NO173902B

NO173902B - Fremgangsmaate for immunologisk paavisning av en markoer forunormal lipidmetabolisme og diagnostisk system for utfoerelse av fremgangsmaaten

Info

Publication number: NO173902B
Application number: NO87874056A
Authority: NO
Inventors: Richard S Smith; Doreen M Hogle; Linda K Curtiss; Joseph L Witztum; Steven Young
Original assignee: Scripps Clinic Res
Priority date: 1986-09-29
Filing date: 1987-09-28
Publication date: 1993-11-08
Also published as: IL83938A; PT85827A; JP2656774B2; IE872605L; DE3783991D1; PT85827B; US4828986A; NZ221941A; FI89214B; FI874253A0; EP0262854B1; ES2053555T3; NO874056D0; FI874253L; IE60119B1; JPS63277968A; DK509287A; FI89214C; NO173902C; DK173724B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for immunologisk påvisning av en markør for unormal lipidmetabolisme, som omfatter trinnene med å analysere med hensyn på mengden av humant apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I pr. enhetsvolum av en blodprøve, og å bestemme forholdet mellom apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I i prøven, samt et diagnostisk system for utførelsen av fremgangsmåten.

A. Arteriosklerose og lipoproteiner

Arteriosklerose er den sykdomstilstanden hvor kolesterol og andre lipider som akkumuleres på veggene til arterier, danner voluminøse plakker som hindrer blodstrømmen og som kan føre til dannelse av en blodpropp som stopper til en arterie og forårsaker okklusiv thrombotisk eller embolisk sykdom,

slik som hjerteanfall eller slag. Opp til 50% av alle døds-fall i USA er forårsaket av arteriosklerose og dens sekundær-komplikasjoner.

Human arteriosklerose defineres som akkumulering av utvalgte lipider, deriblant kolesterol, og celler på veggene av arterier og som med tiden gir okklusive skader. Selv om etiologien ved arteriosklerose har flere faktorer, tyder en stor mengde kliniske, patologiske, genetiske og eksperi-mentelle bevis på at unormaliteter ved lipoproteinmetabolismen kan bidra til utviklingen av arteriosklerose. Disse lipidene transporteres i blodstrømmen som komplekser av lipid og protein, kalt lipoproteiner.

Artheriosklerose og særlig den form som er kjent som kransarteriesykdom (CAD), er et stort helseproblem. Arteriosklerose og de beslektede vaskulære sykdommer førte til 983.000 dødsfall i 1983, og CAD alene fører til flere dødsfall årlig enn alle kreftformer tilsammen. I USA skjer det mer enn 1.000.000 hjerteattakk hvert år, og mer enn 500.000 mennesker dør som et resultat av denne sykdommen. I direkte kostnader i forbindelse med helsestell koster CAD USA mer enn 6 0 milliarder dollar hvert år. Denne enorme utgiften har fokusert oppmerksomheten på måter for å identifisere spe-sielle populasjoner med risiko for CAD slik at sykdommen kan kontrolleres med kosthold, adferdsendring (trening) og bestemte terapeutiske midler.

Fire hovedklasser kolesterol-assosierte plasmalipo-proteinpartikler er blitt bestemt, og har sin opprinnelse i tarmen eller leveren.Disse partiklene er involvert i transporten av de nøytrale lipidene, deriblant kolesterol og triglycerider. Alle klassene med plasmalipoproteiner har apolipoproteiner som er forbundet med lipid-protein-komplekset, og apolipoproteinene spiller nødvendige roller i funksjonen til disse lipoproteinene.

Den første klasse er kylomikronene. De er de største av lipoproteinene og er rike på triglycerider. Opprinnelses-stedet for kylomikronene er tarmen.

Selv om apolipoproteinene utgjør en kvantitativt mindre andel av massen av kylomikroner, er apolipoproteinene A-I, A-II og A-IV klart forbundet med kylomikroner, og tarmsyntese av A-apolipoproteiner er funnet.Kylomikroner inneholder også apolipoprotein B-48. Mye av kylomikron-komplementet av A-apolipoproteiner går tapt, og C- og E-apolipoproteiner erverves når kylomikroner eksponeres mot plasma eller lipoprotein med høy densitet (HDL) in vitro. Tarmproduksjon av A-apolipoproteinene (apo A) kan reguleres ved hjelp av andre faktorer enn fettabsorpsjon og kylomikrondannelse.

Den neste klasse lipoproteiner er lipoproteinene med svært lav densitet, VLDL. VLDL-partikkelen lages i leveren og er involvert i triglyceridmetabolisme og transport av disse lipidene fra leveren. Apolipoproteinene apo B-100 og apo E er hovedbestanddelene i VLDL-partikkelen.

Det tredje lipoprotein kalles lipoprotein med lav densitet (LDL) og er et spesifikt produkt av katabolismen av VLDL. Det viktigste apolipoprotein i LDL-partikkelen er apolipoprotein B-100 eller apo B-100.

Resultatene fra den nå klassiske Framingham-undersøkelse

(1971) viste en klar korrelasjon mellom risiko for CAD og serumkolesterolnivåer. Denne undersøkelse viste også at for-høyede nivåer av kolesterol bundet til lipoprotein med lav densitet (LDL), er forbundet med økt risiko for CAD. Nylig har en undersøkelse utført av Lipid Research Clinics Coronary Primary Prevention Trial (1984), vist at plasmanivåer av kolesterol og LDL-kolesterol kan reduseres ved hjelp av en kom-binert kur av diett og legemidler, og at denne reduksjon av plasmakolesterol resulterer i reduksjon av hyppigheten av CAD-dødelighet.

LDL er det viktigste kolesterolbærende lipoprotein i plasma. LDL er en stor rund partikkel med en lipidkjerne som er sammensatt av ca. 1500 molekyler kolsterol som bare er bundet ved hjelp av en esterbinding til en langkjedet fett-syre. Denne kjernen av kolesterylesterene er omsluttet av et lag av fosfolipid, ikke-forestrede kolesterolmolekyler og ett enkelt molekyl av apolipoprotein B-100. Fosfolipidene er innrettet slik at de hydrofile hodene er på utsiden, noe som gjør det mulig for LDL å foreligge i hydratisert sus-pensjon i blodet eller de ekstracellulære væsker.

Kolesterolen avgis til celler på LDL via en spesifikk LDL-reseptor og frigjøres fra LDL-partiklene i lysosomer hvor den kan kontrollere cellens kolesterolmetabolisme. En akkumulering av intracellulær kolesterol modulerer tre prosesser.

For det første reduserer den cellens evne til å lage sitt eget kolesterol ved å slå av syntesen av et enzym, HMG CoA-reduktase, som katalyserer et trinn i kolesterolens bio-syntetiske spor. Undertrykkelse av enzymet gjør cellen avhengig av ekstern kolesterol avledet fra det reseptor-for-midlede opptak av LDL.

For det andre fremmer den innkommende LDL-avledede kolesterol lagringen av kolesterol i cellen ved å aktivere et enzym som er betegnet lipoprotein-acyltransferase. Dette enzymet forestrer fettsyrer til overskytende kolesterolmolekyler, og lager kolesterylestere som avsettes i små dråper for lagring.

For det tredje, og mest betydningsfullt, driver akku-muleringen av kolesterol i cellen en feedback-mekanisme som får cellen til å stanse syntetiseringen av nye LDL-reseptorer. Celler regulerer derved sitt komplement av eksterne reseptorer slik at tilstrekkelig kolesterol bringes inn i cellene for å møte cellenes varierende behov, men ikke tilstrekkelig til å overlesse dem. F.eks. opprettholder fibro-blaster som deler seg aktivt slik at nytt membranmateriale trengs, et maksimalt komplement av LDL-reseptorer på ca. 40.000 pr. celle. I celler som ikke vokser, begynner det innkommende kolesterol å akkumulere, feedback-systemet reduserer reseptorproduksjon og komplementet av reseptorer reduseres så mye som ti ganger.

På den annen side er det blitt påvist at et annet lipoprotein i omløp, partikler av lipoprotein med høy densitet (HDL), er implisert i en tilstand av forhøyet innhold av kolesterol forbundet med redusert risiko for arteriosklerose. Apolipoprotein A-I er et strukturelt protein og antigen for HDL-partikkelen. Mengden av HDL gir en omvendt korrelasjon

for den forventede hyppighet av arteriosklerose.

Lipoprotein med høy densitet (HDL) inneholder to hoved-apolipoproteiner, apolipoprotein A-I (apo A-I) og apolipoprotein A-II (apo A-II). Apo A-I er hovedproteinkomponenten i all primat-HDL. Alle HDL-partikler inneholder apo A-I, og immunologisk kvantifisering av HDL har derfor vanligvis omfattet kvantifiseringen av apo A-I. Ca. 80% av HDL-partiklene inneholder også apo A-II, men HDL-partikler som inneholder bare apo A-II, er ikke blitt beskrevet.

En funksjon av apo A-I er aktiveringen av plasmaenzymet lecithin-kolesterol-acyltransferase. Dette enzymet er påkrevet for forestringen av fri kolesterol på HDL for transport til leveren. I fravær av apo A-I forestres ikke kolesterol i blodet, og kolesterol slipper derved ikke ut av blodet. Den bestemte rollen i HDL-metabolisme som apo A-II har, er ikke blitt fastslått.

Mange undersøkelser har vist at forhøyede HDL-nivåer korrelerer med en redusert hyppighet av CAD. Enkelte forskere har gjettet på at HDL fjerner "kolesterol fra perifere steder, slik som arterieveggen, og derfor tilskrevet HDL de anti-arteriogene egenskaper. Høyere konsentrasjoner av HDL-kolesterol korrelerer med forholdsvis normal lipidmetabolisme og en lavere hyppighet og/eller en redusert alvorlighet av kardio-vaskulær sykdom, mens forhøyede nivåer av LDL-kolesterol er forbundet med unormal lipidmetabolisme og en forøkt risiko for CAD. For den korrekte behandling av pasienter med hyper-lipidemi (for mye lipider i blodet) og de pasienter som har spesiell risiko for CAD, er det ønskelig å bestemme LDL- og HDL-kolesterolnivåene med jevne mellomrom. Hittil har analyser av HDL-kolesterol vært tungvinte og unøyaktige når det gjelder å bestemme blodnivåer av HDL.

B. Lipoproteinstruktur og - funksjon.

Det er viktig å forstå at kolesterol ikke foreligger

i fri form i plasma, men transporteres til vevstedene i kroppen ved hjelp av lipoproteiner. Kolesterol kan fåes fra direkte cellulær syntese eller ved hjelp av diett. Kolesterol kan imidlertid fjernes fra verten bare ved hjelp av leveren hvor den omdannes til gallesyrer og skilles ut.

Kylomikroner transporterer kost-kolesterol og triglycerider til leveren for etterfølgende bearbeiding, mens LDL avgir kolesterol til vev utenfor leveren, deriblant krans-arteriene. Således er lipoproteiner LDL/apo B-100 involvert i avsetningen av "dårlig" kolesterol på perifert vev. Omvendt fjerner lipoproteinet HDL/apo A "god" kolesterol fra vevene og sender kolesterol tilbake til leveren for utskillelse.

Opp gjennom tiden er det blitt utviklet mange systemer for å isolere og karakterisere lipoproteiner. Disse teknikkene er vanligvis basert på de fysiokjemiske egenskaper til lipo-proteinpartiklene. De to hyppigst brukte teknikker er ultrasentrifugering og elektroforese.

Differensiell densitetgradient-ultrasentrifugering drar fordel av det faktum at lipoproteinene er lettere og mindre tette enn andre plasmaproteiner, og det er forholdsvis lett, selv om det er tidkrevende og besværlig, å separere kylomikronene (de letteste lipoproteinene), VLDL, LDL og HDL fra hverandre. Elektroforeseteknikker har vært nyttige for klassifiseringen av pasienter med hyperlipidemier. Disse teknikkene utføres imidlertid ikke med letthet i et vanlig klinisk laboratorium.

Man kan også se at den enkle kvantifisering av blod-kolesterol eller triglycerider ikke gir legen informasjon om hvilke bestemte lipoproteiner som bærer disse lipidene, og kvantifiseringen av disse.

C. Plasmalipoproteinene.

Fire hovedklasser av plasmalipoproteiner; dvs. kylomikroner, VLDL, LDL og HDL, er blitt definert, og det finnes uten tvil underklasser innenfor disse. Alle lipoproteiner har sin opprinnelse i tarmen eller leveren, eller begge, og synes å ha en pseudomicellestruktur. Nøytrale lipider og særlig kolesterolestere og triglycerider, oppbevares i kjernen i lipoproteinene i en oppløselig og stabil form gjennom gjensidige påvirkninger med de polare overflatebestanddeler, apolipoproteiner og fosfolipider.

Ikke-forestret kolesterol er også tilstede i disse kom-pleksene. Dens polaritet ligger mellom polariteten til de nøytrale lipidene (kolesterylestere og triglycerider) og polariteten til de mer polare apolipoproteiner og fosfolipider, og kan finnes både i kjernen og på overflaten.

En ytre overflate bestående av apolipoproteiner, ikke-forestret kolesterol og fosfolipider omgir en vannuoppløselig kjerne av kolesterylestere og triglycerider og beskytter de upolare lipider mot de vandige omgivelser. Dette generelle strukturkonsept er blitt understøttet av undersøkelser ved hjelp av røntgenbestråling ved lav vinkel og ved hjelp av andre fysiske metoder hvor en rekke prøver har blitt brukt til å utforske strukturen til lipoproteinene. En viktig funksjon ved plasmalipoproteinene er således oppløseliggjøringen og transporten av de nøytrale lipidene.

D. Apolipoproteinene.

Apolipoproteiner er de lipidfrie proteinbestanddeler

i plasmalipoproteinene som fåes ved å behandle isolerte intakte lipoproteiner med organiske oppløsningsmidler, deter-genter eller kaotropiske midler. Ikke alle proteiner som fanges inn av lipidproteiner, har nødvendigvis en rolle i lipid-transporten. Et aktuelt eksempel er den nylige erkjennelse av at amyloid A proteinene i serum, akuttfasereaktanter, transporteres i plasma bundet til HDL. Disse proteinene med lav molekylvekt kan omfatte opp til 30% av apo-HDL i betennelses-tilstander, men det er tvilsomt om de har bestemte lipidtrans-portroller.

1. Apolipoprotein A- I

(a) Proteinet

Apolipoproteinet A-I (apo A-I) er et protein av interesse i forbindelse med foreliggende oppfinnelse. Apo A-I er omtalt nedenunder.

Apo A-I er hovedproteinbestanddelen i all primat-HDL, er tilstede i alle HDL-partikler, og det er flere, f.eks. 7-8, apo A-I-molekyler pr. HDL-partikkel. Den er blitt rapportert å være tilstede i forholdsvis små mengder i kylomikroner,

VLDL og LDL, samt å utgjøre ca. 60 - 80% av den samlede protein-masse i HDL.

Apo A-I består av en enkel kjede med 243 - 245 rester, inneholder ikke cystin, cystein, leucin eller carbohydrat,

og foreligger i flere isoformer. Apo A-I har et cc-helisk innhold på ca. 55% i den lipidfrie tilstand, som øker til ca.

75% etter binding av fosfolipid. Gjentatte sykluser med 11 heliske rester er blitt identifisert i dette apolipoproteinet. Det er blitt antydet at disse enhetene utgjør en enkel avstam-ningskjede som, ved hjelp av genfordobling, har generert en 22-resters gjentagelsesenhet. Disse enhetene har nær sekvens-homologi og antas å utgjøre de lipidbindende områder i proteinet.

Apo A-I er en kraftig aktivator for LCAT, et plasma-enzym som katalyserer omdannelsen av kolesterol og fosfatidyl-cholin til henholdsvis kolesterylester og lysofosfatidyl-cholin. Spesifikke lipidbindende områder i apo A-I er funnet å aktivere LCAT, og dens aktivitet er blitt forbundet med lipidbindingsegenskapen. Som allerede angitt, syntetiserer lever og tarm apo A-I, men deres relative bidrag til det samlede plasmainnhold og faktorene som modulerer apo A-I-produksjon, er ikke godt definert.

Vanligvis er mer enn ca. 90% av plasma apo A-I forbundet med HDL, mindre enn ca. 1% med VLDL og LDL, og ca. 10% eller mindre er forbundet med den lipoproteinfrie plasmafraksjon. Mengdene av apo A-I i hver partikkeltype varierer etter hvem som rapporterer dataene, og synes å være en funksjon av de teknikker som brukes ved separasjon av partiklene,

(b) Klinisk betydning av apo A- I lipoproteiner

Måling av hovedproteinbestanddelen i HDL, apo A-I, er klinisk viktig. Resultatene av en rekke undersøkelser har vist at apo A-I-nivåer er nedsatt i individer med CAD. Denne obser-vasjon understreker den beskyttende rolle til plasma apo A-I

i denne pasientgruppen.

Resultatene fra flere undersøkelser antyder at det kan være mulig å forutsi et individs prognose med hensyn på unormal lipidmetabolisme, arteriosklerose og særlig for CAD ved å måle nivået av apo A-I nøyaktig. For en nyere oversikt over 2416 barn vises det til Freedman et al., (1986) New Eng. J. Med. 315: 721-726. Mengden av apo A-I alene kan imidlertid ikke benyttes som en markør for unormal lipidmetabolisme, om ikke annet bare på grunn av vanskeligheten med nøyaktighet og presisjon i målingen. Selv om forholdsvis høye nivåer av apo A-I er tilbøyelig til å korrelere med normal lipidmetabolisme, og forholdsvis lave nivåer med unormal lipidmetabolisme og CAD, er det således ikke blitt rapportert en klar grenselinje mellom normale personer og de med kjent CAD.

Som angitt tidligere, er det funnet å være svært vanske-lig å kvantifisere apo A-I nøyaktig og presist i et klinisk anvendbart immunologisk analysesystem, slik som en radioimmuno-logisk analyse (RIA), en enzymbundet immunologisk analyse (ELISA), en elektroimmunologisk analyse (EIA), en radial-immunodif fus jon (RID) eller ved hjelp av immunonefeiometri (INA) . Se f.eks. tabell 1 Steinberg et al., (1983) Clin. Chem. 29/ 3: 415-426 med hensyn på variasjonen i verdier som er rapportert under anvendelse av forskjellige teknikker.

En av de påståtte grunner for disse analytiske vanske-ligheter er at apolipoprotein A-I-molekylet er tilstede i plasma og serum som del av en stor, biokjemisk heterogen partikkel hvori noen av de antigene steder (epitoper) er skjult og maskert. Som en følge av dette har flere forskere benyttet avmaskeringsbehandlinger på prøvene sine slik at de vanligvis skjulte epitoper avmaskeres og blir tilgjengelige for immunologisk reaksjon.

Steinberg et al. (1983 ) Clin. Chem. 29:415-426 om-taler også avmaskering ved behandling av en blodprøve, slik som plasma eller serum, med denatureringsmidler, slik som urea, tetramethylurea og guanidin, overflateaktive midler, slik som natriumdodecylsulfat og polyoxyethylen(20)-sorbitan-monolaurat ("Tween 20"), oppvarming f.eks. ved 52°C i 3 timer og ved

37°C i 2 timer, og organiske oppløsningsmidler for fjerning av lipider, slik som blandinger av ethanol og diethylether, methanol og diethylether, kloroform og methanol, og lignende.

Ytterligere spesifikke avmaskeringsbehandlinger kan finnes i det arbeidet som er rapportert av Maciejko et al. (1982)

Clin. Chem. 28:199-204 (overflateaktivt middel); Koren et al.

(1985) Clin. Chim. Acta 147:85-95 (organisk oppløsningsmiddel) og Bury et al. (1985) Clin. Chem. 31:247-251 (37°C, 2 timer).

Noen av de ovenfor nevnte forskere og andre har også benyttet polyklonale antistoffpreparater for å hjelpe til å unngå den tilsynelatende heterogenisitet til apo A-I slik det foreligger i plasma og serum. Maciejko et al. (1982) Clin. Chem. 28.: 199-204; Koren et al. (1985) Clin. Chim. acta 147:85-95; Bury et al. (1985) Clin. Chem. _3_i: 247-251 og Fesmire et al.

(1984) Clin. Chem. 30.: 712-716. Bruken av polyklonale antistoffer i en klinisk nyttig kvantitativ immunologisk analyse fører selvfølgelig med seg skaden ved forskjeller i antistoff-aktivitet som ligger i bruk av sera fra flere dyr, og også forskjeller i immunospesifisitet mellom forskjellige mengder av serum.

Bortsett fra de monoklonale paratopiske molekyler som her er benyttet, har på den annen side ingen andre beskrevet monoklonale antistoffer som reagerer immunologisk i det vesentlige likt med HDL-partikler og apo A-I, samt reagerer immunologisk med i det vesentlige alt av apo A-I som er tilstede på HDL i en prøve. Således rapporterte Curtiss et al.

(1985) J. Biol. Chem. 200:2982-2998 et monoklonalt antistoff betegnet AI-7 som reagerte immunologisk omtrent likt med apo A-I og HDL, men som bare var i stand til å utfelle immunologisk ca. 60% av den radioaktivt merkede apo A-I eller HDL som man visste var tilstede i de analyserte prøver.

2. Apolipoprotein B- 10 0

(a) Proteinet

En art av apo B syntetisert i leveren, betegnet apolipoprotein B-100 (apo B-100), gjenkjennes og bindes av cellulære eller LDL-reseptorer. Ved å binde apo B-100 binder disse reseptorene LDL-partikler og ekstraherer dem fra plasmaet. LDL tas derved inn i cellene og brytes ned, noe som får dets kolesterol til å kjenne hver celles behov. Den gjensidige reaksjon mellom apo B og LDL-reseptor spiller således en hovedrolle i fjerning av LDL-kolesterol fra blod-

strømmen, og alle LDL-partikler inneholder apo B-100.

(b) Klinisk betydning av apo B- 100 lipoprotein

I motsetning til apo A-I og HDL, er høye nivåer av

apo B blitt forbundet med unormal lipidmetabolisme og CAD, mens lavere mengder er tilbøyelige til å korrelere med normal tilstand og en redusert risiko for sykdommen. Kylomikronpar-tikler inneholder et betydningsfullt apo B protein som refereres til som apolipoprotein B-48, som også er et produkt av genet for apo B-100 [Young et al. (1986) J. Biol. Chem. 261; 2995-2998] og har minst én kryssreaktiv epitop til felles med apo B-100. VLDL- og LDL-partikler inneholder apo B-100. Av de to proteinene synes apolipoprotein apo B-100 (apo B-100) å være det viktigste for unormal lipidmetabolisme og CAD.

I den senere tid har flere forskere antydet at plasmanivåer av apo B-100 kan forutsi mer med hensyn til CAD-risiko enn plasmanivåer av LDL-kolesterol. Sniderman et al. (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 7_7:604~608- Som tilfellet var for HDL og apo A-I, er det ikke bestemt noen klar skillelinje mot det nivå av apo B-10 0 eller LDL alene som kan bestemme om en person har unormal lipidmetabolisme eller har en forøkt risiko for CAD.

Mange typer immunologiske analyser for plasma apoprotein B hvor det benyttes spesifkke antistoffholdige antisera, er blitt rapportert, deriblant konkurrerende væskefase og fastfase RIA-er, ELISA-er, RID-er og andre. Problemer som begrenser utbredt anvendelse av disse immunologiske analyser med apo B, har vært reproduserbarhet og kvaliteten og spesifisiteten av de anvendte antisera. En oversikt over metode-problemene ved hver av de forskjellige typer analyser med apo B finnes i Currey et al. (1978), Clin. Chem. 24:280-286

og Rosseneu et al. (1983), Clin. Chem. 28;427-433.

Flere forskere har rapportert utvikling av paneler av monoklonale antistoffer mot human apo B for anvendelse i under-søkelse av dets antigene struktur og rolle i lipoproteinmeta-bolisme. Videre finnes det rapporter vedrørende anvendelse av anti-apo B monoklonale antistoffer for å måle plasmanivåer av apo B i væskefase RIA-er. Patton et al. (1983) Clin. Chem. 29:1898-1902; Maynard et al. (1984) Clin. Chem. 30:1620-1624 og Young et al. (1986) Clin. Chem. 32; 1484-1490. I tillegg har en gruppe rapportert bruk av en blanding av anti-apo B monoklonale antistoffer i en analyse med radialimmunodiffusjon med hensyn på plasma apo B. Marconvina et al. (1985) Clin.

Chim. Acta 147:117-125. Disse analyseteknikker lider imidlertid av nødvendigheten av langvarige inkubasjoner, gjentatt sentrifugering og/eller bruk av radioaktive materialer.

3. Monoklonale paratopiske molekyler som reagenser for apo

A- I og B- 100

Anvendelsen av monoklonale antistoffer eller deler derav med antistoffets forbindelsessted, dvs. paratopiske molekyler, som reagenser for analysering med hensyn på tilstedeværelsen av apo A-I eller B-10 0 i humane blodprøver, er tillokkende fordi når slike reagenser først er erholdt, kan de fremstilles i forholdsvis store mengder med ensartet kvali-tet, og derved kan problemet med uensartethet som er forbundet med polyklonale antistoffer, unngåes. Det er imidlertid en rekke faktorer som taler imot bruken av et partikulært monoklonalt paratopisk molekyl som en bestanddel i slike analyse-systemer.

Når det anvendes et monoklonalt antistoff som eksempel på et monoklonalt paratopisk molekyl, sier teknikkens stand at et monoklonalt antistoff kan være for immunospesifikt til å være nyttig på grunn av den antigene heterogenitet til målantigenet. F.eks. avhenger spesifisiteten av vanlige polyklonale antistoffholdige antisera av en samstemmighet blant flere hundre tusen forskjellige antistoffer som binder seg til antigene determinanter som dekker mesteparten eller alt av et antigent protein, noe som er funnet nyttig i analyse med apoA-I. Som et resultat av dette, vil små endringer i strukturen til antigenet som skyldes genetisk polymorfisme, heterogenitet ved glycosylering eller svak denaturering eller annen reaksjon, vanligvis ha liten virkning på binding av polyklonalt antistoff. På samme måte vil vanligvis en større eller mindre undermengde av antistoffer fra polyklonale antisera binde antigener som er blitt modifisert eller denaturert.

I motsetning til dette bindes monoklonale antistoffer vanligvis til én antigen determinant (epitop) på antigenmole-kylet. Dersom den determinante av en eller annen grunn er endret, vil eller behøver ikke antistoffet fortsette med å bindes. Hvorvidt dette er et problem eller en fordel, avhenger av de individuelle omstendigheter. Dersom det monoklonale antistoff, slik som i foreliggende tilfelle, skal anvendes i en diagnostisk analyse med hensyn på et apolipoprotein, vil en mindre antigenvariasjon i proteinet kunne forårsake store feil. Således rapporterte f.eks. Tsao et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:15222-15228 og Mao et al. (1983) _2£: 1890-1897 at

noen monoklonale antistoffer som er spesifikke for apo B molekyler, binder seg til epitoper som ikke er uttrykt på alle LDL-partikler. Slike antistoffer ville klart ikke være anvendbare for kvantifisering av total mengde apo B-100 i plasma eller serum.

Den antigene heterogenitet av apoproteiner A-I ble omtalt ovenfor. Heterogenitet av apo B-100 er også godt doku-mentert. F.eks. er epitopekspresjon på apo B funnet å bli modu-lert ved hjelp av (1) sammensetningen av de tilknyttede lipider, (2) temperatur ved den immunologiske reaksjon, (3) graden av isolering av LDL fra dets naturlige omgivelser og (4) genetisk ekspresjon hos enkeltindivider.

På grunn av deres unike spesifisitet, er for det andre den vellykkede anvendelse av et monoklonalt antistoff (Mab) ofte avhengig av dets affinitet overfor målantigenet. Mens f.eks. et Mab .kan ha tilstrekkelig affinitet til å være anvendbart når det gjelder å binde antigen i flytende og fast fase, mens Mab-et selv er i væskefasen, kan det hende at det samme antistoff ikke kan anvendes som et fastfasebundet antistoff som er anvendbart når det gjelder å binde seg til og holde antigenet borte fra oppløsning.

De ovenfor nevnte problemer er felles for bruken av monoklonale antistoffer. Fagfolk innen teknikken har derfor erkjent at det er vesentlig å teste og karakterisere monoklonale antistoffer i ethvert analysesystem hvor de skal brukes. Se Goding, James W., Monoclonal Antibodies: " Principles and Practice", Academic Press, New York (1983), sider 40-46. Foreliggende oppfinnelse er rettet mot en forbedret fremgangsmåte for immunologisk påvisning av en markør for unormal lipidmetabolisme, som omfatter trinnene med å analysere med hensyn på mengden av humant apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I pr. enhetsvolum av en blodprøve, og å bestemme forholdet mellom apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I i prøven. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at: (a) en første aliquot av en apolipoprotein B-100-holdig flytende blodprøve fra en person analyseres med hensyn på mengden av apolipoprotein B-100 som er til stede ved å: (i) blande den første flytende prøvealiquot med en fast bærer bestående hovedsakelig av en fast matriks med fastfasebundne første monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100, og utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746 som er avledet fra ikke-humane pattedyr immunisert med henholdsvis humant VLDL og humant LDL, hvorved det dannes en første blanding av fast og flytende fase, idet overflaten til bæreren har blokkerte ikke-spesifikke bindingsseter, (ii) holde den første blanding av fast og flytende fase under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de første paratopiske molekyler kan reagere immunologisk med apolipoprotein B-100 som er til stede i prøvealiquoten, og danne en fastfase-bundet immunoreaktant som inneholder i det vesentlige alt apolipoprotein B-100 som er til stede i prøvealiquoten, (iii) blande apolipoprotein B-100 i den første flytende prøvealiquot med andre monoklonale paratopiske molekyler i flytende fase som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100, utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746, men benyttes ikke i trinn (a) (i), og er operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel, hvorved det dannes en andre blanding, (iv) holde den andre blanding under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de andre indikasjonsmiddelbundne paratopiske molekyler kan danne en immunoreaktant som inneholder i det vesentlige alt apolipoprotein B-100 i prøvealiquoten, (v) separere den faste og den flytende fase som fås fra trinnene (a) (i-iv) ovenfor, og (vi) bestemme mengden av indikasjonsmiddelbundet apolipoprotein B-100-holdig immunoreaktant som er til stede i den fraskilte faste fase, og derved mengden av apolipoprotein B-100 i et enhetsvolum av prøve, (b) en andre aliquot av den flytende blodprøve som inneholder apolipoprotein A-I og ikke har vært underkastet avmaskeringsbehandling, analyseres med hensyn på mengden av apolipoprotein A-I som er til stede ved å: (i) blande den andre flytende prøvealiquot med en fast bærer bestående hovedsakelig av en fast matriks med fastfasebundne tredje monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I og utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201 som begge er avledet fra ikke-humane pattedyr immunisert med humant HDL, hvorved det dannes en tredje blanding av fast og flytende fase, idet overflaten til den faste bærer har blokkerte og ikke-spesifikke bindingsseter, (ii) holde den tredje blanding av fast og flytende fase under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de første paratopiske molekyler kan reagere immunologisk med apolipoprotein A-I som er til stede i aliquotprøven, og danne en fastfase-bundet immunoreaktant som inneholder i det vesentlige alt apolipoprotein A-I som er til stede i prøvealiquoten. (iii) blande apolipoprotein A-I i den andre flytende prøvealiquot med fjerde monoklonale paratopiske molekyler i flytende fase som reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I, utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201, men som ikke benyttes i trinn (b) (v), hvorved det dannes en fjerde blanding, (iv) holde den fjerde blanding under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de fjerde indikasjonsmiddelbundne paratopiske molekyler kan danne en immunoreaktant med i det vesentlige alt apolipoprotein A-I som er til stede i prøve-aliquoten, (v) separere den faste og den flytende fase som fås fra trinnene (b) (i-iv), og (vi) bestemme mengden av indikasjonsmiddelbundet apolipoprotein A-I-holdig immunoreaktant som er til stede i den fraskilte faste fase, og derved mengden av apolipoprotein A-I i et enhetsvolum av prøven.

Ved en annen og foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres de to ovenfor nevnte blandingstrinn hovedsakelig samtidig og de to opprettholdelsestrinn utføres sammen. Denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at: (a) en første aliquot av en apolipoprotein B-100-holdig flytende blodprøve fra en person analyseres med hensyn på mengden av apolipoprotein B-100 som er til stede ved å: (i) danne en første blanding av fast og flytende fase ved i det vesentlige samtidig å blande den første flytende prøvealiquot med en fast bærer bestående hovedsakelig av en fast matriks med fastfasebundne første monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100, og utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746 som er avledet fra ikke-humane pattedyr immunisert med henholdsvis humant VLDL og humant LDL, og andre monoklonale paratopiske molekyler operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel som utskilles av begge hybridomer med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746, og ikke er de første paratopiske molekyler bundet til den faste matriks, idet overflaten på bæreren har blokkerte ikke-spesifikke bindingsseter, (ii) holde den første blanding av fast og flytende fase under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de første paratopiske molekyler og de indikasjonsmiddelbundne andre paratopiske molekyler kan reagere immunologisk med i det vesentlige alt apolipoprotein B-100 som er til stede i prøvealiquoten, hvorved det dannes en fastfasebundet sandwichimmunoreaktant og en flytende fase, (iii) separere den faste og den flytende fase, og (iv) bestemme mengden av indikasjonsmiddelbundet apolipoprotein B-100-holdig sandwichimmunoreaktant som er til stede i den fraskilte faste fase, og derved mengden av apolipoprotein B-100 i et enhetsvolum av prøve, (b) en andre aliquot av den flytende blodprøve som inneholder apolipoprotein A-I og ikke har gjennomgått avmaskeringsbehandling, analyseres med hensyn på mengden av apolipoprotein A-I som er til stede ved å: (i) danne en andre blanding av fast og flytende fase ved i det vesentlige samtidig å blande den andre flytende prøvealiquoten med en fast bærer bestående hovedsakelig av en fast matriks med fastfasebundne tredje monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I og utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201 som begge er avledet fra ikke-humane pattedyr immunisert med humant HDL, og fjerde monoklonale paratopiske molekyler operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel som utskilles av begge hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201, og ikke er de tredje paratopiske molekyler bundet til den faste matriks, idet overflaten på bæreren har blokkerte ikke-spesifikke bindingsseter, (ii) holde den andre blanding av fast og flytende fase under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de tredje paratopiske molekyler og de indikasjonsmiddelbundne fjerde paratopiske molekyler kan reagere immunologisk med i det vesentlige alt apolipoprotein A-I som er til stede i prøvealiquoten, hvorved det dannes en fastfasebundet sandwichimmunoreaktant og en flytende fase, (iii) separere den faste og den flytende fase, og (iv) bestemme mengden av indikasjonsmiddelbundet apolipoprotein A-I-holdig sandwichimmunoreaktant som er til stede i den fraskilte faste fase, og derved mengden av apolipoprotein A-I i et enhetsvolum av prøve.

Det er foretrukket at også de to ovenfor nevnte blandingstrinn utføres hovedsakelig samtidig og at de ovenfor nevnte, to opprettholdelsestrinn utføres sammen. Således blandes igjen de fastfasebundne paratopiske molekyler, de enzymbundne paratopiske molekyler og prøvealiquoten hovedsakelig samtidig og opprettholdes inntil den faste og flytende fase separeres. Ved særlig foretrukne utførelsesformer ut-føres de ovenfor nevnte analyser med hensyn på apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I under benyttelse av de foretrukne utførelsesformer slik at i hver analyse blandes de fastfase-bundne monoklonale paratopiske molekyler, de paratopiske molekyler bundet til enzymindikerende middel i væskefase og prøve-aliquoten hovedsakelig samtidig og opprettholdes deretter i et tidsrom som er tilstrekkelig til at begge paratopiske molekyler i hver blanding reagerer immunologisk med hovedsakelig alt av de respektive apolipoproteiner B-100 og A-I som er til stede i hver blanding.

I alle de ovenfor nevnte analyser er det foretrukket at de førstnevnte, fastfasebundne monoklonale paratopiske molekyler er de som utskilles av hybridomet med ATCC deponeringsnummer HB 8746, og at de tredje, fastfasebundne paratopiske molekyler er de som utskilles av hybridomet med ATCC deponeringsnummer HB 9200.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen utgjør et diagnostisk system egnet for bruk ved bestemmelse av forholdet mellom apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I i en flytende blod-prøve. Systemet er kjennetegnet ved at det omfatter: a) en første beholder med paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100 og utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746,

b) en andre beholder med paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100, utskilles av

ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746, men er ikke til stede i den første beholder, og som er operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel,

c) en tredje beholder med paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I og utskilles av

ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201, og

d) en fjerde beholder med paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I, utskilles av ett

av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201, men er ikke til stede i den tredje beholder, og som er operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel, idet hvert av de paratopiske molekyler er til stede i en mengde som er tilstrekkelig til å utføre en bestemmelse av forholdet.

Helst er de respektive monoklonale paratopiske molekyler som ikke er bundet til de respektive indikasjonsmidler, hver separat bundet til fastfasematrikser slik at det dannes separate fastfasebærere. Overflatene på hver av disse bærerne har ikke-spesifikke proteinbindende seter blokkert. De faste matriksene av disse faste bærerne utgjør beholderen eller pakningen for de respektive paratopiske molekyler.

Det skal forståes at selv om de paratopiske molekyler er gitt nummere; dvs. første, andre, tredje og fjerde, noe som også gjelder for pakningene som inneholder dem i diagnostiske systemer, er disse numrene bare benyttet for identifikasjons-formål og angir ikke den rekkefølge hvorved de paratopiske molekyler blandes inn i en prøvealiquot, eller som de embal-lerte innhold benyttes i. Likeledes skal det forståes at de tidligere beskrevne blandinger er blitt tildelt nummer som er like med numrene til de paratopiske molekyler som tilblandes, men at disse blandingene ikke behøver å bli dannet i den angitte rekkefølge. Således kan f.eks. blanding av den tidligere beskrevne andre aliquot med de tredje og fjerde monoklonale paratopiske molekyler tidsmessig skje før blandingen av den tidligere beskrevne første aliquoten med de første og andre paratopiske molekyler. På samme måte kan, som allerede angitt, de første og andre paratopiske molekyler bli tilblandet hovedsakelig samtidig.

Foreliggende oppfinnelse har flere nytteverdier og fordeler. Iøynefallende blant disse nytteverdier og fordeler er det faktum at det ved anvendelse av de analysemetoder som er beskrevet nedenunder kan det oppnåes en markør for unormal lipidmetabolisme som korrelerer med kransarteriesykdom (CAD), og som er nøyaktig og pålitelig.

En annen nytteverdi og fordel ved foreliggende oppfinnelse er at analysene kan utføres med den ønskede nøyaktig-het og presisjon i løpet av et forholdsvis kort tidsrom, f.eks. innen et tidsrom på ca. 1 time, dersom dette er ønskelig.

Nok en annen nytteverdi og fordel ved foreliggende oppfinnelse er at selv om fremgangsmåten gir svært nøyaktige og presise målinger for apo B-10 0, apo A-I og forholdsmarkøren, oppnåes disse målingene uten anvendelse av radioaktive grunnstoffer og de skader som bruken av slike grunnstoffer vanligvis gir.

Ytterligere nytteverdier og fordeler ved foreliggende oppfinnelse vil være åpenbare for fagfolk innen teknikken ut fra den nærmere beskrivelse av oppfinnelsen som følger nedenunder.

Det vises til tegningene som utgjør en del av be-skrivelsen, hvor: Figur 1 er en grafisk fremstilling som viser prosent-125

andelen av I-merkede LDL-partxkler bundet (ordinat) ved økende molare konsentrasjoner av monoklonalt antistoff MB47 [abscisse: Ab-konsentrasjon (MB47)] i en væskefase-radioimmuno-analyse (RIA).

LDL ble fremstilt fra sammenslått plasma fra 10 individer (-----) eller fra et individ med normale lipidemiske egenskaper ( ). Plasma ble erholdt ved plasmaforese av individer etter en omtrent 12-timers fasteperiode.

Figur 2 inneholder to grafiske fremstillinger. Grafisk fremstilling A viser evnen til en kjent, konstant mengde pepperrotperoxidase-merkede MB47-molekyler (HRPO-MB47) når det gjelder å reagere immunologisk med fastfase-bundet reagens apo B-100

i nærvær av økende mengder MB2 4-molekyler. Ordinaten er i relative enheter for optisk tetthet mens abscissen er i enheter som angir mikrogram pr. milliliter (ug/ml) ikke-merket antistoff protein tilsatt som konkurrent.

En konstant mengde (20 ug) HRPO-koblede MB47-molekyler ble i det vesentlige samtidig blandet med økende mengder ikke-merkede MB47-(0 ) eller ikke-merkede MB24-( A ) molekyler og fastfasebundet reagens apo B-100 (LDL). Blandingene ble opprettholdt i et tidsrom på 3 timer ved 25°C for derved å la MB24 og MB47 paratopiske molekyler reagere immunologisk med reagenset apo B-100 og danne en fastefasebundet immunoreaktant. Mengden av fastfasebundet merket MB47 ble så ana-l<y>s<er>t som beskrevet i den delen av avsnittet vedrørende materialer og metoder som omhandler kompetitiv ELISA.

Grafisk fremstilling A viser at tilstedeværelsen av økende mengder av ikke-merkede MB47 paratopiske molekyler i immunoreaksjonsblandingen tilsvarende nedsetter mengden av merkede MB47-molekyler bundet som fastfase-immunoreaktanten. Ikke-merket MB47 konkurrerer således med merket MB47 om LDL.

Grafisk fremstilling A viser også at økende mengder

av ikke-merkede MB24-molekyler ikke nedsetter mengden av merket MB47 bundet som fastfaseimmunoreaktant i betydelig grad. Ikke-merkede MB24-molekyler konkurrerer således ikke med merkede MB47-molekyler om binding til LDL.

Grafisk fremstilling B viser at lignende resultater fåes når det anvendes HRPO-merkede MB24-molekyler og ikke-merkede MB47-molekyler. MB47 og MB24 paratopiske molekyler binder seg derfor til forskjellige epitoper som separeres tilfredsstillende på overflaten av apo B-100 slik at binding av begge molekylene til et enkelt apo B-100 molekyl muliggjøres uten sterisk konkurrering med og inhibering av det andre molekylets binding.

Figur 3 inneholder to grafiske fremstillinger merket

A og B. Grafisk fremstilling A viser evnen til en kjent, konstant mengde (0,375 ug/ml) pepperrotperoxidase-merkede AI-10-molekyler når det gjelder å reagere immunologisk med fastfasebundet reagens apo A-I i nærvær av økende mengder ikke-merkede AI-10-(A ) og AI-11-(B ) molekyler. Ordinaten er i enheter for optisk tetthet, mens abscissen er mikrogramenheter (ug) av ikke-merkede, konkurrerende monoklonale antistoffer tilsatt. Denne undersøkelse er lik med den som ble omtalt for fig. 2, og er nærmere omtalt i avsnittet vedrørende materialer og metoder.

Grafisk fremstilling A viser at økende mengder ikke-merkede AI-10-molekyler i immunoreaksjonsblandingen tilsvarende nedsetter mengden av merket AI-10 bundet som fastfase-immunoreaktanten. Således konkurrerer ikke-merket AI-10 med merket AI-10 om apo A-I.

Grafisk fremstilling A viser også at økende mengder ikke-merkede AI-11-molekyler ikke i betydelig grad nedsetter mengden av merkede AI-10-molekyler bundet som fastfaseimmunoreaktant. Ikke-merkede AI-11-molekyler konkurrerer således ikke med merkede AI-10-molekyler om binding til apolipoprotein

A-I.

Grafisk fremstilling B viser at lignende resultater fåes når HDL brukes som antigen med en konstant mengde (0,375 ug/ml) HRPO-merkede AI-10-molekyler og ikke-merkede AI-11-molekyler ( A ) og AI-10-molekyler (■ )• AI-10- og AI-11-molekyler binder seg således til forskjellige epitoper som er tilfredsstillende adskilt på overflaten av apo A-I eller apo A-I på HDL, slik at binding av begge monoklonale antistoffmolekyler til et enkelt apo A-I-molekyl uten sterisk konkurrering med og inhibering av det andre molekylets binding, muliggjøres.

I. Generell omtale

A. Definisjoner

Uttrykket "antistoff" refererer til et molekyl som

er et medlem av en familie av glycosylerte proteinerLkalt immuno-globuliner som spesifikt kan danne forbindelse med et antigen. Et slikt antistoff danner forbindelse med sitt antigen ved hjelp av en spesifikk immunologisk bindingsreaksjon mellom antigenets antigene determinant og antistoffets antistoffbindingssete.

Et "antistoffbindingssete" er den strukturelle del av et antistoffmolekyl som består av variable og hypervariable områder av tung og lett kjede som spesifikt binder antigen.

Når nomenklaturen til Jerne (1974) Ann. Immunol. ( Inst. Pasteur), 125C;373-389, brukes, refereres et antistoffbindingssete her vanligvis til som en "paratop".

Antistoffbindingssete-holdige (paratop-holdige) poly-peptiddeler av antistoffer er de deler av antistoffmolekyler som inneholder paratopen og binder seg til et antigen, og omfatter f.eks. Fab-, Fab'-, F(ab')2~°9 F(v)-delene av antistoffene. Fab- og F(ab<*>)2~delene av antistoffer fremstilles ved hjelp av den proteolytiske omsetning med henholdsvis papain og pepsin på hovedsakelig intakte antistoffer ved hjelp av fremgangsmåter som er godt kjente. Se f.eks. US patent-skrift nr. 4 342 566. Fab<1->antistoffdeler er også godt kjente og fremstilles fra F(ab')2~deler etterfulgt av reduksjon av disulfidbindingene som binder de to tunge kjededelene sammen, slik som med mercaptoethanol, og etterfulgt av alkylering av det resulterende proteinmercaptan med et reagens, slik som jodacetamid. Intakte antistoffer er foretrukket, og benyttes som illustrerende for de monoklonale ligandmolekyler ifølge oppfinnelsen.

Ordet "antigen" har historisk blitt brukt til å betegne et objekt som bindes av et antistoff, og også til å betegne objektet som induserer fremstillingen av antistoffet. Nyere bruk begrenser betydningen av antigen til det objekt som bindes av et antistoff, mens ordet "immunogen" brukes for det objekt som induserer antistoffproduksjon. Når et objekt som her er omtalt, er både immunogent og antigent, vil det generelt bli betegnet et antigen.

Uttrykket "antigen determinant" refererer til den aktuelle strukturelle del av antigenet som bindes immunologisk av et antistoffbindingssete. Nomenklaturen til Jerne redefi-nerer en antigen determinant som en "epitop".

Uttrykket, "biologisk aktiv" refererer i det minste til et proteinmolekyls evne til spesifikt å binde antigen eller spesifikt antistoffbindingssete, selv om annen generell eller effektorevne også kan være tilstede i molekylet.

Biologisk aktivitet av et paratopisk molekyl som inneholder et antistoffbindingssete bevises gjennom den immunologiske reaksjon mellom paratopen (antistoffbindingssetet) og dens epitop (den antigene determinant) etter sammenblanding i et vandig medium slik at det dannes en immunoreaktant, i det minste ved fysiologiske pH-verdier og ionestyrker. Fortrinnsvis opptrer biologisk aktivitet under biologiske analysebetingelser; dvs. de betingelser hvor et monoklonalt paratopisk molekyl som kan benyttes i denne oppfinnelse, binder seg til epitopen (den antigene determinant) innenfor et pH-verdiområde på ca. 5 til ca. 9, ved ionestyrker slik som i destillert vann og til omtrent 1 mol natriumklorid, og ved temperaturer på ca. 4°C til ca. 45°C. De monoklonale paratopiske molekyler som her kan anvendes, er alle biologisk aktive.

"ELISA" refererer til en enzymbundet immunosorbentana-lyse hvor det anvendes et antigen eller et antistoff bundet til en fast fase og et enzym-antistoff- eller enzym-antigen-konjugat for å påvise og kvantifisere mengden av antigen eller antistoff som er tilstede i en prøve. En beskrivelse av ELISA-teknikken finnes i kapittel 2 2 i fjerde utgave av Basic and Clinical Immunology av D.P. Sites et al., utgitt av Lange Medical Publications, Altos, CA i 1982, og i US patentskrifter nr. 3 654 090, 3 850 752 og 4 016 043.

"Enzym" refererer til et protein som er i stand til

ved katalytisk virkning å akselerere eller gi en eller annen endring i et substrat som det ofte er spesifikt for.

"Immunoreaktant" refererer slik det her er brukt, til produktet av en immunologisk reaksjon; dvs. det objekt som fremstilles når et antigen bindes immunologisk av et antistoff eller et molekyl som inneholder en paratop. En immunoreaktant er derfor en bestemt type kompleks dannet mellom molekyler.

Uttrykkene "indikasjonsmiddel", "enzymindikasjonsmiddel" eller "markør" brukes vekselvis her i forskjellige grammatikalske former for å referere til enzymer som er direkte involvert i fremstillingen av et påvisbart signal for å indikere deres nærvær. Paratopiske molekyler refereres her også til som enzymbundne paratopiske molekyler når de er bundet til enzymmarkører.

Uttrykket "helt antistoff" brukes her til å skjelne

et fullstendig, intakt molekyl utskilt av en celle fra andre, mindre molekyler som også inneholder paratopen som er nødven-dig for biologisk aktivitet i en immunoreaksjon med en epitop.

De paratopiske molekyler som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse, er monoklonale paratopiske molekyler. Et "monoklonalt antistoff" (Mab) er et antistoff som er fremstilt av kloner av et hybridom som bare utskiller ett slag antistoffmolekyl, og et monoklonalt paratopisk molekyl er et monoklonalt antistoff eller en paratopholdig polypeptiddel derav, som er omtalt nedenunder. Hybridomcellen er sammensmeltet av en antistoffproduserende celle og et myelom eller en annen selv-forevigende cellelinje. Slike antistoffer ble først beskrevet av Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497 (1975).

Uttrykkene "monoklonalt paratopisk molekyl" og "paratopisk molekyl" alene brukes vekselvis og samlet her for å referere til slekten av molekyler som inneholder et bindings-sete i et monoklonalt antistoff, og omfatter et helt monoklonalt antistoff, et i det vesentlige helt monoklonalt antistoff og en antistoffbindingssete-holdig del av et monoklonalt antistoff. De hele monoklonale antistoffer betegnet MB47, MB24, AI-10 og AI-11 er paratopiske molekyler ifølge oppfinnelsen, og det er også deler av disse hele antistoffene som omfatter paratopen. Uttrykkene "monoklonalt paratopisk molekyl" eller "paratopisk molekyl" brukes her alene når det er ment et biolgisk aktivt molekyl som inneholder paratopen fra de ovenfor nevnte monoklonale antistoffer. Uttrykkene MB47, MB24, AI-10 og AI-11 med eller uten ordene "paratopisk molekyl" brukes når det er ment de spesifikke, hele antistoffene som produseres av hybridomene ATCC HB 8742, HB 8746, HB 9200 eller HB 9201.

Ordene "utskille" og "produsere" brukes ofte vekselvis innen teknikken om celler hvorfra antistoffmolekyler fåes. Celler som produserer antistoffer kan imidlertid ikke utskille disse molekylene i omgivelsene. Hybridomcellene som her er av interesse, utskiller monoklonale antistoffer i omgivelsene. Ikke desto mindre refereres her slike celler noen ganger til som "antistoffproduserende" celler og deres antistoffer refereres noen ganger til som "produsert" for å holde seg til uttrykket som benyttes innen teknikken. Paratop-holdige poly-peptiddeler av de ovenfor nevnte antistoffer refereres her likeledes til som "produserte" eller "utskilte", selv om det skal forståes at slike molekyler fremstilles fra antistoffer som selv er "produsert" eller "utskilt".

Uttrykkene "supernat" og "supernatant" brukes her vekselvis og refererer til det in vitro væskemedium hvor celler dyrkes. Monoklonale antistoffer produsert av hybridomkulturene som her er av interesse, utskilles i sine kulturmediumomgiv-elser. Derfor er kulturmediumsupernatet for disse cellene en foretrukket kilde for det monoklonale paratopiske molekyl,

og lar seg lett erholde i en form fri for hybridomceller ved hjelp av godt kjente teknikker. Et eksempel på slike teknikker er sentrifugering ved lav hastighet for å sedimentere celler ut fra væskemediet. Monoklonale paratopiske molekyler kan alternativt fåes fra ascitestumorvæske. (ascitesvæske) fra labo-ratoriedyr hvori hybridomvevet ble innført. Begge metodene er beskrevet nedenunder.

Uttrykket "hovedsakelig samtidig" slik det her er brukt i forhold til blandingen av tre eller flere antigen-

og paratopiske molekylbestanddeler for å danne en immunoreaksjonsblanding, betyr at alle bestanddelene er tilstede og blandet i en enkel blanding innen ca. 15 minutter, og fortrinnsvis innen ca. 5 minutter fra blandingen av hvilke som helst av to åv bestanddelene.

Uttrykket ."hovedsakelig alt" slik det her er brukt i forhold til immunoreaksjonen mellom et paratopisk molekyl og dets antigen, enten apolipoprotein B-100 som LDL, eller apolipoprotein A-I som HDL, for å danne en immunoreaktant, betyr at det paratopiske molekyl reagerer immunologisk med minst ca. 90% av antigenet som er tilstede i oppløsning slik at immunoreaktanten dannes når det paratopiske molekyl er tilstede i overskudd. Ved foretrukket utøvelse danner det paratopiske molekyl en immunoreaktant med mer enn 95% av det antigene molekyl som er tilstede, når det paratopiske molekyl også er til stede i overskudd.

B. Hybridomer og monoklonale paratopiske molekyler

Ved foreliggende oppfinnelse benyttes to par av to paratopiske molekyler som utskilles av fire hybridomer. Ett par av paratopiske molekyler reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100. Det andre par reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I.

Hybridomene som utskiller paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apo B-100, bærer laboratoriebeteg-nelsene HL130C2.3C5 og V82A6.1G4, og de hele monoklonale paratopiske molekyler som utskilles av disse hybridomene, refereres vanligvis her til som henholdsvis MB47 og MB24. Hver av de paratopiske molekyler utskilt av disse hybridomene reagerer

125

immunologisk med mer enn ca. 90% av I-LDL, og med en sær-skilt og separat bevart antigen determinant på apo B-100. Som det vil sees ved undersøkelse av de grafiske fremstillinger A og B i figur 2, binder de paratopiske molekyler MB47 og MB24 seg begge til apo B-100, idet hver av dem gjør det uten i vesentlig grad å inhibere den immunologiske reaksjon til det andre molekylet. Som påpekt i Young et al. (1986) Clin. Chem., 32/ 8:1484-1490, reagerer MB47 bare med apo B-100, mens MB24 reagerer immunologisk med apo B-100 samt kryssreagerer med apo B-48 og også med apo B-26, et fragment av apo B-100 som er omtalt nedenunder.

Det andre par med hybridomer har laboratoriebetegn-elsene H91H4.2H8 og H103D8.1D11, og utskiller paratopiske molekyler betegnet henholdsvis AI-10 og AI-11.Hvert av disse paratopiske molekyler AI-10 og AI-11 reagerer immunologisk med en bevart antigen determinant på apo A-I og reagerer

125

immunologisk med mer enn ca. 90% av I-HDL-partikler i en fastfase-ELISA. Som det sees ved undersøkelse av de grafiske fremstillinger A og B i figur 3., binder begge paratopiske molekyler AI-10 og AI-11 seg til apo A-I og HDL, men virker ikke i vesentlig grad inn på hverandres binding.

Hver av de ovenfor nevnte fire hybridomer ble deponert ved American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD,

i overensstemmelse med Budapest-Konvensjonen om internasjonal godkjennelse av deponering av mikroorganismer for patenterings-formål.

De ovenfor nevnte deponeringer ble gjort i overensstemmelse med Budapest-Konvensjonens krav om at varigheten av deponeringen skal være 30 år fra deponeringsdatoen eller 5 år fra den siste forespørsel etter deponeringen ved deponeringsinstitusjonen, eller så lenge et patent i USA som skriver seg fra denne søknad, er gyldig, idet det tidsrom som varer lengst skal gjelde. Hybridomene vil bli komplettert dersom de blir ikke-levedyktige ved deponeringsinstitusjonen, og vil bli gjort tilgjengelig for almenheten av ATCC etter at et patent er blitt bevilget.

Tidligere rapporterte Curtiss et al., (1982) J. Biol. Chem., 257;15213-15221, produksjon og karakterisering av 11 apo B spesifikke paratopiske molekyler, deriblant de betegnet MB24 produsert av hybridom HB 8742. Hybridom HB 8742 ble erholdt ved å fusjonere splenocytter fra mus immunisert med human VLDL med myelomcelier.

MB24 ble påvist å reagere immunologisk med denaturert apo B-100 som er tilstede i VLDL og LDL, samt denaturert apolipoprotein B-26 fra LDL og et ikke-identifisert LDL-protein med høy molekylvekt i den tidsskriftartikkelen. Nyere arbeide indikerer at det bandt apo B-100. MB24 ble påvist å reagere immunologisk med 100% av tilført naturlig forekommende LDL-antigen i en væskefase-RIA iTsao. et al. (1982) J. Biol. Chem. 15222-15228.

IgG-fraksjonen fra MB24-holdig ascitesvæske frembragt ved intraperitoneal dyrking av HB 8742, ble karakterisert ved hjelp av isoelektrisk fokusering (IEF). Som angitt i Curtiss et al., (1982) J. Biol. Chem., 257:15213-15221, ble fusjonen utført ved å bruke P3x63Ag8 myelomceller som utskiller et IgG^k immunoglobulin (myelomprotein). Etter IEF oppviste derfor HB 8742 ascitesvæske et unikt mønster av multiple proteinbånd som representerer tilfeldig blandede immunoglobulinmole-kyler som inneholder tung og lett kjede, i tillegg til P3x63Ag8 myelom IgG^k antistoffet og de paratopiske molekyler MB24.

Hybridom HB 8746 produserer MB47 paratopiske molekyler og ble dannet ved å fusjonere splenocytter fra mus immunisert med LDL og P3x63Ag8.653.1 myelomceller. Det monoklonale antistoff og hybridom ble rapportert av Young et al. (1986) Arteriosclerosis, 6^:178-188. Den varietet av opphavsmyelom-cellelinjen som ble benyttet til å fremstille hybridomet, utskiller ikke et myelomprotein. IEF av HB 8746 ascitesvæske av-slører et unikt mønster av proteinbånd som representerer de IgG2a tunge og kappa-lette kjeder i MB47.

Således kan de ovenfor nevnte hybridomer delvis karak-teriseres ved hjelp av IEF-mønsteret til de paratopiske molekyler som de utskiller. Mens hybridomet HB 8742 produserer mer enn én type paratopisk molekyl, kan de paratopiske molekyler som kan benyttes ved denne oppfinnelse, lett identi-fiseres og isoleres ved hjelp av deres individuelle evne til å reagere immunologisk med epitop (antigene determinanter) på apo B-100.

De antigene spesifisiteter til MB24 og MB47 ble under-søkt ved å analysere deres individuelle evne til å reagere immunologisk med apoproteiner erholdt fra kylomikroner, VLDL, LDL og HDL i forskjellige analyser. De derved erholdte data indikerte at MB47 og MB24 reagerer immunologisk med apo B-100 erholdt fra LDL, VLDL og IDL, men ikke apo B-48 fra VLDL eller kylomikroner, og ikke med HDL. Fab-fragmenter av MB47 og MB24 binder seg også til LDL i fastfase-RIA.

Tidligere undersøkelser har vist antigen heterogenitet i apo B-100. Dvs. at noen apo B-100-epitoper ikke uttrykkes av alle LDL-partikler. Blanding med et overskudd av visse monoklonale antistoffer i en væskefase-RIA resulterer således ikke i immunologisk binding av alle radioaktivt merkede LDL-partikler (<125>I-LDL).

For å bestemme hvorvidt epitopene gjenkjent av MB47-molekyler ble uttrykt enhetlig av alle LDL, ble evnen til MB47 når det gjelder å binde seg immunologisk til <125> I-LDL i en væskefase-RIA undersøkt. LDL isolert fra sammenslått plasma fra 10 normale individer og fra et enkelt normalt individ ble merket radioaktivt som beskrevet nedenunder og ble blandet med biologisk aktive MB47-molekyler slik at det ble dannet en immunoreaksjonsblanding. Blandingen ble holdt under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som var tilstrekkelig til at MB47-molekylene kunne binde seg immunologisk til apo B-100 i hver prøve og danne et immuno-reaks jonsprodukt (immunoreaktant).

125

Den maksimale mengde av I-LDL bundet av et overskudd av de paratopiske MB47-molekylene ble analysert ved ut-felling av alle reseptormolekyler med IgSORB og kvantifisering

125

av I-LDL-forbundne tellinger i utfellingen i en gamma-teller.

125

Resultatene uttrykt som en prosentandel av I-LDL utfelt

ved hjelp av trikloreddiksyre (TCA) og vist i figur 1, demon-125

strerer at praktisk talt all I-LDL ble bundet av antistoff, noe som indikerer at epitopen gjenkjent og bundet av MB47 uttrykkes av alle LDL-partikler.

For analysefremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse må de første og andre monoklonale paratopiske mole-

kyler binde seg til forskjellige epitoper av apo B-100-molekylet, og separeres tilstrekkelig slik at bindingen av ett paratopisk molekyl ikke sterisk hindrer bindingen av det andre paratopiske molekyl. Evnen til MB47 og MB24 når det gjelder kompetitivt å inhibere bindingen av hverandre til fastfase-festet reagens apo B-100, ble derfor undersøkt.

Resultatene av denne undersøkelsen, som er vist i

figur 2, indikerer at et 70-gangers overskudd av ikke-merket MB24 ikke inhiberer peroxidasémerket MB47 signifikant fra binding til reagens apo B-100. Likeledes inhiberer et 70-gangers overskudd av ikke-merket MB47 ikke signifikant peroxidase-merket MB24 fra binding til reagens apo B-100. Således binder MB24 og MB47 seg til forskjellige epitoper på

apo B-100 og disse epitopene er tilstrekkelig adskilt slik at MB24 og MB47 som intakte antistoffer ikke inhiberer bindingen av hverandre til et enkelt apo B-100-molekyl.

Hybridomene som produserer monoklonale paratopiske molekyler AI-10 og AI-11, ble fremstilt fra to separate fusjoner av mus-splenocytter med celler av musmyelomlinje P3x6Ag8.653. Human HDL ble brukt som immunogen. AI-10-molekyler tilhører IgG2a-klassen, mens AI-11-molekyler tilhører IgGl-klassen.

Som det kan sees av en undersøkelse av figur 3, reagerer både AI-10 og AI-11 immunologisk med apo A-I. Dataene i figur 3 illustrerer videre at immunoreaksjonen til hver av AI-10 og AI-11 med apo A-I eller HDL ikke virker inn på immunoreaksjonen til den andre med det antigenet.

125 Bindingsundersøkelser under anvendelse av I-HDL 125

og I-apo A-I ble utført under anvendelse av RIA-teknikker som beskrevet generelt i Curtiss et al. (1985) J. Biol. Chem., 260;2982-2993. Resultatene fra disse undersøkelsene er vist i tabell 1 nedenunder som prosentandeler av total mengde trikloreddiksyre (TCA)-utfellbar radioaktivitet.

Dataene i tabell 1 illustrerer den forholdsvis store grad av binding av hele AI-10 og AI-11 til radioaktivt merket HDL i den anvendte væskefaseanalyse. Disse dataene gjenspeiler også den relative ustabilitet til, og resulterende lave grad av binding til apo A-I. Den relative ustabilitet til apolipoprotein A-I har nødvendiggjort bruken av HDL som en andre standard i apo A-I-analysen, slik det er nærmere omtalt nedenunder. Dataene ovenfor illustrerer også en forholdsvis lavere bindingsgrad for AI-11 til apo A-I enn til HDL-partikler. Ikke desto mindre indikerer en sammenligning av data erholdt under anvendelse av ELISA-metoden for apo A-I med data erholdt ved hjelp av andre, mer besværlige teknikker, at ELISA-metoden påviser kvantitativt praktisk talt all apolipoprotein A-I (HDL) som er til stede i de analyserte prøver.

C. Markør for unormal lipidmetabolisme

Som tidligere angitt har flere undersøkelser vist en korrelasjon mellom høye nivåer av LDL med forholdsvis lave nivåer av HDL og unormal lipidmetabolisme som fører til en forøkt risiko for CAD. Unormal lipidmetabolisme er også viktig for å overvåke sykdomsforløpet hos personer som er blitt diag-nostisert klinisk til å ha CAD. Disse undersøkelsene har imidlertid ikke tilveiebragt en markør og en klar skillelinje mellom de personene som er normale og de som utviser unormal lipidmetabolisme.

Således målte f.eks. Kottke et al. (1986) Mayo Clin. Proe. 6J_: 313-320, serumnivåene av apolipoproteinene A-I, A-2 og B, HDL-kolesterol, triglycerider og alder som variable størrelser hos personer av hankjønn, og fant at bruken av alle disse seks variable størrelsene var påkrevet for å skille CAD-pasienter nøyaktig fra asymptomatiske kontroller. Disse forskerne benyttet radioimmunoanalyser for bestemmelsene av apolipoproteiner.

Polyklonale antistoffer, en opprettholdelsestid på

16 timer for antistoffprøve, og en avmaskerende detergentbe-handling ble angitt å være benyttet for RIA-målingen av apo A-I-verdier hos Kottke et al. Et monoklonalt antistoff ble rapportert å være benyttet for RIA-målingen av apo B. Kottke et al. rapporterte gjennomsnittsverdier for apo A-I i serum hos normale individer og CAD-pasienter som ikke overlappet innenfor ett standardavvik. Deres verdier for gjennomsnittlig serum apo B mellom de to gruppene overlappet innenfor ett standardavvik. Disse forskerne rapporterte ikke et forhold mellom sine verdier for apo B og apo A-I.

I tillegg rapporterte Bentzen et al. (1982) Clin. Chem. 28:1951-1956, anvendelse av et forhold mellom 3-lipoprotein-kolesterol (LDL-kolesterol) og a-lipoprotein-kolesterol (HDL-kolesterol) som en markør for å indikere en pasients risiko for slag eller koronar hjertesykdom sammenlignet med anvendelse av verdien for HDL-kolesterol alene. Verdier for lipopro-teinkolesterol er selvfølgelig forskjellige fra LDL og apo B-100 eller HDL og apo A-I, og fremgangsmåten som ble brukt

av disse forskerne, som var basert på affinitetskromatografi over heparinagarose, adskiller seg mye fra den fremgangsmåte som her er benyttet.

II. Den forbedrede fremgangsmåte

I henhold til foreliggende oppfinnelse benyttes forholdet mellom apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I i en flytende blodprøve som en markør for en unormal lipidmetabolisme hos personer som ikke er blitt identifisert som syke, samt hos diagnostiserte CAD-pasienter. Så snart CAD eller unormal metabolisme er blitt identifisert ved hjelp av analysefremgangsmåten, behandles personen vanligvis ved hjelp av konvensjonell terapi, slik som trening, kosthold eller bestemte legemidler, noe som er godt kjent.

En flytende blodprøve benyttes ved denne fremgangsmåte. Prøven kan enten være serum eller plasma ettersom resultater erholdt under anvendelse av begge disse er funnet ikke å kunne skjelnes fra hverandre statistisk. Noen resultater som er rapportert nedenunder under anvendelse av fremgangsmåten ble faktisk oppnådd ved å bruke gjennomsnittsverdier erholdt fra analyser av både serum og plasma. Uansett om det brukes serum eller plasma erholdes den flytende blodprøve fortrinnsvis fra personer som har fastet i minst ca. 12 timer, noe som er kjent innen teknikken. En slik blodprøve refereres til som en "faste"-prøve.

Det var overraskende at nøyaktige og presise resultater kunne fåes ved å benytte de foreliggende ELISA-metoder med en flytende blodprøve, slik som plasma eller serum, ettersom disse prøvematerialene inneholder proteiner, lipider og andre forbindelser som kunne forventes å virke inn på analysen. Se f.eks. Maggio, Enzyme- Immunoassay, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL, 1980, side 65.

Ved den forbedrede fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen oppdeles blodprøven i minst to aliquoter. En prøvealiquot benyttes til bestemmelsen av apo B-100 og den andre til bestemmelsen av apo A-I.

Idet man starter med analysen med hensyn på apolipoprotein B-100, dannes en første blanding av fast og flytende fase ved å blande en på forhånd bestemt mengde av en første flytende blodprøvealiquot med en fast bærer som hovedsakelig består av en fast matriks med fastfasebundne første monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apo B-100. Disse fastfasebundne første monoklonale paratopiske molekyler er til stede i overskudd i forhold til mengden av apo B-100 som forventes å være i prøven, og utskilles av ett av hybridomene som har ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746 som er avledet fra ikke-humane pattedyr immunisert med henholdsvis humant VLDL og humant LDL. Ikke-spesifikke proteinbindingsseter på overflaten av den faste bærer blokkeres før denne blanding.

Den første blanding av fast og flytende fase opprettholdes under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de første paratopiske molekyler reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100 som er til stede i prøvealiquoten og danner en fastfase-bundet immunoreaktant som inneholder hovedsakelig alt apolipoprotein B-100 som er til stede i prøvealiquoten.

Apo B-100 i den første prøvealiquot blandes også med de andre monoklonale paratopiske molekyler i væskefase som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100 slik at det dannes en andre blanding. Disse andre monoklonale paratopiske molekyler utskilles av ett av hybridomene som har ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746, men som ikke utnyttes i den førstnevnte blanding. Disse andre paratopiske molekyler er også operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel.

Den andre blanding opprettholdes under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de andre, enzymbundne paratopiske molekyler kan danne en immunoreaktant som inneholder hovedsakelig alt

apolipoprotein B-100 i prøvealiquoten.

De faste og flytende faser som fåes fra blandingen av begge paratopiske molekyler og dannelse av immunoreaktanter mellom begge paratopiske molekyler og apo B-100, separeres f.eks. ved skylling, og mengden av indikasjonsmiddelbundet apolipoprotein B-100-holdig immunoreaktant som er til stede i den fraskilte faste fase, bestemmes. Ettersom hvert av de to monoklonale paratopiske molekyler reagerer immunologisk med hovedsakelig alt apo B-100 som er til stede i prøvealiquoten, og fordi minst ett av de paratopiske molekyler reagerer immunologisk med en ikke-kryssreaktiv, bevart epitop på apo B-100, gir bestemmelse av mengden av enzymbundet apo B-10 0 i immuno-reaktrjvten en bestemmelse av mengden av apo B-100 som er til stede i prøvealiquoten. Mengden av apolipoprotein B-100 pr. enhetsvolum prøve kan lett beregnes ved hjelp av kjennskap til volumet av den opprinnelig benyttede, forhåndsbestemte mengde av flytende blodprøvealiquot.

Mengden av apolipoprotein A-I bestemmes ved å bruke

en andre, på forhånd bestemt mengde av flytende blodprøve-aliquot. I motsetning til fremgangsmåter, som benyttes av andre, er den andre flytende blodprøvealiquot fri for avmaskeringsbehandling, noe som er vanlig for måling av apo A-I.

Analoge trinn med de som tidligere er beskrevet for apolipoprotein B-100 følges, bortsett fra at de tredje og fjerde monoklonale paratopiske molekyler utskilt av ett av hybridomene som har ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201, som begge er avledet fra ikke-humane pattedyr immunisert med humant HDL, benyttes til den andre blodprøvealiquot. Hvis man holder seg til analogien med de tidligere beskrevne trinn, så blandes fastfasebundne tredje monoklonale paratopiske molekyler med den andre blodprøve slik at det dannes en tredje blanding av fast og flytende fase, og den tredje blanding av fast og flytende fase opprettholdes som beskrevet tidligere slik at det dannes en fastfasebundet immunoreaktant som inneholder hovedsakelig alt apolipoprotein A-I som er tilstede i prøve-aliquoten.

Apolipoprotein A-I i den andre prøvealiquot blandes også med de fjerde monoklonale paratopiske molekyler i flytende fase som er omtalt tidligere, og som ikke er de som er bundet til den faste matriks og er operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel for å danne en fjerde blanding. Den fjerde blanding opprettholdes som beskrevet tidligere i et tidsrom som er tilstrekkelig til at de fjerde, enzymbundne monoklonale paratopiske molekyler danner en immunoreaktant med hovedsakelig alt apolipoprotein A-I som er til stede i prøvealiquoten.

De faste og flytende faser som fåes fra blandings- og opprettholdelsestrinnene, separeres, og mengden av enzymindikasjonsmiddel-bundet apolipoprotein A-I-holdig immunoreaktant som er til stede i den fraskilte faste fase, bestemmes, noe som gir en bestemmelse av mengden av apolipoprotein A-I i prøvealiquoten og pr. enhetsvolum, som omtalt tidligere.

Analysene med hensyn på apo B-100 og apo A-I omtalt tidligere kan hver utføres med hvert av blandings- og opprettholdelsestrinnene i hver analyse, idet de utføres i rekke-følge, eller de to blandingstrinnene i hver analyse kan ut-føres hovedsakelig samtidig, idet de to opprettholdelsestrinnene i hver analyse utføres sammen.

Når trinnene utføres etter hverandre, er det foretrukket at de fastfasebundne monoklonale paratopiske molekyler blandes og at den dannede blanding opprettholdes før tilblanding av de enzymindikasjonsmiddel-bundne paratopiske molekyler og opprettholdelse av den resulterende blanding. Når de foretrukne, sekvensvise trinn følges, er det videre foretrukket at de dannede faste og flytende faser separeres, og at den faste fase skylles for å hjelpe til å sikre denne separasjon før tilblandingen av de flytende enzymindikasjonsmiddel-bundne paratopiske molekyler til den fraskilte faste fase og opprettholdelse av denne blanding.

Det bemerkes også at de enzymindikasjonsmiddel-bundne paratopiske molekyler kan være de første som blandes til den passende prøvealiquot. Når denne utførelsesform av fremgangsmåten benyttes, skjer det ingen separasjon av faser før tilblanding av de fastfasebundne monoklonale paratopiske molekyler .

Både for analysen av apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I er det mest foretrukket at de fastfasebundne monoklonale paratopiske molekyler, blodprøvealiquoten og de enzymindikasjonsmiddel-bundne paratopiske molekyler tilblandes hver for seg hovedsakelig samtidig, og at hver av de resulterende blandinger av fast og flytende fase opprettholdes sammen. Hver blanding opprettholdes således i et tidsrom som er tilstrekkelig til at de to separate fastfasebundne monoklonale paratopiske molekyler kan danne fastfasebundne immunoreaktanter med hovedsakelig alt av henholdsvis apo B-100 og apo A-I, og til at de to enzymindikasjonsmiddel-bundne paratopiske molekyler i flytende fase også kan reagere immunologisk med hovedsakelig alt av henholdsvis apo B-100 og apo A-I i de respektive prøvealiquoter. De derved dannede immunoreaktanter refereres til som fastfasebundne sandwich-immunoreaktanter. Det er også til.stede en flytende fase.

Det ble oppnådd lignende resultater når man brukte hver av de monoklonale paratopiske molekyler i de to setene av paratopiske molekyler som de fastfase-bundne paratopiske molekyler i de respektive analyser. Mesteparten av det arbeidet som her er omtalt, ble imidlertid utført ved å bruke molekylene som ble utskilt av hybridomet med ATCC deponeringsnummer HB 8746 (MB47) bundet til den faste matriks når apolipoprotein B-100 ble analysert, og molekylene utskilt ved hjelp av hybridomet med ATCC deponeringsnummer HB 9200 (AI-10) bundet til fastfasematriksen når apolipoprotein A-I ble analysert.

I tillegg er det spesielt foretrukket å bruke MB47 som de fastfase-bundne paratopiske molekyler ettersom disse molekylene ikke reagerer immunologisk med apo B-48 som kan være tilstede i kylomikroner i blodprøver fra ikke-fastende individer eller hos personer med unormalt høye kylomikronnivåer. Bindingen av kylomikroner til den faste bærer kan således, på grunn av deres store størrelse, virke inn på den ytterligere binding av hovedsakelig alt apo B-100 (LDL), selv når mengden av fastfase-bundne paratopiske molekyler er i overskudd i forhold til apo B-100 i den analyserte prøve.

Eksempler på faste matrikser som kan brukes ved frem-gangsmåtene nevnt ovenfor, er godt kjent innen teknikken og omfatter en fast matriks, slik som 96-brønners mikrotiterplater solgt under betegnelsen Falcon Microtest III Flexible Assay Plates, eller en mikrotiter-strimmel som inneholder 12 brønner i en rekke, slik som strimlene som selges under betegnelsen Immulon I og II. Mikrotiterstrimmelen eller -platen er laget av et klart plasmateriale, fortrinnsvis polyvinylklorid eller polystyren. Alternative faste matrikser for anvendelse i en ovenfor beskrevet fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen, omfatter polystyrenkuler, ca. 1 pm til ca. 5 mm i diameter, polystyren-rør, -pinner eller -"paddles" av hvilken som helst passende størrelse, og polystyrenlateks med polystyrenpartikler som har en størrelse på ca. 1 um og kan separeres ved sentrifugering fra det gjenværende av lateksen.

Den faste matriks kan også være laget av en rekke forskjellige materialer, slik som kryssbundet dekstran, f.eks. "Sephadex G-25, -50, -100, -200" og lignende, agarose og kryssbundet agarose, f.eks. "Sepharose 6B, CL6B, 4B, CL46" og lignende.

Enzymindikasjonsmidlet er bundet direkte til et paratopisk molekyl som kan brukes ved oppfinnelsen til å danne et konjugat. Det skal forståes at anvendbare enzymmolekyler bundet til et paratopisk molekyl er operativt bundet. Virkningen av enzymet forringes således ikke i vesentlig grad av bindingen av paratopisk molekyl, og virkningen av det monoklonale paratopiske molekyl som enzymet er bundet til, forringes heller ikke i vesentlig grad av bindingen eller tilstedeværelsen av enzymet.

Enzymindikasjonsmidlet er et biologisk aktivt enzym, slik som pepperrotperoxidase (HRPO) eller glukoseoxidase, eller lignende. Som det også er godt kjent, er det påkrevet med ytterligere reagenser for å visualisere det faktum at et antistoff-antigen-kompleks er blitt dannet når indikasjons-midlet er et enzym, slik som HRPO eller glukoseoxidase. Slike ytterligere reagenser for HRPO omfatter hydrogenperoxyd og

en forløper for et oxydasjonsfargestoff, slik som diamino-benzidin. Ytterligere reagenser som kan benyttes sammen med glukoseoxidase, omfatter glukose og 2,2'-azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS).

Teknikker for operativ sammenknytting av et enzym til et paratopisk molekyl for å danne et konjugat, er godt kjent innen teknikken. Eksempelvise teknikker er omtalt i Maggio, Enzyme- Immunoassay, kapittel 4 av Kabakoff, CRC Press, Boca Raton, FL (1980), sider 71-104.

De monoklonale paratopiske molekyler kan utnyttes slik de er erholdt fra hybridomsupernatanter eller som ascites. Det er imidlertid foretrukket at rensede paratopiske molekyler benyttes.

Flere midler for rensing av paratopiske molekyler er godt kjent innen teknikken og vanligvis benyttes kromato-grafiske teknikker. Hurtig protein-væskekromatografi (FPLC)

er den renseteknikk som her velges.

De enzymbundne konjugater med paratopisk molekyl til-føres blandingene i væskefasen. Disse molekylene oppløses vanligvis i en vannblanding. Vanlige blandinger inneholder buffer-salter, noe som er tilfellet ved de eksempelvise rensede monoklonale antistoffholdige blandinger som her er brukt, og som omfatter fosfatbufret saltoppløsning (PBS) som et fortynning smidde 1. Fortynnet ascitesvæske kan også benyttes.

Som tidligere angitt blokkeres ikke-spesifikke proteinbindingsseter på overflaten av fastfasebæreren. De fastfase-bundne paratopiske molekyler bindes således f.eks. ved adsorp-sjon eller andre godt kjente måter for festing til den faste matriks. Deretter blandes en vandig oppløsning av et protein som er frittfor gjensidig påvirkning med analysen, slik som bovint, hest- eller annet serumalbumin som også er fritt for forurensning av human apo B-100 eller apo A-I, med den faste fase for å adsorbere det tilblandede protein på overflaten av den paratopiskemolekylholdige faste bærer på proteinbindingsseter på overflaten som ikke er okkupert av det monoklonale paratopiske molekyl.

En typisk vandig proteinoppløsning inneholder ca. 3 til ca. 10 vekt% bovint serumalbumin i PBS ved en pH-verdi på

7,1 - 7,5. Blandingen av vandig proteinoppløsning og fast bærer opprettholdes vanligvis i tidsrom på minst 1 time ved 37°C og den resulterende faste fase skylles deretter fri for ikke-bundet protein.

Den flytende blodprøve kan være plasma eller serum,

som allerede angitt. Denne prøven med apo A-I fortynnes for-

trinnsvis til ca. 1:2500 - ca. 1:20.000, og helst til ca. 1:5000, før bruk for å oppnå lineære resultater i analysene som her er spesifikt beskrevet. For apo B-100 fortynnes prøven fortrinnsvis til ca. 1:500 - 1:5000, og helst til ca. 1:1000. Bruken av svakere fortynning kan gi for mye av apo-lipoproteinantigenet til blandingen og forringe lineariteten til analyseresultatene, samt redusere eller fjerne overskuddet av fastfase-bundet paratopisk molekyl i forhold til det tilblandede antigen. Bruk av mer enn ca. en 1:20.000 fortynning er tilbøyelig til å redusere nøyaktigheten.

Opprettholdelsestidene som benyttes, kan variere i stor grad med liten variasjon i resultat så lenge et minimalt tidsrom på ca. 3 0 minutter ved omgivende værelsetemperatur (ca. 20 - 25°C) benyttes. Når det er ønsket å bruke et minimalt 30-minutters opprettholdelsestidsrom, er det foretrukket at den opprettholdte blanding omrøres under dette tidsrom for å sikre i det vesentlige fullstendig immunologisk reaksjon mellom apolipoprotein og antigenet og de monoklonale paratopiske molekyler. Når det benyttes lengre opprettholdelsestider, som 1 time eller mer ved værelsetemperatur, er det ikke påkrevet med omrøring. Den ønskede omrøring kan lett tilføres ved hjelp av et gyro-rysteapparat som drives ved ca. 100 rpm. Hver av analysene som brukes ved fremgangsmåten, er i stand til å bli utført under anvendelse av opprettholdelsestider for blandingen av paratopisk molekyl og prøve som er ca. 30 minutter til ca. 6 0 minutter ved omgivende værelsetemperaturer.

Mengden av apolipoproteinantigen som er tilstede i den analyserte immunoreaktant, bestemmes ved blanding av den fraskilte enzymbundne apolipoproteinholdige faste fase med en på forhånd bestemt mengde visualiseringsreagens eller -reagenser. Når HRPO benyttes som enzymindikasjonsmiddel, blandes visualiseringsreagenser slik som hydrogenperoxyd og en oxydativ fargestofforløper slik som 0-fenylendiamin (OPD) som er tilstede i et vandig medium, med den fraskilte fastfase-bundne immunoreaktant. Den derved dannede blanding opprettholdes under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom, slik som minst ca. 30 minutter ved omgivelsestempera-ture, for at farge skal utvikles. Fargeutvikling stanses der-

etter ved blanding av et stoppreagens, slik som svovelsyre.

Den optiske tetthet til blandingen avleses deretter, sammenlignes med en standardkurveverdi og mengden av apolipopro-

tein bestemmes, noe som er velkjent.

Så snart den faste bærer og den flytende blodprøve er fremstilt, kan således hver analyse utføres ved omgivende værelsetemperatur i løpet av et tidsrom på ca. 1 time; dvs.

en 30-minutters opprettholdelsestid med omrøring for blandinger dannet fra både paratopiske molekyler og prøvealiquoten, og en annen 30-minutters opprettholdelsestid for fargeutvikling. Faktisk behøver man ikke fremstille den faste bæreren like før hver anvendelse, men slike bærere som her er beskrevet, kan heller fremstilles og lagres fuktig og tildekket under vanlige kjøleskapsbetingelser i et tidsrom på minst én måned før bruk.

Hver av apo B-100- og apo A-I-analysene benytter en standard som de optiske tetthetsverdier som fåes i ELISA-ene sammenlignes med for å beregne konsentrasjonene av de to apolipoproteinene. Ved begge analysene benyttes sekundærstandarder. Dvs. at i stedet for å benytte apo B-100 og apo A-I som standarder, benyttes det ved analysene henholdsvis human LDL og HDL som standarder. De sekundære standardene benyttes på grunn av den forholdsmessige ustabilitet ved lagring av de primære apolipoproteiner. Kottke og medarbeidere la også merke til nedbrytning av renset apo A-I brukt som en primærstandard og benyttet en sekundærstandard i sin RIA med polyklonalt serum for apo A-I. Au et al. (1986) Clin. Chem. 32:1394-1397.

Sekundærstandardene tilveiebringes vanligvis som lyofilisert LDL og HDL fra sammenslått humant plasma fra fastende individer, og rekondisjoneres før bruk. Hver av standardene er selv standardisert mot primærstandarder av apo B-100 som LDL og apo A-I som HDL. Eksempelvise fremgangsmåter er illu-strert for apolipoprotein B-100 (LDL) og apolipoprotein A-I (HDL) under avsnittet vedrørende materialer og metoder.

III. Diagnostiske systemer

Foreliggende oppfinnelse vedrører også et diagnostisk system, vanligvis i settform, som kan benyttes ved utførelse av de tidligere beskrevne fremgangsmåter. Systemet omfatter i separate beholdere minst de tidligere beskrevne monoklonale paratopiske molekyler MB47 og MB24 som reagerer immunologisk med apo B-100, og AI-10 og AI-11 som reagerer immunologisk med apo A-I. Ett av de paratopiske molekyler i hvert par, dvs. ett av MB47 og MB24, og ett av AI-10 og AI-11 bindes til et enzymindikasjonsmiddel som konjugater. Pakningene inneholder en mengde av hvert av de paratopiske molekyler som er tilstrekkelig til å utføre minst én analyse med hensyn på markører for unormal lipidmetabolisme.

Helst inneholder systemet faste bærere som hver består hovedsakelig av en fast matriks hvortil det er bundet monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med henholdsvis enten apo B-10 0 eller apo A-I, og som på overflaten har ikke-spesifikke proteinbindingsseter som er blokkert, samt to separat pakkede enzym-tilknyttede konjugater med monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med henholdsvis apo B-100 og apo A-I. Det benyttes de samme fire paratopiske molekyler som er omtalt ovenfor.

Fastfasematriksene av det ovenfor nevnte diagnostiske system kan være hvilken som helst av fastefasematriksene som er omtalt tidligere, selv om begge matriksene fortrinnsvis er av samme type. Mikrotiterbrønner, slik som de i de tidligere beskrevne 12-brønners strimler og 96-brønners plater,

er særlig foretrukket. Ikke-spesifikke bindingsseter på de faste bærerne blokkeres som omtalt tidligere.

Den faste matriks utgjør en beholder for de bundne monoklonale paratopiske molekyler ifølge denne utførelsesform. Typiske beholdere for de enzym-tilknyttede monoklonale paratopiske molekyler er ampuller eller flasker laget av glass eller en plast, slik som polyethylen eller polypropylen.

Når det brukes en mikrotiterplate som en eksempelvis fast matriks, og hele monoklonale antistoffer MB47 og AI-10

som de fastfase-bundne monoklonale paratopiske molekyler,

serum som den flytende blodprøve og hele monoklonale antistoffer MB24 og AI-11 bundet til HRPO, omfatter et eksempelvis, mer foretrukket diagnostisk system i settform det følgende: a) en fast bærer som består hovedsakelig av en mikrotiterplate ned monoklonalt antistoff MB47 bundet til denne i en mengde som er tilstrekkelig til å utføre en analyse av en serumprøvealiquot med hensyn på mengden av apolipoprotein B-100 som er tilstede i denne, og med ikke-spesifikke proteinbindingsseter på overflaten som er blokkerte;

b) en fast bærer som består hovedsakelig av en mikrotiterplate med monoklonalt antistoff AI-100 bundet til denne

i en mengde som er tilstrekkelig til å utføre en analyse av en serumprøvealiquot med hensyn på mengden av apolipoprotein A-I som er tilstede i denne, og med ikke-spesifikke proteinbindingsseter på overflaten som er blokkerte;

c) en separat pakning som inneholder en vandig oppløs-ning inneholdende monoklonalt antistoff MB24 bundet til HRPO

som er tilstede i en mengde tilstrekkelig til å utføre en analyse av en serumprøvealiquot med hensyn på mengden av apo B-100 som er til stede i denne; og

d) en separat pakning som inneholder en vandig oppløs-ning inneholdende monoklonalt antistoff AI-11 bundet til

HRPO som er tilstede i en mengde tilstrekkelig til å utføre

en analyse av en serumprøvealiquot med hensyn på mengden av apo A-I som er til stede i denne.

Aller helst omfatter et diagnostisk system de ovenfor nevnte fire bestanddeler (a-d) og én eller flere av de føl-gende: (i) en mengde hydrogenperoxyd med kjent konsentrasjon, (ii) en visualiserende oxydativ fargestofforløper, slik som OPD, (iii) en oppløsning av et stoppmiddel, slik som 4 N svovelsyre, for å stanse fargedannelsesreaksjonen, (iv) én eller flere buffere i tørr eller flytende form for bruk i analysen, (v) materialer for fremstilling av standardreferanse-kurver og (vi) instruksjoner for utførelse av analysene. Hver av de ovenfor oppramsede bestanddeler er tilstede i det diagnostiske system i en mengde som er tilstrekkelig til å utføre minst én analyse, og disse bestanddelene er hensiktsmessig pakket separat.

IV. Resultater

Resultatene som ble oppnådd ved å bruke analysefremgangsmåten beskrevet ovenfor og som er nærmere beskrevet nedenunder i avsnittet vedrørende materialer og fremgangsmåter, er omtalt nedenunder. Brønner i 96-brønners mikrotiterplater av polystyren ble benyttet som faste matrikser. Hele monoklonale antistoffer MB47 og AI-10 ble benyttet som de fastfase-bundne første og tredje monoklonale paratopiske molekyler, i henholdsvis analyse av apolipoprotein B-100 og A-I. Ikke-spesifikke proteinbindingsseter på overflatene av den faste bærer ble blokkert med BSA. HRPO-bundne hele monoklonale antistoffer MB24 og AI-11 ble benyttet som de andre og fjerde antimono-klonale paratopiske molekyler i analyser av henholdsvis apolipoprotein B-100 og A-I, med OPD som den visualiserende oxy-dative fargestofforløper.

Analyser med hensyn på apo B-100 og apo A-I ble utført for 37 personer uten noen CAD-bakgrunn. Disse personene er referert til som "normale".

Det ble oppnådd verdier ved å bruke fortynnet plasma

og serum som de flytende blodprøver. Disse verdiene ble funnet å ikke vise noen forskjeller i statistisk signifikans mellom de to prøvekildene, og gjennomsnittet ble regnet ut.

En sammenligning av resultatene for de "normale" er vist i tabell 2 nedenunder for de 23 menn og 14 kvinner hver for seg, og som "kombinerte" verdier.

Verdier ble oppnådd på samme måte ved å bruke serum og plasma fra 42 individer av hankjønn som var identifisert klinisk til å ha CAD. En sammenstilling av disse verdiene er vist i tabell 3 nedenunder.

Når man ser på de ovenfor angitte data og sammenligner - dem med data gitt i Kottke et al. (1986) Mayo Clin. Proe,

.61:313-320, er det flere trekk som fremhever seg.

Ett trekk er at gjennomsnittsverdiene for normale og CAD-pasienter når det gjelder apo A-I i analysen ovenfor, er like med de som er rapportert av Kottke et al. Lignende standardavvik ble oppnådd for begge analysetyper.

Denne resultatlikhet var overraskende av flere grunner. For det første brukte Kottke et al. en avmaskeringsbehand-

ling med detergent ("Tween 20") for sine analyser, mens de foreliggende flytende blodprøver ikke ble underkastet slike behandlinger. For det andre benyttet Kottke et al. en radio-immunoanalyse, som generelt ansees for å være mer nøyaktig og presis enn en ELISA som her er brukt. Se Voller et al. (1976) Bull. World Health Organ., 5_3:55-65. For det tredje ble polyklonale antistoffer som vanligvis ansees for å være i stand

til å gi forbedret immunologisk reaksjon med det forholdsvis heterogene apo A-I brukt av Kottke et al., mens monoklonale antistoffer ble brukt her. For det fjerde benyttet Kottke et al. en opprettholdelsestid på 16 timer ved værelsetemperatur for den immunologiske reaksjon mellom de polyklonale antistoffer og apo A-I, mens et tidsrom på 30 minutter ved værelsetemperatur ble benyttet her.

Et annet trekk er at mens gjennomsnittsverdiene for apo B-100 for normale og CAD-pasienter er noe lavere i de foreliggende analyser sammenlignet med de respektive gjennomsnittsverdier hos Kottke et al., er standardavvikene som finnes i de foreliggende analyser ganske mye mindre enn de som er rapportert av Kottke et al. Både Kottke et al. og foreliggende oppfinnere benyttet monoklonale antistoffer til sine analyser, selv om Kottke et al. igjen benyttet RIA i motsetning til den foreliggende ELISA.

Sammenligninger ble også gjort ved å bruke kommersielt tilgjengelige RID-analyser for apo B-100 sammen med apo A-I-analysen som her er beskrevet, for å oppnå forhold mellom apo B-100 og apo A-I. Oppsummeringer av disse resultatene for for-holdene hos normale og CAD-pasienter er vist i tabell 4 nedenunder. Aliquoter av en blodprøve fra hver av de 20 normale og 40 CAD-pasienter ble brukt i denne undersøkelse for å gi interne kontroller.

Undersøkelse av dataene i tabellen ovenfor viser at uakseptabelt store overlappinger ble oppnådd istaridardavvik-områdene for forholdet når markørverdier for normale personer og CAD-pasienter ble oppnådd under anvendelse av ett av to kommersielt tilgjengelige RID-sett for apo B-100-analysen sammenlignet med bruk av den foreliggende apo B-100-analyse sammen med den foreliggende apo A-I-analyse.

IV. Materialer og fremgangsmåter

A. Fremstilling og rensing av paratopiske molekyler

1. Isolering av anti- apo A- I immunoglobulin

Ascitesvæsker ble erholdt fra 10 uker gamle Balb/c-

mus som var blitt preparert med 0,3 ml mineralolje og inji-

5

sert intraperitonealt med 3 - 50 x 10 hybridomceller. Gjennomsnittstiden for utvikling av ascites var 9 dager. Etter klaring ved sentrifugering ved 15.000 x g i 15 timer ved 23°C, ble ascitesvæsker slått sammen og lagret nedfryst ved -20°C. Isolerte AI-10- og AI-11-antistoffer ble fremstilt ved hjelp av hurtig proteinvæskekromatografering (FPLC) under anvendelse av en Pharmacia Mono Q HR5/5 anionbytterkolonne, under anvendelse av en 0 - 0,5 M NaCl gradient i 10 mM Tris, pH 8,0. Rensede Mab-er ble oppkonsentrert under anvendelse av en Ami-con omrørt ultrafiltreringscelle (PM 30 membran) til en konsentrasjon på 1 mg pr. ml, det ble dialysert i PBS (fosfatbufret saltoppløsning, pH 7,2) og lagret ved -70°C.

2. Isolering av anti- apo B- 10 0 immunoglobulin

Ascitesvæsker inneholdende anti-apo B-100 paratopiske molekyler som kan benyttes her, ble erholdt fra 10 uker gamle Balb/c-mus som var blitt preparert med 0,3 ml mineralolje og injisert intraperitonealt med 3 - 50 x 10 hybridomceller. Gjennomsnittstiden for utvikling av ascites var 12 dager. Etter klaring ved sentrifugering med 15.000 x g i 1 time ved .-4°C . ble ascitesvæsker slått sammen og lagret nedfryst ved -20°C.

Isolert antistoff MB47 ble fremstilt ved kromatogra-fering av ascitesvæskene med monoklonalt hybridom og en protein A-"Sepharose 4B"-kolonne. Antistoff ble eluert fra kolonnen med 0,1 mol eddiksyre.

Isolerte paratopiske molekyler ble også fremstilt ved hjelp av hurtig proteinvæskekromatografi (FPLC) på en ascitesvæske med monoklonalt hybridom på en Pharmacia Mono Q HR 5/5 anionbytterkolonne i et Pharmacia FPLC-system under anvendelse av en 0 - 0,5 M NaCl gradient i 10 mM Tris, pH 8,0, og idet retningslinjene som ble levert sammen med kolonnen ble fulgt.

B. Karakterisering av hybridomantistoffer

Det totale gammaglobulininrihold (lg) i hver blanding av ascitesvæske ble funnet frem til ved hjelp av elektroforese av 1 - 3 ml prøver og av celluloseacetatstrimler i 75 mm veronalbuffer ved en pH-verdi på 8,6 i 45 minutter ved 200 millivolt (mV). Prosentandelen av det totale protein som var lg, ble kvantifisert ved densitometrisk scanning av Ponceau S-formede geler, og totalt protein ble bestemt ved hjelp av de modifiserte Lowry-fremgangsmåter som tidligere omtalt.

Murin lg tunge og lette kjeder for MB47 og MB24 ble identifisert ved dobbeldiffusjon i 0,9% agarose. 10 pl av en passende fortynning av ascitesvæske ble omsatt med et like stort volum passende fortynnet kanin-anti-murin tung og lett kjede-spesifikke antisera. Etter diffusjon i ca. 15 timer ved 20°C og vasking, ble precipitinlinjer identifisert ved farging med 0,5% "Coomassie brilliant blue R-250" .

Underklassene av monoklonale antistoffer AI-10 og AI-11 ble identifisert ved å bruke kommersielle radialimmunodiffusjonssett. Ascitesvæske ble plassert i en brønn som var skåret inn i en agarosegel som inneholdt enten anti-IgGl, anti-IgG2a, anti-IgG2b eller anti-IgM. Det ble dannet en syn-lig precipitinring med antistoffene i den identifiserte klasse etter en forhåndsbestemt, spesifikk tid under kontrollerte betingelser. Ringens diameter er proporsjonal med konsentra-sjonen av spesifikt immunoglobulin som er til stede i ascites-væsken. AI-10 ble funnet å være av klasse IgG2a og AI-11 ble funnet å være av klasse IgGl.

Isoelektriske profiler for de monoklonale antistoffer ble erholdt ved hjelp av isoelektrisk fokusering av 0,01 ml prøver av ascitesvæskene i 0,8% agarose ("EF-802-300") inneholdende 10% sorbitol, og 2% amfolin innenfor et pH-verdi-område på 5 - 8, i 150 minutter ved 3 watts konstant strøm-styrke. Etter fiksering og tørking ble gelene farget med "Coomassie brilliant blue" og fotografert.

C. Sandwich- analyser

1. Apo A- I ( HDL) sandwich- ELISA

a. Apo A- I primærstandarder: Kvantifisering av HDL og isolert apolipoprotein A- I

HDL-fraksjonen (1,063 - 1,21 g/ml) ble erholdt fra sammenslått humant plasma ved hjelp av standard ultrasentrifu-geringsteknikker og ble dialysert over i PBS. Den ble deretter sterilfiltrert gjennom en 0,45 um "acrodisc" filterenhet og lagret ved 4°C. Proteininnholdet i HDL-fraksjonen ble bestemt ved hjelp av en modifisert Lowry proteinanalyse med BSA som standard. Tre fortynninger av HDL-fraksjonen ble kjørt in duplo for å sikre avlesninger innenfor en lineær del av standardkurven. F.eks. ble HDL-fraksjonen kjørt ved fortynninger på 1:5, 1:10 og 1:20. Proteinkonsentrasjonen var vanligvis mellom 5 og 10 ml. For langvarig lagring ble HDL-fraksjonen fortynnet med PBS til en proteinkonsentrasjon på 1 - 2 mg/ml. Etter fortynning ble proteinkonsentrasjonen på nytt bekreftet ved hjelp av Lowry-analyse ved fortynninger på 1:2, 1:5 og 1:10. Den fortynnede HDL-fraksjon ble deretter delt opp i aliquoter og lagret ved 4°C.

Isolert apolipoprotein A-I kan fåes fra en rekke kommersielle kilder. Selv om produsenten vanligvis inkluderer en erklæring vedrørende proteininnhold og -renhet, ble pro-teinkonsentras jonen alltid bekreftet ved hjelp av Lowry-analyse, og om nødvendig regulert på grunnlag av disse resultatene. Fortynninger av apo A-I-preparatet ble kjørt som beskrevet i det tidligere avsnitt. Preparatet ble delt opp i aliquoter og lagret som foreslått av produsenten.

HDL- og/eller apo A-I-preparatene ble deretter analysert som ukjente prøver (fortynnet 1:5000) i apo A-I-ELISA (beskrevet nedenunder). Et minimum på to analyseplater pr. dag inneholdende et fullstendig sett av standarder, kvalitets-kontroller og fortynninger av HDL- og/eller apo A-I-preparater ble utført i løpet et 5-dagers tidsrom. De oppnådde ELISA-verdier for HDL- og/eller apo A-I stemte innenfor 20% av verdien for Lowry proteinanalyse. Dersom verdiene ikke var i overensstemmelse med de fastlagte grenser, ble Lowry-analysen gjentatt for å bekrefte den proteinkonsentrasjon

som var bestemt. Dersom verdiene fortsatt var avvikende, var dette vanligvis indikasjon på aldring eller forurensning av preparatet, og det ble ikke ansett for å være egnet for bruk som en primærstandard.

Renheten til primærstandarden ble også bestemt ved hjelp av analytisk natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-gel-elektroforese; SDS-PAGE.

b. Apo A- I ELISA sekundærstandardfremstilling og verdibe-bestemmelse

i. Fremstilling av lyofilisert standard sammenslått

plasma

Nytappet plasma eller serum ble samlet opp fra minst 10 normolipidemiske individer som hadde fastet over natten. Det ble utført felbotomi under anvendelse av sterile rør inneholdende dinatrium-EDTA ved hjelp av ikke-traumatisk vene-punktur. Prøvene ble sentrifugert ved 1500 x g i 30 minutter ved 4°C og plasmaet ble overført til rene, tett lukkede rør og lagret i ikke mer enn 24 timer ved 4°C. Like store mengder av prøvene ble slått sammen og 0,5 ml mengder ble delt opp i aliquoter i syrerensede Wheaton 5 ml serumglass og lyofilisert over natten (ca. 16 - 18 timer). Glassene ble lukket og lagret ved 4°C.

ii. Rekondisjonering av lyofilisert, sammenslått

plasmastandard

Glassene fikk komme til værelsetemperatur før rekondisjonering. Aluminiumringen og korken ble fjernet, idet vakuumet i glasset sakte ble opphevet. Under anvendelse av en presisjonspipette ble de tørkede, sammenslåtte standarder rekondisjonert med 0,5 ml dobbeltdestillert vann ved å dis-pensere vannet sakte til siden i glassene. Korkene ble på nytt satt på og glassene ble hvirvlet hurtig 3-4 ganger og holdt ved værelsetemperatur i minst 3 0 minutter. Standarden ble ikke vortexbehandlet eller omrørt kraftig, men hvirvlet forsiktig for å sikre fullstendig oppløseliggjøring.

iii. Verdibestemmelse av apo A- I sekundærstandard

Apo A-I-verdien for den lyofiliserte sekundærstandard ble bestemt i apo A-I ELISA under anvendelse av primærstandarden (enten HDL eller apo A-I) som kalibreringsmiddel. ELISA-analysefremgangsmåten er beskrevet her.

Den lyofiliserte sekundærstandard ble analysert som en ukjent prøve in triplo på minst to analyseplater pr. dag i minst 10 dager, noe som frembragte et minimum på 20 verdier (gjennomsnitt av tre prøver). Det ble utregnet gjennomsnitt for alle verdier som ble oppnådd for sekundærstandarden, og apo A-I-verdien i milligram pr. desiliter (mg/dl) ble bestemt.

Etter at verdibéstemmelsen" var blitt gjort, ble sekundærstandarden brukt til å konstruere en standardkurve som ble prøvd på den samme ELISA-plate med en primærstandard-kurve, sammen med et komplett sett av kontroller. Primær- og sekundærstandardkurver ble prøvd på et minimum av to 96-brønners analyseplater hver dag over et tidsrom på 5 dager.

Etter at verdibestemmelsen for sekundærstandarden var godtatt, ble det konstruert standardkurver og disse ble prøvd på den samme ELISA-plate med den nylig godtatte mengde lyofilisert standard over et tidsrom på 5 dager (to analyseplater pr. dag).

c. Analysen, generelt

Isolerte AI-10-molekyler ble festet til veggene i poly-styrenmikrotiterplatebrønner (Nunc-Immuno Plate 1) ved å blande 0,15 ml av en pH 9,0 natriumbicarbonatbuffer inneholdende 5 ug pr. ml (ug/ml) AI-10 i hver brønn. Platene ble holdt i 18 timer ved 4°C og deretter vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,1% BSA og 0,05% polyoxyethylen (2 0) sorbi-tanmonolaurat ("Tween 20"). Gjenværende, ikke-spesifikke bindingsseter ble deretter blokkert ved å tilblande 0,2 ml PBS inneholdende 10% BSA i hver brønn, og holde blandingen i 1 time ved 37°C etterfulgt av skylling. Således preparerte brønner kan anvendes i opp til 1 måned etter preparering når de lagres i et rom med fuktig luft.

Human HDL ble fortynnet i PBS til konsentrasjoner som varierte fra 1,0 til 0,031 ug/ml for bruk som standardkontroll-oppløsning. Som tidligere angitt brukes det human HDL i stedet for human apo A-I som standard i disse analysene fordi apo A-I er funnet å være forholdsvis ustabil etter lagring, mens HDL synes å være forholdsvis mer lagringsstabil. Prøver av plasma (eller serum) ble fortynnet 1:5000 i PBS.

Femti mikroliter (ul) av standard eller prøve ble tilblandet i brønnene in triplo. Innen 5 minutter deretter ble 50 ul PBS inneholdende HRPO-merkede AI-11 paratopiske molekyler tilblandet i hver brønn. Immunoreaksjonsblandingene ble holdt i et tidsrom på 30 minutter ved 25°C. Ikke-bundet materiale ble så fjernet fra brønnene ved vasking som beskrevet ovenfor.

Mengden av fastfase-festet sandwich-immunoreaktant inneholdende HRPO-markør ble så analysert ved tilblanding av 0,1 ml nyfremstilt substratoppløsning (destillert vann inneholdende 3% H202 og 0,67 mg/ml).

d. Trinnvis apo A- I HDL sandwich- ELISA

De følgende trinn ble utført ved utøvelsen av apolipoprotein A-I sandwich-ELISA. Kommersielle kontroller ble rekondisjonert i henhold til pakningsinnlegg med avionisert vann. Kontrollene ble hvirvlet forsiktig og holdt 20 - 30 minutter ved værelsetemperatur for å sikre fullstendig oppløs-ning.

(i) Prøver og kontroller

Prøver og kontroller ble fortynnet 1:5000 i PBS. En seriefortynning kan gjøres på følgende måte:

20 yl prøve + 1,98 ml PBS (1:100),

40 ul av den ovenfor nevnte fortynning + 1,96 ml PBS

(1:5000).

(ii) Standardfortynning

Isolert apo A-I (HDL) standard ble fortynnet til 4 ug/ ml i PBS. Deretter ble det gjort to-gangers seriefortynninger til 0,031 ug/ml. Ved f.eks. å bruke et preparat av HDL betegnet 860527 som inneholdt 868 pl/ml:

4 ug/ml = 46 yl + 9,954 ml PBS (1:217),

2 ug/ml = 1 ml av det ovenfor nevnte + 1 ml PBS, og

fortsette 2-gangers fortynninger til 0,031 ug/ml.

(iii) HRPO- merket AI- 11- fortynning

En 1:5000 fortynning av AI-11 HRPO-konjugat antistoff i PBS ble brukt.De følgende fortynninger kan lages:

20 ul + 1,98 ml PBS (1:100) og

240 ul av det ovenfor nevnte + 11,76 ml PBS (1:5000).

Tildekk med folie for å beskytte mot lys. Denne mengde er tilstrekkelig til to plater.

(iv) 3. Prosent hydrogenperoxyd

Fortynn 30% hydrogenperoxyd (H202) 1:10 i destillert vann.

(v) p- fenylendiamin- substrat

1 o-fenylendiamin-tablett (OPD) oppløses i 15 ml destillert vann. 62,5 ul 3% H202 tilsettes. Det tildekkes med folie for å beskytte mot lys. Substratet nyfremstilles like før bruk hver gang.

e. Analysefremgangsmåte

i. Antistoffbundet ELISA-plate ekvilibreres ved omgivende værelsetemperatur (20 - 22°C) i minst 20 minutter. Platen fjernes fra posen og snus for å fjerne restbuffer i brønnene. Brønnene fylles med 300 ul skyllebuffer (PBS inneholdende 0,1% BSA og 0,05% "Tween 20", pH 7,2) og platen oppbevares i et tidsrom på 10 minutter. Platen snus for å fjerne buffer og tørkes tørr med papirhåndkle. Brønnene får ikke være tomme lengre enn 10 minutter under analysen. ii. 50 yl standard eller prøve tilsettes til brønnene in triplo.

0 ug/ml standarden er 50 yl PBS.

50 yl fortynnet HDL-standarder tilsettes til standard-brønnene (0,031. 0,062, 0,125, 0,25, 0,50 og 1,0 yg/ml) . 50 yl fortynnede kontroller og pasientprøver tilsettes til de respektive brønner. iii. 50 yl/brønn HRPO-bundet antistoff tilsettes til alle brønnene. iv. Platen pakkes inn i aluminiumfolie og plasseres på et gyro-rysteapparat (ca. 100 rpm) i 3 0 minutter ved omgivende værelsetemperatur (ca. 20 - 25°C). v. Platen vaskes ved å fylle brønnene med 300 yl/brønn skyllebuffer og platen snus deretter for å fjerne bufferen. Dette gjentas to ytterligere ganger slik at det i alt vaskes tre ganger. Platen tørkes ved oppsuging på papirhåndkle etter tredje vask. Platen får ikke tørke ut. vi. 1.00 yl/brønn nyfremstilt OPD-substrat tilsettes. Fargen får utvikle seg ved værelsetemperatur i 30 minutter. vii. Reaksjonen stanses med 50 yl 4N svovelsyre tilsatt til alle brønnene. O.D. avleses ved 492 nm.

2. Apo B- 100 sandv/ ich- ELISA

a. Oppsamling av plasmablanding og preparering for

lyofilisering for sekundærstandard

Friskt plasma innsamles fra 10 normale individer som har fastet over natten. (Individene får lov til å drikke svart kaffe eller te).

Flebotomi utføres ved å bruke et sterilt vakuatiner-rør inneholdende dinatrium EDTA ved ikke-traumatiske vene-punkturteknikker. Disse prøver sentrifugeres ved 1500 x g i 30 minutter ved 4°C. Plasma overføres til rene, tett lukkede

rør og lagres i ikke mer enn 24 timer.

Like stor mengde av plasmaprøvene blandes. 0,5 ml mengder oppdeles i aliquoter i kromsyrerenset Wheaton 5 ml gule serumflasker (VWR nr. 223778). Gummikorker plasseres i flaskene slik at ikke mer enn 0,635 cm av korken stikker ned i flasken. Flaskene plasseres så på brettene som er blitt fjernet fra hylleenheten i lyofilisatoren.

b. Lyofilisering av plasmablandingen for standarden

Systemet som ble brukt for lyofilisering var FTS-systemer "Dura-Stop" hylleenhet sammen med "Dura-Dry" konden-serenhet.

i. "Dura-Stop" hylleenhet avkjøles ned til -50°C.

ii. Plasmaprøver nedfryses ved å plassere brett med prøver i forhåndsavkjølt hylleenhet. Blydetektorer for termoelement plasseres inne i noen få prøver for å overvåke tem-peraturendringer . iii. Så snart blydetektorene for termoelement indikerer at prøvene er nedfryst til -50°C (omtrent 30 minutter, tiden varierer avhengig av antallet prøver), slåes kjølingen på i "Dura-Dry" kondenserenheten. iv. Når maksimal lav temperatur er nådd, slåes vakuum-pumpen på. v. Så snart vakuumtrykket når 200 um eller lavere, økes temperaturen i hylleenheten til -2 0°C. vi. Prøvene hensettes ved denne temperaturen og etter å ha stått i omtrent 20 timer har temperaturen økt til -10°C. vii. I løpet av 30 minutter økes temperaturen til -50°C. Den endelige temperaturøkning til 4°C utføres 30 minutter senere. viii. Hyllen i hylleenheten løftes så opp for å skyve gummikorkene inn i flaskene. Vakuumet brytes så i kammeret og prøvene fjernes.

ix. En Wheaton håndkrymper (Wheaton nr. 224 303) brukes til å feste Wheaton aluminiumkapsler (VWR nr. 226-355) på prøveglassene. Prøvene lagres så ved 4°C inntil bruk.

C. Rekondisjonering og stabilitet

i. Rekondisjonering

Lyofiliserte plasmastandarder bør være ved værelsetemperatur før rekondisjonering. Det foreslåes et minimum på 30 minutter ved værelsetemperatur.

Aluminiumringene og korken fjernes idet man er forsiktig slik at vakuumet i glasset oppheves sakte. Det rekon-dis joneres med 0,5 ml avionisert 1^0 under anvendelse av en presisjonspipette. Vannet helles sakte mot siden i glasset. Korken settes tilbake, glasses hvirvles hurtig 3-4 ganger og får stå ved værelsetemperatur i minst 30 minutter. Heller ikke denne standard vortex-behandles eller rystes kraftig, men hvirvles for å oppnå oppløsning.

Etter 30 minutter hvirvles glasset forsiktig før bruk.

ii. Stabilitet

Standarden lagres mellom 2 - 8°C før og etter rekondisjonering. Den rekondisjonerte standard er stabil 4 uker når den lagres slik.

d. Verdifastsettelse

i. Kompetitiv ELISA

Verdifastsettelse for den lyofiliserte standard bestemmes i den kompetitive referanse-ELISA under anvendelse av en primær-LDL. Fleksibel polyvinylklorid-mikrotiterplater (Falcon, Microtest III) ble belagt i 16 timer ved 4°C med 200 yl PBS inneholdende 5 ug/ml LDL. Veggene ble så vasket tre ganger med 200 ul PBS inneholdende 1% BSA, og 0,5% "Tween". Gjenværende bindingsseter ble blokkert med 200 ul 3% BSA i PBS i 1 time ved 25°C. Deretter ble brønnene på nytt vasket tre ganger under anvendelse av den samme vaskebuffer. For standardkurven, som var inkludert i hver plate, ble LDL-apo B-100-standarden fortynnet i PBS inneholdende 0,5% lipoprotein utarmet plasma (LPDP), hvorved man fikk LDL-konsentrasjoner som varierte fra 32 ug/ml til 0,25 ug/ml. I hver analyse ble det benyttet tre forskjellige kontroller: 1) "Isolab Lipotype Control", 2) tre nivåer av Tago Inc. "Apolipoprotein B Reference Sera Controls" og 3) "Omega Lipid Fraction Control Serum". Hver kontroll ble fremstilt i henhold til produsentens instruksjoner.

Plasmaprøver og kontroller ble fortynnet 200 ganger

i LPDP/PBS-fortynningsbuffere. 50 ul av standardene, kontrollene og ukjente prøver ble pipettert inn i brønnene, øyeblikkelig etterfulgt av 50 pl av en fastsatt konsentrasjon av MB24 ascitesvæske (2000 ganger fortynning i 3% BSA/PBS). Platene ble så inkubert i 18 timer ved 4°C. Alle bestemmelsene ble gjort in triplo. Etter på nytt å ha vasket brønnene, ble 100 ul HRPO-konjugert . geit-anti-mus-IgG fortynnet'40u0 ganger i 1% BSA/PBS tilsatt til brønnene, det ble inkubert i nøyaktig 1 time ved 25°C og deretter vasket på nytt. Substratoppløsningen inneholdt 3% H2°2 og °'67 mg/ml o-fenylendiamin (OPD) fortynnet i destillert vann. 100 ul nyfremstilt substratoppløsning inneholdende 3% ^ 2°2 °g °'67 mg/ml o-fenylendiamin (OPD) i destillert vann ble tilsatt til alle brønnene og farge fikk utvikle seg i 30 minutter ved 25°C. Reaksjonen ble stanset ved tilsetning av 50 ul 4N H2S04 og den optiske tetthet (O.D.) til oppløsningen ble så bestemt ved 490 nm under anvendelse av en 96-brønners mikrotiterplate-avleser (Dynatech MR600).

(ii) Apo B- 10 0 sandwich- analyse

Det neste trinn er å bruke den lyofiliserte standard

i den direkte sandwich-analyse. Mikrotiterplater av polystyren (Nunc-Immuno Plate I) ble belagt med 150 ul natriumbicarbonatbuffer, pH 9,0, inneholdende 1 ug/ml renset MB47 i 16 timer ved 4°C. Platene ble vasket tre ganger med PBS inneholdende 0,1% BSA, 0,05% "Tween" og deretter blokkert med 3% BSA nøy-aktig som beskrevet for den kompetitive analyse. Den lyofiliserte standard av LDL-apo B ble fortynnet 1:200 LPDP/PBS (for-tynningsbuf fer) til konsentrasjoner som varierte fra 0,125

til 4,0 ug/ml. De samme kontrollene beskrevet ovenfor for den kompetitive ELISA ble brukt i denne analyse. Plasmaprøver og kontroller ble fortynnet 1000 ganger i fortynningsbuffer.

50 yl av standarder, kontroller og ukjente prøver ble tilsatt til brønnene in triplo. Deretter ble 50 yl PBS inneholdende en fastsatt konsentrasjon av HRPO-bundet MB24 øyeblikkelig pipettert inn i brønnene. Platene ble inkubert i nøyaktig 30 minutter ved 25°C, vasket og 100 yl OPD-substrato<p>plosning tilsatt i 30 minutter, 25°C inkubasjon. Fargeutvikling ble stanset ved tilsetning av 50 yl 4N I^SO^ og platene ble avlest

i en mikroplateavleser som i den kompetitive ELISA.

D. Kompetitiv ELISA

Reagens apo B-100 i form av LDL ble festet til veggene i mikrotiterplatebrønner av fleksibeltpolyvinylklorid (Mikro-test III) som fast matriks ved tilblanding av 0,2 ml PBS inneholdende 5 ug/ml isolert human LDL i hver brønn. Brønnene ble holdt ved 4°C i 16 timer og ble deretter vasket tre ganger med 0,2 ml PBS inneholdende 1% BSA, o,5% "Tween" og 0,02% aprotinin. Gjenværende ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert som beskrevet i den ikke-kompetitive ELISA.

Ikke-spesifikke bindingsseter ble blokkert ved be-legning med 3% BSA i PBS i 30 minutter ved værelsetemperatur. Platene ble så vasket med PBS-vaskebuffer som i tillegg inneholdt 0,1% BSA, 0,01% natriumazid og 0,05% "Tween 20".

For standardkurven, som var inkludert i hver plate, ble reagens-LDL fortynnet i PBS inneholdende 0,5% lipoprotein-utarmet plasma (LPDP), hvorved man fikk konsentrasjoner som varierte fra 32 mg/ml til 0,25 mg/ml.

Plasmaprøver ble fortynnet 1:200 i PBS inneholdende 0,5% LPDP. 50 ul av standardene eller prøvene ble tilblandet in triplo i brønnene. Innen ca. 5 minutter deretter ble 50 ul PBS inneholdende 3% BSA og ca. 4 ug/ml MB24 paratopiske molekyler tilblandet i hver brønn. De således dannede blandinger ble holdt ved 4°C i ca. 18 timer. Det ikke-bundne materiale som var separert fra de fastfase-bundne MB24-reagens apo B-100 immunorekasjonsprodukter ved vasking som beskrevet ovenfor.

De fastfase-immunoreaktantene ble preparert for analysering ved tilblanding av 0,1 ml PBS inneholdende 1% BSA og en effektiv mengde HRPO-merket geit-anti-mus-IgG til hver brønn. Denne andre immunoreaksjonsblanding ble holdt ved 24°C i 1 time og deretter vasket som beskrevet ovenfor, hvorved det ble dannet en sandwich-immunoreaktant.

Mengden av fastfase-bundet sandwich-immunoreaktant inneholdende HRPO-markør ble analysert som beskrevet i den kompetitive ELISA.

E. Plasmaprøver og lipoproteinkvantifisering

Plasmaprøver ble erholdt fra 20 pasienter med kransarteriesykdom fra hjertekateteriseringslaboratoriet ved San Diego VA-hospitalet. I tillegg ble plasma erholdt fra 37 normale individer.

Blod ble samlet opp i rør inneholdende 1,5 mg/ml ethy-lendiamintetraacetat (EDTA) og plasmaet ble separert øyeblikkelig ved sentrifugering ved 4°C.

Total plasmakolesterol og triglycerider ble målt på friske plasmaprøver i et standardisert klinisk laboratorium under anvendelse av et Abbott ABA-200 bikromatisk analyseappa-rat, og høyytelseskolesterolreaktant 236691 fra Boehringer-Mannheim og Abbott Laboratories 11 triglycerides A-gent". LDL-

og HDL-kolesterol ble målt under anvendelse av teknikker beskrevet i Lipid Research Clinic Procedures, HEW Pub. nr. 75-628 (NIH), 2. ed., Washington, D.C., Gov. Print. Off., (1974). Nivåer av apoprotein B ble bestemt ved å bruke to kommersielt tilgjengelige radialimmunodiffusjonssett: Diffu-gen RID, som her er kalt RID I, og M-Partigen RID, som her er kalt RID II.

125

F. Væskefase- RIA for I- merket antigen

For å bestemme fraksjonen av <125>I-LDL-partikler bundet av MB47 og MB24, ble en væskefase-RIA benyttet idet man fulgte de generelle fremgangsmåter til Tsao et al. (1982) J. Biol. Chem. 257:15222-15228. To forskjellige LDL-preparater (d = 1,019 - 1,063 g/ml ble undersøkt, et som var isolert fra sammen-blandet plasma fra 10 normale individer, og et som var isolert fra plasma fra ett normalt individ.

125

I-LDL (2000 cpm/ng) fremstilt ved å bruke Iodogen-teknikken, var 90% trikloreddiksyre-utfellbar. Denne blandingen ble fortynnet i 9% bovint serumalbumin (BSA) og sentrifugert ved 30.000 x g i 15 minutter før hver analyse for å fjerne komplekst materiale.

Analyser ble utført i 12 x 75 mm glassrør in triplo i 55 mM natriumbarbitalbuffer ved en pH-verdi på 8, inneholdende 150 mM NaCl, 0,02% natriumazid, 3% BSA og 1,5 mM natrium-EDTA.

125

Til 0,1 ml I-LDL (inneholdende 20 nanogram (ng) LDL-protein) ble tilsatt 0,1 ml buffer eller konkurrerende antigen og 0,1 ml økende konsentrasjoner av isolerte MB47-reseptorer fortynnet i BSA-barbitalbufferen. Etter 18 timer ved 4°C ble 0,1 ml IgSorb tilblandet. Etter 2 timers oppbevaring ble 2 ml BSA-fri barbitalbuffer tilsatt og rørene ble øyeblikkelig sentrifugert ved 1500 x g i 60 minutter. De resulterende ut-fellinger ble vasket to ganger med barbitalbuffer.

Analyser hvor det benyttes AI-10 og AI-11 ble utført samtidig, slik som omtalt i Tsao et al. referert til ovenfor og i Curtiss and Edgington (1985) J. Biol. Chem. 260:2982-2993. Således ble det til 0,1 ml radiojodert antigen (HDL eller apolipoprotein A-I) tilsatt 0,1 ml fosfatbufret salt-oppløsning, pH 7,2, og 0,1 ml av varierende fortynninger av mushybridom-kulturvæske eller ascitesvæske fortynnet i 1:50 normal musserum. Alle bufrene inneholdt også 5% dekstran (molekylvekt 40.000). Etter 18 timer ved 4°C ble 0,1 ml av utfellende andre antistoff (geit-anti-mus-IgG-serum) tilsatt. Etter en 4-timers inkubasjon ved 4°C ble 2 ml kald PBS tilsatt og rørene ble sentrifugert ved 2000 x g i 30 minutter ved 4°C. Supernatantene ble dekantert og I-aktivitet i pelletene bestemt i en gamma-teller. Maksimal utfellbar radioaktivitet ble bestemt ved å bytte IgSorb (for MB47) eller det andre antistoff (for AI-10 og AI-11) med 100% TCA. Den minimale utfellbare radioaktivitet eller ikke-spesifikke binding (NSB) ble bestemt ved å bytte ut de spesifikke hybridomantistoffer med et irrelevant hybridomantistoff av den samme klasse av tung kjede.

Data ble beregnet som:

hvor MEAN = gjennomsnittlig radioaktivitet utfelt i nærvær av en bestemt mengde spesifikt antistoff og TCA er den maksimale TCA-utfellbare radioaktivitet.

D. Kompetitiv immunoenzymometrisk analyse med hensyn

på AI- 10 og AI- 11

Mikrotiterplater av fleksibelt polyvinylklorid ble belagt i et tidsrom på ca. 18 timer (over natten) ved 4°C med 0,2 ml fosfatbufret saltoppløsning (PBS) inneholdende 5 ug/ml av enten HDL eller renset apo A-I. Brønnene ble vasket tre ganger med 0,3 ml PBS inneholdende 1,0 g BSA og 0,5 ml "Tween 20" pr. liter. Gjenværende bindingsseter i brønnene ble blokkert ved å inkubere 0,2 ml PBS inneholdende 30 BSA pr. liter i brønnene i 1 time ved omgivelsestemperatur (20 - 25°C). Brønnene ble så vasket tre ganger med skyllebuffer. Platene ble øyeblikkelig brukt.

PBS (0,05 ml) inneholdende 0,375 ug/ml AI-10 konjugert med pepperrotperoxidase, ble inkubert i de på forhånd belagte brønner med 0,05 ml PBS inneholdende fra 0 til 8,0 ug/ml ikke-konjugert AI-10 eller ikke-konjugert AI-11 monoklonalt antistoff. Inkubasjonstiden var 3 timer ved omgivelsestemperatur (20 - 25°C). Brønnene ble så vasket tre ganger med skyllebuffer og 0,1 ml PBS inneholdende o-fenylendiamin-substrat ble tilsatt til alle brønnene, og det ble inkubert i 30 minutter ved omgivelsestemperatur. Fargereaksjonen ble stanset ved tilsetning av 0,05 ml 4N H2S04 til alle brønnene og den optiske tetthet (O.D.) for hver brønn ble bestemt ved 490 nanometer (nm) under anvendelse av et Dynatech 96-brØnners plateavlesningsapparat.

Resultatene for den apo A-I-belagte plate vist i figur 3A og resultatene for den HDL-belagte plate er vist i figur 3B. En 21-gangers økning av ikke-merkede AI-11-molekyler kon-kurrerte ikke signifikant med peroxidase-merkede AI-10-molekyler når det gjelder binding til HDL eller apo A-I. Under-søkelsen er blitt gjentatt under anvendelse av peroxidase-merket AI-11 med ikke-merket AI-10 og AI-11 ved de samme konsentrasjoner med praktisk talt de samme- resultater.

Claims

1. Fremgangsmåte for immunologisk påvisning av en markør for unormal lipidmetabolisme, som omfatter trinnene med å analysere med hensyn på mengden av humant apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I pr. enhetsvolum av en blodprøve, og å bestemme forholdet mellom apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I i prøven, karakterisert ved at: (a) en første aliquot av en apolipoprotein B-100-holdig flytende blodprøve fra en person analyseres med hensyn på mengden av apolipoprotein B-100 som er til stede ved å: (i) blande den første flytende prøvealiquot med en fast bærer bestående hovedsakelig av en fast matriks med fastfasebundne første monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100, og utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746 som er avledet fra ikke-humane pattedyr immunisert med henholdsvis humant VLDL og humant LDL, hvorved det dannes en første blanding av fast og flytende fase, idet overflaten til bæreren har blokkerte ikke-spesifikke bindingsseter, (ii) holde den første blanding av fast og flytende fase under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de første paratopiske molekyler kan reagere immunologisk med apolipoprotein B-100 som er til stede i prøvealiquoten, og danne en fastfase-bundet immunoreaktant som inneholder i det vesentlige alt apolipoprotein B-100 som er til stede i prøvealiquoten, (iii) blande apolipoprotein B-100 i den første flytende prøvealiquot med andre monoklonale paratopiske molekyler i flytende fase som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100, utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746, men benyttes ikke i trinn (a) (i), og er operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel, hvorved det dannes en andre blanding, (iv) holde den andre blanding under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de andre indikasjonsmiddelbundne paratopiske molekyler kan danne en immunoreaktant som inneholder i det vesentlige alt apolipoprotein B-100 i prøvealiquoten, (v) separere den faste og den flytende fase som fås fra trinnene (a) (i-iv) ovenfor, og (vi) bestemme mengden av indikasjonsmiddelbundet apolipoprotein B-100-holdig immunoreaktant som er til stede i den fraskilte faste fase, og derved mengden av apolipoprotein B-100 i et enhetsvolum av prøve, (b) en andre aliquot av den flytende blodprøve som inneholder apolipoprotein A-I og ikke har vært underkastet avmaskeringsbehandling, analyseres med hensyn på mengden av apolipoprotein A-I som er til stede ved å: (i) blande den andre flytende prøvealiquot med en fast bærer bestående hovedsakelig av en fast matriks med fastfasebundne tredje monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I og utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201 som begge er avledet fra ikke-humane pattedyr immunisert med humant HDL, hvorved det dannes en tredje blanding av fast og flytende fase, idet overflaten til den faste bærer har blokkerte og ikke-spesifikke bindingsseter, (ii) holde den tredje blanding av fast og flytende fase under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de første paratopiske molekyler kan reagere immunologisk med apolipoprotein A-I som er til stede i aliquotprøven, og danne en fastfase-bundet immunoreaktant som inneholder i det vesentlige alt apolipoprotein A-I som er til stede i prøvealiquoten. (iii) blande apolipoprotein A-I i den andre flytende prøvealiquot med fjerde monoklonale paratopiske molekyler i flytende fase som reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I, utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201, men som ikke benyttes i trinn (b) (v), hvorved det dannes en fjerde blanding, (iv) holde den fjerde blanding under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de fjerde indikasjonsmiddelbundne paratopiske molekyler kan danne en immunoreaktant med i det vesentlige alt apolipoprotein A-I som er til stede i prøve-aliquoten, (v) separere den faste og den flytende fase som fås fra trinnene (b) (i-iv), og (vi) bestemme mengden av indikasjonsmiddelbundet apolipoprotein A-I-holdig immunoreaktant som er til stede i den fraskilte faste fase, og derved mengden av apolipoprotein A-I i et enhetsvolum av prøven.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at blandingen i trinnene (a) (i) og (a) (iii) utføres i det vesentlige samtidig, og at opprettholdelsestrinnene (a) (ii) og (a) (iv) utføres sammen.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den faste og den flytende fase som er til stede etter trinn (a) (ii), separeres før trinn (a) (iii), og at apolipoprotein B-100 i den første flytende aliquot som tilblandes i trinn (a) (iii), er til stede i den fastfasebundne immunoreaktant dannet i trinn (a) (ii).

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den faste og den flytende fase som er til stede etter trinn (b) (ii), separeres før trinn (b) (iii), og at apolipoprotein A-I i den andre flytende aliquot tilblandet i trinn (b) (iii), er til stede i den fastfasebundne immunoreaktant dannet i trinn (b) (ii).

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at blandingen i trinnene (b) (i) og (b) (iii) utføres i det vesentlige samtidig, og at opprettholdelsestrinnene (b) (ii) og (b) (iv) utføres sammen.

6. Fremgangsmåte for immunologisk påvisning av en markør for unormal lipidmetabolisme, som omfatter trinnene med å analysere med hensyn på mengden av humant apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I pr. enhetsvolum av en blodprøve, og å bestemme forholdet mellom apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I i prøven, karakterisert ved at: (a) en første aliquot av en apolipoprotein B-100-holdig flytende blodprøve fra en person analyseres med hensyn på mengden av apolipoprotein B-100 som er til stede ved å: (i) danne en første blanding av fast og flytende fase ved i det vesentlige samtidig å blande den første flytende prøvealiquot med en fast bærer bestående hovedsakelig av en fast matriks med fastfasebundne første monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100, og utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746 som er avledet fra ikke-humane pattedyr immunisert med henholdsvis humant VLDL og humant LDL, og andre monoklonale paratopiske molekyler operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel som utskilles av begge hybridomer med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746, og ikke er de første paratopiske molekyler bundet til den faste matriks, idet overflaten på bæreren har blokkerte ikke-spesifikke bindingsseter, (ii) holde den første blanding av fast og flytende fase under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de første paratopiske molekyler og de indikasjonsmiddelbundne andre paratopiske molekyler kan reagere immunologisk med i det vesentlige alt apolipoprotein B-100 som er til stede i prøvealiquoten, hvorved det dannes en fastfasebundet sandwichimmunoreaktant og en flytende fase, (iii) separere den faste og den flytende fase, og (iv) bestemme mengden av indikasjonsmiddelbundet apolipoprotein B-100-holdig sandwichimmunoreaktant som er til stede i den fraskilte faste fase, og derved mengden av apolipoprotein B-100 i et enhetsvolum av prøve, (b) en andre aliquot av den flytende blodprøve som inneholder apolipoprotein A-I og ikke har gjennomgått avmaskeringsbehandling, analyseres med hensyn på mengden av apolipoprotein A-I som er til stede ved å: (i) danne en andre blanding av fast og flytende fase ved i det vesentlige samtidig å blande den andre flytende prøvealiquoten med en fast bærer bestående hovedsakelig av en fast matriks med fastfasebundne tredje monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I og utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201 som begge er avledet fra ikke-humane pattedyr immunisert med humant HDL, og fjerde monoklonale paratopiske molekyler operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel som utskilles av begge hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201, og ikke er de tredje paratopiske molekyler bundet til den faste matriks, idet overflaten på bæreren har blokkerte ikke-spesifikke bindingsseter, (ii) holde den andre blanding av fast og flytende fase under biologiske analysebetingelser i et på forhånd bestemt tidsrom som er tilstrekkelig til at de tredje paratopiske molekyler og de indikasjonsmiddelbundne fjerde paratopiske molekyler kan reagere immunologisk med i det vesentlige alt apolipoprotein A-I som er til stede i prøvealiquoten, hvorved det dannes en fastfasebundet sandwichimmunoreaktant og en flytende fase, (iii) separere den faste og den flytende fase, og (iv) bestemme mengden av indikasjonsmiddelbundet apolipoprotein A-I-holdig sandwichimmunoreaktant som er til stede i den fraskilte faste fase, og derved mengden av apolipoprotein A-I i et enhetsvolum av prøve.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at de første paratopiske molekyler utskilles av hybridomet med ATCC deponeringsnummer HB 8746.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at de tredje paratopiske molekyler utskilles av hybridomet med ATCC deponeringsnummer HB 9200.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at opprettholdelsen under biologiske analysebetingelser i trinnene (a) (ii) og (b) (ii) skjer i et tidsrom på 30 minutter til 60 minutter ved omgivende værelsestemperatur.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at opprettholdelsen skjer i et tidsrom på 30 minutter og utføres med risting.

11. Diagnostisk system egnet for bruk ved bestemmelse av forholdet mellom apolipoprotein B-100 og apolipoprotein A-I i en flytende blodprøve, karakterisert ved at det omfatter: a) en første beholder med paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100 og utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746, b) en andre beholder med paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100, utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 8742 og HB 8746, men er ikke til stede i den første beholder, og som er operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel, c) en tredje beholder med paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I og utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201, og d) en fjerde beholder med paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein A-I, utskilles av ett av hybridomene med ATCC deponeringsnummer HB 9200 og HB 9201, men er ikke til stede i den tredje beholder, og som er operativt bundet til et enzymindikasjonsmiddel, idet hvert av de paratopiske molekyler er til stede i en mengde som er tilstrekkelig til å utføre en bestemmelse av forholdet.

12. Diagnostisk system ifølge krav 11, karakterisert ved at de respektive monoklonale paratopiske molekyler som reagerer immunologisk med apolipoprotein B-100 og med apolipoprotein A-I som ikke er bundet til respektive indikasjonsmidler, hvert er separat bundet til en fastfasematriks slik at det dannes separate faste bærere, idet de ikke-spesifikke bindingsseter på overflaten av bærerne er blokkert.

13. Diagnostisk system ifølge krav 12, karakterisert ved at monoklonale paratopiske molekyler utskilt av hybridomet med ATCC deponeringsnummer HB 8746 og HB 9200, er bundet til de separate faste matrikser.