NL8201432A - Nieuwe stam van fusarium en toepassing van deze voor de bereiding van fusafungine. - Google Patents

Description

'w > ' --- J_ , , - 1 -

Nieuwe stam van Fusarium en toepassing van deze voor de bereiding van fusafungine.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een nieuw micro-organisme, dat gekweekt wordt voor de produk-tie van antibiotica en meer in het bijzonder van fusafungine, een antibioticum voor extern gebruik voor de behandeling van 5 aandoeningen aan de keel.

Fusafungine en de bereiding daarvan uit Fusarium lateritium is in het bijzonder beschreven in het Franse octrooischrift 1.164.181 en dit micro-organisme is gedeponeerd bij het Centraal Bureau voor Schimmelculturen in 10 Baarn onder het nummer CBS 119.63. Verder worden in het Franse octrooischrift 1.392.717 de verbeteringen beschreven van de industriële bereidingswerkwijze van fusafungine uit de laatst genoemde stam, d.w.z. verbeterde opbrengsten van 0,5 tot 0,8 g/i.

15 Verschillende werkwijzen zijn reeds beproefd waarmee het niet mogelijk bleek de opbrengst te verhogen, omdat fusafungine, een bestanddeel van het lichaam van het Fusarium, in iedere stam aanwezig is in een karakteristieke concentratie, die niet verhoogd kan worden door de bereidings-20 werkwijze tot boven het punt waarbij alle in het preparaat aanwezige fusafungine wordt gewonnen.

Andere stammen zijn reeds beproefd, welke niet een gunstiger opbrengst opleverden en moeilijkere kweek-omstandigheden hadden.

25 De uitvinding heeft tot doel te voorzien in een stam, welke een grotere hoeveelheid fusafungine met gelijke kwaliteit produceert - en wel volgens dezelfde bereidingswerkwijze.

Aanvraagster is erin geslaagd een nieuwe stam 30 te verkrijgen, welke voldoet aan dit kriterium. Het doel wordt in zovere verwezenlijkt dat terwijl de oudere stammen opbrengsten gaven in de orde 'van 0,1-0,2 g/1 fusafungine in het laboratorium, de nieuwe stam 0,6-0,9 g/1 levert, dat wil zeggen een opbrengst die gemiddeld zes maal groter is. Op indus-35 triele schaal kon 1,8-3,6 kg/m worden verkregen, d.w.z. ten- 8201432 « ^ - 2 - minste drie tot vier maal zoveel als volgens het Franse oc-trooischrift 1.392.717. De nieuwe stam volgens de onderhavige uitvinding werd verkregen uit stam CBS 119.63 door scheiding, isolering van kolonies en enting op verschillende dragers.

5 Uitgaande van sporen, die in de vorm van een monster waren getrokken van verschillende dragers die mutagene middelen kunnen bevatten, werden entingen gemaakt op agarmedia onder oplevering van geïsoleerde kolonies. Deze werden beproefd op produktiemedia. De opbrengst en de samenstelling van 10 het geproduceerde fusafungine werd bepaald.

De stam, welke het onderwerp vormt van de uitvinding kwam hierbij naar voren. Deze is thans gestabiliseerd door vriesdrogen op afgescheiden melk.

Volgens zijn karakteristieke eigenschappen 15 behoort deze nieuwe stam tot het type Fusarium. De stam is gedeponeerd en geïdentificeerd bij het Centraal Bureau voor Schimmelculturen te Baarn, onder nummer CBS 675.80.

De onderhavige stam kan niet worden geïdentificeerd aan de hand van enig bekende soort en is een nieuwe 20 soort, die door aanvraagster Fusarium Lateritium Servier is genoemd.

Morfologische studie.

De nieuwe stam Fusarium Lateritium Servier CBS 675.80 heeft een donkere kleur, de sporulatie heeft een 25 sporodochiumaspect met bosjes van luchtmicelium -, terwijl de oorspronkelijke stam die gedeponeerd is bij het Centraal Bureau voor Schimmelculturen te Baarn onder nummer 119.63 licht gekleurd is, een gladde kweek heeft en een sporulatie van· het pionnaattype heeft.

30 Genetische studie.

De belangrijke biochemische eigenschappen betreffende de produktie van fusafungine worden genetisch overgedragen. Daarom heeft het de eigenschappen van een moeilijk genoom.

35 De overdracht van deze eigenschappen via drie opvolgende generaties, waarbij deze vergeleken worden met twee andere bekende stammen die tegelijkertijd zijn gekweekt en weer uitgeplant zijn onder identieke omstandigheden in drie 8201432

V

- 3 - generaties, werd nagegaan aan de hand van de volgende procedure:

De'-wilde soort CBS 119.63, bewaard op kweepereboom of accaciakompost, werd geïsoleerd uit het conserveringsmedium 5 door deze over te brengen op een vloeistofmedium volgens Scheffer, voordat deze geënt werd op een agarbuis, die verrijkt was met havermeel, teneinde als referentie te dienen.

Terwijl het Fusariunt Lateritium Servier direct geënt was op havermeelagar, waren de volgende procedures iden-10 tiek voor de drie soorten - isolering van een element, - enting - aan het eind van de cyclus, extractie van het grootste gedeelte voor gisting en analyse - isolering van een element en opnieuw enten op een nieuwe agar.

De procedure is dezelfde aan het eind van de 15 tweede generatie voor het verkrijgen van een derde generatie.

De gistingsprocedures waren identiek voor de drie generaties van de drie stammen en hetzelfde medium werd telkens gebruikt.

In de volgende tabel worden de resultaten 20 opgesomd.

. productie van Fusafungine per S *C ct Iu liter medium (in g) le 2de 3de generatie generatie generatie 25 F. Lateritium CBS 119.63 (kweepereboomkompost) 0,1 0,12 0,09 F. Lateritium CBS 119.63 0,14 0,17 0,13 (acaciakompost) F. Lateritium Servier CBS 675.80 0,710 0,605 0,826 1 8201432

Biochemische studie.

De zeer grote hoeveelheid aanwezig fusafungine, groter dan alle bekende concentraties in andere stammen, vormt een biochemisch bewijs voor zijn origineel karakter.

Vastgesteld werd dat het fusafungine dat door v - 4 - * « deze stam geproduceerd wordt identiek is aan het fusafungine dat geproduceerd wordt door de andere afwijkende soorten, die gebruikt worden voor de produktie van fusafungine wat betreft zijn kleur, smeltpunt, antibiotisch vermogen en absorp-5 tiespectra van electromagnetische, infra-rode en ultraviolette golven.

Bereiding van het fusafungine.

De stam van Fusarium Lateritium Servier kan in vriesdroge vorm in afgesloten ampullen worden geconser-10 veerd.

De inhoud van de gevriesdroogde ampul kan gebruikt worden voor het direct enten van een verrijkte agar-buis, zoals deze commercieel verkrijgbaar is of volgens standaardtechnieken .

15 Het mycelium ontwikkelt zich in toenemende mate en na een cyclus van 15-20 d kan het dienen voor heren-ting van een volgende buis, teneinde gisting te verkrijgen.

Een op de volgende wijze samengesteld medium wordt gebruikt.

Saccharose 25 g/1 20 sponsachtig glucose 25 g/1 ammoniumnitraat 10 g/1 monokaliumfosfaat . 5 g/1 magnesiumsulfaat 2,5 g/1

De spontane pH is daarop 5,4-5,5.

25 Het medium wordt vervolgens gesteriliseerd gedurende 30 min bij 120°C en de pH ervan wordt 4,8-5.

Het medium wordt geënt en de temperatuur ervan vastgesteld op 28°C.

Beluchting wordt aangebracht met een snelheid 30 van 1 liter lucht/min/liter medium en men laat gedurende 95 + 5 h gisten - totdat de koolhydraten zijn uitgeput.

Na de gisting wordt het mycelium geëxtraheerd met een gechloreerd oplosmiddel. Het extractie-oplosmiddel wordt verwijderd door verdamping onder verminderde druk en het 35 residu wordt opgelost in een koolwaterstof, waaruit het opnieuw wordt geëxtraheerd met een waterige alcohol.

Concentrering van de waterige alcohol doet het ruwe produkt neerslaan.

8201432 -5-.

Zuivering wordt bereikt door behandeling met een alcoholische oplossing met speciaal voor dit doel behandeld geactiveerde kool. Het gezuiverde produkt wordt herkristalli-seerd uit een ethylalcohol-watermengsel.

5 Karakterisering:

Smp. = 128-131°C.

Draaiïngsvermogen: (_ α_7^° = -94 tot -104° (2 % in chloroform) IR-spectrum (^im) : 3,4 5,8 6,0 6,8 7,3 7,7 8,0 8,5 9,0 9,2 10,0 11,6 10 De uitvinding omvat tevens een biologisch zuivere kuituur van Fusarium Lateritium Servier, waarvan de eigenschappen overeenkomen met die van de stam, die geïdentificeerd is onder nr. CBS 675.80 en die ook de antibiotische stof door gisting in een voedingsmedium kan produceren.

15 De stam welke het onderwerp is van de uitvin ding kan gebruikt worden voor de bereiding van verbindingen van biologische oorsprong en meer in het bijzonder van fusa-fungine, dat gebruikt kan worden in de farmaceutische, cosmetische, resp. voedingsindustrieën, als medicament, voedings- 20 middel of toevoegsel.

De volgens de uitvinding gebruikte stam kan gemuteerd worden met bekende kunstmatige mutatiemiddelen: UV- en röntgenstralen en verschillende chemische stoffen, zoals nitrosoguanidines, mitomycine, enz. en al de mutanten die 25 verkregen worden en in staat zijn het antibiotische fusafungi-ne te produceren, kunnen gebruikt worden om de onderhavige uitvinding uit te voeren. 1 8201432

Claims (4)

1. Een nieuwe stam van Fusarium Lateritium waarvan de eigenschappen zijn als die van de stam, geïdentificeerd onder het nummer CBS 675.80.

2. Een zuiver biologische kuituur van de stam volgens conclusie 1.

3. Het gebruik van de stam volgens conclusie 1 voor de produktie van verbindingen van biologische oorsprong.

4. De toepassing van de stam volgens conclu-10 sie 1 voor de bereiding van fusafungine. 8201432