1 % v/v) como fuente de carbono. Después de tres días, se colocaron parches en los transformantes para completar el medio sin histidina ni uracilo suplementado con ambos 2 % de glucosa y 0.5 % de etanol como fuentes de carbono. Los viales del congelador se producen por dilución de cultivos en fase log con glicerol al 45 % hasta una concentración final de glicerol de 15 % (w/v) .

Producción de isobutanol Los viales del congelador se usan para inocular 80 mi de medio completo sintético sin histidina y uracilo suplementado tanto con glucosa al 0.25 % como etanol al 0.5 % como fuentes de carbono. Se prepara un termentador de 1 litro y se esteriliza con 0.4 1 de agua. Después del enfriamiento, el medio esterilizado del filtro se agrega para dar las siguientes concentraciones finales en la inoculación posterior de 800 mi: Medio (concentración final) : Base nitrogenada de levadura, sin aminoácidos 6.7 g/1 (Difco) 2.8 g/1, suplemento del medio de abandono sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano y uracilo (Sigma Y2001) 20 ml/1 de 1 % (peso/volumen) L-leucina 4 ml/1 de 1 % (peso/volumen) L-triptófano 1 ml/1 de solución ergosterol/tween/etanol 0.2 ml/1 Sigma DF204 10 g/1 de glucosa El termentador se fija para controlar a un pH 5.5 con KOH, do al 30 %, temperatura 30 °C y flujo de aire de 0.2 SLPM (o 0.25 wm) . En la inoculación, el flujo de aire se fija en 0.01 SLPM, inicialmente , después, se aumenta a 0.2 SLPM una vez que se establece el cultivo. La glucosa se mantiene en 5-15 g/1 durante el transcurso de tiempo mediante adición manual.

Para cuantificar la pérdida de isobutanol debido a la extracción, el gas residual del termentador se envía, directamente, a un espectrómetro de masas (Prima dB, Thermo Electron Corp., Madison, WI) para cuantificar la cantidad de isobutanol en la corriente de gas. Los picos de isobutanol con relaciones de masa a carga de 74 o 42 se controlan, con inuamente, para cuantificar la cantidad de isobutanol en la corriente de gas. La glucosa y los ácidos orgánicos en la fase acuosa se controlan por HPLC durante la fermentación. Además, se usa un analizador de glucosa (YSI, Inc., Yellow Springs, OH) para controlar rápidamente la glucosa. El isobutanol y el ácido isobutirico en la fase acuosa se cuantifican por HPLC después de eliminar periódicamente la fase acuosa del termentador .

Ejemplo 38 Análisis de la producción de ácido isobutirico Las cepas se inocularon en medio completo sintético sin histidina y uracilo suplementado con etanol al 0.05 %. Una vez que los cultivos alcanzan la fase fija, estos se subcultivan en medio fresco (OD inicial = 0.2) . Para PNY2205 (Ejemplo 13), el medio se suplemento con etanol al 0.05 % para cumplir con el requisito de C2 observado en la levadura PDC KO que no tiene la ruta de fosfocetolasa . Para PNY2209 (Ejemplo 13), las células se subcultivaron en medios con y sin etanol . Para los clones de ald6A (PNY2216 y los clones isogénicos, Ejemplo 24), se usó medio sin etanol. Los cultivos se cultivaron en matraces de agitación con tapas de rosca (20 mi de medio en matraces de 125 mi) . Los sobrenadantes del cultivo se recolectaron inmediatamente después de la inoculación y nuevamente después de 48 horas. Estos sobrenadantes del cultivo se analizaron por HPLC (descrita en la patente de los Estados Unidos núm. US20070092957 , que se incorpora en la presente descripción como referencia) para determinar el consumo de glucosa y la concentración de ácido isobutírico.

Tabla 35. Rendimiento molar de ácido isobutírico en cepas ald6A.

Indica que el medio de cultivo se suplemento con etanol 0.05 % Ejemplo 39 Producción incrementada de isobutanol y producción reducida de subproducto en cepas nuevas El propósito de este ejemplo consiste en describir experimentos de cultivo a pequeña escala con las cepas recién construidas con el uso del plásmido pK9G9.OLElp.ilvD para suministrar los genes restantes de la ruta de isobutanol.

Las cepas huésped nuevas PNY1528, PNY2243, PNY2237 y PNY2238 se transformaron con el plásmido pK9G9.OLElp.ilvD y se evaluaron para analizar la producción de isobutanol. Los transformantes se obtuvieron por selección en medio completo sintético sin uracilo con etanol al 1 % como la fuente de carbono. Los transformantes se parcharon en medio completo sintético sin uracilo con glucosa al 2 % y etanol al 0.05 % como fuentes de carbono. Se usó parches para inocular el medio líquido (completo sintético sin uracilo con glucosa al 0.3 % y etanol al 0.3 % como fuentes de carbono) . Para evaluar la producción de isobutanol, los cultivos líquidos se subcultivaron en medio completo sintético sin uracilo que contiene glucosa al 2 % y etanol al 0.05 % como fuentes de carbono que contenían, además, mezcla de vitaminas BME (Sigma cat. núm. B6891) . Los cultivos se incubaron en viales de suero sellados (10 mi de medio en viales de 15 mi) a 30 °C con agitación (250 rpm en un agitador Infors Multitron) . Después de 48 horas, el medio de cultivo se filtró (columna Spin-X) y se analizó por HPLC (como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20070092957) . El rendimiento molar del subproducto de isobutirato de la ruta se redujo en 50 % en las cepas que portan ald6&. Se descubrió que las cepas basadas en PNY2238 tienen mayor consumo de glucosa y mayor título de isobutanol (resultados del clon K que se muestran en la tabla a continuación) .

Tabla 36. Rendimiento molar del ácido isobutírico en las cepas ald6A Indica que el medio de cultivo se suplemento con etanol 0.05 % Todas las cepas contenían el plásmido pK9G9.OLElp.ilvD.

Para las cepas derivadas de PNY2237 y de PNY2238, los datos presentados son un promedio de dos réplicas biológicas.

Ejemplo 40 Construcción de una genoteca de genes de saturación en sitio y evaluación de la producción de isobutanol de las variantes resultantes en PNY2259 La mezcla de cebadores inversos (llamada K9_309r en este ejemplo) que contiene los cebadores que codifican los cambios de los 20 aminoácidos individuales en la posición 309 (Tabla 37) y el cebador directo K9_131T_080211f : GGACTTGATGTCACTATGATC (llamado K9_131Tf en este ejemplo) se usaron para crear una genoteca de saturación de un solo sitio específica para la posición 309 de KARI K9. Un plásmido que contiene la variante K9SB2 (pHR81-ILV5p . K9SB2. TEF1 (M4) . ilvD (sec. con núm. de ident . : 930, llamada, además, "pLH744") .

En resumen, se preparó un megacebador por medio de una PCR regular. La mezcla de PCR megacebador consistió en 45 µ? de SuperMix (Invitrogen, Carlsbad, CA, núm. 10572063), 2.0 µ? de K9_131Tf (20 µ?) , 2.0 µ? de K9_309r (20 µ?) y 1.0 µ? de plantilla (50 ng/µ?) . El programa de PCR para preparar el megacebador es: la temperatura inicial fue de 95 °C durante 1.0 min, seguida por 35 ciclos de calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consistió en 95 °C durante 20 s, 55 °C durante 20 s y 72 °C durante 1.0 min. Después, el megacebador se usó para introducir la mutación en K9SB2 con el uso del mismo procedimiento, tal como se muestra en el Ejemplo 5. Los clones de la genoteca de saturación de un solo sitio se secuenciaron.

Las variantes únicas resultantes junto con pLH744 se analizaron para evaluar la producción de isobutanol y la formación de subproducto en levadura (triple para cada mutante) . Las cepas de la ruta de levadura se produjeron en el huésped PNY2259 (MATa ura3A::loxP his3A pdc6A pdclA : : P [PDC1] -DHAD | ilvD_Sm-PDClt-P [FBA1] -ALS | alsS_Bs-CYClt pdc5A : : P [PDC5] -ADHI sadB_Ax-PDC5t gpd2A : : loxP fra2A : : P [PDC1] - ADH| adh_Hl-ADHlt adhlA : : UAS (PGK1) P [FBA1] -kivD_Lg(y) -ADHlt yprcA15A : :P [PDC5] -ADHIadh_Hl-ADHlt ymr226cA ald6A : : loxP ; Ejemplo 22) al transformar los vectores de KARI . Las células transformadas se colocaron en placas con medio sintético sin histidina o uracilo (etanol al 1 % como fuente de carbono) . Tres transformantes se transfirieron a placas frescas del mismo medio. Los transformantes se evaluaron para analizar la producción de isobutanol en condiciones anaerobias en placas de 48 pocilios (Axygen, Union City, CA núm. 391-05-061) .

Después de 5-7 días, aparecieron colonias de levadura a partir de la transformación en placas con SE-Ura. Las tres colonias de cada variante se parcharon en placas frescas con SE-Ura y se incubaron a 30 °C durante 3 días.

Medios de crecimiento y procedimiento Se usó dos tipos de medios durante el procedimiento de crecimiento de las cepas de levadura: un medio precultivo aerobio y un medio de cultivo anaerobio. Todas las sustancias químicas se obtuvieron de Sigma, a menos que se indique de otra manera (St. Louis, MO) Medio de precultivo aerobio (SE-Ura) : 6.7 g/1 de base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos (Difco, 291940, Sparks, MD) , 1.4 g/1 de suplemento de medio selectivo sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano y uracilo, etanol al 0.2 %, glucosa al 0.2 %, leucina al 0.01 % en w/v, histidina al 0.002 % en w/v y triptófano al 0.002 % en w/v.

Medio de cultivo anaerobio (SEG-Ura-His) : MES 50 mM (pH de 5.5, 6.7 g/1 de base de nitrógeno para levadura sin aminoácidos (Difco, 291940, Sparks, MD) , 1.4 g/1 de suplemento de medio selectivo sintético de levadura sin histidina, leucina, triptófano y uracilo, etanol al 0.1 %, glucosa al 3 %, leucina al 0.01 %, histidina al 0.002 % en w/v, triptófano al 0.002 %, 30 mg/1 de ácido nicotínico, 30 mg/1 de tiamina y 10 mg/1 de ergosterol producido en una solución 50/50 v/v de Tween /etanol.

Las células parchadas se inocularon en placas de 48 pocilios. Cada pocilio contiene 1.5 mi de medio aerobio. Las placas se cubrieron con láminas de metal permeables y se cultivaron a 30 °C con agitación durante la noche. Después, se determinó la densidad celular (OD60o) · Se calculó la cantidad de células para preparar 1.5 mi de suspensión celular (en medio anaerobio) con la OD60o final =0.2 para cada pocilio y se preparó 1.5 mi de suspensión celular con medio anaerobio y se agregó en cada pocilio. Se eliminó el oxígeno en las placas de 48 pocilios con el uso de una cámara anaerobia según el protocolo del fabricante (Coy Laboratory Products Inc. Grass Lake , MI) . Después, las células se cultivaron a 30 °C con agitación durante dos días. Después, se determinó la densidad celular (OD6oo) · Los mutantes con mejor crecimiento se sometieron al mismo crecimiento de dos días en placas de 48 pocilios para determinar la producción de isobutanol. Después del crecimiento anaerobio de dos días, se determinó la densidad celular (OD60o) · Las células se centrifugaron a 4,000 g durante 5 min y el sobrenadante se recolectó para la medición de isobutanol con el uso de LC/MS.

Análisis de LC/MS de las cepas de levadura con mutantes de KARI K9 Las muestras para el análisis de LCMS se tomaron al final del período de crecimiento anaerobio. El análisis de LCMS se llevó a cabo con el uso de una unidad de separaciones Waters AcQuity UPLC y un espectrómetro de masas AcQuity TQD triple quad (Waters, Milford, MA) con una columna para separaciones Waters AcQuity UPLC HSS T3 (Waters, Milford, MA) . Los compuestos se separaron con el uso de un gradiente de fases inversas de agua (ácido fórmico + 0.1 %) y acetonitrilo (ácido fórmico + 0.1 %) empezando con acuosa al 99 % y terminando con orgánica al 99 %, a un índice de flujo de 0.5 ml/min. Los cromatogramas se analizaron con el uso del programa Waters Masslynx 4.1 (Waters, Milford, MA) . Se calculó micro rendimientos molares para isobutanol con el uso del programa Waters Quanlynx (Waters, Milford, MA) con el uso de una curva de calibración de análisis triplicados de patrones.

Tabla 37. Cebadores inversos Posición (es) Cebadores objetivo de KARI K9 309 K9_309I_ 111711r : CTTTCTCATAGCCTTAATGTGGAC (sec . con núm. de ident . : 884) 9_309L_ 111711r : CTTTCTCATAGCCTTTAAGTGGAC (sec . con núm. de ident . : 885) K9_309Y_ 111711r : CTTTCTCATAGCCTTATAGTGGAC (sec . con núm. de ident . : 886) K9_309C_ 111711 : CTTTCTCATAGCCTTACAGTGGAC (sec . con núm. de ident . : 887) K9_309W_ 111711 : CTTTCTCATAGCCTTCCAGTGGAC (sec . con núm. de ident . : 888) K9_309P_ 111711 : CTTTCTCATAGCCTTTGGGTGGAC (sec . con núm. de ident . : 889) K9_309H_ 111711r : CTTTCTCATAGCCTTATGGTGGAC (sec . con núm . de ident . : 890) K9_309Q_ 111711r : CTTTCTCATAGCCTTTTGGTGGAC (sec . con núm. de ident . : 891) 9_309M_ 111711r : CTTTCTCATAGCCTTCATGTGGAC (sec . con núm. de ident . : 892) K9_309N_ 11171Ir : CTTTCTCATAGCCTTATTGTGGAC (sec . con núm . de ident . : 893) K9_309V_ 111711r : CTTTCTCATAGCCTTAACGTGGAC (sec . con núm. de ident . : 894) Tabla 38. Lista de algunos variantes con OD60o y título de isobutanol (mM) después de dos días de crecimiento anaerobio Ejemplo 41 Construcción de K9SB2 SH (K9SB2 short) , una versión truncada de K9SB2 Un gen que codifica una versión de K9SB2 que no tiene los primeros cinco aminoácidos en N-terminal (MEECK) se preparó por PCR con el kit de PCR de alta fidelidad Phusion® (catálogo núm . E0553L, New England Biolabs) . Los cebadores Kshortl (AAACCGGTTTAAACAGTATGGCTAAGATTTACTACCAAGAAGACTG; sec . con núm. de ident . : 903) y YGrev (TTCTGTTTTATCAGACCGCTTC; sec. con núm. de ident.: 904) fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville IA) . Aparte de los cebadores, la mezcla de dNTP (catálogo núm. 18427-013, Invitrogen, Carlsbad, CA) , la plantilla y H20 dd, los reactivos usados aquí fueron suministrados con el kit indicado anteriormente.

La mezcla de PCR consistió en 1 µ? de K9SB2 en un plásmido pBAD.KARI (20 ng/µ? ; La preparación del plásmido se describe en el Ejemplo 17; sec. con núm . de ident. : 428) , 2 µ? de cada cebador (20 µ? de soluciones base) , 10 µ? del regulador Phusion HF 5x, 2 µ? de mezcla de dNTP 5 mM, 0.5 µ? de poliraerasa y 28 µ? de H20 dd . Se usó las siguientes condiciones para la reacción de PCR: La temperatura inicial fue de 98 °C durante 2 min seguida por 30 ciclos de calentamiento/enfriamiento. Cada ciclo consistió en 98 °C durante 10 s, 48 °C durante 30 s y 72 °C durante 1.5 min. Al terminar el ciclo de temperatura, la muestra se mantuvo a 72 °C durante 10 min más y, después, se esperó la recuperación de la muestra a 4 °C. El producto de reacción se separó de la plantilla por medio de electroforesis con gel de agarosa (agarosa al 1 %, regulador TBE IX) y se recuperó con el uso del ADN de PCR Illustra GFX™ y del kit de purificación con banda de gel (catálogo núm. 28-9034-70, GE Healthcare Sciences, Piscataway, NJ) según las recomendaciones del fabricante. El producto de PCR purificado se digirió con Pmel y Sfil y se ligó en los sitios correspondientes de pBAD-ps-JEAl (sec. con núm. de ident. : 905) y se confirmó la secuencia del constructo K9SB2_SH resultante en pBAD.KARI (sec. con núm. de ident.: 929) .

Ejemplo 42 Producción de plásmidos de expresión de levadura para estudios de K9SB2 y otras enzimas KARI Construcción de pHR81-ILV5p-K9SB2 -TEF (M4 ) -IlvD (pLH744; sec, con núm. de ident . : 930) : el gen K9SB2 se cortó de pHR81- ILV5p-K9SB2 por la digestión de Pmel y Sfil, y se ligó con pHR81-ILV5p-K9D3-TEF (M4) -IlvD (pBP2090) en los sitios Pmel y Sfil. El vector ligado se denominó pHR81- ILV5p-K9SB2 -TEF ( 4 )- IlvD (pLH744) y este vector se confirmó por secuenciación .

Construcción de K9SB2 SH DHAD (sec. con núm. de ident.: 931): El producto de PCR K9SB2_SH digerido (descrito en el Ejemplo 41) se ligó en los sitios Pmel y Sfil de pLH744 y se confirmó por secuenciación.

Construcción de K9SB2 SH 81 (sec. con núm. de ident.: 932) El producto de PCR K9SB2_SH digerido (descrito en el Ejemplo 41) se ligó en los sitios Pmel y Sfil de pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9 y se confirmó por secuenciación.

Construcción de plásmidos para la expresión de levadura de los derivados de K9SB2 Los plásmidos de expresión de levadura para las variantes enumeradas en la Tabla 39 (descritos en los Ejemplos 17 y 21) se generaron por subclonación de los genes de KARI correspondientes de los plásmidos pBAD.KARI en los sitios Pmel y Sfil del plásmido pLH744 y del plásmido pHR81- PIlv5-KARI- 9. G9. Los constructos se confirmaron por secuenciacion .

Tabla 39. Derivados de K9SB2 subclonados en plásmidos de expresión de levadura Construcción de plásmidos para la expresión de levadura de versiones truncadas de derivados de K9SB2 Las versiones truncadas en N-terminal de los derivados de K9SB2 se prepararon como se describió en el Ejemplo 41, con modificaciones. El cebador Kshortl se reemplazó con el cebador fosforizado en 5' KPSH1 (AAACAGTATG GCT AAG ATT TAC TAC CAA GAA GAC TG; sec . con núm . de ident . : 906) , sintetizado por Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville IA) . K9SB2 en la PCR se reemplazó por mezclas agrupadas de las variantes (plásmidos de pBAD.KARI) enumeradas en la Tabla 39. Los productos de PCR purificados se digirieron con Sfil y se ligaron en los sitios Pmel y Sfil de pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9. Se llevó a cabo la secuenciación de ADN con TempliPhi™ (GE Healthcare) y los cebadores pHR81-F (ACACCCAGTATTTTCCCTTTCC) y pHR81- Rev (CTA GTG TAC AGA TGT ATG TCG G) (sec. con núms . de ident.: 924 y 925) para identificar cada derivado truncado. Las variantes identificadas se indican en la Tabla 40. Las secuencias codificantes para las versiones truncadas se clonaron posteriormente en los sitios Pmel y Sfil del plásmido pLH744 y se confirmaron por secuenciación.

Tabla 40. Versiones truncadas de los derivados de K9SB2 La construcción de K9 Zeke SH (K9SB2 -K90M-T93A) y K9 Annabel SH (K9SB2 -K90M-T93 I ) K9_Zeke_SH (sec. con núm. de ident.: 860, proteína de la sec . con núm. de ident.: 861) y K9_Annabel_SH (sec. con núm. de ident.: 862, proteína de la sec. con núm. de ident.: 863) se derivaron de K9_David_SH por medio de mutagénesis sitio dirigida con el uso del kit de mutagénesis sitio dirigida QuikChange® Lightning (catálogo núm. 210518; Agilent Technologies, Stratagene Products División, La Jolla, CA) . Excepto por los cebadores, plantillas y H20 dd, todos los reactivos usados aquí fueron suministrados con el kit indicado anteriormente. Los cebadores fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, Inc (Coralville IA) .

Para K9_Zeke_SH, se usó los cebadores ??G93? (GATCCCAGATGAAATGCACXX^^ ; sec. con núm. de ident.: 920)) y oMT93Arev (CGATGTCGTTTTTCT ; sec. con núm. de ident. : 921) . La mezcla de reacción contenía 1 µ? de K9_David_SH en el vector derivado de pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9 (20 ng/µ?) , 1 µ? de cada cebador (150 ng/ul) , 5 µ? de regulador de reacción ???, 1 µ? de mezcla de dNTP, 1.5 µ? de QuikSolution, 1 ul de enzima QuikChange Lightning y 38.5 µ? de H20 dd. Para K9_Annabel_SH, los cebadores se reemplazaron con OT93I (GATCCCA(¾TG-¾AATGCAG ; sec. con núm. de ident.: 922) y oMT93Irev (Q_¾GTQ3TTTT^ ; sec. con núm. de ident. : 923) .

Las siguientes condiciones se usaron para ambas reacciones: La temperatura inicial fue de 95 °C durante 2 min, seguida por 18 ciclos de calentamiento/enfriamiento . Cada ciclo consistió en 95 °C durante 20 s, 60 °C durante 10 s y 68 °C durante 6 min. Al terminar el ciclo de temperatura, se esperó la recuperación de las muestras a 4 °C. Se agregó 2 µ? de Dpn I en cada reacción y las mezclas se incubaron durante 1 hora a 37 °C. 2 µ? de cada reacción mutagénica se transformaron en E. coli químicamente competente One Shot® Stbl3™ (Invitrogen, catálogo núm. C7373-03) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Los transformantes se dispersaron en placas de agar que contienen el medio LB y 100 µg/ml de ampicilina (catálogo núm. L1004, Teknova Inc. Hollister, CA) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Después, se seleccionó múltiples transformantes para la secuenciación de ADN TempliPhi™ (GE Healthcare) , que usó los cebadores pHR81-F (ACACCCAGTATTTTCCCTTTCC; sec. con núm. de ident . : 924) y pHR81-Rev (CTA GTG TAC AGA TGT ATG TCG G; sec. con núm. de ident.: 925) . Las variantes con las secuencias confirmadas (K9_Zeke_SH y 9_Annabel_SH en los vectores derivados de pHR81-PIlv5-KARI-K9.G9) se subclonaron en los sitios Pmel y Sfil de pLH744 (sec. con núm. de ident. : 930) .

Ejemplo 43 Producción de isobutanol de K9SB2 y derivados cultivados en condiciones anaerobias en placas de 48 pocilios Los plásmidos de expresión de levadura para K9SB2, K9SB2_SH y K9SB2-T93A, preparados con el vector derivado de pLH744 como se describe en el Ejemplo 42, se usaron para evaluar la producción de isobutanol en levadura que se cultivó en condiciones anaerobias en una placa de 48 pocilios. Las cepas de producción de isobutanol se produjeron en el huésped PNY2259 (MATa ura3A::loxP his3A pdc6A pdclA : : P [PDC1] -DHAD | ÍlvD_Sm-PDClt-P [FBAl] -ALS | alsS_Bs-CYClt pdc5A: :P [PDC5] -ADH | sadB_Ax-PDC5t gpd2A : : loxP fra2A : : P [PDC1] -ADHI adh_Hl-ADHlt adhlA : :UAS (PGK1) P [FBAl] -kivD_Lg(y) -ADHlt yprcA15A: :P[PDC5] -ADH | adh_Hl-ADH1t ymr226cA ald6A::loxP) al transformar los plásmidos que contienen las secuencias codificantes para las variantes de KARI y al colocar en placas con medio sintético sin uracilo (etanol al 1 % como fuente de carbono) . Después de 3-5 días de incubación a 30 °C, aparecieron colonias de levadura a partir de la transformación en placas con SE-Ura. Por lo menos tres colonias de cada variante se parcharon en placas con SE-Ura fresco y se incubaron a 30 °C.

Condiciones de cultivo de levadura: Medio de cultivo aerobio: medio con SE -Ura con 2 g/1 de etanol .

Medio de cultivo anaerobio: SEG -Ura con 30 g/1 de glucosa y 1 g/1 de etanol, suplementado con 10 mg/1 de ergosterol, regulador MES 50 mM (pH de 5.5), 30 mg/1 de tiamina y 30 mg/1 de ácido nicotínico.

Placas de 48 pocilios: catálogo núm. P-5ML-48-C-S de Axygen, un volumen total de 5 ml/pocillo, volumen del cultivo de 1.5 ml/pocillo.

Las placas se cubrieron con película adhesiva permeable (VWR; catálogo núm. 60941-086) para el cultivo aerobio. Las placas se agitaron a 225 rpm a 30 °C. Para el cultivo anaerobio, las placas recién inoculadas recubiertas con película permeable se lavaron para eliminar el oxígeno por equilibración en una cámara anaerobia durante 2 horas. Después, las tapas de las placas se intercambiaron por tapas de aluminio adhesivas (VWR; catálogo núm. 89049-034) y cada placa se colocó en una caja plástica hermética (Mitsubishi Gas Chemical America, Inc; New York, NY; Catálogo núm. 50-25) junto con un empaque depurador de oxígeno fresco (Mitsubishi Gas Chemical America, Inc; New York, NY; catálogo núm. 10-01) . El ensamblaje (placa(s) y el empaque depurador de oxígeno dentro de una caja plástica hermética sellada) se retiró de la cámara anaerobia y se agitó a 225 rpm a 30 °C. Protocolo experimental Las colonias individuales de levadura en placas de agar con SE -Ura se rayaron para transferirlas en placas de agar fresco con SE -Ura y se incubaron a 30 °C hasta que crecieron parches densos de células. Los precultivos líquidos en placas de 48 pocilios se inocularon con bucles de estas células para el cultivo aerobio inicial. Después de agitar durante la noche, se determinó la OD60o de cada pocilio de cultivo al transferir 0.15 mi de cada pocilio en una placa de 96 pocilios de fondo plano y al determinar la absorbancia de cada pocilio a 600 nm con un lector de placas Molecular Devices (Sunnyvale, CA) . Una transformación lineal en base a una línea de calibración determinada experimentalmente se aplicó es estas densidades ópticas determinadas con el lector de placas para convertirlas en valores de absorbancia comparables para un espectrofotómetro a base de cubetas.

Una porción calculada de cada pocilio de precultivo aerobio se inoculó en el pocilio correspondiente de una placa fresca de 48 pocilios con 1.5 mi del medio de SEG -Ura, para lograr una OD6oo inicial (en unidades de absorbancia del espectrofotómetro de cubetas) de 0.2. En el proceso de inocular la placa fresca, la placa de precultivo aerobio se centrifugó, el sobrenadante se retiró de cada pocilio y las células en cada pocilio se resuspendieron en medio fresco de SEG -Ura. Esta placa de cultivo anaerobio se agitó durante 3 días. La concentración de isobutanol en los sobrenadantes del cultivo se determinó por HPLC (Tabla 41) .

Tabla 41. Títulos de isobutanol producidos en el primer ciclo de cambio de cultivos anaerobios Un cultivo anaerobio de seguimiento se inició a partir del primer cultivo anaerobio de la siguiente manera: Una porción calculada de cada pocilio de cultivo anaerobio se inoculó en el pocilio correspondiente de una placa fresca de 48 pocilios con 1.5 mi del medio de SEG -Ura, para lograr una OD6oo inicial (en unidades del espectrofotómetro de cubetas) de 0.2. En el proceso de inocular la placa fresca, la placa de crecimiento se centrifugó, el sobrenadante se eliminó de cada pocilio y las células en cada pocilio se resuspendieron en medio fresco de SEG -Ura para minimizar el traslado de metabolitos de un cultivo a otro. La placa del cultivo anaerobio de seguimiento (segundo ciclo) se agitó durante 2 días. La concentración de isobutanol en los sobrenadantes del cultivo se determinó por HPLC (Tabla 42) .

Tabla 42. Títulos de isobutanol producidos en el segundo ciclo de cambio de cultivos anaerobios Ejemplo 44 Caracterización cinética de K9G9, K9SB2 y K9SB2 SH K9G9, K9SB2, K9SB2_SH se sobreexpresaron por medio de plásmidos pBAD.KARI en la cepa Bw25113 de E. coli (ZÜlvC) y se purificaron para una medición detallada de los parámetros cinéticos .

La expresión, la purificación y los análisis cinéticos del cofactor se realizaron como se describió en el Ejemplo 18, con las siguientes modificaciones. Los cultivos de expresión se cultivaron en 20 mi de LB con 100 µ9/??1 de ampicilina y arabinosa al 0.2 % (w/v) en un matraz de 125 mi con tapa ventilada. El medio de expresión se inoculó con un volumen 1/10 de 8 horas de cultivo. Los cultivos de expresión se cultivaron durante 18 horas para K9 SB2 y 24 horas para K9SB2 SH.

Tabla 43. Parámetros cinéticos que comparan las reacciones con NADH y con NADPH Ejemplo 45 Producción de isobutanol de K9SB2 y derivados El análisis de producción de isobutanol en placas de 48 pocilios se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 42, con las siguientes modificaciones. El medio de cultivo aerobio y el de cultivo anaerobio son iguales que los descritos en el Ejemplo 19, pero con adiciones de histidina al 0.01 % w/v. Los valores de OD60o de los precultivos aerobios se determinaron con el uso de un espectrofotómetro Cary 300 (Agilent Technology, ilmington, DE) . Se usó un equipo Heraeus Multifug XIR con un rotor M-20 (Thermo Scientific, altham, MA) para agrupar las células de precultivo aerobio y se descartó el medio de cultivo usado. Las placas con comprimidos celulares se transfirieron en la bolsa anaerobia Coy (Grass Lake , MI) y se agregó 100 µ? de medio de cultivo anaerobio en cada comprimido. Se dejó que el medio de cultivo anaerobio se desgasificara durante por lo menos 24 horas antes de colocar 1.5 mi de alícuotas en la placa de 48 pocilios; este proceso se llevó a cabo dentro de la bolsa anaerobia. La placa de cultivo anaerobio se inoculó con el volumen adecuado de resuspensión de células y se cubrió con papel de aluminio adhesivo. Las placas se colocaron en un sistema MCG 2.5L AnaeroPack (MCG, Japón) . La caja se selló y se retiró de la bolsa anaerobia y se colocó en una incubadora a 30 °C durante 80 horas con agitación a 220 rpm. Se analizó tres transformantes por variante, se analizó seis transformaciones para K9D3 y K92B2 (Tabla 44) .

Tabla 44. Títulos de isobutanol El análisis de producción de isobutanol en viales de suero se llevó a cabo para seleccionar variantes como se describió en el Ejemplo 19, con las siguientes modificaciones. Las variantes de KARI se expresaron en levadura de plásmidos derivados de pLH744, preparados como se describió en el Ejemplo 42. Se agregó histidina tanto en el medio de crecimiento de precultivo aerobio como en el anaerobio hasta una concentración final de 0.01 % w/v. Se analizó tres o cuatro transformantes por variante (Tablas 45, 46 y 47) .

Tabla 45. Experimento 1 de títulos de isobutanol Tabla 46. Experimento 2 de títulos de isobutanol Tabla 47. Títulos de isobutanol m 441 v 51 m isi, • w Sf O LO i-i LD IT) LO LD LO O LO LO rH rH LO un Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (74)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una célula huésped recombinante caracterizada porque comprende una ruta de producción de isobutanol modificada y a) por lo menos uno de: i) un polipéptido heterólogo con actividad de cetol-ácido reductoisomerasa (KARI) seleccionado del grupo que consiste en: 1) un polipéptido tiene por lo menos aproximadamente 90 % de identidad con una enzima KARI derivada de Bifidobacterium angulatum, Bifidobacterium dentium, Zymomonas mobilis, Clostridium beijerinckii o Anaerostipes caceas, o un fragmento activo de estos; 2) Un polipéptido tiene por lo menos aproximadamente 90 % de identidad o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad con la sec . con núm. de ident . : 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63 o 65; o ii) un polinucleótido heterólogo que codifica el polipéptido heterólogo con actividad de KARI de a) ; y b) por lo menos una modificación de la célula huésped que mejora el rendimiento de la ruta de producción de isobutanol modificada.

2. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la combinación de a) y b) produce un incremento sinérgico en el rendimiento de la ruta de producción de isobutanol.

3. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque la modificación de la célula huésped comprende expresión o actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada y expresión o actividad de acetolactato reductasa reducida o eliminada.

4. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque comprende expresión o actividad de aldehido deshidrogenasa reducida o eliminada y expresión o actividad de acetolactato reductasa reducida o eliminada, y en donde el polipéptido heterólogo con actividad de KARI tiene una ?¾ para NADH menor que 300 µ?.

5. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido heterólogo con actividad de KARI tiene por lo menos aproximadamente 90 % o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad con la sec. con núm. de ident . : 27, 29, 141, 143, 275 o 277.

6. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el polipéptido heterólogo con actividad de KARI comprende sustituciones en los aminoácidos correspondientes a S56 y S58 de la sec. con núm. de ident . : 27.

7. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el polipéptido heterólogo con actividad de KARI comprende, además, una sustitución de uno o más de los aminoácidos correspondientes a 186, N87, T131 o T191 de la sec. con núm. de ident.: 27.

8. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque tiene una productividad efectiva de isobutanol de por lo menos aproximadamente 3 , por lo menos aproximadamente 4 o por lo menos aproximadamente 5 gramos por gramo de células después de aproximadamente 48 horas, caracterizada además porque por lo menos las últimas aproximadamente 24 de las 48 horas son en condiciones anaerobias.

9. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizada porque el polipéptido heterólogo con actividad de KARI tiene una KM para NADH menor que aproximadamente 350, menor que aproximadamente 100, menor que aproximadamente 50 o menor que aproximadamente 10 µ? a pH 6.8.

10. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido heterólogo con actividad de KARI comprende una sustitución de aminoácidos en una o más de las posiciones correspondientes a los aminoácidos A41, S56, S58, 187, T131, TI91, R227 o Q246 de la sec . con núm. de ident . : 27.

11. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizada porque la modificación de la célula huésped comprende por lo menos uno de una supresión, mutación o sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa.

12. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa corresponde al número de la comisión de la enzima EC 1.21.3, EC 1.2.1.4, EC1.2.1.5, o una combinación de estos.

13. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, caracterizada porque es S. cerevisiae y el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa es ALD2 , ALD3 , ALD , ALD5, ALD6 o un homólogo de estos.

14. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, caracterizada porque es K. lactis y el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa es KLLA0F00440, KLLA0E23057, KLLAOD10021 o KLLA0D09999G .

15. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, caracterizada porque es P. stipitis y el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa es ALD2 , ALD3 , ALD4 , ALD5 o ALD7.

16. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, caracterizada porque es Lactobacillus plantarum y el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa es AldH.

17. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, caracterizada porque es E. coli y el polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa es aldA, aldB o aldH.

18. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada porque comprende por lo menos una o más de una supresión, mutación o sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa.

19. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa corresponde al número de la comisión de enzimas EC 1.2.3.1

20. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad de aldehido oxidasa es A0X1, A0X2 , o una combinación de estos.

21. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada porque comprende por lo menos una o más de una supresión, mutación o sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa.

22. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el polinucleótido endógeno se selecciona del grupo que consiste en la sec . con núm. de ident . : 676, sec. con núm. de ident.: 678, sec. con núm. de ident. : 680, sec. con núm. de ident. : 682, sec. con núm. de ident.: 684, sec. con núm. de ident.: 686, sec. con núm. de ident.: 688, sec. con núm. de ident.: 690, sec. con núm. de ident.: 692, sec. con núm. de ident.: 694, sec. con núm. de ident. : 696, sec. con núm. de ident. : 702, sec. con núm. de ident. : 704, sec. con núm. de ident. : 706, sec. con núm. de ident.: 708, sec. con núm. de ident.: 710, sec. con núm. de ident. : 712, sec. con núm. de ident. : 714, sec. con núm. de ident.: 716, sec. con núm. de ident.: 718, sec. con núm. de ident.: 720, sec. con núm. de ident.: 722, sec. con núm. de ident. : 724, sec. con núm. de ident. : 726, sec. con núm. de ident. :728 y sec. con núm. de ident.: 730

23. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad de acetolactato reductasa es YMR226C.

24. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-23, caracterizada porque es una célula huésped de levadura.

25. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la levadura es Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Candida, Kluyveromyces, Yarrowia, Issatchenkia o Pichia.

26. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1 o 25, caracterizada porque la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae .

27. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-26, caracterizada porque la ruta de producción de isobutanol modificada comprende las siguientes conversiones de sustrato a producto: a) piruvato a acetolactato b) acetolactato a 2 , 3 -dihidroxiisovalerato c) 2 , 3 -dihidroxiisovalerato a 2 -cetoisovalerato d) 2 -cetoisovalerato a isobutiraldehído; y e) isobutiraldehído a isobutanol en donde cada una de las conversiones de sustrato a producto está catalizada por una enzima expresada de manera recombinante por la célula huésped.

28. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque todas las conversiones de sustrato a producto están catalizadas por enzimas heterólogas para la célula huésped.

29. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque por lo menos un polinucleótido heterólogo que codifica por lo menos una de las enzimas heterologas para la célula huésped está integrada cromosomáticamente en la célula huésped.

30. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-29, caracterizada porque las conversiones de sustrato a producto están catalizadas por enzimas prácticamente localizadas para el citosol.

31. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27-30, caracterizada porque la conversión de sustrato a producto para isobutiraldehído a isobutanol está catalizada por una enzima alcohol deshidrogenasa que usa NADH como cofactor.

32. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31, caracterizada porque comprende además, una capacidad reducida, interrumpida o eliminada para convertir acetolactato a 2 , 3 -dihidroxi -2 -. metilbutirato .

33. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-32, caracterizada porque es levadura y tiene una expresión o actividad de piruvato descarboxilasa reducida, interrumpida o eliminada.

34. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque tiene una actividad de PDC1, PDC5 o PDC6 reducida, interrumpida o eliminada o una combinación de estas.

35. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34, caracterizada porque tiene una expresión o actividad de glicerol-3-fosfato deshidrogenasa dependiente de NAD reducida o eliminada.

36. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque tiene una expresión o actividad de GPD2 reducida.

37. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, caracterizada porque tiene una expresión o actividad de FRA2 reducida o eliminada.

38. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-37, caracterizada porque produce isobutanol en condiciones anaerobias, y caracterizada además porque la proporción molar de isobutanol y glicerol es mayor que 1.

39. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-38, caracterizada porque el polipéptido que tiene actividad de KARI coincide con el perfil HMM proporcionado en la Tabla Z con un valor E del perfil HMM de <10"3.

40. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-39, caracterizada porque produce isobutanol a un rendimiento mayor que aproximadamente 25 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 75 % o aproximadamente 90 % del rendimiento teórico.

41. La célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-40, caracterizada porque se produce isobutanol, y en donde también se produce etanol .

42. Un método para producir isobutanol; caracterizado porqu comprende : a) proporcionar la célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-41, y b) poner la célula huésped de a) en contacto con un sustrato de carbono en condiciones para producir isobutanol.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque por lo menos una porción del contacto se produce en condiciones anaerobias.

44. El método de conformidad con la reivindicación 42 o 43, caracterizado porque el contacto se produce en presencia de un extractante.

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el contacto se produce en presencia de una cantidad suficiente de extractante orgánico para formar un sistema de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica.

46. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42-45, caracterizado porque uno o más del índice efectivo, título efectivo o rendimiento efectivo de isobutanol se incrementa en comparación con una célula huésped recombinante que no comprende (i) por lo menos un polipéptido heterólogo con actividad de KARI o un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad de KARI y (ii) por lo menos una modificación que mejora el rendimiento de la ruta de producción de isobutanol modificada .

47. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42-46, caracterizado porque la producción de DHMB, la producción de ácido isobutírico o ambas se reducen en comparación con una célula huésped recombinante que no comprende (i) por lo menos un polipéptido heterólogo con actividad de KARI o un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad de KARI y (ii) por lo menos una modificación que mejora el rendimiento de la ruta de producción de isobutanol modificada.

48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42-47, caracterizado porque la proporción molar de isobutanol y glicerol es mayor que 1.

49. Una composición fermentativa caracterizada porque comprende la célula huésped y el isobutanol producido de acuerdo con el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42-28.

50. Un método para producir isobutanol; caracterizado porque comprende : a) proporcionar una célula huésped recombinante que produce isobutanol b) poner la célula huésped de a) en contacto con un sustrato de carbono en condiciones para producir isobutanol; en donde por lo menos una porción del contacto se produce en condiciones anaerobias; y en donde la relación de isobutanol y glicerol producidos es mayor que 1.

51. Un método para la producción de butanol; caracterizado porque comprende: a) cultivar una levadura recombinante que comprende una ruta biosintética con la capacidad de convertir piruvato a acetolactato en condiciones para producir butanol; y b) eliminar el DHMB del cultivo.

52. Una composición producida mediante el método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque comprende butanol y no más de aproximadamente 0.5 mM de DHMB.

53. Una composición caracterizada porque comprende i) una levadura recombinante con la capacidad de producir butanol, ii) butanol y iii) no más de aproximadamente 0.5 mM de DHMB.

54. Un método para producir una célula huésped recombinante; caracterizado porque comprende: a) proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una modificación en un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene actividad de aldehido deshidrogenasa o actividad de aldehido oxidasa; y b) transformar la célula huésped con un polinucleótido que codifica un polipéptido de una ruta biosintética de isobutanol .

55. Un método para reducir o eliminar la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico; caracterizado porque comprende : a. proporcionar la célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-41; y b. someter la célula huésped a condiciones en donde la conversión de isobutiraldehído a ácido isobutírico se reduce o se elimina en comparación con una célula huésped recombinante que no comprende una actividad de aldehido deshidrogenasa y/o de aldehido oxidasa reducida o eliminada.

56. Una. composición caracterizada porque comprende isobutanol y una célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-41.

57. Un polipéptido caracterizado porque comprende por lo menos aproximadamente 90 % de identidad o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con las sec . con núms . de ident.: 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464 , 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484 , 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534, 535, 536, 537, 624, 626, 628, 630, 632 o un fragmento activo de estas, en donde el polipéptido tiene actividad de cetol-ácido reductoisomerasa.

58. Un polipéptido caracterizado porque comprende por lo menos aproximadamente 90 % de identidad o por lo menos aproximadamente 95 % de identidad o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con la sec. con núm. de ident.: 417, 419, 421, 423, 425 o 427 o un fragmento activo de estas, en donde el polipéptido tiene actividad de cetol-ácido reductoisomerasa.

59. Un polinucleótido caracterizado porque codifica el polipéptido de conformidad con la reivindicación 57 o 58.

60. Un método para convertir acetolactato a 2,3-dihidroxiisovalerato; caracterizado porque comprende: a) proporcionar un polipéptido de conformidad con la reivindicación 57 o 58; b) poner el polipéptido de a) en contacto con acetolactato en condiciones para producir 2,3-dihidroxiisovalerato .

61. Una célula huésped recombinante caracterizada porque comprende un polipéptido heterologo de conformidad con la reivindicación 57, reivindicación 58, o un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 59.

62. Una levadura recombinante caracterizada porque comprende una ruta biosintética con la capacidad de convertir piruvato a acetolactato, y en donde la levadura produce menos de 0.01 moles de 2 , 3 -dihidroxi-2 -metilbutirato (DHMB) por mol de azúcar consumida.

63. Una levadura recombinante caracterizada porque comprende una ruta biosintética con la capacidad de convertir piruvato a acetolactato, y en donde la levadura produce DHMB a un índice menor que aproximadamente 1.0 mM/hora.

64. Una levadura recombinante caracterizada porque comprende una ruta biosintética con la capacidad de convertir piruvato a acetolactato, y en donde la levadura produce una cantidad de 2 , 3-dihidroxi-3-isovalerato (DHIV) que es por lo menos aproximadamente 1.5 veces la cantidad de DHMB producido .

65. Un método para la producción de butanol; caracterizado porque comprende: a) cultivar una levadura recombinante que comprende una ruta biosintética con la capacidad de convertir piruvato a acetolactato en condiciones para producir butanol; y b) determinar la concentración de DHIV y/o de DHMB; en donde las etapas a) y b) se pueden llevar a cabo simultánea o secuencialmente y en cualquier orden.

66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la medición comprende cromatografía liquida-espectrometría de masas.

67. Un método para incrementar la actividad de cetol-ácido reductoisomerasa (KARI) ; caracterizado porque comprende a) proporcionar una composición que comprende acetolactato, una enzima KARI y una enzima acetolactato reductasa y b) reducir las concentraciones de DHMB.

68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la reducción de las concentraciones de DHMB se logra al reducir la actividad de la enzima acetolactato reductasa.

69. . El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la reducción de las concentraciones de DHMB se logra al eliminar el DHMB de la composición.

70. Un método para incrementar la actividad de dihidroxiácido deshidratasa (DHAD) ; caracterizado porque comprende a) proporcionar una composición que comprende dihidroxiisovalerato (DHIV) y una enzima DHAD y b) reducir las concentraciones de DHMB.

71. Un método para incrementar la produc ividad de la enzima KARI en una célula huésped; caracterizado porque la célula huésped comprende una ruta, de producción de isobutanol modificada que comprende una enzima KARI heteróloga y por lo menos una modificación genética que reduce, interrumpe o elimina la expresión o actividad de acetolactato reductasa, y en donde la actividad de la enzima de KARI se reduce en presencia de DHMB .

72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la KARI tiene por lo menos aproximadamente 90 %, por lo menos aproximadamente 95 % o por lo menos aproximadamente 99 % de identidad con KARI de E. coli o L. lactis.

73. El método de conformidad con la reivindicación 71 o 72, caracterizado porque la expresión o actividad de acetolactato reductasa reducida, interrumpida o eliminada reduce sustancialmente la presencia de DHMB.

74. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que tiene actividad de KARI que comprende la sec . con núm. de ident . : 33 o 35 o un fragmento activo de esta.